DE60014967T2

DE60014967T2 - Vorrichtung zur durchführung von wärmetauschenden chemischen reaktionen

Info

Publication number: DE60014967T2
Application number: DE60014967T
Authority: DE
Inventors: Ronald Chang; B. Douglas DORITY; A. Lee CHRISTEL; E. Kurt PETERSEN
Original assignee: Cepheid
Current assignee: Cepheid
Priority date: 1999-12-21
Filing date: 2000-12-15
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2020-12-16
Also published as: AU3075301A; ATE401958T1; US6660228B1; EP1239964B1; WO2001045845A1; EP1462176A3; ATE279260T1; US20080286151A1; DE60039640D1; US8303895B2; US20110176971A1; EP1462176A2; US7462323B1; DE60014967D1; EP1239964A1; EP1462176B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zum Steuern der Temperatur eines Reaktionsgemisches in einem Reaktionsbehälter, gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Es gibt viele Anwendungen auf dem Gebiet der chemischen Bearbeitung, in welchen es wünschenswert ist, die Temperatur von Reaktionsmischungen (beispielsweise biologischen Proben, die mit Chemikalien oder Reagenzen gemischt sind) präzise zu steuern, in den Mischungen schnelle Temperaturübergänge zu induzieren sowie Zielanalyte in den Mischungen zu erfassen. Eine der am weitesten verbreiteten Anwendungen von Temperatur-Steuersystemen ist die Anwendung zur Amplifikation von Nukleinsäure. Die Nukleinsäure-Amplifikation kann angewandt werden für: die Diagnose von genetischen Störungen; die Erfassung von Nukleinsäuresequenzen pathogener Organismen in einer Vielzahl von Proben einschließlicht Blut, Gewebe, Umwelt, Luft und dergleichen; die genetische Identifizierung einer Vielzahl von Proben einschließlich forensischer, agrikultureller, veterinärischer und dergleichen; die Analyse von Mutationen in aktivierten Onkogenen, Erfassung von Verunreinigungen in Proben wie beispielsweise Lebensmitteln; und in vielen anderen Aspekten der Molekularbiologie. Versuche mit der Amplifikation von Polynucleotid können in einem breiten Anwendungsbereich verwendet werden, beispielsweise für die Erzeugung spezifischer Sequenzen von geklonten doppelsträngigen DNA für die Verwendung als Sonden, die Erzeugung von Sonden spezifisch für ungeklonte Gene durch die selektive Amplifikation bestimmter Steuerungen von cDNA, die Erzeugung von Bibliotheken von cDNA aus kleinen Mengen mRNA, die Erzeugung großer Mengen an DNA für die Sequenzierung und Analyse von Mutationen.
Eine bevorzugte Erfassungstechnik für die chemische oder biochemische Analyse ist die optische Abfrage, typischerweise unter Verwendung von Fluoreszenz- oder Chemolumineszenz-Messungen. Für Ligand-bindende Versuche werden oft die zeitlich aufgelöste Fluoreszenz, die Fluoreszenzpolarisation oder die optische Absorption verwendet. Für PCR-Versuche (PCR: polymerase chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion) werden oft Fluoreszenzchemien verwendet.
Herkömmliche Instrumente zum Durchführen von thermischen Reaktionen und zum optischen Erfassen der Reaktionsprodukte beinhalten typischerweise einen Metallblock, der 96 konische Reaktionsröhren hat. Der Metallblock wird entweder durch eine Peltier-Heiz-/Kühlvorrichtung oder durch ein geschlossenschleifiges Flüssigkeits-Heiz-/Kühlsystem erhitzt und abgekühlt, in welchem Flüssigkeit durch Kanäle hindurchfließt, die in dem Block ausgeformt sind. Solche Instrumente mit einem Metallblock sind in den US-Patenten 5,038,852 (Johnson) und 5,333,675 (Mullis) beschrieben.
Diese herkömmlichen Instrumente haben einige Nachteile. Aufgrund der großen thermischen Masse eines Metallblocks sind zunächst die Erhitzungs- und Abkühlungs-Geschwindigkeiten in diesen Instrumenten auf ungefähr 1°C pro Sekunde begrenzt, was zu längeren Bearbeitungszeiten führt. Beispielsweise können in einer typischen PCR Anwendung fünfzig Zyklen zwei oder mehr Stunden benötigten, um fertiggestellt zu werden. Es ist festgestellt worden, dass mit diesen relativ langsamen Erhitzungs- und Abkühlungsgeschwindigkeiten einige Prozesse, die eine präzise Temperatursteuerung erfordern, ineffizient sind. Beispielsweise können Reaktionen bei den Zwischentemperaturen auftreten, was zu ungewünschten und störenden Seitenprodukten führt, wie beispielsweise PCR-"primer-dimers" oder abweichenden Amplikonen, welche für den analytischen Prozess schädlich sind. eine schlechte Temperatursteuerung führt auch zu einem übermäßigen Verbrauch von Reagenzen, die für die beabsichtigte Reaktion notwendig sind.
Ein weiterer Nachteil der herkömmlichen Instrumente ist, dass sie normalerweise keine optische Echtzeiterfassung oder kontinuierliche optische Überwachung der chemischen Reaktion ermöglichen. Beispielsweise wird bei herkömmlichen thermischen Zyklen-Instrumenten die optische Fluoreszenzerfassung durch Führen eines Lichtleiters in jede der 96 Reaktionsstellen in einem Metallblock erzielt. Ein zentraler Hochenergielaser erregt nacheinander jede Reaktionsstelle und erfasst das Fluoreszenzsignal durch den Lichtleiter hindurch. Da alle Reaktionsstellen nacheinander durch einen einzelnen Laser erregt werden, und da die Fluoreszenz mittels eines einzelnen Spektrometers und einer einzelnen Photomultiplikatorröhre erfasst wird, ist eine gleichzeitige Überwachung aller Reaktionsstellen nicht möglich.
Einige Instrumente für neuere Prozesse, die die optische Echtzeiterfassung einer chemischen Reaktion erfordern, sind eben erst erhältlich geworden. Ein solches Instrument von Northrup et al. im US-Patent 5,589,136 offenbart. Die Einrichtung beinhaltet eine hülsenartige Reaktionskammer auf Siliziumbasis, die Heizer, wie beispielsweise dotiertes Polysilizium für das Heizen, und Schüttgut-Silizium für die Konvektionskühlung kombiniert. Die Einrichtung beinhaltet optional eine sekundäre Röhre (beispielsweise Plastik) zum Halten der Probe. Im Betrieb wird die Röhre mit der Probe in die Siliziumhülse eingebracht. Die Hülse hat auch ihre eigene, ihr zugeordnete optische Anregungsquelle und einen Fluoreszenz-Detektor zum Empfangen von optischen Echtzeitdaten. Diese Einrichtung ermöglicht eine schnellere Aufheiz- und Abkühlgeschwindigkeit als die Instrumente, die einen Metallblock verwenden, wie oben beschrieben. Diese Einrichtung hat jedoch mehrere Nachteile im Hinblick auf die Verwendung einer feinbearbeiteten Siliziumhülse. Ein erster Nachteil ist, dass die brüchige Siliziumhülse zerspringen und absplittern kann. Ein zweiter Nachteil ist, dass es schwierig ist, die Siliziumhülse mit ausreichender Genauigkeit und Präzision fein zu bearbeiten, so dass die Hülse präzise eine Plastikröhre aufnimmt, die die Probe hält. Demzufolge kann die Plastikröhre eventuell keinen optimalen thermischen Kontakt mit der Siliziumhülse aufbauen.
Ein anderes Analyseinstrument ist von Wittwer et al. beschrieben in "The LightCycler^TM: A Microvolume Multisample Fluorimeter with Rapid Temperature Control", BioTechniques, Vol. 22, Seiten 176–181, Januar 1997. Das Instrument beinhaltet ein kreisförmiges Karussell zum Aufnehmen von bis zu 32 Proben. Die Temperatur, der Proben wird gesteuert durch eine zentrale Heizpatrone und einen Ventilator, der in einer zentralen Kammer des Karussells positioniert ist. Im Betrieb sind die Proben in Kapillaren platziert, welche mittels des Karussells gehalten werden, und ein Schrittmotor dreht das Karussell, um jede Probe sequentiell über einer Optik-Baueinheit zu plazieren. Jede Probe wird durch eine Kapillarspitze durch Epilumination optisch abgefragt. Dieses Instrument ermöglicht auch schnellere Erhitzungs- und Abkühlungsgeschwindigkeiten als die oben beschriebenen Metallblöcke. Leider ist es nicht für kommerzielle Diagnose-Anwendungen mit hohem Durchsatz geeignet.
Eine Vorrichtung gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 ist aus WO 98/38487 bekannt.
ZUSAMMENFASSUNG
Die vorliegende Erfindung überwindet die Nachteile des Standes der Technik, indem sie eine verbesserte Vorrichtung zum thermischen Steuern und optischen Abfragen einer Reaktionsmischungen schafft. Im Gegensatz zu den oben beschriebenen herkömmlichen Einrichtungen ermöglicht die erfindungsgemäße Vorrichtung ein extrem schnelles Aufheizen und Abkühlen der Mischung, stellt einen optimalen Wärmetransfer zwischen der Mischung und den Heiz- oder Kühlelementen her, schafft eine optische Echtzeiterfassung und Überwachung von Reaktionsprodukten mit erhöhter Fassungsgenauigkeit, und ist einfach aufgebaut für automatisierte Anwendungen mit großem Durchsatz. Die Vorrichtung ist nützlich zum Ausführen von chemischen Wärme-Austauschreaktionen, wie beispielsweise der Amplifikation von Nukleinsäure.
Die Vorrichtung der Erfindung ist im Anspruch 1 definiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet die Vorrichtung ein Reaktionsgefäß mit einer Kammer zum Halten der Mischung. Das Gefäß oder der Behälter hat einen starren Rahmen, der die Seitenwände der Kammer definiert, und zumindest eine flexible Materialbahn, die an dem starren Rahmen angebracht ist, um so eine Hauptwand der Kammer zu bilden. Der starre Rahmen hat außerdem zumindest eine Öffnung zum Hinzufügen eines Fluids zu der Reaktionskammer, und einen Kanal, der die Öffnung mit der Kammer verbindet, um eine einfaches Befüllen. Verschließen und unter Druck setzen der Kammer zu ermöglichen. Die Vorrichtung beinhaltet auch zumindest eine thermische Oberfläche zum Kontaktieren der flexiblen Hauptwand der Kammer. Die Vorrichtung hat außerdem eine Einrichtung zum Erhöhen des Drucks in der Kammer. Der Druckanstieg in der Kammer ist ausreichend, um die flexible Hauptwand dazu zu zwingen, die thermische Oberfläche zu kontaktieren und sich an diese anzupassen, um so eine optimale thermische Leitfähigkeit zwischen der thermischen Oberfläche und der Kammer sicherzustellen. Die Vorrichtung hat außerdem auch zumindest ein thermisches Element (beispielsweise ein Heizelement, eine thermo-elektrische Einrichtung, eine Wärmesenke, einen Lüfter, oder eine Peltier-Einrichtung) zum Erhitzen oder Abkühlen der thermischen Oberfläche, um eine Temperaturveränderung innerhalb der Kammer zu induzieren.
In der bevorzugten Ausführungsform beinhaltet der Reaktionsbehälter eine erste und eine zweite flexible Materialbahn, die an gegenüberliegenden Seiten des starren Rahmens angeordnet sind, um so gegenüberliegende Hauptwände der Kammer zu bilden. In dieser Ausführungsform beinhaltet die Vorrichtung eine erste und eine zweite thermische Oberfläche, die ausgebildet sind durch eine erste und eine zweite gegenüberliegende Platte, die so positioniert sind, dass sie die Kammer des Behälters zwischen sich aufnehmen. Wenn der Druck in der Kammer ansteigt, dehnen sich die flexiblen Hauptwände der Kammer nach außen aus, um so die Innenflächen der Platten zu kontaktieren und sich an diese anzupassen. Ein resistives Heizelement wie beispielsweise ein dicker oder dünner Filmresistor ist mit jeder Platte gekoppelt, um die Platten zu erhitzen. Außerdem beinhaltet die Vorrichtung eine Kühleinrichtung wie beispielsweise einen Lüfter zum Kühlen der Platten. Jede der Platten besteht vorzugsweise aus einem keramischen Material und hat eine Dicke von höchstens 1 mm für eine geringe thermische Masse. Insbesondere wird gegenwärtig bevorzugt, dass jede der Platten eine thermische Masse von weniger als ungefähr 5 J/°C hat, noch besser weniger als 3 J/°C und noch besser weniger als 1 J/°C, um eine extrem schnelle Abkühlung und Erhitzung zu ermöglichen.
Das unter Druck setzen der Kammer stellt sicher, dass die flexiblen Hauptwände des Behälters dazu gezwungen werden, die Innenflächen der Platten zu berühren und sich an diese anzupassen, um so einen optimalen thermischen Kontakt zwischen den Hauptwänden und den Platten sicherzustellen. In der bevorzugten Ausführungsform weist die Einrichtung zum Erhöhen des Drucks in der Kammer einen Plungerkolben auf, der in den Kanal eingebracht ist, um Gas in dem Behälter zu komprimieren und so den Druck in der Kammer zu erhöhen. Der Plungerkolben hat vorzugsweise einen Druckhub in dem Kanal, der ausreichend ist, um den Druck in der Kammer auf zumindest 12 Kilopascal (kPa) oberhalb des Umgebungsdrucks außerhalb des Behälters anzuheben, und besser noch auf einen Druck im Bereich von 55 bis 105 kPa oberhalb des Umgebungsdrucks. In der bevorzugten Ausführungsform wird die Länge des Druckhubs gesteuert durch zumindest eine Drucksteuernut in der Innenfläche des Rahmens, der den Kanal definiert. Die Drucksteuernut erstreckt sich von der Öffnung bis zu einer vorbestimmten Tiefe in dem Kanal, so dass Gas aus dem Kanal entweichen kann, und dadurch die Unterdrucksetzung der Kammer verhindert wird, bis der Plungerkolben die vorbestimmte Tiefe erreicht. Wenn der Plungerkolben die vorbestimmte Tiefe erreicht, bildet der Plungerkolben eine Abdichtung mit den Wänden des Kanals und beginnt mit dem Druckhub. Die Drucksteuernuten sorgen für eine sehr gut steuerbare Unterdrucksetzung der Kammer und helfen beim Verhindern einer falschen Ausrichtung des Plungerkolbens in dem Kanal.
Die Vorrichtung beinhaltet eine automatisierte Maschine zum Befüllen und Rücksetzen des Behälters. Die Vorrichtung beinhaltet einen Bestückungsautomaten mit einer Pipette zum Befüllen des Behälters und mit einer Maschinenspitze zum Einführen des Plungerkolbens in den Kanal hinein nach dem Befüllen. Der Plungerkolben beinhaltet vorzugsweise eine Kappe mit einer sich verjüngenden Eingriffsöffnung zum Aufnehmen und Aufbauen einer Passung mit der Maschinenspitze, um es so der Maschinenspitze zu ermöglichen, den Plungerkolben in den Kanal hinein zu platzieren.
Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung ermöglicht eine Echtzeit-Überwachung und Erfassung von Reaktionsprodukten in dem Behälter mit einer verbesserten optischen Empfindlichkeit. In der bevorzugten Ausführungsform sind zumindest zwei der Seitenwände der Kammer optisch durchlässig und winklig versetzt voneinander, vorzugsweise um einen Winkel von ungefähr 90°. Die Vorrichtung hat außerdem ein Optiksystem zum optischen Abfragen der Mischung in der Kammer durch die optisch durchlässigen Seitenwände. Das Optiksystem beinhaltet zumindest eine Lichtquelle zum Anregen der Mischung durch eine erste der Seitenwände hindurch, und zumindest einen Detektor zum Erfassen von Licht, das aus der Kammer durch eine zweite der Seitenwände emittiert wird.
Eine optimale optische Empfindlichkeit kann erreicht werden durch Maximieren der optischen Probenweglänge von sowohl den Lichtstrahlen, die die gekennzeichneten Analyte in der Reaktionsmischung anregen, als auch des emittierten Lichts, das erfasst wird. Das dünne, breite Reaktionsgefäß der vorliegenden Erfindung optimiert die Erfassungsempfindlichkeit, indem es eine maximale optische Weglänge pro Einheit Analytvolumen zur Verfügung stellt. Insbesondere ist der Behälter vorzugsweise so aufgebaut, dass das Verhältnis der Breite der Kammer zur Dicke der Kammer zumindest 4:1 beträgt und die Kammer eine Dicke hat, die geringer ist als ungefähr 2 mm. Diese Parameter sind gegenwärtig bevorzugt, um einen Behälter zu schaffen, der eine relativ große durchschnittliche optische Weglänge durch die Kammer hindurch hat, während die Kammer immer noch ausreichend dünn ist, um ein extrem schnelles Aufheizen und Abkühlen der Reaktionsmischung zu ermöglichen.
Die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung kann als kleines in der hand gehaltenes Instrument konfiguriert sein oder alternativ als großes Instrument mit mehreren Reaktionsstellen zum gleichzeitigen Bearbeiten hunderter Proben. In Ausführungsformen mit hohem Durchsatz sind die Platten, die Heiz- und Kühlelemente und die Optik vorzugsweise in einem einzelnen Gehäuse vorgesehen, um ein unabhängig steuerbares, Wärme austauschendes Modul mit Erfassungsfähigkeit zu bilden. Die Vorrichtung beinhaltet ein Basisinstrument zum Aufnehmen eines Vielzahl solcher Module, und das Basisinstrument beinhaltet Bearbeitungselektronik zum unabhängigen Steuern des Betriebs jedes Moduls. Jedes Modul bietet eine Reaktionsstelle zum thermischen Bearbeiten einer in einem Reaktionsbehälter befindlichen Probe und zum Erfassen zumindest eines Zielanalyts in der Probe. Die Vorrichtung kann auch einen Computer zum Steuern des Basisinstruments beinhalten.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt eine teilweise explodierte, isometrische Ansicht eines Reaktionsgefäßes gemäß der vorliegenden Erfindung, bei welchem die Reaktionskammerseitenwände entfernt sind, um das Innere der Kammer zu zeigen.
2 ist eine Vorderansicht des Behälters aus 1.
3 ist eine Draufsicht einer Plungerkappe des Behälters der 1.
4 ist eine weitere Draufsicht des Behälters der 1.
5 ist eine Seitenansicht des Behälters aus 1, eingefügt in eine thermische Hülle, die durch gegenüberliegende thermische Platten geformt wird.
6 ist eine Frontansicht einer der Platten aus 5.
7A – 7D sind schematische Querschnittsansichten eines Plungerkolbens, der in einen Kanal des Reaktionsbehälters der 1 eingesetzt ist.
8 ist eine schematische Frontansicht eines Wärmetauschermoduls gemäß der vorliegenden Erfindung mit einer thermischen Hülse, einem Paar optischer Anordnungen sowie einem Abkühlsystem. Der Reaktionsbehälter der 1 ist in die thermische Hülse eingesetzt.
9 ist eine Explosionsansicht einer Stützstruktur zum Halten der Platten aus 5.
10 und 11 sind zusammengefügte Ansichten der Stützstruktur der 9.
12 ist eine isometrische Ansicht des Reaktionsbehälters aus 1, eingefügt zwischen die Platten aus 5.
13 ist eine isometrische Ansicht, die das Äußere einer der Optikanordnungen aus 8 zeigt.
14 ist eine isometrische Ansicht der Optikanordnung der 13, der Platten aus 5 in Kontakt mit der Optikanordnung sowie des Behälters aus 1 oberhalb der Platten.
15A und 15B sind Graphen, die die Anregungs- bzw. Emissions-Spektren vierer Farbstoffe zeigen, die oft in thermischen Reaktionen verwendet werden.
15C zeigt die Effekte des Filterns der Ausgaben grüner und blauer LEDs, um bestimmte Anregungswellenbereiche zu schaffen.
15D zeigt die Effekte des Filterns von Licht, das von jedem der vier Farbstoffe der 15A–B emittiert wird, um bestimme Emissions-Wellenlängenbereiche zu bilden.
16 ist eine Draufsicht einer optischen Anregungsanordnung des Moduls der 8.
17 ist eine Explosionsansicht der Anregungsanordnung der 16.
18 ist eine Draufsicht einer optischen Einfassungsanordnung des Moduls der 8.
19 ist eine Explosionsansicht der Einfassungsanordnung der 18.
20 ist eine isometrische Ansicht eines Mehrstellen-Reaktorsystems gemäß der vorliegenden Erfindung.
21 ist ein schematisches Blockdiagramm eines anderen Mehrstellen-Reaktorsystems mit mehreren thermischen Zyklierinstrumenten, die in einer Gänseblümchen-Kette mit einem Computer und einer Energiequelle verbunden sind.
22 ist ein schematisches Blockdiagramm eines Basisinstruments des Systems der 20.
23 ist ein schematisches Blockdiagramm der Elektronik-Komponenten des Moduls aus 8.
24 ist ein schematisches Diagramm eines Bestückungsautomaten mit einer Pipette zum Befüllen des Reaktionsbehälters der 1.
25 ist ein schematisches Diagramm des Bestückungsautomaten der 24, der gerade einen Plungerkolben in den Behälter der 1 einbringt.
26 ist eine schematische Frontansicht eines Reaktionsbehälters gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung.
27 ist eine schematische Querschnittsansicht eines Reaktionsbehälters gemäß einer alternativen Ausführungsform der Erfindung.
28 ist eine teilweise explodierte isometrische Ansicht eines Reaktionsbehälters gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung, bei welcher die Hauptwände der Reaktionskammer entfernt sind, um das Innere der Kammer zu zeigen.
29 ist eine schematische Frontansicht des Behälters der 28.
30 ist eine Draufsicht einer Plungerkolbenkappe des Behälters der 28.
31 ist eine schematische Frontansicht eines Reaktionsbehälters gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung.
32 ist eine Draufsicht einer Plungerkolbenkappe des Behälters der 31.
33 ist ein schematisches Diagramm eines Bestückungsautomaten zum unter Druck setzen eines Reaktionsbehälters gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung.
34 und 35 sind schematische Diagramme eines Bestückungsautomaten, der eine Nadel mit einer Doppelbohrung verwendet, um ein Reaktionsgefäß gemäß einer alternativen Ausführungsform der Erfindung zu befüllen und unter Druck zu setzen.
36 und 37 sind schematische Diagramme eines Bestückungsautomaten, der eine Nadel mit einer einzelnen Bohrung verwendet, um ein Reaktionsgefäß gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung zu befüllen und unter Druck zu setzen.
38 und 39 sind schematische Diagramme einer Pressmaschine mit einer Platte zum Verschließen einer Öffnung eines Reaktionsgefäßes gemäß einer alternativen Ausführungsform (nicht Teil der Erfindung).
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung schafft eine Vorrichtung zum thermischen Steuern und optischen Abfragen einer Reaktionsmischung. Die Reaktionsmischung ist normalerweise eine Mischung aus einer Testprobe und zumindest einer biologischen, chemischen, oder physikalischen Substanz oder Reagenz. Die Reaktionsmischung kann auch Verdünner und Puffer beinhalten. Die Probe ist typischerweise eine Körperflüssigkeit (beispielsweise Blut, Urin, Speichel, Sputum, Samenflüssigkeit, Spinalflüssigkeit, Mucus, oder andere Körperflüssigkeiten). Alternativ kann die Probe auch ein Feststoff sein, der in einer Flüssigkeit löslich gemacht oder gelöst ist, oder die Probe kann eine Umweltprobe wie beispielsweise eine Grund- oder Abwasserprobe sein, Bodenextrakte, Überbleibsel von Pestiziden, oder in einem Fluid plazierte Sporen aus der Luft.
In einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet die Vorrichtung ein Reaktionsgefäß zum Aufnehmen der Reaktionsmischung und ein Wärmetauschermodul zum Aufnehmen des Gefäßes für die thermische Bearbeitung und optische Erfassung. Das Wärmetauschermodul beinhaltet ein Paar von gegenüberliegenden thermischen Platten, zwischen welche das Gefäß für die thermische Bearbeitung eingefügt wird, zumindest ein Heiz- oder Kühlelement zum Erhitzen oder Abkühlen der Platten, und eine Optik zum optischen Abfragen der Mischung in dem Behälter. Die Vorrichtung beinhaltet auch eine Basiseinheit mit Verarbeitungselektronik zum Aufnehmen mehrerer solcher Wärmetauschermodule und zum unabhängigen Steuern jedes Moduls. Die Vorrichtung kann auch eine Steuerung wie beispielsweise einen Personalcomputer oder Netzwerkcomputer beinhalten, welche eine Benutzerschnittstelle zu der Vorrichtung bietet und den Betrieb der Verarbeitungselektronik steuert. Die Vorrichtung ist nützlich für das Ausführen von chemischen Wärmetauschreaktionen wie beispielsweise der Amplifikation von Nukleinsäure, und für das optische Abfragen von Zielanalyten.
