DE60021715T2

DE60021715T2 - Phospahatasen mit verbesserter phytase-aktivität

Info

Publication number: DE60021715T2
Application number: DE60021715T
Authority: DE
Inventors: Xingen Lei
Original assignee: Cornell Research Foundation Inc
Current assignee: Cornell Research Foundation Inc
Priority date: 1999-03-31
Filing date: 2000-03-31
Publication date: 2006-06-01
Anticipated expiration: 2020-04-01
Also published as: EP1165806A2; WO2000058481A2; US6511699B1; MXPA01009809A; ES2248067T3; WO2000058481A3; BR0009516A; AU4056700A; CA2365418C; US6974690B2; BR0009516B1; DE60021715D1; CN100347303C; EP1165806B1; ATE301198T1; CN1413253A; CA2365418A1; US20030072844A1; WO2000058481A9; DK1165806T3

Description

Die vorliegende Anmeldung zielt auf den Nutzen der Anmeldung zum Vorläufigen Patent Seriennr. 60/127.032 ab, die am 31. März 1999 eingereicht wurde.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Phytasen sind myo-Inositol-Hexakisphosphat-phosphohydrolasen, die die stufenweise Spaltung von anorganischem Orthophosphat aus Phytat (myo-Inositol-Hexakisphosphat) katalysieren. Es gibt zwei Arten von Phytasen. Eine wird 3-Phytase genannt (EC.3.1.3.8), die die Eliminierung von Phosphatgruppen in den Positionen 1 und 3 des Myo-Inositol.Rings in Gang setzt. Die andere wird 6-Phytase genannt (EC.3.1.3.26) und setzt zuerst das Phosphat in Position 6 des Rings frei. Auch wenn Phytasen in tierischen Geweben nicht identifiziert wurden, enthalten Pflanzen im Allgemeinen 6-Phytasen und eine große Vielfalt an Mikroorganismen, einschließlich Bakterien, fadenartiger Pilze und Hefen, produzieren 3-Phytasen (2–9). Aufgrund der Tatsache, dass mehr als 70% des gesamten Phosphors pflanzlicher Herkunft in Lebensmitteln und im Tierfutter in Form von Phytat vorliegt, das für Tiere mit einfachem Magen und Menschen nur selten verwertbar ist, werden Phytasen oft verwendet, um die mineralische Ernährung dieser Arten zu verbessern (10–16). Der Zusatz an mikrobiellen Phytasen in der Nahrung von Schweinen und Hühnervögeln potenziert wirksam die Bioverfügbarkeit des Phosphorphytats und reduziert die Notwendigkeit eines anorganischen Phosphorzusatzes (11–15), wodurch eine geringere Umweltverschmutzung aufgrund des Phosphors in Gebieten entsteht, in denen intensive Viehproduktion betrieben wird (8–15). Eine Ergänzung mit Phytase in relativ hohem Maße in der tierischen Nahrung ist allerdings notwendig (10–16), da sich wahrscheinlich durch die Proteolyse von Pepsin und Trypsin im Magen und Dünndarm eine beträchtliche Menge des Enzyms abbaut (13). Unterdessen wurden die Proteolyseprofile der verschiedenen Phytasen nicht erforscht. Klar ist, dass ein besseres Verständnis ihrer Hydrolyseempfindlichkeit für Trypsin und Pepsin dabei helfen könnte, den Nährwert der Phytasen zu verbessern. Es erfolgte eine Überexpression des Gens der Phytase Aspergillus niger phyA) in seinem Ursprungswirt (17) und das rekombinante Enzym(r-PhyA, EC.3.1.3.8) wurde in der Tiernahrung als eine handelsübliche Phytase verwendet. Bei diesem Enzym handelt es sich um ein Glukoprotein von ungefähr 80 kDa. Außerdem wurde das Gen der Phosphatasesäure Escherichia coli (appA) mit einem pH-Wert von 2,5 gekennzeichnet (18, 19). Experimente an Tieren haben bewiesen, dass das rekombinante Enzym (r-AppA, EC.3.1.3.2) in der Freisetzung von Phosphorphytat in Tiernahrung so wirksam ist wie r-PhyA (14).
Der Aufwand bei der Zufuhr von nur begrenzt im Handel zur Verfügung stehender Phytase aber und die instabile Aktivität des Enzyms bei der Wärme der Futterkörnung verhindern ihren praktischen Einsatz in der Tierindustrie. Für den Einsatz in Tierfutter besteht infolgedessen eine Notwendigkeit an Enzymen, die ein hohes Maß an Phytase-Aktivität und ein hohes Maß an Stabilität besitzen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung schlägt eine Phosphatase vor, die eine verbesserte Phytase-Aktivität besitzt, ein isoliertes Nukleinsäure-Molekül, das die Phosphatase kodiert, einen Vektor, der das Nukleinsäure-Molekül trägt, eine Wirtszelle, die mit dem Vektor verändert ist und ein verbessertes Tierfutter, das die Phosphatase umfasst, so wie sie in Patentanspruch 1 definiert ist.
KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt die Veränderung in der Phytase-Aktivität nach der Verdauung mit Protease 1A zeigt die Veränderungen in der Phytase-Aktivität von r-PhyA und r-AppA, die in unterschiedlichen Verhältnissen von Trypsin/Protein (w/w) inkubiert wurden (r = 0,001; 0,005; 0,01 und 0,025). Symbole:r-PhyA (∎) und r-AppA. Die Ergebnisse sind der Mittelwert ± SEM aus fünf unabhängigen Experimenten. * gibt die statistische Wertigkeit (P < 0,01) gegenüber der Kontrolle von unbehandelten r-PhyA oder r-AppA an.
1B zeigt die Veränderungen in der Phytase-Aktivität von r-PhyA und r-AppA, die in unterschiedlichen Verhältnissen von Trypsin/Protein (w/w) inkubiert wurden (r = 0,001; 0,002; 0,005 und 0,01). Symbole:r-PhyA (☐) und r-AppA (o). Die Ergebnisse sind der Mittelwert ± SEM aus sieben unabhängigen Experimenten. * gibt die statistische Wertigkeit (P < 0,01) gegenüber der Kontrolle von unbehandelten r-PhyA oder r-AppA an.
2 zeigt die verbleibende Phytase-Aktivität von r-PhyA und r-AppA nach der Trypsin- oder Pepsinhydrolyse in der Zeit (0, 1, 51 30 und 120 min). Symbole: mit Trypsin verdaute r-PhyA (∎) oder r-AppA (•); mit Trypsin verdaute r-PhyA (☐) und r-AppA (o). Das verwendete Verhältnis von Trypsin/Phytase (w/w) betrug: r = 0,01 (w/w). Das verwendete Verhältnis von Pepsin/Phytase betrug r = 0,005. Die Ergebnisse sind der Mittelwert ± SEM aus sechs unabhängigen Experimenten. * gibt die statistische Wertigkeit (P < 0,01) gegenüber der Kontrolle von unbehandelten r-PhyA oder r-AppA an.
3 zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese in SDS-Polyacrylamid-Gel der verdauten Produkte mit r-AppA (12%, Schautafel A) oder r-PhyA (20%, Schautafel B) nach unterschiedlichen Trypsinmengen (p = 0,001; 0,005; 0,01 und 0,025 (w/w)). Die Proteine verfärbten sich bei der Verwendung von Coomassie-Blau. T: Trypsinkontrolle, C: gereinigte r-AppA (Schautafel A) oder r-PhyA (Schautafel B) Der Proteinindikator (M) ist ein Maßstab von 10 kDa (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 und 200 kDa) (Gibco). Die Ergebnisse sind aus vier unabhängigen Experimenten repräsentativ.
4 zeigt die Ergebnisse der Elektrophorese in SDS-Polyacrylamid-Gel (20%) der mit r-AppA (4A) oder r-PhyA (4B) verdauten Produkte nach unterschiedlichen Pepsinmengen (r = 0,001; 0,002; 0,005 und 0,01 (w/w)). Die Proteine verfärbten sich bei der Verwendung von Coomassie-Blau. T: Trypsinkontrolle, C: gereinigte r-AppA (4A) oder r-PhyA (4B). Der Proteinindikator (M) ist ein Maßstab von 10 kDa (10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120 und 200 kDa) (Gibco). Die Ergebnisse sind aus sechs unabhängigen Experimenten repräsentativ.
5 zeigt die Menge an anorganischem Phosphor (P_i), der durch r-PhyA und r-AppA aus Sojamehl freigesetzt wurde, die in unterschiedlichen Trypsinkonzentrationen (p = 0,001; 0,005; 0,01 und 0,025 w/w) (5A) oder Pepsinkonzentrationen (p = 0,001, 0,002; 0,005 und 0,01) (5B) inkubiert wurden. Symbole: r-AppA (∎), r-PhyA (☐). Die Ergebnisse sind der Mittelwert ± SEM aus drei unabhängigen Experimenten. * gibt die statistische Wertigkeit (P < 0,01) gegenüber der Kontrolle von unbehandelten r-AppA oder r-PhyA an.
6 zeigt die Nukleotid-Sequenz des Gens appA2 (SEQ. ID. Nr. 1) und seine abgeleitete Aminosäure-Sequenz (SEQ. ID. Nr. 9). Der nicht übertragene Bereich ist mit Kleinbuchstaben angegeben. Bei den unterstrichenen Sequenzen handelt es sich um die Primer, die für die Erweiterung von appA2 verwendet wurden (Pf1:1–22 und K2:1468–1490), appA2 (E2:243–252 und K2:1468–1490). Die potentiellen Glykosilationsorte befinden sich in Kasten. Die Sequenz von appA2 wurde an die Datenbank Genebank unter der Zugriffsnummer 250016 übermittelt.
