DE60107962T2

DE60107962T2 - Saratin zur hemmung der plättchenadhäsion auf dem kollagen

Info

Publication number: DE60107962T2
Application number: DE60107962T
Authority: DE
Inventors: Christopher Barnes; Matthias Frech; Uwe Hofmann; Johannes Gleitz; Wolfgang Strittmatter
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2000-08-25
Filing date: 2001-08-23
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2021-08-24
Also published as: CN1224421C; HU229367B1; DE60107962D1; MY128992A; MXPA03001604A; NO20030841L; KR20030034141A; PT1311284E; EP1311284B1; SK287829B6; ATE285246T1; CZ2003720A3; US20030190342A1; NO331326B1; US20050143305A1; CZ302353B6; AU9550601A; CA2419385A1; US7459438B2; EP1311284A2

Description

Kurze Darstellung der Erfindung
Die Erfindung betrifft die Wirkung eines Polypeptides mit der Bezeichnung Saratin, das die Adhäsion und Ansammlung von Blutplättchen nach Gefäßverletzungen, wie Endarterektomie, signifikant senkt. Die Erfindung betrifft darüber hinaus die Hemmung der vWF-abhängigen Bindung der Blutplättchen an die Kollagene der Gefäßwand unter erhöhter Scherungsbedingungen und genauer eine neue medizinische Verwendung von Saratin als Thrombose-Inhibitor, wobei das Polypeptid lokal als topisches Mittel oder als Beschichtung für medizinische Vorrichtungen verwendet werden kann.
Gebiet der Erfindung
Die Anhaftung von Blutzellen, insbesondere Blutplättchen, an der Wand von verletzten Blutgefäßen ist ein bekanntes Phänomen bei der Angioplastie und bei chirurgischen Verfahren. Solche Verletzungen können während verschiedener chirurgischer und perkutaner Therapien vorkommen, die zur Wiederöffnung von blockierten Kanälen, Bahnen und anderer Lumina, zur Entfernung von erkranktem Gewebe und zur Implantation von Ersatzgewebe oder deren Komponenten entwickelt wurden.
Es wurden verschiedene Interventionstechniken entwickelt, die die Reduktion oder die Entfernung der Blockierung in dem Blutgefäß erleichtern, so dass ein erhöhter Blutfluss durch das Gefäß ermöglicht wird. Eine Technik zur Behandlung von Stenose oder Verschluss eines Blutgefäßes ist die perkutane Ballon-Angioplastie. Ein Ballonkatheter wird durch das Arteriensystem des Patienten gefädelt und in den verengten oder blockierten Bereich eingeführt, und der Ballon wird aufgeblasen, damit er den verengten Bereich ausdehnt. Die perkutane transluminale Angioplastie (PTCA) ist das am häufigsten zur Öffnung verschlossener Athersklerose-Arterien verwendete Verfahren.
Gewöhnlich erzeugen Angioplastie-Verfahren hervorragende Ergebnisse, die den Bedarf für eine Bypass-Operation erübrigen, jedoch kann bei etwa 30 bis 40% der Patienten auf eine scheinbar erfolgreiche anfängliche Erweiterung der Arterie eine Verengerung des Gefäßes (Restenose) etwa 3 bis 9 Monate später folgen. Wenn diese Restenose schwer ist, können die Patienten ein zweites Angioplastie-Verfahren benötigen, und zwar oft mit einer Implantation eines Stents, der in dem Gefäß als Gerüst wirkt.
Bei anderen Fällen kann eine Arterienrekonstruktion unter Bypass-Operation, die ein Verfahren mit einem höheren Risiko ist, erforderlich sein. Bei mehr als 800000 PTCA-Verfahren, die derzeit weltweit jährlich durchgeführt werden, wurde die sozioökonomische Bedeutung dieser 30- bis 40%igen Restenose-Rate zu einem schweren Belang für die intervenierenden Kardiologen.
Die Restenose ist oft das Ergebnis der ballonvermittelten Dehnungs- und Quetschverletzung der Arterienwand und der Möglichkeit, dass die Führungsdrähte der bei solchen Verfahren verwendeten Katheter während des Einsatzes Verletzungen verursachen und zur Proliferation der Glattmuskelzellen der Arterie führen können, was einen Wiederverschluss der Arterie ("Restenose") über die folgenden Monate bewirkt.
Wegen der potentiellen Komplikationen bei der Restenose und der Furcht vor einer aus einem ulzerativen Plaque ausgelösten Embolie und den schweren daraus resultierenden Folgen, schränkt die Anwendung einer wiederholten Angioplastie in den Carotis-Arterien die Alternativen eines minimal invasiven Eingriffs stark ein.
Bisher wurden Versuche zur Behandlung von Verschlüssen in den zum Gehirn führenden Carotis-Arterien durch andere Arten von Eingriffen gemacht.
Die Carotis-Endarterektomie ist ein chirurgisches Verfahren zur Entfernung der Blockierungen aus der Carotis-Arterie und ist eine der üblichsten Gefäßoperationsverfahren, die in den Vereinigten Staaten durchgeführt wird. Die Ergebnisse von Multicenter-Versuchen haben die Wirksamkeit dieses Verfahrens bei der Behandlung von extrakranialer Carotiserkrankung bei symptomatischen und asymptomatischen Patienten gezeigt (JAMA 1995; 273: 1421–28; N. Engl. J. Med. 1991; 325; 445–53), und Endarterektomie-Verfahren werden bei der Behandlung der okklusiven Gefäßerkrankung in anderen Gefäßbetten verwendet (Vasc. Surg. 1999: 33: 461–70).
