DE60038029T2

DE60038029T2 - Methoden und reagenzien zur in situ amplifizierung

Info

Publication number: DE60038029T2
Application number: DE60038029T
Authority: DE
Inventors: Yuexia Burtonsville LI; Kathy Lynn Germantown HICKMAN; Eun Mi Rockville LEE; Gregory J. Clifton Park HURTEAU
Original assignee: Biomerieux Inc
Current assignee: Biomerieux Inc
Priority date: 1999-09-01
Filing date: 2000-08-30
Publication date: 2009-02-05
Anticipated expiration: 2020-08-31
Also published as: ATE386140T1; JP4608162B2; US6187567B1; EP1212460B1; WO2001016374A2; DE60038029D1; WO2001016374A3; JP2003519471A; EP1212460A2

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Amplifikation und Detektion von Zielnucleinsäuremolekülen. Genauer bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Verfahren und Reagenzien zum Zurückhalten amplifizierter Zielnucleinsäuremoleküle innerhalb einer Zelle bei einer in-situ-Amplifikation sowie zum Detektieren der amplifizierten Moleküle. Die vorliegende Erfindung verbessert somit die in situ erfolgende Amplifikation und Detektion eines Zielnucleinsäuremoleküls.
Die in-situ-Amplifikation und -Detektion von Nucleinsäuremolekülen ist bei der Diagnose, Prognose, Arzneimittelwirksamkeitsbestimmung, Gewebepathologiebewertung, Patientenüberwachung und bei vielen anderen klinischen und Forschungsanwendungen nützlich.
Hintergrund der Erfindung
Verfahren zur Untersuchung verschiedener Aspekte der Genexpression wurden entwickelt, um Fragen zu beantworten, die sich zum Beispiel darauf beziehen, wie Zellen ihre verschiedenen Funktionen erfüllen, wie Krankheitserreger Wirtszellen beeinflussen und wie Zellen in einen bösartigen Zustand verwandelt werden. Bei einem Verfahren können RNA-Moleküle isoliert, in einer flüssigen Phase amplifiziert und dann detektiert werden. Dieses Verfahren lässt jedoch nicht erkennen, welche Zellen das RNA-Molekül, das von Interesse ist, produzieren. In manchen Fällen ist es wichtig zu wissen, welcher Prozentsatz einer Zellpopulation oder welche Untergruppe einer Zellpopulation bestimmte RNA-Moleküle exprimiert.
Bei den meisten Herpesvirusinfektionen stimmt die klinische Erkrankung zum Beispiel mit der Produktion bestimmter Virus-RNAs bei aktiven Infektionen überein, wohingegen sie mit der Produktion anderer Virus-RNAs oder einer Virus-DNA, die während einer latenten Infektion produziert wird, nicht übereinstimmt. Als weiteres Beispiel wurde HHV-8, das als der Verursacher des Kaposi-Sarkoms gilt, in Kaposi-Sarkom-Biopsien und peripheren Blutproben gefunden. In-situ-Untersuchungen zeigen, dass eine Virusinfektion auf die endotheliale (Spindel)-Zellkomponente abzielt, welche als zentrale Zelle bei der Pathogenese der Läsion gilt. Es wird angenommen, dass bestimmte Transcripte eine Virusreplikation anzeigen, und durch eine Detektion dieser Transcripte können latente vo aktiven Infektionen unterschieden werden (Zhong et al. (PNAS 93:6641(1996)).
Die in-situ-Amplifikation kann auch zum Nachweis von Infektionen mit dem menschlichen Papillomavirus (HPV) und zum Bestimmen der Rolle, die das Virus während der Transformation von Gebärmutterhalszellen spielt, eingesetzt werden (siehe US-Patent Nr. 5,506,105 ). Bestimmte HPV-Transcripte werden nur in Zellen produziert, die tatsächlich in den bösartigen Zustand verwandelt wurden, und die Detektion dieser Transcripte stimmt daher spezifisch mit dem Nachweis einer frühen Malignität überein.
Die Nucleinsäureamplifikation wurde vorteilhafterweise auch zum Nachweis einer HIV-1-Exposition bei seronegativen Sexualpartnern von HIV-1-seropositiven Personen, bei HIV-1-seronegativen Säuglingen und Kinder und bei Beschäftigten im Gesundheitswesen, die versehentlich HIV-1-positivem Blut oder HIV-1-positiven Körperflüssigkeiten ausgesetzt wurden, eingesetzt. Die Fähigkeit, einzelne Zellen, die entweder latent oder produktiv infiziert wurden, unter dem Mikroskop zu identifizieren, wäre sehr nützlich, um einen latenten Zustand von einem Notfall abzugrenzen. Dies wäre nicht nur für das Verständnis der Entwicklung einer Infektion, sondern auch als direkterer quantitativer Maßstab für die Wirkung einer Antivirustherapie von Nutzen. Die Fähigkeit, einzelne infizierte Zellen zu identifizieren, würde weiters auch dabei helfen, den Mechanismus der HIV-1-Übertragung zu verstehen.
Es besteht daher beträchtliches Interesse am Detektieren der Verteilung und/oder Expression von RNA-Molekülen in Zellen und Geweben. Die in-situ-Amplifikation von RNA-Zielen liefert beispielsweise eine leistungsfähige Methode zum Differenzieren von Nachbarzellen in einem histochemischen oder zytochemischen Präparat bezüglich einer somatischen Mutation, pathogenen Infektion, onkogenen Transformation, der Immunkompetenz und -spezifität, des Differenzierungszustands, des Entwicklungsursprungs, eines genetischen Mosaik-Mongolismus, der Zytokinexpression und anderer Charakteristika, die für das Verständnis sowohl normaler als auch pathologischer Zustände in eukaryotischen Organismen nützlich sind.
In manchen Fällen sind die Spiegel der Zielnucleinsäuren ausreichend hoch, so dass sie mit einer in-situ-Hybridisierung unter Verwendung einer markierten Sonde sichtbar gemacht werden können. Zumindest eine Beschränkung, die solchen Techniken anhaftet, ist jedoch die Kopienzahl des Zielmoleküls; die Detektion von RNA-Molekülen durch Hybridisierung erfordert typischerweise Dutzende bis Hunderte Kopien des Zielnucleinsäuremoleküls pro Zelle. In vielen Fällen sind die Zielnucleinsäuremoleküle, die von Interesse sind, nur in niedrigen Spiegeln vorhanden, in welchem Fall andere Techniken eingesetzt werden müssen.
Eine PCR wurde eingesetzt, um Nucleinsäuren in geringer Kopienzahl zu amplifizieren, so dass ausreichende Mengen an Zielsequenz für eine Hybridisierung und anschließende Sichtbarmachung verfügbar sind (Haase et al., PNAS 87:4971, 1990).
Während diese Technik das Problem einer geringen Kopienzahl überwindet, haben Verfahren, die Temperaturzyklen involvieren, möglicherweise eine schädliche Wirkung auf die Struktur von Zellen und Geweben. Nach dem Temperaturzyklus könnte es beispielsweise schwierig sein, die Zellen, die das gewünschte Transcript enthalten, zu identifizieren oder zu klassifizieren, wodurch die durch Anwendung des PCR-Verfahrens gewonnenen Vorteile und nützlichen Informationen reduziert werden.
Die Empfindlichkeit einer PCR-Amplifikation wurde mit der Ziel-Lokalisierung einer in-situ-Hybridisierung kombiniert, um eine in-situ-PCR zu schaffen, wobei die PCR in chemisch fixierten Zellen durchgeführt wird (Haase et al 1990, PNAS 87:4971). Haase et al. verwendeten eine Reihe überlappender Primerpaare, die für überlappende Zielsequenzen innerhalb des Genoms ausgewählter Organismen spezifisch waren, um die Retention amplifizierter Zielnucleinsäuren innerhalb zellulärer Kompartimente zu verbessern.
Eine Variation der herkömmlichen PCR ist die RT/PCR, welche Ziel-RNA-Sequenzen in Untersuchungsproben mittels komplementärer DNA (cDNA)-Sequenzen, die aus der Ziel-RNA reverse-transcribiert wurden, detektiert; die cDNA wird dann unter Anwendung einer herkömmlichen PCR detektiert (Kawasaki et al., 1988, PNAS 85(15):5698, und Rappolee et al., 1989, J. Cell. Biochem. 39:1–11). Frühere Verfahren, welche die RT/PCR nutzen, haben jedoch ebenfalls gewisse Beschränkungen, einschließlich der Tatsache, dass die RT/PCR zusätzlich zu ihrer schädlichen Wirkung auf die Morphologie erfordert, dass nur RNA in einem DNA-Hintergrund amplifiziert wird. In-vitro-RT/PCR-Verfahren lösen dieses Problem auf zwei allgemeinen Wegen: 1) die DNase-Behandlung und 2) die Unterscheidung des RNA-Amplifikationsprodukts vom DNA-Amplifikationsprodukt. Option 1 ist bei in-situ-Aufbereitungen schwieriger durchzuführen als bei Reaktionen in Lösung. Option 2 erfordert üblicherweise, dass die zwei möglichen Amplifikationsprodukte verschiedene Größen haben und auf einem Gel unterschiedlich gelöst werden. Option 2 erfordert auch, dass die zwei möglichen Produkte mit verschiedenen Sequenzen und unterschiedlich markierten Sonden hybridisieren, wodurch auch diese Option bei in-situ-Verfahren eingeschränkt wird.
Die in-situ-Amplifikationsverfahren leiden auch an dem Problem, dass die Amplifikationsprodukte, bei denen es sich um kleine Moleküle handelt, infolge von Permeationen, die in der Zelloberfläche gebildet wurden, um Amplifikationsreagenzien das Eindringen in die Zelle zu ermöglichen, aus der Zelle diffundieren können. Somit besteht die Notwendigkeit, das Auftreten dieses Phänomens, das als Entweichen bezeichnet wird, zu verhindern. In-situ-Amplifikationsverfahren erfordern somit ein Gleichgewicht zwischen erstens einer ausreichenden Permeabilisierung der Zellmembran, um zu ermöglichen, dass die Amplifikationsreagenzien die Zielnucleinsäure erreichen, und zweitens der Aufrecht erhaltung einer ausreichenden Integrität in der Membran, um ein Entweichen des amplifizierten Zielmaterials zu verhindern und eine Detektion zu ermöglichen.
Bei den Verfahren zur Lösung des Entweichungsproblems während einer in-situ-PCR-Amplifikation wurden multiple Primersets verwendet. Solche Verfahren produzieren überlappende Amplifikationsprodukte in verschiedenen Größen, wobei die Produkte teilweise doppelsträngig sind und jeder Strang überhängende Enden hat, die miteinander hybridisieren können, um große Konkatemere zu bilden und die Diffusion aus der Zelle zu verzögern. Die Verwendung multipler Primerpaare zur Lösung des Entweichungsproblems hat jedoch neben den obenstehenden Nachteilen, die mit einer Standard-in-situ-PCR zusammenhängen (z. B. eine schlechte Morphologie aufgrund des Temperaturzyklus), zusätzliche Nachteile, einschließlich der erhöhten Ausgaben für deren Produktion und des inhärenten Problems, dass es bei vielen Zielorganismen, wie z. B. krankheitserregenden Viren, schwierig ist, auch nur einige kurze Sequenzen zu finden, die gute Primer- und Sondenstellen ergeben. Die Verwendung multipler Primerpaare hat auch den Nachteil einer Erhöhung der Wahrscheinlichkeit einer nichtspezifischen Hintergrundamplifikation. Andere wichtige abnorme Zielsequenzen, wie z. B. aktivierte Onkogene, inaktivierte Tumorsuppressorgene und onkogenische Chromosomen-Translokationen, involvieren außerdem somatische Punktmutationen und Chromosomen-Neugruppierungen, die von der elterlichen (normalen) Sequenz nur zu unterscheiden sind, wenn sie aus einzelnen Primerpaaren amplifiziert wurden.