Die 1–25 illustrieren eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung. 1 zeigt eine teilweise explodierte Ansicht eines Reaktionsgefäßes 12 gemäß der bevorzugten Ausführungsform, und 2 zeigt eine Vorderansicht des Gefäßes 12. Das Gefäß 12 beinhaltet eine Reaktionskammer 17 zum Aufnehmen einer Reaktionsmischung für die thermische Bearbeitung und optische Abfrage. Das Gefäß 12 ist ausgestaltet für einen optischen Wärmeaustausch mit der Reaktionsmischung und für eine effiziente optische Betrachtung der Mischung. Die dünne Gestalt des Gefäßes trägt zu optimalen thermischen Kinetiken bei, indem sie große Oberflächen für die thermische Leitung zur Verführung stellt. Außerdem schaffen die Seitenwände des Gefäßes 12 optische Fenster in die Kammer 17, so dass die gesamte Reaktionsmischung optisch in Echtzeit abgefragt werden kann, während die chemische Reaktion stattfindet.
Um genauer auf die 1 und 2 einzugehen, beinhaltet das Reaktionsgefäß 12 einen festen Rahmen 16, welcher die Seitenwände 19A, 19B, 20A, 20B der Reaktionskammer 17 definiert. Der starre Rahmen 16 beinhaltet auch einen Anschluss 14 sowie einen Kanal 28, der den Anschluss 14 mit der Reaktionskammer 17 verbindet. Der Behälter beinhaltet auch dünne, flexible Materialbahnen, die an gegenüberliegenden Seiten des starren Rahmens 16 angebracht sind, um gegenüberliegende Hauptwände 18 der Kammer zu bilden. (Die Hauptwände 18 sind in 1 aus Klarheitsgründen von dem Rahmen 16 explodiert dargestellt.) Die Reaktionskammer 17 ist somit definiert durch die starren Seitenwände 19A, 19B, 20A, 20B des Rahmens 16 und durch die flexiblen Hauptwände 18, die mit gegenüberliegenden Seiten des Rahmens versiegelt sind.
Die Hauptwände 18 erleichtern die optimale thermische Leitung zu der Reaktionsmischung in der Kammer 17. Jede der Wände 18 ist ausreichend flexibel, um eine entsprechende thermische Oberfläche zu berühren und sich daran anzupassen, so dass ein optimaler thermischer Kontakt und Wärmeaustausch zwischen der thermischen Oberfläche und der Reaktionsmischung in der Kammer 17 möglich wird. Außerdem passen sich die flexiblen Wände 18 weiter an die thermischen Oberflächen an, wenn die Gestalt der Oberflächen sich aufgrund der thermischen Ausdehnung oder Kontraktion während des Verlaufs des Wärmeaustauschvorgangs verändert.
wie in 5 dargestellt, sind die thermischen Oberflächen zum Berühren der flexiblen Wände 18 vorzugsweise ausgebildet durch ein Paar einander gegenüberliegender Platten 50A, 50B, die so positionier sind, dass sie die Kammer 17 zwischen sich aufnehmen. Wenn die Kammer 17 des Behälters zwischen diese Platten 50A, 50B eingesetzt ist, berühren die Innenflächen der Platten die Innenwände 18, und die flexiblen Wände passen sich an die Oberflächen der Platten an. Die Platten haben vorzugsweise einen Abstand voneinander, der gleich der Dicke T der Kammer 17 ist, wie sie definiert ist durch die Dicke des Rahmens 16. In dieser Position sind kaum Zwischenräume zwischen den Plattenoberflächen und den Wänden 18 ausgeformt, oder überhaupt keine Zwischenräume. Die Platten können erhitzt werden und abgekühlt werden durch verschiedene thermische Elemente, um Temperaturveränderungen innerhalb der Kammer 17 zu induzieren, wie dies noch genauer beschrieben wird.
Die Wände 18 sind vorzugsweise flexible Filme aus polymerischem Material wie beispielsweise Polypropylen, Polyethylen, Polyester, oder anderen Polymeren. Die Filme können entweder geschichtet sein, beispielsweise Laminate, oder die Filme können auch homogen sein. Beschichtete Filme sind bevorzugt, weil sie im allgemeinen eine bessere Stärke haben und strukturelle Integrität als homogene Filme. Insbesondere werden geschichtete Polypropylenfilme gegenwärtig bevorzugt, weil Polypropylen nicht hemmend für PCR ist. Alternativ können die Wände 18 auch jedes andere Material aufweisen, das in eine flexibel dünne Materialbahn geformt werden kann und einen schnellen Wärmetransfer ermöglicht. Für eine gute thermische Leitung beträgt die Dicke jeder Wand 18 vorzugsweise zwischen ungefähr 0,003 bis 0,5 mm, besser zwischen 0,01 bis 0,15 mm und am besten zwischen 0,025 und 0,08 mm.
Mit Bezug auf die 1 und 2 beinhaltet der Reaktionsbehälter 12 auch einen Plungerkolben 22, der in den Kanal 28 nach dem Befüllen der Kammer 17 mit der Reaktionsmischung eingebracht wird. Der Plungerkolben 22 komprimiert Gas in den Behälter 12, um dadurch den Druck in der Kammer 17 zu erhöhen und die flexiblen Wände 18 nach außen auszudehnen. Das durch den Plungerkolben 22 komprimierte Gas ist typischerweise Luft, die den Kanal 28 befüllt. Das unter Druck setzen der Kammer 17 ist wichtig, weil es die Wände 18 gegen die Oberflächen der Platten 50A, 50B zwingt (siehe 5) und sicherstellt, dass die Wände 18 vollständig die Innenflächen der Platten berühren und sie an diese anpassen, um so eine optimale thermische Leitung zwischen den Platten 50A, 50B und der Kammer 17 zu garantieren.
Wieder mit Bezug auf die 1 und 2 kann der Plungerkolben irgendeine Einrichtung aufweisen, die eine Abdichtung mit den Wänden des Kanals 28 aufbauen kann und Gas in dem Behälter komprimieren kann. Solche Einrichtungen beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf, Kolben, Stopfen oder Anschläge. Der Plungerkolben 22 der bevorzugten Ausführungsform beinhaltet einen Schaft 30 und einen Kolben 32 an dem Schaft. Wenn der Plungerkolben 22 in den Kanal 28 eingebracht ist, baut der Kolben 32 eine Dichtung mit den Innenwänden des Kanals auf und komprimiert Luft in dem Kanal. Der Kolben 32 ist vorzugsweise eine Schale, die integral mit dem Schaft 30 ausgeformt ist. Alternativ kann der Kolben 32 auch ein separates, an dem Schaft angebrachtes elastomerisches Stück sein.
Der Plungerkolben 22 beinhaltet vorzugsweise auch einen Ausrichtungsring 34, der den Schaft umgibt, um den Plungerkolben 22 in koaxialer Ausrichtung mit dem Kanal 28 zu halten, wenn der Plungerkolben in den Kanal eingebracht wird. Der Ausrichtering 34 ist vorzugsweise integral mit dem Schaft 30 ausgeformt. Der Schaft 30 kann optional Stützrippen 44 zum Versteifen und Verstärken des Schaftes beinhalten. Der Plungerkolben 22 hat auch eine an dem Schaft 30 angebrachte Plungerkolbenkappe 36. Wie in 2 dargestellt, beinhaltet die Kappe 36 einen Schnappring 38, und das Gefäß beinhaltet eine ringförmige Ausnehmung 23, die die Öffnung 14 umgibt, zum aufnehmen des Schnapprings 38. Die Kappe 36 kann optional einen Hebelbereich 40 beinhalten, der angehoben wird, um den Plungerkolben 22 aus dem Kanal 28 zu entfernen.
Mit Bezug auf die 7A hat der starre Rahmen 16 einen Innenfläche 41, die den Kanal 28 definiert. Die Innenfläche 41 hat vorzugsweise zumindest eine Drucksteuernut 42, die darin ausgeformt ist. In der bevorzugten Ausführungsform hat die Innenfläche vier Drucksteuernuten (nur drei sind in der Ansicht der 7A dargestellt), die in regelmäßigem Abstand um den Außenumfang des Kanals 28 herum beabstandet sind. Die Drucksteuernuten 42 erstrecken sich von der Öffnung 14 aus bis zu einer vorbestimmten Tiefe D1 in dem Kanal 28. Die Drucksteuernuten 42 ermöglichen das Entweichen von Gas aus dem Kanal 28 und verhindern so das Unterdrucksetzen der Kammer 17, bis der Kolben 32 die Tiefe D1 in dem Kanal erreicht. Wenn der Kolben 32 die Tiefe D1 erreicht, baut der Kolben eine ringförmige Dichtung mit den Wänden des Kanals 28 auf und beginnt, in dem Kanal gefangene Luft zu komprimieren. Die Kompression der gefangenen Luft verursacht die gewünschte Unterdrucksetzung der Kammer 17.
Der Hub des Plungerkolbens 22 in den Kanal 28 hinein ist in den 7A–7D vollständig dargestellt. Wie in 7A dargestellt, ist vor dem Einbringen des Plungerkolbens 22 in den Kanal 28 hinein die Kammer 17 mit der gewünschten Reaktionsmischung R gefüllt. Bestimmte Verfahren zum Befüllen der Kammer (beispielsweise Pipettieren) sind genauer weiter unten diskutiert. Die Reaktionsmischung R füllt den Behälter 12 bis zu einer Füllhöhe der Flüssigkeit S. Auch vor dem Einsetzen der Plungerkolbens 22 in den Kanal 28 hinein hat der Kanal 28 weiter einen Druck gleich dem Druck der Atmosphäre außerhalb des Behälters, im folgenden als Umgebungsdruck bezeichnet. Der Umgebungsdruck ist normalerweise der atmosphärische Standarddruck, beispielsweise ungefähr 101,3 kPa. Wie in 7B dargestellt, beginnt der Kolben 32, wenn der Plungerkolben 22 zuerst in den Kanal 28 eingebracht wird, die Luft in dem Kanal zu verschieben. Die verschobene Luft entweicht aus dem Kanal 28 durch die Drucksteuernuten 42 hindurch.
Mit Bezug auf die 7C bildet, wenn der Kolben 32 die Tiefe D1 erreicht, bei welcher die Drucksteuernuten enden, der Kolben 32 eine ringförmige Abdichtung mit den Wänden des Kanals 28 und beginnt, in dem Kanal zwischen dem Kolben 32 und der Oberfläche S der Reaktionsmischung gefangene Luft zu komprimieren. Die Reaktionsmischung ist normalerweise eine Flüssigkeit und daher im wesentlichen inkompressibel mittels des Kolbens. Die in dem Kanal 28 gefangene Luft kann jedoch komprimiert werden, um den Druck in der Kammer 17 zu erhöhen. Wie in 7D dargestellt, hält der Ausrichtering 34, wenn der Plungerkolben 22 weiter in den Kanal 28 eingeführt wird, den Plungerkolben 22 koaxial ausgerichtet mit dem Kanal 28, wenn der Kolben 32 in dem Kanal gefangene Luft weiter zusammenpresst. Wenn der Plungerkolben 22 vollständig in den Kanal 28 eingebracht ist, schnappt der Schnappring 38 in die ringförmige Ausnehmung 23 hinein und beendet den Plungerkolbenhub.
Wenn der Plungerkolben 22 vollständig eingebracht ist, verschließt der Kolben 32 den Kanal 28 bei einer Tiefe D2, die tiefer ist als die Tiefe D1, bei welcher die Drucksteuernuten 42 enden. Der Abstand D3, den der Nut 32 zwischen den Tiefen D1 und D2 zurücklegt, d.h. der Abstand des Druckhubs, bestimmt den Grad der Unterdrucksetzung der Kammer 17. Wieder mit Bezug auf 5 sollte der Druck in der Kammer 17 ausreichend hoch sein, um sicherzustellen, dass die flexiblen Hauptwände 18 der Kammer sich auswärts ausdehnen, um die Oberflächen der Platten 50A, 50B zu kontaktieren und sich an diese anzupassen. Der Druck sollte jedoch nicht so groß sein, dass die flexiblen Wände 18 zerbersten, sich von dem starren Rahmen 16 lösen oder den Rahmen oder die Platten verformen.
Gegenwärtig wird bevorzugt, die Kammer auf einen Druck im Bereich von 12 bis 350 kPa oberhalb des Umgebungsdrucks unter Druck zu setzen. Dieser Bereich wird gegenwärtig bevorzugt, weil 12 kPa im allgemeinen genug Druck sind, um eine Konformität zwischen den flexiblen Wänden 18 und den Oberflächen der Platten 50A, 50B sicherzustellen, während Drücke oberhalb 350 kPa ein Zerbersten der Wände 18 oder eine Verformung des Rahmens 16 oder der Platten 50A, 50B verursachen können. Noch besser wird die Kammer 17 auf einen Druck im Bereich von 55 bis 104 kPa oberhalb des Umgebungsdrucks unter Druck gesetzt. Dieser Bereich wird noch stärker bevorzugt, weil er sicher innerhalb der praktischen oben beschriebenen Grenzen liegt, d.h. Drücke von 55 bis 105 kPa sind normalerweise mehr als genug, um sicherzustellen, dass die flexiblen Wände 18 die Oberflächen der Platten 50A, 50B kontaktieren und sich an diese anpassen, aber sie sind signifikant geringer als die Drücke, die die Wände 18 zerbersten lassen oder den Rahmen 16 verformen können.
Wieder mit Bezug auf die 7D kann die gewünschte Unterdrucksetzung der Kammer 17 erzielt werden durch eine geeignete Ausgestaltung des Plungerkolbens 22, des Kanals 28 und der Drucksteuernuten 42 und durch die Verwendung der folgenden Gleichung: P1*V1=P2*V2;wobei
P1 gleich dem Druck in dem Behälter 12 vor dem Einführen des Plungerkolben 22 ist,
V1 gleich dem Volumen des Kanals 28 zwischen der Oberfläche der Flüssigkeit S und der Tiefe D1 ist, bis zu welcher sich die Drucksteuernuten erstrecken,
P2 gleich dem gewünschten endgültigen Druck in der Kammer 17 nach dem Einbringen des Plungerkolbens 22 in den Kanal 28 hinein ist, und
V2 gleich dem Volumen des Kanals 28 zwischen der Oberfläche S der Flüssigkeit und der Tiefe D2 ist, bei welcher der Kolben 32 eine Abdichtung mit den Wänden des Kanals 28 aufbaut, wenn der Plungerkolben 22 vollständig in den Kanal eingebracht ist.
Um die gewünschte Unterdrucksetzung P2 der Kammer 17 sicherzustellen, sollte man den Kanal 28 und den Druckhubabstand D3 so bemessen, dass des Verhältnis der Volumina V1:V2 gleich dem Verhältnis der Drücke P2:P1 ist. Ein Ingenieur mit normalen Fachkenntnissen wird dazu fähig sein, geeignete Werte für die Volumina V1 und V2 auszuwählen, und zwar unter Verwendung der oben gegebenen Beschreibung und Gleichung. Beispielsweise ist in der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform der Anfangsdruck P1 in dem Behälter gleich einem Standard-Atmosphärendruck von ungefähr 101,3 kPa, das Volumen v1 ist gleich 110 Mikroliter (ml), die Tiefe D1 ist ungefähr gleich 5 mm, die Tiefe D2 ist ungefähr 7 mm, um einen Druckhubabstand D3 von ungefähr 2 mm zu erreichen, und das Volumen V2 ist gleich 60 ml, um einen abschließenden Druck P2 von ungefähr 185 kPa (den gewünschten 84 kPa oberhalb des Umgebungsdrucks) zu erreichen. Dies ist aber nur ein Beispiel geeigneter Abmaße für den Behälter 12, und dies soll den Bereich der Erfindung nicht einschränken. Viele andere geeignete Werte können ausgewählt werden.
Durch das Auswählen geeigneter Abmaße für den Kanal 28 und den Druckhubabstand D3 (und so der Volumina V1 und V2) gibt es keine theoretische Grenze, wie groß oder klein diese Abmaße sein sollen. Es ist nur wichtig, dass das Verhältnis der Volumina V1:V2 den gewünschten abschließenden Druck P2 in der Kammer ergibt. Praktisch wird jedoch gegenseitig bevorzugt, den Behälter so auszugestalten, dass der Abstand D3 des Druckhubs zumindest 1,25 mm beträgt, d.h. so dass der Plungerkolben 22, wenn er vollständig in den Kanal 28 eingebracht ist, sich bis zu einer Tiefe D2 erstreckt, die zumindest 1,25 mm unterhalb der Tiefe D1 liegt, bei welcher die Drucksteuernuten enden. Diese minimale Länge des Druckhubs wird bevorzugt, um den Effekt, den irgendwelche Herstell- oder Betätigungsfehler auf die Unterdrucksetzung der Kammer haben können, zu reduzieren oder vernachlässigbar zu machen. Beispielsweise kann die Länge des Druckhubs sich leicht von Behälter zu Behälter unterscheiden aufgrund von Herstellungs-Abweichungen, oder das Volumen der komprimierten Luft kann sich verändern aufgrund eines Betätigungsfehlers beim Befüllen des Behälters (beispielsweise unterschiedliche Füllstände). Wenn der Behälter dazu ausgestaltet ist, einen ausreichend langen Druckhub zu haben, werden solche Varianzen jedoch einen geringeren oder sogar vernachlässigbaren Effekt auf das Verhältnis der Volumina V1:V2 haben, und eine geeignete Unterdrucksetzung der Kammer wird immer noch erfolgen. Außerdem sollte man, um einen Sicherheitsrand für Herstell- oder Betätigungsfehler zu schaffen, einen Druckhub auswählen, der ausreichend ist, um einen endgültigen Druck P2 zu erreichen, der auf sichere Art und Weise höher ist (beispielsweise zumindest 20 kPa höher) als der minimale Druck, der notwendig ist, um die flexiblen Wände der Kammer gegen die inneren Oberflächen der Platten zu zwingen. Mit einem solchen Sicherheitsrand werden alle Abweichungen im endgültigen Druck aufgrund von Herstellabweichungen oder Fehler bei der Befüllung der Kammer einen vernachlässigbaren Effekt haben, und die Unterdrucksetzung der Kammer 17 wird immer noch geeignet ausgeführt werden. Wie bereits oben erwähnt, ist der Plungerkolbenhub vorzugsweise dazu ausgestaltet, den Druck in der Kammer 17 auf einen Druck im Bereich von 55 bis 105 kPa oberhalb des Umgebungsdrucks anzuheben, um den Sicherheitsrand zu schaffen.
Die Drucksteuernuten 42 schaffen mehrere wichtige Vorteile. Zunächst schaffen die Drucksteuernuten 42 einen einfachen Mechanismus zum präzisen und akkuraten Steuern des Druckhubs des Plungerkolbens 22, und so der Unterdrucksetzung der Kammer 17. Zweitens ermöglichen es die Drucksteuernuten 42 dem Plungerkolben 22, vollständig mit dem Kanal 28 ausgerichtet zu werden, bevor der Druckhub beginnt, und so wird verhindert, dass der Plungerkolben in dem Kanal falsch ausgerichtet ist oder sich verklemmt. Dies stellt einen sehr konsistenten Druckhub sichern. Obwohl es möglich ist, dass der Behälter nur eine Drucksteuernut hat, wird bevorzugt, dass der Behälter mehrere Drucksteuernuten hat (beispielsweise 2 bis 6 Nuten), die regelmäßig um den Außenumfang des Kanals 28 herum beabstandet sind. Wieder mit Bezug auf die 7A schneiden die Drucksteuernuten 42 vorzugsweise ungefähr 0,25 bis 0,75 mm in die Oberfläche 41 hinein, die den Kanal 28 definiert. Dieser Bereich ist bevorzugt, so dass die Drucksteuernuten 42 groß genug sind, damit Luft aus dem Kanal 28 entweichen kann, aber nicht so tief in die Oberfläche 41 hineingeschnitten sind, dass sie die strukturelle Integrität des Rahmens 16 beeinträchtigen.
Obwohl die Drucksteuernuten 42 bevorzugt sind, ist es auch möglich, den Behälter 12 ohne die Drucksteuernuten auszubilden und immer noch die gewünschte Unterdrucksetzung der Kammer 17 zu erreichen. ein Nachteil dieser Ausführungsform ist, dass der Plungerkolben 22 in dem Kanal 28 während des Druckhubs falsch ausgerichtet sein kann oder sich verklemmen kann, so dass weniger konsistente Ergebnisse erzielt werden. In Ausführungsformen, in welchen der Behälter keine Drucksteuernuten hat, beginnt der Druckhub des Plungerkolbens 22, wenn der Kolben 32 in den Kanal 28 eintritt und eine Abdichtung mit den Wänden des Kanals aufbaut. In diesen Ausführungsformen ist das Volumen V1 (für die Verwendung in der obigen Gleichung) gleich dem Volumen des Kanals 28 zwischen der Oberfläche S der Flüssigkeit und der Öffnung 14, wo der Kolben 32 zuerst eine Abdichtung mit den Wänden des Kanals aufbaut. Um die gewünschte Unterdrucksetzung P2 der Kammer 17 sicherzustellen, sollte man den Kanal 28 und die Länge des Druckhubs so ausgestalten, dass das Verhältnis der Volumina V1:V2 gleich dem Verhältnis der Drücke P2:P1 ist. Wie zuvor beschrieben, ist die minimale Länge des Druckhubs vorzugsweise 1,25 mm, um den Effekt irgendwelcher Herstell- oder Betriebsabweichungen zu minimieren.
Wieder mit Bezug auf 2 beinhaltet der Behälter 12 vorzugsweise auch optische Fenster für die optische in situ Abfragung der Reaktionsmischung in der Kammer 17. In der bevorzugten Ausführungsform sind die optischen Fenster die Seitenwände 19A, 19B des starren Rahmens 16. Die Seitenwände 19A, 19B sind optisch durchlässig, um eine Anregung der Reaktionsmischung in der Kammer 17 durch die Seitenwand 19A und die Erfassung von aus der Kammer 17 durch die Seitenwand 19B hindurch emittiertem Licht zu erlauben. Die Pfeile A bedeuten die Erleuchtungsstrahlen, die in die Kammer 17 durch die Seitenwand 19A eintreten, und die Pfeile B stehen für das emittierte Licht (beispielsweise eine fluoreszierende Emission von gekennzeichneten Analyten in der Reaktionsmischung), die die Kammer 17 durch die Seitenwand 19B verlassen.
Die Seitenwände 19A, 19B sind vorzugsweise voneinander winklig versetzt. Es wird normalerweise bevorzugt, dass die Wärme 19A, 19B voneinander um einen Winkel von ungefähr 90° versetzt sind. Ein 90°-Winkel zwischen den Anregungs- und den Erfassungswegen stellte sicher, dass eine minimale Menge von Anregungsstrahlung, die durch die Wand 19 eintritt, durch die Wand 19B austreten wird. Außerdem ermöglicht, der 90° Winkel, dass eine maximale Menge von emittiertem Licht, beispielsweise Fluoreszenz, durch die Wand 19B hindurch gesammelt wird. Die Wände 19A, 19B sind vorzugsweise miteinander verbunden, so dass sie einen V-förmigen Schnitt miteinander am Boden der Kammer 17 bilden. Alternativ brauchen die winkligen Wände 19A, 19B aber auch nicht direkt miteinander verbunden zu sein, sondern können auch durch einen dazwischen liegenden Bereich getrennt sein, wie beispielsweise eine andere Wand oder verschiedene mechanische oder fluidische Merkmale, die nicht mit der thermischen und optischen Leistungsfähigkeit des Behälters interferieren. Beispielsweise können sich die Wände 19A, 19B auch bei einer Öffnung treffen, die zu einem weiteren Bearbeitungsflächenbereich in Kommunikation mit der Kammer 17 führt, beispielsweise zu einem Flächenbereich für die integrierte Kapillar-Elektrophorese. In der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform erstreckt sich ein Positionierplättchen 27 von dem Rahmen 16 unterhalb des Schnittpunkts der Wände 19A, 19B. Das Positionierplättchen 27 wird dazu verwendet, den Behälter 12 geeignet in einem weiter unten mit Bezug auf die 8 beschriebenen Wärmeaustauschmodul zu positionieren.
Eine optimale optische Empfindlichkeit kann erzielt werden durch Maximieren der optischen Weglänge der Lichtstrahlen, die die gekennzeichneten Analyte in der Reaktionsmischung anregen, und des emittierten Lichts, welches erfasst wird, wie es gekennzeichnet wird durch die folgende Gleichung: I0Ii = C · L · A,wobei I₀ der Beleuchtungsausgang des emittierten Lichts in Volt, Photonen oder ähnlichem ist, C die Konzentration des zu erfassenden Analytes, I_i die Eingangsbeleuchtung, L die Pfadlänge und A die Eigen-Absorptivität des Farbstoffs, der zum Kennzeichnen des Analyts verwendet wird.