Bei der Endarterektomie wird die Carotis-Arterie gespalten, und Plaque wird aus dem Gefäß im gespaltenen Bereich entfernt. Bei einer Operation wird die Carotis-Gabelung durch einen Schnitt im Hals des Patienten freigelegt, und es werden Klammern auf beiden Seiten des Verschlusses untergebracht, um diesen zu isolieren, und die Arterie wird mit einem Schnitt geöffnet. Der Verschluss wird beseitigt, der isolierte Bereich wird gespült und abgesaugt und die Arterie zugenäht. Die Klammern werden entfernt, damit der Blutfluss durch die Arterie wieder hergestellt wird. Die Embolie und die in den Klammern enthaltenen Trümmer können erhebliche Probleme nach dem Öffnen der Carotis-Arterie verursachen, was einen Blutfluss zurück in den vorher isolierten Bereich ermöglicht.
Die Endarterektomie ist zwar eine wirksame Therapie, jedoch lässt sie die Adventitia und einen signifikanten Bereich des thrombogenen Subendothels unabgedeckt. Trotz der Wirksamkeit der Carotis-Endarterektomie kann die Operation zu Komplikationen führen, wie beispielsweise Thrombose und die Entwicklung von Intima-Hyperplasie, die Komplikationen verursachen, welche die vorteilhafte Wirkung des Eingriffs wieder zunichte machen oder neue Probleme aufwerfen.
Klinische Untersuchungen haben eine Schlaganfallrate nach der Carotis-Endarterektomie von 1 bis 10% in der Zeitspanne unmittelbar nach der Operation ergeben, die fast vollständig für die Thrombusbildung an der Endarterektomiestelle mit einer anschließenden cerebralen Embolisierung verantwortlich ist (Stroke 1984; 15: 950–55). Ansammlung von Blutplättchen kann aufgrund der Entwicklung einer Intima-Hyperplasie ebenfalls zu einer Restenose führen, die innerhalb von zwei Jahren nach der Operation erfolgen kann. Die Restenose kommt Berichten zufolge bei 10 bis 20% von sämtlichen endarterektomierten Patienten 2 bis 5 Jahre nach der Operation vor, welches fast vollständig auf einer Intima-Hyperplasie, einer Intima-Verdickung und einer Reduktion des Gefäßdurchmessers beruht, wie es durch Carotis-Duplex-Ultraschalldurchmusterung dokumentiert wurde (J. Vasc. Surg. 1986; 3; 10–23).
Die zelluläre und molekulare Reaktion der Gefäßwand auf mechanisch induziertes Trauma, chirurgischen Eingriff, Stent-Einführung, Unterbringung von einem Gefäßtransplantat (Arterien- oder Arteriovenen-Transplantat, beispielsweise Dialysetransplantat) ist ein komplexes Wechselspiel zwischen Entzündung, Wanderung von glatten Muskelzellen, Proliferation und Myofibroblasten-Transformation, welches einsetzt, sobald das Trauma auftritt (Futura; 1997, S. 289–317). Ist die Arterie durch eine Erkrankung schwer beschädigt und möglicherweise durch Calciumablagerung verhärtet, kann ein Eingriff ebenfalls ein gewisses Maß an zusätzlicher Verletzung mit einer lokalen Deendothelialisierung und das Bloßlegen der darunter liegenden extrazellulären Matrixkomponenten, wie Kollagen und Elastin, verursachen. Bei einigen Patienten kann die übermäßige Rekrutierung der Blutplättchen und Fibrin dann zu einem akuten Thrombose-Verschluss führen.
Untersuchungen an endarterektomierten Carotis-Arterienmodellen der Ratte (Neurosurg. 1985; 16; 773–79), sowie an Embolektomie-Ballonverletzungsmodellen (Lab. Invest. 1983; 49: 327–33) haben gezeigt, dass die Blutplättchen beim Abstreifen der Endothelzellen während der Gefäßverletzung beginnen, an dem freiliegenden Subendothel zu haften. Spallone et al., (Neurosurg. 1985; 16: 773–79) haben mittels Raster elektronenmikroskopie gezeigt, dass sich 5 Minuten nach einer Carotis-Endarterektomie in einer Ratte eine Blutplättchen-Monoschicht über dem verletzten Bereich bildet. 15 min nach der Verletzung werden Blutplättchenaggregation und Thrombusbildung beobachtet. 30 min nach der Endarterektomie ist die Stelle mit aktivierten Blutplättchen bedeckt und mit Fibrin und roten Blutzellen beschichtet. Die Thrombusbildung erreicht ihren Peak 3 Std. nach der Verletzung, wobei eine dicke Fibrin-Blutplättchenschicht beobachtet wird. Blutplättchen sind eine integrierte Komponente dieser Thrombusbildung und somit der Thrombose, aber sie scheinen ebenfalls eine Rolle bei der Entwicklung der Intima-Hyperplasie zu spielen.
