DE60033920T2

DE60033920T2 - Homogene nachweismethode unter verwendung von kryptaten der seltenen erden

Info

Publication number: DE60033920T2
Application number: DE60033920T
Authority: DE
Inventors: Gerard Mathis; Herve Bazin
Original assignee: CIS Bio International SA
Current assignee: CIS Bio International SA
Priority date: 1999-04-08
Filing date: 2000-04-07
Publication date: 2007-10-18
Anticipated expiration: 2020-04-08
Also published as: FR2792072A1; EP1166119A1; US6878552B1; ATE356996T1; JP2002541483A; EP1166119B1; WO2000062072A1; AU3826100A; DE60033920D1

Description

Die Erfindung betrifft ein homogenes Verfahren zur Detektion und/oder Bestimmung einer chemischen oder physikochemischen Wechselwirkung mittels Fluoreszenz in einem Meßmedium, in welchem man ein Seltenerdcryptat verwendet, das einen Substituenten aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß man die Variation wenigstens eines Fluoreszenzmerkmals des Seltenerdcryptats mißt, das durch die Modifikation der physikochemischen Eigenschaften resultierend aus der Wechselwirkung induziert ist.
In der Biologie ist von Interesse, daß man die Aktivität von verschiedenen Enzymen oder eine Wechselwirkung zwischen Biomolekülen messen oder untersuchen kann, die Schlüsselereignisse beim Verständnis von Zellphänomenen und bei der Erforschung von neuen Molekülen oder natürlichen Wirkstoffen sind.
Sogenannte homogene Verfahren (welche die Messung der Aktivität oder der Bindung erlauben, ohne die untersuchten Biomoleküle von dem Medium zu isolieren) sind besonders interessant, da sie eine Automatisierung der Untersuchungs- oder Meßprozesse erlauben.
Verfahren, welche die Fluoreszenz verwenden, sind besonders empfindlich, aber sie können durch die optischen Eigenschaften des Mediums gestört werden.
Ein homogenes Verfahren, welches Seltenerdcryptate verwendet, ist besonders interessant, aber erfordert die Verwendung von zwei Markern (G.Mathis et al., Clin. Chem., 1993, 39, 1251).
In der Anmeldung WO 91/08490 verwendet man geschickt die verschiedenen Aktivitäten der zu untersuchenden Enzyme, um an einem Substratmolekül eine chemische Modifikation vorzunehmen, das in der Lage ist oder dazu fähig wird, einen Komplex in Lösung mit einer seltenen Erde zu bilden.
Dieses Verfahren erlaubt im Prinzip, mehrere enzymatische Aktivitätstypen in homogener Phase zu detektieren. In der Praxis ist die In-Situ-Bildung des Komplexes mit der seltenen Erde (in Anwesenheit des biologischen Mediums) ein wichtiges Handikap, denn das Medium kann Moleküle enthalten, die mit dem zum Bilden des Komplexes modifizierten Substrat in Konkurrenz treten.
Diese Technik wird vor allem in heterogenen Dosierungen verwendet, wo man die Aktivität eines als Tracer (Elisa) verwendeten Enzyms bei der Untersuchung der photophysikalischen Eigenschaften verschiedener Cryptate und insbesondere von Cryptaten mißt, die Substituenten tragen, die an den Donator-Molekülmotiven fixiert sind.
Die WO 99/18114 beschreibt fluoreszierende Konjugierte von Nukleosiden oder Nukleotiden mit einem Seltenerdcryptat und ihre Verwendung in einem Verfahren zum Messen der enzymatischen Aktivität eines Enzyms, das in eine Synthesereaktion von Nukleinsäure (z.B. DNA- oder RNA-Polymerase, Transcriptase, Transferase, Ligase) verwickelt ist, durch Messung der emittierten Fluoreszenz (direkt oder indirekt). Die indirekte Fluoreszenzmessung erfordert die Zugabe eines zweiten Tracers (FRET).
Man hat nun herausgefunden, daß eine chemische oder physikochemische Wechselwirkung, welche einen an ein Seltenerdcryptat gebundenen Substituenten modifizieren kann, Modifikationen in der Koordinationsumgebung des Seltenerdions nach sich ziehen und folglich die phytophysikalischen Eigenschaften des Cryptats modifizieren kann.
Der Gegenstand der Erfindung liegt also darin, diese Modifikationen der Koordinationsumgebung eines Seltenerdions in einem Cryptat zu verwenden, um eine enzymatische Aktivität oder eine biologische Wechselwirkung in homogener Phase zu detektieren oder messen.
Das Verfahren erfordert nur einen einzigen fluoreszierenden Tracer, nämlich Seltenerdcryptat.
Insbesondere beeinflußt die Modifikation die Solvatationsumgebung des Seltenerdions.
Das Fluoreszenzmerkmal ist beispielsweise gewählt unter der Emissionslebensdauer, der Fluoreszenzintensität, der Verteilung der Strahlen im Fluoreszenz- und Polarisationsspektrum.
Die bei dem Verfahren nach der Erfindung gemessene Variation kann beispielsweise eine Vergrößerung oder Verminderung der Emissionslebensdauer oder der Fluoreszenzintensität sind und insbesondere an einem Mittel liegen, das eine Steigerung oder ein Extinktion der Fluoreszenz induziert.
Nach einem vorteilhaften Gesichtspunkt des Verfahrens nach der Erfindung wird der Substituent im Verlauf eines physikochemischen Prozesses negativ geladen oder erwirbt eine negative Ladung.
Unter „Substituent" versteht man in der vorliegenden Beschreibung sowohl eine chemische Gruppierung wie beispielsweise eine Phosphat-, Phosphonat-, Carboxylatgruppe oder eines ihrer Derivate, z.B. ein Ester- oder Amidderivat, als auch ein chemisches oder biologisches Molekül, das eine solche Gruppe aufweist, wie beispielsweise eine Nukleinsäure, ein Oligonukleotid oder ein Oligonukleotid, das aus Analoga von Nukleotiden gebildet ist oder diese umfaßt, ein Nukleotid oder ein Nukleosid und ihren Analoga.
Die Wechselwirkung, die detektiert werden soll, kann sich beispielsweise aus einer enzymatischen Reaktion ergeben, die insbesondere Enzyme wie Phosphatase, Phosphodiesterase, Esterase, Exonuklease, Desoxyribonuklease, Ribonuklease, Ligase, Kinase oder Polymerase ins Spiel bringt.
Die Wechselwirkung kann nach einem weiteren Gesichtspunkt in einer Hybridisierungs- oder Denaturierungsreaktion von Nukleinsäuren, Oligonukleotiden oder Oligonukleotiden bestehen, die aus Nukleotidanaloga bestehen oder diese umfassen, oder in einer Reaktion zwischen den Nukleinsäuren oder Oligonukleotiden mit Proteinen mit einer Affinität zu diesen bestehen.
Man versteht unter „Analogon" von Nukleotiden oder Oligonukleotiden Moleküle, die sich von den entsprechenden natürlichen Molekülen durch Modifikation ihrer Struktur unterscheiden, wie optische Isomere (beispielsweise Konfiguration α der Base bezüglich des Zuckers), Positionsisomere (beispielsweise 2'-5'-Kettenbildungen der Phosphatbrücken), oder durch Modifikation der Substituenten der Base (beispielsweise Diaminopurin) oder des Zuckers (beispielsweise 3'-Desoxyribose).
Diese Oligonukleotide können beispielsweise aus einer Kettenbildung von Ribonukleotid- oder Desoxyribonukleotideinheiten oder von analogen Einheiten von Nukleotiden bestehen, die an dem Zucker oder an der Base modifiziert und untereinander durch natürliche Internukleotidbindungen vom Typ Phosphodiester verbunden sind, wobei ein Teil der Internukleotidbindungen möglicherweise durch Phosphat-, Phosphoramid- oder Phosphorthioat ersetzt sein. Diese verschiedenen Familien von Oligonukleotiden sind beschrieben in Goodchild, Bioconjugate Chemistry, 1(3), May/June 1990, 77–99.
Diese Oligonukleotide können auch aus einer Kettenbildung bestehen, die gleichzeitig Ribonukleotid- oder Desoxyribonukleotideinheiten umfassen, die untereinander durch Bindungen vom Typ Phosphodiester verbunden sind, und analoge Einheiten von Nukleosiden, die untereinander durch Amidbindungen verbunden sind, die gemeinhin mit „PNA" (englisch „peptide nucleic acid") bezeichnet werden, wie dies beschrieben ist in M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 1895–1897; solche Verbindungen sind beispielsweise beschrieben in R.Vinayak et al., Nucleoside & Nucleotide, 1997, 16(7–9), 1653–1656.
Das Verfahren nach der Erfindung erlaubt insbesondere die Untersuchung der kinetischen Aspekte einer Wechselwirkung zwischen Molekülen in Echtzeit, z.B. der Hybridation, der Tatsache, das ein einziger fluoreszierender Marker verwendet wird, wobei die Durchführung deutlich vereinfacht ist.
Bei einem vorteilhaften Gesichtspunkt der Erfindung ist das Meßmedium ein biologisches Medium, insbesondere ein Serummedium.
Nach einem Gesichtspunkt der Erfindung kann das bei dem Verfahren nach der Erfindung verwendete Seltenerdcryptat kovalent entweder direkt oder mittels eines Beabstandungsarmes gebunden sein.
Wenn der Substituent ein Oligonukleotid ist, kann die direkte Bindung an einer funktionellen Gruppe realisiert sein, die vorher an einem oder mehreren Atomen einer Base oder einer Pentofuranose-Einheit des Oligonukleotiden eingebracht oder erzeugt worden ist.
In der vorliegenden Beschreibung ist mit funktionelle Gruppe jede Funktion bezeichnet, die von dem Nukleotidteil getragen wird oder an diesen Teil durch jedes dem Fachmann bekannte Verfahren eingebracht ist und in der Lage ist, sich durch kovalente Bindung direkt oder nach Aktivierung mit einer Funktion zu erbinden, die an dem Cryptat oder an dem Beabstandungsarm vorliegt, der von dem Cryptat getragen wird. Solche funktionellen Gruppen sind insbesondere die Funktionen NH₂, COOH, CHO, OH oder SH sowie die Funktionen, die in der Lage sind, kovalente Bindungen durch Substitution (Halogenide, Sulfonate, Epoxide) oder durch Addition zu ergeben (Doppelbindungen Typ Maleimid). Diese Funktionen werden allgemein von einer Kohlenwasserstoffkette getragen, die ihrerseits mit dem Nukleotidteil verbunden ist.
Verfahren zum Einbringen dieser funktionellen Gruppen sind insbesondere in C.Kessler, Nonisotopic probing, Blotting and Sequencing 2^nd edition, L.J.Kricka (1995), Ed. Academic press Ltd., London, S. 66–72 beschrieben. Nach einem bevorzugten Gesichtspunkt der Erfindung ist das Seltenerdcryptat an das Oligonukleotid mittels eines Beabstandungsarmes gebunden. Man versteht unter „Beabstandungsarm" jedes Mittel, das erlaubt, kovalent das Oligonukleotid an das Cryptat auf Höhe eines endständigen Phosphats, eines Atoms einer Purin- oder Pyrimidinbase oder eines Atoms des Zuckers zu binden.
Bei einem vorteilhaften Gesichtspunkt besteht der Beabstandungsarm aus einem bivalenten organischen Rest, gewählt unter den linearen oder verzweigten C₁- bis C₂₀-Alkylengruppen, der gegebenenfalls eine oder mehrere Doppelbindungen oder Dreifachbindungen enthält und/oder gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome enthält, wie Sauerstoff, Stickstoff, Phosphor oder eine oder mehrere Carbamoyl- oder Carboxamidgruppen, den C₅- bis C₈-Cykloalkylengruppen und den C₆- bis C₁₄-Arylengruppen, wobei die Alkylen-, Cycloalkylen- oder Arylengruppen gegebenenfalls durch Alkyl-, Aryl-, oder Sulfonatgruppen substituiert sind.
Insbesondere ist der Beabstandungsarm unter den Gruppen mit folgenden Formeln gewählt:
in welchen n = 2 bis 6 und -CONH-(CH₂)₆, wobei die Bindung über die Gruppe -CONH auf Höhe des Cryptats stattfindet.
Das bei dem Verfahren nach der Erfindung verwendete Seltenerdcryptat besteht aus wenigstens einem Seltenerdsalz, das komplexiert ist durch eine makropolyzyklische Verbindung mit einer Formel
in welcher Z ein Atom mit drei oder vier Valenzen ist, R nichts ist oder Wasserstoff repräsentiert, die Hydroxygruppe, eine Aminogruppe oder einen Kohlenwasserstoffrest darstellt, die bivalenten Reste
,
und
unabhängig voneinander Kohlenwasserstoffketten sind, die gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome enthalten und gegebenenfalls unterbrochen sind durch einen Heteroaromatenring mit wenigstens einem der Reste
,
und
, umfassend wenigstens ein Molekülmotiv oder im wesentlichen bestehend aus einem Molekülmotiv, wobei das Molekülmotiv eine Triplettenergie über jener des Emissionsniveaus des komplexierten Seltenerdions besitzt.
Insbesondere genügt das Seltenerdcryptat der Formel (I), in welcher das Molekülmotiv gewählt ist aus Phenanthrolin, Anthracen, Benzol, Naphtalin, Bi- und Ter-Phenyl, Azobenzol, Azopyridin, Pyridin, Bipyridinen, Bischinolinen und den Verbindungen mit folgenden Formeln:

– C₂H₄-X₁-C₆H₄-X₂-C₂H₄-
– C₂H₄-X₁-CH₂-C₆H₄-CH₂-X₂-C₂H₄-

₁

₂

Vorteilhaft besteht das Seltenerdkryptat aus einem Seltenerdsalz, das komplexiert ist durch eine der folgenden makrozyklischen Verbindungen:
(22) Phenanthrolin; (22)Phenanthrolinamid; (22)Anthracen; (22)Anthracenamid; (22)Biisochinolin; (22)Biphenyl-Bis-Pyridin; (22)Bipyridin; (22)Bipyridinamid; die Makropolyzyklen Tris-Bipyridin, Tris-Phenanthrolin; Phenanthrolin-Bis-Bipyridin; Biisochinolin-Bis-Bipyridin, Bis-Bipyridin-Diphenylpyridin.
Solche Verbindungen sind beispielsweise in der Patentschrift EP 180 492 beschrieben.
Man kann auch makropolyzyklische Cryptatverbindungen verwenden, die Seltenerdionen komplexieren, bei welchen das Molekülmotiv gewählt ist unter Bipyrimidinen und stickstoffhaltigen Hetereozyklen, umfassend die N-Oxidgruppen.
Makropolyzyklische Verbindungen mit Bipyrazineinheiten sind in F.Bodar-Houillon et al., New J. Chem., 1996, 20, 1041–1045 beschrieben.
Makropolyzyklische Verbindungen mit Bipyrimidineinheiten sind in J.M.Lehn et al., Helv. Chim. Acta 1992, 75, 1221 beschrieben.
Makropolyzyklische Verbindungen umfassend stickstoffhaltige Heterozyklen mit N-Oxidgruppen sind in J.M.Lehn et al. Helv. Chim. Acta 1991, 74, 572 beschrieben.
Nach einem weiteren vorteilhaften Gesichtspunkt besteht das Seltenerdcryptat aus wenigstens einem Seltenerdsalz, das komplexiert ist durch eine makropolyzyklische Verbindung, die einer der nachfolgenden Formeln II oder III entspricht:
in denen:

– der Ring der Formel
eine r der folgenden Ringe ist:
– Y eine Gruppe oder ein Beabstandungsarm ist, welche (welcher) besteht aus einem organischen bivalenten Rest, gewählt unter den linearen oder verzweigten C₁- bis C₂₀-Alkylengruppen, der gegebenenfalls eine oder mehrere Doppelbindungen enthält und/oder gegebenenfalls ein oder mehrere Heteroatome enthält wie Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor oder eine oder mehrere Carbamoyl- oder Carboxamidgrupen, unter den C₅- bis C₈-Zykloalkylengruppen oder unter den C₆- bis C₁₄-Arylengruppen, wobei die Alkylen-, Cykloalkylen- oder Arylengruppen gegebenenfalls substituiert sind durch Alkyl-, Aryl- oder Sulfonatgruppen;
– Z eine funktionelle Gruppe ist, die geeignet ist, sich kovalent mit einer biologischen Substanz zu verbinden;
– R' Wasserstoff oder eine -COOR"-Gruppe ist, in der R" eine C₁- bis C₁₀-Alkylgruppe ist und vorzugsweise die Methyl-, Ethyl- oder tert.-Butylgruppe darstellt oder auch R' eine Gruppe -CO-NH-Y-Z ist.

