DE60023754T2

DE60023754T2 - Künstlicher kalciumphosphatknochen als osteokonduktives und biologisch abbauba res knochenersatzmaterial

Info

Publication number: DE60023754T2
Application number: DE60023754T
Authority: DE
Inventors: Soo Kyung Kangnam-ku CHAE; Hong Yeol Mapo-ku KIM; Ho Yeon Songpa-ku LEE; Chang Hun Nowon-ku RHEE; Moon Kang Sungbuk-ku SEO
Original assignee: Kyung Won Medical Co Ltd
Current assignee: Kyung Won Medical Co Ltd
Priority date: 2000-04-03
Filing date: 2000-08-04
Publication date: 2006-07-06
Anticipated expiration: 2020-08-05
Also published as: KR100371559B1; CA2401194A1; US6537589B1; EP1272232A1; EP1272232B1; KR20010094058A; WO2001074410A1; CA2401194C; CN1452499A; EP1272232A4; DE60023754D1; JP2003532458A; ATE308350T1; AU6189200A; CN1213775C; AU2000261892B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft einen neuen künstlichen Kalziumphosphatknochen als osteokonduktives und osteoinduktives, biologisch abbaubares Substratmaterial, welches die biokompatible Knochenregeneration hervorragend fördern kann.
Die vorliegende Erfindung betrifft besonders den neuen künstlichen Kalziumphosphatknochen, der die biokompatible Knochenregeneration begünstigt, und der einen gewöhnlichen Kalziumphosphatknochenzement und ein lineares Polyphosphat aus 3–200 Orthophosphatmoleküle umfasst.
Der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung kann gewöhnliche Knochenzemente, allogene Transplantate und autogene Transplantate, die zur Behandlung von Defekten und Frakturen in allen Knochen des Körpers, der Heilung von Osteoporose, den Füllmitteln von Implantaten für die Kieferchirurgie, dem Knochenersatz für die plastische Chirurgie, den Ersatz für defekte Knochen bei der Operation von Gelenken, einschließlich dem Hüftgelenk, dem Kniegelenk und dem Schultergelenk, und der Operation von Wirbeln verwendet werden, ersetzen.
HINTERGRUND
Knochengewebe sind Bindegewebe, die aus Knochenzellen und extrazellulären Matrizen bestehen, die sich jedoch von anderen Bindegeweben derart unterscheiden, dass die verknöcherten Bindesubstanzen innerhalb der extrazellulären Matrizes anorganisch sind. Die anorganische Substanz besteht hauptsächlich aus Kalziumphosphat, das als Hydroxylapatitkristalle (Ca₁₀(PO₄)(OH)₂) vorliegt.
Knochengewebe sind hart genug, um sich gegen die physikalischen Belastungen des Körpers zu schützen und zu verteidigen, und ihre Fraktur, oder ihre Dichteverringerung oder der Schaden, der pathogenen Veränderungen zuzuordnen ist, kann am Körper eine Missbildung zur Folge haben. Wenn der Knochen, aufgrund welcher Gründe auch immer, geschädigt oder entfernt wird, muss ein Knochen auf natürliche Weise regeneriert werden, oder muss durch eine Prothese oder Knochenmaterial von einem anderen Körperteil chirurgisch ersetz werden. Zusätzlich erfordert die Heilung eines physisch gebrochenen (frakturierten) Knochens oder eines chirurgisch beschädigten Knochens das Verwenden von prothetischen Werkzeugen, einschließlich künstlicher Knochen, zum künstlichen Ausrichten und Immobilisieren des Knochens. In diesem Fall bedarf es für den Knochen jedoch eines wesentlich längeren Zeitraumes, um sich in seiner ursprünglichen Form und Funktion wieder aufzubauen, während der Patient unter ernsten physischen und mentalen Belastungen leidet. Des Weiteren neigt, wenn der Heilungsprozess länger andauert, der beschädigte Teil zunehmend dazu, der Gefahr einer Infektion mit Keimen ausgesetzt zu werden, so dass ein perfekter Heilungseffekt nicht erwartet werden kann.
Im Falle von Zähnen, ist, wenn ein knochenbildendes Gewebe von maxillofazialen Teilen pathogenisch oder physisch frakturiert oder beschädigt ist, ihr Ersatz oder ihre Regeneration in vielerlei Hinsicht von Bedeutung. Besonders alveolare Knochen, die die Zähne stützen, werden nicht nur leicht mit Bakterien infiziert, sondern bauen sich auf natürliche Weise nur sehr schlecht in ihrem ursprünglichen Zustand wieder auf, wenn sie mit Bakterien infiziert wurden oder durch andere Faktoren gebrochen wurden. In einem der gängigsten Behandlungsverfahren zum Ausgleich des beschädigten Knochengewebes eines Zahnes wird ein auf Titan basierendes Metalltransplantat in den Kieferknochen eingesetzt, um eine künstlichen Zahn aufzubauen. Dieses Transplantationsverfahren ist jedoch nicht ohne Nachteile, da das inserierte Transplantat benachbarte alveolare Knochen okklusal übermäßig anstrengt, und die chirurgische Transplantationsoperation nicht stattfinden kann, wenn die Knochenunterstützung um die betreffende Stelle herum nicht ausreichend ist.
Es besteht weiterhin ein dringender Bedarf, Verfahren zum Erleichtern des Heilungsprozesses (Regeneration) von beschädigten Knochengeweben, oder zum Induzieren der Morphogenese von neuen Knochengeweben oder Materialen, die für die Verwendung zu diesem Zweck geeignet sind, zu entwickeln. In diesem Zusammenhang sind Materialen für das Knochenwachstum und -rekonstruktion, wie zum Beispiel Biokeramiken, Kompositmaterialien und Knochenderivate als auch künstliche Füllmittel für den Wiederaufbau von Knochen, wie zum Beispiel natürliche oder synthetische Polymere, gezielt entwickelt worden.
Die internationale Patentanmeldung WO 97/45147 offenbart ein resorbierbares Biomaterial für die Implantation, das amorphes oder kristallines, kondensiertes Kalziumphosphat der allgemeinen Formel [Ca(PO₃)₂]_n, umfasst, wobei n mindestens 3 und das molare Verhältnis von Ca zu P zwischen etwa 0,4 bis 0,6 liegt.
Die europäische Patentanmeldung 0 987 324 offenbart einen Zellwachstumsbeschleuniger, der eine Polyphosphorsäure umfasst, als auch ein Zellwachstumsverfahren, das denselben verwendet, um die Gewebereparatur zu beschleunigen oder um Verletzungen und Verbrennungen zu heilen.
Die japanische Patentanmeldung 07319353 offenbart ein künstliches Knochenmaterial, das im Wesentlichen aus einer Vorstufe des Hydroxylapatit, die aus dem sekundären Kalziumphosphat, Kalziumoctaphosphat und/oder amorphem Kalziumphosphat besteht, gefertigt ist, als auch ein Verfahren für seine Herstellung mit einer Dreiwegeröhre (Tri-Flow Tube) als Mischungsvorrichtung.
Die japanische Patentanmeldung 61075105 offenbart zuguterletzt eine Kalziumphosphatzusammensetzung, bestehend aus Trikalzium-α-Phosphat und Octakalziumphosphat, die als Ausgangsmaterial für künstliche Knochen und Gelenke oder als Wurzelkanal-Füllungsmaterial in der Zahntechnik verwendbar ist.
Bisher sind demineralisierte Knochen, Hydroxylapatit und anderer Transplantatersatzmittel entwickelt und verwendet worden, um die Knochenregeneration an beschädigten Knochengewebsteilen zu erleichtern, erbrachten jedoch keinen zufrieden stellende Leistung bei der Regeneration von Knochengewebe in der Praxis. Kürzlich ist von Wachstumsfaktoren, wie zum Beispiel knochenmorphogenetischen Faktoren (BMF), Plättchenwachstumsfaktoren (PDGF) und Insulin ähnlichen Wachstumsfaktoren (IGF), und Cytokinen berichtet worden, dass sie bei der Regeneration von Knochengeweben sehr gut zu verwenden sind. Es ist auch berichtet worden, dass, damit die Wachstumsfaktoren und Cytokine bei der Regeneration von Knochengeweben mitarbeiten, es besonders wichtig ist, ihre zellulären Rezeptoren zu exprimieren. Wenn sie mit den zellulären Rezeptoren verbunden sind, lösen die Wachstumsfaktoren und Cytokine die normale Wundheilung von Knochengeweben aus. Die Mechanismen, bei denen Wachstumsfaktoren und Cytokine bei der Wundheilung und der Geweberegeneration eingeschlossen sind, sind bisher jedoch nicht eindeutig aufgedeckt worden. Da die Wachstumsfaktoren und Cytokine in unterschiedlichen Zelltypen in Spurenmengen synthetisiert werden, sind rekombinante Techniken erforderlich, um die Wachstumsfaktoren und Cytokine in ausreichenden Mengen für die Anwendung zur Wundbehandlung von beschädigten Knochengeweben herzustellen. Jedoch werden die rekombinanten Techniken wegen des ökonomischen Grundes der hohen Produktionskosten nicht allgemein verwendet.
Neben der Induktion der natürlichen Knochenregeneration, wird das Ersetzen von beschädigten Knochengeweben auch durch Fördern der Osteogenese mit verschiedenen Knochenanlegespänen (bone onlays) und Knochentransplantatersatzmitteln vorgenommen. Das Anwenden von Knochenanlegespänen und Knochentransplantatersatzmitteln wird weitestgehend mittels zweier Verfahren vorgenommen: ein Verfahren für ein autogenes Transplantat und ein Verfahren für ein allogenes Transplantat. Beide Verfahren verwenden die eigenen Knochen des Patienten, um die Osteogenese zu induzieren. Die zu transplantierenden Knochen müssen in ihrem Elastizitätskoeffizienten zu benachbarten Knochen, die neben der Transplantationsfläche liegen, ähnlich sein, da Transplantationsmaterialien, die sich im Elastizitätskoeffizienten stark unterscheiden, z.B., Metalltransplantate, übermäßige Spannungen erzeugen.
Jedoch weisen Transplantationsverfahren, die Knochenanlegespäne verwenden, ebenfalls verschiedene Probleme auf. Wenn ein Verfahren für ein autogenes Transplantat angewendet wird, sind die erhältlichen Transplantate quantitativ begrenzt. Während eine chirurgische Operation durchgeführt wird, um den erforderlichen Knochen für ein autogenes Transplantat völlig zu entfernen, existiert zusätzlich immer die Gefahr der bakteriellen Infektion und des Blutverlustes. Zusätzlich verringert sich die strukturelle Stabilität der Bereiche, aus denen die Transplantate entnommen werden. Die Transplantationstechnik, einschließlich der chirurgischen Operation, kann einige Patienten zwingen, die Schmerzen über einen längeren Zeitraum zu ertragen, als bei einer Operation zum Zusammenfügen (fusion surgery). Gegenüber dem Verfahren für ein autogenes Transplantat hat das Verfahren für ein aulogenes Transplantat den Vorteil, dass die Beschaffung von allogenen Transplantaten relativ einfach ist, da sie von Fremdspendern stammen, jedoch liegen allogenische Knochen in ihrem osteoinduktiven Potential weit unter dem von autogenen Knochen und können daher nur als vorübergehende Unterstützung verwendet werden.
Auch findet man zusätzliche Probleme sowohl in Verfahren für autogene Transplantate als auch für allogene Transplantate. Da zum Beispiel die Transplantate, die in den obigen Transplantationsverfahren verwendet werden, alleine keine Stabilität bieten können, die groß genug ist, um das Rückenmark beständig zu tragen, muss gleichzeitig ein internes Fixierungsverfahren durchgeführt werden. In diesem Fall werden Metallfixierungsmittel verwendet, die eine kompliziertere chirurgische Operation erfordern. Zusätzlich muss der Operateur das Transplantat wiederholt auf eine präzise Größe zurechtschneiden, damit es in das gewünschte Knochengewebe passt, was zur Folge hat, dass die Zeit, die für die chirurgische Operation benötigt wird, ausgedehnt wird. Des Weiteren kann im Allgemeinen die glatte Oberfläche eines Transplantates keine Reibungskraft bereitstellen, die für das Einsetzten des Transplantates zwischen benachbarte Knochengewebe erforderlich ist. Dabei gibt es beim Zurechtschneiden immer die Gefahr, dass das zurechtgeschnittene Transplantat aus den Knochengeweben herausrutscht, die Struktur des transplantierten Knochengewebes bricht und einen Schaden am Nervensystem und am Gefäßsystem nahe dem Knochengewebe verursacht.