Somit besteht ein Bedarf an verbesserten Methoden zum Zurückhalten amplifizierter Zielnucleinsäuremoleküle innerhalb einer Zelle und damit dem Verbessern der Amplifikations- und Detektionsresultate.
Eine Aufgabe der Erfindung ist somit die Bereitstellung von Methoden zum Verbessern der Detektion eines Zielnucleinsäuremoleküls nach einer in-situ-Amplifikation.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Methoden zum Zurückhalten eines amplifizierten Zielnucleinsäuremoleküls innerhalb einer Zelle nach einer in-situ-Amplifikation.
Wiederum eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer effizienten Methode zum Detektieren eines Zielnucleinsäuremoleküls, sobald dieses in situ amplifiziert wurde.
Noch eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung von Methoden zum Aufrechterhalten der richtigen Morphologie von Zellen und Gewebeschnitten.
Kurzfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Reagenzien zur in-situ-Amplifikation von Zielnucleinsäuremolekülen. Die Detektion von Nucleinsäuren in Zellen durch eine thermophile in-situ-Strangverdrängungsamplifikation ist in der WO 97/11196 geoffenbart. Die vorliegende Erfindung löst ein mit der in-situ-Amplifikation zusammenhängendes, als Entweichen bezeichnetes Problem, das von der Permeabilisierung von Zellmembranen, um Amplifikationsreagenzien das Eindringen in die Zelle zu ermöglichen, herrührt.
Die vorliegende Erfindung stellt somit ein Verfahren zur Verhinderung des Entweichens eines amplifizierten Zielnucleinsäuremoleküls aus einer Zelle bereit. Das Verfahren umfasst den Schritt des Aussetzens der Zelle einem neuartigen, „Molekülklebeband" genannten Reagens, das in die Zelle eindringt und mit dem amplifizierten Zielmolekül hybridisiert, um einen Komplex zu bilden. Durch Bildung eines solchen Komplexes kann das amplifizierte Zielmolekül, das andernfalls klein genug ist, um aus der Zelle zu entweichen, für eine in-situ-Detektion innerhalb der Zelle bleiben.
Die vorliegende Erfindung kann mit den meisten, wenn nicht allen Arten von Amplifikationsreaktionen, einschließlich der einen Temperaturzyklus umfassenden Amplifikation, wie z. B. PCR und RT-PCR, praktiziert werden. Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird unter Anwendung einer isothermen Amplifikation, einschließlich der isothermen Amplifikation auf Transcriptionsbasis, wie z. B. der auf Nucleinsäuresequenzen basierenden Amplifikation (NASBA), praktiziert.
Bei einigen Ausführungsformen der Erfindung kann das Molekülklebeband, das mit dem amplifizierten Zielmolekül einen Komplex bildet, weiters an einen oder mehrere intrazelluläre Bestandteile, wie z. B. Actin, binden.
Das Zielnucleinsäuremolekül kann jedes Nucleinsäuremolekül, einschließlich DNA und RNA, und deren Analoga sein und ist vorzugsweise RNA.
Zusätzlich zu gezüchteten oder sonstigen Zellen können die Verfahren und Reagenzien der vorliegenden Erfindung zum Amplifizieren und Detektieren von Zielnucleinsäuremolekülen in anderen Proben, einschließlich Gewebeschnitten, verwendet werden. Die Zelle, innerhalb der ein Zielnucleinsäuremolekül erfindungsgemäß amplifiziert und detektiert wird, kann weiters eine aus einer Mehrzahl von suspendierten Zellen sein.
Das amplifizierte Zielnucleinsäuremolekül kann erfindungsgemäß in situ detektiert werden oder alternativ nach einer Zelllyse unter Anwendung verschiedener Detektionsverfahren, welche das Vorhandensein des amplifizierten Zielmoleküls bestätigen können. Wenn die Detektion in situ erfolgt, sind auch verschiedene Detektionsverfahren und detektierbare Markierungen nützlich. Beispielsweise kann das Molekülklebeband selbst eine detektierbare Markierung, vorzugsweise eine fluoreszierende Komponente, umfassen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren und Reagenzien bieten den Vorteil, dass sogar das kleinste amplifizierte Zielnucleinsäuremolekül innerhalb einer permeabilisierten Zelle zurückgehalten werden kann, um seine Detektion zu ermöglichen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 stellt einen Komplex eines Molekülklebebands und eines amplifizierten Zielmoleküls gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung dar.
2 zeigt die in situ erfolgende Fluorescein-konjugierte Anti-Digoxigenin-Detektion von H9-Zellen in gemischten Zellpopulationen von 0% infizierten Zellen, 50% infizierten Zellen und 100% infizierten Zellen, wie in Beispiel 4 beschrieben.
3 zeigt die in-situ-Fluorescein-Detektion von Lymphknotenschnitten eines mit SIV infizierten Affen, wie in Beispiel 5 beschrieben.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Wie obenstehend dargelegt, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verhinderung des Entweichens eines amplifizierten Zielnucleinsäuremoleküls aus einer Zelle nach einer in-situ-Amplifikation bereit. Das „Entweichen" wird verhindert als Folge eines „Molekülklebeband" genannten Reagens, das in die Zelle eindringt und mit dem amplifizierten Molekül hybridisiert, um einen Komplex zu bilden. Die Bildung des Komplexes verhindert das Entweichen. Im Allgemeinen ist das Molekülklebeband imstande, Komplexe mit amplifizierten Zielmolekülen zu bilden, wo auch immer die amplifizierten Zielmoleküle in einer in-situ-Reaktion zu finden sind.
Der Begriff „Entweichen" und andere Formen dieses Worts (z. B. Entweichung, entweichend) sind definiert als das unerwünschte Austreten eines amplifizierten Zielnucleinsäuremoleküls aus einer Zelle, was während und nach einer in-situ-Amplifikation des Zielmoleküls geschehen kann. Das Entweichen kann beispielsweise infolge einer Permeabilisierung der Zellmembran, um Amplifikationsreaktanten zwecks Bewirkung einer in-situ-Amplifikation das Eindringen in die Zelle zu ermöglichen, auftreten. Die Öffnungen in der Membran, die als Folge der Permeabilisierung zurückbleiben, können Amplifikationsprodukten, die klein genug sind, um durch diese Öffnungen zu passen, das Austreten und somit das Entweichen aus der Zelle ermöglichen.
Der Begriff „verhindern" und andere Formen des Worts werden allgemein verwendet, um das Hemmen, Verringern und/oder Stoppen eines Entweichens zu umfassen.
Der Begriff „Molekülklebeband" ist so definiert, um verschiedene Formen von Nucleinsäuremolekülen, einschließlich einzelsträngiger sowie doppelsträngiger Moleküle, welche die Funktion des Zurückhaltens eines amplifizierten Zielnucleinsäuremoleküls innerhalb einer Zelle bei einer in-situ-Amplifikation erfüllen, zu umfassen. Das Molekül klebeband kann durch verschiedene Mechanismen bewirken, dass das amplifizierte Zielnucleinsäuremolekül innerhalb der Zelle bleibt.
Bei einer Ausführungsform der Erfindung kann das Molekülklebeband bei einer Amplifikation mit einer oder mehreren Kopien des Zielmoleküls hybridisieren. Die Hybridisierung kann beispielsweise zwischen getrennten Nucleinsäuresequenzbereichen am Molekülklebeband und komplementären Bereichen am amplifizierten Zielmolekül erfolgen. Diese Ausfürungsform kann somit die Bildung von Komplexen oder Konkatemeren bewirken, die ein oder mehrere Moleküle eines Molekülklebebands umfassen, wobei ein erster Sequenzbereich des Molekülklebebands mit einem komplementären Bereich einer ersten Kopie des amplifizierten Zielmoleküls (oder Amplikons) hybridisiert und ein zweiter Sequenzbereich des Bands mit einem komplementären Bereich einer zweiten Kopie des amplifizierten Moleküls hybridisiert. Die erfindungsgemäß gebildeten Komplexe oder Konkatemere umfassen typischerweise eine Mehrzahl von Molekülen eines Molekülklebebands, das mit komplementären Bereichen an einer oder mehreren Kopien des amplifizierten Zielmoleküls hybridisiert und dadurch bewirkt, dass mehrfache Kopien des amplifizierten Zielmoleküls miteinander komplexiert werden. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist beispielsweise in 1 dargestellt, welche eine Mehrzahl von Molekülklebebändern (grau) zeigt, die erstens mit einem komplementären Bereich am 5'-Ende des amplifizierten Zielmoleküls (schwarz) und zweitens mit einem komplementären Bereich stromaufwärts vom 3'-Ende des amplifizierten Zielmoleküls hybridisieren. Wie zuvor dargelegt, sollten die Größen der erfindungsgemäß gebildeten Komplexe und Konkatemere die Größen der meisten, wenn nicht aller Öffnungen, die, wie obenstehend beschrieben, zum Beispiel infolge der Permeabilisierung der Membran in der Zellmembran vorhanden sind, größtenteils übersteigen.
Bei einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann der durch die Wechselwirkung zwischen einem amplifizierten Zielmolekül und dem Molekülklebeband gebildete Komplex als zusätzliches Mittel zur Verhinderung eines Entweichens weiters mit einem intrazellulären Bestandteil, wie z. B. einer Organelle oder einem Strukturprotein (z. B. Actin), interagieren.
Das Molekülklebeband kann eine Vielzahl von verschiedenen Längen aufweisen, wobei ein länger bemessenes Molekülklebeband imstande ist, die Wechselwirkung zwischen mehrfachen Kopien des amplifizierten Zielmoleküls zu bewirken. Das Molekülklebeband sollte lang genug sein, um einen Komplex zweier oder mehrerer Kopien eines amplifizierten Zielmoleküls oder alternativ einen Komplex von mindestens einer Kopie des amplifizierten Zielmoleküls und einem intrazellulären Bestandteil zu bilden. Die Länge des Molekülklebebands kann von etwa 20 Nucleotiden bis zu einer Nucleotidlänge, die mit der Länge des Zielmoleküls kompatibel ist, d. h. einer Länge, die vorzugsweise kürzer als die Nucleotid länge des Zielmoleküls ist und die Amplifikation des Zielmoleküls nicht störend beeinflusst, variieren. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann die Länge des Molekülklebebands von etwa 20 bis etwa 60 Nucleotiden reichen, und zwar mit einem noch bevorzugteren Bereich von etwa 30 bis etwa 50 Nucleotiden. Zusätzliche Merkmale und Vorteile des erfindungsgemäßen Molekülklebebands werden aus der nachfolgenden Beschreibung und den nachfolgenden Beispielen ersichtlich.
