DE60036053T2

DE60036053T2 - Erythropoietinkonjugate

Info

Publication number: DE60036053T2
Application number: DE60036053T
Authority: DE
Inventors: Pascal Sebastian Florham Park Bailon
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1999-07-02
Filing date: 2000-06-28
Publication date: 2008-01-03
Anticipated expiration: 2020-06-29
Also published as: EP1839676A3; AR055650A2; TNSN00147A1; HU226233B1; RS49928B; CY1107719T1; FR07C0051I1; CA2310536A1; DE10031839A1; YU40700A; CN1280137A; KR20010049676A; ES2191511B1; GB2393960A; ITMI20001479A1; HK1068354A1; NL300289I1; SG92717A1; CN1283664C; NZ505454A

Description

Hintergrund der Erfindung
Die Erythropoese ist die Erzeugung von roten Blutzellen, die zum Ausgleich des Zellabbaus erfolgt. Erythropoese ist ein kontrollierter, physiologischer Mechanismus, der für eine geeignete Versorgung des Gewebes mit Sauerstoff ausreichend rote Blutzellen zur Verfügung stellen kann. Natürlich vorkommendes Humanerythropoietin (hEPO) wird in der Niere erzeugt und ist der humorale Plasmafaktor, der die Erzeugung von roten Blutzellen stimuliert (Carnot, P. und Deflandre, C. (1906) C.R. Acad. Sci. 143: 432; Erslev, A.J. (1953) Blood 8: 349; Reissmann, K.R. (1950) Blood 5: 372; Jacobson, L.O., Goldwasser, E., Freid, W. und Plzak, L.F. (1957) Nature 179: 6331-4). Natürlich vorkommendes EPO stimuliert die Teilung und Differenzierung von jeweiligen erythroiden Vorläufern im Knochenmark und übt seine biologische Aktivität durch Binden an Rezeptoren an erythroiden Vorstufen aus (Krantz, BS (1991) Blood 77: 419).
Erythropoietin wurde biosynthetisch unter Verwendung von rekombinanter DNA-Technologie hergestellt (Egrie, J.C., Strickland, T.W., Lane, J. et al. (1986) Immunobiol. 72: 213-224) und ist das Produkt eines geklonten Human-EPO-Gens, inseriert in und exprimiert in den Ovariumgewebszellen des Chinesischen Hamsters (CHO-Zellen). Die Primärstruktur der predominanten voll ausgebildeten Form von hEPO wird in SEQ ID NR.: 1 erläutert. Es gibt zwei Disulfidbrücken zwischen Cys⁷-Cys¹⁶¹ und Cys²⁹-Cys³³. Das Molekulargewicht der Polypeptidkette von EPO ohne die Zuckerreste ist 18236 Da. In dem intakten EPO-Molekül machen die Kohlenhydratgruppen, die das Protein an den Glycosylierungsstellen am Protein glycosylieren, etwa 40% des Molekulargewichts aus (Sasaki, H., Bothner, B., Dell, A. und Fukuda, M. (1987) J. Biol. Chem. 262: 12059).
Da Humanerythropoietin bei der Bildung von roten Blutzellen wesentlich ist, ist das Hormon bei der Behandlung von Blutkrankheiten, die durch eine geringe oder mangelhafte Erzeugung von Blutzellen gekennzeichnet sind, brauchbar. Klinisch wird EPO bei der Behandlung von Anämie bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz (CRF) (Eschbach, J.W., Egri, J.C., Downing, M.R. et al. (1987) NEJM 316: 73-78; Eschbach, J.W., Abdulhadi, M.H., Browne, J.K. et al. (1989) Ann. Intern. Med. 111: 992; Egrie, J.C., Eschbach, J.W., Mc-Guire, T., Adamson, J.W. (1988) Kidney Intl. 33: 262; Lim, V.S., Degowin, R.L., Zavala, D. et al. (1989) Ann. Intern. Med. 110: 108-114) und bei AIDS und Krebspatienten, die mit einer Chemotherapie behandelt werden (Danna, RP, Rudnick, S.A., Abels, R.I. In: M.B. Garnick, Herausg. Erythropoietin in Clinical Applications-An International Perspective. New York, NY: Marcel Dekker; 1990: S. 301-324) eingesetzt. Die Bioverfügbarkeit von handelsüblichen Proteintherapeutika, wie EPO, ist allerdings durch ihre kurze Halbwertszeit in Plasma und durch ihre Anfälligkeit für Proteaseabbau begrenzt. Diese Nachteile verhindern das Erreichen einer maximalen klinischen Wirkung.
WO 99/11781 beschreibt Polypeptide, die die gesamte oder einen Teil der primären strukturellen Konformation und biologischen Eigenschaft von Erythropoietin aufweisen und eine verbesserte in vivo Halbwertszeit und biologische Aktivität aufgrund eines modifizierten Glycosylierungsprofils besitzen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Erfindung stellt ein Erythropoietin-Konjugat bereit, wobei das Konjugat ein Erythropoietinglycoprotein mit mindestens einer freien Aminogruppe umfaßt und die biologische in vivo-Aktivität aufweist, um Knochenmarkzellen zur ge steigerten Erzeugung von Reticulozyten und roten Blutzellen zu veranlassen, und ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Humanerythropoietin und Humanerythropoietin, modifiziert durch die Addition von 1 bis 6 Glycosylierungsstellen oder eine Umlagerung mindestens einer Glycosylierungsstelle, aufweisen, wobei das Glycoprotein kovalent an "n" Pole(ethylenglycol)gruppen der Formel -CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)m-OR gebunden ist, wobei die Gruppe -CO (d.h. Carbonyl) jeder Poly(ethylenglycol)gruppe eine Amidbindung mit einer der Aminogruppen bildet; wobei R C₁-C₆-Alkyl bedeutet; x 2 oder 3 bedeutet; m etwa 450 bis etwa 900 bedeutet; n 1 bis 3 bedeutet; und n und m so ausgewählt sind, daß das Molekulargewicht des Konjugats abzüglich des Erythropoi-etinglycoproteins 20 Kilodalton bis 100 Kilodalton beträgt. Die Erfindung stellt außerdem Zusammensetzungen bereit, die hierin beschriebene Konjugate enthalten, wobei der Prozentsatz an Konjugaten in der Zusammensetzung, in der n gleich 1 ist, mindestens neunzig Prozent beträgt.
Verglichen mit nicht modifiziertem EPO (d.h. EPO ohne gebundenes PEG) und üblichen PEG-EPO-Konjugaten weisen die vorliegenden Konjugate erhöhte Halbwertszeit im Kreislauf und Verweilzeit im Plasma, vermindertes Clearance und verminderte klinische in vivo-Aktivität auf. Die erfindungsgemäßen Konjugate weisen dieselbe Verwendung wie EPO auf. Insbesondere sind die erfindungsgemäßen Konjugate zur Behandlung von Patienten durch Stimulierung der Teilung und Differenzierung von jeweiligen erythroiden Vorläufern im Knochenmark in derselben Weise, in der EPO zur Behandlung von Patienten verwendet wird, geeignet.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung stellt Konjugate bereit, wobei die Konjugate ein Erythropoietinglycoprotein mit mindestens einer freien Aminogruppe umfassen und die biologische in vivo-Aktivität aufweisen, um Knochenmarkzellen zur gesteigerten Erzeugung von Reticulozyten und roten Blutzellen zu veranlassen, und ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Humanerythropoietin und Humanerythropoietin modifiziert durch die Addition von 1 bis 6 Glycosylierungsstellen oder eine Umlagerung mindestens einer Glycosylierungsstelle, aufweisen, wobei das Glycoprotein kovalent an "n" Poly(ethylenglycol)gruppen der Formel -CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR gebunden ist, wobei die Gruppe -CO (d.h. Carbonyl) jeder Poly(ethylenglycol)gruppe eine Amidbindung mit einer der Aminogruppen bildet; wobei R C₁-C₆-Alkyl bedeutet; x 2 oder 3 bedeutet; m etwa 450 bis etwa 900 bedeutet; n 1 bis 3 bedeutet; und n und m so ausgewählt sind, daß das Molekulargewicht des Konjugats abzüglich des Erythropoietinglycoproteins 20 Kilodalton bis 100 Kilodalton beträgt.
Es wurde gefunden, daß die erfindungsgemäßen Konjugate in derselben Weise wie nicht modifiziertes EPO verwendet werden können. Die erfindungsgemäßen Konjugate weisen jedoch eine höhere Halbwertszeit im Kreislauf und eine höhere Verweilzeit im Plasma, vermindertes Clearance und erhöhte in vivo-Aktivität auf. Aufgrund dieser verbesserten Eigenschaften können die erfindungsgemäßen Konjugate einmal wöchentlich, anstatt dreimal wöchentlich wie bei nicht modifiziertem EPO, verabreicht werden. Eine verminderte Verabreichungshäufigkeit führt erwartungsgemäß zu einer verbesserten Befolgung durch den Patienten, was zu einem besseren Behandlungsergebnis sowie zu einer besseren Lebensqualität des Patienten führt. Verglichen mit üblichen Konjugaten von EPO, das an Poly(ethylenglycol) gebunden ist, wurde gefunden, daß Konjugate mit dem Molekulargewicht und der Linkerstruktur der erfindungsgemäßen Konjugate eine verbesserte Wirksamkeit, Stabilität, AUC (Fläche unter der Serumkonzentration-Zeit-Kurve), Halbwertszeit im Kreislauf und ein besseres Kostenprofil aufweisen.
Die erfindungsgemäßen Konjugate können in der gleichen Weise wie EPO in einer therapeutisch wirksamen Menge an Patienten verabreicht werden. Die therapeutisch wirksame Men ge ist jene Menge an Konjugat, die für die biologische in vivo-Aktivität erforderlich ist, um die Knochenmarkzellen zu einer Steigerung der Erzeugung von Reticulozyten und roten Blutzellen zu veranlassen. Die exakte Menge an Konjugat unterliegt solchen Faktoren wie der genauen Art des zu behandelnden Zustandes, dem Zustand des zu behandelnden Patienten sowie anderen Bestandteilen in der Zusammensetzung. Beispielsweise können 0,01 bis 10 μg pro kg Körpergewicht, vorzugsweise 0,1 bis 1 μg pro kg Körpergewicht, beispielsweise einmal wöchentlich verabreicht werden.
Die das Konjugat enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen können in einer Stärke formuliert werden, die zur Verabreichung durch verschiedene Maßnahmen an einen Patienten (Mensch) mit Blutkrankheiten, die durch eine geringe oder mangelhafte Erzeugung von roten Blutzellen gekennzeichnet sind, wirksam ist. Mittlere therapeutisch wirksame Mengen des Konjugats können variieren und insbesondere sollten sie auf den Empfehlungen und Verschreibungen eines ausgebildeten Arztes beruhen.
Die Erythropoietinglycoprotein-Produkte, welche gemäß vorliegender Erfindung hergestellt wurden, können zu pharmazeutischen Zusammensetzungen, geeignet zur Injektion mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder Vehikulum, durch an sich bekannte Verfahren zubereitet werden. Beispielsweise wurden geeignete Zusammensetzungen in WO 97/09996 , WO 97/40850 , WO 98/58660 und WO 99/07401 beschrieben. Unter den bevorzugten pharmazeutisch verträglichen Trägern zur Formulierung der erfindungsgemäßen Produkte sind Humanserumalbumin, Humanplasmaproteine usw. Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in 10 mM Natrium/Kaliumphosphatpuffer bei pH 7 mit einem Tonizitätsmittel, beispielsweise 132 mM Natriumchlorid, formuliert werden. Gegebenenfalls kann die pharmazeutische Zusammensetzung einen Konservierungsstoff enthalten. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann unterschiedliche Mengen an Erythropoietin, beispielsweise 10-1000 μg/ml, beispielsweise 50 μg oder 400 μg enthalten.