7 ist eine Zeitstudie der Aktivitäten der Phytase (☐) und der Phosphatasesäure (∎) außerhalb der Zelle, und der Expression des RNS-m CIPPA2 (
in Pichia pastoris, die nach der Induktion mit appA2 verändert wurde. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM aus drei Experimenten ausgedrückt.
8 zeigt eine Northern-Blot-Analyse der Expression RNS-m appA2 in Pichia pastoris, die nach der Induktion mit appA2 verändert wurde (8A). Die Hybridisierung wurde ausgeführt, wobei als Probe appA2 verwendet wurde, das mit [α–³²P] gekennzeichnet ist. 20 μg der gesamten RNS wurden pro Strang eingefüllt. Die Schautafel B stellt die Füllung einer gleichen Menge RNS dar, was durch die Hefe-RNS-r unter UV-Licht sichtbar gemacht ist.
9 zeigt die pH-Abhängigkeit der Enzym-Aktivität bei 37° C von den gereinigten r-appA2 (•), r-appA (
) und r-phyA (☐) mit Natriumphytat als Substrat. Puffer: 0,2 M HCl/Glycin, pH 1,5–4,5; 0,2 M Citrat, pH 5,5–7,5, 0,2 M Tris-HCl, pH 8,5. Die Ergebnisse sind als Mittelwert + SEM aus drei Experimenten ausgedrückt.
10 zeigt eine Analyse der Elektrophorese der remanenten Phosphatasesäure Aktivität von r-AppA2 in nicht denaturiertem Gel (15%) nach der Inkubation bei verschiedenen Temperaturen über 20 Min. hinweg. Nach der Wärmebehandlung, wurden die Proben 5 Min. in Eis gelegt, bevor sie in das Gel gefüllt wurden (200 μg Proteine/Strang).
11 zeigt die Phosphorphytathydrolyse in Sojamehl mit verschiedenen Mengen (100, 300, 600 und 900 PU) an den gereinigten Enzymen r-appA2 (•), r-appA (
) und r-phyA (☐). * gibt bedeutende Unterschiede (P < 0,05) zwischen r-appA und den anderen beiden Enzymen an. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM aus drei Experimenten ausgedrückt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung schlägt eine Phosphatase vor, die eine verbesserte Phytase-Aktivität besitzt.
Die verbesserte Phosphatase kann in Tierfutter verwendet werden, damit das Tier einen besseren Zugriff auf das Phosphat erlangt.
Die Erfindung schlägt eine Phosphatase vor, die eine verbesserte Phytase-Aktivität besitzt, die die in SEQ. ID Nr. 9 gezeigte Aminosäure-Sequenz besitzt, wie sie in 6 gezeigt wird.
Vorzugsweise wird das Protein oder Polypeptid mit Phytase-Aktivität durch eine Zelle auf dem Nährboden ausgeschieden. Dadurch kann ein höheres Expressionsniveau und eine leichtere Isolierung des Produktes erzielt werden. Das Protein oder Polypeptid mit Phytase-Aktivität verbindet sich mit einer Signalsequenz, mit deren Hilfe das Protein aus der Zelle geleitet werden kann. Vorzugsweise spaltet Signalsequenz das Protein auf.
In einer bevorzugten Ausführungsform verbindet sich das heterologe Gen, das ein Protein oder Polypeptid mit Phytase-Aktivität kodiert, im Gleichtakt mit einem Verstärkerelement der Übertragung.
Das Gen appA von E. Coli hat eine bevorzugte Phosphatase kodiert. Das Gen, das ursprünglich als E. Coli-Gen des Phosphohydrolase-Phosphoanhydrid-Periplasma (appA) definiert war, enthält 1298 Nukleotide (Zugriffsnummer bei der GeneBank: M58708). Zu Beginn kodierte das Gen in E. coli ein Phosphatasesäureprotein mit einem pH-Optimum von 2,5 (EcAP). Die Phosphatasesäure ist ein Monomer mit einer Molekülmasse von 44644 Da. Die reife EcAP enthält 410 Aminosäuren (18). Ostanin et al. bewirkten eine Überexpression von appA in E. coli BL21, wobei sie einen Vektor pT7 verwendeten und seine Phosphatase-Aktivität um ungefähr das 400-fache (440 mU/mg Protein) steigerten. Es ist vorher nicht bewiesen worden, dass das Produkt des Gens appA Phytase-Aktivität hätte.
Die Phosphatase kann in einem prokaryontischen oder eukaryontischen Expressionssystem ausgedrückt werden. Es können verschiedene Wirt-Vektor-Systeme verwendet werden, um die Sequenz oder Sequenzen, die die Proteine kodieren, auszudrücken. Die bevorzugten Vektoren schließen einen Virusvektor, ein Plasmid, ein Kosmid oder ein Oligonukleotid ein. Das Vektorensystem muss vor allem mit der verwendeten Wirtszelle kompatibel sein. Die Wirtszellen-Systeme schließen, wenn auch ohne Beschränkung, die folgenden ein: Bakterien, die mit DNS-Bakteriophagen, DNS-Plasmid oder DNS-Kosmid verändert sind; Mikroorganismen wie Hefen, die Hefevektoren enthalten; Zellensysteme von Säugetieren, die mit einem Virus infiziert sind (zum Beispiel virus vaccinia, Adenovirus, etc.); Zellensysteme von Insekten, die mit einem Virus infiziert sind (zum Beispiel Baculovirus) und Pflanzenzellen, die mit Bakterien infiziert sind. Die Expressionselemente dieser Vektoren variieren in ihrer Potenz und ihren Spezifitäten. In Abhängigkeit des verwendeten Wirt-Vektor-System können beliebige der verschiedenen adäquaten Transkriptions- und Übersetzungselemente verwendet werden.
Die für die Phosphataseexpression bevorzugten Wirte umfassen Pilzzellen; fadenartige Hefe- oder Pilzarten können ebenfalls in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung als Wirtszellen verwendet werden. Die bevorzugten Hefewirtszellen umfassen verschiedene Stämme von Saccharomyces cerevisiae. Es können auch andere Hefen wie Kluyveromyces, Torulaspora und Schizosaccharomyces verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der für die Überexpression des Proteins verwendete Hefestamm Saccharomyces cerevisiae. Die fadenartigen Pilzwirtszellen umfassen Aspergillus und Neurospora.
Der Hefestamm kann ein methylotropher Hefestamm sein. Die methylotrophen Hefen sind solche Hefesorten, die Methanol als Kohlenstoffquelle für die Produktion der Energiereserven nutzen können, die für die Aufrechterhaltung der Zellenfunktion nötig sind und ein Gen für die Expression von Alkohol-Oxidase enthalten. Die typischen methylotrophen Hefen umfassen Mitglieder der Sorten Pichia, Hansenula, Torulopsis, Candida und Karwinskia. Diese Hefesorten können Methanol als einzige Kohlenstoffquelle verwenden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der methylotrophe Hefestamm Pichia pastoris.
Das Protein oder Polypeptid, das eine Phytase-Aktivität besitzt, kann eine optimale Aktivität in einem Temperaturbereich von 57 bis 65° C besitzen. Eine bevorzugtere Ausführungsform ist ein Protein oder Polypeptid, das eine Phytase-Aktivität besitzt, in der deren optimale Aktivität in einem Temperaturbereich von 58 bis 62° C liegt.
Eine weitere ebenfalls bevorzugte Ausführungsform ist ein Protein oder Polypeptid, das eine Phytase-Aktivität besitzt, in der das Protein mindestens 40% seiner Aktivität behält, nachdem das Protein 15 Minuten lang bei 80° C erwärmt wurde. Bevorzugter ist es ein Protein oder Polypeptid, das eine Phytase-Aktivität besitzt, in der das Protein mindestens 60% seiner Aktivität behält, nachdem das Protein 15 Minuten lang bei 60° C erwärmt wurde.
Das reine Protein kann mit mehreren Methoden erhalten werden. Das Protein oder Polypeptid der vorliegenden Erfindung wird vorzugsweise in reiner Form (vorzugsweise mit einem Reinheitsgrad von mindestens ungefähr 80%, bevorzugter von 90%) mit herkömmlichen Verfahrensweisen hergestellt. Typischerweise wird das Protein oder Polypeptid der vorliegenden Erfindung im Nährboden der rekombinanten Wirtszellen ausgeschieden. Alternativ wird das Protein oder Polypeptid der vorliegenden Erfindung im Nährboden hergestellt, aber dort nicht ausgeschieden. In solchen Fällen wird, um das Protein zu isolieren, die Trägerwirtszelle eines rekombinanten Plasmids fortgepflanzt, durch Sonikation lysiert, erwärmt oder chemisch behandelt und das homogenisierte Gemisch zentrifugiert, um die Zellenreste zu entfernen. Anschließend wird das Überschüssige mit Ammoniaksulfat sequentieller Präzipitation unterworfen. Die Fraktion, die das Polypeptid oder Protein der vorliegenden Erfindung enthält, wird einer Filtration in Gel in einer Dextran- oder Polyacrylamid-Kolonne geeigneter Größe unterworfen, um die Proteine zu trennen. Wenn es nötig ist, kann die Proteinfraktion nachträglich mit HPLC gereinigt werden.
Der Hefestamm kann ein heterologes Gen besitzen, das ein Protein oder Polypeptid mit einer Phytase-Aktivität kodiert. Das heterologe Gen muss funktionell mit einem Promotoren vereinigt sein, der die Phytase in Hefen ausdrücken kann, und von einem Transkriptionsterminatoren gefolgt sein.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung ist auch ein Vektor für die Expression der Phytase in einem Wirt. Der Vektor trägt ein Phosphatase-Gen, das ein Protein oder Polypeptid mit einer Phytase-Aktivität kodiert.
