DE60033499T2 - Verfahren zum differenzieren und überwachen von parathyroid und krankheiten, die mit dem zustand der knochen verbunden sind - Google Patents

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Description

  • Technisches Gebiet
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Verfahren und Vorrichtungen zum Differenzieren von Parathyroid Erkrankungen wie etwa Hyper-Parathyroidismus, von normalen oder Nichterkrankungs-Zuständen in einem Patienten. Man detektiert vollständiges oder nicht-fragmentiertes (1 bis 84) Parathormon in einer biologischen Probe und auch ein großes nicht-vollständiges Parathormon-Peptid-Fragment, das als Parathormon-Antagonist dienen kann. Indem entweder Werte verglichen werden oder unabhängig die Werte entweder des großen nicht-vollständigen Parathormon-Peptid-Fragments, des vollständigen Parathormons oder die Kombination dieser Werte verwendet werden, kann man Parathyroide und knochenbezogene Erkrankungszustände differenzieren, wie auch solche Zustände von normalen Zuständen differenzieren.
  • Stand der Technik
  • Calcium spielt eine unabkömmliche Rolle bei der Zellpermeabilität, der Bildung von Knochen und Zähnen, der Blutgerinnung, der Übertragung von Nervenimpulsen und der normalen Muskelkontraktion. Die Konzentration an Calcium-Ionen im Blut wird, zusammen mit Calcitrol und Calcitonin, hauptsächlich durch das Parathorm (PTH) reguliert. Obwohl die Calciumaufnahme und -ausscheidung variieren kann, dient PTH durch einen Feedback-Mechanismus dazu, eine stabile Konzentration an Calcium in Zellen und umgebenden Fluiden aufrecht zu erhalten. Wenn das Serum-Calcium sinkt, sezernieren die Parathyroid-Drüsen PTH, was die Freisetzung von gespeichertem Calcium berührt. Wenn das Serum-Calcium steigt, wird die Freisetzung gespeicherten Calciums durch abgesenkte Ausschüttungen an PTH gehemmt.
  • Die vollständige Form menschlichen PTHs, das manchmal im Stand der Technik auch als hPTH bezeichnet wird, das aber in der vorliegenden Erfindung entweder als vollständiges PTH oder wPTH bezeichnet wird, ist ein einmaliges 84-Aminosäuren-Peptid (SEQUENZ ID-Nr.1), wie in 1 gezeigt. Forscher haben herausgefunden, dass dieses Peptid einen anabolen Effekt auf Knochen hat, der eine Domäne für Proteinkinase-C-Aktivierung (Aminosäure-Reste 28 bis 34) wie auch eine Domäne für Adenylat-Cyclase-Aktivierung (Aminosäure-Reste 1 bis 7) involviert. Jedoch werden auch verschiedene katabole Formen von abgeschnittenen oder fragmentierten PTH-Peptiden im Kreislauf gefunden, die am wahrscheinlichsten durch intraglandulären oder peripheren Metabolismus gebildet werden. Beispielsweise kann das vollständige PTH zwischen den Aminosäuren 34 und 35 gespalten werden, um ein (1-34) PTH N-terminales Fragment und ein (35-84) PTH C-terminales Fragment herzustellen. Gleichermaßen kann eine Spaltung zwischen entweder den Aminosäuren 36 und 37 oder 37 und 38 auftreten. Jüngst ist ein großes PTH-Fragment, das als "nicht-(1-84)PTH" bezeichnet worden ist, offenbart worden, das näher am N-terminalen Ende von PTH gespalten ist (Siehe R. LePage et al., "A non-(1-84) circulating parathyroid hormone (PTH) fragment interferes significantly with intact PTH commercial assay measurements in uremic samples" Clin. Chem. (1998); (44, 805-810).
  • Die klinische Notwendigkeit für eine genaue Messung von PTH ist gut demonstiert worden. Der Serum-PTH-Spiegel ist einer der wichtigsten Indikationen für Patienten mit den folgenden Krankheiten: Familiäre Hypocalcurie; Hypercalcämie; Multiple endokrine Neoplasie Typen I und II; Osteoporose, Paget's Knochenkrankheit; Primärer Hyperparathyroidismus – verursacht durch primäre Hyperplasie oder Adenome der Parathyroid-Drüsen; Pseudo-Hypoparathyroidismus; und Nierenversagen, welches sekundären Hyperparathyroidismus verursachen kann.
  • PTH spielt eine Rolle im Verlauf der Erkrankung bei einem Patienten mit chronischem Nierenversagen. Renale Osteodystrophie (RO) ist eine komplexe Skeletterkrankung, die Osteitis Fibrosa Cystica (verursacht durch PTH-Überschuss), Osteomalazie – unmineralisierte Knochenmatrix (verursacht durch Vitamin D-Mangel), extraskelettale Kalzifizierung/Verknöcherung (verursacht durch abnormen Calcium- und Phosphor-Metabolismus) und die adynamische Knochenerkrankung (zu dem PTH-Unterdrückung beiträgt) umfasst. Chronische Nierenversagens-Patienten können RO entwickeln. Versagende Nieren vergrößern den Serum-Phosphor (Hyperphosphorimie) und senken die 1,25-Dihydroxyvitamin D (1,25-D)-Produktion durch die Niere. Das erstere führt zu sekundärem Hyperparathyroidismus aus verminderter gastrointestinaler Calciumabsorption und Osteitis Fibrosa Cystica aus vermehrtem PTH in Reaktion auf ein Ansteigen im Serum-Phosphor. Das letztere verursacht Hypocalcämie und Osteomalacie. Mit dem Einsetzen von sekundärem Hyperparathyroidismus wird die Parathyroid-Drüse weniger responsiv gegenüber ihren hormonellen Regulatoren, aufgrund der verringerten Expression seiner Calcium- und Vitamin-D-Rezeptoren. Serum-Calcium fällt. RO kann zu einem digitalen Gangrän, Knochenschmerzen, Knochenbrüchen und Muskelschwäche führen.
