DE60036863T2

DE60036863T2 - Medizinische vorrichtungen und verwendungen von polyhydroxyalkanoatpolymeren

Info

Publication number: DE60036863T2
Application number: DE60036863T
Authority: DE
Inventors: Simon F. Sherborn WILLIAMS; David P. Arlington MARTIN; Frank Somerville SKRALY
Original assignee: Metabolix Inc
Current assignee: Metabolix Inc
Priority date: 1999-03-25
Filing date: 2000-03-24
Publication date: 2008-07-31
Anticipated expiration: 2020-03-25
Also published as: EP2305324A1; EP2305324B1; JP2002539854A; EP1867348A2; ATE376433T1; JP5031144B2; US20080095823A1; US6867247B2; CA2368470A1; US7553923B2; WO2000056376A1; US6548569B1; ES2525553T3; CA2368470C; US20020156150A1; US20070135929A1; AU4027700A; DE60036863D1; WO2000056376A9; PT1163019E

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft generell medizinische Implantate, die Biopolymere aus Polyhydroxyalkanoat ("PHA") umfassen, sowie medizinische Anwendungen und Verfahren zu ihrer Herstellung.
Hintergrund der Erfindung
Auf dem Gebiet der Medizin sind verschiedene abbaubare Polymere entwickelt worden, die sich in vivo innerhalb von Wochen oder wenigen Monaten in ihre jeweiligen Monomere zersetzen. Trotz der Verfügbarkeit dieser synthetischen abbaubaren Polymere besteht immer noch ein Bedarf an der Entwicklung abbaubarer Polymere, die das Spektrum der zur Verfügung stehenden Eigenschaften, insbesondere der mechanischen Eigenschaften, weiter verbreitern.
Polyhydroxyalkanoate sind natürliche thermoplastische Polyester, und sie können mittels herkömmlicher Techniken der Polymerverarbeitung für den Einsatz in einer enormen Vielzahl von Anwendungen, einschließlich der Verpackung von Verbrauchsartikeln, Auskleidungen von Einmalwindeln und Abfalltüten, Nahrungsprodukten und medizinischen Produkten, verarbeitet werden. Zunächst waren die Anstrengungen auf Anwendungen, die Formprozesse beinhalten, gerichtet, insbesondere auf Verpackungen wie Flaschen, Behälter für Kosmetikartikel, Kugelschreiber und Golftees. Die US-Patente Nr. 4 826 493 und 4 880 592 beschreiben die Herstellung von Folien aus Poly-(R)-3-hydroxybutyrat ("PHB") und Poly-(R)-3-hydroxybutyrat-co-(R)-3-hydroxyvalerat ("PHBV") und ihre Verwendung als Backsheets für Windeln. Das US-Patent Nr. 5 292 860 beschreibt die Herstellung des PHA-Copolymers Poly(3-hydroxybutyrat-co-3-hydroxyhexanoat) und die Verwendung dieser Polymere zur Herstellung von Backsheets für Windeln und anderen Einmalartikeln. Materialien für Backsheets für Windeln und andere Materialien für die Herstellung biologisch abbaubarer oder kompostierbarer Kosmetikartikel aus PHB-Copolymeren, bei denen es sich nicht um PHBV handelt, werden in PCT WO 95/20614 , WO 95/20621 , WO 95/23250 , WO 95/20615 , WO 95/33874 , WO 96/08535 und in den US-Patenten Nr. 5 502 116 , 5 536 564 und 5 489 470 beschrieben.
Eine der nützlichsten Eigenschaften von PHAs, durch die sie sich deutlich von petrochemisch erzeugten Polymeren unterscheiden, ist ihre biologische Abbaubarkeit. PHAs, die natürlicherweise durch Bodenbakterien erzeugt werden, werden bei der nachfolgenden Exposition gegen die gleichen Bakterien entweder im Boden, im Kompost oder im Meeressediment abgebaut. Der biologische Abbau von PHAs hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie der mikrobiellen Aktivität der Umgebung und der Oberfläche des Gegenstandes. Die Temperatur, der pH, das Molekulargewicht und die Kristallinität sind ebenfalls wichtige Faktoren. Der biologische Abbau beginnt, wenn Mikroorganismen anfangen, auf der Oberfläche des Kunststoffs zu wachsen und Enzyme zu sezernieren, die das Polymer in monomere Einheiten aus Hydroxysäuren abbauen, die dann von den Mikroorganismen aufgenommen und als Kohlenstoffquellen für ihr Wachstum verwendet werden. In aeroben Umgebungen werden die Polymere zu Kohlendioxid und Wasser abgebaut, während die Abbauprodukte in anaeroben Umgebungen Kohlendioxid und Methan sind (Williams & Peoples, CHEMTECH 26: 38–44 (1996)). Während man generell davon ausgeht, dass der Mechanismus des Abbaus von PHAs in der Umwelt über einen enzymatischen Angriff verläuft, und er relativ schnell sein kann, nimmt man allgemein an, dass der Mechanismus des Abbaus in vivo einen einfachen hydrolytischen Angriff auf die Esterbindungen der Polymere beinhaltet, der proteinvermittelt sein kann, es aber nicht sein muss. Im Gegensatz zu Polymeren, die 2-Hydroxysäuren umfassen, wie Polyglykolsäure und Polymilchsäure, bestehen Polyhydroxyalkanoate normalerweise aus 3-Hydroxysäuren und, in bestimmten Fällen, 4-, 5- und 6-Hydroxysäuren. Die sich von diesen Hydroxysäuren ableitenden Esterbindungen sind im Allgemeinen gegenüber einer Hydrolyse weniger empfindlich als Esterbindungen, die sich von 2-Hydroxysäuren ableiten.
Forscher haben Verfahren zur Erzeugung einer großen Vielzahl von PHAs entwickelt, und ungefähr 100 verschiedene Monomere sind unter kontrollierten Fermentationsbedingungen in Polymere inkorporiert worden (Steinbüchel & Valentin, FEMS Microbiol. Lett. 128: 219–28 (1995)). Es gibt derzeit nur zwei im Handel erhältliche PHA-Zusammensetzungen: PHB und PHBV. Aufgrund ihrer großen Mannigfaltigkeit bezüglich der Zusammensetzung können PHAs mit unterschiedlichen physikalischen Eigenschaften erzeugt werden (Williams & Peoples, CHEMTECH 26: 38–44 (1996)). Die im Handel erhältlichen PHAs, PHB und PHBV, repräsentieren nur einen kleinen Teil der in den PHAs zur Verfügung stehenden Gruppen von Eigenschaften. Zum Beispiel liegt die Dehnung beim Reißen für PHB und PHBV im Bereich von ungefähr 4 bis 42%, während die gleiche Eigenschaft für Poly-4-hydroxybutyrat ("P4HB") bei ungefähr 100% liegt (Saito & Doi, Int. J. Biol. Macromol. 16: 99–104 (1994)). Ähnlich liegen die Werte für den Elastizitätsmodul und die Zugfestigkeit für PHB und PHBV bei 3,5 bis 0,5 GPa bzw. 40 bis 16 MPa (für einen auf 25 Mol-% ansteigenden HV-Gehalt) im Vergleich zu 149 MPa bzw. 104 MPa für P4HB (Saito & Doi, Int. J. Biol. Macromol. 16: 99–104 (1994)).
PHB und PHBV sind bezüglich eines Einsatzes in biomedizinischen Anwendungen extensiv untersucht worden, zusätzlich zu ihrer kommerziellen Verwendung als biologisch abbaubarer Ersatz für synthetische Harze für Bedarfsgegenstände. Diese Studien reichen von potenziellen Anwendungen bei der verzögerten Freisetzung (siehe z. B. Koosha et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 6: 117–30 (1989) und Pouton & Akhtar, Adv. Drug Delivery Rev. 18: 133–62 (1996)) bis zur Verwendung bei der Formulierung von Tabletten, chirurgischen Nähten, Wundverbänden, Schmierpulvern, Blutgefäßen, Gewebegerüsten, chirurgischen Implantaten zur Verbindung röhrenförmiger Körperteile, Platten zur Fixierung von Knochenbrüchen und in anderen orthopädischen Anwendungen, wie es in PCT WO 98/51812 beschrieben wird. Aus PHB hergestellte Wundverbände werden in GB 2166354 A an Webb et al. beschrieben. Eine fortgeschrittene medizinische Anwendung ist der Einsatz von PHB und PHBV zur Erzeugung eines porösen, biologisch resorbierbaren flexiblen Bogens zur Trennung von Geweben und zur Stimulierung einer Geweberegeneration in geschädigtem weichem Gewebe, wie es in EP 754467 A1 an Bowald et al. und EP 349505 A2 beschrieben wird. In Berichten wurde auch die Verwendung von PHBV zur Aufrechterhaltung des Zellwachstums beschrieben (Rivard et al., J. Appl. Biomat. 6: 65–68 (1995)).
Neben der Biokompatibilität ist es oft erwünscht, dass sich eine implantierte medizinische Vorrichtung zersetzen sollte, nachdem sie ihre primäre Funktion erfüllt hat. PHB und PHVB, die einzigen bis heute als medizinische Implantate getesteten PHAs, haben in vivo sehr lange Abbauzeiten gezeigt, von mehr als einem Jahr für PHB (Duvernoy et al., Thorac. Cardiovasc. Surgeon 43: 271–74 (1995), Malm et al., J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 104: 600–07 (1992)). Für viele Anwendungen ist diese sehr lange Abbaudauer unerwünscht, da die Persistenz des Polymers an der Stelle einer Wundheilung beim Patienten zu einer chronischen entzündlichen Reaktion führen kann. Für sich langsam zersetzende PHB-Patches, die zur Regenerierung von Arteriengewebe eingesetzt wurden, wurde gefunden, dass sie eine lange (über mehr als zwei Jahre) anhaltende Makrophagen-Reaktion hervorrufen (Malm et al., Eur. Surg. Res. 26: 298–308 (1994)). Für Makrophagen wurde gefunden, dass sie am Abbau der PHB-Implantate beteiligt sind, und diese lange anhaltende Makrophagen-Reaktion zeigt offenbar das Vorliegen persistenter, sich langsam zersetzender, teilchenförmiger Materialien an, die vom Implantat abstammen. Zwar war ein PHB-Patch, der für die Reparatur des Perikards eingesetzt worden war, mittels normaler Lichtmikroskopie nach einer 12-monatigen Implantation nicht mehr nachweisbar, aber mittels einer Mikroskopie unter Verwendung von polarisiertem Licht wurde etwas restliches teilchenförmiges Material gesehen (Malm et al., Scand. J. Thor. Cardiovasc. Surg. 26: 9–14 (1992)). Es ist unklar, ob dieses teilchenförmige Material am Ort des Implantats verbleibt, oder ob es durch den Körper wandert und möglicherweise unvorhergesehene Komplikationen verursacht. Das biologische Schicksal oder die medizinischen Auswirkungen des teilchenförmigen Materials kann bzw. können ohne eine Langzeitstudie nicht vorhergesagt werden. Zur Minimierung potenzieller Probleme, die mit sich langsam zersetzenden PHAs assoziiert sind, ist es vorteilhaft, resorbierbare Materialien, die sich in vivo schneller abbauen, einzusetzen.
Es gibt bisher nur einen Bericht, der die Biokompatibilität oder den In-vivo-Abbau irgendeines anderen PHA-Polymers in biomedizinischen Anwendungen beschreibt (PCT WO 98/51812 ). Das US-Patent Nr. 5 334 698 an Witholt et al. offenbart medizinische Gegenstände, die mittels eines optisch aktiven Polyesters hergestellt werden, der aus Zellen von Pseudomonas oleovorans isoliert wird. Es werden jedoch keine Beispiele und keine Diskussion der Herstellung oder der Testung auf Biokompatibilität gebracht, und es werden keine Verfahren zur Gewinnung des Polymers in einer für eine medizinische Verwendung in vivo geeigneten reinen Form bereitgestellt. Da für die Produktion dieser Polymere geeignete Bakterien auch ein Endotoxin sowie andere Entzündungsmediatoren bilden können, ist es wichtig, dass das Polymer zur Entfernung dieser Verunreinigungen bearbeitet wird.
Für viele Anwendungen ist die Geschwindigkeit des biologischen Abbaus des PHA gut für die erforderliche Lebensdauer des Produkts geeignet. In bestimmten Fällen wäre es jedoch wünschenswert, die Geschwindigkeit, mit der sich die Polymere in der Umwelt zersetzen, besser steuern zu können. Eine derartige Steuerung würde das Spektrum der Anwendungen für diese Polymerklasse erweitern. Zum Beispiel kann eine PHA-Folie geeignete mechanische Eigenschaften für eine Verwendung als Mulchfolie haben, aber trotzdem nicht die optimale Abbaugeschwindigkeit für diese Anwendung aufweisen. Die Fähigkeit, die Abbaugeschwindigkeit des Polymers in der Umwelt steuern zu können, wäre somit ein ausgesprochener Vorteil.
Das US-Patent Nr. 5 935 506 offenbart einen Stent aus PHB. Die Stent-Konstruktion, für die berichtet wird, dass sie schnell biologisch resorbiert wird, enthält eine große Menge eines Weichmachers. Der Ansatz unter Verwendung eines mit einem Weichmacher versehenen PHB funktioniert jedoch nicht, da nach 4 Wochen eine Stenose des Stents von über 90% gezeigt wurde (siehe Behrend, American. J. Cardiol., S. 45, TCT Abstracts (Okt. 1998), Unverdorben et al., American J. Cardiol., S. 46, TCT Abstracts (Okt. 1998). Es wäre vorteilhaft, einen biologisch resorbierbaren Stent mit verbesserten mechanischen Eigenschaften und ohne einen Weichmacher bereitzustellen.
Somit ist, auch wenn die Polyhydroxyalkanoate ein breites Spektrum mechanischer Eigenschaften bereitstellen, die in medizinischen Anwendungen potenziell nützlich sein könnten, ihr Einsatz insbesondere in vivo als resorbierbare Polymere durch ihre langsame Hydrolyse eingeschränkt. Es wäre deshalb wünschenswert, Verfahren zur Steuerung der Abbaugeschwindigkeiten von Polyhydroxyalkanoaten zu entwickeln.
PCT WO 98/51812 offenbart Verfahren zur Herstellung eines großen Bereiches an biologisch abbaubaren, biokompatiblen Polyestermaterialien, die als Polyhydroxyalkanoate bekannt sind. Diese Materialien werden in hoher Reinheit hergestellt, und sie sind für den Einsatz in medizinischen Anwendungen in vivo geeignet.
Es ist deshalb ein Ziel dieser Erfindung, neue Vorrichtungen aus und Anwendungen für Zusammensetzungen, die Polyhydroxyalkanoate umfassen oder sich von ihnen ableiten, bereitzustellen, die sich in der Umwelt und/oder in vivo leichter zersetzen.
Es ist ein weiteres Ziel dieser Erfindung, Verfahren zur Herstellung der Gegenstände und Vorrichtungen aus diesen Zusammensetzungen bereitzustellen.
Zusammenfassung der Erfindung
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein biokompatibles, medizinisches Implantat für die Befestigung, Fixierung, Stützung, Reparatur oder Verstärkung von weichem Gewebe bereitgestellt, wobei das Implantat eine Zusammensetzung aus einem Poly(4-hydroxybutyrat)-Homopolymer umfasst,
wobei die Zusammensetzung aus dem Poly(4-hydroxybutyrat)-Homopolymer gegebenenfalls Additive umfasst, die die chemische Beständigkeit des Polymers verändern,
wobei das Poly(4-hydroxybutyrat)-Homopolymer ein Gewichtsmittel des Molekulargewichts im Bereich zwischen 10 000 und 10 000 000 Dalton aufweist,
wobei das Implantat aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Verschlussnähten, Vorrichtungen für die Meniskusreparatur, Nieten, Stiften, Interferenzschrauben, chirurgischen Netzen für Implantate in weiches Gewebe zur Verstärkung von weichem Gewebe, zur Überbrückung von Faszienschäden, für Patches für die Trachea oder andere Organe, für eine Organentnahme, für ein Material für eine Duratransplantation, für Verbände für Wunden oder Verbrennungen oder für eine hämostatische Tamponade, Schlingen, orthopädischen Stiften, Adhäsionsbarrieren, kardiovaskulären Stents, gastroenterologischen Stents oder Ureterstents, Vorrichtungen für die Gelenkknorpelreparatur, Nervenleitschienen, Vorrichtungen für die Sehnenreparatur, Vorrichtungen für die Reparatur von Atriumseptum-Defekten, kardiovaskulären Patches für ein Patch-Grafting an Gefäßen, eine Anbringung intrakardialer Patches oder einen Patchverschluss nach einer Endarteriektomie, und Reparaturpatches für die Reparatur abdominaler Schäden und von Schäden der Thoraxwand, von Inguinal-, Parakolostomie-, Ventral-, Nabel-, Skrotal- oder Femoralhernien, für die Verstärkung von Muskellappen, für die Verstärkung von Klammernähten und langen Schnitten, für die Rekonstruktion des Beckenbodens, für die Reparatur des Rektum- und Scheidenvorfalls, für Polster für Nähte und Klammern, für die Reparatur der Harnwege und -blase oder für Binden.
Es wird auch ein Verfahren zur Herstellung eines biokompatiblen, medizinischen Implantats für die Befestigung, Fixierung, Stützung, Reparatur oder Verstärkung von weichem Gewebe bereitgestellt, wobei das Implantat eine Zusammensetzung aus einem Poly(4-hydroxybutyrat)-Homopolymer umfasst,
wobei die Zusammensetzung aus einem Poly(4-hydroxybutyrat)-Homopolymer gegebenenfalls Additive umfasst, die die chemische Beständigkeit des Polymers verändern,
wobei das Poly(4-hydroxybutyrat)-Homopolymer ein Gewichtsmittel des Molekulargewichts im Bereich zwischen 10 000 und 10 000 000 Dalton hat,
wobei das Verfahren umfasst:
Bereitstellen einer Zusammensetzung aus einem Poly(4-hydroxybutyrat)-Homopolymer,
wobei die Zusammensetzung aus einem Poly(4-hydroxybutyrat)-Homopolymer gegebenenfalls Additive umfasst, die die chemische Beständigkeit des Polymers verändern,
wobei das Poly(4-hydroxybutyrat)-Homopolymer ein Gewichtsmittel des Molekulargewichts im Bereich zwischen 10 000 und 10 000 000 Dalton hat, und
Formen oder Inkorporieren der Zusammensetzung aus einem Poly(4-hydroxybutyrat)-Homopolymer zu einem Implantat oder in ein Implantat, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Verschlussnähten, Vorrichtungen für die Meniskusreparatur, Nieten, Stiften, Interferenzschrauben, chirurgischen Netzen für Implantate in weiches Gewebe zur Verstärkung von weichem Gewebe, zur Überbrückung von Faszienschäden, für Patches für die Trachea oder andere Organe, für eine Organentnahme, für ein Material für eine Duratransplantation, für Verbände für Wunden oder Verbrennungen oder für eine hämostatische Tamponade, Schlingen, orthopädischen Stiften, Adhäsionsbarrieren, kardiovaskulären Stents, gastroenterologischen Stents oder Ureterstents, Vorrichtungen für die Gelenkknorpelreparatur, Nervenleitschienen, Vorrichtungen für die Sehnenreparatur, Vorrichtungen für die Reparatur von Atriumseptum-Defekten, kardiovaskulären Patches für ein Patch-Grafting an Gefäßen, eine Anbringung intrakardialer Patches oder einen Patchverschluss nach einer Endarteriektomie, und Reparaturpatches für die Reparatur abdominaler Schäden und von Schäden der Thoraxwand, von Inguinal-, Parakolostomie-, Ventral-, Nabel-, Skrotal- oder Femoralhernien, für die Verstärkung von Muskellappen, für die Verstärkung von Klammernähten und langen Schnitten, für die Rekonstruktion des Beckenbodens, für die Reparatur des Rektum- und Scheidenvorfalls, für Polster für Nähte und Klammern, für die Reparatur der Harnwege und -blase oder für Binden.
Die Abbaugeschwindigkeiten von Polymeren können durch den Zusatz verschiedener Komponenten zu Polymerzusammensetzungen sowie die Auswahl der chemischen Zusammensetzung, des Molekulargewichts, der Verarbeitungsbedingungen und der Form des fertigen Polymergegenstandes manipuliert werden. Die chemische Zusammensetzung kann durch die Wahl von Monomeren verändert werden, die in das Polymer inkorporiert werden können, indem Bindungen, chemische Rückgratgruppen oder anhängende Gruppen verändert werden und/oder indem das Molekulargewicht manipuliert wird. Die Polyhydroxyalkanoat-Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Implantats kann Additive zur Veränderung der Abbaugeschwindigkeit enthalten. Die Porosität kann erhöht werden, hydrophile Substanzen können zugefügt werden, und/oder es kann die dem Wasser ausgesetzte Oberfläche erhöht werden, was alles die Abbaugeschwindigkeit erhöht. Hydrophobe Beschichtungen oder die Inkorporation hydrophober Substanzen in das Polymer oder das Zumischen hydrophober Substanzen zum Polymer verringern bzw. verringert die Abbaugeschwindigkeit.
Zu bevorzugten Implantaten gehören Verschlussnähte, Vorrichtungen für die Meniskusreparatur, Nieten, Stifte, Interferenzschrauben, chirurgische Netze für die oben angegebenen Verwendungen, Reparatur-Patches für die oben angegebenen Verwendungen, Schlingen, kardiovaskuläre Patches für die oben angegebenen Verwendungen, orthopädische Stifte (einschließlich von Material zur Verwendung beim Auffüllen von Knochen), Adhäsionsbarrieren, die oben beschriebenen Stents, Vorrichtungen für die Gelenkknorpelreparatur, Nervenleitschienen, Vorrichtungen für die Sehnenreparatur und Vorrichtungen für die Reparatur von Atriumseptum-Defekten. Polyhydroxyalkanoat-Zusammensetzungen können sowohl in neuen als auch in bereits existierenden medizinischen Anwendungen eingesetzt werden, einschließlich der Arzneimittelzufuhr und der verzögerten Freisetzung von Arzneimitteln und anderen bioaktiven Materialien. Polyhydroxyalkanoat-Zusammensetzungen können auch zur Herstellung oder Formung von Beschichtungen auf einer großen Vielzahl von Vorrichtungen, einschließlich von Stents, Kathetern und Sensoren, verwendet werden. Ihre Vorteile für neue und bereits existierende Anwendungen können der Einsatz eines biologisch abbaubaren Ersatzmaterials in der Anwendung sein oder die Hinzufügung eines anderen erwünschten Charakteristikums oder Attributs, das mit der Anwendung oder dem Einsatz assoziiert ist, wie eine mechanische Eigenschaft oder eine Oberflächeneigenschaft, eine physikalische oder chemische Eigenschaft, eine Sterilisierungstechnik, eine Biokompatibilität, einen Abbaumechanismus, eine bevorzugte Verpackung und/oder einen Aspekt bezüglich der Stabilität.
Wie durch die Beispiele demonstriert wird, haben Polyhydroxyalkanoat-Zusammensetzungen, die Poly(4HB) umfassen, extrem günstige mechanische Eigenschaften, und sie sind biokompatibel und zersetzen sich unter physiologischen Bedingungen in einem erwünschten Zeitrahmen. Diese Polyhydroxyalkanoat-Materialien stellen ein breiteres Spektrum an Abbaugeschwindigkeiten des Polyhydroxyalkanoats bereit, als sie derzeit verfügbar sind.
Es werden auch Verfahren zur Verarbeitung dieser Materialien zu Vorrichtungen, die implantiert oder injiziert werden können, beschrieben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung von PHA-Biopolymeren, die in Abhängigkeit von der Länge ihrer anhängenden Gruppen und ihrer jeweiligen Biosynthesewege grob in Gruppen eingeteilt sind.
2a ist eine schematische Darstellung der Wege, über die PHAs mit kurzen anhängenden Gruppen erhalten werden. 2b ist eine schematische Darstellung der Wege, über die PHAs mit langen anhängenden Gruppen erhalten werden.
3 ist eine grafische Darstellung des Abbaus von P4HB in vivo mit der Zeit (Wochen).
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Es sind medizinische Implantate entwickelt worden, die biokompatible Polyhydroxyalkanoat-Zusammensetzungen, wie sie im beigefügten Anspruch 1 definiert werden, umfassen.
I. Definitionen
