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Die
Erfindung betrifft die Therapie von Eierstockkrebs. Insbesondere
betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung von Taurolidin
oder Taurultam zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung
von oder Prophylaxe vor Eierstockkrebs.
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Trotz
Fortschritten bei der Identifizierung chemotherapeutischer Mittel
zum Inhibieren des Wachstums von Krebszellen bleibt Krebs eine schreckliche
Krankheit mit einer hohen Sterblichkeitsrate. Ein signifikantes Problem
der chemotherapeutischen Mittel ist die geringe Spezifität. Viele
Antikrebsmittel unterscheiden nicht hinreichend zwischen normalen
Zellen und Krebszellen. Als eine Folge haben diese oft unterwünschte ernste Nebenwirkungen.
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Die
WO 92/00743 betrifft die Verwendung von Taurolidin und/oder Taurultam
zur Behandlung von Tumoren im Allgemeinen. Die WO 98/52572 betrifft
die Verwendung von Taurolidin zur Behandlung von Leukämien.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird die Verwendung von Taurolidin oder Taurultam zur
Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von oder Prophylaxe
vor Eierstockkrebs, wie sie in Anspruch 1 unten beansprucht wird,
zur Verfügung
gestellt.
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Die
Erfindung sorgt für
die Inhibition des Tumorwachstums in einem Säugetier mit wenigen oder ohne schädliche Nebenwirkungen,
indem dem Säugetier
eine Zusammensetzung verabreicht wird, welche eine aktive Taurolidin-
oder Taurultamverbindung enthält.
Die Verbindung kann verabreicht werden, um direkt mit einer Tumorzelle
in einer Dosis in Kontakt zu treten, die ausreicht, um den Zelltod
durch Apoptose zu induzieren. Vorzugsweise kann die Verbindung in
einer Weise und in einer Dosis verabreicht werden, welche bevorzugt einen
apoptotischen Tod im Vergleich zu einem nekrotischen Tod induziert.
Die zu verabreichende Verbindung ist Taurolidin oder Taurultam:
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Die
Verbindungen können
allein oder in Kombination mit anderen antineoplastischen Mitteln
verabreicht werden. Vorzugsweise töten die parallel verabreichten
Mittel Tumorzellen durch einen Mechanismus, der von der Apoptose
verschieden ist. Beispielsweise wird ein Antimetabolit, ein Purin-
oder Pyrimidinanalogon, ein Alkylierungsmittel, Vernetzungsmitte
(z.B. eine Platinverbindung) und interkalierendes Mittel und/oder
ein Antibiotikum in einem Kombinationstherapieregime verabreicht.
Das parallel verabreichte Arzneimittel kann vor, nach oder gleichzeitig
mit einer Taurolidin- oder Taurultamverbindung verabreicht werden.
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Der
Tumor kann ein arzneimittelresistenter Tumar, z.B. ein Tumor mit
multipler Arzneimittelresistenz (MDR), in einem Säugetier
sein, wobei dem Säugetier
eine Taurolidin- oder
Taurultamverbindung verabreicht wird. Der zu behandelnde Tumor kann
ein Karzinom sein. Der arzneimitteiresistente Tumor kann ein solider Tumor
sein.
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Vorzugsweise
kann die Verbindung, d.h. Taurolidin oder Taurultam, in einer Weise
verabreicht werden, welche einen direkten Kontakt mit der Oberfläche der
Tumorzelle erlaubt. Die Verbindung bindet an eine Komponente, z.B.
einen Zelloberflächen-Polypeptidliganden
oder einen anderen Zelloberflächenanteil,
um eine intrazelluläre
Signaltransduktionskaskade zu starten, welche in dem Zelltod durch
Apoptose gipfelt. Alternativ wird die langsame Freisetzung der Verbindung
an irgendein Gewebe erreicht, indem eine Arzneimittel-beladene Matrix
in direktem Kontakt mit oder benachbart zu dem Ort des Tumors implantiert
wird.
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Die
Verbindungen können
zur Verabreichung, um direkt Krebszellen zu kontaktieren, z.B. in
der Form einer wässrigen
Lösung
formuliert sein.
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Es
folgt eine beispielhafte Beschreibung nur mit Bezug auf die begleitenden
Zeichnungen von Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung.
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In
den Zeichnungen:
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ist 1 ein
Schaubild der Struktur von Taurolidin und von dessen Hauptabbauprodukten
oder Metaboliten (Taurultam, Taurinamid und Taurin). Beim Abbau
erzeugt jedes Molekül
von Taurolidin 3 Methylol-haltige Anteile, die an den antibiotischen
und anti-Endotoxin-Aktivitäten von
Taurolidin beteiligt sind.
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ist 2 ein
Balkendiagramm, welches die Wirkung einer 48 h-Exposition an Taurolidin
auf das Erscheinen von DNA-Trümmern
in PA-1-, SKOV-3- und NIH-3T3-Zellen zeigt. Drei × 105 Zellen wurden in Plastikgewebekulturkolben
angeimpft. Vierundzwanzig Stunden später wurde Taurolidin zugegeben,
um Endkonzentrationen von 25 μM,
50 μM oder
100 μM zu
erzielen. Kontrollkulturen erhielten ein geeignetes Volumen von
Kollidin-17P. Nach einem 48 h-Zeitraum der Taurolidinexposition
wurden Zellen geerntet und mit Propidiumiodid angefärbt. Der
Prozentsatz an DNA-Trümmern
in dem sub-G0/G1-Bereich
wurde unter Verwendung von zytofluorometrischen Techniken festgestellt.
Jeder Balken stellt den Mittelwert (± SE) von drei Bestimmungen
dar. ** p ≤ 0,01,
*** p ≤ 0,001,
**** p ≤ 0,0001
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ist 3 ein
Balkendiagramm, welches die Wirkung einer 24 h-Exposition an Taurolidin
auf die Externalisierung von Membranphosphatidylserin in PA-1-,
SKOV-3- und NIH-3T3-Zellen
zeigt. Drei × 105 Zellen wurden in Plastikgewebekulturkolben
angeimpft. Vierundzwanzig Stunden später wurde Taurolidin zugegeben,
um Endkonzentrationen von 25 μM,
50 μM oder
100 μM zu
erzielen. Kontrollkulturen erhielten ein geeignetes Volumen von
Kollidin-17P. Nach zusätzlichen
24 h wurden Zellen geerntet und die Externalisierung von Phosphatidylserin
bestimmt, indem die Annexin-V-FITC-Bindung unter Verwendung von
zytofluorometrischen Techniken festgestellt wurde. Jeder Balken
stellt den Mittelwert ± SEM
von vier Bestimmungen dar. ** p ≤ 0,01,
*** p ≤ 0,001
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ist 4 eine
Photographie, welche die Ergebnisse einer Western Blot-Analyse der
Wirkung einer 24 h-Exposition an 50 oder 100 μM Taurolidin auf die PARP-Expression
und das Erscheinen eines Haupt-PARP-Spaltungsprodukts in PA-1-,
SKOV-3- und NIH-3T3-Zellen
zeigt. Zwei × 106 Zellen wurden in 150 cm2-Gewebekulturkolben
angeimpft. Vierundzwanzig Stunden später wurde Taurolidin in Konzentrationen
von 50 μM
oder 100 μM
zugegeben. Nach zusätzlichen
vierundzwanzig Stunden wurden Zellen geerntet, die Zel lenzahl bestimmt,
und Aliquots, die von gleichen Zellenzahlen abgeleitet waren, von
jeder Expositionsbedingung erzeugt. Die gesamten Proteine aus diesen
Ganzzelllysaten wurden durch SDS-PAGE getrennt und auf Nitrocellulosefilter überführt. Die
Filter wurden dann einem Immunoblot unterzogen, um intaktes PARP-Protein und
Spaltungsfragmente nachzuweisen, indem der monoklonale anti-PARP-Mausantikörper Klon
C-2-10 (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) verwendet wurde.
Die resultierenden Protein-Antikörper-Komplexe
wurden durch Chemilumineszenztechniken sichtbar gemacht.
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ist 5 ein
Balkendiagramm, welches die Auswirkung der verzögerten Verabreichung eines
einzelnen 3 Tage (3 d)-intraperitonealen (i.p.)-Bolusinjektionsregimes
von Taurolidin (20 mg/Maus/Injektion) auf das Auftreten von i. p.
menschlichen Tumorfremdtransplantaten (tumor xenografts) in weiblichen
Nacktmäusen nach
der i.p.-Verabreichung von 5 × 106 menschlichen SKOV-3-Eierstocktumorzellen
zeigt. Die Taurolidintherapie wurde am Tag der Tumorzellinokulation
oder bis zu 5 d danach begonnen. Vierzehn Tage nach der letzten Taurolidininjektion
wurden Mäuse
in allen Gruppen geopfert und die Bauchhöhle auf das Vorliegen von Tumoren
untersucht. Jedes Experiment wurde dreimal wiederholt, und die Gesamtzahl
an Tieren in jeder Gruppe reichte von 15–21.
