DE60016877T2 - NEP-Inhibitoren zur Behandlung von weiblichen sexuellen Störungen - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung eines Wirkstoffes zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von weiblicher Sexualstörung (FSD), insbesondere weiblicher sexueller Erregungsstörung (FSAD). Der Wirkstoff ist ein Inhibitor der neutralen Endopeptidase (I:NEP).
  • Zur Vereinfachung ist eine Liste von Abkürzungen, welche im folgenden Text verwendet werden, vor dem Abschnitt mit den Ansprüchen angegeben.
  • WEIBLICHES SEXUALANSPRECHEN
  • Die weibliche Sexualansprechphase der Erregung lässt sich nicht ohne weiteres von der Phase des Begehrens unterscheiden bis die physiologischen Veränderungen in der Vagina und Klitoris sowie in anderen Sexualorganen sattzufinden beginnen. Die sexuelle Erregung und Lust sind von einer Kombination von vaskulären und neuromuskulären Ereignissen begleitet, welche zum Anschwellen der Klitoris, Schamlippen und Vaginalwand, zu verstärkter vaginaler Lubrikation und zur Dilatation des Vaginallumens führen (Levin, 1980; Ottesen, 1983; Levin, 1991; Levin, 1992; Sjoberg, 1992; Wagner, 1992; Schiavi et al., 1995; Masters et al., 1996; Berman et al., 1999).
  • Die vaginale Schwellung ermöglicht eine Transsudation, und dieser Prozess ist für die verstärkte vaginale Lubrikation verantwortlich. Die Transsudation erlaubt einen Fluss von Plasma durch das Epithel und auf die Vaginaloberfläche, wobei die antreibende Kraft ein erhöhter Blutfluss im vaginalen Kapillarbett während des Erregungszustandes ist. Ausserdem führt die Schwellung zu einer Erhöhung der Vaginallänge und des Lumendurchmessers, insbesondere in den distalen 2/3 des Vaginalkanals. Die Dilatation des Lumens der Vagina ergibt sich aus einer Kombination einer Relaxation der glatten Muskulatur ihrer Wandung und einer Relaxation der Skelettmuskulatur der Untelreibsmuskeln. Von gewissen sexuellen Schmerzstörungen wie Vaginismus wird angenommen, dass sie mindestens teilweise durch eine ungenügende Relaxation verursacht werden, welche eine Dilatation der Vagina verhindert; es bleibt abzuklären, ob dies primär ein Problem der glatten oder der Skelettmuskulatur ist. (Levin, 1980; Ottesen, 1983; Levin, 1991; Levin, 1992; Sjoberg, 1992; Wagner, 1992; Schiavi et al., 1995; Master et al., 1996; Berman et al., 1999).
  • Die Gefässe und Mikrogefässe der Vagina sind von Nerven innerviert, welche Neuropeptide und andere Neurotransmitter-Kandidaten enthalten. Diese umfassen das Calcitonin-Genassoziierte Peptid (CGRP), das Neuropeptid Y (NPY), die Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS), die Substanz P und das vasoaktive intestinale Peptid (VIP) (Hoyle et al., 1996). Die in der Klitoris vorhandenen Peptide werden unten besprochen. Die Stickstoffmonoxid-Synthase, welche oft mit dem VIP kolokalisiert ist, zeigt immunologisch eine stärkere Expression in den tiefen Arterien und Venen gegenüber den Blutgefässen der Propria (Hoyle et al., 1996).
  • WEIBLICHE SEXUALSTÖRUNG
  • Es ist bekannt, dass gewisse Individuen an weiblicher Sexualstörung (FSD) leiden können.
  • FSD wird am besten definiert als die Schwierigkeit oder Unfähigkeit einer Frau, Befriedigung bei der sexuellen Entfaltung zu finden. FSD ist ein kollektiver Begriff für mehrere unterschiedliche weibliche Sexualstörungen (Leiblum, 1998, Berman et al., 1999). Die Frau kann einen Mangel an Begehren, Schwierigkeiten mit der Erregung oder dem Orgasmus, Schmerzen beim Geschlechtsverkehr oder eine Kombination dieser Probleme haben. Mehrere Arten von Erkrankungen, Medikationen, Verletzungen oder psychologische Problemen können FSD verursachen.
  • Studien, welche Sexualstörungen bei Ehepaaren untersuchten, ergaben, dass sich bis zu 76% der Frauen über Sexualstörungen beklagen und dass 30–50% der Frauen in den USA an FSD leiden.
  • Subtypen von FSD umfassen eine Störung mit hypoaktivem sexuellem Begehren, weibliche sexuelle Erregungsstörung, Orgasmusstörung und Störung des sexuellen Begehrens.
  • Die sich in der Entwicklung befindenden Behandlungen haben zum Ziel, spezifische Subtypen von FSD, vornehmlich Störungen des Begehrens und Erregungsstörungen zu behandeln.
  • Die Kategorien von FSD lassen sich am besten durch Abgrenzung gegenüber den Phasen des normalen weiblichen Sexualansprechens: Begehren, Erregung und Orgasmus (Leiblum 1998) definieren. Begehren oder Libido ist der Antrieb für sexuelle Entfaltung – und die Manifestationen umfassen oft sexuelle Gedanken entweder beim Zusammensein mit einem interessanten Partner oder unter dem Einfluss anderer erotischer Stimuli. Im Gegensatz dazu ist die sexuelle Erregung die vaskuläre Antwort auf eine sexuelle Stimulation, wovon eine wichtige Komponente die vaginale Lubrikation und die Ausdehnung der Vagina ist. Demnach ist die sexuelle Erregung im Gegensatz zum sexuellen Begehren eine Antwort, die mit dem genitalen (z.B. vaginalen und klitoralen) Blutfluss zusammenhängt und nicht notwendigerweise eine Sensibilität ist. Der Orgasmus ist die Freisetzung von sexueller Anspannung, welche während der Erregung zu einem Höhepunkt gekommen ist. Demnach kommt FSD typischerweise vor, wenn eine Frau eine inadäquate oder unbefriedigende Antwort in irgend einer dieser Phasen, gewöhnlich Begehren, Erregung oder Orgasmus hat. Die FSD-Kategorien umfassen eine Störung mit hypoaktivem sexuellem Begehren, eine sexuelle Erregungsstörung, Orgasmusstörungen und sexuelle Schmerzstörungen.
  • Eine Störung mit hypoaktivem sexuellem Begehren liegt vor, wenn eine Frau kein oder wenig Begehren hat, sexuell aktiv zu sein, und keine oder wenige sexuelle Gedanken oder Fantasien hat. Diese Art von FSD kann durch niedrige Testosteronspiegel entweder infolge natürlicher Menopause oder infolge chirurgischer Menopause verursacht werden. Andere Ursachen umfassen Krankheit, Medikationen, Müdigkeit, Depression und Angst.
  • Die weibliche sexuelle Erregungsstörung (FSAD) ist durch eine inadequate genitale Antwort auf sexuelle Stimulation gekennzeichnet. Die Genitalien (z.B. die Vagina und/oder die Klitoris) unterliegen nicht der Anschwellung, welche die normale sexuelle Erregung kennzeichnet. Die Vaginalwände sind wenig lubriziert, so dass der Geschlechtsverkehr schmerzhaft ist. Die Orgasmen können verhindert sein. Die Erregungsstörung kann durch reduziertes Östrogen in der Menopause oder nach der Geburt eines Kindes und während des Stillens sowie durch Erkrankungen mit vaskulären Komponenten wie Diabetes und Atherosklerose verursacht sein. Andere Ursachen ergeben sich aus der Behandlung mit Diuretika, Antihistaminika, Antidepressiva z.B. SSRIs oder Antihypertensiva. FSAD wird unten detaillierter besprochen.
  • Sexuelle Schmerzstörungen (welche Dyspareunie und Vaginismus umfassen) sind durch Schmerzen gekennzeichnet, die sich bei der Penetration ergeben, und können durch lubrikationsvermindernde Medikationen, eine Endometriose, eine Unterleibsentzündung, entzündliche Darmerkrankungen oder Probleme im Harntrakt verursacht sein.
  • Die Prävalenz von FSD ist schwierig zu beurteilen, weil der Begriff mehrere Arten von Problemen abdeckt, wovon einige schwierig zu messen sind, und weil das Interesse zur Behandlung von FSD erst seit kurzem besteht. Bei vielen Frauen hängen die sexuellen Probleme entweder direkt mit dem weiblichen Alterungsprozess oder mit chronischen Erkrankungen wie Diabetes und Hypertonie zusammen.
  • Bei der angegebenen Inzidenz und Prävalenz von FSD besteht eine grosse Variabilität, was teilweise durch die Verwendung von unterschiedlichen Evaluationskriterien erklärt wird, wobei aber die meisten Untersucher berichten, dass ein signifikanter Anteil von andersweitig gesunden Frauen Symptome von einer oder mehreren der FSD-Subgruppen haben. Beispielsweise zeigen Studien, welche Sexualstörung bei Paaren vergleichen, dass 63% der Frauen Erregungs- oder Orgasmusstörung hatten, während im Vergleich dazu 40% der Männer Erektions- oder Ejakulationsstörung haben (Frank et al., 1978).
  • Allerdings variiert die Prävalenz der weiblichen sexuellen Erregungsstörung beträchtlich von Erhebung zu Erhebung. In einer kürzlich veröffentlichten National Health und Social Life Erhebung berichteten 19% der Frauen über Lubrikationsschwierigkeiten, während 14% der Frauen in einer ambulanten gynäkologischen Klinik ähnliche Schwierigkeiten mit der Lubrikation angaben (Rosen et al., 1993).
  • In mehreren Studien wurde von sexuellen Erregungsstörungen bei diabetischen Frauen (bis zu 47%) berichtet, wobei diese eine verringerte vaginale Lubrikation umfassten (Wincze et al., 1993). Es bestand kein Zusammenhang zwischen Neuropathie und Sexualstörung.
  • In zahlreichen Studien wurde auch gezeigt, dass zwischen 11-48% der Frauen insgesamt mit dem Altern ein verringertes sexuelles Begehren haben. Ähnlicherweis geben zwischen 11-50% der Frauen Probleme mit der Erregung und der Lubrikation an und leiden demzufolge während dem Geschlechtsverkehr an Schmerzen. Vaginismus ist weitaus weniger häufig und betrifft ungefähr 1% der Frauen.
  • In Studien mit sexuell erfahrenen Frauen wurde gezeigt, dass 5–10% eine primäre Anorgasmie haben. Weitere 10% haben selten Orgasmen und noch weitere 10% erfahren diese inkonsistent (Spector et al., 1990).
  • Weil FSD aus mehreren Subtypen besteht, welche Symptome in unterschiedlichen Phasen des sexuellen Ansprechzyklus zeigen, gibt es keine einzelne Therapie. Die gegenwärtige Behandlung der FSD konzentriert sich im Prinzip auf psychologische oder partnerschaftliche Aspekte. Die Behandlung der FSD entwickelt sich allmählich, indem mehr klinische und grundlagenwissenschaftliche Studien der Erforschung dieses medizinischen Problems gewidmet werden. Nicht alle weiblichen sexuellen Beschwerden haben eine psychologische Pathophysiologie, insbesondere für diejenigen Individuen, die eine Komponente einer vaskulogenen Störung (z.B. FSAD) haben könnten, welche zur gesamthaften weiblichsexuellen Beschwerde beitragen. Es gibt zur Zeit keine Medikamente, die für die Behandlung der FSD zugelassen sind. Die empirische medikamentöse Therapie umfasst die Verabreichung von Östrogen (topisch oder als Hormonersatztherapie), Androgenen oder stimmungsaufhellenden Medikamenten wie Buspiron oder Trazodon. Diese Behandlungsoptionen sind wegen der niedrigen Wirksamkeit oder den unannehmbaren Nebenwirkungen oft unbefriedigend.
  • Da das Interesse, FSD pharmakologisch zu behandeln, relativ neu ist, besteht die Therapie aus Folgenden: - psychologische Beratung, rezeptfreie Sexualgleitmittel und experimentelle Kandidaten, einschliesslich Medikamente, die für andere Krankheitszustände zugelassen sind. Diese Medikationen umfassen hormonelle Wirkstoffe, entweder Testosteron oder Kombinationen von Östrogen und Testosteron, und seit kurzem vaskuläre Medikamente, die sich bei der männlichen erektilen Dysfunktion als wirksam erwiesen haben. Keiner dieser Wirkstoffe hat sich bei der Behandlung von FSD als sehr wirksam erwiesen.
  • WEIBLICHE SEXUELLE ERREGUNGSSTÖRUNG (FSAD)
  • Die sexuelle Erregungsantwort besteht aus einer Vasokongestion im Unterleibsbereich, einer vaginalen Lubrikation und einer Ausdehnung und Anschwellung der äusserlichen Genitalien. Die Störung verursacht eine ausgeprägte Belastung and/oder zwischenmenschliche Schwierigkeiten. Studien zur Untersuchung von Sexualstörung bei Paaren ergaben, dass es eine grosse Anzahl von Frauen gibt, die an sexueller Erregungsstörung – anderweitig als weibliche sexuelle Erregungsstörung (FSAD) bezeichnet – leiden.
  • Das Diagnostic und Statistical Manual (DSM) IV der American Psychiatric Association definiert weibliche sexuelle Erregungsstörung (FSAD) als:
    "eine persistierende oder rezidivierende Unfähigkeit, bis zur Vollendung der sexuellen Aktivität eine adäquate Lubrikations-Anschwellungsantwort auf die sexuelle Erregung zu erreichen oder zu erhalten. Die Störung muss eine ausgeprägte Belastung oder zwischenmenschliche Schwierigkeit verursachen."
  • FSAD ist eine weit verbreitete sexuelle Störung, die prä-, peri- und postmenopausale (+/–HRT) Frauen betrifft. Sie ist mit begleitenden Störungen wie Depression, kardiovaskulären Erkrankungen, Diabetes und UG-Störungen vergesellschaftet.
  • Die primären Folgen der FSAD sind ein Mangel an Anschwellung/Schwellung, ein Mangel an Lubrikation und ein Mangel an lustvollen Empfindungen im Genitalbereich. Die sekundären Folgen der FSAD sind vermindertes sexuelles Begehren, Schmerzen während des Geschlechtsverkehrs und Schwierigkeit zum Erreichen eines Orgasmus.
  • Kürzlich wurde die Hypothese aufgestellt, dass zumindest für einen Teil der Patienten mit Symptomen der FSAD eine vaskuläre Basis besteht (Goldstein et al., 1998), wobei Tierdaten diese Ansicht unterstützen (Park et al., 1997).
  • Wirkstoff-Kandidaten zum Behandeln der FSAD, die sich in der Erprobung bezüglich der Wirksamkeit befinden, sind primär Therapien der erektile Dysfunktion, welche die Zirkulation in den männlichen Genitalien fördern. Sie bestehen aus zwei Arten von Formulierungen, orale oder sublinguale Medikationen (Apomorphin, Phentolamin, Sildenafil) und Prostaglandin (PGE1 – Alprostadil), die bei Männern injziiert oder transurethral verabreicht werden und bei Frauen topisch auf die Genitalien appliziert werden.
  • Die vorliegende Erfindung bezweckt, einen effektiven Wirkstoff zur Behandlung von FSD und insbesondere von FSAD bereitzustellen.
  • ZUSAMMENFASSUNG VON ASPEKTEN DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
  • Ein entscheidener Befund der vorliegenden Erfindung ist die Fähigkeit, eine an FSD (bevorzugt FSAD) leidende Frau unter Verwendung eines I:NEP zu behandeln.
  • Erfindungsgamäss wird die Verwendung eines Inhibitors der neutralen Endopeptidase (I:NEP) zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von weiblicher Sexualströung (FSD) bereitgestellt.
  • In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird der erfindungsgemässe I:NEP als der "erfindungsgemässe Wirkstoff" bezeichnet.
  • Der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) kann auch in Kombination mit einem oder mehreren zusätzlichen pharmazeutisch aktiven Wirkstoffen verwendet werden. Der zusätzliche pharmazeutisch aktive Wirkstoff, falls dieser vorhanden ist oder zusammen mit dem erfindungsgemässen Wirkstoff verwendet wird, kann als ein "zusätzlicher Wirkstoff" bezeichnet werden. Einer oder mehrere dieser zusätzlichen Wirkstoffe können eines oder mehrere sein von: I:PDE, ein anderer I:NEP, ein I:NPY. Kombinationen von Wirkstoffen werden unten näher beschrieben.
  • Falls der erfindungsgemässe zusätzliche Wirkstoff ein I:PDE ist, dann ist besagter PDE in gewissen Ausgestaltungen ein cAMP hydrolysierender (und wahlweise cGMP-hydrolysierender) PDE. Der Begriff "cAMP-hydrolysierend" umfasst auch das Metabolisieren und/oder Zersetzen von cAMP. Der Begriff "cAMP-hydrolysierend (und wahlweise cGMP)" bedeutet, dass der zusätzliche Wirkstoff fähig sein kann, cGMP zusätzlich zu cAMP zu hydrolysieren. Hier umfasst der Begriff "cGMP Hydrolysieren" auch das Metabolisieren und/oder Zersetzen von cGMP. Allerdings gilt für gewisse Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung, dass der zusätzliche Wirkstoff nicht notwendigerweise fähig sein muss, cGMP zu hydrolysieren.
  • Allgemeine Bezugnahmen auf Wirkstoffe können hier auf zusätzliche Wirkstoffe wie auch auf erfindungsgemässe Wirkstoffe anwendbar sein.
  • Gemäss der vorliegenden Erfindung wirkt der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) auf ein Wirkziel (nachfolgend: "Target"), vorzugsweise spezifisch auf das besagte Target. Dieses Target wird gelegentlich als das "erfindungsgemässe Target" bezeichnet. Allerdings kann der erfindungsgemässe Wirkstoff auch an einem oder mehreren anderen Targets wirken. Diese anderen Targets können als ein "zusätzliches Target" bezeichnet werden. Ähnlicherweise gilt, dass wenn ein zusätzlicher Wirkstoff verwendet wird, dieser zusätzliche Wirkstoff an demselben erfindungsgemässen Target und/oder an einem zusätzlichen Target (welches nicht dasselbe zusätzliche Target zu sein braucht, an dem der erfindungsgemässe Wirkstoff wirkt) wirken kann. Targets sind hier beschrieben. Es versteht sich, dass hier allgemeine Bezugnahmen auf Targets ebenso auf die zusätzlichen Targets wie auf das erfindungsgemässe Target anwendbar sein können.
  • Ein weiterer entscheidender Befund der vorliegenden Erfindung ist die Fähigkeit, unter Verwendung des erfindungsgemässen Wirkstoffes (d.h. I:NEP) den weiblichen genitalen (z.B. vaginalen oder klitoralen) Blutfluss zu verstärken.
  • In unseren Experimenten wurde gefunden, dass FSAD mit einem verringerten genitalen Blutfluss – insbesondere einem verringerten Blutfluss in der Vagina und/oder der Klitoris einhergeht. Demnach kann eine Behandlung von Frauen mit FSAD durch Erhöhung des genitalen Blutfluss mittels vasoaktiver Wirkstoffe erreicht werden. In unseren Studien wurde gezeigt, dass cAMP die vaginale und klitorale Vasorelaxation vermittelt und dass der genitale (z.B. vaginale und klitorale) Blutfluss durch Erhöhung der cAMP-Spiegel verstärkt/potenziert werden kann. Dies ist ein weiterer entscheidender Befund.
  • In diesem Zusammenhang hat vorgängig niemand vorgeschlagen, dass FSAD auf eine solche Weise – d.h. durch direkte oder indirekte Erhöhung der cAMP-Spiegel – behandelt werden kann. Darüber hinaus gab es keine Lehre im Fachgebiet, welche vorgeschlagen hätte, dass FSAD mit einer nachteiligen Modulierung von cAMP-Aktivität und/oder -Spiegeln zusammenhängt oder dass cAMP für die Vermittlung der vaginalen und klitoralen Vasorelaxation verantwortlich ist. Demnach ist die vorliegende Erfindung sogar noch weiter überraschend.
  • Ausserdem wurde gefunden, dass es unter Verwendung der erfindungsgemässen Wirkstoffe möglich ist, die genitale Anschwellung zu verstärken und die FSAD zu behandeln – z.B. die Lubrikation in der Vagina und die Sensitivität in der Vagina und Klitoris zu erhöhen.
  • Demnach bezieht sich die vorliegende Erfindung in einem breiten Aspekt auf die Verwendung eines cAMP-Potenziators zur Behandlung von FSD, insbesondere FSAD.
  • Die vorliegende Erfindung ist vorteilhaft, weil sie einen Wirkstoff zum Wiederherstellen einer normalen sexuellen Erregungsantwort – nämlich eines verstärkten genitalen Blutflusses, der zur vaginalen, klitoralen und labialen Anschwellung führt, bereitstellt. Dies wird zu einer verstärkten vaginalen Lubrikation über Plasmatranssudation, zu einer verstärkten vaginalen Dehnbarkeit und einer verstärkten genitalen (z.B. vaginalen und klitoralen) Sensitivität führen. Demnach bezieht sich die vorliegende Erfindung auf einen Wirkstoff zur Wiederherstellung oder Potenzierung der normalen sexuellen Erregungsantwort.
  • DETAILLIERTE ASPEKTE DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG
  • In einem ihrer Aspekte bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung eines I:NEP zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung von FSD.
  • In einem anderen Aspekt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung eines Wirkstoffs zur Herstellung eines Medikamentes (wie einer pharmazeutischen Zusammensetzung) für die Behandlung von FSD, insbesondere FSAD; wobei der Wirkstoff zur Potentierung von cAMP in den sexuellen Genitalien einer an FSD, insbesondere FSAD; leidenden Frau befähig ist; und wobei besagter Wirkstoff der hier definierte erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) ist.
  • Der Einfachheit halber werden diese und weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung nun unter geeigneten Abschnittstiteln besprochen. Allerdings sind die Lehren unter jedem Abschnitt nicht notwendigerweise auf den jeweiligen einzelnen Abschnitt beschränkt.
  • BEVORZUGTE ASPEKTE
  • Der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) ist bevorzugt für die Behandlung von FSAD vorgesehen.
  • Der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) ist bevorzugt ein Vermittler der weiblichen genitalen (z.B. vaginalen oder klitoralen) Vasorelaxation.
  • In einer der Ausgestaltungen ist der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) bevorzugt für die orale Verabreichung vorgesehen.
  • In einer weiteren Ausgestaltung kann der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) für die topische Verabreichung vorgesehen sein.
  • Der erfindungsgemässe Wirkstoff ist ein I:NEP (gelegentlich als NEPi geschrieben), wobei besagter NEP das EC 3.4.24.11 ist.
  • Für gewisse Anwendungen ist der Wirkstoff bevorzugt ein selektiver I:NEP, wobei besagter NEP das EC 3.4.24.11 ist.
  • Der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) ist ein Inhibitor – d.h. er ist fähig, eine Inhibitionsfunktion zu entfalten.
  • Der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) hat bevorzugt einen indirekten Potenzierungseffekt auf cAMP. Anders ausgedrückt, hat der Wirkstoff für gewisse Anwendungen bevorzugt keinen direkten Potenzierungseffekt auf cAMP. Es versteht sich, dass der Wirkstoff einen indirekten Potenzierungseffekt auf cAMP haben kann durch Wirkung auf natürlich vorkommende und natürlich gefundene direkt wirkende Wirkstoffe – wie auf natürlich vorkommendes und gefundenes VIP.
  • Für gewisse Anwendungen kann der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) in Kombination mit einem anderen pharmazeutisch aktiven Wirkstoff verabreicht werden. Dabei muss die Mitverabreichung nicht zur selben Zeit erfolgen, und schon gar nicht über denselben Weg. Beispielsweise kann eine Mitverabreichungs-Zusammensetzung eine Zusammensetzung sein, die ein Wirkstoff gemäss der vorliegenden Erfindung (d.h. I:NEP) und einen zusätzlichen Wirkstoff umfasst, wobei der zusätzliche Wirkstoff einen direkten Potenzierungseffekt auf cAMP haben könnte. Kombinationsbeispiele werden unten beschrieben.
  • Für gewisse Anwendungen hat der zusätzliche Wirkstoff bevorzugt einen indirekten Potenzierungseffekt auf cAMP. Beispiele für solche zusätzliche Wirkstoffe umfassen I:NEP und/oder I:NPY. Anders ausgedrückt, hat der zusätzliche Wirkstoff für gewisse Anwendungen bevorzugt keinen direkten Potenzierungseffekt auf cAMP. Es versteht sich, dass der zusätzliche Wirkstoff einen indirekten Potenzierungseffekt auf cAMP haben kann durch Wirkung auf natürlich vorkommende und natürlich gefundene direkt wirkende Wirkstoffe – wie auf natürlich vorkommendes und gefundenes VIP.
  • Für gewisse Anwendungen hat der zusätzliche Wirkstoff bevorzugt einen direkten Potenzierungseffekt auf cAMP. Beispiele für solche zusätzlichen Wirkstoffe umfassen I:PDE.
  • Für gewisse Anwendungen ist der zusätzliche Wirkstoff ein Inhibitor – d.h. er ist fähig, eine Inhibitionsfunktion zu entfalten.
  • Für gewisse Anwendungen ist der zusätzliche Wirkstoff ein Antagonist.
  • Für gewisse Anwendungen ist der zusätzliche Wirkstoff bevorzugt ein I:PDE (gelegentlich als PDEi bezeichnet).
  • Für gewisse Anwendungen ist der zusätzliche Wirkstoff bevorzugt eine selektiver I:PDE.
  • Für gewisse Anwendungen ist der zusätzliche Wirkstoff bevorzugt ein I:PDE1 oder l:PDE2 (gelegentlich als I:PDEII oder PDEIIi oder PDE2i bezeichnet) oder I:PDE3 oder I:PDE4 oder I:PDE7 oder I:PDE8, wobei der Wirkstoff besonders bevorzugt ein I:PDE2 ist.
  • Für gewisse Anwendungen ist der zusätzliche Wirkstoff bevorzugt ein selektiver I:PDEII (gelegentlich als PDE2 bezeichnet).
  • Für gewisse Anwendungen ist der zusätzliche Wirkstoff bevorzugt ein I:NEP (gelegentlich als NEPi bezeichnet).
  • Für gewisse Anwendungen ist der zusätzliche Wirkstoff bevorzugt ein selektiver I:NEP.
  • Für gewisse Anwendungen ist der zusätzliche Wirkstoff bevorzugt ein I:NEP, wobei besagter NEP das EC 3.4.24.11 ist.
  • Für gewisse Anwendungen ist der zusätzliche Wirkstoff bevorzugt ein selektiver I:NEP, wobei besagter NEP das EC 3.4.24.11 ist.
  • Für gewisse Anwendungen ist der zusätzliche Wirkstoff bevorzugt ein I:NPY (gelegentlich als NPYi bezeichnet).
  • Für gewisse Anwendungen ist der zusätzliche Wirkstoff bevorzugt ein I:NPY Y1 oder I:NPY Y2 oder I:NPY Y5, besonders bevorzugt ist der Wirkstoff ein I:NPY Y1.
  • Für gewisse Anwendungen ist der zusätzliche Wirkstoff bevorzugt ein selektiver I:NPY.
  • Für gewisse Anwendungen ist der zusätzliche Wirkstoff bevorzugt ein I:NPY Y1.
  • Für gewisse Anwendungen ist der zusätzliche Wirkstoff bevorzugt ein selektiver I:NPY Y1.
  • Bei gewissen Anwendungen verursacht der Wirkstoff keinen anhaltenden Abfall des Blutdruckes – oder er wird in einer solchen Weise verabreicht (z.B. über eine Periode von ungefähr 5 Minuten oder mehr), dass er keinen anhaltenden Abfall des Blutdruckes verursacht. In dieser Ausgestaltung, kann der Wirkstoff, wenn er topisch zu verabreichen ist, die Fähigkeit haben, einen ausgedehnten Abfall des Blutdruckes zu verursachen (so wie bei intravenöser Verabreichung), vorausgesetzt, dass bei der topischen Applikation nur minime Mengen des Wirkstoffs in den Blutstrom gelangen. Bei einem oralen Wirkstoff ist es bevorzugt, dass der Wirkstoff keinen anhaltenden Abfall des Blutdruckes verursacht.
  • In einem bevorzugten Aspekt verursacht der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) keine grosse Veränderung der Herzfrequenz – oder er wird in einer solchen Weise verabreicht, dass es keine grosse Veränderung der Herzfrequenz verursacht.
  • BEHANDLUNG
  • Es versteht sich, dass hier alle Bezugnahmen auf eine Behandlung eine oder mehrere kurative, palliative und prophylaktische Behandlungen mit einschliessen. Der Begriff Behandlung umfasst bevorzugt mindestens eine kurative Behandlung und/oder eine palliative Behandlung.
  • WEIBLICHE GENITALIEN
  • Der Begriff "weibliche Genitalien" wird in Übereinstimmung mit der in Gray's Anatomy, C.D. Clemente, 13th American Edition gegebenen Definition verwendet – nämlich:
    "Die Genitalorgane bestehen aus einer inneren und äusseren Gruppe. Die inenren Organe befinden sich innerhalb des Unterleibs und bestehen aus den Eierstöcken, den Eileitern, der Gebärmutter und der Vagina. Die äusseren Organe liegen ausserhalb des urogenitalen Diaphragmas und unterhalb des Beckenbogens. Sie umfassen den Venusberg, die äusseren und inneren Schamlippen, die Klitoris, den Scheidenvorhof, den Scheidenvorhofkörper und die grossen Scheidenvorhofdrüsen".
  • ENDOGENES cAMP
  • In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung potenziert der erfindungsgemässe Wirkstoff das endogene cAMP – also die endogenen cAMP-Spiegel werden erhöht.
  • Hier bezieht sich der Begriff "endogenes cAMP" auf cAMP, welches aus der sexuellen Stimulation (sexuellen Erregung) stammt. Demnach umfasst der Begriff nicht die cAMP-Spiegel, welche unabhängig von sexuellen Antrieb erhöht sind.
  • Demnach wird die Behandlung von FSAD gemäss der erfindungsgemässen Verwendung durch direkte oder indirekte Potenzierung der endogenen cAMP-Signalisierung erreicht, welche ihrerseits den vaginalen Blutfluss/die vaginale Lubrikation und/oder den klitoralen Blutfluss erhöht; wodurch die natürliche sexuelle Erregungsantwort verstärkt wird. Demnach führt das Behandlungsverfahren zur Wiederherstellung oder Potenzierung der normalen Erregungsantwort.
  • Das Behandlungsverfahren entsprechend der erfindungsgemässen Verwendung kann durch Verwendung eines Inhibitors von NEP (EC 3.4.24.11) erreicht werden.
  • Ein tierisches Testmodell ist hier angegeben. Dieses tierische Testmodell kann zur Bestimmung von Erhöhungen des genitalen Blutflusses als Folge der cAMP-Potenzierung verwendet werden. In diesem Tiermodell wird ein Pelvisnerv stimuliert - was ein Wirkung herbeiführt, welche die Physiologie einer sexuellen Erregung/Antwort nachahmt. In diesen Experimenten verursachen die erfindungsgemässen Wirkstoffe eine Erhöhung des Blutflusses, welche über der Zunahme bei den Kontrollen liegt, nachdem der Nerv stimuliert worden ist. Bei fehlender Stimulation haben die Wirkstoffe keine (oder eine vernachlässigbare) Wirkung bezüglich des Verursachens eines erhöhten Blutflusses. Typischerweise wird in diesen Experimenten zunächst der Nerv stimuliert, um eine anfängliche Erhöhung des Blutflusses zu erhalten. Dann wird dem Tier ein Kandidaten- (oder ein aktueller) Wirkstoff systemisch oder lokal verabreicht, beispielsweise über den intravenösen, topischen oder oralen Weg. Eine Erhöhung des Blutflusses im Vergleich zur Erhöhung bei den Kontrollen weist dann auf einen erfindungsgemässen Wirkstoff hin.
  • SEXUELLE STIMULATION
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verabreichung des erfindungsgemässen Wirkstoffs (d.h. I:NEP) vor und/oder während der sexuellen Stimulation. Hier kann der Begriff "sexuelle Stimulation" mit dem Begriff "sexuelle Erregung" gleichbedeutend sein. Dieser Aspekt der vorliegenden Erfindung ist vorteilhaft, weil er systemische Selektivität ergibt. Die natürliche Kaskade findet nur in den Genitalien und nicht an anderen Orten – z.B. im Herz usw. statt. Demnach wäre es möglich, eine selektive Wirkung an den Genitalien zu erreichen.
  • Demnach ist es in gewissen Aspekten der vorliegenden Erfindung äusserst wünschenswert, dass es einen sexuellen Stimulationsschritt gibt. Es wurde gefunden, dass dieser Schritt systemische Selektivität ergeben kann. Hier kann "sexelle Stimulation" eine oder mehrere aus einer visuellen Stimulation, einer körperlichen Stimulation, einer auditorischen Stimulation oder einer gedanklichen Stimulation sein.
  • Demnach werden die erfindungsgemässen Wirkstoffe bevorzugt vor oder während der sexuellen Stimulation verabreicht, insbesondere wenn diese Wirkstoffe zur oralen Verabreichung vorgesehen sind.
  • Demnach beschreibt die vorliegende Erfindung in diesem bevorzugten Aspekt die Verwendung eines erfindungsgemässen Wirkstoffes zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von FSAD; wobei der Wirkstoff zur Potenzierung von cAMP in den sexuellen Genitalien einer an FSAD leidenden Frau befähigt ist; und wobei besagte Frau vor oder während Verabreichung des besagten Medikamentes sexuell stimuliert wird; und wobei besagter Wirkstoff ein I:NEP ist.
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich vorzugsweise auf die Verwendung eines erfindungsgemässen Wirkstoffes zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von FSAD; wobei der Wirkstoff zur Potenzierung von cAMP in den sexuellen Genitalien einer an FSAD leidenden Frau befähigt ist; und wobei besagte Frau vor oder während Verabreichung des besagten Medikamentes sexuell stimuliert wird; und wobei das besagte Medikament der besagten Frau oral verabreicht wird; und wobei besagter Wirkstoff ein I:NEP ist.
  • POTENZIERUNG VON cAMP
  • Im Zusammenhang mit cAMP umfasst hier der Begriff "Potenzierung" irgend eines oder mehrere von: Erhöhung der Wirksamkeit von cAMP, Erhöhung der cAMP-Spiegel, Erhöhung der Aktivität von cAMP, Verminderung des Ausmasses des cAMP-Abbaus, Verminderung des Ausmasses der cAMP-Inhibition.
  • Die potenzierende Wirkung kann eine direkte Wirkung sein. Ein Beispiel für eine direkte Wirkung wäre die Aufregulierung des cAMP-Spiegels durch einen Wirkstoff, welcher dessen Expression erhöht.
  • Alternativ könnte die potenzierende Wirkung eine indirekte Wirkung sein. Ein Beispiel für eine solche Wirkung wäre die Wirkung auf eine Substanz, welche sonst cAMP inhibieren und/oder die Spiegel und/oder Aktivität von cAMP verringern würde. Ein anderes Beispiel für eine solche Wirkung wäre die Erhöhung der Wirkung einer Substanz, welche die Wirksamkeit von cAMP erhöht, den Spiegel von cAMP erhöht, die Aktivität von cAMP erhöht, das Ausmass des cAMP-Abbaus verringert oder das Ausmass der cAMP-Inhibition verringert.
  • Ein Beispiel für einen zusätzlichen Wirkstoff, das als ein PcAMP wirken könnte, wäre ein I:PDE wie beispielsweise I:PDEII.
  • cAMP-Mimetikum
  • In gewissen Aspekten der vorliegenden Erfindung kann der zusätzliche Wirkstoff als ein cAMP-Mimetikum wirken.
  • Der hier verwendete Begriff "cAMP-Mimetikum" bezieht sich auf einen Wirkstoff, der in einer ähnlichen Weise (z.B. mit ähnlichem biologischen Profil und Wirkung) auf cAMP in den weiblichen sexuellen Genitalien wirken kann und dabei irgend eines oder mehrere der Folgenden bewirkt: Erhöhung der Wirksamkeit von cAMP-artigen Einheiten, Erhöhung des Spiegels von cAMP-artigen Einheiten, Erhöhung der Aktivität von cAMP-artigen Einheiten, Verringerung des Ausmasses des Abbaus von cAMP-artigen Einheiten, Verringerung des Ausmasses der Inhibition von cAMP-artigen Einheiten.
  • Ein Beispiel für ein cAMP-Mimetikum wäre Forskolin. Es wurde hier gefunden, dass Forskolin den vaginalen und klitoralen Blutfluss erhöht, und es kann auch als ein vaginales Relaxans wirken.
  • In einem bevorzugten Aspekt wird das cAMP-Mimetikum oral verabreicht.
  • AKTIVATOR VON cAMP
  • Der hier verwendete Begriff "Aktivator von cAMP" bedeutet eine Substanz, welche cAMP in den weiblichen sexuellen Genitalien kontrolliert oder freisetzt. Die Kontrolle kann direkt (z.B. auf cAMP selber) oder indirekt (z.B. über die Aktivierung von cAMP) erfolgen. Der Einfachheit halber werden diese Substanzen als AcAMp bezeichnet.
  • TARGET
  • Der hier im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendete Begriff "Target" bedeutet jede Substanz, die cAMP, ein AcAMP, ein IcAMP, oder ein AMcAMP ist. Anders ausgedrückt, kann das erfindungsgemässe Target als PcAMP-Target bezeichnet werden.
  • Das erfindungsgemässe Target und/oder das zusätzliche Target kann eine Aminosäurensequenz und/oder eine für dasselbe kodierende Nukleotid-Sequenz und/oder eine für die Expression desselben verantwortliche Expressions-Einheit und/oder ein Modulator desselben sein.
  • Das Target kann sogar eine Kombination von solchen Targets sein.
  • WIRKSTOFF
  • Der erfindungsgemässe Wirkstoff ist ein I:NEP. Der erfindungsgemässe Wirkstoff kann jeder geeignete Wirkstoff sein, der als PcAMP wirken kann.
  • Der Wirkstoff (d.h. der erfindungsgemässe Wirkstoff und/oder der zusätzliche Wirkstoff) kann eine Aminosäurensequenz oder ein chemisches Derivat davon sein. Die Substanz kann auch eine organische Verbindung oder eine andere Chemikalie sein. Der Wirkstoff kann sogar eine Nukleotid-Sequenz sein – wobei es sich um eine Sense-Sequenz oder eine Antisense-Sequenz handeln kann. Der Wirkstoff kann sogar ein Antikörper sein.
  • Demnach umfasst der Begriff "Wirkstoff" ohne darauf beschränkt zu sein eine Verbindung, welche von irgend einer geeigneten Quelle, ob natürlich oder nicht, erhältlich ist oder daraus gebildet werden kann.
  • Der Wirkstoff kann aus einer Bibliothek von Verbindungen, welche Peptide sowie andere Verbindungen, beispielsweise kleine organische Moleküle wie Leitverbindungen umfassen kann, erstellt oder erhalten werden.
  • Beispielsweise kann der Wirkstoff eine natürliche Substanz, ein biologisches Makromolekül oder ein aus biologischem Material wie Bakterien, Pilzen oder Tierzellen oder -gewebe (insbesondere von Säugern) hergestellter Extrakt, ein organisches oder ein anorganisches Molekül, ein synthetischer Wirkstoff, ein semi-synthetischer Wirkstoff, ein strukturelles oder funktionelles Mimetikum, ein Peptid, ein Peptidomimetikum, ein derivatisierter Wirkstoff, ein aus einem ganzen Protein abgespaltetes Peptid oder ein synthetisch hergestelltes Peptid (beispielsweise unter Verwendung eines Peptid-Synthesizers oder von rekombinanten Verfahren oder Kombinationen davon), ein rekombinanter Wirkstoff, ein Antikörper, ein natürlicher oder ein nichtnatürlicher Wirkstoff, ein Fusionsrotein oder ein Äquivalent davon sowie ein Mutant, Derivat oder Kombination davon sein.
  • Der hier verwendete Begriff "Wirkstoff" kann eine einzelne Einheit sein oder er kann eine Kombination von Wirkstoffen sein.
  • Falls der I:NEP eine organische Verbindung ist, dann kann diese organische Verbindung bei einigen Anwendungen typischerweise eine Amid-Gruppe (d.h.-N(H)-C(O)- oder sogar -C(O)-N(H)-) und eine oder mehrere Kohlenwasserstoffgruppen umfassen. Hier bedeutet der Begriff "Kohlenwasserstoffgruppen" eine mindestens C und H umfassende Gruppe, die wahlweise einen oder mehrere andere geeignete. Substituenten umfassen kann. Beispiele von solchen Substituenten können Halogen-, Alkoxy-, Nitro-, eine Alkylgruppe, eine cyclische Gruppe usw. umfassen. Zusätzlich zur Möglichkeit, dass die Substituenten eine cyclische Gruppe sein können, kann eine Kombination von Substituenten eine cyclische Gruppe bilden. Falls die Kohlenwasserstoffgruppe mehr als ein C umfasst, dann müssen diese Kohlenstoffe nicht notwendigerweise miteinander verknüpft sein. Beispielsweise können mindestens zwei der Kohlenstoffe über ein(e) geeignete(s) Element oder Gruppe verknüpft sein. Demnach kann die Kohlenwasserstoffgruppe Heteroatome enthalten. Geeignete Heteroatome sind einer Fachperson bekannt und umfassen beispielsweise Schwefel, Stickstoff und Sauerstoff. Für gewisse Anwendungen umfasst der Wirkstoff bevorzugt mindestens eine cyclische Gruppe. Für gewisse Anwendungen umfasst der Wirkstoff bevorzugt mindestens eine mit einer anderen Kohlenwasserstoffgruppe über eine Amid-Bindung verknüpfte cyclische Gruppe. Beispiele von solchen Verbindungen sind hier im Abschnitt mit den Beispielen aufgeführt.
  • Falls der zusätzliche Wirkstoff eine organische Verbindung ist, dann kann diese organische Verbindung bei gewissen Anwendungen – beispielsweise falls der Wirkstoff ein I:PDE ist – typischerweise zwei oder mehrere verknüpfte Kohlenwasserstoffgruppen umfassen. Bei gewissen Anwendungen umfasst der Wirkstoff bevorzugt zwei cyclische Gruppen – wobei eine dieser cyclischen Gruppen eine fusionierte cyclische Ringstruktur sein kann. Bei gewissen Anwendungen ist bevorzugt mindestens eine der cyclischen Gruppen eine heterocyclische Gruppe. Bei gewissen Anwendungen umfasst die heterocyclische Gruppe bevorzugt mindestens ein N im Ring.
  • Beispiele von solchen Verbindungen sind hier im Abschnitt mit den Beispielen aufgeführt.
  • Falls der zusätzliche Wirkstoff eine organische Verbindung ist, dann kann diese organische Verbindung bei gewissen Anwendungen – beispielsweise falls der Wirkstoff ein I:NPY ist – typischerweise zwei oder mehrere verknüpfte Kohlenwasserstoffgruppen umfassen. Bei gewissen Anwendungen umfasst der Wirkstoff bevorzugt zwei cyclische Gruppen – wobei eine dieser cyclischen Gruppen wahlweise eine fusionierte cyclische Ringstruktur sein kann. Bei gewissen Anwendungen ist mindestens eine der cyclische Gruppen eine heterocyclische Gruppe. Bei gewissen Anwendungen umfasst die heterocyclische Gruppe bevorzugt mindestens ein N im Ring. Beispiele von solchen Verbindungen sind hier im Abschnitt mit den Beispielen aufgeführt.
  • Der Wirkstoff kann Halogengruppen enthalten. Hier bedeutet "Halogen" Fluor, Chlor, Brom oder Iod.
  • Der Wirkstoff kann eine oder mehrere Alkyl-, Alkoxy-, Alkenyl-, Alkylen- und Alkenylengruppen enthalten – welche unverzweigt- oder verzweigtkettig sein können.
  • Der Wirkstoff kann in der Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes – wie eines Säureadditionssalzes oder eines Basensalzes – oder eines Solvates davon, einschliesslich eines Hydrates davon vorliegen. Für eine Übersicht über geeignete Salze siehe Berge et al, J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1–19.
  • Geeignete Säureadditionssalze werden aus Säuren gebildet, welche nicht-toxische Salze bilden, und Beispiele sind Hydrochlorid-, Hydrobromid-, Hydroiodid-, Sulfat-, Bisulfat-, Nitrat-, Phosphat-, Hydrogenphosphat-, Acetat-, Maleat-, Fumarat-, Lactat-, Tartrat-, Citrat-, Gluconat-, Succinat-, Saccharat-, Benzoat-, Methansulfonat-, Ethansulfonat-, Benzolsulfonat-, p-Toluolsulfonat- und Pamoatsalze.
  • Geeignete Basensalze werden aus Basen gebildet, welche nicht-toxische Salze bilden, und Beispiele sind Natrium-, Kalium-, Aluminium-, Kalzium-, Magnesium-, Zink- und Diethanolaminsalze.
  • Ein pharmazeutisch annehmbares Salz eines erfindungsgemässen Wirkstoffes kann ohne weiteres durch entsprechendes Zusammenmischen von Lösungen des Wirkstoffes und der gewünschten Säure oder Base hergestellt werden. Das Salz kann aus der Lösung ausgefällt und durch Filtration gesammelt werden oder durch Abdampfen des Lösungsmittels wiedergewonnen werden.
  • Der Wirkstoff kann in polymorpher Form vorliegen.
  • Der Wirkstoff kann ein oder mehrer asymmetrische Kohlenstoffatome enthalten und demnach in zwei oder mehreren stereoisomeren Formen vorliegen. Wenn ein Wirkstoff eine Alkenyl- oder Alkenylengruppe enthält, kann auch cis-(E)- und trans-(Z)-Isomerie vorkommen. Die vorliegende Erfindung umfasst die einzelnen Stereoisomeren des Wirkstoffes und gegebenenfalls die einzelnen tautomeren Formen davon, zusammen mit Gemischen davon.
  • Die Auftrennung von Diastereoisomeren oder cis- und trans-Isomeren kann durch herkömmliche Verfahren, z.B. durch fraktionierte Kristallisation, Chromatographie oder H.P.L.C. eines Stereoisomeren-Gemisches des Wirkstoffes oder eines geeigneten Salzes oder Derivatives davon erreicht werden. Ein einzelnes Enantiomer des Wirkstoffs kann auch aus einem entsprechenden optisch reinen Zwischenprodukt oder durch Auftrennen, beispielsweise durch H.P.L.C. des entsprechenden Racemates unter Verwendung eines geeigneten chiralen Trägers oder durch fraktionierte Kristallisation des diastereoisomeren Salzes, das durch Umsetzen des entsprechenden Racemates mit einer geeigneten optisch aktiven Säure oder Base gebildet wird, hergestellt werden.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch alle geeigneten Isotopenvariationen des Wirkstoffes oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon. Eine Isotopenvariation eines erfindungsgemässen Wirkstoffes oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon ist definiert als eine solche, in welcher mindestens ein Atom ersetzt ist durch ein Atom, welches dieselbe Atomzahl hat, aber eine Atommasse aufweist, die sich von der üblicherweise in der Natur gefundenen Atommasse unterscheidet. Beispiele von Isotopen, die in den Wirkstoff und die pharmazeutisch annehmbaren Salze davon eingebaut werden können, umfassen Isotope von Wasserstoff, Kohlenstoff, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor, Schwefel, Fluor und Chlor wie 2H, 3H, 13C, 14C, 15N, 17O, 18O, 31P, 32P, 35S, 18F beziehungsweise 36Cl. Gewisse Isotopenvariationen des Wirkstoffes und der pharmazeutisch annehmbaren Salze davon, beispielsweise diejenigen, in welchen ein radioaktives Isotop wie 3H oder 14C eingebaut ist, sind für Wirkstoff- und/oder Substrat- Gewebeverteilungsstudien nützlich. Tritiierte, d.h. 3H-, und Kohlenstoff-14-, d.h. 14C-Isotope sind wegen deren Einfachheit zur Herstellung und Nachweisbarkeit besonders bevorzugt. Ausserdem kann die Substitution mit Isotopen wie Deuterium, d.h. 2H gewisse therapeutische Vorteile ergeben, die sich aus einer grösseren metabolischen Stabilität, beispielsweise aus einer erhöhten in vivo-Halbwertszeit oder einem verringerten Dosierungsbedarf ergeben, und kann demnach in gewissen Fällen bevorzugt sein. Isotopenvariationen des Wirkstoffes und pharmazeutisch annehmbare Salze davon können im Allgemeinen durch konventionelle Verfahren unter Verwendung von geeigneten Isotopenvariationen von geeigneten Reagenzien hergestellt werden.