Um diese Probleme zu umgehen, ist die aktive Forschung auf die Entwicklung von Knochentransplantatersatzmittel gerichtet worden, welche die exzellenten biomechanischen Eigenschaften von Metalltransplantaten und die hervorragenden biologischen Eigenschaften von Knochentransplantaten aufweisen, sowie gleichzeitig nicht die Nachteile von Metall- und Knochentransplantaten aufweisen. Als Ergebnis davon, sind verschiedene Knochenmarktransplantate, die aus Hydroxylapatit und Rinderkollagen bestehen, entwickelt worden und sind kommerziell erhältlich. Zusätzlich hat diese Forschung die Entwicklung von biologisch aktiven Ersatzmitteln für die zelluläre Expression der Knochenregeneration, die auf kaskadenartige Weise innerhalb des Zytoplasmas vervielfältigt wird, ausgelöst, was zur Entwicklung von knochenmorphogenetischen Proteinen führt, die sowohl als Ersatzmittel, oder Untertransplantate als auch als Serie von osteoinduktiven Faktoren, die aus Knochenmatrizes synthetisiert werden, die die Knochenmorphogenese in transplantierten Bereichen induzieren können, verwendbar sind. Es wurde berichtet, dass rekombinantes, humanes, knochenmorphogenetisches Protein-2 (rhBMP-2) bei der Regeneration von beschädigten Knochen in zahlreichen Tiermodellen wirksam ist. Jedoch sind diese Proteine nicht ohne Nachteil, da ihre Verwendung geeignete Träger und Spacertools für die Fusion erfordert.
Um der Notwendigkeit von sichereren und geeigneteren Knochentransplantaten gerecht zu werden, ist seit kurzem ein großes Interesse an Knochentransplantatersatzstoffen, wie zum Beispiel Biokeramiken, entstanden.
Kalziumphosphatkeramiken, eine der Biokeramiken, zeigen eine überragende Biokompatibilität und sind von der bakteriellen Infektion und immunologischen Gefahr, die von allogenen Transplantaten verursacht werden können, im Wesentlichen befreit. Mithin können, mit den Vorteilen der allogenen Transplantation von Knochentransplantaten, Kalziumphosphatkeramiken im Überfluss hergestellt werden. Zusätzlich sind diese Biokeramiken nicht nur osteokonduktiv, sondern stellen auch poröse Matrizes bereit, welche die Knochenmorphogenese in Knochengeweben erleichtert. Jedoch haben Biokeramiken den Nachteil, dass sie vor der Transplantation eine interne Fixierung erforderlich machen, da ihre Festigkeit zu niedrig ist, um das Gewicht des Knochenmarks zu stützen.
Biokeramiken, die am geläufigsten sind, schließen Kalziumphosphat, Hydroxylapatit und Trikalziumphosphat ein. Bei hervorragender Biokompatibilität ist das Hydroxylapatit den anorganischen Knochensubstanzen chemisch sehr ähnlich, doch ist es in vivo schwer abzubauen. In letzter Zeit hat das Wissen um das natürliche Auftreten von Hydroxylapatit als Funktionsbaustein in Zähnen und Knochen von einigen invertebraten Tieren ein intensives Interesse und eine Berücksichtigung der Verbindung und seiner modifizierten Formen zu Folge. β-Trikalziumphosphat ist sehr schnell biologisch abbaubar, jedoch zu schwach, um das schwere Knochenmark zu stützen. Außerdem wurden zahlreiche Substanzen, einschließlich verschiedener Formen von Kalziumphosphat, entwickelt, um als Unterstützung, Ersatzmittel und Kontrollmittel für die Knochenmorphogenese oder den Knochenersatz zu dienen.
Es wurde auch eine Entwicklung bei verschiedenen Zusammensetzungen von medizinischen Zementen erzielt, die in vivo angewendet werden können. Von diesen besitzen Zemente zum Heilen, welche die Vorteile von Kalziumphosphat nutzen, eine hervorragende Flexibilität, da Tetrakalziumphosphat, ein Hauptbestandteil von Kalziumphosphat, während des Heilungsprozesses in Hydroxylapatit umgewandelt werden kann. Der Zeitraum jedoch, den diese Zemente zur Heilung zum Aushärten benötigen, macht es schwierig, sie in der Praxis anzuwenden. Auch das Anwenden der Zemente zum Heilen bringt Schwierigkeiten mit sich, wenn eine Körperflüssigkeit im Überfluss vorliegt, da, wenn der Zement sofort nach dem Mischen (z.B., Kneten) mit Pseudokörperflüssigkeit in Kontakt kommt, die Flüssigkeit in ihn eindringen und den gekneteten Gips am Ende zerstören kann. Es werden zwei Techniken verwendet, um dieses Problem zu umgehen. Bei einer Technik wird die geknetete Zementgipspaste in vivo angewendet, nachdem sie bis zu einem bestimmten Grad ausgehärtet ist, anstatt direkt nach dem Vermischen. Bei der Anderen wir ein gekneteter Zementpaste erst angewendet, nachdem die Körperflüssigkeit entfernt und das hämostatische Verfahren beendet worden ist. Bei beiden Verfahren werden geknetete Zementpasten verwendet, die zu einem gewissen Grad ausgehärtet sind und daher schwer zu handhaben sind. Dazu sind diese Verfahren noch kompliziert und beanspruchen einen langen Zeitraum bis zu ihrer Beendigung, da das Entfernen von Körperflüssigkeit, das Stoppen von Blutungen und zusätzliche Verfahren erforderlich sind.
Im Bestreben diese Probleme zu überwinden, wird eine wässrige Lösung einer organischen Säure, wie zum Beispiel Zitronensäure oder Hydroxybernsteinsäure, oder eine anorganische Säure, wie zum Beispiel Phosphorsäure, für das Kneten eines solchen Zements angewendet, um die Zeit zu verringern, die für das Aushärten der gekneteten Zementpaste erforderlich ist. Die geknetete Zementpaste, die beim Verwenden einer solchen sauren, wässrigen Lösung hergestellt wird, ist jedoch so biostimulativ, dass sie eine Entzündung in dem von der Anwendung betroffenen Körperbereich verursacht. Um den Abbau des Zements zu verhindern, schlug man eine Chitosan-enthaltende wässrige Lösung als Aushärtungslösung für den Zement vor. Um Chitosan aufzulösen, muss die wässrige Lösung einen niedrigen pH von etwa 1–2 aufweisen, was durch die Zugabe einer Säure erreicht wird, und daher kann die Chitosanenthaltende Aushärtungslösung ebenso zu einer Entzündung führen.
Wenn beschädigt, können verschiedene Körpergelenke, wie zum Beispiel das gesamte Hüftgelenk, das gesamte Kniegelenk und das gesamte Schultergelenk durch künstliche Knochen ersetzt werden. Für diesen Schritt sind synthetische Materialien verwendbar, die aus einer Mischung aus Polymethylmetachlorit (PMMA) und Benzoylperoxid hergestellt werden. Die künstlichen Knochen, die aus den synthetischen Material hergestellt werden, leiden jedoch an dem ernsten Problem, dass sie nicht auf natürliche Art in vivo abgebaut werden. Dadurch werden neu wachsende Knochen durch die beständigen künstlichen Knochen behindert, so dass eine fieberhafte Erkrankung auftritt, die die benachbarten Gewebe verletzt. Üblicherweise unterzieht sich ein Patient, der an einem Bruch der Halswirbelsäule, der Lendenwirbelsäule oder der Brustwirbelsäulenscheiben leidet, einer chirurgischen Operation unter Verwendung von autogenen Transplantaten. Um sein oder ihr eigenes Darmbein zu besorgen, muss eine zusätzliche Operation am Patienten durchgeführt werden, die ihn oder sie zwingt, zusätzliche Schmerzen zu erleiden, und beim Patienten können sich Komplikationen entwickeln. Alternativ dazu, werden Knochen, die aus Leichen entnommen werden, wie zum Beispiel die Fibula und die Hüfte, als Ersatzmittel für die Verwendung in der Operation verwendet. Diese allogene Transplantationsoperation bedingt sicherlich eine physikalisch leichtere Bürde für den Patienten, leidet jedoch an vielen Nachteilen, wie wahrscheinlich auftretenden bakteriellen Infektionen, der geringere Festigkeitserhalt der Transplantate, höhere Materialkosten und schlechtere biologische Kompatibilität. Wenn die Lieferanten für allogene Transplantate darüber hinaus nicht genügend Leichen beschaffen, ist die Versorgung und Nachfrage für allogene Transplantate nicht ausgewogen. Weiterhin ist es bei allogenen Transplantaten schwierig, die Knochenfestigkeit beizubehalten, die für Patienten tauglich ist, die an Osteoporose leiden oder die sich einer Operation am Gesichtsknochen (ossa faciei) oder an Oberteilen beim odontoiden Verfahren unterziehen. Bei allogenen Transplantaten tritt ein Ablösen wahrscheinlich auf.
Zu der vorliegenden Erfindung führend, ergab die intensive und gründliche Forschung an einem idealen knochenregenerativem Knochenersatzmaterial, die von den jetzigen Erfindern wiederholt wurde, das Ergebnis, dass ein Mischung aus Kalziumphosphatzement und Polyphosphat die Erfordernisse zur Verwendung bei der Knochentransplantation, die die biologische Kompatibilität, die Sterilisation, die Osteoinduktivität, die Osteokonduktivität, die biologische Abbaubarkeit einschließt, ohne Immunogenität und Toxizität für die Gewebe, erfüllt und für die Verwendung in der Knochenregeneration und Knochenmorphogenese geeignet ist.
Ein Polyphosphat ist ein lineares Polymer, das aus zehn bis hunderten von Orthophosphatresten (Pi), die miteinander über hochenergetische Phosphoranhydritbindungen verbunden sind, besteht. Polyphosphat akkumulierende Bakterien besitzen Polyphosphat, aus dem Orthophosphat erfolgreich freigesetzt wird, um Energie, genau wie ATP, im Körper bereitzustellen. Bei Belastung, wie zum Beispiel Unterernährung, Erhitztheit oder einer osmotischen Druckveränderung, synthetisieren Polyphosphat akkumulierende Bakterien Polyphosphate aktiv für ihr Überleben. In anderen Worten, Polyphosphat wirkt als Regulator für eine solche äußere Belastung. Kürzlich fand man heraus, dass Polyphosphat eine antibakterielle Aktivität aufweist. Zusätzlich wurde berichtet, das Polyphosphat charakteristische Funktionen aufweist, die den Beitrag zur Verbindung von Wasser und Fleisch, die Verbesserung von Assimilationsverfahren und die Hemmung des oxidativen Odorierens und Entfärbens einschließt. Die Vorteile der funktionellen Charakteristika von Polyphosphat nutzend, ergänzt die vorliegende Erfindung die konventionellen künstlichen Knochenmaterialen um Polyphosphat, um neue Knochenersatzmittel herzustellen, die unzweifelhaft besser bei der Knochenmorphogenese sind, ohne dabei Nebenwirkungen zu entfalten.
Daher ist es ein Ziel der vorliegenden Erfindung, die vorangehenden und die anderen im Stand der Technik anzutreffenden Nachteile zu überwinden und einen neuen polyphosphathaltigen, künstlichen Kalziumphosphatknochen als osteokonduktives und osteoinduktives, biologisch abbaubares Ersatzmaterial bereitzustellen, das die biologisch kompatible Knochenregeneration sehr gut fördern kann.
Der polyphosphathaltige, künstliche Knochen, der mit Polyphosphat der vorliegenden Erfindung versetzt ist, kann herkömmliche künstliche Knochen ersetzen, die durch chirurgische Operationen ausgetauscht werden gegen Gelenke, wie zum Beispiel den gesamten Hüftknochen, das gesamte Kniegelenke, das gesamte Schultergelenke und andere Gelenke, ohne Nebenwirkungen wie sie die Konventionellen verursachen. Zusätzlich wird bei Operationen an der Halswirbelsäule, der Brustwirbelsäule und der Lendenwirbelsäule der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung auch als Füllmittel verwendet, wenn ein zu transplantierender Gewebsteil eine Gerüstform aufweist. Daher ist der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung ein biologisch kompatibles, knochenregenerierendes Knochenersatzmaterial, das als Füllmittel, als Verstärkung und als Unterstützung für viele plastische und orale Transplantationen verwendbar ist.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist ein Ziel dieser Erfindung, einen neuen, künstlichen Kalziumphosphatknochen als osteokonduktives und osteoinduktives biologisch abbaubares Substratmaterial, das die biologisch kompatible Knochenregeneration sehr gut fördern kann, bereitzustellen.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung werden die zuvor genannten Ziele und Vorteile leicht erzielt.
Die vorliegende Erfindung stellt das künstliche Kalziumphosphatknochenmaterial, das die biologisch kompatible Knochenregeneration begünstigt, bereit, wobei es einen gewöhnlichen Kalziumphosphatknochenzement und ein lineares Polyphosphat, das 3–200 Orthophosphatmoleküle umfasst, umfasst.
Weitere Eigenschaften der vorliegenden Erfindung werden nachfolgend dargestellt.
KURZE BESCHREIBUNG DER FIGUREN
1 zeigt einen schematischen Querschnitt, der ein Zellkulturverfahren unter Verwendung einer Transmembran darstellt.
2 zeigt eine schematische Aufsicht, die ein Zellkulturverfahren unter Verwendung von Agarose darstellt.
3 zeigt ein Histogramm, das die Wirkungen des polyphosphathaltigen, künstlichen Knochens der vorliegenden Erfindung auf die Transkription eines Osteoblasten bildenden Gens der MG-63-Zellen darstellt, wobei Kontrolle; wenn die Zellen alleine kultiviert werden,

