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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neuartiges Verfahren
für die
Herstellung eines neuartigen Verabreichungssystems mit auf Lipiden beruhenden
Cochleaten, die von dem Verabreichungssystem mit auf Lipiden beruhenden
Cochleaten abgeleiteten pharmazeutischen Zubereitungen, und die
Verwendung dieser pharmazeutischen Zubereitungen, um eine effiziente
systemische oder über die
Schleimhäute
erfolgende Verabreichung biologisch aktiver Moleküle zu erzielen.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Die
Fähigkeit
von biologisch aktiven Molekülen,
oral verabreicht werden zu können,
hängt von mehreren
Faktoren ab. Das biologisch aktive Molekül muss in den Flüssigkeiten
des Magen-Darm-Trakts löslich
sein, damit das biologisch aktive Molekül für einen aktiven Transportmechanismus
durch biologische Membranen transportiert werden kann, oder eine
geeignete kleine Teilchengröße aufweisen,
die durch die Peyer-Plaques im Dünndarm
und durch das lymphatische System aufgenommen werden kann. Die Teilchengröße ist ein
wichtiger Parameter, wenn orale Verabreichung erreicht werden soll
(siehe Couvreur P. et al., Adv. Drug Delivery Reviews 10: 141–162, 1993).
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Das
Hauptproblem bei der Möglichkeit,
Arzneimittel oral zu verabreichen, ist der Schutz des Arzneimittels
vor proteolytischen Enzymen. Ein idealer Ansatz ist es, das Arzneimittel
in ein hydrophobes Material einzubauen, so dass die wässrigen
Flüssigkeiten
nicht das System eindringen können.
Auf Lipiden beruhende Cochleate sind ein ideales System, das diesen
Zweck erreichen kann.
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Die
Vorteile von Cochleaten sind zahlreich. Die Cochleate haben eine
nichtwässrige
Struktur und folglich:
- a) sind sie beständiger auf
Grund geringerer Oxidation von Lipiden;
- b) können
sie in lyophilisierter Form gelagert werden, was die Möglichkeit
bietet, sie für
lange Zeiträume
bei Raumtemperatur zu lagern, was vorteilhaft wäre für den weltweiten Transport
und die Lagerung vor der Verabreichung;
- c) behalten sie ihre Struktur sogar nach Lyophilisierung, während die
Strukturen von Liposomen durch Lyophilisierung zerstört werden;
- d) zeigen sie effizienten Einbau von biologisch aktiven Molekülen in die
Lipid-Doppelschicht der Cochleatstruktur;
- e) bieten sie die Möglichkeit,
ein biologisch aktives Molekül
in vivo langsam freizusetzen, in dem Maße, in dem die Cochleate sich
auflösen;
- f) weisen sie eine Lipid-Doppelschicht auf, die als Träger dient
und aus einfachen Lipiden zusammengesetzt ist, die in Membranen
von Tier- und Pflanzenzellen gefunden werden, so dass die Lipide
nicht giftig sind;
- g) können
sie leicht und sicher produziert werden;
- h) können
sie als definierte Formulierungen hergestellt werden, die aus vorgegebenen
Mengen und Verhältnissen
von Wirkstoffen oder Antigenen zusammengesetzt sind.
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Cochleat-Strukturen
sind zuerst von D. Papahadjopoulos als ein Zwischenprodukt bei der
Herstellung von großen
unilamellaren Vesikeln hergestellt worden (siehe
US 4 078 052 ). Die Verwendung von
Cochleaten für
die Verabreichung von Protein- oder Peptidmolekülen für Impfstoffe ist in
US 5 840 707 offenbart worden.
Jedoch spricht keines dieser Patente die Bedeutung der Teilchengröße oder
die wirkungsvolle orale Verabreichung von biologisch aktiven Molekülen an,
die durch kleine Cochleate vermittelt wird.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Dementsprechend
ist es ein Gegenstand dieser Erfindung, ein Verfahren zur Herstellung
eines in einem Hydrogel isolierten Cochleats mit einer Teilchengröße von kleiner
als ein Mikron zur Verfügung zu
stellen. Das Verfahren enthält
weiterhin die Schritte, die erforderlich sind, um mindestens ein
biologisch aktives Molekül
in einer therapeutisch wirksamen Menge in den in einem Hydrogel
isolierten Cochleaten einzuschließen.
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Ein „biologisch
aktives Molekül" ist ein Molekül, das eine
Rolle in den Lebensprozessen eines lebenden Organismus spielt. Das
Molekül
kann organisch oder anorganisch sein, ein Monomer oder ein Polymer
sein, endogen in einem Wirtsorganismus vorkommen oder nicht, natürlich vorkommen
oder in vitro synthetisiert sein, und dergleichen mehr. So schließen Beispiele
Vitamine, Mineralien, Aminosäuren,
Toxine, Mikrobizide, Mikroorganismenwachstum verhindernde Mittel,
Cofaktoren, Enzyme, Polypeptide, Polypeptidaggregate, Polynukleotide,
Lipide, Kohlenhydrate, Nukleotide, Stärken, Pigmente, Fettsäuren, Hormone,
Cytokine, Viren, Organellen, Steroide und andere polyzyklische Strukturen, Zucker bzw.
Saccharide, Metalle, Stoffwechselgifte, Wirkstoffe und dergleichen
mit ein.
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Diese
und andere Gegenstände
sind erhalten worden, indem man ein in einem Cochleat eingeschlossenes
biologisch aktives Molekül
zur Verfügung
stellte, worin das Cochleat des biologisch aktiven Moleküls die folgenden
Bestandteile enthält:
- a) ein biologisch aktives Molekül,
- b) ein negativ geladenes Lipid, und
- c) eine kationische Komponente,
wobei die Teilchengröße des in
dem Cochleat eingeschlossenen biologisch aktiven Moleküls kleiner
als ein Mikron ist und worin außerdem
das biologisch aktive Molekül
vorzugsweise ein Wirkstoff ist.
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Die
vorliegende Erfindung stellt außerdem ein
Verfahren zur oralen Verabreichung einer biologisch wirksamen Menge
des oben beschriebenen Cochleats an einen Wirt zur Verfügung.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird das Cochleat des biologisch aktiven Moleküls oral verabreicht.
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KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
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1.
Schema des Verfahrens, durch das die in einem Hydrogel isolierten
Cochleate mit oder ohne Wirkstoff erhalten werden.
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2a und 2b.
Teilchengrößenverteilung (Gewichtsanalyse)
von in einem Hydrogel isolierten Cochleaten, entweder mit Amphotericin
B (AmB) beladen (2a) oder leer (2b), wie durch Laserlichtstreuung gemessen.
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3a und 3b.
Durch ein Mikroskop aufgenommene Bilder einer Mischung von Liposomen
in Dextran, die in der Lösung
eines PEG-Gels dispergiert wurden. Die kleinen schwarzen Punkte
sind Dextranpartikel, die durch die Dispergierung der Dextranphase
in der PEG-Phase gebildet wurden. Die großen offenen Kreise werden durch
Verschmelzung kleiner Dextranpartikel gebildet. Die Verteilung der
Liposomen bevorzugt die Dextranphase, wie durch die gelbe Farbe
von AmB angezeigt wird. 3b. Durch ein Mikroskop
aufgenommene Bilder der in 3a gezeigten
Probe nach Behandlung mit einer Lösung von CaCl2.
Die schwarzen Objekte in den Kreisen, die durch einen Pfeil markiert
sind, sind Cochleate, die durch die Zugabe von Ca2+-Ionen
gebildet werden.
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4a–4f. Durch ein Mikroskop aufgenommene Bilder
der in 3a und 3b gezeigten
Probe nach dem Waschen mit einem Puffer, der 1 mM CaCl2 und
100 mM NaCl enthält.
Die Cochleat-Partikel bilden Aggregate. 4b.
Die in 4a gezeigte Suspension nach
der Zugabe von EDTA. Die Cochleat-Partikel öffneten sich zu Liposomen mit
einem Durchmesser von 1–2
Mikrometer und zeigten dadurch an, dass die tatsächliche Größe der Cochleat-Partikel weniger
als 1 Mikrometer beträgt. 4c. Mit Zink entsprechend dem in Beispiel
4 beschriebenen Verfahren ausgefällte
mit AmB beladene in einem Hydrogel isolierte Cochleate. 4d. Die in 4c dargestellten
Cochleate nach Behandlung mit EDTA. 4e. Leere
in einem Hydrogel isolierte Cochleate, ausgefällt mit Zink entsprechend dem
in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren. 4f)
Die in 4f dargestellten Cochleate nach
Behandlung mit EDTA.
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5.
Mikrographen von in einem Hydrogel isolierten Cochleaten nach Gefrierbruch.
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6.
Hemmung des Wachstums von Candida albicans durch mit AmB beladene
in einem Hydrogel isolierte Cochleate bei 0,625 μg AmB/ml. Es wird mit AmB in
DMSO und in AmBisome® verglichen.
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7.
Effekt von in einem Hydrogel isolierten Cochleaten auf die Entwicklungsfähigkeit
von Candida albicans nach 30 Stunden.
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8.
Wirksamkeit von Amphotericin B enthaltenden Cochleaten und von Makrophagenkulturen.
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9.
Konzentrationen von Amphotericin B im Gewebe nach Verabreichung
von Amphotericin B enthaltenden Cochleaten.
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10. Änderung
der Konzentration von AmB über
die Zeit im Gewebe nach einmaliger Verabreichung von mit AmB beladenen
in einem Hydrogel isolierten Cochleaten.
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11.
Konzentration von AmB im Gewebe 24 Stunden nach Behandlung durch
einmalige Gabe und 24 Stunden nach Behandlung durch mehrmalige Gabe.
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12.
Wechselbeziehung zwischen der Konzentration von Amphotericin B im
Gewebe und der Konzentration von Candida albicans nach Verabreichung
von Amphotericin B enthaltenden Cochleaten.