  • Es wird Fachpersonen bekannt sein, dass der Wirkstoff aus einer Prodrug abgeleitet werden kann. Beispiele von Prodrugs umfassen Einheiten, die (eine) gewisse geschützte Gruppe(n) aufweisen und welche keine pharmakologische Aktivität als solche besitzen müssen, aber die in gewissen Fällen verabreicht werden können (beispielsweise oral oder parenteral) und danach im Körper unter Bildung des pharmakologisch aktiven Wirkstoffes metabolisiert werden.
  • Es ist weiterhin bekannt, dass gewisse Anteile, bekannt als "Pro-Anteile", an geeignete Funktionalitäten der Wirkstoffe angebracht werden können, beispielsweise wie in "Design of Prodrugs" by H. Bundgaard, Elsevier, 1985 (dessen Inhalt hiermit durch Bezugnahme übernommen wird) beschrieben. Solche Prodrugs gehören ebenfalls zum Umfang der vorliegenden Erfindung.
  • Der PcAMP kann eines oder mehrere der Folgenden bewirken: direkte oder indirekte Erhöhung der Wirksamkeit von cAMP, direkte oder indirekte Erhöhung des Spiegels von cAMP, direkte oder indirekte Erhöhung der Aktivität von cAMP, direkte oder indirekte Verringerung des Ausmasses des cAMP-Abbaus, direkte oder indirekte Erhöhung des Spiegels von cAMP, direkte oder indirekte Verringerung des Ausmasses der cAMP-Inhibition.
  • Der erfindungsgemässe Wirkstoff (I:NEP) führt vorzugsweise zu einer direkten oder indirekten Erhöhung des cAMP-Spiegels in den sexuellen Genitalien einer an FSAD leidenden Frau.
  • Der erfindungsgemässe Wirkstoff (I:NEP) führt besonders bevorzugt zu einer direkten oder indirekten selektiven Erhöhung des cAMP-Spiegels in den sexuellen Genitalien einer an FSAD leidenden Frau.
  • Der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) führt besonders bevorzugt zu einer direkten oder indirekten selektiven Erhöhung des cAMP-Spiegels, wobei besagtes cAMP durch sexuelle Erregung induziertes cAMP ist.
  • In einem besonders bevorzugten Aspekt erhöht der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) die relative Menge des durch sexuelle Erregung induzierte cAMP.
  • Bei gewissen Anwendungen führt der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) zu einer selektiven Behandlung von FSAD.
  • In einem Aspekt kann der Wirkstoff ein geeignetes Target inhibieren oder antagonisieren und dabei die cAMP-Spiegel in den weiblichen sexuellen Genitalien potenzieren. Im Text wird der Begriff Inhibitor als Bezeichnung für einen Inhibitor und/oder Antagonisten verwendet.
  • In einem anderen Aspekt kann der Wirkstoff ein geeignetes Target aktivieren oder agonisieren und dabei die cAMP-Spiegel in den weiblichen sexuellen Genitalien potenzieren. Im Text werden die Begriffe Aktivator und auf regulierender Inhibitor als Bezeichnung für einen Aktivator und/oder Aufregulierer und/oder Agonisten verwendet.
  • Demnach kann der Wirkstoff ein geeignetes Target agonisieren, antagonisieren, auf regulieren, oder inhibieren.
  • Der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) kann eine einzelne Einheit sein, die befähigt ist, zwei oder mehrere dieser Eigenschaften zu entfalten. Alternativ oder zusätzlich kann der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) eine Kombination vom Wirkstoffen sein, die befähigt sind, zwei oder mehrere dieser Eigenschaften zu entfalten.
  • Vorzugsweise kann der Wirkstoff ein geeignetes Target selektiv agonisieren, selektiv antagonisieren, selektiv aufregulieren oder selektiv inhibieren.
  • Der Wirkstoff kann auch befähig sein, eine oder mehrere anderen vorteilhafte funktionelle Eigenschaften zu zeigen. Beispielsweise kann der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) sowohl cAMP als auch cGMP potenzieren.
  • Für gewisse Anwendungen (wie eine topischen Anwendung) kann der Wirkstoff auch eine ACE-(Angiotensin-konvertierendes-Enzym)-Inhibitionswirkung zeigen. Ein ACE-Assay ist hier im experimentellen Abschnitt vorgestellt. Für gewisse Anwendungen (wie bei besonderen Patientenarten), sind solche Wirkstoffe (d.h. diejenigen, die auch ACE-Inhibitionswirkung zeigen) nicht für die orale Verabreichung geeignet.
  • Für gewisse Anwendungen kann der Wirkstoff auch eine ECE-(Endothel-konvertierendes-Enzym)-Inhibitionswirkung zeigen. ECE-Assays sind im Fachgebiet wohlbekannt.
  • PHARMAZEUTISCHE KOMBINATIONEN
  • Der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) kann in Kombination mit einem oder mehreren anderen pharmazeutisch aktiven Wirkstoffen, beispielsweise mit einem PcGMP (wie einem Phosphodiesterase-Typ-5-Inhibitor, z.B. Sildenafil, oder einem Stickstoffmonoxid-Donor, oder einem Stickstoffmonoxid-Vorläufer z.B. L-Arginin oder Inhibitoren der Arginase) und/oder einem zentral wirkenden Pharmazeutikum (z.B. mit einem Dopaminrezeptoragonisten wie Apomorphin oder einem selektiven Dopamin-D2-Rezeptoragonisten wie PNU-95666 oder einem Melanocortin-Rezeptoragonist wie Melanotan II) verwendet werden. Lehren über die Verwendung von Apomorphinen als Pharmazeutikum finden sich in US-A-5945117. In jenem Dokument wird Apomorphin sublingual verabreicht. Zusätzlich oder alternativ kann der Wirkstoff zusammen mit einem oder mehreren aus: einem PDE5-Inhibitor (z.B. Sildenafil, Vardenafil (Bayer BA 38-9456) und IC351 (Cialis, Icos Lilly)), einem oder mehreren Stickstoffmonoxid-Donoren (z.B. NMI-921), einem oder mehreren Dopamin-Rezeptoragonisten (z.B. Apomorphin, Uprima, Ixsene), einem oder mehreren heterocyclischen Aminen wie dies allgemein und spezifisch in WO 00/40226, insbesondere in den Beispielen Nummer 7, 8 und 9 beschrieben ist, einem oder mehreren Melanocortin-Rezeptoragonisten (z.B. Melanotan II oder PT14), einem oder mehreren Kaliumkanalöffner (z.B. ein KATP-Kanalöffner (z.B. Minoxidil, Nicorandil) und/oder einem Kalzium-aktivierten Kaliumkanalöffner (z.B. BMS-204352), einem oder mehreren α1-Adrenozeptor-Antagonisten (z.B. Phentolamin, Vasofem, Vasomax), einem oder mehreren VIP-Rezeptoragonisten oder einem VIP-Analogon (z.B. Ro-125-1553) oder einem VIP-Fragment, einem oder mehreren α-Adrenozeptor-Antagonisten in Kombination mit VIP (z.B. Invicorp, Aviptadil), einem oder mehreren α2-Adrenozeptor-Antagonisten (z.B. Yohimbine), einem oder mehreren Östrogenen, Östrogen und Medroxyprogesteron oder Medroxyprogesteronacetat (MPA) oder Östrogen- und Methyltestosteron-Hormonersatztherapie-Wirkstoffen (z.B. HRT, insbesondere Premarin, Cenestin, Oestrofeminal, Equin, Estrace, Estrofem, Elleste Solo, Estring, Eastraderm, Eastraderm TTS, Eastraderm Matrix, Dermestril, Premphase, Prempro, Prempak, Premique, Estratest, Estratest HS, Tibolon), einem oder mehreren Testosteronersatz-Wirkstoffen (einschl. DHEA (Dehydroandrostendion), Testosteron (Tostrelle) oder einem Testosteronimplantat (Organon)), einem oder mehreren Testosteron/Öestradiol-Wirkstoffen, einem oder mehreren Östrogenagonisten, z.B. Lasofoxifen, einem oder mehreren Serotonin-Rezeptoragonisten oder -antagonisten (z.B. 5HT1A-, 5HT2C-, 5HT2A- und 5HT3-Rezeptoragonisten und -antagonisten; wie in WO2000/28993 beschrieben), einem oder mehreren Prostanoid-Rezeptoragonisten (z.B. Muse, Alprostadil, Misoprostol), einem oder mehreren Purinerg-Rezeptoragonisten (insbesondere P2Y2 und P2Y4) einem oder mehreren Antidepressiva (z.B. Bupropion (Wellbutrin), Mirrtazapin, Nefazodon) verwendet werden.
  • Die Struktur von IC351 ist:
  • Figure 00350001
  • Falls eine Kombination von aktiven Wirkstoffen verabreicht wird, dann können diese gleichzeitig, getrennt oder nacheinander verabreicht werden.
  • VIP-KOMBINATION
  • Gemäss der vorliegenden Erfindung ist der Wirkstoff bevorzugt nicht VIP (oder vorzugsweise nicht ein Analogon davon oder nicht ein Fragment davon). Allerdings kann der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) in gewissen Ausführungsformen zusammen mit einem VIP oder einem Analogon davon oder einem Fragment davon verabreicht werden.
  • In einem besonders bevorzugten Aspekt wird kein VIP oder Analogon davon oder Fragment davon verabreicht. Der Grund hierfür liegt darin, dass gemäss einem Bericht VIP-Infusionen zu signifikanten kardiovaskulären Nebenwirkungen wie einem Anstieg der Herzfrequenz und einer Abnahme des diastolischen arteriellen Blutdruckes führen (Ottesen 1983, 1987, 1995).
  • Ausserdem, und trotz der Tatsache, dass Ottesen und Mitarbeiter gezeigt haben, dass VIP bei gesunden Freiwilligen eine Erhöhung des vaginalen Blutflusses und der Lubrikation induziert, sind die Mechanismen, durch die VIP seine Wirkung entfaltet, unklar. In der Literatur gibt es eine Anzahl von Beispielen wonach VIP über verschiedene Second-Messenger-Systeme, z.B. cGMP/Guanylatcyclase (Ashur-Fabian, 1999); Kohlenstoffmonoxid-(CO)/Häm-Oxygenase (Fan et al., 1998) und cAMP/Adenylatcyclase (Foda, 1995; Schoeffter, 1985; Gu, 1992) signalisiert. Ein Beispiel hierfür findet sich in einem neueren Bericht, der aufzeigt, wie die vasorelaxierenden Wirkungen von VIP in der Gebärmutterarterie durch die Freisetzung von Stickstoffmonoxid erklärt werden kann (Jovanovic, 1998). Weiterhin bestehen auch Hinweise, dass VIP bei der männlichen urogenitalen Funktion Stickstoffmonoxid (NO)/cGMP moduliert (Kim, 1994).
  • Ausserdem wurde in der Literatur berichtet, dass VIP in Kulturen von vaginalen glatten Muskelzellen keine Wirkung auf die cAMP-Spiegel hat (siehe Traish, A., Moreland, R.B., Huang, Y., et al. (1999). Development of human und rabbit vaginal smooth muscle cell cultures: Effects of vasoactive agents on intracellular level of cyclic nucleotides. Mol. Cell Biol. Res. Comm., 2, 131–137).
  • Ausserdem berichteten Ottesen und Mitarbeiter (siehe Palle, Bredkjaer, Ottesen und Fahrenkrug 1990 Clinical und Experimental Pharmacology und Physiology vol 17 61–68) in Follow-up-Studien, dass die Wirkung von VIP auf den vaginalen Blutfluss unabhängig vom Verabreichungsweg Teil einer systemischen vasodilatorischen Wirkung und nicht einer lokalen Antwort ist. Ausserdem berichteten sie über eine Anzahl von mit VIP zusammenhängenden vaskulären Nebenwirkungen – beispielsweise Gesichtrötung, Hypertonie und Tachykardie.
  • Ki - WERTE
  • Für gewisse Anwendungen hat der erfindungsgemässe Wirkstoff (und wahlweise der mögliche zusätzliche Wirkstoff) vorzugsweise einen Ki-Wert von weniger als ungefähr 100 nM, vorzugsweise weniger als ungefähr 75 nM, vorzugsweise weniger als ungefähr 50 nM, vorzugsweise weniger als ungefähr 25 nM, vorzugsweise weniger als ungefähr 20 nM, vorzugsweise weniger als ungefähr 15 nM, vorzugsweise weniger als ungefähr 10 nM, vorzugsweise weniger als ungefähr 5 nM.
  • Kb - WERTE
  • Für gewisse Anwendungen hat der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) (und wahlweise der mögliche zusätzliche Wirkstoff) einen Kb-Wert von weniger als ungefähr 100 nM, vorzugsweise weniger als ungefähr 75 nM, vorzugsweise weniger als ungefähr 50 nM, vorzugsweise weniger als ungefähr 25 nM, vorzugsweise weniger als ungefähr 20 nM, vorzugsweise weniger als ungefähr 15 nM, vorzugsweise weniger als ungefähr 10 nM, vorzugsweise weniger als ungefähr 5 nM.
  • Ka - WERTE
  • Für gewisse Anwendungen hat der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) (und wahlweise der mögliche zusätzliche Wirkstoff) einen Ka-Wert von weniger als ungefähr 100 nM, vorzugsweise weniger als ungefähr 75 nM, vorzugsweise weniger als ungefähr 50 nM, vorzugsweise weniger als ungefähr 25 nM, vorzugsweise weniger als ungefähr 20 nM, vorzugsweise weniger als ungefähr 15 nM, vorzugsweise weniger als ungefähr 10 nM, vorzugsweise weniger als ungefähr 5 nM.
  • PHARMAKOKINETIK
  • Bei einigen Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung haben die erfindungsgemässen Wirkstoffe (d.h. I:NEP) (und wahlweise der mögliche zusätzliche Wirkstoff) vorzugsweise einen log D von –2 bis +4, besonders bevorzugt von –1 bis +2. Der log D kann mittels im Fachgebiet bekannten Standardverfahren, wie in J. Pharm. Pharmacol. 1990, 42:144 beschrieben, bestimmt werden.
  • Zusätzlich oder alternativ haben die erfindungsgemässen Wirkstoffe (d.h. I:NEP) in gewissen Ausgestaltungen (und wahlweise der mögliche zusätzliche Wirkstoff) vorzugsweise einen caco-2-Fluss grösser als 2 × 10-6 cms-1, besonders bevorzugt grösser als 5 × 10-6 cms-1. Der Wert des caco-2-Flusses kann mittels im Fachgebiet bekannten Standardverfahren, wie in J. Pharm. Sci 79, 7, S. 595–600 (1990), und Pharm. Res. vol 14, no. 6 (1997) beschrieben, bestimmt werden.
  • SELEKTIVITÄT
  • Für gewisse Anwendungen hat der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) (und wahlweise der mögliche zusätzliche Wirkstoff) vorzugsweise eine mindestens ungefähr 100-fache Selektivität zum gewünschten Target, vorzugsweise eine mindestens ungefähr 150-fache Selektivität zum gewünschten Target, vorzugsweise eine mindestens ungefähr 200-fache Selektivität zum gewünschten Target, vorzugsweise eine mindestens ungefähr 250-fache Selektivität zum gewünschten Target, vorzugsweise eine mindestens ungefähr 300-fache Selektivität zum gewünschten Target, vorzugsweise eine mindestens ungefähr 350-fache Selektivität zum gewünschten Target.
  • Für gewisse Anwendungen hat der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) (und wahlweise der mögliche zusätzliche Wirkstoff) vorzugsweise eine mindestens ungefähr 400-fache Selektivität zum gewünschten Target, vorzugsweise eine mindestens ungefähr 500-fache Selektivität zum gewünschten Target, vorzugsweise eine mindestens ungefähr 600-fache Selektivität zum gewünschten Target, vorzugsweise eine mindestens ungefähr 700-fache Selektivität zum gewünschten Target, vorzugsweise eine mindestens ungefähr 800-fache Selektivität zum gewünschten Target, vorzugsweise eine mindestens ungefähr 900-fache Selektivität zum gewünschten Target, vorzugsweise eine mindestens ungefähr 1000-fache Selektivität zum gewünschten Target.
  • CHEMISCHE SYNTHESEVERFAHREN
  • Typischerweise wird der Wirkstoff durch chemische Syntheseverfahren hergestellt werden.
  • Der Wirkstoff oder das Target oder Varianten, Homologa, Derivate, Fragmente oder Mimetika davon können unter Verwendung von chemischen Verfahren zur Synthese des Wirkstoffes als ganzes oder als Teil hergestellt werden. Beispielsweise können Peptide durch Festphasenverfahren synthetisiert, vom Harz abgespaltet und mittels präparativer Hochleistungs-Flüssig-Chromatographie gereinigt werden (z.B. Creighton (1983) Proteins Structures und Molecular Principles, WH Freeman und Co, New York NY). Die Zusammensetzung der synthetischen Peptide kann mittels Aminosäure-Analyse oder Sequenzierung bestätigt werden (z.B. Edman-Abbauverfahren; Creighton, oben).
  • Die direkte Synthese des Wirkstoffes oder von Varianten, Homologa, Derivaten, Fragmenten oder Mimetika davon kann unter Verwendung von verschiedenen Festphasen-Verfahren durchgeführt werden (Roberge JY et al (1995) Science 269: 202–204), und die automatisierte Synthese kann beispielsweise unter Verwendung des ABI 43 1 A Peptide-Synthesizer (Perkin Elmer) entsprechend den vom Hersteller gelieferten Anleitungen erreicht werden. Ausserdem können die den Wirkstoff oder irgend einen Teil desselben umfassenden Aminosäurensequenzen während der direkten Synthese verändert und/oder unter Verwendung von chemischen Verfahren mit einer Sequenz von anderen Untereinheiten oder irgend einem Teil davon kombiniert werden, woraus sich eine Wirkstoff- oder Targetvariante wie beispielsweise eine NEP-Variante ergibt.
  • In einer alternativen Ausgestaltung der Erfindung kann die kodierende Sequenz des Wirkstoff-Targets oder von Varianten, Homologa, Derivaten, Fragmenten oder Mimetika davon als ganzes oder als Teil unter Verwendung von im Fachgebiet wohlbekannten chemischen Verfahren synthetisiert werden (siehe Caruthers MH et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 215-23, Horn T et al (1980) Nuc Acids Res Symp Ser 225–232).
  • MIMETIKUM
  • Der hier verwendete Begriff "Mimetikum" bezieht sich auf irgend eine chemische Verbindung, was ohne darauf beschränkt zu sein ein Peptid, ein Polypeptid, einen Antikörper oder eine andere organische chemische Verbindung umfasst, welche dieselbe qualitative Aktivität oder Wirkung am Target haben wie ein Referenzwirkstoff.
  • CHEMISCHE DERIVATE
  • Der hier verwendete Begriff "Derivat" oder "derivatisiert" umfasst chemische Modifikationen eines Wirkstoffes. Ein Beispiel für solche chemischen Modifikationen wäre das Ersetzen von Wasserstoff durch einen Halogengruppe, eine Alkylgruppe, eine Acylgruppe oder eine Aminogruppe.
  • CHEMISCHE MODIFIKATION
  • In einer Ausgestaltung der vorliegenden Erfindung kann der Wirkstoff ein chemisch modifizierter Wirkstoff sein.
  • Die chemische Modifikation eines Wirkstoffes kann die Wasserstoffbindungs-Interaktion, die Ladungs-Interaktion, die hydrophobe Interaktion, die Van Der Waals Interaktion oder die Dipol-Interaktion zwischen dem Wirkstoff und dem Target entweder verstärken oder reduzieren.
  • In einem der Aspekte kann der identifizierte Wirkstoff als Modell (beispielsweise als Matrize) für die Entwicklung von anderen Verbindungen wirken.
  • REKOMBINANTE VERFAHREN
  • Typischerweise kann das im Assay verwendete Target durch rekombinante DNS-Verfahren hergestellt werden.
  • POTENZIERUNG VON cGMP
  • Der hier unter Bezugnahme auf cGMP verwendete Begriff "Potenzierung" umfasst irgend eines oder mehrere von: Erhöhung der Wirksamkeit von cGMP, Erhöhung des Spiegels von cGMP, Erhöhung der Aktivität von cGMP, Verringerung des Ausmasses des cGMP-Abbaus, Verringerung des Ausmasses der cGMP-Inhibition.
  • Die potenzierende Wirkung kann eine direkte Wirkung sein. Alternativ kann sie eine sekundäre Wirkung und/oder eine Wirkung stromabwärts sein.
  • Hier wirkt der Wirkstoff, der cGMP potenziert, vorzugsweise auf ein IcGMP und/oder ein AMcGMP, wobei der Modulator von cGMP eine schädliche Wirkung auf cGMP hat, so dass der Wirkstoff die schädliche Wirkung auf das IcGMP und/oder das AMcGMP gegenüber cGMP reduziert und/oder eliminiert und/oder maskiert und/oder abhält.
  • Demnach umfasst die vorliegende Erfindung eine Kombination von einem oder mehreren I:IcAMP und einem oder mehreren I:IcGMP. In einem Aspekt ist das I:IcGMP ein I:PDEcGMP.
  • IcAMP UND/ODER AMcAMP
  • Es wurde gezeigt, dass cAMP den genitalen (z.B. vaginalen oder klitoralen) Blutfluss vermittelt, und durch Erhöhung der cAMP-Signalisierung kann im Tiermodell der genitale (z.B. vaginale oder klitorale) Blutfluss erhöht werden. Demnach wird ein Wirkstoff, welcher die cAMP-vermittelte Vasorelaxation auf reguliert/erhöht, bei der Behandlung von FSAD wirksam sein. Zur Vereinfachung werden diese Substanzen als Inhibitoren von IcAMP und/oder von AMcAMP bezeichnet. Hier haben das IcAMP und das AMcAMP eine schädliche Wirkung auf die cAMP-Spiegel oder -Aktivität.
  • Demnach kann der Wirkstoff eines oder mehrere sein von: ein I:IcAMP und/oder ein I:AMcAMP.
  • Der Wirkstoff kann eine einzelne Einheit sein, die befähigt ist, zwei oder mehrere dieser Eigenschaften zu entfalten. Alternativ oder zusätzlich kann der Wirkstoff eine Kombination von Wirkstoffen sein, die befähigt sind, eine oder mehrere dieser Eigenschaften zu entfalten.
  • Beispiele von IcAMP und AMcAMP umfassen NEP und einer oder mehrere PDE(s) oder irgend eine assoziierte Komponente. Die assoziierte Komponente kann beispielsweise ein Rezeptor und/oder eim Kofaktor sein.
  • Demnach kann der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) in Kombination mit einem oder mehreren von: einem I:PDEcAMP, einem I:NPY (gelegentlich als NPYi bezeichnet), ein I:NPY Yn (gelegentlich als NPY Yni bezeichnet) verwendet werden.
  • Ähnlicherweise kann der Wirkstoff eine einzelne Einheit sein, die befähigt ist, zwei oder mehrere dieser Eigenschaften zu entfalten. Alternativ oder zusätzlich kann der Wirkstoff eine Kombination von Wirkstoffen sein, die befähigt sind, eine oder mehrere dieser Eigenschaften zu entfalten.
  • I:IcAMP UND/ODER I:AMcAMP
  • In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass es möglich ist, FSAD unter Verwendung eines Wirkstoffes, welcher die schädliche Wirkung auf das IcAMP und/oder das AMcAMP gegenüber cAMP reduziert und/oder eliminiert und/oder maskiert und/oder abhält und/oder verhindert, zu behandeln und/oder zu verhindern. Der Wirkstoff kann sogar die cAMP-Spiegel wiederherstellen, die durch ein IcAMP und/oder ein AMcAMP verringert wurden. Der Einfachheit halber werden diese Substanzen als I:IcAMP und/oder als I:AMcAMP bezeichnet. Hier verhindert oder verringert das I:IcAMP und das I:AMcAMP die schädliche Wirkung auf die cAMP-Spiegel oder -Aktivität.
  • Demnach ist der Wirkstoff in einem bevorzugten Aspekt ein I:IcAMP und/oder ein I:AMcAMP, wobei das AMcAMP eine schädliche Wirkung auf AMcAMP hat.
  • AcAMP
  • In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde gefunden, dass eine der wichtigen Ursachen von FSAD niederige Spiegel oder eine niederige Aktivität von cAMP in den weiblichen Genitalien sind.
  • Demnach kann der Wirkstoff ein U:AcAMP sein.
  • Demnach sollte der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) vorzugsweise auch befähigt sein, als A:AC, A:VIPr, A:VIPn, I:I:VIPr oder I:IvIPn zu wirken und/oder zusammen mit irgend einem oder mehreren derselben verwendet zu werden.
  • Der Wirkstoff kann eine einzelne Einheit sein, die befähigt ist, zwei oder mehrere dieser Eigenschaften zu entfalten. Alternativ oder zusätzlich kann der Wirkstoff eine Kombination von Wirkstoffen sein, die befähigt sind, eine oder mehrere dieser Eigenschaften zu entfalten.
  • U:AcAMP
  • In einem anderen Aspekt kann ein zusätzliches Target eine Komponente sein, welche den cAMP-Spiegel erhöht. Demnach kann der Wirkstoff auch als ein U:AC wirken.
  • Demnach kann der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) beispielsweise auch befähigt sein, als U:AcAMP, ein A:AC, ein A:VIPr, ein A:VIPn, ein I:I:VIPr oder ein I:I:VIPn zu wirken und/oder zusammen mit irgend einem oder mehreren derselben verwendet zu werden.
  • Beispielsweise könnte das Target cAMP selber oder AC oder VIP (oder Kombinationen davon) sein.
  • KOMBINATION von I:IcAMP UND/ODER I:McAMP AND/OR U:AcAMP
  • In einem anderen Aspekt kann der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) zusammen mit cAMP-Potenziatoren verwendet werden. Beispielsweise kann der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) zusammen mit einem oder mehreren von:
    • I:PDEcAMP
    • I:PDEncAMP
    • I:NPY
    • I:NPY Yn
    • I:NEP
    • U:AcAMP
    • A:AC
    • A:VIPr
    • A:VIPn
    • I:I:VIPr
    • I:I:VIPn
    • CAMP-Mimetikum
    • verwendet werden.
  • INHIBITOREN
  • Der hier im Zusammenhang mit dem erfindungsgemässen Wirkstoff (d.h. I:NEP) verwendete Begriff "Inhibitor" bedeutet einen Wirkstoff, welcher die schädliche Wirkung von einem IcAMP und/oder einem schädliche McAMP gegenüber cAMP reduzieren und/oder eliminieren und/oder maskieren und/oder verhindern kann.
  • AKTIVATOR
  • Der hier im Zusammenhang mit dem erfindungsgemässen Wirkstoff (d.h. I:NEP) verwendete Begriff "Aktivator" bedeutet einen Wirkstoff, welcher cAMP und/oder AcAMP erhöhen und/oder bilden und/oder demaskieren kann und/oder die Wirkung von cAMP und/oder eines AcAMP verstärken oder sicherstellen kann. Der Aktiviator kann als ein Agonist wirken.
  • ANDERE AKTIVEN KOMPONENTEN
  • In einem anderen Aspekt kann der erfindungsgemässe Wirkstoff sogar zusammen mit einer oder mehreren anderen aktiven Komponenten – beispielsweise mit einem oder mehreren Wirkstoffen, die zur Potenzierung von cGMP befähigt sind – vorliegen.
  • AMINOSÄURENSEQUENZ
  • Der hier verwendete Begriff "Aminosäurensequenz" ist gleichbedeutend mit dem Begriff "Polypeptid" und/oder dem Begriff "Protein". In gewisse Fällen ist der Begriff "Aminosäurensequenz" gleichbedeutend mit dem Begriff "Peptid". In gewisse Fällen ist der Begriff "Aminosäurensequenz" gleichbedeutend mit dem Begriff "Protein".
  • Die Aminosäurensequenz kann durch Isolieren aus einer geeigneten Quelle hergestellt werden, oder sie kann synthetisch hergestellt werden, oder sie kann unter Verwendung von rekombinanten DNS-Verfahren hergestellt werden.
  • Ferner wird eine Aminosäurensequenz beschrieben, die befähigt ist, in einem Assay als Target zu dienen, wobei das Assay zur Identifikation von einem oder mehreren Wirkstoffen und/oder Derivaten davon vorgesehen ist, welche die Aminosäurensequenz dahingehend beeinflussen können, dass das cAMP zwecks Behandlung von FSAD potenziert wird,
  • NUKLEOTID-SEQUENZ
  • Der hier verwendete Begriff "Nukleotid-Sequenz" ist gleichbedeutend mit dem Begriff "Polynukleotid".
  • Die Nukleotid-Sequenz kann DNS oder RNS von genomischem oder synthetischem oder rekombinantem Ursprung sein. Die Nukleotid-Sequenz kann doppelsträngig oder einzelsträngig sein, unabhängig davon, ob sie den Sense- oder Antisense-Strang oder Kombinationen davon repräsentiert.
  • Für gewisse Anwendungen ist die Nukleotid-Sequenz vorzugsweise DNS.
  • Für gewisse Anwendungen wird die Nukleotid-Sequenz vorzugsweise unter Verwendung von rekombinanten DNS-Verfahren (z.B. rekombinanter DNS) hergestellt.
  • Für gewisse Anwendungen ist die Nukleotid-Sequenz vorzugsweise cDNS.
  • Für gewisse Anwendungen kann die Nukleotid-Sequenz vorzugsweise dieselbe sein wie die natürlich vorkommende Form für diesen Aspekt.
  • Ausserdem wird eine Nukleotid-Sequenz bereitgestellt, die für eine Substanz kodiert, welche befähigt ist, in einem Assay (beispielsweise in einem Hefe-Zwei-Hybrid-Assay) als Target zu dienen, wobei das Assay zur Identifikation von einem oder mehreren Wirkstoffen und/oder Derivaten davon vorgesehen ist, welche zwecks Behandlung von FSAD die Aminosäurensequenz dahingehend beeinflussen können, dass das cAMP potenziert wird.
  • Eine Fachperson wird verstehen, dass infolge der Entartung des genetischen Codes zahlreiche unterschiedliche Nukleotid-Sequenzen für die Targets kodieren können. Ferner versteht sich, dass Fachpersonen unter Verwendung von Routineverfahren Nukleotid-Substitutionen vornehmen können, welche – ohne die durch die erfindungsgemässe Nukleotid-Sequenz kodierte Aktivität wesentlich zu beeinflussen – die Codon-Belegung von jedem besonderen Wirtsorganismus reflektieren, in welchem das Target exprimiert werden soll. Demnach umfassen die Begriffe "Variante", "Homolog" oder "Derivat" im Zusammenhang mit der in den beigefügten Nukleotid-Sequenzprotokollen angegebenen Nukleotid-Sequenz jegliche Substitution, Variation, Modifikation, Ersetzung, Deletion oder Addition von einer oder mehreren Nukleinsäuren aus oder in die Sequenz, sofern die resultierende Nukleotid-Sequenz für ein funktionelles Target gemäss der vorliegenden Erfindung kodiert (oder sogar für einen erfindungsgemässen Wirkstoff (d.h. I:NEP), falls besagter Wirkstoff eine Nukleotid-Sequenz oder eine Aminosäurensequenz umfasst).
  • Wie oben im Zusammenhang mit der Sequenzhomologie aufgezeigt, besteht bevorzugt eine mindestens 75%-ige, noch bevorzugter mindestens 85%-ige, noch bevorzugter mindestens 90%-ige Homologie zu den im beiliegenden Sequenzprotokoll angegebenen Sequenzen. Besonders bevorzugt besteht eine mindestens 95%-ige, noch bevorzugter eine mindestens 98%-ige Homologie. Nukleotid-Homologie-Vergleiche können wie oben beschrieben durchgeführt werden. Ein bevorzugtes Sequenz-Vergleichs-Programm ist das oben beschriebene GCG-Wisconsin-Bestfit-Programm. Die vorgegebene Treffermatrix hat einen Übereinstimmungswert von 10 für jedes identische Nukleotid und –9 für jede Nicht-Übereinstimmung. Der vorgegebene Abzug für eine Lückenbildung ist –50 und der vorgegebene Abzug für eine Lückenausdehnung ist –3 für jedes Nukleotid.
  • Ausserdem werden Nukleotid-Sequenzen beschrieben, die fähig sind, selektiv zu den hier angegebenen Sequenzen oder zu irgend einer Variante, einem Fragment oder Derivat davon oder zum Komplement eines der obigen zu hybridisieren. Nukleotid-Sequenzen haben bevorzugt eine Länge von mindestens 15 Nukleotiden, besonders bevorzugt eine Länge von mindestens 20, 30, 40 oder 50 Nukleotiden. Diese Sequenzen können als Sonden, beispielsweise in einem diagnostischen Kit, verwendet werden.
  • VARIANTEN/HOMOLOGA/DERIVATE
  • Zusätzlich zu den hier erwähnten spezifischen Aminosäurensequenzen und Nukleotid-Sequenzen umfasst die vorliegende Erfindung auch die Verwendung von Varianten, Homologa und Derivaten davon. Hier kann der Begriff "Homologie" mit "Identität" gleichbedeutend sein.
  • Im vorliegenden Zusammenhang wird davon ausgegangen, dass eine homologe Sequenz eine Aminosäurensequenz enthält, die zu mindestens 75, 85 oder 90% identisch, vorzugsweise zu mindestens 95 oder 98% identisch ist. Inbesondere sollte Homolgie typischerweise im Bezug auf diejeinigen Regionen der Sequenz betrachtet werden, welche erwiesenermassen für eine Aktivität essenziell sind. Obwohl Homologie auch in Bezug auf die Ähnlichkeit (d.h. Aminosäurenreste mit ähnlichen chemischen Eigenschaften/Funktionen) betrachtet werden kann, wird Homologie im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung vorzugsweise in Bezug auf Sequenzidentität auszudrücken.
  • Homologie-Vergleiche können von Auge oder, was noch üblicher ist, mit Hilfe von ohne weiteres verfügbaren Sequenz-Vergleichsprogrammen ausgeführt werden. Diese kommerziell verfügbaren Computerprogramme können die % Homolgie zwischen zwei oder mehreren Sequenzen berechnen.
  • Die %-Homolgie kann über benachbarte Sequenzen berechnet werden, d.h. die eine Sequenz wird mit der anderen Sequenz ausgerichtet, und jede Aminosäure in der einen Sequenz wird direkt mit der entsprechenden Aminosäure in der anderen Sequenz verglichen, jeweils ein Rest aufs Mal. Dies wird als ein "lückenloses" Ausrichten bezeichnet. Typischerweise werden solche lückenlosen Ausrichtungen nur über eine relativ kurze Anzahl von Resten durchgeführt.
  • Obwohl es sich um ein sehr einfaches und konsistentes Verfahren handelt, berücksichtigt dieses nicht, dass beispielsweise in einem ansonsten identischen Paar von Sequenzen eine Insertion oder Deletion den nachfolgenden Aminosäurenrest aus der Reihe bringt, was zu einer grossen Reduktion in der % Homolgie führen kann, wenn eine globale Ausrichtung vorgenommen wird.
  • Demzufolge sind die meisten Sequenz-Vergleichsverfahren dazu ausgelegt, optimale Ausrichtungen zu bilden, welche mögliche Insertionen und Deletionen ohne ungebührlichen Abzug beim Gesamthomolgiewert berücksichtigen. Dies wird durch Einfügen von "Lücken" in der Sequenzausrichtung erreicht, wobei versucht wird, eine maximale lokale Homolgie herbeizuführen.
  • Allerdings wesien diese komplexeren Verfahren jeder vorkommenden Lücke in der Ausrichtung einen "Lücken-Abzug" zu, so dass für dieselbe Anzahl von identischen Aminosäuren eine Sequenz-Ausrichtung mit möglichst wenigen Lücken – was einer höhere Übereinstimmung zwischen den beiden verglichenen Sequenzen entspricht – einen höheren Wert erreichen wird als ein solche mit zahlreichen Lücken. Typischerweise werden "affine Lücken-Kosten" verwendet, welche für das Vorkommen einer Lücke einen vergleichsweise hohen Zuschlag auferlegen und für jeden zusätzlichen Rest in der Lücke einen kleineren Zuschlag auferlegen. Dies ist das am häufigsten verwendete Lücken-Bewertungssystem. Hohe Lücken-Zuschläge werden natürlich optimierte Ausrichtungen mit weniger Lücken ergeben. Die meisten Ausrichtungsprogramme erlauben es, die Lücken-Zuschläge zu modifizieren. Allerdings ist es beim Verwenden solcher Software für Sequenzvergleiche bevorzugt, die vorgegebene Werte zu verwenden. Falls beispielsweise das GCG Wisconsin Bestfit Paket (siehe unten) verwendet wird, beträgt der vorgegebene Lücken-Zuschlag für Aminosäurensequenzen –12 für eine Lücke und –4 für jede Extension.
  • Die Berechnung der maximalen % Homolgie erfordert denmach erstens die Bildung einer optimalen Ausrichtung, welche die Lücken-Zuschläge berücksichtigt. Ein geeignetes Computerprogramm für die Durchführung einer solchen Ausrichtung ist das GCG Wisconsin Bestfit Paket (University of Wisconsin, U.S.A.; Devereux et al., 1984, Nucleic Acids Research 12:387). Beispiele für andere Software, welche Sequenzvergleiche durchführen kann, umfassen ohne darauf beschränkt zu sein, das BLAST Paket (siehe Ausubel et al., 1999 ibid – Chapter 18), FASTA (Atschul et al., 1990, J. Mol. Biol., 403–410) und das GENEWORKS Vergleichsinstrumente-Paket. Sowohl BLAST als auch FASTA sind für offline und online Suchen verfügbar (siehe Ausubel et al., 1999 ibid, pages 7–58 to 7–60). Allerdings ist es bevorzugt, das GCG Bestfit-Programm zu verwenden. Es ist auch ein neues Instrument für den Vergleich von Protein- und Nukleotid-Sequenzen verfügbar, das als BLAST 2 Sequences bezeichnet wird (siehe FEMS Microbiol Lett 1999 174(2): 247-50; FEMS Microbiol Lett 1999 177(1): 187–8 und tatiana@ncbi.nlm.nih.gov).
  • Obwohl die endgültige %-Homolgie in Bezug auf Identität bestimmt werden kann, beruht der Ausrichtungsprozess als solcher typischerweise nicht auf einem alles-oder-nichts- Paarvergleich. Vielmehr wird im Allgemeinen eine skalierte Ähnlichkeitswert-Matrix verwendet, welche jedem paarweisen Vergleich einen auf chemischer Ähnlichkeit oder evolutionärem Abstand basierenden Wert zuweist. Ein Beispiel für eine solche üblicherweise verwendete Matrix ist die BLOSUM62-Matrix – die Vorgabematrix für das Programmpaket BLAST. Die GCG-Wisconsin-Programme verwenden im Allgemeinen entweder die öffentlichen Vorgabewerte oder falls verfügbar eine zugeschnitte Symbolvergleichstabelle (siehe Anwendungshandbuch für weitere Detaile). Es wird bevorzugt, für das GCG Paket die öffentlichen Vorgabewerte und im Falle von anderer Software die Vorgabematrix wie BLOSUM62 zu verwenden.
  • Nachdem die Software eine optimale Ausrichtung gebildet hat, ist es möglich die %-Homolgie, vorzugsweise die %-Sequenzidentität zu berechnen. Die Software tut dies typischerweise im Zuge des Sequenzvergleichs und erzeugt ein numerisches Resultat.
  • Die Sequenzen können auch Deletionen, Insertionen oder Substitutionen von Aminosäurenresten haben, welche eine stille Veränderung bilden und zu einer funktionell äquivalenten Substanz führen. Vorsätzliche Aminosäuren-Substitutionen können auf der Basis von Ähnlichkeit in der Polarität, Ladung, Löslichkeit, Hydrophobie, Hydrophilie und/oder der amphiphilen Natur der Reste gemacht werden, so lange die sekundäre Bindungsaktivität der Substanz erhalten bleibt. Beispielsweise umfassen negativ geladene Aminosäuren Aspartansäure und Glutaminsäure; positiv geladene Aminosäuren umfassen Lysin und Arginin; und Aminosäuren mit ungeladenen polaren Kopfgruppen, die ähnliche Hydrophile- Werte aufweisen, umfassen Leucin, Isoleucin, Valin, Glycin, Alanin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Phenylalanin und Tyrosin.
  • Konservative Substitutionen können beispielsweise gemäss der unten aufgeführten Tabelle vorgenommen werden. Aminosäuren im selben Block in der zweiten Spalte und vorzugsweise in derselben Zeile in der dritten Spalte können für einander substituiert werden:
  • Figure 00550001
  • Es können homologe Substitutionen (Substitution und Ersatz werden hier beide als Bezeichnung für den Austausch eines bestehenden Aminosäurerestes durch einen alternativen Rest verwendet), d.h. gleich-für-gleich Substitutionen wie basisch für basisch, sauer für sauer, polar für polar usw. vorkommen. Es können auch nicht-homologe Substitutionen, d.h. Substitutionen von einer Klasse von Resten zu einer anderen oder alternativ der Einschluss von unnatürlichen Aminosäuren wie Ornithin (hiernach als Z bezeichnet), Diaminobuttersäure-ornithin (hiernach als B bezeichnet), Norleucin-ornithin (hiernach als O bezeichnet), Pyriylalanin, Thienylalanin, Naphthylalanin und Phenylglycin vorkommen.
  • Ersetzungen können auch durch unnatürliche Aminosäuren einschliesslich; alpha*- und alpha-disubstituierte* Aminosäuren, N-Alkyl-Aminosäuren*, Milchsäure*, Halogenderivate von natürlichen Aminosäuren wie Trifluorotyrosin*, p-Cl-Phenylalanin*, p-Br-Phenylalanin*, p-I-Phenylalanin*, L-Allyl-glycine*, β-Alanin*, L-α-Aminobuttersäure*, L-γ-Aminobuttersäure*, L-α-Aminoisobuttersäure*, L-ε-Aminocapronsäure#, 7-Aminoheptansäure*, L-Methioninsulfon#*, L-Norleucin*, L-Norvalin*, p-Nitro-L-phenylalanin*, L-hydroxyprolin#, L-Thioprolin*, Methylderivate von Phenylalanin (Phe) wie 4-Methyl-Phe*, Pentamethyl-Phe*, L-Phe-(4-amino)#, L-Tyr-(methyl)*, L-Phe-(4-isopropyl)*, L-Tic-(1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure)*, L-Diaminopropionsäure# und L-Phe-(4-benzyl)* erfolgen. Die Bezeichnung* wurde zum Zweck der obigen Diskussion (im Bezug auf homologe oder nicht-homologe Substitution) zur Bezeichnung der hydrophoben Natur des Derivates verwendet, während # zur Bezeichnung der hydrophilen Natur des Derivates verwendet wurde, #* weist auf amphiphile Eigenschaften hin.
  • Variante Aminosäurensequenzen können geeignete Spacergruppen umfassen, welche zwischen zwei beliebigen Aminosäurenresten der Sequenz eingeführt werden können und Alkylgruppen wie Methyl-, Ethyl- oder Propylgruppen sowie Aminosäurespacer wie Glycin oder β-alanin-Reste umfassen. Eine weitere Art von Variation umfasst die Gegenwart von einem oder mehreren Aminosäurenresten in peptoider Form, was Fachpersonen wohl bekannt sein wird. Zur Vermeidung von Unklarheiten wird "die peptoide Form" verwendet, um auf Varianten eines Aminosäurenrestes hinzuweisen, worin die α-Kohlenstoff-Substituentgruppe am Stickstoffatom des Restes statt am α- Kohlenstoff ist. Verfahren zur Herstellung von Peptiden in der peptoiden Form sind im Fachgebiet wohlbekannt, beispielsweise Simon RJ et al., PNAS (1992) 89(20), 9367-9371 und Horwell DC, Trends Biotechnol. (1995) 13(4), 132-134.
  • HYBRIDISIERUNG
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch die Verwendung von Sequenzen, die zu den hier dargestellten Target-Sequenzen hybridisieren können – beispielsweise wenn der Wirkstoff eine Antisense-Sequenz ist.
  • Der hier verwendete Begriff "Hybridisierung" soll "das Verfahren, durch das ein Strang von Nukleinsäuren über Basen-Paarung mit einem komplementären Strang verknüpft wird" sowie das Verfahren der durch Polymerase-Kettenreaktions-(PCR)-Technologie ausgeführten Amplifikation umfassen.
  • Die erfindungsgemässen Nukleotid-Sequenzen, die zur selektiven Hybridisierung an die hier angegebenen Nukleotid-Sequenzen oder an deren Komplement befähigt sind, werden im Allgemeinen zu mindestens 75%, bevorzugt zu mindestens 85 oder 90% und besonders bevorzugt zu mindestens 95% oder 98% homolog zu den hier angegebenen entsprechenden komplementären Nukleotid-Sequenzen sein, und zwar über eine Region von mindestens 20, vorzugsweise mindestens 25 oder 30, beispielsweise mindestens 40, 60 oder 100 oder mehr benachbarten Nukleotiden. Bevorzugte erfindungsgemässe Nukleotid-Sequenzen werden Regionen umfassen, die zu der in SEQ ID No 2 der Sequenz-Liste der vorliegenden Erfindung angegebenen Nukleotid-Sequenz bevorzugt mindestens 80 oder 90% und besonders bevorzugt mindestens 95% homolog sind.
  • Der Begriff "selektiv hybridisierbar" bedeutet, dass die Nukleotid-Sequenz, wenn sie als Sonde verwendet wird, unter Bedinungen eingesetzt wird, wo eine Target-Nukleotid-Sequenz mit der Sonde in einem signifikant über dem Hintergrund liegenden Ausmass hybridisiert. Die Hintergrund-Hybridisierung kann wegen anderen Nukleotid-Sequenzen vorkommen, die beispielsweise in der gescreenten cDNS- oder genomischen DNS-Bibliothek vorhanden sind. In solchen Fällen impliziert "Hintergund" ein durch Interaktion zwischen der Sonde und einem nicht-spezifischen DNS-Mitglied der Bibliothek erzeugten Signal, welches weniger als 10-fach, vorzugsweise weniger als 100-fach so intensiv ist wie die mit der Target-DNS beobachtete spezifische Interaktion. Die Intensität der Interaktion kann beispielsweise durch Radiomarkierung der Sonde, z.B. mit 32P, gemessen werden.
  • Hybridisierungsbedingungen beruhen auf der Schmelztemperatur (Tm) des Nukleinsäure-Bindungskomplexes wie in Berger und Kimmel (1987, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology, Vol 152, Academic Press, San Diego CA) angegeben, und verleihen eine definierte "Stringenz" wie unten erklärt.
  • Eine maximale Stringenz kommt typischerweise bei ungefähr Tm-5°C (5°C unter dem Tm der Sonde) vor; eine hohe Stringenz bei ungefähr 5°C bis 10°C unter Tm; eine mittlere Stringenz bei ungefähr 10°C bis 20°C unter Tm; und eine niedrige Stringenz bei ungefähr 20°C bis 25°C unter Tm. Wie es Fachpersonen wohlbekannt sein wird, kann eine Hybridisierung maximaler Stringenz zur Identifikation und zum Nachweis von identischen Nukleotid-Sequenzen verwendet werden, während eine Hybridisierung mittlerer (oder niedriger) Stringenz zur Identifikation oder zum Nachweis von ähnlichen oder verwandten Polynukleotid-Sequenzen verwendet werden kann.
  • In einem bevorzugten Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung Nukleotid-Sequenzen, welche unter stringenten Bedingungen (z.B. 65°C und 0.l × SSC {1 × SSC = 0.15 M NaCl, 0.015 M Na3-Citrat, pH 7.0) zur erfindungsgemässen Nukleotid-Sequenz hybridisieren können. Wenn die erfindungsgemässe Nukleotid-Sequenz doppelsträngig ist, gehören beide Stänge des Duplexes, entweder individuell oder in Kombination, zur vorliegenden Erfindung. Es versteht sich, dass wenn die Nukleotid-Sequenz einsträngig ist, die komplementäre Sequenz dieser Nukleotid-Sequenz ebenfalls zum Umfang der vorliegenden Erfindung gehört.