Die Untersuchungen an Thrombocytopenie-Ratten haben weiter eine signifikante Abnahme der Intima-Verdickung nach einer Carotis-Arterienverletzung im Vergleich zu Kontrollratten ergeben (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989; 86: 8412–16). Sobald die Blutplättchen an dem freigelegten Subendothel eines verletzten Gefäßes haften, werden sie aktiviert und setzen ihre Granula frei. Diese Granula enthalten vasoaktive und thrombotische Faktoren (Serotonin, ADP, Fibrinogen, Von-Willebrand-Faktor, Thromboxan A2), sowie Wachstumsfaktoren (von Blutplättchen hergeleiteter Wachstumsfaktor, transformierender Wachstumsfaktor Beta, und Epidermis-Wachstumsfaktor) (Circulation 1985; 72: 735–40). Die genauen Mechanismen, durch die die Blutplättchen die Entwicklung der engen Hyperplasie steigern, sind noch nicht vollständig verstanden. Untersuchungen legen nahe, dass die Blutplättchen in erster Linie einen chemotaktischen Stimulus für die mediale Glattmuskelzellwanderung in Richtung Intima während der zweiten Phase der Intima-Hyperplasie-Entwicklung bereitstellen (Vasc. Surg. 1991; 13: 885–91). Andere Untersuchungen mittels anti-PDGF-Antikörpern haben die wichtige Rolle gezeigt, die PDGF bei der Neointima-Glattmuskelzellansammlung nach einer Gefäßverletzung spielt (Science 1991: 253: 1129–32). Ein anderer Mechanismus, durch den die Blutplättchen die Entwicklung der Intima-Hyperplasie steigern können, ist über die Aktivierung der Koagulationskaskade und die anschließende Ansammlung von Thrombin an der Verletzungsstelle. Mehrere Unter suchungen haben die mitogenen Wirkungen von Thrombin auf die Glattmuskelzellen ergeben (J. Clin. Invest. 1993; 91: 94–98, J. Vasc. Surg. 1990; 11: 307–13). Zudem hat sich herausgestellt, dass Thrombin ein Stimulus für die Blutplättchenaktivierung ist. Ungeachtet des genauen Mechanismus spielen die Blutplättchenadhäsion und die Aktivierung an der Stelle der Gefäßverletzung eine signifikante Rolle bei der Entwicklung der Thrombose und der Intima-Hyperplasie, und somit kann die Hemmung der Blutplättchenadhäsion und -Aktivierung dabei helfen, die Thromboseraten und die Entwicklung der Intima-Hyperplasie zu verhindern oder zu reduzieren.
Die Anhaftung der Blutplättchen an der verletzten Arterienwand wird in erster Linie durch den von-Willebrand-Faktor (vWF) vermittelt, der ein multimeres Glycoprotein ist, das von Endothelzellen freigesetzt wird und im Plasma zirkuliert, wo es als Carrierprotein für den Faktor VIII wirkt (Annu. Tev. Biochem. 1998; 67: 395–424). Stark multimerisierter vWF zirkuliert auch im Inneren der alpha-Granula von Blutplättchen, von wo er nach der Blutplättchenaktivierung freigesetzt wird (Annu. Tev. Biochem. 1998; 67: 395–424). Unter erhöhten Scherbedingungen, wie sie beispielsweise an Stellen von atheromatösen Plaques oder bei mechanischem Eingriff vorliegen, kann vWF über seine A3-Domäne an oberflächenexponierte Kollagenfasern binden (Biochemistry 1986; 25(26): 8357–8361, Blood 1987; 70(5): 1577–1583, J. Biol. Chem. 1987; 262(28): 13835–13841). Kollagen-gebundener vWF wiederum "bindet" die Blutplättchen über scherabhängige Freilegung eines Epitops in der vWF-A1-Domäne, die mit dem Blutplättchen GPIb/IX/V interagiert (Blood 1985; 65(1); 85–90, Blood 1985; 65(4): 823–831, Br. J. Haematol. 1986; 63(4): 681–691). Somit wirkt vWF als Brücke zwischen Kollagen und den Blutplättchen und ist eine Voraussetzung für die Adhäsion der Blutplättchen an Kollagen unter Fluss (J. Lab. Clin. Med. 1974; 83(2): 296–300). Das über vWF rollende Blutplättchen führt jedoch zu einer schwachen Adhäsion und zusätzlich sind direkte Wechselwirkungen zwischen Kollagen und anderen Rezeptoren auf der Oberfläche der Blutplättchen erforderlich, um die permanente Blutplättchenadhäsion, Aktivierung und Aggregation zu erleichtern (Thromb. Haemost 1997; 78(1) 434–438, Thromb. Haemost 1997; 78(1): 439–444). Die direkten Kollagenrezeptoren auf den Blutplättchen umfassen GP VI (Blood 1987; 69(6): 1712–1720, Thromb. Haemost 1999; 81(5); 782–792, J. Clin. Invest. 1989; (84); 1440–1445), GP Ia/IIa (α₂/β₁) (J. Clin. Invest. 1989; 84(5): 1440–1445, Nature 1985; 318 (6045): 470–472) und in geringerem Masse GPIV (CD36) (J. Biol. Chem. 1989; 264(13): 7576–7583) und vielleicht sogar p65 (J. Clin. Invest. 1997; 100(3): 514–521). Bei Fehlen der vWF-unterstützten Blutplättchenbindung haben sich diese Rezeptoren als zu schwach bei der Vermittlung der Blutplättchenrekrutierung an Kollagen im Fluss erwiesen (Br. J. Haematol. 1986; 63(4): 681–691). Schließlich erleichtert vWF in Kombination mit Fibrinogen die Vernetzung und die weitere Aktivierung der Blutplättchen über die Bindung and Blutplättchen-GPIIb/IIIa (J. Clin. Invest. 2000; 105(6); 783–791), so dass dem sich entwickelnden Thrombus Stabilität und Festigkeit verliehen wird.