Nach einem vorteilhaften Gesichtspunkt ist das erfindungsgemäß verwendete Seltenerdcryptat ein Europium-, Terbium-, Samarium-, Dysprosium- oder Neodymcryptat, wobei das Europiumcrypatat bevorzugt ist.
Bei einem vorteilhaften Gesichtspunkt ist das Seltenerdcryptat das Europiumcryptat Eu-Tris-Pyridin oder Eu[Bis-Diethoxy-Bipyridin.Bipyridin].
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, bei welchen die folgenden Abkürzungen verwendet werden:

ACN:: Acetonitril
BSA:: Rinderalbuminserum
NHS/DCC:: N-Hydroxybernsteinsäureimid/Dicyclohexylcarbodiimid
TEAB:: Triethylammoniumhydrogencarbonat
TEA: Ac: Triethylammoniumacetat mit 10 % Acetonitril
TFA:: Trifluoressigsäure
UF:: willkürliche Fluoreszenzeinheit (hängt von dem für die Messung verwendeten Gerät ab.

BEISPIEL 1: MODIFIKATION DER PHOTOPHYSIKALISCHEN EIGENSCHAFTEN EINES CRYPTAT-TRIPHOSPHAT-KONJUGIERTEN UND MESSUNG DER FLUORESZENZLEBENSDAUER:
1) Herstellung eines Cryptat-Triphosphat-Konjugierten
Man verwendet ein Konjugiertes, das aus einer [Eu3+ (Trisbipyridin)]-Einheit besteht, die an Position 4 eines Bipyridins funktionalisiert ist, und über einen Beabstandungsarm an die Position 5 einer 2'-Desoxynucleosid-5'-Triphosphat-Einheit gekoppelt ist; dieses Konjugierte wird mit K-11-dUTP bezeichnet. Die Verbindung K-11-dUTP wird nach der folgenden Prozedur hergestellt.
Bei diesem Konjugierten gibt die Ziffer 11 die Gesamtanzahl von Atomen des Beabstandungsarms und der funktionellen Gruppierung an, welche die Cryptatstruktur mit dem Nukleotid verbindet (hier geschieht die Bindung an Position 5 des Pyrimidins).
Das verwendete Nukleosid-Triphosphat ist das 5-[N-(6-Aminocaproyl)-3-Aminoallyl]-2'-Desoxyuridin-5'-Triphosphat] (AH-dUTP), welches durch Reaktion von Trifluoracetamido-Caproat von N-Hydroxysuccinimid (M.S.Urdea et al., Nucleic acids Res., 1988, 4937) an dem 5-(3-Aminoallyl-2'-Desoxyuridin-5'-Triphosphat hergestellt wurde, welches nach einem Verfahren der Literatur hergestellt wurde (Langer et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1981), 78, 6633–6637), gefolgt von einem ammoniakalischen Cracken (NH₄OH wäßrig 3 %, 45 min bei 60°C). Die Verbindung wird an DEAE-Sepharose^® (Pharmacia) in einem linearen Gradienten von Triethylammuniumhydrogencarbonat (0,1 M bis 0,3 M) gereinigt.
Man verdünnt 68 μl einer Lösung von AN-dUTP mit 6 μmol/ml (also 0,4 μmol) mit 250 μl Triethylammonium (TEAB) 0,1 M pH 7,8 und man fügt 320 μl einer Lösung von N-Hydroxysuccinimidcryptat (4 mg/ml in Acetonitril) hinzu, die wie folgt hergestellt wurde. Das Europiumcryptat [(Bis-Bpy)-(Bpy-Diester)], das im Beispiel 4, Abschnitt A der Anmeldung EP 0 321 353 beschrieben ist, wird durch NaOH hydrolysiert, und das erhaltene zweisäurige Cryptat wird an der Kolonne RP-18 HPLC gereinigt (Gradient von Acetonitril in Trifluoressigsäure mit 1 % in Wasser). Das so erhaltene Europiumcryptat [Bis-Bpy)-(Bpy-diacid) (4 mg) wird in 0,5 ml Acetonitrilanhydrid gelöst, und man fügt 1 mg N-Hydroxysuccinimid hinzu, dann eine Lösung von 1,9 mg Dicyclohexalcarbodiimid gelöst in 0,5 ml Acetonitril. Nach 16 h Reaktion wird das dicyclohexylurierte Präzititat gefiltert, und die Lösung von N-Hydroxysuccinimidcryptat wird direkt für die Kopplung verwendet.
Nach 45 min unter Rühren fügt man 15 μl TEAB 1 M pH 8,5 hinzu, dann spritzt man die Mischung an einer Kolonne Superdex 30^® HR 10/30 (Pharmacia) ein unter Eluieren durch TEAB 0,05 M pH 7 mit 10 % Acetonitril (Durchsatz 1 ml/min).
Man sammelt die Verbindung Rt ≅ 16,4 mn, dann wird diese mit Fraktion 1 bezeichnete Fraktion unter Vakuum (speed-vac) bis zu einem Volumen von 350 μl konzentriert und enthält 8 UA₃₀₄ nm. Schätzt man ein ε₃₀₄ ≅ 35000, dann liegt die geschätzte Konzentration an K-dUTP bei etwa 0,72 mM.
Eine Aliquote (90 ml) dieser Fraktion 1 wird an der gleichen Kolonne eingespritzt, eluiert durch einen Triethylammoniumacetatpuffer 25 mM pH 7 mit 5 % Acetonitril. Die Fraktion, die der einzigen Spitze des Chromatogramms entspricht, wird gesammelt (16 min < Rt < 19 min) und unter Vakuum (speed-vac) konzentriert. Man erhält 150 μl einer Lösung von K-dUTP mit 1,95 UA₃₀₄ nm, die mit Fraktion 2 bezeichnet ist.
Die Verbindung wird in Massenspektrometrie analysiert (positiver Electrospray-Modus): (M–2H)⁺ = 1431 (M–2H+CH₃CooH)⁺ = 1491.
Das UV-Spektrum in Wasser weist ein Maximum bei 241 nm auf, das charakteristisch für den Nukleosidteil des Moleküls (λmax = 289 nm, ε = 7100, λmax = 240 nm, ε = 10700) ist, und ein Maximum bei 304 nm in der Nähe des λmax von 305 nm (ε = 30000), das charakteristisch für das Europiumcryptat ist. Man beobachtet ein Verhältnis A₃₀₄/A₂₄₁ ≅ 0,83, das mit der vorgeschlagenen Struktur vergleichbar ist.
2) Messung der Hydrolysekinetik eines Cryptat-Triphosphats [Trisbipyridin(Eu³⁺)-11-dUTP] durch die alkalische Phosphatase durch Messung der Lebensdauer:
Man bringt in die Kufe eines Spektralfluorometers LS 50 (Perkin-Elmer) 600 μl einer Lösung von K-dUTP mit einer Konzentration von 1,6.10^–6 M in einem Puffer Tris 0,1 M pH 9,0 mit 0,1 M NaCl und 15 mM MgCl₂ ein.
Man mißt die Fluoreszenzintensität bei 620 nm sowie die Fluoreszenzlebensdauer [Regelung des Spektralfluorometers: λErregung = 305 nm, λEmission = 550 bis 750 nm, Phosphoreszenz-Modus 0,1 ms bis 0,4 ms Erregungsspalt = 10 nm, Emissionsspalt = 10 nm] die den Anfangswert ergibt (t = 0).
Man fügt 2 μl einer auf 1/100 verdünnten Lösung alkalische Phosphatase (Boehringer) in Puffer Tris 0,1 M pH 9,0 hinzu, was zwei enzymatischen Einheiten entspricht. Nach Zeiten von 15 min, 30 min, 60 min und 80 min mißt man unter den gleichen Bedingungen wie oben die Fluoreszenzintensität bei 620 nm (Fluoreszenzspektrum) sowie die Lebensdauer des Europiums für die Zeiten 30 min, 60 min und 80 min.
Die beobachteten Werte sind in der folgenden Tabelle 1 aufgeführt.
TABELLE 1
Messungen von Fluoreszenzen und von Lebensdauern unter ähnlichen Bedingungen werden mit einer Lösung von K-11-dUTP mit einer Konzentration von 3,7.10^–6 M in dem obengenannten Puffer durchgeführt, dann fügt man 10 μl auf 1/10 verdünnte alkalische Phosphatase in Puffer Tris 0,1 M pH 9,0 hinzu, was 10 enzymatischen Einheiten entspricht.
Vor dem Hinzufügen des Enzyms beobachtet man eine Lebensdauer von 0,61 ms; nach dem Hinzufügen des Enzyms beobachtet man, daß die Lebensdauer sehr rasch abnimmt und sich stabilisiert, um einen Endwert von 0,41 ms zu ergeben.
Als Referenz mißt man das Spektrum und die Lebensdauer eines einfach durch einen Beabstandungsarm funktionalisierten Cryptats [Eu3+(Tris-Pyridin)], im folgenden KNH2 genannt. Man beobachtet, daß die Lebensdauer des KNH2 in dem Puffer Tris 0,1 M pH 9,0 bei 0,39 ms liegt.
Die Graphen der Kinetiken der Fluoreszenzintenisät und der Lebensduer sind in 1 bzw. 2 dargestellt.