Zur Klonung in der Hefe kann das Gen in jedem beliebigen Vektor geklont werden, der sich autonom replizieren oder sich in dem Genom der Hefe integrieren kann. Die Anzahl der Plasmidkopien, die sich autonom replizieren, zum Beispiel YEp Plasmide, kann hoch, aber ihre mitotische Stabilität unzureichend sein (48). Sie können die 2 mu-Plasmid-Sequenz, die für die autonome Replikation verantwortlich ist, und eine E. coli-Sequenz, die für die Replikation in E. coli verantwortlich ist, enthalten. Die Vektoren enthalten vorzugsweise einen genetischen Indikator für die Auswahl Hefe-Transformanten und ein antibiotisches Resistenzgen für die Auswahl in E. coli. Die episomale Vektoren, die die ARS- und CEN-Sequenzen enthalten, erscheinen als einzige Kopie pro Zelle und sind stabiler als die YEp-Vektoren. Integrative Vektoren werden verwendet, wenn ein DNS-Fragment als Kopie oder mehrere Kopien im Hefegenom integriert wird. In diesem Fall ist die rekombinante DNS stabil und bedarf keiner Auswahl (49–51). Einige Vektoren besitzen einen Replikationsursprung, der in der ausgewählten Wirtszelle abläuft. Die adäquaten Replikationsursprünge umfassen 2μ, RSS1 und 25 μM. Die Vektoren besitzen Orte für Restriktionsendonukleasen für die Einsetzung des Fusionsgens und Promotoren-Sequenzen sowie Auswahlindikatoren. Die Vektoren können modifiziert werden, um Restriktionsorte zu entfernen oder hinzuzufügen, oder andere unerwünschte Nukleotide zu entfernen.
Das Phytasegen kann unter die Kontrolle jedes beliebigen Promotors gestellt werden (52). Es kann ein konstitutiver oder ein regulierter Hefe-Promotor gewählt werden. Die adäquaten Promotoren-Sequenzen für Hefevektoren umfassen unter anderem Promotoren für Metallothionin, 3-Phosphoglycerat-Kinase (53) und weitere glykolytische Enzyme (54), so wie Enolase, Glyceraldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvat-Decarboxilase, Phosphofructokinase, 6-Phosphat-Glukose-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvatkinase, Triphosphat-Isomerase, Phosphoglukose-Isomerase und Glukokinase. Weitere für die Expression von Hefen eingesetzte adäquate Vektoren und Promotoren werden ausführlicher in EP A-73.657 von Hitzeman beschrieben, das diesem Dokument als Referenz beigefügt ist. Eine weitere Alternative ist der Glukose abwehrende Promotor ADH2, der diesem Dokument als Referenz beigefügt ist.
Es kann ein konstitutiver oder ein regulierter Hefe-Promotor gewählt werden. Die leistungsfähigen Promotoren von, z.B. dem Gen der Phosphoglycerat-Kinase (PGK), weiteren Genen, die glykolytische Enzyme kodieren, und dem Gen des Alpha-Faktors, sind konstitutive Promotoren. Wenn ein konstitutiver Promotor verwendet wird, wird das Produkt während des Zellenwachstums synthetisch hergestellt. Der ADH2-Promotor wird mit Äthanol und Glukose, die GAL-1-10- und GAL7-Promotoren mit Galaktose und Glukose, der PHO5-Promotor mit Phosphat und der Metallothionin-Promotor mit Kupfer reguliert. Die Thermoschock-Promotoren, zu denen der HSP150-Promotor gehört, sind über die Temperatur reguliert. Es können auch hybride Promotoren verwendet werden. Ein regulierter Promotor wird verwendet, wenn eine anhaltende Expression des gewünschten Produkts die Wirtszellen schädigt. Anstelle von Hefepromotoren kann ein leistungsfähiger prokaryontischer Promotor, wie der T7-Promotor, verwendet werden, in diesem Fall muss jedoch der Hefestamm mit einem Gen, das die Polymerase jeweils kodiert, transformiert werden. Um die Transkription abzuschließen, wird der HSP150-Terminator oder ein beliebig anderer funktioneller Terminator verwendet. Hier sind die Promotoren und Terminatoren als Kontrollelemente bezeichnet. Die vorliegende Erfindung ist auf keinen spezifischen Vektor, Promotor oder Terminator beschränkt.
Der Vektor kann auch einen auswählbaren Indikator tragen. Die auswählbaren Indikatoren sind häufig antibiotische Resistenzgene oder Gene, die die Hefestämme, die klar gekennzeichnete metabolische Defizienzen, wie Mutanten, die Tryptophan- oder Histidindefizienzen haben, besitzen. Die bevorzugten auswählbaren Indikatoren umfassen URA3, LEU2, HIS3, TRP1, HIS4, ARG4 oder antibiotische Resistenzgene.
Der Vektor kann auch einen Replikationsursprung besitzen, der eine Replikation in einer Bakterienzelle bewirken kann. Die Vektorenmanipulation ist in Bakterienstämmen wirksamer. Die bevorzugten Bakterien-Replikationsursprünge sind ColE1, Ori oder oriT.
Es kann auch eine Führersequenz der Hefe- oder Phytasegene oder anderer Quellen verwendet werden, um die Ausscheidung des in dem Medium ausgedrückten Phytaseenzyms zu unterstützen. Die vorliegende Erfindung ist auf keinen spezifischen Typ Führersequenz oder Signalpeptid beschränkt.
Die adäquaten Führersequenzen umfassen die Führersequenz des Alpha-Faktors von Hefen, die für die direkte Ausscheidung der Phytase verwendet werden kann. Die Führersequenz des Alpha-Faktors wird häufig zwischen die Promotorensequenz und die Sequenz des strukturellen Gens eingefügt (58; US-Patent Nr. 4,546,082 und in Europa veröffentlichte Patentanmeldung Nr. 324.274, die diesem Dokument als Referenzen beigefügt sind). Eine weitere adäquate Führersequenz ist die S. Cerevisiae-MF Alpha I (Alpha-Faktor), die synthetisch als Präproform aus 165 Aminosäuren hergestellt wird, die das Signal oder Präpeptid aus 19 Aminosäuren, gefolgt von einem "Führer" oder Propeptid aus 64 Aminosäuren umfassen, und die drei Glykosilationsorte mit N-Verbindung, gefolgt von (LysArg(Asp/Glu,Ala)2-3 Alpha-Factor)4 besitzt (58). Der Führungssignalteil der preproMF Alpha 1 wurde ausgedehnt angewendet, um in S. Cerevisiae eine heterologe Proteinsynthese und -ausscheidung zu erlangen. Der Einsatz von homologen Signal-/Führerpeptiden für Hefen sind aus dem US-Patent Nr. 4,546,082, den europäischen Patentanmeldungen Nr. 116.201; 123.294; 123.544; 163.529 und 123.289 und der Patentanmeldung DK Nr. 3614/83 bekannt, die diesem Dokument als Referenz beigefügt sind. In der europäischen Patentanmeldung zum Nr. 123.289, die diesem Dokument als Referenz beigefügt ist, wird die Nutzung des Vorläufers des Faktors a von S. Cerevisiae beschrieben, während in WO 84/01153, das diesem Dokument als Referenz beigefügt ist, die Nutzung des Signalpeptids der Invertase Saccharomyces cerevisiae angegeben ist und die Anmeldung zum Deutschen Patent DK 3614/83, das diesem Dokument als Referenz beigefügt ist, die Nutzung des Signalpeptids PHO5 Saccharomyces cerevisiae für die Ausscheidung fremder Proteine angibt.
Das Führersignal des Saccharomyces cerevisiae-Alpha-Faktors (MF Alpha 1 oder MF Alpha 2) kann auch im Prozess einer in Hefen ausgedrückten heterologen Proteinausscheidung verwendet werden (US-Patent Nr. 4,546,082, europäische Patentanmeldung Nr. 16.201; 123.294 und 163.529, die diesem Dokument als Referenz beigefügt sind). Bewiesen wurde dies durch die Fusion einer DNS-Sequenz, die die S. cerevisiae-Signal-/Führersequenz MF Alpha I am äußersten Rand 5' des Gens für die Ausscheidung und Verarbeitung des gewünschten Proteins kodiert. Der Einsatz des Amylase-Signalpeptids der Speicheldrüse einer Maus (oder einem Mutanten von dieser) wurde beschrieben, um in den veröffentlichten PCT-Anmeldungen Nr. WO 89/02463 und WO 90/10075, die diesem Dokument als Referenzen beigefügt sind, die Ausscheidung von in Hefen ausgedrückten heterologen Proteinen vorzuschlagen.
Das US-Patent Nr. 5,726,038 beschreibt den Einsatz des Signalpeptids der aspartischen 3-Protease von Hefe, mit der eine verbesserte Ausscheidung der in Hefe ausgedrückten Proteine erreicht werden kann. Weitere adäquate Führersequenzen für die leichtere Ausscheidung rekombinanter Polypeptide aus Hefewirten sind dem Fachmann bekannt. Eine Führersequenz kann in der Nähe ihres Extrems 3' modifiziert werden, um einen oder mehrere Restriktionsorten zu enthalten. Dies wird die Fusion der Führersequenz mit dem strukturellen Gen erleichtern.
Die Tranformationsprotokolle von Hefen sind dem Fachmann bekannt. Ein solches Protokoll ist in Hinnen et al. (59) beschrieben. Das Protokoll von Hinnen et al. wählt Trp-Transformanten in einem trennscharfen Medium aus, in dem das trennscharfe Medium zu 0,67% aus einer Stickstoffbase von Hefen, zu 0,5% aus Kasaminosäuren, zu 2% aus Glukose, zu 10 μg/ml aus Adenin und zu 20 μg/ml aus Uracil besteht.