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ist 6 ein
Balkendiagramm, welches die Auswirkung der verzögerten Verabreichung eines
einzelnen 3 d-i.p.-Bolusinjektionsregimes von Taurolidin (20 mg/Maus/Injektion)
auf das Gewicht von i. p. menschlichen Tumorfremdtransplantaten
in weiblichen Nacktmäusen
nach der i.p.-Verabreichung von 5 × 106 menschlichen
SKOV-3-Eierstocktumorzellen zeigt. Die Taurolidintherapie wurde
am Tag der Tumorzellinokulation oder bis zu 5 d danach begonnen.
Vierzehn Tage nach der letzten Taurolidininjektion wurden Mäuse in allen
Gruppen geopfert, i.p. Eierstocktumorfremdtransplantate entfernt
und der Tumor gewogen. Jedes Experiment wurde dreimal wiederholt,
und die Gesamtzahl an Tieren in jeder Gruppe reichte von 15–21. Jeder
Balken repräsentiert
das mittlere (± SE)
Tumorgewicht von 15–21
Tieren. *** p ≤ 0,001,
**** p ≤ 0,0001
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Es
wurde gefunden, dass Taurolidin und Taurultam sichere und wirksame
antineoplastische Mittel sind, welche vorzugsweise den apoptotischen
Tod in Krebszellen induzieren. Die Verbindungen induzieren den apoptotischen
Tod von Tumorzellen.
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Therapeutische
Verbindungen
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Es
wurde gefunden, dass Taurolidin für Krebszellen selektiv toxisch
ist, ohne normale Zellen (d.h. nichtkrebsartige) Zellen zu töten. Taurolidin,
Taurultam oder Derivate oder Metaboliten von diesen weisen eine hohe
Affinität
auf für
und binden selektiv an einen Anteil auf der Oberfläche einer
Krebszelle (z.B. einen Phosphatidylserinrezeptor) und induzieren
Apoptose in dieser Zelle, was wiederum zu Zytotoxizität führt. Eine
Aufnahme der Verbindung in die Zelle kann zur Induktion des apoptotischen
Tods einer Krebszelle nicht notwendig sein.
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Die
Zytotoxizität
oder der Zelltod können
entweder durch Nekrose oder Apoptose stattfinden. Die Nekrose, welche
nicht genetisch gesteuert ist, ist gewöhnlich das Ergebnis einer physikalischen
oder chemischen Verletzung. Die Apoptose ist genetisch gesteuert
und ist eine zelluläre
Antwort auf spezifische Reize, z.B. ein an der Zelloberfläche erzeugtes
Signal. Die Nekrose beinhaltet die Zerstörung von zytoplasmatischen
Organellen und einen Verlust der Plasmamembranintegrität, wogegen
Zellen, die eine Apoptose durchmachen, ein Schrumpfen der Zelle,
ein Blebbing der Membran, Kondensation und Fragmentation von Chromatin
zeigen. Nach der DNA-Schädigung
in dem Caspaseenzym-Stoffwechselweg gibt es eine Reihe von Vorfällen, die
auftreten, welche eine Calciumaktivierung und Calpain-Enzyme beinhalten,
was weiterhin zu anderen zellulären Änderungen
und der Regulation von zytoplasmatischen Enzymen führt.
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Ein
Hauptunterschied zwischen der Nekrose und der Apoptose in vivo ist
die Eliminierung der apoptotischen Zelle bevor eine Entzündungsreaktion
ausgelöst
wird. Im Gegensatz zu der Apoptose von Zellen verursacht die Nekrose
von Zellen eine Entzündung.
Somit bietet die Induktion der Zytotoxizität von Krebszellen durch Apoptose
beträchtliche
Vorteile gegenüber
der Induktion des Zelltods durch herkömmliche chemotherapeutische
Mittel, da der apoptotische Tod mit einer minimalen Schädigung für die umgebenden
Zellen oder das Gewebe verbunden ist. Anders als viele herkömmliche
chemotherapeutische Mittel sind Taurolidin- oder Taurultamverbindungen,
die gemäß der Erfindung
verabreicht werden, zytotoxische Mittel, welche die Apoptose von
Krebszellen (aber nicht von normalen nichtkrebsartigen Zellen) induzieren,
um sicher die Tumorbelastung in einem Säugetier, das an Krebs leidet,
zu verringern.
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Funktionale
Charakterisierung von Taurolidin
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Taurolidin
(TaurolinTM) wird chemisch als Bis-(1,1-dioxoperhydro-1,2,4-thiadiazinyl-4)methan identifiziert
(1). Es ist ein relativ kleines dimeres Molekül mit einem
Molekulargewicht von 284 (Knight et al., 1983, J. Pharm. Sci. 72:
705–707)).
Eine frühe
Feststellung von dessen antibiotischer Aktivität zeigte, dass es gegenüber einem
breiten Spektrum von aeroben und anaeroben Bakterienstämmen eine
bakterizide Aktivität
besaß.
Die minimale Konzentration, die benötigt wurde, um das Bakterienzellwachstum
(MIC) zu inhibieren, reichte von 0,01 bis 1 mg/ml, was von dem ausgewerteten
Bakterienstamm abhing. Frühe
Siudien zeigten ebenfalls, dass Taurolidin eine Aktivität gegenüber klinisch
relevanten Pilzen aufwies. Die Konzentration, die benötigt wurde,
um eine antifungale Aktivität
auszuüben,
ist ungefähr äquivalent
zu der, die benötigt
wird, um dessen antibakterielle Aktivität zu erzeugen.
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Die
antibiotische Aktivität
von Taurolidin hängt
von einer chemischen Reaktion ab, die der Erzeugung von aktiven
Methylolgruppen, die bei der Zersetzung des Taurolidinstammmoleküls gebildet
werden (1), nachgeordnet ist. Biochemische
und morphologische Studien zeigten, dass von Taurolidin abgeleitete
Methylolgruppen-haltige Anteile mit Komponenten der Bakterienzellwand
zu reagieren schienen. Das Ergebnis dieser chemischen Reaktion ist,
dass eine Exposition an dieses Mittel signifikant die Fähigkeit
der Mikroorganismen inhibiert, an biologischen Oberflächen wie
z.B. Epithelzellen zu haften. Eine Exposition an Taurolidin zerstörte die
Struktur und verringerte die Anzahl an Fimbrien der Bakterienzelle,
was anscheinend die Agglutination dieser Strukturen widerspiegelt.
Es wird angenommen, dass die Modifikation dieser Oberflächenstrukturen für die Fähigkeit
von Taurolidin verantwortlich ist, die Anhaftung der Bakterienzelle
zu stören.
Zusätzlich
zu dieser direkten Wirkung auf Komponenten der Bakterienzellwand
besitzt Taurolidin ebenfalls eine anti-Endotoxin-Aktivität durch
eine Verringerung der Synthese und Aktivität von Tumornekrosefaktor alpha
(TNF-α).
Taurolidin verringert ebenfalls das Ausmaß und die Schwere von postoperativen
peritonealen Anhaftungen und ist klinisch, durch Lavage, nach einer
Bauchraumoperation verabreicht worden, um postoperative Infektionen
und Anhaftungen zu verringern wie auch um Peritonitis zu behandeln.
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Taurolidin
ist ein synthetisches Breitbandantibiotikum, das ebenfalls antifungale
Aktivität
besitzt. Mechanistisch reagiert es mit Komponenten der Bakterienzellmembran,
um die Anhaftung von Bakterienzellen an Epithelzelloberflächen zu
verhindern. Die Schlüsselrolle der
Zellanhaftung bei dem Wachstum und der Entwicklung menschlicher
solider Tumore bedenkend wurden Studien begonnen, um die zytotoxische
Aktivität dieses
Mittels gegenüber
dem Wachstum einer Gruppen, bestehend aus 12 ausgewählten menschlichen
und Maustumorzelllinien, festzustellen. Die Feststellung der wachstumsinhibitorischen
Aktivität
einer 3 d-Taurolidinexposition zeigte, dass dieses Mittel das Wachstum
aller ausgewerteten Zelllinien mit IC50s,
die von 9,6–34,2 μM reichten,
inhibierte. Studien, um den (die) zugrunde liegenden Mechanismus(en)
zu identifizieren, die für diese
Wirkung verantwortlich waren, wurden in NIH-3T3-Mausfibroblasten
und den menschlichen Eierstocktumorzelllinien PA-1 und SKOV-3 durchgeführt. Anfängliche
Studien stellten die Wirkung einer 48 h-Exposition an Taurolidin
auf die Zellzyklusverteilung fest. Die Ergebnisse dieser Analyse
zeigten, dass während
Taurolidin eine geringe Wirkung auf den Zellzyklus in PA-1-Zellen
aufwies, es in SKOV-3-Zellen den Prozentsatz an Zellen in der G0/G1-Phase verringerte
und den Prozentsatz an Zellen in sowohl S als auch G2/M
erhöhte.