Der Begriff "Erythropoietin" oder "EPO" betrifft ein Glycoprotein mit der Aminosäuresequenz, die in (SEQ ID NR.: 1) oder (SEQ ID NR.: 2) angeführt ist, oder eine Aminosäuresequenz, die im wesentlichen homolog dazu ist, deren biologische Eigenschaften die Stimulierung der Erzeugung von roten Blutzellen und die Stimulierung der Teilung und Differenzierung von jeweiligen erythroiden Vorläufern im Knochenmark betreffen. Diese hier verwendeten Begriffe schließen solche Proteine, die gezielt, beispielsweise durch direkte Ortsmutagenese oder zufällig durch Mutationen modifiziert wurden, ein. Diese Begriffe schließen auch Analoge mit 1 bis 6 zusätzlichen Glycosylierungsstellen, Analoge mit mindestens einer zusätzlichen Aminosäure an dem Carboxy-endständigen Ende von Glycoprotein, wobei die zusätzliche Aminosäure mindestens eine Glycosylierungsstelle einschließt, und Analoge mit einer Aminosäuresequenz, die eine Umlagerung von mindestens einer Glycosylierungsstelle einschließt, ein. Diese Begriffe schließen sowohl natürliches als auch rekombinant erzeugtes Humanerythropoietin ein.
Die erfindungsgemäßen Erythropoietin-Konjugate können durch die Formel I: P-[NHCO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR]_n (I)wiedergegeben werden, wobei x, m, n und R wie vorstehend definiert sind. In Formel I ist P der Rest eines hier beschriebenen Erythropoietinglycoproteins (d.h. ohne die Aminogruppe oder Aminogruppen, die eine Amidbindung mit der in Formel I gezeigten Carbonylgruppe bilden) mit der biologischen in vivo-Aktivität, die Knochenmarkzellen zur gesteigerten Erzeugung von Reticulozyten und roten Blutzellen veranlaßt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist R Methyl. Vorzugsweise ist m etwa 650 bis etwa 750 und n ist vorzugsweise 1.
In der besonders bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform ist R Methyl, m ist etwa 650 bis etwa 750 und n ist 1, d.h. das wie vorstehend definierte Konjugat hat die Formel [CH₃O(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂CH₂CO-NH]_n-P worin m 650 bis 750 ist, n 1 ist und P wie vorstehend definiert ist. Vorzugsweise weist n im Durchschnitt etwa 680 auf.
Vorzugsweise ist das Glycoprotein der vorstehend definierten Konjugate Humanerythropoietin. Humanerythropoietin und wie vorstehend definierte analoge Proteine können durch endogene Genaktivierung exprimiert werden. Bevorzugte Humanerythropoietinglycoproteine sind jene von SEQ ID NR.: 1 und SEQ ID NR.: 2, besonders bevorzugt jene von SEQ ID NR.: 1.
Außerdem kann P aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Resten von Humanerythropoietin und Analogen davon mit 1 bis 6 zusätzlichen Glycosylierungsstellen besteht. Wie nachstehend genauer ausgeführt, sind die Zubereitung und Reinigung von EPO auf dem Fachgebiet bekannt. EPO bedeutet das natürliche oder rekombinante Protein, vorzugsweise humanen Ursprungs, wie es von einer üblichen Herkunft wie Gewebe, Proteinsynthese, Zellkulturen mit natürlichen oder rekombinanten Zellen erhalten wird. Ein beliebiges Protein mit der Aktivität von EPO, wie Muteine oder anderweitig modifizierte Proteine, sind mit umfaßt. Rekombinantes EPO kann über Expression in CHO-, BHK- oder HeLa-Zellinien durch rekombinante DNA-Tech-nologie oder durch endogene Genaktivierung erzeugt werden. Expression von Proteinen, einschließlich EPO, durch endogene Genaktivierung ist auf dem Fachgebiet bekannt und wird beispielsweise in den US-Patenten 5 733 761 , 5 641 670 und 5 733 746 und in den internationalen Patentveröffentlichungen WO 93/09222 , WO 94/12650 , WO 95/31560 , WO 90/11354 , WO 91/06667 und WO 91/09955 offenbart. Die bevorzugten EPO-Arten zur Zubereitung von Erythropoietinglycoprotein-Produkten sind Human-EPO-Arten. Besonders bevorzugt ist die EPO-Spezies des Human-EPO mit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NR.: 1 oder SEQ ID NR.: 2 ausgeführt ist, vorzugsweise der Aminosäuresequenz SEQ ID NR.: 1.
In einer Ausführungsform kann P der Rest eines Glycoproteinanalogen mit 1 bis 6 zusätzlichen Glycosylierungsstellen sein. Die Glycosylierung eines Proteins mit ein oder mehreren Oligosaccharidgruppen findet an speziellen Orten längs des Polypeptidgerüstes statt und beeinflußt in starkem Maße die physikalischen Eigenschaften des Proteins, wie Proteinstabilität, Sekretion, subzelluläre Lokalisierung und biologische Aktivität. Die Glycosylierung erfolgt gewöhnlich in zwei Arten. O-gebundene Oligosaccharide werden an Serin- oder Threoninreste gebunden und N-gebundene Oligosaccharide werden an Asparaginresten gebunden. Eine Art Oligosaccharid, die man sowohl an N-gebundenen als auch an O-gebundenen Oligosacchariden findet, ist N-Acetylneuraminsäure (Sialinsäure), nämlich eine Familie von Aminozuckern mit 9 oder mehr Kohlenstoffatomen. Sialinsäure ist gewöhnlich der endständige Rest sowohl an N-gebundenen als auch an O-gebundenen Oligosacchariden und, da sie eine negative Ladung trägt, überträgt sie auf das Glycoprotein saure Eigenschaften. Humanerythropoietin mit 165 Aminosäuren enthält 3 N-gebundene und eine O-gebundene Oligosaccharidkette, umfassend etwa 40% des gesamten Molekulargewichts des Glycoproteins. N-gebundene Glycosylierung findet an Asparaginresten, angeordnet an Positionen 24, 38 und 83, statt, und O-gebundene Glycosylierung findet an einem Serinrest, angeordnet in Position 126, statt. Die Oligosaccharidketten sind mit endständigen Sialinsäureresten modifiziert. Die enzymatische Entfernung aller Sialinsäurereste aus dem glycosylierten Erythropoietin führt zu einem Verlust an in vivo-Aktivität, jedoch nicht an in vitro-Aktivität, da Sialylierung von Erythropoietin dessen Bindungsvermögen und folglich Clearance durch hepatisches Bindungsprotein verhindert.
Die erfindungsgemäßen Glycoproteine schließen Analoge von Humanerythropoietin mit ein oder mehreren Änderungen in der Aminosäuresequenz von Humanerythropoietin, was zu einer Steigerung in der Zahl der Sialinsäurebindungsstellen führt, ein. Diese Glycoproteinanaloge können durch ortsgerichtete Mutagenese mit Additionen, Deletionen oder Substitutionen von Aminosäureresten, die die zur Glycosylierung verfügbaren Stellen steigern oder ändern, erzeugt werden. Glycoprotein analoge mit einem hohen Anteil an Sialinsäure, der größer ist als jener, den man bei Humanerythropoietin findet, werden durch Addition von Glycosylierungsstellen, die die zur biologischen Aktivität erforderliche sekundäre oder tertiäre Konfirmation nicht stören, erzeugt. Die erfindungsgemäßen Glycoproteine schließen auch Analoge mit erhöhten Anteilen an Kohlenhydratbindung an einer Glycosylierungsstellen ein, welche gewöhnlich die Substitution von ein oder mehreren Aminosäuren in unmittelbarer Nähe zu einer N-gebundenen oder O-gebundenen Stelle einbeziehen. Die erfindungsgemäßen Glycoproteine schließen auch Analoge mit ein oder mehreren Aminosäuren, die sich vom Carboxyende des Erythropoietins erstrecken und mindestens eine zusätzliche Kohlenhydratstelle bereitstellen, ein. Die erfindungsgemäßen Glycoproteine schließen auch Analoge mit einer Aminosäuresequenz ein, die eine Umlagerung mindestens einer Stelle für die Glycosylierung einschließt. Eine solche Umlagerung der Glycosylierungsstelle bezieht die Deletion von einer oder mehreren Glycosylierungsstellen in Humanerythropoietin und die Addition von einer oder mehreren nicht natürlich vorkommenden Glycosylierungsstellen ein. Die Erhöhung der Zahl der Kohlenhydratketten am Erythropoietin und daher der Zahl an Sialinsäuren pro Erythropoietin-Molekül kann vorteilhafte Eigenschaften, wie erhöhte Löslichkeit, größere Beständigkeit gegen Proteolyse, verminderte Immunogenizität, erhöhte Serumhalbwertszeit und erhöhte biologische Aktivität übertragen. Erythropoietinanaloge mit zusätzlichen Glycosylierungsstellen sind genauer in EP-A-640 619 , Elliot, veröffentlicht am 1. März 1995, offenbart.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die erfindungsgemäßen Glycoproteine eine Aminosäuresequenz, die mindestens eine zusätzliche Stelle für die Glycosylierung einschließt, wie Erythropoietine, umfassend die Sequenz von Humanerythropoietin, modifiziert durch eine Modifizierung, ausgewählt aus den nachstehenden:
Asn³⁰Thr³²;
Asn⁵¹Thr⁵³;
Asn⁵⁷Thr⁵⁹;
Asn⁶⁹;
Asn⁶⁹Thr⁷¹;
Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹;
Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;
Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;
Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰;
Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹²;
Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²;
Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;
Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰;
Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹;
Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹;
Asn¹³⁶Thr¹³⁸;
Asn¹³⁸Thr¹⁴⁰;
Thr¹²⁵; und
Pro ¹²⁴Thr¹²⁵
sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Die hierin zur Modifizierung von Aminosäuresequenzen verwendete Bezeichnungsweise bedeutet, daß die Stellung(en) des entsprechenden nicht modifizierten Proteins (d.h. hEPO von SEQ ID NR.: 1 oder SEQ ID NR.: 2), angeführt durch die hochgestellte(n) Zahl(en) zu den entsprechenden Aminosäure(n) geändert wird, die unmittelbar der entsprechenden jeweiligen Zahl(en) vorangeht/vorangehen.
Das Glycoprotein kann auch ein Analoges sein mit mindestens einer zusätzlichen Aminosäure am terminalen Carboxyende des Glycoproteins, wobei die zusätzliche Aminosäure mindestens eine Glycosylierungsstelle einschließt, d.h. das wie vorstehend definierte Konjugat betrifft auch eine Verbindung, worin das Glycoprotein eine Sequenz, umfassend die Sequenz von Humanerythropoietin und eine zweite Sequenz an dem Carboxyende der Humanerythropoietin-Sequenz, aufweist, wobei die zweite Sequenz mindestens eine Glycosylierungsstelle enthält. Die zusätzliche Aminosäure kann ein Peptidfragment umfassen, abgeleitet von dem Carboxy-terminalen Ende von Humanchorion-Gonadotropin. Vorzugsweise ist das Glycoprotein ein Analoges, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus (a) Humanerythropoietin mit der Aminosäuresequenz Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gin (SEQ ID NR.: 3), die sich von dem Carboxyterminus erstreckt, (b) dem Analogen in (a), außerdem umfassend Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO; und (c) dem Analogen in (a), außerdem umfassend Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO.