A; auf einen konventionellen Knochenzement,
B; auf einem konventionellen Knochenzement, der mit 0,005 Gew.% Typ 75-Polyphosphat versetzt ist,
C; auf einem konventionellen Knochenzement, der mit 0,01 Gew.% Typ 75-Polyphosphat versetzt ist,
D; auf einem herkömmlichen Knochenzement, der mit 0,05 Gew.% Typ 75-Polyphosphat versetzt ist,
E; auf einem konventionellen Knochenzement, der mit 0,005 Gew.% Typ 65-Polyphosphat versetzt ist,
F; auf einem konventionellen Knochenzement, der mit 0,01 Gew.% Typ 65-Polyphosphat versetzt ist,
G; auf einem Knochenzement, der mit 0,05 Gew.% Typ 65-Polyphosphat versetzt ist.

4 zeigt ein Histogramm, das die Wirkungen der polyphosphathaltigen, künstlichen Knochen der vorliegenden Erfindung auf die Transkription eines Osteoblasten bildenden Gens der Hos-TE85-Zellen darstellt, wobei Kontrolle; wenn die Zellen alleine kultiviert werden,

A; auf einem konventionellen Knochenzement,
B; auf einem konventionellen Knochenzement, der mit 0,005 Gew.% Typ 75-Polyphosphat versetzt ist,
C; auf einem konventionellen Knochenzement, der mit 0,01 Gew.% Typ 75-Polyphosphat versetzt ist,
D; auf einem konventionellen Knochenzement, der mit 0,05 Gew.% Typ 75-Polyphosphat versetzt ist,
E; auf einem konventionellen Knochenzement, der mit 0,005 Gew.% Typ 65-Polyphosphat versetzt ist,
F; auf einem konventionellen Knochenzement, der mit 0,01 Gew.% Typ 65-Polyphosphat versetzt ist, und
G; auf einem Knochenzement, der mit 0,05 Gew.% Typ 65-Polyphosphat versetzt ist.

5a zeigt das Ergebnis einer Elektrophorese von RT-PCR-Produkten aus Hos-TE85-Zellen, wobei

Bahn 1; ein DNA Marker (DNA-Leiter),
Bahn 2; eine Kontrolle, Bahn 3; ein RT-PCR-Produkt aus Hos-TE85-Zellen, die nur auf einem Zement wuchsen,
Bahn 4; ein RT-PCR-Produkt aus Zellen, die auf Zement + 0,005 Gew.% Typ 75-Polyphosphat wuchsen,
Bahn 5; ein RT-PCR-Produkt aus Zellen, die auf Zement + 0,01 Gew.% Typ 75-Polyphosphat wuchsen,
Bahn 6; ein RT-PCR-Produkt aus Zellen, die auf Zement + 0,05 Gew.% Typ 75-Polyphosphat wuchsen,
Bahn 7; ein RT-PCR-Produkt aus Zellen, die auf Zement + 0,005 Gew.% Typ 65-Polyphosphat wuchsen,
Bahn 8; ein RT-PCR-Produkt aus Zellen, die auf Zement + 0,01 Gew.% Typ 65-Polyphosphat wuchsen, und
Bahn 9, ein RT-PCR-Produkt aus Zellen, die auf Zement + 0,05 Gew.% Typ 65 Polyphosphate wuchsen, ist.

5b zeigt das Ergebnis einer Elektrophorese von RT-PCR-Produkten aus MG-63-Zellen, wobei

Bahn 10; eine Kontrolle
Bahn 11; ein RT-PCR-Produkt aus MG-63-Zellen, die nur auf einem Zement wuchsen,
Bahn 12; ein RT-PCR-Produkt aus Zellen, die auf Zement + 0,005 Gew.% Typ 75-Polyphosphat wuchsen,
Bahn 13; ein RT-PCR-Produkt aus Zellen, die auf Zement + 0,01 Gew.% Typ 75-Polyphosphat wuchsen,
Bahn 14; ein RT-PCR-Produkt aus Zellen, die auf Zement + 0,05 Gew.% Typ 75-Polyphosphat wuchsen,
Bahn 15; ein RT-PCR-Produkt aus Zellen, die auf Zement + 0,005 Gew.% Typ 65-Polyphosphat wuchsen,
Bahn 16; ein RT-PCR-Produkt aus Zellen, die auf Zement + 0,01 Gew.% Typ 65-Polyphosphat wuchsen, und
Bahn 17; ein RT-PCR-Produkt aus Zellen, die auf Zement + 0,05 Gew.% Typ 65-Polyphosphat wuchsen, ist.