Man beobachtet also, daß die enzymatische Hydrolyse der Triphosphatkette, um anorganischen Phosphor zu ergeben, von einer Abnahme der Fluoreszenz und einer Abnahme der Lebensdauer begleitet wird. Die Verminderungskinetik der Lebensdauer (die unabhängig von der Konzentration an fluoreszierender Verbindung ist) ist eine Funktion der enzymatischen Aktivität; sie ist schneller, wenn man die Anzahl von eingebrachten enzymatischen Einheiten erhöht.
Der Endwert der Lebensdauer t = 0,41 ms nach Hydrolyse von K-dUTP tendiert zu dem Wert von 0,39 ms, der für das nicht konjugierte Cryptat beobachtet wurde.
Die Hydrolyse der Phosphatgruppen ändert also die Umgebung des Europiumcryptats und modifiziert seine photophysikalischen Eigenschaften.
BEISPIEL 2: MODIFIKATION DER PHOTOPHYSIKALISCHEN EIGENSCHAFTEN EINES KONJUGIERTEN CRYPTAT-TRIPHOSPAT UND MESSUNG DER FLUORESZENZINTENSITÄT IN ABGELAUFENER ZEIT
Man stellt eine Lösung von K-11-dUTP her, die wie oben in Beispiel 1 angegeben mit einer Konzentration von 3.10^–6 M in einem Puffer Tris 0,1 M pH 9,0 mit 0,1 M NaCl und 15 mM MgCl₂ hergestellt wurde. Parallel stellt man eine Lösung von KNH2 mit einer Konzentration von 3.10^–6 M in dem gleichen Puffer her.
Jede Lösung wird auf 1/500 M in dem gleichen Puffer verdünnt, und man lagert 200 μl der verdünnten Lösung von K-11-dUTP in zwei Reihen von 10 Mulden einer Mikroplatte mit schwarzem Boden ab. Auf die gleiche Weise lagert man 200 μl der verdünnten Lösung von KNH2 in zwei anderen Reihen von 10 Mulden der Mikroplatte ab.
Man liest die Fluoreszenz bei 620 nm (unter Verwendung eines Fensters von 50 bis 400 μs) an den verschiedenen Mulden dank eines Fluorometers (Discovery) in abgelaufener Zeit, um die Fluoreszenzwerte zu t₀ = 0 zu haben.
Man fügt 2 μl Puffer in jede der Mulden einer Reihe hinzu, welche K-11-dUTP (bezeichnet KTP-T) enthält, und einer Reihe hinzu, welche KNH-2 (bezeichnet K-T) enthält, man fügt 2 μl einer auf 1/100 verdünnten Lösung alkalische Phosphatase (vgl. Beispiel 1) in jede der Mulden der anderen Reihe hinzu, welche KdUTP (bezeichnet KTP-E) enthält, und der anderen Reihe, welche KNH2 (bezeichnet K-E) enthält. Man bildet die Fluoreszenz-Mittelwerte jeder Reihe.
Man führt die Messungen bei 620 nm nach 10 min, 35 min und 70 min durch. Man mißt das Verhältnis (Ft/F₀) der Fluoreszenz (Ft) zur Zeit t zu der Fluoreszenz (F₀) zu t₀.
Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 aufgeführt.
TABELLE 2
Die Ergebnisse zeigen, daß in Anwesenheit des Enzyms die Fluoreszenzintensität bei 620 nm im Lauf der Zeit abnimmt. Diese Entwicklung verläuft mit einer Geschwindigkeit ab, die mit dem zu vergleichen ist, was man für die enzymatische Hydrolyse der Phosphatgruppen eines Triphosphatnucleosids unter den gewählten experimentellen Bedingungen erwarten kann.
Im übrigen beobachtet man, daß die Fluoreszenz in den Mulden KNH2 mit Enzym (K-E) auf der gleichen Intensität wie in den Vergleichsmulden KNH2 (K-T) ohne Enzym ist, und daß in beiden Fällen die Fluorzeszenz im Lauf der Zeit nur sehr wenig variiert, was zeigt, daß das Cryptat selbst nicht durch die Anwesenheit des Enzyms modifiziert ist.
Diese Ergebnise bestätigen, daß die Hydrolyse der Phosphatkette des K-11-dUTP eine Modifikation der photophysikalischen Eigenschaften des Seltenerdcryptats hervorruft.
BEISPIEL 3: HERSTELLUNG DES CRYPTATS [TRISBIPYRIDIN(EU3+)-AMINOHEXYLPHOSPHAT]
1) Herstellung eines konjugierten Cryptats [Trisbipyridin(Eu3+)-Aminohexylphosphat (KAH-PO4)
Man löst 2 mg (10 μmol) Aminohexylphosphat (Sigma) in 100 μl Triethylammoniumhydrogencarbonat (TEAB) 0,1 M pH 7,8 und fügt 100 μl einer Lösung von aktiviertem Cryptat [TBP-(Eu3+) (4mg/ml in Acetonitril) hinzu, also 0,26 μmol. Das aktivierte Cryptat [TBP-(Eu3+) (NHS/DCC) in Acetonitril wie in Beispiel 1, 1°) oben beschrieben wird sofort ausgehend von Europiumcryptat[(Bis-Bipy)-(Bipy-Diacid)] hergestellt, das seinerseits ausgehend von Europiumcryptat[(Bis-Bipy)-(Bipy-Dimethylester)] erhalten wurde, das in Beispiel 4, Abschnitt A der Anmeldung EP 0 321 353 beschrieben ist.
Nach 15 min unter Rühren konzentriert man auf die Hälfte, dann spritzt man die Mischung an einer Kolonne Superdex Peptid HR 10/30 (Pharmacia) unter Eluieren durch TEAAc 15 mM pH 9 ein, das 10 % Acetonitril enthält (Durchsatz 1 ml/min).
Man sammelt die Verbindung von Rt ≅ 19 min; diese Fraktion wird im Vakuum (speed-vac) bis zu einem Volumen von etwa 300 μl konzentriert. Diese Lösung von gereinigtem KAH-PO4 enthält 01,2 μmol Cryptat und wird für die photophysikalischen Messungen dienen. Diese Fraktion wird an der gleichen Kolonne Superdex Peptid analysiert, eluiert durch einen Triethylammoniumacetat-Puffer 25 mM pH 7, der 10 % Acetonitril enthält. Man beobachtet eine einzige Spitze von Rt ≅ 20 min. Die Koeinspritzung mit dem Europiumcryptat [Bis-Bipy)-(Bipy-Diacid)] zeigt, daß dieses mit einem Rt ≅ 23,7 min wandert. Ebenso analysiert man das KAH-PO4 durch RP18-HPLC (Merck) in einem Acetonitrilgradienten in einer wäßrigen Lösung von TFA mit 1 % (ACN 15 % isokratisch während 5 min, dann linearer Gradient von 15 bis 100 % von ACN in 30 min). Man beobachtet eine Spitze bei Rt ≅ 16,6 min, unterschiedlich von dem Europiumcryptat [Bis-Bipy)-(Bipy-Diacid)], das mit einem Rt ≅ 15,9 min wandert.
2) Photophysikalische Eigenschaften des Konjugierten KAH-PO4:
Ausgehend von der wie oben hergestellten wäßrigen Lösung von KAH-PO4 stellt man eine verdünnte Lösung mit 1,5·10^–5 M von KAH-PO4 in einem Puffer Tris 0,1 M pH 9,0 her, der 0,1 M NaCl und 15 mM MgCl₂ enthält.
Man mißt die Fluoreszenzintensität bei 620 nm sowie die Fluoreszenzlebensdauer [Regelung des Spektrofluorometers: λErregung = 305 nm, λEmission = 550 bis 750 nm, Phosphoreszenz-Modus 0,1 ms bis 0,4 ms Erregungsspalt = 10 nm, Emissionsspalt = 10 nm], die den Anfangswert ergibt (t = 0).
Man beobachtet eine Lebensdauer t = 0,637 ms.
Man bemerkt, daß das Europiumcryptat [Bis-Bipy)-(Bipy-Diacid)] unter den gleichen Bedingungen eine Lebensdauer t = 0,21 ms aufweist.
3) Freisetzungskinetik der Phosphate:
Man verwendet die oben beschriebene Lösung von KAH-PO4 in dem Puffer Tris, und man fügt dann 2 μl einer auf 1/100 verdünnten Lösung von alkalischer Phophatase (Boehringer) in Puffer Tris 0,1 M pH 9,0 hinzu, was zwei enzymatischen Einheiten entspricht.
Man führt die Messungen der Fluoreszenzintensität und der Lebensdauer zu den in der folgenden Tabelle 3 angegebenen Zeiten durch:
TABELLE 3
Man läßt dann das Reaktionsgesmisch 16 h bei 20°C, damit die enzymatische Reaktion total ist. Man beobachtet dann eine Lebensdauer t = 0,45 ms.
Man beobachtet eine Modifikation der photophysikalischen Eigenschaften im Lauf der Hydrolyse der Phosphatfunktionen. Im Lauf der Reaktion tendiert die Lebensdauer dazu, sich dem Wert der Lebensdauer der Lebensdauer (t = 0,39 ms) anzunähern, der für KNH2 in dem gleichen Medium beobachtet wurde.
BEISPIEL 4: HYDROLYSE EINES KONJUGIERTEN CRYPTAT [TRISBIPYRIDIN(EU3+)]-OLIGONUKLEOTID DURCH PHOSPHATASE/PHOSPHODIESTERASE]
1) Markierung eines Oligodesoxynukleotiden durch ein Cryptat