  • Das Bestimmen von zirkulierenden biologisch aktivem PTH-Spiegel im Menschen ist eine Herausforderung gewesen. Ein Hauptproblem ist, dass PTH bei niedrigen Spiegeln gefunden wird, normalerweise 10 pg/ml bis 65 pg/ml. Mit extrem niedrigen Zirkulationsspiegeln ist das Problem die Heterogenität von PTH und seine vielen zirkulierenden Fragmente gekoppelt. In vielen Fällen haben Immunoassays signifikante und maßgebliche Interferenz von zirkulierenden PTH-Fragmenten erfahren. Beispielsweise haben einige kommerziell erhältliche PTH-Kits eine praktisch 100 %ige Kreuzreaktivität mit dem Nicht-(1-84)PTH-Fragment, (siehe den LePage-Artikel).
  • Die PTH-Immunoassays haben über die Jahre verändert. Ein früher Ansatz ist ein Doppel-Antikörper-Präzipitations-Immunoassay, der in der U.S. 4,369,138 an Arnold W. Lindall et al. gefunden wird. Ein erster Antikörper hat eine hohe Affinität für ein (65-84) PTH-Fragment. Ein radioaktiv markiertes (65-84) PTH-Peptid wir der Probe mit dem ersten Antikörper zugegeben, um um das endogene, unmarkierte Peptid zu kompetieren. Ein zweiter Antikörper wird zugegeben, der an jeden ersten Antikörper und radioaktiv markierten PTH-Fragment-Komplex bindet, wodurch ein Präzipitat gebildet wird. Sowohl Präzipitat als auch Überstand können bezüglich Radioaktivitäts-Aktivität gemessen werden und die endogenen PTH-Spiegel können daraus berechnet werden.
  • Im Bestreben, PTH-Fragment-Interferenz zu überwinden, sind immunoradiometrische Zwei-Ort-Assays für intaktes PTH(I-PTH) eingeführt worden, wie etwa der Allgro® Intakt-PTH-Assay des Nichol's Institut aus San Juan Capistrano, Kalifornien. In einer Version bindet ein Fang-Antikörper spezifisch an den C-terminalen Bereich von hPTH, während ein markierter Antikörper spezifisch am N-terminalen Bereich des gefangenen hPTH bindet. Bei einem anderen wurden zwei monoklonale Antikörper verwendet, die beide am N-terminalen Bereich des hPTH anlagerten.
  • Unglücklicherweise haben diese Assays Probleme damit, dass sie zwar messen, aber nicht zwischen wPTH und nicht-vollständigen PTH-Peptid-Fragmenten unterscheiden. Diese Unfähigkeit spielt eine Rolle bei Hyperparathyroid-Patienten und Nierenversagen-Patienten, die signifikante endogene Konzentrationen von großen, nicht-vollständigen PTH-Fragmenten aufweisen.
  • Jüngst haben Forscher einen spezifischen Binde-Assay gemacht, der auf die großen N-terminalen PTH-Fragmente gerichtet ist (siehe Gao, Ping et. Al. "Immunochemicalluminometric assay with two monoclonal antibodies against the N-terminal sequence of human parathyroid hormone", Clinica Chimica Acta 245 (1996) 39-59). Dieser immunochemiluminomnetrische Assay verwendet zwei monoclonale Antikörper, um N-terminale (1-34) PTH-Fragmente, aber keine Mittelbereichs-PTH-Framgente oder C-terminalen PTH-Fragmente zu detektieren. Ein Schlüsselfaktor im Design dieser Assays besteht darin, jegliche Reaktion mit C-terminalen PTH-Fragmenten zu eliminieren.
  • Maegerlein M et.al.: "A NEW IMMUNOENZYMOMETRIC ASSAY FOR BIOACTIVE N-TERMINAL HUMAN PARATHYROID HORMONE FRAGMENTS AND ITS APPLICATION IN PHARMACOKINETIC STUDIES IN DOGS", ARZNEIMITTELFORSCHUNG. DRUG RESEARCH, EDITIO CANTOR. AULENDORF, DE, Bd. 48, Nr. 2, 1998, Seiten 199-204, XP001010446 ISSN: 0004-4172, offenbart einen Assay für bioaktive N-terminale Parathyroid-Fragmente, der einen monoclonalen Antikörper (13C63/a), der hPTH-Fragment 16-24 erkennt, mit einem polyclonalen Antikörper (K2), der eine prädominante Bindesequenz bei hPTH 1-5 zeigt, kombiniert.
  • In "Accumulation of a Non-(1-84) Molecular Form of Parathyroid Hormone(PTH) Detected by Intact PTH assay in Renal Failure: Importance in the Interpretation of PTH Values", BROSSARD ET AL., JOURNAL OF CLINICAL ENDOCRINOLOGY AND METABOLISM, 1996, Seiten 3923-3929, wurden intakte PTH (I-PTH) und C-terminal PTH (C-PTH) im Normal- und Nierenversagen-Patienten bestimmt. Das C- PTH/I-PTH-Verhältnis wird berechnet und die Beziehung zur Parathyroid-Funktion wurde untersucht.