Mit dem Aufkommen der Blutplättchen-GP IIb/IIIa- und ADP-Rezeptor-Antagonisten wurden in den letzten Jahren große Fortschritte in Richtung einer Antiaggregationstherapie gemacht (Coronary Art. Dis. 1999; 10(8): 553–560, J. Am. Coll. Surg. 2000; 191(1): 76–92). Diese Strategien sind jedoch nicht dazu ausgelegt, dass sie die anfängliche Adhäsion der Blutplättchen an freiliegenden Kollagenfasern hemmen, und trotz der Effizienz der GP IIb/IIIa-Antagonisten bei der Abschwächung der Plättchen-Plättchen-Wechselwirkungen haften die Blutplättchen immer noch an der verletzten Gefäßwand (Blood 1993; 81(5): 1263–1276, Circulation 1995; 91(5): 1354–1362). Die Blutplättchenaktivierung geht darüber hinaus fast sicher weiter als Aggregation und akute Thrombose, wobei das Fortschreiten der subakuten und chronischen Intima-Hyperplasie mindestens teilweise durch mitogene Vermittler beeinflusst wird, wie durch den von Blutplättchen hergeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF), der durch die Aktivierung der Blutplättchen freigesetzt wird. Tatsächlich wurde gezeigt, dass die Hemmung von PDGF die Intima-Hyperplasie bei verschiedenen Tierarten reduziert (Science 1991; 253(5024): 1129–1132, Circulation 1999; 99(25): 3292–3299).
Die pathophysiologische Bedeutung von vWF wird durch den Anstieg des zirkulierenden vWF bei Patienten mit akutem Myokardinfarkt angedeutet (Thromb. Haemost. 2000; 84: 204–209, Circulation 1998; 98(4): 204–299), wobei die vWF-Mengen positiv mit der schlechten anschließenden Prognose korreliert sind (Circulation 1998; 98 (4); 294–299). In-vivo-Untersuchungen haben weiterhin ergeben, dass die Neutralisation von anti-vWF-Antikörpern die experimentelle Thrombose hemmen, was die wesentliche Rolle von vWF bei der Thrombusbildung bestätigt (Thromb. Haemost. 1998; 79(1): 202–210). Mit der immer stärkeren Verwendung von Angioplastie-Techniken bei den akuten Koronar-Syndromen, die unweigerlich zur Beschädigung der Gefäßwand und zur Freilegung von Kollagen führt, gibt es darüber hinaus einen steigenden Bedarf an Strategien, die so früh wie möglich während der Blutplättchen-Adhäsions-Aggregations-Kaskade pharmakologisch intervenieren.
Die beiden Hauptlinien der Therapie, die derzeit in einem Versuch zur Steuerung der Blutplättchen-Adhäsion, Aktivierung und anschließende Thrombose sowie Intima-Hyperplasie verwendet werden, sind Anti-Blutplättchenmittel und die antithrombotische Verabreichung. Medikamente, wie Aspirin, blockieren zwar effizient die Synthese von Thromboxan A2 durch die Hemmung des Cyclooxygenase-Wegs, jedoch verhindern sie nicht die kollageninduzierte Blutplättchen-Adhäsion und -Aktivierung, die die Entwicklung der Intima-Hyperplasie stimuliert. Die Verwendung von Heparin als Antithrombosemittel geht mit Komplikationen und Einschränkungen einher, wie unter anderem einer nicht vorhersehbaren Dosisreaktion, dem Bedarf für eine genaue Laborüberwachung, einer eingeschränkten Aktivität gegen gerinnselgebundenes Thrombin, multiple inhibitorische Stellen, Antithrombin-III-Abhängigkeit, einer Gefahr einer starken Blutung, sowie der Notwendigkeit einer kontinuierlichen Infusion. Ein ideales Mittel produziert eindeutig stellenspezifische und lokalisierte Wirkungen ohne systemische Verteilung oder eine generalisierte Koagulopathie.
Die wichtigen Schritte, die die Ereigniskaskade auslösen, führen anscheinend zur Thrombose und einem späteren Intima-Hyperplasie-Stamm aus der Wechselwirkung zwischen dem freiliegenden Subendothel-Kollagen an der Stelle der Gefäßverletzung und einer an dem freiliegenden Kollagen haftenden Monoschicht der Blutplättchen. Folglich kann ein spezifischer Inhibitor der Haftung des Blutplättchens an dem Subendothel-Kollagen die Entwicklung des Thrombus und der Intima-Hyperplasie verhindern oder zumindest senken.