Ein "bioerodierbares Polymer" ist ein wasserunlösliches Polymer, das unter physiologischen Bedingungen in wasserlösliche Materialien überführt wird, und zwar unabhängig vom jeweiligen Mechanismus, der am Erosionsprozess beteiligt ist. "Bioerosion" schließt sowohl physikalische Prozesse (wie eine Auflösung) als auch chemische Prozesse (wie eine Spaltung des Rückgrats) ein. Die Vorsilbe "bio oder Bio" gibt an, dass die Erosion unter physiologischen Bedingungen erfolgt, im Gegensatz zu anderen Erosionsprozessen, die zum Beispiel durch hohe Temperaturen, starke Säuren oder Basen, UV-Licht oder die Wetterbedingungen verursacht werden. Die Begriffe "Bioresorption" und "Bioabsorption" werden austauschbar eingesetzt und implizieren häufig, dass das Polymer oder seine Abbauprodukte in einer biologischen Umgebung über eine zelluläre Aktivität (z. B. eine Phagozytose) entfernt wird bzw. werden.
So, wie er hier unter Bezug auf Polymere verwendet wird, bezieht sich der Begriff "abbauen" auf eine solche Spaltung der Polymerkette, dass das Molekulargewicht auf der Ebene des Oligomers angenähert konstant bleibt und Polymerpartikel nach dem Abbau zurückbleiben. Der Begriff "vollständig abbauen" bezieht sich auf eine solche Spaltung des Polymers auf der molekularen Ebene, dass es zu einem praktisch vollständigen Massenverlust kommt. Der Begriff "abbauen", wie er hier verwendet wird, schließt "vollständig abbauen" mit ein, sofern nichts anderes angegeben wird.
"Biokompatibel" bezieht sich auf Materialien, die nach einer Implantation oder einer Ingestion keine toxische oder keine schwere immunologische Reaktion hervorrufen.
II. Polyhydroxyalkanoat ("PHA")-Zusammensetzungen
1) Polymerzusammensetzungen
"PHA-Materialien" enthalten eine oder mehrere Einheit(en), zum Beispiel zwischen 10 und 100 000, und vorzugsweise zwischen 100 und 30 000, Einheiten mit der folgenden Formel (1): -OCR¹R²(CR³R⁴)_nCO wobei n eine ganze Zahl ist, zum Beispiel zwischen 1 und 15, und bei einer bevorzugten Ausführungsform zwischen 1 und 4, und
wobei R¹, R², R³ und R⁴ unabhängig voneinander Kohlenwasserstoffgruppen, einschließlich von Gruppen aus langkettigen Kohlenwasserstoffen, halogen- und hydroxysubstituierte Gruppen, Hydroxygruppen, Halogengruppen, stickstoffsubstituierte Gruppen, sauerstoffsubstituierte Gruppen und/oder Wasserstoffatomen sein können.
Die Formel -(CR³R⁴)_n- schließt die folgenden Formeln ein: -CR³R⁴- (wobei n = 1), -CR³R⁴CR^3'CR^4'- (wobei n = 2), und -CR³R⁴CR^3'CR^4'CR^3''CR^4''- (wobei n = 3), wobei R³, R⁴, R^3', R^4', R^3'' und R^4'' unabhängig voneinander Kohlenwasserstoffgruppen, einschließlich von Gruppen aus langkettigen Kohlenwasserstoffen, halogen- und hydroxysubstituierte Gruppen, Hydroxygruppen, Halogengruppen, stickstoffsubstituierte Gruppen, sauerstoffsubstituierte Gruppen und/oder Wasserstoffatomen sein können. Somit schließt die Formel (I) Einheiten ein, die sich von 3-Hydroxysäuren (n = 1), 4-Hydroxysäuren (n = 2) und 5-Hydroxysäuren (n = 3) ableiten.
Diese Einheiten können die gleichen in einem Homopolymer sein, oder sie können mehrere unterschiedliche Einheiten sein, wie zum Beispiel in einem Copolymer oder Terpolymer. Die Polymere haben typischerweise ein Molekulargewicht von über 300, zum Beispiel zwischen 300 und 10⁷, oder, wie bei den in der vorliegenden Erfindung eingesetzten Poly(4-hydroxybutyrat)-Homopolymeren, von 10 000 bis 10 000 000 Dalton.
PHA-Materialien können andere Moleküle enthalten oder so modifiziert sein, dass sie andere Moleküle enthalten, wie bioaktive und nachweisbare Verbindungen, oberflächenaktive Mittel, andere abbaubare oder nicht-abbaubare Polymere sowie Materialien, die zur Modifizierung mechanischer Eigenschaften von PHAs eingesetzt werden, wie Weichmacher, Füllstoffe, Nukleierungsmittel, Farbstoffe, Stabilisatoren, Modifikatoren und Bindemittel.
Repräsentative PHAs werden bei Steinbüchel & Valentin, FEMS Microbiol. Lett. 128: 219–28 (1995), beschrieben.
PHB und P4HB haben sehr unterschiedliche physikalische Eigenschaften. Ein Spektrum von PHA-Copolymeren, die 4-Hydroxybutyrat enthalten, ist entweder bekannt oder kann mit einem Spektrum an Eigenschaften hergestellt werden, die zwischen denen von PHB und P4HB liegen (Saito & Doi, Int. J. Biol. Macromol. 16: 99–104 (1994)). Über biomedizinische Anwendungen, eine Testung auf Biokompatibilität und den In-vivo-Abbau von P4HB und seinen Copolymeren ist jedoch nicht berichtet worden. PHA-Copolymere von 4HB und 3HB mit Zusammensetzungen, die von 0 bis 100% 4HB variieren, sind in Alcaligenes eutrophus erzeugt worden (Nakamura et al., Macromol. 25: 4237–31 (1992)), und solche mit 64 bis 100% 4HB in Comamonas acidovorans (Saito & Doi, Int. J. Biol. Macromol. 16: 99–104 (1994)). Diese Polymere hatten jedoch eine bescheidene Molekülmasse (1 × 10⁵ bis 5 × 10⁵ g/mol, bestimmt mittels GPC) im Vergleich zur Molekülmasse, die in rekombinanten E. coli erzeugt wurde (über 5 × 10⁵ g/mol, GPC).
PHA-Biopolymere können auf der Basis der Länge ihrer anhängenden Gruppen und ihrer jeweiligen Biosynthesewege grob in drei Gruppen eingeteilt werden (1). Diejenigen mit kurzen anhängenden Gruppen, wie Polyhydroxybutyrat (PHB), ein Homopolymer aus R-3-Hydroxybuttersäure (R-3HB)-Einheiten, sind hochkristalline, thermoplastische Materialien und am längsten bekannt (Lemoigne und Roukhelman, Annales des fermentations 5: 527–36 (1925)). Von einer zweiten Gruppe von PHAs, die die kurzen R-3HB-Einheiten mit viel längeren anhängenden Gruppen aus Hydroxysäureeinheiten zufällig polymerisiert enthalten, wurde erstmals in den frühen 1970er Jahren berichtet (Wallen und Rohwedder, Environ. Sci. Technol. 8: 576–79 (1974)). Verschiedene Mikroorganismen, die spezifisch Copolymere aus R-3HB mit diesen längeren anhängenden Gruppen aus Hydroxysäureeinheiten produzieren, sind ebenfalls bekannt und gehören zu dieser zweiten Gruppe (Steinbüchel und Wiese, Appl. Microbiol. Biotechnol. 37: 691–97 (1992)). In den frühen 80er Jahren identifizierte eine Forschergruppe in den Niederlanden eine dritte Gruppe von PHAs, die vorwiegend längere anhängende Gruppen aus Hydroxysäuren enthielten (De Smet et al., J. Bacteriol. 154: 870–78 (1983)).
PHA-Polymere können bis zu 90% des Zelltrockengewichts von Bakterien ausmachen, und sie finden sich als einzelne Körnchen im Inneren der Bakterienzellen. Diese PHA-Körnchen akkumulieren als Reaktion auf einen Nährstoffmangel und dienen als Reservematerialien für Kohlenstoff und Energie. Von Mikroorganismen werden unterschiedliche Wege zur Erzeugung jeder dieser Polymergruppen eingesetzt. Einer dieser Wege, der zu den Polyhydroxyalkanoaten mit kurzen anhängenden Gruppen ("short pendant group polyhydroxyalkanoates", SPGPHAs) führt, umfasst drei Enzyme, nämlich die Thiolase, die Reduktase und die PHB-Synthase (manchmal als Polymerase bezeichnet). Über diesen Weg wird das Homopolymer PHB durch die Kondensation von zwei Molekülen Acetyl-Coenzym-A unter Bildung von Acetoacetyl-Coenzym-A, gefolgt von der Reduktion dieses Zwischenprodukts zu R-3-Hydroxybutyryl-Coenzym-A und der nachfolgenden Polymerisation, synthetisiert (2a). Das letzte Enzym in diesem Weg, die Synthase, hat eine Substratspezifität, die monomere C3-C5-Einheiten, einschließlich von R-4-Hydroxysäure- und R-5-Hydroxysäureeinheiten, umsetzen kann. Dieser Biosyntheseweg findet sich zum Beispiel in den Bakterien Zoogloea ramigera und Alcaligenes eutrophus. Der Biosyntheseweg, der zur Bildung der dritten Gruppe der PHAs, der Polyhydroxyalkanoate mit langen anhängenden Gruppen ("long pendant group PHAs", LPGPHAs) eingesetzt wird, ist zum Teil noch unbekannt. Es wird jedoch derzeit angenommen, dass die monomeren Hydroxyacyleinheiten, die zu den LPGPHAs führen, aus der β-Oxidation von Fettsäuren und dem Fettsäureweg stammen (2b). Die R-3-Hydroxyacyl-Coenzym-Substrate, die aus diesen Wegen hervorgehen, werden dann durch PHA-Synthasen (manchmal als Polymerasen bezeichnet), die Substratspezifitäten haben, die die größeren monomeren Einheiten im C6-C14-Bereich bevorzugen, polymerisiert. LPGPHAs werden zum Beispiel von Pseudomonaden erzeugt.
Von der zweiten Gruppe von PHAs, die Monomere sowohl aus kurzen R-3HB-Einheiten als auch solchen mit längeren anhängenden Gruppen enthalten, wird angenommen, dass sie beide Wege zur Bereitstellung der Hydroxysäuremonomere einsetzen. Die Letzteren werden dann von PHA-Synthasen, die imstande sind, diese Einheiten zu akzeptieren, polymerisiert.
Bis jetzt sind ungefähr 100 unterschiedliche Typen von Hydroxysäuren durch Fermentationsverfahren in PHAs inkorporiert worden (Steinbüchel und Valentin, FEMS Microbiol. Lett. 128: 219–28 (1995)). Bemerkenswerterweise gehören zu diesen PHAs solche, die funktionalisierte anhängende Gruppen enthalten, wie Ester, Doppelbindungen, Alkoxygruppen, aromatische Gruppen, Halogene und Hydroxygruppen.
Ein bevorzugtes Polyhydroxyalkanoat für medizinische Anwendungen ist Poly-4-hydroxybutyrat (P4HB). P4HB ist biokompatibel, resorbierbar, verarbeitbar, stabil und geschmeidig. Die Beibehaltung der Reißfestigkeit ist ein weiterer sehr wichtiger Parameter für Naht- und Klammermaterialien, insbesondere von resorbierbaren. Da resorbierbare Materialien in vivo abgebaut werden, ändern sich ihre physikalischen und mechanischen Eigenschaften als Folge dieses Abbaus. Zum Beispiel wird eine resorbierbare Naht den größten Teil ihrer Reißfestigkeit, und somit ihrer Fähigkeit zur Fixierung von Gewebe, innerhalb eines Zeitraums verlieren, der kürzer als die für ihre vollständige Resorption erforderliche Zeit ist. Nähte aus Polyglycolsäure (PGA), zum Beispiel, verlieren ihre Stabilität in vivo zum großen Teil innerhalb von drei Wochen (Vet. Surg. 21, 192: 355–61), sind aber nicht vor sechs Wochen vollständig resorbiert. Dieser Verlust der mechanischen Stabilität resultiert aus der Abnahme der Molekülmasse des Polymers. Es ist wichtig festzuhalten, dass verschiedene Parameter die Resorptionsgeschwindigkeiten und Reißfestigkeiten von Nähten in vivo beeinflussen, wie der Gewebetyp, mechanische Beanspruchungen, das Vorliegen von Infektionen etc.
Die Beispiele zeigen, dass die Geschwindigkeit des Abbaus von P4HB in vivo im Vergleich zu der anderer PHAs hoch ist, seine Resorptionsgeschwindigkeit aber langsamer ist als die von vielen der Materialien, die als resorbierbare Nähte verwendet werden. Außerdem behalten, wie in der Tabelle 7 gezeigt ist, P4HB-Implantate ihre Molekülmasse während des Resorptionsprozesses bei. Für diese Beibehaltung der Molekülmasse wird erwartet, dass sie sich vorteilhaft auf die Aufrechterhaltung der mechanischen Eigenschaften, wie die Reißfestigkeit, der als Materialien zur Schließung von Wunden verwendeten PHAs auswirkt. Aufgrund ihrer ausgezeichneten mechanischen Eigenschaften, der Beibehaltung einer großen Molekülmasse, der Verarbeitbarkeit, der Biokompatibilität und der Resorbierbarkeit sind P4HB und P4HB-co-HA für verschiedene medizinische Vorrichtungen nützlich, zu denen beispielsweise resorbierbare Vorrichtungen für das Verschließen von Wunden, wie Naht- und Klammermaterialien, gehören.
2) Quellen für PHAs
PHA-Materialien, die zur Abänderung ihrer Abbaugeschwindigkeiten modifiziert werden können, können entweder biologischen Ursprungs, enzymatischen Ursprungs oder chemischen Ursprungs sein. Die biologische Quelle kann ein Mikroorganismus oder ein höherer Organismus, wie eine Pflanze, sein, und sie kann mittels gentechnologischer Verfahren erhalten werden.
In der Mitte der 1980er Jahre waren mehrere Forschergruppen intensiv damit beschäftigt, die für die PHA-Synthese verantwortlichen Gene und Genprodukte zu identifizieren und zu isolieren. Diese Anstrengungen haben zur Entwicklung von transgenen Systemen zur Erzeugung von PHAs sowohl in Mikroorganismen als auch in Pflanzen sowie zu enzymatischen Verfahren der PHA-Synthese geführt. Solche Wege könnten die Zahl der verfügbaren PHA-Typen weiter erhöhen. Diese Fortschritte wurden in Reviews beschrieben (Williams & Peoples, CHEMTECH 26: 38–44 (1996) und Williams & Peoples, Chem. Br. 33: 29–32 (1997)).
Verfahren, die zur Erzeugung von PHA-Polymeren eingesetzt werden können, die für eine nachfolgende Modifizierung zur Veränderung ihrer Abbaugeschwindigkeiten geeignet sind, werden zum Beispiel beschrieben im US-Patent Nr. 4 910 145 an Holmes et al., bei Byrom, "Miscellaneous Biomaterials" in Biomaterials (Byrom, Hrsg.), S. 333–59 (MacMillan Publishers, London 1991), Hocking & Marchessault, "Biopolyesters" in Chemistry and Technology of Biodegradable Polymers (Griffin, Hrsg.), S. 48–96 (Chapman and Hall, London 1994), Holmes, "Biologically Produced (R)-3-hydroxyalkanoate Polymers and Copolymers," in Developments in Crystalline Polymers (Bassett, Hrsg.), Band 2, S. 1–65 (Elsevier, London 1988), Lafferty et al., "Microbial Produktion of Poly-b-hydroxybutyric acid" in Biotechnology (Rehm & Reed, Hrsg.), Band 66, S. 135–76 (Verlagsgesellschaft, Weinheim 1988), Müller & Seebach, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 32: 477–502 (1993), Steinbüchel, "Polyhydroxyalkanoic Acids" in Biomaterials (Byrom, Hrsg.), S. 123–213 (MacMillan Publishers, London 1991), Williams & Peoples, CHEMTECH 26: 38–44 (1996), Steinbüchel & Wiese, Appl. Microbiol. Biotechnol. 37: 691–697 (1992), in den US-Patenten Nr. 5 245 023 , 5 250 430 , 5 480 794 , 5 512 669 und 5 534 432 , bei Agostini et al., Polym. Sci., Teil A-1, 9: 2775–87 (1971), Gross et al., Macromolecules 21: 2657–68 (1988), Dubois et al., Macromolecules 26: 4407–12 (1993), Le Borgne & Spassky, Polymer 30: 2312–19 (1989), Tanahashi & Doi, Macromolecules 24: 5732–33 (1991), Hori et al., Macromolecules 26: 4388–90 (1993), Kemnitzer et al., Macromolecules 26: 1221–29 (1993), Hori et al., Macromolecules 26: 5533–34 (1993), Hocking et al., Polym. Bull. 30: 163–70 (1993), Xie et al., Macromolecules 30: 6997–98 (1997), im US-Patent Nr. 5 563 239 an Hubbs und in den US-Patenten Nr. 5 489 470 und 5 520 116 an Noda et al.. Die mittels dieser Verfahren gewonnenen PHAs können in einer beliebigen Form vorliegen, einschließlich eines Latex oder einer festen Form.
Die Identifizierung, Klonierung und Expression der an der Biosynthese von PHAs beteiligten Gene verschiedener Mikroorganismen in rekombinanten Organismen ermöglichen die Herstellung von PHAs in Organismen, die von Haus aus kein PHA erzeugen. Ein bevorzugtes Beispiel ist E. coli, das ein anerkannter Wirt für die Produktion von Biopharmazeutika und PHAs für medizinische Anwendungen ist. Solche rekombinanten Organismen ermöglichen den Forschern eine bessere Kontrolle über den Prozess der PHA-Produktion, da sie frei von Hintergrund-Enzymaktivitäten für die Biosynthese unerwünschter PHA-Vorläufer oder für den Abbau des PHA sind. Außerdem kann die geeignete Wahl eines rekombinanten Organismus die Reinigung des erzeugten PHA erleichtern oder eine verbesserte Biokompatibilität von diesem ermöglichen.
Die Minimalanforderungen an die Synthese von PHA in einem rekombinanten Organismus sind eine Quelle für Hydroxyalkanoyl-CoA und eine geeignete PHA-Synthase (Gerngross & Martin, D. P., Proc. Natl. Acad. Sci. 92: 6279–83 (1995)). Rekombinante PHA- Produzenten benötigen somit einen Biosyntheseweg für ein Hydroxyalkanoyl-CoA-Monomer und eine geeignete PHA-Synthase. Die Erzeugung eines Homopolymers erfordert, dass der Organismus nur ein geeignetes Substrat für die PHA-Synthase bildet, da die Bildung multipler Substrate zur Bildung eines PHA-Copolymers führt. Rekombinante Organismen, die ein für eine PHA-Synthase codierendes Transgen enthalten, reichen für die Herstellung von P4HB aus.
In Abwesenheit von Abbauwegen für PHAs kann die Molekülmasse des in rekombinanten Organismen akkumulierten PHA sehr hoch sein. Für in rekombinanten E. coli erzeugtes PHB wurde berichtet, dass es eine Molekülmasse von 4 × 10⁶ g/mol hat (Sim et al., Nature Biotech. 15: 63–67 (1997)). Die Molekülmasse ist für die Steuerung der physikalischen Eigenschaften des jeweiligen PHA wichtig, da die erhöhte Molekülmasse in rekombinanten Organismen erzeugter PHAs zu verbesserten Materialeigenschaften führen kann, wie einer erhöhten Zugfestigkeit und Dehnung beim Reißen (Kusaka et al., Pure Appl. Chem. A35: 319–335 (1998)).
Die Biosynthese von P3HB-co-4HB mit einem niedrigen 4HB-Gehalt (1,5%) ist für rekombinante E. coli beschrieben worden (Valentin et al., J. Biotech. 58: 33–38 (1997)). Es ist bemerkenswert, dass die Molekülmassen dieser PHAs sehr hoch waren (über 1 × 10⁶ g/mol). Außerdem ist die Biosynthese des P3HB-co-4HB und des Homopolymers P4HB in rekombinanten E. coli beschrieben worden (Hein et al., FEMS Microbiol. Lett. 153: 411–418 (1997)).
Zusätzlich zum Einsatz biologischer Wege für die PHA-Synthese können PHA-Polymere auch durch eine chemische Synthese erhalten werden. Ein häufig verwendeter Ansatz beinhaltet die Ringöffnungspolymerisation von β-Lactonmonomeren unter Einsatz verschiedener Katalysatoren oder Initiatoren wie Aluminoxanen, Distannoxanen oder Alkoxy-Zink- oder Alkoxy-Aluminium-Verbindungen (siehe Agostini et al., Polym. Sci., Teil A-1, 9: 2775–87 (1971), Gross et al., Macromolecules 21: 2657–68 (1988), Dubois et al., Macromolecules 26: 4407–12 (1993), Le Borgne & Spassky, Polymer 30: 2312–19 (1989), Tanahashi & Doi, Macromolecules 24: 5732–33 (1991), Hori et al., Macromolecules 26: 4388–90 (1993), Kemnitzer et al., Macromolecules 26: 1221–29 (1993), Hori et al., Macromolecules 26: 5533–34 (1993) und Hocking & Marchessault, Polym. Bull. 30: 163–70 (1993). Ein zweiter Ansatz beinhaltet die Kondensationspolymerisation von Estern und wird im US-Patent Nr. 5 563 239 an Hubbs et al. beschrieben. Forscher haben auch chemisch-enzymatische Verfahren zur Herstellung von PHAs entwickelt. Zum Beispiel offenbaren Xie et al., Macromolecules 30: 6997–98 (1997) eine Ringöffnungspolymerisation von Beta-Butyrolacton mittels thermophiler Lipasen unter Bildung von PHB.
Die biologische Produktion von P4HB oder P4HB-co-HA hat gegenüber herkömmlichen Verfahren einer chemischen Synthese gewisse Vorteile. Die chemische Synthese von P4HB mit hoher Molekülmasse (über 1 × 10⁵ g/mol) ist aufgrund der Neigung der freien Säure, unter Bildung des relativ spannungsarmen und kinetisch begünstigten fünfgliedrigen Rings zu lactonisieren, schwierig. Somit ist eine Polykondensation von 4-Hydroxybuttersäure schwer zu erreichen, während das Material, dass aus den Reaktionen der Ringöffnungspolymerisation von γ-Butyrolacton bei hohem Druck resultiert, eine sehr niedrige Molekülmasse hat (Korte & Gelt, Polymer Lett. 4: 685 (1966)) und schlechte mechanische Eigenschaften aufweisen würde. Eine alternative Strategie für die Synthese von P4HB, die über freie Radikale verlaufende Ringöffnungspolymerisation von 2-Methylendioxolan, führt zu einem Copolymer, das ringgeöffnete und nicht geöffnete Einheiten enthält (Bailey et al., J. Polym. Sci. Polym. Chem. 20: 3021–30 (1982), Bailey, J. Polym. Preprints 25: 210–11 (1984)). 4HB wurde erfolgreich mit 3HB über eine Ringöffnungspolymerisation copolymerisiert (Hori et al., Polymer, 36: 4703–4705 (1996)). Das Molekulargewicht der Copolymere war jedoch bescheiden (unter 1 × 10⁵ g/mol), insbesondere für Zusammensetzungen mit mehr als 80% 4HB (unter 2 × 10⁴ g/mol). Außerdem enthalten viele der für die chemische Synthese von Polyestern eingesetzten Katalysatoren toxische Metalle. Diese toxischen Verunreinigungen können bei Verwendung eines biologischen Verfahrens zur Herstellung von PHAs vermieden werden.
3) PHA-Formulierungen mit veränderten Abbaugeschwindigkeiten
a. Additive, die die Abbaugeschwindigkeiten verändern
Die Hydrolyse von Polyhydroxyalkanoaten ist bei sauren oder basischen pH-Werten beschleunigt, und somit kann die Einarbeitung saurer oder basischer Additive oder Hilfsstoffe dazu eingesetzt werden, die Abbaugeschwindigkeit von PHAs zu modulieren. Die Hilfsstoffe können in Form von Teilchen zugegeben werden, sie können mit einem beliebigen anderen zugesetzten oder zuzusetzenden Additiv oder Mittel gemischt werden, oder sie können im Polymer gelöst werden. Zu Additiven, die die Abbaugeschwindigkeit erhöhen, gehören anorganische Säuren wie Ammoniumsulfat und Ammoniumchlorid, organische Säuren wie Citronensäure, Benzoesäuren, Peptide, Ascorbinsäure, anorganische Basen wie Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Calciumcarbonat, Zinkcarbonat und Zinkhydroxid, und organische Basen wie Protaminsulfat, Spermin, Cholin, Ethanolamin, Diethanolamin und Triethanolamin sowie Tenside wie TWEEN^TM und PIURONIC^TM. Solche Additive werden vorzugsweise in Konzentrationen zwischen 0,1 und 30 Gew.-% eingesetzt.
Die Abbaugeschwindigkeit kann auch durch Additive erhöht werden, die Poren bilden oder auf andere Art die Oberfläche des Polymers erhöhen oder den amorphen Anteil des Polymers erhöhen. Porenbildende Mittel werden generell in Form von Teilchen zugesetzt, und zu ihnen gehören wasserlösliche Verbindungen wie anorganische Salze und Zucker, die durch Auslaugen entfernt werden. Zu geeigneten teilchenförmigen Materialien gehören Salzkristalle, Proteine wie Gelatine und Agarose, Stärken, Polysaccharide wie Alginat und andere Polymere. Die Durchmesser der Teilchen können zweckmäßigerweise von Nanometern bis zu 500 Mikrometern reichen. Sie können auch lyophilisierbar sein. Porenbildende Mittel können in einer Menge zwischen 0,01 und 90 (Gew./Vol.), vorzugsweise in einem Anteil zwischen einem und dreißig Prozent (Gew./Gew., Polymer) zur Erhöhung der Porenbildung eingearbeitet werden. Zum Beispiel wird beim Sprühtrocknen oder der Lösemittelverdampfung zuerst ein porenbildendes Mittel wie ein flüchtiges Salz, zum Beispiel Ammoniumbicarbonat, Ammoniumacetat, Ammoniumchlorid oder Ammoniumbenzoat oder ein anderes lyophilisierbares Salz, in Wasser gelöst. Die das porenbildende Mittel enthaltende Lösung wird dann mit der Polymerlösung emulgiert, um Tröpfchen des porenbildenden Mittels im Polymer zu erzeugen. Diese Emulsion wird dann sprühgetrocknet oder einem Prozess einer Lösemittelverdampfung/Extraktion unterzogen. Nach dem Ausfällen des Polymers werden die gehärteten Mikroteilchen eingefroren und zur Entfernung des porenbildenden Mittels lyophilisiert. Weichmacher, wie die Citratester, und andere Polymere, wie ataktische Polyhydroxyalkanoate, können zur Erhöhung des amorphen Charakters des Polymers zugesetzt werden.