  • Offenbarung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf neue Verfahren und Vorrichtungen zum Differenzieren in einer Patienten-Parathyroid-Erkrankung (wie etwa primärem Hyperparathyroidismus, sekundärem Hyperparathyroidismus und Stadien derselben) von Normal- oder Nicht-Erkrankungszuständen, zur Überwachung der Funktion der Parathyroid-Drüsen entweder während oder nach Behandlung, das heißt intraoperative oder postoperative Parathyroid-Funktionsüberwachung wie auch therapeutische Behandlung; und auch zum Überwachen der Effekte von therapeutischen Behandlungen von parathyroid-bezogenen Knochenerkrankungen und von Hyperparathyroidismus. Man detektiert den Spiegel im Serum oder Blut von zumindest einem von drei verschiedenen Parametern, nämlich dem vollständigen oder nicht-fragmentierten Parathormon in einer biologischen Probe, einem großen, nicht-vollständigen Parat-Hormon-Peptid-Fragment, das als ein Parathormon-Antagonist funktionieren kann, oder der Kombination dieser zwei Werte. Durch Vergleichen der zwei Werte oder durch Untersuchen unabhängig voneinander eines der obigen drei Werte kann man Parathyroid- und Knochenerkrankungszustände differenzieren, wie auch solche Zustände von normalen Zuständen differenzieren, da sich die Beziehung zwischen diesen Werten, wie auch die Werte selbst, signifikant von einer normalen Person zu einem Patienten mit einer Parathyroid-Erkrankung ändern.
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Entdeckung, dass ein großes, nicht-vollständiges PTH-Peptid-Fragment, ein Peptid mit einer Aminosäure-Sequenz von zwischen (SEQ ID No.2 [PTH3-84]) und (SEQ ID No.3 [PTH34-38]) in vivo als ein wPTH-Antagonist oder Inhibitor (PIN) funktioniert, (siehe 12). Anders ausgedrückt werden die Bindung von wPTH an PTH-Rezeptoren und die nachfolgende biologische Aktivität durch die Anwesenheit dieses PIN-Peptid-Fragments betroffen. Die PTH-Rezeptoren können in Bezug auf PTH oder PTH-Analoge dahingehend verbunden werden, dass die PTH-Bindestelle blockiert ist. Die Beziehung zwischen den Konzentrationen von wPTH und PIN variiert mit den PTH-bezogenen Erkrankungszuständen und sie sind somit Indikativ für solche Zustände.
  • Gleichermaßen nützlich im Hinblick auf die Entdeckung der antagonistischen Natur von PIN bezieht sich die folgende Erfindung auf neue Verfahren und Vorrichtungen zum Überwachen von parathyroid-bezogenen Knochenerkrankungen und dem sich ergebenden Knochenverlust oder Aufbau. Vergrößerte Mengen an PIN können die Calcium-freisetzende Aktivität von PTH hemmen.
  • Beim Herstellen einer Messung von wPTH will man PIN nicht detektieren. Das Verfahren zum Messen der Menge an wPTH in einer Probe wie etwa Serum, Plasma oder Blut umfasst vier allgemeine Schritte, die abhängig davon variieren können, ob man einen ersten Antikörper oder ein Antikörperfragment verwendet, das für das PTH-Peptid SER-VAL-SER-GLU-ILE-GLN-LEU-MET (SEQ ID Nr.4) spezifisch ist, während zumindest vier Aminosäuren Teil des Antikörper-reaktiven Bereichs des Peptides entweder als ein Signal-Antikörper oder als ein Fang-Antikörper in konventionellen Immunoassay-Formaten sind. (Man kann auch ein analoges Peptid verwenden, das in anderen Spezies vorhanden ist, wie etwa ein Ratten-Peptid, bei dem die erste Aminosäure Serin durch Alanin substituiert ist.) Entweder als ein Signal-Antikörper oder als ein Fang-Antikörper verwendet, wird genug Antikörper zugegeben, um das gesamte vorhandene wPTH zu binden. Als nächstes gestattet man dem ersten Antikörper, an jegliches vorhandenes wPTH zu binden, wodurch ein Komplex gebildet wird. Eine spezifische Bindemarkierung, die aus einem zweiten Antikörper und einer konventionellen Immunoassay-Markierung besteht, wie etwa ein chemiluminszentes Agens, colorimetrische Agenzien, Energietransfer-Agenzien, Enzyme, Fluoreszenzmittel und Radioisotope, wird verwendet, um den Komplex, vorzugsweise am C-terminalen Ende von wPTH zu markieren und kann entweder im Wesentlichen gleichzeitig mit dem ersten Antikörper oder darauf nachfolgend zugegeben werden. Schließlich verwendet man konventionelle Techniken, um die Menge an markiertem Komplex zu messen und dadurch wPTH-Spiegel in der Probe zu berechnen. Falls als ein Signal-Antikörper verwendet, lagert sich der erste Antikörper immer noch am N-terminalen Ende an, aber der zweite Antikörper würde als ein Fang-Antikörper dienen, der sich am C-terminalen Ende anlagert.
  • Bei Durchführen einer Messung von PIN kann man es entweder direkt oder indirekt messen. Eine indirekte Messung kann durch zuerst Messen von wPTH und dann Messen von Gesamt-PTH durchgeführt werden. Das Abziehen des wPTH-Wertes vom Gesamt-PTH-Wert ergibt den PIN-Wert (für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bezieht sich "Gesamt-PTH" auf die Summe von wPTH, dem natürlich auftretenden prädominanten PTH-Rezeptor-Bindeantagonisten und PIN, den natürlich auftretenden prädominanten PTH-Rezeptor bindenden Antagonisten.) Ein Gesamt-PTH-Assay detektiert sowohl PIN als auch wPTH durch Detektieren des N-terminalen Endes von PTH nicht an der SEQ ID Nr.4, dem absoluten Ende des N-Terminus. Durch Detektion zwischen etwa Aminosäure 7 bis 38 von PTH kann der Assay beides detektieren. Ein kommerziell erhältlicher Assay für Gesamt-PTH ist von Scantibodies Laboratory, Inc. aus Santee, Kalifornien, erhältlich. Eine direkte Messung von Gesamt-PTH kann unter Verwendung eines Antikörpers oder Antikörper-Fragementes durchgeführt werden, das für einen Bereich von PTH-Peptid LEU-MET-HIS-ASN-LEU-GLY-LYS-HIS-LEU-ALA-SER-VAL-GLU-ARG-MET-GLN-TRP-LEU-ARG-LYS-LYS-LEU-GLN-ASP-VAL-HIS-ASN-PHE-VAL-ALA-LEU-GLY (SEQ ID Nr.5) spezifisch ist, welches die Aminosäuren 7 bis 38 von PTH (vorzugsweise zwischen Aminosäuren 9 und 34) umfasst, wobei zumindest vier Aminosäuren Teil des Antikörper-reaktiven Bereichs des Peptides sind. Solch ein Antikörper oder Antikörper-Fragment kann bei konventionellen Immunoassay-Formaten entweder als ein Signal-Antikörper oder ein Fang-Antikörper eingesetzt werden.