Das Gen kann in einem stabilen Expressionsvektor, einem künstlichen Chromosom oder durch Integration in das Chromosom der Hefewirtszelle erhalten werden. Die Integration in das Chromosom kann durch das Klonen des Phytase-Gens in einem Vektor erreicht werden, der mit dem Hefechromosom rekombiniert. Die adäquaten Vektoren können Nukleotid-Sequenzen umfassen, die mit Nukleotid-Sequenzen des Hefechromosoms homolog sind. Alternativ kann sich das Phytase-Gen zwischen Rekombinationsorten wie Transposons befinden, die das Gen im Chromosom mobilisieren.
Die Phytase kann hergestellt werden, wobei ein isoliertes Phosphatase-Gen, das ein Protein oder Polypeptid mit einer Phytase-Aktivität kodiert und das Gen in der Wirtszelle ausdrückt, befähigt wird. Die Phosphatase ist vorzugsweise eine mikrobielle Phosphatase. In einer bevorzugteren Ausführungsform ist die mikrobielle Phosphatase eine Escherichia coli-Phosphatase. Ebenso bevorzugt sind die mikrobiellen Phosphatasen AppA und AppA2.
Das Phytat kann sich in Inositol und anorganischen Phosphor umwandeln. Ein appA-Gen wird aus einem Organismus isoliert, wobei auf diesem Gebiet wohl bekannte Verfahren angewandt werden. Anschließend wird ein Protein oder Polypeptid mit einer Phytase-Aktivität aus dem Gen in einer Wirtszelle ausgedrückt. Das erhaltene Protein oder Polypeptid wird gemischt oder tritt mit dem Phytat in Kontakt. Dieses Verfahren ist besonders zweckmäßig, um das Phytat von Lebensmitteln oder Tierfutter zu behandeln.
Das bevorzugte appA-Gen wird aus Escherichia coli isoliert.
Während das in einem Hefesystem produzierte Phytase-Enzym Phytat-P aus Mais und Soja ebenso wirksam wie die derzeit handelsübliche Phytase freisetzte, schien es wärmebeständiger zu sein. Dieses Überexpressionssystem von Phytase in Hefen kann verwendet werden, um eine wärmebeständige Phytase für ihren Einsatz in der Lebensmittel- und Futterindustrie zu liefern.
BEISPIELE
Beispiel 1 – Materialien und Methoden für die Beispiele 2–6
Expression r-AppA. Das Gen appA (Zugriffsnummer auf die Genebank M58708) wurde aus dem Stamm E. coli BL21 erhalten, der mit einem Expressionsvektor pAPPA1 (20) verändert ist. Nach den Anweisungen des Herstellers (Perkin Elmer) wurde ein DNS-Fragment durch PCR um 1,35 kb erweitert, das den Kodierungsbereich appA enthielt. Die Primer wichen von den Bereichen 5' und 3' der Nukleotid-Sequenz ab (18) und umfassen: E2 [direkt: 242–252]: 5'GGAATTCCAGAGTGAGCCGGA3' (SEQ. ID Nr. 2) und K2 [umgekehrt: 1468–1490]: 5'GGGGTACCTTACAAACTGCACG3' (SEQ. ID Nr. 3). Diese beiden Primer wurden in den Einrichtungen für Oligonukleotid-Synthese der Universität von Cornell (Ithaca, NY) synthetisch hergestellt. Das erweiterte Produkt wurde aus einem 1%igen Agargel ausgeschnitten und mit dem Test-Kit GENECLEAN herausgelöst Π (Bio101). Das reine Fragment wurde zuerst in einem Vektor pGEM T-easy (Promega) geklont und anschließend in den Expressionsvektor von Hefen pPIcZαA (Invitrogen) am Ort EcoRI eingesetzt. Als ursprünglicher Wirt wurde der Stamm TOP10F' von E. coli (Invitrogen) verwendet, um diese beiden Konstruktionen zu erweitern. Der Vektor pPIcZαA, der appA enthielt, wurde gemäß der Anweisungen des Herstellers (Invitrogen) im Stamm X33 von P. pastoris durch Elektroporation transformiert. Die transformierten Zellen wurden auf Platten mit Agar YPD-Zystein-Medium gelegt und die positiven Bänder in geringen Medien mit Glyzerin (BMGY) 24 h lang inkubiert. Als die Zellendichte von Hefe 2,5 × 10⁸ Zellen/ml (DO₆₀₀ = 5) erreichte, wurden die Zellen zentrifugiert und im Medium mit 0,5%igem Methanol (BMMY) wieder suspendiert, um die Expression des Gens appA zu induzieren. Das gesamte DNS-Genom von Hefe wurde nach der Induktion aus den transformierten Zellen X33 herausgezogen und als Form verwendet, um die Präsenz des Gens appA durch PCR zu überprüfen, wobei die gleichen Primer, die oben beschrieben wurden, verwendet wurden. Das erweiterte DNS-Fragment wurde in den DNS-Einrichtungen und Dienstleistungen der Universität von Cornell sequenziert, wobei der automatische Sequencer Taq Cycle mit Terminatoren Dye Deoxy (Applied Biosystems, Forster City, CA) verwendet wurde.
Reinigung von r-PhyA und r-AppA. r-PhyA wurde von BASF erhalten (Mt Olive, NJ). Beide Enzyme, r-PhyA und r-AppA wurden anfangs wieder in 50 mM Tris-HCl, pH 7 suspendiert und 25% gesättigtes Ammoniaksulfat hinzugefügt. Nachdem das Gemisch zentrifugiert wurde (25.000 g, 20 Min.), wurde das Überschüssige auf später zurückgestellt und bis zu 75% gesättigtes Ammoniaksulfat hinzugefügt. Anschließend wurde das Gemisch zentrifugiert (25.000 g, 20 Min.) und das Sediment wieder in 10 ml von 25 mM Tris-HCl, pH 7 suspendiert. Die Suspension wurde eine Nacht lang gegen den gleichen Puffer dialysiert und in eine mit 25 mM Tris-HCl, pH 7 ausgeglichenen Kolonne DEAE-Sepharose (Sigma) gefüllt. Die Proteine wurden mit 0,2 M NaCl, 25 mM Tris-HCl, pH 7 versetzt, anschließend wurde die Kolonne mit 200 n-LL 25 mM Tris-HCl, pH 7 gewaschen. Die Phytase-Aktivität und die in allen Fraktionen aufgefangene Proteinkonzentration wurden getestet (21). Die vollständige Reinigung wurde bei 4° C durchgeführt und die Fraktionen wurden bei –20° C konserviert, bevor sie analysiert wurden.
Proteolyse und Elektrophorese von Proteinen. Gemäß den Vorschriften des Herstellers (Sigma) wurden die gereinigten r-AppA und r-PhyA (2 mg/ml) mit verschiedenen Mengen an Pepsin und Trypsin inkubiert. Das Pepsin (800 Einheiten/mg Protein) und das Trypsin (1.500 Einheiten BAEE/mg Protein) wurden jeweils in 10 mM HCl, pH 2 (0,1 mg/ml) und 80 mM Ammoniakhydrogenkarbonat, pH 7,5 (0,1 mg/ml) aufgelöst. Eine Einheit BAEE wurde definiert als eine Absorbensveränderung von 0,001 bis 253 nm pro Minute bei pH 7,6 und 25° C mit BAEE als Substrat. In einem Endvolumen von 100 μl wurden 10 μg mit Trypsin oder Pepsin gereinigte r-PhyA (0,1 PU) oder r-AppA (0,08 PU) in Protease/Phytase-Verhältnissen (p/p) inkubiert, die 1 bis 120 Min. bei 37° C zwischen 0,001 und 0,01 schwankten. Für die Elektrophorese von Proteinen und den Test der Phytase-Aktivität wurde die Umsetzung in Eis gestoppt und der pH-Wert des Gemischs auf 8 eingestellt. Die verdauten Proteingemische wurden mittels Elektrophorese in Dodecylsulfonat (SDS)-Acrylamid-Gele oder SDS-Polyacrylamid-Harnstoffen wie oben beschrieben analysiert (22, 23).
Phytase- und Hydrolyse Aktivität des Phosphorphytats aus Sojamehlen. Wie oben beschrieben wurde die Phytase-Aktivität sowohl von r-PhyA als auch von r-AppA vorher oder mit verschiedenen Proteolysezeitwerten bestimmt (24). Das freigesetzte anorganische Phosphor (P_i) wurde durch die Methode Chen et al. getestet (25). Eine Phytaseeinheit (PU) wurde als die Aktivität definiert, die 1 μmol P_i bei 37° C pro Minute aus Natriumphytat produziert. Um die Proteolysewirkungen des Trypsins oder Pepsins in den verbleibenden Aktivitäten von r-PhyA und r-AppA zu bestätigen, wurde ein Nachlauf der Hydrolyse des Phosphorphytats aus dem Sojamehl durch diese beiden Enzyme durchgeführt, die mit unterschiedlichen Mengen an Trypsin oder Pepsin inkubiert wurden. In 5 ml Gesamtreaktion wurden 0,5 mg mit 1 g Sojamehl und Pepsin gereinigte r-PhyA (5 PU) oder r-AppA (4 PU) in 10 mM HCl, pH 2,5 oder 0,2 M Trypsin, pH 6,8 in Citrat 2 h lang bei 3 VC inkubiert. Der freigesetzte P; wurde wie oben beschrieben bestimmt.
Beispiel 2 – Vorbereitung von r-AppA und r-PhyA.