6a zeigt das Ergebnis einer Elektrophorese von GAPDH RT-PCR-Produkten aus Hos-TE85-Zellen, wobei

Bahn 1; ein DNA Marker (DNA-Leiter),
Bahn 2; eine Kontrolle, Bahn 3; ein RT-PCR-Produkt aus Hos-TE85-Zellen, die nur auf einem Zement wuchsen,
Bahn 4; ein RT-PCR-Produkt aus Zellen, die auf Zement + 0,005 Gew.% Typ 75-Polyphosphat wuchsen,
Bahn 5; ein RT-PCR-Produkt aus Zellen, die auf Zement + 0,01 Gew.% Typ 75 Polyphosphat wuchsen,
Bahn 6; ein RT-PCR-Produkt aus Zellen, die auf Zement + 0,05 Gew.% Typ 75-Polyphosphat wuchsen,
Bahn 7; ein RT-PCR-Produkt aus Zellen, die auf Zement + 0,005 Gew.% Typ 65-Polyphosphat wuchsen,
Bahn 8; ein RT-PCR-Produkt aus Zellen, die auf Zement + 0,01 Gew.% Typ 65 Polyphosphat wuchsen, und
Bahn 9; ein RT-PCR-Produkt aus Zellen, die auf Zement + 0,05 Gew.% Typ 65-Polyphosphat wuchsen, ist.

6b zeigt das Ergebnis einer Elektrophorese von Osteocalcin RT-PCR-Produkten aus MG-63-Zellen, wobei

Bahn 10; eine Kontrolle,
Bahn 11; ein RT-PCR-Produkt aus MG-63-Zellen, die nur auf einem Zement wuchsen,
Bahn 12; ein RT-PCR-Produkt aus Zellen, die auf Zement + 0,005 Gew.% Typ 75-Polyphosphat wuchsen,
Bahn 13; ein RT-PCR-Produkt aus Zellen, die auf Zement + 0,01 Gew.% Typ 75-Polyphosphat wuchsen,
Bahn 14; ein RT-PCR-Produkt aus Zellen, die auf Zement + 0,05 Gew.% Typ 75-Polyphosphat wuchsen,
Bahn 15; ein RT-PCR-Produkt aus Zellen, die auf Zement + 0,005 Gew.% Typ 65-Polyphosphat wuchsen,
Bahn 16; ein RT-PCR-Produkt aus Zellen, die auf Zement + 0,01 Gew.% Typ 65-Polyphosphat wuchsen, und
Bahn 17; ein RT-PCR-Produkt aus Zellen, die auf Zement + 0,05 Gew.% Typ 65-Polyphosphat in Bahn 17 wuchsen, ist.

7 zeigt die Ergebnisse der histochemischen Untersuchung einer Oberschenkelknocheneinzelprobe eines Beagles, wobei

7A eine grobe Ansicht zeigt, die, nachdem ein Defekt in seinem Oberschenkelknochen verursacht wurde, nicht behandelt worden ist,
7B ein Querschnitt von 7A ist,
7C ein Bild durch ein optisches Mikroskop mit einer neunfachen Vergrößerung von 7B ist,
7D ein Bild durch ein optisches Mikroskop mit einer vierzigfachen Vergrößerung von 7C ist, und
7E ein Bild durch ein optisches Mikroskop mit einer einhundertfachen Vergrößerung von 7D ist.

8 zeigt die Ergebnisse der histochemischen Untersuchung einer Oberschenkelknocheneinzelprobe eines Beagles, in den ein künstlicher Knochen, der 0,01 Gew.% Typ 65-Polyphosphat enthält, eingesetzt wurde, nachdem ein Defekt in seinem Oberschenkelknochen gesetzt worden ist, wobei

8A eine grobe Ansicht ist,
8B ein Querschnitt von 8A ist,
8C ein Bild durch ein optisches Mikroskop mit einer neunfachen Vergrößerung von 8B ist,
8D ein Bild durch ein optisches Mikroskop mit einer 40-fachen Vergrößerung von 8C ist,
8E ein Bild durch ein optisches Mikroskop mit einer hundertfachen Vergrößerung von 8D ist.

9 zeigt die Ergebnisse einer histochemischen Untersuchung von Oberschenkelknocheneinzelproben eines Beagles, in den ein künstlicher Knochen, der kein Polyphosphat enthält, eingesetzt wurde, nachdem ein Defekt in seinem Oberschenkelknochen gesetzt worden ist, wobei

9A eine grobe Ansicht ist,
9B ein Querschnitt von 9A ist,
9C ein Bild durch ein optisches Mikroskop mit einer neunfachen Vergrößerung von 9B ist,
9D ein Bild durch ein optisches Mikroskop mit einer 40-fachen Vergrößerung von 9C ist,
9E ein Bild durch ein optisches Mikroskop mit einer hundertfachen Vergrößerung von 9D ist.

10 zeigt Autoradiogramme eines Oberschenkelknochens eines Beagles, der, nachdem ein Defekt im Oberschenkelknochen gesetzt worden ist, nicht behandelt worden ist, wobei

1A; kurz nach der Operation,
1B; zwei Wochen nach der Operation,
1C; vier Wochen nach der Operation, und
1D; sechse Wochen nach der Operation darstellt.

11 zeigt Autoradiogramme eines Oberschenkelknochens eines Spürhundes in den ein künstlicher Knochen, der kein Phosphat enthält, implantiert wurde, nachdem ein Defekt im Oberschenkelknochen gesetzt worden ist, wobei

2A, kurz nach der Operation,
2B; zwei Wochen nach der Operation,
2C; vier Wochen nach der Operation, und
2D; sechs Wochen nach der Operation darstellt.

12 zeigt Autoradiogramme eines Oberschenkelknochen eines Beagles, in den ein künstlicher Knochen, der 0,01 Gew.% Typ 65-Polyphosphat enthält, implantiert wurde, nachdem ein Defekt im Oberschenkelknochen gesetzt worden ist, wobei

3A; kurz nach der Operation
3B; zwei Wochen nach der Operation, 3C; vier Wochen nach der Operation, und
3D; sechs Wochen nach der Operation darstellt.