Außerdem können, falls erforderlich, gemäß der vorliegenden Erfindung Maßnahmen ergriffen werden, um sicherzustellen, dass das Molekülklebeband nicht als Primer fungiert. Diese Maßnahmen können beispielsweise das Blockieren des 3'-Endes des Molekülklebebands umfassen, um jegliche Startreaktion zu verhindern.
Das Molekülklebeband kann DNA- oder RNA-Sequenzen oder deren Analoga, wie z. B. peptidhaltige Nucleinsäuren, umfassen.
Bei einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Molekülklebeband eine detektierbare Markierung umfassen und fungiert somit sowohl als Molekülklebeband als auch als Detektionssonde. 1 zeigt ein Beispiel eines fluoreszierenden Molekülklebebands, bei dem die Fluorescein-Komponente sowohl mit dem 5'- als auch mit dem 3'-Ende des Bands verbunden (z. B. kovalent gekoppelt) ist.
Das erfindungsgemäße Molekülklebeband kann mittels einer handelsüblichen Synthese von Oligonucleotiden gemäß vorbestimmten Spezifikationen für die Nucleotidsequenz des Bands hergestellt werden. Diese Spezifikationen können festgelegt werden, indem beispielsweise zwei getrennte Sequenzbereiche im Zielnucleinsäuremolekül ausgewählt und ein Oligonucleotid, das getrennte, zu den obenstehenden Bereichen komplementäre Bereiche enthält, synthetisiert wird. Ein Beispiel dafür ist in 1 dargestellt, welche eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung zeigt. Das Molekülklebeband kann dann in einer Amplifikationsreaktion, wie z. B. der bevorzugten NASBA-Reaktion, experimentell getestet werden, wobei die Fähigkeit des Molekülklebebands, ein Entweichen des amplifizierten Zielmoleküls zu verhindern, unter Anwendung der hier beschriebenen Detektionsverfahren gemessen werden kann. Der Begriff „Nucleinsäure" ist so definiert, um DNA und RNA und deren Analoga zu umfassen, und ist vorzugsweise RNA. Die erfindungsgemäßen Verfahren sind weiters nicht auf die Detektion von mRNAs beschränkt. Andere RNAs, die möglicherweise von Interesse sind, umfassen tRNAs, rRNAs und snRNAs.
Der Begriff „intrazellulärer Bestandteil" bezeichnet jeglichen Bestandteil innerhalb einer Zelle, der imstande ist, in manchen Fällen nach einer Modifikation mit dem Molekülklebeband zu reagieren, und weiters bewirkt, dass der Komplex aus Molekülklebeband und amplifiziertem Zielnucleinsäuremolekül innerhalb der Zelle zurückgehalten wird.
Der intrazelluläre Bestandteil (die intrazellulären Bestandteile) kann bzw. können somit ein zusätzliches Mittel zur Verhinderung eines Entweichens liefern. Intrazelluläre Bestandteile können beispielsweise Organellen und intrazelluläre Strukturproteine, wie z. B. Actin, umfassen.
Der Begriff „Primer", wie hier verwendet, bezieht sich auf ein Oligonucleotid, das zu einer Nucleinsäuresequenz (als Matrize oder Zielsequenz) komplementär ist und unter geeigneten Bedingungen (z. B. Puffer, Salz, Temperatur und pH-Wert) deren Synthese in Gegenwart von Nucleotiden und eines Mittels zur Nucleinsäurepolymerisation, wie z. B. einer DNA-abhängigen oder RNA-abhängigen Polymerase, fördern kann. Ein Primer sollte lang genug sein, um mit einem geeigneten Zielbereich zu hybridisieren, und sollte imstande sein, die Synthese komplementärer Nucleinsäuresequenzen in Gegenwart von Polymerisationsmitteln zu fördern. Ein typischer Primer enthält eine Sequenzlänge von mindestens 10 Nucleotiden und ist zur Zielsequenz im Wesentlichen komplementär oder homolog. Primer enthalten vorzugsweise etwa 15–26 Nucleotide, längere Primer sind jedoch ebenfalls nützlich, und zwar beispielsweise bei Techniken, die auf einer Transcription beruhen, wie z. B. bei einer NASBA, bei der einer der Primer eine zusätzliche, einen Polymerase-Promotor codierende Promotorsequenz enthält.
Der Begriff „Promotorsequenz" definiert ein Oligonucleotid, das von einer Polymerase, wie z. B. RNA-Polymerase, erkannt wird. Im Prinzip kann jede Promotorsequenz eingesetzt werden, für die es eine bekannte und verfügbare Polymerase gibt, welche imstande ist, die Initiationssequenz zu erkennen. Bekannte und nützliche Promotoren umfassen jene, die von bestimmten Bakteriophagen-RNA-Polymerasen, wie z. B. Bakteriophage T3, T7 oder SP6, erkannt werden. Die Verwendung der Promotorsequenz als Teil des Primers, z. B. des Ausgangspunkts für eine Verlängerungsreaktion, kann weiters bei bestimmten Ausführungsformen der Erfindung blockiert werden. Eine besonders bevorzugte Promotorsequenz ist jene, die den T7-RNA-Polymerase-Promotor (AATTCTAATACGACTCACTATAGGG) codiert, welcher Promotor bei einer NASBA, einem bevorzugten erfindungsgemäßen isothermen Amplifikationssystem auf Transcriptionsbasis, verwendet wird.
A. Proben
Wie obenstehend dargelegt, können die erfindungsgemäßen Verfahren und Reagenzien für die in-situ-Amplifikation und -Detektion verschiedener Arten von Proben, einschließlich Gewebeschnitten und suspendierter Zellen, verwendet werden.
Gewebe- und Zellproben, die in Verbindung mit der Erfindung verwendet werden, können von verschiedenen Säugetierquellen, einschließlich menschlicher Gewebe- und Zellproben, ohne darauf beschränkt zu sein, erhalten werden. Zellproben können aus abgesaugtem Gewebe und Körperflüssigkeiten gewonnen werden. Die Erfindung kann bei transformierten oder hyperplastischen Zellen oder bei aus Karzinomen erhaltenen Zellen verwendet werden. Menschliche Blutzellen, insbesondere periphere mononukleare Blutzellen (PBMCs), werden beispielsweise häufig zur Untersuchung von HIV-1 und HIV-2 verwendet.
Gewebeschnitte können auf mehreren verschiedenen Wegen erhalten werden, was das Kryostat-Schnittverfahren oder das Mikrotomieren oder Ähnliches einschließt. Gewebe kann aus einer Reihe verschiedener Quellen, einschließlich fester Organe, wie z. B. Gehirn, Milz, Knochen, Herz, Gefäßgewebe, Lunge, Niere, Leber, Hirnanhangdrüse oder endokriner Drüse, Lymphknoten, dispergierter primärer Zellen, Tumorzellen oder anderer, gewonnen werden. Lymphgewebe und vermutete Tumorgewebe und -zellen sind für klinische Proben von besonderer Wichtigkeit.
Die Gewebe können vor der Schnittanfertigung gemäß herkömmlichen Methoden vorbehandelt werden. Eine geschnittene Gewebeprobe kann durch herkömmliche Techniken, welche die nachfolgende Bearbeitung nicht beeinträchtigen, fixiert werden. Die besondere Art und Weise, in der eine Gewebeprobe fixiert wird, ist nicht entscheidend, solange die Integrität der Zielnucleinsäuremoleküle gewahrt bleibt und der Fixiervorgang nicht die nachfolgenden Verfahrensschritte beeinträchtigt.
Zell- und Gewebeproben können auch durch Standardtechniken, wie z. B. Abschabung, Spülung oder Biopsie, erhalten werden. Primäre Zellen oder etablierte Zelllinien können in einer Kultur auf einem Träger gezüchtet oder in einer Suspension gezüchtet und auf einen Träger zentrifugiert werden.
B. Voramplifikationsbearbeitung
Zell- und Gewebeproben können durch jede bekannte herkömmliche Fixiertechnik fixiert werden. Eine bevorzugte Fixiertechnik zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung umfasst eine Kombination aus vernetzenden und präzipitiven Fixierungsmitteln für Zellen sowie vernetzende Fixierungsmittel alleine (wie z. B. neutrales 10%iges gepuffertes Formalin) für das Gewebeschnittverfahren. Das ausgewählte Zielnucleinsäuremolekül kann somit genauso wie die Zell/Gewebe-Morphologie gut konserviert werden.
Gewebe- und Zellproben werden auf herkömmlichen Wegen für die Mikroskopie vorbereitet, was die Dehydratation und Rehydration der Proben mit bekannten Lösungsmitteln, gefolgt von Waschungen mit Standardpuffern, wie z. B. phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), umfassen kann. Da weiters bekannt ist, dass für eine in-situ-Amplifikation vorbereitete Zellen zerbrechlich sein können, sollten die Zentrifugenzeiten und -geschwindigkeiten sorgfältig gewählt werden, um gute Resultate zu erhalten. Die Geschwindigkeiten und Zeiten, die in den nachfolgenden Beispielen, in denen H9-Zellen verwendet werden, angegeben sind, könnten beispielsweise eine geringfügige Anpassung für unterschiedliche Zelltypen erfordern.
Zellproben können auf geeigneten Trägern, wie z. B. Objektträgern für die Lichtmikroskopie oder Gittern für die Elektronenmikroskopie, gezüchtet oder alternativ ohne Träger gezüchtet und später auf den Träger aufgebracht werden.
C. Amplifikationsverfahren
Wie obenstehend dargelegt, kann eine Amplifikation unter isothermen Bedingungen durchgeführt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann ein isothermes Amplifikationssystem auf Transcriptionsbasis basierend auf den koordinierten Aktivitäten von drei Enzymen (Reverse Transcriptase, RNase H und RNA-Polymerase) und zwei DNA-Oligonucleotiden (hier als Primer bezeichnet), die für die Zielsequenz spezifisch sind, durchgeführt werden. Das Verfahren beginnt mit einer RNA-Matrize und synthetisiert abwechselnd DNA und RNA. Beginnend mit der gewünschten RNA-Matrize, einem Primer, dNTPs und einer Reverse Transcriptase wird im Speziellen ein RNA/DNA-Hybrid erzeugt. Die RNA wird durch RNase H-Aktivität aus dem Hybrid abgebaut. Unter Verwendung des zweiten Primers wird dann eine doppelsträngige DNA durch die Reverse Transcriptase hergestellt, und die doppelsträngige DNA fungiert daraufhin als Matrize zum Synthetisieren großer Mengen an RNA, wobei die RNA-Polymerase in Gegenwart von NTPs verwendet wird. Diese synthetisierten RNA-Moleküle können dann in nachfolgenden Amplifikationszyklen als Matrizen dienen. Einer der Primer besitzt neben den zur Matrize komplementären Sequenzen zusätzliche Sequenzen, die zum Erzeugen eines Promotors und einer Transcriptionsinitiationsstelle erforderlich sind. Bevorzugte Promotoren und Transcriptionsinitiationsstellen sind jene, die von Bakteriophagen-RNA-Polymerasen, wie z. B. T3, SP6 und T7, erkannt werden. Die drei enzymatischen Aktivitäten können von drei separaten Enzymen, Reverse Transcriptase, RNase H und RNA-Polymerase, oder nur von zwei Enzymen, Reverse Transcriptase und RNA-Polymerase, wobei die RNase-Aktivität von der Reverse Transcriptase geliefert wird, bereitgestellt werden. Die Reverse Transcriptase ist vorzugsweise die Vogel-Myeloblastosevirus-Reverse-Transcriptase (AMV-RT), und bei der RNA-Polymerase handelt es sich um die T7-RNA-Polymerase.