Das dünne flache Reaktionsgefäß 12 gemäß der vorliegenden Erfindung optimiert die Erfassungsempfindlichkeit durch Schaffen einer maximalen optischen Pfadlänge pro Volumeneinheit des Analytes. Mit Bezug auf 4 und 5 ist das Gefäß 12 vorzugsweise so aufgebaut, dass jede Seitenwand 19A, 19B, 20A, 20B der Kammer 17 eine Länge L zwischen 1 und 15 mm hat, die Kammer eine Breite W im Bereich von 1,4 bis 20 mm und eine Dicke im Bereich von 0,5 bis 5 mm hat und das Verhältnis der Breite W der Kammer zur Dicke T der Kammer zumindest 2:1 beträgt. Diese Parameter sind gegenwärtig bevorzugt, um ein Gefäß mit einer relativ großen optischen Pfadlänge durch die Kammer hindurch zu schaffen, beispielsweise durchschnittlich 1 bis 15 mm, während die Kammer immer noch ausreichend dünn bleibt, um eine extrem schnelle Erhitzung und Abkühlung der Reaktionsmischung in der Kammer zu ermöglichen. Die durchschnittliche optische Weglänge der Kammer 17 ist der Abstand von der Mitte der Seitenwand 19A bis zur Mitte der Kammer 17 plus der Abstand von der Mitte der Kammer 17 zur Mitte der Seitenwand 19B. Hier ist die Dicke T der Kammer 17 definiert als die Dicke der Kammer vor der Ausdehnung der Hauptwände nach außen, d.h. die Dicke T der Kammer ist definiert durch die Dicke des Rahmens 16.
Weiter bevorzugt ist das Gefäß 12 so aufgebaut, dass jede Seitenwand 19A, 19B, 20A, 20B der Kammer 17 eine Länge L im Bereich von 5 bis 12 mm hat, die Kammer eine Breite W im Bereich von 7 bis 17 mm und eine Dicke im Bereich von 0,5 bis 2 mm hat und das Verhältnis der Breite W der Kammer zur Dicke T der Kammer zumindest 4:1 beträgt. Diese Bereiche sind stärker bevorzugt, weil sie ein Gefäß schaffen, das sowohl eine große optische Pfadlänge (d.h. durchschnittlich 5 bis 12 mm) als auch eine große Volumenkapazität (im Bereich von 12 bis 100 Mikrolitern) hat, während die Kammer ausreichend dünn bleibt, um eine extrem schnelle Erhitzung und Abkühlung einer Reaktionsmischung zu ermöglichen. Die relativ große Volumenkapazität schafft eine gesteigerte Empfindlichkeit bei der Erfassung von Analyten mit geringer Konzentration wie beispielsweise Nukleinsäuren.
In der bevorzugten Ausführungsform hat das Reaktionsgefäß 12 eine diamantenförmige Kammer 17, definiert durch die Seitenwände 19A, 19B, 20A, 20B, die jeweils eine Länge von 10 mm haben; die Kammer 17 hat eine Dicke von 1 mm, definiert durch die Dicke des Rahmens 16, und eine Volumenkapazität von ca. 100 Mikrolitern. Dieses Reaktionsgefäß schafft eine relativ lange optische Pfadlänge von 10 mm durch die Kammer 17 hindurch. Außerdem ermöglicht die dünne Kammer eine extrem schnelle Erhitzung und/oder Abkühlung der Reaktionsmischung in der Kammer. Die Diamantenform der Kammer 17 hilft dabei, zu verhindern, dass Luftbläschen sich in der Kammer ausbilden, wenn diese mit der Reaktionsmischung befüllt wird, und unterstützt auch die optische Abfrage der Mischung.
Der Rahmen 16 besteht vorzugsweise aus einem optisch durchlässigen Material, beispielsweise einem Polycarbonat oder geklärtem Polypropylen, so dass die Seitenwände 19A, 19B, 20A, 20B optisch durchlässig sind. Hierin bedeutet der Ausdruck "optisch durchlässig", dass zumindest eine Lichtwellenlänge durch die Wände hindurchgelassen werden kann. In der bevorzugten Ausführungsform sind die optisch durchlässigen Wände 19A, 19B im wesentlichen transparent. Außerdem kann sich zumindest ein optisches Element an den optisch durchlässigen Seitenwänden 19A, 19B befinden. Die optischen Elemente können beispielsweise dazu ausgestaltet sein, das gesamte Volumen der Lösung zu maximieren, das durch eine Lichtquelle beleuchtet wird, das Anregungslicht auf einen spezifischen Bereich der Kammer 17 zu fokussieren oder möglichst viel Fluoreszenzsignal von einer möglichst großen Fraktion des Kammervolumens zu sammeln. In alternativen Ausführungsformen können die optischen Elemente Gitter zum Auswählen bestimmter Wellenlängen aufweisen, Filter, die nur bestimmte Wellenlängen durchlassen, oder farbige Linsen, um Filterfunktionen zu schaffen. Die Wandoberflächen können beschichtet sein oder Materialien wie beispielsweise Flüssigkeitskristall aufweisen zum Verbessern der Absorption bestimmter Wellenlängen. In der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform sind die optisch durchlässigen Wände 19A, 19B im wesentlichen klare, flache Fenster mit einer Dicke von ungefähr 1 mm.
Wie in 2 dargestellt, beinhalten die Seitenwände 20A, 20B vorzugsweise reflektive Flächen 21, die intern Licht reflektieren, das versucht, die Kammer 17 durch die Seitenwände 20A, 20B hindurch zu verlassen. Die reflektiven Flächen 21 sind so angeordnet, dass benachbarte Flächen winklig voneinander um ungefähr 90° versetzt sind. Außerdem definiert der Rahmen 16 offene Räume zwischen den Seitenwände 20A, 20B sowie Stützrippen 15. Die offenen Räume sind durch Umgebungsluft besetzt, die einen anderen Brechungsindex hat als das Material, das den Rahmen bildet (beispielsweise Plastik). Aufgrund des Unterschieds in den Brechungsindizes sind die reflektierenden Flächen 21 effektiv, um intern Licht zu reflektieren, das versucht, die Kammer durch die Wände 20A, 20B hindurch zu verlassen, und sie schaffen eine erhöhte Erfassung optischer Signale durch die Wände 19A, 19B hindurch. In der bevorzugten Ausführungsform definieren die optisch durchlässigen Seitenwände 19A, 19B den Bodenbereich der diamantenförmigen Kammer 17, und die retro-reflektiven Seitenwände 20A, 20B definieren den oberen Bereich der Kammer.
Der Reaktionsbehälter 12 kann in manuellen Operationen verwendet werden, die durch menschliche Techniker ausgeführt werden, oder in automatisierten Vorgängen, die durch Maschinen ausgeführt werden, beispielsweise Bestückungsautomaten. Wie in 1 dargestellt, beinhaltet für die manuellen Ausführungsformen der Behälter 12 vorzugsweise Fingergriffe 26 und eine Leine 24, die den Plungerkolben 22 bequem am Körper des Behälters 12 anbringt. Wie in 3 dargestellt, beinhaltet für die automatisierten Ausführungsformen die Plungerkolbenkappe 36 vorzugsweise eine sich verjüngende Eingriffsöffnung 46 zum Aufnehmen und Aufbauen einer Passung mit einem robotischen Arm oder einer Maschinenspitze (in 3 nicht dargestellt), um es so der Maschinenspitze zu ermöglichen, den Plungerkolben in dem Kanal zu platzieren. Die Eingriffsöffnung 46 hat vorzugsweise sich verjüngende Seitenwände zum Aufbauen einer Reibpassung mit der Maschinenspitze. Alternativ kann die Eingriffsöffnung dazu ausgestaltet sein, eine Vakuumpassung mit der Maschinenspitze aufzubauen. Die Plungerkolbenkappe 36 kann optional auch Ausrichteöffnungen 48A, 48B beinhalten, die von der Maschinenspitze auch dazu verwendet werden, die Plungerkolbenkappe 36 geeignet auszurichten, wenn der Plungerkolben in den Kanal hineingebracht wird, wie dies noch genauer mit Bezug auf die 25 beschrieben wird.
Ein bevorzugtes Verfahren zum Herstellen des Reaktionsbehälters 2 wird nun mit Bezug auf die 1 und 2 beschrieben. Der Reaktionsbehälter 12 kann hergestellt werden, indem zuerst der starre Rahmen 16 unter Verwendung bekannter Spritzgusstechniken hergestellt wird. Der Rahmen 16 wird vorzugsweise als einzelnes Element aus polymerischem Material, beispielsweise geklärtem Polypropylen, ausgeformt.
Nachdem der Rahmen 16 produziert worden ist, werden dünne flexible Materialbahnen auf ihre Größe zugeschnitten und an gegenüberliegenden Seiten des Rahmens 16 angesiegelt, um die Hauptwände 18 der Kammer 17 zu bilden.
Die Hauptwände 18 sind vorzugsweise gegossene oder extrudierte Filme aus polymerischem Material, beispielsweise Polypropylenfilme, die zugeschnitten sind und an dem Rahmen 16 angebracht sind unter Verwendung des nun folgenden Vorgangs. Ein erstes Stück Film wird über eine Seite des Bodenbereichs des Rahmens 16 hinüber platziert. Der Rahmen 16 beinhaltet vorzugsweise einen Klebebalken 47 zum Ausrichten der oberen Kante des Films. Der Film wird über den Bodenbereich des Rahmens 16 so hinüber platziert, dass die obere Kante des Films mit dem Klebebalken 47 ausgerichtet ist, und so, dass der Film den Bodenbereich des Rahmens 16 unterhalb des Klebebalkens 47 vollständig bedeckt. Der Film sollte größer sein als der Bodenbereich des Rahmens 16, so dass er leicht gehalten und flach über den Rahmen hinüber gestreckt werden kann. Der Film wird dann auf seine Größe zugeschnitten, so dass er zum Umriss des Rahmens passt, in dem der Bereich des Films, der den Rahmen bedeckt, an dem Rahmen verklemmt wird, und die Bereiche des Films, die sich nach jenseits des Umfangs des Rahmens erstreckten, mit beispielsweise einem Laser oder einer Matrize weggeschnitten werden. Der Film wird dann an dem Rahmen angeheftet, vorzugsweise mit einem Laser.
Der Film wird beispielsweise an den Rahmen 16 angesiegelt, vorzugsweise durch Heißsiegeln. Heißsiegeln wird gegenwärtig bevorzugt, weil es eine starke Versiegelung produziert, ohne potentielle Verunreinigungen in den Behältern einzubringen, wie es bei der Verwendung von Klebstoffen oder Lösungsmittel-Verbindungstechniken der Fall sein könnte. Heißsiegeln ist auch einfach und kostengünstig. Der Film sollte mindestens vollständig mit den Oberflächen der Seitenwände 19A, 19B, 20A, 20B versiegelt werden. Am besten wird der Film auch zusätzlich noch mit den Oberflächen der Stützrippen 15 und des Haftbalkens 47 versiegelt. Das heißt, Siegeln kann beispielsweise mit einer erhitzten Platte ausgeführt werden. Ein identischer Vorgang kann verwendet werden, um eine zweite Materialbahn zu zerschneiden und sie mit der gegenüberliegenden Seite des Rahmens 16 zu versiegeln, um die Kammer 17 zu vervollständigen.
Viele verschiedene Varianten sind bei dieser Herstellungsprozedur möglich. Beispielsweise wird in einer alternativen Ausführungsform der Film über den Bodenbereich des Rahmens 16 hinüber gestreckt und dann vor dem Zerschneiden des Films auf seine Größe mit dem Rahmen versiegelt. Nach dem Siegeln des Films auf den Rahmen werden die Bereiche des Films, die sich nach jenseits des Umfangs des Rahmens erstrecken, mit beispielsweise einem Laser oder einer Matrize weggeschnitten.
Der Plungerkolben 22 ist ebenfalls vorzugsweise aus einem polymerischem Material, vorzugsweise Polypropylen, unter Verwendung bekannter Spritzgusstechniken ausgeformt. Wie in 1 dargestellt, können der Rahmen 16, der Plungerkolben 22 und die Leine 24, die den Plungerkolben mit dem Rahmen verbindet, alle in der gleichen Form ausgeformt werden, so dass ein einstückiges Element entsteht. Diese Ausführungsform des Behälters ist besondere geeignet für die manuelle Verwendung, bei welcher ein menschlicher Bediener den Behälter befüllt und den Plungerkolben 22 in den Kanal 28 einbringt. Die Leine 24 stellt sicher, dass der Plungerkolben 22 nicht verloren geht oder auf den boden fällt. Alternativ kann, wie in 2 dargestellt, der Plungerkolben 22 separat von dem Rahmen 16 ausgeformt werden, so dass der Plungerkolben und der Rahmen separate Elemente sind. Diese Ausführungsform ist besonders geeignet für die automatische Verwendung des Behälters, bei welcher der Plungerkolben 22 in den Kanal 28 hinein durch eine automatisierte Maschine platziert wird.
Obwohl es gegenwärtig bevorzugt ist, den Rahmen 16 einstückig auszubilden, ist es auch möglich, den Rahmen aus mehreren Stücken herzustellen. Beispielsweise können die Seitenwände 19A, 19B, die die winkligen optischen Fenster bilden, aus Polycarbonat ausgeformt werden, was eine sehr gute optische Transparenz hat, während der Rest des Rahmens aus Polypropylen geformt wird, das weniger teuer und kompatibel mit PCR ist. Die separaten Stücke können in einem zweiten Schritt dann zusammengefügt werden. Beispielsweise können die Seitenwände 19A, 19B mit dem verbleibenden Bereich des Rahmens 16 pressgepasst und/oder verbunden werden. Die flexiblen Wände 18 können dann an gegenüberliegenden Seiten des Rahmens 16 angebracht werden, wie zuvor beschrieben.
Mit Bezug auf 5 können die Platten 50A, 50B aus verschiedenen thermisch leitfähigen Materialien gemacht sein, einschließlich Keramiken oder Metallen. Geeignete keramische Materialien beinhalten Aluminiumnitrid, Aluminiumoxid, Berylliumoxid und Siliziumnitrid. Andere Materialien, aus welchen die Platten gemacht sein können, beinhalten beispielsweise Galliumarsenid, Silizium, Siliziumnitrid, Siliziumdioxid, Quarz, Glas, Diamant, Polyacryle, Polyamide, Polycarbonate, Polyester, Polyimide, Vinylpolymere sowie halogenierte Vinylpolymere wie beispielsweise Polytetrafluorethylene. Andere mögliche Plattenmaterialien beinhalten Chrom/Aluminium, Superlegierungen, Zircalloy, Aluminium, Stahl, Gold, Silber, Kupfer, Tungsten, Molybdän, Tantal, Messing, Saphir, oder irgendeines der vielen anderen in der Technik erhältlichen keramischen, metallenen oder polymerischen Materialien.
Keramische Platten werden gegenwärtig bevorzugt, weil ihre Innenflächen bequem auf eine sehr hohe Glattheit für hohen Verschleißwiderstand, hohen chemischen Widerstand und guten thermischen Kontakt mit den flexiblen Wänden des Reaktionsbehälters bearbeitet werden können. Keramische Platten können auch sehr dünn sein, vorzugsweise zwischen ungefähr 0,6 und 1,3 mm, für eine geringe thermische Masse, um extrem schnelle Temperaturveränderungen zu ermöglichen. Eine Platte aus Keramik ist auch sowohl ein guter thermischer Leiter als auch ein elektrischer Isolator, so dass die Temperatur der Platte gut gesteuert werden kann unter Verwendung eines mit der Platte gekoppelten resistiven Heizelements.
Verschiedene thermische Elemente können verwendet werden, um die Platten 50A, 50B zu erhitzen und abzukühlen und so die Temperatur der Reaktionsmischungen der Kammer 17 zu steuern. Im allgemeinen beinhalten geeignete Heizelemente zum Erhitzen der Platte konduktive Heizer, Konvektionsheizer oder Strahlungsheizer. Beispiele von konduktiven Heizern beinhalten resistive oder induktive Heizelemente, die mit den Platten gekoppelt sind, beispielsweise Resistoren oder thermo-elektrische Einrichtungen. Geeignete Konvektionsheizer beinhalten Zwangsluftheizer oder Fluid-Wärmetauscher zum Strömenlassen von Fluiden an den Platten entlang. Geeignete Strahlungsheizer beinhalten Infrarot- oder Mikrowellenheizer. Auf gleiche Art und Weise können verschiedene Kühlelemente verwendet werden, um die Platten zu kühlen. Beispielsweise können verschiedene Konvektions-Kühlelemente verwendet werden, wie beispielsweise ein Lüfter, eine Peltier-Einrichtung, eine Kühleinrichtung, oder eine Strahldüse zum Strömenlassen von Kühlfluiden entlang den Oberflächen der Platten. Alternativ können verschiedene konduktive Kühlelemente verwendet werden, beispielsweise eine Wärmesenke, beispielsweise ein gekühlter Metallblock, in direktem Kontakt mit den Platten.
Mit Bezug auf 6 hat in der bevorzugten Ausführungsform jede Platte 50 ein resistives Heizelement 56, das an ihrer Außenfläche vorgesehen ist. Das resistive Heizelement 56 ist vorzugsweise ein dicker oder dünner Film und kann direkt auf jede Platte 50 siebgedruckt werden, insbesondere Platten, die ein keramisches Material wie beispielsweise Aluminiumnitrid oder Aluminiumoxid aufweisen. Das Siebdrucken schafft eine hohe Verlässlichkeit und einen geringen Querschnitt für den effizienten Transfer von Wärme in die Reaktionskammer hinein. Dicke oder dünne Filmresistoren mit verschiedenen geometrischen Mustern können auf den äußeren Oberflächen der Platten vorgesehen werden, um eine gleichmäßigere Erhitzung zu schaffen, beispielsweise indem dichtere Resistoren an den Enden und dünnere Resistoren in der Mitte vorgesehen werden. Obwohl es gegenwärtig bevorzugt wird, ein Heizelement an der äußeren Oberfläche jeder Platte vorzusehen, kann ein Heizelement auch alternativ innerhalb jeder Platte eingebacken werden, insbesondere wenn die Platten keramisch sind. Das Heizelement 56 kann Metalle, Tungsten, Polysilizium oder andere Materialien aufweisen, die warm werden, wenn ein Spannungsunterschied über das Material hinüber angelegt wird.
Das Heizelement 56 hat zwei Enden, die mit jeweiligen Kontakten 54 verbunden sind, die ihrerseits mit einer Spannungsquelle (in 6 nicht dargestellt) verbunden sind, um einen Strom dazu zu bringen, durch das Heizelement hindurch zu fließen. Jede Platte 50 hat vorzugsweise auch einen Temperatursensor 52 wie beispielsweise ein Thermoelement, einen Thermistor oder ein RTD, der über zwei Spuren 53 mit jeweiligen Kontakten 54 verbunden ist. Der Temperatursensor 52 kann dazu verwendet werden, die Temperatur der Platte 50 in einer gesteuerten Rückführschleife zu überwachen.
Es ist wichtig, dass die Platten eine geringe thermische Masse haben, um ein schnelles Erhitzen und Abkühlen der Platten zu ermöglichen. Insbesondere ist gegenwärtig bevorzugt, dass jede der Platten eine thermische masse von weniger als ungefähr 5 J/°C hat, noch besser weniger als 3 J/°C und am besten weniger als 1 J/°C. Der Ausdruck thermische Masse einer Platte ist hier definiert als die spezifische Wärme der Platte multipliziert mit der Masse der Platte. Außerdem sollte jede Platte groß genug sein, um eine jeweilige Hauptwand der Reaktionskammer abzudecken. In der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsform hat beispielsweise jede der Platten eine Breite X im Bereich von 2 bis 22 mm, eine Länge Y im Bereich von 2 bis 22 mm und eine Dicke im Bereich von 0,5 bis 5 mm. Die Breite X und die Länge Y der Platte ist jeweils ausgewählt, dass sie geringfügig größer ist als die Breite und Länge der Reaktionskammer. Außerdem hat jede Platte vorzugsweise einen winkligen Bodenbereich, der zu der Geometrie des Bodenbereichs der Reaktionskammer passt, wie dies noch mit Bezug auf die 12 beschrieben wird. Auch ist in der bevorzugten Ausführungsform jede der Platten aus Aluminiumnitrid mit einer spezifischen Wärme von ungefähr 0,75 J/g °C gemacht. Die Masse jeder Platte liegt vorzugsweise im Bereich von ungefähr 0,005 bis 5,0 g, so dass jede Platte eine thermische Masse im Bereich von 0,00375 bis 3,75 J/°C hat.
8 ist eine schematische Seitenansicht eines Wärmetauschermoduls 60, in welches hinein der Reaktionsbehälter 12 für die thermische Bearbeitung und optische Abfrage eingesetzt wird. Das Modul 60 beinhaltet vorzugsweise ein Gehäuse 62 zum Halten der verschiedenen Komponenten des Moduls. Das Modul 60 hat auch thermisch leitende Platten 50, die oben beschrieben sind. Das Gehäuse 62 beinhaltet einen Schlitz (in 8 nicht dargestellt), oberhalb der Platten 50, so dass die Reaktionskammer des Behälters 12 durch den Schlitz hindurch und zwischen die Platten eingebracht werden kann. Das Wärmetauschermodul 60 beinhaltet vorzugsweise auch ein Kühlsystem, wie beispielsweise einen Lüfter 66. Der Lüfter 66 ist so positioniert, dass er Kühlluft an den Oberflächen der Platten 50 entlang bläst, um die Platten abzukühlen und so auch die Reaktionsmischung in dem Behälter 12. Das Gehäuse 62 definiert vorzugsweise Kanäle zum Richten der Kühlluft an den Platten 50 vorbei und aus dem Modul 60 heraus.
Das Wärmetauschermodul 60 beinhaltet außerdem eine optische Anregungsanordnung 68 und eine optische Erfassungsanordnung 70 zum optischen Abfragen der Reaktionsmischung in dem Behälter 12. Die Anregungsanordnung 68 beinhaltet eine erste Leiterplatte 72 zum Halten ihrer elektronischen Komponenten, und die Erfassungsanordnung 68 beinhaltet eine zweite Leiterplatte 74 zum Halten ihrer elektronischen Komponenten. Die Anregungsanordnung 68 beinhaltet zumindest eine Lichtquelle wie beispielsweise eine LED zum Anregen fluoreszierend gekennzeichneter Analyte in dem Behälter 12. Die Anregungsanordnung 68 beinhaltet auch zumindest eine Linse zum Kollimieren des Lichts von den Lichtquellen sowie Filter zum Auswählen der Anregungs-Wellenlängenbereiche, die von Interesse sind. Die Erfassungsanordnung 70 beinhaltet zumindest einen Erfasser wie beispielsweise eine Photodiode zum Erfassen des von dem Behälter 12 emittierten Lichts. Die Erfassungsanordnung 70 beinhaltet auch zumindest eine Linse zum Fokussieren und Kollimieren des emittierten Lichts sowie Filter zum Auswählen der Emissions-Wellenbereiche, die von Interesse sind. Die spezifischen Komponenten der Optikanordnungen 68, 70 sind später noch genauer mit Bezug auf die 16–19 beschrieben.
Die Optikanordnungen 68, 70 sind in dem Gehäuse 62 so positioniert, dass, wenn die Kammer des Behälters 12 zwischen den Platten 50 eingesetzt ist, die erste Optikanordnung 68 in optischer Verbindung mit der Kammer 17 durch die optisch durchlässige Seitenwand 19A (siehe 2) ist und die zweite Optikanordnung 70 in optischer Verbindung mit der Kammer durch die optisch durchlässige Seitenwand 19B (2). In der bevorzugten Ausführungsform sind die Optikanordnungen 68, 70 in optischer Verbindung mit den optisch durchlässigen Seitenwänden dadurch platziert, dass die Optikanordnungen 68, 70 einfach neben den Bodenkanten der Platten 50 platziert sind, so dass, wenn die Kammer des Behälters zwischen den Platten platziert ist, die Optikanordnungen 68, 70 diese Seitenwände direkt kontaktieren oder sich nahe daran befinden.
Wie in 12 dargestellt, hat der Behälter 12 vorzugsweise einen gewinkelten Bodenbereich (beispielsweise dreieckig), der durch die optisch durchlässigen Seitenwände 19A, 19B gebildet wird. Jede der Platten 50A, 508 hat einen entsprechend gestalteten Bodenbereich. Der Bodenbereich der ersten Platte 50A hat eine erste Bodenkante 98A und eine zweiten Bodenkante 98B. In gleicher Art und Weise hat der Bodenbereich der zweiten Platte 50B eine erste Bodenkante 99A und eine zweite Bodenkante 99B. Die ersten und die zweiten Bodenkanten jeder Platte sind vorzugsweise voneinander um den gleichen Winkel versetzt, um den die Seitenwände 19A, 19B voneinander versetzt sind (beispielsweise 90°). Außerdem sind die Platten 50A, 50B vorzugsweise dazu positioniert, die Kammer des Behälters 12 zwischen sich aufzunehmen, so dass die erste Seitenwand 19A im wesentlichen angrenzend an und parallel zu jeder der ersten Bodenkanten 98A, 99A positioniert ist, so dass die zweite Seitenwand 19B im wesentlichen angrenzend an und parallel zu jeder der zweiten Bodenkanten 28B, 99B positioniert ist. Diese Anordnung ermöglicht einen einfachen optischen Zugang zu den optisch durchlässigen Seitenwänden 19A, 19B und so zu der Kammer des Behälters 12.