Das Glycoprotein kann auch ein Analoges mit einer Aminosäuresequenz, die eine Umlagerung von mindestens einer Glycosylierungsstelle einschließt, sein. Die Umlagerung kann eine Deletion von einer beliebigen N-gebundenen Kohlenhydratstelle in Humanerythropoietin und eine Addition einer N-gebundenen Kohlenhydratstelle an Position 88 der Aminosäuresequenz von Humanerythropoietin sein. Vorzugsweise ist das Glycoprotein ein Analoges, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Gln²⁴Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO; Gln³⁸Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO; und Gln⁸³Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰EPO.
Der hier verwendete Begriff "Niederalkyl" bedeutet eine lineare oder verzweigte Alkylgruppe mit ein bis sechs Kohlenstoffatomen. Beispiele für Niederalkylgruppen schließen Methyl, Ethyl und Isopropyl ein. Erfindungsgemäß ist R eine Niederalkylgruppe. Konjugate, worin R Methyl ist, sind bevorzugt.
Das Symbol "m" bedeutet eine Zahl von Ethylenoxidresten (OCH₂CH₂) in der Poly(ethylenoxid)gruppe. Eine einzige PEG-Untereinheit von Ethylenoxid weist ein Molekulargewicht von etwa 44 Dalton auf. Somit hängt das Molekulargewicht des Konjugats (ausgenommen das Molekulargewicht des EPO) von der Zahl "m" ab. In den Konjugaten dieser Erfindung ist "m" von etwa 450 bis etwa 900 (entsprechend einem Molekulargewicht von etwa 20 kDa bis etwa 40 kDa), vorzugsweise von etwa 650 bis etwa 750 (entsprechend einem Molekulargewicht von etwa 30 kDa). Die Zahl m wird so ausgewählt, daß das erhaltene Konjugat der Erfindung eine physiologische Aktivität aufweist, die mit nicht modifiziertem EPO vergleichbar ist, wobei die Aktivität dieselbe, größer oder einen Bruchteil der entsprechenden Aktivität von nicht modifiziertem EPO darstellen kann. Ein Molekulargewicht von "etwa" einer bestimmten Zahl bedeutet, daß es in einem angemessenen Bereich dieser Zahl liegt, was durch übliche analytische Techniken bestimmt wird. Die Zahl "m" wird so ausgewählt, daß das Molekulargewicht jeder Poly(ethylenglycol)-gruppe, die kovalent an dem Erythropoietinglycoprotein gebunden ist, etwa 20 kDa bis etwa 40 kDa und vorzugsweise etwa 30 kDa beträgt.
In den erfindungsgemäßen Konjugaten ist die Zahl "n" die Zahl von Polyethylenglycolgruppen, die kovalent an freie Aminogruppen (einschließlich ε-Aminogruppen einer Lysinaminosäure und/oder der Amino-endständigen Aminogruppe) eines Erythropoietinproteins über Amidbindung(en) gebunden sind. Ein erfindungsgemäßes Konjugat kann ein, zwei oder drei PEG-Gruppen pro EPO-Molekül enthalten. "n" ist eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 3, vorzugsweise ist "n" 1 oder 2 und bevorzugter ist "n" 1.
Die Verbindung der Formel I kann aus dem bekannten polymeren Material hergestellt werden:
worin R und m wie vorstehend beschrieben sind, durch Kondensation der Verbindung der Formel II mit dem Erythropoietinglycoprotein. Verbindungen der Formel II, worin x 3 bedeutet, sind Alphaniederalkoxy-Buttersäuresuccinimidylester von Poly(ethylenglycol) (Niederalkoxy-PEG-SBA). Verbindungen der Formel II, worin x 2 ist, sind Alphaniederalkoxy-Propionsäuresuccinimidylester von Poly(ethylenglycol) (Niederalkoxy-PEG-SPA). Ein beliebiges übliches Verfahren zur Um setzung eines aktivierten Esters mit einem Amin zur Bildung eines Amids kann verwendet werden. In der vorstehend beschriebenen Reaktion ist der beispielhaft angeführte Succinimidylester eine Abgangsgruppe, die eine Amidbildung hervorruft. Die Verwendung von Succinimidylester wie die Verbindungen der Formel II zur Erzeugung von Konjugaten mit Proteinen wird in US-A-5 672 662 , herausgegeben am 30. September 1997 (Harris et al.), offenbart.
Human-EPO enthält neun freie Aminogruppen, die Amino-endständige Aminogruppe plus ε-Aminogruppen von 8 Lysinresten. Wenn das Pegylierungsreagenz mit einer SBA-Verbindung der Formel II kombiniert wurde, wurde gefunden, daß bei pH 7,5, einem Verhältnis von Protein:PEG von 1:3 und einer Reaktionstemperatur von 20-25°C ein Gemisch von mono-, di- und Restmengen von tripegylierten Spezies erzeugt wurde. Wenn das Pegylierungsreagenz eine SPA-Verbindung der Formel II bei ähnlichen Bedingungen war, ausgenommen, daß das Verhältnis von Protein:PEG 1:2 war, werden vorwiegend monopegylierte Arten erzeugt. Das pegylierte EPO kann als Gemisch oder, wenn durch Kationenaustauschchromatographie getrennt, als unterschiedliche pegylierte Arten verabreicht werden. Durch Manipulierung der Reaktionsbedingungen (beispielsweise Verhältnis von Reagenzien, pH-Wert, Temperatur, Proteinkonzentration, Reaktionszeit usw.) können die relativen Mengen der unterschiedlichen pegylierten Spezies variiert werden.
Humanerythropoietin (EPO) ist ein Humanglycoprotein, das die Bildung von Erythrozyten stimuliert. Seine Herstellung und seine therapeutische Anwendung werden genauer in den US-Patenten 5 547 933 und 5 621 080 , EP-B-0 148 605 , Huang, S.L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 2708-2712, EP-B-0 205 564 , EP-B-0 209 539 und EP-B-0 411 678 sowie Lai, P.H. et al., J. Biol. Chem. 261 (1986) 3116-3121, und Sasaki, H. et al., J. Biol. Chem. 262 (1987) 12059-12076 beschrieben. Erythropoietin für therapeutische Verwendungen kann durch rekombinante Maßnahmen erzeugt werden ( EP-B-0 148 605 , EP-B-0 209 539 und Egrie, J.C., Strickland, T.W., Lane, J. et al. (1986) Immunobiol. 72:213-224).
Verfahren zur Expression und Zubereitung von Erythropoietin in serumfreiem Medium werden beispielsweise in WO 96/35718 , Burg, veröffentlicht am 14. November 1996, und in der EP-A-513 738 , Koch, veröffentlicht am 12. Juni 1992, beschrieben. Zusätzlich zu den vorstehend genannten Veröffentlichungen ist bekannt, daß eine serumfreie Fermentation von rekombinanten CHO-Zellen, die ein EPO-Gen enthalten, ausgeführt werden kann. Solche Verfahren sind beispielsweise in EP-A-0 513 738 , EP-A-0 267 678 und in allgemeiner Form von Kawamoto, T. et al., Analytical Biochem. 130 (1983) 445-453, EP-A-0 248 656 , Kowar, J. und Franek, F., Methods in Enzymology 421 (1986) 277-292, Bavister, B. Expcology 271 (1981) 45-51, EP-A-0 481 791 , EP-A-0 307 247 , EP-A-0 343 635 , WO 88/00967 beschrieben worden.
In EP-A-0 267 678 werden eine Ionenaustauschchromatographie an S-Sepharose, eine präparative Umkehrphasen-HPLC an einer C₈-Säule und eine Gelfiltrationschromatographie zur Reinigung von EPO, erzeugt in einer serumfreien Kultur, nach einer Dialyse, beschrieben. In diesem Zusammenhang kann der Gelfiltrationschromatographieschritt durch Fast-Flow-Ionenaustauschchromatographie an S-Sepharose ersetzt werden. Es wird auch vorgeschlagen, daß eine Farbstoffchromatographie an einer Blue Trisacryl-Säule vor der Ionenaustauschchromatographie ausgeführt werden kann.
Ein Verfahren zur Reinigung von rekombinantem EPO wird von Nobuo, I. et al., J. Biochem. 107 (1990) 352-359, beschrieben. Bei diesem Verfahren wird EPO allerdings mit einer Lösung von Tween 20, Phenylmethylsulfonylfluorid, Ethylmaleimid, Pepstatin A, Kupfersulfat und Oxaminsäure vor den Reinigungsschritten behandelt. Veröffentlichungen, einschließlich WO 96/35718 , Burg, veröffentlicht am 14. November 1996, offenbaren ein Verfahren zur Herstellung von Erythropoietin in einem serumfreien Fermentationsverfahren (EPOsf).
Die spezifische Aktivität von EPO oder EPO-Konjugaten gemäß der Erfindung kann durch verschiedene bekannte Assays ermittelt werden. Die biologische Aktivität von gereinigten EPO-Proteinen dieser Erfindung ist dergestalt, daß die Verabreichung von EPO-Protein durch Injektion an Patienten (Mensch) in Knochenmarkzellen, verglichen mit Kontrollgruppen oder Personen, die nicht injiziert wurden, zu einer erhöhten Erzeugung von Reticulozyten und roten Blutzellen führt. Die biologische Aktivität von EPO-Proteinen oder Fragmenten davon, erhalten und gereinigt gemäß dieser Erfindung, kann durch Verfahren gemäß Annable, et al., Bull. Wld. Hlth. Org. (1972) 47: 99-112 und Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997 (2), geprüft werden. Ein weiteres biologisches Assay zur Bestimmung der Aktivität von EPO-Protein, das normozythämische Mausassay, ist in Beispiel 4 beschrieben.
Die Erfindung liefert eine wie vorstehend beschriebene Konjugate umfassende Zusammensetzung. Eine mindestens neunzig Prozent Mono-PEG-Konjugate enthaltende Zusammensetzung, d.h. worin n 1 ist, kann wie in Beispiel 5 gezeigt zubereitet werden. Gewöhnlich sind Mono-PEG-Konjugate von Erythropoietinglycoproteinen erwünscht, da sie in der Regel eine höhere Aktivität als Di-PEG-Konjugate aufweisen. Der Prozentsatz von Mono-PEG-Konjugaten sowie das Verhältnis von Mono- und Di-PEG-Arten kann durch Zusammenfügen breiterer Fraktionen um den Elutionspeak zur Senkung des Prozentsatzes von Mono-PEG oder engerer Fraktionen zur Erhöhung des Prozentsatzes von Mono-PEG in der Zusammensetzung gesteuert werden. Etwa neunzig Prozent Mono-PEG-Konjugate sind ein guter Ausgleich von Ausbeute und Aktivität. Manchmal können Zusammensetzungen, in denen beispielsweise mindestens zweiundneunzig Prozent oder mindestens sechsundneunzig Prozent der Konjugate Mono-PEG-Arten (n gleich 1) sind, erwünscht sein. In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist der Prozentsatz an Konjugaten, worin n 1 ist, von neunzig Prozent bis sechsundneunzig Prozent.
Die Erfindung betrifft auch die entsprechenden pharmazeutischen Zusammensetzungen, die ein Konjugat oder eine Zusammensetzung wie vorstehend beschrieben und einen pharmazeutisch verträglichen Exzipienten umfassen.
Die Konjugate und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung sind besonders zur Herstellung von Medikamenten zur Behandlung oder Prophylaxe von Krankheiten, die mit Anämie bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz (CRF) einhergehen, AIDS und zur Behandlung von Krebspatienten, die mit einer Chemotherapie behandelt werden, geeignet.
Eine zusätzliche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von Erkrankungen, die Anämie bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz (CRF) einbeziehen, AIDS und Krebspatienten, die mit einer Chemotherapie behandelt werden, umfassend den Schritt der Verabreichung einer vorstehend beschriebenen Zusammensetzung an einen Patienten.