Mehr als 30 X33-Bänder, die mit dem Gen appA verändert sind, drückten eine extrazellulare Phytase-Aktivität aus, die Natriumphytat hydrolytisch abspaltet. Die Kolonie 26 besaß die höchste Aktivität (88 U/ml) und wurde für spätere Studien ausgewählt. Nachdem die r-PhyA- und r-AppA-Proben aus der Kolonne DEAE-Sepharose herausgelöst waren, wurden von beiden Enzymen 45 Fraktionen von jeweils 4 ml aufgefangen, um die Phytase-Aktivität zu testen. Die für die Proteolyse verwendeten Fraktionen besaßen eine spezifische Phytase-Aktivität von jeweils 9,6 und 8,1 U/mg Protein für r-PhyA und r-AppA.
Beispiel 3 – Wirkungen bei der Verdauung mit Trypsin in den Phytase-Aktivitäten beider Enzyme.
Nach zweistündiger Verdauung mit Trypsin kam es in den verbleibenden Phytase-Aktivitäten zwischen r-PhyA und r-AppA zu beträchtlichen Unterschieden (1A). Obwohl beide Enzyme mehr als 85% ihrer ursprünglichen Aktivitäten bei den Verhältnissen Trypsin/Phytase 0,001 und 0,005 aufrechterhielten, verlor r-AppA jeweils 64 und 74% seiner ursprünglichen Aktivität bei den Verhältnissen 0,01 und 0,025. r-PhyA verlor währenddessen jeweils nur 14 und 23% seiner ursprünglichen Aktivität. Aufgrund des sichtlichen Unterschiedes in der Empfindlichkeit dieser beiden Enzyme bei der Verdauung mit Trypsin bei einem Verhältnis 0,01 wurde eine Zeitstudie mit diesem Verhältnis durchgeführt. Bis zur zweistündigen Verdauung mit Trypsin hielt r-PhyA 90% seiner ursprünglichen Aktivität weiter aufrecht (2). r-AppA verlor im Gegenzug 64, 77, 87 und 95% seiner ursprünglichen Aktivität jeweils nach 1, 5, 30 und 120 Minuten andauernder Verdauung.
Beispiel 4 – Wirkungen bei der Verdauung mit Pepsin in den Phytase-Aktivitäten beider Enzyme.
Nach zweistündiger Verdauung mit Pepsin war die verbleibende Phytase-Aktivität von r-AppA absolut unerwartet. Bei den Verhältnissen 0,001 und 0,002 blieb die Phytase-Aktivität unverändert oder stieg leicht. Bei den Verhältnissen 0,005 und 0,01 erhöhte sich die Phytase-Aktivität um 30% im Vergleich zum Anfangswert. r-PhyA indessen verlor bei diesen hohen Verhältnissen 58 und 77% seiner ursprünglichen Aktivität (1B). Aufgrund der beträchtlich unterschiedlichen Reaktionen zwischen r-PhyA und r-AppA beim Verhältnis 0,005 wurde dieses Verhältnis für eine darauf folgende Zeitstudie verwendet. Dabei kam es zu einem stufenweisen Anstieg der Phytase-Aktivität während der Zeit, in der r-AppA von 0 bis 30 Min. mit Pepsin inkubiert wurde. Danach wurden keine zusätzlichen Steigerungen beobachtet (2). r-PhyA verlor indessen 42, 73, 82 und 92% seiner ursprünglichen Aktivität nach jeweils 1, 5, 30 und 120 Minuten Inkubation.
Beispiel 5 – Elektrophorese in SDS-Polyacrylamid-Gel.
Als r-AppA mit Trypsin inkubiert wurde, baute sich das Enzymprotein bei den Verhältnissen von ungefähr 0,01 ab und war bei dem Verhältnis von 0,025 unsichtbar. In den drei niedrigen Trypsinverhältnissen gab es eine Anfangsbande bei ungefähr 28 kDa mit mehreren Banden zwischen dieser Bande und dem intakten Protein. Diese Anfangsbande reduzierte sich jedoch deutlich und die anderen Bande verschwanden mit den höchsten Trypsinverhältnissen (3A). Es entstanden viele Zwischenbande, als r-PhyA mit verschiedenen Mengen Trypsin inkubiert wurde und es gab mindestens drei sichtbare Bande mit dem höchsten Trypsinverhältnis (3B). Eine einzige Bande bei ungefähr 8,4 kDa wurde nachgewiesen, als r-AppA mit Pepsin im Verhältnis von über 0,002 inkubiert wurde (4A). Andererseits entstanden bei der Proteolyse von r-PhyA mit verschiedenen Mengen Pepsin neben einem Anfangsfragment von ungefähr 14 kDa schleppend viele diffuse Flecke (4B).
Beispiel 6 – Wirkungen der Proteolyse in der Hydrolyse von Phosphorphytat durch r-PhyA und r-AppA.
Als r-AppA mit Sojamehl und verschiedenen Mengen Trypsin 2 h lang bei 37° C inkubiert wurde, betrug der Rückgang in der Freisetzung von P_i aus dem Sojamehl 3, 13, 34 und 52% bei den Verhältnissen von jeweils 0,001, 0,005, 0,01 und 0,025 (5A). Der Rückgang bei r-PhyA betrug währenddessen unter der gleichen Bedingung jeweils 3, 6, 13 und 28%. Bei der Zusetzung von Pepsin zu r-AppA (Verhältnis 0.005) und dem Sojamehlgemisch ergab sich ein Anstieg von ungefähr 30% bei der Freisetzung von P_i aus dem Sojamehl im Vergleich zur Kontrolle (5B). Die gleichen Behandlungen bewirkten im Gegenzug einen Rückgang von mehr als 50% bei der Freisetzung von P_i durch r-PhyA.
Bis zu diesem Zeitpunkt waren keine spezifischen Daten über die Empfindlichkeiten mikrobieller Phytasen für Trypsin und Pepsin vorhanden. In dieser Studie wurden zwei rekombinante teilweise gereinigte Phytasen mit einer einzigen Protease Verdauungen unterworfen und die Wirkungen bei der Proteolyse auf ihre verbleibenden Aktivitäten und ihre Fähigkeit, Phosphorphytat aus Sojamehl freizusetzen, gemessen. Diese Ergebnisse bewiesen, dass r-PhyA resistenter gegen Trypsin und weniger resistent gegen Pepsin ist als r-AppA. Die Proteolysemuster dieser beiden Phytasen, die durch eine SDS-PAGE-Analyse gezeigt werden sind ebenfalls deutlich unterschiedlich. Diese unterschiedlichen Empfänglichkeiten für Proteasen zwischen r-PhyA und r-AppA können vermutlich mit den Charakteristiken ihrer primären Aminosäuren-Sequenzen und der Peptidfaltung in Zusammenhang stehen, da zwischen diesen beiden Enzymen eine geringe Homologie (–15%) in den Aminosäuren-Sequenzen besteht (17, 18). Dabei ist allerdings Vorsicht geboten, wenn man den Molekularmechanismus der Phytasenproteolyse bedenkt, der über die ursprüngliche Reichweite der vorliegenden Untersuchung hinausgeht. Kürzlich erzielte Fortschritte in der Kristallisierung und (oder) der Voruntersuchung durch Röntgenstrahlen der Phytase phyA (26) und von einer Phytase von E. coli (27) könnten zum Verständnis der strukturellen Base in Bezug auf ihre Proteolysereaktionen beitragen.
r-AppA zeigte in der verbleibenden Phytase-Aktivität nach der Verdauung mit Pepsin unerwartet einen Anstieg um 30%. Mit Pepsinpräsenz setzte dieses Enzym ebenfalls 30% mehr P_i aus Sojamehl frei. Aus der Analyse durch SDS-PAGE ergibt sich, dass während unterschiedlicher Inkubationszeiträume r-AppA durch das Pepsin in kleine Peptide deutlich abgebaut wird. Es können wahrscheinlich Polypeptide entstehen, die gegen das Pepsin mit einer höheren Phytase-Aktivität als das intakte Protein r-AppA potentiell resistent sind. Obwohl die Analyse durch SDS-PAGE keine spezifische Information über solche Peptide bot, wurde bewiesen, dass das Pepsin natürliche oder synthetische Proteine in aktive Polypeptide umwandelt, so wie beispielsweise die Umwandlung von Schweineendothelin in aktives Endothelin mit 21 Überresten (28). Das Pepsin kann ebenfalls die Struktur und Funktionen bestimmter Proteine modulieren (29, 30). Wie oben erwähnt könnte die Verfügbarkeit der jüngsten Daten über die Kristallisation der phyA (26) und der Phytasen von E. coli (27) die an den Ort des Gens appA gelenkten Mutagenesen oder Deletionen erleichtern. Es kann somit möglich sein, den Molekularmechanismus für den Anstieg der Phytase-Aktivität von r-AppA in Zusammenhang mit der Pepsin-Hydrolyse zu entdecken. Trotz der biochemischen Ungewissheit in Bezug auf die gegen Pepsin resistenten Peptide von r-AppA besitzt diese Entdeckung eine große Nutritionsimplikation. Aufgrund der Tatsache, dass das Pepsin, eine gut beschriebene aspartische Protease, die die hauptsächliche Protease im Magen ist (31), könnte ein Phytase-Polypeptid, das gegen Pepsin resistent ist, die Ergänzung der Nahrung mit einem geringen Enzymniveau, das eine ausreichende Aktivität besitzt, ermöglichen. Die Kosten für den Einsatz von Nahrungsphytasen in der Tierproduktion würden so gesenkt werden.