  • Um zwischen Parathyroid-Erkrankungszuständen und dem normalen Zustand zu unterscheiden oder die Effekte einer therapeutischen Behandlung von Parathyroid-Erkrankungszuständen zu überwachen, kann man die Beziehung zwischen den Werten von wPTH, PIN oder Gesamt-PTH (der Kombination von wPTH und PIN) vergleichen, anders ausgedrückt, die Beziehung zwischen den Werten von PIN und Gesamt-PTH, zwischen PIN und vollständigem PTH oder zwischen vollständigem PTH und Gesamt-PTH. Beispielsweise kann man eine Proportion zwischen wPTH und Gesamt-PTH, zwischen PIN und Gesamt-PTH oder zwischen PIN und wPTH verwenden. (Vergleiche können sogar die Form eines neuronalen Netzwerks aller dieser Faktoren annehmen.) Unabhängig von dem gewählten Vergleichsverfahren verändern sich diese Werte signifikant zwischen einer normalen Person und einem Patienten mit einer Parathyroid-Erkrankung und zwischen verschiedenen Stadien von Parathyroid-Erkrankungen.
  • Alternativ kann man sowohl zwischen Parathyroid-Erkrankungszuständen als auch normalem Zustand differenzieren oder die Effekte therapeutischer Behandlung von Parathyroid-Erkrankungszuständen durch unabhängiges Überwachen des Wertes von entweder wPTH, PIN oder Gesamt-PTH allein überwachen.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 ist eine Diagrammansicht von menschlichem wPTH.
  • 2 ist eine Diagrammansicht eine wPTH-Assays unter Verwendung des vorliegenden Antikörpers als Spurelement.
  • 3 ist eine Diagrammansicht eines wPTH-Assays unter Verwendung des vorliegenden Antikörpers als ein Fangelement.
  • 4 ist eine Grafik, die eine Standardkurve für ein wPTH-Assay zeigt.
  • 5 ist eine Grafik, die einen konventionellen I-PTH-Assay mit den vorliegenden wPTH-Assay für gesunde normale Personen mit "normalen" PTH-Werten vergleicht.
  • 6 ist eine Diagrammansicht, welche Interferenz von PIN in konventionellen I-PTH-Assays zeigt.
  • 7 ist eine Grafik, die einen konventionellen I-PTH-Assay mit dem vorliegenden wPTH-Assay für Patienten mit chronischer Urämie vergleicht.
  • 8 ist eine Grafik, die die Verteilung von wPTH-Werten für gesunde normale Personen, Patienten mit primärem Hyperparathyroidismus und Patienten mit chronischer Urämie vergleicht.
  • 9 ist eine Diagrammansicht, die zeigt, wie PIN die Wirkung von wPTH auf Rezeptor-Niveau blockiert, wodurch die Person gegenüber den biologischen Effekten von wPTH insensitiviert wird.
  • 10 ist eine Grafik, die vollständige Kreuz-Reaktivität von wPTH und PIN in einem in der vorliegenden Erfindung verwendeten Gesamt-PTH-Assay demonstriert.
  • 11 ist eine Grafik, die zeigt, wie das in der vorliegenden Erfindung verwendete vollständige PTH-Assay kein PIN detektiert.
  • 12 ist eine Grafik, die demonstriert, wie PIN ein in-vivo-Inhibitor von wPTH ist.
  • Beste Modi zum Ausführen der Erfindung
  • Beim Offenbaren der vorliegenden Erfindung sollte man im Gedächtnis behalten, dass es eine Anzahl von engen analogen spezies-abhängigen Formen von PTH gibt. In 1 ist die Aminosäure-Sequenz von hPTH gezeigt. Jedoch findet man beispielsweise für Ratten-PTH, Rinder-PTH oder Schweine-PTH Substitutionen an einigen der Aminosäuren in der hPTH-Sequenz. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung kann man Antikörper oder Antikörper-Fragmente auch für Formen dieser PTHs austauschbar verwenden, obwohl bevorzugt wird, einen Antikörper mit Spezifität für PTH mit einer Sequenz zu verwenden, die zur Spezies passt, in der die PTH-Messungen gemacht werden.
  • Immunoassay für vollständiges PTH
  • Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein immunoradiometrisches Assay (IRMA), das oft als ein Sandwich-Assay bezeichnet wird, wie in den 2 und 3 gezeigt. In einem solchen Assay (10) eingesetzte Elemente beinhalten einen Fang-Antikörper (12), der auf einem festen Halter (14) angebracht ist, und einen Signal-Antikörper (16) mit einer Markierung (18) daran angebracht (20). Typischerweise wählt man einen Fang-Antikörper, der für C-terminale PTH-Fragmente (22) spezifisch ist, während der Markierungs-Antikörper für die anfängliche wPTH-Peptid-Sequenz spezifisch ist, die eine Domäne für Adenylat-Cyclase-Aktivierung (24) umfasst, wie in 2 gezeigt. Jedoch könnte man die Spezifität dieser Antikörper umkehren, wie in 3 gezeigt.