Ein Oligodesoxynukleotid (ODN)de^5'd(T₁₀ G₄ C^AH G)_3', modifiziert nahe seinem Ende 3' durch einen Aminohexylarm (AH) wird auf festem Träger durch das mit „Phosphit-Phosphoramit" bezeichnete Verfahren synthetisiert, wobei ein DNA-Synthesator (Applied Biosystems Typ 392) nach dem Protokoll des Fabrikanten verwendet wird. Ein modifiziertes Nukleotid wird eingebracht durch Kopplung an einem Träger CPG, der mit Desoxyguanosin (Perkin Elmer/Applied Biosystems) gepropft ist, von einem Derivat N,N-Diisopropyl-β-Cyanethyl-Phosphoramidit, das erhalten ist ausgehend von 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-N-4-(6-Trifluoracetamidohexyl)-2'-Desoxycitidin, hergestellt durch Trifluoracetylierung von 5'-O-(4,4'-Dimethoxytrityl)-N-4-(6-Aminohexyl)-2'Desoxycytidin [ROGET et al. Nucleic Acids Res., 17, 7643–7650, (1989)]. Man fährt dann mit der Synthese der obengenannten Sequenz fort, am Schluß der Synthese an einem DNA-Synthesator im Modus „Trityl-on", das Oligonukleotid wird mit konzentriertem Ammoniak behandelt (16 h bei 55°C) und durch HPLC an einer Kolonne LiChrospher^® RP-18E 250-10 (10 μm) (Merck, Deutschland) gereinigt durch einen Acetonitril-Grdienten in Triethylammoniumacetat 50 mM (Puffer A: 5 % Acetonitril, Puffer B: 50 % Acetonitril; Durchsatz 5 ml/min, Gradient von 10 % B bis 60 % B in 20 min, isokratisch 60 % B während 5 min, dann Gradient von 60 % B bis 100 % B in 5 min) (Oligonucleotide synthesis: A practical approach, Ed M.H. Gait. IRL Press, Oxford); die Fraktionen, die einer mehrheitlichen Spitze entsprechen (Retentionszeit über 20 min), werden verdampft. Nach der Verdampfung und Koverdampfung mit Wasser wird das so erhaltene teilweise gecrackte Oligonukleotid detrityliert durch Essigsäure mit 80 % (Umgebungstemperatur, 30 min), nach der Verdampfung und Koverdampfung wird das vollständig gecrackte Oligonukleotid wieder in 50 μl Triethylammoniumhydrogencarbonat (TEAB) 1000 mM pH ∼ 8 genommen und durch 1,5 ml N-Butanol ausgefällt. Nach Zentrifugierung wird der Überstand wird beseitigt, und das unter Vakuum getrocknete Präzipitat wird durch 200 μl Wasser wieder aufgenommen, diese Mutterlösung (Oligonukleotid genannt AH-ODN1) wird für die Markierung am Cryptat verwendet.
2) Kopplung eines Cryptatmoleküls TTBP-(Eu3+)] an einem Oligodesoxynukleotid funktionalisiert durch einen Aminohexylarm (AH-ODN1):
Ein Aliquotteil der Mutterlösung des oben erhaltenen Oligonukleotiden wird durch 150 μl einer wäßrigen Lösung von Triethylammoniumhydrogencarbonat (TEAB) 0,1 M pH 7,8 verdünnt, und man fügt 60 μl einer Lösung von aktiviertem Cryptat [TBP-(Eu3+)] (4 mg/ml) hinzu, also 171 nmol (etwa 4 Äquivalente). Das aktivierte Cryptat [TBP-(Eu3+)] (NHS/DCC) wird sofort ausgehend von Europiumcryptat [(Bis-Bipy)-(Bipy-Diacid)] hergestellt, das seinerseits ausgehend von Europiumcryptat [(Bis-Bipy)-(Bipy-Dimethylester)] erhalten ist, wie dies in Beispiel 4, Abschnitt A der Anmeldung EP 0 321 353 beschrieben ist.
Nach 30 min unter Rühren fügt man 15 μl von TEAB 1 M pH 8,5 hinzu, dann verdampft man unter Vakuum (speed-vac) bis zu einem Volumen von 200 μl, man lagert an einer Kolonne NAP 10 (Pharmacia) ab, neutralisiert in einem Puffer TEAAc 25 mM pH 7, der 10 % Acetonitril enthält, man eluiert durch den gleichen Puffer nach dem Protokoll des Fabrikanten, die ausgeschlossene Fraktion wird in einem Volumen von 1 ml gesammelt, und diese Fraktion wird bis zu einem Volumen von 200 μl konzentriert.
3) Reinigung des Konjugierten gebildet aus einem Cryptat TTBP-(Eu3+)] und einem Oligodesoxynukleotiden funktionalisiert durch einen Aminohexylarm (Konjugiertes KH-ODN1):
Das Konjugierte KH-ODN1 wird durch FPLC an einer Kolonne mono-Q (Pharmacia) analysiert, wobei die folgenden Bedingungen verwendet werden (Puffer A: Natriumacetat 20 mM pH 5, enthaltend 10 % Acetonitril; Puffer B: Natriumacetat 20 mM pH 5 Lithiumchlorid 1 M, enthaltend 10 % Acetonitril; Gradient: 0 bis 2 min isokratisch 20 % B, 2 min bis 30 min Gradient von 20 % B bis 60 % B, Durchsatz 1 ml/min).
Dann spritzt man die Gesamtheit der ausgeschlossenen Fraktion aus der Kolonne NAP10 (200 μl) an der Kolonne mono-Q ein, die dem Konjugierten K-ODN1 entsprechende Fraktion wird gesammelt, bis auf 300 μl konzentriert und an einer Kolonne NAP entsalzt, neutralisiert in einem Puffer TEAAc 25 mM pH 7, enthaltend 10 % Acetonitril. Man eluiert durch den gleichen Puffer nach dem Protokoll des Fabrikanten, die ausgeschlossene Fraktion wird in einem Volumen von 1 ml gesammelt. Diese Fraktion, die dem reinen Konjugierten KH-ODN1 entspricht, ist durch ein Ultraviolettspektrum gekennzeichnet, das ein Maximum bei 260 nm aufweist (Komponente ODN) und eine Schulter etwa bei 305 nm (Komponente Cryptat). Man erhält so ein Oligonukleotid, das von dem Cryptat and dem Aminohexylarm markiert ist, der an Position 4 des Cytosin nahe dem Ende 3' fixiert ist [Sequenz ^5'-d(T₁₀G₄C^KAHG)3' bezeichnet K-ODN1].
4) Man verwendet eine Mutterlösung des Konjugierten K-ODN1, diese Mutterlösung wid in Puffer PBS verdünnt, der 0,1 % BSA enthält.
Man lagert 100 μl der verdünnten Lösung in den Mulden einer Mikrotitrationsplatte ab. In den zwei ersten Mulden fügt man 100 μl des Puffers hinzu, und in den folgenden Mulden lagert man 100 μl einer Harnsäureverdünnung ab, die derart hergestellt ist, daß die Endkonzentration an Harnsäure von einer Mulde zur anderen nach der folgenden Tabelle 4 um einen Faktor 2 zunimmt.
Man mißt die Fluoreszenz bei 620 nm an einem Gerät Discovery, man trägt die Ergebnisse in der folgenden Tabelle 4 ein. Man berechnet den Prozentsatz der Extinktion (quenching) bezüglich des Vergleichs, der keine Harnsäure enthält, durch die folgende Beziehung: 100–100[E620(Harns./E620(standard 0)
TABELLE 4
Man führt die gleiche Meßreihe nach zunehmenden Inkubationszeiten durch (angegeben in Stunden), und auf die gleiche Weise mißt man die Extinktion (%) in Abhängigkeit von der Harnsäurekonzentration.
Die Ergebnis sind in der folgenden Tabelle 5 aufgeführt.
TABELLE 5
Die Ergebnisse zeigen, daß man für eine gegebene Konzentration von Harnsäure (50 mg/l), die eine schwache Extinktion der Fluoreszenz des Cryptats hevorruft, wenn es an das Oligonukleotid gekoppelt ist (etwa 20 %), im Lauf der Zeit eine Erhöhung der Extinktion bis zu etwa 75 % zu einer Zeit beobachtet, die einer vollständigen Digestion des Oligonukleotiden entspricht.
Die Digestion des Oligonukleotiden, um Nukleoside zu ergeben, geht also einher mit einer Variation der photophysikalischen Eigenschaften des Cryptats und einer Erhöhung seiner Empfindlichkeit gegenüber Quenching.
Diese Ergebnisse zeigen die Möglichkeit, dem Ablauf einer Reaktion durch die Entwickung der photophysikalischen Eigenschaften (wie der Extinktion) eines fluoreszierenden Markers in Anwesenheit eines Extinktionsmittels zu folgen, das in das Reaktionsmilieu eingebracht ist.
BEISPIEL 5: MODIFIKATIONEN DER PHOTOPHYSIKALISCHEN EIGENSCHAFTEN EINES KONJUGIERTEN CRYPTAT [TRISBIPYRIDIN(EU3+)]-OLIGONUKLEOTID IM LAUF EINER HYBRIDISATION