Bei diesen menschlichen Tumorzelllinien erhöhte die Taurolidinexposition
signifikant DNA-Trümmer
in dem sub-G0/G1-Bereich,
was eine Auswirkung ist, die mit einer Induktion von Apoptose konsistent
ist. Im Gegensatz dazu erhöhte
Taurolidin in NIH-3T3-Zellen
den Prozentsatz an Zellen in der S-Phase, verringerte den Prozentsatz
an Zellen in G0/G1 und
erhöhte
die DNA-Trümmer
im sub-G0/G1-Bereich
nicht. Weitere Studien der Beziehung zwischen der Taurolidinexposition
und der Tumorzellapoptose stellten nach einer 24 h-Exposition an
Taurolidin eine Externalisierung von Phosphatidylserin fest, wobei
die Annexin-V-Bindung als ein Zelloberflächenmarker verwendet wurde.
Diese Studien zeigten, dass Taurolidin den Prozentsatz an Annexin-V-positiven
Zellen in PA-1- und SKOV-3-Zellen 4- bzw. 3fach erhöhte. Im
Gegensatz dazu erhöhte
die Taurolidinexposition in NIH-3T3-Zellen leicht (~5%) die Annexin-V-Bindung.
Komplementäre
Studien bestimmten, ob eine 48 h-Exposition an entweder 50 oder
100 μM Taurolidin
die PARP-Spaltung
in diesen Zellmodellen beeinflusste, und zeigte, dass Taurolidin
sowohl in PA-1- als
auch SKOV-3-Zellen die PARP-Spaltung induzierte. Insgesamt zeigen
diese in vitro-Ergebnisse,
dass Taurolidin eine für
Tumorzellen zytotoxische Aktivität
besitzt, welche mit dessen Fähigkeit
korreliert, spezifisch Apoptose zu induzieren. Schließlich wurden
Studien an Mäusen
durchgeführt,
um die antineoplastische Aktivität
dieses Mittels festzustellen. Anfängliche Studien stellten die
Toxizität von
3 aufeinander folgenden täglichen
i.p.-Bolusinjektionen von Taurolidin bei Dosen, die von 5 mg/Injekt./Maus–30 mg/Injekt./Maus
reichten, fest. Die Dosis von 20 mg/Injekt. erzeugte eine Sterblichkeit
von ~10% und wurde in diesem Modell als die MTD identifiziert. Die
Verabreichung dieses Taurolidinregimes an Nacktmäuse, welche i.p. menschliche
Eierstockiumorfremdtrans plantate trugen, führte zu einer signifikanten
Inhibition von sowohl der Tumorbildung als auch des -wachstums.
Diese Funde zeigen, dass Taurolidin eine neue Klasse von antineoplastischen
Mitteln repräsentieren
kann, und sie werden im Lichte ihrer klinischen Bedeutungen diskutiert.
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Die
Erfindung basiert auf dem Fund, dass zusätzlich zu den oben diskutierten
Aktivitäten
Taurolidin selektiv und verlässlich
das Tumorzellwachstum inhibiert und Tumorzzellen selektiv tötet, indem
Apoptose induziert wird. Es wurde nun gefunden, dass Taurolidin
wenigstens 28 verschiedene menschliche Tumorzelllinien, einschließlich Eierstock-,
Brust-, Gehirn-, Darm-, Prostata-, Harnblasen- und Lungentumoren
wie auch Melanomen, Mesotheliomen, Laryngealkarzinomen, Leukämien und
Lymphomen, tötet.
Zusätzlich
wurden mehrfach arzneimittelresistente Gliomzellen und myelodysplastische
Syndromzellen (ein präkanzeröser Zelltyp) durch
Taurolidin getötet.
Die Inhibition des Tumorwachstums und die Induktion des apoptotischen
Tumorzelltods tritt bei Taurolidinkonzentrationen auf, die signifikant
niedriger sind als jene, welche für eine antibiotische Aktivität benötigt werden.
Beispielsweise wird Taurolidin für
antineoplastische Anwendungen in einer Dosis verabreicht, die wenigstens
10% geringer, vorzugsweise wenigstens 20% geringer, insbesondere
wenigstens 50% geringer und bis zu einer logarithmischen Einheit
geringer ist als die Dosis, die für eine antibakterielle oder antiadhäsive Aktivität benötigt wird.
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Taurolidin
ist für
Tumorzellen (nicht aber normale Nichttumorzellen), unabhängig von
dem Ursprung des Tumors, toxisch. Die Apoptose von Tumorzellen wird
nach einer Inkubation mit Taurolidin für so wenig wie eine Stunde
in Kultur induziert.
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Taurolidin
ist ebenfalls in einer Kombinationstherapie nützlich. Die Daten zeigen, dass
Taurolidin nützlich
ist, um die Zytotoxizität
anderer chemotherapeutischer Mittel und/oder einer Strahlentherapie
zu erhöhen, indem
gewisse Typen von Krebszellen veranlasst werden, in die „S"-Phase einzutreten.
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Taurolidin
und Angiogenese
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Patienten
mit metastasierendem Darmkrebs wurden mit Taurolidin behandelt,
und mehrere Faktoren, welche die Angiogenese steuern, wurden gemessen.
Es wurde gefunden, dass vier Faktoren, weiche das Wachstum von Blutgefäßen steuern
(Gewebenekrose faktor (TNF); Interleukine 1, 6 und 10; vaskulärer endothelialer
Wachstumsfaktor (VEGF); und Tumorwachstumsfaktor β (TGF)),
bei mit Taurolidin behandelten Versuchspersonen im Vergleich zu
Versuchspersonen, die ein Placebo erhielten, verringert waren. Diese
Daten zeigen, dass Taurolidin ein Antiangiogenesemittel ist. (Die
Verwendung von Taurolidin oder Taurultam zur Behandlung von Krebsarten
außer
Eierstockkrebs wird hierin nicht beansprucht).
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Therapeutische
Verabreichung
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Eine
wirksame Menge einer therapeutischen Verbindung beträgt vorzugsweise
von ca. 0,1 mg/kg bis ca. 150 mg/kg. Jedoch können aufgrund der geringen
Toxizität
von Taurolidin- und Taurultamverbindungen höhere Dosen ohne schädliche Nebenwirkungen
verabreicht werden. Eine Dosis, die wirksam ist, um die Apoptose
von Krebszellen zu induzieren, liegt eine Größenordnung niedriger als Dosen,
die zu antiseptischen, antibakteriellen, antitoxischen oder Antiadhäsionszwecken
verabreicht werden. Eine apoptotische Dosis von Taurolidin oder
Taurultam, die wirksam ist, um die Apoptose zu induzieren (z.B.
0,5 μg/dl),
ist ebenfalls signifikant geringer als Dosen, die früher als
potentiell nützlich
bei der Behandlung gewisser Krebsarten vorgeschlagen wurden (z.B.
150–450
mg/kg). Wirksame Dosen variieren, wie von den Fachleuten auf dem
Gebiet anerkannt wird, in Abhängigkeit
von dem Verabreichungsweg, der Arzneimittelträgerverwendung und der parallelen
Verabreichung mit anderen therapeutischen Behandlungen einschließlich der
Verwendung von anderen Antitumormitteln (z.B. einem Antimetaboliten,
einem Purin- oder Pyrimidinanalogon, einem Alkylierungsmittel, Vernetzungsmittel,
interkalierenden Mittel oder einem Antibiotikum) und einer Strahlentherapie.
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Ein
therapeutisches Regime wird durchgeführt, indem ein Säugetier,
z.B. ein menschlicher Patient, welcher an einem Krebs oder Metastasen
leidet (oder das Risiko aufweist, diese zu entwickeln), unter Verwendung
von Standardmethoden identifiziert wird. Beispielsweise wird Taurolidin
oder Taurultam einem Individuum, bei welchem ein Krebs diagnostiziert
wurde, oder einem Individuum, bei dem ein präkanzeröser Zustand diagnostiziert
wurde, verabreicht. Die pharmazeutische Verbindung kann einem solchen
Individuum unter Verwendung von Methoden, die im Stand der Technik
bekannt sind, verabreicht werden. Vorzugsweise kann die Verbindung
oral, topisch oder parenteral, z.B. subcutan, intraperitoneal, intramuskulär und intravenös, verabreicht
werden. Eierstockkrebs kann durch Intraperitoneal-Lavage unter Verwendung
einer pharmazeutisch verträglichen Lösung von
Taurolidin oder Taurultam behandelt werden. Die Verbindung kann
prophylaktisch, nach der Entdeckung eines rekurrierenden Tumors
oder zur Zeit der Operation verabreicht werden. Die Verbindung kann
als eine Komponente eines Cocktails von chemotherapeutischen Arzneimitteln
formuliert werden, um einen primären
Eierstockkrebs zu behandeln oder rekurrierende Tumore zu verhindern.