Die Seitenwände 19A, 19B können fluchtend mit den Kanten der Platten 50A, 50B positioniert sein, oder noch besser können die Seitenwände 19A, 19B so positioniert sein, dass sie geringfügig nach jenseits der Kanten der Platten hervorstehen. Wie es weiter unten mit Bezug auf die 16-19 beschrieben ist, beinhaltet jede Optikanordnung vorzugsweise eine Linse, die physikalisch eine jeweilige der Seitenwände 19A, 19B kontaktiert. Es wird bevorzugt, dass die Seitenwände 19A, 19B geringfügig (beispielsweise um 0,02 bis 0,3 mm) nach jenseits der Kanten der Platten 50A, 50B hervorstehen, so dass die Platten die Linsen nicht physikalisch kontaktieren und beschädigen. Ein Gel oder Fluid kann optional dazu verwendet werden, die optische Verbindung zwischen jeder Optikanordnung und den Seitenwänden 19A, 19B aufzubauen oder zu verbessern. Das Gel oder Fluid sollte einen Brechungsindex nahe den Brechungsindizes der Elemente haben, die es koppelt.
Wieder mit Bezug auf die 8 sind die Optikanordnungen 68, 70 vorzugsweise dazu angeordnet, einen 90° Winkel zwischen dem Anregungs- und dem Erfassungsweg zu bilden. Der 90° Winkel zwischen dem Anregungs- und dem Erfassungsweg stellt sicher, dass eine minimale Menge der Anregungsstrahlung, die durch die erste Seitenwand der Kammer eintritt, durch die zweite Seitenwand wieder austritt. Außerdem ermöglicht der 90° Winkel, dass eine maximale Menge emittierter Strahlung durch die zweite Seitenwand hindurch gesammelt wird. In der bevorzugten Ausführungsform beinhaltet der Behälter 12 ein Positionierplättchen 27 (siehe 2), das in einen Schlitz passt, der zwischen den Optikanordnungen 68, 70 ausgeformt ist, um eine geeignete Positionierung des Behälters 12 für die optischen Erfassung sicherzustellen. Für die verbesserte Erfassung beinhaltet das Modul 60 vorzugsweise auch einen lichtdichten Deckel (nicht dargestellt), der über den oberen Bereich des Behälters 12 hinüber platziert ist und bezüglich des Gehäuses 62 lichtdicht gemacht ist, nachdem der Behälter zwischen die Platten 50 eingebracht worden ist.
Obwohl es gegenwärtig bevorzugt wird, die Optikanordnungen 68, 70 neben den Bodenkanten der Platten 50 anzuordnen, sind viele andere Anordnungen möglich. Beispielsweise kann die optische Verbindung aufgebaut werden zwischen den Optikanordnungen 68, 70 und den Wänden des Behälters 12 über Lichtleiter, Lichtröhren, Wellenleiter oder ähnliche Einrichtungen. Ein Vorteil dieser Einrichtungen ist, dass sie die Notwendigkeit vermeiden, die Optikanordnungen 68, 70 physikalisch angrenzend an die Platten 50 vorzusehen. Dies belässt mehr Platz um die Platten herum, in welchem Kühlluft oder Kühlmittel zirkulieren kann, so dass die Kühlung verbessert werden kann.
Das Wärmetauschmodul 60 beinhaltet auch eine PC-Platte 76 zum Halten der elektronischen Komponenten des Moduls sowie einen Kantenverbinder 80 zum Verbinden des Moduls 60 mit einem Basisinstrument, wie es noch genauer mit Bezug auf die 22 beschrieben wird. Die als Elemente und Temperatursensoren auf den Platten 50 sowie die optischen Platten 72, 74 sind mit der PC-Platte 76 über Flexkabel verbunden (in 8 aus Gründen der Klarheit der Veranschaulichung nicht dargestellt). Das Modul 60 kann auch eine Erdungsspur 68 zum Abschirmen des optischen Erfassungskreises beinhalten. Das Modul 60 beinhaltet vorzugsweise auch einen Anzeiger, wie beispielsweise eine LED 64, um den Benutzer den momentanen Status des Moduls anzuzeigen, beispielsweise "Bereit zum Aufnehmen einer Probe", "Bereit zum Einbringen des Reagens", "Heizen", "Abkühlen", "Fertig" oder "Fehler".
Das Gehäuse 62 kann aus einem starren Hochleistungsplastik oder anderem herkömmlichen Material gemacht sein. Die hauptsächlichen Funktionen des Gehäuses 62 sind, einen Rahmen zum Halten der Platten 50, der Optikanordnungen 68, 70, der Lüfters 66 und der PC-Platte 76 zu schaffen. Das Gehäuse 62 bietet vorzugsweise auch Durchflusskanäle und Öffnungen zum Richten von Kühlluft von dem Lüfter 66 über die Oberflächen der Platten 50 hinüber und aus dem Gehäuse heraus. In der bevorzugten Ausführungsform weist das Gehäuse 62 komplementäre Elemente auf (nur eines ist in der schematischen Seitenansicht der 1 dargestellt), die zusammenpassen, um die Komponenten des Moduls 60 zwischen sich einzuschließen.
Die gegenüberliegenden Platten 50 sind so positioniert, dass sie die Kammer des Behälters 12 zwischen sich aufnehmen, so dass die flexiblen Hauptwände der Kammer, die die inneren Oberflächen der Platten kontaktieren und sich an diese anpassen. Gegenwärtig wird bevorzugt, dass die Platten 50 in einer gegenüberliegenden Beziehung zueinander unter Verwendung von beispielsweise Halterungen, Stützen oder Rückhaltern gehalten werden. Alternativ können die Platten 50 auch zueinander hin federbelastet sein, wie in der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 98/38487 beschrieben, deren Offenbarung hierin durch Bezug aufgenommen wird. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung wird eine der Platten in einer festen Position gehalten, und die andere Platte ist in Richtung der ersten Platte federbelastet. Wenn zumindest eine Feder verwendet wird, um die Platten zueinander hin zu belasten, sollten die Federn ausreichend steif sein, um sicherzustellen, dass die Platten gegen die flexiblen Wände des Behälters mit einer ausreichenden Kraft gedrückt werden, so dass sich die Wände an die inneren Oberflächen der Platten anpassen.
Die 9 und 10 veranschaulichen eine bevorzugte Stützstruktur 61 zum Halten der Platten 50A, 50B in einer einander gegenüberliegenden Beziehung. 9 zeigt eine explodierte Ansicht der Struktur, und 10 zeigt eine zusammengefügte Ansicht der Struktur. Aus Gründen einer klaren Veranschaulichung sind die Stützstruktur 81 und die Platten 50A, 50B bezüglich ihrer normalen Orientierung in dem Wärmetauschmodul der 8 verkehrt herum dargestellt. Mit Bezug auf 9 beinhaltet die Stützstruktur 81 eine Anbringplatte 82, in der ein Schlitz 83 ausgeformt ist. Der Schlitz 83 ist ausreichend groß, damit die Kammer des Behälters durch ihn hindurch eingebracht werden kann. Beabstandungsstangen 84A, 84B erstrecken sich von der Anbringplatte 82 auf gegenüberliegenden Seiten des Schlitzes 83. Auf entgegengesetzten Seiten der Beabstandungsstange 84A sind Einkerbungen 86 ausgeformt (nur eine Seite ist in der isometrischen Darstellung in 9 dargestellt), und auf gegenüberliegenden Seiten der Beabstandungsstange 84B sind Einkerbungen 87 ausgeformt (nur eine Seite ist in der isometrischen Ansicht der 9 dargestellt). Die Einkerbungen 86, 87 in den Beabstandungsstangen dienen dazu, die Kanten der Platten 50A, 50B aufzunehmen. Um die Struktur zusammenzufügen, werden die Platten 50A, 50B gegen gegenüberliegende Seiten der Beabstandungsstangen 84A, 84B platziert, so dass die Kanten der Platten in den Einkerbungen 86, 87 positioniert sind. Die Kanten der Platten werden kann in den Einkerbungen unter Verwendung eines geeigneten Rückhaltemittels gehalten. In der bevorzugten Ausführungsform werden die Platten durch Rückhalteclips 88A, 88B gehalten. Alternativ können die Platten 50A, 50B aber auch durch Klebeverbindungen, Schrauben, Bolzen, Klemmen oder andere geeignete Mittel gehalten werden.
Die Anbringplatte 82 und die Beabstandungsstangen 84A, 84B sind vorzugsweise integral als einzelnes geformtes Element aus Plastik ausgebildet. Das Plastik sollte ein Hochtemperatur-Plastik sein, wie beispielsweise Polyetherimid, das sich nicht verformt oder sogar schmilzt, wenn die Platten 50A, 50B erhitzt werden. Die Rückhalteclips 84A, 84B bestehen vorzugsweise aus rostfreiem Stahl. Die Anbringplatte 82 kann optional auch Einkerbungen 82A, 82b zum Aufnehmen jeweiliger Flexkabel 90A, 90B beinhalten, die die Heizelemente und die Temperatursensoren, die an den Platten 50A, 50B vorgesehen sind, mit der PC-Platte 76 des Wärmetauschmoduls 60 (8) verbinden. Der Bereich der Flexkabel 90A angrenzend an die Platte 50A wird in der Einkerbung 92A durch ein Stück Klebeband 94A gehalten, und der Bereich der Flexkabel 90B angrenzend an die Platte 50B wird in der Einkerbung 92B durch ein Stück Klebeband 94B gehalten.
11 ist eine isometrische Ansicht der zusammengefügten Stützstruktur 81. Die Anbringplatte 82 beinhaltet vorzugsweise Plättchen 96, die sich von gegenüberliegenden Seiten der Platte 82 erstrecken, um die Struktur 81 an dem Gehäuse des Wärmetauschmoduls zu sichern. Wieder mit Bezug auf die 8 beinhaltet das Gehäuse 62 vorzugsweise Schlitze zum Aufnehmen der Plättchen, um die Anbringplatte 82 sicher an ihrer Stelle zu halten. Alternativ kann die Anbringplatte 82 auch an dem Gehäuse 62 unter Verwendung beispielsweise einer Klebeverbindung, Schrauben, Bolzen, Klemmen oder anderer herkömmlicher Mittel für die Anbringung angebracht werden.
Wieder mit Bezug auf 9, hält die Stützstruktur 81 vorzugsweise die Platten 50A, 50B so, dass ihre Innenflächen sehr geringfügig zueinander hin gewinkelt sind. In der bevorzugten Ausführungsform hat jede der Beabstandungsstangen 84A, 84b eine Wand 89, die sich geringfügig verjüngt, so dass, wenn die Platten 50A, 50B gegen gegenüberliegende Seiten der Wand gedrückt werden, die Innenflächen der Platten geringfügig zueinander hin gewinkelt sind. Wie in 5 dargestellt, sind die Innenflächen der Platten 50A, 50B zueinander hin gewinkelt, so dass sie einen geringfügig V-förmigen Schlitz bilden, in welchen hinein die Kammer 17 eingebracht wird. Der Betrag, um welchen die Innenflächen zueinander hin gewinkelt sind, ist sehr gering, vorzugsweise ungefähr 1° von der Parallelen aus. Die Oberflächen sind zueinander hin so gewinkelt, dass vor dem Einbringen der Kammer 17 zwischen den Platten 50A, 50B die Böden der Platten geringfügig näher aneinander sind als die oberen Bereiche. Diese leichte Winklung der inneren Oberflächen ermöglicht es, die Kammer 17 des Behälters einfacher zwischen die Platten einzubringen und sie herauszunehmen. Alternativ könnten die Innenflächen der Platten 50A, 50B auch parallel zueinander gehalten werden, aber das Einbringen und Entfernen des Behälters 12 wäre dann schwieriger.
Außerdem sind die Innenflächen der Platten 50A, 50B vorzugsweise voneinander um einen Abstand beabstandet, der gleich der Dicke des Rahmens 16 ist. In Ausführungsformen, in welchen die inneren Oberflächen zueinander hin gewinkelt sind, sind die Mitten der Innenflächen vorzugsweise um einen Abstand beabstandet, der gleich der Dicke des Rahmens 16 ist, und die Böden der Platten sind anfänglich um einen Abstand beabstandet, der geringfügig kleiner ist als die Dicke des Rahmens 16. Wenn die Kammer 17 zwischen den Platten 50A, 50B eingebracht ist, zwingt der starre Rahmen 16 die Bodenbereiche der Platten voneinander weg, so dass die Kammer 17 fest sandwichartig zwischen den Platten gehalten ist. Der Abstand, um den die Platten 50A, 50B durch den Rahmen 16 voneinander weg gekeilt werden, ist normalerweise sehr gering, beispielsweise ungefähr 0,035 mm, wenn die Dicke des Rahmens 1 mm beträgt und die Innenflächen zueinander hin um 1° gewinkelt sind.
Mit Bezug auf 10 sollten die Rückhalteclips 88A, 88B ausreichen flexibel sein, um diese geringfügige Auswärtsbewegung der Platten 50A, 50B aufzunehmen und die Platten dennoch steif innerhalb der Ausnehmungen in den Abstandsstangen 84A, 84B während des Einbringens und Entfernens des Behälters zu halten. Das Verkeilen des Behälters zwischen den Platten 50A, 50B schafft eine anfängliche Vorbelastung gegen die Kammer und stellt sicher, dass die flexiblen Hauptwände der Kammer, wenn sie unter Druck gesetzt werden, einen guten thermischen Kontakt mit den Innenflächen der Platten aufbauen.
Wieder mit Bezug auf 8 können, um den Betrag zu beschränken, um den die Platten 50 beim Unterdrucksetzen des Behälters 12 auseinandergespreizt werden können, Anschläge in die Gehäuse der Optikanordnungen 68, 70 eingeformt sein. Wie in 13 dargestellt, beinhaltet das Gehäuse 221 der Optikanordnung 70 klauenartige Anschläge 247A, 247B, die sich auswärts von dem Gehäuse aus erstrecken. Wie in 14 dargestellt, ist das Gehäuse 221 so positioniert, dass die Bodenkanten der Platten 50A, 50B zwischen den Anschlägen 247A, 247B eingesetzt sind. Die Anschläge 247A, 247B verhindern so, dass die Platten 50A, 50B weiter als um einen vorbestimmten maximalen Abstand voneinander weggespreizt werden. Obwohl dies in 14 nicht dargestellt ist aus Gründen der Klarheit, hat die Optikanordnung 68 (siehe 8) ein Gehäuse mit entsprechenden Anschlägen, um zu verhindern, dass die anderen Hälften der Platten weiter auseinandergespreizt werden als der vorbestimmte maximale Abstand. Wieder mit Bezug auf 14, sollte der maximale Abstand, um den sich die inneren Oberflächen der Platten 50A, 50B aufgrund der Anschläge 247A, 247B voneinander entfernen können, gut zu der Dicke des Rahmens 16 passen. Vorzugsweise ist der maximale Abstand der inneren Oberflächen der Platten 50A, 50B geringfügig größer als die Dicke des Rahmens 16, um Toleranz-Variationen in dem Behälter 12 und den Platten 50A, 50B aufzunehmen. Beispielsweise ist der maximale Abstand vorzugsweise ungefähr 0,1 bis 0,3 mm größer als die Dicke des Rahmens 16.
Die 15A und 15B zeigen die fluoreszierenden Anregungs- bzw. Emissionsspektren von vier fluoreszierenden Farbstoffen, die von Interesse sind. Diese Farbstoffe sind fluoreszierende Standard-Farbstoffe, die mit der TaqMan^® Chemie (erhältlich von der Perkin-Elmer Corporation, Foster City, Kalifornien) verwendet werden und unter ihren Acronymen FAM, TET, TAMRA, und ROX wohlbekannt sind. Obwohl die bevorzugte Ausführungsform mit Bezug auf diese vier Farbstoffe beschrieben wird, ist die Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung selbstverständlich nicht auf diese besondere Farbstoffe oder die TaqMan^®-Chemie beschränkt. Die Vorrichtung kann mit allen fluoreszierenden Farbstoffen verwendet werden oder mit interkulierenden Farbstoffen wie SYBRGreen^TM oder Ethidiumbromid. Solche Farbstoffe sind von verschiedenen, gut bekannten Zulieferern kommerziell erhältlich. Fluoreszierende Farbstoffe und Kennzeichnungs-Chemien zum Kennzeichnen von Analyten in einer Reaktionsmischung sind in der Technik wohlbekannt und brauchen hier nicht weiter diskutiert zu werden. Obwohl gegenwärtig die Fluoreszenzerfassung bevorzugt ist, ist die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung nicht auf die Erfassung auf der Grundlage von fluoreszierenden Kennzeichen beschränkt. Die Vorrichtung kann auf eine Erfassung auf der Grundlage von phosphoreszierenden Kennzeichen, chemolumineszierenden Kennzeichen oder elektrochemolumineszierenden Kennzeichen anwendbar sein.
Wie in 15A dargestellt, sind die Anregungsspektrenkurven für FAM, TET, TAMRA und ROX typischerweise sehr breit an der Basis, jedoch schärfer an den Spitzen. Wie in 15B dargestellt, sind die entsprechenden Emissionsspektrenkurven für die gleichen Farbstoffe auch sehr breit an der Basis und schärfer an den Spitzen. Daher haben diese Farbstoffe stark überlappende Merkmale in sowohl ihren Anregungsspektren als auch ihren Emissionsspektren. Die überlappenden Merkmale haben es traditionell schwierig gemacht, das fluoreszierende Signal eines Farbstoffs von einem anderen zu unterscheiden, wenn mehrere Farbstoffe verwendet werden, um unterschiedliche Analyte in einer Reaktionsmischung zu kennzeichnen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden mehrere Lichtquellen verwendet, um Anregungsstrahlen auf die Farbstoffe in mehreren Anregungs-Wellenlängenbereichen zu richten. Jede Lichtquelle schafft Anregungslicht in einem Wellenlängenbereich, der an den Spitzenanregungsbereich eine der Farbstoffe angepasst ist. In der bevorzugten Ausführungsform sind die Lichtquellen blaue und Grüne LEDs. 15C zeigt die Auswirkungen des Filterns der Ausgänge der blauen und grünen LEDs, um im wesentlichen bestimmte Anregungs-Wellenlängenbereiche zu schaffen. Typische blaue und grüne LEDs haben eine wesentliche Überlappung im Bereich von ungefähr 480 bis 530 nm. Durch die Filterfunktion der vorliegenden Erfindung wird das Licht der blauen LED auf einen Bereich von ungefähr 450 bis 495 nm gefiltert, so dass es zu der relativen Anregungsspitze für FAM passt. Das Licht der grünen LED wird auf einen ersten Bereich von 495 bis 527 Nahtmaterial gefiltert, entsprechend der Anregungsspitze für TET, auf einen zweiten Bereich von 527 bis 555 nm, entsprechend er Anregungsspitze für TAMRA, und auf einen dritten Bereich von 555 bis 593 nm, entsprechend der Anregungsspitze für ROX.
15D zeigt die Effekte des Filterns von Licht (fluoreszierende Emission), das von jedem der vier Farbstoffe emittiert wird, um bestimmte Emissions-Wellenlängenbereiche zu bilden. Wie zuvor in 15B dargestellt, sind die fluoreszierenden Emissionen der Farbstoffe vor dem Filtern sphärisch diffus mit überlappenden spektralen Wandbreiten, was es schwierig macht, die fluoreszierende Ausgabe eines Farbstoffs von einer anderen zu unterscheiden. Wie in 15D dargestellt, werden durch Filtern der fluoreszierenden ausgaben der Farbstoffe in im wesentlichen bestimmte Wellenlängenbereiche eine Reihe von relativ schmalen Spitzen (Erfassungsfenstern) erhalten, wodurch es möglich wird, die fluoreszierenden Ausgaben von unterschiedlichen Farbstoffen zu unterscheiden, wodurch die Erfassung einer Anzahl von unterschiedlichen fluoreszierend gekennzeichneten Analyten in einer Reaktionsmischung möglich wird.
16 ist eine schematische Draufsicht der optischen Anregungsanordnung 68. Die Anordnung 68 ist angrenzend an das Reaktionsgefäß 12 positioniert, um Anregungsstrahlen auf die Reaktionsmischung in der Kammer 17 zu übertragen. 17 ist eine Explosionsansicht der Anregungsanordnung 68. Wie in den 16 bis 17 dargestellt, beinhaltet die Anordnung 68 ein Gehäuse 219 zum Aufnehmen von verschiedenen Komponenten der Anordnung. Das Gehäuse 219 beinhaltet Anschläge 245A, 245B zum Beschränken des maximalen Abstands der thermischen Platten, wie zuvor mit Bezug auf die 8 und 14 diskutiert. Das Gehäuse 219 weist vorzugsweise zumindest ein geformtes Stück aus Plastik auf. In der bevorzugten Ausführungsform ist das Gehäuse 219 ein mehrteiliges Gehäuse, das aus drei Gehäuseelementen 220A, B und C besteht. Das obere und das untere Gehäuseelement 220A und C sind vorzugsweise komplementäre Teile, die zusammengekoppelt werden und in das Gehäuseelement 220B schnappgepasst werden.
In dieser Ausführungsform werden die Gehäuseelement 220A und C durch Schrauben 214 zusammengehalten. In alternativen Ausführungsformen kann das gesamte Gehäuse 219 ein einstückiges Gehäuse sein, welches ein hineingleitendes optisches Paket aufnimmt.
Das unter Gehäuseelement 220C beinhaltet ein optische Fenster 235, in welches eine zylindrische Stangenlinse 215 platziert worden ist, um Anregungsstrahlen in die Kammer 17 hinein zu fokussieren. Im allgemeinen kann das optische Fenster 235 einfach eine Öffnung in dem Gehäuse aufweisen, durch welche hindurch Anregungsstrahlen zu der Kammer 17 übertragen werden können. Das optische Fenster kann optional ein optisch durchlässiges oder durchlässiges stück aus Glas oder Plastik beinhalten, das als Fensterscheibe dient, oder, wie in der bevorzugten Ausführungsform, eine Linse zum Fokussieren von Anregungsstrahlen. Die Linse 215 kontaktiert vorzugsweise eine der optisch durchlässigen Seitenwände der Kammer 17 direkt.
Die optische Anordnung 68 beinhaltet auch vier Lichtquellen, vorzugsweise LEDs 100A bis D, zum Übertragen von Anregungsstrahlen durch die Linse 215 hindurch auf die Reaktionsmischung in der Kammer 17. Im allgemeinen kann jede Lichtquelle einen Laser aufweisen, eine Glühlampe oder eine LED. In der bevorzugten Ausführungsform weist jede Lichtquelle ein Paar von direktionalen LEDs auf. Insbesondere sind die vier Lichtquellen in 16–17 vorzugsweise ein erstes Paar von grünen LEDs 100A, ein zweites Paar von grünen LEDs 100B, ein Paar von blauen LEDs 100C sowie ein drittes Paar von grünen LEDs 100D. Die LEDs empfangen Energie durch Leitungen 201, welche mit einer Energiequelle (nicht in den 16 und 17 dargestellt) verbunden sind. Die LEDs sind an der optischen Leiterplatte 72 angebracht, welche an der Rückseite des Gehäuseelements 220B befestigt ist, so dass die LEDs in dem Gehäuse fest angebracht sind. Die optische Leiterplatte 72 ist mit der Haupt-PC-Platte des Wärmetauschermoduls (in 8 dargestellt) über das Flexkabel 103 verbunden.
Die optische Anordnung 68 beinhaltet weiter einen Satz von Filtern und Linsen, die in dem Gehäuse 219 angeordnet sind, um die von den LEDs erzeugten Anregungsstrahlen zu filtern, so dass jeder der Strahlen, der auf die Kammer 17 übertragen wird, einen bestimmten Anregungs-Wellenlängenbereich hat. Wie in 17 dargestellt, beinhaltet das untere Gehäuseelement 220C vorzugsweise Wände 202, welche separate Anregungskanäle in dem Gehäuse ausbilden, um ein potentielles Nebensprechen zwischen den unterschiedlichen Paaren von LEDs zu reduzieren. Die Wände 202 beinhalten vorzugsweise Schlitze zum Aufnehmen und Festhalten der Filter und Linsen. Die Filter und Linsen können auch in dem Gehäuse fest angebracht sein mittels allein eines Klebstoffs, oder stärker bevorzugt mit einem Klebstoff in Kombination mit Schlitzen in dem Gehäuse.