Außerdem betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von vorstehend beschriebenen Verbindungen, wobei das Verfahren die Kondensation der Verbindung der Formel II
mit einem Erythropoietinglycoprotein umfaßt und worin R, m und x wie vorstehend definiert sind.
Die Erfindung betrifft auch wie vorstehend definierte Verbindungen zur Behandlung von Krankheiten, die mit Anämie einhergehen, bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz (CRF), AIDS und Krebspatienten, die mit einer Chemotherapie behandelt werden.
Die Erfindung wird durch Hinweis auf die nachstehenden Beispiele besser verständlich, die die hierin beschriebene Erfindung erläutern, aber nicht begrenzen.
BEISPIELE
BEISPIEL 1: Fermentation und Reinigung von Human-EPO
a) Inoculumzubereitung und Fermentation
Ein Fläschchen von Working Cell Bank, Ursprung einer EPO-erzeugenden CHO-Zellinie (ATCC CRL8695, veröffentlicht in EP 411 678 (Genetics Institute) kann verwendet werden) wird aus der Gasphase des Lagertanks mit flüssigem Stickstoff genommen. Die Zellen werden in Glasgefäße (glass spinner flask) überführt und in einem Hydrogencarbonat-gepufferten Medium in einem feuchtgehaltenen CO₂-Inkubator gezüchtet. Typische serumfreie Medien, die für die Inoculumzubereitung und die Fermentation verwendet werden, sind in EP-A-513 738 , Koch, veröffentlicht am 12. Juni 1992, oder WO 96/35718 , Burg, veröffentlicht am 14. November 1996, offenbart und enthalten beispielsweise als Medium DMEM/F12 (z.B. JRH Biosciences/Hazleton Biologics, Denver, US, Order Nr. 57-736) und zusätzlich Natriumhydrogencarbonat, L+Glutamin, D+Glucose, rekombinantes Insulin, Natriumselenit, Diaminobutan, Hydrocortison, Eisen(II)sulfat, Asparagin, Asparaginsäure, Serin und einen Stabilisator für Säugerzellen, wie Polyvinylalkohol, Methylcellulose, Polydextran, Polyethylenglycol, Pluronic F68, Plasmaexpander, Polygelin (HEMACCEL^®) oder Polyvinylpyrrolidon ( WO 96/35718 ).
Die Kulturen werden mikroskopisch hinsichtlich Abwesenheit von kontaminierenden Mikroorganismen geprüft und die Zelldichten werden bestimmt. Diese Tests werden bei jedem Splittingschritt ausgeführt.
Nach einem anfänglichen Wachstumszeitraum wird die Zellkultur mit frischem Medium zu der Ausgangszelldichte verdünnt und unterliegt einem weiteren Wachstumszyklus. Dieses Verfahren wird wiederholt, bis ein Kulturvolumen etwa 2 l pro Glasgefäß erhalten wurde. Nach etwa 12 Duplizierungen sind 1 bis 5 Liter dieser Kultur verfügbar, die dann als Inoculum für den 10 l-Inoculumfermenter verwendet wird.
Nach 3-5 Tagen kann die Kultur in dem 10 l-Fermenter als Inoculum für den 100 l-Fermenter verwendet werden.
Nach zusätzlichen 3-5 Tagen Züchtung kann die Kultur in dem 100 l-Fermenter als Inoculum für den 1000 l-Produktionsfermenter verwendet werden.
b) Ernten und Zelltrennung
Ein Batch-Refeed-Verfahren wird verwendet, d.h., wenn die gewünschte Zelldichte erreicht ist, werden etwa 80% der Kultur geerntet. Die zurückbleibende Kultur wird mit frischem Kulturmedium aufgefüllt und bis zur nächsten Ernte gezüchtet. Ein Produktionslauf besteht aus maximal 10 aufeinanderfolgenden Ernten: 9 Teilernten und 1 Gesamternte am Ende der Fermentation. Das Ernten findet alle 3-4 Tage statt.
Das bestimmte Erntevolumen wird in ein gefülltes Gefäß überführt. Die Zellen werden durch Zentrifugation oder Filtration entfernt und verworfen. Der EPO enthaltende Überstand aus dem Zentrifugationsschritt wird in-line filtriert und in einem zweiten gekühlten Gefäß gesammelt. Jede Ernte wird während der Reinigung getrennt verarbeitet.
Ein typisches Verfahren zur Reinigung von EPO-Protein ist in WO 96/35718 , Burg, veröffentlicht am 14. November 1996, offenbart. Der Reinigungsschritt wird nachstehend erläutert.
a) Blue Sepharose-Chromatographie
Blue Sepharose (Pharmacia) besteht aus Sepharosekügelchen, an deren Oberfläche Cibacron Blau-Farbstoff kovalent gebunden ist. Da EPO stärker an Blue Sepharose bindet als die meisten nicht proteinischen Verunreinigungen, können einige proteinische Verunreinigungen und PVA entfernt werden und EPO kann in diesem Schritt angereichert werden. Die Elution von der Blue Sepharose-Säule erfolgt durch Erhöhen der Salzkonzentration sowie des pH-Werts.
Die Säule wird mit 80-100 l Blue Sepharose gefüllt, mit NaOH regeneriert und mit Konditionierungspuffer ins Gleichgewicht gebracht (Natrium/Calciumchlorid und Natriumacetat). Der angesäuerte und filtrierte Fermenterüberstand wird aufgetragen. Nach Abschluß des Auftragens wird die Säule zuerst mit einem Puffer ähnlich dem Konditionierungspuffer, der allerdings eine höhere Natriumchloridkonzentration enthält, und anschließend mit einem Tris-Base-Puffer gewaschen. Das Produkt wird mit Tris-Base-Puffer eluiert und in einer einzigen Fraktion gemäß dem Masterelutionsprofil gesammelt.
b) Butyl Toyopearl-Chromatographie
Butyl Toyopearl 650 C (Toso Haas) ist eine Matrix auf Polystyrolbasis, an die aliphatische Butylreste kovalent gekuppelt sind. Da EPO stärker an diesem Gel bindet als die meisten Verunreinigungen und PVA, muß es mit einem Isopropanol enthaltenden Puffer eluiert werden.
Die Säule wird mit 30-40 l Butyl Toyopearl 650 C gefüllt, mit NaOH regeneriert, mit Tris-Basepuffer gewaschen und mit einem Isopropanol enthaltenden Tris-Basepuffer ins Gleichgewicht gebracht.
Das Blue Sepharose-Eluat wird auf die Konzentration an Isopropanol in dem Säulenkonditionierungspuffer eingestellt und auf die Säule gegeben. Dann wird die Säule mit Konditionierungspuffer mit steigender Isopropanolkonzentration gewaschen. Das Produkt wird mit Elutionspuffer (Tris-Basepuffer mit hohem Isopropanolgehalt) eluiert und in einer einzigen Fraktion gemäß dem Masterelutionsprofil gesammelt.
c) Hydroxyapatit Ultrogel-Chromatographie
Das Hydroxyapatit Ultrogel (Biosepra) besteht aus Hydroxyapatit, das in eine Agarosematrix eingearbeitet ist, um die mechanischen Eigenschaften zu verbessern. EPO weist eine geringe Affinität für Hydroxyapatit auf und kann daher bei geringeren Phosphatkonzentrationen eluiert werden als Proteinverunreinigungen.
Die Säule wird mit 30-40 l Hydroxyapatit Ultrogel gefüllt und mit Kaliumphosphat/Calciumchlorid-Puffer und NaOH, gefolgt von Tris-Basepuffer, regeneriert. Dann wird mit Tris-Basepuffer, der eine geringe Menge Isopropanol und Natriumchlorid enthält, ins Gleichgewicht gebracht.
Das EPO enthaltende Eluat aus der Butyl Toyopearl-Chromatographie wird auf die Säule aufgetragen. Anschließend wird die Säule mit Konditionierungspuffer und einem Tris-Basepuffer ohne Isopropanol und Natriumchlorid gewaschen. Das Produkt wird dann mit einem Tris-Basepuffer, der eine geringe Konzentration an Kaliumphosphat enthält, eluiert und in einer einzigen Fraktion gemäß dem Masterelutionsprofil gesammelt.
d) Umkehrphasen-HPLC an Vydac C4
Das RP-HPLC-Material Vydac C4 (Vydac) besteht aus Kieselgelteilchen, deren Oberfläche C4-Alkylketten tragen. Die Abtrennung von EPO von den proteinischen Verunreinigungen basiert auf dem Unterschied in der Stärke der hydrophoben Wechselwirkungen. Die Elution wird mit einem Acetonitrilgradienten in verdünnter Trifluoressigsäure ausgeführt.
Präparative HPLC wird unter Verwendung einer Edelstahlsäule (gefüllt mit 2,8 bis 3,2 Liter Vydac C4 Kieselgel) ausgeführt. Das Hydroxyapatit Ultrogel-Eluat wird durch Zugabe von Trifluoressigsäure angesäuert und auf die Vydac C4-Säule aufgegeben. Zum Waschen und zur Elution wird ein Acetonitrilgradient in verdünnter Trifluoressigsäure verwendet. Die Fraktionen werden gesammelt und sofort mit Phosphatpuffer neutralisiert. Die EPO-Fraktionen, die innerhalb der IPC-Grenzen liegen, werden zusammengeführt.
e) DEAE Sepharose Chromatographie
Das DEAE-Sepharosematerial (Pharmacia) besteht aus Diethylaminoethyl(DEAE)-Gruppen, die kovalent an der Oberfläche der Sepharosekügelchen gebunden sind. Die Bindung von EPO an DEAE-Gruppen wird durch ionische Wechselwirkungen vermittelt. Acetonitril und Trifluoressigsäure gelangen durch die Säule, ohne daß sie zurückgehalten werden. Nachdem diese Stoffe fortgewaschen wurden, werden Spurenverunreinigungen durch Waschen der Säule mit Acetatpuffer bei einem geringen pH-Wert entfernt. Die Säule wird dann mit neutralem Phosphatpuffer gewaschen und EPO wird mit einem Puffer bei steigender Ionenstärke eluiert.
Die Säule wird mit Fast-Flow-DEAE-Sepharose gefüllt. Das Säulenvolumen wird eingestellt, um zu gewährleisten, daß eine EPO-Beladung im Bereich von 3-10 mg EPO/ml Gel vorliegt. Die Säule wird mit Wasser und mit Konditionierungspuffer (Aquilibrierungspuffer) (Natrium/Kaliumphosphat) gewaschen. Die gesammelten Fraktionen des HPLC-Eluats werden aufgetragen und die Säule wird mit Konditionierungspuffer gewaschen. Dann wird die Säule mit Waschpuffer gewaschen (Natriumacetatpuffer), gefolgt von Waschen mit Konditionierungspuffer. Anschließend wird EPO von der Säule mit Elutionspuffer (Natriumchlorid, Natrium/Kaliumphosphat) gewaschen und in einer einzigen Fraktion gemäß dem Masterelutionsprofil gesammelt.
Das Eluat der DEAE Sepharose-Säule wird auf eine spezifische Leitfähigkeit eingestellt. Der erhaltene Arzneistoff wird in Teflonflaschen steril filtriert und bei –70°C gelagert.
BEISPIEL 2: Pegylierung von EPO mit mPEG-SBA
EPO, gereinigt gemäß dem serumfreien Verfahren von Beispiel 1 (EPOsf), war homogen, bestimmt durch analytische Verfahren, und zeigte das typische Isoformmuster, das aus 8 Isoformen bestand. Es hatte eine spezifische biologische Aktivität von 190000 IU/mg, ermittelt durch das normozythämische Mausassay. Das verwendete Pegylierungsreagenz war ein Methoxy-PEG-SBA, nämlich eine Verbindung der Formel II, worin R Methyl ist, x 3 ist und m von 650 bis 750 beträgt (im Durchschnitt etwa 680 entsprechend einem mittleren Molekulargewicht von etwa 30 kDa).
Pegylierungsumsetzung
Zu einhundert Milligramm EPOsf (9,71 ml einer 10,3 mg/ml EPOsf-Stammlösung, 5,48 μmol) wurden 10 ml 0,1 M Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5, enthaltend 506 mg eines 30 kDa Methoxy-PEG-SBA (16,5 μmol) (erhalten von Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama) gegeben und 2 h bei Raumtemperatur (20-23°C) vermischt. Die Proteinendkonzentration betrug 5 mg/ml und das Verhältnis von Protein:PEG-Reagenz betrug 1:3. Nach zwei Stunden wurde die Reaktion durch Einstellen des pH auf 4,5 mit Eisessig gestoppt und bei –20°C bis zur Reinigung gelagert.
Reinigung