Mehrere aus Blutegel hergeleitete Substanzen hemmen Berichten zufolge die Wechselwirkungen zwischen Kollagen und Blutplättchen (Blond 1995; 85(3): 805–711, Platelets 2000; 11(2): 83–86, J. Biol. Chem. 1992; 267(10); 6893–6898, J. Biol. Chem. 1992; 267(10); 6899–6904, Blond Coagul. Fibrinolysis 1991, 2(1); 179–184). Destabilase, eine Isopeptidase mit einer Fibrin-depolymerisierenden Aktivität, isoliert aus Hirudo medicinalis, hemmt Berichten zufolge die Blutplättchen-Aggregation, die durch verschiedene Agonisten, einschließlich Kollagen, induziert wird, bindet aber wahrscheinlich direkt an die Blutplättchenmembran (Platelets 2000; 11(2): 83–86). Das Antiblutplättchen-Protein aus Blutegel (LAPP), ein ~13 kDa-Protein aus der Speicheldrüse von Haementeria officinalis, hemmt die Blutplättchen-Adhäsion an Kollagen unter statischen Bedingungen (J. Biol. Chem. 1992; 267(10): 6899–6904, Thromb. Haemost 1999, 82(3); 1160: 1160–1163) und erhöhtem Fluss (Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 1995, 15(9): 1424–1431), und zwar mit Wirkungen sowohl auf vWF- und Blutplättchen-GP Ia/IIa-vermittelte Bindung an Kollagen (Thromb. Haemost. 1999, 82(3): 1160–1163). Calin ist ein ~65 kDa Protein aus Hirudo medicinalis für das ein ähnliches Profil auftrat. Calin hemmt auch die Wechselwirkungen zwischen Kollagen und Blutplättchen unter statischen und Flussbedingungen (Blood 1995; 85(3): 705–711, Blond Coagul. Fibrinolysis 1991, 2(1): 179–184, Thromb. Haemost 1999, 82(3): 1160–1163). Zudem sind sowohl LAPP als auch Calin wirksame Inhibitoren der kollageninduzierten Blutplättchen-Aggregation, wobei die Hemmung der Aggregation bei ähnlichen Konzentrationen wie bei der Blockierung der vWF-Bindung an Kollagen erfolgt (J. Biol. Chem. 1992; 267(10): 6893–6898, Blood Coagul. Fibrinolysis 1991, 2(1): 179–184, Blood 1995, 85(3); 712–719).
Sowohl LAPP als auch Calin wurden in Thrombose-Modellen in vivo mit gemischtem Erfolg bewertet. LAPP konnte trotz der Verwendung von Dosen, die die kollageninduzierte Blutplättchenaggregation hemmten, keine Thrombusbildung auf kollagenbeschichteten Transplantaten in einem arteriovenösen Shunt bei Pavian reduzieren (Arterioscler. Thromb. 1993), 13(11): 1593–1601), wohingegen Calin dosisabhängig die Thrombusbildung in einem Hamster-Modell der Venenthrombose hemmte (Blood 1995, 85(3): 712–719).
Nicht-thrombogene und anti-thrombogene Beschichtungen für Stents und Katheter sind im Fachgebiet bekannt. Die nicht-thrombogenen Beschichtungen und Produkte beruhen auf modifizierten und fortschrittlichen Polymeren, und Beispiele sind in WO9301221 und WO9830615 angegeben.
Anti-thrombotische und Anti-Restenose-Beschichtungen sind gewöhnlich biologisch kompatible Beschichtungen, die ebenfalls als Reservoire für die lokale Medikamentenabgabe dienen. Die Beschichtungen beruhen vorwiegend auf Hydrogelen, und Beispiele in der Patentliteratur für Verfahren zur Herstellung verschiedener Arten von Hydrogelen und medizinischen Beschichtungsvorrichtungen umfassen WO9211896, WO9811828, WO0147572, EP0887369 und WO0139811.
Das Freisetzungsprofil der therapeutischen Substanzen, die in der Beschichtung enthalten sind, können beispielsweise durch Verändern der Dicke der Polymerschichten oder durch Auswahl spezifischer Polymer beschichtungen, die ausgewählte physikalisch-chemische Eigenschaften (wie Ladung, Hydrophobie, Hydrophilie) verleihen und/oder durch Herstellen der Beschichtung als verschiedene Lagen eingestellt werden. Die Kriterien zur Auswahl des Polymers und der Optimierung der Freisetzungsrate sind dem Fachmann geläufig. Andere Beschichtungen sind beschrieben von Fischell (Circulation, 1996, 94: 1494–95); Topol et al. (Circulation, 1989, 98: 1802–20) und McNair et al., in device Technology, 1996, 16–22).
Die Verwendung von Stents, Drähten und Kathetern in dem kardiovaskulären System ist übliche Praxis, und die Gefäßwandverletzung, Embolisierung und die folgende Restenose sind ein Hauptbelang bei Kardiologen während und nach dem chirurgischen Eingriff oder den Katheterisierungen. Alternative Verfahren, wie Endarterektomie, verursachen vergleichbare Probleme. Jedes Verfahren, bei dem an Arterien gearbeitet wird, d. h. Gefäßoperation und Angioplastie, ist für die Entwicklung von Intima-Hyperplasie anfällig. Die Verwendbarkeit eines Verfahrens zur Verhinderung oder zur Senkung der Entwicklung von Intima-Hyperplasie kann nicht überbetont werden, und die Vorteile eines Verfahrens, das dazu fähig ist, ohne dass systemische Wirkungen erzeugt werden, ist sogar noch ermutigender.