Mit Bezug auf 16 können die Filter in der optischen Anordnung 68 so ausgewählt werden, dass Anregungsstrahlen für die Reaktionsmischung in der Kammer 17 in jedem gewünschten Anregungs-Wellenlängenbereich geschaffen werden. Die optische Anordnung 68 kann daher mit jedem fluoreszierenden, phosphoreszierenden, chemolumineszierenden oder elektrochemolumineszierenden Kennzeichen von Interesse verwendet werden. Aus Gründen der Darstellung wird nun eine spezifische Ausführungsform der Anordnung 68 beschrieben, in welcher die Anordnung ausgestaltet ist, um Anregungsstrahlen entsprechend den Spitzen-Anregungs-Wellenlängenbereichen FAM, TAMRA, TET und ROX zu schaffen.
In dieser Ausführungsform ist ein Paar von 593 nm Tiefpassfiltern 203 vor grünen LEDs 100A positioniert, ein Paar von 555 nm Tiefpassfiltern 205 ist vor grünen LEDs 100B positioniert, ein Paar von 495 nm Tiefpassfiltern 205 ist vor blauen LEDs 100C positioniert, und ein Paar von 527 nm Tiefpassfiltern 206 ist vor grünen LEDs 100D positioniert.
Obwohl es gegenwärtig bevorzugt ist, ein Paar von Tiefpassfiltern vor jedem Paar von LEDs für eine doppelt Filterung von Anregungsstrahlen zu positionieren, kann in alternativen Ausführungsformen ein einzelner Filter verwendet werden. Außerdem ist eine Linse 207 vorzugsweise vor jedem Paar von Filtern positioniert, um die gefilterten Anregungsstrahlen zu kollimieren. Die optische Anordnung 68 beinhaltet auch einen 495 nm Hochpassreflektor 208, einen 527 nm Hochpassreflektor 209, einen Spiegel 210, einen 555 nm Tiefpassreflektor 211, und einen 593 nm Tiefpassreflektor 212. Die reflektierenden Filter und Spiegel 208–212 sind um 30° von den Tiefpassfiltern 203–206 winklig versetzt.
Die Anregungsanordnung 68 überträg Anregungsstrahlen auf die Kammer 17 in vier bestimmten Anregungs-Wellenlängenbereichen, und zwar wie folgt. Wenn die grünen LEDs 100A aktiviert sind, erzeugen sie einen Anregungsstrahl, der durch das Paar von 593 nm Tiefpassfiltern 203 und durch die Linse 207 hindurchtritt. Der Anregungsstrahl wird dann von dem 593 nm Tiefpassreflektor 212 reflektiert, tritt durch den 555 nm Tiefpassreflektor 211 hindurch, wird von dem 527 nm Hochpassreflektor 209 reflektiert und tritt durch die Linse 215 hindurch in die Reaktionskammer 17 ein. Der Anregungsstrahl von den LEDs 100A wird so auf einen Wellenlängenbereich von 555 bis 493 nm gefiltert, entsprechend dem Spitzen-Anregungsbereich für ROX. Wenn die grünen LEDs 100B aktiviert werden, erzeugen sie einen Anregungsstrahl, der durch das Paar von 555 nm Tiefpassfilter 204 hindurchtritt, von dem 555 nm Tiefpassreflektor 211 reflektiert wird, von dem 527 nm Hochpassreflektor 209 reflektiert wird, und durch die Linse 215 hindurch in die Reaktionskammer 17 eintritt. Der Anregungsstrahl von den LEDs 100B wird so auf einen Wellenlängenbereich von 527 bis 555 nm gefiltert, entsprechend dem Spitzen-Anregungsbereich für TAMRA.
Wenn die blauen LEDs 1000 aktiviert werden, erzeugen sie einen Anregungsstrahl, der durch das Paar von 495 nm Tiefpassfiltern 205 hindurchtritt, durch den 495 nm Hochpassreflektor 208, durch den 527 nm Hochpassreflektor 209 und durch die Linse 215 in die Reaktionskammer 17. Der Anregungsstrahl von dem LEDs 1000 wird so auf eine Wellenlänge von unter 495 nm gefiltert, entsprechend dem Spitzen-Anregungsbereich für FAM. Wenn schließlich die grünen LEDs 100d aktiviert werden, erzeugen sie einen Anregungsstrahl, der durch das Paar von 527 nm Tiefpassfiltern 206 hindurchtritt, von dem Spiegel 210 reflektiert wird, von dem 495 nm Hochpassreflektor 208 reflektiert wird, durch den 527 nm Hochpassreflektor 209 hindurchtritt und durch die Linse 215 hindurch in die Reaktionskammer 17 eintritt. Der Anregungsstrahl von den LEDs 100D wird so auf einen Wellenlängenbereich von 495 bis 527 nm entsprechend dem Spitzen-Anregungsbereich für TET gefiltert. Im Betrieb werden die LEDs 100A bis D sequentiell aktiviert, um die unterschiedlichen fluoreszierenden Farbstoffe in der Kammer 17 mit Anregungsstrahlen in im wesentlichen bestimmten Wellenlängenbereichen anzuregen, wie weiter unten genauer beschrieben werden wird.
18 ist eine schematische Draufsicht der optischen Erfassungsanordnung 70. Die Anordnung 70 ist angrenzend an das Reaktionsgefäß 12 positioniert, um von der Kammer 17 emittiertes Licht aufzunehmen. 19 ist eine explodierte Ansicht der Erfassungsanordnung 70. Wie in 18 und 19 dargestellt, beinhaltet die Anordnung 70 ein Gehäuse 221 zum Aufnehmen verschiedener Komponenten der Anordnung. Das Gehäuse 221 beinhaltet die Anschläge 247A, 247B, die bereits mit Bezug auf 13 und 14 beschrieben wurden. Das Gehäuse 221 weist vorzugsweise zumindest ein geformtes Plastikstück auf. In der bevorzugten Ausführungsform ist das Gehäuse 221 ein mehrteiliges Gehäuse aus einem oberen und einem unteren Gehäuseelement 234A und B. Die Gehäuseelemente 234A und B sind komplementäre zusammenpassende Stücke, die mittels Schrauben 214 zusammengehalten werden. In alternativen Ausführungsformen kann das gesamte Gehäuse 221 ein einstückiges Gehäuse sein, das ein hineingleitendes optisches Paket hält.
Das untere Gehäuseelement 234B beinhaltet ein optisches Fenster 237, in welches hinein eine zylindrische Stangenlinse 232 zum Kollimieren von von der Kammer 17 emittiertem Licht platziert ist. Im allgemeinen kann das optische Fenster einfach eine Öffnung in dem Gehäuse aufweisen, durch welches hindurch das emittierte Licht aufgenommen werden kann. Das optische Fenster kann optional ein optisch durchlässiges oder transparentes Stück aus Glas oder Plastik beinhalten, das als Fensterscheibe dient, oder, wie in der bevorzugten Ausführungsform, die Linse 232 zum Kollimieren von von der Kammer 17 emittiertem Licht. Die Linse 232 kontaktiert eine der optisch durchlässigen Seitenwände der Kammer 17 vorzugsweise direkt.
Die optische Anordnung 70 beinhaltet auch vier Detektoren 102A bis D zum Erfassen von von der Kammer 17 emittiertem und durch das Fenster 237 aufgenommenem Licht. Im allgemeinen kann jeder Detektor eine Photomultiplizierröhre sein, eine CCD, ein SMOS Detektor, eine Photodiode oder ein anderer Festkörperdetektor. In der bevorzugten Ausführungsform ist jeder Detektor eine PIN Photodiode. Die Detektoren 102A bis D sind vorzugsweise in Ausnehmungen in dem unteren Gehäuseelement 234B fest angebracht. Die Detektoren sind elektrisch durch Leitungen 245 mit der optischen Leiterplatte 52 (siehe 8) verbunden, welche vorzugsweise an der Unterseite des unteren Gehäuseelements 234B angebracht ist.
Die optische Anordnung 70 beinhaltet weiter einen Satz von Filtern und Linsen, die in dem Gehäuse 221 angeordnet sind, um von der Kammer 17 emittiertes Licht in unterschiedliche Emissions-Wellenlängenbereiche aufzuteilen und um das Licht in jedem der Emissions-Wellenlängenbereiche zu einem jeweiligen Detektor zu richten. Wie in 19 dargestellt, beinhaltet das unter Gehäuseelement 234B vorzugsweise Wände 247, welche separate Erfassungskanäle in dem Gehäuse bilden, wobei einer der Detektoren am Ende jedes Kanals positioniert ist. Die Wände 247 beinhalten vorzugsweise Schlitze zum Aufnehmen und Festhalten der Filter und Linsen. Die Filter und Linsen können auch in dem Gehäuse 221 allein durch Klebstoff fest angebracht sein oder stärker bevorzugt mit einem in Kombination mit Schlitzen in dem Gehäuse verwendeten Klebstoff.
Mit Bezug auf 18 können die Filter in der optischen Anordnung 48 so ausgewählt werden, dass sie Licht, das von der Kammer 17 emittiert wird, außerhalb jedes gewünschten Emissions-Wellenlängenbereichs blockieren. Die optische Anordnung 70 kann daher mit jedem fluoreszierenden, phosphoreszierenden, chemolumineszierenden oder elektrochemolumineszierenden Kennzeichen von Interesse verwendet werden. Aus Gründen der Darstellung wird nun eine spezifische Ausführungsform der Anordnung 70 beschrieben, in welcher die Anordnung ausgestaltet ist, um von der Kammer 17 emittiertes Licht in den Spitzen-Emissions-Wellenlängenbereichen von FAM, TAMRA, TET und ROX zu erfassen.
In dieser Ausführungsform beinhaltet der Satz von Filtern vorzugsweise einen 515 nm Schott Glas^® Filter 222A vor dem ersten Detektor 102A, einen 550 nm Schott Glas^® Filter 222B vor dem zweiten Detektor 102B, einen 570 nm Schott Glas Filter 222C vor dem dritten Detektor 102C sowie einen 520 nm Schott Glas^® Filter 222D vor dem vierten Detektor 102D. Diese Schott Glas^® Filter sind kommerziell erhältlich von Schott Glass Technologies, Inc. in Duryea, Pennsylvania. Die optische Anordnung 70 beinhaltet auch ein Paar von 505 nm Hochpassfiltern 223 vor dem ersten Detektor 102A, ein Paar von 537 nm Hochpassfiltern 224 vor dem zweiten Detektor 102B, ein Paar von 565 nm Hochpassfiltern 225 vor dem dritten Detektor 102C sowie ein Paar von 605 nm Hochpassfiltern 226 vor dem vierten Detektor 102D.
Obwohl gegenwärtig bevorzugt ist, ein Paar von Hochpassfiltern vor jedem Detektor zum doppelten Filtern von Licht zu positionieren, kann in alternativen Ausführungsformen auch ein einzelner Filter verwendet werden. Außerdem ist vorzugsweise eine Linse 242 in jedem Erfindungskanal zwischen dem Paar von Hochpassfiltern und dem Schott Glas^® Filter positioniert, um das gefilterte Licht zu kollimieren. Die optische Anordnung 70 beinhaltet weiter einen 605 nm Hochpassreflektor 227, einen Spiegel 228, einen 565 nm Tiefpassreflektor 229, einen 537 nm Hochpassreflektor 230, und einen 505 nm Hochpassreflektor 231. Die reflektierenden Filter und Spiegel 227–231 sind vorzugsweise winklig von den Hochpassfiltern 223–226 um 30° versetzt. Wie in 19 dargestellt, beinhaltet die Erfassungsanordnung 70 vorzugsweise auch eine erste Öffnung 238 zwischen jedem Detektor und Schott Glas^® Filter 222 und eine Öffnung 240 zwischen jeder Linse 242 und Schott Glas^® Filter 222. Die Öffnungen 238, 240 reduzieren die Menge von Streulicht oder Licht abseits der Achse, welches die Detektoren 102A bis D erreicht.
Wieder mit Bezug auf 18 erfasst die Erfassungsanordnung 70 von der Kammer 17 emittiertes Licht in vier Emissions-Wellenlängenbereichen, und zwar wie folgt. Wie in 18 dargestellt, tritt das emittierte Lichtstrahl durch die Linse 232 hindurch und trifft auf den 565 nm Tiefpassreflektor 229. Der Bereich des Lichts mit einer Wellenlänge im Bereich von ungefähr 505 bis 537 nm (entsprechend dem Spitzen-Emissions-Wellenlängenbereich von FAM) reflektiert von dem 565 nm Tiefpassreflektor 229, tritt durch den 537 nm Hochpassreflektor 230 hindurch, wird von dem 505 nm Hochpassreflektor 231 reflektiert, tritt durch das Paar von 505 nm Hochpassfiltern 223 hindurch, durch die Linse 242, durch den 515 nm Schott Glas^® Filter 222A, und wird mittels des ersten Detektors 102A erfasst. Indessen wird der Bereich des Lichts mit einer Wellenlänge im Bereich von ungefähr 535 bis 565 nm (entsprechend dem Spitzen-Emissions-Wellenlängenbereich von TET) von dem 565 nm Tiefpassreflektor 229 reflektiert, wird von dem 537 nm Hochpassreflektor 230 reflektiert, tritt durch das Paar von 537 nm Hochpassfiltern 224 hindurch, durch die Linse 242, durch den 550 nm Schott Glas^® Filter 222B und wird mittels des zweiten Detektors 102B erfasst.
Weiter tritt der Bereich des Lichts mit einer Wellenlänge im Bereich von ungefähr 565 bis 605 nm (entsprechend dem Spitzen-Emissions-Wellenlängenbereich von TAMRA) durch den 565 nm Tiefpassreflektor 229 hindurch, durch den 605 nm Hochpassreflektor 227, durch das Paar von 565 nm Hochpassfiltern 225, durch die Linse 242, durch den 570 nm Schott Glas^® Filter 222C und wird mittels des dritten Detektors 102C erfasst. Der Bereich des Lichts mit einer Wellenlänge von über 605 nm (entsprechend dem Spitzen-Emissions-Wellenlängenbereich von ROX) tritt durch den 565 nm Tiefpassreflektor 229 hindurch, wird von dem 605 nm Hochpassreflektor 227 reflektiert, wird von dem Spiegel 228 reflektiert, tritt durch das Paar von 605 nm Hochpassfiltern 226 hindurch, durch die Linse 242, durch den 620 nm Schott Glas^® Filter 222D, und wird mittels des vierten Detektors 102D erfasst. Im Betrieb werden die Ausgaben der Detektoren 102A bis D analysiert, um die Konzentrationen von jedem der unterschiedlichen Farbstoffe in der Kammer 17 zu bestimmen, wie später noch genauer beschrieben werden wird.
20 zeigt ein Mehrfachstellen-Reaktorsystem 106 gemäß der vorliegenden Erfindung. Das Reaktorsystem 106 weist einen thermischen Durchläufer (thermal cycler) 108 sowie eine Steuerung 112 wie beispielsweise einen PC oder Netzwerkcomputer auf. Der thermische Durchläufer 108 weist ein Basisinstrument 110 zur Aufnahme mehrerer Wärmetauschermodule 60 auf (zuvor beschrieben mit Bezug auf
8). Das Basisinstrument 110 hat eine logische Hauptplatte mit Kantenverbindern 114 zum Aufbauen einer elektrischen Verbindung zu den Modulen 60. Das Basisinstrument 110 beinhaltet auch vorzugsweise einen Ventilator 116 zum Abkühlen seiner elektronischen Komponenten. Das Basisinstrument 110 kann mit der Steuerung 112 unter Verwendung jeder geeigneten Datenverbindung verbunden sein, wie beispielsweise mittels eines universellen Serienbusses (USB), mittels einer Ethernet-Verbindung oder einer seriellen Leitung. Momentan wird bevorzugt, einen USB zu verwenden, welcher mit der seriellen Schnittstelle der Steuerung 112 verbunden ist. Alternativ kann die Steuerung in das Basisinstrument 110 eingebaut sein. Aufgrund der räumlichen Beschränkung von Patentzeichnungen beinhaltet der in 20 gezeigte thermische Durchläufer 108 nur sechzehn Reaktionsstellen, die durch die sechzehn Wärmetauschermodule 60 gebildet werden, die in zwei Reihen von jeweils acht Modulen angeordnet sind. Der thermische Durchläufer kann jedoch jede Anzahl gewünschter Reaktionsstellen aufweisen, d.h. er kann als Instrument mit mehreren hundert Stellen ausgestaltet sein, um Hunderte Proben gleichzeitig zu bearbeiten. Alternativ kann er als kleines, in der Hand haltbares, batteriegetriebenes Instrument mit z.B. 1 bis 4 Reaktionsstellen ausgebildet sein.
Jede Reaktionsstelle in dem thermischen Durchläufer 108 wird durch ein Wärmetauschermodul 60 gebildet. Die Module 60 sind vorzugsweise unabhängig steuerbar, so dass unterschiedliche chemische Reaktionen gleichzeitig in dem thermischen Durchläufer 108 ablaufen können. Der thermische Durchläufer 108 ist vorzugsweise modular, so dass jedes Wärmetauschermodul 60 individuell von dem Basisinstrument 110 zur Wartung, zur Reparatur oder zum Austausch entfernt werden kann. Diese Modularität reduziert die Stillstandszeit, da nicht alle Module 60 abgeschaltet werden müssen, um eines zu reparieren, und das Instrument 110 kann hochgestuft und vergrößert werden, um, wenn gewünscht, mehr Module hinzuzufügen. Die Modularität des thermischen Durchläufers 108 bedeutet auch, dass individuelle Module 60 präzise kalibriert werden können und modulspezifische Pläne oder Korrekturen in die Steuerungsprogramme eingebaut werden können, beispielsweise als Reihe von modulspezifischen Kalibrierungs- oder Einstelltabellen.
In Ausführungsformen, in welchen das Basisinstrument 110 mit externer Energie arbeitet, beispielsweise 110 V Wechselstrom, beinhaltet das Instrument vorzugsweise zwei Stromanschlüsse 122, 124. Energie wird aufgenommen durch den ersten Anschluss 122 und abgegeben durch den zweiten Anschluss 124. In gleicher Weise beinhaltet das Instrument 110 vorzugsweise einen Netzwerk-Schnittstellen-Eingang 118 und einen -Ausgang 120 zum Aufnehmen einer Datenverbindung durch den Eingang 118 und zum Ausgeben von Daten an ein anderes Basisinstrument durch den Ausgang 120. Wie im Blockdiagramm der 21 dargestellt, ermöglicht diese Anordnung einen Gänseblümchenkranz von mehreren thermischen Durchläufern 108A bis D von einer Steuerung 112 und einer externen Energiequelle 128.
22 ist ein schematisches Blockdiagramm des Basisinstruments 110. Das Basisinstrument beinhaltet eine Energieversorgung 134 zum Versorgen des Instruments und jedes Moduls 60 mit Energie. Die Energieversorgung 134 kann einen Gleichstrom/Wechselstrom-Umwandler aufweisen zum Aufnehmen von Energie von einer äußeren Quelle und Umwandeln der Energie in Gleichstrom, beispielsweise zum Aufnehmen von 100V Wechselstrom und zum Umwandeln in 12V Gleichstrom. Alternativ kann die Energieversorgung 110 eine Batterie aufweisen, beispielsweise eine 12V-Batterie. Das Basisinstrument 110 beinhaltet auch einen Mikroprozessor oder eine Mikrosteuerung 130, die Firmware zum Steuern des Betriebs des Basisinstruments 110 und der Module 60 beinhaltet. Die Mikrosteuerung 130 kommuniziert durch eine Netzwerk-Schnittstelle 132 mit einem Benutzer-Schnittstellencomputer über einen USB. Aufgrund von momentanen Begrenzungen der Berechnungsleistung wird momentan bevorzugt, zumindest eine Mikrosteuerung pro sechzehn Module 60 in dem Basisinstrument vorzusehen. Wenn das Basisinstrument also eine Kapazität von 32 Modulen hat, sollten zumindest zwei Mikrosteuerungen in dem Instrument 110 vorgesehen werden, um die Module zu steuern.
Das Basisinstrument 110 beinhaltet weiter eine Erhitzer-Energiequelle und einen -Steuerkreis 136, einen Energieverteiler 138, einen Datenbus 140 sowie einen Modulauswahlsteuerkreis 142. Aufgrund von Platzbegrenzungen in Patentzeichnungen sind der Steuerkreis 136, der Energieverteiler 138, der Datenbus 140 sowie der Steuerkreis 142 nur einmal in dem schematischen Diagramm in 22 dargestellt. Das Basisinstrument 110 beinhaltet jedoch eigentlich einen Satz dieser vier funktionalen Komponenten 136, 138, 140, 142 für jedes Wärmetauschermodul 60. In der Ausführungsform in 22 beinhaltet daher das Basisinstrument 110 sechzehn Steuerkreise 136, Energieverteiler 138, Datenbusse 140 und Steuerkreise 142. In gleicher Weise beinhaltet das Basisinstrument 110 auch einen anderen Kantenverbinder 131 für den Anschluss an jedes Modul 60, so dass das Instrument sechzehn Kantenverbinder für die in 22 dargestellte Ausführungsform beinhaltet. Die Kantenverbinder sind vorzugsweise 120 Pin- Karten-Kantenverbinder, welche eine kabellose Verbindung von dem Basisinstrument 110 zu jedem Modul 60 bieten. Jeder Steuerkreis 136, Energieverteiler 138, Datenbus 140 und Steuerkreis 142 ist mit einem jeweiligen Kantenverbinder und mit der Mikrosteuerung 130 verbunden.
Jeder Erhitzerenergie- und Quellensteuerkreis 136 ist ein Energieregler zum Regeln der Energiemenge, die den Heizelementen eines jeweiligen Moduls 60 zugeführt wird. Der Quellensteuerkreis 136 ist vorzugsweise ein Gleichstrom-Gleichstrom-Umwandler, welcher eine +12V Eingangsspannung von der Energieversorgung 134 aufnimmt und eine variable Spannung zwischen 0 und –24V ausgibt. Die Spannung wird gemäß Signalen variiert, die von der Mikrosteuerung 130 her empfangen werden. Jeder Energieverteiler 138 versorgt ein jeweiliges Modul 137 mit –5V, +5V, +12V und GND (ground, Bezugspotential). Der Energieverteiler liefert daher Energie für die elektronischen Komponenten des Moduls. Jeder Datenbus 140 bietet parallele und serielle Verbindungen zwischen der Mikrosteuerung 130 und den digitalen Einrichtungen eines jeweiligen Moduls 60. Jede Modulauswahlsteuerung 142 ermöglicht es der Mikrosteuerung 130, ein individuelles Modul 60 zu adressieren, um Steuerungs- oder Statusinformationen auszulesen oder zu schreiben.
23 ist ein schematisches Blockdiagramm der elektronischen Komponenten eines Wärmetauschermoduls 60. Jedes Modul beinhaltet einen Kantenverbinder 80 für die kabellose Verbindung mit einem entsprechenden Kantenverbinder des Basisinstruments. Das Modul beinhaltet auch Heizplatten 50A und B, die jeweils ein resistives Heizelement haben, wie oben beschrieben. Die Platten 50A und B sind parallelverdrahtet, um Eingangsenergie 146 an dem Basisinstrument zu empfangen. Die Platten 50A und B beinhalten auch Temperatursensoren 52, beispielsweise Thermistoren, welche analoge Temperatursignale an einen A/D-Umwandler 154 ausgeben. Der Umwandler 154 wandelt die analogen Signale in digitale Signale um und lenkt sie zu der Mikrosteuerung in dem Basisinstrument durch den Kantenverbinder 80. Das Wärmetauschermodul beinhaltet auch ein Kühlsystem wie beispielsweise einen Ventilator 66 zum Abkühlen der Platten 50A und B und der Reaktionsmischung in einem Gefäß zwischen den Platten. Der Ventilator 66 empfängt Energie von dem Basisinstrument und wird aktiviert durch Umschalten eines Energieschalters 164. Der Energieschalter 164 wird seinerseits gesteuert durch einen logischen Steuerkasten 162, welcher Steuersignale von der Mikrosteuerung in dem Basisinstrument empfängt.