Zu hydrophoben Beschichtungen oder Materialien, die zur Erhöhung der Abbaugeschwindigkeiten inkorporiert werden können, gehören hydrophobe Verbindungen wie Phospholipide, Cholesterol und andere Polymere sowie Tenside. Diese Materialien und Verfahren zur Bildung von Beschichtungen oder die Inkorporation in die Materialien werden beschrieben in WO 96/18420 von Bracco Research SA, WO 92/1 81 64 von Delta Biotechnology Ltd., WO 95/03356 des Massachusetts Institute of Technology, PCT/US97/03007 von Acusphere, im US-Patent Nr. 5 271 961 an Mathiowitz et al., im US-Patent Nr. 5 711 933 an Bichon et al. und im US-Patent Nr. 5 705 187 an Unger. Spezifische Beispiele offenbaren Fettsäuren und Phospholipide als Emulgatoren zur Stabilisierung der Ölphase in der wässrigen Phase während des Vorgangs der Emulgierung/Verkapselung mit dem Ergebnis, dass die Mikrokügelchen mit einer Tensidschicht überzogen werden. Die Verwendung von Additiven wie Fetten, Wachsen und hochmolekularen Kohlenwasserstoffen zur Hydrophobisierung der Polymerwände und zur Verlangsamung der Wasserpenetration wird ebenfalls offenbart.
b. Modifizierung anhängender Gruppen von PHA
Ein alternatives Verfahren zur Veränderung der Abbaugeschwindigkeit der PHA-Polymere beinhaltet die Modifizierung der anhängenden Gruppen des Polyhydroxyalkanoats. Die anhängenden Gruppen können vollständig oder zum Teil modifiziert werden. Anhängende Gruppen können zum Beispiel in saure und basische Gruppen überführt werden, wie Carbonsäuren und Amine. Diese Typen von Gruppen können den Abbau über die Veränderung lokaler pH-Werte beschleunigen. Alternativ können die anhängenden Gruppen in reaktive Gruppen überführt werden, wie Alkohole und Amine, die das Polymerrückgrat entweder über eine intramolekulare oder eine intermolekulare Reaktion spalten können. Zusätzlich zu diesen Umwandlungen können die anhängenden Gruppen auch in hydrophile Gruppen überführt werden, um die Aufnahme hydrolytischer Agenzien wie Wasser zu erhöhen, oder sie können in Gruppen überführt werden, die die amorphe Natur der Polymere verstärken. Die Verfahren, die zur Durchführung der Überführung der anhängen Gruppen in funktionelle Gruppen erforderlich sind, sind Fachleuten auf diesem Gebiet gut bekannt. Ein geeignetes Verfahren, das zur Herstellung eines PHA eingesetzt werden kann, der eine Einheit enthält, die die Abbaugeschwindigkeit des Polymers verändert, wird in WO 98/39453 von Hein et al. offenbart. Geeignete anhängende Gruppen in PHA-Polymeren, die die Abbaugeschwindigkeit verändern, können auch direkt über eine Fermentation erhalten werden.
c. Chemische Modifizierung von PHAs
Die Hydrolysegeschwindigkeit von Polyhydroxyalkanoat hängt von verschiedenen Faktoren ab. Ein Schlüsselfaktor ist die chemische Natur oder die Reaktivität der Esterverknüpfungen zwischen den Monomeren. Die Geschwindigkeit des Abbaus des PHA-Rückgrats kann somit durch das Inkorporieren chemischer Verknüpfungen in das Polymerrückgrat verändert werden, die empfindlicher gegenüber einer Hydrolyse oder einem enzymatischen Angriff sind. Beispiele für Monomere, die in Polyhydroxyalkanoat-Rückgrate inkorporiert werden können, um die Abbaugeschwindigkeit des Polymers zu verändern, sind 2-Hydroxysäuren, wie Glykolsäure und Milchsäure, und andere Hydroxysäuren, die die Reaktivität der Esterbindung modulieren, wie 2-Hydroxyethoxyessigsäure. Neben der Inkorporation anderer Hydroxysäuren, die zu Estern führen, die empfindlicher gegenüber einem hydrolytischen oder enzymatischen Angriff sind, können andere Typen von Funktionalitäten in das Polymerrückgrat inkorporiert werden. Zum Beispiel kann eine Esterbindung oder können mehrere Esterbindungen durch Gruppen wie Amid, Anhydrid, Carbonat oder Carbamat ersetzt werden. Beispiele für Monomere, die in das Polyhydroxyalkanoat-Rückgrat inkorporiert werden können, sind Aminosäuren und Aminoalkohole. Weiterhin können multifunktionelle Monomere in die Polyhydroxyalkanoat-Rückgrate inkorporiert werden, zum Beispiel Triole oder Tetrole.
Diese Typen von Monomereinheiten können auch dazu eingesetzt werden, das Molekulargewicht des Polymers über eine Vernetzung zwischen den Ketten zu erhöhen oder aufrechtzuerhalten oder um die Kristallinität der Polymere zu modifizieren.
Es können verschiedene Verfahren zur Inkorporation empfindlicher chemischer Bindungen in die Polyhydroxyalkanoat-Rückgrate eingesetzt werden. Zum Beispiel können Co-Feeds während der Fermentierung der PHAs zugegeben werden, die zum Einbau der gewünschten Monomere führen. Zu geeigneten Co-Feeds gehören Hydroxyalkoxyessigsäuren. Diese Typen von Monomeren können auch während der chemischen Synthese aus Hydroxysäure-Monomeren unter Verwendung von Katalysatoren und über Coenzym-A-Derivate unter Einsatz enzymatischer Katalysatoren, wie der PHA-Synthasen, inkorporiert werden.
Empfindliche chemische Bindungen können in Polyhydroxyalkanoat-Rückgrate auch nach deren Synthese inkorporiert werden. Zu Verfahren, mit denen das erreicht werden kann, gehören chemische Transformationen, wie Insertionsreaktionen, eine Bestrahlung, eine Veresterung, eine Umesterung (siehe z. B. Otera et al., Tetrahedron Lett. 27: 2383–86 (1986), Otera J. et al., Org. Chem. 56: 5307–11 (1991), Otera et al., J. Org. Chem. 54: 4013–14 (1989) und Otera et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1742–43 (1991)), Ester-Metathese-Reaktionen (siehe z. B. Stanton & Gagné, J. Am. Chem. Soc. 119: 5075–76 (1997)) und ein reaktives Mischen. Im letzteren Fall können die chemischen Reaktionen in Gegenwart eines Katalysators in der Schmelze durchgeführt werden. Zum Beispiel können Ester oder Polyester mit Polyhydroxyalkanoaten in Gegenwart geeigneter Katalysatoren geschmolzen werden, um das Polyhydroxyalkanoat chemisch zu modifizieren.
d. Verarbeitung von PHAs, die empfindliche Bindungen enthalten
Polyhydroxyalkanoate können ferner mittels eines breiten Spektrums an Techniken zur Polymerverarbeitung manipuliert werden. Zu Verfahren zur Verarbeitung dieser Materialien gehören ein Lösemittelgießen, eine Schmelzverarbeitung, ein(e) Faserverarbeitung/Spinnen/Weben, ein Extrudieren, ein Spritz- und Druckformen und ein Laminieren.
III. Vorrichtungen und Verfahren zu ihrer Herstellung
Zusammensetzungen aus Poly(4-hydroxybutyrat) sind für die Herstellung einer Vielzahl biologisch abbaubarer und/oder bioresorbierbarer medizinischer Vorrichtungen (Implantate) oder von Beschichtungen auf diesen nützlich. Die biologisch abbaubaren Polymerzusammensetzungen zeigen vorzugsweise einen relativ langsamen biologischen Abbau, zum Beispiel mit einer In-vivo-Halbwertszeit zwischen 3 und 6 Monaten oder darunter. Das Polymer hat vorzugsweise einen relativ niedrigen Schmelzpunkt/eine relativ niedrige Glasübergangstemperatur von zum Beispiel unter 136°C, und/oder es ist zur Erleichterung der Verarbeitung in untoxischen, nicht-halogenierten Lösemitteln löslich.
Repräsentative Vorrichtungen und Anwendungen werden unten beschrieben. Die Materialien nach dem Stande der Technik in diesen Vorrichtungen und Anwendungen können vollständig oder teilweise durch die hier beschriebenen biokompatiblen Zusammensetzungen ersetzt werden, um die Eigenschaften der Vorrichtung, wie die Abbaugeschwindigkeit und die mechanischen Eigenschaften, bereitzustellen.
(I) Verschlussnähte
Diese Vorrichtungen werden typischerweise zur Wiederbefestigung von Gewebe oder Knochen eingesetzt. Häufig beinhalten die Verfahren die Befestigung von Sehnen, Bändern oder anderem weichem Gewebe am Knochen in der Schulter, dem Knie, dem Ellbogen, dem Handgelenk, der Hand oder dem Knöchel. Bei einem Ansatz werden Knochenanker in den Knochen eingeführt, und dann kann weiches Gewebe, wie ein Band oder eine Sehne, am Verankerungspunkt festgenäht werden. Das Verfahren kann offen oder, vorzugsweise, unter Einsatz einer minimal invasiven Technik durchgeführt werden, bei der die Vorrichtung mithilfe einer geeigneten Zuführungsvorrichtung eingesetzt wird. Beispiele für Verschlussnahtvorrichtungen, die derzeit verwendet werden und den Stand der Technik repräsentieren, sind der Bionx Biodegradable Anchor (Bionx Implants, Bluebell, Pennsylvania), der BioROC EZ^TM Suture Bone Fastener (Innovasive Devices, Marlborough, Massachusetts), die Resorbable Soft Tissue Attachment Device (Zimmer, Warsaw, Indiana) und die Acufex TAG Bioabsorbable Anchors (Smith & Nephew Endoscopy, Mansfield, Massachusetts). Verschlussnahtvorrichtungen aus Polyhydroxyalkanoat können gemäß der Verfahren und Prozeduren hergestellt werden, die in den US-Patenten Nr. 5 814 071 , 5 797 963 , 5 735 875 , 5 725 529 , 5 649 963 , 5 643 321 , 5 593 425 , 5 423 821 , 5 269 809 , 5 268 001 , 5 163 960 und 5 041 129 beschrieben werden.
2) Vorrichtungen für die Meniskusreparatur
Es gibt eine Reihe von Vorrichtungen für die Reparatur von Meniskusschäden. Bei einem Verfahren werden diese orthopädischen Befestigungsvorrichtungen für die sichere Fixierung longitudinaler vertikaler Meniskusschäden (Korbhenkel-Schäden) eingesetzt, die im vaskularisierten Bereich des Meniskus lokalisiert sind, und zwar zusammen mit einer geeigneten Immobilisierung. Die Vorrichtungen werden häufig in minimal invasiven chirurgischen Eingriffen eingesetzt. Beispiele für Reparaturvorrichtungen, die derzeit eingesetzt werden, und die repräsentativ für den Stand der Technik sind, sind der BIOFIX^TM Meniskus Arrow (Bioscience Inc., Malvern, Pennsylvania), der T-Fix Suture Bar (Acufex Microsurgical Inc.) und der Meniscal Dart (Innovasive Devices, Marlborough, Massachusetts). Vorrichtungen aus Polyhydroxyalkanoat für die Meniskusreparatur können gemäß den Verfahren und Prozeduren hergestellt werden, die bei de Goot, Biomaterials 18: 613–22 (1997) und in den US-Patenten Nr. 5 855 619 , 5 853 746 , 5 725 556 , 5 645 589 , 5 059 206 , 5 035 713 , 4 976 715 , 4 924 865 , 4 895 148 und 4 884 572 beschrieben werden.
3) Nieten und Stifte
Biologisch abbaubare Nieten und Stifte können für die Wiederbefestigung von weichem Gewebe eingesetzt werden. Zu spezifischen Anwendungen gehören die Wiederbefestigung von weichem Gewebe in der Schulter, einschließlich der Behebung einer Instabilität in der Schulter (Bankart-Verfahren), der Reparatur von SLAP-Läsionen, der Reparatur einer akromioklavikularen Separation, der Reparatur der Rotatorenmanschette, der Einsatz beim Kapselshift oder für capsulolobrale Rekonstruktionen, die Bizepstenodese und die Reparatur des Deltamuskels. Ein Beispiel für eine Nietenvorrichtung nach dem Stande der Technik ist die LactoSorb Pop Rivet (Biomet Inc. Warsaw, Indiana). Nieten und Stifte aus Polyhydroxyalkanoat können gemäß den Verfahren und Prozeduren hergestellt werden, die bei Speer et al., Clin. Orthop. 291: 67–74 (1993) und in den US-Patenten Nr. 5 840 078 , 4 895 148 , 5 868 747 , 5 843 084 , 5 840 078 , 5 827 298 , 5 807 292 , 5 785 713 und 5 730 744 beschrieben werden.
4) Interferenzschrauben
Biologisch abbaubare Interferenzschrauben können für die Fixierung von weichem Gewebe eingesetzt werden. Solche Schrauben können zum Beispiel zur Fixierung von Transplantaten aus weichem Gewebe am Knochen bei chirurgischen Eingriffen zur Rekonstruktion kranialer Kreuzbänder am Knie verwendet werden. Beispiele für Schrauben nach dem Stande der Technik sind die RCI-Schraube (Smith & Nephew, Carlsbad, Kalifornien) und die BIO-INTERFERENCE^TM-Schraube von Arthrex (Arthrex, Naples, Florida). Schrauben aus Polyhydroxyalkanoat können gemäß den Verfahren und Prozeduren hergestellt werden, die in den US-Patenten Nr. 5 275 601 , 5 584 836 , 5 364 400 , 5 348 026 , 5 876 455 , 5 632 748 , 5 496 326 , 5 718 706 , 5 69 222 , 5 383 878 , 5 425 733 , 5 417 692 , 4 927 421 , 5 211 647 , 5 116 337 und 4 927 421 beschrieben werden.
5) Chirurgische Netze
Biologisch abbaubare chirurgische Netze können in der allgemeinen Chirurgie eingesetzt werden. Zum Beispiel werden chirurgische Netze bei der Behandlung von Hernien eingesetzt, bei denen das Bindegewebe gerissen ist, oder als Material für eine Schlinge zur Unterstützung der Repositionierung und zur Stützung des Blasenhalses bei der Harninkontinenz der Frau. Bei der vorliegenden Erfindung werden derartige Netze (Stopfen) als Implantate in weiches Gewebe zur Verstärkung von weichem Gewebe, zum Beispiel bei der Reparatur abdominaler Aponeurosen und der Bauchdecke, von Faszien- oder Kapselschäden, von Patella- und Achillessehnen und für den Ersatz von Infraspinatus-Sehnen oder kranialen Kreuzbändern eingesetzt. Zu anderen Verwendungen derartiger Netze in der vorliegenden Erfindung gehören die Überbrückung von Faszienschäden, der Einsatz als Patches für die Trachea oder andere Organe, für eine Organentnahme, Schlingen (einschließlich einer Intestinalschlinge), ein Material für eine Dura-Transplantation, Verbände für Wunden oder Verbrennungen oder eine hämostatische Tamponage. Beispiele für Netze nach dem Stande der Technik sind die Brennen Biosynthetic Surgical Mesh Matrix (Brennan Medical, St. Paul, Minnesota), die GORE-TEX^TM-Patches (Gore, Flagstaff, Arizona) und das SEPRAMESH^TM (Genzyme Corporation, Massachusetts). Chirurgische Netze aus Polyhydroxyalkanoat können gemäß den Verfahren und Prozeduren hergestellt werden, die bei Bupta, "Medical textile structures: an overview", Medical Plastics and Biomaterials, S. 16–30 (Jan./Febr. 1998) beschrieben werden, und mittels Verfahren, die in den US-Patenten Nr. 5 843 084 , 5 836 961 , 5 817 123 , 5 747 390 , 5 736 372 , 5 679 723 , 5 634 931 , 5 626 611 , 5 593 441 , 5 578 046 , 5 516 565 , 5 397 332 , 5 393 594 , 5 368 602 , 5 252 701 , 4 838 844 , 4 655 221 , 4 633 873 , 4 441 496 , 4 052 988 , 3 875 937 , 3 797 499 und 3 739 773 beschrieben werden.
6) Reparatur-Patches Biologisch abbaubare Reparatur-Patches können in der allgemeinen Chirurgie eingesetzt werden. In der vorliegenden Erfindung werden diese Patches zur Reparatur abdominaler Schäden und von Schäden der Thoraxwand, von Inguinal- Parakolostomie-, Ventral-, Nabel-, Skrotal- und Femoralhernien und anderen Hernien, für die Verstärkung von Muskellappen, für die Verstärkung von Klammernähten und langen Schnitten, für die Rekonstruktion des Beckenbodens, für die Reparatur des Rektum- und Scheidenvorfalls, für Polster, für Nähte und Klammern, für die Reparatur der Harnwege und -blase oder für Binden eingesetzt. Beispiele für Patches nach dem Stand der Technik sind das TISSUEGUARD^TM-Produkt (Bio-Vascular Inc., St. Paul, Minnesota). Reparatur-Patches aus Polyhydroxyalkanoat können gemäß den Verfahren und Prozeduren hergestellt werden, die in den US-Patenten Nr. 5 858 505 , 5 795 584 , 5 634 931 , 5 614 284 , 5 702 409 , 5 690 675 , 5 433 996 , 5 326 355 , 5 147 387 , 4 052 988 und 3 875 937 beschrieben werden.
7) Schlingen
Biologisch abbaubare Schlingen können als Implantate zur Verstärkung von weichem Gewebe eingesetzt werden, wenn eine Schwäche vorliegt. Beispiele für derartige Verfahren sind die Pubourethral- und Blasenstützung, die Harnleiterreparatur und die Reparatur des Scheidenvorfalls, die Rekonstruktion des Beckenbodens und die Sakrokolposuspension. Die Vorrichtung kann zur Behandlung der Harninkontinenz der Frau eingesetzt werden, die aus einer Hypermobilität des Harnleiters oder einer intrinsischen Sphinkterdefizienz resultiert. Beispiele für Vorrichtungen nach dem Stande der Technik sind die SUSPEND^TM Sling von Mentor (Mentor Corporation, Minneapolis, Minnesota). Schlingenvorrichtungen aus Polyhydroxyalkanoat können gemäß den Verfahren und Prozeduren hergestellt werden, die in den US-Patenten Nr. 5 700 479 , 5 860 425 , 5 836 315 , 5 836 314 , 5 813 408 , 5 690 655 , 5 611 515 und 4 217 890 beschrieben werden.
8) Kardiovaskuläre Patches
Biologisch abbaubare kardiovaskuläre Patches werden in der vorliegenden Erfindung für ein Patch-Grafting an Gefäßen (Verstärkung der Lungenarterie), für die Anbringung intrakardialer Patches und für einen Patch-Verschluss nach einer Endarteriektomie eingesetzt. Beispiele für ähnliche Patch-Materialien nach dem Stande der Technik (nicht abbaubar) sind die FLUOROPASSIC^TM-Patches und Gewebe von Sulzer Vascutek (Sulzer Carbomedics Inc., Austin, Texas). Kardiovaskuläre Patches aus Polyhydroxyalkanoat können gemäß der Verfahren und Prozeduren hergestellt werden, die in den US-Patenten Nr. 5 176 395 , 5 100 422 , 5 104 400 und 5 700 287 sowie von Malm et al., Eur. Drug. Res. 26: 298–308 (1994), beschrieben werden.
9) Orthopädische Stifte
Biologisch abbaubare Stifte werden in der vorliegenden Erfindung zur Fixierung von weichem Gewebe eingesetzt. Solche Vorrichtungen werden zum Beispiel zur Stabilisierung von Brüchen des Handgelenkes, des Fußes, des Knöchels, der Hand, des Ellbogens, der Schulter und des Knies eingesetzt. Beispiele für Vorrichtungen nach dem Stande der Technik sind die RESOR-PIN^TM Resorbable Membrane Pin (Geistlich-Pharma, Washington, DC). Orthopädische Stifte aus Polyhydroxyalkanoat können mittels herkömmlicher Verarbeitungstechniken, beispielsweise mit Schmelzverarbeitungstechniken wie einem Spritz- und Druckformen und einem Faserformen, sowie mit lösemittelbasierten Techniken hergestellt werden.
10) Adhäsionsbarrieren
Biologisch abbaubare Adhäsionsbarrieren werden in der allgemeinen Chirurgie zur Verhinderung unerwünschter Adhäsionen, insbesondere nach einem chirurgischen Eingriff, eingesetzt. Beispiele für Vorrichtungen nach dem Stande der Technik, die für diese Zwecke eingesetzt werden, sind die Endopath INTERCEED^TM Absorbable Adhesion Barrier (Ethicon Inc.) und SEPRAFILM^TM (Genzyme, Cambridge, Massachusetts). Adhäsionsbarrieren aus Polyhydroxyalkanoat können gemäß der Verfahren und Prozeduren hergestellt werden, die in den US-Patenten Nr. 5 824 658 , 5 795 584 , 5 791 352 , 5 711 958 , 5 639 468 , 5 626 863 , 5 626 622 , 5 607 686 , 5 580 923 , 5 137 875 und 4 840 626 beschrieben werden.
11) Stents
Stents werden derzeit in verschiedenen medizinischen Anwendungen eingesetzt, normalerweise zur Verhinderung eines erneuten Verschlusses eines Gefäßes. In der vorliegenden Erfindung sind die Stents kardiovaskuläre, gastroenterologische oder urethrale Stents. Im Allgemeinen sind diese Stents nicht abbaubar. Ureterstents und urethrale Stents werden zur Hilfe bei Blockierungen bei verschiedenen gutartigen, bösartigen und posttraumatischen Erkrankungen eingesetzt, wie dem Vorliegen von Steinen und/oder Steinfragmenten oder anderen Blockierungen des Harnleiters, wie solchen, die mit einer Harnleiterverengung, einem Karzinom von Bauchorganen, einer retroperitonealen Fibrose oder einem Uretertrauma verbunden sind, oder in Verbindung mit einer extrakorporalen Schockwellenlithotripsie. Der Stent kann unter Einsatz endoskopischer chirurgischer Verfahren oder perkutan eingesetzt werden. Beispiele für Stents nach dem Stande der Technik sind der Double-Pigtail-Ureterstent (C. R. Bard. Inc., Covington, Georgia), der SpiraStent (Urosurge, Coralville, Iowa) und die Ureteral and Urethral Stents von Cook Urological (Cook Urological, Spencer, Indiana).
Ein Vorteil der Stents aus Polyhydroxyalkanoat ist ihre Bioresorbierbarkeit, die insbesondere in Anwendungen wie urologischen Anwendungen erwünscht ist, da kein zweiter Eingriff zur Entfernung des Stents erforderlich ist. Außerdem ist eines der Hauptprobleme bei der Verwendung von Stents aus Metall in kardiovaskulären Anwendungen die nachfolgende Restenose, die durch das exzessive Endothelwandwachstum verursacht wird, von dem man annimmt, dass es zumindest teilweise durch die Reizung der Gefäßwand durch den metallischen Stent hervorgerufen wird (siehe Behrend, American J. Cardiol., S. 45, TCT Abstracts (Okt. 1998), Unverdorben et al., American J. Cardiol., S. 46, TCT Abstracts (Okt. 1998)). Ein bioresorbierbarer Stent, der aus einem Polyhydroxyalkanoat hergestellt ist oder mit ihm beschichtet ist, sollte eine geringere oder keine Reizung bewirken.
Stents aus Polyhydroxyalkanoat können mittels der Methoden und Prozeduren hergestellt werden, die in den US-Patenten Nr. 5 792 106 , 5 769 883 , 5 766 710 , 5 670 161 , 5 629 077 , 5 551 954 , 5 500 013 , 5 464 450 , 5 443 458 , 5 306 286 , 5 059 211 und 5 085 629 beschrieben werden. Siehe auch Tanquay, Cardiology Clinics 23: 699–713 (1994) und Talja, J. Endourology 11: 391–97 (1997).
12) Gelenkknorpelreparatur
Biologisch abbaubare Polymermatrizes, allein oder in Verbindung mit inkorporierten Zellen und/oder bioaktiven molekularen Wachstumsfaktoren, sind zur Reparatur von Gelenkknorpelschäden eingesetzt worden. Ein Beispiel für ein Material, das in einem derartigen Verfahren eingesetzt wurde, ist Polymilchsäure (Schroder et al., J. Biomed. Mat. Res. 25: 326–39 (1991)). Vorrichtungen aus Polyhydroxyalkanoat für die Gelenkknorpelreparatur können gemäß den Verfahren und Prozeduren hergestellt werden, die in den US-Patenten Nr. 5 876 452 , 5 736 372 , 5 716 981 , 5 700 774 , 5 655 546 und 5 041 138 beschrieben werden.
13) Nervenleitschienen und Sehnenreparatur
Biologisch abbaubare Vorrichtungen können als Leitschienen zur Erleichterung des Nachwachsens und der Wiederverbindung durchtrennter oder geschädigter Nerven und Sehnen eingesetzt werden. Die Vorrichtungen werden generell in Form von Röhren hergestellt. Ein Beispiel für eine Nervenleitschiene ist das Neurotube^TM-Produkt. Vorrichtungen aus Polyhydroxyalkanoat zur Sehnenreparatur können gemäß den Prozeduren hergestellt werden, die im US-Patent Nr. 4 792 336 beschrieben werden. Nervenleitschienen aus Polyhydroxyalkanoat können gemäß der Verfahren und Prozeduren hergestellt werden, die in den US-Patenten Nr. 5 800 544 , 5 735 863 , 5 584 885 , 5 514 181 , 5 026 381 , 5 019 087 und 4 955 893 beschrieben werden.