  • Nukleotid-Sequenzen, die zu den erfindungsgemässen Sequenzen nicht zu 100% homolog sind, aber zum Umfang der Erfindung gehören, können auf eine Vielzahl von Wegen erhalten werden. Andere Varianten der hier beschriebenen Sequenzen können beispielsweise durch Absuchen von DNS-Bibliotheken gewonnen werden, die von einer Reihe von Quellen erzeugt wurden. Ausserdem können andere virale/bakterielle oder zelluläre Homologa, insbesondere in Zellen von Säugern (z.B. Zellen von Ratten, der Mäusen, Rindern und von Primaten) gefundene zelluläre Homologa, gewonnen werden, und solche Homologa und Fragmente davon sind im Allgemeinen zur selektiven Hybridisierung zu den hier in den Sequenzprotokolllen gezeigten Sequenzen befähigt. Solche Sequenzen können durch Absuchen von cDNS-Bibliotheken oder genomischen DNS Bibliotheken von anderen Tierspezies und durch Absuchen solcher Bibliotheken mit Sonden, welche die gesamte oder Teile der hier angegebenen Nukleotid-Sequenz unter Bedingungen mittlerer bis hoher Stringenz umfassen, gewonnen werden. Ähnliche Überlegungen gelten für das Gewinnen von Spezies-Homologa und allele Varianten der erfindungsgemässen Aminosäuren- und/oder Nukleotid-Sequenzen.
  • Varianten und Strang/Spezies-Homologa können auch unter Verwendung von degenerierter PCR gewonnen werden, welche Primer verwendet, die zur Ansteuerung von Sequenzen innerhalb der Varianten und Homologa ausgelegt sind, welche für erhaltene Aminosäurensequenzen innerhalb der erfindungsgemässen Sequenzen kodieren. Erhaltene Sequenzen können beispielsweise durch Ausrichtung der Aminosäurensequenzen aus mehreren Varianten/Homologa vorhergesagt weden. Sequenz-Ausrichtungen können unter Verwendung von im Fachgebiet bekannter Computer-Software vorgenommen werden. Beispielsweise wird das GCG Wisconsin PileUp Programm häufig verwendet. Die bei der degenerierten PCR verwendeten Primer werden eine oder mehrere degenerierte Positionen enthalten und werden unter Stringenz-Bedingungen verwendet, die niedriger sind als diejenigen, die zum Klonieren von Sequenzen mit Einzelsequenz-Primern gegen bekannte Sequenzen verwendet werden.
  • Alternativ können solche Nukleotid-Sequenzen durch ortsgerichtete Mutagenese von charakterisierten Sequenzen wie beispielsweise der in SEQ ID No 2 des erfindungsgemässen Sequenzprotokolls angegebenen Nukleotid-Sequenz gewonnen werden. Dies kann nützlich sein, wenn beispielsweise stille Codonveränderungen von Sequenzen benötigt werden zur Optimierung der Codonpräferenzen für eine bestimmte Wirtzelle, in welcher die Nukleotid-Sequenzen exprimiert werden. Andere Sequenzveränderungen können erwünscht sein, um Restriktionsenzym-Erkennungsstellen einzuführen oder um die Aktivität des durch die Nukleotid-Sequenzen kodierten Proteins zu verändern.
  • Die erfindungsgemässen Nukleotid-Sequenzen können zur Bildung eins Primers, z.B. eines PCR-Primers, eines Primers für eine alternative Amplifikationsreaktion, einer Sonde, die z.B. auf konventionelle Art unter Verwendung von radioaktiven oder nicht-radioaktiven Markierungen mit einer erkennbaren Markierung versehen ist, verwendet werden, oder die Nukleotid-Sequenzen können in Vektoren kloniert werden. Solche Primer, Sonden und andere Fragmente werden eine Länge von mindestens 15, vorzugsweise mindestens 20, beispielsweise mindestens 25, 30 oder 40 Nukleotide haben und sind im Begriff Nukleotid-Sequenz wie er hier verwendet wird ebenfalls enthalten.
  • Die Nukleotid-Sequenzen wie beispielsweise DNS-Polynukleotide und erfindungsgemässe Sonden können rekombinant, synthetisch oder durch irgend ein den Fachpersonen verfügbares Mittel hergestellt werden. Sie können auch mittels standardmässigen Verfahren kloniert werden.
  • Im Allgemeinen werden Primer synthetisch hergestellt, was eine schrittweise Herstellung der gewünschten Nukleinsäure-Sequenz – ein Nukleotid aufs Mal – beinhaltet. Verfahren, um dies mittels automatisierter Verfahren zu erreichen, sind im Fachgebiet bekannt.
  • Längere Nukleotid-Sequenzen werden im Allgemeinen unter Verwendung von rekombinanten Mitteln, beispielsweise unter Verwendung eines PCR- (Polymerase-Kettenreaktion) Klonierungsverfahrens, hergestellt. Dies umfasst das Erzeugen eines Paares von Primern (z.B. aus ungefähr 15 bis 30 Nukleotiden), welche eine Region der zu klonierenden Targeting-Sequenz flankieren, das in Kontakt bringen der Primer mit mRNS oder cDNS, die aus Zellen von einem Tier oder Menschen gewonnen wurde, das Durchführen einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Bedingungen, welche eine Amplifikation der gewünschten Region ergeben, das Isolieren des amplifizierten Fragmentes (z.B. durch Reinigen des Reaktionsgemisches auf einem Agarosegel) und das Wiedergewinnen der amplifizierten DNS. Die Primer können dahingehend ausgestaltet sein, dass sie geeignete Restriktionsenzym-Erkennungsstellen enthalten, so dass die amplifizierte DNS in einen geeigneten Klonierungsvektor kloniert werden kann.
  • Wegen der inhärenten Entartung des genetischen Codes können andere DNS-Sequenzen, welche im Wesentlichen für dieselbe oder eine funktionell äquivalente Aminosäurensequenz kodieren, zum Klonieren und Exprimieren der Target-Sequenzen verwendet werden. Wie den Fachpersonen bekannt ist, kann es für gewisse Expressionssysteme vorteilhaft sein, die Target-Sequenzen mit nicht-natürlich vorkommenden Codons zu erzeugen. Codons, die von einem bestimmten prokaryotischen oder eukaryotischen Wirt bevorzugt werden (Murray E et al (1989) Nuc Acids Res 17:477–508), können ausgewählt werden, um beispielsweise die Geschwindigkeit der Target-Expression zu erhöhen oder um rekombinante RNS-Transkripte mit gewünschten Eigenschaften zu erzeugen, beispielsweise mit einer längeren Halbwertszeit als diejenige von Transkripten aus einer natürlich vorkommenden Sequenz.
  • EXPRESSION VON VEKTOREN
  • Die als Target oder zur Expression des Targets verwendete Nukleotid-Sequenz kann in einen rekombinanten replizierbaren Vektor eingebaut werden. Der Vektor kann zur Repliaktion und Expression der Nukleotid-Sequenz in und/oder aus einer kompatiblen Wirtzelle verwendet werden. Die Expression kann durch Verwendung von Kontroll-Sequenzen, welche Promotoren/Verstärker und andere expressionsregulierende Signale umfassen, kontrolliert werden. Es können Prokaryotische Promotoren und in eukaryotischen Zellen funktionelle Promotoren verwendet werden. Es können gewebespezifische oder stimulispezifische Promotoren verwendet werden. Es können auch chimäre Promotoren, welche Sequenzelemente aus zwei oder mehreren unterschiedlichen Promotoren wie oben beschrieben umfassen, verwendet werden.
  • Das von einer rekombinanten Wirtzelle durch Expression der Nukleotid-Sequenz erzeugte Protein kann je nach verwendeter Sequenz und/oder Vektor ausgeschieden werden oder intrazellulär enthalten bleiben. Die kodierenden Sequenzen können mit Signal-Sequenzen versehen werden, welche die Ausscheidung der substanzkodierenden Sequenzen durch eine bestimmte prokaryotische oder eukaryotische Zellmembran lenken.
  • FUSIONSPROTEINE
  • Die Target-Aminosäurensequenz kann als Fusionsprotein hergestellt werden, um beispielsweise die Extraktion und Reinigung zu erleichtern. Beispiele von Fusionsproteinpartnern umfassen Glutathion-S-Transferase (GST), 6xHis, GAL4 (DNS-Bindungs- und/oder Transkriptions-Aktivierungsdomänen) und β-Galactosidase. Es kann auch vorteilhaft sein, eine proteolytische Spaltungstelle zwischen dem Fusionsproteinpartner und der interessierenden Proteinsequenz einzubauen, um das Entfernen von Fusionsprotein-Sequenzen zu erlauben. Vorzugsweise wird das Fusionsprotein die Aktivität des Targets nicht behindern.
  • Das Fusionsprotein kann ein(e) mit der erfindungsgemässen Substanz fusionierte(s) Antigen oder antigene Determinante umfassen. In dieser Ausgestaltung kann das Fusionsprotein ein nicht-natürlich vorkommendes Fusionsprotein sein, das eine Substanz umfasst, welche als ein Adjuvans im Sinne der Bereitstellung einer generalisierten Stimulation des Immunsystems wirken kann. Das Antigen oder die antigene Determinante kann entweder an das Amino- oder das Carboxyende der Substanz gebunden sein.
  • In einer anderen Ausgestaltung der Erfindung kann die Aminosäurensequenz an einer heterologe Sequenz gebunden sein, um ein Fusionsprotein zu kodieren. Beispielsweise kann es für das Absuchen von Peptid-Bibliotheken nach Wirkstoffen, die zur Beeinflussung der Substanz-Aktivität befähigt sind, nützlich sein, eine chimäre Substanz zu kodieren, die ein heterologes Epitop exprimiert, das von einem kommerziell verfügbaren Antikörper erkannt wird.
  • ANTIKÖRPER
  • Es wird ein Antikörper beschrieben. Zusätzlich oder alternativ kann das Target ein Antikörper sein. Zusätzlich oder alternativ kann das Mittel zum Nachweis des Targets ein Antikörper sein.
  • Antikörper können durch Standardverfahren wie der Immunisierung mit der erfindungsgemässen Substanz oder durch Verwendung einer Phagen-Display-Bibliothek hergestellt werden.
  • Im Rahmen der vorliegenden Erfindung umfasst der Begriff "Antikörper", wenn nicht anders angegeben und ohne darauf beschränkt zu sein, polyklonale, monoklonale, chimäre, "single-chain" Fab-Fragmente sowie durch eine Fab-Expressions-Bibliothek erzeugte Fragmente wie auch Mimetika davon. Solche Fragmente umfassen Fragmente ganzer Antikörper, die ihre Bindungsaktivität für eine Target-Substanz bewahren, Fv-, F(ab')- und F(ab')2-Fragmente, sowie single-chain Antikörper (scFv), Fusionsproteine und andere synthetische Proteine, welche die Antigen-Bindungsstelle des Antikörpers umfassen. Ausserdem können die Antikörper und Fragmente davon humanisierte Antikörper sein. Neutralisierende Antikörper, d.h. solche, welche die biologische Aktivität des Substanz-Polypeptids inhibieren, sind für Diagnostika und Therapeutika besonders bevorzugt.
  • Falls polyklonale Antikörper gewünscht werden, wird ein ausgewählter Säuger (z.B. Maus, Hase, Ziege, Pferd, usw.) mit einem immunogenen Polypeptid immunisiert, das ein aus einem identifizierten Wirkstoff und/oder einer erfindungsgemässen Substanz erhältliches Epitop trägt.
  • In Abhängigkeit der Wirtspezies können verschiedenen Adjuvanzien zur Erhöhung der immunologischen Antwort verwendet werden. Solche Adjuvanzien umfassen ohne darauf beschränkt zu sein Freund's, Mineralgele wie Aluminiumhydroxid und oberflächenaktive Substanzen wie Lysolecithin, pluronische Polyole, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen, Schlüsselloch-Limpet-Hämocyanin und Dinitrophenol. BCG (Bacilli Calmette-Guerin) und Corynebacterium parvum sind potenziell nützliche menschliche Adjuvanzien, welche in gereinigter Form verwendbar sind. Die Polypeptid-Substanz wird an immunologisch kompromittierte Individuen zwecks Stimulierung der systemischen Abwehr verabreicht.
  • Das Serum vom immunisierten Tier wird gesammelt und nach bekannten Verfahren behandelt. Falls ein Serum, das polyklonale Antikörper zu einem Epitop enthält, das von einem identifizierten erfindungsgemässen Wirkstoff und/oder einer erfindungsgemässen Substanz erhältlich ist, zudem Antikörper gegenüber anderen Antigenen enthält, können die polyklonalen Antikörper durch Immunoaffinitäts-Chromatographie gereinigt werden. Verfahren zum Erzeugen und Verarbeiten von polyklonalem Antisera sind im Fachgebiet bekannt. Damit solche Antikörper erzeugt werden können, beschreibt die Erfindung auch erfindungsgemässe Polypeptide oder Fragmente davon, die zwecks Verwendung als Immunogene bei Tieren oder Menschen an ein anderes Polypeptid haptenisiert sind.
  • Monoklonale Antikörper, die gegen Epitope gerichtet sind, welche von einem(r) erfindungsgemässen identifizierten Wirkstoff und/oder Substanz erhältlich sind, können von einer Fachperson ohne weiteres hergestellt werden. Die allgemeine Methodik zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern durch Hybridome ist wohlbekannt. Unsterbliche antikörpererzeugende Zell-Linien können durch Zellfusion und auch durch andere Verfahren wie direkte Transformation von B-Lymphozyten mit onkogener DNS oder Transfektion mit Epstein-Barr-Virus erzeugt werden. Paneele von gegen Orbit-Epitope gebildeten monoklonalen Antikörpern können nach verschiedene Eigenschaften gescreent werden; d.h. nach Isotypen- und Epitopen-Affinität.
  • Monoklonale Antikörper zur Substanz und/oder zum identifiziertem Wirkstoff können unter Verwendung irgend eines Verfahrens, welches die Bildung von Antikörper-Molekülen durch kontinuierliche Zell-Linien in Kulturen erlaubt, hergestellt werden. Diese umfassen – ohne darauf beschränkt zu sein – das ursprünglich von Koehler und Milstein beschriebene Hybridom-Verfahren (1975 Nature 256:495–497), das menschliche B-Zellen-Hybridom-Verfahren (Kosbor et al (1983) Immunol Today 4:72; Cote et al (1983) Proc Natl Acad Sci 80:2026–2030) und das EBV-Hybridom-Verfahren (Cole et al (1985) Monoclonale Antibodies und Cancer Therapy, Alan R Liss Inc, pp 77–96). Ausserdem können die für die Bildung von "chimären Antikörpern" entwickelten Verfahren, das Verspleissen von Maus-Antikörpergenen an menschliche Antikörpergene unter Gewinnung eines Moleküls mit geeigneter Antigenspezifität und biologischer Aktivität, verwendet werden (Morrison et al (1984) Proc Natl Acad Sci 81:6851–6855; Neuberger et al (1984) Nature 312:604–608; Takeda et al (1985) Nature 314:452–454). Alternativ können Verfahren, die zur Bildung von single-chain Antikörpern beschrieben wurden (US Patent No. 4,946,779), zur Bildung substanzspezifischer single-chain Antikörper adaptiert werden.
  • Sowohl monoklonale wie auch polyklonale Antikörper, die sich gegen Epitope richten, die aus einem(r) identifizierten Wirkstoff und/oder Substanz erhältlich sind, eignen sich besonders für die Diagnose, und solche, die neutralisierend sind, eignen sich für die passive Immunotherapie. Monoklonale Antikörper können insbesondere zur Erhöhung der anti-idiotypen Antikörper verwendet werden. Anti-idiotype Antikörper sind Immunoglobuline, welche ein "inneres Bild" der Substanz und/oder des Wirkstoffes tragen, gegen die der Schutz erwünscht ist. Verfahren zur Erhöhung von anti-idiotypen Antikörpern sind im Fachgebiet bekannt. Diese anti-idiotypen Antikörper können auch für die Therapie nützlich sein.
  • Antikörper können auch durch Induktion der in-vivo-Bildung in der Lymphozytenpopulation oder durch Screening von rekombinanten Immunoglobulin-Bibliotheken oder Paneelen mit hochspezifischen Bindingsreagenzien wie in Orlandi et al (1989, Proc NatI Acad Sci 86: 3833–3837) und Winter G und Milstein C (1991; Nature 349:293–299) beschrieben gebildet werden.
  • Es können auch Antikörper-Fragmente gebildet werden, welche spezifische Bindungsstellen für die Substanz enthalten. Beispielsweise umfassen solche Fragmente, ohne darauf beschränkt zu sein, die F(ab')2-Fragmente, welche durch Pepsinverdauung des Antikörper-Moleküls erzeugt werden können, und die Fab-Fragmente, welche durch Reduktion der Disulfidbrücken der F(ab')2-Fragmente gebildet werden können. Alternativ können Fab-Expressions-Bibliotheken konstruiert werden, um eine schnelle und einfache Identifikation von monoklonalen Fab-Fragmenten mit der gewünschten Spezifizität zu ermöglichen (Huse WD et al (1989) Science 256:1275–1281).
  • REPORTER
  • Eine grosse Vielzahl von Reportern kann in den Assay-Verfahren (wie auch in den Screenings) der vorliegenden Erfindung verwendet werden, wobei bevorzugte Reporter einfach nachweisbare Signale (z.B. mittels Spektroskopie) liefern. Beispielsweise kann ein Reportergen ein Enzym kodieren, das eine Reaktion katalysiert, welche die Lichtabsorptionseigenschaften verändert.
  • Beispiele von Reporter-Molekülen umfassen ohne darauf beschränkt zu sein β-Galactosidase, Invertase, grünes fluoreszierendes Protein, Luciferase, Chloramphenicol, Acetyltransferase, β-Glucuronidase, Exo-Glucanase und Glucoamylase. Alternativ können radioaktiv markierte oder fluoreszierend markierte Nukleotide in naszente Transcripte eingebaut werden, welche dann identifizierbar sind, wenn sie an Oligonukleotid-Sonden gebunden sind.
  • In einer bevorzugten Ausgestaltung wird die Bildung des Reporter-Moleküls anhand der enzymatischen Aktivität des Reportergen-Produktes, beispielsweise von β-Galactosidase, gemessen.
  • Eine Vielzahl von Protokollen zum Nachweis und zur Messung der Expression des Targets, wie die Verwendung von für das Protein spezifischen polyklonalen oder monoklonalen Antikörpern, sind im Fachgebiet bekannt. Beispiele umfassen den Enzyme-linked-immunosorbent Assay (ELISA), den Radioimmunoassay (RIA) und die Fluoreszenz-aktivierte Zellensortierung (FACS). Ein zwei-stelliger, monoklonalbasierter Immunoassay, welcher monoklonale Antikörper die gegenüber zwei nicht-interferierenden Epitopen auf Polypeptiden reaktiv sind, wird bevorzugt, aber es kann auch ein kompetitiver Bindungsassay verwendet werden. Diese und andere Assays sind unter anderem in Hampton R et al (1990, Serological Methods, A Laboratory Manual, APS Press, St Paul MN) und Maddox DE et al (1983, J Exp Med 15 8:121 1) beschrieben.
  • Eine grosse Vielzahl von Markierungs- und Konjugationsverfahren sind den Fachpersonen bekannt und können in verschiedenen Nuklein- und Aminosäure-Assays verwendet werden. Die Mittel zur Bildung von markierter Hybridisierung oder PCR-Sonden zum Nachweis der Target-Polynukleotid-Sequenzen umfassen die Oligomarkierung, die Nicktranslation und die Endmarkierung oder PCR-Amplifikation unter Verwendung eines markierten Nukleotides. Alternativ kann die kodierende Sequenz oder irgend ein Teil davon in einen Vektor zur Bildung einer mRNS-Sonde kloniert werden. Solche Vektoren sind im Fachgebiet bekannt, sind kommerziell verfügbar und können in vitro durch Zugabe einer geeigneten RNS-Polymerase wie T7, T3 oder SP6 und von markierten Nukleotiden zur Synthese von RNS-Sonden verwendet werden.
  • Eine Anzahl von Unternehmen wie Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ), Promega (Madison, WI) und US Biochemical Corp (Cleveland, OH) vertreiben kommerzielle Kits und Protokolle für diese Verfahren. Geeignet Reporter-Moleküle oder Markierungen umfassen Radionuklide, Enzyme, sowie fluoreszente, chemilumineszente oder chromogene Wirkstoffe sowie Substrate, Kofaktoren, Inhibitoren, magnetische Partikel und dergleichen. Patente, welche die Verwendung von solchen Markierungen angeben, umfassen US-A-3817837; US-A-3850752; US-A-3939350; US-A-3996345; US-A-4277437; US-A-4275149 und US-A-4366241. Es können auch rekombinante Immunoglobuline hergestellt werden wie in US-A-4816567 gezeigt.
  • Zusätzliche Verfahren zur Quantifizierung der Expression eines bestimmten Moleküls umfassen das radioaktive Markieren (Melby PC et al 1993 J Immunol Methods 159:235–44) oder das Biozinnylieren (Duplaa C et al 1993 Anal Biochem 229–36) von Nukleotiden, die Koamplifikation einer Kontroll-Nukleinsäure, sowie Standardkurven, auf denen die experimentellen Resultate interpoliert werden. Die Quantifizierung von mehrfachen Proben kann durch Durchführen des Assays in einem ELISA-Format, wobei das interessierende Oligomer in verschiedenen Verdünnungen vorliegt, beschleunigt werden, und eine spektrophotometrische oder kalorimetrische Antwort erlaubt eine rasche Quantifizierung.
  • Obwohl das Vorliegen/Fehlen von Marker-Gen-Expression darauf hinweist, dass das interessierende Gen vorhanden ist, sollte dessen Gegenwart und Expression bestätigt werden. Falls beispielsweise die Nukleotid-Sequenz in eine Marker-Gen-Sequenz eingeführt wird, können rekombinante Zellen, welche dieselbe enthalten, durch das Fehlen von Markergen-Funktion identifiziert werden. Alternativ kann ein Markergen im Tandem mit einer für ein Target kodierenden Sequenz unter der Kontrolle eines einzelnen Promotors plaziert werden. Die Expression des Markergens als Antwort auf die Induktion oder Selektion weist üblicherweise ebenfalls auf die Expression des Targets hin.
  • Alternativ können Wirtzellen, welche die kodierende Sequenz für das Target enthalten und die für das Target kodierenden Regionen exprimieren, durch verschiedene den Fachpersonen bekannten Verfahren identifiziert werden. Diese Verfahren umfassen ohne darauf beschränkt zu sein die DNS-DNS- oder DNS-RNS- Hybridisierung sowie Protein-Bioassay- oder Immunoassay-Verfahren, welche membranbasierte, lösungsbasierte oder chipbasierte Technologien zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung der Nukleinsäure oder des Proteins umfassen.
  • ALLGEMEINE ASSAYS FÜR cAMP-AKTIVITÄT/SPIEGEL
  • Die Fähigkeit eines Testwirkstoffes, cAMP zu potenzieren, kann durch Messung einer relevanten Zunahme oder Abnahme eines Targetspiegels bestimmt werden. Zusätzlich oder alternativ kann die Fähigkeit eines Testwirkstoffes, cAMP zu potenzieren, durch Messung einer relevanten Zunahme der cAMP-Spiegel bestimmt werden. Beispielsweise können die Lehren von Smith et al 1993 (Appl. Biochem. Biotechnol. 41:189–218) adaptiert werden. Es gibt auch kommerziell erhältliche Immunoassay-Kits zur Messung von cAMP (z.B. Amersham International, Arlington Heights, IL und DuPont, Boston, MA). Details zu einem geeigneten cAMP-Assay werden im experimentellen Abschnitt besprochen.
  • SCREENINGS
  • Irgend ein oder mehrere geignete Targets – wie eine Aminosäurensequenz und/oder Nukleotid-Sequenz – können zur Identifikation von PcAMP in irgend einem von zahlreichen Wirkstoff-Screening-Verfahren verwendet werden. Das in einem solchen Test verwendete Target kann frei in Lösung vorliegen, an einen festen Träger gebunden sein, auf der Zelloberfläche liegen oder intrazellulär lokalisiert sein. Das Target kann sogar in einem Tiermodell sein, wobei das besagte Target ein exogenes Target oder ein eingeführtes Target sein kann. Das Tiermodell wird ein nicht-menscliches Tiermodell sein. Die Aufhebung der Target-Aktivität oder die Bildung von Bindungs-Komplexen zwischen dem Target und dem zu testenden Wirkstoff kann gemessen werden.
  • Verfahren für das Wirkstoff-Screening können auf dem in Geysen, Europäische Patent-Anmeldung 84/03564, veröffentlicht am 13. September 1984 beschriebenen Verfahren basieren. Kurz gesagt, werden grosse Anzahlen von unterschiedlichen kleinen Peptid-Testverbindungen auf einem festen Substrat, beispielsweise auf Plastiknadeln oder einer anderen Oberfläche synthetisiert. Die Peptid-Testverbindungen werden mit einem geeigneten Target oder einem Fragment davon umgesetzt und gewaschen. Die gebundenen Einheiten werden alsdann nachgewiesen – beispielsweise durch Adaption geeigneter, im Fachgebiet bekannter Verfahren. Ein gereinigtes Target kann zur Verwendung in einem Wirkstoff-Screening-Verfahren auch direkt auf Platten geschichtet werden. Alternativ können nicht-neutralisierende Antikörper verwendet werden, um das Peptid einzufangen und es auf einem festen Träger zu fixieren.
  • Es wird auch die Verwendung von kompetitiven Wirkstoff-Screening-Assays beschrieben, in welchen neutralisierende Antikörper, die zur spezifischen Bindung an ein Target befähigt sind, mit einer Testverbindung um die Bindung an ein Target konkurrieren.
  • Ein anderes Screening-Verfahren erlaubt ein Hochdurchsatz-Screening (HTS) von Wirkstoffen, welche eine geeignete Bindungsaffintät an die Substanzen aufweisen, und beruht auf dem ausführlich in WO 84/03564 beschriebenen Verfahren.
  • Es ist zu erwarten, dass die hier erwähnten Assay-Verfahren für das Screening von Testverbindungen sowohl in kleinem wie auch in grossem Massstab und auch für quantitative Assays geeignet sein wird.
  • Demnach wird ferner ein Verfahren zur Identifikation von Wirkstoffen, die cAMP potenzieren, beschrieben, wobei das Verfahren das Zusammenbringen eines geeigneten Targets mit dem Wirkstoff und die anschliessende Messung der Aktivität und/oder der Spiegel von cAMP umfasst.
  • Es wird ferner ein Verfahren zur Identifikation von Wirkstoffen, die cAMP in den weiblichen sexuellen Genitalien selektiv potenzieren, beschrieben, wobei das Verfahren das Zusammenbringen eines geeigneten Targets aus weiblichen sexuellen Genitalien und die anschliessende Messung der Aktivität und/oder der Spiegel von cAMP umfasst.
  • Es wird ferner ein Verfahren zur Identifikation von Wirkstoffen, die cAMP potenzieren, beschrieben, wobei das Verfahren das Zusammenbringen eines geeigneten Targets mit dem Wirkstoff und die anschliessende Messung der Aktivität und/oder der Spiegel des Targets umfasst.
  • Es wird ferner ein Verfahren zur Identifikation von Wirkstoffen, die cAMP in den weiblichen sexuellen Genitalien selektiv potenzieren, beschrieben, wobei das Verfahren das Zusammenbringen eines geeigneten Targets aus weiblichen sexuellen Genitalien und die anschliessende Messung der Aktivität und/oder der Spiegel des Targets umfasst.
  • In einem bevorzugten Aspekt umfasst das erfindungsgemässe Screening mindestens die foglenden Schritte (welche nicht notwendigerweise in derselben Reihenfolge vorliegen müssen): (a) Durchführung eines in vitro Screenings zur Bestimmung, ob ein Kandidaten-Wirkstoff die relevante Aktivität (beispielsweise eine Modulation von NEP, wie NEP aus Hundenieren) besitzt; (b) Durchführung eines oder mehrerer Selektivitäts-Screenings zur Bestimmung der Selektivität des besagten Kandidaten-Wirkstoffs (z.B. um festzustellen, ob besagter Wirkstoff auch ein ACE-Inhibitor ist – beispielsweise unter Verwendung des hier beschriebenen Assay-Protokolls); und (c) Durchführung eines in vivo Screenings mit besagtem Kandidaten-Wirkstoff (z.B. unter Verwendung eines funktionellen Tiermodelles). Typischerweise wird, falls besagter Kandidaten-Wirkstoff das Screening (a) und das Screening (b) besteht, daraufhin das Screening (c) durchgeführt.
  • DIAGNOSTIKA
  • Es wird ferner eine diagnostische Zusammensetzung oder ein Kit zum Nachweis einer Prädisposition für FSAD beschrieben. In diesem Zusammenhang wird die Zusammensetzung oder der Kit eine Einheit umfassen, die befähigt ist, die Gegenwart von einem oder mehreren – oder sogar die Abwesenheit von einem oder mehreren – der Targets in einer Testprobe anzuzeigen. Vorzugsweise wird die Testprobe aus den weiblichen sexuellen Genitalien oder aus einer Aussonderung davon oder daraus gewonnen.
  • Beispielsweise kann die diagnostische Zusammensetzung irgend eine der hier erwähnten Nukleotid-Sequenzen oder eine Variante, ein Homologon, ein Fragment oder ein Derivat davon, oder eine Sequenz, die zur Hybridisierung an die gesamte oder an einen Teil von irgend einer Nukleotid-Sequenz befähigt ist, umfassen.
  • Um eine Basis zur Diagnose einer Erkrankung bereitzustellen, sollten Normal- oder Standardwerte für ein Target bereitgestellt werden. Dies kann durch Zusammenbringen von Körperflüssigkeiten oder Zellextrakten, die von normalen tierischen oder menschlichen Subjekten gewonnen wurden, mit einem Antikörper für ein Target unter einschlägig bekannten Bedingungen, welche für die Kompexbildung geeignet sind, erreicht werden. Die Menge der standardmässigen Kompexbildung kann durch deren Vergleich mit einer Verdünnungsreihe von positiven Kontrollen, bei denen eine bekannte Menge von Antikörper mit bekannten Konzentrationen eines gereinigten Targets zusammengegeben wurde, quantifiziert werden. Danach können die aus normalen Proben erhaltenen Standardwerte mit den aus Proben von möglicherweise von FSAD betroffenen Subjekten erhaltenen Werten verglichen werden. Die Abweichung zwischen dem Standardwert und dem Wert des Subjektes weist das Vorliegen des Krankheitszustandes nach.
  • Ein Target selbst oder irgend ein Teil davon kann die Basis für eine diagnostische und/oder eine therapeutische Verbindung bereitstellen. Für diagnostische Zwecke können Target-Polynukleotid-Sequenzen verwendet werden, um die Genexpression bei Krankheitszuständen, Störungen oder Erkrankungen, an welchen FSAD beteiligt sein kann, nachzuweisen und zu quantifizieren.
  • Die für das Target kodierende Polynukleotid-Sequenz kann zur Diagnose von FSAD verwendet werden, die von der Expression des Targets herrührt. Beispielsweise können die für ein Target kodierenden Polynukleotid-Sequenzen in Hybridisierungs- oder PCR-Assays von Geweben aus Biopsien oder Autopsien oder biologischen Flüssigkeiten verwendet werden, um Abnormitäten bei der Target-Expression nachzeuweisen. Die Form von solchen qualitativen oder quantitativen Verfahren kann Southern- oder Northern-Analyse, Dot-Blot- oder andere membranbasierte Technologien; PCR-Technologien; Dipstick-, Pin- oder Chip-Technologien; sowie ELISA- oder andere formale Mehrfachproben-Technologien umfassen. Sämtliche Verfahren sind im Fachgebiet bekannt und bilden in der Tat die Basis für manche kommerziell verfügbare diagnostische Kits.
  • Solche Assays können auf die Evaluation der Wirksamkeit eines bestimmten therapeutischen Behandlungsregimes zugeschnitten sein und können in Tierstudien, in klinischen Studien oder zur Überwachung der Behandlung eines einzelnen Patienten verwendet werden. Um eine Basis zur Diagnose einer Erkrankung bereitzustellen, sollte ein Normal- oder Standardprofil für die Target-Expression bereitgestellt werden. Dies kann durch Zusammenbringen von Körperflüssigkeiten oder Zellextrakten, die von normalen tierischen oder menschlichen Subjekten gewonnen wurden, mit dem Target oder einem Teil davon unter Bedingungen, die für eine Hybridisierung oder Amplifikation geeignet sind, erreicht werden. Die standardmässige Hybridisierung kann durch Vergleich der Werte von normalen Subjekten mit denjenigen einer Verdünnungsreihe von positiven Kontrollen in demselben Experiment, wobei eine bekannte Menge von gereinigtem Target verwendet wird, quantifiziert werden. Die von normalen Proben erhaltenen Standardwerte können mit denjenigen aus Proben von Subjekten, die möglicherweise von einer mit der Expression der für das Target kodierenden Sequenz zusammenhängenden Störung oder Erkrankung betroffenen sind, verglichen werden. Die Abweichung zwischen dem Standardwert und dem Wert des Subjektes weist das Vorliegen des Krankheitszustandes nach. Falls die Erkrankung bestätigt ist, kann ein vorhandener therapeutischer Wirkstoff verabreicht werden, und ein Behandlungsprofil oder -werte können erzeugt werden. Schliesslich kann der Assay regelmässig wiederholt werden, um zu untersuchen, ob die Werte gegen das Norm- oder Standardmuster zurückstreben oder dieses erreichen. Sukzessive Behandlungsprofile können verwendet werden, um die Wirksamkeit einer Behandlung über eine Periode von mehreren Tagen oder mehreren Monaten zu zeigen.
  • Demnach wird die Verwendung eines Target-Polypeptids oder einer Variante, eines Homologons, eines Fragmentes oder Derivates davon zur Bildung von anti-Target-Antikörpern beschrieben, welche beispielsweise zum Nachweis und zur Quantifizierung der Target-Spiegel in einem FSAD-Zustand diagnostisch verwendet werden kann.
  • Weiterhin werden diagnostische Assays und Kits zum Nachweis eines Targets in Zellen und Geweben beschrieben, wobei dieses ein als positive Kontrolle verwendbares gereinigtes Target und anti-target Antikörper umfassen. Solche Antikörper können in lösungsbasierten, membranbasierten oder gewebebasierten Technologien verwendet werden, um irgend einen Krankheitszustand oder eine Störung, die mit der Expression von Target-Protein oder mit der Expression von Deletionen oder einer Variante, eines Homologons, eines Fragmentes oder eines Derivates davon zusammenhängen, nachzuweisen.
  • ASSAY-VERFAHREN
  • Die diagnostischen Zusammensetzungen und/oder Verfahren und/oder Kits können in den folgenden Verfahren verwendet werden, welche – ohne darauf beschränkt zu sein – umfassen: kompetitive und nicht-kompetitive Assays, Radioimmunoassays, Biolumineszenz- und Chemilumineszenz-Assays, fluorometrische Assays, Sandwich-Assays, immunoradiometrische Assays, Dot-Blots, Enzyme-linked-Assays einschliesslich ELISA, Mikrotiter Platten, mit Antikörpern belegte Streifen oder Stäbchen zur schnellen Überwachung von Urin oder Blut, Immunohistochemie und Immunozytochemie.
  • Beispielsweise kann ein Immunohistochemie-Kit auch zur Lokalisation von NEP-Aktivität in genitalem Gewebe verwendet werden. Dieser Immunohistochemie-Kit erlaubt unter Verwendung sowohl von Licht- als auch von Elektronenmikroskopie die Lokalisation von NEP in Gewebeschnitten und kultivierten Zellen, was sowohl für Forschungs- als auch für klinische Zwecke verwendet werden kann. Solche Informationen können für diagnostische und möglicherweise für therapeutische Zwecke zum Nachweis und/oder zur Prävention und/oder zur Behandlung einer FSD wie FSAD nützlich sein. Für jedes Kit sind der Bereich, die Sensitivität, die Genauigkeit, die Zuverlässigkeit, die Spezifizität und die Reproduzierbarkeit des Assays belegt. Die Intraassay- und Interassay-Variation wird bei 20%, 50% und 80% Punkten auf den Standardkurven der Verschiebung oder Aktivität festgelegt.
  • SONDEN
  • Es werden ferner Nukleinsäure-Hybridisierungs- oder PCR-Sonden angegeben, welche (insbesondere diejenigen, die zur selektiven Selektion befähigt sind) zum Nachweis von Polynukleotid-Sequenzen, einschliesslich genomischen Sequenzen, die für eine Target-Kodierungsregion oder eng verwandten Molekülen wie Allelen kodieren, befähigt sind. Die Spezifität der Sonde, d.h. ob sie von einer hochgradig erhaltenen, erhaltenen oder nicht-erhaltenen Region oder Domäne abgeleitet ist, und die Stringenz der Hybridisierung oder Amplifikation (hoch, mittel oder niedrig) wird bestimmen, ob die Sonde nur natürlich vorkommende Target-Kodierungssequenz oder auch verwandte Sequenzen identifiziert. Sonden zum Nachweis von verwandten Nukleinsäure-Sequenzen werden aus erhaltenen oder hochgradig erhaltenen Nukleotid-Regionen von Target-Familienmitgliedern ausgewählt, und solche Sonden können in einem Pool von entarteten Sonden verwendet werden. Für den Nachweis von identischen Nukleinsäure-Sequenzen, oder wo eine maximale Spezifität gewünscht wird, werden die Nukleinsäure-Sonden aus den nicht-erhaltenen Nukleotid-Regionen oder aus den einzigartigen Regionen der Target-Polynukleotide ausgewählt. Der hier verwendete Begriff "nicht-erhaltene Nukleotid-Region" bezieht sich auf eine Nukleotid-Region, die für eine hier beschriebene target-kodierende Sequenz einzigartig ist und bei verwandten Familienmitgliedern nicht vorkommt.
  • Die in US-A-4683195, US-A-4800195 und US-A-4965188 beschriebene PCR ergibt zusätzliche Verwendungen für Oligonukleotide, die auf Target-Sequenzen beruhen. Solche Oligomere werden im Allgemeinen chemisch synthetisiert, aber sie können auch enzymatisch erzeugt werden oder aus einer rekombinanten Quelle gebildet werden. Oligomere umfassen im Allgemeinen zwei Nukleotid-Sequenzen, und zwar eine mit Sense-Orientierung (5'->3') und eine mit Antisense (3'<-5'), die unter optimierten Bedingungen zur Identifizierung eines(r) spezifischen Gens oder Bedingung verwendet werden. Die selben zwei Oligomere, verschachtelte Sätze von Oligomeren oder sogar ein entarteter Pool von Oligomeren können unter weniger stringenten Bedingungen zum Nachweis und/oder zur Quantifizierung von nahe verwandten DNS- oder RNS-Sequenzen verwendet werden.
  • Die Nukleinsäure-Sequenz für ein Target kann auch verwendet werden, um wie vorgängig beschrieben Hybridisierungs-Sonden zur Kartierung der endogenen genomischen Sequenz zu erzeugen. Die Sequenz kann auf ein bestimmtes Chromosom oder auf eine spezifische Region des Chromosoms kartiert werden, wobei wohlbekannte Verfahren verwendet werden. Diese umfassen die in-situ-Hybridisierung an chromosomalen Ausstrichen (Verma et al (1988) Human Chromosomes: A Manual of Basic Techniques, Pergamon Press, New York City), flusssortierte chromosomale Präparationen oder artifizielle Chromosomenkonstrukte wie YACs, bakterielle artifizielle Chromosomen (BACs), bakterielle PI-Konstrukte oder Einzelchromosom cDNS Bibliotheken.
  • Die in-situ-Hybridisierung von chromosomalen Präparationen und physikalische Kartierungsverfahren wie die Linkage-Analyse unter Verwendung von bewährten chromosomalen Markern sind zur Ausdehnung von genetischen Karten von unschätzbarem Wert. Beispiele von genetischen Karten können in Science (1995; 270:410f und 1994; 265:1981f) gefunden werden. Das Platzieren eines Gens auf das Chromosom einer anderen Säugerspezies kann oftmals assozierte Marker zutage bringen, obwohl die Nummer oder der Arm eines bestimmten mesnchlichen Chromosoms nicht bekannt ist. Neue Sequenzen können durch physkialische Kartierung an Chromosomenarme oder Teile davon zugeordnet werden. Dies liefert wertvolle Informationen für Wissenschaftler, die unter Verwendung von Positions-Klonierung oder anderen Gen-Erkennungsverfahren nach Krankheitsgenen suchen. Nachdem eine Erkrankung oder ein Syndrom durch genetische Verknüpfung an eine bestimmte Genomregion grob lokalisiert wurde, können jegliche Sequenzen, die auf die besagte Region lokalisiert wurden, assozierte oder regulatorische Gene für die weitere Untersuchung darstellen. Die erfindungsgemässe Nukleotid-Sequenz kann auch verwendet werden, um Unterschiede in der chromosomalen Lage infolge Translokation, Inversion, usw. zwischen normalen Individuen, Trägern oder betroffenen Individuen festzustellen.
  • WIRTZELLEN
  • Der Begriff "Wirtzelle" – umfasst im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung jegliche Zellen, welche das Target für den Wirkstoff enthalten könnten.
  • Demnach werden Wirtzellen bereitgestellt, die mit einem Polynukleotid transformiert oder transfiziert sind, welches das Target ist oder das Target exprimiert. Vorzugsweise wird das besagte Polynukleotid in einem Vektor für die Replikation und Expression von Polynukleotiden, die das Target sein oder das Target exprimieren sollen, transportiert. Die Zellen werden so ausgewählt, dass sie mit dem besagten Vektor kompatibel sind, und sie können beispielsweise prokaryotische (beispielsweise bakterielle), Pilz-, Hefe- oder Pflanzenzellen sein.
  • Das gram-negative Bakterium E. coli wird häufig als Wirt für die heterologe Genexpression verwendet. Allerdings haben grosse Mengen von heterologem Protein die Tendenz, sich im Inneren der Zelle anzureichern. Die anschliessende Reinigung des gewünschten Proteins aus der Masse intrazellulärer Proteine von E. coli kann gelegentlich schwierig sein.
  • Im Gegensatz zu E.coli sind Bakterien des Genus Bacillus wegen ihrer Fähigkeit, Proteine in das Kulturmedium auszuschütten, als heterologe Wirte sehr geeignet. Andere als Wirte geeignete Bakterien sind diejenigen der Genera Streptomyces und Pseudomonas.
  • In Abhängigkeit von der Natur des Polynukleotides, welches für das erfindungsgemässe Polypeptid kodiert und/oder von der Wünschbarkeit einer Weiterverarbeitung des exprimierten Proteins, können eukaryotische Wirte wie Hefe oder andere Pilze bevorzugt sein. Im Allgemeinen werden Hefezellen gegenüber Pilzzellen bevorzugt, weil sie einfacher zu manipulieren sind. Allerdings werden gewisse Proteine entweder von den Hefezellen schlecht ausgeschüttet oder in einigen Fällen nicht richtig umgesetzt (z.B. Hyperglykosylierung in Hefe). In diesen Fällen sollte ein anderer Pilzwirt-Organismus ausgewählt werden.
  • Beispiele von geeigneten Expressionswirten im Rahmen der vorliegenden Erfindung sind Pilze wie Aspergillus-Spezies (wie die in EP-A-0184438 und EP-A-0284603 beschriebenen) und Trichoderma-Spezies; Bakterien wie Bacillus-Spezies (wie die in EP-A-0134048 und EP-A-0253455 beschrieben), Streptomyces-Spezies und Pseudomonas-Spezies; und Hefen wie Kluyveromyces-Spezies (wie die in EP-A-0096430 und EP-A-0301670 beschrieben) und Saccharomyces-Spezies. Beispielsweise können typische Expressionswirte aus Aspergillus niger, Aspergillus niger var. tubigenis, Aspergillus niger var. awamori, Aspergillus aculeatis, Aspergillus nidulans, Aspergillus orvzae, Trichoderma reesei, Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus amyloliquefaciens, Kluyveromyces lactis und Saccharomyces cerevisiae ausgewählt werden.
  • Die Verwendung von geeigneten Wirtzellen – wie Hefe-, Pilz- und Pflanzen-Wirtzellen – kann post-translationale Modifikationen (z.B. Myristoylation, Glycosylation, Truncation, Lapidation und Tyrosin-, Serin- oder Threonin-Phosphorylierung) ermöglichen, die benötigt werden, um den erfindungsgemässen Produkten der rekombinanten Expression eine optimale biologische Aktivität zu verleihen.
  • ORGANISMUS
  • Der Begriff "Organismus" umfasst im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung irgend einen Organismus, welcher das Target und/oder die daraus erhaltenen Produkte umfassen kann. Beispiele von Organismen können einen Pilz, Hefe oder eine Pflanze umfassen.
  • Der Begriff "transgener Organismus" umfasst im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung irgend ein Organismus, welcher das Target und/oder die erhaltenen Produkte enthält.
  • TRANSFORMATION DER WIRTZELLEN/WIRTORGANISMEN
  • Wie bereits früher erwähnt, kann der Wirtorganismus ein prokaryotischer oder ein eukaryotischer Organismus sein. Beispiele von geeigneten prokaryotischen Wirten umfassen E. coli und Bacillus subtilis. Lehren über die Transformation von prokaryotisch Wirten sind im Fachgebiet gut dokumentiert, siehe beispielsweise Sambrook et al (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press) und Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1995), John Wiley & Sons, Inc.
  • Falls ein prokaryotischer Wirt verwendet wird, dann kann es nötig sein, die Nukleotid-Sequenz vor der Transformation geeignet zu modifizieren – beispielsweise durch Entfernen von Introns.
  • In einer anderen Ausgestaltung kann der transgene Organismus eine Hefe sein. In diesem Zusammenhang wurde Hefe häufig auch als Vehikel für die heterologe Genexpression verwendet. Die Spezies Saccharomyces cerevisiae hat eine lange Geschichte der industriellen Verwendung, wobei diese die Verwendung für die heterologe Genexpression einschliesst. Die Expression von heterologen Genen in Saccharomyces cerevisiae ist in Goodey et al (1987, Yeast Biotechnology, D R Berry et al, eds, pp 401–429, Allen und Unwin, London) und in King et al (1989, Molecular und Cell Biology of Yeasts, E F Walton und G T Yarronton, eds, pp 107–133, Blackie, Glasgow) diskutiert worden.
  • Aus verschiedenen Gründen ist Saccharomyces cerevisiae für die heterologe Genexpression gut geeignet. Erstens ist es für Menschen nicht-pathogen und es ist nicht zur Bildung gewisser Endotoxine fähig. Zweitens hat es eine lange Geschichte einer sicheren Verwendung nach Jahrhunderten der kommerziellen Nutzung für verschiedene Zwecke. Dies hat zu einer breiten öffentlichen Akzeptanz geführt. Drittens hat die dem Organismus gewidmete extensive kommerzielle Verwendung und Forschung zu einer Menge von Wissen über die Genetik und Physiologie sowie zu Charakteristika der Fermentation von Saccharomyces cerevisiae in grossem Massstab geführt.
  • Eine Übersicht der Prinzipien der heterologen Genexpression in Saccharomyces cerevisiae und der Ausschüttung von Genprodukten ist in E Hinchcliffe E Kenny (1993, "Yeast as a Vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts, Vol 5, Anthony H Rose und J Stuart Harrison, eds, 2nd edition, Academic Press Ltd.) gegeben.
  • Es sind mehrere Arten von Hefevektoren, einschliesslich integrativer Vektoren, welche für deren Erhalt die Rekombination mit dem Wirtgenom benötigen, sowie autonom replizierende Plasmidvektoren, verfügbar.
  • Um das transgene Saccharomyces herzustellen, werden Expressionskonstrukte durch Insertion der erfindungsgemässen Nukleotid-Sequenz in ein für die Expression in Hefe gestaltetes Konstrukt hergestellt. Es wurden mehrere Arten von für die heterologe Expression verwendeten Konstrukten entwickelt. Die Konstrukte enthalten einen in Hefe aktiven Promotor, der mit der erfindungsgemässen Nukleotid-Sequenz fusioniert ist, wobei es sich gewöhnlich um einen aus Hefe stammenden Promotor wie der GAL1-Promotor handelt. Gewöhnlich wird eine aus Hefe stammende Signalsequenz wie die für das SUC2-Signalpeptid kodierende Sequenz verwendet. Ein in Hefe aktiver Terminator beendet das Expressionssystem.
  • Für die Transformation von Hefe wurden mehrere Transformationsprotokolle entwickelt. Beispielsweise kann ein erfindungsgemässes transgenes Saccharomyces durch Befolgen der Lehren von Hinnen et al (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA 75, 1929); Beggs, J D (1978, Nature, London, 275, 104); und Ito, H et al (1983, J Bacteriology 153, 163–168) hergestellt werden.