Beispiele für
Formulierungen, die zur parenteralen Verabreichung geeignet sind,
beinhalten wässrige
Lösungen
des aktiven Mittels in einer isotonischen Salzlösung, eine 5% Glucoselösung oder
einen anderen pharmazeutisch verträglichen Standardträger. Standardmäßige Solubilisierungsmittel
wie z.B. PVP oder Cyclodextrine werden ebenfalls als pharmazeutische
Träger
zur Beförderung
der therapeutischen Verbindungen benutzt.
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Die
hierin beschriebenen therapeutischen Verbindungen werden zu Zusammensetzungen
für andere Verabreichungswege
formuliert, indem herkömmliche
Methoden benutzt werden. Beispielsweise können Taurolidin oder Taurultam
in einer Kapsel oder einer Tablette zur oralen Verabreichung formuliert
werden. Kapseln können
irgendwelche standardmäßigen pharmazeutisch
verträglichen
Materialien wie z.B. Gelatine oder Cellulose enthalten. Tabletten
können
gemäß herkömmlichen
Verfahren formuliert werden, indem Mischungen einer therapeutischen
Verbindung mit einem festen Träger
und einem Gleitmittel verpresst werden. Beispiele für feste
Träger
beinhalten Stärke
und Zuckerbentonit. Die Verbindung wird in der Form einer Tablette
mit harter Hülle
oder einer Kapsel, welche ein Bindemittel, z.B. Lactose oder Mannitol,
einen herkömmlichen
Füllstoff
und ein Tablettierungsmittel enthält, verabreicht. Andere Formulierungen
beinhalten eine Salbe, Paste, Spray, Pflaster, Creme, Gel, resorbierbaren
Schwamm oder Schaum. Solche Formulierungen werden hergestellt, indem
Methoden verwendet werden, die im Stand der Technik wohlbekannt
sind.
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Taurolidin-
oder Taurultamverbindungen sind bei direktem Kontakt der Verbindung
mit der Krebszelle wirksam. Dementsprechend kann die Verbindung
topisch verabreicht werden. Die Verbindungen können verabreicht werden, indem
eine feste oder resorbierbare Matrix, welche die Verbindung langsam
in benachbarte und umgebende Gewebe des Patienten freisetzt, implantiert
wird.
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Zytotoxizität der Taurolidin-
und Taurultamverbindungen
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Die
zytotoxische Aktivität
von Taurolidin wurde in vitro gegenüber dem Wachstum einer Vielzahl
von menschlichen Krebszelllinien wie auch „normalen" NIH 3T3-Fibroblasten ausgewertet, und
es wurde gefunden, dass dieses eine apoptotische Zytotoxizität induziert.
Die neoplastischen Zelllinien, die in dem Überblick verwendet wurden,
waren Standard-Tumorzelllinien, z.B. die menschliche Eierstockzelllinie
PA-1, die menschliche Eierstockzelllinie SKOV-3, die menschliche
Darmtumorzelllinie HT29, die menschliche Prostatatumorzelllinie
DU145, die menschliche Glioblastomzelllinie U251, die menschliche
Glioblastomzelllinie U251-MDR, die mit DNA, welche MDR codiert,
transfiziert war, die menschliche Glioblastomzelllinie T98G, die
menschliche Leukämiezelllinie
SP-1 und die menschliche Leukämiezelllinie
Daudi.
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Die
Daten zeigten, dass Taurolidin das Wachstum menschlicher Krebszellen
inhibierte. Überraschenderweise
betrug die Konzentration von Taurolidin, die benötigt wurde, um das Tumorzellwachstum
nach einer 3-tägigen
Exposition an die Verbindung zu inhibieren (IC50),
ungefähr
12,5 μM–50 μM. Diese
Konzentration ist wenigstens 1000fach niedriger als Konzentrationen,
die verwendet werden, um das Bakterienzellwachstum zu inhibieren.
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Taurolidin
und Krebszellen wurden gleichzeitig zu Kolben zugegeben, und das
Zellwachstum wurde 3 Tage später
festgestellt. Parallele Studien wurden durchgeführt, um festzustellen, ob eine
Störung
der Zellanhaftung bei der zytotoxischen Aktivität eine Rolle spielte. Tests
wurden durchgeführt,
um die Fähigkeit
von Taurolidin festzustellen, das Wachstum von menschlichen Eierstocktumorzellen
zu inhibieren, nachdem diese etabliert wurden und in vitro als getrennte
Kolonien wuchsen. Die Daten zeigten, dass eine 24 Stunden-Exposition an
50 μM Taurolidin
eine signifikante zytotoxische Wirkung gegenüber dem Wachstum von etablierten
Tumorzellen erzeugte. Die Daten zeigten, dass die zytotoxische/zytostatische
Aktivität
von Taurolidin nicht auf der Inhibition der Tumorzellanhaftung beruht.
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Der
Mechanismus, durch welchen Taurolidin eine Zytotoxizität erzeugt,
wurde ausgewertet. Kinetiken des Zellzyklus und die Zellzyklusverteilung
von Tumorzellen wurden nach einer 24 Stunden-Exposition an Taurolidin
untersucht. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl in PA1- als auch
3T3-Zellen die Taurolidinexposition die Kinetiken des Zellzyklus
störte
und den Prozentsatz an Zellen in sowohl der S- als auch der G2/M-Phase signifi kant
verringerte. Die Exposition von menschlichen PA1-Eierstockzellen
an dieses Regime von Taurolidin induzierte ebenfalls einen hohen
Grad an DNA-Fragmentierung, was die Induktion von Apoptose anzeigt.
Diese DNA-Fragmentierung wurde bei normalen 3T3-Zellen nicht beobachtet.
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Um
weiterhin die Möglichkeit
auszuwerten, dass eine Exposition an 50 μM Taurolidin in der Lage war, die
Apoptose spezifisch in menschlichen Eierstocktumorzellen, nicht
aber in normalen Fibroblasten zu induzieren, wurden Studien unternommen,
um die DNA-Fragmentierung als eine Funktion der Taurolidinexposition durch
Verwendung einer Agarosegelelektrophorese auszuwerten. Die Ergebnisse
bestätigten,
dass bei Eierstocktumorzellen die Exposition an Taurolidin zu einer
offenen DNA-Fragmentierung führte,
welche bei 3T3-Zellen, die einer identischen Taurolidinbehandlung
ausgesetzt wurden, nicht ersichtlich war.
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Die
zytotoxische Aktivität
von Taurultam wurde in vitro ausgewertet, indem dieselben menschlichen Krebszelllinien,
wie sie oben beschrieben sind, verwendet wurden. Die Daten zeigten,
dass Taurultam in derselben Weise wie Taurolidin einen apoptotischen
Tod von Krebszellen, nicht aber von normalen Kontrollzellen induzierte.
Die zytotoxische Aktivität
von Taurultam betrug ungefähr
75% der Aktivität,
die mit Taurolidin beobachtet wurde.
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Der
apoptotische Tod wird von dem Tod durch andere Mechanismen unterschieden,
indem Methoden verwendet werden, die im Stand der Technik bekannt
sind. Eine andere frühe
Folge der Induktion der Apoptose ist die Spaltung der Proteinpoly(ADP-Ribose)polymerase
(PARP) durch zelluläre
Caspasen. Auf Western Blot basierende Studien wurden durchgeführt, um
zu bestimmen, ob eine Exposition an Taurolidin zu einer PARP-Spaltung führte. Die
Ergebnisse zeigten, dass eine PARP-Spaltung in 3T3-Zellen nicht
ersichtlich war, wenn eine Exposition an dasselbe Taurolidinregime
stattfand. Die Apoptose wird ebenfalls nachgewiesen, indem bekannte
Methoden wie z.B. die Bestimmung von Caspaseaktivierung, bax/bcl12-Verhältnissen
und fas und fas-1 Wechselwirkungen verwendet wurden. Andere Methoden
der Unterscheidung zwischen Apoptose und Nekrose (z.B. eine auf
Fluoreszenz basierende Methode, die in dem U.S.-Patent Nr. 5,976,822
beschrieben wird) werden verwendet, um den Mechanismus des Todes
oder die Dosis, bei welcher eine Verbindung Apoptose im Vergleich
zu Nekrose induziert, zu bestimmen.
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Die
Antitumoraktivität
einer Verbindung wird ebenfalls ausgewertet, indem ein standardmäßiger kolorimetrischer
MTS-Test verwendet wird. Ergebnisse, die mit verschiedenen Typen
von Tumorzellen (primären Zellen
oder Zellinien) erhalten werden, werden mit jenen verglichen, die
unter Verwendung normaler Zellen erhalten werden. Die Lebensfähigkeit
der Zellen in jeder Zelllinie wird abgeschätzt, indem die zelluläre Umwandlung
eines Tetrazoliumsalzes nach Inkubieren der Zellen in einer Lösung, die
eine Testverbindung enthält,
in einer Platte mit 96 Vertiefungen gemessen wird. IC50-Werte,
die unter Verwendung der identischen Testverbindung mit normalen
Zellen und Zellen einer bestimmten Tumorzelllinie erhalten wurden,
werden verglichen und deren Verhältnis
(IC50 normale Zelle/IC50 Krebszelle)
zeigt die Krebsselektivität
der Testverbindung an. Eine Zunahme bei dem Verhältnis IC50 normale
Zelle/IC50 Krebszelle spiegelt eine höhere Selektivität der Testverbindung,
um die Krebszelle zu töten,
wider.