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AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung liefert eine Lösung dafür, eine wirkungsvolle orale
Verabreichung von Arzneimitteln zu erreichen, indem man mit einem neuen
Verfahren kleine Cochleate herstellt. Der neue Ansatz beruht auf
der Unverträglichkeit
zweier Polymerlösungen,
die beide wässrige
Polymerlösungen sind.
Wässrige
zweiphasige Systeme von Polymeren werden häufig für die Reinigung von Proteinen
eingesetzt, auf Grund einer Anzahl von Vorteilen wie Freiheit von
der Notwendigkeit des Einsatzes organischer Lösungsmittel, geringe Oberflächenspannung und
der Biokompatibilität
von wässrigen
Polymeren (siehe P. A. Albertsson „Verteilung von Zellpartikeln und
Makromolekülen" (Partition of cell
particles and macromolecules), 3. Ausgabe, Wiley NY 1986; und „Trennung
unter Einsatz eines Systems mit wässriger Phase" (Separation using
aqueous Phase System) D. Fisher Eds, Plenum NY, 1989). Es zum Beispiel bekannt,
dass große
polare Moleküle
wie beispielsweise Proteine sich in einer viel höheren Konzentration in einer
Polymerphase mit physikalischen Eigenschaften, die denen von Dextran ähnlich sind,
ansammeln als in einer Polymerphase mit physikalischen Eigenschaften,
die denen von PEG ähnlich sind
(D. Forciniti, C. K. Hall, M. R. Kula, Biotechnol. Bioeng. 38, 986,
1991).
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung werden Verfahren zur Verfügung gestellt für die Herstellung kleiner,
auf Lipiden beruhender Cochleat-Partikel und daraus hergestellter
Zubereitungen, die ein in den Partikeln eingebautes biologisch aktives
Molekül
enthalten. Die Cochleat-Partikel sind aus einer alternierenden Reihenfolge
von Lipid-Doppelschichten und Kationen aufgebaut. Das biologisch
aktive Molekül
ist entweder in den Lipid-Doppelschichten oder im Zwischenraum zwischen
den Lipid-Doppelschichten enthalten. Eines der Verfahren zur Herstellung
der kleinen Cochleate umfasst: 1) Herstellung einer Suspension von
kleinen unilamellaren Liposomen oder mit biologisch aktiven Molekülen beladenen
Liposomen, 2) Mischen der Suspension der Liposomen mit Polymer A,
3) Zugabe, vorzugsweise durch Einspritzen, der Suspension von Liposomen
in Polymer A zu einem anderen Polymer B, mit dem Polymer A nicht mischbar
ist, wodurch ein wässriges
zweiphasiges System von Polymeren erhalten wird, 4) Zugabe einer
Lösung
eines Kationen enthaltenden Salzes zu dem zweiphasigen System aus
Schritt 3, so dass das Kation in das Polymer B und dann in die Partikel
diffundiert, die aus Liposom und Polymer A bestehen, was die Bildung
kleiner Cochleate erlaubt, 5) Auswaschen der Polymeren und Resuspendieren
der leeren oder mit Wirkstoff beladenen Cochleate in einem physiologischen
Puffer oder in irgendeinem geeigneten pharmazeutischen Vehikel.
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Ein
zweites Verfahren zur Herstellung der kleinen Cochleate schließt ein Tensid
und ein biologisch aktives Molekül
und ein Kation ein. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
- a) Bereitstellen einer wässrigen Suspension, die eine
Mischung von Tensid und Lipid enthält;
- b) Mischen der Suspension von Tensid und Lipid mit Polymer A;
- c) Zugabe der Suspension aus Tensid und Lipid und Polymer A
zu einer Polymer B enthaltenden Lösung, wobei Polymer A und Polymer
B nicht mischbar sind, wodurch ein zweiphasiges Polymersystem erzeugt
wird;
- d) Hinzufügen
einer Lösung
einer kationischen Spezies zu dem zweiphasigen Polymersystem; und
- e) Waschen des zweiphasigen Polymersystems, um das Polymer zu
entfernen.
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Ein
Verfahren zur Lyophilisierung kann angewendet werden und der Komplex
aus lyophilisiertem biologisch aktiven Molekül und Cochleat kann in weiche
oder harte Gelatinekapseln, Tabletten oder andere Dosierungsformen
gefüllt
werden, für
eine systemische Verabreichung, eine Verabreichung über die Haut
oder über
die Schleimhäute.
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Dieses
Verfahren führt
zu einen kleinen Partikel mit einer engen Größenverteilung, das eine effektive
orale Verabreichung von biologisch aktiven Molekülen erlaubt. Das biologisch
aktive Molekül
verteilt sich in einer oder in beiden Lipid-Doppelschicht(en) und
im Zwischenraum und das biologisch aktive Molekül wird aus den Cochleat-Partikeln
durch Dissoziation der Partikel in vivo freigesetzt. Alternative
Wege der Verabreichung können
systemische Wege sein wie beispielsweise intramuskuläre, subkutane
oder intravenöse Verabreichung
oder Wege über
die Schleimhäute
wie beispielsweise intranasale, intraokulare, intravaginale, intraanale,
parenterale oder intrapulmonäre
Verabreichung. Geeignete Dosierungen können z. B. durch Dosis-Wirkungs-Experimente an Labortieren
oder in klinischen Versuchen ermittelt werden, wobei das Körpergewicht
des Patienten, die Absorptionsrate, die Halbwertzeit, die Schwere
der Krankheit und dergleichen mehr in Betracht zu ziehen sind. Die
Anzahl der Dosen, die tägliche
Dosis und der Behandlungsverlauf können von Individuum zu Individuum
unterschiedlich sein. Andere Wege der Verabreichung können dermale,
transdermale oder intradermale Verabreichung sein.
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Der
erste Schritt des neuen Verfahrens der vorliegenden Erfindung, die
Herstellung von kleinen Liposomen, kann durch Standardmethoden wie
Ultraschallbehandlung oder Mikrofluidisierung oder andere verwandte
Verfahren erfolgen (siehe zum Beispiel „Liposomentechnologie, Liposomenherstellung und
verwandte Techniken" (Liposome
Technology, Liposome Preparation and Related Techniques), herausgegeben
von Gregory Gregoriadis, Vol. I, 2. Ausgabe, CRC Press, 1993).
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Die
Zugabe, vorzugsweise durch Einspritzen, der Suspension von Polymer
A/Liposom zu Polymer B kann mechanisch erreicht werden durch das Verwenden
einer Spritzenpumpe mit einer geeigneten kontrollierten Dosierrate,
z. B. einer Rate von 0,1 ml/min bis 50 ml/min und vorzugsweise mit
einer Rate von 1 bis 10 ml/min.
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Die
Lipide der vorliegenden Erfindung sind ungiftige Lipide und umfassen,
ohne darauf beschränkt
zu sein, einfache Lipide, die in Membranen von Tier- und Pflanzenzellen
gefunden werden. Vorzugsweise ist das Lipid ein negativ geladenes
Lipid, besonders bevorzugt ein negativ geladenes Phospholipid und
ganz besonders bevorzugt ein Lipid aus der Gruppe von Phosphatidylserin,
Phosphatidylinositol, Phosphatidylsäure und Phosphatidylglycerin. Die
Lipide können
auch kleine Mengen zwitterionischer Lipide, kationischer Lipide
oder neutraler Lipide enthalten, die zur Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen
zu einem biologisch aktiven Molekül wie beispielsweise einem
pegyliertem Lipid fähig sind.
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Die
Polymere A und B der vorliegenden Erfindung können irgendeiner Klasse von
biokompatiblen Polymeren angehören,
die ein wässriges
zweiphasiges System bilden können.
Zum Beispiel kann Polymer A, ohne darauf beschränkt zu sein, Dextran 200.000–500.000,
Polyethylenglykol (PEG) 3.400– 8.000
sein; Polymer B kann, ohne darauf beschränkt zu sein, Polyvinylpyrrolidon
(PVP), Polyvinylalkohol (PVA), Ficoll 30.000–50.000, Polyvinylmethylether (PVMB)
60.000–160.000,
PEG 3.400–8.000
sein. Die Konzentration von Polymer A kann von 2–20 Gew.-% als Endkonzentration
betragen, abhängig
von den Eigenschaften des Polymers. Der gleiche Konzentrationsbereich
kann auf Polymer B angewendet werden. Beispiele geeigneter zweiphasiger
Systeme sind Dextran/PEG, 5–20
Gew.-% Dextran 200.000–500.000
in 4–10
Gew.-% PEG 3.400–8.000; Dextran/PVP
10–20
Gew.-% Dextran 200.000–500.000
in 10–20
Gew.-% PVP 10.000–20.000;
Dextran/PVA 3–15
Gew.-% Dextran 200.000–500.000
in 3–15
Gew.-% PVA 10.000–60.000;
Dextran/Ficoll 10–20
Gew.-% Dextran 200.000–500.000
in 10–20
Gew.-% Ficoll 30.000–50.000;
PEG/PVME 2–10
Gew.-% PEG 3,500–35.000
in 6–15
Gew.-% PVME 60.000–160.000.
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Das
biologisch aktive Molekül
kann ein organisches Molekül
sein, das in wässrigem
Medium hydrophob ist. Das biologisch aktive Molekül kann ein Wirkstoff
sein, und der Wirkstoff kann ein antiviraler Wirkstoff, ein Anästhetikum,
ein antiinfektiver Wirkstoff, ein antimykotischer Wirkstoff, ein
Krebs bekämpfender
Wirkstoff, ein Immunosuppressivum, ein steroidaler entzündungshemmender
Wirkstoff, ein nicht steroidaler entzündungshemmender Wirkstoff, ein
Beruhigungsmittel oder ein gefäßerweiterndes Mittel
sein. Beispiele schließen
Amphotericin B, Acyclovir, Adriamycin, Cabamazepin, Melphalan, Nifedipin,
Indomethacin, Naproxen, Östroge ne,
Testosterone, Steroide, Phenytoin, Ergotamine, Cannabinoide, Rapamycin,
Propanidid, Propofol, Alphadion, Echinomycin, Miconazolnitrat, Teniposid,
Taxol und Taxoter ein.