  • Alternativ könnte man ein Immunoassay erzeugen, in dem wPTH entweder aus der Lösung präzipitiert oder anders in einer Lösung differenziert wird, wie in konventionellen präzipitierenden Assays oder turbidometrischen Assays. Beispielsweise kann man zumindest drei Antikörper verwenden, um eine präzipitierende Masse zu bilden. Zusätzlich zu dem Anfangs-wPTH-Sequenz-Antikörper und einem C-terminalen Antikörper kann man zumindest einen dritten Antriebskörper verwenden, der sich an dem mittleren Bereich von PTH anlagert. Die kombinierte Masse von wPTH und den zumindest drei Antikörpern würde eine markierte präzipitierende Masse bilden, die durch konventionelle Techniken gemessen werden kann. Ein anderes Verfahren würde darin bestehen, den anfänglichen wPTH-Sequenz-Antikörper mit kolloidalen Festträgern wie etwa Latexpartikeln zu koppeln.
  • Spezifischer kann man einen Signal-Antikörper durch Iodisieren von 50 Mikrogramm von affinitäts-gereinigtem Ziegen-Anti-(1-6)PTH-Antikörper (Scantibodies Laboratory, Inc., Santee Califormina, U.S.A.) durch Oxidation mit Chloramin T, Inkubation für 25 Sekunden bei Raumtemperatur mit 1 Millicurie 125-I-Radioisotop und Reduktion mit Natrium-Metabisulfat herstellen. Nicht eingebautes 125-I Radioisotop wird vom 125-I-Ziegen-Anti-(1-6)PTH-Signal-Antikörper durch Passieren der Iodisierungsmischung über eine PD-10-Entsalzungs-Säule (Pharmacia, Uppsala, Schweden) und den Herstelleranweisungen folgend getrennt. Die aus der Entsalzungssäule gesammelten Fraktionen werden in einem Gamma-Zähler gemessen und jene Fraktionen, die den 125-I-Ziegen-Anti(1-6)PTH-Antikörper repräsentieren, werden vereinigt und auf ungefähr 300000 DPM (Desintegrationen pro Minute) pro 100 Mikroliter verdünnt. Diese Lösung ist die im vollständigen PTH-IRMA zu verwendende Tracer-Lösung.
  • Fang-Antikörper-beschichtete Röhrchen können durch Anheften von affinitätsgereinigtem Ziegen-Anti-PTH 39-84-Antikörper (Scantibodies Laboratory, Inc., Santee, California, U.S.A.) an 12 × 75 mm Polystyrol-Röhrchen (Nunc, Dänemark) mittels passiver Absorptionstechniken hergestellt werden, die Fachleuten bekannt sind. Die Röhrchen werden gereinigt und getrocknet, was Festphasen-Antikörper-beschichtete Röhrchen erzeugt.
  • Um ein vollständiges PTH-Assay einer Probe durchzuführen, werden 200 Mikroliter Proben menschlichen Serums dem Festphasen-Antikörper-beschichteten Röhrchen zugegeben. Jedem Röhrchen werden 100 Mikroliter der Tracer-Lösung (markierter Ziegen-Anti-(1-6)-PTH-Signal-Antikörper) zugegeben. Die Röhrchen werden bei Raumtemperatur unter Schütteln bei 170 upm für 20-22 Stunden inkubiert. Während dieser Zeit findet die immunochemische Reaktion des Bildens des Sandwiches von {Festphasen-Ziegen-Anti-(39-84)PTH-Antikörper} – {vollständiges PO PTH} – {125-I-Ziegen-Anti-(1-6)PTH-Antikörper} statt. Dieser Inkubation folgend werden die Teströhrchen mit destilliertem Wasser gewaschen. Radioaktivität auf der Festphase, deren Menge mit der Menge an vorhandenem wPTH korrespondiert, wird unter Verwendung eines Gamma-Zählers gemessen. Die Radioaktivitätsdaten für die Proben werden durch konventionelle Analyse unter Verwendung der Ergebnisse aus Standards und Kontrollen und einer Computersoftware prozessiert, so dass die Konzentration von vollständigem PTH in den Proben bestätigt werden kann. 4 zeigt eine Standardkurve für solch ein Assay.
  • Anfängliches vollständiges PTH-Sequenz-Peptid
  • Um den Signal-Antikörper im obigen Assay herzustellen, macht man zuerst ein synthetisches PTH-Peptid, das entweder hPTH (Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu- Met), Ratten-PTH (Ala-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met) oder zumindest vier Aminosäuren in der gemeinsamen Sequenz entspricht. Das ausgewählte Peptid kann Teil eines Affinitäts-Reinigungsmittels für die Isolation des gewünschten Signal-Antikörpers oder Fang-Antikörpers sein.
  • In Kürze kann ein solches Peptid auf einem Applied Biosystems Inc. (Foster City, California, U.S.A.) Modell 431 automatisiertem Peptid-Synthetisierer, der Fmoc(9-Fluoronylmethoxycarbonyl) als alpha-amino-schützende Gruppe verwendet, synthetisiert werden. Alle Aminosäuren und Lösungsmittel stammen von Applied Biosystems und sind vom Synthesegrad. Nach der Synthese wird das Peptid vom Harz abgespalten und die Seitenketten werden entblockt, wobei ein Spalt-Cocktail verwendet wird, der 6,67% Phenol, 4,4 Vol.% Thioanisol und 8,8% Ethandithiol in Trifloressigsäure (TFA) enthält. Das gespaltene Peptid wird präzipitiert und mehrmals in kaltem Diethylether gewaschen. Es wird dann in Wasser gelöst und lyophilisiert.