Daher ist der Bedarf an neuen und verbesserten Pharmazeutika und Verfahren zur Hemmung der frühesten Ereignisse bei der Pathophysiologie (beispielsweise Blutplättchen-Adhäsion) offensichtlich und Beiträge in diesem Gebiet senken erwartungsgemäß im Wesentlichen die Morbidität und Mortalität, die mit Angioplastie- oder chirurgischen Verfahren einhergehen.
Beschreibung der Erfindung
Im Allgemeinen betrifft die vorliegende Erfindung das Einbringen des kürzlich beschriebenen Blutplättchen-Adhäsionsinhibitors Saratin in oder auf eine ausgewählte Stelle in oder auf einem Lumen in einem Gewebe, d. h. dem Gefäß oder einem Organ, unter solchen Bedingungen, dass Saratin lokal als topisches Mittel oder als Haftbeschichtung auf der Oberfläche verwendet werden kann, um eine ungewünschte thrombotische und/oder restenotische Reaktion auf die Gefäßwandverletzung, einschließlich der Verletzungen, die bei Angioplastie, Stents, Dialysetransplantaten und/oder Gefäßtransplantaten vorkommen, zu verhindern und zu hemmen, und das Behandeln von gutartiger hypertropher Narbenbildung sowie die Behandlung und Passivierung von instabilen atherosklerotischen Plaques.
Saratin ist ein kürzlich beschriebenes (WO0056885) rekombinantes 12 kD Protein, das ursprünglich aus einem Blutegel isoliert wurde. Das Protein hemmt die vWF-abhängige Bindung der Blutplättchen an die Arterienwand-Kollagene unter erhöhten Scherbedingungen, und es ist dieser Aspekt der Erfindung, der Saratin zur Hemmung der arteriellen Thrombose geeignet macht. Ein weiterer neuer Aspekt ist, dass Saratin als topisches Mittel an der Verletzungsstelle verwendet werden kann, mit dem Vorteil, dass es die Thrombose und/oder Intima-Hyperplasie ohne jegliche systemische Wirkungen senkt. Dies veranschaulicht eine Modalität mit spezifischen und lokalisierten Wirkungen, die für die Anwendung durch den Chirurg und den eingreifenden Radiologen geeignet sind.
Saratin kann mit einer Vielzahl von therapeutischen Mitteln für die Abgabe an Ort und Stelle kombiniert werden. Beispiele zur Verwendung bei Koronar-Arterien-Anwendungen sind Anti-Thrombosemittel, beispielsweise Prostacyclin und Salicylate, Thrombolysemittel, beispielsweise Streptokinase, Urokinase, Gewebe-Plasminogenaktivator (TPA) und anisoylierter Plasminogen-Streptokinase-Aktivator-Komplex (APSAC), Vasodilatatoren, d. h. Nitrate, Calciumkanal-blockierende Medikamente, antiproliferative Mittel, d. h. Colchicin und alkylierende Mittel, interkalierende Mittel, wachstumsmodulierende Faktoren, wie Interleukine, Transformations-Wachstumsfaktor Beta und Verwandte des von Blutplättchen hergeleiteten Wachstumsfaktors, monoklonale Antikörper, die gegen die Wachstumsfaktoren gerichtet sind, sowohl steroidale als auch nicht-steroidale entzündungshemmende Mittel, und andere Mittel, die die Gefäßtonus-, die Funktions-, Arteriosklerose- und Heilreaktion auf Gefäß- oder Organverletzung nach dem Eingriff modulieren können. Antibiotika können auch in erfindungsgemäßen Kombinationen oder Beschichtungen enthalten sein. Darüber hinaus kann eine Beschichtung dazu verwendet werden, um die pharmazeutische Abgabe fokal in der Gefäßwand herbei zu führen. Durch Aufnahme des Wirkstoffs in einem quellfähigen Polymer wird dieser beim Quellen des Polymers freigesetzt.
Bei einer Ausführungsform besteht die Beschichtung aus einem Hydrogel, wie Polyethylenoxid, Albumin, hydrophilen Polymethacrylaten und hydrophilen Polyurethanen.
Die vorliegende Erfindung stellt beispielsweise zudem die Verwendung von Saratin und Derivaten über lokale Medikamentenabgabe-Vorrichtungen/Katheter oder über Stents und Stent-Beschichtungen und Gefäßtransplantaten und Transplantat-Beschichtungstechnologien bereit. Die Erfindung stellt auch Verfahren zum Verabreichen von Saratin in Zusammensetzungen bereit, die regulierte Mengen Saratin in einem bestimmten Bereich über die Zeit eluieren.