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Das
biologisch aktive Molekül
kann ein Polypeptid sein wie beispielsweise Cyclosporin, die Angiotensine
I, II und III, die Enkephaline und ihre Analoga, ACTH, die entzündungshemmenden
Peptide I, II, III, Bradykinin, Calcitonin, b-Endorphin, Dinorphin, Leukokinin,
das Luteinisierungshormon freisetzende Hormon (LHRH), Insulin, die
Neurokinine, Somatostatin, die Substanz P, das Thyreotropin-Releasinghormon
(TRH) und Vasopressin.
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Das
biologisch aktive Molekül
kann ein Antigen sein, aber das Antigen ist nicht auf Proteinantigene
beschränkt.
Das Antigen kann auch ein Kohlenhydrat oder ein Polynukleotid wie
DNA sein. Beispiele für
Antigenproteine schließen
Glucoproteine der Hülle
von Influenza- oder Sendaiviren, Membranproteine von Tierzellen,
Membranproteine von Pflanzenzellen, Membranproteine von Bakterien
und Membranproteine von Parasiten ein.
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Das
biologisch aktive Molekül
wird aus den als Quelle dienenden Partikeln, Zellen, Geweben oder
Organismen durch bekannte Methoden extrahiert. Die biologische Aktivität der biologisch
aktiven Moleküle
braucht nicht aufrechterhalten zu werden. Jedoch ist es in einigen
Fällen
(z. B. wenn ein Protein eine Membranen verschmelzende oder Liganden bindende
Aktivität
zeigt oder ein komplexe Konformation aufweist, die vom Immunsystem
erkannt wird) wünschenswert,
die biologische Aktivität
aufrecht zu erhalten. In diesen Fällen wird ein Extraktionspuffer verwendet,
der ein Tensid enthält,
das die biologische Aktivität
des Membranproteins nicht zerstört.
Geeignete Tenside schließen
ionische Tenside wie beispielsweise Cholatsalze, Desoxycholatsalze
und dergleichen oder heterogene Polyoxyethylentenside wie Tween,
BRIG oder Triton mit ein.
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Die
Anwendung dieses Verfahrens erlaubt die Rekonstitution von Antigenen,
genauer gesagt Proteinen, in die Liposomen unter Erhalt der biologischen
Aktivitäten
und schließlich
die effiziente Verbindung mit den Cochleaten. Dies vermeidet organische
Lösungsmittel,
Ultraschallbehandlungen oder extreme pH-Werte, Temperaturen oder
Drücke,
die alle eine schädliche
Auswirkung auf eine effiziente Rekonstitution des Antigens in einer
biologisch aktiven Form haben können.
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In
einem Hydrogel isolierte Cochleate können eine Kombination von verschiedenen
biologisch aktiven Molekülen
enthalten, soweit erforderlich.
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Die
Bildung von kleinen Cochleaten (mit einem biologisch aktiven Molekül oder ohne
ein biologisch aktives Molekül)
wird erreicht, indem man ein positiv geladenes Molekül der wässrigen
zweiphasigen Polymerlösung
hinzufügt,
die Liposomen enthält. Im
oben genannten Verfahren zur Herstellung von Cochleaten kann das
positiv geladene Molekül
ein mehrwertiges Kation und insbesondere jedes zweiwertige Kation
sein, das die Bildung von Cochleaten verursachen kann. In einer
bevorzugten Ausführungsform
umfassen die zweiwertigen Kationen Ca+++,
Zn+++, Ba++ und
Mg++ oder andere Elemente, die fähig sind
zur Bildung zweiwertiger Ionen oder anderer Strukturen, welche mehrere
positive Ladungen aufweisen und dazu fähig sind, negativ geladene
Lipide zu chelatisieren und zu überbrücken. Die
Zugabe von positiv geladenen Molekülen zu Liposomen enthaltenen
Lösungen
wird auch benutzt, um Cochleate aus der wässrigen Lösung auszufällen.
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Um
die Cochleat-Strukturen zu isolieren und die Polymerlösung zu
entfernen, werden die Cochleat-Niederschläge wiederholt mit einem Puffer
gewaschen, der ein positiv geladenes Molekül und besonders bevorzugt ein
zweiwertiges Kation enthält.
Die Zugabe eines positiv geladenen Moleküls zu dem Waschpuffer stellt
sicher, dass die Cochleat-Strukturen während des Waschschrittes erhalten
bleiben, und dass sie als Niederschläge erhalten bleiben.
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Das
Medium, in dem die Cochleate suspendiert werden, kann Salze wie
beispielsweise Calciumchlorid, Zinkchlorid, Cobaltchlorid, Natriumchlorid, Natriumsulfat,
Kaliumsulfat, Ammoniumsulfat, Magnesiumsulfat und Natriumcarbonat
enthalten. Das Medium kann Polymere wie beispielsweise Tween 80 oder
BRIG oder Triton enthalten. Das biologisch aktive Moleküle enthaltende
Cochleat wird hergestellt, indem man in einen geeigneten biologisch
annehmbaren Träger
verdünnt
(z. B. einen zweiwertige Kationen enthaltenden Puffer).
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Die
Cochleat-Partikel können
darmgängig bzw.
enterisch sein. Die Cochleat-Partikel können in Gelatinekapseln eingebracht
werden und die Kapsel kann mit einem gegen Magensaft resistenten Überzug versehen
werden.
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In
den Zubereitungen der vorliegenden Erfindung können bestimmte hydrophobe Materialien
hinzugefügt
werden, um verbesserte Absorptionseigenschaften für die orale
Verabreichung von biologisch aktiven Molekülen zur Verfügung zu
stellen. Diese Materialien werden vorzugsweise aus der Gruppe ausgewählt, die
aus langkettigen Carbonsäuren, langkettigen
Carbonsäureestern,
langkettigen Carbonsäurealkoholen
und Mischungen davon besteht. Die hydrophoben Materialien können entweder
am Anfang dem Lipid vor der Bildung der Liposomen zugegeben werden
oder in einem späteren
Schritt in Form eines Fettvehikels wie beispielsweise einer Emulsion.
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Der
Fachmann kann die wirksamsten und therapeutisch sinnvollsten Mittel
für die
Durchführung einer
Behandlung im Rahmen der Ausführung
der vorliegenden Erfindung ermitteln. Es kann auch auf eine der
zahlreichen Autoritäten
und Nachschlagewerke verwiesen werden, einschließlich z. B. „Goodman & Gillman's, Die pharmazeutischen
Grundlagen der Therapeutik" (The
Pharmaceutical Basis for Therapeutics), (6. Ausgabe, Goodman et
al. (Hrsg.), MacMillan Publ. Co., New York, 1980).
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Die
Erfindung wird nun durch Beispiele beschrieben werden, die nicht
als die Erfindung beschränkend
aufgefasst werden sollen. In den Beispielen beziehen sich, falls
es nicht anders angegeben ist, alle Verhältnisse, Prozente und Mengen
auf das Gewicht.
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BEISPIELE
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Beispiel 1. Herstellung von leeren, in
einem Hydrogel isolierten Cochleaten aus Dioleoylphosphatidylserin, ausgefällt mit
Calcium
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Schritt 1: Herstellung von kleinen unilamellaren
Vesikeln aus Dioleoylphosphatidylserin.
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Eine
Lösung
von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS, Avanti Polar Lipids, Alabaster,
AL, USA) in Chloroform (10 mg/ml) wurde in einen Rundkolben gefüllt und
mit einem Büchi
Rotationsverdampfer bei 35 °C
zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer wurde sterilisiert,
indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter geflasht wurde. Die
folgenden Schritte wurden in einem sterilen Abzug durchgeführt. Der
getrocknete Lipidfilm wurde mit entionisiertem Wasser bei einer
Konzentration von 10 mg Lipid/ml hydratisiert. Die hydratisierte
Suspension wurde mit Stickstoff gespült und versiegelt, dann in
einem gekühlten
Ultraschallbad (Laboratory Supplies Com., Inc.) mit Ultraschall
behandelt. Die Ultraschallbehandlung wurde fortgesetzt (einige Sekunden
lang bis einige Minuten lang, abhängig von der Menge und der
Art des Lipids) bis die Suspension klar wurde (Suspension A) und
unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 1000X Vergrößerung keine
Liposomen augenscheinlich erkennbar waren. Laserlichtstreuung (Gewichtsanalyse,
Coulter N4 Plus) zeigt an, dass der mittlere Durchmesser 35,7 ± 49,7
nm beträgt.
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Schritt 2: Herstellung von in einem Hydrogel
isolierten Cochleaten
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Die
in Schritt 1 erhaltene Suspension von Liposomen wurde dann mit 40
Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen
Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde
dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt
[PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um
die Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit betrug 800–1000 U/min.
Eine Lösung
von CaCl2 (100 mM) wurde der Suspension zugegeben,
um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
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Das
Rühren
wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer,
der 1 mM CaCl2 und 150 mM NaCl enthielt,
der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben.
Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 3000
U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war,
wurde zusätzlicher Waschpuffer
in einem Volumenverhältnis
von 0,5 : 1 hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugierung unter den gleichen
Bedingungen. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung
von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das
resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration
rekonstituiert. Laserlichtstreuung (Gewichtsanalyse, Coulter N4
Plus) zeigt an, dass der mittlere Durchmesser des Cochleats 407,2 ± 85 nm beträgt (2b).