  • Die transformierten Hefezellen werden unter Verwendung von verschiedenen selektiven Markern selektioniert. Zu den für die Transformation verwendeten Markern gehören verschiedene auxotrophische Marker wie LEU2, HIS4 und TRP1 sowie dominante Antibiotikaresistenzmarker wie Aminoglycosid-Antibiotikamarker, z.B. G418.
  • Ein anderer Wirtorganismus ist eine Pflanze. Das Basisprinzip bei der Konstruktion von genetisch modifizierten Pflanzen ist das Einsetzen von genetischer Information in das Pflanzengenom, so dass eine stabile Erhaltung des eingeführten genetischen Materials erreicht wird. Es existieren mehrere Verfahren zum Einsetzen der genetischen Information, wobei die zwei Hauptprinzipien das direkte Einsetzen der genetischen Information und das Einsetzen der genetischen Information unter Verwendung eines Vektorsystems sind. Eine Übersicht über die allgemeinen Verfahren kann in Artikeln von Potrykus (Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol [1991] 42:205–225) und Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech March/April 1994 17–27) gefunden werden. Weitere Lehren zur Pflanzentransformation können in EP-A-0449375 gefunden werden.
  • Demnach wird ein Verfahren zum Transformieren einer Wirtzelle mit einer Nukleotid-Sequenz beschrieben, welche das Target ist oder das Target exprimiert. Wirtzellen, die mit der Nukleotid-Sequenz transformiert werden, können unter Bedingungen, die für die Expression und die Rückgewinnung des kodierenden Proteins aus der Zellkultur geeignet sind, kultiviert werden. Das durch eine rekombinanten Zelle erzeugte Protein kann in Abhängigkeit von der verwendeten Sequenz und/oder dem Vektor ausgeschüttet werden, oder es kann intrazellulär lokalisiert sein. Wie von den Fachpersonen verständen wird, können Expressionsvektoren, welche die kodierende Sequenzen enthalten, mit Signalsequenzen ausgestattet werden, welche die Sekretion der kodierenden Sequenzen durch eine bestimmte prokaryotische oder eukaryotische Zellmembran leiten. Andere rekombinante Konstruktionen können die kodierende Sequenz mit einer Nukleotid-Sequenz verknüpfen, die für eine Polypeptid-Domäne kodiert, was die Reinigung von löslichen Proteinen erleichtern wird (Kroll DJ et al (1993) DNS Cell Biol 12:441–53).
  • PHARMAZEUTISCHE ZUSAMMENSETZUNGEN
  • Ferner wird eine pharmazeutische Zusammensetzung angegeben, welche eine therapeutisch wirksame Menge des erfindungsgemässen Wirkstoffes (d.h. I:NEP) und ein(en) pharmazeutisch annehmbare(n/s) Träger, Lösungsmittel oder Hilfsstoffe (einschliesslich Kombinationen davon) umfasst.
  • Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können zur Verwendung bei Menschen oder Tieren in der Human- bzw. Veterinärmedizin vorgesehen sein und werden typischerweise eines oder mehrere aus einem pharmazeutisch annehmbaren Lösungsmittel, Träger oder Hilfsstoff umfassen. Annehmbare Träger oder Lösungsmittel für die therapeutische Verwendung sind im Fachgebiet der Pharmazie wohlbekannt, und sind beispielsweise, in Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A. R. Gennaro edit. 1985) beschrieben. Die Wahl des pharmazeutischen Trägers, Hilfsstoffes oder Lösungsmittels kann im Hinblick auf den vorgesehenen Verabreichungsweg und gemäss der pharmazeutischen Standardpraxis erfolgen. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen können als oder zusätzlich zum Träger, Hilfsstoff oder Lösungsmittel irgend ein(en) geeignetes(n) Bindemittel, Schmiermittel, Suspendierungsmittel, Beschichtungsmittel, Lösungsvermittler umfassen.
  • Es können Konservierungsmittel, Stabilisierungsmittel, Farbstoffe und sogar Geschmacksmittel in der pharmazeutischen Zusammensetzung enthalten sein. Beispiele von Konservierungsmitteln umfassen Natriumbenzoat, Sorbinsäure und Ester des p-Hydroxybenzoesäure. Antioxidanzien und Suspendierungsmittel können ebenfalls verwendet werden.
  • Es können in Abhängigkeit der unterschiedlichen Verabreichungssysteme unterschiedliche Zusammensetzungs-/Formulierungs-Erfordernisse bestehen. Beispielsweise kann die erfindungsgemässe Zusammensetzung zur Verabreichung unter Verwendung einer Mini-Pumpe oder über den Mukosaweg, beispielsweise als ein Nasenspray oder Aerosol zur Inhalation oder als einnehmbare Lösung, oder zur parenteralen Verabreichung, bei welcher die Zusammensetzung durch eine injziierbare Form zur Verabreichung über beispielsweise einen intravenösen, intramuskulären oder subkutanen Weg formuliert sein. Alternativ kann die Formulierung zur Verabreichung über beide Wege ausgelegt sein.
  • Wenn der Wirkstoff mukosal über die gastrointestinale Mukosa verabreicht wird, sollte er fähig sein, während der Passage durch den Magen-Darm-Trakt stabil zu bleiben; beispielsweise sollte er gegenüber dem proteolytischen Abbau resistent, bei saurem pH stabil und gegenüber der zersetzenden Wirkung von Galle resistent sein.
  • Falls angemessen, können die pharmazeutischen Zusammensetzungen durch Inhalation, in der Form eines Suppositorium oder Pessars, topisch in der Form einer Lotion, Lösung, Creme, Salbe oder Talkpuder, durch Verwendung eines Hautpflasters, oral in der Form von Tabletten, die Hilfsstoffe wie Stärke oder Laktose enthalten, oder in Kapseln oder Ovuli, entweder alleine oder in Vermischung mit Hilfsstoffen, oder in der Form von Elixieren, Lösungen oder Suspensionen, die Geschmacksmittel oder Färbemittel enthalten, verabreicht werden, oder sie können parenteral, beispielsweise intravenös, intramuskulär oder subkutan injiziiert werden. Für die parenterale Verabreichung können die Zusammensetzungen am besten in der Form einer sterilen wässrigen Lösung, welche andere Substanzen enthalten kann, beispielsweise genügend Salze oder Monosaccharide, um die Lösung mit dem Blut isotonisch zu machen, verwendet werden. Für die buccale oder sublinguale Verabreichung können die Zusammensetzungen in der Form von Tabletten oder Pastillen, welche auf herkömmliche Weise formuliert sein können, verabreicht werden.
  • Für gewisse Ausgestaltungen können die Wirkstoffe auch in Kombination mit einem Cyclodextrin verwendet werden. Von Cyclodextrinen ist bekannt, dass sie Einschluss- und nicht- Einschluss-Komplexe mit den Wirkstoffmolekülen bilden. Die Bildung eines Wirkstoff-Cyclodextrin-Komplexes kann die Löslichkeit, die Auflösungsgeschwindigkeit, die Bioverfügbarkeit und/oder die Stabilitätseigenschaften eines Wirkstoffmoleküls modifizieren. Wirkstoff-Cyclodextrin-Komplexe sind im Allgemeinen für die meisten Dosierungsformen und Verabreichungswege nützlich. Als Alternative zur direkten Komplexierung mit dem Wirkstoff kann das Cyclodextrin als ein Hilfszusatz, z.B. als ein Träger, Lösungsmittel oder Lösungsvermittler verwendet werden. Alpha-, beta- und gamma-Cyclodextrine werden am häufigsten verwendet und sind geeignet. Beispiele sind in WO-A-91/11172, WO-A-94/02518 und WO-A-98/55148 beschrieben.
  • In einer bevorzugten Ausgestaltung werden die erfindungsgemässen Wirkstoffe systemisch (wie oral, buccal, sublingual), vorzugsweise oral verabreicht.
  • Demnach liegt der Wirkstoff vorzugsweise in einer Form vor, die für die orale Verabreichung geeignet ist.
  • Für gewisse Ausgestaltungen wirkt der Wirkstoff – wenn im Gebrauch – vorzugsweise nicht auf das Zentralnervensystem.
  • Für gewisse Ausgestaltungen ist der Wirkstoff – wenn in Gebrauch – vorzugsweise peripher wirksam.
  • VERABREICHUNG
  • Der Begriff "verabreicht" umfasst die Verabreichung durch virale oder nicht-virale Verfahren. Die viralen Verabreichungsmechanismen umfassen ohne darauf beschränkt zu sein adenovirale Vektoren, adeno-assoziierte virale (AAV) Vektoren, herpes-virale Vektoren, retrovirale Vektoren, lentivirale Vektoren und baculovirale Vektoren. Nicht-virale Verabreichungsmechanismen umfassen die lipid-vermittelte Transfektion, Liposomen, Immunoliposomen, Lipofektin, kationische faziale Amphiphile (CFAs) und Kombinationen davon.
  • Der erfindungsgemässe Wirkstoff kann alleine verabreicht werden, aber er wird im Allgemeinen als pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht werden – z.B. wenn der Wirkstoff in Vermischung mit einem geeigneten pharmazeutischen Hilfsstoff, Lösungsmittel oder Träger vorliegt, welche im Hinblick auf den beabsichtigten Verabreichungsweg und gemäss der pharmazeutischen Standardpraxis ausgewählt sind.
  • Beispielsweise kann der Wirkstoff (z.B. oral oder topisch) in der Form von Tabletten, Kapseln, Ovuli, Elixieren, Lösungen oder Suspensionen, welche Geschmacksmittel oder Färbemittel enthalten können, für Anwendungen mit unmittelbarer, verzögerter, modifizierter, anhaltender, gepulster oder kontrollierter Freisetzung verabreicht werden.
  • Die Tabletten können Hilfsstoffe wie mikrokristalline Cellulose, Laktose, Natriumcitrat, Kalziumcarbonat, dibasisches Kalziumphosphat und Glycin, Aufschlussmittel wie Stärke (bevorzugt Mais-, Kartoffel- oder Tapiokastärke), Natriumstärke-Glykollat, Croscarmellose-Natrium- und gewisse komplexen Silikate und Granulations-Bindemittel wie Polyvinylpyrrolidon, Hydroxypropylmethylcellulose (HPMC), Hydroxypropylcellulose (HPC), Sucrose, Gelatine und Akazie enthalten. Ausserdem können Schmiermittel wie Magnesiumstearat, Stearinsäure, Glycerylbehenat und Talk eingeschlossen werden.
  • Feste Zusammensetzungen ähnlichen Typs können auch als Füllmittel in Gelatinekapseln verwendet werden. Bevorzugte Hilfsstoffe umfassen in diesem Zusammenhang Laktose, Stärke, eine Cellulose, Milchzucker oder Polyethylenglykole hohen Molekulargewichtes. Für wässrige Suspensionen und/oder Elixiere kann der Wirkstoff mit verschiedenen Süssmitteln oder Geschmacksmitteln, Färbemitteln oder Farbstoffen, mit Emulgierungssmitteln und/oder Suspendierungsmitteln und mit Verdünnungsmitteln wie Wasser, Ethanol, Propylenglycol und Glycerin und Kombinationen davon kombiniert werden.
  • Die Verabreichungswege (Abgabe) umfassen ohne darauf beschränkt zu sein eines oder mehrere von: oral (z.B. als eine Tablette, Kapsel oder als eine einnehmbare Lösung), topisch, mukosal (z.B. als ein Nasenspray oder Aerosol zur Inhalation), nasal, parenteral (z.B. über eine injizierbare Form), gastrointestinal, intraspinal, intraperitoneal, intramuskulär, intravenös, intrauterin, intraocular, intradermal, intrakranial, intratracheal, intravaginal, intrazerebroventrikulär, intrazerebral, subkutan, ophthalmisch (einschliesslich intravitreal oder intracameral), transdermal, rektal, buccal, vaginal, epidural, sublingual.
  • Es versteht sich, dass nicht der gesamte Wirkstoff über denselben Weg verabreicht werden muss. Ebenso gilt, dass falls die Zusammensetzung mehr als eine aktive Komponente umfasst, dann diese Komponenten über unterschiedliche Wege verabreicht werden können.
  • Falls der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) parenteral verabreicht wird, dann umfassen Beispiele von solcher Verabreichung eines oder mehrere von: intravenöse, intra-arterielle, intraperitoneale, intrathecale, intraventrikuläre, intraurethrale, intrasternale, intrakraniale, intramuskuläre oder subkutane Verabreichung des Wirkstoffes; und/oder unter Verwendung von Infusionsverfahren.
  • Für die parenterale Verabreichung wird der Wirkstoff am besten in der Form einer sterilen wässrigen Lösung verwendet, welche andere Substanzen, beispielsweise genügend Salze oder Glucose, um die Lösung mit dem Blut isotonisch zu machen, enthalten kann. Die wässrigen Lösungen sollten falls nötig geeignet gepuffert sein (vorzugsweise auf einen pH von 3 bis 9). Die Herstellung von geeigneten parenteralen Formulierungen unter sterile Bedingungen kann mittels standardmässigen pharmazeutischen Verfahren, die den Fachpersonen wohl bekannt sind, ohne weiteres bewerkstelligt werden.
  • Wie angegeben, kann der erfindungsgemässe Wirkstoff (d.h. I:NEP) intranasal oder durch Inhalation verabreicht werden und wird zweckmässigerweise in der Form eines trockenen Puder-Inhalators oder eines Aerosolspray-Zubereitung aus einem unter Druck stehenden Behälter, Pumpe, Spray oder Vernebler unter Verwendung eines geeigneten Treibgases, z.B. Dichlorodifluoromethan, Trichlorofluoromethan, Dichlorotetrafluoroethan, ein Hydrofluoroalkan wie 1,1,1,2- Tetrafluoroethan (HFA 134ATM) oder 1,1,1,2,3,3,3-Heptafluoropropan (HFA 227EATM), Kohlenstoffdioxid oder andere geeignete Gase verabreicht. Im Falle eines unter Druck stehenden Aerosols kann die Dosierungseinheit durch Einsetzen eines Ventils zur Verabreichung einer abgemessenen Menge bestimmt werden. Die unter Druck stehenden Behälter, Pumpen, Sprays oder Vernebler können eine Lösung oder Suspension der aktiven Verbindung enthalten, z.B. durch Verwendung eines Gemisches von Ethanol und dem Treibgas als Lösungsmittel, welches zusätzlich ein Schmiermittel, z.B. Sorbitantrioleat, enthalten kann. Kapseln und Patronen (beispielsweise aus Gelatine hergestellt) zur Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator können so formuliert werden, dass sie ein Pudergemisch des Wirkstoffes und einer geeigneten Puderbasis wie Laktose oder Stärke enthalten.
  • Alternativ kann der Wirkstoff in der Form eines Suppositoriums oder Pessars verabreicht werden, oder er kann topisch in der Form eines Gels, eines Hydrogels, einer Lotion, einer Lösung, einer Creme, einer Salbe oder eines Staub-puders angewendet werden. Der Wirkstoff kann auch dermal oder transdermal, beispielsweise unter Verwendung eines Hautpflasters, verabreicht werden. Sie können auch über die pulmonalen oder rektalen Wege verabreicht werden. Sie können auch über den okularen Weg verabreicht werden. Für die ophthalmische Verwendung können die Verbindungen als mikronisierte Suspensionen in isotonischer, pH-angepasster, steriler Kochsalzlösung, oder bevorzugt als Lösungen in isotonischer, pH-angepasster, steriler Kochsalzlösung, wahlweise in Kombination mit einem Konservierungsmittel wie einem Benzylalkoniumchlorid, formuliert sein. Alternativ können sie als eine Salbe wie Petrolatum formuliert sein.
  • Für die topische Applikation auf die Haut kann der Wirkstoff als eine geeignete Salbe formuliert sein, welche die aktive Verbindung in suspendierter oder gelöster Form enthält, beispielsweise ein Gemisch mit einem oder mehreren der Folgenden: Mineralöl, flüssiges Petrolatum, weisses Petrolatum, Propylenglykol, Polyoxyethylen-polyoxypropylen-Verbindung, emulgierender Wachs und Wasser. Alternativ kann er als eine geeignete Lotion oder Creme formuliert sein, die beispielsweise in einem Gemisch mit einem oder mehreren der Folgenden suspendiert oder aufgelöst ist: Mineralöl, Sorbitanmonostearat, ein Polyethylenglycol, flüssiges Paraffin, Polysorbat-60, Cetylesterwachse, Cetearylalkohol, 2-Octyldodecanol, Benzylalksohol und Wasser.
  • Die erfindungsgemässen Zusammensetzungen können durch direkte Injektion verabreicht werden.
  • Für gewisse Anwendungen wird der Wirkstoff vorzugsweise oral verabreicht.
  • Für gewisse Anwendungen wird der Wirkstoff vorzugsweise topisch verabreicht.
  • DOSISSPIEGEL
  • Typischerweise wird ein Arzt die aktuelle Dosierung bestimmen, welche für ein einzelnes Subjekt am geeignetesten ist. Der spezifische Dosisspiegel und die Häufigkeit der Dosierung für irgend einen bestimmten Patient können variiert werden und hängen von einer Vielzahl von Faktoren ab, welche die Aktivität der verwendeten spezifischen Verbindung, die metabolische Stabilität und die Wirkungsdauer dieser Verbindung, das Alter, das Körpergewicht, den allgemeinen Gesundheitszustand, das Geschlecht, die Ernährung, die Art und die Zeit der Verabreichung, die Ausscheidungsgeschwindigkeit, die Wirkstoffkombinationen, den Schweregrad des bestimmten Krankheitszustandes und das sich der Therapie unterziehende Individuum umfassen. Der Wirkstoff und/oder die erfindungsgemässe Zusammensetzung können in Übereinstimmung mit einem Regimen von 1- bis 10-mal pro Tag, wie einmal oder zweimal pro Tag, verabreicht werden.
  • Für die orale und parenterale Verabreichung an menschliche Patienten kann der tägliche Dosierungsspiegel des Wirkstoffs in einer einzelnen oder in aufgeteilten Dosen vorliegen.
  • In Abhängigkeit des Bedarfs kann der Wirkstoff mit einer Dosis von 0.01 bis 30 mg/kg Körpergewicht, beispielsweise von 0.1 to 10 mg/kg, vorzugsweise von 0.1 to 1 mg/kg Körpergewicht verabreicht werden. Natürlich sind die hier erwähnten Dosierungen Beispiele für den durchschnittlichen Fall. Es kann natürlich Einzelbeispiele geben, wo höhere oder tiefere Dosierungsbereiche bevorzugt werden.
  • FORMULIERUNG
  • Der Wirkstoff kann zu einer pharmazeutischen Zusammensetzung formuliert sein, beispielsweise durch Vermischen mit einem oder mehreren geeigneten Trägern, Lösungsmitteln oder Hilfsstoffen unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahren.
  • Nachfolgend sind einige nicht-einschränkende Beispiele von Formulierungen angegeben.
  • Formulierung 1: Eine Tablette wird unter Verwendung der folgenden Ingredienzien hergestellt:
    Gewicht/mg
    Wirkstoff 250
    Cellulose, mikrokristallin 400
    Kieselsäure, hochdispers 10
    Stearinsäure 5
    Total 665
    die Komponenten werden vermischt und zur Bildung von Tabletten komprimiert, wovon jede 665 mg wiegt.
  • Formulierung 2: Eine intravenöse Formulierung kann wie folgt hergestellt werden:
    Wirkstoff 100 mg
    Isotonische Kochsalzlösung 1.000 ml
  • PHARMAZEUTISCH AKTIVES SALZ
  • Der Wirkstoff kann als ein pharmazeutisch annehmbares Salz verabreicht werden. Typischerweise kann ein pharmazeutisch annehmbares Salz ohne weiteres durch Verwendung einer gewünschten Säure oder ggf. Base hergestellt werden. Das Salz kann aus der Lösung ausgefällt und durch Filtration gesammelt werden oder es kann durch Abdampfen des Lösungsmittels gewonnen werden.
  • TIERISCHE TESTMODELLE
  • Zur Untersuchung und/oder zur Entwicklung von Therapien oder therapeutischen Wirkstoffen für die Behandlung von FSAD können in-vivo-Modelle verwendet werden. Die Modelle könnten zur Untersuchung der Wirkung von verschiedenen Werkzeugen/Leitverbindungen auf eine Vielzahl von Parametern verwendet werden, die auf die sexuelle Erregungsantwort hinweisen. Diese tierischen Testmodelle können als oder im erfindungsgemässen Assay verwendet werden. Das tierische Testmodell wird ein nicht-menschliches tierisches Testmodell sein.
  • Es gibt eine Anzahl von Tiermodellen für die vaskulogene weibliche Sexualstörung (FSAD), die verwendet werden könnten.
  • Beispielsweise kann auf invasive Tiermodelle verwiesen werden (siehe z.B. Park et al., 1997). Dabei können die vaginale und klitorale hämodynamische Antwort bei normalen und atherosklerotischen weiblichen Hasen nach Pelvisnervstimulation direkt aufgezeichnet werden. Die in-vivo-Wirkungen von cAMP-Potenziatoren können entweder bei normalen oder bei FSAD-Tieren untersucht werden.
  • Als weiteres Beispiel kann auf nicht-invasive Tiermodelle verwiesen werden (siehe z.B. die Übersicht von Goldstein et al., 1998; Laan et al., 1998). Hier liefert die Pulswellen-Doppler-Ultrasonographie ein Mittel zum Nachweis der Blutflussveränderungen in den vaginalen und klitoralen Arterien. Dieses Modell kann zur Untersuchung von vaskulogenen Wirkungen während der pharmakologischen Verabreichung von Vasodilatatoren verwendet werden.
  • Andere nicht-invasive Verfahren, die verwendet werden können, umfassen die vaginale Photoplethysmographie, welche ein quantitatives Mass für die Anschwellung der Vaginalmukosa liefert, sowie Verfahren der vaginalen thermischen Clearance, welche auf dem Prinzip beruhen, dass Veränderungen des vaginalen Blutflusses durch Messung des Wärmeabflusses von einer auf konstanter Temperatur gehaltenen intravaginalen Sonde gemessen werden können.
  • EIN TIERMODELL DER SEXUELLEN ERREGUNG
  • In unseren Studien wurde ein robustes reproduzierbares Modell der Physiologie der sexuellen Erregung entwickelt. Dieses Modell verwendet einen anästhesierten Hasen und benutzt zur Aufzeichnung des genitalen Blutflusses Laser-Doppler-Verfahren, während die kardiovaskulären Parameter routinemässig aufgezeichnet werden. Es ist möglich, kleine Veränderungen im vaginalen (und sogar im klitoralen) Blutfluss, die durch Stimulation des Pelvisnervs oder durch Infusion von VIP in der Abwesenheit und in Gegenwart von Testwirkstoffen induziert werden, zu messen.
  • Wir glauben, dass unser Tiermodell die klinischen Daten direkt widerspiegelt. Demnach kann dieses Modell für die Untersuchung von Kandidaten-Wirkstoffen zur Behandlung von FSAD, beispielsweise durch Messung der Erhöhung des vaginalen oder klitoralen Blutflusses, verwendet werden.
  • PHYSIOLOGISCHE MESSUNGEN DER WEIBLICHEN SEXUELLEN ERREGUNG
  • Es kann eine Reihe von unterschiedlichen Verfahren zur Messung des klitoralen und vaginalen Blutflusses verwendet werden. Beispielsweise kann die vaginale Photoplethysmographie, die vaginale Wärmeauswasch-Technik, die klitorale und vaginale kontrastverstärkte MRI, die klitorale/vulvale gepulste Laser-Doppler-Bildgebung und die klitorale Ultrasonographie eingesetzt werden.
  • Die Quantifizierung der vaginalen Lubrikation kann ebenfalls gemessen werden, wobei im Fachgebiet bekannte Verfahren – wie (a) das Wägen von vaginalen Tampons prä- und poststimulatiorisch und (b) die Messung des pH der vaginalen Flüssigkeit – zum Einsatz kommen. In Bezug auf den letzten Aspekt gilt, dass das im normalen Ruhezustand saure Medium in der Vagina durch Annäherung an den pH-Wert des Blutes akalischer wird, wenn bei der sexuellen Stimulation eine Transsudation von Flüssigkeit stattfindet.
  • NEP (neutrale Endopeptidase)
  • Gemäss der vorliegenden Erfindung ist das Target ein PcAMP-Target, welches PcAMP-Target NEP ist.
  • Nukleotid-Sequenzen und Aminosäurensequenzen für NEP sind aus der Literatur entnehmbar. Einige Sequenzen sind in den hier aufgeführten Sequenzprotokollen vorgestellt.
  • NEP ist NEP (EC 3.4.24.11) (auch als Enkephalinase oder Endopeptidase-2 bekannt). Hier wurde in der Vagina von Menschen und Hasen NEP EC 3.4.24.11 mRNS und exprimiertes Protein gefunden.
  • Hier wird angenommen, dass bei Frauen, einschliesslich solcher die an FSAD leiden, VIP durch NEP EC3.4.24.11 abgebaut wird. Demnach werden NEP-Inhibitoren die endogene vasorelaxierende Wirkung des während der Erregung freigesetzten VIP potenzieren. Dies wird zu einer Behandlung von FSAD führen, beispielsweise durch Erhöhung der vaginalen Anschwellung. Es wurde gezeigt, dass selektive Inhibitoren von NEP EC 3.4.24.11 die durch Pelvisnervstimulation und durch VIP induzierte Erhöhung im genitalen (z.B. vaginalen oder klitoralen) Blutfluss verstärken. Ausserdem verstärken diese selektiven NEP-Inhibitoren die durch VIP und über Nerven vermittelte Relaxationen von isolierter Vaginawand.
  • Hintergrundslehren über NEP sind von Victor A. McKusick et al auf http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htm angegeben. Die folgenden Informationen betreffend NEP wurden von jener Quelle entnommen.
  • Das Antigen der gemeinen akuten lymphozytischen Leukämie ist ein wichtiger Zelloberflächenmarker bei der Diagnose von akuter lymphozytischen Leukämie (ALL) beim Menschen. Es ist auf den leukämischen Zellen vom prä-B-Phänotyp vorhanden, welche 85% der ALL-Fälle ausmachen. CALLA ist jedoch nicht auf leukämische Zellen beschränkt und wird auf einer Vielzahl von normalen Geweben gefunden. CALLA ist ein Glycoprotein, das besonders in den Nieren vorkommt, wo es auf dem Bürstenrand der proximalen Tubuli und auf dem glomerulären Epithel vorliegt. Letarte et al. (1988) haben eine für CALLA kodierende cDNS kloniert und gezeigt, dass die aus der cDNS-Sequenz abgeleitete Aminosäurensequenz zu derjenigen von menschlicher membran-assoziierter neutraler Endopeptidase (NEP; EC 3.4.24.11), auch als Enkephalinase bekannt, identisch ist. NEP spaltet Peptide an der Aminostelle von hydrophoben Resten und inaktiviert mehrere Peptidhormone, einschliesslich Glucagon, Enkephaline, Sunstanz-P, Neurotensin, Oxytocin, und Bradykinin. Mittels cDNS-Transfektionsanalyse bestätigten Shipp et al. (1989), dass CALLA eine funktionell neutrale Endopeptidase von dem Typ ist, der vorgängig als Enkephalinase bezeichnet wurde. Barker et al. (1989) zeigten, dass das CALLA-Gen, welches für ein 100-kD Typ-II-Transmembran-Glycoprotein kodiert, als eine einzelne Kopie mit einer Grösse von mehr als 45 kb vorliegt, welches in malignem Gewebe, das Zelloberflächen-CALLA exprimiert, nicht umgelagert wird. Das Gen wurde aufgrund der Untersuchung von somatischen Zellhybriden auf das menschlichen Chromosom 3 lokalisiert, und durch in-situ-Hybridisierung wurde die Lokalisation auf 3q21-q27 regionalisiert. Tran-Paterson et al. (1989) ordneten das Gen anhand von Southern blot Analyse von DNS aus somatischen Mensch-Nagetier-Zellhybriden ebenfalls dem Chromosom 3 zu. D'Adamio et al. (1989) zeigten, dass das CALLA-Gen mehr als 80 kb umfasst und aus 24 Exons zusammengesetzt ist."
  • I:NEP
  • Wie oben angegeben, kann der Wirkstoff irgend ein geeigneter Wirkstoff sein, der als I:NEP wirken kann.
  • Details über ein geeignetes Assay-System zur Identifizierung und/oder Untersuchung eines I:NEP sind im folgenden Abschnitt angegeben.
  • I:NEPs werden in den folgenden Übersichtsartikeln diskutiert:
    • Pathol. Biol., 46(3), 1998, 191.
    • Current Pharm. Design, 2(5), 1996, 443.
    • Biochem. Soc. Trans., 21(3), 1993, 678.
    • Handbook Exp. Pharmacol., 104/1, 1993, 547.
    • TiPS, 11, 1990, 245.
    • Pharmacol. Rev., 45(1), 1993, 87.
    • Curr. Opin. Inves. Drugs, 2(11), 1993, 1175.
    • Antihypertens. Drugs, (1997), 113.
    • Chemtracts, (1997), 10(11), 804.
    • Zinc Metalloproteases Health Dis. (1996), 105.
    • Cardiovasc. Drug Rev., (1996), 14(2), 166.
    • Gen. Pharmacol., (1996), 27(4), 581.
    • Cardiovasc. Drug Rev., (1994), 12(4), 271.
    • Clin. Exp. Pharmacol. Physiol., (1995), 22(1), 63.
    • Cardiovasc. Drug Rev., (1991), 9(3), 285.
    • Exp. Opin. Ther. Patents (1996), 6(11), 1147.
  • I:NEPs sind in den folgenden Dokumenten beschrieben:
    • EP-509442A
    • US-192435
    • US-4929641
    • EP-599444B
    • US-884664
    • EP-544620A
    • US-798684
    • J. Med. Chem. 1993, 3821.
    • Circulation 1993, 88(4), 1.
    • EP-136883
    • JP-851 36554
    • US-4722810
    • Curr. Pharm. Design, 1996, 2, 443.
    • EP-640594
    • J. Med. Chem. 1993, 36(1), 87.
    • EP-738711-A
    • JP-270957
    • CAS # 115406-23-0
    • DE-19510566
    • DE-19638020
    • EP-830863
    • JP-98101565
    • EP-733642
    • WO9614293
    • JP-08245609
    • JP-96245609
    • WO9415908
    • JP05092948
    • WO-9309101
    • WO-9109840
    • EP-519738
    • EP-690070
    • J. Med. Chem. (1993), 36, 2420.
    • JP-95157459
    • Bioorg. Med. Chem. Letts., 1996, 6(1), 65.
  • Bevorzugte I:NEPs sind in den folgenden Dokumenten beschrieben:
    • EP-A-0274234
    • JP-88165353
    • Biochem. Biophys. Res. Comm., 1989, 164, 58
    • EP-629627-A
    • US-77978
    • Perspect. Med. Chem. (1993), 45.
    • EP-358398-B
  • Bevorzugte Beispiele von I:NEPs sind aus den folgenden Strukturen ausgewählt:
  • Figure 01070001
  • Figure 01080001
  • Figure 01090001
  • Besonders bevorzugte I:NEPs sind aus den folgenden Strukturen ausgewählt:
  • Figure 01090002
  • Figure 01100001
  • Besonders bevorzugte I:NEPs sind aus den folgenden Strukturen ausgewählt:
  • Figure 01110001
  • Figure 01120001
  • Figure 01130001
  • Diese Verbindungen werden gemäss den im experimentellen Abschnitt beschriebenen Lehren hergestellt (unten). Diese Verbindungen wurden als Wirkstoffe getestet und erwiesen sich zur Potenzierung von cAMP als nützlich und sind demnach für die Behandlung von FSAD nützlich. Einige der diese Verbindungen betreffenden experimentellen Daten sind im experimentellen Abschnitt dargestellt (unten).
  • NEP-ASSAY
  • DIE HERSTELLUNG UND DER ASSAY VON LÖSLICHER (NEP) NEUTRALER ENDOPEPTIDASE AUS DEM NIERENKORTEX VON HUNDEN, RATTEN, HASEN UND MENSCHEN.
  • Lösliche NEP wird aus dem Nierenkortex gewonnen, und die Aktivität wird durch Messung der Geschwindigkeit der Spaltung des NEP-Substrates Abz-D-Arg-Arg-Leu-EDDnp unter Bildung von dessen fluoreszierendem Produkt Abz-D-Arg-Arg bestimmt.
  • EXPERIMENTELLES VERFAHREN
  • 1. MATERIALIEN
  • Sämtliches Wasser ist zweifach entionisiert.
    • 1.1 Gewebe Menschliche Niere IIAM (Pennsylvania. U.S.A. Rattenniere Hasenniere Hundeniere
    • 1.2 Homogenisationsmedium 100 mM Mannitol und 20 mM Tris bei pH 7.1 2.42 g Tris (Fisher T/P630/60) wird mit 1 Liter Wasser verdünnt, und der pH wird unter Verwendung von 6M HCl bei Raumtemperatur auf 7.1 eingestellt. Dazu werden 18.22 g Mannitol (Sigma M-9546) zugegeben.
    • 1.3 Tris-Puffer (NEP Puffer). 50 ml 50 mM Tris pH 7.4 (Sigma T2663) werden in 950 ml Wasser verdünnt.
    • 1.4 Substrat (Abz-D-Arg-Arg-Leu-EDDnp) Wird von SNPE auf Auftrag hergestellt und wird als Pulver bei –20°C gelagert. Eine 2 mM Stammlösung wird durch sorgfältiges Resuspendieren des Substrats in Tris Puffer hergestellt, wobei dieser nicht verwirbelt oder beschallt werden darf. 600 μl Aliquote der 2 mM-Stammlösung werden während bis zu einem Monat bei –20°C gelagert. (Medeiros, M.A.S., Franca, M.S.F. et al., (1997), Brazilian Journal of Medical und Biological Research, 30, 1157–1162).
    • 1.5 Gesamtprodukt Proben, die einer 100%igen Substrat-zu-Produkt Umwandlung entsprechen, werden mit auf die Platte gegeben, um den %-Substratumsatz zu bestimmen. Das Gesamtprodukt wird durch Inkubieren von 1 ml des 2 mM Substrates mit 20 μl der Enzym-Stammlösung während 24 Stunden bei 37°C erzeugt.
    • 1.6 Stopplösung. Eine 300 μM Stammlösung von Phosphoramidon (Sigma R7385) wird in NEP-Puffer hergestellt und in 50 μl Aliquoten bei –20 gelagert.
    • 1.7 Dimethylsulfoxid (DMSO).
    • 1.8 Magnesiumchlorid – MgCl2.6H2O (Fisher MO600/53).
    • 1.9 Black-Assay-Platten mit 96 Vertiefungen mit flachem Boden (Costar 3915 oder Packard).
    • 1.10 Topseal A (Packard 6005185).
    • 1.11 1 Zentrifugenröhrchen
  • 2. SPEZIFISCHE AUSSTATTUNG
    • 2.1 Sorvall RC-5B Zentrifuge (SS34 GSA Rotor, vorgekühlt auf 4°C).
    • 2.2 Braun Miniprimer Mixer.
    • 2.3 Beckman CS-6R Zentrifuge.
    • 2.4 Fluostar Galaxy.
    • 2.5 Wesbart 1589 Schüttelinkubator.
  • 3. METHODEN
    • 3.1 GEWEBE-PRÄPARATION
    • 3.2 NEP von Hunden, Ratten, Hasen und Menschen wird aus dem Nierenkortex unter Verwendung einer von Booth, A.G. & Kenny, A.J. (1974) Biochem. J. 142, 575–581 angepassten Methode erhalten.
    • 3.3 Gefrorene Nieren werden auf Raumtemperatur auftauen gelassen und der Kortex wird von der Medulla abgetrennt.
    • 3.4 Der Kortex wird fein zerschnitten und in ungefähr 10 Volumina des Homogenisationspuffers (1.2) unter Verwendung eines Braun Miniprimer (2.2) homogenisiert.
    • 3.5 Magnesiumchlorid (1.8) (20,3 mg/gm Gewebe) wird zum Homogenisat zugegeben und während 15 Minuten in einem Eiswasserbad gerührt.
    • 3.6 Das Homogenisat wird während 12 Minuten mit 1.500 g (3.820 rpm) in einer Beckman Zentrifuge (2.3) zentrifugiert, und anschliessend wird der Überstand in ein frisches Zentrifugenrohr gebracht und das Pellet verworfen.
    • 3.7 Der Überstand wird während 12 Minuten mit 15.000 g (12.100 rpm) in der Sovall Zentrifuge (2.1) zentrifugiert, und der Überstand wird entfernt.
    • 3.8 Die hellrosa Phase am oberen Ende des verbleibenden Pellets wird entfernt und erneut in Homogenisationspuffer, der Magnesiumchlorid (9 mg MgCl in 5 ml Puffer pro 1 g Gewebe) enthält, suspendiert.
    • 3.9 Die Suspension wird während 12 Minuten bei 2.200 g (4,630 rpm) in einer Beckman Zentrifuge zentrifugiert, und anschliessend wird das Pellet verworfen.
    • 3.10 Der Überstand wird während 12 Minuten bei 15.000 g (12.100 rpm) unter Verwendung der Sorvall Zentrifuge zentrifugiert, und der Überstand wird entfernt.
    • 3.11 Das übrigbleibende Pellet wird erneut in Homogenisationspuffer, welcher Magnesiumchlorid (0,9 mg MgCl in 0,5 ml Puffer pro 1 g Gewebe) enthält, suspendiert. Eine homogene Suspension wird unter Verwendung eines Braun Miniprimer (2.2) erhalten. Diese wird dann in 100 μl Aliquoten eingefroren, um die NEP-Aktivität zu bestimmen.
  • 4.0 BESTIMMUNG DER NEP-AKTIVITÄT
  • Die Aktivität der vorgängig aliquotierten NEP wird aufgrund ihrer Fähigkeit, das NEP-spezifische Peptid-Substrat zu spalten, gemessen.
    • 4.1 Eine 4%-ige DMSO/NEP-Pufferlösung (4 ml DMSO in 96 ml NEP-Puffer) wird hergestellt.
    • 4.2 Substrat, Gesamtprodukt, Enzym und Phosphoramidon-Stammlösung werden zum Auftauen auf Eis belassen.
    • 4.3 50 μl 4%-ige DMSO/NEP-Pufferlösung werden in jede Vertiefung gegeben.
    • 4.4 Die 2 mM Substrat-Stammlösung wird 1:40 verdünnt, woraus sich eine 50 μM Lösung ergibt. 100 μl von 50 μM Substrat wird in jede Vertiefung zugegeben (Endkonzentration im Assay 25 μM).
    • 4.5 50 μl einer Reihe von Enzymverdünnungen werden zugegeben, um die Reaktion auszulösen (gewöhnlich werden 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600 und 1:3200 verwendet). 50 μl des NEP-Puffers werden in die leeren Vertiefungen zugegeben.
    • 4.6 Das 2 mM Gesamtprodukt wird 1:80 verdünnt, woraus sich eine 25 μM Lösung ergibt. 200 μl des 25 μM Produkt werden in die ersten vier Vertiefungen einer neuen Platte zugegeben.
    • 4.7 Die Platten werden während 60 Minuten bei 37°C in einem Schüttelinkubator inkubiert.
    • 4.8 Die 300 μM Phosphoramidon-Stammlösung wird 1:100 auf 300 nM verdünnt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 100 μl 300 nM Phosphoramidon gestoppt und während 20 Minuten bei 37°C in einem Schüttelinkubator inkubiert, und anschliessend auf dem BMG Fluostar Galaxy (ex320/em420) ausgemessen.
  • 5. NEP-INHIBITIONS-ASSAYS
    • 5.1 Substrat, Gesamtprodukt, Enzym und Phosphoramin-Stammlösungen werden zum Auftauen auf Eis belassen.
    • 5.2 Verbindungs-Stammlösungen werden in 100% DMSO hergestellt und 1:25 in NEP-Puffer verdünnt, woraus sich eine 4% DMSO-Lösung ergibt. Alle weiteren Verdünnungen werden in einer 4% DMSO-Lösung (4 ml DMSO in 96 ml NEP-Puffer) durchgeführt.
    • 5.3 50 μl der Verbindung werden zweifach in die Platte mit 96 Vertiefungen gegeben, und 50 μl des 4% DMSO/NEP-Puffers werden in die Kontroll- und in die leeren Vertiefungen gegeben.
    • 5.4 Die 2 mM Substrat-Stammlösung wird mit NEP Puffer 1:40 verdünnt, woraus sich eine 50 μM Lösung ergibt (275 μl des 2 mM Substrats zu 10.73 ml Puffer zugegeben ist für 1 Platte ausreichend).
    • 5.5 Die Enzym-Stammlösung wird mit NEP-Puffer verdünnt (aus Aktivitäts-Tests bestimmt).
    • 5.6 Die 2 mM Gesamtprodukt-Stammlösung wird 1:80 mit NEP-Puffer verdünnt, woraus sich eine 25 μM Lösung ergibt. 200 μl werden zu den ersten vier Vertiefungen einer separaten Platte gegeben.
    • 5.7 Die 300 μM Phosphoramidon-Stammlösung wird 1:1000 verdünnt, woraus sich eine 300 μM Stammlösung (11 μM Phosphoramidon zu 10.99 ml NEP-Puffer) ergibt.
    • 5.8 In jede Vertiefung der Platte mit 96 Vertiefungen wird das Folgende zugegeben:
    • Tabelle Reagenzien, die in die Platte mit 96 Vertiefungen zuzugeben sind.
      Figure 01190001
    • 5.9 Die Reaktion wird durch Zugabe des NEP-Enzyms ausgelöst, und anschliessend wird während 1 Stunde bei 37°C in einem Schüttelinkubator inkubiert.
    • 5.10 Die Reaktion wird durch Zugabe von 100 μl 300 nM Phosphoramidon gestoppt, und es wird während 20 Minuten bei 37°C in einem Schüttelinkubator inkubiert, wonach auf dem BMG Fluostar Galaxy (ex320/em420) abgelesen wird.
  • 6. BERECHNUNGEN
  • Die Aktivität des NEP-Enzyms wird in Gegenwart und in Abwesenheit der Verbindung bestimmt und in Prozentwerten ausgedrückt.
  • %-Kontroll-Aktivität (Umsatz des Enzyms):
    Figure 01200001
  • %-Aktivität mit Inhibitor:
    Figure 01200002
  • Als % der Kontrollen ausgedrückte Aktivität:
    Figure 01200003
  • Eine sigmoidale Dosis-Antwort-Kurve wird an die %-Aktivitäten (% Kontrolle) vs. Verbindungskonzentration angepasst und IC50-Werte werden mittels der LabStats Ausgleichskurve in Excel berechnet.
  • PDE (Phosphodiesterase)
  • Gemäss einem Aspekt der vorliegenden Erfindung kann ein zusätzliches Target ein anderes PcAMP-Target wie PDE (Phosphodiesterase) sein, insbesondere eine PDE, welche eine cAMP-hydrolysierende (und wahlweise eine cGMP-hydrolysierende) PDE ist.
  • Es ist bekannt, dass cyclische Nukleotide wie cAMP und cGMP wichtige intrazelluläre second Messengers sind. Zyklische Nukleotid-Phosphodiesterasen – anderweitig als PDEs bekannt – sind eine Familie von Enzymen, welche den Abbau von cyclischen Nukleotiden katalysieren und dabei eine der zellulären Komponenten darstellen, welche die Konzentration von cyclischen Nukleotide regulieren.
  • In den vergangenen Jahren sind, beruhend auf Substrataffinität und Kofaktorenerfordernissen mindestens sieben PDE-Enzyme (wie PDEI – PDEVII) sowie viele Subtypen dieser Enzyme identifiziert worden (Beavo JA und Reifsnyder DH, Trends Pharmacol. Sci. 11:150 [1990]; Beavo J, In: Cyclic Nucleotide Phosphodiesterases: Structure, Regulation und Drug Action., Beavo J und Housley MD (Eds.). Wiley:Chichester, pp. 3–15 [1990]).
  • Beispiele von PDEs umfassen: PDEI, welche eine Ca2+/Calmodulin-abhängige PDE ist; PDEII, welche eine cAMP- und cGMP-stimulierende PDE ist; PDEIII, welche eine cGMP-inhibierende PDE ist; PDEIV, welche eine mit hoher Affinität cAMP-spezifische PDE ist; und PDEV, welche eine cGMP spezifische PDE ist. PDEI usw. werden manchmal als PDE-Typ I usw. oder PDE-Typ 1 usw bezeichnet.
  • Jede PDE-Familie kann zwei oder mehrere Isoformen enthalten (d.h. es können zwei oder mehrere PDE-Isoenzyme sein). Beispielsweise ist von der Säuger-PDE-IV, dem Homologon des Drosophila Dunce Gens (Chen CN et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 83:9313 [1986]) bekannt, dass sie bei der Ratte vier Isoformen hat (Swinnen JV et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 86:5325 [1989]). Auch von menschlichen PDEs ist bekannt, dass sie als Isoformen vorkommen und Splice-Varianten haben. Beispielsweise wurde 1990 über das Klonieren einer menschlichen Isoform von PDEIV aus Monozyten berichtet (Livi GP et al., Mol. Cell. Bio., 10:2678 [1990]).
  • Als weiteres Beispiel haben andere Mitarbeiter unabhängig drei Splice-Varianten von PDEIV kloniert, welche inzwischen als hPDEIV-B1, hPDEIV-B2, und hPDEIV-B3 bezeichnet werden.
  • Lehren über cyclische Nukleotid-Phosphodiesterasen können auch in US-A-5932423 und US-A-5932465 gefunden werden.
  • Lehren zu einer weiteren cyclischen Nukleotid-Phosphodiesterase – namentlich CN PCDE8 – können in WO-A-97/35989 gefunden werden. Gemäss WO-A-97/35989 hat CN PCDE8 zwei Isozyme – welche als CN PCDE8A und CN PCDE8B bezeichnet wurden. Der Begriff "Isozym" wird im Fachgebiet gelegentlich als "Isoform" angegeben.
  • Gemäss WO-A-97/35989 sind zahlreiche Inhibitoren von unterschiedlichen PDEs identifiziert worden, und einige wurden der klinischen Evaluation unterzogen. Beispielsweise werden PDEIII-Inhibitoren als antithrombotische Wirkstoffe, als antihypertensive Wirkstoffe und als kardiotonische Wirkstoffe entwickelt, die für die Behandlung des kongestiven Herzversagens nützlich sind. Rolipram, ein PDEIII-Inhibitor, ist zur Behandlung von Depression verwendet worden, und anderen Inhibitoren von PDEIII werden als anti-inflammatorische Wirkstoffe evaluiert. Von Rolipram wurde auch gezeigt, dass es den durch Lipopolysaccharid (LPS) induzierten TNF-alpha inhibiert, von welchem gezeigt wurde, dass er in vitro die Replikation von HIV-1 verstärkt. Demnach kann Rolipram die HIV-1-Replikation inhibieren (Angel et al 1995 AIDS 9:1137–44). Ausserdem wurde von Rolipram gezeigt, dass es beruhend auf seiner Fähigkeit, die Bildung von TNF-alpha und -beta sowie von Interferon-gamma zu unterdrücken, bei der Behandlung der Enzephalomyelitis, dem experimentellen Tiermodell für Multiple Sklerose, wirksam ist (Sommer et al, 1995 Nat Med 1:244–248) und dass es zu Behandlung der tardiven Dyskinesie wirksam sein kann (Sasaki et al, 1995 Eur J Phamacol 282:71–76).
  • Gemäss WO-A-97/35989 gibt es auch nicht-spezifische PDE-Inhibitoren wie das zur Behandlung von Bronchialasthma und anderen respiratorischen Erkrankungen verwendete Theophyllin und das zur Behandlung von intermittierender Claudicatio und von diabetesinduzierten peripheren vaskulären Erkrankungen verwendete Pentoxiphyllin. Von Theophyllin wird angenommen, dass es bei der Behandlung von respiratorischen Erkrankungen auf die Funktion der glatten Muskeln in den Luftwegen sowie durch eine anti-inflammatorische oder immunmodulatorische Kapazität wirkt (Banner et al 1995 Respir J 8:996–1000), wobei angenommen wird, dass es durch Inhibition der Hydrolyse sowohl von CN PDE cAMP- als auch von cGMP wirkt (Banner et al 1995 Monaldi Arch Chest Dis 50:286–292). Pentoxiphyllin, von dem auch bekannt ist, dass es die TNF-alpha-Bildung blockiert, kann die HIV-1-Replikation inhibieren (Angel et al unten). Eine Liste von CN PDE-Inhibitoren ist in Beavo 1995 oben gegeben.