1. Konjugatgemisch: etwa 28 ml von SP-SEPHAROSE FF (Sulfopropyl-Kationenaustauschharz) wurden auf eine AMICON-Glassäule (2,2 × 7,5 cm) gefüllt und mit 20 mM Acetatpuffer, pH 4,5, bei einer Strömungsgeschwindigkeit von 50 ml/h ins Gleichgewicht gebracht. Sechs Milliliter des Reaktionsgemisches, enthaltend 30 mg Protein, wurden 5mal mit dem Konditionierungspuffer verdünnt und auf die Säule aufgetragen. Nicht adsorbierte Materialien wurden mit dem Puffer fortgewaschen und das adsorbierte PEG-Konjugat-Gemisch wurde von der Säule mit 0,175 M NaCl in dem Konditionierungspuffer eluiert. Nicht modifiziertes EPOsf, das noch auf der Säule verblieb, wurde mit 750 mM NaCl eluiert. Die Säule wurde in dem Startpuffer reäquilibriert. Proben wurden durch SDS-PAGE analysiert und deren Pegylierungsgrad wurde ermittelt. Es wurde gefunden, daß das 0,175 M NaCl-Eluat sowohl mono- als auch di- und Spurenmengen von tripegylierten Arten enthielt, wobei das 750 mM NaCl-Eluat nicht modifiziertes EPOsf enthielt.
2. Di-PEG und Mono-PEG-EPOsf: Das gereinigte Konjugatgemisch, das von der Säule im vorstehenden Schritt eluiert wurde, wurde 4fach mit dem Puffer verdünnt und wieder auf eine Säule aufgetragen und wie beschrieben gewaschen. Di-PEG-EPOsf und Mono-PEG-EPOsf wurden getrennt von der Säule mit 0,1 M NaCl bzw. 0,175 M NaCl eluiert. Die Elution wurde auch mit 750 mM NaCl ausgeführt, um verbliebenes nicht modifiziertes EPOsf zu eluieren.