  • Das Rohpeptid wird einer Aminosäure-Analyse (Waters PICO-TAG-System, Boston, Massachusetts, U.S.A.) und einer Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer VYDAC(TM) C8-Säule mit 0,1% TFA in Wasser und 99,9% Acetonitril in 0,1% TFA als den mobilen Puffern unterworfen. Das Vorhandensein einer einzelnen Haupt-Spitze zusammen mit der geeigneten Aminosäure-Zusammensetzung wird als Evidenz angesehen, dass das Peptid zur weiteren Verwendung geeignet ist.
  • Das sich ergebende Peptid wird dann an quervernetzte Agaroseperlen (aktivierte Sepharose 4B von Pharmacia, Uppsala, Schweden) gemäß den Anweisungen des Herstellers angebracht. Bewaffnet mit der anfänglichen Peptid-Sequenz auf einer Perle kann man eine polyklonale Antikörperserumquelle affinitäts-reinigen, um den Antikörper der anfänglichen Sequenz für den wPTH-Immunoassay zu isolieren.
  • Anfängliche Sequenz vollständiger PTH-Antikörper
  • Um einen affinitäts-gereinigten Anti-(1-6)PTH-Antikörper zu erzeugen, verwendet man zuerst ein ausgewähltes anfängliches PTH-Sequenz-Peptid als Teil eines Immunogens zur Injektion in eine Ziege. Das injizierbare Immunogen ist die wPTH-Komplett-Peptid-Sequenz. Das Immunogen wird mit einem gleichen Volumen Freunds'schen kompletten Adjuvansgemisch, das eine Mischung aus leichtem Mineralöl, Arlaceldetergens und inaktiviertem Mycobakterium tuberkulosis-Bazillen ist. Die sich ergebende Mischung wird homogenisiert, um eine Wasser/Öl-Emulsion zu bilden, die zur Primärimmunisierung in das Tier (typischerweise eine Ziege) injiziert wird. Die Immunogen-Dosis beträgt ungefähr 50-400 Mikrogramm. Den Ziegen wird monatlich dieselbe Dosis Immunogenkomplex injiziert, außer dass bei diesen nachfolgenden Injektionen keine Mycobakterium tuberkulosis-Bazillen verwendet werden. Die Ziegen werden monatlich geblutet, ungefähr drei Monate nach der primären Immunisierung. Das Serum (oder Anitserum) wird aus jeder Blutung durch Abtrennen der roten Blutzellen vom Blut durch Zentrifugation und Entfernen des Antiserums, das reich an (1-6)PTH-Antikörpern ist, erhalten.
  • Um das Antiserum für die gewünschten (1-6)PTH-Antikörper zu reinigen, packt man eine Trennsäule mit den oben beschriebenen anfänglichen PTH-Sequenz-Peptid gebundenen Perlen, wäscht die Säule und äquilibriert sie mit 0,01 M Phosphatgepufferter Saline (PBS). Das Antiserum wird auf die Säule geladen und mit 0,01 M PBS gewaschen, um Antikörper ohne die (1-6)PTH-Spezifität zu entfernen. Der gebundene spezifische Ziegen-Anti-(1-6)PTH-Polyclonal-Antikörper wird aus der Festphasen-PTH 1-6 in der Säule durch Hindurchpassieren einer Elutionslösung von 0,1 M Glycin-Hydrochloridpuffer, PH 2,5 durch die Säule eluiert. Der eluierte polyklonale Antikörper wird neutralisiert, nachdem er die Säule verlässt, entweder mit Zugabe von 1,0 M Phophatpuffer, pH 7,5 oder durch einen Pufferaustausch mit 0,01 M PBS, wie Fachleuten bekannt ist. Der polyklonale Antikörper wird bei 2-8 Grad Celsius gelagert.
  • Vergleich zwischen vollständigem PTH und Gesamt-PTH-Assays.
  • Der vorliegende wPTH-IRMA-Assay wurde mit einem konventionellen intakten PTH oder I-PTH-Immuno-Assay, dem Allegro Nichols Intact-PTH-Assay, (der kommerziell erhältlich und gemacht wird vom Nichols Institute Diagnostics aus San Juan Capistrano, California, U.S.A.) sowohl im PTH normaler Personen als auch bei solchen, die an chronischer Urämie leiden, verglichen. Dieser I-PTH-Immunoassay ist aufgrund seiner 100% Kreuz-Reaktivität zwischen PIN und wPTH in der Tat ein Gesamt-PTH-Assay, (siehe 10).
  • 5 zeigt die Ergebnisse für 34 normale menschliche Serumsproben aus gesunden Subjekten, die sowohl mit dem vorliegenden wPTH-IRMA als auch dem obigen I-PTH-Assay analysiert wurden. In jedem Fall ist der Spiegel an wPTH, der von IRMA detektiert wird, niedriger als der, der vom I-PTH-Assay berichtet wird, was die Fähigkeit des vorliegenden IRMA demonstriert, die Detektion der interferierenden großen (1-84)PTH-Fragmente, die vom I-PTH-Assay detektiert werden, zu vermeiden (siehe 11). 6 illustriert, wie eine solche Interferenz auftreten kann. Ein N-terminaler PTH-spezifischer Signal-Antikörper, der nicht für die anfängliche PTH-Peptid-Sequenz spezifisch ist, wie in der vorliegenden Erfindung, kann nicht nur wPTH (wie im oberen Teil von 6) detektieren, sondern auch PIN detektieren, das große, Nicht-(1-84)PTH-Fragment, (wie im unteren Teil von 6).
  • Ein Vergleich von Assay-Ergebnissen für 157 chronische Urämie-Patienten ist in 7 gezeigt. Serumsproben aus diesen Patienten wurden unter Verwendung des wPTH-IRMA und des obigen I-PTH-Assays gemessen. In jedem Fall sind die wPTH-Spiegel niedriger als die I-PTH-Werte.