-
Die
Antitumoraktivität
einer Verbindung wird ebenfalls in vivo ausgewertet, indem z.B.
ein Tumorfremdtransplantatregressionstest verwendet wird. Beispielsweise
werden Tiere, welche etablierte Tumore tragen, für einen Zeitraum von drei Wochen
mit einer Testverbindung behandelt. Das Wachstum der Tumore und
die allgemeine Gesundheit des Tieres werden während der Dreiwochenbehandlung
und für
zwei weitere Wochen nach der Behandlung überwacht, um festzustellen,
ob ein erneutes Tumorwachstum auftritt. Die antineoplastische Aktivität von Taurolidin
wird bei athymischen (nackten) Mäusen
bestimmt, welche fortgeschrittene und/oder metastasierende Fremdtransplantate
tragen. Taurolidinregimes mit einer einzelnen und mehreren Dosen
werden in athymischem (nackten) Mäusen ausgewertet. Bei der Identifizierung
von Dosisregimes wird die antineoplastische Aktivität in athymischen
(nackten) Mäusen,
die Fremdtransplantate von menschlichen Krebszellen, z.B. Eierstockkrebs,
tragen, festgestellt.
-
Behandlung von Eierstockkrebs
-
Über 80%
der Patienten, bei denen Eierstockkrebs diagnostiziert wurde, erleiden
nach einer therapeutischen Intervention im Hinblick auf den primären Tumor
rekurrierende Tumore. Selbst eine Ansprechrate von 5%, z.B. eine
5% Verringerung beim Tumorwachstum, würde zu einem klinischen Nutzen
führen.
Die Ansprechrate ist definiert als eine Verringerung bei der Tumorgröße oder
bei der Anzahl der Metastaseherde. Beispielsweise wird eine Verringerung
bei der Tumorgröße bestimmt,
indem eine Abnahme bei der Größe der größten neoplastischen
Läsion,
z.B. durch ein Sonogramm oder durch eine Messung unter Verwendung
eines Tasters (caliper), bestimmt wird.
-
Ein
Standardmausmodell von Eierstockkrebs wurde verwendet, um die Wirkung
von Taurolidin auf rekurrierenden Eierstockkrebs zu untersuchen.
Holland Sprague-Dawley-Mäusen
wurden 5 × 106 Tumorzellen (z.B. die menschliche SKOV-3-Eierstocktumorzelllinie)
injiziert, um einen Zustand eines fortgeschrittenen Eierstockkrebses
zu imitieren. Taurolidin wurde 5 Tage später durch Intraperitoneal-Lavage
verabreicht. Taurolidin wurde 3mal täglich für 4 Tage mit einer Dosis von
30 mg/Tag verabreicht. Wenigstens eine 75–80%ige Verringerung der Tumorherde
wurde beobachtet. Diese Daten zeigen, dass die Verabreichung von
Taurolidin die Eierstocktumorbelastung und das Rekurrieren von Tumoren
verringert.
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Behandlung
von arzneimittelresistenten Tumoren
-
Es
wurde gefunden, dass Taurolidin besonders wirksam ist, um Tumorzellen
zu töten,
welche widerstandsfähig
gegenüber
einer Zytotoxizität
durch andere bekannte chemotherapeutische Mittel sind. Glioblastomzellen
wurden mit einem Gen transfiziert, das eine multiple Arzneimittelresistenz
(MDR) codierte. Die transfizierten Zellen waren 100–1000fach
resistent gegenüber
standardmäßigen chemotherapeutischen
Mitteln, z.B. Adriamycin. Nicht transfizierte Glioblastomzellen,
die mit einer Standarddosis (z.B. 1 μM) Adriamycin kultiviert wurden,
wurden getötet,
aber MDR-transfizierte Glioblastomzellen, die mit 1 μM des Arzneimittels
in Kontakt gebracht wurden, waren resistent. Eine signifikante Zytotoxizität der MDR-transfizierten
Glioblastomzellen wurde nach Kontakt mit der Verbindung (z.B. Taurolidin
in einer Dosis von 50 μM)
beobachtet. Diese Daten zeigen, dass die hierin beschriebene Verbindung
ihre zytotoxische Aktivität über einen
Mechanismus ausübt,
der von dem der standardmäßigen chemotherapeutischen
Mittel verschieden ist. Demgemäß führt eine
Kombinationstherapie, bei welcher eine Taurolidin- oder Taurultamverbindung
vor, nach oder zusammen mit einem anderen chemotherapeutischen Mittel
(z.B. einem Antimetaboliten, einem tumorspezifischen monoklonalen
Antikörper
oder einem antiangiogenen Mittel) verabreicht wird, zu einem verbesserten
klinischen Ergebnis für
Patienten, die an einem malignen Zustand leiden, welcher durch eine
gemischte Population von Tumorzellen (z.B. jene, welche durch standardmäßige chemotherapeutische
Mittel getötet
werden, und jene, welche MDR sind) gekennzeichnet ist. (Wie bereits
erwähnt
wird die Verwendung von Taurolidin oder Taurultam zur Behandlung
von Krebsarten außer
Eierstockkrebs hierin nicht beansprucht).
-
Beispiel 1: Zytotoxische
und mechanistische Auswertung von antineoplastischen Mitteln
-
Es
wurde gefunden, dass Taurolidin beim Inhibieren des Wachstums einer
Vielzahl von menschlichen Tumorzelllinien in vitro aktiv ist. Menschliche
PA-1- und SKOV-3-Eierstocktumorzelllinien und NIH-3T3-Mausfibroblasten
wurden verwendet, um den Mechanismus der Antitumoraktivität zu bestimmen.
Die Studien zeigten, dass diese Wirkung mit Veränderungen bei DNA-Struktur,
Zellmembrankomponenten und Proteinspaltung verbunden war, die mit
der Induktion von Apoptose insbesondere in Tumorzellen konsistent
waren. Die antineoplastische Auswertung von Taurolidin in Nacktmäusen, welche
intraperitoneale Fremdtransplantate menschlicher Eierstocktumore
trugen, zeigten, dass dieses Mittel die Tumorentwicklung und das
-wachstum in vivo signifikant inhibierte.
-
Um
die neoplastische Aktivität
zu studieren, wurde Taurolidin als 2%ige Lösung in 5% Kollidon 17PF formuliert.
Standardzellkulturwachstumsmedium (z.B. Hochglucose DMEM, RPMI 1640,
McCoy's 5A und F12K),
Trypsin und fötales
Rinderserum (FBS) wurden alle bei GIBCO/Life Technologies (Grand
Island, NY) gekauft. Die Externalisierung von Phosphatidylserin
durch Zellen wurde ausgewertet, indem das ApoAlert® Annexin-V/FITC-Testkit verwendet
wurde, welches bei Clontech (Palo Alto, CA) gekauft wurde. Reagenzien
für die
SDS-PAGE wurden bei BioRad Laboratories (Richmond, CA) gekauft.
Ein monoklonaler Mausantikörper (Klon
C-2-10) gegen menschliches PARP wurde. bei Zymed Laboratories (San
Francisco, CA) gekauft. Alle anderen Chemikalien wurden bei Sigma
(St. Louis, MO) gekauft.
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Studien,
um die zytotoxische Aktivität
von Taurolidin festzustellen, wurden, indem eine Gruppe von menschlichen
Zelllinien solider Tumore verwendet wurden, wie auch in NIH 3T3-Mausfibroblasten
durchgeführt.
Umfasst von der Gruppe der Tumorzelllinien waren Eierstocktumorzellen
(PA-1 und SKOV-3) und zum Vergleich Darmtumorzellen (HCT-8, HCT-15
und HT-29), Lungentumorzellen (H-157, A-549 und H-596), Prostatatumorzellen
(DU-145), Gliomzellen (U-251) und Melanom[zellen] (MNT-1). Die Mausmelanom-B16F10-Zelllinie
wurde ebenfalls getestet. Diese Zelllinien sind leicht, z.B. von
der American Type Culture Collection (ATCC), verfügbar. Zellen
wurden in einem geeigneten Wachstumsmedium bei 37°C in einem
befeuchteten Inkubator in einer Atmosphäre von 5% CO kultiviert. Unter
diesen Wachstumsbedingungen betrug die Verdopplungszeit aller Zelllinien
20–28
h.