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Beispiel 2. Herstellung von leeren in
einem Hydrogel isolierten Cochleaten aus einer Mischung aus Dioleoylphosphatidylserin
und 1,2-Distearoyl-sn-glycerin-3-phosphoethanolamin-n-(poly(ethylenglykol)-5000,
DSPE-PEG), ausgefällt
mit Calcium
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Schritt 1: Herstellung von kleinen unilamellaren
Vesikeln.
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Eine
Lösung
von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) und 1,2-Distearoyl-sn-glycerin-3-phosphoethanolamin-n-(poly(ethylenglykol)-5000),
(DSPE-PEG, Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL, USA) in Chloroform
(Gewichtsverhältnis
von DOPS : DSPS-PEG = 100 : 1) wurde in einen Rundkolben gefüllt und
mit einem Büchi
Rotationsverdampfer bei 35 °C
zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer wurde sterilisiert,
indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter geflasht wurde. Die
folgenden Schritte wurden in einem sterilen Abzug durchgeführt. Der
getrocknete Lipidfilm wurde mit entionisiertem Wasser bei einer
Konzentration von 10 mg Lipid/ml hydratisiert. Die hydratisierte
Suspension wurde mit Stickstoff gespült und versiegelt, dann in
einem gekühlten Ultraschallbad
(Laboratory Supplies Com., Inc.) mit Ultraschall behandelt. Die
Ultraschallbehandlung wurde fortgesetzt (einige Sekunden lang bis
einige Minuten lang, abhängig
von der Menge und der Art des Lipids) bis die Suspension klar wurde
(Suspension A) und unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 1000X
Vergrößerung keine
Liposomen augenscheinlich erkennbar waren.
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Schritt 2: Herstellung von in einem Hydrogel
isolierten Cochleaten
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Die
in Schritt 1 erhaltene Suspension von Liposomen wurde dann mit 40
Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen
Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde
dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt
[PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um die
Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit
betrug 800–1000
U/min. Eine Lösung
von CaCl2 (100 mM) wurde der Suspension zugegeben,
um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
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Das
Rühren
wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer,
der 1 mM CaCl2 und 150 mM NaCl enthielt,
der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben.
Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 3000
U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war,
wurde zusätzlicher Waschpuffer
in einem Volumenverhältnis
von 0,5 : 1 hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugierung unter den gleichen
Bedingungen. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung
von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das
resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration
rekonstituiert. Phasenkontrast-Lichtmikroskopie
zeigt die Bildung von einheitlichen, sehr kleinen, nadelartigen
Cochleaten.
-
Beispiel 3. Herstellung von leeren, in
einem Hydrogel isolierten Cochleaten aus einer Mischung von Dioleoylphosphatidylserin
und n-Octyl-beta-D-glucopyranosid, ausgefällt mit Calcium
-
Schritt 1: Herstellung von kleinen, unilamellaren
Vesikeln.
-
Eine
Lösung
von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) in Chloroform wurde in einen
Rundkolben gefüllt
und mit einem Büchi
Rotationsverdampfer bei 35 °C
zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer wurde sterilisiert,
indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter geflasht wurde. Die
folgenden Schritte wurden in einem sterilen Abzug durchgeführt. Der
getrocknete Lipidfilm wurde mit einer Lösung von n-Octyl-beta-D-glucopyranosid
(OCG) bei 1 mg/ml und bei einem Gewichtsverhältnis von DOPS : OCG von 10
: 1 hydratisiert. Die hydratisierte Suspension wurde mit Stickstoff
gespült und
versiegelt, dann kurz in einem gekühlten Ultraschallbad mit Ultraschall
behandelt.
-
Schritt 2: Herstellung von in einem Hydrogel
isolierten Cochleaten
-
Die
in Schritt 1 erhaltene Suspension von Liposomen wurde dann mit 40
Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen
Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde
dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt
[PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um
die Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit betrug 800–1000 U/min.
Eine Lösung
von CaCl2 (100 mM) wurde der Suspension zugegeben,
um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
-
Das
Rühren
wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer,
der 1 mM CaCl2 und 150 mM NaCl enthielt,
der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben.
Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 3000
U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war,
wurde zusätzlicher Waschpuffer
in einem Volumenverhältnis
von 0,5 : 1 hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugierung unter den gleichen
Bedingungen. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung
von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das
resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration
rekonstituiert. Phasenkontrast-Lichtmikroskopie
zeigt die Bildung von einheitlichen, sehr kleinen, nadelartigen
Cochleaten.
-
Beispiel 4. Herstellung von mit Amphotericin
B beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten, ausgefällt mit
Calcium
-
Schritt 1: Herstellung von kleinen, unilamellaren,
mit AmB beladenen Vesikeln aus Dioleoylphosphatidylserin.
-
Eine
Mischung von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) in Chloroform (10
mg/ml) und AmB in Methanol (0,5 mg/ml) in einem molaren Verhältnis von 10
: 1 wurde in einen Rundkolben gefüllt und mit einem Büchi Rotationsverdampfer
bei 40 °C
zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer wurde sterilisiert,
indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter geflasht wurde. Die
folgenden Schritte wurden in einem sterilen Abzug durchgeführt. Der
getrocknete Lipidfilm wurde mit entionisiertem Wasser bei einer Konzentration
von 10 mg Lipid/ml hydratisiert. Die hydratisierte Suspension wurde
mit Stickstoff gespült und
versiegelt, dann in einem gekühlten
Ultraschallbad mit Ultraschall behandelt. Die Ultraschallbehandlung
wurde fortgesetzt (einige Sekunden lang bis einige Minuten lang,
abhängig
von der Menge und der Art des Lipids) bis die Suspension klar und
gelb wurde (Suspension A) und unter einem Phasenkontrastmikroskop
bei 1000X Vergrößerung keine
Liposomen augenscheinlich erkennbar waren.
-
Schritt 2: Herstellung von mit AmB beladenen,
in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
-
Die
in Schritt 1 erhaltene Suspension von Liposomen wurde dann mit 40
Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen
Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde
dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt
[PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um
die Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit betrug 800–1000 U/min.
Eine Lösung
von CaCl2 (100 mM) wurde der Suspension zugegeben,
um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
-
Das
Rühren
wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer,
der 1 mM CaCl2 und 150 mM NaCl enthielt,
der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben.
Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 3000
U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war,
wurde zusätzlicher Waschpuffer
in einem Volumenverhältnis
von 0,5 : 1 hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugierung unter den gleichen
Bedingungen. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung
von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das
resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration
rekonstituiert. Laserlichtstreuung (Gewichtsanalyse, Coulter N4
Plus) zeigt an, dass der mittlere Durchmesser der mit AmB beladenen
Cochleate 407,3 ± 233,8
nm betrug (2a).
-
Beispiel 5. Herstellung von mit Doxorubicin
(DXR) beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten, ausgefällt mit
Calcium
-
Schritt 1: Herstellung von kleinen, unilamellaren,
mit DXR beladenen Vesikeln aus Dioleoylphosphatidylserin.
-
Eine
Mischung von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) in Chloroform (10
mg/ml) und (DXR) in Methanol (0,5 mg/ml) in einem molaren Verhältnis von
10 : 1 wurde in einen Rundkolben gefüllt und mit einem Büchi Rotationsverdampfer
bei Raumtemperatur zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer
wurde sterilisiert, indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter
geflasht wurde. Die folgenden Schritte wurden in einem sterilen
Abzug durchgeführt.
Der getrocknete Lipidfilm wurde mit entionisiertem Wasser bei einer
Konzentration von 25 mg Lipid/ml hydratisiert. Die hydratisierte
Suspension wurde mit Stickstoff gespült und versiegelt, dann in
einem gekühlten
Ultraschallbad mit Ultraschall behandelt. Die Ultraschallbehandlung
wurde fortgesetzt (einige Sekunden lang bis einige Minuten lang,
abhängig
von der Menge und der Art des Lipids) bis die Suspension klar und
rosa wurde (Suspension A) und unter einem Phasenkontrastmikroskop
bei 1000X Vergrößerung keine
Liposomen augenscheinlich erkennbar waren.
-
Schritt 2: Herstellung von mit DXR beladenen,
in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
-
5
ml der in Schritt 1 erhaltenen Suspension von Liposomen wurden dann
mit 40 Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2
Volumenteilen Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese
Mischung wurde dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma)
eingespritzt [PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um
die Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit betrug 800–1000 U/min.
Eine Lösung
von CaCl2 (100 mM) wurde der Suspension zugegeben,
um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
-
Das
Rühren
wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer,
der 1 mM CaCl2 und 150 mM NaCl enthielt,
der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben.
Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 6400
U/min zentrifugiert. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung
von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das
resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration
rekonstituiert. Laserlichtstreuung (Gewichtsanalyse, Coulter N4
Plus) bestätigte
die Bildung von kleinen, mit DXR beladenen Cochleaten.
-
Beispiel 6. Herstellung von mit Cyclosporin
A (CSPA) beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten, ausgefällt mit
Calcium
-
Schritt 1: Herstellung von kleinen, unilamellaren,
mit CSPA beladenen Vesikeln aus Dioleoylphosphatidylserin.
-
Eine
Mischung von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) in Chloroform (10
mg/ml) und CSPA in Methanol (0,5 mg/ml) in einem molaren Verhältnis von
10 : 1 wurde in einen Rundkolben gefüllt und mit einem Büchi Rotationsverdampfer
bei Raumtemperatur zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer
wurde sterilisiert, indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter
geflasht wurde. Die folgenden Schritte wurden in einem sterilen
Abzug durchgeführt.