  • Klinischer Einsatz
  • Die vorliegenden wPTH und PIN-Assays sind in einer klinischen Umgebung verwendet worden, die 188 Personen umfasste. Die Gruppe beinhaltete 31 Personen mit normalen gesunden Parathyroid-Drüsen und 157 Patienten mit chronischer Urämie, die Dialyse auf kontinuierlicher Basis erhielten. Jeder Person wurde eine Blutprobe entnommen, die unter Verwendung eines wPTH-Assays von Scantibodies Laboratory, wie auch einem I-PTH-Assay vom Nichols Institute untersucht wurden, was die Gesamt-PTH-Werte ergab.
  • Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse individuell und vergleichend, von wPTH, PIN und Gesamt-PTH-Assays von chronischen Urämie-Patienten unter Dialyse.
  • Figure 00140001
  • Figure 00150001
  • Figure 00160001
  • Figure 00170001
  • Figure 00180001
  • Figure 00190001
  • Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse individuell und vergleichend der wPTH, PIN und Gesamt-PTH-Assays aus den Normalen.
  • Figure 00190002
  • Figure 00200001
  • Die statistisch signifikanten Differenzen bei den Medianen dieser zwei Gruppen zeigen klar, das man zwischen den zwei unter Verwendung dieser Assays alleine oder durch Vergleichen ihrer entsprechenden Werte differenzieren kann.
  • Tabelle 3
    Figure 00210001
  • Der Durchschnitts-Fachmann kann erkennen, dass die vorliegende Erfindung jegliche Zahl bevorzugter oben beschriebener Merkmale beinhalten kann.

Claims (43)

  1. Verfahren zum Messen der Menge an vollständigem Parathormon in einer Probe, während ein interferierendes Nicht-(1-84)-Parathormonfragment nicht detektiert wird, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch: a) Zugabe zur Probe eines ersten Antikörpers oder Antikörperfragments, welches für das Parathormonpeptid SER-VAL-SER-GLU-ILE-GLN-LEU-MET (SEQ ID NO:4) als Teil der Komplettsequenz des vollständigen Parathormons (wPTH) spezifisch ist, und wobei zumindest vier Aminosäuren in dem Peptid Teil eines reaktiven Bereichs des ersten Antikörpers oder Antikörperfragments sind, wobei der erste Antikörper oder das erste Antikörperfragment unter Verwendung der kompletten wPTH-Peptidsequenz als ein Immunogen hergestellt wird, b) Zugabe eines zweiten Antikörpers oder Antikörperfragments, der/das spezifisch an einem anderen Teil des vollständigen Parathormons als die anfängliche Parathormon-Peptidsequenz, die an den ersten Antikörper bindet, bindet, wobei entweder erster/s Antikörper oder Antikörperfragment oder der zweite/s Antikörper oder Antikörperfragment markiert ist, wodurch ein markierter Komplex gebildet wird; und c) Messen der Menge des markierten Komplexes, um die Menge an vollständigem Parathormon in der Probe zu messen.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der/das zweite Antikörper oder Antikörperfragment sequentiell oder gleichzeitig mit dem ersten Antikörper oder Antikörperfragment zugegeben wird.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der/das erste Antikörper oder Antikörperfragment an einem festen Träger gebunden ist.
  4. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der/das erste Antikörper oder Antikörperfragment an einem kolloidalen, festen Träger gebunden ist.
  5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der kolloidale, feste Träger Latexpartikel ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der/das erste Antikörper oder Antikörperfragment markiert ist und ein monoklonaler Antikörper ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der/das erste Antikörper oder Antikörperfragment markiert ist und ein polyklonaler Antikörper ist.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der/das zweite Antikörper oder Antikörperfragment markiert ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der/das zweite Antikörper oder Antikörperfragment an einem kolloidalen, festen Träger gebunden ist.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Markierung des markierten Antikörpers oder Antikörperfragments ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus einem Chemilumineszenzagens, einen kolorimetrischen Agens, einem Energieübertragungsagens, einem Enzym, einem Fluoreszenzagens und einem Radioisotop besteht.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der/das erste Antikörper oder Antikörperfragment ein Ziegen-anti-(1-6)-Parathormonantikörper ist.
  12. verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren dazu in der Lage ist, wPTH bei einem normalen physiologischen Spiegel zu detektieren.
  13. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren in der Lage ist, wPTH bei Spiegeln von 27,89 pg/mL und niedriger zu detektieren.
  14. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus einem Serum, einem Plasma und einer Blutprobe besteht.
  15. Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend den Schritt des Bestimmens entweder des Gesamtspiegels an Gesamt-PTH oder des Spiegels an Parathormon-Inhibitorpeptidfragment oder des Spiegels beider in der Probe.
  16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei der Spiegel ein Parathormon-Inhibitorpeptidfragment in der Probe durch Subtrahieren des gemessenen Spiegels an vollständigem PTH in der Probe vom gemessenen Spiegel an Gesamt-PTH in der Probe bestimmt wird, um den Spiegel an Parathormon-Inhibitorpeptidfragment zu berechnen.
  17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei der Gesamt-PTH-Spiegel unter Verwendung eines für das Fragment PTH7-38 spezifischen Antikörpers bestimmt wird.
  18. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, weiterhin umfassend den Schritt des Vergleichens von zumindest zwei Parametern, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus dem Spiegel an vollständigem Parathormon, dem Parathormon-Inhibitorpeptidfragmentspiegel und dem Gesamt-Parathormonspiegel besteht, wodurch bestimmt wird, ob die Probe von einer Person stammt, die im Wesentlichen normale Nebenschilddrüsenfunktion hat oder eine Nebenschilddrüsenerkrankung aufweist.