14) Reparatur von Atriumseptum-Defekten
Große Atriumseptum-Defekte, die nicht direkt mit Nähten geschlossen werden können, können mit Perikard-Patches oder mit synthetischen, nicht-resorbierbaren Materialien repariert werden. Reparatur-Patches aus Polyhydroxyalkanoat für die Reparatur von Atriumseptum-Defekten können gemäß den Verfahren und Prozeduren hergestellt werden, die in den US-Patenten Nr. 5 853 422 , 5 634 936 , 5 861 003 , 5 855 614 und von Malm, T. et al., Scand. J. Thor. Cardiovasc. Surg. 26: 9–14 (1992) beschrieben werden.
IV. Verfahren zur Herstellung der Vorrichtungen (Implantate)
Zu den Verfahren zur Herstellung der medizinischen Vorrichtungen gehören ein Lösemittelgießen, eine Schmelzverarbeitung, ein Extrudieren, ein Spritz- und Druckformen, ein Faserformen und ein Sprühtrocknen. Die Partikel werden vorzugsweise direkt über einen Prozess auf der Basis einer Fermentation hergestellt oder über eine Technik einer Lösemittelverdampfung, einer Doppelemulsionstechnik oder durch eine Mikrofluidisierung mittels Verfahren, die auf diesem Gebiet zur Verfügung stehen (Koosha, Ph. D. Dissertation, 1989, Univ. Nottingham, GB, Diss. Abstr. Int. B 51: 1206 (1990), Bruhn & Mueller, Proceed. Intern. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 18: 668–69 (1991), Conti et al., J. Microencapsulation 9: 153–66 (1992), Ogawa et al., Chem. Pharm. Bull. 36: 1095–103 (1988), Mathiowitz & Langer, "Polyanhydride microspheres as drug delivery systems", in Microcapsules Nanopart. Med. Pharm. (Donbrow, Hrsg.), Kap. 5, S. 99–123 (CRC, Boca Raton, Florida 1992)).
PHAs können zu Vorrichtungen verarbeitet werden, die für eine Wundheilung geeignet sind. Zum Beispiel können für diesen Zweck vliesartige Fasermaterialien aus derartigen Polymeren hergestellt werden, indem zuerst Polymerfasern erzeugt werden, indem die Polymere durch eine siebartige Öffnung gepresst werden, und zwar mittels Verfahren, die Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind. Die Fasern können dann zu einer porösen Membran (einem Gewebe) verarbeitet werden, indem sie auf einem festen Träger ausgebreitet und einer Druckformung unterzogen werden. Die Dicke der Vorrichtung kann unter 500 μm liegen. Eine Vorrichtung zur Wundheilung kann auch durch das Perforieren einer Folie oder Membran mittels eines Lasers zur Erzielung der Porosität oder mittels einer Auslaugtechnik zur Erzeugung eines porösen Materials hergestellt werden. Die Porengrößen sollten idealerweise klein genug sein, um Zellen oder anderes Material aus dem Gewebe auszuschließen. Die Vorrichtungen zur Wundheilung können in vivo zur Trennung von Geweben und zur Stimulierung der Geweberegeneration angeordnet werden.
PHAs können zur Verkapselung von Zellen eingesetzt werden. Mittels Verfahren, die Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, können die Zellen zuerst vorbeschichtet werden (siehe Maysinger, Reviews in the Neurosciences 6: 15–33 (1995)). Mittels eines Verfahrens zur Verkapselung von Partikeln, wie der Doppelemulsionstechnik, können dann die Zellen mit PHAs verkapselt werden (Ogawa et al., Pharm. Bull. 36: 1095–103 (1988)). Verkapselte Zellen können dann in vivo implantiert werden.
PHAs können mittels vieler verschiedener Techniken der Polymerverarbeitung zu Gerüsten für ein Gewebe-Engineering verarbeitet werden. Zu Verfahren zur Erzeugung von Gerüsten aus PHA für ein Gewebe-Engineering gehören ein Lösemittelgießen, eine Schmelzverarbeitung, ein(e) Faserverarbeitung/Spinnen/Weben oder andere Mittel zur Erzeugung von Fasern, ein Extrudieren, ein Spritz- und Druckformen, ein Laminieren und ein Lösemittellaugen/Lösemittelgießen. Diese Verfahren sind Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Gerüstes aus PHA für das Gewebe-Engineering beinhaltet die Verwendung eines Extruders, wie eines Brabender-Extruders. Zum Beispiel kann diese Technik zur Erzeugung extrudierter, für eine Implantation geeigneter Röhren in verschiedenen Längen und Größen eingesetzt werden.
Ein weiteres Verfahren umfasst die Herstellung eines vliesartigen PHA-Gerüstes aus Fasern. Die Fasern können aus der Schmelze oder der Lösung erzeugt werden und mittels Verfahren, die Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind, zu vliesartigen Materialien verarbeitet werden. Die Eigenschaften der vliesartigen Materialien können durch das Variieren zum Beispiel des PHA-Materials, der Faserabmessungen, der Faserdichte, der Dicke des Material, der Faserorientierung und des Verfahrens zur Faserverarbeitung maßgeschneidert werden. Die porösen Membranen können, wenn es gewünscht ist, weiter verarbeitet werden. Zum Beispiel können diese Membranen zu hohlen Röhren geformt werden.
Ein weiteres Verfahren beinhaltet die Schmelz- oder Lösemittelverarbeitung eines geeigneten PHA zu einer geeigneten Form und das Perforieren des Materials mittels eines Lasers oder einer anderen Vorrichtung zur Erzielung der gewünschten Porosität. Andere Verfahren beinhalten das Walzen eines druckgeformten PHA-Bogens zu einer offenen Röhre und deren Verschluss mittels Wärme. Der PHA-Bogen kann gegebenenfalls mit einem anderen Material, wie einem zweiten biologisch abbaubaren Polymer, gewalzt werden. Zum Beispiel kann das Letztere ein vliesartiges Material aus Polyglykolsäure, Polymilchsäure oder einem Copolymer von Glykol- und Milchsäure sein, wodurch zum Beispiel eine laminierte Röhre bereitgestellt wird, die für die Konstruktion neuer Gefäße, Gänge und Röhren geeignet ist. PHAs können auch zur Beschichtung anderer Gerüste für ein Gewebe-Engineering eingesetzt werden. Solche Materialien könnten aus anderen abbaubaren Polymeren erzeugt worden sein. Die Beschichtung kann zum Beispiel mit einer Lösung auf der Basis eines Lösemittels oder mittels Schmelztechniken oder unter Verwendung eines PHA-Latex erfolgen.
Die hier beschriebenen Vorrichtungen für ein Gewebe-Engineering können vor der Implantation oder nach der Implantation mit Zellen besät werden. Die Zellen können aus einem gesunden Teil des Gewebes des Spenders erhalten werden, in vitro unter Einsatz von Zellkulturtechniken vermehrt und dann entweder vor oder nach der Implantation in ein Gerüst (oder eine Matrix) ausgesät werden. Alternativ können die Zellen aus dem Gewebe eines anderen Spenders oder von existierenden Zelllinien erhalten werden.
PHAs können zur Beschichtung anderer Vorrichtungen und Materialien eingesetzt werden. Derartige Beschichtungen können deren Eigenschaften für medizinische Anwendungen verbessern, indem sie zum Beispiel ihre Biokompatibilität und ihre mechanischen Eigenschaften verbessern, und indem ihre Profile bezüglich des Abbaus und der verzögerten Freisetzung maßgeschneidert werden. PHAs können mittels der oben beschriebenen Herstellungsverfahren auf andere Vorrichtungen aufgetragen werden. Die Dicke der Beschichtung kann an die Anforderungen der jeweiligen Anwendung angepasst werden, indem das eingesetzte Gewicht oder die eingesetzte Konzentration der Beschichtung verändert wird, und/oder indem mehrere Schichten aufgetragen werden.
PHAs können mittels einer Vielzahl von Polymerverarbeitungstechniken zu Stents verarbeitet werden. Zu Verfahren zur Erzeugung von Stents aus PHA gehören ein Lösemittelgießen, eine Schmelzverarbeitung, ein(e) Faserverarbeitung/Spinnen, ein Extrudieren, eine Laserablation, ein Spritzformen und ein Druckformen. Derartige Verfahren sind Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt.
Verfahren zur Erzeugung der Vorrichtungen, die die Porosität oder die exponierte Oberfläche erhöhen, können zur Veränderung der Abbaubarkeit eingesetzt werden. Zum Beispiel kann, wie in den Beispielen demonstriert wird, poröses Poly(4-hydroxybutyrat) mittels Verfahren erzeugt werden, die Poren, Hohlräume oder Zwischenräume erzeugen, wie mittels einer Emulsionstechnik oder einer Sprühtrocknungstechnik, oder die auslaugbare oder lyophilisierbare Partikel in das Polymer inkorporieren.
Weitere Verfahren zur Herstellung von Vorrichtungen aus Polyhydroxyalkanoat werden in Biomaterials Science (Ratner et al., Hrsg.), Academic Press, San Diego, Kalifornien 1966, Biomedical Applications of Polymeric Materials (Tsuruta et al., Hrsg.), CRC-Press, Boca Raton, Florida, 1993), Synthetic Biodegradable Polymer Scaffolds (Atala, et al., Hrsg.), Birhauser, Boston, 1997, Wound Closure Biomaterials and Devices (Chu, J. et al., Hrsg.), CRC Press, Boca Raton, Florida, 1997, Polyurethanes in Biomedical Applications (Lamba et al., Hrsg.) CRC Press, Boca Raton, Florida, 1998, Handbook of Biodegradable Polymers (Domb et al., Hrsg.), Harwood Academic Publishers, Amsterdam, Die Niederlande, 1997, beschrieben.
V. Einsatz der Vorrichtungen
Die Implantate (einschließlich von Beschichtungen) aus Polyhydroxyalkanoat können über ein beliebiges Verfahren zugeführt werden, einschließlich eines offenen chirurgischen Eingriffes oder mittels eines minimal invasiven Verfahrens, wie einer Ingestion oder Injektion oder Insertion. Weiterhin kann die Zusammensetzung in Abhängigkeit von der Anwendung weiter so modifiziert werden, dass sie andere Materialien enthält, beispielsweise bioaktive Mittel wie Wachstumsfaktoren, Arzneimittel, antimikrobielle Mittel, Angiogenesefaktoren oder Materialien, die die Eigenschaften der Vorrichtung modifizieren, wie andere Polymere, Weichmacher, Nukleierungsmittel und Füllstoffe.
Wenn entpyrogenisierte PHAs in den Körper implantiert werden, führen diese Materialien zu einer sehr geringen oder gar keinen akuten Entzündungsreaktion oder sonstigen schädlichen Gewebereaktion. Es gibt keine signifikante Entzündungsreaktion oder Bildung von Narbengewebe. Die Rekrutierung von Entzündungszellen ist minimal. Die histologische Untersuchung der explantierten Vorrichtungen zeigt, dass die Materialien praktisch inert sind. Dementsprechend können aus PHAs konstruierte Vorrichtungen mit minimaler schädlicher Wirkung auf das umgebende Gewebe implantiert werden. Die Freisetzung der Hydroxysäure-Zersetzungsprodukte der implantierten Materialien erfolgt typischerweise langsam und wird vom Körper gut toleriert. Somit wird für die PHAs erwartet, dass sie ihre Materialeigenschaften über Monate beibehalten und sich schließlich zu untoxischen Materialien zersetzen.
Aus PHAs hergestellte Vorrichtungen können für eine große Zahl unterschiedlicher medizinischer Anwendungen eingesetzt werden.
Die in der vorliegenden Erfindung eingesetzten PHAs (Homopolymer-Zusammensetzung aus Poly(4-hydroxybutyrat)) können beliebige einer Vielzahl therapeutischer, prophylaktischer oder diagnostischer Agenzien verkapseln, mit diesen gemischt werden oder ionisch oder kovalent an sie gekoppelt werden. Eine große Vielzahl bioaktiver Materialien kann verkapselt oder inkorporiert werden, entweder für die Zufuhr durch das Polyhydroxyalkanoat zu einer bestimmten Stelle, oder um dem Polymer bestimmte Eigenschaften zu verleihen, wie eine Bioadhäsion, eine Haftung an Zellen, eine Verstärkung des Zellwachstums, eine Hemmung des Bakterienwachstums und eine Verhinderung einer Gerinnselbildung.
Beispiele für geeignete therapeutische und prophylaktische Agenzien sind synthetische anorganische und organische Verbindungen, Proteine und Peptide, Polysaccharide und andere Zucker, Lipide und DNA- und RNA-Nucleinsäuresequenzen mit therapeutischen, prophylaktischen oder diagnostischen Aktivitäten. Zu Nucleinsäuresequenzen gehören Gene, Antisense-Moleküle, die an komplementäre DNA binden und die Transkription hemmen, und Ribozyme. Verbindungen mit sehr unterschiedlichen Molekulargewichten, zum Beispiel zwischen 100 und 500 000 Gramm oder mehr pro Mol, können verkapselt werden. Beispiele für geeignete Materialien sind Proteine, wie Antikörper, Rezeptorliganden und Enzyme, Peptide wie Adhäsionspeptide, Saccharide und Polysaccharide, synthetische organische oder anorganische Arzneimittel und Nucleinsäuren. Beispiele für Materialien, die verkapselt werden können, sind Enzyme, Blutgerinnungsfaktoren, Inhibitoren oder Blutgerinnsel auflösende Agenzien wie die Streptokinase und der Gewebe-Plasminogenaktivator, Antigene für eine Immunisierung, Hormone und Wachstumsfaktoren, Polysaccharide wie Heparin, Oligonucleotide wie Antisense-Oligonucleotide und Ribozyme und retrovirale Vektoren für den Einsatz in der Gentherapie. Das Polymer kann auch zur Verkapselung von Zellen und Geweben eingesetzt werden. Repräsentative diagnostische Agenzien sind Agenzien, die durch Röntgen, Fluoreszenz, Magnetresonanz-Imaging, Radioaktivität, Ultraschall, Computertomografie (CT) und Positronen-Emissions-Tomografie (PET) nachgewiesen werden können. Diagnostische Ultraschallagenzien sind typischerweise Gase wie Luft, Sauerstoff oder Perfluorkohlenstoffe.
Im Falle einer verzögerten Freisetzung kann eine große Vielzahl unterschiedlicher bioaktiver Verbindungen in eine Vorrichtung für eine verzögerte Freisetzung inkorporiert werden. Zu diesen gehören hydrophobe und hydrophile Moleküle und Makromoleküle mit hohem Molekulargewicht wie Proteine. Die bioaktive Verbindung kann in einer prozentualen Beladung zwischen 0,1 und 70 Gew.-%, bevorzugter zwischen 5 und 50 Gew.-%, in das P4HB inkorporiert werden. Die Homopolymer-Zusammensetzungen aus Poly(4-hydroxybutyrat) können in fast jeder beliebigen Form eingesetzt werden, wie als Pulver, Folie, Formstück, Teichen, Kügelchen, Latexe und kristalline und amorphe Materialien. Sie können mit weiteren Materialien, bei denen es sich nicht um PHA handelt, beispielsweise anderen Polymeren, kombiniert werden.
Vor der Implantation muss ein bioresorbierbarer Polymergegenstand zur Verhinderung einer Erkrankung und Infektion des Empfängers sterilisiert werden. Die Sterilisation wird vor dem Besäen einer Polymervorrichtung mit Zellen durchgeführt. Eine Hitzesterilisation von PHA-haltigen Gegenständen ist oft nicht durchführbar, da die Hitzebehandlung den Gegenstand deformieren könnte, insbesondere wenn das PHA eine Schmelztemperatur hat, die unter der für die Hitzesterilisationsbehandlung benötigten Temperatur liegt. Dieses Problem kann durch die Verwendung von kaltem Ethylenoxidgas als Sterilisationsmittel vermieden werden. Die Exposition eines PHA-haltigen Gegenstands gegen Ethylenoxiddämpfe vor der Implantation sterilisiert den Gegenstand und macht ihn für eine Implantation geeignet. Während der Sterilisation mit kaltem Ethylenoxidgas behält der Gegenstand aus PHA seine Form bei. Dieser Typ von Behandlung ist auf ideale Weise für die Sterilisation geformter oder vorgeformter Gegenstände geeignet, bei denen die Form des Gegenstands eine wichtige Rolle für sein richtiges Funktionieren spielt.
Die hier beschriebenen Vorrichtungen können systemisch oder lokal zugeführt werden.
Die hier beschriebenen Implantate und Verfahren werden durch die folgender Beispiele noch besser verständlich werden.
Beispiel 1: Produktion von P4HB in rekombinanten E. coli
Der E.-coli-Stamm MBX1177, ein Abkömmling des Stammes DH5α, der aufgrund seiner Fähigkeit, mit 4-Hydroxybuttersäure (4HB) als einziger Kohlenstoffquelle zu wachsen, selektiert worden war, wurde mit pFS30 transformiert, einem Plasmid, das die Gene enthält, die für die PHA-Synthase aus Ralstonia eutropha, die 4-Hydroxybutyryl-CoA-Transferase aus Clostridium kluyveri und die β-Lactamase, die eine Resistenz gegen Ampicillin bewirkt, enthält, transformiert. Die Synthase und die Transferase befinden sich unter der Steuerung durch den trc-Promotor, der mit Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid (IPTG) in pFS30 induziert werden kann. Diese Zellen ließ man zunächst in 100 mL LB (Luria Broth, Difco, Detroit, Michigan, 25 g/L) plus 100 μg/mL Ampicillin über Nacht in einem 250-ml-Erlenmeyer-Kolben bei 37°C unter Schütteln bei 200 Upm wachsen. Diese gesamte Kultur wurde zum Animpfen der in einem Gefäß von 7 L durchgeführten Fermentation eingesetzt. Der erste Schritt der Fermentation bestand aus dem Wachsenlassen der Biomasse in 5 L LB-Ampicillin bei 37°C unter Rühren mit 800 Upm und einer Belüftung mit 1 volumetrischen Volumen Luft/Minute (vvm). Nach 17 Stunden wurde das Volumen durch die Zugabe von einem Liter Medium auf 6 L eingestellt, sodass das Gesamtvolumen die folgenden Inhaltsstoffe pro Liter enthielt: 2,5 g LB-Pulver, 5 g 4HB in Form des Natriumsalzes, 2 g Glucose, 50 mmol Kaliumphosphat (pH 7), 7 g Phosphorsäure, 100 μg Ampicillin und 0,1 mmol IPTG. Zu diesem Zeitpunkt wurde die Temperatur auf 33°C eingestellt, und die Rührgeschwindigkeit wurde auf 400 Upm verringert. Glucose und Natrium-4HB wurden immer dann zugegeben, wenn der pH signifikant unter bzw. über 7 lag, da die Zugabe von Glucose dazu führte, dass der pH langsam abnahm, und die Zugabe von 4HB dazu führte, dass der pH langsam anstieg. Der pH wurde nicht automatisch gesteuert. Auf diese Weise wurde die Fermentation weitere 70 Stunden fortgesetzt, und danach waren insgesamt 34 g/L Glucose und 15 g/L 4HB zugesetzt worden. Man ließ die Zellen sich bei 4°C 2 Tage absetzen, und danach wurde die flüssige Phase abgepumpt, und die Aufschlämmung der Zellen wurde mittels eines M110-EH-Microfluidizer von Microfluidics Corporation (Newton, Massachusetts) bei 18 000 psi fluidisiert. Das resultierende Material wurde lyophilisiert und unter Erhitzen (60°C) und mechanischem Rühren in Tetrahydrofuran (THF, 3% Gew./Vol. P4HB) extrahiert. Der resultierende THF-Extrakt wurde unter Druck durch Glasmikrofasern (2,3 μm) und Teflonfilter (2 μm) filtriert. Das Polymer wurde durch Zugabe des gleichen Volumens an Wasser ausgefällt und lyophilisiert. Das Polymer wurde wieder in THF (3% Gew./Vol. P4HB) unter Erhitzen (60°C) aufgelöst und die Lösung wurde durch Glasmikrofasern (2,3 μm) und Teflonfilter (2 μm) filtriert und in Wasser/THF (1:1) ausgefällt. Das Präzipitat wurde mit Wasser/THF (1:1) gewaschen und lyophilisiert, wodurch ein weißer Schaum (20 g) erhalten wurde. Dieses Material wurde als Poly-4-hydroxybutyrat identifiziert, und mittels eines Agar-Diffusionsassays (ISO 10993), Toxicon Corp., Bedford, Massachusetts) wurde gezeigt, dass es nicht zytotoxisch war. Die Elementaranalyse ergab C 55,63%, H 7,41%, O 37,28% und N 41 ppm. Die GC-Analyse zeigt, dass nur sehr geringe Lipidmengen im gereinigten Polymer vorhanden sind. Die NMR-Analyse zeigt die erwarteten Peaks und keine Lipide.
Referenzbeispiel 2: Produktion von Poly(4HV-co-2HB) in rekombinanten E. coli
Die E.-coli-Stämme MBX1177/pFS30 und MBX184 (CGSC6966)/pFS30 wurden in 300 mL LB-Ampicillin in einem Erlenmeyer-Kolben von 1 L bei 30°C über Nacht unter Schütteln mit 200 Upm vorkultiviert. Zwei Aliquots von 100 mL jeder Vorkultur wurden zentrifugiert (2000 × g, 10 Minuten), und die aus diesen Aliquots erhaltenen Zellen wurden in 100 mL eines Mediums resuspendiert, das pro Liter enthielt: 6,25 g LB-Pulver, 2 g Glucose, 50 mmol Kaliumphosphat (pH 7), 100 μg Ampicillin und 100 μmol IPTG. Das Medium enthielt auch 2-Hydroxybuttersäure (2HB) und 4HB. In einem Kolben lagen die Konzentrationen bei 8 g/L 2HB und 2 g/L 4HB, und im anderen lagen die Konzentrationen der beiden Säuren jeweils bei 5 g/L. Beide Säuren wurden in Form des Natriumsalzes zu den Kolben gegeben. Die für die Säuren angegebenen Massen enthalten nicht die Masse des Natriums. Diese vier Kolben (zwei Kolben für jeden Stamm) wurden weitere 48 Stunden unter Schütteln bei 200 Upm bei 30°C inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation (2000 × g, 10 Minuten) aus dem Medium entfernt, einmal mit Wasser gewaschen, erneut zentrifugiert und lyophilisiert. Zur Analyse des Polymergehalts und der Polymerzusammensetzung wurde eine gaschromatografische Analyse der lyophilisierten Zellmasse durchgeführt. Die Gehalte der Zellen und die Zusammensetzungen der erzeugten PHAs sind in der Tabelle 2 gezeigt. Wenn das Verhältnis von 2HB zu 4HB bei 4:1 lag, lag der Gehalt des Polymers an 2HB für beide Stämme bei über 19 Prozent, wie mittels GC-Analyse bestimmt wurde, während bei einem Verhältnis von 2HB zu 4HB von 1:1 der Gehalt des Polymers an 2HB bei ungefähr 1 Prozent lag. Das 4HB wurde leichter als das 2HB in das Polymer inkorporiert. Deshalb war, wenn 4HB in einer Konzentration von 2 g/L vorlag, der Gesamtgehalt der Zellen an Polymer geringer, als wenn es in einer Konzentration von 5 g/L vorlag. Die von MBX184/pFS30 produzierten Polymere wurden aus den Zellen extrahiert und analysiert. Die lyophilisierte Zellmasse wurde in 5 mL Chloroform bei 37°C 2 Stunden inkubiert. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation (2000 × g, 5 Minuten) entfernt, und die resultierende Polymerlösung wurde zur Ausfällung zu 50 mL Ethanol getropft. Das ausgefällte Polymer wurde vom Ethanol wie oben beschrieben abzentrifugiert. Im Falle des 2HB:4HB-Verhältnissses von 4:1 war es schwierig, das Polymer vom Ethanol abzuzentrifugieren. Es bildete bei der Zugabe des Ethanols einen Schleier, und es konnte nur zum Teil durch die Zentrifugation gesammelt werden, wahrscheinlich, weil das Molekulargewicht dieses Polymers ziemlich niedrig war. Das aus dem Kolben mit dem 2HB:4HB-Verhältnis von 1:1 isolierte Polymer wurde leicht aus dem Ethanol ausgefällt, und es wurde nahezu vollständig gewonnen. Die GC-Analyse dieser extrahierten Proben (Tabelle 2) zeigte, dass der Gehalt an 2HB etwas geringer war, wenn die Analyse mit ganzen Zellen durchgeführt wurde. Es ist möglich, dass 2HB-Reste in der Polymerkette während der Extraktion hydrolysiert werden, wodurch der apparente Gehalt an 2HB in den extrahierten Proben verringert wurde. Die Tatsache, dass das Molekulargewicht des extrahierten Polymers offenbar niedriger war, wenn der Gehalt an 2HB höher war, stimmt mit dieser Erklärung überein.