Der getrocknete Lipidfilm wurde mit entionisiertem Wasser bei einer
Konzentration von 10 mg Lipid/ml hydratisiert. Die hydratisierte
Suspension wurde mit Stickstoff gespült und versiegelt, dann in
einem gekühlten
Ultraschallbad mit Ultraschall behandelt. Die Ultraschallbehandlung
wurde fortgesetzt (einige Sekunden lang bis einige Minuten lang,
abhängig
von der Menge und der Art des Lipids) bis die Suspension klar wurde
(Suspension A) und unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 1000X
Vergrößerung keine
Liposomen augenscheinlich erkennbar waren.
-
Schritt 2: Herstellung von mit CSPA beladenen,
in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
-
Die
in Schritt 1 erhaltene Suspension von Liposomen wurde dann mit 40
Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen
Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde
dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt
[PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um
die Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit betrug 800–1000 U/min.
Eine Lösung
von CaCl2 (100 mM) wurde der Suspension zugegeben,
um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
-
Das
Rühren
wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer,
der 1 mM CaCl2 und 150 mM NaCl enthielt,
der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben.
Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 3000
U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war,
wurde zusätzlicher Waschpuffer
in einem Volumenverhältnis
von 0,5 : 1 hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugierung unter den gleichen
Bedingungen. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung
von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das
resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration
rekonstituiert. Laserlichtstreuung (Gewichtsanalyse, Coulter N4
Plus) bestätigte
die Bildung von kleinen, mit CSPA beladenen Cochleaten.
-
Beispiel 7. Herstellung von mit Nelfinavir
(NVIR) beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten, ausgefällt mit
Calcium
-
Schritt 1: Herstellung von kleinen, unilamellaren,
mit NVIR beladenen Vesikeln aus Dioleoylphosphatidylserin.
-
Eine
Mischung von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) in Chloroform (10
mg/ml) und NVIR in Methanol (0,5 mg/ml) in einem molaren Verhältnis von
10 : 1 wurde in einen Rundkolben gefüllt und mit einem Büchi Rotationsverdampfer
bei Raumtemperatur zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer
wurde sterilisiert, indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter
geflasht wurde. Die folgenden Schritte wurden in einem sterilen
Abzug durchgeführt.
Der getrocknete Lipidfilm wurde mit entionisiertem Wasser bei einer
Konzentration von 10 mg Lipid/ml hydratisiert. Die hydratisierte
Suspension wurde mit Stickstoff gespült und versiegelt, dann in
einem gekühlten
Ultraschallbad mit Ultraschall behandelt. Die Ul traschallbehandlung
wurde fortgesetzt (einige Sekunden lang bis einige Minuten lang,
abhängig
von der Menge und der Art des Lipids) bis die Suspension klar wurde
(Suspension A) und unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 1000X
Vergrößerung keine
Liposomen augenscheinlich erkennbar waren.
-
Schritt 2: Herstellung von mit NVIR beladenen,
in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
-
Die
in Schritt 1 erhaltene Suspension von Liposomen wurde dann mit 40
Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen
Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde
dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt
[PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um
die Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit betrug 800–1000 U/min.
Eine Lösung
von CaCl2 (100 mM) wurde der Suspension zugegeben,
um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
-
Das
Rühren
wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer,
der 1 mM CaCl2 und 150 mM NaCl enthielt,
der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben.
Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 3000
U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war,
wurde zusätzlicher Waschpuffer
in einem Volumenverhältnis
von 0,5 : 1 hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugierung unter den gleichen
Bedingungen. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung
von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das
resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration
rekonstituiert. Laserlichtstreuung (Gewichtsanalyse, Coulter N4
Plus) bestätigte
die Bildung von kleinen, mit NVIR beladenen Cochleaten.
-
Beispiel B. Herstellung von mit Rifampin
(RIF) beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten, ausgefällt mit
Calcium
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Schritt 1: Herstellung von kleinen, unilamellaren,
mit RIF beladenen Vesikeln aus Dioleoylphosphatidylserin.
-
Eine
Mischung von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) in Chloroform (10
mg/ml) und RIF in Methanol (0,5 mg/ml) in einem molaren Verhältnis von 10
: 1 wurde in einen Rundkolben gefüllt und mit einem Büchi Rotationsverdampfer
bei Raumtemperatur zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer
wurde sterilisiert, indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter
geflasht wurde. Die folgenden Schritte wurden in einem sterilen
Abzug durchgeführt.
Der getrocknete Lipidfilm wurde mit entionisiertem Wasser bei einer
Konzentration von 10 mg Lipid/ml hydratisiert. Die hydratisierte
Suspension wurde mit Stickstoff gespült und versiegelt, dann in
einem gekühlten Ultraschallbad
mit Ultraschall behandelt. Die Ultraschallbehandlung wurde fortgesetzt
(einige Sekunden lang bis einige Minuten lang, abhängig von
der Menge und der Art des Lipids) bis die Suspension klar wurde
(Suspension A) und unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 1000X
Vergrößerung keine
Liposomen augenscheinlich erkennbar waren.
-
Schritt 2: Herstellung von mit RIF beladenen,
in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
-
Die
in Schritt 1 erhaltene Suspension von Liposomen wurde dann mit 40
Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen
Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde
dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt
[PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um
die Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit betrug 800–1000 U/min.
Eine Lösung
von CaCl2 (100 mM) wurde der Suspension zugegeben,
um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
-
Das
Rühren
wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer,
der 1 mM CaCl2 und 150 mM NaCl enthielt,
der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben.
Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 3000
U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war,
wurde zusätzlicher Waschpuffer
in einem Volumenverhältnis
von 0,5 : 1 hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugierung unter den gleichen
Bedingungen. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung
von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das
resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration
rekonstituiert. Laserlichtstreuung (Gewichtsanalyse, Coulter N4
Plus) bestätigte
die Bildung von kleinen, mit RIF beladenen Cochleaten.
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Beispiel 9. Herstellung von mit Vitamin
A beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten, ausgefällt mit
Calcium
-
Schritt 1: Herstellung von kleinen, unilamellaren,
mit Vitamin A beladenen Vesikeln aus Dioleoylphosphatidylserin.
-
Vitamin
A (Retinol) ist empfindlich gegenüber Oxidation durch Luft und
wird durch UV-Licht deaktiviert. Vitamin A ist geschützt, wenn
es in Lipid-Doppelschichten eingebettet ist. Der Einbau wird wie
folgt erreicht:
Eine Mischung von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS)
in Chloroform (10 mg/ml) und Vitamin A in Methanol (0,5 mg/ml) in
einem molaren Verhältnis von
10 : 1 wurde in einen Rundkolben gefüllt und mit einem Büchi Rotationsverdampfer
bei Raumtemperatur zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer
wurde sterilisiert, indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter
geflasht wurde. Die folgenden Schritte wurden in einem sterilen
Abzug durchgeführt.
Der getrocknete Lipidfilm wurde mit entionisiertem Wasser bei einer
Konzentration von 10 mg Lipid/ml hydratisiert. Die hydratisierte Suspension
wurde mit Stickstoff gespült
und versiegelt, dann in einem gekühlten Ultraschallbad mit Ultraschall
behandelt. Die Ultraschallbehandlung wurde fortgesetzt (einige Sekunden
lang bis einige Minuten lang, abhängig von der Menge und der
Art des Lipids) bis die Suspension klar wurde (Suspension A) und
unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 1000X Vergrößerung keine
Liposomen augenscheinlich erkennbar waren.
-
Schritt 2: Herstellung von mit Vitamin
A beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
-
Die
in Schritt 1 erhaltene Suspension von Liposomen wurde dann mit 40
Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen
Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde
dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt
[PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um
die Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit betrug 800–1000 U/min.
Eine Lösung
von CaCl2 (100 mM) wurde der Suspension zugegeben,
um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
-
Das
Rühren
wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer,
der 1 mM CaCl2 und 150 mM NaCl enthielt,
der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben.
Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 3000
U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war,
wurde zusätzlicher Waschpuffer
in einem Volumenverhältnis
von 0,5 : 1 hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugierung unter den gleichen
Bedingungen. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung
von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das
resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration
rekonstituiert.
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Beispiel 10. Herstellung von mit mehrfach
ungesättigten
Fettsäuren
(polyunsaturated fatty acid, PFA) beladenen, in einem Hydrogel isolierten
Cochleaten, ausgefällt
mit Calcium
-
Mehrfach
ungesättigte
Fettsäuren
(PFA) sind biologisch aktive Moleküle, die an der Steuerung des Cholesteringehalts
im Blut beteiligt sind und die Vorstufen der Prostaglandine sind.
PFA sind für
Oxidation anfällig,
weshalb sie nur in begrenztem Umfang in die Nahrung eingebracht
werden können.
PFA durchlaufen in Gegenwart von Sauerstoff eine Reihe von Reaktionen,
die Autoxidation genannt werden und zu Aldehyden und dann zu Ketonen
führen,
die einen fischartigen unangenehmen Geruch und Geschmack haben.
Die Einbettung von PFA in steife, eingerollte Lipid-Doppelschichten
hilft, die Autoxidationskaskade zu verhindern. Ein allgemeines Verfahren
zur Herstellung von mit PFA beladenen Cochleaten ist das folgende:
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Schritt 1: Herstellung von kleinen, unilamellaren,
mit PFA beladenen Vesikeln aus Dioleoylphosphatidylserin.
-
Eine
Mischung von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) in Chloroform (10
mg/ml) und PFA in Methanol (0,5 mg/ml) in einem molaren Verhältnis von 10
: 1 wurde in einen Rundkolben gefüllt und mit einem Büchi Rotationsverdampfer
bei Raumtemperatur zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer
wurde sterilisiert, indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter
geflasht wurde. Die folgenden Schritte wurden in einem sterilen
Abzug durchgeführt.