Das Modul beinhaltet weiter vier Lichtquellen, wie beispielsweise LEDs 100, für die Erregung von gekennzeichneten Analyten in der Reaktionsmischung, sowie vier Detektoren 102, vorzugsweise Photodioden, zum Erfassen von fluoreszierenden Emissionen von der Reaktionsmischung her. Das Modul beinhaltet auch eine einstellbare Stromquelle 150 zum Zuführen einer variablen Menge von Strom (beispielsweise im Bereich von 0 bis 30 mA) zu jeder LED, um die Helligkeit der LED zu variieren. Ein Digital/Analog-Umwandler 152 ist zwischen der einstellbaren Stromquelle 150 und der Mikrosteuerung des Basisinstruments verbunden, um es der Mikrosteuerung zu ermöglichen, die Stromquelle digital anzustellen. Die einstellbare Stromquelle 150 wird vorzugsweise verwendet, um sicherzustellen, dass jede LED ungefähr die gleiche Helligkeit hat, wenn sie aktiviert ist. Aufgrund von Herstellungsvarianten haben viele LEDs eine unterschiedliche Helligkeit, wenn sie mit der gleichen Strommenge versorgt werden. Daher wird momentan bevorzugt, die Helligkeit jeder LED während der Herstellung des Wärmetauschermoduls zu testen und Kalibrierungsdaten in einem Speicher 160 des Moduls zu speichern. Die Kalibrierungsdaten zeigen die korrekte Strommenge an, die jeder LED zugeführt werden muss. Die Mikrosteuerung liest die Kalibrierungsdaten aus dem Speicher 160 aus und steuert die Stromquelle 150 dementsprechend an. Die Mikrosteuerung kann auch die Stromquelle ansteuern, um die Helligkeit der LEDs 100 als Antwort auf eine optische Rückmeldung einzustellen, die von den Detektoren 102 her empfangen wird, wie später noch genauer beschrieben wird.
Das Modul beinhaltet zusätzlich einen Signalaufbereitungs/Steigerungsauswahl-/Offset-Einstellblock 156 aus Verstärkern, Schaltern, elektronischen Filtern und einem Digital/Analog-Umwandler. Der Block 156 passt die Signale von den Detektoren 102 an, um die Steigerung anzuheben, den Offset zu verstärken und Geräusche zu reduzieren. Die Mikrosteuerung in dem Basisinstrument steuert den Block 156 durch ein digitales Ausgaberegister 158 an. Das Ausgaberegister 158 empfängt Daten von der Mikrosteuerung und gibt Steuerspannungen an den Block 156 aus. Der Block 156 gibt die angepassten Detektorsignale an die Mikrosteuerung aus durch den Analog-/Digital-Umwandler 154 und den Kantenverbinder 80. Das Modul beinhaltet auch den Speicher 160, vorzugsweise einen seriellen EEPROM, zum Speichern von Daten, die spezifisch sind für das Modul, wie beispielsweise Kalibrierungsdaten für die LEDs 100, thermischen Platten 50A und B und Temperatursensoren 52 sowie Kalibrierungsdaten für einen Deconvolutions-Algorithmus, der später noch genauer beschrieben wird.
Wieder mit Bezug auf 20 beinhaltet das System 106 einen Bestückungsautomaten zum Befüllen und Unterdrucksetzen jedes Behälters 12.
24 zeigt ein schematisches Diagramm eines Bestückungsautomaten 166 zum automatischen Befüllen und Unterdrucksetzen eines Reaktionsbehälters 12. Der Automat 166 hat einen Pipettenkopf 168 für den Eingriff mit einer Wegwerg-Pipettenspitze 170. Der Automat 166 hat auch steuerbare Vakuum- und Druckquellen, die in Verbindung mit dem Pipettenkopf 168 zum Ansaugen und Ausgeben von Fluiden unter Verwendung der Pipettenspitze 170. Die Vakuum- und Druckquellen können beispielsweise zumindest eine Spritzenpumpe aufweisen, Druckluftquellen, pneumatische Pumpen, Vakuumpumpen oder Anschlüsse an externe Druckquellen.
Wie in 25 dargestellt, hat der Bestückungsautomat 166 auch einen robotischen Arm oder eine Automatenspitze 172 zum Platzieren des Plungerkolbens 22 in den Kanal 28 des Reaktionsbehälters 12 hinein. Die Automatenspitze 172 kann optional einen Ausrichtestift 174 zum Ausrichten der Kappe 36 des Plungerkolbens in einer gewünschten winkligen Orientierung mit Bezug auf den Körper des Behälters 12 beinhalten. Der Ausrichtestift 174 bietet einen bequemen Mechanismus zum Drehen der Kappe in die gewünschte Orientierung vor dem Einbringen des Plungerkolbens 22 in den Kanal 28 hinein. Wie zuvor bereits in 3 dargestellt, beinhaltet die Kappe 36 eine sich verjüngende Eingriffsöffnung 46 zum Aufnehmen und Aufbauen einer Reibpassung mit der Automatenspitze. Die Kappe 36 hat auch Ausrichteöffnungen 48A, 48B, von denen jede den Ausrichtestift aufnehmen kann.
Wieder mit Bezug auf 25 beinhaltet der Bestückungsautomat 166 vorzugsweise auch eine Ejektorplatte 176, die an der Automatenspitze 172 hinabgleitet, um den Plungerkolben 22 aus der Automatenspitze auszustoßen, nachdem der Plungerkolben in den Kanal 28 eingebracht worden ist. Obwohl diese Ausführungsform des Bestückungsautomaten gegenwärtig bevorzugt wird, sind auch andere Ausführungsformen möglich. beispielsweise kann die Automatenspitze 172 dazu ausgestaltet sein, eine Vakuumpassung mit der Kappe 36 des Plungerkolbens aufzubauen. Alternativ kann der Bestückungsautomat einen robotischen Greifarm zum Ergreifen des Plungerkolbens 22 und Einbringen des Plungerkolbens in den Kanal 28 hinein haben. Geeignete Bestückungsautomaten für die Verwendung in der erfindungsgemäßen Vorrichtung sind kommerziell erhältlich als vorkonfigurierte Automaten von verschiedenen Zulieferern, beispielsweise Tecan U.S.Inc., die ein Büro im 4022 Stirrup Creek Drive, Durham, North Carolina 27703, haben.
Wieder mit Bezug auf 20, beinhaltet die Steuerung 112 vorzugsweise Software zum Steuern des thermischen Umläufers 108 und des Bestückungsautomaten (oben mit Bezug auf die 24 und 25 beschrieben), um die in dem nachfolgenden Betriebsabschnitt beschriebenen Funktionen auszuführen. Diese Funktionen beinhalten das Vorsehen einer Benutzer-Schnittstelle, damit ein Benutzer gewünschte thermische Bearbeitungsparameter auswählen kann (beispielsweise Soll- Temperaturen und Haltezeiten bei jeder Temperatur) sowie optische Erfassungsparameter, die automatische Befüllung und Unterdrucksetzung der Behälter 12, die thermische Bearbeitung der Behälter gemäß den ausgewählten Parametern, die optische Abfrage der Reaktionsmischungen in den Behältern, und die Aufzeichnung der erzeugten optischen Daten. Die Erzeugung von Software und/oder Firmware zum Ausführen dieser Funktionen kann von einem Computerprogrammierer mit normalen Fähigkeiten ausgeführt werden. Außerdem kann sich die Software und/oder Firmware lediglich in der Steuerung 112 befinden oder auch zwischen der Steuerung und zumindest einem Mikroprozessor in dem thermischen Umläufer oder dem Bestückungsautomaten verteilt sein. Alternativ kann die Steuerung 112 auch einfach in den thermischen Umläufer oder die Bestückungsmaschine eingebaut sein.
Im Betrieb wird das Reaktorsystem 106 dazu verwendet, zumindest eine Probe thermisch zu bearbeiten und optisch abzufragen. Eine beispielhafte Verwendung des Systems 106 ist für die Amplifizierung von Nukleinsäure in einer Probe (beispielsweise unter Verwendung von PCR) und für die optische Erfassung zumindest eines Zielanalyts in der Probe. Ein Benutzer wählt ein gewünschtes thermisches Profil für die Probe unter Verwendung beispielsweise des Keyboards oder der Maus der Steuerung 112. Beispielsweise kann für die PCR Amplifikation der Benutzer das thermische Profil so auswählen, dass es mit einem 30-sekündigen Induktionshalt bei 95°C beginnt, gefolgt von 45 thermischen Zyklen, in welchen die Reaktionsmischung zwischen höheren und geringeren Temperaturen hin- und hergeführt wird für die Denaturisierung, Härtung und Polymerisierung. beispielsweise kann jeder thermische Zyklus eine erste Soll-Temperatur von 95C° beinhalten, die für 1 Sekunde gehalten wird, um doppelsträngige DNA zu denaturieren, gefolgt von einer zweiten Sollpunkt-Temperatur von 60°C, die für 6 Sekunden gehalten wird, um primer zu härten und umzupolymerisieren.
Wieder mit Bezug auf 24 wird die Probe vorzugsweise in den Behälter 12 hinein gegeben durch Ansaugen der Probe in die Pipettenspitze 170 hinein, Einbringen der Pipettenspitze 170 durch den Kanal 28 hindurch in die Kammer 17 hinein, und Ausgeben der Probe in die Kammer. Gegenwärtig wird bevorzugt, dass die Kammer 17 von unten befüllt wird, d.h. vom Boden aus, in dem anfänglich die Pipettenspitze 170 nahe am Boden der Kammer 17 eingebracht wird und die Pipettenspitze 170 langsam zurückgezogen wird, wenn sich die Kammer 17 füllt. Das Befüllen der Kammer 17 auf diese Art und Weise reduziert die Wahrscheinlichkeit, dass sich Luftbläschen in der Kammer bilden werden. Solche Luftbläschen könnten einen negativen Effekt auf die anschließende optische Erfassung haben. Die Fluidprobe kann gemischt werden mit Chemikalien, die notwendig sind für die beabsichtigte Reaktion (beispielsweise PCR Reagenzen und/oder fluoreszierende Sonden), bevor sie in die Kammer 17 eingebracht wird. Alternativ kann die Probe zu dem Chemikalien in der Kammer 17 hinzugefügt werden, d.h. durch Hinzufügen der Chemikalien zu der Kammer, bevor oder nachdem die Probe eingebracht wird, um die gewünschte Reaktionsmischung in der Kammer zu bilden. In einer besonders vorteilhaften Ausgestaltung werden die notwendigen Reagenzen und/oder fluoreszierenden Sonden für die beabsichtigte Reaktion in der Kammer 17 platziert, wenn der Behälter hergestellt wird. Die Reagenzen werden vorzugsweise in der Kammer 17 in getrockneter oder lyophilisierter Form platziert, so dass sie adäquat konserviert werden, bis der Behälter verwendet wird.
Wieder mit Bezug auf 25 wird die Kammer 17 dann unter Druck gesetzt, nachdem sie mit der Reaktionsmischung befüllt worden ist. Um den Druck in dem Behälter zu erhöhen, gerät die Automatenspitze 172 des Bestückungsautomaten 166 mit der Kappe 36 des Plungerkolbens 22 in Eingriff und bringt den Plungerkolben in den Kanal 28 ein, bis der Schnappring 38 in die ringförmige Ausnehmung 23 hineinschnappt. Wenn der Plungerkolben 22 eingebracht wird, komprimiert der Kolben 32 Gas in dem Kanal 28, um den Druck in der Kammer 17 zu erhöhen, vorzugsweise auf ungefähr 55 bis 105 kPa oberhalb der Umgebungsdrucks, wie zuvor mit Bezug auf die 7A–7D diskutiert. Nachdem der Plungerkolben 22 eingebracht worden ist, stößt die Ejektorplatte 176 den Plungerkolben 22 aus der Maschinenspitze 172 aus.
Wieder mit Bezug auf 20 kann jeder der Behälter 12 zwischen den thermischen Platten eines jeweiligen Wärmetauschmoduls 60 entweder vor dem Befüllen und Unterdrucksetzen des Behälters oder nach dem Befüllen und Unterdrucksetzen des Behälters eingebracht werden. In beiden Fällen zwingt, wie in 5 dargestellt, der Druck in der Kammer 17 die flexiblen Hauptwände 18 dazu, die Innenflächen der Platten 50 zu berühren und sich an diese anzupassen. In Ausführungsformen, in welchen die Behälter zwischen die Platten eingebracht werden vor dem Befüllen und Unterdrucksetzen, beinhaltet der Bestückungsautomat einen robotischen Arm (nicht dargestellt) zum Aufnehmen der Behälter und Einbringen der Behälter in die Module hinein.
Wieder mit Bezug auf 25 kann jeder Behälter 12 alternativ zwischen die Platten eines jeweiligen Moduls nach dem Befüllen und Unterdrucksetzen unter Verwendung der Automatenspitze 172 eingebracht werden. In dieser Ausführungsform wird der Behälter 12 vorzugsweise in einer Schiene, auf einer Auflage oder einer ähnlichen Halterungseinrichtung während des Befüllens und Unterdrucksetzens gehalten. Nachdem der Behälter 12 befüllt und unter Druck gesetzt worden ist, nimmt die Automatenspitze 172 den Behälter 12 durch die Kappe 36 des Plungerkolbens 22 auf und setzt die Kammer 17 des Behälters zwischen die Platten eines Wärmetauschmoduls. Der Plungerkolben 22 wird in dem Kanal 28 während dieser Bewegung durch den Schnappring 38 gehalten, der in der ringförmigen Ausnehmung 23 im Eingriff ist. Nachdem der Behälter 12 eingebracht worden ist, stößt die Ejektorplatte 176 die Kappe 36 aus der Automatenspitze 172 aus.
Wieder mit Bezug auf die 20 wird, sobald ein befüllter und unter Druck gesetzter Reaktionsbehälter 12 zwischen den thermischen Platten eines Wärmetauschmoduls 60 platziert worden ist, die Reaktionsmischung in dem Behälter dem vom Benutzer ausgewählten thermischen Profil unterworfen. Die Steuerung 112 implementiert eine Proportional-Integral-Ableitungssteuerung (PID Steuerung), um das ausgewählte thermische Profil auszuführen. Wieder mit Bezug auf 23 empfängt die Steuerung Signale, die die Temperaturen der Platten 50A, 50B anzeigen, von den Temperatursensoren 52. Ein Abfragen der Plattentemperaturen findet vorzugsweise alle 100 Millisekunden während des Durchlaufs des Temperaturprofils statt. Nach jeder Abfrage mittelt die Steuerung die Temperaturen der beiden Platten 50A, 50B, um eine durchschnittliche Plattentemperatur zu bestimmen. Die Steuerung bestimmt dann den Unterschied (Delta) zwischen der Profil-Solltemperatur, d.h. der von dem Benutzer für die jeweilige Zeit in dem Profil bestimmte Solltemperatur, und der durchschnittlichen Plattentemperatur. auf der Grundlage der Beziehung zwischen der durchschnittlichen Plattentemperatur und der momentanen Solltemperatur steuert die Steuerung die Menge an Energie, die den Heizelementen an den Platten 50A, 50B oder dem Lüfter 66 zugeleitet wird, wie es geeignet ist, um die momentane Solltemperatur zu erreichen oder beizubehalten. Die PID Steuerung ist in der Technik bekannt und braucht hier nicht weiter beschrieben zu werden. Die Steuerung kann optional eine modifizierte Version der PID Steuerung implementieren, die in der Internationalen Patent-Veröffentlichung mit der Nr. WO 99/48608 beschrieben ist, veröffentlicht am 30. September 1999, deren Offenbarung hierin durch Bezug aufgenommen wird.
Wieder mit Bezug auf 20 werden die Reaktionsmischungen in den Behältern 12 optisch in Echtzeit abgefragt, während sie thermisch bearbeitet werden. Wenn die Mischungen dem thermischen Umlauf oder Durchlauf unterworfen sind, dann wird jede Mischung vorzugsweise optisch abgefragt einmal pro thermischem Zyklus bei der geringsten Temperatur in dem Zyklus. Wenn die isothermische Amplifikation verwendet wird, dann wird jede Mischung vorzugsweise optisch abgefragt in regelmäßigen Zeitintervallen (beispielsweise alle 10 Sekunden) während der Amplifikation. Wieder mit Bezug auf 16 und 18 wird die optische Abfrage einer individuellen Mischung in einem Reaktionsbehälter 12 ausgeführt durch sequentielles Aktivieren von LEDs 100A, 100B, 1000 und 100D, um unterschiedliche fluoreszierend gekennzeichnete Nukleinsäure-Sequenzen in der Mischung anzuregen und durch Erfassen fluoreszierender Signale, die von der Kammer 17 emittiert werden, unter Verwendung der Detektoren 102A bis D. In dem folgenden Beispiel des Betriebs werden die fluoreszierenden Farbstoffe FAM, TAMRA, TET und ROX verwendet, um die Ziel-Nukleotid-Sequenzen in der Reaktionsmischung zu kennzeichnen.
Es gibt vier Paare von LEDs 100A bis D und vier Detektoren 102A bis D für insgesamt sechzehn Kombinationen von Paaren aus LED und Detektor. Es ist theoretisch möglich, Ausgabesignale von den Detektoren für alle sechzehn Kombinationen zu sammeln. Von diesen sechzehn Kombinationen gibt es jedoch nur vier primäre Detektionskanäle oder Erfassungskanäle. Jeder primäre Erfassungskanal wird gebildet durch ein Paar von LEDs in der optischen Anordnung 68, deren Anregungsstrahlen in der Spitzenanregungs-Wellenlänge eines bestimmten Farbstoffs liegen, und durch einen entsprechenden Kanal in der Optikanordnung 70, der dazu ausgestaltet ist, in dem Spitzenemisssions-Wellenlängenbereich es gleichen Farbstoffs emittiertes Licht zu erfassen. Der erste primäre Erfassungskanal wird geformt durch das erste Paar von LEDs 100A und den vierten Detektor 102D (den ROX Kanal). Der zweite primäre Erfassungskanal wird gebildet durch das zweite Paar LEDs 100D und den dritten Detektor 102C (den TAMRA Kanal). Der dritte primäre Erfassungskanal wird gebildet durch das dritte Paar LEDs 100C und den ersten Detektor 102A (der FAM Kanal). Der vierte primäre Erfassungskanal wird gebildet durch das vierte Paar LEDs 100D und den zweiten Detektor 102B (den TET Kanal).
Vor dem Aktivieren der LEDs 100A–D wird zunächst eine "dunkle Lesung" durchgeführt, um das Ausgabesignal jedes der vier Detektoren 102A–D zu bestimmen, wenn keine der LEDs erleuchtet ist. Das Signal der "dunklen Lesung", das von jedem Detektor ausgegeben wird, wird anschließend von dem entsprechenden Signal der "hellen Lesung" abgezogen, das von dem Detektor ausgegeben wird, um jeden elektronischen Offset in dem optischen Erfassungskreis zu korrigieren. Dieser Vorgang des Beschaffens von Signalen der "dunklen Lesung" und Subtrahieren der dunklen Signale von den entsprechenden Signalen der "hellen Lesung" wird vorzugsweise jedes Mal dann durchgeführt, wenn ein Reaktionsgefäß optisch abgefragt wird, inklusive der Male, wenn das Gefäß während der Entwicklung von Kalibrierungsdaten (unten genauer beschrieben) abgefragt wird. Für eine Klarheit und Kürze der Erläuterung werden jedoch die Schritte des Beschaffens der Signale der "dunklen Lesung" und des Subtrahierens der dunklen Signale von den entsprechenden Signalen der "hellen Lesung" in dieser Beschreibung nicht weiter wiederholt.
Anschließend an die "dunkle Lesung" wird eine "erleuchtete Lesung" in jedem der vier optischen Haupterfassungskanäle wie folgt durchgeführt. Das erste Paar LEDs 100A wird aktiviert und erzeugt einen Anregungsstrahl, der durch das Paar von 593 nm Tiefpassfiltern 203 hindurchtritt und von dem 593 nm Tiefpassreflektor 212 reflektiert wird. Er tritt durch den 555 nm Tiefpassreflektor 211 hindurch, wird von dem 527 nm Hochpassreflektor 209 reflektiert und tritt durch die Linse 215 hindurch in die Reaktionskammer 17 ein. Der Anregungsstrahl von den LEDs 100A wird so auf einen Wellenlängenbereich von 555 bis 493 nm gefiltert, entsprechend dem Spitzen-Anregungsbereich für ROX. Wie in 18 dargestellt, tritt emittiertes Licht (Fluoreszenz-Emissions-Strahlung) von der Kammer 17 durch die Linse 232 der Erfassungsanordnung 70 hindurch und trifft auf den 565nm Tiefpassreflektor 229. Der Bereich des Lichts mit einer Wellenlänge von über 605 nm (entsprechend dem Spitzen-Emissions-Wellenlängenbereich von ROX) tritt durch den 565 nm Tiefpassreflektor 229 hindurch, wird von dem 605 nm Hochpassreflektor 227 reflektiert, wird von dem Spiegel 228 reflektiert, tritt durch das Paar von 605 nm Hochpassfiltern 226 hindurch, durch die Linse 242, durch den 620 nm Schott Glas Filter 222D, und wird mittels des vierten Detektors 102D erfasst. Der vierte Detektor 102D gibt ein entsprechendes Signal aus, das in einen digitalen Wert umgewandelt und aufgezeichnet wird.
Wie in 16 dargestellt, wird anschließend das zweite Paar LEDs 100B aktiviert und erzeugt einen Anregungsstrahl, der durch das Paar von 555 nm Tiefpassfilter 204 hindurchtritt, von dem 555 nm Tiefpassreflektor 211 reflektiert wird, von dem 527 nm Hochpassreflektor 209 reflektiert wird, und durch die Linse 215 hindurch in die Reaktionskammer 17 eintritt. Der Anregungsstrahl von den LEDs 100B wird so auf einen Wellenlängenbereich von 527 bis 555 nm gefiltert, entsprechend dem Spitzen-Anregungsbereich für TAMRA. Wie in 18 dargestellt, tritt von der Kammer 17 emittiertes Licht durch die Linse 232 der Erfassungsanordnung 48 hindurch und trifft auf den 565nm Tiefpassreflektor 229. Der Bereich des Lichts mit einer Wellenlänge im Bereich von ungefähr 565 bis 605 nm (entsprechend dem Spitzen-Emissions-Wellenlängenbereich von TAMRA) tritt durch den 565 nm Tiefpassreflektor 229 hindurch, durch den 605 nm Hochpassreflektor 227, durch das Paar von 565 nm Hochpassfiltern 225, durch die Linse 242, durch den 570 nm Schott Glas Filter 222C und wird mittels des dritten Detektors 102C erfasst. Der dritte Detektor 102C gibt ein entsprechendes Signal aus, das in einen digitalen Wert umgewandelt und aufgezeichnet wird.
Anschließend werden, wie in 16 gezeigt, die beiden blauen LEDs 100C aktiviert und erzeugen einen Anregungsstrahl, der durch das Paar von 495 nm Tiefpassfiltern 205 hindurchtritt, durch den 495 nm Hochpassreflektor 208, durch den 527 nm Hochpassreflektor 209 und durch die Linse 215 in die Reaktionskammer 17. Der Anregungsstrahl von dem LEDs 100C wird so auf eine Wellenlänge von unter 495 nm gefiltert, entsprechend dem Spitzen-Anregungsbereich für FAM. Wie in 18 dargestellt, tritt emittiertes Licht von der Kammer 10 durch die Linse 232 der Erfassungsanordnung 70 hindurch und trifft auf den 565nm Tiefpassreflektor 229. Der Bereich des Lichts mit einer Wellenlänge im Bereich von ungefähr 505 bis 537 nm (entsprechend dem Spitzen-Emissions-Wellenlängenbereich von FAM) reflektiert von dem 565 nm Tiefpassreflektor 229, tritt durch den 537 nm Hochpassreflektor 230 hindurch, wird von dem 505 nm Hochpassreflektor 231 reflektiert, tritt durch das Paar von 505 nm Hochpassfiltern 223 hindurch, durch die Linse 242, durch den 515 nm Schott Glas Filter 222A, und wird mittels des ersten Detektors 102A erfasst. Der erste Detektor 102A gibt ein entsprechendes Signal aus, das in einen digitalen Wert umgewandelt und aufgezeichnet wird.
Anschließend wird, wie in 16 dargestellt, das vierte Paar LEDs 100D aktiviert und erzeugt einen Anregungsstrahl, der durch das Paar von 527 nm Tiefpassfiltern 206 hindurchtritt, von dem Spiegel 210 reflektiert wird, von dem 495 nm Hochpassreflektor 208 reflektiert wird, durch den 527 nm Hochpassreflektor 209 hindurchtritt und durch die Linse 215 hindurch in die Reaktionskammer 17 eintritt. Der Anregungsstrahl von den LEDs 100D wird so auf einen Wellenlängenbereich von 495 bis 527 nm entsprechend dem Spitzen-Anregungsbereich für TET gefiltert. Wie in 18 dargestellt, tritt emittiertes Licht von der Kammer 17 durch die Linse 232 der Erfassungsanordnung 70 hindurch und trifft auf den 565nm Tiefpassreflektor 229. Indessen wird der Bereich des Lichts mit einer Wellenlänge im Bereich von ungefähr 535 bis 565 nm (entsprechend dem Spitzen-Emissions-Wellenlängenbereich von TET) von dem 565 nm Tiefpassreflektor 229 reflektiert, wird von dem 537 nm Hochpassreflektor 230 reflektiert, tritt durch das Paar von 537 nm Hochpassfiltern 224 hindurch, durch die Linse 242, durch den 550 nm Schott Glas Filter 222B und wird mittels des zweiten Detektors 102B erfasst. Der zweite Detektor 102B gibt ein entsprechendes Signal aus, das in einen digitalen Wert umgewandelt und aufgezeichnet wird. Die Gesamtzeit, die erforderlich ist, um jede der vier LEDs 100A–D nacheinander zu aktivieren und vier entsprechende Detektorenmessungen zu sammeln, beträgt typischerweise 5 Sekunden oder weniger.