13 zeigt ein Diagramm, in dem PCV-Mengen in Bezug auf die Zeit, nachdem der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung in einen Oberschenkelknochen eines Beagles transplantiert worden ist, dargestellt werden.
14 zeigt ein Diagramm, in dem Hämoglobinkonzentrationen in Bezug auf die Zeit, nachdem der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung in einen Oberschenkelknochen des Beagles transplantiert worden ist, dargestellt werden.
15 zeigt ein Diagramm, in dem die Mengen weißer Blutzellen im Blut in Bezug auf die Zeit, nachdem ein polyphosphathaltiger, künstlicher Knochen der vorliegenden Erfindung in einen Oberschenkel eines Beagles transplantiert worden ist, dargestellt werden.
16 zeigt ein Diagramm, in dem die Gesamtserumproteinkonzentrationen im Bezug auf die Zeit, nachdem der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung in einen Oberschenkelknochen des Beagles transplantiert worden ist, dargestellt werden.
17 zeigt ein Diagramm, in dem weiße AST-Konzentrationen im Blut in Bezug auf die Zeit, nachdem der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung in einen Oberschenkelknochen des Beagles transplantiert worden ist, dargestellt werden.
18 zeigt ein Diagramm, in dem ALT-Konzentrationen in Bezug auf die Zeit, nachdem der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung in einen Oberschenkelknochen des Beagles transplantiert worden ist, dargestellt werden.
19 zeigt ein Diagramm, in dem Harnstoff-Stickstoff-Mengen im Blut in Bezug auf die Zeit, nachdem der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung in einen Oberschenkelknochen des Beagles transplantiert worden ist, dargestellt werden.
20 zeigt ein Diagramm, in dem die Kreatinin-Konzentrationen in Bezug auf die Zeit, nachdem der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung in einen Oberschenkelknochen des Beagles transplantiert worden ist, dargestellt werden.
21 zeigt ein Diagramm, in dem Kalzium-Mengen im Blut in Bezug auf die Zeit, nachdem der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung in einen Oberschenkelknochen des Beagles transplantiert worden ist, dargestellt werden.
22 zeigt ein Diagramm, in dem Phosphat-Mengen im Blut in Bezug auf die Zeit, nachdem der Polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung in einen Oberschenkelknochen des Beagles transplantiert worden ist, dargestellt werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues künstliches Kalziumphosphat-Knochenersatzmittel bereit, das die biologisch kompatible Knochenregeneration fördert, das osteoinduktive und osteokonduktive Aktivitäten aufweist und das aus Kalziumphosphatzement und linearem Polyphosphat hergestellt wird.
Das biologisch kompatible, knochenregenerierende Kalziumphosphat wird als ein ideales Ersatzmittel oder Füllmittel für beschädigte Knochen gesehen. Beispiele für dieses Kalziumphosphat beinhalten Dikalziumphosphatdihydrat (DCPD), Dikalziumphosphat (DCP), Tetrakalziumphosphat (TTCP) und Hydroxylapatit (HA).
Der Kalziumphosphatzement, der das künstliche Kalziumphosphat-Knochenersatzmittel der vorliegenden Erfindung aufnimmt, kann einer sein, der im Stand der Technik gut bekannt ist, der hauptsächlich β-Trikalziumphosphat, Monokalziumphosphat und/oder Kalziumsulfathemihydrat umfasst, darauf jedoch nicht begrenzt ist. Es sei betont, dass die Modifikation eines Teils oder aller Bestandteile möglich ist und innerhalb des Schutzumfangs der Erfindung liegt.
Bevorzugt wird der Kalziumphosphatzement aus einer Mischung hergestellt, die zusammengesetzt ist aus 40–58 Gew.% β-Trikalziumphosphat, 10–15 Gew.% Monokalziumphosphat, 8–12 Gew.% Kalziumsulfathemihydrat und 5–20 Gew.% anderer Additive. Für die Herstellung des Kalziumphosphatzementes wird die Mischung durch Autoklavieren sterilisiert und verfestigt. Wenn den Wachstumsbedingungen für Osteoblasten Rechnung getragen wird, wird der Kalziumphosphatzement bevorzugt in einem pH-Bereich von 7,0 bis 7,4 nach der Verfestigung beibehalten.
Die vorliegende Erfindung stellt durch Versetzen mit Polyphosphat einen neuen künstlichen Knochenzement bereit, der gegenüber Herkömmlichen bezüglich der Anforderungen knochenregenerativer, künstlicher Knochenersatzmittel besser ist.
Polyphosphat, eine einfache Struktur, die durch eine Vielzahl von Phosphodiesterbindungen gebildet wird, hat die Funktion die Knochenregeneration in Kombination mit herkömmlichem künstlichem Knochenzement zu fördern. Besonders Polyphosphatsalze, wie zum Beispiel Kaliumpolyphosphat und Natriumpolyphosphat, beugen dem Abbau von Vitamin C und der Entfärbung der natürlichen Pigmente und synthetischen Farbstoffe als auch der Desodorisierung von Metall-Ionen vor. Wenn sie mit Polyphosphat verbunden werden, können Proteine und Peptide in Wasser gelöst werden. Daher führt Polyphosphat zu einer Verbesserung bei der Hydration und Retention von Proteinen oder Peptiden. Weiterhin ist Polyphosphat so sicher für den Körper, das es als Lebensmittelszusatz anerkannt ist.
Tatsächlich wird Polyphosphat bei proteinreichen Lebensmitteln mit dem Ziel verwendet, die Lebensmittel durch Ausnutzen des Vorteils der Funktion von Polyphosphaten, Wasser beim Durchdringen von Proteinen und Peptiden zu unterstützen, die Lebensmittel aufzuweichen.
Für den Fall, dass es in einer flüssigen Phase gemischt wird, wird das Polyphosphat der vorliegenden Erfindung bevorzugt in einer Salzform, jedoch nicht begrenzt darauf, bereitgestellt. Wenn es in linearer Struktur vorliegt, kann jede Art von Polyphosphat, das mit Metallen oder Chemikalien verbunden ist, verwendet werden. Bevorzugt sind Natriumsalze, Kaliumsalze und Kalziumsalze.
Ein Polyphosphat, das zum künstlichen Knochenzement der vorliegenden Erfindung zugegeben werden kann, ist in seiner Konfiguration nicht besonderes begrenzt, weist jedoch bevorzugt eine lineare Struktur auf. Bezogen auf das Gesamtgewicht des künstlichen Knochenzementes, wird Polyphosphat in einer Menge von 0,001 bis 0,05 Gew.% verwendet. Wenn zum Beispiel der künstliche Knochenzement einen Polyphosphatgehalt von weniger als 0,001 Gew.% aufweist, können die gewünschten Wirkungen nicht erzielt werden. Wenn auf der anderen Seite, der Polyphosphatgehalt 0,05 Gew.% überschreitet, durchläuft der Osteoblast den Zelltod.
Ein anderer Parameter, der die knochenregenerierende Wirkung des künstlichen Knochenzements bestimmt, ist die Kettenlänge des Polyphosphats. Das Auswählen der geeigneten Kettenlänge für das Polyphosphat dient der Verbesserung des knochenregenerierenden Potentials des künstlichen Knochenzements, da die Kettenlänge des Polyphosphats einen Einfluss auf die Transkriptionsrate des Osteocalcins hat, einem wichtigen Genprodukt der Osteoblasten. Bezüglich der Kettenlänge, variiert das Polyphosphat bevorzugt, in Orthophosphatrest-Zahlen, von 3 bis 200, noch bevorzugter von 10 bis 100 und am meisten bevorzugt von 60 bis 80.
Der Polyphosphathaltige, künstliche Knochenzement der vorliegenden Erfindung ist durch Aktivieren der Transkription eines Osteoblasten bildenden Gens bei der Knochenregeneration involviert. Diese Funktion kann in in vitro Tests mit MG-63 und Hos-TE85-Zellen, die beide Osteoblastenstämme sind, und in in vivo Tests unter Verwendung von Beaglen (siehe die 7 bis 10) verifiziert werden.
Der Polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung, mit den Vorteilen, dass er für den Körper nicht toxisch, chemisch stabil und biologisch abbaubar ist, ist für die Behandlung von frakturierten Knochen oder schadhaften Bereichen des Knochens verwendbar und kann die herkömmlichen künstlichen Knochen, allogenen Transplantate und autogenen Transplantate ersetzen, die beim Ersetzen eines gesamten Gelenkes und bei Wirbeloperationen verwendet werden.
BEISPIELE
In der Praxis und gegenwärtig bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung werden erläutert, wie in den folgenden Beispielen gezeigt wird.
Beispiel 1: Herstellung von künstlichem Knochenmaterial mit Polyphosphat
5,47 g β-Trikalziumphosphat, 1,33 g Monokalziumphosphat und 1,07 g Kalziumsulfathemihydrat wurden homogen vermischt. Aus der Kalziumphosphat-Stammmischung wurden 0,16 g entnommen und dann bei 121°C bei einem Druck von 15 psi (103,42 kPa) autoklaviert, während es in Alufolie eingewickelt war. Nach dem Beenden des Autoklavierens wurde die Mischung in eine sterilisierte Sechs-Kammer-Platte oder eine 100 mm Petrischale gegossen und verfestigt. Um die Mischung während der Verfestigung bei pH 7,0–7,4 zu halten, wurden 100 μl 0,15 N NaOH und 200 μl sterilisiertes, deionisiertes Wasser dünn auf der Kammer-Platte oder der Schale verteilt, gefolgt vom Trocknen der Kammer-Platte oder Schale für 2–3 Stunden in einem Inkubator, der auf 37°C eingestellt wurde.
Um Natriumpolyphosphat zum vorbereitetem Kalziumphosphatzement zuzugeben, wurden alle Natriumpolyphosphat-Lösungen, die eine Kettenlängen von 5, 15, 25, 35, 45, 65 und 75 aufweisen, mit einer 10% Stammlösung zu einer 0,05 Gew.%, einer 0,01 Gew.% beziehungsweise einer 0,005 Gew.% Lösung verdünnt, die dann mit dem Kalziumphosphatzement vermischt wurden. Die Verfestigung dieser Mischungen erforderte künstliche Knochenmaterialien der vorliegenden Erfindung.
Versuchsbeispiel 1: in vitro Tests zum Bestimmen von toxizitätspuffernden Wirkungen von Kalziumphosphat auf Zellen
<1-1> Zellkultur
Menschliche Osteoblastenstämme MG-63 (männliches Osteosarkom, Koreanische Zelllinienbank, KAT. #21247) und HOS-TE85 (weibliches Osteosarkom, Koreanische Zelllinienbank, KAT. #21543) wurden für in vivo Tests zum Bestimmen der toxizitätspuffernden Wirkungen von Kalziumphosphat verwendet.
Es wurden besonders die menschlichen Osteoblastenstämme MG-63 und HOS-TE85 in 100 mm Petrischalen oder T-75 Kulturflaschen angeimpft. Während MG-63 in MEM (minimum essential medium), das in den Schalen oder Flaschen zum Kultivieren von MG-63 enthalten war, kultiviert wurde, wurden HOS-TE85 in DMEM (Dulbeco's modified Eagle medium), das 3,7 g/l Natriumdicarbonat und 2,5 g/l HEPES-Puffer enthält, kultiviert. Jedes Kulturmedium wurde mit 2 mM L-Glutamin, 0,1 mM nicht-essentiellen Aminosäuren, 1,0 mM Natriumpyruvat, 10% fötalem Rinderserum (FBS) und 1% Penizillin-Streptomycin (10.000 U/ml) versetzt. Das Kulturmedium wurde zweimal pro Woche durch frisches ersetzt. Die Osteoblastenzellen wurden ein bis zwei Mal pro Woche in einem Inkubator, der bei einer Atmosphäre, die 5% CO₂ und 95% O₂ enthält, auf 37°C eingestellt war, subkultiviert. Vor Gebrauch wurde FBS über 30 Min auf 56°C erhitzt. Alle in dieser Zellkultur verwendeten Reagenzien wurden bei Gibco. BRL Co., USA bezogen.
<1-2> Zellkultivierung mittels Medium mit künstlichem Knochenzement
Mit dem polyphosphathaltigen, künstlichen Knochenzement, das in Beispiel 1 hergestellt wurde, wurden humane Osteoblastenzellen MG-63 und HOS-TE85 auf die folgenden zwei Arten kultiviert.
<1-2-1> Transmembran Anwendung
Über den polyphosphathaltigen, künstlichen Knochenzement der vorliegenden Erfindung, der auf einer Sechs-Kammer-Platte verfestigt wurde, wurden 2–3 ml des Zellkulturmediums gegeben, um den Knochenzement vollständig abzudecken, wie in 1 dargestellt. Eine sterile Transmembran, eine Art Kollagen beschichtete Polytetrafluorethylenmembran (Transwell-COL, Coster USA), wurde auf das Kulturmedium gelegt, wonach Zellen auf der Transmembran angeimpft und kultiviert wurden.
<1-2-2> Agarose Anwendung
Eine 0,7% Agarose-Lösung (Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt, Sigma USA) in sterilem, deionisiertem Wasser wird bei geeigneter Temperatur gehalten. Über das polyphosphathaltige, künstliche Knochenmaterial der vorliegenden Erfindung, das auf einer 100 mm Petrischale verfestigt wurde, wurden unter Verwendung einer 1000 ml Pipette 3 ml der 0,7% Agarose-Lösung langsam zugegeben, damit der verfestigte künstliche Knochen nicht kollabiert, bis der künstliche Knochen vollständig bedeckt ist. Die Agarose-Lösung wurde nur über das polyphosphathaltige, künstliche Knochenmaterial, das im Beispiel 1 hergestellt und verfestigt wurde, gegossen. Nach dem Verfestigen des polyphosphathaltigen, künstlichen Knochenmaterials auf der 100 mm Petrischale wurde das künstliche Knochenmaterial ausgeschmolzen, um nur eine Hälfte der Fläche der Petrischale zu bedecken, damit die andere halbe Fläche für das Anbinden von Zellen, wie in 2 gezeigt, bereitgestellt würde.