Es wurde ein zweites Experiment mit MBX184/pFS30 durchgeführt. Diese Zellen wurden in 400 mL LB-Ampicillin in einem Erlenmeyer-Kolben von einem Liter bei 30°C über Nacht unter Schütteln bei 200 Upm präkultiviert. Zu jedem Kolben wurden 20 mL Medium zugegeben, so dass das Gesamtvolumen pro Liter enthielt: 2,5 g zusätzliches LB-Pulver, 2 g 4HB in Form des Natriumsalzes, 2 g Glucose, 50 mmol Kaliumphosphat (pH 7), 100 μg Ampicillin, 50 μmol IPTG und 2, 4, 6 oder 8 g 2HB in Form des Natriumsalzes. Die Kolben wurden weitere 48 Stunden bei 30°C mit 200 Upm inkubiert. Die Zellen wurden vom Medium durch Zentrifugation (2000 × g, 10 Minuten) abgetrennt, einmal mit Wasser gewaschen, erneut zentrifugiert und lyophilisiert. Die getrocknete Zellmasse wurde wie oben beschrieben einer GC-Analyse unterzogen. Die Tabelle 3 zeigt den Gehalt der Zellen an den Polymeren und die Zusammensetzung. Bei niedrigen 2HB:4HB-Verhältnissen wurde wenig oder kein 2HB in das Polymer inkorporiert. Wenn dieses Verhältnis jedoch bei 3:1 oder 4:1 lag, war die Inkorporation des 2HB in das Polymer sehr signifikant. Der Gesamtgehalt aller Zellen an Polymer war ziemlich niedrig, wahrscheinlich, weil die Säuren nicht in Konzentrationen vorliegen, die hoch genug sind, um eine schnelle Aufnahme und/oder Inkorporation zu ermöglichen. Tabelle 2: GC-Analyse von Poly(4HB-co-2HB) aus MBX1177/pFS30 und MBX184/pFS30