Der getrocknete Lipidfilm wurde mit entionisiertem Wasser bei einer
Konzentration von 10 mg Lipid/ml hydratisiert. Die hydratisierte
Suspension wurde mit Stickstoff gespült und versiegelt, dann in
einem gekühlten Ultraschallbad
mit Ultraschall behandelt. Die Ultraschallbehandlung wurde fortgesetzt
(einige Sekunden lang bis einige Minuten lang, abhängig von
der Menge und der Art des Lipids) bis die Suspension klar wurde
(Suspension A) und unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 1000X
Vergrößerung keine
Liposomen augenscheinlich erkennbar waren.
-
Schritt 2: Herstellung von mit PFA beladenen,
in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
-
Die
in Schritt 1 erhaltene Suspension von Liposomen wurde dann mit 40
Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen
Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde
dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt
[PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um
die Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit betrug 800–1000 U/min.
Eine Lösung
von CaCl2 (100 mM) wurde der Suspension zugegeben,
um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
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Das
Rühren
wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer,
der 1 mM CaCl2 und 150 mM NaCl enthielt,
der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben.
Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 3000
U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war,
wurde zusätzlicher Waschpuffer
in einem Volumenverhältnis
von 0,5 : 1 hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugierung unter den gleichen
Bedingungen. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung
von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das
resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration
rekonstituiert.
-
Beispiel 11. Herstellung von mit Zimtöl (CinO)
beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten, ausgefällt mit
Calcium
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Schritt 1: Herstellung von kleinen, unilamellaren,
mit CinO beladenen Vesikeln aus Dioleoylphosphatidylserin.
-
Eine
Mischung von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) in Chloroform (10
mg/ml) und CinO in Methanol (0,5 mg/ml) in einem molaren Verhältnis von 10
: 1 wurde in einen Rundkolben gefüllt und mit einem Büchi Rotationsverdampfer
bei 40 °C
zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer wurde sterilisiert,
indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter geflasht wurde. Die
folgenden Schritte wurden in einem sterilen Abzug durchgeführt. Der
getrocknete Lipidfilm wurde mit entionisiertem Wasser bei einer Konzentration
von 10 mg Lipid/ml hydratisiert. Die hydratisierte Suspension wurde
mit Stickstoff gespült und
versiegelt, dann in einem gekühlten
Ultraschallbad mit Ultraschall behandelt. Die Ultraschallbehandlung
wurde fortgesetzt (einige Sekunden lang bis einige Minuten lang,
abhängig
von der Menge und der Art des Lipids) bis die Suspension klar wurde
(Suspension A) und unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 1000X
Vergrößerung keine
Liposomen augenscheinlich erkennbar waren.
-
Schritt 2: Herstellung von mit CinO beladenen,
in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
-
Die
in Schritt 1 erhaltene Suspension von Liposomen wurde dann mit 40
Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen
Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde
dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt
[PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um
die Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit betrug 800–1000 U/min.
Eine Lösung
von CaCl2 (100 mM) wurde der Suspension zugegeben,
um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
-
Das
Rühren
wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer,
der 1 mM CaCl2 und 150 mM NaCl enthielt,
der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben.
Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 3000
U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war,
wurde zusätzlicher Waschpuffer
in einem Volumenverhältnis
von 0,5 : 1 hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugierung unter den gleichen
Bedingungen. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung
von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das
resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration
rekonstituiert.
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Beispiel 12. Herstellung von mit DNA beladenen,
in einem Hydrogel isolierten Cochleaten, ausgefällt mit Calcium
-
Schritt 1: Herstellung von kleinen, unilamellaren,
mit DNA beladenen Vesikeln aus Dioleoylphosphatidylserin.
-
Eine
Lösung
von Dioleoylphosphatidylserin in Chloroform (10 mg/ml) wurde in
einen Rundkolben gefüllt
und mit einem Büchi
Rotationsverdampfer bei Raumtemperatur zu einem Film getrocknet.
Der Rotationsverdampfer wurde sterilisiert, indem Stickstoffgas
durch ein 0,2 μm
Filter geflasht wurde. Die folgenden Schritte wurden in einem sterilen
Abzug durchgeführt.
Der getrocknete Lipidfilm wurde mit einer Lösung von pCMV-beta-gal-DNA
in TE Puffer (in einer Konzentration von 1 mg/ml) hydratisiert,
um eine Konzentration von DOPS : DNA von 10 : 1 und eine Konzentration
von 10 mg Lipid/ml einzustellen. Die hydratisierte Suspension wurde
mit Stickstoff gespült
und versiegelt und dann einige Minuten lang gevortext.
-
Schritt 2: Herstellung von mit DNA beladenen,
in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
-
Die
Mischung aus DNA und Liposomen wurde dann mit 40 Gew.-% Dextran
500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen Dextran
auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde dann
mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt [PEG 8000/(Suspension
A)], unter Rühren
mit einem Magnetrührer, um
die Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit betrug 800–1000 U/min.
Eine Lösung
von CaCl2 (100 mM) wurde der Suspension
zugegeben, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
-
Das
Rühren
wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer,
der 1 mM CaCl2 und 150 mM NaCl enthielt,
der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben.
Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 3000
U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war,
wurde zusätzlicher Waschpuffer
in einem Volumenverhältnis
von 5 : 1 hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugierung unter den gleichen
Bedingungen. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung
von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das
resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration
rekonstituiert.
-
Beispiel 13. Herstellung von leeren, in
einem Hydrogel isolierten Cochleaten, ausgefällt mit Zink
-
Schritt 1: Herstellung von kleinen, unilamellaren
Vesikeln aus Dioleoylphosphatidylserin.
-
Eine
Lösung
von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) in Chloroform (10 mg/ml) wurde
in einen Rundkolben gefüllt
und mit einem Büchi
Rotationsverdampfer bei 35 °C
zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer wurde sterilisiert,
indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter geflasht wurde. Die folgenden
Schritte wurden in einem sterilen Abzug durchge führt. Der getrocknete Lipidfilm
wurde mit entionisiertem Wasser bei einer Konzentration von 10 mg
Lipid/ml hydratisiert. Die hydratisierte Suspension wurde mit Stickstoff
gespült
und versiegelt, dann in einem gekühlten Ultraschallbad mit Ultraschall
behandelt. Die Ultraschallbehandlung wurde fortgesetzt (einige Sekunden
lang bis einige Minuten lang, abhängig von der Menge und der
Art des Lipids) bis die Suspension klar wurde (Suspension A) und
unter einem Phasenkontrastmikroskop bei 1000X Vergrößerung keine
Liposomen augenscheinlich erkennbar waren.
-
Schritt 2: Herstellung von in einem Hydrogel
isolierten Cochleaten
-
Die
in Schritt 1 erhaltene Suspension von Liposomen wurde dann mit 40
Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen
Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde
dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt
[PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um
die Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit betrug 800–1000 U/min.
Eine Lösung
von ZnCl2 (100 mM) wurde der Suspension zugegeben,
um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
-
Das
Rühren
wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer,
der 1 mM ZnCl2 und 150 mM NaCl enthielt,
der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben.
Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 3000
U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war,
wurde zusätzlicher Waschpuffer
in einem Volumenverhältnis
von 0,5 : 1 hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugierung unter den gleichen
Bedingungen. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung
von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das
resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration
rekonstituiert. Laserlichtstreuung (Gewichtsanalyse, Coulter N4
Plus) bestätigte
die Bildung von kleinen Cochleaten.
-
Beispiel 14. Herstellung von mit Amphotericin
B beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleaten, ausgefällt mit
Zink
-
Schritt 1: Herstellung von kleinen, unilamellaren,
mit AmB beladenen Vesikeln aus Dioleoylphosphatidylserin.
-
Eine
Mischung von Dioleoylphosphatidylserin (DOPS) in Chloroform (10
mg/ml) und AmB in Methanol (0,5 mg/ml) in einem molaren Verhältnis von 10
: 1 wurde in einen Rundkolben gefüllt und mit einem Büchi Rotationsverdampfer
bei 40 °C
zu einem Film getrocknet. Der Rotationsverdampfer wurde sterilisiert,
indem Stickstoffgas durch ein 0,2 μm Filter geflasht wurde. Die
folgenden Schritte wurden in einem sterilen Abzug durchgeführt. Der
getrocknete Lipidfilm wurde mit entionisiertem Wasser bei einer Konzentration
von 10 mg Lipid/ml hydratisiert. Die hydratisierte Suspension wurde
mit Stickstoff gespült und
versiegelt, dann in einem gekühlten
Ultraschallbad mit Ultraschall behandelt. Die Ultraschallbehandlung
wurde fortgesetzt (einige Sekunden lang bis einige Minuten lang,
abhängig
von der Menge und der Art des Lipids) bis die Suspension klar und
gelb wurde (Suspension A) und unter einem Phasenkontrastmikroskop
bei 1000X Vergrößerung keine
Liposomen augenscheinlich erkennbar waren.
-
Schritt 2: Herstellung von mit AmB beladenen,
in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
-
Die
in Schritt 1 erhaltene Suspension von Liposomen wurde dann mit 40
Gew.-% Dextran 500.000 (Sigma) in einer Suspension von 2 Volumenteilen
Dextran auf 1 Volumenteil Liposomen gemischt. Diese Mischung wurde
dann mit einer Spritze in 15 Gew.-% PEG-8.000 (Sigma) eingespritzt
[PEG 8000/(Suspension A)], unter Rühren mit einem Magnetrührer, um die
Suspension B zu ergeben. Die Rührgeschwindigkeit
betrug 800–1000
U/min. Eine Lösung
von ZnCl2 (100 mM) wurde der Suspension zugegeben,
um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten.
-
Das
Rühren
wurde eine Stunde lang fortgesetzt, dann wurde ein Waschpuffer,
der 1 mM ZnCl2 und 150 mM NaCl enthielt,
der Suspension B in einem Volumenverhältnis von 1 : 1 hinzugegeben.