<1-3> Animpfen der Zellen und RNA Isolation
MG-63 und HOS-TE85-Zellen, die im Versuchsbeispiel <1-2> kultiviert wurden, wurden aus den entsprechenden Petrischalen entnommen und in sterilisiertem, deionisiertem Wasser aufgelöst. 20 μl jeder Zelllösung wurde mit 0,4% Tryphanblau gefärbt, und die Zellzahl wurde mit Hilfe eines Hämocytometers ausgezählt. Künstliche Knochenmaterialien, die Typ 65- beziehungsweise Typ 75-Polyphosphat enthielten wurden auf Petrischalen oder Sechs-Kammer-Platten verfestigt und als Matrizes bereitgestellt, auf denen Zellen mit einer Dichte von 1,0 × 10⁶ Zellen/ml angeimpft wurden und auf Petrischalen angebunden.
Um die Testzellen auf Kulturschalen anzubinden, wurde kalziumfreies EMEM (BioWhittaker, Walkersvile, Maryland) dem 1 M HEPES-Puffer (60 ml/l), 10% FBS und 1% Penizillin-Streptomycin zugegeben wurden, verwendet und alle drei Tage erneuert.
Nach 72 stündigem Kultivieren wurde die gesamte RNA aus jeder der MG-63 und HOS-TE85-Zellen extrahiert. 1 ml Trizol (Gibco BRL) wurde in jede Petrischale gegossen und die Zellen wurden mittels eines Schabers entnommen. Die Zellernte wurde mit Hilfe von 18–21 G-Spritzen in 1,5 ml Mikroröhrchen homogenisiert und bei 12.000 rpm, bei 4°C für 10 Minuten zentrifugiert. Den Überstand lies man, nachdem 200 μl einer Mischung aus 25 : 24 : 1, Phenol : Chloroform Isoamylalkohol zugegeben wurde, für 5–15 Minuten bei Raumtemperatur stehen, um eine klare Schicht zu erhalten, die dann bei 12.000 rpm, bei 4°C für 15 Minuten zentrifugiert wurde. In einem neuen Reaktionsgefäß wird die so erhaltene RNA-Schicht mit einem Volumen aus absolutem Isopropylalkohol vermischt, für 5–15 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen und bei 12.000 rpm, bei 4°C für 5 Minuten zentrifugiert. Das RNA-Pellet wurde bei Raumtemperatur für 5–10 Minuten gut getrocknet, 100 μl DEPC-Wasser wurden zugegeben und wurde dann mit einem UV-Spektrometer (Hewlett Packard, USA) quantitativ vermessen.
<1-4> Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR)
Von der im Versuchsbeispiel <1-3> erhaltenen RNA wurde durch chemische Behandlung bei 42°C für 30 Minuten und dann 75°C für 30 Minuten cDNA synthetisiert und als Matrize für eine PCR verwendet. In diesem Zusammenhang wurde ein humanes Glyzerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase (GAPDH)-Gen, eine Art von konstitutivem Gen (house-keeping gene), als Positiv-Kontrolle verwendet. Unter Verwendung eines Satzes des Sinn-Primers GAPDN-N, dargestellt durch SEQ ID NO: 3, und des Gegensinn-Primers GAPDH-C, dargestellt durch SEQ ID NO: 4, begann eine PCR für die Kontrolle bei 95°C für die Erstdenaturierung für 3 Minuten und wurde dann für 30 Zyklen bei einer Denaturierungstemperatur von 95°C für 30 Sekunden, einer Reassoziierungstemperatur von 63°C für 30 Sekunden, einer Temperatur für das Verlängern von 72°C für 30 Sekunden und am Ende gefolgt von einer Verlängerung bei 72°C für zusätzliche 7 Minuten durchgeführt. Für die Amplifizierung eines Osteocalcin-Gens startete eine PCR mit einem Satz des Sinn-Primers OCN-Sinn, dargestellt durch SEQ ID NO: 1 und des Gegensinn-Primers OCN-Gegensinn, dargestellt durch SEQ ID NO: 2, mit 95°C für die Erstdenaturierung für 3 Minuten und wurde dann für 30 Zyklen bei einer Denaturierungstemperatur von 95°C für 30 Sekunden, einer Reassoziierungstemperatur von 55°C für 30 Sekunden, einer Temperatur für das Verlängern von 72°C für 30 Sekunden und am Ende gefolgt von einer Verlängerung bei 72°C für zusätzliche 7 Minuten durchgeführt. Die Mischungszusammensetzungen für die RT-PCR und die PCR werden in der unten stehenden Tabelle 1 wiedergegeben.
<Tabelle 1> Mischungszusammensetzung für die RT-PCR und die PCR
<1-5> Agarosegelelektrophorese
10 μl des im Versuchsbeispiel <1-4> erhaltenen RT-PCR-Produktes wurde durch Elektrophorese auf einem 1,5 Agarosegel analysiert. Die Elektrophorese wurde für 40 Minuten bei 100 V mit einem 1 × TAE (Trisacetat)-Puffer durchgeführt. Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Agarosegel für 20 Minuten in EtBr (Ethidiumbromid) gefärbt und dann für 15–20 Minuten in deionisiertem Wasser entfärbt. Das entfärbte Gel wurde auf einem UV-Transilluminator (Paramount) beobachtet, durch Verwendung eines Photodock-Systems (GEL-DOC, Bio-Rad, USA) wiederum untersucht und photographiert.
Versuchsbeispiel 2: Wirkung des künstlichen Polyphosphatknochens auf die Transkription des Osteoblasten bildenden Gens
<2-1> Bestimmung der Transkriptionsrate des Osteoblasten bildenden Gens von MG-63
Alle Beispiele wurden auf die gleiche Weise durchgeführt wie in Versuchsbeispiel 1. Nachdem sie in künstlichen Knochen inokuliert worden sind, die mit beiden Typen 65- und 75-Polyphosphat mit 0,005 Gew.%, 0,05 Gew.% beziehungsweise 0,01 Gew.% vermischt waren, wurden MG-63-Zellen für 72 Stunden kultiviert und einer RNA-Isolation unterzogen. Als Kontrolle wurden MG-63-Zellen, die alleine gewachsen sind, verwendet. Ein Satz von Osteoblasten bildenden, Gen-spezifischen Primern, die durch SEQ ID NO: 1 und 2 dargestellt werden, wurde unter Verwendung der isolierten RNA's als entsprechende Matrizen für die RT-PCR verwendet. Die Dichte der Banden im Gel, die nach der Elektrophorese der oben genannten RT-PCR-Produkte aufgetreten sind, wurden mit denen verglichen, die nach der Elektrophorese der RT-PCR-Produkte, die bei Verwendung der GAPDH-spezifischen Primer (3, 5b und 6B) erhalten wurden, aufgetreten sind.
Im Allgemeinen war die Transkriptionsrate der Zellen, die zusammen mit den polyphosphathaltigen, künstlichen Knochenmaterialien der vorliegenden Erfindung zugegeben wurden, zwei- oder dreimal höher als bei den Zellen, die zusammen mit herkömmlichen künstlichen Knochen zugegeben wurden. Besonders bei den Zellen, die zusammen mit künstlichen Knochenmaterialien zugegeben wurden, die einen konventionellen künstlichen Knochenzement in Kombination mit 0,005 Gew.% des Typ 75-Polyphosophats und 0,05 Gew.% des Typ 65-Polyphosphats umfassen, fand man, dass sie sich in der Transkriptionsrate des Osteoblasten bildenden Gens bemerkenswert verbessert hatten. Diese Ergebnisse zeigen, dass das Polyphosphat, das dem herkömmlichen künstlichen Knochenzement zugegeben wird, einen Beitrag zur schnellen knochenmorphogenetischen Wirkung durch Erhöhen der Aktivität der Osteoblasten leistet.
<2-2> Bestimmung der Transkriptionsrate des Osteoblasten bildenden Gens von HOS-TE85
Alle Versuche wurden auf vergleichbarer Weise durchgeführt wie die für die oben genannten MG-63-Zellen.
Bei allen HOS-TE85-Zellen, die zusammen mit künstlichen Knochen zugegeben wurden, die 0,005 Gew.% des Typ 75-Polyphosphats und 0,05 Gew.% des Typ 65-Polyphosphats umfassten, waren die Transkriptionsraten der Osteoblasten bildenden Gene etwa zweimal so hoch wie bei einer Kontrolle. Die Zellen, die mit künstlichen Knochen zugegeben wurden, die 0,005 Gew.% und 0,01 Gew.% des Typ 65-Polyphosphates umfassten, zeigten eine etwa 1,5-fach höhere Transkriptionsrate des Osteoblasten bildenden Gens als die der Kontrolle (4, 5a und 6a). Obwohl bei der Transkriptionsrate etwas unterschiedlich zu MG-63 aus dem Versuchsbeispiel <2-1>, abhängig von der Kettenlänge des Polyphosphats, waren die HOS-TE85-Zellen im Allgemeinen in ihrer Aktivität bei der Bildung von Osteoblasten besser als die Kontrolle.
Versuchsbeispiel 3: In vivo Tests zur Bestimmung der knochenregenerierenden, fördernden Wirkung von polyphosphathaltigem, künstlichem Knochenmaterial
Um die knochenregenerierende fördernde Wirkung des polyphosphathaltigen, künstlichen Knochens der vorliegenden Erfindung zu untersuchen, fügten diese Erfinder den polyphosphathaltigen, künstlichen Knochen in Knochendefekte ein, die in kondylären Oberschenkelknochen von Beaglen durch chirurgische Operation eingesetzt wurden und untersuchten ihre knochenregenerierenden fördernden Wirkungen.
<3-1> Versuchstiere
Knochendefekte wurden in die linken und rechten Oberschenkelknochen von zwei männlichen Beaglen eingefügt, von denen jeder ein Jahr alt oder älter war, mit einem Körpergewicht von etwa 15 kg. Um auszuschließen, dass die Knochenregeneration der Knochenepiphysenfuge und dem Östrogen zuzuordnen sind, müssen die Versuchstiere ein Jahr alt oder älter und männlich sein. Mindestens eine Woche vor dem chirurgischen Experiment wurden die Versuchstiere in den Versuchsraum eingeschlossen und man verabreichte ihnen wurmabtötende Medikamente und unterzog sie einer Impfung. Die Versuche wurden nicht gestartet bis man erkannte, dass sie sich den neuen Umständen angepasst hatten. Eine der zwei Versuchsgruppen wurde mit dem künstlichen Knochen, der 0,01 Gew.% des Typ 65-Polyphosphats der vorliegenden Erfindung enthielt, behandelt, während der andere mit dem künstlichen Knochen, der keine Polyphosphate enthielt, behandelt wurde.
<3-2> Herstellen von künstlichen Knochen
Ein künstliches Knochenmaterial, das 0,01 Gew.% des Typ 65-Polyphosphates enthält, wurde entsprechend dem Verfahren aus Beispiel 1 hergestellt. Das künstliche Knochenmaterial wurde in einen zylindrischen Block gegossen, der 10 mm lang war und einen Durchmesser von 4.8 mm besaß. Bezüglich des Eingießens wurde das künstliche Knochenzementmaterial in einen rostfreien Zylinder mit einem Innendurchmesser von 4,8 mm gegossen, bevor es verfestigt wurde. Eine chirurgische Operation wurde durchgeführt um einen Knochendefekt zu setzten.
<3-3> Behandlung von Versuchstiergruppen
Die präoperative Vorbereitung der Versuchstiere wurde nach allgemeinen Angaben durchgeführt. Durch eine Injektion mit Atropin bei einer Dosis von 0,05 mg/kg, und dann eine Injektion in einen Muskel mit Ketamin bei einer Dosis von 15 mg/kg und Xylazin bei einer Dosis von 2 mg/kg wurden die Versuchstiere unter eine allgemeine Anästhesie gesetzt.
Das polyphosphathaltige, künstliche Knochenmaterial der vorliegenden Erfindung wurde in einen der linken und der rechten Oberschenkelknochen des gründlich anästhesierten Tiers eingesetzt, während ein konventionelles künstliches Knochenmaterial, das kein Polyphosphat enthält, in den anderen linken und rechten Oberschenkelknochen eingesetzt wurde. Dafür wurde ein Loch 10 mm tief an einer vorbestimmten Stelle einer exponierten Oberschenkelknochenregion mit Hilfe einer 3,5 mm Bohrerspitze geschaffen und dann mit Hilfe einer 5 mm Bohrerspitze erweitert. In diese Defekt-Stelle wurde ein künstlicher Knochenzementblock, der im Versuchsbeispiel <3-2> hergestellt worden ist, eingesetzt und danach wurden das Weichgewebe und die Epidermis nach allgemeinen operativen Methoden geschlossen.
Nach der Operation wurde den Tieren für drei Tage Sefazolin injiziert, um einer bakteriellen Infektion vorzubeugen. Die operierten Bereiche wurden mit Bandagen geschützt, während Elizabeth's-Kragen um ihre Hälse gelegt wurden, damit die Tiere die bandagierten Stellen nicht stören.
<3-4> Histologische Untersuchung
In der sechsten Woche nach der chirurgischen Operation wurden alle Versuchstiere einer sanften Tötung unterzogen, wonach ihnen Proben der Oberschenkelknochen entnommen wurden. Nachdem sie mittels einer Präzisionssäge schräg zerschnitten wurden, werden die Knochenproben für die Fixierung für 46 Stunden in 10% gepuffertem Formalin (pH 7,6) eingetaucht. Die fixierten Proben wurden durch die Verwendung eines Dekalzifizierungsagens (Plank-Rychlo-Lösung) dekalzifiziert, in eine 5% Na₂SO₄-Lösung eingetaucht und in einer 10% Formalin-Lösung fixiert. Man lies die Proben ein Gewebezubereitungsverfahren durchlaufen, um Parafineinbettungen herzustellen, die dann in 5 μm dicke Dünnschnitte geschnitten wurden. Das Härten der Dünnschnitte mit Hämatoxylin-Eosin (H&E) ermöglichte die Beobachtung unter einem optischen Mikroskop.
Die Ergebnisse der optischen Mikroskopie werden in 7 gezeigt. Eine Gewebeeinzelprobe der distalen Extremität des Beagle Oberschenkelknochens, in dem der künstlich gesetzte Knochendefektbereich ohne weitere Maßnahmen behandelt worden ist, zeigte, dass Sinusoide (S) sich im Wesentlichen um den Knochendefekt (BD) herum mit einer teilweisen Bildung eines neuen Knochens (N) gebildet hatten. Jedoch gab es immer noch Osteoklasten (durch einen Pfeil angezeigt) im Defekt.