-
Studien,
um in vivo die Toxizität
und therapeutische Wirksamkeit festzustellen, wurden bei 6–12 Wochen
alten weiblichen homozygoten athymischen (Hsd:athymic nude nu/nu)
Mäusen
durchgeführt,
welche von Harlan (Indianapolis, IN) erhalten wurden.
-
Um
die Inhibition des Zellwachstums auszuwerten, wurden subkonfluente
Kulturen von geeigneten Zelllinien durch Trypsinierung geerntet
und in Medium bei einer Zelldichte von 1–5 × 104 Zellen/ml
resuspendiert. Ein ml dieser Zellsuspension wurde zu jeder Vertiefung
einer Zellkulturplatte mit 12 Vertiefungen zugegeben, welche 3 ml
eines geeigneten Mediums plus Serum enthielten. Vierundzwanzig Stunden
später
wurde Taurolidin zu jeder Vertiefung in einem Volumen von 40 μl zugegeben,
um eine Endkonzentration von 0,1–200 μM zu erzielen. Kontrollvertiefungen
erhielten nur 40 μl
5% Kollidon 17PF. Zweiundsiebzig Stunden später wurden alle Zellen durch
Trypsinierung geerntet und die Zellenzahl elektronisch bestimmt,
indem ein Coulter Modell Z1-Teilchenzähler (Coulter Corp., Miami,
FL) verwendet wurde, um die Inhibition des Zellwachstums festzustellen.
Jedes Experiment wurde im Doppel durchgeführt und mindestens dreimal
wiederholt.
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Für Flusszytometriestudien
wurden 1 × 106 PA-1-, SKOV-3- oder NIH-3T3-Zellen für 24 h in
einem geeigneten Medium, das Serum enthielt, inkubiert. Vierundzwanzig
Stunden später
wurde Taurolidin in einem Volumen von 40 μl zugegeben, um eine Endkonzentration
von 25, 50 oder 100 μM
zu erzielen. Kontrollkulturen für
jede Zelllinie wurden in Medium inkubiert, welches nur 40 μl 5% Kollidon
17PF enthielt. Achtundvierzig Stunden später wurden alle Zellen durch
Trypsinierung geerntet und zur zytofluorometrischen Analyse durch Standardmethoden
vorbereitet. Beispielsweise wurden geerntete Zellen in eiskalter
phosphatgepufferter Salzlösung
bei einer Endzelldichte von 2 × 106 Zellen/ml resuspendiert. Die Zellen wurden
dann für
30 min bei Raumtemperatur im Dunklen mit einer Lösung von 0,05 mg/ml Propidiumiodid,
0,6% Igepal und 1% Natriumcitrat angefärbt. Eine Flusszytometrie wurde
mit einem FACScan (Becton Dickinson, Plymouth, England) durchgeführt, wobei
das Programm ModFit LT (Becton Dickinson) verwendet wurde. Eine
statistische Analyse wurde mit dem nicht parametrischen Kruskal
Wallis ANOVA-Test durchgeführt,
worauf ein Dunn's
Mehrfachvergleichstest unter Verwendung von Instat folgte.
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Die
Externalisierung von Zellmembranphosphatidylserin als eine Folge
der potentiellen Induktion von Apoptose wurde durch Flusszytometriemethoden
festgestellt, indem das ApoAlert® Annexin-V/FlTC-Testkit verwendet
wurde. Kurz gesagt wurden 1 × 106 Zellen für 24 h in Gewebekulturmedium,
welches Serum enthielt, inkubiert. Danach wurde Taurolidin zugegeben,
um eine Endkonzentration von 25, 50 oder 100 μM zu erzielen. Kontrollkulturen
erhielten nur 5% Kollidon 17PF. Vierundzwanzig Stunden später wurden
alle Zellen durch Trypsinierung geerntet. Die geernteten Zellen
wurden in 200 μl
Bindungspuffer resuspendiert und dann für 5–15 min in einer Lösung, die
1 μg/ml
Annexin-V FITC enthielt, bei Raumtemperatur im Dunklen inkubiert. Die
Zellen wurden dann analysiert, um die Annexin-V-Bindung durch zytofluorometrische
Techniken, welche ein FACScan benutzten, wobei das ModFit LT-Programm
mit statistischer Analyse wie oben beschrieben verwendet wurde,
zu quantifizieren.
-
Eine
Western Blot-Analyse wurde verwendet, um die PARP-Spaltung festzustellen.
Zwei × 106 Zellen wurden in getrennten 75 cm2-Gewebekulturkolben, welche 20 ml Gewebekulturmedium
plus Serum enthielten, angeimpft. Vierundzwanzig Stunden später wurde
Taurolidin in Konzentrationen von 50 μM oder 100 μM zugegeben. Vierundzwanzig
Stunden nach der Zugabe von Taurolidin wurden die Zellen geerntet,
die Zellenzahl bestimmt und Aliquots, welche eine gleiche Zellenzahl
enthielten, wurden von jeder Expositionsbedingung erzeugt. Die Gesamtproteine
aus Ganzzelllysaten, die von diesen Aliquots erzeugt wurden, wurden
durch SDS-PAGE getrennt und elektrisch auf Nitrocellulosefilter überführt. Die
Filter wurden dann verarbeitet, um intaktes PARP-Protein und Spaltungsfragmente
nachzuweisen; indem der monoklonale anti-PARP-Mausantikörper Klon.
C-2-10 (Zymed Laboratories, San Francisco, CA) verwendet wurde.
Die resultierenden Protein-Antikörper-Komplexe
wurden durch standardmäßige Chemilumineszenztechniken
sichtbar gemacht.
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Um
die Taurolidin-induzierte Toxizität auszuwerten, wurden die Mäuse in Gruppen
von 5–8
Tieren aufgeteilt. Danach wurden alle Mäuse gewogen und die Therapie,
bestehend aus einer einzelnen i.p.-Bolusinjektion von Taurolidin
an 3 aufeinander folgenden Tagen, wurde begonnen. Die ausgewerteten
Taurolidindosen waren 5, 10, 15, 20, 25 und 30 mg/Maus/Injektion
und wurden, außer
für die
Injektionen von 25 (1,25 ml) und 30 mg/Maus (1,5 ml), in einem Volumen
von 1 ml verabreicht. Taurolidin zur Injektion wurde ausgehend von der
2%igen Taurolidinlösung
durch die Zugabe von 5% Kollidon 17PF verdünnt. Kontrolltiere erhielten
1 ml-Injektionen von nur 5% Kollidon 17PF. Die Tiere wurden täglich untersucht
und das Köpergewicht
zweimal wöchentlich
aufgezeichnet. Eine Verringerung des Körpergewichts um mehr als 10%
wurde als signifikant betrachtet. Die maximal tolerierte Dosis (MTD)
wurde als die Dosis betrachtet, welche eine Sterblichkeit von ~10%
erzeugte.
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Um
die therapeutische Wirksamkeit auszuwerten, erhielten Mäuse eine
einzelne intraperitoneale Injektion von 5 × 106 SKOV-3-Zellen
in einem Volumen von 0,5 ml. Unmittelbar danach wurden die Mäuse zufällig in
Behandlungsgruppen von 7 Tieren aufgeteilt. Die Taurolidintherapie,
bestehend aus einer einzelnen i.p.-Bolusinjektion von 20 mg Taurolidin
an 3 aufeinander folgenden Tagen, wurde entweder unmittelbar nach
der Tumorzellinokulierung oder zu ausgewählten Zeitabschnitten nach
der Tumorzellinokulierung (≤ 5
d) begonnen. Kontrolltiere erhielten 1 ml-Injektionen von nur 5%
Kollidon 17PF. Die Tiere wurden täglich untersucht und das Köpergewicht
zweimal wöchentlich
aufgezeichnet. Vierzehn Tage nach der letzten Taurolidininjektion
wurden Mäuse
in allen Gruppen durch CO2-Erstickung geopfert,
alle i.p. Tumorherde entfernt und das Tumorgewicht bestimmt. Das
mittlere Tumorgewicht für
jede Behandlungsgruppe wurde berechnet, und eine statistische Analyse
der Unterschiede bei dem mittleren Tumorgewicht zwischen den Behandlungsgruppen
setzte den Studenten-t-Test ein. p-Werte von ≤ 0,05 wurden als signifikant
betrachtet.
-
Taurolidin
inhibiert das Tumorzellwachstum
-
Die
Fähigkeit
von Taurolidin, das Zeltwachstum zu inhibieren, wurde in einer Gruppe
von neoplastischen menschlichen und Mauszelllinien, welche aus 13
verschiedenen Linien, die 6 verschiedene Tumortypen repräsentierten,
zusammengesetzt war, festgestellt. Die Ergebnisse dieses Überblicks
zeigten, dass eine 3 d-Exposition an Taurolidin das Zellwachstum
bei jeder untersuchten Zellinie inhibierte (Tabelle 5).
-
Die
IC50 von Taurolidin gegenüber dem
Wachstum einer ausgewählten
neoplastischen menschlichen oder Mauszelllinie wurde wie folgt ausgewertet.