Stamm	4HB, g/L	2HB, g/L	Gesamt-PHA, % des ZTW^a	P4HB, % des PHA^b	P2HB, % des PHA^b
184/30	2	8	18,3	70,8	19,2 (14,2)^c
184/30	5	5	47,1	98,8	1,2 (0,9)^c
1177/30	2	8	13,0	62,3	27,7
1177/30	5	5	40,1	98,9	1,1

^a ZTW: Zelltrockengewicht
^b Bestimmt mittels GC-Analyse. Ungefähr 20 mg der lyophilisierten Zellmasse wurden 3 Stunden einer Butanolyse bei 110°C in 2 mL einer Mischung unterzogen, die (in Volumeneinheiten) 90% 1-Butanol und 10% konzentrierte Salzsäure enthielt, wobei 2 mg/mL Benzoesäure als interner Standard zugegeben worden waren. Die wasserlöslichen Komponenten der resultierenden Mischung wurden durch Extraktion mit 3 mL Wasser entfernt. Die organische Phase (1 μL in einem Splitverhältnis von 1:50 bei einer Gesamtflussgeschwindigkeit von 2 mL/min) wurde auf einer SPB-1-Kapillar-GC-Säule aus verschmolzenem Siliciumoxid (30 m, 0,32 mm ID, 0,25 μm Film, Bellafonte, Pennsylvania) mit dem folgenden Temperaturprofil analysiert: 80°C, 2 min, 10°C pro min auf 250°C, 250°C 2 min. Der zur Testung auf das Vorliegen von 4-Hydroxybutyrat-Einheiten im Polymer eingesetzte Standard war γ-Butyrolacton. Der zur Testung auf 2-Hydroxybutyrat-Einheiten im Polymer eingesetzte Standard war Natrium(2-hydroxybutyrat).
^c Die in Klammern angegebenen Prozentzahlen wurden mittels einer GC-Analyse wie oben bestimmt, aber nach der Extraktion des Polymers in Chloroform und einer nachfolgenden Ausfällung in Ethanol.