Das Spektrum der Fluoreszenz, welches von den für die Erfassung verwendeten Farbstoffen emittiert wird, ist recht breit. Als Ergebnis kann, wenn ein individueller Farbstoff (beispielsweise FAM, TAMRA, TET oder ROX) Fluoreszenz von dem Reaktionsgefäß emittiert, die Fluoreszenz in mehreren der Haupterfassungskanäle erfasst werden, d.h. mehrere der Detektoren 102A bis D erfassen die Fluoreszenz und erzeugen ein Ausgabesignal. Jeder Farbstoff hat jedoch seine eigene Unterschrift, d.h., die Verhältnisse der optischen Signale in jedem Erfassungskanal sind eindeutig für jeden Farbstoff. Es ist auch eine vernünftige Annahme, dass die fluoreszierende Emission von einer Mischung aus Farbstoffen sich in jedem Erfassungskanal einfach addieren, so dass die individuellen Farbstoffkonzentrationen einer Farbstoffmischung und Verwendung von linearer Algebra aus den gemischten Signalen extrahiert werden können.
In der bevorzugten Ausführungsform ist die Steuerung dazu programmiert, die Ausgabesignale der Detektoren in Werte umzuwandeln, die die wahre Konzentration jedes Farbstoffs in der Reaktionsmischung anzeigen, und zwar unter Verwendung linearer Algebra und einer Kalibrierungsmatrix. Ein bevorzugtes Verfahren zum Entwickeln der Kalibrierungsmatrix wird nun beschrieben unter Verwendung des Vierkanalsystems der bevorzugten Ausführungsform als Beispiel. Zunächst wird ein Reaktionsgefäß, das nur einen Reaktionspuffer beinhaltet, optisch gelesen unter Verwendung von optischen Anordnungen 68, 70. Der Reaktionspuffer sollte ein Fluid sein, das gleich oder fast identisch mit den Reaktionsmischungen ist, die mittels der optischen Anordnungen während der tatsächlichen Produktionsverwendung des Systems, um Proben zu testen, optisch gelesen werden. Der Reaktionspuffer sollte keine Farbstoffe beinhalten, so dass die Konzentrationen aller Farbstoffe gleich Null ist. Das optische Auslesen des Reaktionspuffers in den vier Haupterfassungskanälen produziert vier Ausgabesignale, welche in entsprechende digitale Werte umgewandelt werden. Diese vier Zahlen werden Puffer (I) genannt, wobei I gleich 1,2,3 oder 4 ist, abhängig davon, welcher Erfassungskanal ausgelesen wird. Die Pufferwerte sind eine Messung des Hintergrundsignals oder Streulichts, welches in jedem Haupterfassungskanal erfasst wird, ohne jedes addierte fluoreszierende Signal von Farbstoffen.
Anschließend wird eine Reaktionsmischung mit einer bekannten Konzentration, beispielsweise 100 nM, von Farbstoff #1 in das Gefäß eingefügt, und dann werde die vier Kanäle noch einmal ausgelesen. Die vier produzierten Nummern werden Rawdye(I,1) genannt. Ähnliche Sätze von vier Nummern werden beschafft für die anderen drei Farbstoffe, um Rawdye(I,2), Rawdye(I,3) und Rawdye (I,4) zu beschaffen. Die Pufferwerte werden dann von den Rohfarbstoffwerten (Rawdye) subtrahiert, um die Netto-Farbstoffwerte wie folgt zu beschaffen: Netdye (I, J) = Rawdye (I, J) – Puffer (I);wobei I den Erfassungskanal bezeichnet und J die Farbstoffnummer.
Die Matrix Netdye(I,J) wird dann invertiert unter Verwendung von numerischen Standardverfahren (beispielsweise der Gauss'schen Eliminierung), um eine neue Matrix zu beschaffen, die als Kalibrierungsmatrix Cal(I,J) bezeichnet wird. Es wird darauf hingewiesen, dass das Matrixprodukt aus Netdye(I,J)*Cal(I,J) die Einheitsmatrix ist. Jede Reaktionsmischung kann nun ausgelesen werden, und die Ausgabesignale der Detektoren in den vier Erfassungskanälen können in Werte umgewandelt werden, die für die wahren Konzentrationen der Farbstoffe in der Mischung stehen. Das optische auslesen der Mischung produziert vier Nummern, die RawMix(I) genannt werden. Die Reaktionspufferwerte werden dann von den RawMix Werten subtrahiert, um vier Zahlen zu erhalten, die Mix(I) genannt werden, und zwar wie folgt: Mix (I) = RawMix (I) – Puffer (I)
Anschließend werden die wahren Konzentrationen der Farbstoffe durch Matrixmultiplikation wie folgt beschafft: Truedye (I) = 100mN*Cal (I,J) * Mix(I)
In der oben benannten Gleichung stammt der Faktor 100 aus der Tatsache, dass eine Konzentration von 100 nM für die anfängliche Kalibrierungsmessungen verwendet wurde. Die Konzentration von 100 nM wird nur zu Zwecken des Beispieles verwendet und soll den Bereich der Erfindung nicht begrenzen. Im allgemeinen sollten die Farbstoffkonzentrationen für die Kalibrierungsmessungen irgendwo im Bereich von 25 bis 2000 nM liegen, abhängig von der Fluoreszenzeffizienz (Stärke) der Farbstoffe und ihrer Verwendung in einem bestimmten Versuch. Wenn sie einem Benutzer angezeigt werden, können die fluoreszierenden Signalwerte normalisiert werden auf eine beliebige Skala mit beliebigen Einheiten der Fluoreszenz-Intensität (z.B. eine Skala, die von 0 bis 1000 Einheiten reicht).
Wieder mit Bezug auf die 22 und 23 werden die Matrizen Cal(I,J) und Puffer(I) vorzugsweise produziert während der Herstellung jedes Wärmetauschermoduls 60 und in dem Speicher 160 gespeichert. Wenn das Modul 60 in der Basisinstrument 110 gesteckt wird, liest die Steuerungs-Software-Anwendung in dem Basisinstrument oder externen Computer die Matrizen in den Speicher und verwendet die Matrizen, um die Ausgabesignale der Detektoren 102 in werte umzuwandeln, die die Konzentration jedes Farbstoffs in der Reaktionsmischung anzeigen. Weil die Kalibrierungsmatrizen Cal(I,J) und Puffer (I) von dem jeweiligen kalibrierten Satz von Farbstoffen abhängig sind und vom Volumen des Reaktionsgefäßes, ist auch bevorzugt, mehrere Sätze der Matrizen für verschiedene Kombinationen von Farbstoffsätzen und Reaktionsgefäßvolumina zu produzieren und zu speichern. Dies verschafft dem Endbenutzer eine größere Flexibilität beim Verwenden des Systems. Als ein Beispiel können Kalibrierungsmatrizen für drei unterschiedliche Farbstoffsätze gespeichert werden, um diese mit drei unterschiedlichen Größen von Reaktionsgefäßen zu verwenden (beispielsweise 25, 50 und 100 ml) für insgesamt neun unterschiedliche Sätze von Kalibrierungsmatrizen. In einer möglichen Implementierung des Vier-Kanal-Systems werden drei der optischen Kanäle dazu verwendet, amplifizierte Nukleinsäure-Sequenzen zu erfassen, während der vierte Kanal dazu verwendet wird, eine interne Steuerung zu überwachen, um die Leistungsfähigkeit des Systems zu überprüfen. Beispielsweise wird Beta-Actin oft als interne Steuerung bei Nukleinsäure-Amplifikationsreaktionen verwendet, weil es eine vorhersagbare Amplifikationsantwort hat und einfach gekennzeichnet werden kann und überwacht werden kann, um sicherzustellen, dass die Amplifikation korrekt stattfindet.
Wieder mit Bezug auf 20 speichert die Steuerung 112 im Speicher die dekonvolvierten fluoreszierenden Signalwerte, die für jeden primären Erfassungskanal bei jeder verwendeten Reaktionsstelle bestimmt worden sind. Die Signalwerte werden vorzugsweise in einem Feld gespeichert, das indiziert ist durch Reaktionsstelle, Erfassungskanal und Zykluszahl (oder Zeitwert für die isothermische Amplifikation). Die für einen bestimmten Erfassungskanal bei einer bestimmten Stelle gespeicherten Signalwerte definieren eine Wachstumskurve für eine Ziel-Nukleinsäuresequenz, die an dieser Stelle amplifiziert und in diesem Kanal erfasst wird. Die gespeicherten Werte für die fluoreszierenden Signale können dazu verwendet werden, eine quantitative Analyse (beispielsweise eine quantitative PCR Analyse) der jeweiligen Reaktionsmischungen unter Verwendung in der Technik bekannter Methoden auszuführen.
Ein Vorteil der Vorrichtung gemäß der bevorzugten Ausführungsform ist, dass sie eine extrem schnelle Aufheizung und Abkühlung einer Reaktionsmischung gewährleisten kann. Diese sehr schnelle Aufheizung und Abkühlung ist insbesondere nützlich für die Nukleinsäure-Amplifikation aufgrund der gesteigerten Geschwindigkeit, mit welcher die Amplifikation erreicht werden kann, und weil die Wahrscheinlichkeit, dass unerwünschte und interferierende Seitenprodukte wie beispielsweise PCR Primer-Dimer oder anormale Ampliconen erzeugt werden, signifikant reduziert ist. Ein anderer Vorteil der Vorrichtung ist, dass sie die empfindliche Echtzeiterfassung zumindest eines Analyts in einer Reaktionsmischung ermöglicht, während die Reaktion ausgeführt wird.
26 zeigt ein Reaktionsgefäß 180 gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung. Das Gefäß bzw. der Behälter 180 gleicht dem Behälter der bevorzugten Ausführungsform (bereits beschrieben mit Bezug auf die 1 und 2), abgesehen davon, dass der Behälter 180 eine kleinere Reaktionskammer 184 hat. Die Größe der Kammer 184 ist definiert durch die Seitenwände 186A, 186B, 188A, 188B und durch die Dicke des starren Rahmens 182. In dieser Ausführungsform hat jede der Seitenwände 186A, B, 188A, B eine Länge L von ungefähr 5 mm, die Kammer hat eine Breite W von ungefähr 7 mm, und die Kammer hat eine Dicke T von 1 mm, so dass die Kammer eine Volumenkapazität von ungefähr 25 ml hat. Der Vorteil des Behälters 180 ist, dass er ein kleineres Volumen der Reaktionsmischung hält, so dass die Mischung weniger Reagenz erfordert. Der Nachteil ist, dass das kleinere Volumen zu einer verminderten Empfindlichkeit bei der Erfassung von in geringer Konzentration vorhandenen Analyten wie beispielsweise Nukleinsäuren, führen kann. Der Behälter 180 demonstriert, dass die Reaktionsbehälter der vorliegenden Erfindung mit Kammern mit unterschiedlichen Volumenkapazitäten, vorzugsweise im Bereich von 5 bis 200 Mikrolitern, hergestellt werden können. Gegenwärtig wird bevorzugt, jeden der Behälter mit im wesentlichen der gleichen Rahmengröße herzustellen, unabhängig von der Volumenkapazität der Kammer, so dass jeder der Behälter mit einem gleich großen Wärmetauschermodul 60 (8) verwendet werden kann.
27 zeigt einen Reaktionsbehälter 190 gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung. Der Behälter 190 gleicht dem Behälter der bevorzugten Ausführungsform (beschrieben mit Bezug auf die 1 und 2), abgesehen davon, dass der Behälter 190 einen elastomerischen Plungerkolben 192 hat. Der Plungerkolben 192 ist aufgebaut aus einem elastomerischen Material, beispielsweise einem thermischen plastischen Elastomer (TPE) oder Silikon. Der elastomerische Plungerkolben 192 beinhaltet vorzugsweise einen Verschlussring 194, der eine Dichtung mit den Wänden des Kanals 193 aufbaut, wenn der Plungerkolben in den Kanal eingebracht wird, um Gas in dem Behälter zu komprimieren und den Druck in der Kammer 191 anzuheben. Der Plungerkolben 192 kann eine Eingriffsöffnung beinhalten, so dass ein Bestückungsautomat den Plungerkolben aufnehmen und in den Kanal hinein platzieren kann.
28 zeigt einen Reaktionsbehälter 250 gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung. Der Behälter 250 ist gleich dem Behälter der bevorzugten Ausführungsform (beschrieben mit Bezug auf die 1 und 2, abgesehen davon, dass der Behälter 250 mehrere zusätzliche Merkmale hat. Insbesondere hat der Plungerkolben 252 dieses Behälters eine Plungerkolbenkappe 259, an welcher rampenförmige Vorsprünge 260A, B ausgeformt sind. Der Behälter beinhaltet entsprechende rampenförmige Vorsprünge 262A, B, die vorzugsweise an den Fingergriffen 26 ausgeformt sind und auf gegenüberliegenden Seiten der Öffnung 14 positioniert sind. Die entsprechenden Sätze rampenförmiger Vorsprünge geraten miteinander in Eingriff und ermöglichen ein einfaches Abdrehen des Plungerkolbens 252, wenn dies gewünscht ist, nachdem der Behälter 250 benutzt worden ist.
Der Plungerkolben 252 beinhaltet auch einen Schaft 254, der in einer Zunge 258 mündet. Wie in 29 dargestellt, hat der Schaft 254 eine Länge, die im wesentlichen gleich der Länge des Kanals 228 ist, so dass die Spitze der Zunge 258 am Ende des Kanals 28 angrenzend an den Eingang 266 zu der Kammer 17 positioniert ist, wenn der Plungerkolben 252 vollständig in den Kanal eingebracht ist. Der Vorteil der Zunge 258 ist, dass sie eine physikalische Barriere bietet, um zu verhindern, dass die Reaktionsmischung in der Kammer 17 aufsprudelt (refluxing) oder in den Kanal 28 hinein verdampft, wenn die Mischung erhitzt wird. Wie in 30 dargestellt, kann die Kappe 259 auch eine Eingriffsöffnung 246 sowie Ausrichteöffnungen 48A, B beinhalten, um ein automatisiertes Aufnehmen und Platzieren des Plungerkolbens in den Kanal hinein zu ermöglichen.
31 zeigt einen Reaktionsbehälter 268 gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung. Der Behälter 268 hat einen Plungerkolben 270, der sich von dem Plungerkolben der bevorzugten Ausführungsform (oben beschrieben mit Bezug auf die 1 und 2) unterscheidet. Der Plungerkolben 270 beinhaltet auch einen Schaft 272 und einen elastomerischen Ring 274, der den Schaft 272 kreisförmig umgibt. Wenn der Plungerkolben 270 in den Kanal 228 hineingebracht wird, baut der Ring 274 eine Dichtung mit den Wänden des Kanals auf. Wenn diese Dichtung aufgebaut ist, komprimiert ein weiteres Einführen des Plungerkolbens 22 in den Kanal 28 hinein die Luft in dem Kanal und erzeugt die gewünschte Unterdrucksetzung der Kammer 17 (beispielsweise 12 bis 350 kPa oberhalb des Umgebungsdrucks oder noch besser 55 bis 105 kPa oberhalb des Umgebungsdrucks, wie bereits in der bevorzugten Ausführungsform beschrieben). Die Wände des Kanals 28 können, wenn dies gewünscht ist, Drucksteuernuten haben, wie oben mit Bezug auf die 7A–7D erläutert, um einen gesteuerten Druckhub des Plungerkolbens 270 zu schaffen. Alternativ können die Drucksteuernuten aber auch weggelassen werden, so dass der Druckhub dann beginnt, wenn der Ring 274 in den Kanal 28 eintritt und eine Dichtung mit den Wänden des Kanals aufbaut.
Der Plungerkolben 270 beinhaltet auch zwei Flansche 276A, B, die sich radial von dem Schaft 272 aus erstrecken. Die Flansche 276A, B sind auf gegenüberliegenden Seiten des Rings 274 positioniert, um den Ring in einer festen Position an dem Schaft 272 zu halten. der Plungerkolben 270 kann optional einen Kopf 278 am Ende des Schaftes 272 haben, um eine physikalische Barriere gegen ein Verdampfen oder einen Rückfluss oder Rückstrom der Reaktionsmischung in der Kammer 17 zu bieten, ähnlich wie die zuvor mit Bezug auf die 29 beschriebene Zunge. Mit der Ausnahme des elastomerischen Rings 274 ist der Plungerkolben 270 vorzugsweise als einstückiges polymerisches Element hergestellt (beispielsweise aus Polypropylen oder Polycarbonat) unter Verwendung bekannter Spritzgussvorgänge. Nachdem der Körper des Plungerkolbens 270 ausgeformt worden ist, wird der Ring 274 über den Kopf 278 hinüber gestreckt und an dem Schaft 270 zwischen den Flanschen 276A, B positioniert. Der Ring 274 kann jedes geeignete elastomerische Material aufweisen, beispielsweise ein thermisches plastisches Elastomer (TPE) oder Silikon. Wie in 32 dargestellt, kann die Plungerkolbenkappe 280 optional eine Eingriffsöffnung 46 und Ausrichteöffnungen 48A, B beinhalten, um ein automatisches Aufnehmen und Platzieren des Plungerkolbens in den Kanal hinein zu ermöglichen.
33 zeigt eine alternative Ausführungsform der Erfindung, bei welcher das Unterdrucksetzen des Behälters 12 durch einen Bestückungsautomaten 282 mit einem Automatenkopf 284 ausgeführt wird. Der Automatenkopf 284 hat eine axiale Bohrung 286 für die Kommunikation mit dem Kanal 28 des Behälters. Der Bestückungsautomat 282 beinhaltet auch eine geregelte Druckquelle in Fluidverbindung mit der Bohrung 286 zum Unterdrucksetzen des Behälters 12 durch die Bohrung 286 hindurch. Die Druckquelle kann beispielsweise eine Spritzenpumpe aufweisen, eine Druckluftquelle, eine pneumatische Pumpe oder einen Anschluss an eine externe Luftzufuhr. Die Vorrichtung beinhaltet vorzugsweise auch einen Wegwerf-Adapter 288, um die Bohrung 286 in Fluidverbindung mit dem Kanal 28 zu bringen. Der Adapter 288 hat eine axiale Bohrung 290, die die Bohrung 286 in dem Maschinenkopf oder Automatenkopf mit dem Kanal 28 in dem Behälter verbindet. Der Adapter 288 ist so bemessen, dass er so in den Kanal 28 eingebracht werden kann, dass der Adapter eine Abdichtung mit den Wänden des Kanals aufbaut. Der Adapter 282 weist vorzugsweise ein elastomerisches Material auf, beispielsweise ein thermisches plastisches Elastomer (tpe) oder Silikon. Der Adapter 288 beinhaltet vorzugsweise ein Einwegeventil 292 (beispielsweise ein Rückschlagventil), um zu verhindern, dass Fluid aus dem Behälter 12 entweicht.
Während des Betriebs wird der Behälter 12 vorzugsweise in ein Wärmetauschmodul hinein platziert und mit einer Reaktionsmischung befüllt, wie zuvor in der bevorzugten Ausführungsform beschrieben. Der Behälter kann manuell durch einen menschlichen Bediener befüllt werden oder alternativ kann der Bestückungsautomat 282 eine Pipette zum befüllen des Behälters beinhalten. Nachdem die Kammer 17 mit der Reaktionsmischung befüllt worden ist, nimmt der Maschinenkopf 284 den Adapter 288 auf und bringt den Adapter in den Kanal 28 ein. Um den Adapter 288 aufzunehmen und zu platzieren, hat der Automatenkopf 284 vorzugsweise eine Spannhülse zum Ergreifen und Loslassen des Adapters 288. Alternativ kann der Automatenkopf so bemessen sein, dass er eine Press- oder Reibpassung mit dem Adapter 288 aufbaut. Wenn er in den Kanal 28 eingebracht ist, baut der Adapter 288 eine Abdichtung mit den Wänden des Kanals auf. Der Bestückungsautomat 282 übermittelt dann Gas, vorzugsweise Luft, von der Druckquelle aus in den Kanal 28 hinein, um den Druck in der Kammer 17 zu erhöhen. Der Strom von Luft in den Behälter 12 hinein wird angehalten, wenn die gewünschte Unterdrucksetzung der Kammer 17 erreicht ist.
Die gewünschte Druckbeaufschlagung der Kammer 17 in dieser Ausführungsform ist die gleiche wie die in der bevorzugten Ausführungsform oben beschriebenen. Wie in 5 dargestellt, sollte der Druck in der Kammer 17 ausreichend hoch sein, um sicherzustellen, dass die flexiblen Hauptwände 18 der Kammer sich nach außen ausdehnen, um die Oberflächen der Platten 50A, B zu berühren und sich an diese anzupassen. Der Druck sollte jedoch nicht so groß sein, dass die Wände 18 zerbersten, sich von dem Rahmen 16 lösen oder den Rahmen oder die Platten verformen. Es wird gegenwärtig bevorzugt, die Kammer 17 auf einen Druck in dem Bereich von 12 bis 350 kPa oberhalb des Umgebungsdrucks zu bringen. Dieser Bereich wird bevorzugt, weil 12 kPa allgemein genug sind, um eine Konformität zwischen den flexiblen Wänden 18 und den Oberflächen der Platten 50A, 50B sicherzustellen, während Drücke oberhalb von 350 kPa zu einem Zerbersten der Wände 18 oder einer Verformung des Rahmens 16 oder der Platten 50A, B führen können. Noch besser wird die Kammer 17 auf einen Druck im Bereich von 55 bis 105 kPa innerhalb des Umgebungsdrucks gebracht. Dieser Bereich wird stärker bevorzugt, weil er sich sicher innerhalb der oben beschriebenen praktischen Grenzen bewegt, um jegliche durch die Herstellung oder den Betrieb entstehende Abweichungen von der Spezifikation zuzulassen.
Wieder mit Bezug auf 33 wird der Automatenkopf 284 von dem Adapter 288 anschließend an die Druckbeaufschlagung des Behälters 12 gelöst. Wenn der Maschinenkopf 284 von dem Adapter 288 gelöst wird, verhindert das Ventil 292, dass Fluid aus dem Behälter 12 entweicht. So verbleibt die Kammer 17 für die thermische Bearbeitung druckbeaufschlagt, und der Behälter 12 ist effektiv verschlossen, um zu verhindern, dass die Reaktionsmischung in dem Behälter die externe Umgebung verunreinigt. Der restliche Betrieb dieser Ausführungsform ist analog zu dem Betrieb der bevorzugten Ausführungsform, die oben beschrieben ist.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung gibt der Automatenkopf 284 Fluid in den Behälter 12 durch die Bohrung 286 aus, um die Kammer 17 in einem einzigen Schritt zu befüllen und druckzubeaufschlagen. In dieser Ausführungsform hat der Bestückungsautomat 282 eine steuerbare Vakuum- und eine steuerbare Druckquelle in Verbindung mit dem Automatenkopf 284 zum Ansaugen uns Ausgeben von Fluiden durch die Bolzen 286 hindurch. Diese Vakuum- und Druckquellen können beispielsweise zumindest eine Spritzenpumpe aufweisen, Druckluftquellen, pneumatische Pumpen, Vakuumpumpen oder Anschlüsse an externe Druckquellen. Während des Betriebs saugt der Automatenkopf 284 eine Reaktionsmischung in die Bolzen 286 hinein. Der Maschinenkopf 284 baut dann einen Verschluss mit der Öffnung 14 und/oder dem Kanal 28 des Behälters auf und gibt die Reaktionsmischung in die Kammer 17 aus. Der Maschinenkopf 284 kann dazu ausgestaltet sein, den Behälter 12 direkt zu kontaktieren, um die Öffnung 14 oder den Kanal 28 zu verschließen. Um potentielle Verunreinigungsprobleme zu reduzieren, wird jedoch stärker bevorzugt, dass ein Adapter wie der oben beschriebene Adapter 288 verwendet wird, um den Automatenkopf 284 in Fluidverbindung mit dem Behälter 12 zu bringen.