Zellen wurden bei einer Dichte von 1–5 × 104 Zellen
in jeder Vertiefung eines Gewebekulturkolbens mit 6 Vertiefungen
angeimpft. Vierundzwanzig Stunden später wurde Taurolidin in Konzentrationen
zugegeben, die von 1–100 μM reichten.
Nach drei Tagen wurden Zellen durch Trypsinierung geerntet und die
Zellenzahl elektronisch bestimmt. Die Zellwachstumsinhibition wurde
durch Vergleich mit nicht an Taurolidin exponierten Kontrollkulturen
bestimmt. Der IC50 wurde als die Konzentration berechnet,
welche benötigt
wurde, um die Zellenzahl um 50% zu inhibieren. Jeder IC50-Wert
stellt den Mittelwert ± SE
von 4–8
Bestimmungen dar.
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Überraschenderweise
waren die beobachteten IC50s für jede Zelllinie
bemerkenswert ähnlich
und variierten über
den relativ engen Bereich von ~10 μM (PA-1, DU-145, HCT-8, HCT-15,
B16F10 und NIH-3T3) bis ~35 μM
(H-596).
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Die
Studien haben die Wirkung von Taurolidin auf die Tumorzellproliferation
festgestellt. Die Inhibition der Proliferation konnte entweder die
Folge eines Aufhaltens des Wachstums oder des Zelltods sein. Daher wurden
die Studien als nächstes
darauf konzentriert, den Mechanismus(en) zu identifizieren, durch
welchen Taurolidin die Inhibition des Zellwachstums induzierte.
Diese Studien wurden in den menschlichen Eierstocktumorzelllinien
PA-1 und SKOV-3 und in NIH-3T3-Mausfibroblasten durchgeführt. Studien,
die herkömmliche Flusszytometrietechniken
einsetzten, stellten die Wirkung einer 48 h-Exposition an Taurolidin
auf die Zellzyklusverteilung in sowohl den menschlichen PA-1- als
auch den SKOV-3-Eierstocktumorzellinien fest. Die Ergebnisse dieser
Studien zeigten, dass eine Exposition an dieses Mittel kein konsistentes
Muster von Zellzyklusveränderungen
induzierte.
-
Die
Auswirkung einer 48 h-Exposition an ausgewählte Konzentrationen von Taurolidin
auf die Zellzyklusverteilung in menschlichen Eierstocktumorzellen
(PA-1 und SKOV-3) und Mausfibroblasten (NIH-3T3) wurde wie folgt
durchgeführt.
Drei × 105 Zellen wurden in Plastikgewebekulturkolben
angeimpft. Vierundzwanzig Stunden später wurde Taurolidin zugegeben,
um Endkonzentrationen von 25 μM,
50 μM oder
100 μM zu
erzielen. Kontrollkulturen erhielten ein geeignetes Volumen an Kollidin-17P.
Nach zusätzlichen
48 h wurden Zellen geerntet, mit Propidiumiodid angefärbt und
die Zellzyklusverteilung festgestellt, indem zytofluorometrische Techniken
verwendet wurden. Jeder Wert stellt den Prozentsatz an Zellen in
den angegebenen Zellzyklusphasen dar und ist der Mittelwert ± SEM von
drei Bestimmungen.
-
-
Insbesondere
bei PA-1-Zellen hatte eine 48 h-Exposition an bis zu 100 μM Taurolidin
eine geringe Auswirkung auf die Zellzyklusverteilung. Tatsächlich war
der Prozentsatz an Zel len in den G0/G1-, S- und G2/M-Phasen
trotz Exposition an Taurolidin im Wesentlichen unverändert. Alternativ
führte
die Exposition an Taurolidin bei SKOV-3-Zellen zu einer konzentrationsabhängigen Abnahme
bei dem Prozentsatz an Zellen in G0/G1, erhöhte
aber den Prozentsatz an Zellen in sowohl der S-Phase als auch G2/M. Wichtig ist, dass sowohl bei PA-1- als
auch SKOV-3-Zelllinien die Exposition an Taurolidin ebenfalls zu
dem Erscheinen von DNA-Trümmern
in dem sub-G0G1-Bereich
führte,
was ein Effekt war, der von der Taurolidinkonzentration abhängig war (2).
Wie bei der SKOV-3-Zelllinie senkte ein Exponieren von NIH-3T3-Zellen
an Taurolidin den Prozentsatz an Zellen in G0/G1 und erhöhte
den Prozentsatz an Zellen in S in einer konzentrationsabhängigen Weise. Anders
jedoch als bei den menschlichen Eierstocktumorzellen festgestellt,
beeinflusste die Exposition an Taurolidin bei NIH-3T3-Zellen das
Erscheinen von DNA-Trümmern
in dem sub-G0G1-Bereich
nicht signifikant (2).
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Die
DNA-Spaltung in einzelne Fragmente ist ein spätes Ereignis in dem Prozess
der Apoptose. Das Erscheinen von DNA-Trümmern in dem sub-G0/G1-Bereich 48 h nach der Exposition an Taurolidin
könnte
eine Folge der mit der Apoptose verbundenen DNA-Fragmentierung sein. Um diese Möglichkeit
auszuwerten, haben Studien als nächstes
die Fähigkeit
von Taurolidin, die Externalisierung von Phosphatidylserin auf Zellmembranen
zu erhöhen,
festgestellt, welche ein Ereignis ist, das früher in dem apoptotischen Prozess
auftritt. Diese Studien basierten auf Fluorozytometrie und setzten
einen fluoreszierenden Antikörper-Bindungstest
(Annexin-V) ein, um die Externalisierung von Phosphatidylserin festzustellen.
Die Ergebnisse der Studien (die in 3 gezeigt
sind) zeigten, dass sowohl bei den menschlichen PA-1- als auch den
SKOV-3-Eierstocktumorzelllinien eine 24 h-Exposition an Taurolidin eine signifikante,
von der Taurolidinkonzentration abhängige Zunahme bei der Annexin-V-Bindung
um ein 4- bzw. 3-faches induzierte. Im Gegensatz dazu führte die
Exposition an Taurolidin bei NIH-3T3-Zellen zu einer nicht signifikanten
Zunahme (~5%) bei der Antikörperbindung.
Diese Daten unterstützten
die Ergebnisse aus den Zellzyklusstudien wie auch die Beobachtung,
dass die Exposition an Taurolidin in PA-1- und SKOV-3-Zellen, nicht aber in
NIH-3T3-Zellen, Apoptose induzierte. Die Ergebnisse zeigen, dass
Taurolidin vorzugsweise in Tumorzellen im Vergleich zu Nichttumorzellen
Apoptose (und apoptotischen Tod) induziert.
-
Um
die Induktion von Apoptose durch Taurolidin weiter zu bestätigen, wurde
die Beziehung zwischen der Exposition an Taurolidin und der PARP-Spaltung
festgestellt. PARP ist ein Kernprotein, das eine Schlüsselrolle
bei der Erkennung und Reparatur von sowohl Einzel- als auch Doppelstrang-DNA-Brüchen spielt.
Zusätzlich
ist ein Schlüsselereignis
in dem apoptotischen Prozess die Spaltung, welche durch Caspase
3 und Caspase 9 vermittelt wird, und die folgende katalytische Deaktivierung
dieses Proteins. Um zu bestimmen, ob die Exposition an Taurolidin
zu einer PARP-Spaltung in Eierstocktumorzellen führte, wurde eine Western Blot-Analyse
mit Ganzzellextrakten von PA-1-, SKOV-3- und NIH-3T3-Zellen nach
einer 24 h-Exposition an entweder 50 oder 100 μM Taurolidin durchgeführt. Die
Ergebnisse dieser Analyse, welche in dem repräsentativen Westen Blot, der
in 4 enthalten ist, dargestellt werden, zeigten,
dass in PA-1- und SKOV-3-Zellen eine Exposition an entweder 50 μM oder 100 μM Taurolidin
zu einer PARP-Spaltung führte.
Im Gegensatz dazu gab es in NIH-3T3-Zellen nach der Exposition an
Taurolidin wenig Beweise für
dieses proteolytische Ereignis. Diese Daten bestätigen, dass Taurolidin in Tumorzellen,
nicht aber in Nichttumorzellen, Apoptose induziert.
-
In
Anbetracht der bevorzugten Induktion des apoptotischen Todes in
Tumorzellen im Vergleich zu normalen nichtneoplastischen Zellen
wurde Taurolidin Tumor-tragenden Tieren verabreicht, um die antineoplastische
Aktivität
weiter auszuwerten. Studien wurden begonnen, um die antineoplastische
Aktivität
von Taurolidin in Nacktmäusen,
weiche i.p. menschliche Eierstocktumorfremdtransplantate trugen,
auszuwerten. In vivo-Studien wurden geplant, um das Regime bei der
maximal tolerierten Dosis (MTD) von Taurolidin in weiblichen Nacktmäusen zu
identifizieren und die Toxizität
festzustellen. Die Toxizität
wurde ausgewertet, indem Änderungen
beim Körpergewicht
und die Sterblichkeit nach einem 3 d-i.p.-Bolusinjektionsregime
gemessen wurden. Tägliche
1 ml-Injektionen gaben Dosen ab, die von 5 mg/Maus/Tag–30 mg/Maus/Tag
reichten. Die Ergebnisse dieser Studien zeigten, dass bei täglichen
Dosen unter 15 mg/Maus (~650 mg/kg) Taurolidin gut vertragen wurde
(Tabelle 7).