Probe	4HB, g/L	2HB, g/L	Gesamt-PHA % des ZTW^a	P4HB, % des PHA^b	P2HB, % des PHA^b
1	2	2	8,2	100	0
2	2	4	5,6	100	0
3	2	6	5,7	84,1	15,9
4	2	8	4,1	54,3	45,7

^a ZTW: Zelltrockengewicht
^b Bestimmt mittels GC-Analyse. Siehe Tabelle 2 bezüglich Details.

Referenzbeispiel 3: Produktion von Poly(4HB-co-3HB) in rekombinanten E. coli
Der Stamm MBX1177/pFS30 wurden in 100 mL LB-Ampicillin in vier separaten Erlenmeyerkolben von 250 mL bei 30°C über Nacht unter Schütteln mit 200 Upm vorkultiviert. Zu jedem Kolben wurden 20 mL Medium gegeben, sodass das Gesamtvolumen pro Liter enthielt: 2,5 g zusätzliches LB-Pulver, 4 g 4HB in Form des Natriumsalzes, 4 g Glucose, 50 mmol Kaliumphosphat (pH 7), 100 μg Ampicillin, 50 μmol IPTG und 0,25, 0,5, 0,75 oder 1 g 3-Hydroxybutyrat (3HB) in Form des Natriumsalzes. Die Kolben wurden weitere 48 Stunden bei 30°C mit 200 Upm inkubiert. Die Zellen wurden vom Medium durch Zentrifugation (2000 × g, 10 Minuten) abgetrennt, einmal mit Wasser gewaschen, erneut zentrifugiert und lyophilisiert. Zur Analyse des Polymergehalts und der Polymerzusammensetzung wurde eine gaschromatografische Analyse der lyophilisierten Zellmasse durchgeführt. Der zur Testung auf 3-Hydroxybutyrat-Einheiten im Polymer eingesetzte Standard war Poly(3-hydroxybutyrat). Die Gehalte der Zellen und die Zusammensetzungen der erzeugten PHAs sind in der Tabelle 4 angegeben. Wenn das Verhältnis von 4HB/3HB im Medium abnahm, stieg der Gehalt des Polymers an 3HB auf monotone Weise an, während der Gesamtgehalt der Zellen an Polymer in allen Versuchen ähnlich war, was bedeutet, dass die Zusammensetzung des Mediums auf vorhersagbare Weise zur Steuerung der Zusammensetzung des Copolymers eingesetzt werden kann, ohne dass die Gesamtausbeute an Polymer signifikant beeinflusst wird. Das Polymer wurde aus dem Rückstand der lyophilisierten Zellmasse extrahiert. Bei allen Proben wurde die lyophilisierte Zellmasse mit ungefähr dem dreifachen Volumen an 1,2-Dichlorethan gemischt und unter leichtem Schütteln in einem geschlossenen Röhrchen 6 Stunden bei 37°C inkubiert. Das teilchenförmige Material wurde durch Zentrifugation (2000 × g, 10 Minuten) von der Polymerlösung abgetrennt. Die resultierende Lösung wurde zum ungefähr 10-Fachen ihres Volumens an Ethanol getropft, und das ausgefällte Polymer ließ man sich aus der Lösung absetzen. Der Überstand wurde abgegossen, und das verbleibende nasse Polymer ließ man stehen, bis es anscheinend trocken war. Das Polymer wurde dann bis zur vollständigen Trockne lyophilisiert. Die thermischen Eigenschaften dieser P4HB-co-3HB-Zusammensetzungen sind in der Tabelle 5 gezeigt. Tabelle 4: GC-Analyse von Poly(4HB-co-3HB) aus MBX1177/pFS30

Probe 4HB, g/L 3HB, g/L Gesamt-PHA, % des ZTW^a P4HB, % des PHA^b P3HB, % des PHA^b

3a 4 0,25 49,3 98,0 2,0

3b 4 0,5 46,7 94,2 5,8

3c 4 0,75 56,6 91,7 8,3

3d 4 1 51,8 89,4 10,6

^a ZTW: Zelltrockengewicht.
^b Bestimmt mittels GC-Analyse. Siehe Tabelle 2 bezüglich Details. Der zur Testung auf das Vorliegen von 4-Hydroxybutyrat-Einheiten im Polymer eingesetzte Standard war γ-Butyrolacton. Der zur Testung auf das Vorliegen von 3-Hydroxybutyrat-Einheiten im Polymer eingesetzte Standard war Poly(3-hydroxybutyrat).

Probe	%^a 4HB	%^a 3HB	Tm^b (°C)	dH Tm1^b (J/g)	Tg^b (°C)	Tx^b (°C)	Tm2^b (°C)	Mw^c
P4HB	100	0	60	45	–51	–16	X	1 000 000
3b	94,2	5,8	47	36	–52	–4	44	1 500 000
3c	91,7	8,3	40	20	–53	n. n.	39	1 900 000
3d	89,4	10,6	39	17	–53	n. n.	n. n.	1 100 000

n. n. = nicht nachgewiesen
^a Bestimmt mittels GC-Analyse, siehe Tabelle 2 bezüglich Details.
^b Bestimmt mittels DSK-Analyse. Es wurde ein Differential-Scanning-Kalorimeter Pyris 1 von Perkin Elmer eingesetzt. Die Probenmassen lagen bei ungefähr 4–8 mg. Das eingesetzte Temperaturprogramm sah folgendermaßen aus: 25°C, 2 min, Erhitzen auf 195°C mit 10°C pro min, Halten bei 195°C für 2 min, Abkühlen auf –80°C mit 300°C pro min, Halten bei –80°C für 2 min, Erhitzen auf 195°C mit 10 °C pro min. Die Schmelztemperatur (Tm) und die Fusionsenthalpie dieses Schmelzpeaks (dHTm1) wurden im ersten Heizzyklus bestimmt. Die Glasübergangstemperatur (Tg), die Kristallisationstemperatur (Tx) und die Schmelztemperatur (Tm2) wurden während des zweiten Heizzyklus bestimmt.
^c Bestimmt mittels GPC-Analyse. Die isolierten Polymere wurden in Chloroform in einer Konzentration von ungefähr 1 mg/mL gelöst, und Proben (50 μL) wurden auf einer Styragel-HT6E-Säule von Waters bei einer Flussgeschwindigkeit von 1 mL Chloroform pro Minute bei Raumtemperatur unter Verwendung eines Brechungsindex-Detektors chromatografiert. Die Molekülmassen wurden relativ zu Polystyrolstandards geringer Polydispersität bestimmt.

Beispiel 4: In-vitro- und In-vivo-Abbau von P4HB
Der Abbau von P4HB wurde in vitro und in vivo untersucht. Es wurden drei verschiedene Konfigurationen mit unterschiedlicher Porosität (0%, 50% und 80% Porosität) untersucht. Kleine Scheibchen (Durchmesser 5 mm) wurden aus druckgeformten P4HB-Folien gleichmäßiger Dicke ausgestanzt. Poröse P4HB-Proben wurden mittels der unten beschriebenen Salzlaugungstechnik hergestellt. Das Abbauverhalten in vitro wurde durch das Inkubieren der Scheibchen in einem sterilen Phosphatpuffer (8 mM Natriumphosphat, 2 mM Kaliumphosphat, 140 mM NaCl, 10 mM KCl, pH 7,4, mit NaN₃ als Konservierungsmittel) bei 37°C untersucht. Das Abbauverhalten in vivo wurde nach der Implantation in subkutane Taschen an Ratten untersucht.
Herstellung von porösem P4HB
Natriumchloridkristalle definierter Größe (80–180 μm) wurden mit geschmolzenem P4HB gemischt. (Man beachte, dass das Verhältnis von Polymer zu Salz zur Erzeugung der gewünschten Porosität eingestellt werden kann, während die Teilchengröße zur Erzeugung von Poren unterschiedlicher Größe eingestellt werden kann.) Die Mischung aus Polymer und Salz wurde zu einer dünnen Folie gepresst. Nachdem man das Material hatte fest werden lassen, wurde der Film von der Mylar-Trägerfolie abgelöst. Die Folie wurde zur Entfernung des Salzes erschöpfend mit Wasser extrahiert, wobei eine poröse Folie aus P4HB zurückblieb.
Beschleunigter Abbau von P4HB
Der Abbau von PHB wurde in vivo untersucht. Es wurden drei verschiedene Konfigurationen mit unterschiedlicher Porosität (0%, 50% und 80% Porosität) untersucht. Kleine Scheibchen (Durchmesser 5 mm) wurden aus druckgeformten P4HB-Folien gleichmäßiger Dicke ausgestanzt. Poröse P4HB-Proben wurden mittels der unten beschriebenen Salzlaugungstechnik hergestellt. Das Abbauverhalten in vivo wurde an Ratten nach Implantation in subkutane Taschen untersucht. Proben wurden zu unterschiedlichen Zeiten entfernt. Die Molekülmassen wurden mittels GPC gemessen, und der Massenverlust wurde über die Quantifizierung des verbliebenen 4HB mittels GC-Analyse gemessen. Die Ergebnisse sind in der 3 gezeigt. Wie in der 3 gezeigt ist, hängt der Massenverlust der Proben von der Porosität ab. Die Folie und die zu 50% und zu 80% porösen Proben zeigten innerhalb des Zeitraumes von 6 Wochen einen Massenverlust von 5%, 20% bzw. 75%, und der durchschnittliche Massenverlust dieser Proben nahm ebenfalls signifikant ab (20 bis 50%). Diese Daten zeigen, dass die Abbaugeschwindigkeit von PHAs durch die Veränderung der Porosität und die Erhöhung der Oberfläche modifiziert und gesteuert werden kann.
Ergebnisse
Die P4HB-Implantate zeigten eine sehr minimale entzündliche Reaktion, viel geringer als die bei einem vliesartigen Netz aus PGA. Das ist ein sehr guter Hinweis auf die Biokompatibilität dieser Materialien. Proben wurden zu unterschiedlichen Zeiten entnommen und sowohl bezüglich der Implantate als auch des umgebenden Gewebes histologisch untersucht. Die Molekülmasse wurde mittels GPC gemessen, und der Massenverlust wurde durch die Quantifizierung des verbliebenen 4HB mittels GC-Analyse gemessen. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 6 und 7 gezeigt. Wie in der Tabelle 6 gezeigt ist, zersetzt sich P4HB in vitro innerhalb eines Zeitraums von 10 Wochen nicht signifikant. Alle Proben behielten ihr Ausgangsgewicht bei, und es kam zu einer Abnahme der durchschnittlichen Molekülmasse von ungefähr 20 bis 40%. Die in vivo inkubierten Proben zeigten einen viel stärker ausgeprägten Abbau. Der Massenverlust hing von der Porosität ab. Die Folie und Proben mit 50% und 80% Porosität zeigten über den Zeitraum von 10 Wochen einen Massenverlust von 20%, 50% bzw. 100%, und der durchschnittliche Massenverlust dieser Proben nahm ebenfalls signifikant ab (20 bis 50%).
Die Untersuchung der Proben mittels Lichtmikroskopie und Environmental-Scanning-Elektronenmikroskopie (ESEM) zeigte fast keine erkennbare Veränderung für die In-vitro-Proben über den Inkubationszeitraum von 10 Wochen. Im Gegensatz dazu zeigten die In-vivo-Implantate ausgeprägte Anzeichen eines Abbaus. Die Oberfläche dieser Materialien wurde während des Implantationszeitraums von 10 Wochen zunehmend abgebaut. Nach einer Woche zeigten die Folienproben einige Anzeichen eines Brüchigwerdens und Reißens, die sich während der folgenden 9 Wochen zu einer Oberflächenerosion und einem Angefressensein weiter entwickelten.

Die Daten zum In-vitro-Abbau legen nahe, dass P4HB gegenüber einer einfachen Hydrolyse recht stabil ist, im Gegensatz zu anderen Polyestern, die in bioresorbierbaren Anwendungen eingesetzt werden, wie PGA, PLA und deren Copolymeren. Der Abbau der Implantate zeigte jedoch, dass P4HB in vivo abgebaut werden kann, was eine biologisch vermittelte Art des Abbaus nahelegt. Die Daten zeigen einen zunehmenden Abbau mit zunehmender Porosität, was anzeigt, dass die Oberfläche des Polymerimplantats eine Rolle bei seinem Abbau in vivo spielt. Das legt nahe, dass der Abbau von P4HB-Polymeren in vivo an der Oberfläche des Implantats abläuft, im Gegensatz zu PGA- oder PLA-Materialien, die durch eine Hydrolyse in ihrer gesamten Masse abgebaut werden, was mit einer Abnahme der Molekülmasse und einem Verlust der mechanischen Eigenschaften assoziiert ist. Diese Daten legen nahe, dass die Abbaugeschwindigkeit von P4HB über das Verändern seiner Oberfläche modifiziert und gesteuert werden kann. Es wird auch erwartet, dass dieser Typ des oberflächlichen Abbaus zu einer relativ langsamen Geschwindigkeit des Verlustes der Molekülmasse kommt, was es ermöglicht, die Eigenschaften des Polymermaterials für längere Zeiten aufrecht zu erhalten, als es bei existierenden resorbierbaren medizinischen Polyestern der Fall ist. Die P4HB-Implantate wurden sehr gut toleriert und zeigten nur eine sehr minimale Fremdkörperreaktion. Diese Befunde zeigen, dass diese Materialien gegenüber existierenden biomedizinischen Polyestern signifikante Vorteile aufweisen. Tabelle 6: Abbau von P4HB in vitro: Verbliebener Anteil der ursprünglichen Masse in Prozent und Molekülmasse

Implantation (Wochen)	Folie, Gew.-% verblieben^a	Folie, Molekülmasse^b	50% Por., Gew.-% verblieben^a	50% Por., Molekülmasse^b	80% Por., Gew.-% verblieben^a	80% Por., Molekülmasse^b
0	108	1144592	96	963145	123	1291117
1	97	1160707	93	1103860	99	968245
2	101	1008496	98	1055614	106	1072328
4	100	887005	96	725089	116	987665
6	109	896521	97	764260	95	1049079
10	92	772485	90	605608	100	727543

^a Bestimmt mittels GPC-Analyse. Siehe Tabelle 3 bezüglich Details.
^b Bestimmt mittels quantitativer GC-Analyse. Siehe Tabelle 2 bezüglich Details

Implantation (Wochen)	Folie, Gew.-% verblieben^a	Folie, Molekülmasse^b	50% Por., Gew.-% verblieben^a	50% Por., Molekülmasse^b	80% Por., Gew.-% verblieben^a	80% Por., Molekülmasse^b
0	108	1144592	96	963145	123	1291117
1	103	1091107	109	1026821	88	1132492
2	95	1054873	94	973830	35	943960
4	92	1007736	73	989629	39	881919
6	90	797170	74	901330	28	689157
10	80	716296	48	647175	0	n. n.

a Bestimmt mittels GPC-Analyse. Siehe Tabelle 3 bezüglich Details.
^b Bestimmt mittels GC-Analyse. Siehe Tabelle 2 bezüglich Details. Die Explantate wogen aufgrund des Vorliegens von anhängendem Gewebe oder koaguliertem Blut oft mehr als das ursprüngliche Implantat. Deshalb wurde die P4HB-Masse im Explantat mittels quantitativer GC-Analyse bestimmt. Das verbliebene P4HB in Gewichtsprozent wurde als diese Masse geteilt durch die des ursprünglichen Implantats bestimmt.