Insbesondere können Vorrichtungen auf Katheterbasis zur lokalen Abgabe von Saratin verwendet werden. Saratin kann ebenfalls gut mit oder ohne andere Therapeutika aus einer Polymermatrix in Körpergewebe mit Hilfe von Kathetern verwendet werden. Die Grundvoraussetzungen für das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendende Polymermaterial sind Biokompatibilität und Medikamenten-Freisetzungseigenschaften, die an eine bestimmte Anwendung angepasst werden können.
Die lokal kontrollierte Saratin-Freisetzung kann nur durch Permeation, nur durch Iontophorese, nur durch Elektroporation oder durch kombinierte Iontophorese erzielt werden, und die Elektroporation kann zum effizienten Freisetzen und Einbringen von Saratin in das Gefäßlumen verwendet werden. Der Katheter kann vorzugsweise Verfahren ausüben, die dazu ausgelegt sind, dass eine hohe Medikamentenkonzentration in dem ausgewählten Gefäßraum aufrechterhalten wird, so dass die Ergebnisse eine verbesserte Gefäßbeschichtung mit Saratin allein oder mit zusätzlichen Behandlungsmitteln ergeben.
Die vorliegende Erfindung eignet sich besonders zur lokalen Abgabe von Saratin während und nach eingreifenden kardiologischen Verfahren, wie Angioplastie und Stent-Implantation und Endarterektomie.
Eingehende Beschreibung der Erfindung
Geeignetes rekombinantes Saratin zur Verwendung in der Erfindung wurde in Hansenula polymorpha exprimiert und daraus isoliert, und es wurde gefunden, dass es durch Blockieren der vWF-Bindung an Kollagen wirkt und effizient die Adhäsion der Blutplättchen an Kollagen unter erhöhter Scherung verhindert. Saratin hemmte dosisabhängig die Bindung von gereinigtem Human-vWF an Human-Kollagene vom Typ I und Typ III (IC₅₀ = 0,23 ± 0,004 bzw. 0,81 ± 0,04 μg/ml^–1) und an Kalbshaut-Kollagen (IC₅₀ = 0,44 ± 0,008 μg ml^–1). Darüber hinaus zeigte Saratin eine inhibitorische Wirksamkeit gegen die Bindung von Human- Nagetier- und Schweine-Plasma-vWF an diese Kollagene. Bei einer Fließkammer unter erhöhten Scherbedingungen (2700 s^–1) hemmte Saratin dosisabhängig und effizient die Bildung von Blutplättchenaggregat auf einer kollagenbeschichteten Oberfläche (IC₅₀ = 0,96 ± 0,25 μg ml^–1), aber bei einer reduzierten Scherung von (1300 s^–1) wurde eine Rechts-Verschiebung in der Dosis-Reaktionskurve beobachtet (IC₅₀ = 5,2 ± 1,4 μg ml^–1). Die Oberflächen-Plasmon-Resonanz-Analyse ergab Bindungsstellen mit hoher und niedriger Affinität für Saratin an Human-Kollagen vom Typ III (K_d = 5 × 10^–8 M bzw. 2 × 10^–6 M), und obwohl niedrige Saratin-Konzentrationen, die die Adhäsion von Blutplättchen unter erhöhter Scherung (d. h. Sättigung der Bindungsstellen mit hoher Affinität) hemmten, keine Wirkung auf die vWF-unabhängige kollagen-induzierte Blutplättchenaggregation hatten, wurde gefunden, dass hohe Konzentrationen (d. h. die Sättigung der Bindungsstellen mit niedriger Affinität) die Blutplättchenaggregation hemmen. Diese Daten zeigen, dass Seratin ein leistungsfähiger Inhibitor der vWF-abhängigen Adhäsion an Kollagen ist, die die Grundlage für das therapeutische Potential als Antithrombose-Mittel bildet.
Die Untersuchungen zeigen zudem, dass Saratin potentiell und dosisabhängig die Bindung von vWF hemmt, und zwar nicht nur an Kalbshaut-Kollagen, sondern auch an Human-Kollagen der Typen I und III, die jeweils in den Subendothelschichten der Arterienwand abundant sind, und die wahrscheinlich bei den Wechselwirkungen zwischen Blutplättchen und Gefäßwand wichtig sind (Thromb. Haemost. 1997, 78(1): 434–438). Da Kollagen-vWF-GP Ib/IX/V-Wechselwirkungen nur bei hinreichend erhöhter Scherung stattfinden, war es ein wichtiger Aspekt der Erfindung, die Effizienz von Saratin nicht nur unter statischen Bedingungen zu zeigen, sondern auch in einer Umgebung, die die Situation, der man in vivo begegnet, genauer nachahmt. In einer Flusskammer, wo die Scherkräfte zur Simulation einer solchen Umgebung variiert werden können, hemmte Saratin klar die Ansammlung von Blutplättchen an Kollagen, insbesondere bei höherer Scherung. Die Rechtsverschiebung der Dosisreaktionskurve als Folge der Verringerung der Scherung ist bemerkenswert, da die Beteiligung darin besteht, dass die Effizienz von Saratin in vivo auf Hochscherbereiche lokalisiert sein kann, wo die Unterbrechung des laminaren Blutflusses auf Änderungen der dem Blut präsentierten Endotheloberfläche zurückzuführen ist, beispielsweise in der Gegenwart von atherosklerotischem Plaque oder nach einem mechanischen Eingriff.