Alternativ wurde das Reaktionsgemisch 5fach mit Acetatpuffer verdünnt und auf eine SP-Sepharose-Säule (~0,5 mg Protein/ml Gel) aufgetragen. Die Säule wurde gewaschen und adsorbierte Mono-PEG-EPOsf, Di-PEG-EPOsf und nicht modifiziertes EPOsf wurden wie im vorstehenden Abschnitt beschrieben eluiert.
Ergebnisse
PEG-EPOsf wurde durch chemische Konjugation eines linearen PEG-Moleküls mit einem zahlenmittleren Molekulargewicht von 30 kDa synthetisiert. PEG-EPOsf stammte aus der Umsetzung zwischen primären Aminogruppen von EPOsf und dem Succinimidylesterderivat einer 30 kDa PEG-Buttersäure, was zu einer Amidbindung führt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengefaßt. Gereinigtes Konjugatgemisch umfaßte Mono- und Di-PEG-EPOsf und war frei von nicht modifiziertem EPOsf, wie durch SDS-PAGE-Analyse ermittelt. Das konjugiertes Gemisch machte 23,4 mg oder 78% des Ausgangsmaterials aus. Trennung durch Kationenaustauschchromatographie von Mono- und Di-PEG-EPOsf zeigte an, daß das Mono- zu Di-PEG-Verhältnis in dem Konjugatgemisch fast 1:1 war. Nach Ablauf der Reaktion war das Verhältnis der einzelnen Komponenten Mono:Di:nicht modifiziert 40:38:20 (%). Die Gesamtausbeute war fast quantitativ. Tabelle 1. Zusammenfassung der Ergebnisse von EPOsf-Pegylierung