Im Gegensatz dazu, zeigte eine Gewebeeinzelprobe der distalen Extremität des Beagle Oberschenkelknochens, in dem der künstliche Knochenzement, der 0,01 Gew.% des Typ 65-Polyphosphates enthielt, in den künstlich gesetzten Knochendefektbereich transplantiert wurde, dass ein neuer Knochen (N) in den Knochenzement (BC) eingewachsen war. Zusätzlich fand man dicht gewachsene Osteoblasten (durch einen Pfeil angezeigt) um den neuen Knochen und den Knochenzement herum, was auf das Auftreten einer aktiven Knochenregeneration, wie in die 8c und 8d gezeigt, hinweist. In der 100-fachen Vergrößerung der optischmikroskopischen Fotographie der 8e kann man weiterhin deutlich Osteoblasten erkennen, die dicht um den Knochenzement und den neuen Knochen herum gewachsen waren, während der neue Knochen wuchs, wobei er den Knochenzement umgibt. Das Betrachten eines Querschnitts des Oberschenkelknochens in dem der künstliche Knochen transplantiert worden war, unterstützte die Kenntnis, dass fast das gesamte Mark um den Knochenzement herum durch die weiße Matrix substituiert worden war.
Andererseits beobachtete man in einer Gewebeeinzelprobe der distalen Extremität des Beagle Oberschenkelknochens, in den der künstlichen Knochenzement, der kein Polyphosphat enthält, anstelle des polyphosphathaltigen Knochenzementes der vorliegenden Erfindung transplantiert wurde, dass ein neuer Knochen (N) teilweise den Knochenzement (BC) umgab, jedoch waren Osteoklasten (durch eine Pfeil angezeigt) um den Knochenzement (BC) herum vorherrschend. Es wurden auch viele Entzündungszellen im interstitiellen Gewebe (9c und 9d) beobachtet. In der 100-fachen Vergrößerung der optisch-mikroskopischen Fotographie der 9e, wurden Osteoklasten (OC) gezeigt, die sich um den Knochenzement (BC) herum gesammelt hatten.
<3-5> Röntgenstrahluntersuchung
Sofort zwei Wochen, vier Wochen und sechs Wochen nach dem Durchlaufen der chirurgischen Operation zum Setzen der Knochendefekte und dem Transplantieren der künstlichen Knochen gemäß dem Versuchsbeispiel <3-3>, wurden die Versuchstiere geröntgt, um den Knochenregenerationsprozess zu überwachen. Zum Vergleich wurde auch ein Versuchstier, dessen Knochendefekt unbehandelt blieb, als Kontrolle verwendet.
Im Versuchstier, das nicht mit Knochenzementen behandelt wurde, fand man keine beachtenswerten Unterschiede, mit der Ausnahme, dass nur eine geringe Zunahme bei der Knochendichte an der Grenze des Knochendefekts gerade sechs Wochen nach der Operation, wie in 10 gezeigt, beobachtet wurde. Das Versuchstier, in dem der Knochenzement mit keinem Polyphosphat transplantiert wurde, zeigte, dass in der zweiten Woche nach der Operation neuer Knochen anfing zu wachsen und auf eine Größe, so groß wie der transplantierte Knochen nach sechswöchigen Verlauf, wie in 11 gezeigt, anwuchs. Andererseits fand man im Versuchstier, dass mit dem künstlichen Knochen der vorliegenden Erfindung behandelt worden ist, dass in der zweiten Woche nach der Operation ein neuer Knochen anfing zu wachsen und auf eine Größe anwuchs, die 1,5 mal so groß war, wie beim künstlichen Knochen nach sechswöchigem Verlauf. Daher war der künstliche Knochenzement, der mit Polyphosphat der vorliegenden Erfindung ergänzt wurde, gegenüber konventionellen Knochenzementen bei seinem knochenregenerativen Potential besser.
Versuchsbeispiel 4: Test der Toxizität des polyphosphathaltigen, künstlichen Knochens für den Körper
Nach dem Durchlaufen der chirurgischen Operation zum Setzen der Knochendefekte und Transplantieren der künstlichen Knochen wie in Versuchsbeispiel <3-3>, wurden die Versuchstiere Blut- und serologischen Tests unterzogen, um zu untersuchen, ob die künstlichen Knochentransplantate eine in vivo Toxizität zeigen oder nicht. Zum Vergleich wurde eine Tiergruppe, deren Knochendefekte unbehandelt blieben, als Kontrolle verwendet. Während der Hämatokritwert (PCV), die Hämoglobindichte und die Anzahl der gesamten weißen Blutzellen als zu untersuchende Größen für die Bluttests ausgewählt wurden, wurden Messungen des gesamten Serumproteins, AST, ALT, BUN, Kreatin, Ca und P für den serologischen Test durchgeführt.
<4-1> Messung der Veränderung im PCV
Um die Veränderung im PCV (Hämatokritwert; packed cell volume) der roten Blutkörperchen in jeder Versuchsgruppe zu messen, wurden jede Woche von kurz bevor bis zur sechsten Woche nach der Operation Blutproben aus jeder Versuchstiergruppe entnommen. Jede Blutprobe im Röhrchen, das mit EDTA, einem Antikoagulanz, behandelt wurde, wurde mit Hilfe eines automatischen QBC-Hämozytometers (Idexx Co., USA) auf eine Veränderung im Hämatokritwert überwacht.
Wie in 13 dargestellt, lag der PCV der Tiergruppe, in die der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung eingesetzt worden war, innerhalb des normalen PCV-Bereichs, der bekanntermaßen bei 35 bis 54% liegt (Muir WW und Hubbel JAE, Handbook of veterinary anesthesia, Mosby, St. Louis, S.13–15, 1995). Daher zeigt der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung keine Toxizität im Bezug auf den Hämatokritwert.
<4-2> Messung der Veränderung bei der Hämoglobindichte
Bei Blutproben, die auf vergleichbare Weise wie im Versuchsbeispiel <4-1> hergestellt wurden, wurde mit einem automatischen QBC-Hämozytometer (Idexx Co., USA) die Hämoglobinmenge im Blut bestimmt.
Während des Versuchszeitraumes, wie in 14 gezeigt, maß man, dass die Tiergruppe, in die der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung eingesetzt worden war, eine normale Hämoglobinmenge im Blut aufwies, die bekanntermaßen von 12,5 bis 19 g/dl variiert (Muir WW und Hubbel JAE, Handbook of veterinary anesthesia, Mosby, St. Louis, S.13–15, 1995). Daher ist der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung im Bezug auf die Hämoglobinmenge im Blut nicht toxisch.
<4-3> Messung der Veränderung der Gesamtzahl der weißen Blutkörperchen
Bei Blutproben, die auf vergleichbare Weise wie im Versuchsbeispiel <4-1> hergestellt wurden, wurde mit einem automatischen QBC-Hämozytometer (Idexx Co., USA) die Gesamtzahl der weißen Blutkörperchen bestimmt.
Wie in 15 gezeigt, maß man, dass bei der Tiergruppe, in die der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung eingesetzt worden war, die Anzahl der gesamten weißen Blutkörperchen von 12.920 bis 17.667 Zellen pro ml Blut variierte, was innerhalb des normalen Bereiches liegt, der bekanntermaßen bei etwa 6.500–19.000 Zellen pro ml Blut liegt (Muir WW und Hubbel JAE, Handbook of veterinary anesthesia, Mosby, St. Louis, S.13–15, 1995). Daher hat der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung weder eine negative Auswirkung auf die Gesamtzahl der weißen Blutkörperchen noch auf das Immunsystem des Körpers.
<4-4> Messung der Veränderung der Gesamtserumproteine
Blutproben, die gemäß dem Versuchsbeispiel <4-1> entnommen wurden, wurden in Röhrchen gegeben, die nicht mit Antikoagulanz behandelt worden sind, und man lies sie für 30 Minuten koagulieren, gefolgt von einer Zentrifugation bei 3.000 G für 15 Minuten, um das Serum abzutrennen. Das Serum wurde in sterile Röhrchen übertragen und bei –70°C bis zur Analyse gelagert. Mittels eines Serum-Chemischen Analysators (Ektachem) wurde das Serum auf Konzentrationsveränderungen in den Gesamtserumproteinen untersucht.
Wie in 16 dargestellt, maß man bei der Tiergruppe, in die der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung eingesetzt worden war, dass das Gesamtserumprotein von 6 bis 9,4 g/dl variiert, was etwas höher erscheint, als der normale Bereich, der bekanntermaßen bei etwa 6–7,5 g/dl liegt (Muir WW und Hubbel JAE, Handbook of veterinary anesthesia, Mosby, St. Louis, S.13–15, 1995), jedoch wurden größere Mengen als im normalen Bereich nur in der ersten und der sechsten Woche nach der Operation beobachtet. Man erkennt, dass diese inkonsistente Veränderung nichts mit der Toxizität zu tun hat, wenn andere Assay-Ergebnisse berücksichtigt werden. Daher hat der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung keinen Einfluss auf die Gesamtserumproteinmenge im Blut.
<4-5> Leberfunktionstest
Um die Wirkung zu untersuchen, die der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung auf die Leberfunktionen hat, während er in vivo vorliegt, um die Knochenregeneration zu fördern, wurde das Serum auf Aspartataminotransferase (AST) und Alaninaminotransferase (ALT) hin untersucht. Dafür wurde Serum, das auf vergleichbare Weise wie im Versuchsbeispiel <4-4> hergestellt wurde, mit einem Serum-Chemischen Analysator (Ektachem) automatisch auf die Konzentrationsveränderung in allen Serumenzymmengen hin gemessen.
Wie in den 17 und 18 gezeigt, maß man, dass die Tiergruppen, in die der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung eingesetzt worden war, nicht von den normalen Bereichen für die AST- und ALT-Mengen, die bekanntermaßen bei etwa 10–50 IU/l bzw. 15–110 IU/l liegen (Muir WW und Hubbel JAE, Handbook of veterinary anesthesia, Mosby, St. Louis, S.13–15, 1995), abwich. Daher hat der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung keine toxischen Auswirkungen auf die Leberfunktion.
<4-6> Nierenfunktionstest
Um die Wirkung zu untersuchen, die der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung auf die Nierenfunktion hat, während er in vivo vorliegt, um die Knochenregeneration zu fördern, wurde das Serum auf vergleichbare Weise wie im Versuchsbeispiel <4-4> hergestellt, und man maß die Konzentrationsveränderung des Urin-Stickstoffs und des Kreatinins im Blut mit einem Serum-Chemischen Analysator (Ektachem).
Wie in den 19 und 20 dargestellt, maß man, dass die Tiergruppe, in die der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung eingesetzt worden war, nicht vom normalen Bereich des Harnstoff-Stickstoffs im Blut, der bekanntermaßen bei etwa 6–30 mg/dl liegt (Muir WW und Hubbel JAE, Handbook of veterinary anesthesia, Mosby, St. Louis, S.13–15, 1995), abwich. Bei der Kreatininmenge im Blut, fand man, dass sie bei 0,7–1,3 mg/dl blieb, was niedriger ist als ihr normaler Bereich, was deutlich macht, dass der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung keine toxischen Wirkungen auf die Nierenfunktion hat.
<4-7> Messung der Veränderung der Kalzium- und Phosphatmenge im Serum
Um zu untersuchen, ob der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung irgendeine Veränderung bei den Kalzium- und Phosphatmengen im Blut zur Folge hat, wurde das Blut auf vergleichbare Weise wie im Versuchsbeispiel <4-4> hergestellt, und mit einem Serum- Chemischen Analysator (Ektachem) bezüglich der Kalzium- und Phosphatmengen im Blut überwacht.
Wie in den 21 und 22 dargestellt, wurde nachgewiesen, dass keine wesentlichen Veränderungen bei den Kalzium- und Phosphatmengen im Blut der Versuchstiere, in die der polyphosphathaltige, künstliche Knochen eingesetzt worden war, detektiert wurden.
Industrielle Anwendbarkeit
Die vorliegende Erfindung stellt einen neuen künstlichen Kalziumphosphatknochen bereit, der mit linearem Polyphosphat versetzt ist, der eine hervorragende biologischen Kompatibilität, Sterilisierung, Osteoinduktivität, Osteokonduktivität, biologische Abbaubarkeit und Immunogenität aufweist.
Der künstliche Kalziumphosphatknochen, der mit linearem Polyphosphat der vorliegenden Erfindung versetzt wurde, ist als Ersatzmittel für Gelenke, wie zum Beispiel Hüftgelenke, Kniegelenke, Schultergelenke und andere Gelenke, verwendbar. Zusätzlich ist der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung sicher für den Körper, chemisch stabil und bezüglich der Produktionskosten ökonomisch günstig.
Des Weiteren hat der polyphosphathaltige, künstliche Knochen der vorliegenden Erfindung eine Verringerung bei der während der Operation zu transfusierenden Blutmenge zur Folge, da es keine zusätzlichen Operationen gibt, um Knochentransplantate zu bekommen oder es möglich ist die Operation ohne Blutung durchzuführen. Die vorliegende Erfindung kann daher auch für Patienten verwendet werden, die aufgrund ihrer religiösen Prinzipien bei chirurgischen Operationen eingeschränkt sind.