1) Markierung eines ODN AH-kras 12M1 durch das Cryptat.

Man verwendet ein Oligonukleotid der Sequenz 5'-d(^AHC ACG CCA CTA GCT CC)_3', modifiziert an seinem Ende 5' durch einen Aminohexylarm (A), synthetisiert auf festem Träger.
Folgt man dem Markierungsprotokoll des Beispiels 4, dann erhält man in diesem Fall ein Oligonukleotid, das von dem Cryptat an dem Aminohexylarm markiert ist, der an Position 4 des Derivats von Cytosin fixiert ist, das am Ende 5' liegt [Sequenz ^5'd(C^KAH ACG CCA CTA GCT CC)_3', bezeichnet K-ODN2].

2) Man synthetisiert das Oligonukleotid ODN3 mit der Sequenz ^5'd(GGAGCTAGTGGCGT)_3', komplementär zu der oben beschriebenen Sequenz K-ODN2.
3) Vergleich der Legensdauer eines Konjugierten Olignukleotid Cryptat in Form einfache Faser und in Form doppelte Faser: Man setzt in denaturierenden Bedingungen (95°C, 5 min) eine Lösung, die äquivalente Mengen des Olignukleotids K-ODN2 und seines Komplements enthält, in einen Phosphatpuffer 0,1 M NaCl, dann fördert man die Hybridisation, indem 20 min bei 30°C inkubiert wird.