Probe Protein (mg) Ausbeute (%)

Reaktionsgemisch 30 100

Mono- 12,0 40

Di- 11,4 38

Nicht modifiziert 6,0 20

Konjugiertes Gemisch 23,4 78
BEISPIEL 3: Pegylierung von EPO mit mPEG-SPA
Eine andere aliquote Menge von EPOsf, das in Beispiel 2 verwendet wurde, wurde mit 30 kDa Methoxy-PEG-SPA (Shearwater Polymers, Inc., Huntsville, Alabama) umgesetzt. Die Reaktion wurde bei einem Verhältnis von Protein:Reagenz von 1:2 ausgeführt und die Reinigungsvorgänge erfolgten gemäß Beispiel 2. Vorwiegend wurden monopegylierte Arten erzeugt.
BEISPIEL 4: In vivo Aktivität von pegyliertem EPO, ermittelt durch das normozythämische Mausassay
Das normozythämische Mausbioassay ist auf dem Fachgebiet bekannt (Pharm. Europa Spec. Issue Erythropoietin BRP Bio 1997(2)) und ein Verfahren in der Monographie von Erythropoietin von Ph. Eur. BRP. Die Proben wurden mit BSA-PBS verdünnt. Normale gesunde Mäuse, 7-15 Wochen alt, wurden s.c. mit 0,2 ml der EPO-Fraktion mit nicht pegyliertem EPO oder tri-, di- oder monopegyliertem EPO von Beispiel 2 oder 3 behandelt. Über einen Zeitraum von 6 Tagen wurde durch Punktur der Schwanzvene Blut entnommen und so verdünnt, daß 1 μl Blut in 1 ml einer 0,15 μmol Acridinorange-Färbelösung vorlag. Die Färbezeit betrug 3 bis 10 Minuten. Die Reticulozyten-Zählung wurde mikrofluorometrisch in einem Flowcytometer durch Analyse des roten Fluoreszenzhistogramms ausgeführt. Die Reticulozyten-Zählungen wurden in bezug auf absolute Zahlen (pro 30000 analysierten Blutzellen) angegeben. Für die vorliegenden Daten bestand jede Gruppe aus 5 Mäusen pro Tag und den Mäusen wurde nur einmal Blut entnommen.

In getrennten Versuchen wurde eine einzige Dosis von nicht modifiziertem EPO (25 ng EPO), das PEG(SPA)-EPO-Gemisch von Beispiel 2 (10 ng Konjugat), mono- und dipegylierte EPO von Beispiel 2 (10 ng Konjugat), das PEG(SPA)-EPO von Beispiel 3 (10 ng Konjugat) und Pufferlösung den Mäusen verabreicht. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. Die Ergebnisse zeigen die ausgezeichnete Aktivität und die längere Halbwertszeit der pegylierten EPO-Spezies, angezeigt durch die wesentlich höhere Mengen an Reticulozyten und der Verschiebung des Maximums der Reticulozyten-Zählung unter Verwendung derselben Dosis pro Maus (10 ng), verglichen mit einer Dosis von 25 ng für nicht modifiziertes EPO. Tabelle 2

	EPO (nicht modifiziert)	30 kDa SPA PEG	Mono 30K SBA	Di 30K SBA	PEG-EPO SBA Kon-jugat-Gemisch	Kontrollpuffer

72 h	1000	1393	1411	994	1328	857
96 h	500	1406	1501	926	1338	697
120 h	~200	1100	1182	791	944	701
144 h	~0	535	607	665	660	708

BEISPIEL 5: Herstellung von hauptsächlich Mono-PEG-EPO Pegylierungsumsetzung
Ausgehend von 100 mg (5,48 μmol) EPOsf in 100 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5, hergestellt gemäß Beispiel 1, wurden 329 mg (10,96 μmol) 30 kDa PEG-SBA-Reagenz, gelöst in 3 ml 1 mM HCl, zugegeben. Genügend 100 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5, wurde zugegeben, um das Volumen des Reaktionsgemisches auf 20 ml aufzufüllen. Die letztliche Proteinkonzentration betrug 5 mg/ml und das Verhältnis von Protein:PEG-Reagenz betrug 1:2. Das Reaktionsgemisch wurde 2 h bei Raumtemperatur (20-22°C) gemischt. Nach 2 h wurde die Reaktion durch Einstellen des pH-Werts auf 4,5 mit Eisessig gestoppt und bis zur Reinigung bei –20°C gefroren gelagert.
Reinigung
Das Reaktionsgemisch aus dem vorangehenden Schritt wurde mit 10 mM Natriumacetat, pH 4,5, 1:5 verdünnt und auf 300 ml SP-Sepharose FF (Sulfopropyl-Kationenaustauschharz), gefüllt in eine 4,2 × 19 cm-Säule, aufgetragen. Die Säule wurde vorher mit demselben Puffer ins Gleichgewicht gebracht. Der Säulenabstrom wurde mit einem UV-Monitor von Gilson bei 280 nm verfolgt und mit einem Bandschreiber von Kipp und Zonen aufgezeichnet. Die Säule wurde mit 300 ml oder 1 Bettvolumen Konditionierungspuffer gewaschen, um überschüssige Reagenzien, Reaktionsnebenprodukte und oligomeres PEG-EPO zu entfernen. Dem folgte Waschen mit 2 Bettvolumen von 100 mM NaCl, um Di-PEG-EPO zu entfernen. Mono-PEG-EPO wurde dann mit 200 mM NaCl eluiert. Während der Elution des Mono-PEG-EPO wurden die ersten 50 ml des Proteinpeaks verworfen und das Mono-PEG-EPO wurde als 150 ml-Fraktion gesammelt. Nicht modifiziertes EPOsf, das auf der Säule verblieb, wurde mit 750 mM NaCl eluiert. Alle Elutionspuffer wurden in dem Konditionierungspuffer hergestellt. Alle eluierten Proben wurden durch SDS-PAGE und durch High Performance Size Exclusion Chromatographie (SEC) analysiert. Der aus der 150 ml-Fraktion erhaltene Mono-PEG-EPO-Pool, bei dem kein nicht modifiziertes EPOsf nachgewiesen wurde, wurde dann auf –4,5-7,5 mg/ml konzentriert und in den Vorratspuffer, 10 mM Kaliumphosphat, 100 mM NaCl, pH 7,5, diafiltriert. Konzentrierung/Diafiltration erfolgte mit einem Millipore Labscale^TM TFF-System, ausgestattet mit einer 50 kDa Cut Off Millipore Pellicon XL Biomax 50-Membran, bei Umgebungstemperatur. Konzentriertes Mono-PEG-EPO wurde steril filtriert und bei –20°C gefroren gelagert.
Etwa 75% des EPOsf waren pegyliert. Nach der Reinigung betrug die Gesamtausbeute ~30% Mono-PEG-EPO ohne nachweisbaren nicht modifiziertes EPOsf und etwa 25% Di-PEG-EPO. Oligomere und nicht pegyliertes EPOsf machte das übrige Protein aus. Der Mono-PEG-EPO-Pool, erhalten aus der 150 ml-Fraktion, enthielt etwa 90% Mono-PEG-EPO und etwa 10% Di-PEG-EPO.
SEQUENCEPROTOKOLL