  19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Nebenschilddrüsenerkrankung primärer Hyperparathyroidismus ist.
  20. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Nebenschilddrüsenerkrankung sekundärer Hyperparathyroidismus ist.
  21. verfahren nach Anspruch 18, wobei die Parathyroiderkrankung durch chronisches Nierenversagen verursacht wird.
  22. Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Nebenschilddrüsenerkrankung Nierenosteodystrophie ist.
  23. Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Nierenosteodystrophie ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus Recklinghausen-Syndrom, Osteomalazie, extraskeletaler Verkalkung/Verknochung und einer adynamischen Knochenerkrankung besteht.
  24. Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Spiegel an vollständigem Parathormon mit dem Parathormon-Inhibotorpeptidfragmentspiegel verglichen wird.
  25. Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Spiegel an vollständigem Parathormon mit dem Gesamt-Parathormonspiegel in der Probe verglichen wird.
  26. Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Parathormon-Inhibitorpeptidfragmentspiegel mit dem Gesamt-Parathormonspiegel in der Probe verglichen wird.
  27. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, weiterhin umfassend den Schritt des Vergleichens von zumindest zwei Parametern, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus dem Spiegel an vollständigem Parathormon, dem Parathormon-Inhibitorpeptidfragmentspiegel und dem Gesamt-Parathormonspiegel besteht, wodurch eine nebenschilddrüsenbezogene Knochenerkrankung und Behandlung in der Person, aus der die Probe genommen wurde, überwacht wird.
  28. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, weiterhin umfassend den Schritt des Vergleichens von zumindest zwei Parametern, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die aus dem Spiegel an vollständigem Parathormon, dem Parathormon-Inhibitorpeptidfragmentspiegel, und dem Gesamt-Parathormonspiegel besteht, wodurch Effekte der therapeutischen Behandlung des Hyperparathyroidismus in der Person, aus der die Probe genommen wurde, überwacht werden.
  29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei der Hyperparathyroidismus ausgewählt ist aus der Gruppe, die aus primärem Hyperparathyroidismus, sekundärem Hyperparathyroidismus, Nierenknochenerkrankung,
  30. Nierenosteodystrophie, Recklinghausen-Syndrom, Osteomalazie, extraskeletaler Verkalkung/Verknöcherung und einer adynamischen Knochenerkrankung besteht.
  31. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, weiterhin umfassend den Schritt des Vergleichens des Spiegels an vollständigem Parathormon mit dem Parathormon-Inhibitorpeptidfragmentspiegel, um Nieren-Osteodystrophie und ihrer Behandlung zu überwachen.
  32. Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 30, wobei der Vergleich in Form eines Verhältnisses oder Anteils vorliegt.
  33. verfahren nach Anspruch 18, wobei die Probe von einer Person stammt, die ein Patient mit chronischer Urämie ist.
  34. Verfahren nach Anspruch 31, wobei das Parathormon-Inhibitorpeptidfragment ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz des menschlichen PTH7-84 ist.
  35. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Parathormon-Inhibitorpeptidfragment ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz zwischen PTH3-84 (SEQ ID NO:2) und PTH34-84 (SEQ ID NO:3) ist und in vivo als Parathormonantagonist oder -inhibitor (PIN) wirkt.
  36. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Parathormon-Inhibitorpeptidfragment ein Peptid mit einer Aminosäuresequenz des menschlichen PTH7-84 ist.
  37. Verfahren nach Anspruch 1, weiterhin umfassend den Schritt der Verwendung des Spiegels an vollständigem Parathormon in der Probe zur Bestimmung, ob die Probe von einer Person stammt, die im Wesentlichen normale Parathyroidfunktion aufweist oder eine Parathyroiderkrankung aufweist.
  38. Im Wesentlichen reiner/s Antikörper oder Antikörperfragment, das für eine Anfangspeptidsequenz von vollständigem Parathormon spezifisch ist, wobei die Anfangspeptidsequenz aus SER-VAL-SER-GLU-ILE-GLN-LEU-MET (SEQ ID NO:4) als Teil von wPTH besteht, wobei zumindest vier Aminosäuren in der Sequenz Teile eines reaktiven Bereichs mit dem Antikörper oder Antikörperfragment sind, und wobei der/das Antikörper oder Antikörperfragment unter Verwendung der konkreten wPTH Peptid-Sequenz als Immunogen hergestellt wird.
  39. Antikörper oder Antikörperfragment nach Anspruch 37, wobei der/das Antikörper oder Antikörperfragment ein monoklonaler Antikörper ist.
  40. Antikörper oder Antikörperfragment nach Anspruch 37, wobei der/das Antikörper oder Antikörperfragment ein polyklonaler Antikörper ist.
  41. Antikörper oder Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 37 bis 39, wobei der/das Antikörper oder Antikörperfragment dazu in der Lage ist, wPTH bei normalen physiologischen Spiegeln zu detektieren.
  42. Antikörper oder Antikörperfragment nach einem der Ansprüche 37 bis 39, wobei der/das Antikörper oder Antikörperfragment zum Detektieren von wPTH bei Spiegeln von 27,89 pg/ml und niedriger in der Lage ist.
  43. Antikörper oder Antikörperfragment eines der Ansprüche 37 bis 41 oder das Verfahren eines der Ansprüche 1 bis 36, wobei der/das erste Antikörper oder Antikörperfragment unter Verwendung eines synthetischen Peptids affinitätsgereinigt wird, das ausgewählt ist aus hPTH 1-8(SER-VAL-SER-GLU-ILE-GLN-LEU-MET), fat-PTH 1-8(ALA-VAL-SER-GLU-ILE-GLN-LEU-MET) und einem Peptid von zumindest vier Aminosäuren in der gemeinsamen Sequenz.
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