  • Es wurde vorgeschlagen, dass selektive Inhibitoren der PDEs samt ihren Isozymen und ihren Subtypen zu einer wirksameren Therapie mit weniger Nebenwirkungen führen werden. Siehe beispielsweise die Angaben in den Übersichten von Wieshaar RE et al, (J. Med. Chem., 28:537 [1985]), Giembycz MA (Biochem. Pharm., 43:2041 [1992]) und Lowe JA und Cheng JB (Drugs of the Future, 17:799–807 [1992]).
  • Demnach ist es bei gewissen Anwendungen wünschenswert, eine selektive Inhibition eines einzelnen Typs von PDE zu haben.
  • Hintergrundlehren über PDEs sind in Victor A. McKusick et al auf http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htm angegeben. Die folgenden Informationen betreffend PDE2 oder cGMP-stimulierte PDE wurden dieser Quelle entnommen.
  • "Zyklische Nukleotide dienen als second Messengers, welche eine Vielzahl von zellulären Antworten auf extrazelluläre Signale wie Hormone, Licht und Neurotransmitter vermitteln. Zyklische Nukleotid-Phosphodiesterasen (PDEs) spielen durch Regulierung der zellulären Konzentrationen von cyclischen Nukleotiden eine Rolle bei der Signalübertragung. Säugerzellen enthalten multiple PDEs, welche aufgrund ihrer Substrataffinität und ihrer selektiven Sensitivität auf Kofaktoren und inhibitorische Wirkstoffe in mindestens 7 Familien unterteilt werden. Diese Familien sind: (I) Ca(2+)/calmodulin-abhängige PDEs; (II) cGMP-stimulierte PDEs; (III) cGMP-inhibierte PDEs; (IV) cAMP-spezifische PDEs; (V) cGMP-spezifische PDEs; (VI) Photorezeptoren-PDEs; und (VII) hohe Affinität, cAMP-spezifische. Aus den Aminosäurensequenzen ist es ersichtlich, dass all diese PDE-Familien eine verwandte Domäne enthalten, von der angenommen wird, dass sie die katalytische Domäne ist, wobei eine ungefähr 30%-ige Sequenzidentität zwischen den Familien vorliegt. Mitglieder derselben Familien sind näher verwandt; sie teilen sich 60 bis 80% Sequenz-Identität über die gesamte kodierende Region. Michaeli et al. (1993) entwickelten ein hochsensitives funktionelles Screening für die Isolierung von cDNSs kodierenden cAMP-Phosphodiesterasen durch Komplementierung von Defekten im Saccharomyces cerevisiae Strang, dem beide endogenen cAMP-PDE-Gene, PDE1 und PDE2, fehlen. Drei Gruppen von cDNSs, welche den 3 unterschiedlichen, für die cAMP-spezifischen PDEs kodierenden humanen Gene entsprechen, wurden unter Verwendung dieses funktionellen Screenings aus einer humanen Glioblastoma-cDNS-Bibliothekx isoliert. Zwei der Gene waren mit der Drosophila 'dunce' cAMP-spezifischen PDE nahe verwandt. Das dritte Gen, welches Michaeli et al. (1993) als HCP1 bezeichneten, kodiert für eine neue, cAMP-spezifische PDE. HCP1 hat eine mit den Sequenzen der katalytisch Domänen von allen cyclischen Nukleotid-PDEs verwandte Aminosäurensequenz. Es ist eine cAMP-spezifische PDE mit hoher Affinität, welcher jedoch keine anderen Eigenschaften mit der cAMP-spezifischen PDE-Familie teilt. Die PDE-Aktivität von HCP1 war gegenüber cGMP oder anderen Inhibitoren der durch cGMP inhibierbaren PDEs nicht sensitiv. Die biochemischen und pharmakologischen Eigenschaften von HCP1 wiesen Michaeli et al. (1993) darauf hin, dass es sich um ein Mitglied einer vorher nicht entdeckten cyclischen Nukleotid-PDE-Familie handelt, welche sie als Familie VII bezeichneten. Die Northern Blot Analyse wies auf die Gegenwart von hohen Spiegeln einer HCP1-RNS in menschlichen Skelettmuskeln hin.
    Mittels Southern Blot Analyse von somatischen Zellhybrid-Linien lokalisierten Milatovich et al. (1994) den HCP1-Lokus auf Chromosom 8; durch die Untersuchung von somatischen Zellhybrid-Linien, welche unterschiedliche Regionen von Chromosom 8 enthielten, regionalisierten sie die Zuordnung auf 8q13-q22. Han et al. (1998) lokalisierten das PDE7A Gen mittels Fluoreszenz in situ Hybridisirung auf 8q13. Mittels interspezifischer Rückkreuzungs-Analyse lokalisierten sie das Maus-Pde7A-Gen auf die proximale Region von Chromosom 3."
  • Hintergrundlehren über PDE2 wurden von Jennifer P. Macke et al in http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htm angegeben. Die folgenden Informationen betreffend cGMP-stimulierte PDE wurden dieser Quelle entnommen.
  • "Rosman et al. (1997) klonten eine dem menschlichem PDE2A entsprechende cDNS. Das PDE2A-Gen kodiert für ein 941-Aminosäuren-Polypeptid mit einer vorhergesagten Molekülmasse von 106 kD. Die Proteinsequenz ist mit den PDE2A-Sequenzen vom Rind und der Ratte zu 90% identisch. Die Northern Blot Analyse zeigte, dass PDE2A als eine 4.2-kb mRNS in variierendem Ausmass in allen geprüften menschlichen Geweben exprimiert wurde, wobei die stärkste Expression im Gehirn erfolgte. Expressionsstudien ergaben, dass PDE2A cAMP und cGMP hydrolysiert und durch den PDE2A-spezifischen Inhibitor EHNA inhibiert wird."
  • Nukleotid-Sequenzen und Aminosäurensequenzen für PDEs sind in der Literatur verfügbar. Einige Sequenzen sind in den hier aufgeführten Sequenz-Listen angegeben.
  • In einem Aspekt wird das PDE-Target aus irgend einem oder mehreren der folgenden PDE-Enzyme ausgewählt: PDEcAMP 1, PDEcAMP 2, PDEcAMP 3, PDEcAMP 4, PDEcAMP 7 und PDEcAMP 8.
  • In einem besonders bevorzugten Aspekt wird das PDE-Target aus irgend einem oder mehreren der folgenden PDE-Enzyme ausgewählt: PDEcAMP 1, PDEcAMP 2, PDEcAMP 3, und PDEcAMP 4.
  • Vorzugsweise ist erfindungsgemäss das Verhältnis von PDE zu Target mindestens 2.
  • I:PDE
  • Wie oben angegeben, kann der zusätzliche Wirkstoff irgend ein geeigneter Wirkstoff sein, welcher als ein I:PDE wirken kann. Zusätzlich oder alternativ kann der erfindungsgemässe Wirkstoff auch als ein I:PDE wirken.
  • Beispiele von I:PDE sind in EP-A-091133 und EP-A-0771799 angegeben.
  • Vorzugsweise ist der I:PDE ein I:PDE2. Demnach sind bevorzugte Beispielverbindungen diejenigen, die in EP-A-0771799 vorgestellt sind.
  • Der Einfachheit halber wird nun der Anspruch 1 von EP-A-0771799 wiederholt:
  • Purin-6-on-Derivat der allgemeinen Formel (I):
    Figure 01270001
    wobei:
    • R1 für Wasserstoff oder für ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen steht;
    • R2 für ein geradkettiges oder verzweigtes Acyl mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen, oder für ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls durch Hydroxyl, Azido oder eine Gruppe der Formel -NR3R4 oder – OSO2R5substituiert ist, steht, worin
    • R3 und R4 gleich oder verschieden sind und ein Cycloalkyl mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen, Wasserstoff, Formyl, oder ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls durch ein Hydroxy, Carboxy oder ein geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy oder Alkoxycarbonyl mit jeweils bis zu 6 Kohlenstoffatomen oder durch eine Gruppe der Formel -(CO)a-NR6R7 substituiert ist, bedeuten, worin
    • a die Zahl 0 oder 1 bedeutet;
    • R6 und R7 gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, Formyl, Hydroxy, Phenyl oder ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls durch Hydroxy oder ein geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen substituiert ist, bedeuten; oder
    • R3 und/oder R4 ein geradkettiges oder verzweigtes Alkoxycarbonyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, Carboxy oder ein geradkettiges oder verzweigtes Acyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls durch Hydroxy oder ein geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit bis zu 4 Kohlenstoffatomen substituiert ist, bedeuten; oder
    • R3 und/oder R4 einen Rest der Formel -(CO)b-T-NR8R9, -CO- R10, -SO2R11 oder -SO2NR12R13 bedeuten, worin
    • b die oben angegebene Bedeutung von a hat und mit diesem gleich oder verschieden ist;
    • T ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen darstellen kann oder im Fall b ≠ 0 auch eine Bindung darstellen kann;
    • R8 und R9 die oben angegebene Bedeutung von R6 und R7 haben und mit diesen gleich oder verschieden sind;
    • R10 einen gesättigten, partiell ungesättigten oder ungesättigten 5- bis 7-gliedrigen Heterocyclus mit bis zu 3 Heteroatomen aus der Reihe S, N und/oder O bedeutet, der gegebenenfalls auch über die N-Funktion durch ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl, Alkoxy oder Alkoxycarbonyl mit jeweils bis zu 4 Kohlenstoffatomen, Carboxyl, Benzyloxycarbonyl oder Hydroxy substituiert sein kann;
    • R11 ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen, Benzyl oder Phenyl bedeutet;
    • R12 und R13 gleich oder verschieden sind und Wasserstoff, Phenyl oder ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 6 Kohlenstoffatomen bedeuten; oder
    • R3 und R4 gemeinsam mit dem Stickstoffatom einen 5- oder 6-gliedrigen gesättigten, partiell ungesättigten oder ungesättigten Heterocyclus bilden, der bis zu 3 Heteroatome aus der Reihe N, S und/oder O oder einen Rest -NR14 enthalten kann, und der gegebenenfalls durch Carbonyl, ein geradkettiges oder verzweigtes Alkoxycarbonyl mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen oder ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen substituiert ist, das seinerseits durch Hydroxy, Carboxy oder durch ein geradkettiges oder verzweigtes Acyl, Alkoxy oder Alkoxycarbonyl mit jeweils bis zu 6 Kohlenstoffatomen substituiert sein kann; worin
    • R14 Wasserstoff, Carbonyl oder ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl oder Alkoxycarbonyl mit jeweils bis zu 5 Kohlenstoffatomen bedeutet; und
    • R5 Phenyl oder ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen bedeutet;
    • A für eine geradkettige oder verzweigte Alkylen- oder Alkenylenkette mit jeweils bis zu 6 Kohlenstoffatomen steht;
    • D und L gleich oder verschieden sind und für ein Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder für einen 5- bis 7-gliedrigen aromatischen, gegebenenfalls benzokondensierten Heterocyclus mit bis zu 3 Heteroatomen aus der Reihe S, N und/oder O stehen, die gegebenenfalls bis zu 3-fach gleich oder verschieden durch Halogen, Hydroxy, Nitro, Trifluormethyl, Carboxy, geradkettiges oder verzweigtes Alkyl, Alkoxy oder Alkoxycarbonyl mit jeweils bis zu 6 Kohlenstoffatomen oder durch eine Gruppe der Formel -(V)c-NR15R16 und/oder – OR17 substituiert sind; worin
    • c die Zahl 0 oder 1 bedeutet;
    • V einen Rest der Formel -CO oder -SO2 bedeutet;
    • R15 und R16 gleich oder verschieden sind und die oben angegebene Bedeutung von R3 und R4 haben;
    • R17 Wasserstoff, ein geradkettiges oder verzweigtes Alkenyl mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen oder ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl mit bis zu 8 Kohlenstoffatomen bedeutet, das gegebenenfalls bis zu 3-fach gleich oder verschieden durch Hydroxy, Carboxyl oder geradkettiges oder verzweigtes Alkoxycarbonyl mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen substituiert ist; und/oder die Zyklen gegebenenfalls durch ein Aryl mit 6 bis 10 Kohlenstoffatomen oder durch einen 5- bis 7-gliedrigen aromatischen, gegebenenfalls benzokondensierten Heterocyclus mit bis zu 3 Heteroatomen aus der Reihe S, N und/oder O substituiert sind, die ihrerseits gegebenenfalls bis zu 2-fach gleich oder verschieden durch Halogen, Hydroxy, Nitro, Carboxyl, Trifluormethyl oder durch ein geradkettiges oder verzweigtes Alkyl, Alkoxy oder Alkoxycarbonyl mit jeweils bis zu 5 Kohlenstoffatomen oder durch eine Gruppe der Formel (V')d-NR18R19 substituiert sind; worin
    • d die oben angegebene Bedeutung von a hat und mit diesem gleich oder verschieden ist;
    • R18 und R19 die oben angegebene Bedeutung von R3 und R4 haben und mit diesen gleich oder verschieden sind;
    • V' die oben angegebene Bedeutung von V hat und mit diesem gleich oder verschieden ist; und/oder das unten für D angegebene Ringsystem darstellen, das gegebenenfalls durch ein geradkettiges oder verzweigtes Acyl mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen substituiert ist, das gegebenenfalls durch Hydroxy, ein geradkettiges oder verzweigtes Alkoxy mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen oder durch eine Gruppe der Formel -NR20R21 substituiert ist; worin
    • R20 und R21 gleich oder verschieden und die oben angegebene Bedeutung von R3 und R4 haben; oder
    • E für einen Rest der Formel -CH2-Y-Z- steht; worin
    • Y eine Bindung oder ein Sauerstoff- oder Schwefelatom oder die -NH-Gruppe bedeutet;
    • Z eine geradkettige oder verzweigte Alkylkette mit bis zu 5 Kohlenstoffatomen bedeutet;
    • D für einen Rest der Formel
      Figure 01330001
      steht;

    und deren Tautomere und Salze.
  • Bevorzugte I:PDEs werden aus den folgenden Strukturen ausgewählt:
  • Figure 01330002
  • Figure 01340001
  • NPY (Neuropeptid Y)
  • Gemäss einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist das zusätzliche Target ein PcAMP-Target, wobei das PcAMP-Target NPY oder einer seiner assoziierten Rezeptoren ist.
  • Nukleotid-Sequenzen und Aminosäure-Sequenzen für NPY und seine Rezeptoren sind in der Literatur verfügbar. Einige Sequenzen sind in den hier aufgeführten Sequenzprotokollen angegeben.
  • Es wurde hier gefunden, dass das Neuropeptid Y (NPY) einen inhibitorisch regulierenden Einfluss auf die durch das vasoaktive intestinale Peptid (VIP) vermittelte Vasorelaxation ausübt. Demnach wird die Inhibition von NPY- Rezeptoren zu einer verstärkten Pelvisnerv- und VIP-vermittelten Erhöhung des genitalen (z.B. vaginalen oder klitoralen) Blutflusses führen. Dies wird klinisch zu einer erhöhten vaginalen und/oder klitoralen Anschwellung führen, welche letztlich über Plasma-Transsudation zu einer erhöhten Lubrikation und erhöhten vaginalen Dehnbarkeit führen wird. Demnach ist für die Behandlung von FSAD das NPY oder einer seiner assoziierten Rezeptoren ein geeignetes Target.
  • Demnach ist der zusätzliche Wirkstoff in einem bevorzugten Aspekt ein NPY Y1-, Y2- oder Y5-Antagonist, vorzugsweise ein oraler NPY Y1-, Y2- oder Y5-Antagonist. Dieser Wirkstoff wird FSAD durch Erhöhung des genitalen (z.B. vaginalen oder klitoralen) Blutflusses und durch Erhöhung der Lubrikation behandeln.
  • Der NPY-vermittelte Antagonismus von VIP-induzierten Erhöhungen des Blutflusses stellt demnach ein mögliches therapeutisches Ziel dar, über welches der Blutfluss im weiblichen Genitaltrakt beeinflusst werden kann. Der Mechanismus, über welchen dieser Antagonismus abläuft, ist höchstwahrscheinlich über eine NPY Y1-Rezeptor-induzierte Gi/o-Aktivierung. In anderen physiologischen Systemen haben NPY Y1-Rezeptoren mit der Vermittlung der Vasokonstriktion und Inhibierung der sympathetischen Transmitter-Freisetzung in Zusammenhang gebracht (Lundberg et al., 1996; eine NPY Y2 Wirkung kann nicht ausgeschlossen werden). Es wird vermutet, dass NPY im weiblichen Genitaltrakt die Vasorelaxation inhibiert, und zwar durch direkte Inhibition der Adenylatcyclase, direkte Inhibition der VIP-Freisetzung oder sympathische Neurotransmission.
  • Wie angegeben, ist ein zusätzliches PcAMP-Target einer der NPY-Rezeptoren.
  • Die neuronale Freisetzung von NPY reguliert die VIP-induzierte Vasorelaxation des vaginalen vaskulären Bettes. Dies erfolgt am wahrscheinlichsten über einen auf NPY Y1-Rezeptoren beruhenden präsynaptischen Mechanismus, obwohl eine postsynaptische Wirkungsart nicht ausgeschlossen werden kann. Ein NPY-Antagonist wird die VIP-induzierte Vasodilation des vaginalen vaskulären Bettes potenzieren. Dies wird klinisch über die Anschwellung der Vaginawand zu einer erhöhten vaginalen Lubrikation und Dehnbarkeit führen.
  • Von uns durchgeführte Studien zur Expression von NPY-Rezeptoren haben NPY Y1-, Y2- und Y5-Rezeptor-Subtypen innerhalb der menschlichen Vagina identifiziert.
  • Demnach ist das zusätzliche PcAMP-Target in einem Aspekt einer oder mehrere der NPY Y1-, Y2- und Y5-Rezeptor-Subtypen.
  • Hintergrundlehren über NPY und die damit zusammenhängenden Rezeptoren sind von Victor A. McKusick et al auf http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htm zusammengestellt worden. Der folgende Text betreffend NPY wurde dieser Quelle entnommen.
  • "Das Neuropeptid Y (NPY) ist ein häufiges und weit verbreitetes Peptid im Nervensystem von Säugern. Es zeigt eine Sequenz-Homolgie zum Peptid YY und über 50% Homolgie in der Aminosäuren- und Nukleotid-Sequenz zum pankreatischen Polypeptid (PNP; 167780). NPY ist ein 36-Aminosäuren-Peptid. Minth et al. (1984) klonten das NPY- Gen ausgehend von der mRNS eines Pheochromocytoms. Takeuchi et al. (1985, 1986) isolierten cDNS-Klone von NPY- und PNP-Genen aus einem Pheochromocytom beziehungsweise einem pankreatischen endokrinen Tumor. Unter Verwendung dieser cDNS-Sonden zur Analyse der Genom-DNS aus Chromosomen-Zuordnungspaneelen von menschmaus-somatischen Zellhybriden wurde dann die Frage untersucht, ob die Gene syntenisch sind. Die Studien ergaben mit NPY auf 7pter-7q22 und PNP auf 17p11.1-17qter eine Nichtsyntenie. Mittels Studien einer Rückkreuzung mit Mus spretus lokalisierten Bahary et al. (1991) das homologe NPY-Gen zum Mauschromosom 6. Da das Mauschromosom 6 eine Homolgie zum menschlichen 7q hat, ist es wahrscheinlich, dass das NPY-Gen beim Menschen in der Region 7cen-q22 lokalisiert ist. Meisler et al. (1987) schlossen eine nahe Verknüpfung zwischen den Loki für zystische Fibrose (219700) und Neuropeptid Y aus. Terenghi et al. (1987) bestimmten die Verteilung von mRNS kodierendem NPY in Neuronen des zerebralen Kortex in chirurgischen Biopsieproben und in postmortem Gehirn mittels in-situ-Hybridisierung-Verfahren. Sie zeigten eine konsistente Lokalisation der NPY-Gen-Transkription und Expression in normalen reifen kortikalen Neuronen. Baker et al. (1995) zeigten mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, dass das NPY-Gen auf 7p15.1 lokalisiert ist und als einzelne Kopie vorliegt. Sie bemerkten, dass NPY eines der am höchsten konservierten bekannten Peptide ist, das sich beispielsweise zwischen Menschen und Haien nur in 3 Aminosäuren unterscheidet. Das Neuropeptid Y ist ein an der Kontrolle des Energiegleichgewichtes beteiligter Neuromodulator und wird im Hypothalamus von ob/ob-Mäusen überproduziert. Um die Rolle von NPY bei der Antwort auf Leptin-(164160)-Mangel zu bestimmen, erzeugten Erickson et al. (1996) ob/ob-Mäuse mit NPY-Mangel. In der Abwesenheit von NPY waren die ob/ob-Mäuse wegen verringerter Futteraufnahme und erhöhtem Energieverbrauch weniger übergewichtig und weniger schwerwiegend von Diabetes, Sterilität und somatotropen Defekten betroffen. Diese Resultate wurden dahingehend interpretiert, dass NPY ein zentraler Effektor des Leptinmangels ist. Eine genetische Linkage-Analyse von Ratten, welche selektiv auf Alkoholaffinität gezüchtet wurden, identifizierte eine chromosomale Region, welche das NPY-Gen umfasst (Carr et al., 1998). Alkoholaffine Ratten hatten im Vergleich zu nicht alkoholaffinen Ratten in mehreren Hirnregionen niedriegere NPY-Spiegel. Thiele et al. (1998) untersuchten daher den Alkoholkonsum von Mäusen, denen infolge einer gezielten Gen-Disruption das NPY vollständig fehlte (Erickson et al., 1996). Sie fanden, dass Mäuse mit NPY-Mangel im Vergleich zu Mäusen vom Wildtyp einen erhöhten Konsum von Lösungen mit 6%, 10% und 20% (nach Volumen) Ethanol zeigten. Mäuse mit NPY-Mangel waren auch weniger empfindlich auf die sedierenden/hypnotischen Wirkungen von Ethanol, was durch eine schnellere Erholung aus dem ethanolinduzierten Schlaf gezeigt wurde, die sogar dann eintrat, wenn sich die Ethanol-Plasmakonzentrationen von denjenigen der Kontrollen nicht signifikant unterschieden. Im Gegensatz dazu hatten transgene Mäuse mit einer Überexpression eines markierten NPY-Gens in Neuronen, die dieses üblicherweise exprimieren, eine geringere Präferenz für Ethanol und waren gegenüber den sedierenden/hypnotischen Wirkungen von Ethanol empfindlicher als die Kontrollen. Diese Daten lieferten direkte Hinweise, dass Alkoholkonsum und -resistenz mit dem NPY Spiegel im Gehirn invers zusammenhängen. Als Teil einer laufenden Studie über die genetische Basis der Adipositas identifizierten Karvonen et al. (1998) einen 1128T-C-Polymorphismus, welcher im einzelnen Signalpeptidteil von pre-pro-NPY zur Substitution von Leucin durch Prolin am Rest 7 führt. Dieser Polymorphismus war nicht mit Adipositas oder dem Energiemetabolismus vergesellschaftet, war aber sowohl bei normalgewichtigen als auch bei übergewichtigen Finnen sowie bei übergewichtigen holländischen Subjekten signifikant und konsistent mit hohen Gesamtcholesterin- und LDL-Cholesterin-Serumspiegeln vergesellschaftet. Uusitupa et al. (1998) fanden den pro7-Polymorphismus bei 14% der Finnen, aber nur bei 6% der Holländer. Subjekte mit pro7 in NPY hatten im Durchschnitt um 0.6 bis 1.4 mMol/L höhere Gesamtcholesterin-Serumspiegel als diejenigen ohne diese Genvariante. Da der Einfluss von pro7 NPY auf den Serumcholesterinspiegel bei normalgewichtigen Holländern nicht gefunden werden konnte, kann angenommen werden, dass übergewichtige Personen auf die Wirkung der Genvariante anfälliger sein können. Es wurde berechnet, dass die Wahrscheinlichkeit, das pro7 in NPY zu haben, bei übergewichtigen Subjekten mit einem Gesamtserumcholesterin von oder 8 mMol/L oder mehr 50 bis 60% betragen könnte. Zumindest unter den Finnen ist die pro7-Form von NPY einer der stärksten genetischen Faktoren, welche die Serumcholesterinspiegel beeinflussen. SIEHE AUCH Allen und Bloom (1986); Dockray (1986); Maccarrone und Jarrott (1986); Minth et al. (1986)."
  • Wie angegeben, sind Hintergrundlehren über NPY und seine assoziierten Rezeptoren von Victor A. McKusick et al zusammengestellt worden (ibid). Der folgende Text betreffend NPYR1 wurde dieser Quelle entnommen.
  • "Das Neuropeptid Y (NPY; 162640) ist eines der am häufigsten vorkommenden Neuropeptide im Nervensystem von Säugern und entfaltet einen breiten Bereich von wichtigen physiologischen Aktivitäten, welche Wirkungen auf die psychomotorische Aktivität, die Nahrungsaufnahme, die Regulierung der zentralen endokrinen Sekretion sowie potente vasoaktive Wirkungen auf das kardiovaskuläre System umfassen. Zwei wichtige Subtypen von NPY (Y1 und Y2) sind mittels pharmakologischer Kriterien definiert worden. Die NPY Y1-Rezeptoren wurden in eine Vielzahl von Geweben, namentlich in Gehirn, Milz, Dünndarm, Nieren, Hoden, Plazenta und glatten Muskeln in der Aorta identifiziert. Der Y2-Rezeptor wird hauptsächlich im zentralen Nervensystem gefunden. Herzog et al. (1992) berichteten über das Klonieren einer für den menschlichen NPY-Rezeptor kodierenden cDNS, die sie als Mitglied der G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Superfamilie bestätigten. Wenn der Rezeptor in den Ovarialzellen von Chinesischen Hamstern (CHO) oder in menschlichen embryonalen Nierenzellen exprimiert wird, entfaltet er eine charakteristische Ligandspezifität. In der Nierenzell-Linie war der Rezeptor an ein auf Keuchhustentoxin sensitives G-Protein gekoppelt, das die Inhibition der Anreicherung von cyclischer AMP vermittelt. Andererseits war der Rezeptor in der CHO-Zell-Linie nicht mit der Inhibition der Adenylatcyclase, sondern vielmeher mit der Erhöhung des intrazellulären Kalziums gekoppelt. Demnach war die second Messenger Kopplung des NPY-Rezeptors zelltyp-spezifisch und hing vom spezifischen, im Zelltyp vorhandenen Repertoire an G-Proteinen und Effektorsystemen ab. Larhammar et al. (1992) klonten und charakterisierten unabhängig den Neuropeptid-Y-Rezeptor. Herzog et al. (1993) bestimmten die molekulare Organisation und Regulierung des menschlichen NPY-Y1-Rezeptor-Genes. Im Gegensatz zur zusammenhängenden Struktur der meisten G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Gene fanden sie, dass das NPY-Y1-Rezeptor-Gen 3 Exons hat. Sie identifizierten zudem einen gewöhnlichen Pst1-Polymorphismus im ersten Intron des Gens. Mittels hochauflösender Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung lokalisierten sie das Gen auf 4q31.3-q32. Herzog et al. (1997) fanden, dass die NPY1R- und NPY5R-(602001)-Gene auf dem Chromosom 4q31-q32 kolokalisiert sind. Die beiden Gene werden aus einer gewöhnlichen Promoterregion in entgegengesetzter Richtung transkribiert. Eines der alternierend gespleissten 5-Strich Exons des Y1-Rezeptor-Gens ist ein Teil der kodierenden Sequenz des Y5-Rezeptors. Diese unübliche Anordnung war für Herzog et al. (1997) ein Hinweis, dass die beiden Gene durch ein Gen-Duplikationsereignis entstanden und dass sie koordiniert exprimiert werden könnten. Mittels interspezifischer Rückkreuzungsanalyse lokalisierten Lutz et al. (1997) die Npy1r- und Npy2r-Gene auf konservierte Verknüpfungsgruppen auf den Maus-Chromosomen 8 beziehungsweise 3, welche der distalen Region des menschlichen Chromosoms 4q entsprechen." Wie angegeben, sind Hintergrundlehren über NPY und seine assoziierten Rezeptoren von Victor A. McKusick et al zusammengestellt worden (ibid). Der folgende Text betreffend NPYR2 wurde dieser Quelle entnommen.
  • "Das Neuropeptid Y(NPY) signalisiert über eine Familie von im Gehirn und in sympathischen Neuronen vorhandenen G-Protein-gekoppelten Rezeptoren. Mindestens 3 Arten von Neuropeptid-Y-Rezeptor sind aufgrund von pharmakologischen Kriterien, Gewebeverteilung und Struktur des kodierenden Gens definiert worden; siehe 162641 und 162643. Rose et al. (1995) berichteten über die Expressionsklonierung in COS Zellen einer cDNS für den menschlichen Typ-2-Rezeptor, NPY2R. Transfizierte Zellen zeigten eine hohe Affinität für NPY (162640), Peptid YY (PYY; 600781) und ein Fragment von NPY einschliesslich Aminosäuren 13 bis 36. Das vorhergesagte 381-Aminosäuren-Protein hat 7 Transmembrandomänen, welche für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren charakteristisch sind, und ist zum menschlichen Y1-Rezeptor nur um 31% identisch (NPY1R; 162641). Eine 4-kb mRNS wurde auf Northern Blots von Gewebeproben aus mehreren Regionen des Nervensystems nachgewiesen. Gerald et al. (1995) klonierten die dem menschlichen Y2-Rezeptor entsprechende cDNS aus einer cDNS-Expressions-Bibliothek des menschlichen Hippocampus durch Verwendung eines radioaktiv markierten PYY-Bindungsassays. Sie exprimierten das Y2-Gen in COS-7 Zellen und führten einen Hormon-Bindungsassay durch, welcher zeigte, dass der Y2-Rezeptor (von höchster bis niedrigster Affinität) PYY, NPY und pankreatische Polypeptidhormone (PP; 167780) bindet. Ammar et al. (1996) klonierten und charakterisierten das menschliche Gen, welches für den Typ 2 NPY-Rezeptor kodiert. Das Transkript umspannt 9 kb der Genomsequenz und ist in 2 Exons kodiert. Wie im NPY-Rezeptor-Gen vom Typ 1 wird die nichttranslatierte 5-Strich Region von NPY2R durch eine intervenierende 4.5-kb Sequenz unterbrochen. Ammar et al. (1996) zeigten mittels Southern Analyse von Nager-Mensch Zellhybriden, gefolgt von Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH), dass das NPY2R-Gen auf 4q31 lokalisiert ist, wobei diese Region auch das NPY1R-Gen enthält, was darauf hinweist, dass diese Subtypen trotz ihrer strukturellen Unterschiede durch Gen-Duplikation entstanden sein könnten. Mittels interspezifischer Rückkreuzungsanalyse lokalisierten Lutz et al. (1997) die Npy1r- und Npy2r- Gene auf konservierte Verknüpfungsgruppen auf den Maus-Chromosomen 8 beziehungsweise 3, welche der distalen Region des menschlichem Chromosoms 4q entsprechen."
  • Ein Assay zur Bestimmung, ob ein mutmasslicher oder aktueller Wirkstoff an NPY binden kann, ist in WO-A-98/52890 (siehe Seite 96 davon, Zeilen 2 bis 28) beschrieben.
  • I:NPY
  • Wie oben angegeben, kann der zusätzliches Wirkstoff irgend ein geeigneter Wirkstoff sein, der als I:NPY (gelegentlich als NPY-Antagonist bezeichnet) wirken kann. Zusätzlich oder alternativ kann der erfindungsgemässe Wirkstoff auch als I:NPY wirken.
  • I:NPYs (insbesondere NPY-Antagonisten) werden in den folgenden Übersichtsartikeln besprochen:
    • Dunlop J, Rosenzweig-Lipson S: Therapeutic approaches to obestity Exp Opin Ther Pat 1999 8 12 1683–1694
    • Wang S, Ferguson KC, Burris TP, Dhurandhar NV: 8th annual international conference on obesity and non-insulin dependent Diabetes mellitus: novel drug developments. Exp Opin Invest Drugs 1999 8 7 1117–1125
    • Ling AL: Neuropeptide Y receptor antagonists Exp Opin Ther Pat 1999 9 4 375–384 Adham N, Tamm J, Du P, Hou C, et al: Identification of residues involved in the binding of the antagonist SNAP 6608 to the Y5 receptor Soc Neurosci Abstr 1998 24 part 2 626.9
    • Shu YZ, Cutrone JQ, Klohr SE, Huang S: BMS-192548, a tetracyclic binding Inhibitor of Neuropeptid Y receptors, from Aspergillus niger WB2346. II. Physico-chemical propeties and structural characterization J Antibiot 1995 48 10 1060–1065
    • Rigollier P, Rueger H, Whitebread S, Yamaguchi Y, Chiesi M, Schilling W, Criscione L: Synthesis and SAR of CGP 71683A, a potent and selective antagonist of the neuropeptid Y Y5 receptor. Int Symp Med Chem 1998 15th Edinburgh 239
    • Criscione L, Rigollier P, Batzl-Hartmann C, Rueger H, Stricker-Krongrad A, et al: Food intake in free-feeding and energy-deprived lean rats is mediated by the neuropeptide Y5 receptor. J Clin Invest 1998 102 12 2136–2145
    • Neurogen Corp : NGD 95-1 Clin Trials Monitor 1996 5 10 Ab 19244
    • Buttle LA: Anti-obesity drugs: on target for huge market sales. Exp Opin Invest Drugs 1996 5 12 1583–1587
    • Gehlert DR, Hipskind PA: Neuropeptide Y receptor antagonists in obesity. Exp Opin Invest Drugs 1996 7 9 1827–1838
    • Goldstein DJ, Trautmann ME: Treatments for obesity. Emerging Drugs 1997 2 – 1–27
    • Hipskind P A, Lobb K L, Nixon J A, Britton T C, Bruns R F, Catlow J, Dieckman McGinty D K, Gackenheimer S L, Gitter B D, Iyengar S, Schober D A, et al.: Potent and selective 1,2,3-trisubstituted indole NPY Y-1 antagonists. J Med Chem 1997 40 3712–3714
    • Zimmerman DM, Cantrall BE, Smith ECR, Nixon JA, Bruns RF, Gitter B, Hipskind PA, Ornstein PL, Zarrinmayeh H, Britton TC, Schober DA, Gehlert DR: Structure-activity relationships of a series of 1-substituted-4-methylbenzimidazole neuropeptide Y-1 receptor antagonists Bioorganic Med Chem Lett 1998 8 5 473–476
    • Zarrinmayeh H, Nunes A, Ornstein P, Zimmerman D, Arnold MB, et al: Synthesis and evaluation of a series of novel 2-[(4-chlorophenoxy)methy]benzimidazoles as selective neuropeptid Y Y1 receptor antagonists J Med Chem 1998 41 15 2709–2719
    • Britton TC, Spinazze PG, Hipskind PA, Zimmerman DM, Zarrinmayeh H, Schober DA, Gehlert DR, Bruns RF: Structure activity relationships of a series of benzothiophene-dervied NPY-Y1 antagonists: optimization of the C2 side chain Bioorganic Med Chem Lett 1999 9 3 475–480
    • Zarrinmayeh H, Zimmerman DM, Cantrell BE, Schober DA, Bruns RF, Gackenheimer SL, Ornstein PL, Hipskind PA, Britton TC, Gehlert DR : Structure-activity relationship of a series of diaminoalkyl substituted benzimidazole as neuropeptide Y Y1 receptor antagonists Bioorganic Med Chem Lett 1999 9 5 647-652
    • Murakami Y, Hara H, Okada T, Hashizume H, Kii M, Ishihara Y, Ishikawa M, Mihara S-I, Kato G, Hanasaki K, Hagishita S, Fujimoto M: 1,3-disubstituted benzazepines as novel, potent, selective neurpeptide Y Y1 receptor antagonists J Med Chem 1999 42 14 2621–2632
    • Rudolf K, Eberlein W, Engel W, Wieland HA, Willim KD, Entzeroth M, Wienen W, Beck Sickinger AG, Doods HN : The first highly potent and selective non-peptide neuropeptide Y Y1 receptor antagonist: BIBP3226 Eur J Pharmacol 1994 271 2-3 R11–R13
    • Wieland HA, Willim KD, Entzeroth M, Wienen W, Rudolf K, Eberlein W, Engel W, Doods HN: Subtype selectivity and antagonist profile of the nonpeptide neuropeptide Y1 receptor antagonist BIBP 3226 J Pharmacol Exp Ther 1995 275 1 143–149.
    • Wright J, Bolton G, Creswell M, Downing D, Georgic L, Heffner T, Hodges J, MacKenzie R, Wise L: 8-amino-6-(arylsulphonyl)-5-nitroquinolones: novel nonpeptide neuropeptide Y1 receptor antagonists Bioorganic Med Chem Lett 1996 6 15 1809–1814
    • Capurro D, Huidobro-Toro JP: The involvement of neyropeptide Y Y1 receptors in the blood pressure baroreflex:studies with BIBP 3226 and BIB 3304. Eur J Pharmacol 1999 376 3 251–255
    • Dumont Y, Cadieux A, Doods H, Quirion R : New tools to investigate neuropeptide Y receptors in the central and peripheral nervous systems: BIBO-3304 (Y1), BIIE-246 (Y2) and [1251]-GR-231118 (Y1/Y4). Soc Neurosci Abstr 1999 25 Part 1 Abs 74.11
    • Hegde SS, Bonhaus DW, Stanley W, Eglen RM, Moy TM, Loeb M, et al: Pharmacological evaluation of 1229U91, a high affinity and selective neuropeptide Y(NPY) – Y1 rezeptor antagonist Pharmacol Res 1995 31 190
    • Matthews JE, Chance WT, Grizzle MK, Heyer D, Daniels AJ: Food intake inhibition and body weight loss in rats treated with GI 264879A, an NPY-Y1 receptor. Soc Neurosci Abstr 1997 23 Pt 2 1346
    • Doods HN, Willim K-D, Smith SJ: BIBP 3226: a selective and highly potent NPY-Y1 antagonist Proc Br Pharmacol Soc 1994 13–16 Dec. C47
    • Rudolf K, Eberlein W, Engel W, Wieland HA, Willim KD, Entzeroth M, Wienen W, Beck Sickinger AG, Doods HN: The first highly potent and selective non-peptide neuropeptide Yy1 receptor antagonist: BIBP3226 Eur J Pharmacol 1994 271 2-3 R11–R13
    • Serradelil-Le-Gal C, Valette G, Rouby PE, Pellet A, Villanova G, Foulon L, Lespy L, Neliat G, Chambon JP, Maffrand JP, Le-Fur G: SR 120107A and SR 120819A: Two potent and selective, orally-effective antagonists for NPY Y1 receptors Soc Neurosci Abstr 1994 20 Pt 1 907 – Abs 376.14
    • Hong Y, Gregor V, Ling AL, Tompkins EV, Porter J, Chou TS, Paderes G, Peng Z, Hagaman C, Anderes K, Luthin D, May J: Synthesis and biological evaluation of novel guanylurea compounds as potent NPY Y1 receptor antagonist Acs 1999 217 Anaheim MEDI 108
  • I:NPYs (insbesondere NPY antagonists) werden in den folgenden Dokumenten beschrieben:
    • WO-98/07420
    • WO-94/00486
    • WO-96/22305
    • WO-97/20821
    • WO-97/20822
    • WO-96/14307
    • JP-07267988
    • WO-96/12489
    • US-5552422
    • WO-98/35957
    • WO-96/14307
    • WO-94/17035
    • EP-0614911
    • WO-98/40356
    • EP-0448765
    • EP-0747356
    • WO-98/35941
    • WO-97/46250
    • EP-0747357
  • Bevorzugte Beispiele von I:NPYs sind aus den folgenden Strukturen ausgewählt. Diese Verbindungen wurden geprüft und zur Potenzierung von cAMP als nützlich befunden und demnach zur Behandlung von FSAD als nützlich gefunden. Einige der diese Verbindungen betreffenden experimentellen Daten werden im experimentellen Abschnitt beschrieben (unten).
  • Figure 01490001
  • Figure 01500001
  • Figure 01510001
  • Figure 01520001
  • Figure 01530001
  • VIP (vasoaktives intestinales Peptid)
  • Gemäss einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein zusätzliches Target ein PcAMP-Target, wobei das PcAMP-Target VIP oder einer seiner assoziierten Rezeptoren ist. Die gegenwärtige Klassifikation/Nomenklatur bezeichnet diese als VPAC1, VPAC2 und PACAP.
  • Nukleotid-Sequenzen und Aminosäuren-Sequenzen für VIP und seine Rezeptoren sind in der Literatur verfügbar. Einige Sequenzen sind in den hier aufgeführten Sequenzprotokollen angegeben.
  • Es wurde gezeigt, dass VPAC1 und VPAC2 in der Vagina von Menschen wie auch von Hasen vorliegt. PACAP war in der Vagina von Hasen wie auch von Menschen nicht vorhanden.
  • VIP ist ein wichtiger endogener Neurotransmitter, der während der sexuellen Erregung freigesetzt wird und der für die nerveninduzierte vaginale Vasodilatation des in der Vaginalwand lokalisierten vaskulären Betts verantwortlich ist. Diese vasodilatorischen Wirkungen werden durch die Aktivierung der Adenylatcyclase und die Bildung von cAMP vermittelt. Ohne sich durch Therorie beschränken zu wollen, kann diese Wirkung über die VIP Rezeptorsubtypen VPAC1-, VPAC2- oder PACAP- (Hypophysen-Adenylatcyclase-aktivierendes Peptid)-Rezeptoren vermittelt werden. Die VPAC2- und PACAP-Rezeptoren sind im ZNS am stärksten exprimiert, und die Rezeptoren scheinen, obwohl sie in der Hypophyse exprimiert werden, keine weit verbreitete biologische Funktion zu haben.
  • Der Wirkstoff könnte VIP potenzieren und/oder als VIP-Mimetikum oder Analogon davon wirken. Der Wirkstoff würde dann die vasorelaxatorischen Wirkungen des während der sexuelle Erregung freigesetzten endogenen VIP potenzieren und/oder nachahmen. Der Wirkstoff kann auch eine additive Wirkung auf die VIP-induzierten Relaxationen der vaginalen glatten Muskulatur haben. Dies wird klinisch durch erhöhte vaginale Lubrikation über die Anschwellung der Vaginalwand und -dehnbarkeit zur FSAD-Behandlung führen. In dieser Ausgestaltung würde allerdings das Mimetikum oder Analogon nicht die nachteiligen Eigenschaften von VIP wie oben besprochen haben.
  • Hintergrundlehren über VIP und seine assoziierten Rezeptoren sind von Victor A. McKusick et al auf http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htm angegeben. Der folgende, VIP betreffende Text wurde dieser Quelle entnommen.
  • "Das vasoaktive intestinale Peptid (VIP), ein ursprünglich aus dem Duodenum von Schweinen isoliertes 28-Aminosäuren-Peptid, ist nicht nur in gastrointestinalen Geweben, sondern auch in neuralen Geweben, möglicherweise als Neurotransmitter, vorhanden und entfaltet eine grosse Vielzahl von biologischen Wirkungen. Weil VIP Ähnlichkeiten zu Glucagon, Secretin und gastrischem inhibitorischem Peptid (GIP) zeigt, wird es als Mitglied der Glucagon-Secretin Familie betrachtet. Das primäre Translationsprodukt der für VIP kodierenden mRNS (präpro-VIP) hat ein Molekulargewicht von 20 Dalton. Durch Klonieren der zu der für menschliches VIP kodierenden mRNS komplementären DNS-Sequenz fanden Itoh et al. (1983), dass der VIP-Vorläufer nicht nur VIP, sondern auch ein neues Peptid aus 27 Aminosäuren enthält, das als PHM27 bezeichnet wird und das aminoterminales Histidin und carboxyterminales Methionin aufweist. Es unterscheidet sich von dem aus Schweinemagen isolierten PHI17 durch 2 Aminosäuren; PHI27 weist, wie seine Bezeichnung aufzeigt, ein carboxyterminales Isoleucin auf. Linder et al. (1987) isolierten das menschliche Gen für VIP und PHM27 und studierten dessen Expression in verschiedenen Geweben von Ratten. Heinz-Erian et al. (1985) schlugen vor, dass eine mangelhafte Erneuerung von Schweissdrüsen bei Patienten mit zystischer Fibrose durch das VIP-Neuropeptid ein grundlegender Mechanismus für den verminderten Wassergehalt und für die relative Undurchlässigkeit des Epithels für Chlorid und andere Ionen sein könnte, welche die zystische Fibrose charakterisiert. Zur Überprüfung dieser Hypothese verwendeten Gozes et al. (1987) den "Kandidaten-Gen"-Ansatz. Bodner et al. (1985) hatten gezeigt, dass VIP und PHM-27 durch benachbarte Exons kodiert werden. Gozes et al. (1987) verwendeten das für PHM-27-kodierende Genomfragment zum Nachweis der Anwesenheit des VIP-Gens bei 6q21-qter. Demnach schlossen sie ein defektes VIP-Gen als Kandidat für die primäre Ursache der zystischen Fibrose aus (welche durch das Chromosom 7 kodiert ist).
  • Mittels in-situ-Hybridisierungs-Verfahren ordneten Gozes et al. (1987) das VIP-Gen dem 6q24 zu. Damit wurde VIP in die Region von MYB (189990) platziert, welches auf 6q22 lokalisiert wurde. Gozes et al. (1987) untersuchten eine funktionelle Beziehung zwischen den beiden Genen in neuronalem Gewebe. Sie beobachteten einen scharfen Signal-Peak von MYB mRNS im Hippocampus von 3 Tage alten Ratten, welcher dem Signal von VIP mRNS voranging, das in diesem Bereich bei einem Alter von 8 Tagen auftritt. Omary und Kagnoff (1987) fanden nukleäre Rezeptoren für VIP in einer menschlichen Kolonadenokarzinom-Zelllinie. Gotoh et al. (1988) ordneten VIP dem Chromosom 6 zu mittels Spot Blot Hybridisierung eines molekular klonierten Fragmentes des Gens an sortierte Chromosomen. Die Lokalisation wurde mittels in-situ-Hybridisierung auf 6q26-q27 verfeinert."
  • Wie angegeben, sind Hintergrundlehren über VIP und seine assoziierten Rezeptoren in Victor A. McKusick et al angegeben (ibid). Der folgende Text betreffend VIPR1 oder VPAC1 wurde dieser Quelle entnommen.
  • "Das vasoaktive intestinale Peptid (VIP; 192320) ist ein octacosamerer neuroendokriner Mediator, der vornehmlich in cholinergen präsynaptischen Neuronen des Zentralnervensystems und in peripheren peptidergen Neuronen, die verschiedene Gewebe innervieren, gefunden wird. Von den vielen neuroendokrinen Peptiden mit immunologischen Funktionen unterscheidet sich VIP durch seine Fähigkeit, sowohl B- als auch T-Zellen direkt zu beeinflussen. Bestimmte unterschiedliche Teilsätze von neuralen, respiratorischen, gastrointestinalen und Immun- Zellen tragen spezifische Rezeptoren mit hoher Affinität für VIP, welche mit einem zur Aktivierung der Adenylatcyclase befähigten Guanin-Nukleotid-Bindungs-(G)-Protein zusammenhängen. Libert et al. (1991) fanden durch selektives) Amplifikation und Klonieren aus Schilddrüsen-cDNS vier neue Rezeptoren der G-Protein-gekoppelten Rezeptor-Familie. Eines davon, als RDC1 bezeichnet, wurde von Sreedharan et al. (1991) als der VIP-Rezeptor identifiziert. Libert et al. (1991) lokalisierten das VIPR-Gen auf 2q37 mittels in-situ-Hybridisierung. Spätere Informationen liessen Zweifel aufkommen, dass das auf 2q37 lokalisierte Gen tatsächlich das VIP-Rezeptor-Gen war (Vassart, 1992). Die Sequenz, welche von Sreedharan et al. (1991) als GPRN1 bezeichnet wurde und auf 2q37 lokalisiert wurde, bindet gemäss Wenger (1993) nicht an VIP. Sreedharan et al. (1995) isolierten ein authentisches Typ I VIP-Rezeptor-Gen und lokalisierten es mittels Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung an der 3p22-Bande in einer mit nichtkleinzelligem Lungenkrebs zusammenhängenden Region. Mittels interspezifischer Rückkreuzungs-Analyse lokalisierten Hashimoto et al. (1999) das Maus-Vipr1-Gen auf die distale Region des Chromosoms 9, eine Region, die eine Syntenie-Homolgie mit dem menschlichem Chromosom 3p zeigt. Sreedharan et al. (1993) klonierten ein menschliches intestinales VIP Rezeptor Gen; die ermittelte Aminosäuren-Sequenz teilt 84% Identität mit dem VIP-Rezeptor der Rattenlunge. Couvineau et al. (1994) isolierten zwei VIPR cDNS Klone aus einer menschlichen jeunalen Epithelzellen-cDNS-Bibliothek. Einer kodiert für einen VIP-Rezeptor, der aus 460 Aminosäuren besteht und 7 mutmassliche Transmembrandomänen aufweist, wie dies auch andere G-Protein-gekoppelte Rezeptoren haben. Der andere kodiert für ein 495-Aminosäure-VIP-Rezeptor-verwandtes Protein, das 100% Homolgie mit dem funktionellen VIP-Rezeptor über die 428 Aminosäuren an der C-terminalen Region aufweist, aber eine vollständig divergente 67-Aminosäure-N-terminale Domäne enthält. Bei Expression in COS-7 Zellen band das zweite Protein nicht an radioiodiniertes VIP, obwohl es normalerweise gemäss Immunofluoreszenz-Studien an der Plasmamembran adressiert wird. Für den Typ I VIP-Rezeptor, der auch als Typ II PACAP-Rezeptor bezeichnet wird (siehe 102981 für einen anderen Typ von PACAP-Rezeptor), wurde von Sreedharan et al. (1995) gefunden, dass er ungefähr 22 kb umspannt und 13 Exons (im Bereich von 42 bis 1,400 bp) sowie 12 Introns (im Bereich von 0.3 bis 6.1 kb) enthält. Sreedharan et al. (1995) charakterisierten auch den Promoter und die 5-prime Flankenregion des Gens."