Man mißt die Fluoreszenzlebensdauer des Cryptats im Falle des einfaserigen Oligonukleotids K-ODN2 sowie im Fall des an seinem Komplement hybridiserten Oligonukeotids K-ODN2. Die Messungen werden in Phosphatpuffer pH 7, der 0,1 M NaCl enthält, bei 20°C an einem Gerät LS50 (Perkin Elmer) durchgeführt.
An dem Gerät LS50 erlaubt die Abnahme eines Fluoreszenzsignals (Messung in abgelaufener Zeit), ausgehend von den Messungen die Lebensdauer ausgehend von der linearen Relation zu berechnen, die den Logarithmus und die Zeit verbindet. Die Linearität dieser Relation wird durch die Berechnung des Korrelationskoeffizienten (Methode der kleinsten Fehlerquadrate) mit Hilfe der Software geschätzt, die mit dem Gerät geliefert wird.
Ein Korrelationskoeffizient über 0,999 gibt eine monoexponentielle Abnahme und die Anwesenheit einer Population von homogenen Molekülen wieder, was ihre Lebensdauer angeht, während ein kleinerer Koeffizient allgemein die Koexistenz zweier verschiedener Gattungen in dem Milieu angibt.
Man beobachtet das folgende Ergebnis:
Nach 15 min bei 60°C, d.h. über Tm (charakteristische Schmelztemperatur einer Nukleinsäure = Temperatur, bei welcher die Hälfte der Moleküle in passender Form zu ihrer kompementären Sequenz vorliegen), beobachtet man die folgenden Ergebnisse:
Der Wert von Tm für die Hybridisation von K-ODN2 an seinem Komplement unter den hier verwendeten Bedingungen, wie er durch eine empirische Formel geschätzt ist, welche die Länge des Oligonukleotiden, die Konzentration in NaCl und den Gehalt an Guanin und Cytosin (J.Sambrook et al., Molecular Cloning, 2^nd edition 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press, § 11.46) berücksichtigt, liegt bei etwa 30°C.
Nach der Rückkehr zu den Anfangsbedingungen (günstig für die Hybridisation) beobachtet man die folgenden Ergebnisse:
Man beobachtet, daß im Falle des einfaserigen Oligonukleotids K-ODN2 die Lebensdauer immer höher als im Falle von K-ODN2 in doppelfaseriger Form.
Im Falle von K-ODN2 in doppelfaseriger Form nimmt die Lebensdauer mit der Temperatur zu, wobei die beobachtete Lebensdauer die Resultante des Werts nahe bei 1,20 ms liegt, der für die einfaserige Form beobachtet wurde, und des Werts nahe bei 0,5 ms, der für das doppelfaserige beobachtet wurde (der Wert des Korrelationskoeffizienten gibt die Anwesenheit von zwei Gattungen an.
Nach einem Denaturierungszyklus erlaubt eine Rückkehr zu für die Hybridisation günstige Bedingungen die Beobachtung einer Abnahme der Dauer der doppelfaserigen Form.
BEISPIEL 6: MODIFIKATIONEN DER EMPFINDLICHKEIT GEGENÜBER EXTINKTION EINES KONJUGIERTEN CRYPTAT [TRISBIPYRIDIN(EU3+)]-OLIGONUKLEOTID IM LAUF EINER HYBRIDISATION
Man verwendet die Oligonukleotide K-ODN2 und ODN3, deren Strukturen und Synthesen in Beispiel 5 beschrieben sind.
Man stellt eine Mutterlösung des Konjugierten K-ODN2 her. Diese Mutterlösung wird in Puffer PBS mit 0,1 % BSA derart verdünnt, daß eine Lösung erhalten wird, die etwa 1,5.10^–8 M Cryptat enthält. Parallel dazu stellt man eine Mutterlösung des an seinem Komplement (ODN3) hybridisierten Konjugierten K-ODN2 her. Diese Mutterlösung wird in Puffer PBS mit 0,1 % BSA derart verdünnt, daß eine Lösung erhalten wird, die ebenfalls etwa 1,5.10^–8 M Cryptat enthält.
Man lagert 100 μl der verdünnten Lösung in den Mulden einer Mikrotitrationsplatte ab, in den zwei ersten Mulden fügt man 100 μl des Puffers hinzu, und in den folgenden Mulden lagert man 100 μl einer Harnsäureverdünnung in dem Puffer PBS ab, die derart hergestellt ist, daß die Endkonzentration an Harnsäure von einer Mulde zur anderen nach der folgenden Tabelle 6 um einen Faktor 2 zunimmt.
Man mißt die Fluoreszenzintensität der verschiedenen Mulden bei 620 nm bei Umgebungstemperatur (20°C) an einem Gerät Discovery (Messung in abgelaufener Zeit mit einem Fenster von 50 bis 400 μs). Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 6 eingetragen, und man berechnet die Extinktion bezüglich des Vergleichs, der keine Harnsäure enthält.
TABELLE 6
Dann inkubiert man die Platte während 15 min bei 60°C, und man führt sofort eine Messung der Fluoreszenzintensitäten bei 620 nm der verschiedenen Mulden bei der Temperatur von 60°C an einem Gerät Discovery durch (Messung in abgelaufener Zeit mit einem Fenster von 50 bis 400 μs). Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 7 eingetragen, und man berechnet die Extinktion bezüglich des Vergleichs, der keine Harnsäure enthält.
TABELLE 7
Diese Ergebnisse bestätigen, daß die Empfindlichkeit des Cryptats gegenüber dem Extinktionsphänomen für ein Konjugiertes Craptat-Oligonukleotid unterschiedlich ist, wenn dieses in zweifaseriger Form oder einfaseriger Form vorliegt. Die Harnsäure ist ein spezifisches Extinktionsmittel der zweifaserigen Form.
Man kann so das Hybridisationsphänomen durch Messung der Fluoreszenz in abgelaufener Zeit in Anwesenheit einer Verbindung verfolgen, die eine selektive Extinktion der hybridisierten Gattung erlaubt.
BEISPIEL 7: MODIFIKATION DER PHOTOPHYSIKALISCHEN EIGENSCHAFTEN IM LAUF DER HYDROLYSE VON ESTERFUNKTIONEN:
1) Herstellung des N-Hydroxysuccinimidesters:
Man verwendet einen N-Hydroxysuccinimidester, der den Vorteil aufweist, sich spontan in Wasser mit einem pH 7 mit einer ausreichend langsamen Geschwindigkeit zu hydrolysieren, um die Fluoreszenzmessungen zu erleichtern und auf einfache Weise einer kinetischen Verfolgung der photophysikalischen Eigenschaften zu erlauben.
Man verwendet ein Derivat Cryptat-[Trisbipyridin(Eu³⁺)]-Bis-Aminoethylcarboxamid (in Beispiel 1 KNH2 bezeichnetes Produkt), erhalten durch Aminolyse in Gegenwart von Ethylendiamin des Europiumcryptats[(Bis-Bipy)-(Bipy-Diethylester, beschrieben in dem Beispiel 4, Abschnitt A der Anmeldung EP 0 321 353 (Mathis G. und Lehn J.M.).
Man läßt dieses Cryptat an einem Überschuß von DSS reagieren (Ester Bis(N-Hydroxysuccimid der Suberinsäure, Sigma).
Das Derivat KNH2, das in HPLC durch einen Rt von 12,3 min charakterisiert ist, wird in Ester von NHS (K-Di(NHS-Suberat)] umgewandelt, der einen Rt von 17,2 min zeigt [Bedingungen HPLC analytisch Kolonne Lichrospher (Merck) RP-18 (5 μ) 125-4 Eluierung mit 1 ml/mn Lösungsmittel A: 1 % TFA in H₂O; Lösungsmittel B: reines Acetonitril. Gradient von 15 % B bei 32 % B in 30 min].
Das so erhaltene Cryptat, das zwei Ester-Funktionen [K-Di(NHS-Suberat)] trägt, wird durch vorbereitende HPLC an einer Kolonne Lichrospher (Merck) RP-18 (10 μ) 250-10 Eluierung mit 5 ml/mn gereinigt [Lösungsmittel A: 1 % TFA in H₂O; Lösungsmittel B: reines Acetonitril. Gradient von 15 % B bei 32 % B in 30 min]. Die den reinen Ester enthaltende Fraktion wird unter Vakuum verdampft, dann getrocknet, eine HPLC-Analyse (analytische Bedingungen oben) zeigt eine Retentionszeit von 17,2 min.
Auf analoge Weise stellt man den Ester von NHS [K-Mono-NHS-Suberat)], indem man von einem Derivat Cryptat-[Trisbipyridin(Eu³⁺)]Mono-Aminoethlcarboxamid ausgeht, das durch Aminolyse in Anwesenheit von Ethylendiamin des Europiumcryptats [(Bis-Bipy]-(Bipy-Monoethylester]] erhalten ist, das seinerseits durch teilweise Verseifung (NaOH wäßrig, dann Reinigung RP-HPLC) des Europiumcryptats[(Bis-Bipy)-(Bipy-Diethylester)] hergestellt ist, beschrieben in dem Beispiel 4, Abschnitt A der Anmeldung EP 0 321 353 .
Dieser Ester wird durch vorbereitende RP-HPLC gereinigt (Bedingungen oben), die den reinen Monoester enthaltende Fraktion (Rt ≅ 15,6 min) wird rasch unter Vakuum verdampft. Dieser Monoester wird zur Untersuchung der Fluoreszenzeigenschaften im Lauf der Hydrolyse verwendet.
Durch HPLC-Analyse in dem obigen Gradienten beobachtet man, daß sich der Diester in wäßriger Lösung oder in gepufferter Lösung pH 7 in ein einsäuriges Derivat mit Rt 16,0 min, dann in ein zweisäuriges Derivat mit Rt 14,8 min umwandelt. In Wasser beobachtet man eine Hydrolyse von mehr als 50 % in 3 h.
Durch HPLC-Analyse in dem obigen Gradienten beobachtet man, daß sich der Monoester mit Rt 15,6 Diester in wäßriger Lösung oder in gepufferter Lösung pH 7 in ein saures Derivat mit Rt 14,2 mit umwandelt. In Wasser beobachtet man eine Hydrolyse von mehr als 50 % in 3 h.
2) Modifikation der Fluoreszenzspektren im Lauf der Hydrolyse eines Esters von N-Hydroxysuccinimid von Cryptat-[Trisbipyridin(Eu³⁺)]:
Man zeichnet die Fluoreszenzemissionsspektren und die Fluoreszenzlebensdauer von Cryptat K-NHS-Suberat in wäßriger Lösung auf, indem eine Messung knapp nach der Verdünnung, dann nach 20 h durchgeführt wird. Unter den gleichen Bedingungen zeichnet man die Spektren einer Lösung von KNH2 auf, die als Referenz dient (Lösung mit äquivalenter Konzentration). Man überprüft, daß die Intensität der bei 620 nm dieser Referenz emittierten Fluoreszenz nicht um mehr als 2 % in 20 h variiert, und daß die Lebensdauer nicht modifiziert wird (Variation < 0,3 %). Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 7 aufgeführt.
TABELLE 7
Man beobachtet, daß im Lauf der Hydrolyse der Esterfunktion die photophysikalischen Eigenschaften wie die Emissionsintensität oder die Fluoreszenzlebensdauer modifiziert werden.