NASBA ist ein bevorzugtes isothermes Amplifikationssystem auf Transcriptionsbasis zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung. Das NASBA-Verfahren ist in den U.S.-Patenten Nr. 5,409,818 und 5,554,527 geoffenbart, welche hier durch Bezugnahme aufgenommen sind. NASBA umfasst die Verwendung der T7-RNA-Polymerase, um multiple RNA-Kopien aus einer einen T7-Promotor umfassenden Matrize zu transcribieren.
Eine weitere Technik zur Amplifikation von Nucleinsäuren ist das sogenannte Amplifikationssystem auf Transcriptionsbasis (TAS). Das TAS-Verfahren ist in der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 88/10315 beschrieben, welche hier durch Bezugnahme aufgenommen ist. Amplifikationstechniken auf Transcriptionsbasis umfassen üblicherweise das Behandeln von Zielnucleinsäuren mit einem Paar von Oligonucleotiden, von denen eines eine Promotorsequenz zum Erzeugen einer einen funktionellen Promotor inkludierenden Matrize umfasst. Multiple RNA-Kopien können aus der Matrize transcribiert werden und als Basis für eine weitere Amplifikation dienen.
Andere Amplifikationstechniken auf Transcriptionsbasis sind in der EP 408295 beschrieben, welche hier durch Bezugnahme aufgenommen ist. Die EP 408295 betrifft hauptsächlich ein Amplifikationsverfahren auf Transcriptionsbasis mit zwei Enzymen.
Wie obenstehend dargelegt, kann die Amplifikation auch unter Verwendung von Temperaturzyklen durchgeführt werden. Eine bevorzugte Technik ist die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die in den US-Patenten Nr. 4,683,202 und 4,683,195 beschrieben ist, welche hier durch Bezugnahme aufgenommen sind.
Das PCR-Verfahren kann auch zum Amplifizieren eines gewünschten RNA-Ziels eingesetzt werden. Diese (als RT-PCR bekannte) Technik umfasst einen vorbereitenden Schritt, bei dem eine Reverse Transcriptase (RT) zur Anwendung kommt, um eine zum RNA-Ziel komplementäre einzelsträngige DNA-Sequenz zu erzeugen. Diese DNA-Sequenz wird dann mit einem zweiten Primer umgesetzt, um einen zweiten DNA-Strang zu erzeugen, der zum ersten Strang komplementär ist. Diese doppelsträngige DNA kann daraufhin mittels einer PCR amplifiziert werden.
D. Detektionsverfahren
Im Stand der Technik sind zahlreiche Verfahren zur in-situ-Detektion von Nucleinsäuren bekannt, von denen jedes bei den erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden kann. Detektionsverfahren gehören typischerweise einem von zwei allgemeinen Typen an: 1) der Einbau eines markierten Nucleotids während der Amplifikationsreaktion, und 2) die Hybridisierung mit einer markierten Nucleinsäure oder einem Analogon, die bzw. das spezifisch mit einem Bereich eines Amplifikationsprodukts hybridisiert.
Bei beiden allgemeinen Verfahren kann die Markierung ein radioaktives Isotop, ein Enzym oder jedwede andere Komponente sein, die imstande ist, ein nachweisbares Signal zu erzeugen, einschließlich kalorimetrischer, fluoreszierender, chemilumineszierender und Elektronendichte-Signale.
Eine Autoradiographie mit ³H-, ¹²⁵I-, ¹⁴C- oder ³²P-markierten Sonden kann eingesetzt werden, wobei das Isotop Teil der Basen- oder Zuckerkomponenten ist oder über irgendeine Bindungsgruppe mit dem Nucleotid verbunden ist. Andere Markierungen umfassen Liganden, die kovalent an eine Sonde gebunden sind. Der Ligand bindet dann an einen Anti-Liganden, welcher entweder von Natur aus detektierbar ist oder kovalent an ein nachweisbares Signalsystem, wie z. B. ein Enzym, einen Fluorophor oder eine chemilumineszierende Verbindung, gebunden ist. Die Enzyme, die von Interesse sind, umfassen Phosphatasen, Esterasen oder Glycosidasen oder Oxidoreductasen wie z. B. Peroxidase. Fluoreszierende Verbindungen umfassen Fluorescein und dessen Derivate, Rhodamin und dessen Derivate, Dansyl, Umbelliferon etc.. Chemilumineszierende Verbindungen umfassen Luciferin und 2,3-Dihydrophthalazindione.
Eine Detektion kann beispielsweise als Resultat einer Biotin-Avidin-Wechselwirkung erfolgen, wobei das Avidin mit Fluorophoren, Enzymen oder anderen Markierungen markiert ist. Die Fluorophore, die von Interesse sind, können Phycobiliproteine, Fluorescein oder dergleichen umfassen. Die Enzyme können Meerrettichperoxidase, Phosphatase oder dergleichen umfassen. Alternativ können Markierungen, wie z. B. Kolloidgold oder Ferritin, zur Detektion durch Elektronenmikroskopie eingesetzt werden.
Molekulare Signale können ebenfalls zur Detektion eines Amplifikationsprodukts eingesetzt werden (Tyagi und Kramer, Nature Biotech. 14:303, 1996). Molekulare Signale sind Nucleinsäuresonden, die das Vorhandensein von Zielnucleinsäuren erkennen und anzeigen. Die Signal-Moleküle sind im Speziellen einzelsträngige Nucleinsäuren oder Nucleinsäureanaloga, die eine Stamm- und Schleifenstruktur besitzen. Der Schleifenabschnitt der Moleküle ist eine Sondensequenz, die zur Zielsequenz komplementär ist; der Stamm wird durch das Wiederverbinden von zwei komplementären Armsequenzen auf beiden Seiten der Sondensequenz gebildet. Eine fluoreszierende Komponente ist am Ende des einen Arms angebracht, und eine fluoreszierende Quenchkomponente ist am Ende des anderen Arms angebracht. Wenn der Schleifenabschnitt ein Hybrid mit der Zielsequenz bildet, werden der Fluorophor und der Quencher getrennt, und der Fluorophor fluoresziert bei Bestrahlung mit ultraviolettem Licht. Wenn der Schleifenabschnitt nicht mit einer Zielsequenz hybridisiert, bleiben der Fluorophor und der Quencher eng beieinander und der Fluorophor fluoresziert nicht.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann das amplifizierte Zielmolekül aufgrund einer oder mehrerer nachweisbarer Markierungen am Molekülklebeband detektiert werden. Die nachweisbare Markierung kann die oben genannten Arten von Markierungen umfassen.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können auch in Verbindung mit immunologischen Verfahren, wie z. B. der Immunfärbung oder der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (FACS), eingesetzt werden. Eine mehrfache Färbung z. B. von Zelloberflächenantigenen ermöglicht eine Krankheitsdiagnose und -prognose basierend auf den Infektionsraten zellulärer Subpopulationen. Eine in-situ-Amplifikation in Verbindung mit anderen Färbungsverfahren, die bei Blut- oder Biopsieproben von Patienten, von denen angenommen wird, dass sie mit einem lymphotrophen Retrovirus, wie z. B. HIV-1, infiziert sind, angewandt werden, sollte wertvolle Prognoseinformationen z. B. über den Anteil von CD4⁺ (Oberflächenantigen)-Zellen, die spezifische Virusgene exprimieren, liefern.
Wie obenstehend dargelegt, kann das amplifizierte Zielmolekül nach einer Zelllyse mittels verschiedener Detektionsverfahren detektiert werden, um das intrazelluläre Vorhandensein des amplifizierten Zielmoleküls zu bestätigen. Ein Verfahren ist die Elektrochemilumineszenzchemie (ECL), bei der eine biotinylierte Oligonucleotid-Einfangsonde verwendet wird, die durch eine Biotin-Avidin-Wechselwirkung an der Oberfläche einer Streptavidin-beschichteten Magnetperle immobilisiert ist. Das System verwendet auch eine Oligonucleotid-Detektorsonde, welche mit einem unabhängigen Bereich des Amplifikationsprodukts hybridisierbar ist. Die Detektorsonde ist mit Ruthenium markiert, welches das ECL-Signal erzeugen kann.
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Beispiele beschrieben, die zur Veranschaulichung dargelegt sind und nicht dazu gedacht sind, die Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken.
BEISPIEL 1
Isothermes Standard-Amplifikationsverfahren I (Zellen auf Objektträgern) Voramplifikation:
Gezüchtete Zellen werden gesammelt und bei 1400 U/min (377 g) 10 Minuten lang geschleudert. Die Zellen werden zweimal mit 1X PBS bei 1200 U/min (270 g) 8 Minuten lang gewaschen. Die Zellen werden in 1X PBS bei einer Konzentration von etwa 5–10X 10⁶/ml resuspendiert und in 1 Volumen Zellen zu 9 Volumen Fixierungsmittel (1:1 Aceton:Methanol) 30 Minuten lang fixiert. Die Zellen werden dann einmal mit 1X PBS gewaschen und bei einer Konzentration von 2X 10⁵/ml in 1X PBS resuspendiert. Die Zellen werden auf silanisierten (Shandon Lipshaw)-Objektträgern bei 700 U/min 5 Minuten lang mit einer Zellzahl von 5 × 10⁴/Objektträger geschleudert (250F1/Objektträger von 2 × 10⁵ Zellen/ml). Die Objektträger werden dann 3 Stunden bis eine Nacht lang bei Raumtemperatur (R. T.) lufttrocknen gelassen und bei R. T. 2 Minuten lang mit dd H₂O gewaschen und wiederum mindestens 30 Minuten lang bei R. T. luftgetrocknet.
NASBA-Amplifikation:
Die Amplifikation wird in einer 20 μl-Reaktion erzielt, welche eine 15 μl-Lösung enthält, die folgende Komponenten umfasst: 40 mM Tris, pH 8,5; 12 mM MgCl₂; 70 mM KCl; 5 mM DTT; 1 mM dNTPs (jeweils); jeweils 2,0 mM rATP, rCTP und rUTP (Mischung aus UTP und Digoxigenin-markiertem UTP); 1,5 mM rGTP; 0,5 mM ITP; 15% DMSO; 0,2 μM Primer 1 und Primer 2; 4-Picomol-Molekülklebeband, 1,5 M Sorbit und 5 μl Enzymgemisch, das 2,1 μg BSA enthält; 32 Einheiten T7-RNA-Polymerase; und 25,6 Einheiten AMV-Reverse-Transcriptase (AMV-RT). Wenn Digoxigenin-UTP verwendet wird, sollte die Konzentration des Dig-UTP etwa 10–20% der gesamten UTP-Konzentration ausmachen.
Das Verfahren wird folgendermaßen durchgeführt:

1. Gutes Vermischen des ersten 15F1-Reaktionsgemisches und danach Hinzufügen des zweiten 5FL-Enzymgemisches und sanftes Vermischen (ohne Schleudern).
2. Hinzufügen von insgesamt 20F1 in die Reaktionskammer (MJ Research) an der Oberseite des Objektträgers und sorgfältiges Abdichten der Kammer.
3. 2-stündiges Inkubieren der Objektträger bei 41EC auf einem „Hybaid"-Objektträger-Inkubator.

Nachamplifikation:
Der Objektträger wird zweimal mit 1X PBS, zweimal mit 0,5X PBS und zweimal mit ddH₂O gewaschen, und zwar bei jeder Waschung 5 Minuten lang. Mit Ethanol wird dehydriert: 50%, 2 Minuten; 70%, 2 Minuten; 90%, 2 Minuten; 95%, 2 Minuten; und 100%, 2 Minuten, und etwa 10 Minuten lang wird luftgetrocknet. Die Proben werden dann mit 5%igem Serum, 1%igem fötalem Rinderserum, 5%igem BSA bei R. T. 1 Stunde lang Serumblockiert (unter Verwendung desselben Serums, von dem Anti-Dig abgeleitet wurde), und der Anti-Dig-Antikörper wird über Nacht bei 4EC aufgebracht. Die Proben werden dann zweimal mit 1X PBS, zweimal mit ddH₂O gewaschen. Das Substrat wird danach hinzugefügt, falls ein Enzym-konjugierter Anti-Dig-Antikörper verwendet wird, oder die Zellen werden sofort unter einem Mikroskop kontrolliert, falls ein FITC-konjugierter Anti-Dig-Antikörper oder ein Fluorescein-markiertes Molekülklebeband verwendet wird.
BEISPIEL 2
Isothermes Standard-Amplifikationsverfahren II (Zellen in Suspension) Voramplifikation:
Gezüchtete Zellen werden gesammelt und bei 1400 U/min (377 g) 10 Minuten lang geschleudert. Die Zellen werden zweimal mit 1X PBS bei 1200 U/min (270 g) 8 Minuten lang gewaschen. Die Zellen werden in 1X PBS bei einer Konzentration von etwa 5–10X 10⁶/ml resuspendiert und in 1 Volumen Zellen zu 9 Volumen Fixierungsmittel (1:1 Aceton:Methanol) 30 Minuten lang fixiert. Die Zellen werden dann zweimal mit 1X PBS bei 53 g 15 Minuten lang gewaschen. Die Zellen werden daraufhin einem 5-minütigen Pronase-Aufschluss bei 37EC unterzogen. Dem Aufschluss folgt eine 10-minütige Wärmeinaktivierung bei 90EC. Die Zellen werden dann wiederum zweimal mit 1X PBS bei 53 g 15 Minuten lang gewaschen. Nach der letzten Waschung bleiben die Zellen in einem Volumen von 1X PBS, um 30F1 nicht zu übersteigen, falls die Ausgangszellzahl 2,5–5,0 × 10⁶ Zellen betrug.
NASBA-Amplifikation:
Die Amplifikation wird in einer 20 μl-Reaktion erzielt, welche 1) eine 10 μl-Lösung enthält, die folgende Komponenten umfasst: 40 mM Tris, pH 8,5; 12 mM MgCl₂; 70 mM KCl; 5 mM DTT; 1 mM dNTPs (jeweils); jeweils 2,0 mM rATP, rCTP und rUTP (Mischung aus UTP und Digoxigenin-markiertem UTP); 1,5 mM rGTP; 0,5 mM ITP; 15% DMSO; 0,2 μM Primer 1 und Primer 2; 4-Picomol-Molekülklebeband, 1,5 M Sorbit, 2) 5 μl Enzymgemisch, das 2,1 μg BSA enthält; 32 Einheiten T7-RNA-Polymerase; und 25,6 Einheiten AMV-Reverse-Transcriptase (AMV-RT). (Wenn Digoxigenin-UTP verwendet wird, sollte die Konzentration des Dig-UTP etwa 10–20% der gesamten UTP-Konzentration ausmachen.), und 3) 5F1 Zellen in 1X PBS aus dem obenstehenden Voramplifikationsschritt.
Das Verfahren wird folgendermaßen durchgeführt:

1. Gutes Vermischen des ersten 10F1-Reaktionsgemisches und danach Hinzufügen des zweiten 5FL-Enzymgemisches und sanftes Vermischen (ohne Schleudern).
2. Hinzufügen der obigen 15F1 (obige Komponenten 1 und 2) zu 5F1 Zellen in einem Eppendorf-Röhrchen. Sanftes Vermischen der insgesamt 20F1 in dem Röhrchen.
3. 2-stündiges Inkubieren der Röhrchen bei 41EC.

Nachamplifikation:
Die Zellen werden zweimal mit IX PBS bei 53 g 15 Minuten lang gewaschen. Die Proben werden dann mit 5%igem Serum, 1%igem fötalem Rinderserum, 5%igem BSA bei R. T. 1 Stunde lang Serum-blockiert (unter Verwendung desselben Serums, von dem Anti-Dig abgeleitet wurde), und der Anti-Dig-Antikörper wird über Nacht bei 4EC aufgebracht. Die Proben werden dann zweimal mit 1X PBS gewaschen. Das Substrat wird danach hinzugefügt, falls ein Enzym-konjugierter Anti-Dig-Antikörper verwendet wurde, oder die Zellen sind bereit für die Analyse durch einen FACS-Apparat, falls ein FITC-konjugierter Anti-Dig-Antikörper oder ein Molekülklebeband verwendet wurde. Wenn ein handelsübliches Fluoreszenzsystem in Kombination mit einem Enzym-konjugierten Anti-Dig-Antikörper verwendet wird, wird die vom Hersteller empfohlene Vorgehensweise nach einer Übernacht-Antikörperinkubation befolgt.
BEISPIEL 3
Isothermes Standard-Amplifikationsverfahren III (Gewebeschnitte) Voramplifikation:
Ein fixierter Standardgewebeschnitt wird zweimal mit Xylol jeweils 5 Minuten lang entparaffiniert, gefolgt von zweimaligem Waschen in 100%igem Ethanol jeweils für 5 Minuten. Der Schnitt wird dann bei jeder Behandlung 2 Minuten lang mit 95%igem, 90%igem, 70%igem und 50%igem Ethanol rehydriert, gefolgt von 2 Minuten mit ddH₂O. Der Schnitt wird danach einem Protease-Aufschluss unterzogen, und zwar durch eines der beiden Verfahren: (A) Dispase II- und Pronase-Mischung für 30 Minuten bei 37EC, oder B) Protease K für 30 Minuten bei 37EC. Bei beiden Verfahren müssen die Enzyme nach dem 37EC 10 Minuten lang bei 90EC inaktiviert werden. Nach dem Protease-Aufschluss wird der Schnitt zweimal mit 1X PBS gewaschen, und zwar bei jeder Waschung 2 Minuten lang, gefolgt von zweimaligem Waschen mit ddH₂O, wobei jede Waschung 2 Minuten dauert. Der Schnitt wird dann bei jeder Behandlung 2 Minuten lang mit 50%igem, 70%igem, 90%igem, 95%igem und 100%igem Ethanol dehydriert, gefolgt von einer etwa 10-minütigen Lufttrocknung.
NASBA-Amplifikation:

Gleich wie in Beispiel I.

Nachamplifikation:

Gleich wie in Beispiel I.

BEISPIEL 4
Die Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Molekülklebebands beim Zurückhalten amplifizierter Zielnucleinsäuremoleküle innerhalb einer Zelle wurde untersucht.
Zwei Kulturen von H9 (immortalisierten menschlichen T-Zelllinien)-Zellen wurden (in RPMI mit 10%igem fötalem Kälberserum) gezüchtet und für die Zählung mit Trypanblau gefärbt. Eine Kultur wurde mit HIV-1 IIIB infiziert, die andere Kultur hingegen nicht. Die Zellen wurden wie folgt zugeordnet: Gruppe I enthielt 0% infizierte Zellen; Gruppe II enthielt 50% infizierte Zellen; und Gruppe III enhielt 100% infizierte Zellen. Siehe 2.
Proben jeder Gruppe von Zellen wurden für eine Amplifikation vorbereitet und gemäß den Verfahren im obigen Beispiel 1 amplifiziert, was, wie beschrieben, den Einbau von Digoxigenin-UTP umfasste. Die verwendeten NASBA-Primer sind in einem HIV-Amplifikations- und Detektionskit auf NASBA-Basis („Nuclisens HIV-QT") enthalten, das bei Organon Teknika, Durham N. C., erhältlich ist. Die Hälfte der Zellen jeder Gruppe wurde nach der Dehydratation lysiert, während die andere Hälfte gemäß den obenstehenden in-situ-Verfahren behandelt wurde. Alle Gruppen wurden danach einer Detektion unterzogen, wobei entweder ein FITC-konjugierter Anti-Dig-Antikörper für die in-situ-Detektion oder ECL-Detektor- und Einfangsonden für die lysierten Zellen verwendet wurden.
Wie in Tabelle 1 dargestellt, wurde bei den nach der Dehydratation lysierten Zellen mittels ECL-Detektion festgestellt, dass bei Verwendung eines Molekülklebebands das amplifizierte Zielmolekül im Inneren von Zellen nachweisbar war, was durch „positiv" angezeigt wurde, während bei Fehlen eines Molekülklebebands (MT) kein nachweisbares amplifiziertes Zielmolekül innerhalb der Zellen zurückblieb, was durch „negativ” angezeigt wurde. Das Molekülklebeband enthielt die Sequenz:
Die „negativen" und „positiven" Bezeichnungen, die den ECL-Signalen innerhalb von Zellen (mit oder ohne Molekülklebeband) entsprachen, wurden basierend auf den für die Gruppen I–III auf experimentellem Wege erhaltenen ECL-Zahlen festgelegt. Im Speziellen wird das ECL-Signal als negativ erachtet, wenn die ECL-Zahl weniger als 2,5 Mal der Wert eines vorbestimmten ECL-Assay-Negativs ist (welches basierend auf einem im ECL-System verwendeten Standardalgorithmus berechnet wird, der ebenfalls Teil des Detektions- und Einfangsonden umfassenden „Nuclisens HIV-QT"-Kits von Organon Teknika ist.) Tabelle 1