Es ist schwierig, die Aktivitätenniveaus der in der vorliegenden Studie verwendeten Proteasen mit denen der physiologischen Bedingungen zu vergleichen, da die Pepsin- und Trypsinkonzentrationen in vivo nicht gut beschrieben wurden. Bekannt geworden ist eine durchschnittliche Trypsin-Aktivität von 20 bis 25 U/mg Protein im Schweinedarm (32), die viel größer ist als die in diesem Dokument verwendeten Dosen. Verwendet wurden jedoch mehrere Trypsin- und Pepsinniveaus mit Unterschieden in einem Bereich des 10- bis 25-fachen zwischen den geringsten und den höchsten Niveaus. Außerdem wurde die Freisetzung von P_i durch r-AppA oder r-PhyA unter Vorhandensein von Pepsin oder Trypsin aus Sojamehl gemessen, eine simulierte in vivo-Verdauungsbedingung. Obwohl sowohl r-AppA als auch r-PhyA teilweise rein waren, weisen alle Daten konstant auf verschiedene Umsetzungsmuster dieser beiden rekombinanten Enzyme in Bezug auf Pepsin und Trypsin hin. Diese Beobachtung in vitro kann daher unter den physiologischen Bedingungen zutreffend sein.
Beispiel 7 – Materialien und Methoden für die Beispiele 8–12
Isolierung und Identifikation von Bakterienkolonien, die eine Phytase produzieren. Wir erhielten die Dickdarminhalte von (3 Wochen alten) Hampshire-Yorkshire-Duroc-Schweinen, die in Gefangenschaft auf dem Schweinegut der Universität von Cornell aufgewachsen waren. Diese Schweine wurden mit einer zweckgemäßen Nahrung aus Mais-Sojamehl gefüttert. Unmittelbar nachdem die Schweine geschlachtet wurden, wurde der Dickdarminhalt mit sterilen Methoden entnommen und unter anaeroben Bedingungen in sterilen Plastiktüten frisch gehalten. Eine 10 g schwere Probe wurde mit 190 ml eines Glukosemediums mit anaerober Flüssigkeit des Pansens in einem 250 ml- Erlenmeyerkolben mit Gummipfropfen versetzt. Das Gemisch wurde 3 Min. lang in einer CO₂-Umgebung kräftig geschüttelt. Es erfolgten in Reihen angeordnete Verdünnungen entsprechend nacheinander.
Die verdünnten Proben wurden 3 Tage lang bei 37° C in einem modifizierten Medium aus Pansen-Glukose-Zellbiose-Agar-Fluidum, die unlösliches Kalziumphytat enthielt, kultiviert (43, 44). Die Bänder mit einem hellen Bereich wurden als potentielle Produzenten von intra- und extrazellularer Phytase-Aktivität getestet. Die Phytase-Aktivität wurde gemessen, wobei Natriumphytat als Substrat verwendet wurde (24). Eine Phytaseeinheit (PU) wurde als die Aktivität definiert, die ein μmol anorganischen Phosphor bei 37° C pro Minute aus Natriumphytat freisetzt. Gemäß den Vorschriften des Herstellers (Sigma, St Louis, MO) wurde die Phosphatasesäure-Aktivität getestet, wobei p-Nitrophenylphosphat (P-NPP) als Substrat verwendet wurde. Die Identifikation der ausgewählten Kolonie wurde im Diagnostischen Labor des Cornell Veterinary College (Ithaca, NY) durchgeführt. Die morphologischen und physiologischen Charakteristika der isolierten Kolonie wurden mittels herkömmlicher Methoden bestimmt.
DNS-Erweiterung und -Seguenzierung. Aufgrund der Tatsache, dass die Kolonie die größten Phosphatasesäure- und Phytase-Aktivitäten produzierte, wurde es als ein E. coli-Stamm identifiziert; um das Gen zu isolieren, wurden aus der DNS-Sequenz des Gens der Phosphatasesäure mit einem pH-Wert von 2,5 von E. coli abgeleitete Primer verwendet (appA, Zugriffsnummer auf die GeneBank 145283) (18). Primer: Pfl [direkt: 1–22]:5'-TAAGGAGCAGAAACAATGTGGT-3' (SEQ. ID. Nr. 4), E2 [direkt: 254–264]:5'-GGAATTCCAGAGTGAGCCGGA-3' (SEQ. ID. Nr. 5) und K2 [umgekehrt: 1468–1491]:5'-GGGGTACCTTACAAACTGCACG-3' (SEQ. ID. Nr. 6) wurden in den Einrichtungen für die Synthese von Oligonukleotiden der Universität von Cornell synthetisch hergestellt. Die vollständige Sequenz und der Kodierungsbereich wurden erweitert, wobei jeweils die Primer [Pf1-K21] y [E2-K2] verwendet wurden. Das PCR-Reaktionsgemisch (100 μl) enthielt 500 ng DNS-Genom als Muster, 100 pmoles von jedem Primer, 5 U DNS-Polymerase AmpliTaq (Perkin Elmer, Norwalk, CT), 10 mM Tris-HCl, pH 8,3, 50 mM KCL, 12,5 mM MgCl₂ und 200 μM von jedem dNTP (Promega, Madison, WI). Die Umsetzung wurde im GeneAmp PCR System 2400 (Perkin Elmer) ausgeführt. Das Temperaturprogramm umfasst 1 Zyklus bei 94° C (3 Min.), 30 Zyklen mit [94° C (0,8 Min.), 54° C (1 Min.) und 72° C (2 Min.)] und 1 Zyklus bei 72° C (10 Min.). Die erweiterten PCR-Produkte wurden durch Elektrophorese in einem 1 %igem Agargel unter dem Fusionspunkt getrennt (Gibco BRL, Grand Island, NY). Ein Teil des Gels, das das Band in erwarteter Größe enthielt, wurde aufgespaltet und die DNS mit dem Test-Kit GENECLEAN II (Bio101, Vista, CA) herausgelöst. Die PCR-Produkte wurden in den Einrichtungen des DNS-Dienstes der Universität von Cornell sequenziert, wobei der automatische Sequencer Taq Cycle mit Terminatoren Dye Deoxy (Applied Biosystems, Forster City, CA) verwendet wurde. Die Sequenzierungsexperimente wurden fünfmal durchgeführt und die aus anderen Phosphatasesäuren und Phytasen abgeleitete Amino-Sequenz angeordnet, wobei das multiple alignment Programm CLUSTAL BLAST verwendet wurde (45). Die beiden identifizierten PCR-Fragmente [Pf1-K2] und [E2-K2] wurden im Text fortlaufend jeweils als appA2 und appA2 beschrieben. Zu komparativen Zwecken wurde das Gen appA aus E. coli BL21 (DE3) erweitert, wobei die Primer [E2-K2] verwendet wurden. Die PCR-Umsetzungen und die erhaltenen Fragmente wurden so wie oben beschrieben verarbeitet.
Subklonung und Bau von Expressionsvektoren. Gemäß der Vorschriften des Herstellers wurden die PCR-Produkte [E2-K2] und [Pf1-K2] in dem Vektor pGEM^®T-easy (Promega) geklont und in TOP10F transformiert, um die positiven Bänder auszuwählen. Die isolierten Fragmente appA2 und appA wurden wie in den Vorschriften des Herstellers beschrieben im pPICZαA (Invitrogen, San Diego, CA) an die Orte EcoRI und KpnI eingesetzt. Die Konstruktionen wurden in TOP10F-Zellen transformiert, die auf Platten aus LB-Medium, das 25 μg Zystein/ml enthielt, gelegt wurden. Anschließend wurden die positiven Bänder kultiviert, um die DNS auf die Transformation vorzubereiten.
Transformation und Expression in Hefen. Gemäß den Vorschriften des Herstellers wurde der Stamm X33 von Pichia pastoris (Invitrogen) in YPD-Medium kultiviert und auf die Transformation vorbereitet. 2 μg Plasmid-DNS wurden linearisiert, wobei BglII verwendet wurde und anschließend durch Elektroporation in Pichia transformiert. Nach der dreistündigen Inkubation bei 30° C in 1 M Sorbitol ohne Ausschütteln ordneten sich die Zellen auf einer Platte aus YPD-Zystein-Agar-Medium, um die Integration des im Bereich 5'AOX1 der Wirts-Chromosomen-DNS transformierten Gens auszuwählen. Nach 2 Tagen wurden die Transformanten 24 h lang in geringen Medien mit Glyzerin (GMGY-Medium) inkubiert. Nachdem der Boden eine Dichte von ungefähr 2,5 × 10⁸ Zellen/ml (DO₆₀₀ = 5) erreichte, wurden die Zellen zentrifugiert (3500g, 5 Min.) und dann wieder in Medium mit 0,5%igem Methanol (GIMMY) suspendiert, um die Expression des Gens der Phytase zu induzieren.
RNS-Quantifikation. Nach der Induktion wurde zu unterschiedlichen Zeitpunkten die gesamte RNS aus den Transformanten appA2 herausgezogen. Die RNS wurde in 1 %igem Agar-Formaldehyd-Gel getrennt, auf eine Hybond N+ Membran (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ) durch Kapillaritätsübertragung und zweiminütiger Durchkreuzung mit UV-Licht übertragen. Anschließend wurde die Membran 4 h lang bei 42° C prähybridisiert. Die Probe war das PCR-Fragment appA2 [E2-K2] und wurde mit [α–³²P]-dCTP (DuPont, Boston, MA) markiert, wobei DNS-Perlen als ready-To-Go-TM Kennzeichnung (Amersham Pharmacia Biotech) verwendet wurden. Die Membran wurde eine Nacht lang bei 42° C mit der Probe hybridisiert und dreimal 20 Min. lang bei 25° C und zweimal bei 50° C in SSC 2 × (0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat), 1 %igem Dodecylsulfonat (SDS) und schließlich zweimal 20 Min. lang bei 50° C in SSC 0,2 × 0,1%igem SDS gewaschen. Das Autoradiogramm wurde durch die zehnstündige Belichtung der Membran auf einem Bildschirmverstärker einer Platte aus Imagen BAS-III FUJI (Fuji, Japan) gewonnen und quantifiziert, wobei ein Analysator Bio-Imagen (Kohshin Graphic Systems, Fuji, Japan) verwendet wurde. Die Ergebnisse normalisierten sich mit den relativen Niveaus RNSr 185.