  • Wie angegeben, sind Hintergrundlehren über VIP und seine assoziierten Rezeptoren in Victor A. McKusick et al angegeben (ibid). Der folgende Text betreffend VIPR2 oder VPAC2 wurde dieser Quelle entnommen.
  • "Das vasoaktive intestinale Peptid (VIP; 192320) und das Hypophysen-Adenylatcyclase-aktivierende Polypeptid (PACAP; 102980) sind homologe Peptide, welche als Neurotransmitter und neuroendokrine Hormone wirken. Während die Rezeptoren für VIP und PACAP Homolgie teilen, unterscheiden sie sich in ihren Substratspezifizitäten und Expressionsmustern. Siehe VIPR1 (192321) und ADCYAPIRI(102981). Svoboda et al. (1994) führten eine PCR mit niedriger Stringenz unter Verwendung von Primern durch, die auf Sequenzen beruhten, welche zwischen den VIP-Rezeptoren erhalten bleiben. Sie klonierten das menschliche VIP2-Rezeptor Gen aus einer Lymphoblasten-cDNS-Bibliothek. Dieses Gen kodiert für ein 438-Aminosäuren-Polypeptid, das 86% Identität mit dem Ratten-VIP2-Rezeptor teilt. Sie exprimierten den menschlichen VIP2-Rezeptor in Ovarialzellen des chinesischen Hamsters und fanden, dass es an PACAP-38, PACAP-27, VIP und Helodermin bindet und dass die Bindung des Rezeptors an irgend eines dieser Peptide die Adenylatcyclase aktiviert. Es wurde gefunden, dass die Peptidbindung durch GTP inhibiert wird. Adamou et al. (1995) klonierten das VIP2-Rezeptor-Gen aus einer menschlichen Plazenta-cDNS-Bibliothek. Northern Blotting ergab, dass VIPR2 als zwei Transkripte von 4.6 kb und 2.3 kb mit hohen Spiegeln in Skelettmuskeln und mit tiefen Spiegeln in Herzen, Gehirn, Plazenta und Pankreas exprimiert wird. Mackay et al. (1996) verwendeten Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung um das VIPR2-Gen auf das menschliche Chromosom 7q36.3 zu lokalisieren. Gemäss weiteren Kartierungen mit Zelllinien, die von Patienten mit Holoprosenzephalie vom Typ 3 (HPE3; 142945) abgeleitet wurden, liegt das VIPR2-Gen innerhalb der minimalen kritischen HPE3-Region. Mackay et al. (1996) sagten aus, dass obwohl VIPR2 zum HPE3-Phenotyp beitragen kann, es nicht der einzige verantwortliche Faktor ist."
  • AC (Adenylatcyclase)
  • Gemäss einem Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein zusätzliches Target ein PcAMP-Target, wobei das PcAMP-Target AC ist.
  • Nukleotid-Sequenzen und Aminosäuren-Sequenzen für AC sind in der Literatur verfügbar.
  • Zur Bestätigung, dass VIP die Vasorelaxation über die Erhöhung der intrazellulären cAMP-Spiegel und die anschliessende Aktivierung der Adenylatcyclase induziert, wurden während der VIP-Stimulation die vaginalen cAMP-Konzentrationen gemessen und es wurde Forskolin, ein Adenylatcyclase-Aktivator, verwendet, um die Wirkungen der Aktivierung des cAMP/Adenylatcyclase-Pfads nachzuahmen.
  • In diesen Studien wurde gefunden, dass die VIP-Behandlung und die Forskolin-Behandlung die intrazellulären cAMP-Konzentrationen in isoliertem vaginalen Gewebe erhöhen.
  • Es wurde zudem gefunden, dass Forskolin in einem Tiermodell der sexuellen Erregung den vaginalen Blutfluss erhöht.
  • Ausserdem wurde gefunden, dass Forskolin die Relaxation in isolierter Vagina induziert.
  • Hintergrundlehren über AC sind in Victor A. McKusick et al unter http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/Omim/searchomim.htm angegeben. Der folgende Text betreffend AC wurde dieser Quelle entnommen.
  • "Die Adenylylcyclase (EC 4.6.1.1) katalysiert die Transformation von ATP zu cyclischem AMP. Die enzymatische Aktivität steht unter der Kontrolle von mehreren Hormonen, und verschiedene Polypeptide nehmen an der Transduktion des Signals vom Rezeptor zur katalytischen Einheit teil. Stimulatorische oder inhibitorische Rezeptoren (Rs und Ri) interagieren mit G-Proteinen (Gs und Gi), welche eine GTPase-Aktivität entfalten, und sie modulieren die Aktivität der katalytischen Untereinheit der Adenylylcyclase. Parma et al. (1991) klonierten eine der Adenylylcyclase des menschlichen Gehirns entsprechende cDNS, die sie als HBAC1 bezeichnteten. Mittels in-situ-Hybridisierung an metaphasigen chromosomalen Ausstrichen unter Verwendung von cDNS für menschliches Gehirn als Sonde zeigten Stengel et al. (1992), dass das Gen auf 8q24.2 lokalisiert ist. Ein hochgradig homologes Gen, ADCY2 (103071), wurde mit Hilfe desselben Verfahrens 5p15.3 zugeordnet."
  • ALLGEMEINE VERFAHREN DER REKOMBINANTEN DNS-METHODOLOGIE
  • Obwohl die hier erwähnten Verfahren im Allgemeinen im Fachgebiet wohlbekannt sind, kann insbesondere auf Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1989) und Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (1999) 4th Ed, John Wiley & Sons, Inc. verwiesen werden. Die PCR ist in US-A-4683195, US-A-4800195 und US-A-4965188 beschrieben.
  • ZUSAMMENFASSUNG
  • Zusammenfassend bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung eines I:NEP zur Behandlung von FSD, insbesondere FSAD.
  • BEISPIELE
  • Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend lediglich beispielhaft beschrieben, wobei auf folgende Figuren verwiesen wird:
  • 1, welche eine Grafik ist;
  • 2, welche eine Grafik ist;
  • 3, welche eine Grafik ist;
  • 4, welche eine Grafik ist;
  • 5, welche eine Grafik ist;
  • 6, welche eine Grafik ist;
  • 7, welche eine Grafik ist;
  • 8, welche eine Grafik ist;
  • 9, welche eine Grafik ist;
  • 10, welche eine Grafik ist;
  • 11, welche eine Grafik ist; und
  • 12, welche eine Grafik ist.
  • Es versteht sich, dass der erfindungsgemässe Wirkstoff ein I:NEP ist. Lehren über I:PDE und I:NPY werden ebenfalls angegeben, da diese eine Fachperson klar darauf hinweisen, dass der erfindungsgemässe Wirkstoff in Kombination mit einem oder beiden dieser Typen von Wirkstoffen verwendet werden kann, um die oben erwähnte günstige Wirkung zu erreichen. Diese zusätzlichen Lehren sind ebenfalls angegeben, um unsere wegweisenden Befunde weiter zu stützen.
  • Die Figuren werden nun detaillierter besprochen.
  • 1: – Die elektrische Stimulation des Pelvisnervs induziert eine frequenzabhängige Erhöhung des vaginalen Blutflusses im Modell der sexuellen Erregung beim anästhesierten Hasen. Eine Erhöhung der Stimulationsfrequenz induziert stärkere Erhöhungen des Blutflusses. Die Veränderungen wurden unter Verwendung von Laser-Doppler-Verfahren bestimmt.
  • 2: – Vasoaktives intestinales Peptid (VIP) induziert eine Erhöhung des vaginalen Blutflusses im Modell der sexuellen Erregung beim anästhesierten Hasen. 2a zeigt wie der vaginale Blutfluss durch Infusionen von VIP (intravenöser Bolus) in einer konzentrationsabhängigen Art und Weise erhöht wird. 2b zeigt, dass zwei wiederholte Infusionen von VIP ähnliche Erhöhungen des Blutflusses erzeugen. Man bemerke, dass die Dauer der Antwort ebenfalls ähnlich ist. Alle Veränderungen wurden unter Verwendung von Laser-Doppler-Verfahren bestimmt.
  • 3: – Vasoaktives intestinales Peptid (VIP) reduziert den mittleren arteriellen Blutdruck im Modell der sexuellen Erregung beim anästhesierten Hasen. Diese Grafik zeigt die typischen Wirkungen der vasoaktiven Wirkstoffe und die zur Untersuchung des vaginalen Blutflusses auf den mittleren arteriellen Druck bei einem anästhesierten Hasen verwendeten Stimulationsparameter. Diese beobachteten Wirkungen sind typisch für die bei allen geprüften Tieren festgestellten Trends. VIP induzierte eine signifikante Abnahme des mittleren arteriellen Druckes, während die Pelvisnerven-Stimulation, Kontroll-Infusionen von Hepsalin oder Inhibitoren von PDEcAMP oder NEP keine Wirkung auf den Blutdruck haben. Man bemerke, dass die mit den VIP Infusionen zusammenhängende Reduktion des Blutdrucks auch mit einer starken Erhöhung der Herzfrequenz einhergeht.
  • 4: – Die Aktivierung des cAMP/Adenylatcyclase Pfads ahmt die VIP-vermittelte Vasorelaxation und Relaxation der glatten Muskeln im vaginalen Gewebe nach. 4a zeigt, dass eine Infusion von Forskolin (40 nmol/kg iv Bolus, ein cAMP-Mimetikum) signifikante Erhöhungen des vaginalen Blutflusses induziert. Man bemerke, dass die Amplitude und Dauer der Antwort zu der durch VIP (20.0 μg/kg, iv Bolus) induzierten ähnlich ist. Interessanterweise haben die Wirkungen auf den Blutfluss eine längere Wirkungsdauer auf die äussere Vaginalwand. Alle Veränderungen wurden unter Verwendung von Laser-Doppler-Verfahren bestimmt. 4b zeigt, dass sowohl VIP (0.1 μM) als auch Forskolin (10 μM) die intrazellulären Konzentrationen von cAMP signifikant über die basalen Spiegel in der Hasenvagina erhöht. 4c zeigt, dass Forskolin potente Relaxationen von präkontrahierten (1 μM Phenylephrin) Hasenvaginastreifen induziert mit einem IC50 ~ 300 nM. Alle Veränderungen wurden unter Verwendung von in-vivo-Laser-Doppler-Verfahren, biochemischen cAMP-Enzym-Immunoassays oder durch in-vitro-Gewebe-Relaxation quantifiziert.
  • 5: – Die Infusion von VIP erhöht den klitoralen Blutfluss, und die Aktivierung des cAMP/Adenylatcyclase Pfads ahmt die VIP-vermittelte klitorale Vasorelaxation im Modell der sexuellen Erregung beim anästhesierten Hasen nach. Die Infusion von VIP (60–200 μg/kg) induziert eine konzentrationsabhängige Erhöhung des klitoralen Blutflusses. Eine 115%-ige Erhöhung des klitoralen Blutflusses wurde nach einer iv-Infusion von 200 μg/kg VIP beobachtet. Diese Wirkungen von VIP auf den klitoralen Blutfluss können durch eine Infusion des cAMP-Mimetikums Forskolin (FSK, 40 nmol/kg iv-Bolus) nachgeahmt werden. Eine 156%-ige Erhöhung des klitoralen Blutflusses wurde nach einer iv-Infusion von 40 nmol/kg Forskolin beobachtet. Alle Erhöhungen waren gegenüber den Kontroll-Infusionen (Hepsalin) signifikant erhöht. Man bemerke, dass die Amplitude der Antwort ähnlich zu der durch VIP (200 μg/kg, iv-Bolus) induzierten ist und mit den beim vaginalen Blutfluss in 2 und 4 beobachteten vergleichbar ist. Alle Veränderungen wurden unter Verwendung von in-vivo-Laser-Doppler-Verfahren quantifiziert und waren im Vergleich zu Vehikel-Infusionen (Hepsalin) signifikant erhöht.
  • 6: – Ein selektiver Inhibitor von NEP EC 3.4.24.11 erhöht die unterleibsnervenstimulierten (PNS) Erhöhungen des vaginalen Blutflusses im Modell der sexuellen Erregung beim anästhesierten Hasen. Wiederholte PNS in Intervallen von 15 Minuten induzieren reproduzierbare Erhöhungen des vaginalen Blutflusses (weisser Balken). Die Verabreichung eines NEP-Inhibitors (grauer Balken) verstärkte die durch submaximale Stimulationsfrequenzen (z.B. 4Hz) maximale Erhöhung des vaginalen Blutflusses im Vergleich zu den während zeitlich übereinstimmenden Kontrollstimulationen oder mit Vehikel-Kontrollen beobachteten Erhöhungen (schraffierter Balken). Die folgenden dosisabhängigen Verstärkungen wurden beobachtet: 0.3 mg/kg iv induzierte eine 40%-ige Erhöhung und 1.0 mg/kg iv induzierte eine 91%-ige Erhöhung (Mittelwert n=3). Der NEP-Inhibitor hatte keine Wirkung auf den basalen (nicht stimulierten) vaginalen Blutfluss (Daten nicht dargestellt). Alle Veränderungen wurden unter Verwendung von Laser-Doppler-Verfahren bestimmt.
  • 7: – Selektive Inhibitoren von NEP EC 3.4.24.11 verstärken die VIP-induzierten Erhöhungen des vaginalen Blutflusses im Modell der sexuellen Erregung beim anästhesierten Hasen. Wiederholte Infusionen von VIP in Intervallen von 30 Minuten induzieren reproduzierbare Erhöhungen des vaginalen Blutflusses (siehe 2b). Ein NEP-Inhibitor potenziert sowohl die Amplitude und verlängert auch die Dauer des verstärkten Blutflusses wenn diese Erhöhungen durch submaximale Dosen von VIP, z.B. 6.0 μg/kg, induziert werden. Bei Dosierungen von VIP, welche maximale Erhöhungen im vaginalen Blutfluss induzieren, z.B. 60 μg/kg, potenzieren NEP-Inhibitoren nur die Dauer des verstärkten vaginalen Blutflusses. Die VIP-induzierte Erhöhungen in der Gegenwart eines NEP-Inhibitors sind als geschlossene Dreiecke dargestellt, während die Kontroll-VIP-Antworten als offene Dreiecke dargestellt sind. Eine Kontroll-Infusion von Hepsalin hat keine Wirkung auf die Amplitude der Antworten. Alle Veränderungen wurden unter Verwendung von Laser-Doppler-Verfahren bestimmt.
  • 8: – Ein selektiver Inhibitor von PDEcAMP vom Typ 2 verstärkt die unterleibsnervenstimulierten (PNS) Erhöhungen des vaginalen Blutflusses im Modell der sexuellen Erregung beim anästhesierten Hasen. Wiederholte PNS in Intervallen von 15 Minuten induzieren reproduzierbare Erhöhungen des vaginalen Blutflusses (weisse Quadrate). Die Verabreichung eines PDEcAMP Inhibitors vom Typ 2 verstärkte die durch submaximale Stimulationsfrequenzen induzierte maximale Erhöhung des vaginalen Blutflusses (schwarze Quadrate; bei 4Hz) im Vergleich zu den während zeitlich übereinstimmenden Kontrollstimulationen beobachteten Erhöhungen (offene Quadrate). Eine Infusion des PDE2-Inhibitors (500 μg/kg) induzierte eine 86.8±21.9%-ige Verstärkung des vaginalen Blutflusses (Mittelwert ± sem n=2). Alle Veränderungen wurden unter Verwendung von Laser-Doppler-Verfahren bestimmt.
  • 9: – Selektive Inhibitoren von PDEcAMP vom Typ 2 verstärken die VIP-induzierten Erhöhungen des vaginalen Blutflusses im Modell der sexuellen Erregung beim anästhesierten Hasen. Wiederholte Infusionen von VIP in Intervallen von 30 Minuten induzieren reproduzierbare Erhöhungen des vaginalen Blutflusses (siehe 2b). Ein selektiver PDEcAMP Inhibitor vom Typ 2 (25 μg/kg iv-Bolus) potenziert die Dauer des durch VIP (60 μg/kg iv-Bolus) induzierten erhöhten vaginalen Blutflusses. VIP-induzierte Erhöhungen in der Gegenwart eines PDEcAMP-Inhibitors sind als geschlossene Dreiecke dargestellt, während die Kontroll-VIP-Antworten als offene Dreiecke dargestellt sind. Eine Kontroll-Infusion von Hepsalin hatte keine Wirkung auf die Amplitude der Antworten. Alle Veränderungen wurden unter Verwendung von Laser-Doppler-Verfahren bestimmt.
  • 10: – Ein selektiver Antagonist von NPY-Y1-Rezeptoren verstärkt die unterleibsnervenstimulierten (PNS) Erhöhungen des vaginalen Blutflusses im Modell der sexuellen Erregung beim anästhesierten Hasen. Wiederholte PNS in Intervallen von 15 Minuten induzieren reproduzierbare Erhöhungen des vaginalen Blutflusses (Daten nicht dargestellt). Die Verabreichung eines NPY-Y1-Antagonisten (grauer Balken) verstärkte die durch submaximale Stimulationsfrequenzen (z.B. 4Hz) induzierte maximale Erhöhung des vaginalen Blutflusses im Vergleich zu den während den zeitlich übereinstimmenden Kontrollstimulationen oder mit Vehikelkontrollen beobachteten Erhöhungen (schraffierter Balken). Die folgenden dosisabhängigen Verstärkungen wurden beobachtet: 0.01 mg/kg iv induzierte eine 15.8±19.6%-ige Erhöhung, 0.03 mg/kg iv induzierte eine 35.1±17.17%-ige Erhöhung, 0.10 mg/kg iv induzierte eine 60.1±16.9%-ige Erhöhung und 0.3 mg/kg iv induzierte eine 91.9±27.4%-ige Erhöhung (Mittelwert ± sem n=3). Der NPY-Y1-Antagonist hatte keine Wirkung auf den basalen (nicht stimulierten) vaginalen Blutfluss (Daten nicht dargestellt). Alle Veränderungen wurden unter Verwendung von Laser-Doppler-Verfahren bestimmt.
  • 11 liefert eine Übersichtsgrafik für einige der hier angegebenen Daten, wobei gezeigt wird, dass die Wirkstoffe aufgrund der Potenzierung der endogenen cAMP-Spiegel sehr nützlich zur Erhöhung des vaginalen Blutflusses sind.
  • 12: – Ein selektiver Inhibitor von NEP EC 3.4.24.11 verstärkt die unterleibsnervenstimulierten (PNS) Erhöhungen des klitoralen Blutflusses im Modell der sexuellen Erregung beim anästhesierten Hasen. Die Verabreichung eines NEP-Inhibitors (graue Balken) verstärkte die durch submaximale Stimulationsfrequenzen (z.B. 4Hz) induzierte maximale Erhöhung des klitoralen Blutflusses im Vergleich zu den während der zeitlich übereinstimmenden Kontrollstimulationen oder mit Vehikelkontrollen beobachteten Erhöhungen (schraffierter Balken). Die folgenden dosisabhängigen Verstärkungen wurden beobachtet: 1.0 mg/kg iv induzierte eine 1131%-ige Erhöhung (Mittelwert n=3). Der NEP-Inhibitor hatte keine Wirkung auf den basalen (nicht stimulierten) klitoralen Blutfluss. Alle Veränderungen wurden unter Verwendung von Laser-Doppler-Verfahren ermittelt.
  • EIN ASSAY ZUR MESSUNG DER cAMP AKTIVITÄT/SPIEGEL
  • Messung von cAMP aus Proben von vaginalem Gewebe unter Verwendung eines Biotrak cAMP Enzym-Immunoassay (EIA) Kits (Amersham Life Sciences RPN 225).
  • Die cAMP-Spiegel werden mittels EIA in Proben von vaginalem Gewebe gemessen. Der EIA beruht auf der Kompetition zwischen nicht markiertem cAMP und einer fixen Menge von mit Peroxidase markiertem cAMP für eine beschränkte Menge von cAMP-spezifischem Antikörper.
  • 1. MATERIALIEN
  • Alle Materialien wurden, sofern nicht anders angegeben, von Amersham Life Science cAMP EIA Kit (RPN 225) bezogen.
    • 1.1 Mikrotiter-Platte: Platte mit 96 Vertiefungen, bedeckt mit Esel-anti-Hasen-IgG.
    • 1.2 Assay-Puffer: 0.05 M Natriumacetat-Puffer pH 5.8, der nach Rekonstitution 0.02% Rinderserumalbumin und 0.5% Konservierungsmittel enthält. Die Inhalte der Flaschen werden in einen Messzylinder unter Verwendung von 3 × 15 ml destilliertem Wasser übergeführt. Das endgültige Volumen wird dann auf 500 ml eingestellt.
    • 1.3 cAMP-Standard (für Acetylierungsverfahren). cAMP bei 10.24 pmol/ml in 0.05 M Acetat-Puffer pH 5.8, der nach Rekonstitution 0.02% Rinderserumalbumin und 0.5% Konservierungsmittel enthält. Standard wird für die Verwendung in 2.5 ml des Assay-Puffers gelöst.
    • 1.4 Antiserum. Anti-cAMP-Antikörper in 0.05 M Acetat-Puffer pH 5.8. der nach Rekonstitution 0.02% Rinderserumalbumin und 0.5% Konservierungsmittel enthält. Vor der Verwendung wird der Antikörper mit 11 ml Assay-Puffer verdünnt und durch sanftes Umkippen zum Auflösen der Inhalte gemischt.
    • 1.5 cAMP-Konjugat. cAMP Meerrettich Peroxidase in 0.05 M Acetat-Puffer pH 5.8, der nach Rekonstitution 0.02% Rinderserumalbumin und 0.5% Konservierungsmittel enthält. Vor der Verwendung wird die Lösung mit 11 ml Assay-Puffer verdünnt und durch sanftes Umkippen zum Auflösen der Inhalte gemischt.
    • 1.6 Wasch-Puffer. 0.01 M Phosphat-Puffer pH 7.5, der nach Rekonstitution 0.05% (v/v) TweenTM 20 enthält. Die Inhalte der Flaschen werden in einen Messzylinder unter Verwendung von 3 × 15 ml destilliertem Wasser übergeführt. Das endgültige Volumen wird dann auf 500 ml eingestellt.
    • 1.7 TMB-Substrat. 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB)/Wasserstoffperoxid in 20% (v/v) Dimethylformamid.
  • Gebrauchsfertig.
    • 1.8 Acetylierungsreagens. 2 ml Essigsäureanhydrid, 4 ml Triethylamin, hergestellt nach Bedarf.
    • 1.9 Schwefelsäure (1 M). 1 M Schwefelsäure wird aus einer 18 M Stammlösung (BDH) hergestellt. 1.11 ml der Säure werden zu 18.8 ml destilliertem Wasser zugegeben.
  • 2. SPEZIFISCHE AUSRÜSTUNG
    • 2.1 Wegwerfbare 5 ml Reagenzgläser
    • 2.2 Spektrophotometrischer Plattenleser (Spectra max 190)
    • 2.3 Mikrotiter Plattenschüttler (Luckham R100)
  • 3. METHODEN
    • – Gewebeproben-Herstellung. Die Gewebe wurden in 5 ml Proben einer physiologischen Salzlösung mit der relevanten Vorbehandlung, z.B. Agonisten, cAMP-Mimetika etc., behandelt. Nach der Behandlung wurden die Proben in flüssigem Stickstoff schnellgefroren und dann unter Verwendung eines Hammers zertrümmert. Das Pulver wurde in ein Zentrifugenrohr gegeben und es wurde 1 ml 0.5M eiskalter Perchlorsäure (PCA) zugegeben. Die Probe wurde durch Verwirbeln gemischt und während 1 Std. auf Eis belassen.
    • – cAMP-Extraktion aus Gewebeproben. Die Proben wurden während 5 Min. bei 10000 g bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde entfernt und in anderen Zentrifugenrohre gegeben. Das Pellet wurde für die Protein-Analyse bei –80°C aufbewahrt. Die Überstand-Proben wurden dann auf pH ~ 6 unter Verwendung von K3PO4 neutralisiert. Zentrifugieren während 5 Min bei 10000 g bei 4°C. Der Überstand wird wiedergewonnen und 4 Mal mit 5 Volumina (5 ml) wassergesättigtem Diethylether gewaschen. Die obere Etherphase sollte nach jedem Waschen verworfen werden. Die wässrige Phase wird in ein kurzes dünnes Glasrohr übergeführt und unter einem Stickstoffstrom bei 60°C getrocknet. Der getrocknete Extrakt wird in 1 ml des Assay-Puffers gelöst und bis zum Gebrauch im Kühlschrank gelagert (oder er kann tiefgefroren werden).
    • – Stammreagenzien werden auf Raumtemperatur äquilibriert, und dann werden Arbeitslösungen hergestellt.
    • – cAMP-Standards werden in Glasrohren, die als 2, 4, 8, 16, 32, 64, 128, 256 und 512 fmol markiert sind, hergestellt. Dies wird durch Zugabe von 1 ml des Assay-Puffers zu allen Rohren mit Ausnahme des 512 fmol Standards erreicht. 1 ml Acetylierungsstandard (10.24 pmol/ml) wird dann zu den beiden obersten Standards (256 und 512 fmol) zugegeben. Der 256 fmol Standard wird verwirbelt und 1 ml wird zum 128 fmol Standard übergeführt. Dies wird fortgesetzt bis zum 2 fmol Standard, wo 1 ml Lösung entsorgt wird. Es wird noch ein 1 ml Assay-Puffer enthaltendes Nullstandardrohr bereitgestellt.
    • – Gewebeextraktproben werden auf Eis aufgetaut (falls nötig) und 1 zu 100 (10 μl Proben auf 990 μl Assay-Puffer) in beschrifteten Glasrohren verdünnt.
    • – Das cAMP wird für alle Standards und Proben in einer Kapelle durch Zugabe von 100 μl Acetylierungsreagens acetyliert, welches entlang der Seite des Rohres zugegeben wird, woraufhin umgehend verwirbelt wird.
    • – 50 μl von allen Standards und Proben werden in die geeigneten Vertiefungen der Platte mit 96 Vertiefungen gegeben, und 150 μl Assay-Puffer werden in Vertiefungen für die nichtspezifische Bindung(NSB) gegeben.
    • – 100 μl Antiserum werden in alle Vertiefungen mit Ausnahme derjenigen für Blindproproben (B) und NSB gegeben und anschliessend während 2 Stunden bei 3–5°C inkubiert.
    • – Nach der Inkubation werden 100 μl cAMP-Peroxidase-Konjugat in alle Vertiefungen mit Ausnahme derjenigen für B zugegeben und anschliessend während 1 weiteren Stunde bei 3-5°C inkubiert.
    • – Die Platten werden durch kopfüber stellen geleert und mit Löschpapier betupft, und anschliessend wird jede Vertiefung viermal mit 400 μl Wasch-Puffer gewaschen. Nach jedem Waschen werden die Platten wieder betupft, um sicherzustellen, dass sämtlicher Wasch-Puffer entfernt ist. 200 μl TMB werden dann sofort in alle Vertiefungen verteilt.
    • – Die Platten werden vor Zugabe von 100 μl einer 1 M Schwefelsäure in alle Vertiefungen während 30 Minuten bei Raumtemperatur auf einen Plattenschüttler gestellt. Die optische Dichte wird auf dem Spectra max 190 bei 450 nm innerhalb von 30 Minuten gemessen.
  • 4. STANDARDS
  • Bei jedem Assay werden die folgenden Standardrohre bereitgestellt:
  • 4.1 Zugabe eines Standards in Assay-Puffer
  • Eine bekannte Menge von cAMP wird zum Assay-Puffer gegeben, um die Effizienz des Assays zu bestimmen. 70 pmol/ml cAMP werden zum Assay-Puffer zugegeben, welcher zu 35 fmol/Vertiefung im Assay äquivalent ist, was in der Mitte der Dosis-Antwort-Kurve liegt.
    Bildung von 1 ml Standard: 68.4 μl 521 fmol/Vertiefung Standard
    931.6 μl Assay-Puffer
  • 4. Wirkungen der Verbindungen auf die Platte
  • Standards werden bereitgestellt, um zu bestimmen, ob die in den funktionellen Studien verwendete Verbindung irgend eine Wirkung auf die Platte mit 96 Vertiefungen hat oder das Bindungsverhalten von cAMP beeinflusst. Dies umfasst:
    • – Zugabe der Verbindung in Assay-Puffer alleine, um die Wirkungen der Verbindung direkt auf die Platte zu bestimmen.
    • – Zugabe der Verbindung in Plasma mit basalem Spiegel von cAMP, um die Wirkungen der Verbindung auf das Bindungsverhalten von cAMP auf die Platte zu bestimmen.
  • 5 nM Konzentrationen der Verbindung werden in jeden Standard gegeben. Es wurden 5 nM gewählt, weil in der Vergangehnheit die Gesamtwirkstoffspiegel am Ende der Infusion jeweils ungefähr 150–300 nM betrugen. Die Proben werden vor dem Testen um 1:100 verdünnt, sodass 5 nM auch höhere als erwartete Gesamtwirkstoffkonzentrationen am Ende der Infusion abdeckt sind.
  • 5. BERECHNUNGEN
  • Der Spectra max Plattenleser misst die optische Dichte (OD) bei 450 nm.
  • Die Standardkurve wird durch Auftragen von %B/Bo (y-Achse) gegen cAMP fmol/Vertiefung (x-Achse) auf dem Spectra max erzeugt.
    %B/BO (% gebunden) für jede Probe und Standard werden wie folgt berechnet:
    Bo = Nullstandard (siehe Methoden 3.2)
  • Figure 01740001
  • Der Wert in fmol/Vertiefungsvolumen kann dann für jede Probe direkt aus der Standardkurve abgelesen werden. Die Werte werden dann auf pmol/ml umgerechnet, und anschliessend wird der Mittelwert für jedes Proben-Paar genommen.
  • Umrechnung der Werte aus fmol/Vertiefung zu pmol/ml:
    fmol auf pmol = man teile durch 1000
    Volumen in der Vertiefung = 50 μl .... So (× 1000)/50 50
  • Die Probe wird 1/100 verdünnt, somit gilt gesamthaft = 1 × 1000/1000 × 100/50 = 2
  • Demnach werden alle fmol/Vertiefungs-Werte mit 2 multipliziert um daraus pmol/ml zu erhalten.
  • TIERTESTMODELL
  • DIE POTENZIERUNG DER WIRKUNGEN VON ZYKLISCHEM ADENOSIN-3',5'-MONOPHOSPHAT (cAMP) FÜHRT ZU EINER ERHÖHUNG DES VAGINALEN BLUTFLUSSES IM MODELL DER SEXUELLEN ERREGUNG BEI ANÄSTHESIERTEN HASEN
  • 1.0 Ziele
    • 1. Entwicklung und Validierung eines Tiermodells der weiblichen sexuellen Erregung.
    • 2. Identifikation des (der) für die Regulierung des genitalen Blutflusses im anästhesierten Hasen verantwortlichen Mechanismus(en).
    • 3. Identifikation von möglichen Ansätzen zur Verstärkung des vaginalen und klitoralen Blutflusses.
    • 4. Untersuchung des(der) Mechanismus(en), welche der Relaxation der glatten Muskeln in der Vagina zugrunde liegen und Identifikation von möglichen Ansätzen zur Verstärkung der vaginalen Relaxation.
  • 2.0 Einführung
  • Die normale sexuelle Erregungsantwort besteht aus einer Anzahl von physiologischen Antworten, die während der sexuellen Erregung beobachtet werden. Diese Veränderungen, wie das vaginale, labiale und klitorale Anschwellen ergeben sich aus Erhöhungen des genitalen Blutflusses. Das Anschwellen führt über die Plasma-Transsudation zu einer erhöhten vaginalen Lubrikation, zu einer erhöhten vaginalen Dehnbarkeit (Relaxation der glatten Muskeln der Vagina) und zu Erhöhungen in der vaginalen und klitoralen Sensibilität.
  • Die weibliche sexuelle Erregungsstörung (FSAD) ist eine weit verbreitete sexuelle Störung, die bis zu 40% der prä-, peri- und postmenopausalen (±HRT) Frauen betrifft. Die primären Folgen der FSAD sind ein verringertes genitales Anschwellen, die sich als Mangel der vaginalen Lubrikation und als Mangel an lustvollen genitalen Empfindungen manifestieren. Sekundäre Folgen umfassen ein verringertes sexuelles Begehren, Schmerzen während des Geschlechtsverkehrs und Schwierigkeiten, den Orgasmus zu erreichen. Die häufigste Ursache von FSAD ist ein verringerter genitaler Blutfluss, welcher zu einem verringerten vaginalen, labialen und klitoralen Anschwellen führt (Park, 1997; Goldstein, 1998; Berman, 1999a, Werbin, 1999).
  • Wie hier ausgeführt, bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Mittel zur Wiederherstellung oder Potenzierung der normalen sexuellen Erregungsantwort bei an FSAD leidenden Frauen, durch Erhöhung des genitalen Blutflusses.
  • In unseren Studien wurde cAMP (cyclisches Adenosin-3',5'-Monophosphat) als Mediator der vaginalen Vasorelaxation zur Messung von kleinen Veränderungen im genitalen Blutfluss unter Verwendung von Laser-Doppler-Verfahren identifiziert. Durch Verwendung eines Inhibitors des VIP-Metabolismus (ein NEP EC3.4.24.11 Inhibitor) wurde auch gezeigt, dass die während der Pelvisnervenstimulation beobachteten Erhöhungen im genitalen Blutfluss (d.h. die sexuelle Erregung) durch VIP vermittelt werden. Dies beruhte auf der Entwicklung eines Tiermodells der sexuellen Erregung und auf dem Nachweis, dass die Daten die während der weiblichen sexuellen Erregung beobachteten physiologischen Veränderungen widerspiegeln. Das Modell wurde dann zur Identifikation und Validierung von Mechanismen verwendet, die den genitalen Blutfluss erhöhen, z.B. die direkte oder indirekte Potenzierung der cAMP-vermittelten Vasorelaxation.
  • 3.0 Methoden
  • 3.1 Anästhesie-Protokoll
  • Weibliche Neuseeland Hasen (~ 2.5 kg) wurden mit einer Kombination von Medetomidin (DomitorTM) 0.5 ml/kg i.m. und Ketamin (VetalarTM) 0.25 ml/kg i.m. prämediziert, während die Sauerstoffaufnahme über eine Gesichtsmaske aufrechtgehalten wurde. Die Hasen wurden unter Verwendung eines PortexTM kragenlosen Endotrachealtubus 3 ID tracheotomisiert, mit dem Ventiliergerät verbunden und bei einer Ventilationsrate von 30–40 Atemzügen pro Minute mit einem ungefähren Atemvolumen von 18–20 ml gehalten, wobei ein maximaler Druck in den Atemwegen von 10 cm H2O eingehalten wurde. Die Anästhesie wurde dann auf Isofluran gewechselt und die O2-Beatmung mit 2 l/Min. fortgesetzt. Die rechte marginale Ohrvene wurde unter Verwendung eines 23G oder 24G Katheters kanüliert und eine Lactated Ringer-Lösung mit 0.5 ml/Min. perfundiert. Der Hase wurde während der invasiven Chirurgie auf 3% Isofluran gehalten, wogegen zur Aufrechterhaltung der Anästhesie auf 2% reduziert wurde.
  • 3.2 Kanülierung der Gefässe
  • Die linke Leistenregion des Hasens wurde rasiert, und es wurde ein vertikaler Schnitt mit einer Länge von ungefähr 5 cm entlang des Schenkels vorgenommen. Die Femoralisvene und -arterie wurden exponiert, isoliert und dann mit einem PVC-Katheter (17G) für die Infusion der Wirkstoffe und Verbindungen kanüliert. Die Kanülierung wurde für die Femoralisarterie wiederholt, wobei der Katheter zu einer Tiefe von 10 cm eingeführt wurde, um sicherzustellen, dass der Katheter die Abdominalaorta erreichte. Dieser arterielle Katheter wurde mit einem Gould-System verbunden, um den Blutdruck aufzuzeichnen. Proben für die Blutgasanalyse wurden ebenfalls über den arteriellen Katheter entnommen. Es wurden systolische und diastolische Blutdruckwerte gemessen und der mittlere arterielle Druck unter Verwendung der Formel (diastolisch × 2 + systolisch)/3 berechnet. Die Herzfrequenz wurde über das Pulsoxymeter und das Po-ne-mah-Datenerfassungs-Softwaresystem (Ponemah Physiology Platform, Gould Instrument Systems Inc) gemessen.
  • 3.3 Stimulation des Pelvisnervs
  • Es wurde ein ventraler mittiger Schnitt in die abdominale Höhle gemacht. Der Schnitt hatte eine Länge von ungefähr 5 cm, genau oberhalb der Schamgegend. Das Fett und die Muskeln wurden stumpf abgetrennt, um den hypogastrischen Nerv, welcher die Körperhöhle hinunter verläuft, freizulegen. Es war entscheidend, nahe bei der Seitenkurve der Schamwand zu bleiben, um eine Beschädigung der oberhalb der Schamgegend liegenden Femoralisvene und -arterie zu vermeiden. Der Ischiasnerv und die Pelvisnerven liegen tiefer und sind nach der weiteren Auftrennung auf der dorsalen Seite des Hasens lokalisiert. Nachdem der Ischiasnerv identifiziert ist, wurde der Pelvisnerv ohne weiteres lokalisiert. Der Begriff Pelvisnerv wird hier lose verwendet; entsprechende Anatomiebücher identifizieren die Nerven nicht genügend detailliert. Jedenfalls verursacht die Stimulation des Nervs eine Erhöhung des vaginalen und klitoralen Blutflusses und eine Innervierung der Pelvisregion. Der Pelvisnerv wurde vom umgebenden Gewebe freigelegt und eine Harvard bipolare Stimulationselektrode wurde um den Nerv platziert. Der Nerv wurde leicht angehoben um eine gewisse Spannung zu geben, dann wurde die Elektrode in der Stellung gesichert. Ungefähr 1 ml leichtes Paraffinöl wurde um den Nerv und die Elektrode gegeben. Dieses wirkt als schützendes Schmiermittel für den Nerv und verhindert die Kontamination der Elektrode mit Blut. Die Elektrode wurde mit einem Grass S88 Stimulator verbunden. Der Pelvisnerv wurde unter Verwendung der folgenden Parameter stimuliert: 5V, Pulsbreite 0.5 ms, Dauer des Stimulus 10 Sekunden und Frequenzbereich von 2 bis 16 Hz. Reproduzierbare Antworten wurden erhalten, wenn der Nerv alle 15–20 Minuten stimuliert wurde.
  • Zu Beginn von jedem Experiment wurde eine Frequenz-Antwort-Kurve bestimmt, um die zur Verwendung als submaximale Antwort am besten geeignete Frequenz, normalerweise 4Hz, zu bestimmen. Die zu prüfende(n) Verbindung(en) wurde(n) über die Femoralisvene unter Verwendung einer Harvard 22 Infusionspumpe infundiert, was einen kontinuierlichen 15-minütigen Stimulationszyklus ermöglichte.
  • 3.4 Positionierung der Laser-Doppler-Sonden
  • Es wurde ein ventraler mittiger Schnitt am kaudalen Ende der Schamgegend gemacht, um die Schamgegend freizulegen. Bindegewebe wurde entfernt, um die Tunica der Klitoris freizulegen und um sicherzustellen, dass die Wand frei von kleinen Blutgefässen war. Die äussere Vaginalwand wurde durch Entfernen von sämtlichem Bindegewebe ebenfalls freigelegt. Eine Laser-Doppler-Flusssonde wurde 3 cm in die Vagina eingeführt, so dass die Hälfte des Sondenschaftes immer noch sichtbar war. Eine zweite Sonde wurde so positioniert, dass sie gerade über der äusseren Klitoriswand lag. Die Position dieser Sonden wurde dann verstellt, bis ein Signal erhalten wurde. Eine zweite Sonde wurde gerade über der Oberfläche eines Blutgefässes auf der äusseren Vaginawand platziert. Beide Sonden wurden in ihrer Position festgeklemmt.
  • Die vaginalen und klitoralen Blutflüsse wurde entweder als Zahlenwerte direkt aus dem Flussmeter unter Verwendung der Po-ne-mah-Datenerfassungs-Software (Ponemah Physiology Platform, Gould Instrument Systems Inc) oder indirekt aus der Aufzeichnung des Gould Kartenschreibers erfasst. Eine Kalibrierung wurde zu Beginn des Experiments (0–125 ml/Min./100 g Gewebe) durchgeführt.
  • 3.5 Infusion des vasoaktiven intestinalen Peptides (VIP)
  • Die infundierten Dosierungen von VIP (Bachem, H-3775) waren 2.0, 6.0, 20.0, 60.0 μg/kg iv und wurden in einem Volumen von 0.5 ml physiologischer Kochsalzlösung infundiert. VIP wurde unter Verwendung einer Harvard 22 Pumpe infundiert, wobei mit 500 μl/Min. über ein 3-Wege-Ventil in die Femoralisvene infundiert wurde. Nach der VIP-Infusion wurde der Katheter mit heparinisierter physiologischer Kochsalzlösung (Hepsalin) gespült, so dass kein VIP mehr im Katheter verblieb.
  • Für Experimente mit Verwendung von VIP-Infusionen wurde eine initiale sensitivierende Dosis-Antworts-Kurve (2–60 μg/kg) benötigt, um reproduzierbare Antworten erhalten zu können. Als negative Kontrolle wurde eine initiale Infusion von Hepsalin (50 Ul/ml) infundiert.
  • 3.6 Infusion von Inhibitoren
  • NEP-(Neutrale Endopeptidase EC3.4.24.11)-Inhibitoren, Phosphodiesterase-Typ 5-(PDE5)-Inhibitoren und NPY-Y1-Antagonisten wurden in physiologischer Kochsalzlösung oder 5%-iger Glucose-Lösung (200 μl 50% Glucose in 1.8 ml Wasser für Injektionszwecke) hergestellt. PDEcAMP-Inhibitoren wurden in einer 40%-igen Ethanol-Lösung (200 μl 50% Glucose in 1.8 ml Wasser/Ethanol zur Injektion) gelöst. Die Inhibitoren und Vehikelkontrollen wurden mit derselben Geschwindigkeit wie VIP infundiert. Die NEP-Inhibitoren wurden während 30 Minuten vor einer VIP-Dosis-Antworts-Kurve belassen, während die NEP-Inhibitoren, NPY-Y1-Rezeptor-Antagonisten und PDEcAMP-Inhibitoren während 15 Minuten vor der Pelvisnerv-Stimulation belassen wurden.
  • 3.7 Messung der Relaxation der glatten Muskeln in isolierter Hasenvagina
    • 3.7 (a). Hasenvagina in-vitro-Herstellung: Weibliche weisse Neuseeland Hasen (2.0–3.0 kg) wurden durch Genickbruch getötet. Die abdominale Höhle wurde eröffnet und die Vagina exzidiert. Gewebestreifen wurden longitudinal in 5 ml silanisierten Organkammern von Welsey Co. mittels geflochtener Seidennähte (6/0-Mass) mit einer initialen Ruhespannung von 1.5 g befestigt und in einem bei 37°C gehaltenem und mit 95%O2/5%CO2 begastem Krebs-Bicarbonat-Puffer gelagert. Die obere Ligatur von jedem Gewebestreifen wurde an einen Kraft-Verschiebungs-Transducer mit einem 10 g Messbereich angebracht, und so wurden Veränderungen der isometrischen Kraft gemessen und unter Verwendung eines DART In-vitro-Datenerfassungssystems aufgenommen. Die Gewebe wurden während 1.5 Stunden äquilibriert und regelmässig mit Krebs-Puffer gewaschen.
    • 3.7 (b). Durch vasoaktives intestinales Peptid induzierte Relaxation von Hasenvagina: Jedes Gewebe wurde unter Verwendung einer 1 μM Badkonzentration von Phenylephrin kontrahiert. Nachdem die kontraktile Antwort ein stabiles Plateau (~ 15 Minuten) erreichte, wurde VIP kumulativ in log-Einheiten zur Organkammer zugegeben, so dass sich Konzentrationen von 0.1 – 100 nM ergeben. Die Relaxationsantworten wurden 5 Minuten nach der Zugabe jeder Konzentration von VIP gemessen; die maximale Relaxation war zu diesem Zeitpunkt erreicht worden. Die Gewebe erhielten dann entweder einen Testwirkstoff (z.B. NEP- oder PDE-Inhibitor) oder DMSO-Vehikel (zeitlich übereinstimmende Kontrolle).
    • 3.7 (c). Analyse der Daten von VIP-Relaxations-Experimenten: Für jede VIP-Konzentrations-Relaxations-Antworts-Kurve wurden die durch VIP induzierten Relaxationsantworten als prozentualer Anteil der maximalen durch Phenylephrin induzierten Kontraktion ausgedrückt. Diese Werte wurden dann gegen die log VIP-Konzentration aufgezeichnet, und es wurden sigmoidale Kurven angepasst. Zum Zweck der Kurvenanpassung wurde die minimale Relaxationsantwort auf 0% beschränkt, während die maximale Relaxationsantwort frei angepasst werden konnte. Es wurde die zur Erzeugung einer 50% Relaxation der Phenylephrin-Kontraktion (EC50 PE) benötigte Konzentration von VIP bestimmt.
    • 3.7 (d). Durch elektrisches Feld stimulierte Relaxation von Hasenvagina: Hasenvaginastreifen wurden wie im Abschnitt 3.7 (a) beschrieben hergestellt. Die Gewebestreifen wurden zwischen zwei Platinelektroden befestigt, die am oberen und unteren Ende der Organkammer ungefähr 4 cm auseinander platziert waren. Jedes Gewebe wurde unter Verwendung einer 1 μM Badkonzentration von Phenylephrin kontrahiert. Nachdem die kontraktile Antwort ein stabiles Plateau (~ 15 Minuten) erreichte, wurden die Gewebe einer der Behandlung vorangehenden, durch ein elektrisches Feld stimulierten (EFS) induzierten Relaxationskurve unterzogen. Dies wurde bei 40 – 60 Volt durchgeführt unter Verwendung von sequentiellen Frequenzen von 2, 4, 8 und 16 Hz, die als 10 Sekunden Züge von Pulsen mit einer Breite von 0.5 Millisekunden abgegeben wurden. Die Gewebe wurden zwischen jeder Frequenz (5 Minuten) auf die anfängliche, präkontraktile Spannung zurückkehren gelassen, und es wurde das Ausmass der Relaxationsantwort ermittelt.
  • Nach Vervollständigung der EFS-Antworts-Kurve vor der Behandlung wurden alle Gewebe während 15 Minuten gewaschen, wobei die Gewebe auf die anfängliche Spannung zurückkehren konnten. Die Gewebe erhielten dann entweder einen Testwirkstoff (z.B. NEP- oder PDE-Inhibitor, Stickstoffmonoxid-Synthase-[NOS]-Inhibitor) oder DMSO-Vehikel (zeitlich übereinstimmende Kontrolle). Die Gewebe wurden 15 Minuten nach der Zugabe der Verbindung oder des Vehikels erneut mit Phenylephrin (1 μM) kontrahiert, und es wurde eine EFS-induzierte Relaxations-Antworts-Kurve wie oben beschrieben bestimmt.