Die Suspension wurde gevortext und 30 Minuten lang bei 2–4 °C bei 3000
U/min zentrifugiert. Nachdem der Überstand entfernt worden war,
wurde zusätzlicher Waschpuffer
in einem Volumenverhältnis
von 0,5 : 1 hinzugegeben, gefolgt von Zentrifugierung unter den gleichen
Bedingungen. Ein Schema dieses neuen Verfahrens zur Herstellung
von Cochleaten ist in 1 detailliert dargestellt. Das
resultierende Pellet wurde mit dem gleichen Puffer auf die gewünschte Konzentration
rekonstituiert. Laserlichtstreuung (Gewichtsanalyse, Coulter N4
Plus) bestätigte
die Bildung von kleinen, mit AmB beladenen Zn-Cochleaten.
-
Beispiel 15. Mikroskopische Untersuchung
von in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
-
Eine
lichtmikroskopische Untersuchung wurde stufenweise allein mit dem
Herstellverfahren durchgeführt,
um einige mechanistische Details der Bildung der in einem Hydrogel
isolierten Cochleate zu erhalten.
-
Die
durch ein Mikroskop aufgenommenen Bilder, die man in 3a, b und 4a–f sehen
kann, zeigen die morphologischen Veränderungen in jedem Herstellschritt
der mit AmB beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleate, die
mit Ca2+ Ionen ausgefällt werden. Als die Mischung
aus AmB, Liposomen und Dextran in der PEG-Lösung dispergiert wurde, trat
als Ergebnis eine Phasentrennung auf, wie in 3a gezeigt.
Die Verteilung der Liposomen erfolgte bevorzugt in die dispergierte
Dextranphase, was durch eine von AmB herrührende gelbe Farbe angezeigt
wird. Diese Verteilung stellt sicher, dass Liposomen in jedem der
Dextranpartikel isoliert sind. Die Zugabe von Calciumionen zu der
kontinuierlichen Phase (PEG) führte
zur Bildung von Niederschlägen
in der dispersen Phase. Als Endprodukt wurden kleine, nadelförmige Cochleate
gebildet und unter dem Mikroskop untersucht. Diese Cochleate öffneten
sich bei Zugabe von EDTA und Chelatisierung durch das Calcium zu
unilamellaren Vesikeln (4a, b). Die
nadelförmige
Morphologie wurde durch Rasterelektronenmikroskopie nach Gefrierbruch
bestätigt
(5). Ähnliche
durch ein Mikroskop aufgenommene Bilder wurden erhalten für leere, in
einem Hydrogel isolierte Cochleate und mit AmB beladene, in einem
Hydrogel isolierte Cochleate, die durch Zn ausgefällt worden
waren (4c, d) und für leere,
in einem Hydrogel isolierte Cochleate, die durch Zn ausgefällt worden
waren (4e, f).
-
Beispiel 16. Antimykotische Aktivität von in
einem Hydrogel isolierten Cochleaten, die mit Amphotericin B beladen
sind, in vitro
-
Hemmung des Wachstums von
Candida albicans
-
Eine
in vitro Untersuchung der Anfälligkeit von
Hefen wurde durchgeführt,
die die wachstumshemmenden und lethalen Effekte von mit AmB beladenen
Cochleaten, AmBisomen (liposomale Formulierung von AmB) und AmB
in DMSO vergleicht. Fünf Kolonien
von frisch wachsenden Candida albicans wurden aus einer YPD Agarplatte
(aus einer 48 Stunden Kultur) ausgewählt und zu 2 ml 2 × YPD Broth, pH
5,7 hinzugegeben. Die OD590 dieser Vorratskultur wurde
gemessen und die Dichte der Hefezellen wurde auf OD590 =
0,1 eingestellt und 0,1 ml dieser Suspension wurde in jede Vertiefung
einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben.
-
Mit
AmB beladene Cochleate, AmB in DMSO und AmBisomen wurden Mikrotiterplatten
mit 96 Vertiefungen zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,078,
0,156, 0,3125, 0,625, 1,25 und 2,5 μg/ml AmB einzustellen. Die Mikrotiterplatten
mit 96 Vertiefungen wurden unter vorsichtigem Schütteln bei
37 °C inkubiert
und die Zelldichte wurde nach 0, 2, 4, 6, 24 und 30 Stunden mit
einem Reader für
Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Molecular Devices Spectramax
340) gemessen. 6 zeigt, dass mit AmB beladene
Cochleate einen stärkeren
wachstumshemmenden Effekt als AmBisomen (liposomale Formulierung
von AmB) haben.
-
Fungizider Effekt von in einem Hydrogel
isolierten Cochleaten, die mit Amphotericin B beladen wurden.
-
Aliquoten
von Hefezellen (50 μl)
wurden aus den Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen entnommen und
es wurde eine Verdünnungsreihe
(bis 1 : 10.000 für
das Auftragen auf Agarplatten) davon hergestellt und die Zellen
wurden mit einer Neubauer-Zählkammer
gezählt.
Fünfzig μl der verdünnten Hefezellen wurden
auf YPD Agarplatten aufgetragen und 24 Stunden lang bei 37 °C inkubiert.
Die Hefekolonien wurden mit einem BioRad Fluor-S Multi-Imager gezählt, der
mit Quanitity OneTM Software ausgerüstet war.
-
Mit
AmBisome, AmB in DMSO und mit AmB beladenen Cochleaten (0,625 μg AmB/ml)
behandelte Hefezellen wurden auf das Verhältnis der Kolonien bildenden
Einheiten zur Gesamtzahl der Zellen nach 30 Stunden Inkubation untersucht.
Die Ergebnisse zeigen, dass die mit AmB beladenen Cochleate die größte lethale
Wirkung auf die Hefezellen hatten, verglichen mit den anderen untersuchten
antimykotischen Mitteln. Die Entwicklungsfähigkeit der Hefe nach Behandlung
mit den mit AmB beladenen Cochleaten war annähernd 0 % und die Entwicklungsfähigkeit
der Hefe nach Behandlung mit AmB in DMSO betrug 12 Das AmBisom war
nicht so wirkungsvoll, mit einem Ergebnis von 52 Entwicklungsfähigkeit
der Hefe (7).
-
Schutz von Makrophagen durch mit AmB beladene Cochleate.
-
Teilchen
fressende Zellen wie beispielsweise Makrophagen, sind die erste
Verteidigungslinie gegen viele Infektionen durch Mikroben. Jedoch
ist gezeigt worden, dass viele Mikroben, die schwere klinische Infektionen
beim Menschen verursachen, Makrophagen infizieren und die Zerstörung vermeiden.
-
Es
ist möglich,
dass in vivo die Makrophagen eine wichtige Rolle bei der Aufnahme
von Cochleaten spielen, über
einen Mechanismus in der Zelle. Da die Makrophagen auch eine wichtige
Rolle bei der Verteidigung des Wirts und der Beseitigung von Pilzen
und Parasiten spielen, ist es wichtig, die Wechselwirkung zwischen
Makrophagen und Cochleaten zu untersuchen.
-
Die
folgenden Beispiele zeigen, dass die Cochleate durch Makrophagen
aufgenommen werden. Es wurde gefunden, dass den Makrophagen zugeführte hohe
Dosen von AmB ungiftig waren und in einer biologisch aktiven Form
in den Makrophagen verblieben. Mit AmB beladene Cochleate schützten die
Makrophagen gegen eine Infektion durch Candida albicans, wenn sie
vor oder nach der Pilzinfektion appliziert wurden.
-
Behandlung
durch prophylaktische Gabe: J774A.1 Makrophagen (M) wurden auf einer
Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen in einer Nebenkultur weitergezüchtet bei
einer Konzentration von 1 × 105 Zellen/ml in DMEM + 10 FBS. 100 μl mit AmB
beladene Cochleate (AmBc 0,2, 0,6, 1,25 und 2,5 μg AmB/ml), Fungizon, oder leere
Cochleate (EC in einer Konzentration von 2, 6, 12,5 und 25 μg Lipid/ml) wurden
in der angegebenen Konzentration hinzugefügt. Die Platten wurden über Nacht
bei 37 °C
und 5 % CO2 inkubiert. 24 Stunden später wurde
das Medium ersetzt. Dieser Schritt wurde zweimal durchgeführt. Candida
albicans (CA) wurde der Platte in einer Konzentration von 2,5 × 103 Zellen/ml hinzugefügt, ein Verhältnis von
1 : 200 in Bezug auf die Makrophagen. Die Platten wurden über Nacht
unter den oben angegebenen Bedingungen inkubiert.
-
Im
Anschluss an die 24 Stunden dauernde Inkubation wurden die Platten
entfernt und untersucht. Das Medium wurde energisch abpipettiert,
um die Zellen zu entfernen und zu zerstören, 25 μl dieser Suspension wurden auf
Sabouraud Dextrose Agarplatten aufgebracht und dann über Nacht
bei 37 °C
in einem trockenen Inkubator gelagert. Am folgenden Tag wurden die
koloniebildenden Einheiten („Colony Forming
Unit”,
CFU) von C. albicans gezählt.
Die Daten in 8 weisen darauf hin, dass Makrophagen, die
mit mit AmB beladenen Cochleaten beladen wurden, sehr wirkungsvoll
die Pilzzellen töten.
-
Behandlung
durch Gabe nach einer Infektion: J774A.1 Makrophagen (M) wurden
auf einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen in einer Nebenkultur weitergezüchtet und
dann über
Nacht inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Makrophagen mit
CA in einem Verhältnis
von 200 : 1 infiziert, dann wurde anschließend AmBc, Fungizon oder EC
in den angegebenen Konzentrationen hinzugefügt. Vierundzwanzig Stunden
später
wurden die Zellkulturen untersucht und die CFUs wurden bestimmt
wie oben beschrieben.
-
Wenn
M mit CA belastet wurden und anschließend die mit AmB beladenen
Cochleaten zugesetzt wurden, war die Anzahl der CFUs wieder annähernd null.