Reinigung der ausgedrückten Enzyme. Alle Vorgänge wurden bei 4° C ausgeführt. Die beiden ausgedrückten Enzyme r-appA und r-appA2 und die in A. niger ausgedrückte Phytase r-phyA (freundlicherweise zur Verfügung gestellt von BASF, Mt. Olive, NJ) wurden in 50 mM Tris-HCl, pH 7 mit zu 25% gesättigtem Ammoniaksulfat wieder suspendiert. Die Suspension wurde 20 Min. lang zu 25.000 g zentrifugiert. Der Überschuss wurde mit zu 75% gesättigtem Ammoniaksulfat unter Aufschütteln 12 h lang gemischt und das Gemisch 20 Min. lang zu 25.000 g zentrifugiert. Das Sediment wurde anschließend in 10 ml 25 mM Tris-HCl, pH 7 wieder suspendiert und eine Nacht lang gegen den gleichen Puffer dialysiert. Die dialysierte Probe wurde in eine DEAE-Sepharose Kolonne (Sigma) gefüllt, die mit 25 mM Tris-HCl, pH 7 ausgeglichenen war. Nachdem die Kolonne mit 200 ml des gleichen Puffers gewaschen war, wurde die gebundene Phytase mit 1 M NaCl in 25 mM Tris-HCl, pH 7 herausgelöst. Die drei Fraktionen, die die höchsten Phytase- und Phospahatsesäure-Aktivitäten zeigten, wurden gemeinsam aufgefangen und für die Folgestudien eine Nacht lang gegen 25 mM Tris-HCl, pH 7,5 dialysiert.
Elektrophorese Analyse. Die Proteinkonzentration wurde durch die Methode Lowry gemessen (21). Die Elektrophorese in nicht denaturiertem Gel und die SDS-PAGE (zu 15%) wurden wie Laemmli es beschrieben hat ausgeführt (22). Die Proteine in der SDS-PAGE verfärbten sich mit strahlendem Coomassie-Blau R-250. Die Phosphatasesäure- oder Phytase-Aktivität auf den nicht denaturierten Gelbanden wurden wie oben beschrieben nachgewiesen (17). Nach der Elektrophorese wurde das Gel 20 Min. lang bei 25° C in 0,2%igem α-19 Naphtylphosphat (oder Natriumphytat), 0,1 %igem Fast Gernt GBC-Salzen, 1 mM CaCl₂ und dem Puffer 0,5 M Tris-HCl, pH 7,0 inkubiert.
Deglykosilation der Enzyme. Gemäß der Vorschriften des Herstellers (New England Biolabs, Bervely, MA) erfolgte die Deglykosilation von r-appA2, wobei 4 h lang bei 7° C 0,3 UI Endoglykosidase H_f(Endo H_f) verwendet wurde. Die Deglykosiladeproteine wurden in einem 15%igen SDS-PAGE wie oben beschrieben analysiert.
Eigenschaften des Enzyms und Hydrolyse von Phosphorphytat in Sojamehl. Die Phytase-Aktivität bei verschiedenen pH-Werten wurde bei 33° C bestimmt, wobei drei unterschiedliche Puffer verwendet wurden. Der optimalen Temperatur für jedes Enzym wurde der optimale pH-Wert zugeordnet. Die Werte K_m und V_max für r-appA2 und r-appA wurden beim optimalen pH-Wert jedes Enzyms und bei 37° C bestimmt. Die Phosphorphytat-Hydrolyse durch r-appA2 wurde mit der von r-appA und r-phyA verglichen. Es wurden verschiedene Mengen der mit 1 g Sojamehl gereinigten Enzyme in 5 ml Puffer (10 mM HCl oder 0,2 M Citrat) bei ihren jeweiligen optimalen pH-Werten (2,5 für r-appA, 3,5 für r-appA2 und 5,5 für r-phyA) 2 h lang bei 37° C inkubiert. Die Freisetzung von anorganischem Phosphor wurde wie oben beschrieben bestimmt (25). Die Wärmebeständigkeit dieser drei Enzyme wurde verglichen. Jedes Enzym (2 mg/ml) wurde 1:200 mit 0,2 M Natriumcitrat, pH 5,5 versetzt und 20 Min. lang bei 25, 37, 55, 65, 80 und 100° C inkubiert. Die Proben wurden 30 Min. lang in Eis gelegt und die remanente Phytase-Aktivität bei 37° C gemessen.
Angewendeter statistischer Test. Der Test U Mann-Withney wurde für alle statistischen Ermittlungen angewendet (46).
Beispiel 8 – Screening und Identifikation von Bakterienkolonien.
Insgesamt 93 Kolonien wurden isoliert. Mehr als 70 Kolonien besaßen eine intrazellulare Phytase-Aktivität, die geringer als 500 U/g Protein war und 6 Kolonien besaßen eine Aktivität, die größer als 1.000 U/g Protein war. Die Kolonie 88 bewies die höchste Phytase-Aktivität (2.927 U/g Protein) mit einer Phosphatasesäure-Aktivität (1.391 U/g Protein). Sie wurde daher für zusätzliche Experimente ausgewählt. Die Produktion von Phytase- und Phosphatasesäure-Aktivitäten der Kolonie war in Sweet E größer als im Medium der Kultur LB und unter anaeroben Bedingungen größer als unter aeroben. Die Kolonie wurde nachträglich als eine gram-negative E. coli identifiziert. Dies wurde insbesondere durch das Fermentationsprofil des Substrats bestätigt.
Beispiel 9 – Klonung und Sequenzierung des Gens appA2 von Schweine-E. Coli
Die Fragmente 1482 pb (vollständig) und 1241 (Kodierungsbereich) wurden aus dem DNS-Genom der Kolonie 88 erweitert (6). Außer dem Gen appA von E. coli und dem Gen der Phytase Bacillus wurden keine bedeutenden Homologien in den Datenbanken GenPro databank (Version 61), GeneBank oder EMBL gefunden, wobei das Programm BLAST verwendet wurde. Die vollständige Nukleotid-Sequenz besitzt jeweils 47 und 95% Homologie mit dem Gen der Phytase DS 11 von Bacillus sp. (Zugriffsnummer auf GenBank 3150039) und mit appA von E. coli. Trotz dieser hohen Sequenzhomologie bestanden zwischen appA und appA2 und ihren kodierenden Polypeptiden deutliche Unterschiede. Erstens waren sieben Aminosäuren in den abgeleiteten Peptid-Sequenzen verschieden: eine im Signalpeptid, L4F; sechs im Kodierungsbereich, S102P, P195S, S197L, K202N, K298M und T299A. Zweitens war der nicht übertragene Bereich 73 pb, der sich zwischen der Führersequenz und dem Kodierungsbereich befindet, 6 pb kürzer als der von appA. Die drei Orte wahrscheinlicher N-Glykosilation befanden sich jedoch weiterhin an den gleichen Orten des Kodierungsbereiches. Das DNS-Fragment wurde fünfmal sequenziert, um diese Unterschiede zu überprüfen. Verglichen mit phyA, besaß appA2 nur eine 19%ige Homologie in der Aminosäure-Sequenz. Die Sequenz wurde an die Datenbank GeneBank unter der Zugriffsnummer 250016 übermittelt.
Beispiel 10 – Expression von appA2 in Pichia pastoris.
Die Phytase- und Phosphatasesäure-Aktivitäten von insgesamt 42 Transformanten wurden in verschiedenen Bereichen analysiert. Drei Tage nach der Induktion mit Methanol produzierten 13 Transformanten eine Phytase-Aktivität von durchschnittlich 18 bis 114 U/ml und eine Phosphatasesäure-Aktivität von 7 bis 42 U/ml. 22 Transformanten von appA drückten währenddessen eine Phytase-Aktivität von 25 bis 130 U/ml und eine Phosphatasesäure-Aktivität von 59 bis 85 U/ml aus. Der Transformant appA2, der die höchsten Aktivitäten aufwies wurde in den Zeitstudien (7) und in weiteren Studien verwendet. Das RNS-m-Niveau von appA2 erreichte bei 4 h den Höhepunkt (7 und 8) und erhielt die Höhe bis zu 12 h aufrecht und sank dann beträchtlich ab. Ein RNS-m-Signal von appA2 in den Kontrollzellen wurde nicht nachgewiesen. Sowohl die extrazellularen Phytase- als auch Phosphatasesäure-Aktivitäten, die durch den Transformant produziert wurden, stiegen abrupt zwischen 0 und 24 Stunden an. Danach blieb die Phosphatasesäure-Aktivität nahezu unverändert, während die Phytase-Aktivität im Laufe der Zeit viel geringer stieg als in der Anfangsphase.
Beispiel 11 – Charakterisierung der gereinigten Enzyme
Die spezifische Phytase-Aktivität der gereinigten Enzyme r-appA2, r-appA und r-phyA betrug jeweils 28,9, 30,7 und 19,8 U/mg Protein. Das gereinigte r-appA2 wies eine höhere Affinität für Natriumphytat auf als für pNPP, wie die Werte K_m und V_max zeigen (Tabelle 1). Als Natriumphytat als Substrat verwendet wurde, wichen die pH-Kurven der drei Enzyme beträchtlich voneinander ab.