-
Die
Taurolidin-induzierte Toxizität
in athymischen (nackten) weiblichen Mäusen wurde wie folgt ausgewertet.
Gruppen von 5–10
Mäusen
wurde an drei aufeinander folgenden Tagen Taurolidin injiziert.
Die ausgewerteten Taurolidindosen reichten von 5–30 mg/Maus/Injektion und wurden
intraperitoneal in einem Volumen von 1 ml abgegeben (mit der Ausnahme
der 25 und 30 mg-Dosen, welche aufgrund einer begrenzten Löslichkeit
in einem Volumen von 1,25 bzw. 1,5 ml abgegeben wurden). Während des
Injektionsregimes, und danach täglich
für 30
d, wurden die Mäuse
gewogen und untersucht. Die Experimente wurden mindestens dreimal
wiederholt und die Sterblichkeits- und Gewichtsverlustdaten zusammengenommen.
-
-
Der
maximale Körpergewichtsverlust
als eine Folge dieses Dosisregimes betrug 7%, und das Körpergewicht
kehrte innerhalb von sieben Tagen nach Abschluss der Injektionsbehandlung
auf Werte vor der Injektion zurück.
Mit Regimes, die Dosen von 20 mg/Maus oder mehr einsetzten, wurde
eine signifikantere Toxizität beobachtet
(Tabelle 3). Insbesondere betrug der auf den Tiefstpunkt bezogene
(nadir) Gewichtsverlust für
Behandlungen, die 20, 25 oder 30 mg/Maus einsetzten, –12%, –16% bzw. –25%. Zusätzlich führten die
Behandlungen mit diesen Taurolidindosen zu 15%, 43% bzw. 100% Sterblichkeit.
-
Auf
der Basis der Toxizitätsstudien
wurde eine 3tätige
1 ml-i.p.-Injektion von Taurolidin mit einer Dosis von 20 mg/Maus
als die MTD ausgewählt.
Studien haben als nächstes
die antineoplastische Aktivität
dieses Regimes in Mäusen,
welche i.p. menschliche Eierstocktumorfremdtransplantate trugen,
die von der SKOV-3-Zelllinie abgeleitet waren, ausgewertet. Den
Mäusen
wurden i.p. 5 × 106 SKOV-3-Zellen injiziert. Eine Taurolidintherapie,
welche das 3 d 20 mg/Maus Dosisregime einsetzte, wurde bis zu 5
d nach der Tumorzellinjektion begonnen. Vierzehn Tage nach der Beendigung
der Taurolidintherapie wurden Mäuse
geopfert und alle i.p.-Tumore entfernt und gewogen. Die Ergebnisse
dieser Studie, die in den 5 und 6 zusammengefasst
sind, zeigten, dass die Taurolidintherapie, wenn sie am Tag der
Tumorzellinjektion begonnen wurde, in hohem Maße wirksam war und die Tumorbildung
(5), die Entwicklung von Aszites und das Wachstum (6)
inhibierte.
-
Die
Wirkung eines einzigen 3 d-i.p.-Bolusinjektionsregimes von Taurolidin
(20 mg/Maus/Injektion, beginnend mit dem Tag der Tumorzellinjektion)
auf das Gesamterscheinungsbild von Mäusen, welche i.p. Fremdtransplantate
von menschlichen SKOV-3-Eierstocktumorzellen
trugen, wurde ausgewertet. Neunzehn Tage nach der Tumorzellinjektion
betrug das mittlere Tumorgewicht bei Kontrollmäusen (kein Taurolidin) ungefähr 1,7 g.
Zusätzlich
wurde gefunden, dass Kontrolltiere bis zu 7 ml Aszitesflüssigkeit
enthalten. Das mittlere Tumorgewicht in der mit Taurolidin behandelten
Gruppe (einzelnes Regime von Taurolidin) betrug weniger als 50 mg,
und es gab kein Anzeichen einer Bildung von Aszites. Es wurde ebenfalls
gefunden, dass eine signifikante Anzahl dieser mit Taurolidin behandelten
Tiere tumorfrei war.
-
Wenn
die Therapie am Tag der Tumorzellinjektion begonnen wurde, wiesen
~80% der behandelten Mäuse
bei der Opferung kein Anzeichen einer Krankheit auf. Weiterhin war
die mittlere Tumorgröße bei behandelten
Mäusen
mit Tumoren ungefähr
40fach kleiner als bei Kontrollmäusen
(vehikelbehandelt). Selbst wenn die Taurolidintherapie für bis zu
3 d nach der Tumorzellinjektion verzögert wurde, waren ungefähr 10 Prozent
der Mäuse
bei der Opferung tumorfrei, und die mittlere Tumorgröße in behandelten
Mäusen
war wiederum signifikant kleiner als bei den Kontrollen. Die Initiierung
dieses einzigen Zyklus der Taurolidintherapie 5 d nach der Tumorzellinjektion
(d.h. bei Mäusen
mit etablierten i.p. Eierstocktumoren) was immer noch dazu in der
Lage, das Tumorwachstum signifikant zu inhibieren.
-
Die
hierin angegebenen Daten zeigen, dass eine Klasse von Verbindungen,
welche durch Taurolidin veranschaulicht werden, eine potente antineoplastische
Aktivität
besitzt, indem diese selektiv das Tumorzellwachstum inhibieren und
spezifisch Apoptose in Tumorzellen induzieren. Überraschenderweise wurde gefunden,
dass der zytotoxische IC50 von Taurolidin
in dem Bereich von 10–50 μM, ungefähr 100fach
niedriger als der, welcher für
dessen antibiotische Wirkungen benötigt wird, liegt. Dieser Unterschied
bei den wirksamen Konzentrationen in Verbindung mit der beobachteten
niedrigen klinischen Toxizität
von Taurolidin zeigt, dass diese Klasse von Verbindungen als ein
sicheres, klinisch gut verträgliches
Antineoplastikum nützlich
ist.
-
Die
Daten zeigten, dass eine Exposition an Taurolidin die Proliferation
und Lebensfähigkeit
aller Tumorzelllinien, die in einer großen Gruppe von Zelllinien solider
Tumore ausgewertet wurden, wirksam inhibierte. Taurolidin induzierte
Apoptose in neoplastischen Zellen, was anzeigt, dass dessen Wirkungsmechanismus nicht
einfach eine inhibition von Zelloberflächenadhäsionskomponenten oder -prozessen
ist. Die Exposition an Taurolidin führt zu der Aktivierung der
Caspasen 3, 8 und 9, einer Zerstörung
der Integrität
der Mitochondrienmembran, welche von einem Cytochrom C-Ausfluss
aus diesen Organellen begleitet ist, und der Spaltung von PARP-Protein.
-
Es
wurde gefunden, dass die Fähigkeit
von Taurolidin, Apoptose zu induzieren, für Tumorzellen spezifisch ist.
Diese Beobachtung wurde bestätigt,
indem normale (Nichttumor-)Primärzellen,
die aus Tieren stammten, von denen bekannt war, dass diese frei
von Tumoren waren, verwendet wurden. Die zytotoxische und apoptotische
Aktivität
von Taurolidin in normalen Mausknochenmarkskulturen wie auch in
aktivierten menschlichen T-Zellkulturen
wurde ausgewertet. In beiden Normalzellmodellen war Taurolidin in
dem Hoch μM-Bereich
nicht zytotoxisch und erzeugte keine zellulären Veränderungen, die mit der Induktion
von Apoptose konsistent waren. In normalem Mausknochenmark wurden
Konzentrationen in dem mM-Bereich benötigt, um die Zellproliferation
zu inhibieren. Diese Funde zeigen, dass Taurolidin (oder einer seiner
Metaboliten) auf ein tumorzellspezifisches Target zugreifen, welches
in der Lage ist, die Tumorzellapoptose zu induzieren.
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Beispiel 2: Klinische
Anwendung
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Taurolidin
wurde durch i.p.-Lavage unmittelbar nach einer Operation zur Entfernung
rekurrierender Eierstocktumore verabreicht. Bis heute ist Taurolidin
von diesen Patienten gut vertragen worden.
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Diese
Daten zeigen, dass Taurolidin und Derivate oder Metaboliten von
diesem nützlich
sind, um das Tumorwachstum zu inhibieren oder anzuhalten und die
Lebenserwartung von Tumorpatienten zu verlängern.