  • Für die EFS-Experimente wurde der Krebs-Puffer mit Atropin (10 μM) und Guanethidin (150 μM) supplementiert, um jegliche cholinerge oder adrenerge neuronale Innervation der Vagina zu vermeiden.
  • 3.8 Messung der cAMP-Spiegel in isolierter Hasenvagina
  • Messungen von cAMP-Konzentrationen wurden aus Vaginalgewebe-Extrakten unter Verwendung eines Biotrak-cAMP Enzym-Immunoassay (EIA)-Kits (Amersham Life Sciences RPN 225) durchgeführt.
  • Isolierte Vaginalgewebe-Proben wurden mit Testwirkstoffen (z.B. Forskolin oder VIP) behandelt. Nach 5 Minuten wurden die Proben unter Verwendung von flüssigem Stickstoff schnellgefroren, homogenisiert, und cAMP wurde extrahiert. Die cAMP-Spiegel wurden mittels EIA gemessen. EIA beruht auf einer Kompetition zwischen nicht markiertem cAMP und einer fixen Menge an mit Peroxidase markiertem cAMP für eine beschränkte Menge von cAMP-spezifischem Antikörper.
  • 3.9 Messung der Phosphodiesterase-(PDE)-Aktivität in isolierter Hasenvagina
  • Zytosol-Extrakte von menschlicher Vaginawand wurden von ABS Inc., Delaware (Alter der Donatorinnen 41 und 60 Jahre alt) bezogen. Die PDE-Isoenzyme wurden mittels Mono-Q-Anionenaustausch-Chromatographie aufgetrennt und beruhend auf ihrer Substrat-Selektivität, Sensitivität auf allosterische Modulatoren und selektive Inhibitoren charakterisiert. Es wurde zudem eine Western Analyse unter Verwendung von spezifischen PDE-Isoenzym-Antikörpern zum Nachweis der PDE-Expression in der menschlichen Vagina durchgeführt.
  • Sämtliche Daten werden als Mittelwert ± s.e.m. angegeben. Signifikante Veränderungen wurden unter Verwendung von Student's t-Tests identifiziert.
  • 4.0 Resultate und Diskussion
  • 4.1 Tiermodell der sexuellen Erregung
  • In unseren Studien wurde ein robustes reproduzierbares Modell der Physiologie der sexuellen Erregung entwickelt. Unter Verwendung dieses Modells mit anästhesierten Hasen ist es möglich, mit Hilfe von Laser-Doppler-Verfahren kleine Veränderungen im genitalen Blutfluss zu messen. Es wird die Stimulation des Pelvisnervs verwendet, um die neuronalen Wirkungen der sexuellen Erregung zu simulieren.
  • Es wurde gefunden, dass die Stimulation des Pelvisnervs frequenzabhängige Erhöhungen des vaginalen und klitoralen Blutflusses induziert (siehe 1). Diese Erhöhungen des basalen Blutflusses sind signifikant, und zwar sowohl bei Messung an der intravaginalen wie auch an der extravaginalen Wand. Die Stimulation des Pelvisnervs bei 2Hz induzierte eine mittlere maximale vaginale Blutflusserhöhung von 10.3±1.8, bei 4Hz 20.0±4.6, 8Hz 36.3±4.8 und 16Hz 46.6+4.7 ml/Min./100 g Gewebe (n=4); 15–20V, 0.5ms, 10s) und Erhöhungen des klitoralen Blutflusses von 14.7±3.6 bei 2Hz, 29.4±1.4 bei 4Hz und 69.7±2.1 bei 8Hz. Diese Werte sind von ähnlicher Amplitude wie die vorgängig in Studien am Menschen und in Tiermodellen der Erregung beobachteten (Berman, 1999a; Park, 1997).
  • Es wurde gefunden, dass die submaximale Stimulation des Pelvisnervs zu reproduzierbaren Erhöhungen des genitalen Blutflusses führt (z.B. ergab eine Stimulation mit 4Hz alle 15 Minuten eine mittlere Erhöhung des vaginalen Blutflusses von 8.50±0.10 ml/Min./100 g Gewebe n=8 und eine mittlere Erhöhung des klitoralen Blutflusses von 13.65±0.86 ml/Min./100 g Gewebe n=11). Diese Reproduzierbarkeit bleibt bis zu 5 Stunden erhalten. Die Reproduzierbarkeit dieser Antworten kann verwendet werden zur Untersuchung von a.) der Identität von endogenen vasoaktiven Wirkstoffen/Mechanismen, welche die genitale Anschwellung vermitteln, und b.) des Einflusses von Wirkstoffen, welche zur Erhöhung des vaginalen und/oder klitoralen Blutflusses wirksam sein könnten.
  • Es wurde gefunden, dass die Pelvisnervstimulation im anästhesierten Hasen keine nachteiligen kardiovaskulären Wirkungen hervorruft (siehe 3).
  • Der genitale Blutfluss wird während der sexuellen Erregung über eine erhöhte arterielle Blutzufuhr erhöht (Berman, 1999) – wobei die vaginale Arterie, der vaginale Zweig der Uterusarterie, die interne Pudendalarterie und die mittleren Zweige der mittleren rektalen Arterie alle an der Blutversorgung der Vagina und Klitoris beteiligt sind. Der Pelvisnerv, welcher aus den spinalen Regionen S2/S4 stammt, innerviert die weiblichen Genitalien und hat Zweige, die in der unteren Vagina, Klitoris und den damit zusammenhängenden Blutgefässen enden. Durch Stimulation des Pelvisnervs können die während der sexuellen Erregung beobachteten Wirkungen des Blutfluss stimuliert werden, d.h. eine Erhöhung des arteriellen genitalen Blutflusses. Interessanterweise widerspiegelt sich der erhöhte arterielle Blutfluss nicht in einer entsprechenden venösen Entleerung, so dass sich das Kapillarennetzwerk mit Blut anreichern kann. Das vaginale Anschwellen führt über die erhöhte Plasma-Transsudation zur vaginalen Lubrikation, und dies ist eine der ersten während der sexuellen Stimulation beobachteten Antworten im Pelvisbereich. Die Neurotransmitter, welche nach der Pelvisnerv-Stimulation oder während der sexuellen Erregung freigesetzt werden, sind zur Zeit noch nicht identifiziert. Nerven, welche Neuropeptide und andere Neurotransmitter-Kandidaten enthalten und die Vaskulatur und Mikrovaskulatur der Vagina und Klitoris innervieren, sind immunhistochemisch identifziert worden. Diese Studien weisen darauf hin, dass Calcitonin-Gen-assoziiertes Peptid (CGRP), Neuropeptid Y (NPY), Stickstoffmonoxid-Synthase (NOS), Substanz P und vasoaktives intestinales Peptid (VIP) alle in den Nerven vorliegen, welche die menschliche Vagina und Klitoris innervieren (Hoyle, 1996; Burnett, 1997; Hauser-Kronberger, 1999).
  • 4.2 Validierung des Modells der sexuellen Erregung bei anästhesierten Hasen
  • Um die unter Verwendung dieses Modells erzeugten Blutfluss-Daten auf diejenigen zu übertragen, die in einem menschlichen Modell der sexuellen Erregung beobachtet wurden, wurden unsere Daten direkt mit dem vaginalen Blutfluss und den in präklinischen Studien erhaltenen kardiovaskulären Daten verglichen.
  • Es wurde gefunden, dass die VIP-Infusion die folgenden Wirkungen im Hasen-Modell der sexuellen Erregung hat:
    • – Exogenes VIP (iv-Bolus) induziert signifikante konzentrationsabhängige Erhöhungen des vaginalen Blutflusses (siehe 2a). Diese Erhöhungen liegen signifikant über den basalen Blutflusswerten, und zwar sowohl bei Messung an der intravaginalen wie auch an der extravaginalen Wand. Der vaginale Blutfluss wurde mit einer intravenösen Verabreichung von VIP (60 μg/kg) um 24.7±3.6 ml/Min./100 g Gewebe signifikant erhöht. Der Blutfluss blieb während ungefähr 11 Minuten nach der Infusion über den Basalwerten erhöht. Niedrigere Dosierungen induzierten kleinere Erhöhungen, z.b. 6.0 μg/kg erhöhte den Blutfluss um 7.5±1.3 ml/Min./1.00 g Gewebe, und der Blutfluss blieb während 7 Minuten nach der Infusion erhöht.
    • – Wiederholte Infusionen mit ähnlichen Dosierungen von VIP (iv in Intervallen von 30 Minuten) induzieren signifikante reproduzierbare Erhöhungen des vaginalen Blutflusses (siehe 2b).
    • – VIP (iv) erhöht die Herzfrequenz signifikant und vermindert den mittleren arteriellen Blutdruck (siehe 3). Bei 6.0 μg/kg verursachte VIP (iv) eine signifikante Reduktion des mittleren arteriellen Blutdrucks um 13.2±0.7 mm Hg und eine signifikante Erhöhung der Herzfrequenz um 16±4 Schläge pro Minute.
    • – Dieses Tiermodell widerspiegelt direkt die nach der Infusion von VIP bei gesunden Freiwilligen beobachteten klinischen Daten, z.B. erhöhter vaginaler Blutfluss, verminderter Blutdruck und erhöhte Herzfrequenz. Demnach kann dieses Modell verwendet werden, um den(die) Mechanismus(en) zu untersuchen, die den während der sexuellen Erregung auftretenden physiologischen Veränderungen zugrunde liegen, und zusätzlich um neue Ansätze zur Erhöhung des vaginalen Blutflusses und demzufolge die Behandlung von FSAD zu validieren.
  • 4.3 VIP-induziert Veränderungen im vaginalen Blutfluss über die Stimulation des cAMP/Adenvlatcyclase-Pfads
  • Ottesen und Mitarbeiter zeigten, dass VIP bei gesunden Freiwilligen Erhöhungen des vaginalen Blutflusses und der Lubrikation induziert. Allerdings ist der Mechanismus, über den VIP seine Wirkungen entfaltet, unklar. In der Literatur gibt es zahlreiche Beispiele der VIP-Signalisierung über unterschiedliche second Messenger Systeme, wobei diese cGMP/Guanylatcyclase (Ashur-Fabian, 1999), Kohlenstoffmonoxid/Häm-Oxygenase (Fan, 1998) und cAMP/Adenylatcyclase (Schoeffter, 1985; Gu, 1992; Foda, 1995) umfassen. Dies wird durch einen kürzlichen Bericht verdeutlicht, welcher beschreibt, wie die relaxativen Wirkungen von VIP in der Uterusarterie durch die Freisetzung von Stickstoffmonoxid erklärt werden kann (Jovanovic, 1998). Interessanterweise gibt es auch Hinweise für VIP-modulierende NO/cGMP bei der männlichen urogenitalen Funktion (Kim, 1994), und es gibt direkte Hinweise, dass die Behandlung von menschlichen vaginalen glatten Muskeln-Zellkulturen mit VIP (0.5 μM) die cAMP-Spiegel nicht zu erhöhen vermag (Traish, 1999 ibid).
  • In dieser Studie wurde gezeigt, dass VIP über die Erhöhung der intrazellulären cAMP-Spiegel die Vasorelaxation induziert. Anhand einer Serie von funktionellen Experimenten wurde zusätzlich zur biochemischen Messung der intrazellulären cAMP-Konzentrationen der Blutfluss und die Relaxation der glatten Muskeln gemessen. Es wurde Forskolin, ein Aktivator der Adenylatcyclase oder cAMP-Mimetikum, verwendet, um die Wirkungen der Aktivierung des cAMP/Adenylatcyclase-Pfads nachzuahmen. VIP und Forskolin haben identische Wirkungen auf die physiologischen Wirkungen der Erregung auf den vaginalen Blutfluss und die Relaxation.
  • VIP (20 μg/kg) und Forskolin (40 nmol/kg) induzieren signifikante Erhöhungen des vaginalen Blutflusses um 13.2 beziehungsweise 12.7 ml/Min./100 mg Gewebe (siehe 2a und 4a). Diese durch VIP und Forskolin induzierten Veränderungen in der Amplitude waren nicht signifikant unterschiedlich. Diese Erhöhungen liegen signifikant über den basalen Blutflusswerten, und zwar sowohl bei Messung an der intravaginalen wie auch an der extravaginalen Wand.
  • Sowohl VIP (0.1 μM) als auch Forskolin (10 μM) erhöhten die intrazellulären Konzentrationen von cAMP signifikant über die basalen Spiegel in isoliertem Vaginagewebe (siehe 4b).
  • VIP (0.1 μM) und Forskolin (10 μM) erhöhen die basalen Konzentrationen von 276 nM um 156% beziehungsweise 238%. Die Unterschiede in diesen prozentualen Anteilen widerspiegeln die Unterschiede der verwendeten Konzentrationen von VIP und Forskolin, z.B. relaxierte VIP bei einer Konzentration von 0.1 μM eine präkontrahierte isolierte Vagina um zirka 80%, während 10 μM Forskolin ausreichend ist, um das isolierte Gewebe vollständig zu relaxieren.
  • Ausserdem konnte gezeigt werden, dass VIP und Forskolin in isoliertem vaginalen Gewebe eine Relaxation mit EC50-Werten von 18.8±0.6 nM beziehungsweise 320±20 nM induziert (siehe 4c).
  • Diese Daten belegen, dass VIP die vaginale Vasorelaxation über den cAMP/Adenylatcyclase-Pfad induziert, und demzufolge kann dieses Modell verwendet werden, um zu untersuchen, ob die Pelvisnerv-Stimulation, d.h. die sexuelle Erregung, zur Freisetzung von VIP/Aktivierung des cAMP/Adenylatcyclase-Pfads führt. Ausserdem können auch Ansätze zur Erhöhung des vaginalen Blutflusses während der sexuellen Erregung, z.B. durch direkte oder indirekte Verstärkung der cAMP-Signalisierung, untersucht werden.
  • 4.4 cAMP ist der Mediator der vaginalen Vasorelaxation
  • Der Neurotransmitter und die second Messenger Kandidaten, welche für die Erhöhung des vaginalen Blutflusses während der sexuellen Erregung verantwortlich sind, sind derzeit nicht identifiziert. Zur Zeit haben sich die Forscher auf den Stickstoffmonoxid (NO)/cGMP-Pfad konzentriert. In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, dass: 1.) der cAMP/Adenylatcyclase-Pfad die VIP-induzierten Erhöhungen des vaginalen Blutfluss vermittelt; 2.) VIP der während der sexuellen Erregung freigesetzte Neurotransmitter ist und 3.) dass endogen freigesetztes VIP seine vasorelaxatorischen Wirkungen über die Erhöhung von cAMP induziert.
  • Der für die Relaxation der Vaginawand verantwortliche Neurotransmitter ist derzeit nicht identifiziert. Es wurde gezeigt, dass VIP der nach der Stimulation des Pelvisnervs freigesetzte Neurotransmitter ist und dass cAMP die VIP-vermittelte Vasorelaxation vermittelt. Wirkstoffe, welche den Metabolismus von VIP verhindern oder direkt die cAMP-Signalisierung erhöhen, verstärken die Pelvisnervstimulierten Erhöhungen des vaginalen Blutflusses, z.B. NEP-Inhibitoren beziehungsweise PDEcAMP-Inhibitoren (siehe folgende Abschnitte).
  • In unseren Studien wurde gefunden, dass eine Rolle von NO bei der VIP-induzierten vaginalen Relaxation ausgeschlossen werden kann. Ein wirksamer und selektiver PDE-Typ-5-Inhibitor hat eine minimale Wirkung auf VIP-induzierte Relaxationen von isolierten glatten Muskeln der Vagina (30% Erhöhung der VIP-induzierten Relaxationen; siehe Tablle 1).
  • Tabelle 1: Erhöhung der VIP-vermittelten Relaxation von isolierter Hasenvagina. Diese Tabelle zeigt die prozentuale Erhöhung des EC50 für die VIP-induzierten Relaxationen von präkontrahierten glatten Muskeln der Vagina (1 μM Phenylephrin). Selektive Inhibitoren von PDEcAMP Typ 1, 2, 3 und 4 potenzierten alle die VIP-vermittelten Relaxationen signifikant, während ein selektiver Inhibitor von PDEcGMP Typ 5 oder Vehikelkontrolle keine Wirkung auf die VIP-vermittelten Relaxationen hatten.
  • Figure 01930001
  • Es wurde gezeigt, dass VIP auch der endogene NANC-(nicht-adrenerger, nicht-cholinerger) Neurotransmitter ist, der insbesondere für EFS-induzierte Relaxationen von isolierten glatten Muskeln der Vagina verantwortlich ist. Eine hohe Dosis eines Stickstoffmonoxid-Synthase-Inhibitors (L-NOARG, 300 μM) inhibiert nur 50% der EFS-induzierten Relaxationen. Ein NEP-Inhibitor (1 μM), welcher den NEP-induzierten Metabolismus von VIP verhindern wird und demzufolge die VIP-Signalisierung verstärkt, verstärkt die durch EFS induzierte nicht-Stickstoffmonoxid-NANC-Relaxation. Es wurde gezeigt, dass sowohl NO als VIP den Tonus der glatten Muskeln in der Vaginawand regulieren. Therapeutisch wird es möglich sein, die Relaxationen der glatten Muskeln der Vagina mit Wirkstoffen, welche die NO/cGMP- und/oder VIP/cAMP-vermittelte Signalisierung verstärken, zu erhöhen.
  • 4.5 VIP-induzierte klitorale Vasorelaxation über den cAMP-Pathway
  • Der Neurotransmitter und die second Messenger-Kandidaten, welche für die Erhöhung des klitoralen Blutflusses während der sexuellen Erregung verantwortlich sind, sind derzeit nicht identifiziert. In Übereinstimmung mit laufenden Forschungen des vaginalen Blutflusses, haben Arbeiten auf den Stickstoffmonoxid-(NO)/cGMP-Pathway spekuliert und sich darauf fokussiert. Es gibt keine Berichte, dass VIP bei der Vermittlung des klitoralen Blutflusses/Anschwellens eine Rolle spielt obwohl, VIP enthaltende Neuronen im klitoralen Gewebe visualisert wurden (Hauser-Kronberger et al., 1999).
  • In dieser Studie wurde gezeigt, dass:
    • 1. Die Infusion von VIP den klitoralen Blutfluss erhöht
    • 2. Der cAMP/Adenylatcyclase-Pfad die VIP-induzierte Erhöhung des klitoralen Blutflusses vermittelt
    • 3. VIP ein endogener klitoraler Neurotransmitter ist, welcher während der sexuellen Erregung freigesetzt wird:
    • 1. Die Infusion von VIP (60–200 μg/kg, iv-Bolus) induziert eine konzentrationsabhängige Erhöhung des klitoralen Blutflusses (5). Eine 115%-ige Erhöhung des klitoralen Blutflusses wurde nach einer iv-Infusion von 200 μg/kg VIP beobachtet. Dies war gegenüber den Kontrollinfusionen (Hepsalin) signifikant erhöht.
    • 2. Die Wirkungen von VIP auf den klitoralen Blutfluss können durch eine Infusion des cAMP-Mimetikums Forskolin (40 nmol/kg iv-Bolus, 5) nachgeahmt werden. Eine 156%-ige Erhöhung des klitoralen Blutfluss wurde nach einer iv-Infusion von 40 nmol/kg Forskolin beobachtet. Dies war gegenüber Kontrollinfusionen (Hepsalin) signifikant erhöht. Man bemerke, dass die Amplitude der Antwort ähnlich zu der durch VIP (200 μg/kg, iv-Bolus) induzierten ist und mit denjenigen bezüglich des vaginalen Blutflusses in 2 und 4 vergleichbar ist.
    • 3. Selektive Inhibitoren von NEP EC 3.4.24.11 in klinisch relevanten Dosen verstärken die pelvisnervstimulierten Erhöhungen des klitoralen Blutflusses signifikant (siehe 12). Ein NEP-Inhibitor verstärkt die maximale Erhöhung des klitoralen Blutflusses bis zu 131 im Vergleich zu den Vehikel-Kontroll-Erhöhungen.
  • Diese Daten belegen, dass VIP zur Erhöhung des klitoralen Blutflusses/Vasorelaxation befähigt ist und dass dies durch die Aktivierung des cAMP/Adenylatcyclase-Pfads nachgeahmt werden kann. Der Befund, dass ein Inhibitor von NEP EC3.4.24.11 1 (das für den VIP-Metabolismus verantwortlich ist) die pelvisnervstimulierte Erhöhung des klitoralen Blutflusses verstärkt, zeigt, dass VIP ein Neurotransmitter ist, welcher während der Pelvisnervstimulation/sexuellen Erregung freigesetzt wird.
  • 4.6 Der genitale Blutfluss wird durch pharmakologische Wirkstoffe welche direkt oder indirekt die cAMP-Spiegel erhöhen, verstärkt
  • FSAD steht geht mit einem verringerten genitalen Blutfluss einher und kann sich daraus ergeben. Mögliche Ansätze zur Behandlung dieser Störung drehen sich um die Erhöhung des genitalen Blutflusses. Nachdem nun feststeht, dass cAMP der Mediator der genitalen Vasorelaxation ist und dass sich Erhöhungen von cAMP aus neuronal freigesetztem VIP ergeben, wird angenommen, dass durch Verstärkung der cAMP-Signalisierung als Folge der genitale Blutfluss erhöht sein wird, wodurch der genitale Blutfluss auf normale Spiegel eingestellt und die FSAD behandelt wird.
  • In einem besonders bevorzugten Aspekt wurden drei Targets ausgewählt, um die cAMP-vermittelte Vasorelaxation direkt oder indirekt zu erhöhen: PDEcAMP-Inhibitoren, z.B. PDEcAMP-Typ-2-Inhibitoren, NEP-(EC 3.4.24.11)-Inhibitoren und Neuropeptid-Y-Y1-(NPY Y1)-Rezeptorantagonisten.
  • 4.6.1 Neutrale Endopeptidase-(NEP EC 3.4.24.11)-Inhibitoren
  • NEP EC 3.4.24.11 metabolisiert VIP und beendet demzufolge die VIP-vermittelte biologische Aktivität. NEP-Inhibitoren werden die endogene vasorelaxatorische Wirkung des während der Erregung freigesetzten VIP potenzieren. Dies wird die klinische Wirkung einer Verstärkung des genitalen Anschwellens haben.
  • Es gibt keine vorgängigen Literaturberichte über die NEP EC3.4.24.11 Lokalisation oder über dessen funktionelle Rolle im vaginalen Gewebe oder über eine Rolle bei der sexuellen Erregung.
  • Die selektiven Inhibitoren von NEP EC 3.4.24.11 in klinisch relevanten Dosen verstärken die pelvisnervstimulierten Erhöhungen des vaginalen Blutflusses signifikant (siehe 6).
  • Ein NEP-Inhibitor verstärkt die maximale Erhöhung des vaginalen Blutfluss bis zu 53% im Vergleich zu zeitlich übereinstimmenden Kontrollerhöhungen. Diese Erhöhung der submaximalen Stimulationsfrequenzen (z.B. 4Hz) war dosisabhängig, z.B. 0.1 mg/kg iv induziert eine 35.0±7.6%-ige Erhöhung; 0.3 mg/kg iv induziert eine 42.6.0±27.7%-ige Erhöhung und 1.0 mg/kg iv induziert eine 52.8±32.5%-ige Erhöhung. NEP-Inhibitoren hatten keine Wirkung auf den basalen (nicht-stimulierten) vaginalen Blutfluss. Demnach verstärken die erfindungsgemässen Wirkstoffe die Erregung durch Potenzieren der cAMP-Signalisierung, statt dass sie die Erregung bei Abwesenheit von sexuellem Begehren, d.h. durch direkte Erhöhung der cAMP-Signalisierung, induzieren würden.
  • Die selektiven Inhibitoren von NEP EC 3.4.24.11 in klinisch relevanten Dosen verstärken die pelvisnervstimulierten Erhöhungen des klitoralen Blutflusses signifikant (siehe 12). Ein NEP-Inhibitor verstärkt die maximale Erhöhung des klitoralen Blutflusses um bis zu 131% im Vergleich zu den Erhöhungen der Vehikel-Kontrollen. NEP-Inhibitoren hatten keine Wirkung auf den basalen (nicht stimulierten) vaginalen Blutfluss. Dies stützt unsere Annahmen, dass die erfindungsgemässen Wirkstoffe die Erregung durch Potenzieren der cAMP-Signalisierung, statt dass sie die Erregung bei Abwesenheit von sexuellem Begehren, d.h. durch direkte Erhöhung der cAMP-Signalisierung, induzieren würden.
  • Die selektiven Inhibitoren von NEP EC 3.4.24.11 in klinisch relevanten Dosen verstärken die VIP-induzierten Erhöhungen des vaginalen Blutflusses im Vergleich zu zeitlich übereinstimmenden Kontrollerhöhungen. Bei submaximalen Dosierungen von VIP (z.B. 6.0 μg/kg) ergibt sich sowohl eine signifikante Potenzierung der maximalen Erhöhung (95±6%) als auch eine Verlängerung der Dauer der Erhöhung (zirka 140% - von 7 bis zu über 17 Minuten; siehe 7). Die NEP-Inhibitoren verlängern die Dauer der VIP-induzierten Erhöhung des vaginalen Blutflussses signifikant, wenn sie in Kombination mit einer Dosis von VIP verabreicht werden, welche eine maximale Flusserhöhung (zirka 80% Verlängerung der Dauer – 11 bis 20 Minuten) erzeugt.
  • NEP-Inhibitoren in klinisch relevanten Dosen verstärken die VIP-induzierten und nervenvermittelten Relaxationen im isolierten Gewebe signifikant. Der EC50 für VIP wird in der Gegenwart eines selektiven NEP-Inhibitors (1 μM) signifikant von 18.8±0.6 nM auf 2.9±0.3 nM verringert. Die Wirkung des NEP-Inhibitors ist konzentrationsabhängig.
  • NEP EC 3.4.24.11 mRNS Signal und Protein wird exprimiert und wurde mittels Northern und Western Analysen in der Vagina von Menschen und Hasen identifiziert.
  • 4.6.2 Phosphodiesterase-(PDE)-Inhibitoren
  • cAMP wird durch cAMP-hydrolysierende PDEs, d.h. PDEcAMP abgebaut. Die PDEcAMP-Inhibitoren werden die endogene vasorelaxatorische Wirkung des während der Erregung freigesetzten cAMP potenzieren. Dies sollte die klinische Wirkung haben, das vaginale Anschwellen zu verstärken.
  • Es gibt keine Literaturberichte über die PDEcAMP-Lokalisation oder über eine funktionelle Rolle dieser Isozyme im vaginalen Gewebe oder über eine Rolle bei der sexuellen Erregung. Wir haben mittels PDE-Profiling der Vagina von Mensch und Hasen gezeigt, dass die folgenden PDEcAMP 1, 2, 3, 4, 7 & 8 Isozyme vorhanden sind. Die Inhibitoren dieser PDEcAMP stellen mögliche Wirkstoffe dar, um den vaginalen Blutfluss zu verstärken und/oder die glatten Muskeln der Vagina zu relaxieren.
  • Ein selektiver Inhibitor des PDEcAMP Typ 2-Inhibitors in klinisch relevanten Dosen verstärkt die pelvisnervstimulierten Erhöhungen des vaginalen Blutflusses signifikant (siehe 8). Ein PDEcAMP-Typ-2-Inhibitor (500 μg/kg; iv) verstärkt die maximale Erhöhung des vaginalen Blutflusses um 86.8±21.9% im Vergleich zu den während den zeitlich übereinstimmenden Kontrollen beobachteten Erhöhungen (bei 4Hz).
  • Ein selektiver PDEcAMP-Typ-2-Inhibitor verstärkte die Dauer der VIP-(60 μg/kg)-induzierten Erhöhungen des maximalen vaginalen Blutflusses signifikant um über 100% (gemessen bei einer 50% Amplitude; siehe 9). Der selektive PDEcAMP-Typ-2-Inhibitor verstärkt die durch die VIP-Stimulation induzierte maximale Erhöhung des Blutflusses signifikant (zirka 15±3% [200 μg/kg]).
  • Verstärkte die Dauer der VIP-induzierten Erhöhungen des maximalen vaginalen Blutflusses signifikant um über 100% (gemessen bei einer 50% Amplitude; siehe 8). Der selektive PDEcAMP-Typ-2-Inhibitor verstärkt die durch die Pelvisnervstimulation induzierte maximale Erhöhung des Blutflusses signifikant (zirka 15±3% [200 μg/kg] bei 4Hz).
  • PDEcAMP-Inhibitoren verstärken VIP-induzierte Relaxationen von präkontrahierten isolierten glatten Muskeln der Vagina (1 μM Phenylephrin; siehe Tabelle 1). Die selektiven Inhibitoren der PDEcAMP Typ 1, 2, 3 und 4 potenzierten alle die VIP-vermittelten Relaxationen signifikant. (210% bei 7 6 nM, 130% bei 8 nM, 220% bei 3.4 μM und 160% bei 68 6 nM Potenzierung der VIP-EC50-Werte) Diese Inhibitoren wurden in Dosen verabreicht, von denen bekannt war, dass sie für den jeweils interessierenden PDEcAMP selektiv sind. Ein selektiver Inhibitor des PDEcGMP-Typ 5 oder der Vehikelkontrolle hatte keine erkennbare Wirkung auf die VIP-vermittelten Relaxationen.
  • 4.6.3 NPY-Y1-Rezeptorantagonisten
  • NPY entfaltet einen inhibitorischen Einfluss über die VIP-vermittelte Vasorelaxation, und die NPY-Y1-Rezeptorantagonisten werden die vasorelaxatorische Wirkung des während der Erregung freigesetzten endogenen VIP erleichtern. Dies wird die klinisch Wirkung haben, die vaginale Anschwellung zu verstärken.
  • Es gibt keine Literaturberichte über die NPY-Rezeptor-Lokalisation oder über eine funktionelle Rolle für diese Rezeptoren im vaginalen Gewebe oder über eine Rolle bei der sexuellen Erregung.
  • In Studien über die NPY-Rezeptor-Expression haben wir mittels Northern und Western Analysen festgestellt, dass NPY Y1 Y2 und Y5 Rezeptor-Subtypen in der Vagina von Menschen und Hasen vorhanden sind.
  • Die selektiven Inhibitoren von NPY Y1 in klinisch relevanten Dosen verstärken die pelvisnervstimulierten Erhöhungen des vaginalen Blutflusses signifikant (siehe 10). Ein NPY-Y1-Antagonist verstärkte die maximale Erhöhung des vaginalen Blutflusses um bis zu 92% im Vergleich zu den Erhöhungen bei zeitlich übereinstimmenden Kontrollen. Diese Verstärkung der submaximalen Stimulationsfrequenzen (z.B. 4Hz) war dosisabhängig, z.B. 0.01 mg/kg iv induziert eine 15.8±19.6%-ige Erhöhung; 0.03 mg/kg iv induziert eine 35.1±17.17%-ige Erhöhung; 0.10 mg/kg iv induziert eine 60.1±16.9%-ige Erhöhung und 0.3 mg/kg iv induziert eine 91.9±27.4%-ige Erhöhung (Mittel±sem n=3). Die NPY-Y1-Antagonisten hatten keine Wirkung auf den basalen (nicht stimulierten) vaginalen Blutfluss. Dies bestärkt unsere Ansicht, dass sie die Erregung durch Potenzieren der cAMP-Signalisierung verstärken werden, statt dass sie die Erregung bei Abwesenheit von sexuellem Begehren, d.h. durch direkte Erhöhung der cAMP-Signalisierung, induzieren würden.
  • 4.7 Wirkungen von Wirkstoffen, welche die cAMP verstärken oder den vaginalen Blutfluss auf den mittleren arteriellen Blutdruck im anästhesierten Hasen verstärken.
  • Auf der Suche nach einer oralen Therapie für FSAD ist es wünschenswert, dass keine nachteiligen kardiovaskulären Wirkungen wie z.B. eine Wirkung auf den Blutdruck oder auf die Herzfrequenz auftreten. In unseren Studien wurde gefunden, dass Infusionen von VIP den mittleren arteriellen Blutdruck signifikant verringern (siehe 3) und die Herzfrequenz signifikant erhöhen. Demnach ist der Wirkstoff in einem besonders bevorzugtem Aspekt nicht VIP. Die Pelvisnervstimulation und Inhibitoren der PDEcAMP und NEP hatten jedoch keine Wirkung auf den Blutdruck. Bei 6.0 μg/kg verursachte VIP (iv) eine signifikante Reduktion des mittleren arteriellen Blutdruckes um 13.2±0.7 mm Hg und eine signifikante Erhöhung der Herzfrequenz um 16±4 Schläge pro Minute. Bei höheren Dosierungen wie 60.0 μg/kg verursachte VIP (iv) eine signifikante Reduktion des mittleren arteriellen Blutdruckes um 14.7±1.37 mm Hg, und dies war mit einer signifikanten Erhöhung der Herzfrequenz um 111±30 Schläge pro Minute vergesellschaftet, welche dann den mittleren arteriellen Blutdruck um 8.5±1.4 mmHg erhöhte.
  • GEPRÜFTE VERBINDUNGEN
  • Mehrere der oben erwähnten Verbindungen wurden entsprechend der vorliegenden Erfindung geprüft und erwiesen sich erfindungsgemäss als wirksam – d.h. sie können als PcAMP zur Behandlung von FSD, insbesondere FSAD, wirken.
  • Diese Verbindungen umfassen:
    • Verbindung der Formel Ia ("FIa") – nämlich 5-[4-(Diethylamino)benzyl]-1-methyl-3-propyl-6,7-dihydro-1H-pyrazolo[4,3-d]pyrimidin-7-on. FIa kann gemäss den Lehren von EP-A-0911333 (Beispiel 50 davon) hergestellt werden.
    • Verbindung der Formel II ("FII") – nämlich 9-(1-Acetyl-4-phenylbutyl)-2-[(3,4-dimethoxyphenyl)methyl]-1,9-dihydro-6H-purin-6-on. FII kann gemäss den Lehren von EP-A-0771799 (Beispiel 100 davon) hergestellt werden.
    • Verbindung der Formel III ("FIII") – nämlich Milrinon. FIII ist ein kommerziell verfügbares Produkt.
    • Verbindung der Formel IV ("FIV") – nämlich Rolipram. FIV ist ein kommerziell verfügbares Produkt.
    • Verbindung der Formel V ("FV") – nämlich Cyclohexancarbonsäure, 3-[[[1-(2-Carboxy-4-pentenyl)cyclopentyl]carbonyl]amino]-,1-ethyl-ester. FV kann gemäss den Lehren von EP-A-0274234 (Beispiel 300 davon) hergestellt werden.
    • Verbindung der Formel VI ("FVI") – nämlich Cyclohexancarbonsäure, 3-[[[1-(2-Carboxy-4-pentenyl)cyclopentyl]carbonyl]amino]-. FVI kann gemäss den Lehren von EP-A-0274234 (Beispiel 379 davon) hergestellt werden.
  • Insbesondere sind FIa, FII, FIII und FIV PDEcAMP-Inhibitoren. FIa ist ein I:PDEI, FII ist ein I:PDEII, FIII ist ein I:PDEIII und FIV ist ein I:PDEIV.
  • Die Daten dieser Verbindungen sind oben in den vorangehenden Abschnitten mit den Beispielen vorgestellt worden – siehe beispielsweise Tabelle I.
  • Es ist offensichtlich, dass diese PDEcAMP-Inhibitoren die VIP-induzierten Relaxationen von isoliertem Gewebe verstärken.
  • FII – welcher ein selektiver I:PDEII ist – verstärkt in klinisch relevanten Dosen die VIP-induzierte Erhöhung des vaginalen Blutflusses.
  • FII verstärkt in klinisch relevanten Dosen auch die durch den Pelvisnerv stimulierte Erhöhung des vaginalen Blutflusses.
  • FV und FVI sind selektive Inhibitoren von NEP EC 3.4.24.11.
  • Die oben in den vorgehenden Abschnitten mit den Beispielen präsentierten Daten sind für FVI. Allerdings wurden für FV ähnlichen Resultate erhalten.
  • Es ist offensichtlich, dass FV und FVI in klinisch relevanten Dosen die VIP-induzierte Erhöhung des vaginalen Blutflusses verstärken.
  • FV und FVI verstärken in klinisch relevanten Dosen auch die durch den Pelvisnerv stimulierte Erhöhung des vaginalen Blutflusses.
  • FV und FVI verstärken in klinisch relevanten Dosen auch die VIP-induzierten und nervenvermittelten Relaxationen von isoliertem Gewebe.
  • Zusätzliche Verbindungen, die geprüft wurden und die sich als wirksam erwiesen haben, umfassten:
    • 2-[(1-{[(1-Benzyl-6-oxo-1,6-dihydro-3-pyridinyl)amino]carbonyl}cyclopentyl)methyl]-4-methoxybutansäure (F57)
    • 2-{[1-({[3-(2-Oxo-1-pyrrolidinyl)propyl]amino}carbonylcyclopentyl]-methyl}-4-phenylbutansäure (F58)
    • (+)-2-{[1-({[2-(Hydroxymethyl)-2,3-dihydro-1H-inden-2-yl]amino}carbonyl)cyclopentyl]-methyl}-4-phenylbutansäure (F59)
    • 2-[(1-{[(5-Methyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)amino]carbonyl}cyclopentyl)methyl]-4-phenylbutansäure (F60)
    • cis-3-(2-Methoxyethoxy)-2-[(1-{[(4-{[(phenylsulfonyl)amino]carbonyl}cyclohexyl)-amino]carbonyl}cyclopentyl)methyl]propansäure (F61)
    • (+)-2-{[1-({[2-(Hydroxymethyl)-2,3-dihydro-1H-inden-2-yl]amino}carbonyl)cyclopentyl]-methyl}pentansäure (F62)
    • (+)-2-[(1-{[(5-Ethyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)amino]carbonyl}cyclopentyl)methyl]pentansäure (F63)
    • 2-({1-[(3-Benzylanilino)carbonyl]cyclopentyl}methyl)-pentansäure (F64)
    • 2-[(1-{[(1-Benzyl-6-oxo-1,6-dihydro-3-pyridinyl)amino]carbonyl}cyclopentyl)methyl]-pentansäure (F65)
    • 2-{[1-({[(1R,3S,4R)-4-(Aminocarbonyl)-3-butylcyclohexyl]amino}carbonyl)cyclopentyl]methyl}pentansäure (F66)
    • Jede der Verbindungen F57–66 ist ein I:NEP.
  • SYNTHESEN DER VERBINDUNGEN F57–66
  • Im folgenden Kommentar beziehen sich die Vorschriften auf die Synthese von Zwischenprodukten, während sich die Beispiele auf die Synthese der jeweiligen erfindungsgemässen Verbindungen beziehen.
  • Beispiel 1 2-[(1-{[(1-Benzyl-6-oxo-1,6-dihydro-3-pyridinyl)amino]carbonyl}cyclopentyl)methyl]-4-methoxybutansäure (F57)
    Figure 02060001
  • Ein Gemisch des Benzylesters aus Vorschrift 1 (1/62) (850 mg, 1.64 mMol) und 5% Palladium auf Aktivkohle (250 mg) in 40% wässrigem Ethanol (21 ml) wurde während 30 Minuten bei 30 psi und Raumtemperatur hydriert. Das Reaktionsgemisch wurde durch Hyflo® filtriert, und das Filtrat wurde im Vakuum auf konzentriert. Der verbleibende Schaum wurde mittels Säulenchromatographie auf Silikagel unter Verwendung von Dichlormethan:Methanol (97:3) als Laufmittel gereinigt, woraus sich die Titelverbindung als ein weisser Schaum ergab, 550 mg, 79%; 1H NMR (DMSO-d6, 300 MHz) d: 1.24–2.17 (m, 12H), 2.18–2.31 (m, 1H), 3.07 (s, 3H), 3.21 (t, 2H), 5.08 (s, 2H), 6.63 (d, 1H), 7.23–7.41 (m, 5H), 7.72 (d, 1H), 8.24 (s, 1H).
    Anal. gefunden: C, 67.46; H, 7.18; N, 6.24. C24H30N2O5 erfordert C, 67.58; H, 7.09; N, 6.57%.
  • Beispiel 2 2-{[1-({[3-(2-Oxo-1-pyrrolidinyl)propyl]amino}carbonylcyclopentyl]-methyl}-4-phenylbutansäure (F58)
    Figure 02070001
  • Ein Gemisch des Benzylesters aus Vorschrift 3 (3/67) (780 mg, 1.55 mMol) und 10% Palladium auf Aktivkohle (100 mg) in Ethanol:Wasser (90:10 nach Volumen) (30 ml) wurde während 1.5 Stunden bei Raumtemperatur unter 60 psi H2-Druck hydriert. Der Katalysator wurde abfiltriert, und das Filtrat wurde im Vakuum aufkonzentriert, woraus sich die Titelverbindung als ein weisser Schaum ergab, 473 mg, 74%; 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) d : 1.26–1.77 (m, 10H), 1.78–2.46 (m, 11H), 2.49–2.70 (m, 2H), 2.95–3.36 (m, 4H), 6.92–7.38 (m, 5H); Anal. gefunden: C, 64.05; H, 7.73; N, 6.22. C24H34N2O4;0.75H2O erfordert C, 65.88; H, 7.83; N, 6.40%.
  • Beispiel 3 (+)-2-{[1-({[2-(Hydroxymethyl)-2,3-dihydro-1H-inden-2-yl]amino}carbonyl)cyclopentyl]-methyl}-4-phenylbutansäure (F59)
    Figure 02080001
  • 2-{[1-({[2-(Hydroxymethyl)-2,3-dihydro-1H-inden-2-yl]amino}carbonyl)cyclopentyl]-methyl}-4-phenylbutansäure (WO 9110644) kann mittels standardmässigen HPLC-Verfahren unter Verwendung einer AD-Säule und Hexan:Isopropanol: Trifluoressigsäure (70:30:0.2) als Laufmittel gereinigt werden, woraus sich die Titelverbindung von Beispiel 3 ergab, 99.5% ee; [α]D = +9.1° (c = 1.76 in Ethanol)
  • Beispiel 4 2-[(1-{[(5-Methyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)amino]carbonyl}cyclopentyl)methyl]-4-phenylbutansäure (F60)
    Figure 02090001
  • Ein Gemisch des Benzylesters aus Vorschrift 4 (4/70) (187 mg, 0.39 mMol) und 10% Palladium auf Aktivkohle (80 mg) in Ethanol (20 ml) wurde während 18 Stunden bei 60 psi hydriert. Die DC-Analyse zeigte verbleibendes Ausgangsmaterial, weshalb nochmals 10% Palladium auf Aktivkohle (100 mg) zugegeben und die Reaktion während weiteren 5 Stunden fortgesetzt wurde. Die DC-Analyse zeigte wiederum verbleibendes Ausgangsmaterial, weshalb nochmals Katalysator (100 mg) zugegeben und die Hydrierung während 18 Stunden fortgesetzt wurde. Das Gemisch wurde durch Arbocel® filtriert, und das Filtrat wurde im Vakuum auf konzentriert und mit Dichlormethan azeotropiert. Das Rohprodukt wurde mittels Chromatographie auf Silikagel unter Verwendung einer Biotage®-Säule und Dichlormethan:Methanol (95:5) als Laufmittel gereinigt, woraus sich die Titelverbindung als ein klares Öl ergab, 80 mg, 53%; 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) d: 1.51–1.89 (m, 9H), 2.03 (m, 1H), 2.20 (m, 1H), 2.40 (m, 2H), 2.60 (m, 5H), 7.15–7.30 (m, 5H); LRMS : m/z 387.8 (MH+).
  • Beispiel 5 Cis-3-(2-Methoxyethoxy)-2-[(1-{[(4-{[(phenylsulfonyl)amino]carbonyl}cyclohexyl)amino]carbonyl}cyclopentyl)methyl]propansäure (F61)
    Figure 02100001
  • Eine Lösung des tert-Butylesters aus Vorschrift 8 (8/66) (446 mg, 0.75 mMol) in Dichlormethan (5 ml) und Trifluoressigsäure (5 ml) wurde während 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum auf konzentriert, und der Rückstand wurde mit Dichlormethan, dann Toluol und schliesslich Ether azeotropiert, woraus sich die Titelverbindung als ein weisser Schaum ergab, 385 mg, 95%; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) d: 1.48–2.17 (m, 18H), 2.40 (s, 1H), 2.66 (s, 1H), 3.37 (s, 3H), 3.50–3.70 (m, 6H), 3.94 (s, 1H), 6.10 (d, 1H), 6.59 (s, 1H), 7.55 (t, 2H), 7.61 (m, 1H), 8.02 (d, 2H), 9.11 (s, 1H); Anal. gefunden: C, 54.88; H, 6.90; N, 5.04. C26H38N2O8S;1.7H2O erfordert C, 57.97; H, 7.11; N, 5.20%.
  • Beispiel 6 (+)-2-{[1-({([2-(Hydroxymethyl)-2,3-dihydro-1H-inden-2-yl]amino}carbonyl)cyclopentyl]-methyl}pentansäure (F62)
    Figure 02110001
  • 2-{[1-({[2-(Hydroxymethyl)-2,3-dihydro-1H-inden-2-yl]amino}carbonyl)cyclopentyl]-methyl}pentansäure (WO 9110644) wurde mittels HPLC unter Verwendung einer AD-Säule und Hexan:Isopropanol:Trifluoressigsäure (90:10:0.1) als Laufmittel weiter gereinigt, woraus sich die Titelverbindung von Beispiel 6 ergab, 99% ee, [α]D = +10.4° (c = 0.067, Ethanol).
  • Beispiel 7 (+)-2-[(1-{[(5-Ethyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)amino]carbonyl}cyclopentyl)methyl]pentansäure (F63)
    Figure 02110002
  • Die Säure aus Vorschrift 18 (18/Bsp. 4) (824 mg) wurde mittels HPLC unter Verwendung einer AD-Säule und unter Verwendung von Hexan:Isopropanol:Trifluoressigsäure (85:15:0.2) als Laufmittel weiter gereinigt, woraus sich die Titelverbindung von Beispiel 7 als ein weisser Schaum ergab, 386 mg, 99% ee, 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 0.90 (t, 3H), 1.38 (m, 6H), 1.50–1.79 (m, 9H), 2.19 (m, 1H), 2.30 (m, 1H), 2.44 (m, 1H), 2.60 (m, 1H), 2.98 (q, 2H), 12.10–12.27 (bs, 1H); LRMS: m/z 338 (MH); und [α]D = +3.8° (c = 0.1, Methanol)
  • Beispiel 8 2-({1-[(3-Benzylanilino)carbonyl)cyclopentyl]methyl)pentansäure (F64)
    Figure 02120001
  • Ein Gemisch des Benzylesters aus Vorschrift 10 (10/53) (1.3 mg, 2.47 mMol) und 5% Palladium auf Aktivkohle (130 mg) in Wasser (10 ml) und Ethanol (40 ml) wurde während 2 Stunden bei 30 psi und Raumtemperatur hydriert. Das Reaktionsgemisch wurde durch Arbocel® filtriert, das Filtrat wurde im Vakuum aufkonzentriert, und der Rückstand wurde mit Dichlormethan zerstossen. Der erhaltene Gummi wurde mit Ether, dann Hexan zerstossen, und bei 50°C getrocknet, woraus sich die Titelverbindung als ein Feststoff ergab, 0.79g, 81%; 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) d: 0.95 (t, 3H), 1.24–1.51 (m, 3H), 1.58-1.80 (m, 7H), 1.88 (dd, 1H), 2.15 (m, 2H), 2.24 (m, 1H), 2.48 (m, 1H), 4.00 (s, 2H), 6.98 (d, 1H), 7.24 (m, 6H), 7.40 (m, 3H); Anal. gefunden: C, 75.48; H, 7.76; N, 3.59. C25H31NO3;0.25H2O erfordert C, 75.44; H, 7.98; N, 3.51%.