Wenn die Reaktionsmischung in die Kammer 17 eingefügt wird, wird das Volumen von in dem Behälter 12 gefangenem Fluid vergrößert, so dass die gewünschte Druckbeaufschlagung der Kammer 17 verursacht wird (beispielsweise 12 bis 350 kPa oberhalb des Umgebungsdrucks, wie zuvor beschrieben). So führt die Befüllung der Kammer 17 mit der Reaktionsmischung auch in einem einzigen Schritt zu einer schnellen und bequemen Druckbeaufschlagung. Alternativ kann der Bestückungsautomat 282 auch dazu programmiert sein, den Druck in dem Behälter 12 dadurch zu erhöhen oder abzusenken, dass Luft in den Kanal 28 eingebracht wird oder Luft aus dem Kanal ausgelassen wird durch den Maschinenkopf 284, wie dies geeignet ist, um den gewünschten Druck in der Kammer 17 zu erreichen. Der Bestückungsautomat 282 beinhaltet für diesen Zweck vorzugsweise einen Druckregler. Viele Variationen dieser Ausführungsform sind möglich. Beispielsweise kann vor dem Hinzufügen der Reaktionsmischung in die Kammer 17 in dem Behälter 12 ein geringer Druck oder ein Vakuum herrschen. Um die Kammer 17 zu befüllen und druckzubeaufschlagen, gibt der Bestückungsautomat 282 zunächst die Reaktionsmischung in die Kammer 17 durch den Automatenkopf 284 hindurch aus und strömt dann Luft von der steuerbaren Druckquelle aus in den Kanal 28 hinein, durch den Automatenkopf, um die gewünscht Druckbeaufschlagung der Kammer 17 zu erreichen. Der Automatenkopf 284 kann eine einzelne Bohrung haben oder alternativ zumindest zwei Bohrungen (beispielsweise eine erste Bohrung zum Ansaugen und Ausgeben einer Probe und eine zweite Bohrung zum Hinzufügen oder Entfernen von Gas aus dem Behälter, um die gewünschte Druckbeaufschlagung der Kammer 17 zu erreichen.
34 zeigt eine andere Ausführungsform der Erfindung, in welcher die Befüllung und Druckbeaufschlagung des Behälters 12 durch einen Bestückungsautomaten 300 mit einem Automatenkopf 302 zum Manipulieren einer Nadel 306 ausgeführt wird. Der Automatenkopf 302 hat eine axiale Bohrung 304 für die Kommunikation mit der Nadel 306. Der Bestückungsautomat 300 hat eine steuerbare Vakuum- und eine steuerbare Druckquelle in Verbindung mit der Bohrung 304 zum Ansaugen und Ausgeben von Fluiden unter Verwendung der Nadel 306. Die Vakuum- und Druckquellen können beispielsweise zumindest eine Spritzenpumpe aufweisen, Druckluftquellen, pneumatische Pumpen, Vakuumpumpen oder Anschlüsse an externe Druckquellen. Der Automatenkopf 302 gerät in Eingriff mit der Nadel 306 unter Verwendung irgendeines Standardnadel-Passstücks wie beispielsweise einer Luer-Arretierung. Die Nadel 306 ist vorzugsweise eine Nadel mit zwei Bohrungen, nämlich einer ersten Bohrung 308A zum Einspritzen von Fluid in den Behälter 12 hinein und einer zweiten Bohrung 308B zum Auslassen von Gas aus dem Behälter. Aus Gründen, die recht bald klar sein werden, ist die erste Bohrung 308A länger als die zweite Bohrung 308B.
Die Vorrichtung beinhaltet auch einen elastomerischen Stopfen 310, der in den Kanal 28 des Behälters so eingebracht ist, dass der Stopfen einen Verschluss mit den Wänden des Kanals bildet. Die Nadel 306 wird durch den Stopfen 310 hindurch mittels des Automatenkopfes 302 gebracht, um die Kammer 17 zu befüllen und druckzubeaufschlagen. Der elastomerische Stopfen 310 sollte selbstdichtend sein, so dass er Fluid innerhalb des Behälters 12 abdichtet, wenn die Nadel 306 aus dem Stopfen 310 herausgezogen wird. Der Stopfen 310 wird vorzugsweise in den Kanal 28 während der Herstellung des Behälters 12 eingebracht. Alternativ kann der Stopfen 310 aber auch in den Kanal 28 direkt vor der Verwendung des Behälters 12 eingebracht werden, beispielsweise kann der Stopfen durch einen robotischen Arm oder eine Automatenspitze des Bestückungsautomaten 300 eingebracht werden, oder der Stopfen kann auch manuell von einem menschlichen Bediener eingebracht werden.
Während des Betriebs wird der Behälter 12 vorzugsweise in ein Wärmetauschmodul hinein platziert, wie zuvor bereits in der bevorzugten Ausführungsform beschrieben, nämlich beispielsweise durch die Bestückungsmaschine 300. Der Behälter 12 wird dann befüllt und druckbeaufschlagt mittels des Bestückungsautomaten 300, und zwar wie folgt. Der Automatenkopf 302 nimmt die Nadel 306 auf und saugt die Reaktionsmischung in die Nadel hinein durch die erste Bohrung 308A. Der Automatenkopf 302 setzt dann die Nadel durch den Stopfen 310 hindurch so ein, dass die erste Bohrung 308A in Fluidverbindung mit den Kanal 28 ist und die zweite Bohrung 308B an ihrem einen Ende in dem Kanal 28 vorgesehen ist und an ihrem zweiten Ende außerhalb des Behälters 12 und des Stopfens 310. Der Bestückungsautomat 300 gibt dann die Reaktionsmischung in die Kammer 17 hinein durch die erste Bohrung 308A der Nadel aus. Wenn die Kammer 17 befüllt ist, wird verdrängte Luft in dem Behälter 12 durch die zweite Bohrung 308B hindurch in die Atmosphäre abgegeben.
Wie in 35 dargestellt, zieht der Maschinenkopf 302 die Nadel 306 dann teilweise aus dem Stopfen 310 zurück, nachdem die Kammer 17 mit der Reaktionsmischung befüllt worden ist. Die Nadel 306 wird so teilweise zurückgezogen, dass das Ende der ersten Bohrung 308A immer noch in Fluidverbindung mit dem Kanal 28 steht, aber das Ende der zweiten Bohrung 308B innerhalb des Stopfens 310 eingeschlossen ist. In dieser Position kann die zweite Bohrung 308B nicht länger Luft aus dem Kanal 28 auslassen. Der Bestückungsautomat 300 strömt dann Gas, vorzugsweise Luft, aus der steuerbaren Druckquelle in den Kanal 28 hinein durch die erste Bohrung 308A, um den Druck in der Kammer 17 zu erhöhen. Der Automat 282 hält dann den Luftstrom an, wenn die gewünschte Druckbeaufschlagung der Kammer 17 erreicht ist.
Die gewünschte Druckbeaufschlagung der Kammer 17 in dieser Ausführungsform ist die gleiche wie bei den zuvor beschriebenen Ausführungsformen, nämlich beispielsweise 12 bis 350 kPa und noch besser 55 bis 105 kPa, aus den oben bereits diskutierten Gründen. Anschließend an die Druckbeaufschlagung zieht der Automatenkopf 302 die Nadel 306 vollständig aus dem Stopfen 310 heraus, und der Stopfen 310 dichtet selbst, um den gewünschten Druck in dem Behälter 12 für die thermische Bearbeitung beizubehalten. Die Nadel 306 ist vorzugsweise eine Wegwerfnadel, um eine Querverunreinigung von Fluidproben zu verhindern. Ansonsten ist die Arbeitsweise dieser Ausführungsform analog zu der Arbeitsweise der oben beschriebenen bevorzugten Ausführungsform.
36 zeigt eine geringfügig andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, bei welcher der Automatenkopf 302 eine Nadel 312 mit einer einzigen Bohrung manipuliert, um die Kammer 17 in einem einzigen Schritt zu befüllen und druckzubeaufschlagen. Während des Betriebs nimmt der Maschinenkopf 302 die Nadel 312 auf und saugt die Reaktionsmischung in die Nadel hinein. Der Automatenkopf 302 bringt dann die Nadel 312 durch den Stopfen 310 hindurch ein und gibt die Reaktionsmischung in die Kammer 17 aus. Gegenwärtig wird bevorzugt, dass die Kammer 17 von unten aus, d.h. vom Boden aus befüllt wird, indem die Nadel 312 zunächst nahe am Boden der Kammer 17 eingebracht wird und langsam zurückgezogen wird, wenn die Kammer 17 befüllt wird. Das Befüllen der Kammer 17 auf diese Art und Weise reduziert die Wahrscheinlichkeit, dass Luftbläschen sich in der Kammer bilden.
Mit Bezug auf 37 verdrängt, wenn die Reaktionsmischung in die Kammer 17 eingebracht wird, die Mischung Luft in dem Behälter. Die verdrängte Luft wird gefangen zwischen der Oberfläche der Flüssigkeit S und dem Stopfen 310, so dass die Luft in dem Kanal 28 komprimiert wird. Die Kompression der Luft reicht normalerweise aus, um den gewünschten Druck von beispielsweise 12 bis 350 kPa oberhalb des Umgebungsdrucks in der Kammer 17 zu erreichen, noch besser zwischen 55 bis 105 kPa oberhalb des Umgebungsdrucks. So führt das Befüllen der Kammer 17 in einem einzigen Schritt auch zu einer schnellen und bequemen Druckbeaufschlagung. Alternativ kann der Bestückungsautomat 300 dazu programmiert sein, den Druck im Behälter 12 durch Hinzufügen von Luft zu dem Kanal 28 oder Auslassen von Luft aus dem Kanal durch die Nadel 312 anzuheben oder abzusenken, wie dies geeignet ist, um die gewünschte Druckbeaufschlagung in der Kammer 17 zu erreichen. Die Maschine 300 beinhaltet vorzugsweise einen Druckregler für diesen Zweck. Geeignete Druckregler sind in der Technik bekannt.
Nachdem die gewünschte Druckbeaufschlagung in der Kammer 17 erreicht ist, zieht der Automatenkopf 302 die Nadel 312 aus dem Stopfen 310 heraus, und der Stopfen 310 dichtet selbst ab, um den Druck in dem Behälter 12 für die thermische Bearbeitung beizubehalten. Viele verschiedene Variationen dieser Ausführungsform sind möglich. Beispielsweise kann vor dem Hinzufügen der Reaktionsmischung in die Kammer 17 hinein ein geringer Druck oder ein Vakuum in dem Behälter 12 herrschen. Um die Kammer 17 zu befüllen und unter Druck zu setzen, gibt der Bestückungsautomat 300 zunächst die Reaktionsmischung in die Kammer 17 durch die Nadel 312 hindurch hinein und zieht das Ende der Nadel in den Kanal 28 zurück. Der Automat 300 strömt dann Luft aus der steuerbaren Druckquelle in den Kanal 28 hinein durch die Nadel 312, um die gewünschte Druckbeaufschlagung der Kammer 17 zu erreichen. Der Automatenkopf 302 zieht dann die Nadel 312 aus dem Stopfen 310 zurück, und der Stopfen 310 dichtet sich selbst ab, um den Druck in dem Behälter 12 für die thermische Bearbeitung beizubehalten. Die Arbeitsweise dieser Ausführungsform ist ansonsten gleich wie die Arbeitsweise der oben beschriebenen bevorzugten Ausführungsform.
38 zeigt eine andere Ausführungsform (nicht Teil der Erfindung), bei welcher das Verschließen und Druckbeaufschlagen des Behälters 12 durch eine Presse 314 mit einer Heizplatte 316 zum Heißsiegeln eines Films oder einer Folie 318 auf den Bereich des Rahmens 16 ausgeführt wird, der die Öffnung 14 bildet. Die Folie 18 ist vorzugsweise ein Laminat, das eine Metallschicht (beispielsweise Aluminiumschicht) oben auf einer Schicht aus einem polymerischen Material (beispielsweise Polypropylen oder Polyester) aufweist. Während des Betriebs wird der Behälter 12 vorzugsweise in einem Halter platziert (beispielsweise einer Aufnahme oder Auflage), der sich auf einer Montagelinie für die automatisierte Befüllung, das automatisierte Verschließen und die automatisierte Druckbeaufschlagung des Behälters bewegt. In einem ersten Schritt wird die Kammer 17 des Behälters mit einer Reaktionsmischung unter Verwendung von beispielsweise einer Pipette oder Spritze befüllt. Nachdem die Kammer 17 befüllt worden ist, wird die Folie 318 oben auf der Öffnung 14 platziert, wobei die Metallschicht nach oben weist. Die Folie 318 kann manuell durch einen menschlichen Bediener auf dem Behälter platziert werden, oder besser noch durch den robotischen Arm eines Bestückungsautomaten. Der Behälter 12 wird dann unter die Heizplatte 316 für das Versiegeln und Druckbeaufschlagen bewegt. Die Platte 316 wird dann oben auf den Behälter 12 gepresst, und die Platte 316 siegelt die Folie 318 auf den Behälter, um die Öffnung 14 zu verschließen.
Wie in 39 dargestellt, schmilzt die Hitze von der Platte 316 auch den oberen Bereich des Rahmens 16 an, so dass ein Ende des Kanals 28 zusammenfällt und eine kollabierte Zone 319 entsteht. Das Volumen des Kanals 28 reduziert sich damit. Die Verminderung des Volumens des Kanals 28, nachdem die Öffnung verschlossen worden ist, komprimiert Luft, die in dem Kanal gefangen ist, und führt zu der gewünschten Druckbeaufschlagung der Kammer 17. Die gewünschte Druckbeaufschlagung in der Kammer 17 ist in dieser Ausführungsform gleich wie in den oben beschriebenen Ausführungsformen, beispielsweise 12 bis 350 kPa oberhalb des Umgebungsdrucks, und noch besser 55 bis 105 kPa oberhalb des Umgebungsdrucks. Nachdem der Behälter 12 auf diese Art und Weise verschlossen und druckbeaufschlagt worden ist, wird er aufgenommen und in eines der Wärmetauschmodule 60 (20) hinein für die thermische Bearbeitung und optische Erfassung platziert. Die Arbeitsweise dieser Ausführungsform ist ansonsten gleich wie die der oben beschriebenen bevorzugten Ausführungsform.
Die gewünschte Druckbeaufschlagung in der Kammer 17 kann durch die Verwendung der nun folgenden Gleichung erreicht werden: Pi*Vi = Pf*Vf,wobei
Pi gleich dem Anfangsdruck in dem Behälter 12 vor dem Verschließen der Öffnung ist,
Vi gleich dem Anfangsvolumen des Kanals 28 vor dem Zusammenfallenlassen eines Endes des Kanals,
Pf gleich dem gewünschten endgültigen Druck in der Kammer 17 ist, und
Vf gleich dem endgültigen Volumen des Kanals 28 nach dem Zusammenfallen eines Endes des Kanals ist.
Um den gewünschten abschließenden Druck Pf in der Kammer 17 sicherzustellen, sollte das Heißsiegeln des Behälters das Volumen des Kanals 28 so reduzieren, dass das Verhältnis der Volumina Vi:Vf im wesentlichen gleich dem Verhältnis der Drücke Pf:Pi ist. Ein Ingenieur mit normalen Fähigkeiten wird fähig sein, geeignete Werte für die Volumina Vi und Vf unter Verwendung der Beschreibung und der oben gegebenen Gleichung auszuwählen. Beispielsweise ist, wenn der Anfangsdruck Pi in dem Behälter gleich einem atmosphärischen Standarddruck von ungefähr 101,3 kPa ist, der gewünschte endgültige Druck Pf gleich 190 kPa (89 kPa oberhalb des Umgebungsdrucks), und das anfängliche Volumen Vi des Kanals gleich 150 μl, dann sollte das Heißsiegeln des Behälters das Volumen des Kanals auf ein endgültiges Volumen Vf von ungefähr 80 μl reduzieren. Dies ist nur ein Beispiel für geeignete Werte für das anfängliche und das endgültige Volumen, und der Bereich der Erfindung ist natürlich nicht auf dieses Beispiel beschränkt. Viele andere geeignete Werte können ausgewählt werden, um die gewünschten Verhältnisse zu erzielen, wie sich dies Fachleuten mit normalen Kenntnissen erschließen wird.
Die verschiedenen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung können in vielen Anwendungen verwendet werden. Die Vorrichtung kann dazu verwendet werden, chemische Reaktionen mit Proben auszuführen, beispielsweise die Nukleinsäure-Amplifikation. Obwohl die Amplifikation mit PCR hier beschrieben ist, kann die Vorrichtung selbstverständlich eine Vielzahl anderer Polynukleotid-Amplifikationsreaktionen und ligand-bindenden Versuchen verwendet werden. Solche zusätzlichen Reaktionen können thermisch zykliert sein, oder sie können auch bei einer einzelnen Temperatur ausgeführt werden, beispielsweise die isothermische Nukleinsäure-Amplifikation. Geeignete isothermische Amplifikations-Verfahren, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung praktiziert werden können, beinhalten, aber sind nicht begrenzt auf, die Rollkreis-Amplifikation (Rolling Circle Amplification, RCA), die Strangversatz-Amplifikation (Strand Desplacement Amplification, SDA), die Q-Beta-Replikase, die nukleinsäure-basierte Sequenz-Amplifikation (NASBA), und die selbsthaltende Sequenz-Replikation (3SR). Andere Anwendungen der Vorrichtung sollen in den Bereich der Erfindung fallen, wenn diese Anwendungen die thermische Steuerung einer Reaktionsmischung erfordern.
ZUSAMMENFASSUNG, KONSEQUENZEN UND BEREICH
Obwohl die oben erfolgte Beschreibung viele Details beinhaltet, sollten diese nicht als Beschränkungen des Bereichs der Erfindung verstanden werden, sondern nur als Beispiele einiger der gegenwärtig bevorzugten Ausführungsformen. Viele Modifikationen oder Substitutionen können an der beschriebenen Vorrichtung und den beschriebenen Verfahren ausgeführt werden, ohne dass der Bereich der Erfindung verlassen wird, wie er in den Ansprüchen definiert ist. Beispielsweise hat in einer alternativen Ausführungsform der Reaktionsbehälter nur eine flexible Materialbahn, die eine Hauptwand der Reaktionskammer bildet. Der starre Rahmen definiert die andere Hauptwand der Kammer und auch die Seitenwände der Kammer. In dieser Ausführungsform sollte die durch den Rahmen gebildete Hauptwand eine minimale Dicke von ungefähr 1,25 mm haben (die praktische minimale Grenze für das Spritzgießen), während die flexible Materialbahn sogar nur 0,0125 mm dünn sein kann. Der Vorteil dieser Ausführungsform ist, dass die Herstellung des Reaktionsbehälters vereinfacht ist und daher weniger teuer ist, da nur eine flexible Materialbahn an dem Rahmen angebracht werden muss. Der Nachteil ist, dass die Aufheiz- und Abkühl-Geschwindigkeiten der Reaktionsmischung wahrscheinlich geringer sind, da die Hauptwand, die durch den Rahmen gebildet wird, wahrscheinlich nicht eine so hohe Geschwindigkeit der Wärmeübertragung ermöglichen wird wie die dünne flexible Materialbahn.
Außerdem erfordert die Vorrichtung nur eine thermische Oberfläche zum Berühren einer flexiblen Wand des Reaktionsbehälters und ein thermisches Element zum Aufheizen und/oder Abkühlen der thermischen Oberfläche. Der Vorteil der Verwendung einer thermischen Oberfläche und eines thermischen Elements ist, dass die Vorrichtung weniger teuer wird. Der Nachteil ist, dass das Aufheizen und Abkühlen wahrscheinlich nur halb so schnell stattfindet. Außerdem kann, obwohl es gegenwärtig bevorzugt wird, dass die thermischen Oberflächen durch thermisch leitende Platten gebildet werden, jede thermische Oberfläche durch irgendeine starre Struktur mit einem Kontaktflächenbereich zum Berühren einer Wand des Behälters vorgesehen sein. Die thermische Oberfläche weist vorzugsweise ein Material mit einer hohen thermischen Leitfähigkeit auf, beispielsweise Keramik oder Metall. Außerdem kann die thermische Oberfläche die Oberfläche des thermischen Elements selbst aufweisen. Beispielsweise kann die thermische Oberfläche die Oberfläche eines Ultraschall-Transduktors sein, die die flexible Wand der Kammer für eine Ultraschall-Aufheizung und/oder ein Lysing der Probe in der Kammer berührt. Alternativ kann die thermische Oberfläche einer thermo-elektrischen Einrichtung sein, die die Wand berührt, um die Kammer aufzuheizen und/oder abzukühlen.
Die in den Optikanordnungen verwendeten Filter können dazu ausgestaltet sein, Anregungs- und Emissionslicht in jedem Wellenbereich zur Verfügung zu stellen, der von Interesse ist, nicht nur in den spezifischen oben beschriebenen Wellenbereichen. Die Auswahl fluoreszierender Farbstoffe für irgendeine gegebene Anwendung hängt ab von den Analyten, für die man sich gerade interessiert. Ein Fachmann wird realisieren, dass unterschiedliche Kombinationen aus Lichtquellen, Filtern oder Filter-Wellenlängen verwendet werden können, um die unterschiedlichen Spitzenanregungs- und -Emissionsspektren der ausgewählten Farbstoffe abzudecken. Obwohl die Erfassung der Fluoreszenz-Anregung und -Emission eine bevorzugte Ausführungsform ist, können auch solche optischen Erfassungsverfahren mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwendet werden, wie sie bei der direkten Absorption und/oder Transmission mit On-axis-Geometrien verwendet werden. Alternative Geometrien wie beispielsweise die On-axis-Ausrichtungen von Lichtquellen und Erfassern, können verwendet werden, um Veränderungen in der Farbstoff-Konzentration und den physikalischen Bedingungen (Temperatur, pH, etc.) einer Reaktion durch Messen der Absorption der Erleuchtung zu überwachen. Die Optiken können auch dazu verwendet werden, eine mit der Zeit abklingende Fluoreszenz zu messen. Außerdem sind die Optiken nicht auf die Erfassung auf der Basis von fluoreszierenden Kennzeichen beschränkt. Die Optiksysteme können anwendbar sein auf die Erfassung auf der Grundlage von phosphoreszierenden Kennzeichen, chemilumineszierenden Kennzeichen oder elektrochemilumineszierenden Kennzeichen.
Daher sollte der Bereich der Erfindung durch die nun folgenden Ansprüche und ihre rechtlichen Äquivalente bestimmt sein.

Claims

Vorrichtung zum Steuern der Temperatur eines Reaktionsgemisches in einem Reaktionsbehältnis (12), wobei das Behältnis (12) eine Reaktionskammer (17) sowie zumindest eine Öffnung (14) zum Einbringen von Fluid in die Kammer (17) beinhaltet, welche Kammer (17) zumindest eine flexible Wand (18) hat, wobei die Vorrichtung folgendes aufweist: a) eine thermische Oberfläche für den Kontakt mit der flexiblen Wand (18); b) eine automatisierte Maschine zum Erhöhen des Drucks in der Kammer (17), wobei der Druckanstieg in der Kammer (17) ausreichend ist, um die flexible Wand (18) in Kontakt mit der thermischen Oberfläche zu zwingen, so dass sie sich an diese anpasst; und c) zumindest ein thermisches Element zum Erhitzen oder Abkühlen der thermischen Oberfläche, um eine Temperaturänderung innerhalb der Kammer (17) zu induzieren, wobei das Behältnis (12) einen Kanal (28) beinhaltet, der die Öffnung (14) mit der Kammer (17) verbindet, dadurch gekennzeichnet, dass die automatisierte Maschine einen Bestückungsautomaten (166, 282, 300) zum Einbringen eines Plungerkolbens (22) in den Kanal hinein und zum Komprimieren von Gas in dem Behältnis (12) aufweist.
Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Vorrichtung eine erste und eine zweite thermische Oberfläche beinhaltet, die durch einander gegenüberliegende Platten (50A, B) gebildet werden, die so positioniert sind, dass sie die Kammer (17) des Behältnisses (12) zwischen sich aufnehmen, und worin mit jeder der Platten (50A, B) ein Heizelement (56) gekoppelt ist.
Vorrichtung nach Anspruch 2, wobei jede der Platten (50) eine thermische Masse von weniger als 5 J/°C hat.
Vorrichtung nach Anspruch 2, wobei jede der Platten (50) eine thermische Masse von weniger als 1 J/°C hat.
Vorrichtung nach Anspruch 1, weiter mit einem optischen System zum optischen Abfragen des in der Kammer (17) vorhandenen Gemischs durch eine erste und eine zweite optisch durchlässige Wand (19A, B) des Behältnisses (12), wobei das optische System zumindest eine Lichtquelle (68) zum Anregen des Gemischs durch die erste Wand (19A) hindurch hat, und zumindest einen Detektor (70) zum Erfassen von von der Kammer (17) durch die zweite Wand (19B) hindurch emittiertem Licht.
Vorrichtung nach Anspruch 5, wobei die Platten (50), die Heizelemente (56) sowie das optische System sich in einem Wärmetauschermodul (60) befinden und die Vorrichtung außerdem ein Basisinstrument (110) zum Aufnehmen dieses Wärmetauschermoduls (60) aufweist, und das Basisinstrument (110) eine Verarbeitungselektronik (130) zum Steuern des Betriebs des Moduls (60) beinhaltet.