Claims

Konjugat, wobei das Konjugat ein Erythropoietinglycoprotein mit mindestens einer freien Aminogruppe umfaßt und die biologische in vivo-Aktivität aufweist, um Knochenmarkzellen zur gesteigerten Erzeugung von Reticulozyten und roten Blutzellen zu veranlassen, und ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Humanerythropoietin und Humanerythropoietin, modifiziert durch die Addition von 1 bis 6 Glycosylierungsstellen oder eine Umlagerung mindestens einer Glycosylierungsstelle, aufweisen, wobei das Glycoprotein kovalent an "n" Poly(ethylenglycol)gruppen der Formel -CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR gebunden ist, wobei die Gruppe -CO jeder Poly(ethylenglycol)gruppe eine Amidbindung mit einer der Aminogruppen bildet; wobei R C₁-C₆-Alkyl bedeutet; x 2 oder 3 bedeutet; m 450 bis 900 bedeutet; n 1 bis 3 bedeutet; und n und m so ausgewählt sind, daß das Molekulargewicht des Konjugats abzüglich des Erythropoietinglycoproteins 20 Kilodalton bis 100 Kilodalton beträgt.
Konjugat nach Anspruch 1 der Formel: P-[NHCO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR]_n (I) worin x, m, n und R wie in Anspruch 1 definiert sind und P der Rest des Glycoproteins ohne die n Aminogruppe(n), die Amidbindung(en) mit der/den Poly(ethylenglycol)gruppe(n) bildet/bilden, ist.
Konjugat nach einem vorangehenden Anspruch, wobei R Methyl ist.
Konjugat nach einem vorangehenden Anspruch, wobei m etwa 650 bis etwa 750 ist.
Konjugat nach einem vorangehenden Anspruch, wobei n 1 ist.
Konjugat nach einem vorangehenden Anspruch, wobei R Methyl ist; m etwa 650 bis etwa 750 ist und n 1 ist.
Konjugat nach einem vorangehenden Anspruch der Formel [CH₃O(CH₂CH₂O)_mCH₂CH₂CH₂CO-NH]_n-P worin m 650 bis 750 ist, n 1 ist und P wie in Anspruch 2 definiert ist.
Konjugat nach einem vorangehenden Anspruch, wobei das Glycoprotein Humanerythropoietin ist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Humanerythropoietinglycoprotein durch endogene Genaktivierung exprimiert wird.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei das Glycoprotein die Sequenz SEQ ID NR.: 1 aufweist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Glycoprotein die Sequenz von Humanerythropoietin, modifiziert durch die Addition von 1 bis 6 Glycosylierungsstellen, aufweist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das Glycoprotein die Sequenz von Humanerythropoietin, modifiziert durch eine Modifizierung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Asn³⁰Thr³²; Asn⁵¹Thr⁵³; Asn⁵⁷Thr⁵⁹; Asn⁶⁹; Asn⁶⁹Thr⁷¹; Ser⁶⁸Asn⁶⁹Thr⁷¹; Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰; Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰; Ser⁸⁷Asn⁸⁸Gly⁸⁹Thr⁹⁰; Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Thr⁹²; Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰Ala¹⁶²; Asn⁶⁹Thr⁷¹Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰; Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰; Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹; Ser⁸⁷Asn⁸⁹Ile⁹⁰Thr⁹¹; Asn¹³⁶Thr¹³⁸; Asn¹³⁸Thr¹⁴⁰; Thr¹²⁵; und Pro¹²⁴Thr¹²⁵ aufweist.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei das Glycoprotein eine Sequenz aufweist, die die Sequenz von Humanerythropoietin und eine zweite Sequenz am Carboxyterminus der Humanerythropoietin-Sequenz umfaßt, wobei die zweite Sequenz mindestens eine Glycosylierungsstelle enthält.
Konjugat nach Anspruch 13, wobei die zweiten Sequenzen eine Sequenz, abgeleitet von der Carboxy-endständigen Sequenz von Humanchorion-Gonadotropin, umfaßt.
Konjugat nach Anspruch 13, wobei das Glycoprotein eine Sequenz aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: (a) der Sequenz von Humanerythropoietin und der Sequenz von SEQ ID NR.: 3 am Carboxyterminus der Humanerythropoietin-Sequenz; (b) der Sequenz in (a), modifiziert durch Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰; und (c) der Sequenz in (a), modifiziert durch Asn³⁰Thr³²Val⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰.
Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das Glycoprotein die Sequenz von Humanerythropoietin, modifiziert durch eine Umlagerung mindestens einer Glycosylierungsstelle, aufweist.
Konjugat nach Anspruch 16, wobei die Umlagerung die Deletion von beliebigen der N-gebundenen Glycosylierungsstellen in Humanerythropoietin und Addition einer N-gebundenen Glycosylierungsstelle in Position 88 der Sequenz von Humanerythropoietin umfaßt.
Konjugat nach Anspruch 17, wobei das Glycoprotein die Sequenz von Humanerythropoietin, modifiziert durch eine Modifizierung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: Gln²⁴Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰; Gln³⁸Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰; und Gln⁸³Ser⁸⁷Asn⁸⁸Thr⁹⁰ aufweist.
Zusammensetzung, umfassend Konjugate, wobei jedes der Konjugate ein Erythropoietinglycoprotein mit mindestens einer freien Aminogruppe umfaßt und die biologische in vivo-Aktivität aufweist, um Knochenmarkzellen zur gesteigerten Erzeugung von Reticulozyten und roten Blutzellen zu veranlassen, und ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Humanerythropoietin und Humanerythropoietin, modifiziert durch die Addition von 1 bis 6 Glycosylierungsstellen oder eine Umlagerung mindestens einer Glycosylierungsstelle, aufweisen, wobei das Glycoprotein in jedem Konjugat kovalent an "n" Poly(ethylenglycol)gruppen der Formel -CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR gebunden ist, wobei die Gruppe -CO jeder Poly(ethylenglycol)gruppe eine Amidbindung mit einer der Aminogruppen bildet; wobei in jedem der Konjugate R C₁-C₆-Alkyl bedeutet; x 2 oder 3 bedeutet; m von 450 bis 900 bedeutet; n 1 bis 3 bedeutet; und n und m so ausgewählt sind, daß das Molekulargewicht von jedem Konjugat abzüglich des Erythropoietinglycoproteins 20 Kilodalton bis 100 Kilodalton beträgt, wobei der Prozentsatz der Konjugate, wenn n 1 ist, mindestens neunzig Prozent beträgt.
Zusammensetzung, umfassend Konjugate nach einem der Ansprüche 1 bis 18, wobei der Prozentsatz der Konjugate, wenn n 1 ist, mindestens neunzig Prozent beträgt.
Zusammensetzung nach Ansprüchen 19 oder 20, wobei der Prozentsatz der Konjugate, wenn n 1 ist, mindestens zweiundneunzig Prozent beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 21, wobei der Prozentsatz der Konjugate, wenn n 1 ist, mindestens sechsundneunzig Prozent beträgt.
Zusammensetzung nach Anspruch 19 oder 20, wobei der Prozentsatz der Konjugate, wenn n 1 ist, von neunzig Prozent bis sechsundneunzig Prozent beträgt.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein Konjugat oder eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 23 und einen pharmazeutisch verträglichen Exzipienten.
Verwendung eines Konjugats oder einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 23 zur Herstellung von Arzneimitteln zur Behandlung oder Prophylaxe von Krankheiten, die mit Anämie bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz (CRF), AIDS oder zur Behandlung von Krebspatienten, die mit einer Chemotherapie behandelt werden, in Beziehung stehen.
Verfahren zur Herstellung von Konjugaten nach einem der Ansprüche 1 bis 23, umfassend die Kondensation der Verbindung der Formel II
mit einem Erythropoietinglycoprotein und worin R, m und x wie für einen der Ansprüche 1 bis 6 definiert sind.
Konjugate nach einem der Ansprüche 1 bis 18 zur Behandlung von Krankheiten, die mit Anämie bei Patienten mit chronischer Niereninsuffizienz (CRF), AIDS und Krebspatienten, die mit einer Chemotherapie behandelt werden, verbunden sind.
Konjugat, wobei das Konjugat ein Humanerythropoietinglycoprotein mit mindestens einer freien Aminogruppe umfaßt und die biologische in vivo-Aktivität aufweist, um Knochenmarkzellen zur gesteigerten Erzeugung von Reticulozyten und roten Blutzellen zu veranlassen, wobei das Glycoprotein kovalent an "n" Poly(ethylen-glycol)gruppen der Formel -CO-(CH₂)_x-(OCH₂CH₂)_m-OR gebunden ist, wobei die Gruppe -CO jeder Poly(ethylenglycol)gruppe eine Amidbindung mit einer der Aminogruppen bildet; wobei R Methyl bedeutet; x 3 bedeutet; m 650 bis 750 bedeutet; n 1 bedeutet; und n und m so ausgewählt sind, daß das durchschnittliche Molekulargewicht des Konjugats abzüglich des Erythropoietinglycoproteins etwa 30 Kilodalton beträgt.