Claims

Homogenes Verfahren zur Detektion und/oder Bestimmung durch Fluoreszenz von einer chemischen oder physikochemischen Wechselwirkung in einem Meßmedium, in welchem man ein Seltenerdcryptat verwendet, daß einen Substituenten aufweist, dadurch gekennzeichnet, daß das Seltenerdcryptat der einzige verwendete Fluoreszenz-Tracer ist und dadurch, daß man die Variation eines Fluoreszenzmerkmals des Seltenerdcryptats mißt, das durch die Modifikation der physikochemischen Eigenschaften des Substituenten resultierend aus der Wechselwirkung induziert ist, wobei der Substituent eine Phosphat-, Phosphonat-, Carboxylatgruppe oder eines von ihren Derivaten ist oder ein chemisches oder ein biologisches Molekül, das diese Gruppe umfaßt, wobei das Molekül eine Nukleinsäure, ein Oligonukleotid oder ein Oligonukleotid ist, das aus Nukleotidanaloga besteht oder diese umfaßt, ein Nukleotid oder ein Nukleosid und deren Analoga mit der Bedingung, daß die Wechselwirkung keine Enzymreaktion ist, die katalysiert wird durch die terminale Nukleotidyltranferase, wenn das Seltenerdcryptat Europium-Tris-Bipyridincryptat ist und das Fluoreszenzmerkmal die Lebensdauer ist.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Modifikation die Solvatationsumgebung des Seltenerdions beeinflußt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Fluoreszenzmerkmal gewählt ist unter der Emissionslebensdauer, der Fluoreszenzintensität, der Verteilung der Strahlen im Fluoreszenz- und Polarisationsspektrum.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Variation eine Vergrößerung oder Verminderung der Emissionslebensdauer oder der Fluoreszenzintensität ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Wechselwirkung aus einer enzymatischen Reaktion resultiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Wechselwirkung in einer Hybridisierungs- oder Denaturierungsreaktion von Nuleotidensäuren, Oligonukleotiden oder Oligonuleotiden besteht, die aus Nukleotidanaloga bestehen oder diese umfassen, oder in einer Reaktion unter den Nukleinsäuren oder Oligonukleotiden mit Proteinen mit einer Affinität zu diesen besteht.
Verfahren nach einem Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Seltenerdcryptat kovalent an den Substituenten entweder direkt oder mittels eines Beabstandungsarmes gebunden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Seltenerdcryptat aus wenigstens einem Seltenerdsalz besteht, das komplexiert ist durch eine makropolyzyklische Verbindung mit einer Formel
in welcher Z ein Atom mit drei oder vier Valenzen ist, R nichts ist oder Wasserstoff repräsentiert, die Hydroxygruppe, eine Aminogruppe oder einen Kohlenwasserstoffrest darstellt, die bivalenten Reste
,
und
unabhängig voneinander Kohlenwasserstoffketten sind, die gegebenenfalls eines oder mehrere Heteroatome enthalten und gegebenenfalls unterbrochen sind durch einen Heteroaromatenring mit wenigstens einem der Reste
,
und
, umfassend wenigstens ein Molekülmotiv oder im wesentlichen bestehend aus einem Molekülmotiv, wobei das Molekülmotiv eine Triplettenergie über jener des Emissionsniveaus des komplexierten Seltenerdions aufweist.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Seltenerdcryptat besteht aus einem Seltenerdsalz, das komplexiert ist durch eine der nachfolgend genannten makrozyklischen oder makropolyzyklischen Verbindungen: (22)Phenanthrolin; (22)Phenanthrolinamid; (22)Anthracen; (22)Anthracenamid; (22)Biisoquinolein; (22)Bipheynyl-Bis-Pyridin; (22)Bipyridin; (22)Bipyridinamid; die Makropolyzyklen Tris-Bipyridin, Tris-Phenanthrolin, Phenanthrolin-Bis-Bipyridin, Biisoquinolein-Bis-Bipyridin, Bis-Bipyridin-Diphenylbipyridin; einer makropolyzyklischen Verbindung, die ein Molekülmotiv umfasst, das gewählt unter Bipyrazinen, Bipyrimidinen und den stickstoffhaltigen Heterozyklen, umfassend die N-Oxydgruppen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Seltenerdcryptat besteht aus wenigstens aus einem Seltenerdsalz, das komplexiert ist durch eine makropolyzyklische Verbindung, die einer der nachfolgenden Formeln II oder III entspricht:
in denen: – der Ring einer Formel
einer der folgenden Ringe ist:
– Y eine Gruppe oder ein Beabstandungsarm ist, welche (welcher) besteht aus einem organischem, bivalenten Rest, gewählt unter den linearen oder verzweigten C₁- bis C₂₀-Alkylengruppen, der gegebenenfalls eine oder mehrere Doppelbindungen enthält und/oder gegebenenfalls eins oder mehrere Heteroatome enthält wie Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel, Phosphor oder eine oder mehrere Carbamoyl- oder Carboxamidgruppen, unter den C₅- bis C₈-Zykloalkylengruppen oder unter den C₆- bis C₁₄- Arylengruppen, wobei die Alkylen-, Cykloalkylen- oder Arylengruppen gegebenenfalls substituiert sind durch Alkyl-, Aryl- oder Sulfonatgruppen; – Z eine funktionelle Gruppe ist, die geeignet ist, sich kovalent mit einer biologischen Substanz zu verbinden; – R eine Methylgruppe ist oder die Gruppe -Y-Z darstellt; – R' Wasserstoff oder eine -COOR"-Gruppe ist, in der R" eine C₁- bis C₁₀-Alkylgruppe ist und vorzugsweise die Methyl-, Ethyl- oder tert.-Butylgruppe darstellt oder auch R' eine Gruppe -CO-NH-Y-Z ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Seltenerdcryptat ein Europium-, Terbium-, Samarium-, Dysprosium- oder Neodymcryptat ist.
Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß das Seltenerdcryptat das Europiumcryptat Eu-Tris-Pyridin oder Eu[Bis-Diethoxy-Bipyridin.Bipyridin] ist.