Claims

Ein künstlicher Kalziumphosphatknochen, der für die Verwendung in biologisch kompatiblem Knochenersatz und der Knochenregeneration geeignet ist, der einen Kalziumphosphat-Knochenzement und ein Polyphosphat umfasst, wobei der Kalziumphosphat-Knochenzement 50–58 Gew.% β-Trikalziumphosphat, 10–15 Gew.% Monokalziumphosphat, 8-12% Kalziumsulfathemihydrat und 5–20 Gew.% an anderen Additiven umfasst.
Der künstliche Kalziumphosphatknochen gemäß Anspruch 1, der osteokonduktives und osteoinduktives biologisch abbaubares Ersatzmaterial ist.
Der künstliche Kalziumphosphatknochen nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polyphosphat eine lineare Struktur aufweist.
Der künstliche Kalziumphosphatknochen nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polyphosphat in einer Menge von 0,001 bis 0,05 % des Gewichtes basierend auf dem Gesamtgewicht des künstlichen Knochens enthalten ist.
Der künstliche Kalziumphosphatknochen nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Kettenlänge des Polyphosphates zwischen 3–200 Orthophosphatmolekülen liegt.
Der künstliche Kalziumphosphatknochen nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Kettenlänge des Polyphosphates zwischen 10–100 Orthophosphatmolekülen liegt.
Der künstliche Kalziumphosphatknochen nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Kettenlänge des Polyphosphates zwischen 60–80 Orthophosphatmolekülen liegt.
Der künstliche Kalziumphosphatknochen nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Polyphosphat in Salzform vorliegt.
Der künstliche Kalziumphosphatknochen nach Anspruch 8, wobei die Salzform aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Natriumsalz, Kaliumsalz und Kalziumsalz besteht.
Der künstliche Kalziumphosphatknochen nach Anspruch 1, der für die Behandlung von Defekten und Frakturen in allen Knochen des Körpers, der Heilung von Osteoporose, den Füllmitteln von Implantaten für die Kieferchirurgie, dem Knochenersatz für die plastische Chirurgie, den Ersatz für defekte Knochen bei der Operation von Gelenken, einschließlich dem Hüftgelenk, dem Kniegelenk und dem Schultergelenk, und der Operation von Wirbeln angewendet wird.