Diese Ergebnisse zeigen, dass Makrophagen mit AmB beladene Cochleate
verschlingen und konzentrieren, da die Makrophagen gegen die Belastung
durch C. albicans geschützt
waren, nachdem das mit AmB beladene Cochleat abgewaschen worden
war (8).
-
Im
Gegensatz dazu war Fungizon, (AmB in Desoxycholat), die am weitesten
verbreitete klinische Form von AmB, in vitro extrem giftig und lethal
für die Makrophagen.
Innerhalb von 5 Stunden nach der Applikation wurde in der Petrischale
ei ne große
Menge zellularer Rückstande
gefunden, und es gab keine Anzeichen von entwicklungsfähigen Makrophagen.
-
Die
mikroskopische Untersuchung zeigt, dass die mit AmB beladenen Cochleate
auch bei den höchsten
untersuchten Dosierungen für
die Makrophagen ungiftig sind. Die mit AmB beladenen Cochleate werden
in großem
Umfang akkumuliert, was große
gedehnte Vakuolen zur Folge hat. Nach Waschen der Makrophagen und
erneuter 24 Stunden langer Inkubation hatten die meisten Vakuolen
wieder ihre normale Form und Größe, aber
einige waren merklich vergrößert. Es
wurde sogar beachtet, dass einige Makrophagen sich mit den vergrößerten Vakuolen „bewegten". Mit AmB beladene
Cochleate werden innerhalb der Vakuolen konzentriert und es ist wahrscheinlich,
dass AmB über
die Zeit allmählich freigegeben
wird.
-
Beispiel 17: Auswertung der Gewebepenetration
von AmB nach iv Verabreichung von mit Amphotericin B beladenen,
in einem Hydrogel isolierten Cochleaten
-
Die
Gewebepenetration von Amphotericin B ist nach iv Verabreichung ausgewertet
worden. Gruppen (n = 5) von C57BL/6 Mäusen (20–23 g) wurden iv (0,625 mg/kg)
mit AmB beladene Cochleate (0,05 ml/20 g) gegeben, mit einer ½ cc U 100
Insulinspritze mit einer Nadel der Größe 18 g ½. Zu vorgegebenen Opferzeiten
(2, 5, 10, 20 und 40 Minuten, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 12, 24, 36 und 48
Stunden), wurde den Tieren Anästhesie
verabreicht, es wurde durch Punktion des Herzens Blut entnommen,
dann wurden sie getötet, seziert
und die interessierenden Gewebe wurden entfernt (Gehirn, Lunge,
Leber, Milz, Nieren, Herz, Fett, Magen, Mageninhalt, Darm und Darminhalt) und
gewogen. Für
die Analyse auf AmB wurden die Proben mit einem Extraktionslösungsmittel
gemischt (10 % Methanol, 35 % Wasser, 55 Ethanol), homogenisiert,
mit Ultraschall behandelt und zentrifugiert. Ein 90 μl Aliquot
des Überstands
wurde in ein Microvial überführt und
eingespritzt in das HPLC-System in eine bei 40 °C gehaltene Nova-Pak C-18 Säule (3,9 × 150 mm,
4 μm Teilchengröße). Am photericin
B wurde mit einer Strömungsgeschwindigkeit
von 0,5 ml/min mit 29 % Methanol, 30 % Acetonitril und 41 % 2,5
mM EDTA eluiert und bei 408 nm detektiert. Die Konzentration von
AmB wurde mit Hilfe einer Eichkurve eines externen Standards errechnet.
-
In 9 ist
die Gewebeexposition nach einer einzigen iv Gabe von mit AmB beladenen
Cochleaten gezeigt. Es kann eine hohe Durchdringung von Schlüsselgeweben
wie Leber, Milz und Nieren beobachtet werden.
-
Beispiel 18: Orale Verabreichung von AmB,
vermittelt durch mit AmB beladene in einem Hydrogel isolierte Cochleate.
-
Behandlung durch einmalige
Gabe
-
Die
orale Verfügbarkeit
der mit AmB beladenen, in einem Hydrogel isolierten Cochleate ist
untersucht worden durch Verabreichung der Formulierung des Beispiels
2 in den Magen von über
Nacht fastenden C57BL16 Mäusen
(20–23
g). Ein Zehntel ml der Formulierung in einer Dosis von 10 mg/kg
wurde 9 Mäusen
verabreicht. Drei Mäuse
aus jeder Gruppe wurden 1, 6 und 24 Stunden nach der Verabreichung getötet, anschließend wurde
die Konzentration von AmB in den Organen und Geweben analysiert.
-
Gewebe-
und Blutproben wurden wie folgt verarbeitet: Gewebe wurden 1/20
oder 1/10 verdünnt durch
Zugabe von Extraktionslösungsmittel
(H2O 35 %, Methanol 10 %, Ethanol 55 % w/w/w
nv/v/v) und mit einem Ultra-Turrax® Gerät homogenisiert.
Ein 0,5 ml Aliquot wurde entnommen, 1 min lang mit Ultraschall behandelt
und 12 min lang bei 4 °C
bei 7260 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein HPLC
Microvial überführt und
30 μl wurden
eingespritzt in eine analytische Säule (C-18, 3,9 × 150 mm, 4 μm Teilchengröße) bei
40 °C mit
einer Strömungsgeschwindigkeit
von 0,5 ml. Die bei 408 nm detektierte Konzentration von AmB wurde
mit Hilfe einer Eichkurve eines externen Standards errechnet.
-
10 zeigt
die Änderung
der Konzentration von AmB über
die Zeit in den Geweben über
eine Zeitdauer von 24 Stunden. Obwohl nur Werte für drei Zeitpunkte
abgebildet sind, kann man die Akkumulation in den Schlüsselgeweben
(Leber, Lunge, Milz und Nieren) erkennen.
-
Behandlung durch mehrmalige
Gabe
-
Zwei
andere Gruppen von Mäusen
erhielten 10 Tage lang eine Behandlung mit mehrmaligen Gaben mit
10 mg/kg/Tag und eine Gruppe wurde 24 Stunden nach der letzten erhaltenen
Gabe und die andere Gruppe 20 Tage nach der letzten erhaltenen Gabe
getötet.
Zu den vorgegebenen Zeitpunkten wurden die Mäuse betäubt, getötet und seziert, um die Gewebe
zu erhalten. Die Gewebe wurden wie bei der Behandlung durch einmalige
Gabe verarbeitet und die Konzentration von AmB wurde durch HPLC bestimmt.
Die 24 h nach der zehnten Gabe erhaltenen Ergebnisse sind in 11 bildlich
dargestellt und zeigen, dass in einem Hydrogel isolierte Cochleate die
Zufuhr von AmB in therapeutischen Konzentrationen über den
Magen-Darm-Trakt ermöglichen.
-
Beispiel 19: Korrelation zwischen Biodistribution
in gesunden und infizierten Mäusen
und der Konzentration von Candida albicans im Gewebe nach oraler Gabe
-
12 zeigt
den Zusammenhang zwischen der Konzentration von Amphotericin B im
Gewebe (μg/g
Gewebe auf der linken Skala) und der Wirksamkeit als Abnahme der
Infektion mit Candida albicans (CFU/g auf der rechten Skala) nach
oraler Gabe von mit AmB beladenen Cochleaten (12).
-
Nach
oraler Gabe von 10 mg/kg/Tag über
einen Zeitraum von 10 aufeinanderfolgenden Tagen an gesunde Mäuse fanden
sich hohe Konzentrationen von AmB in den Nieren, gefolgt von der
Lunge, der Milz, der Leber und dem Gehirn, das viel niedrigere Konzentrationen
als die anderen Gewebe aufweist. Es ist gezeigt worden, dass ein
Krankheitszustand die Pharmakokinetik von Arzneimitteln auf unterschiedlichen
Ebenen beeinflusst. Dieses Phänomen kann
man in dem Diagramm deutlich erkennen: Die Konzentration von AmB
im Gewebe ist niedriger bei mit C. albicans infizierten Mäusen nach
oraler Gabe von 10 mg/kg/Tag (die gleiche Dosis) über 15 Tage,
5 Gaben mehr als bei der gesunden Gruppe. Es zeigt auch eine Veränderung
in dem Verteilungsmuster, in dem die Lunge das Zielgewebe mit den
niedrigsten Konzentrationen ist.
-
Orale
Gabe einer Formulierung mit AmB beladener Cochleate mit 10 mg/kg/Tag über 15 Tage
ergab eine hohe Wirksamkeit. Die Abnahme der CFU/g im Nierengewebe
beträgt
etwa 3,5 Zehnerpotenzen für
die Cochleat-Formulierung. In den Lungen rotten AmB Cochleat-Formulierungen
C. albicans vollständig
aus und beseitigen die Pilzinfektion den Lungen. Es wird deutlich,
dass das auf Cochleaten beruhende Verabreichungssystem eine hohe
Konzentration von AmB in infizierten Tieren zur Verfügung stellt.
Dies korreliert mit der höheren
Wirksamkeit, die bei der Cochleat-Formulierung beobachtet wird und
zeigt, dass mit AmB beladene Cochleate ein geeignetes Vehikel für die orale
Behandlung von systemischer Candidiasis sind.
-
Außerdem waren
oral verabreichte, mit AmB beladene Cochleate auch bei der höchsten Dosis
von 50 mg/kg ungiftig (es wurden keine Läsionen in den Nieren, dem Magen-Darm-Trakt
und den anderen Organen von Mäusen
gefunden, denen 10, 20 und 50 mg/kg mit AmB beladene Cochleate verabreicht
worden waren). Diese hohe Dosis (50 mg/kg) entspricht dem 100-fachen der niedrigsten
Dosis (0,5 mg/kg), die in dem Modell der mit Candida infizierten
Mäuse 100
% Überlebensrate
zeigte.