Beispiel 5: Druckformen

P4HB wurde mittels einer hydraulischen Carver-Presse zu einer dünnen Folie gepresst. Die Drucktiegel wurden auf 115°C erhitzt. Das P4HB wurde zwischen zwei Mylar-Bögen unter Verwendung von Metallabstandshaltern gepresst. Die Dicke der Abstandshalter und der Druck der Presse wurden zur Steuerung der Foliendicke eingestellt. Die Folie wurde aus der Presse entnommen, und dann ließ man sie sich auf Raumtemperatur abkühlen. Nach dem Festwerden (innerhalb von Sekunden) ließ sich die Folie leicht vom Mylar-Trägermaterial abschälen. Die mechanischen Daten für dieses Material sind in der Tabelle 1 gezeigt. Das schnelle Festwerden des P4HB zeigt seine schnelle Kristallisation. Tabelle 1: Thermische und mechanische Eigenschaften ausgewählter medizinischer Polymere

Polymer	Tm (°C)	Tg. (°C)	Zugfestigkeit (psi)	Modulus (psi)	Dehnung (%)	Abbau
¹P4HB	60	–51	7 500	9 400	1 000	abhängig von Konfig.
¹pP4HB50^a	60	–51	895	2 155	164	abhängig von Konfig.
¹pP4HB80^b	60	–51	180	257	100	abhängig von Konfig.
⁵P4HB-3HB 10%	50	–42	9 000	14 500	1 080	nicht berichtet
¹PHB	175	0	4 000	110 000	4	> 52 Wochen
²PGA	230	35	10 000	1 000 000	17	8 Wochen
³PDLLA	am.	53	5 000	300 000	5	< 8 Wochen
³PLLA	175	55	10 000	500 000	8	> 8 Wochen
²DLPLG 50/50	am.	48	7 000	300 000	5	3–8 Wochen
⁵LDPE			2 000		400–700	nicht abbaubar
³HDPE			4 000		100–1000	nicht abbaubar
³UHMWPE			7 250		450	nicht abbaubar
PP			4 000	20 000	200–700	nicht abbaubar
PET			8 500		50	nicht abbaubar
PTFE			3 000 bei max. Dehnung	50 000	300	nicht abbaubar

^a pP4HB50, 50% poröses P3HB, siehe Beispiel 7
^b pP4HB80, 80% poröses P4HB, siehe Beispiel 7

Literaturstellen für die Tabelle:

1. aus der vorliegenden Arbeit, gemessen gemäß ASTMD638 bei Umgebungstemperatur und einer Dehnungsgeschwindigkeit von 0,05 oder 0,1 Inch/min
2. Hutmacher et al., int. J. Oral Max. Imp. 1996, 11: 667–78
3. Nobes et al., eingereicht
4. Mark, Physical Properties of Polymers Handbook, American Inst. of Physics, Woodbury, New York, 1996
5. Schwartz, S. S. und Goodman, S. H., Plastic Materials and Processes, Van Nostrand Reinhold Company, New York, 1982
6. Saito, Y. und Doi, Y., Int. J. Biol. Macromol. (1994) 16: 99–104

Beispiel 6: Druckformen von porösem P4HB
Natriumchloridkristalle definierter Größe (80–180 μm) wurden mit schmelzflüssigem P4HB gemischt, wie es in den Beispielen 4 und 5 beschrieben wurde. (Das Verhältnis von Polymer zu Salz zur Erzeugung der gewünschten Porosität eingestellt werden kann, während die Teilchengröße zur Erzeugung von Poren unterschiedlicher Größe eingestellt werden kann.) Die Mischung aus Polymer und Salz wurde unter den im Beispiel 6 beschriebenen Bedingungen zu einer dünnen Folie gepresst. Nachdem man das Material hatte fest werden lassen, wurde die Folie vom Mylar-Träger entfernt. Die Folie wurde zur Entfernung des Salzes erschöpfend mit Wasser extrahiert, wobei eine poröse Folie aus P4HB zurückblieb. Die Entfernung des Salzes wurde über die Analyse des Chlorids im Überstand verfolgt und durch eine Elementaranalyse des ausgelaugten Films bestätigt (weniger als 0,5% Chlorid). Die mechanischen Daten für zu 50% und zu 80% poröses P4HB (pP4HB50 bzw. pP4HB80) sind in der Tabelle 1 bezeigt.
Beispiel 7: Aussaat von Zellen auf Gerüste aus P4HB
Poröses P4HB, wie es im Beispiel 6 beschrieben wurde, wurde durch eine Behandlung mit kaltem Ethylenoxid sterilisiert. Es wurde mit Schaf-Gefäßzellen besät und in vitro kultiviert. Vorläufige Daten zeigten eine sehr gute Anheftung dieser Zellen an dem Material. Das ist eine weitere Demonstration der Biokompatibilität dieses Materials. Die Zahl der an dem Material anhaftenden Zellen kann mittels eines DNA-Assays quantifiziert und mit der für den Standard für Gewebe-Engeneering-Gerüste, einem PGA-Netz, verglichen werden.
Beispiel 8: Orientierung der P4HB-Fasern
Druckgeformte Streifen aus P4HB wurden uniaxial gedehnt. Die Proben wurden schmaler und klar und zeigten dabei Anzeichen einer Einschnürung. Nach diesem Dehnprozess erschien das Polymer stabiler und etwas flexibler, was die uniaxiale Orientierung der Probe anzeigte.
Beispiel 9: Produktion eines P4HB-Schaumes
Es wurde ein Verfahren einer thermischen Phasentrennung zur Erzeugung eines P4HB-Schaumes eingesetzt. Zuerst wurde P4HB in Dioxan in einer Konzentration von 1 bis 5% (Gew./Vol.) gelöst. Diese Polymerlösung wurde zu einer dicken Folie gegossen und durch das Abkühlen auf Eis unter den Schmelzpunkt des Dioxans verfestigt. Das Lösemittel wurde aus diesem festen Material bei verringertem Druck abgezogen, wodurch ein poröser Schaum mit den ungefähren Abmessungen der dicken Ausgangsfolie erhalten wurde. Eine ESEM-Analyse dieses Materials zeigte eine hochporöse, schwammartige Struktur. Die Polymerkonzentration und der Abkühlungsprozess können zur Veränderung der Porosität des Schaumes variiert werden. Vor dem Einfrieren kann die Polymerlösung in verschiedene Formen gebracht werden, zu teilchenförmigem Material zerkleinert oder als eine Beschichtung eingesetzt werden. Deshalb kann diese Technik einer thermischen Phasentrennung zur Erzeugung einer großen Vielzahl hochporöser, dreidimensionaler Formen aus P4HB eingesetzt werden.
Beispiel 10: Beschichtung aus P4HB auf einem vliesartigen Netz aus PGA
P4HB wurde in Tetrahydrofuran in einer Konzentration von 1% (Gew./Vol.) gelöst. Ein vliesartiges Netz aus PGA (Albany International, Schüttdichte 52 mg/cm³) von 1 mm Dicke wurde so in diese Lösung getaucht, dass Hohlräume mit Luft eliminiert wurden. Man ließ das beschichtete Netz an der Luft trocknen, und der Beschichtungsprozess wurde wiederholt. Lichtmikroskopische Analysen und ESEM-Analysen des beschichteten Netzes zeigten, dass das Polymer während des Trocknungsprozesses an die Schnittstellen der Fasern wanderte und eine Aneinanderbindung der Fasern bewirkte. Für diese Technik der Faserverbindung wurde gefunden, dass sie die Stabilität und die Handhabbarkeit des PGA-Netzes dramatisch verbessert. Eine Testung auf Zugfestigkeit gemäß ASTM D638 zeigte, dass die Zugfestigkeit, der Elastizitätsmodul und die maximale Dehnung dieses Materials bei 130 psi, 240 psi bzw. 171% lagen. Das stellte eine dramatische Verbesserung gegenüber dem unbeschichteten Material dar, das für eine Testung dieser Parameter zu empfindlich war.
Beispiel 11: Beschichtung aus P4HB-Schaum auf einem vliesartigen Netz aus PGA
P4HB wurde in Dioxan in einer Konzentration von 2,5% (Gew./Vol.) gelöst. Ein vliesartiges Netz aus PGA (Albany International, Schüttdichte 52 mg/cm³) von 1 mm Dicke wurde so in diese Lösung getaucht, dass Hohlräume mit Luft eliminiert wurden. Das beschichtete Netz wurde auf Eis abgekühlt, sodass die Beschichtungslösung fest wurde. Das Netz wurde zur Entfernung des Dioxans gefriergetrocknet. Die lichtmikroskopische Analyse des beschichteten Netzes zeigte, dass während des Gefriertrocknungsprozesses das Polymer einen netzartigen Schaum im gesamten PGA-Netz bildete. Dieses geschäumte Material lässt sich gut handhaben. Die große Oberfläche und die verbesserten mechanischen Eigenschaften sind für verschiedene Anwendungen sehr attraktiv.
Beispiel 12: Bildung von Mikrokügelchen aus P4HB
P4HB wurde in Dichlormethan in einer Konzentration von 1% (Gew./Vol.) gelöst. Ein Volumen dieser Lösung von 1 mL wurde mit 5 mL einer Lösung von Natriumdodecylsulfat (SDS) mit einer Konzentration von 0,5% (Gew./Vol.) gemischt. Die Mischung aus zwei Phasen wurde zur Erzeugung einer Emulsion mechanisch gemischt. Ein Stickstoffstrom wurde unter schnellem Rühren 1 Stunde durch die Mischung geblubbert, um die Entfernung des Dichlormethans zu beschleunigen. Die Mischung wurde zur Bewirkung der vollständigen Entfernung des Dichlormethans an der freien Luft über Nacht gerührt. Die resultierende Suspension enthielt Mikrokügelchen aus P4HB von ungefähr 1–10 μm, wie unter einem Phasenkontrast-Lichtmikroskop ermittelt wurde.
Schlussfolgerungen aus den Beispielen
Das Homopolymer P4HB weist physikalische Eigenschaften und Abbaueigenschaften auf, die es für den Einsatz als Implantat in medizinischen Anwendungen sehr attraktiv machen. Dieses Polymer kann in Form von Fasern, Bögen, Schäumen, Beschichtungen, Strukturen, Filamenten und dergleichen für deren Einsatz als implantierbare medizinische Materialien hergestellt werden.

Claims

Biokompatibles, medizinisches Implantat für die Befestigung, Fixierung, Stützung, Reparatur oder Verstärkung von weichem Gewebe, wobei das Implantat eine Zusammensetzung aus einem Poly(4-hydroxybutyrat)-Homopolymer umfasst, wobei die Zusammensetzung aus dem Poly(4-hydroxybutyrat)-Homopolymer gegebenenfalls Additive umfasst, die die chemische Beständigkeit des Polymers verändern, wobei das Poly(4-hydroxybutyrat)-Homopolymer ein Gewichtsmittel des Molekulargewichts im Bereich zwischen 10 000 und 10 000 000 Dalton aufweist, wobei das Implantat aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Verschlussnähten, Vorrichtungen für die Meniskusreparatur, Nieten, Stiften, Interferenzschrauben, chirurgischen Netzen für Implantate in weiches Gewebe zur Verstärkung von weichem Gewebe, zur Überbrückung von Faszienschäden, für Patches für die Trachea oder andere Organe, für eine Organentnahme, für ein Material für eine Duratransplantation, für Verbände für Wunden oder Verbrennungen oder für eine hämostatische Tamponade, Schlingen, orthopädischen Stiften, Adhäsionsbarrieren, kardiovaskulären Stents, gastroenterologischen Stents oder Ureterstents, Vorrichtungen für die Gelenkknorpelreparatur, Nervenleitschienen, Vorrichtungen für die Sehnenreparatur, Vorrichtungen für die Reparatur von Atriumseptum-Defekten, kardiovaskulären Patches für ein Patch-Grafting an Gefäßen, eine Anbringung intrakardialer Patches oder einen Patchverschluss nach einer Endarteriektomie, und Reparaturpatches für die Reparatur abdominaler Schäden und von Schäden der Thoraxwand, von Inguinal-, Parakolostomie-, Ventral-, Nabel-, Skrotal- oder Femoralhernien, für die Verstärkung von Muskellappen, für die Verstärkung von Klammernähten und langen Schnitten, für die Rekonstruktion des Beckenbodens, für die Reparatur des Rektum- und Scheidenvorfalls, für Polster für Nähte und Klammern, für die Reparatur der Harnwege und -blase oder für Binden.
Implantat nach Anspruch 1, wobei die Geschwindigkeit des Abbaus der Zusammensetzung aus dem Poly(4-hydroxybutyrat)-Homopolymer über das Erhöhen der Porosität der Poly(4-hydrobybutyrat)-Zusammensetzung gesteuert wird.
Implantat nach Anspruch 1, wobei die Zusammensetzung aus dem Poly(4-hydroxybutyrat)-Homopolymer Additive umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus hydrophilen Substanzen, hydrophoben Substanzen und Beschichtungen, die die Wasseraufnahme der Zusammensetzung verändern, besteht.
Implantat nach Anspruch 1, das Additive umfasst, die die chemische Beständigkeit des Polymers verändern.
Implantat nach Anspruch 4, wobei die Additive die Kettenspaltung fördern.
Implantat nach Anspruch 4, wobei die Additive aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Säuren, Basen, Elektrophilen, Nucleophilen, Weichmachern, Polymeren, porenbildenden Mitteln und Mitteln, die für die Verringerung der Kristallinität des Polymers bestimmt sind, besteht.
Implantat nach Anspruch 1, das porenbildende Mittel umfasst.
Implantat nach Anspruch 7, wobei die porenbildenden Mittel lyophilisierbare Partikel sind.
Implantat nach Anspruch 7, wobei die porenbildenden Mittel Wasser absorbieren.
Verfahren zur Herstellung eines biokompatiblen, medizinischen Implantats für die Befestigung, Fixierung, Stützung, Reparatur oder Verstärkung von weichem Gewebe, wobei das Implantat eine Zusammensetzung aus einem Poly(4-hydroxybutyrat)-Homopolymer umfasst, wobei die Zusammensetzung aus einem Poly(4-hydroxybutyrat)-Homopolymer gegebenenfalls Additive umfasst, die die chemische Beständigkeit des Polymers verändern, wobei das Poly(4-hydroxybutyrat)-Homopolymer ein Gewichtsmittel des Molekulargewichts im Bereich zwischen 10 000 und 10 000 000 Dalton hat, wobei das Verfahren umfasst Bereitstellen einer Zusammensetzung aus einem Poly(4-hydroxybutyrat)-Homopolymer, wobei die Zusammensetzung aus einem Poly(4-hydroxybutyrat)-Homopolymer gegebenenfalls Additive umfasst, die die chemische Beständigkeit des Polymers verändern, wobei das Poly(4-hydroxybutyrat)-Homopolymer ein Gewichtsmittel des Molekulargewichts im Bereich zwischen 10 000 und 10 000 000 Dalton hat, und Formen oder Inkorporieren der Zusammensetzung aus einem Poly(4-hydroxybutyrat)-Homopolymer zu einem Implantat oder in ein Implantat, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Verschlussnähten, Vorrichtungen für die Meniskusreparatur, Nieten, Stiften, Interferenzschrauben, chirurgischen Netzen für Implantate in weiches Gewebe zur Verstärkung von weichem Gewebe, zur Überbrückung von Faszienschäden, für Patches für die Trachea oder andere Organe, für eine Organentnahme, für ein Material für eine Duratransplantation, für Verbände für Wunden oder Verbrennungen oder für eine hämostatische Tamponade, Schlingen, orthopädischen Stiften, Adhäsionsbarrieren, kardiovaskulären Stents, gastroenterologischen Stents oder Ureterstents, Vorrichtungen für die Gelenkknorpelreparatur, Nervenleitschienen, Vorrichtungen für die Sehnenreparatur, Vorrichtungen für die Reparatur von Atriumseptum-Defekten, kardiovaskulären Patches für ein Patch-Grafting an Gefäßen, eine Anbringung intrakardialer Patches oder einen Patchverschluss nach einer Endarteriektomie, und Reparaturpatches für die Reparatur abdominaler Schäden und von Schäden der Thoraxwand, von Inguinal-, Parakolostomie-, Ventral-, Nabel-, Skrotal- oder Femoralhernien, für die Verstärkung von Muskellappen, für die Verstärkung von Klammernähten und langen Schnitten, für die Rekonstruktion des Beckenbodens, für die Reparatur des Rektum- und Scheidenvorfalls, für Polster für Nähte und Klammern, für die Reparatur der Harnwege und -blase oder für Binden.
Implantat nach Anspruch 1 oder Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die Niete oder der Stift eine Vorrichtung für die Reparatur von SLAP-Läsionen, die Reparatur einer akromio-klavikularen Separation, die Reparatur der Rotatorenmanschette, für den Kapselshift oder capsulolobrale Rekonstruktionen, die Bizepstenodese oder die Reparatur des Deltamuskels ist, das chirurgische Netz für die Reparatur abdominaler Aponeurosen, der Bauchdecke, von Faszien- oder Kapselschäden, von Patella- oder Achillessehnen oder den Ersatz von Infraspinatus-Sehnen oder kranialen Kreuzbändern ist.
Implantat gemäß Anspruch 1, wobei das Implantat ferner ein therapeutisches, prophylaktisches oder diagnostisches Mittel umfasst.
Implantat gemäß Anspruch 12, wobei das therapeutische, prophylaktische oder diagnostische Mittel aus der Gruppe ausgewählt ist, die umfasst Gene, Oligonucleotide, Nucleinsäuren, Antisensemoleküle, Ribozyme, retrovirale Vektoren für den Einsatz in der Gentherapie, Antikörper und deren Fragmente, Zelladhäsionsfaktoren, Rezeptorliganden, Enzyme, Adhäsionspeptide, Saccharide, Polysaccharide, synthetische organische oder anorganische Arzneimittel, Gerinnungsfaktoren, Gerinnungshemmer, Thrombolytika, Antigene für eine Immunisierung, Hormone, Wachstumsfaktoren und diagnostische Mittel, die durch Röntgen, über ihre Fluoreszenz, durch ein Magnetresonanzimaging, über ihre Radioaktivität, mittels Ultraschall, Computertomographie (CT) oder Positronenemissionstomographie (PET) nachgewiesen werden können.
Implantat gemäß Anspruch 13, wobei das Thrombolytikum ausgewählt ist aus Streptokinase und Gewebeplasminogenaktivator, das Polysaccharid Heparin ist, das Oligonucleotid ein Antisenseoligonucleotid ist und das mittels Ultraschall nachweisbare diagnostische Mittel ein aus Luft, Sauerstoff und Perfluorkohlenstoffen ausgewähltes Gas ist.
Implantat gemäß Anspruch 1, wobei das Polymer Zellen oder Gewebe einkapselt.