  • Beispiel 9 2-[(1-{[(1-Benzyl-6-oxo-1,6-dihydro-3-pyridinyl)amino]carbonyl}-cyclopentyl)methyl]-pentansäure (F65)
    Figure 02130001
  • Die Titelverbindung wurde als ein weisser Schaum mit einer Ausbeute von 51% aus dem Benzylester aus Vorschrift 13 (13/56) nach einem ähnlichen Verfahren wie dem in der Vorschrift 19 (19/Bsp. 21) beschriebenen gewonnen mit der Ausnahme, dass das Produkt mittels Säulenchromatographie auf Silikagel unter Verwendung von Ethylacetat als Laufmittel gereinigt wurde; 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) d: 0.96 (t, 3H), 1.28–1.80 (m, 12H), 2.01 (m, 1H), 2.30–2.52 (m, 2H), 5.02 (dd, 2H), 6.60 (d, 1H), 7.27 (m, 5H), 7.70 (s, 1H), 8.34 (s, 1H); Anal. gefunden: C, 69.52; H, 7.41; N, 6.51. C24H30N2O4;0.25H2O erfordert C, 69.45; H, 7.41; N, 6.75.
  • Beispiel 10 2-{[1-({[(1R,3S,4R)-4-(aminocarbonyl)-3-butylcyclohexyl]amino}carbonyl)cyclopentyl]methyl}pentansäure (F66)
    Figure 02130002
  • Verbindungen der Formel ic, d.h. Verbindungen der allgemeinen Formel i, wobei r1 Propyl ist, werden aus dem entsprechenden tert-Butylester nach einem ähnlichen Verfahren wie dem in Vorschrift 14 (14/Bsp. 1) beschriebenen hergestellt.
  • Vorschrift 1 (1/62) Benzyl-2-[(1-{[(1-benzyl-6-oxo-1,6-dihydro-3-pyridinyl)amino]carbonyl}cyclopentyl)methyl]-4-methoxybutanoat
    Figure 02140001
  • Oxalylchlorid (0.26 ml, 3.0 mMol) wurde zu einer eisgekühlten Lösung von 1-{2-[(Benzyloxy)carbonyl]-4-methoxybutyl}cyclopentancarbonsäure ( EP 274234 ) (1.0 g, 3.0 mMol) und N,N-Dimethylformamid (2 Tropfen) in Dichlormethan (20 ml) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde während 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde im Vakuum auf konzentriert, und der Rückstand wurde mit Dichlormethan (3 × 10 ml) azeotropiert. Das Produkt wurde in Dichlormethan (20 ml) gelöst, dann in einem Eisbad abgekühlt. Das Amin aus Vorschrift 2 (2/28) (600 mg, 3 mMol) und N-Methylmorpholin (0.6 ml, 5.45 mMol) wurden zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde während 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum aufkonzentriert, und zwischen Wasser und Ether verteilt. Die organische Phase wurde mit Chlorwasserstoffsäure (2N), Natriumbicarbonat-Lösung, dann Wasser gewaschen, getrocknet (MgSO4) und im Vakuum eingedampft. Der erhaltene grüne Feststoff wurde mittels Mitteldruck-Säulenchromatographie auf Silikagel unter Verwendung von Ethylacetat:Hexan (90:10) als Laufmittel gereinigt, woraus sich die Titelverbindung ergab, 880 mg, 57%; 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) d: 1.37–2.28 (m, 12H), 2.46–2.64 (m, 1H), 3.20 (s, 3H), 3.31 (m, 2H), 4.97 (dd, 2H), 5.08 (dd, 2H), 6.57 (d, 1H), 7.12 (m, 1H), 7.18-7.48 (m, 10H), 8.08 (d, 1H).
  • Vorschrift 2 (2/28) 5-Amino-1-benzyl-2(1H)-pyridinon
    Figure 02150001
  • Ein Gemisch von 1-Benzyl-5-nitro-1H-pyridin-2-on (Justus Liebigs Ann. Chem. 484; 1930; 52) (1.0 g, 4.35 mMol) und granuliertem Zinn (3.5 g, 29.5 mMol) in konzentrierter Chlorwasserstoffsäure (14 ml) wurde während 1.5 Stunden bei 90°C erhitzt. Die abgekühlte Lösung wurde mit Wasser verdünnt, unter Verwendung von Natriumcarbonat-Lösung neutralisiert und mit Ethylacetat (250 ml insgesamt) extrahiert. Die kombinierten organischen Extrakte wurden filtriert, getrocknet (MgSO4) und im Vakuum eingedampft, woraus sich die Titelverbindung als ein hellgrüner Feststoff ergab, (wurde mit der Zeit blau), 440 mg, 51%; 1H NMR (CDCl3, 250 MHz) 8: 4.12–4.47 (bs, 2H), 5.00 (s, 2H), 6.31 (d, 1H), 6.86 (s, 1H), 7.07 (m, 1H), 7.14–7.42 (m, 5H).
  • Vorschrift 3 (3/67) Benzyl-2-{[1-({[3-(2-Oxo-1-pyrrolidinyl)propyl]amino}carbonylcyclopentyl]-methyl}-4-phenylbutanoat
    Figure 02160001
  • 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (1.06 g, 5.53 mMol), 1-Hydroxybenzotriazol-Hydrat (0.60 g, 4.44 mMol) und 4-Methylmorpholin (0.56 g, 5.54 mMol) wurden nacheinander zu einer gekühlten Lösung von 1-{2-[(Benzyloxy)carbonyl]-4-phenylbutyl}cyclopentan-carbosäure ( EP 274234 ) (1.5 g, 3.94 mMol) in trockenem Dichlormethan (15 ml) bei Raumtemperatur, gefolgt von N-(3-Aminopropyl)-2-pyrrolidinon (0.56 g, 3.94 mMol) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde während 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde mit Wasser, 2N Chlorwasserstoffsäure, gesättigter wässriger Natriumbicarbonat-Lösung gewaschen, und dann getrocknet (MgSO4) und im Vakuum eingedampft. Das erhaltene gelbe Öl wurde mittels Säulenchromatographie auf Silikagel unter Verwendung von Ethylacetat:Pentan (50:50) als Laufmittel gereinigt, woraus sich die Titelverbindung als ein klarer Gummi ergab, 800 mg, 40%; 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) d : 1.37-2.20 (m, 16H), 2.34–2.58 (m, 5H), 2.92–3.46 (m, 6H), 5.07 (d, 1H), 5.18 (d, 1H), 6.98–7.47 (m, 10H).
  • Vorschrift 4 (4/70) Benzyl-2-[(1-{[(5-methyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)aminolcarbonyl}cyclopentyl)methyl]-4-phenylbutanoat
    Figure 02170001
  • Die Titelverbindung wurde als ein klares Öl mit einer Ausbeute von 74% aus 1-{2-[(Benzyloxy)carbonyl]-4-phenylbutyl}cyclopentan-carbonsäure ( EP 274234 ) und 2-Amino-5-methyl-1,3,4-thiadiazol nach einem ähnlichen Verfahren wie dem in Vorschrift 5 (5/68) beschriebenen erhalten; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) d: 1.58–1.76 (m, 7H), 1.83–1.98 (m, 3H), 2.03 (m, 1H), 2.20 (m, 1H), 2.35 (m, 1H), 2.44 (m, 3H), 2.65 (s, 3H), 5.02 (dd, 2H), 7.00 (d, 2H), 7.15 (m, 1H), 7.19 (m, 2H), 7.35 (m, 5H); LRMS : m/z 478.7 (MH+).
  • Vorschrift 5 (5/68) Benzyl-2-{[1-({[3-(methylamino)-3-oxopropyl]amino}carbonyl)cyclopentyl]methyl}-4-phenylbutanoat
    Figure 02170002
  • 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (122 mg, 0.64 mMol), 1-Hydroxybenzotriazol-Hydrat (86 mg, 0.64 mMol) und 4-Methylmorpholin (173 μl, 1.59 mMol) wurden nacheinander zu einer gekühlten Lösung von 1-{2-[(Benzyloxy)carbonyl]-4-phenylbutyl}cyclopentan-carbonsäure ( EP 274234 ) (202 mg, 0.53 mMol) in N,N-Dimethylformamid (5 ml) bei Raumtemperatur, gefolgt vom Amin-Hydrochlorid aus Vorschrift 6 (6/23) (146 mg, 1.06 mMol) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde während 18 Stunden bei 90°C gerührt. Die abgekühlte Lösung wurde im Vakuum auf konzentriert und der Rückstand zwischen Wasser (20 ml) und Ethylacetat (100 ml) verteilt. Die Phasen wurden aufgetrennt, die organische Phase wurde mit Wasser (3 × 30 ml), gesättigter Kochsalzlösung (25 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO4), und im Vakuum eingedampft, woraus sich ein klares Öl ergab. Das Rohprodukt wurde mittels Säulenchromatographie auf Silikagel unter Verwendung von Dichlormethan:Methanol (98:2) als Laufmittel gereinigt, woraus sich die Titelverbindung als ein farbloses Öl ergab, 162 mg, 67%; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ: 1.38–1.53 (m, 2H), 1.53–1.96 (m, 8H), 2.02 (m, 2H), 2.27 (t, 2H), 2.46 (m, 3H), 2.76 (d, 3H), 3.44 (m, 2H), 5.13 (s, 2H), 5.79 (bs, 1H), 6.38 (m, 1H), 7.06 (d, 2H), 7.18 (m, 1H), 7.22 (m, 2H), 7.38 (m, 5H); LRMS : m/z 465.5 (MH+).
  • Vorschrift 6 (6/23) 3-Amino-N-methylpropanamide-Hydrochlorid
    Figure 02180001
  • Ein Gemisch des Benzylcarbamates aus Vorschrift 7 (7/13) (7.92 g, 33.5 mMol) und 5% Palladium auf Aktivkohle (800 mg) in Ethanol (300 ml) wurde während 4 Stunden bei 50 psi und Raumtemperatur hydriert. Das Reaktionsgemisch wurde durch Arbocel® filtriert, mit Ethanol durchgewaschen, und zu dem zusammengegebenen Filtraten wurde 1N Chlorwasserstoffsäure (36.9 ml, 36.9 mMol) zugegeben. Diese Lösung wurde im Vakuum eingedampft, und der Rückstand wurde mit Dichlormethan azeotropiert, woraus sich die Titelverbindung als ein farbloser Schaum ergab, 4.66 g, 1H NMR (DMSOd6, 300 MHz) δ: 2.46 (t, 2H), 2.60 (s, 3H), 2.95 (m, 2H), 7.98–8.16 (m, 2H).
  • Vorschrift 7 (7/13) Benzyl-3-(methylamino)-3-oxopropylcarbamat
    Figure 02190001
  • Ein Gemisch von N-[(Benzyloxy)carbonyl]-β-Alanin (10 g, 44.8 mMol), Methylamin-Hydrochlorid (3.33 g, 49.28 mMol), 1-Hydroxybenzotriazol-Hydrat (6.05 g, 44.8 mMol), 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (10.3 g, 53.76 mMol) und N-Methylmorpholin (11.33 ml, 103 mMol) in Dichlormethan (200 ml) wurde während 18 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der erhaltene Niederschlag wurde abfiltriert, woraus sich das gewünschten Produkt als ein farbloser Schaum ergab, und das Filtrat wurde im Vakuum aufkonzentriert. Der Rückstand wurde mittels Säulenchromatographie auf Silikagel unter Verwendung eines Elutionsgradienten von Ethylacetat:Hexan (90:10 bis 100:0) gereinigt, woraus sich zusätzliches Produkt ergab, 7.96 g, 75% insgesamt; 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ: 2.42 (t, 2H), 2.80 (s, 3H), 3.50 (m, 2H), 5.21 (s, 2H), 5.49 (bs, 1H), 5.63 (bs, 1H), 7.36 (m, 5H); Anal. gefunden: C, 60.68; H, 7.00; N, 11.95. C12H16N2O3 erfordert C, 61.00; H, 6.83; N, 11.86%.
  • Vorschrift 8 (8/66) Cis-tert-Butyl-3-(2-methoxyethoxy)-2-[(1-{[(4-{[(phenylsulfonyl)amino]carbonyl}-cyclohexyl)amino]carbonyl}cyclopentyl)methyl]propanoat
    Figure 02200001
  • N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (199 mg, 0.97 mMol), 4-Dimethylaminopyridin (118 mg, 0.97 mMol) und Benzolsulfonamid (152 mg, 0.97 mMol) wurden zu einer eisgekühlten Lösung des Säure aus Vorschrift 9 (9/63) (400 mg, 0.878 mMol) in Dichlormethan (12 ml) und N,N-Dimethylformamid (0.5 ml) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde während 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde im Vakuum auf konzentriert und der Rückstand in kaltem Ethylacetat suspendiert. Das erhaltene unlösliche Material wurde abfiltriert, das Filtrat wurde mit Chlorwasserstoffsäure (1 N) und Wasser gewaschen, dann getrocknet (MgSO4) und im Vakuum eingedampft. Das Rohprodukt wurde mittels Säulenchromatographie auf Silikagel unter Verwendung eines Elutionsgradienten von Dichlormethan:Methanol (95:5 bis 90:10) gereinigt, woraus sich die Titelverbindung als ein weisser Schaum ergab, 480 mg, 92%; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) d: 1.44 (s, 9H), 1.63 (m, 13H), 1.80 (m, 2H), 1.88 (m, 1H), 1.98 (m, 2H), 2.36 (m, 1H), 2.57 (m, 1H), 3.38 (s, 3H), 3.40 (m, 1H), 3.51 (t, 2H), 3.58 (m, 3H), 3.95 (m, 1H), 5.92 (d, 1H), 7.56 (m, 2H), 7.62 (m, 1H), 8.05 (d, 2H), 8.75 (bs, 1H); LRMS : m/z 618 (MNa+).
  • Vorschrift 9 (9/63) 4-{[(1-{3-tert-Butoxy-2-[(2-methoxyethoxy)methyl]-3-oxopropyl}cyclopentyl)-carbonyl]amino}cyclohexancarbonsäure
    Figure 02210001
  • Ein Gemisch von Benzyl 4-{[(1-{3-tert-butoxy-2-[(2-methoxyethoxy)methyl]-3-oxopropyl}cyclopentyl)carbonyl]amino}cyclohexancarboxylat ( EP 274234 ) und 10% Palladium auf Aktivkohle (250 mg) in Wasser (10 ml) und Ethanol (50 ml) wurde während 18 Stunden bei 50 psi und Raumtemperatur hydriert. Das Reaktionsgemisch wurde durch Solkafloc® filtriert, das Filtrat wurde im Vakuum auf konzentriert, und der Rückstand wurde mit Toluol (3×) und dann Dichlormethan (3×) azeotropiert, woraus sich die Titelverbindung ergab, 2.0 g, 96%; 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) d: 1.48 (s, 9H), 1.53–1.84 (m, 14H), 1.94–2.10 (m, 5H), 2.60 (m, 2H), 3.40 (s, 3H), 3.41–3.63 (m, 5H), 3.96 (m, 1H), 5.90 (bd, 1H).
  • Vorschrift 10 (10/53)
  • Die folgende Verbindung:
    Figure 02220001
    wobei:
    Figure 02220002
    wurde aus dem Säurechlorid aus Vorschrift 11 (11/3) und dem geeigneten Amin nach einem ähnlichen Verfahren wie dem in Vorschrift 12 (12/52) beschriebenen hergestellt.
  • Vorschrift 11 (11/3) Benzyl-2-{[1-(chlorocarbonyl)cyclopentyl]methyl}pentanoat
    Figure 02230001
  • Oxalylchlorid (1.15 ml, 13.2 mMol) wurde zu einer eisgekühlten Lösung von 1-{2-[(Benzyloxy)carbonyl]pentyl}cyclopentancarbonsäure ( EP 274234 ) (2.0 g, 6.3 mMol) in trockenem Dichlormethan (20 ml) zugegeben, und die Lösung wurde während 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum auf konzentriert, und der Rückstand wurde mit Dichlormethan (3×) azeotropiert, woraus sich die Titelverbindung als ein goldenes Öl ergab, 2.1 g; 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) d: 0.88 (t, 3H) , 1.28 (m, 2H) , 1.43 (m, 2H), 1.63 (m, 6H), 2.00 (m, 1H), 2.08–2.35 (m, 3H), 2.44 (m, 1H), 5.15 (s, 2H), 7.28 (m, 5H).
  • Vorschrift 12 (12/52) Benzyl-2-(11-[(3-pyridinylamino)carbonyl]cyclopentyl}methyl)pentanoat
    Figure 02230002
  • Triethylamin (0.11 ml, 0.78 mMol) wurde zu einem Gemisch des Säurechlorids aus Vorschrift 11 (11/3) (200 mg, 0.60 mMol) und 2-Aminopyridin (61 mg, 0.65 mMol) in Dichlormethan (3 ml) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde während 16 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wurde im Vakuum eingedampft, der Rückstand wurde zwischen Natriumbicarbonat-Lösung (5 ml) und Ethylacetat (20 ml) verteilt, und die Phasen wurden getrennt. Die organische Phase wurde (MgSO4) getrocknet und im Vakuum eingedampft, woraus sich ein Gummi ergab. Das Rohprodukt wurde mittels Säulenchromatographie auf Silikagel unter Verwendung von Ethylacetat als Laufmittel gereinigt, woraus sich die Titelverbindung ergab, 130 mg; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) d: 0.82 (t, 3H), 1.21 (m, 3H), 1.40 (m, 1H), 1.43–1.72 (m, 6H), 1.81 (d, 1H), 1.98 (m, 1H), 2.18 (m, 1H), 2.24 (m, 1H), 2.46 (m, 1H), 4.98 (m, 2H), 7.20–7.38 (m, 6H), 7.42 (s, 1H), 8.06 (d, 1H), 8.35 (d, 1H), 8.56 (s, 1H).
  • Vorschrift 13 (13/56)
  • Die folgende Verbindung:
    Figure 02240001
    wobei:
    Figure 02240002
    wurde aus dem Säurechlorid aus Vorschrift 11 (11/3) und dem geeigneten Amin nach einem ähnlichen Verfahren wie dem in Vorschrift 12 (12/52) beschriebenen hergestellt.
  • Vorschrift 14 (14/Bsp. 1) 2-({1-[(1,3-Benzodioxol-5-ylamino)carbonyl]cyclopentyl}methyl)pentansäure
    Figure 02250001
  • Trifluoressigsäure (5 ml) wurde zu einer Lösung des tert-Butylesters aus Vorschrift 15 (15/34) (130 mg, 0.31 mMol) in Dichlormethan (5 ml) zugegeben, und die Lösung wurde während 4 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde im Vakuum aufkonzentriert, und der Rückstand wurde mit Toluol und Dichlormethan azeotropiert, woraus sich die Titelverbindung als ein klares Öl ergab, 112 mg, 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ0.83 (t, 3H), 1.22–1.40 (m, 3H), 1.50–1.72 (m, 8H), 1.95 (m, 1H), 2.10 (m, 2H), 2.19 (m, 1H), 4.30 (m, 2H), 5.93 (s, 2H), 5.99 (bs, 1H), 6.74 (m, 3H); LRMS: m/z 380 (MH-).
  • Vorschrift 15 (15/34)
  • Die folgende Verbindung:
    Figure 02260001
    wobei:
    Figure 02260002
    wurde aus der Säure von Vorschrift 16 (16/1) und der geeigneten Aminverbindung nach einem ähnlichen Verfahren wie dem in Vorschrift 17 (17/33) beschriebenen hergestellt.
  • Vorschrift 16 (16/1) 1-[2-(tert-Butoxycarbonyl)-4-pentyl]-cyclopentan-carbonsäure
    Figure 02270001
  • Ein Gemisch von 1-[2-(tert-Butoxycarbonyl)-4-pentenyl]cyclopentan-carbonsäure ( EP 274234 ) (23 g, 81.5 mMol) und 10% Palladium auf Aktivkohle (2 g) in trockenem Ethanol (200 ml) wurde während 18 Stunden bei 30 psi und Raumtemperatur hydriert. Das Reaktionsgemisch wurde durch Arbocel® filtriert, und das Filtrat wurde im Vakuum auf konzentriert, woraus sich ein gelbes Öl ergab. Das Rohprodukt wurde mittels Säulenchromatographie auf Silikagel unter Verwendung von Ethylacetat:Pentan (40:60) als Laufmittel gereinigt, woraus sich das gewünschte Produkt als ein klares Öl ergab, 21 g, 91%; 1H NMR (CDCl3, 0.86 (t, 3H), 1.22–1.58 (m, 15H), 1.64 (m, 4H), 1.78 (dd, 1H), 2.00–2.18 (m, 3H), 2.24 (m, 1H); LRMS : m/z 283 (M-H)-.
  • Vorschrift 17 (17/33) tert-Butyl 2-{[1-({[1-(hydroxymethyl)cyclopentyl]amino}carbonyl)-cyclopentyl]methyl}pentanoat
    Figure 02270002
  • 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid-Hydrochlorid (41 mg, 0.21 mMol), 1-Hydroxybenzotriazol-Hydrat (27 mg, 0.2 mMol), N-Methylmorpholin (35 μl, 0.31 mMol) und schliesslich 1-Amino-1-cyclopentanmethanol (25 mg, 0.22 mMol) wurden zu einer Lösung der Säure aus Vorschrift 16 (16/1) (150 mg, 0.53 mMol) in N,N-Dimethylformamid (3 ml) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wurde während 18 Stunden bei 90°C gerührt. Die abgekühlte Lösung wurde mit Ethylacetat (90 ml) verdünnt, mit Wasser (3×25 ml) und gesättigter Kochsalzlösung (25 ml) gewaschen, dann getrocknet (MgSO4) und im Vakuum eingedampft. Das Rohprodukt wurde mittels Chromatographie auf Silikagel, unter Verwendung von Ethylacetat:Pentan (30:70) als Laufmittel gereinigt, woraus sich die Titelverbindung ergab, 38 mg, 57%; 1H NMR (CDCl3, 400 MHz) d: 0.88 (t, 3H), 1.29 (m, 3H), 1.41–1.78 (m, 26H), 1.78–1.98 (m, 4H), 2.04 (m, 1H), 2.26 (m, 1H), 3.59 (dd, 1H), 3.70 (dd, 1H), 4.80 (t, 1H), 5.81 (s, 1H); LRMS : m/z 380 (MH-).
  • Vorschrift 18 (18/Bsp. 4)
  • Eine Verbindung der unten dargestellten Formel wurde aus dem entsprechenden tert-Butylester nach einem ähnlichen Verfahren wie dem in Vorschrift 14 (14/Bsp. 1) beschriebenen hergestellt.
  • Figure 02280001
  • Figure 02290001
  • Vorschrift 19 (19/Bsp. 21) 2-({1-[(3-Benzylanilino)carbonyl]cyclopentyl}methyl)pentansäure
    Figure 02290002
  • Ein Gemisch des Benzylesters aus Vorschrift 10 (10/53) (1.3 mg, 2.47 mMol) und 5% Palladium auf Aktivkohle (130 mg) in Wasser (10 ml) und Ethanol (40 ml) wurde während 2 Stunden bei 30 psi und Raumtemperatur hydriert. Das Reaktionsgemisch wurde durch Arbocel® filtriert, das Filtrat wurde im Vakuum aufkonzentriert, und der Rückstand wurde mit Dichlormethan zerstossen, und bei 50°C getrocknet, woraus sich die Titelverbindung als ein Feststoff ergab, 0.79 g, 81%; 1H NMR (CDCl3, 300 MHz) δ: 0.95 (t, 3H), 1.24–1.51 (m, 3H), 1.58-1.80 (m, 7H), 1.88 (dd, 1H), 2.15 (m, 2H), 2.24 (m, 1H), 2.48 (m, 1H), 4.00 (s, 2H), 6.98 (d, 1H), 7.24 (m, 6H), 7.40 (m, 3H); Anal. gefunden: C, 75.48; H, 7.76; N, 3.59. C25H31NO3;0.25H2O erfordert C, 75.44; H, 7.98; N, 3.51%.
  • ACE-ASSAY
  • DIE HERSTELLUNG UND DER ASSAY VON LÖSLICHEM ANGIOTENSIN-KONVERTIERENDEM-ENZYM (ACE) AUS DEM NIERENKORTEX VON SCHWEINEN und MENSCHEN.
  • Die Aktivität von löslichem ACE wird aus dem Nierenkortex gewonnen und durch Messung der Geschwindigkeit der Spaltung des ACE-Substrats Abz-Gly-p-nitro-Phe-Pro-OH unter Bildung seines fluoreszierenden Produktes Abz-Gly bestimmt.
  • 1. MATERIALIEN
  • Sämtliches Wasser ist doppelt entionisiert.
    • 1.1 Menschliche Niere IIAM (Pennsylvania. U.S.A.) oder UK Human Tissue Bank (UK HTB)
    • 1.2 Schweineniere ACE Sigma (A2580)
    • 1.3 Homogenisationspuffer-1 100 mM Mannitol und 20 mM Tris bei pH 7.1 2.42 g Tris (Fisher T/P630/60) werden mit 1 Liter Wasser verdünnt, und der pH wird unter Verwendung von 6M HCl bei Raumtemperatur auf 7.1 eingestellt. Dazu werden 18.22 g Mannitol (Sigma M-9546) zugegeben.
    • 1.4 Homogenisationspuffer-2 100 mM Mannitol, 20 mM Tris bei pH 7.1 und 10 mM MgCl2.6H2O (Fisher MO600/53) Zu 500 ml des Homogenisationspuffers 1 (1.4) werden 1.017 g MgCl2 zugegeben.
    • 1.5 Tris Puffer (ACE-Puffer). 50 mM Tris und 300 mM NaCl bei pH 7.4 50 ml 50 mM Tris pH 7.4 (Sigma T2663) und 17.52 g NaCl (Fisher S/3160/60) werden in 1000 ml Wasser angesetzt.
    • 1.6 Substrat (Abz-D-Gly-p-nitro-Phe-Pro-OH) (Bachem M-1100) ACE-Substrat wird als Pulver bei –20°C gelagert. Eine 2 mM Stammlösung wird durch sorgfältiges Resuspendieren des Substrats in ACE-Puffer hergestellt, wobei dieses weder verwirbelt noch beschallt werden darf. 400 μl Aliquote der 2 mM Stammlösung werden während bis zu einem Monat bei –20°C gelagert.
    • 1.7 Gesamtprodukt Proben, die einer 100%-igen Substrat-zu-Produkt-Umwandlung entsprechen, werden mit auf die Platte gegeben, um den %-Substratumsatz berechnen zu können (siehe Berechnungen). Das Gesamtprodukt wird durch Inkubieren von 1 ml des 2 mM Substrates mit 20 μl der Enzym-Stammlösung während 24 Stunden bei 37°C erzeugt.
    • 1.8 Stopplösung. 0.5M EDTA (Promega CAS[6081/92/6]) wird mit ACE-Puffer 1:250 verdünnt, woraus sich eine 2 mM Lösung ergibt.
    • 1.9 Dimethylsulfoxid (DMSO).
    • 1.10 Magnesiumchlorid MgCl2.6H2O (Fisher MO600/53).
    • 1.11 Schwarze Platte mit 96 flachbodigen Vertiefungen (Costar 3915 oder Packard).
    • 1.12 Topseal A (Packard 6005185).
    • 1.13 Zentrifugenröhrchen
  • 2. SPEZIFISCHE AUSÜSTUNG
    • 2.1 Sorvall RC-5B Zentrifuge (SS34 GSA Rotor, vorgekühlt auf 4°C).
    • 2.2 Braun Miniprimer Mixer.
    • 2.3 Beckman CS-6R Zentrifuge.
    • 2.4 BMG Fluostar Galaxy.
    • 2.5 Wesbart 1589 Schüttelinkubator.
  • 3. METHODEN
    • 3.1 GEWEBE-PRÄPARATION
    • 3.3 Menschliches ACE wird aus dem Nierenkortex unter Verwendung einer aus Booth, A.G. & Kenny, A.J. (1974) Biochem. J. 142, 575–581 angepassten Methode erhalten.
    • 3.3 Gefrorene Nieren werden auf Raumtemperatur auftauen gelassen und der Kortex wird von der Medulla abgetrennt.
    • 3.4 Der Kortex wird fein zerschnitten und in ungefähr 10 Volumina des Homogenisationspuffers 1 (1.4) unter Verwendung eines Braun Miniprimer (2.2) homogenisiert.
    • 3.5 Magnesiumchlorid (1.11) (20.3 mg/g Gewebe) wird zum Homogenisat zugegeben und während 15 Minuten in einem Eiswasserbad gerührt.
    • 3.6 Das Homogenisat wird während 12 Minuten mit 1,500 g (3,820 rpm) in einer Beckman Zentrifuge (2.3) zentrifugiert, anschliessend wird der Überstand in ein frisches Zentrifugenrohr transferiert und das Pellet verworfen.
    • 3.7 Der Überstand wird während 12 Minuten mit 15,000 g (12,100 rpm) in einer Sovall Zentrifuge (2.1) zentrifugiert, und der Überstand wird verworfen.
    • 3.8 Die hellrosa Phase am oberen Ende des verbleibenden Pellets wird entfernt und in Homogenisationspuffer 2 (1.5) (5 ml Puffer pro 1 g Gewebe) resuspendiert.
    • 3.9 Die Suspension wird während 12 Minuten bei 2,200 g (4,630 rpm) in einer Beckman Zentrifuge zentrifugiert, und anschliessend wird das Pellet verworfen.
    • 3.10 Der Überstand wird während 12 Minuten bei 15,000 g (12,100 rpm) unter Verwendung der Sorvall Zentrifuge zentrifugiert, und der Überstand wird verworfen.
    • 3.11 Das finale Pellet wird in Homogenisationspuffer 2 (0.5 ml Puffer pro 1 g Gewebe) resuspendiert. Eine homogene Suspension wird unter Verwendung eines Braun Miniprimer erhalten. Diese wird dann in 100 μl Aliquoten für die Bestimmung der NEP-Aktivität eingefroren.
  • 4.0 BESTIMMUNG DER ACE-AKTIVITÄT
  • Die Aktivität des vorgängig aliquotierten ACE wird aufgrund seiner Fähigkeit, das ACE-spezifische Peptid-Substrat zu spalten, gemessen.
  • Schweine-ACE (1.2) wird aufgetaut und in ACE-Puffer (1.6) bei 0.004U/μl resuspendiert, und dies wird in 50 μl Aliquoten eingefroren.
    • 4.1 Es wird eine 4%-ige DMSO/ACE-Pufferlösung (4 ml DMSO in 96 ml ACE-Puffer) hergestellt.
    • 4.2 Substrat (1.7), Gesamtprodukt (1.8) und Enzym (1.1, 1.2, 1.3) werden zum Auftauen auf Eis belassen.
    • 4.3 50 μl 4%-ige DMSO/ACE-Pufferlösung werden in jede Vertiefung gegeben.
    • 4.4 Die 2 mM Substrat-Stammlösung wird 1:100 verdünnt, woraus sich eine 20 μM Lösung ergibt. 100 μl des 20 μM Substrats werden in jede Vertiefung gegeben (Endkonzentration im Assay 10 μM).
    • 4.5 50 μl einer Reihe von Enzymverdünnungen werden zugegeben, um die Reaktion auszulösen (gewöhnlich werden 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1600 und 1:3200 verwendet). 50 μl des ACE-Puffers werden in die leeren Vertiefungen gegeben.
    • 4.6 Das 2 mM Gesamtprodukt wird 1:200 verdünnt, woraus sich eine 10 μM Lösung ergibt. 200 μl des 10 μM Produkt werden in die ersten vier Vertiefungen einer neuen Platte gegeben.
    • 4.7 Die Platten werden während 60 Minuten bei 37°C in einem Schüttelinkubator inkubiert.
    • 4.8 Die Enzymreaktion wird durch Zugabe von 100 μl 2 mM EDTA in ACE-Puffer gestoppt und während 20 Minuten bei 37°C in einem Schüttelinkubator inkubiert, und anschliessend auf dem BMG Fluostar Galaxy (ex320/em420) vermessen.
  • 5. ACE-INHIBITIONS-ASSAYS
    • 5.1 Substrat, Gesamtprodukt und Enzym-Stammlösungen werden zum Auftauen auf Eis belassen.
    • 5.2 Verbindungs-Stammlösungen werden in 100% DMSO hergestellt und 1:25 in ACE-Puffer verdünnt, woraus sich eine 4% DMSO-Lösung ergibt. Alle weiteren Verdünnungen werden in einer 4% DMSO/ACE-Pufferlösung (4 ml DMSO in 96 ml ACE-Puffer) durchgeführt.
    • 5.3 50 μl der Verbindung werden zweifach zur Platte mit 96 Vertiefungen gegeben, und 50 μl des 4% DMSO/ACE-Puffer werden in die Kontroll- und in die Blindvertiefungen gegeben.
    • 5.4 Die Schritte 5.2 und 5.3 können entweder manuell oder unter Verwendung des Packard Multiprobenroboters durchgeführt werden.
    • 5.5 Die 2 mM Substrat-Stammlösung wird mit ACE-Puffer 1:100 verdünnt, woraus sich eine 20 μM Lösung ergibt (10 μM Endkonzentration im Assay) (110 μl des 2 mM Substrats zu 10.89 ml Puffer zugegeben, ist für 1 Platte ausreichend).
    • 5.6 Die Enzym-Stammlösung wird mit ACE-Puffer verdünnt, gemäss Bestimmung aus Aktivitätstests (4.0).
    • 5.7 Die 2 mM Gesamtprodukt-Stammlösung wird 1:200 mit ACE-Puffer verdünnt, woraus sich eine 10 μM Lösung ergibt. 200 μl werden in die ersten vier Vertiefungen einer separaten Platte gegeben.
    • 5.8 Die 0.5 mM EDTA-Stammlösung wird 1:250 verdünnt, woraus sich eine 2 mM Stammlösung (44 μl EDTA zu 10.96 ml ACE-Puffer) ergibt.
    • 5.9 In jede Vertiefung der Platte mit 96 Vertiefungen werden die folgenden Reagenzien zugegeben: Tabelle 1: Reagenzien zur Platte mit 96 Vertiefungen gegeben
      Figure 02360001
    • 5.10 50 μl der höchsten Konzentration von jeder im Assay verwendeten Verbindung werden zweifach zur selben Platte mit 96 Vertiefungen gegeben wie das Gesamtprodukt (5.7). 150 μl des ACE-Puffers werden zugegeben, um etwaige Fluoreszenz der Verbindungen zu bestimmen.
    • 5.11 Die Reaktion wird durch Zugabe des ACE-Enzyms gestartet, und anschliessend wird während 1 Stunde bei 37°C in einem Schüttelinkubator inkubiert.
    • 5.12 Die Reaktion wird durch die Zugabe von 100 μl 2 mM EDTA gestoppt, woraufhin während 20 Minuten bei 37°C in einem Schüttelinkubator inkubiert wird, und schliesslich erfolgt die Ablesung mit dem BMG Fluostar Galaxy (ex320/em420).
  • 6. BERECHNUNGEN
  • Die Aktivität des ACE-Enzyms wird in Gegenwart und in Abwesenheit der Verbindung bestimmt und als prozentualer Anteil ausgedrückt.
  • FU = Fluorezenz-Einheiten
    • (i) %-Kontroll-Aktivität (Umsatz des Enzyms):
      Figure 02370001
    • (ii) %-Aktivität mit Inhibitor:
      Figure 02370002
    • (iii) Aktivität ausgedrückt als % der Kontrollen:
      Figure 02370003
    • (iv) %-Inhibition = 100 – %-Kontrolle
    • (v) Für fluoreszierende Verbindungen werden die mittleren FU von Blindproben, welche die Verbindung (5.10) enthalten, von den zur Berechnung der %-Aktivität verwendeten mittleren FU der Verbindungswerte substrahiert.
  • Eine sigmoidale Dosis-Antwort-Kurve wird an die %-Aktivitäten (% Kontrolle) vs. Verbindungskonzentration angepasst und IC50-Werte werden mittels der LabStats Ausgleichskurve in Excel berechnet.
  • SCHLUSSFOLGERUNGEN
  • Wir haben ein Tiermodell entwickelt, das die während der weiblichen sexuellen Erregung beobachtete physiologische Erregungsantwort widerspiegelt und die bei menschlichen Probanden erhaltenen klinisch Daten direkt widerspiegelt. Das Modell verwendet Laser-Doppler-Verfahren, um kleine, durch eine Pelvisnervstimulation oder durch vasoaktive Neurotransmitter induzierte Veränderungen des vaginalen und klitoralen Blutfluss zu erfassen. Während der sexuellen Erregung findet eine Erhöhung des genitalen Blutflusses aufgrund erhöhter Innervation des Pelvisnervs statt. Die im Tiermodell beobachtete pelvisnervstimulierte Erhöhung des vaginalen und klitoralen Blutflusses repräsentiert die während der weiblichen sexuellen Erregung beobachteten endogenen vaskulären Wirkungen – d.h. das Anschwellen. Demnach kann dieses Modell erstens verwendet werden, um die an der Regulation des vaginalen und klitoralen Blutflusses beteiligten Mechanismen zu identifizieren, und zweitens, um neue Ansätze für die Verstärkung des genitalen Blutflusses zu validieren.
  • In dieser Studie wurde erfolgreich eine Kombination von in vivo, in vitro und biochemischen Verfahren verwendet, um zu zeigen, dass VIP den genitalen Blutfluss vermittelt und um cAMP als den die genitale Vasorelaxation (und die Relaxation der Vaginawand) regulierenden Mediator/second Messenger zu identifizieren. Unter Verwendung dieses Tiermodells konnten wir zeigen, dass die Infusion von VIP Erhöhungen des vaginalen und klitoralen Blutflusses induziert. Unter Verwendung eines Inhibitor des VIP-Metabolismus (z.B. ein NEP-EC3.4.24.11-Inhibitor) konnte wir zudem zeigen, dass die während der Pelvisnervstimulation (d.h. während der sexuellen Erregung) beobachteten Erhöhungen des genitalen Blutflusses durch VIP vermittelt werden. Wir haben gezeigt, dass sich die VIP-vermittelten Erhöhungen des genitalen Blutflusses aus der Erhöhung von Gewebe-cAMP ergeben, wogegen früher für VIP eine Erhöhung des vaginalen Blutflusses bei gesunden Freiwilligen aufgezeigt aber der zelluläre Mechanismus nicht identifiziert wurde. Ausserdem haben wir gezeigt, dass der genitale Blutfluss direkt mit einem cAMP-Mimetikum oder indirekt durch Erhöhung der cAMP-Konzentrationen mit einem PDEcAMP-Typ-2-Inhibitor oder einem NPY-Y1-Rezeptorantagonisten erhöht werden kann.
  • Die wichtigste Ursache der FSAD ist ein verminderter genitaler Blutfluss, und dies manifestiert sich als ein verringertes vaginales, labiales und klitorales Anschwellen. Die Behandlung von Frauen mit FSAD lässt sich durch Wiederherstellung der normalen sexuellen Erregungsantwort erreichen. Dies kann durch Erhöhung des genitalen Blutflusses erreicht werden. Unser Ansatze zur Behandlung von FSAD wird darin bestehen, den genitalen Blutfluss zu erhöhen und dabei durch direkte oder indirekte Potenzierung der endogenen cAMP-Signalisierung, z.B. mit einem Inhibitor der NEP (EC 3.4.24.11), einem cAMP-hydrolysierenden PDE-Inhibitor oder einem NPY-Rezeptorantagonisten die vaginale Anschwellung/Lubrikation und die klitorale Anschwellung/Sensitivität zu potenzieren. Als Gesamtwirkung wird dies die normale Erregungsantwort ohne kardiovaskuläre Nebenwirkungen wiederherstellen oder potenzieren. Die sexuelle Erregung/Anschwellung wird verstärkt, nicht aber bei fehlendem sexuellen Begehren induziert wie dies mit einigen exogen verabreichten vasoaktiven Wirkstoffen wie VIP der Fall sein kann.
  • Zusammenfassend bezieht sich die vorliegende Erfindung demnach unter anderem auf:
    Verwendung eines Wirkstoffes zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von FSD, vorzugsweise FSAD; wobei der Wirkstoff zur Potenzierung von cAMP in den sexuellen Genitalien von an FSD, vorzugsweise FSAD, leidenden Frauen befähigt ist; wobei der besagte Wirkstoff ein I:NEP ist.
  • In einer besonders bevorzugten Ausgestaltung bezieht sich die vorliegende Erfindung unter anderem auf:
    Verwendung eines Wirkstoffes zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von FSD, vorzugsweise FSAD; wobei der Wirkstoff zur Potenzierung von cAMP in den sexuellen Genitalien von an FSD, vorzugsweise FSAD, leidenden Frauen befähigt ist; und wobei der besagte Wirkstoff oral verabreicht wird; wobei der besagte Wirkstoff ein I:NEP ist.
  • In einer weiteren besonders bevorzugten Ausgestaltung bezieht sich die vorliegende Erfindung unter anderem auf:
    Verwendung eines Wirkstoffes zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von FSD, vorzugsweise FSAD; wobei der Wirkstoff zur Potenzierung von cAMP in den sexuellen Genitalien von an FSD, vorzugsweise FSAD, leidenden Frauen befähigt ist; und wobei der besagte Wirkstoff das endogene cAMP potenziert; wobei der besagte Wirkstoff ein I:NEP ist.
  • In einer weiteren besonders bevorzugten Ausgestaltung bezieht sich die vorliegende Erfindung unter anderem auf:
    Verwendung eines Wirkstoffes zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung von FSD, vorzugsweise FSAD; wobei der Wirkstoff zur Potenzierung von cAMP in den sexuellen Genitalien von an FSD, vorzugsweise FSAD, leidenden Frauen befähigt ist; und wobei der besagte Wirkstoff oral verabreicht wird und wobei der besagte Wirkstoff das endogene cAMP potenziert; wobei der besagte Wirkstoff ein I:NEP ist.
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  • ABKÜRZUNGEN
    • FSD
    = weibliche Sexualstörung (female sexual dysfunction)
    FSAD
    = weibliche sexuelle Erregungsstörung (female sexual arousal disorder)
    cAMP
    = cyclisches Adenosin-3',5'-monophosphat
    cGMP
    = cyclisches Guanosin-3',5'-monophosphat
    PcAMP
    = Potenziator von cAMP
    PcGMP
    = Potenziator von cGMP
    AcAMP
    = Aktivator von cAMP
    AcGMP
    = Aktivator von cGMP
    AMcAMP
    = Adversmodulator von cAMP
    AMcGMP
    = Adversmodulator von cGMP
    IcAMP
    = Inhibitor von cAMP
    IcGMP
    = Inhibitor von cGMP
    I:IcAMP
    = Inhibitor eines Inhibitors von cAMP
    I:IcGMP
    = Inhibitor eines Inhibitors von cGMP
    I:AMcAMP
    = Inhibitor eines Adversmodulators von cAMP
    I:AMcGMP
    = Inhibitor eines Adversmodulators von cGMP
    U:AcAMP
    = Aufregulator(upregulator) eines Aktivators von cAMP
    U:AcGMP
    = Aufregulator(upregulator) eines Aktivators von cGMP
    AC
    = Adenylatcyclase
    A:AC
    = Aktivator von AC
    NEP
    = neutrale Endopeptidase
    I:NEP
    = Inhibitor von NEP
    VIP
    = vasoaktives intestinales Peptid
    VIPr
    = Rezeptor von VIP (kann als VIPR bezeichnet sein)
    VIPn
    = Rezeptor-Subtyp von VIP (wie VIPR1, VIPR2)
    A:VIPr
    = Aktivator von VIPr
    A:VIPn
    = Aktivator von VIPn
    I:VIPr
    = Inhibitor von VIPr
    I:VIPn
    = Inhibitor von VIPn
    I:I:VIPr
    = Inhibitor eines Inhibitors von VIPr
    I:I:VIPn
    = Inhibitor eines Inhibitors von VIPn
    PDE
    = Phosphodiesterase
    PDEn
    = PDE Familie (e.g. PDE1, PDE2 etc.)
    PDEcAMP
    = cAMP hydrolysierende PDE
    PDEcGMP
    = cGMP hydrolysierende PDE
    I:PDE
    = Inhibitor einer PDE
    I:PDEcAMP
    = Inhibitor einer cAMP hydrolysierenden PDE
    I:PDEcAMP
    = Inhibitor einer cAMP hydrolysierenden PDE- Familie
    NPY
    = Neuropeptid Y
    NPYr
    = Rezeptor von NPY (kann als NPYR bezeichnet sein)
    NPY Yn
    = Yn Rezeptor-Subtyp von NPY (z.B. NPY Y1) (z.B. NPYR1)
    I:NPY
    = Inhibitor von NPY
    I:NPY Yn
    = Inhibitor von NPY Yn
    kDa
    = Kilodalton
    bp
    = Basenpaare
    kb
    = Kilobasenpaare
  • In der wissenschaftlichen Literatur bis zu 1993 sind Beispiele für die Bestimmung der oralen Bioverfügbarkeit bei wachen Hunden aus den nachfolgenden Artikeln verfügbar:
    • 1. Bristol Myers Squibb für das orale Antibiotikum Cefprozil: Absolute Bioavailability of Cefprozil after Oral Administration in Beagles (Barbhaiya et al., 1992, Antimicrobial Agents and Chemotherapy, vol 36, pp 687-689)
    • 2. Carlo Erba für das Zytostatikum Iododoxorubicin: Pharmacokinetics of Iododoxorubicin in the Rat, Dog, and Monkey (Edwards et al., 1991, Drug Metabolism and Disposition, vol 19, pp 938–945)
    • 3. Eli Lilly für den experimentellen ZNS-antiischämischen Wirkstoff LY256548: Pharmacokinetics of a Novel Butylated Hydroxytoluene-Thiazolidinone CNS Antiischemic Agent LY256548 in Rats, Mice, Dogs, and Monkeys (Ruterbories and Lindstrom, 1990, Drug Metabolism and Disposition, vol 18, pp 674–679)
    • 4. Wellcome für den Folatantagonisten Piritrexim: The Disposition and Metabolism of [14C]Piritrexim in Dogs after Intravenous and Oral Administration (Woolley et al., 1991, Drug Metabolism and Disposition, vol 19, pp 1139–1146)
    • 5. ICI für das Antiandrogen Casodex: The Pharmacokinetics of Casodex in Laboratory Animals (Cockshott et al., 1991, Xenobiotica, vol 21, pp 1347-1355)
    • 6. Glaxo für den Calciumantagonisten Lacidipin: Absorption, Distribution and Excretion of Lacidipine, a Dihydropyridine Calcium Antagonist, in Rat and Dog (Pellegatti et al., 1990, Xenobiotica, 1990, vol 20, pp 765–777)
    • 7. Fujisawa für den Aldosereduktase-Inhibitor Zenarestat: Absorption, Distribution and Excretion of Zenarestat, a New Aldose Reductase Inhibitor, in Rats and Dogs (Tanaka et al., 1992, Xenobiotica, vol 22, pp 57–64)
  • In den obigen Beispielen wird für die Bestimmung der oralen Bioverfügbarkeit auch die Verwendung von wachen Mäusen, Ratten und Affen zitiert.
  • SEQUENZPROTOKOLLE
    Figure 02610001
  • Figure 02620001
  • Figure 02630001
  • Figure 02640001
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  • Figure 02670001
  • Figure 02680001
  • Figure 02690001
  • Figure 02700001
  • Figure 02710001
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  • Figure 02730001
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  • Figure 02750001
  • Figure 02760001
  • Figure 02770001
  • Figure 02780001

Claims (14)

  1. Verwendung eines Mittels zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von weiblicher Sexualstörung (FSD), wobei das Mittel ein Inhibitor von neutraler Endopeptidase (I:NEP) ist.
  2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei die I:NEP cAMP in den Geschlechtsorganen einer Frau, die unter FSD leidet, verstärkt, wobei das cAMP endogenes cAMP ist und wobei das endogene cAMP ein cAMP ist, das durch sexuelle Stimulation (sexuelle Erregung) entsteht.
  3. Verwendung nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei das I:NEP einen indirekten verstärkenden Effekt auf cAMP hat.
  4. Verwendung nach Anspruch 3, wobei das I:NEP auf natürlich gefundenes und lokalisiertes vasoaktives intestinales Peptid (VIP) wirkt.
  5. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das Medikament für die orale Verabreichung ist.
  6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die FSD weibliche sexuelle Erregungsstörung (FSAD) ist.
  7. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das I:NEP einen Ki-Wert von weniger als etwa 100 nM hat.
  8. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das I:NEP einen Ki-Wert von weniger als etwa 75 nM hat.
  9. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das I:NEP einen Ki-Wert von weniger als etwa 50 nM hat.
  10. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das I:NEP einen Ki-Wert von weniger als etwa 25 nM hat.
  11. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das I:NEP einen Ki-Wert von weniger als etwa 20 nM hat.
  12. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das I:NEP einen Ki-Wert von weniger als etwa 15 nM hat.
  13. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das I:NEP einen Ki-Wert von weniger als etwa 10 nM hat.
  14. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das I:NEP einen Ki-Wert von weniger als etwa 5 nM hat.
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