TABELLE 1 Kinetische Parameter der gereinigten r-appA und r-appA2, die in Pichia pastoris ausgedrückt wurden.
Der optimale pH-Wert befand sich zwischen 2,5 und 3,5 für r-appA2, bei 2,5 für r-appA und zwischen 2,5 und 5,5 für die Phytase r-phyA (9). Die beiden Enzyme von E. coli wiesen jedoch den gleichen optimalen pH-Wert (2,5) für das Substrat pNPP auf. Außerdem besaßen sowohl r-appA als auch r-appA2 die gleiche optimale Temperatur (55° C), die leicht unter der von r-phyA lag. Diese beiden Enzyme besaßen ebenfalls sehr ähnliche Thermostabilitäten der Phytase-Aktivität, die zwischen 37 und 60° C leicht höher und zwischen 65 und 100° C leicht geringer waren als die von r-phyA. Die Phosphatasesäure-Aktivität von remanentem r-appA2 zeigte sich nach unterschiedlichen Temperaturbehandlungen in dem nicht denaturierten Gel als eine einzige Bande bei 71 kDa (10). Die Aktivität wurde zu einem großen Teil eingebüßt oder verschwand bei 65 oder 80° C vollständig, wurde jedoch bei 100° C teilweise auf irgendeine Weise wiederhergestellt. Als die drei mit Sojamehl gereinigten rekombinanten Enzyme inkubiert wurden, setzte das Protein r-appA2 bedeutend mehr Phosphor aus Phytat frei als die anderen beiden Enzyme (11).
Beispiel 12 – Wirkungen der Deglycosylation auf die Eigenschaften der Enzyme.
Nachdem die drei gereinigten Enzyme mit β-Mercaptoäthanol und mit Endo H_f behandelt wurden, gingen mehr als 90% ihrer Aktivitäten sowohl bei Natriumphytat als auch bei pNPP verloren. Nur Endo H_f jedoch besaß keine bedeutende Wirkung auf seine katalytischen Aktivitäten. Aus der Deglycosylation von r-appA2 entstand eine einzige Bande mit einem ersichtlichen Mr von 46,3 kDa aus drei Banden, die in den Glykosyladformen mit ersichtlichen Mr von 50,5, 53 und 56 kDa voneinander abwichen. Dies ergab einen Glykosylationsbereich von zwischen 8,3 und 17,3 % für r-appA2.
In den oben stehenden Beispielen wurde ein E. coli-Stamm isoliert, der aus dem Inhalt des Schweinekolons eine Phytase produzierte. Indem Primer verwendet wurden, die auf dem Gen der Phosphatasesäure von E. coli (appA) mit einem pH-Wert von 2,5, das von Dassa et al. beschrieben wurde (18), basieren, wurde ein DNS-Fragment 1487 pb aus dem DNS-Genom des Stammes erweitert. Dieses Fragment, das als appA2 bezeichnet wurde, kodiert ein Protein mit 433 Aminosäuren mit 3 wahrscheinlichen Orten für eine N-Glykosylation. Das abgeleitete Peptid enthält sowohl das N-terminal Motiv (RHGXRXP, Position: 38–44)(SEQ. ID Nr. 7) als auch das C-terminal Motiv (HD, Position: 325–326), Eigenschaften der Histidin-Phosphatasensäuren (8). Außerdem entsteht eine Führersequenz von 30 Aminosäuren und eine nicht übertragene Region 73 pb. Unter den in den Datenbanken verfügbaren Sequenzen teilen nur die Gene der Phosphatasesäure mit einem pH-Wert von 2,5 appA von E. coli und der Phytase DS11 von Bacillus sp. mit appA2 eine gewisse Homologie (jeweils 95% und 47% in der Nukleotid-Sequenz). Trotz der großen Homologie zwischen appA und appA2 kommt es zu deutlichen Unterschieden zwischen diesen beiden Genen und ihren jeweiligen Proteinen. Erstens weichen sieben Aminosäuren zwischen den beiden abgeleiteten Polypeptid-Sequenzen voneinander ab: eine im Signalpeptid und sechs im Kodierungsbereich. Zweitens war die nicht übertragene Sequenz 73 pb zwischen der Führersequenz und dem Kodierungsbereich 6 pb kürzer als die von appA. Alle diese Unterschiede wurden in fünf wiederholten Analysen der Nukleotidsequenzierung bestätigt.
Wenn sich diese beiden Gene im gleichen Wirt, Pichia pastoris, transformieren, weisen die ausgedrückten Proteine r-appA und r-appA2 noch beträchtlichere Unterschiede in ihren biochemischen Charakteristiken auf. Obwohl beide den gleichen optimalen ph-Wert von 2,5 für pNPP aufweisen, besitzt r-appA2 einen breiteren optimalen pH-Wert, der zwischen 2,5 und 3,5 liegt, als r-appA mit 2,5 für Natriumphytat besitzt. Im Vergleich zu r-appA besitzt r-appA2 eine größere Affinität für beide Substrate, wie es durch die Werte geringer als K_m und größer als V_max bewiesen ist, und setzt mehr Phosphor aus Phytat in Sojamehl in vitro frei. Damit scheint die katalytische Funktion von r-appA2 in Bezug auf die Phosphorhydrolyse aus Phytat oder Phosphat besser zu sein als die von r-appA. Offensichtlich kann die Veränderung von sechs Aminosäuren im Polypeptid nicht nur eine Polymorphie des Enzyms bewirken, sondern eher für die beobachteten kinetischen Unterschiede verantwortlich sein. Nur vernünftig erscheint daher die Aussage, dass appA2 ein von appA verschiedenes Gen ist, obwohl es einer besser definierten strukturellen Analyse bedarf, um die Beziehung zwischen den spezifischen Veränderungen dieser beiden Aminosäuren und den funktionellen Veränderungen dieser beiden Enzyme aufzuklären. Notwendigerweise wird das Kristall beider Enzyme für zukünftige strukturelle Studien produziert werden müssen (27).
Es wurde oben stehend darüber informiert, dass mehrere Enzyme von E. coli pNPP oder Natriumphytat hydrolytisch abspalten (18, 19, 39–41). Greiner et al. (39) charakterisierten zwei Phytasen von E. coli (P1 und P2). Sie fanden heraus, dass die gereinigte Phytase P2 von E. coli eine große Identität mit der Phosphatasesäure mit einem pH-Wert von 2,5 von E. coli in der N-terminal Sequenz, chemische und kinetische Eigenschaften teilt. Sie schlugen daher vor, dass diese beiden Enzyme das gleiche Protein sein sollten und dass die Phosphatasesäure mit pH 2,5 von E. coli als eine Phytase betrachtet werden sollte. Tatsächlich können sowohl die Phosphatasesäure r-appA als auch r-appA2 nicht nur Phytat in gereinigter chemischer Form oder in natürlicher Nahrung hydrolytisch abspalten, sondern auch eine höhere Affinität für Natriumphytat als für pNPP besitzen. Infolgedessen könnten diese beiden Enzyme als Phytasen klassifiziert werden.
Verglichen mit der gereinigten Phytase (39) besitzt r-appA2 nach der Deglykosilation das gleiche Temperaturoptimum (55° C) und eine ähnliche Molekularmasse (46,3 kDa). Auf der Grundlage der Analysen in nicht denaturierten SDS-PAGE-Gelen ist das Protein auch monomer. r-appA2 besitzt jedoch ein saureres pH-Optimum (2,5 bis 3,5 gegenüber 4,5 für P2) und enthält durch die N-Glykosilation in Pichia 8 bis 14% Zuckerreste. Die Deglykosilation von r-appA mit Endo H_f reduziert den molekularen Umfang, hat aber eine geringe Auswirkung auf seine Aktivität. Im Gegenzug reduzieren sich die Phytase- und Phosphatasesäure-Aktivitäten merklich, wenn das Protein mit P-Mercaptoäthanol und Endo H_f inkubiert wird. Dies zeigt an, dass die Disulfidverbindungen für ihre Phytase-Aktivität notwendig sind, wie es oben für die Phytase von A. ficuum bewiesen wurde (47).
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Literatur
Die folgenden in diesem Dokument zitierten Referenzen sind hiermit dieser Anmeldung als Referenzen beigefügt.

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Claims

Eine Phosphatase, die eine Phytase-Aktivität besitzt, welche umfasst: ein Polypeptid, das die Aminosäure-Sequenz besitzt, wie sie in SEQ. ID Nr. 9 gezeigt ist.
Die Phosphatase nach Anspruch 1, wobei die Phosphatase durch eine Hefe dargestellt ist.
Die Phosphatase nach Anspruch 2, wobei die Hefe Pichia pastoris ist.
Die Phosphatase nach Anspruch 2, wobei die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist.
Die Phosphatase nach Anspruch 1, wobei die Phosphatase durch ein rekombinantes Gen kodiert ist, welches umfasst: einen Promotor; einen Kodierungsbereich, der die Phosphatase dem Anspruch 1 entsprechend kodiert; und einen Terminator.
Ein Tierfutter, das die Phosphatase nach Anspruch 1 umfasst.
Ein isoliertes Nukleinsäure-Molekül, das die Phosphatase dem Anspruch 1 entsprechend kodiert.
Ein Vektor, der das Nukleinsäure-Molekül nach Anspruch 7 trägt.
Eine Wirtszelle, die mit dem Vektor nach Anspruch 8 verändert ist.
Die Wirtszelle nach Anspruch 9, wobei die Wirtszelle eine Hefe ist.
Die Wirtszelle nach Anspruch 10, wobei die Hefe Pichia pastoris ist.
Die Wirtszelle nach Anspruch 10, wobei die Hefe Saccharomyces cerevisiae ist.