ECL-Signale innerhalb ECL-Signale innerhalb

von Zellen (ohne MT) von Zellen (mit MT)

Versuch 1 negativ positiv

Versuch 2 negativ positiv
Bei der restlichen Hälfte der Zellen, die gemäß den in-situ-Verfahren des Beispiels 1 behandelt wurden, was die Verwendung von FITC-markierten Anti-Dig-Antikörpern einschließt, zeigt 2, dass ein Entweichen aus HIV-infizierten Zellen in Gruppe 11 (50% infiziert) und Gruppe III (100% infiziert) bei Vorhandensein eines Molekülklebebands verhindert wurde. In 2 ist dies (insbesondere bei den H9IIIB-Zellen der Gruppe III) durch die Lokalisierung der Fluorescein-markierten NASBA-Signale nur im zytoplasmatischen Abschnitt der infizierten Zellen dargestellt (wie durch die dunkleren Bereiche gekennzeichnet, welche die helleren inneren Kernbereiche umgeben), welche Signale im die Zellen umgebenden Medium fehlen.
Anhand dieser Versuchstypen können die idealen Bedingungen für eine isotherme in-situ-Amplifikation unter Verwendung eines erfindungsgemäßen Molekülklebebands bestimmt werden. Der Fachmann würde weiters verstehen, dass die obenstehenden Verfahren bei Bedarf zu modifizieren sind, um die vorliegende Erfindung mittels alternativer Amplifikationssysteme, wie z. B. Systeme auf Basis eines Temperaturzyklus, zu praktizieren.
BEISPIEL 5
Lymphknotenschnitte von einem mit SIV infizierten Affen und einem nicht mit SIV infizierten Affen (die beide mit Formalin fixiert waren) wurden in Xylol (2 Mal für jeweils 5 Minuten) und Ethanol (2 Mal für jeweils 5 Minuten) dehydriert und in Ethanol (95%, 90%, 70% und 50%, jeweils für 2 Minuten) rehydriert. Die Schnitte wurden danach bei 37EC 30 Minuten lang Dispase 11 (0,6 U bzw. 1,2 U) und einem Pronasegemisch-Aufschluss ausgesetzt. Dem Aufschluss folgte eine 10-minütige Wärmeinaktivierung bei 90E C. Die Schnitte wurden dann zweimal in PBS und zweimal in Wasser gewaschen und mit Ethanol (50%, 70%, 95% und 100%, jeweils für 2 Minuten) dehydriert und luftgetrocknet.
Eine isotherme Amplifikation wurde dann wie obenstehend beschrieben unter Verwendung von Primern aus dem GAG-Gen von SIV folgendermaßen durchgeführt:
Ein FITC-markiertes Molekülklebeband wurde erfindungsgemäß als Detektionssonde sowie zur Verhinderung eines Entweichens eingesetzt. Das Molekülklebeband enthielt die Sequenz: TTAGCTCCATTAGTGCCAACAGGCTCAGCTCCGTCTTGTCAGGG, und war sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende des Moleküls FITC-markiert. 3 zeigt in der linken Tafel („SIV-infiziertes LN") die Lokalisierung des NASBA-Signals im Verhältnis zum zytoplasmatischen Bereich der Zelle und das Fehlen einer Fluorescein-Markierung im umgebenden Medium (und somit die Verhinderung eines Entweichens aus den infizierten Zellen in dieses).
Zusammenfassend bieten die erfindungsgemäßen Verfahren mehrere signifikante Vorteile gegenüber anderen im Stand der Technik bekannten in-situ-Amplifikationsverfahren.
Erstens ermöglicht das erfindungsgemäße Molekulkiebeband die Retention von kleinen Amplifikationsprodukten und erlaubt somit die Amplifikation und Detektion von Zielen jeglicher Größe.
Zweitens ermöglicht eine bevorzugte Ausführungsform einer isothermen Amplifikation auf Transcriptionsbasis eine spezifische Amplifikation von RNA in einem DNA-Hintergrund.
Drittens konserviert die bevorzugte Ausführungsform einer isothermen Amplifikation auf Transcriptionsbasis die Zellmorphologie und liefert somit Informationen, die über das hinausgehen, was mittels Temperaturzyklusverfahren erhalten werden könnte. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Verhinderung des Entweichens eines amplifizierten Zielnucleinsäuremoleküls aus einer Zelle, umfassend die folgenden Schritte: – das Aussetzen der Zelle einem Nucleinsäure-Molekülklebeband, das in die Zelle eindringt und mit dem amplifizierten Molekül und mindestens einem weiteren amplifizierten Molekül oder einem intrazellulären Bestandteil hybridisiert, um einen Komplex mit einer Größe zu bilden, welche die Größe der in derselben Membran vorhandenen Öffnungen übersteigt; oder – das Aussetzen der Zelle einer Mehrzahl von Kopien eines Nucleinsäure-Molekülklebebands, welche in die Zelle eindringen und mit einer oder mehreren Kopien des amplifizierten Zielmoleküls hybridisieren, um einen Komplex mit einer Größe zu bilden, welche die Größe der in der Zellmembran vorhandenen Öffnung übersteigt, wodurch ein Entweichen verhindert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zielnucleinsäuremolekül durch eine isotherme Amplifikation amplifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zielnucleinsäuremolekül durch eine Wärmewechselamplifikation amplifiziert wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Molekülklebeband weiters an einen oder mehrere intrazelluläre Bestandteile bindet.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zielnucleinsäuremolekül RNA ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zielnucleinsäuremolekül DNA ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Zielnucleinsäuremolekül in einem Gewebeschnitt vorhanden ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zelle eine aus einer Mehrzahl von suspendierten Zellen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, weiters umfassend den Schritt des Detektierens des Komplexes.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Detektionsschritt in situ erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Molekülklebeband eine detektierbare Markierung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die isotherme Amplifikation eine isotherme Amplifikation auf Transcriptionsbasis ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die isotherme Amplifikation auf Transcriptionsbasis eine auf Nucleinsäuresequenzen basierende Amplifikation (NASBA) ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Wärmewechselamplifikation eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Wärmewechselamplifikation eine Reverse-Transcriptase-PCR (RT-PCR) ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Molekülklebeband einzelsträngig ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Molekülklebeband doppelsträngig ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Molekülklebeband eine Länge von mindestens 20 Nucleotiden hat.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Länge des Molekülklebebands von 20 bis 60 Nucleotiden reicht.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Länge des Molekülklebebands von 30 bis 50 Nucleotiden reicht.
Verfahren nach Anspruch 1, weiters umfassend den Schritt des Blockieren des 3'-Endes des Molekülklebebands.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Zelle eine fixierte Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei der Gewebeschnitt ein fixierter Gewebeschnitt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Molekülklebeband DNA umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Molekülklebeband RNA umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Molekülklebeband eine peptidhaltige Nucleinsäure umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein erster Sequenzbereich des Molekülklebebands mit einem komplementären Bereich einer ersten Kopie des amplifizierten Zielmoleküls hybridisiert und ein zweiter Sequenzbereich des Molekülklebebands mit einem komplementären Bereich einer zweiten Kopie des amplifizierten Zielmoleküls hybridisiert.