Oberflächen-Plasmon-Resonanzuntersuchungen mit Saratin ergaben, dass Kollagen zwei unabhängige Bindungsstellen für Saratin besitzen kann, und zwar eine mit hoher Affinität und eine mit niedriger Affinität. Die Hemmung der vWF-Bindung an Kollagen durch Saratin wird durch Sättigung der Bindungsstelle mit hoher Affinität erklärt, wobei die IC₅₀-Werte etwa 5 × 10^–8 M betragen, d. h. sie sind gleich der Dissoziationskonstante für diese Stelle. Weil die vWF-unabhängige kollageninduzierte Blutplättchenaggregation nur bei sehr hohen Dosen Saratin (etwa 100 μM) gehemmt wurde, scheint es, dass die Sättigung der Kollagen-Bindungsstelle mit niedriger Affinität mit der Hemmung der direkten Kollagen-Kollagen-Rezeptor-Wechselwirkungen assoziiert ist.
Eine weitere Aufgabe dieser Erfindung ist die Wirkung von Saratin zur Beeinträchtigung der lokalen Umgebung eines endarterektomierten Gefäßes, ohne dass eine systemische Verteilung erforderlich ist und ohne dass die Blutplättchenfunktion verändert wird oder die Koagulation dies zu einer idealen Modalität für die topische Anwendung während der operativen Gefäß- und eingreifenden radiologischen Verfahren macht.
Bei diesem Aspekt der Erfindung wurde der therapeutische Saratin-Effekt mit einem vorher beschriebenen Ratten-Carotis-Endarterektomie (CEA)-Modell untersucht (J. Vasc. Surg. 1998, 28: 909–918). Die PLT-Aktivierung ist wahrscheinlich der initialisierende Schritt bei der Thrombose nach CEA und der Restenose aufgrund von IH. Man hat beobachtet, dass die topische Anwendung von Saratin auf die Lumenoberfläche das Ausmaß an Blutplättchen-Adhäsion an der endarterektomierten Arterie senkt, und somit die postoperative Thrombose und IH senkt.
Als Zusammenfassung der experimentellen Ergebnisse zeigte die Anti-Blutplättchenhaftungswirkung von Saratin, die nach zwei unterschiedlichen postoperativen Zeiten bewertet wurde, dass die Anzahl der haftenden Blutplättchen 3 Std. (4) und 24 Std. (5) nach der Carotis-Endarterektomie in den mit Saratin behandelten Ratten verglichen mit den Kontrollratten signifikant reduziert war.
Die Blutplättchen-Adhäsion war nach 3 Std. um 59% reduziert (64 ± 17,2 vs 155 ± 33,4 PLT pro Raster P = 0,05) und 77% nach 24 Std. (35 ± 11,3 vs 149 ± 36,6 PLT pro Raster P = 0110). Die Blutplättchenadhäsion war nach 3 Std. und 24 Std. in den Kontrollgruppen ähnlich, zeigte aber eine Abnahme der mit Saratin behandelten Gruppe von 64 auf 35 Blutplättchen pro Raster.
Die 6 und 7 zeigt eine typische Darstellung der endarterektomierten Oberfläche mit und ohne topisches Saratin mittels Rasterelektronenmikroskopie bei 2000facher Vergrößerung. Die 6A zeigt die Kontrolloberfläche 3 Std. nach der Carotis-Endarterektomie, und man beachte die deutliche Abundanz des zellulären Materials, der Fibrinstränge, zahlreicher roter Blutzellen und zahlreicher Blutplättchen, die offensichtlich sind. Die 6B zeigt eine mit Saratin behandelte Oberfläche 3 Std. nach der Carotis-Endarterektomie. Man beachte das Fehlen der zellulären Elemente und die nahezu leere Kollagenoberfläche. Die 7A zeigt eine Kontrolloberfläche 24 Std. nach der Carotis-Endarterektomie, wobei die Blutplättchen als kleine weiße Punkte offensichtlich sind. Die 7B ist eine mit Saratin behandelte Oberfläche 24 Std. nach der Carotis-Endarterektomie. Es gibt eine klare Reduktion der Blutplättchenadhäsion bei der Saratin-Behandlung.
Die Anwendung von topischem Saratin nach einer Carotis-Endarterektomie senkte signifikant die Entwicklung der Intima-Hyperplasie verglichen mit der Kontrollgruppe. Die prozentuale Lumen-Stenose als Maß für die IH war bei der Aufbringung von Saratin verglichen mit den Kontrollen signifikant gesenkt. Diese Abnahme der IH-Bildung korrelierte mit der Hemmung der PLT-Haftung. In Bezug auf die Lumenstenose zeigten die Kontrollratten eine 29,8 ± 6,8% p = 0,0042 Lumenstenose gegenüber einer 10,9 ± 1,8% Lumenstenose in der mit Saratin behandelten Gruppe (6). Die mit Saratin behandelten Ratten hatten einen 18,9% größeren Lumendurchmesser als die Kontrollratten. Zwei Wochen nach der Carotis-Endarterektomie entwickelten 5 der 15 Kontrollratten (15%) einen vollständigen Thrombus der Carotisarterie bei histologischer Analyse, wohingegen 0 von 15 der mit Saratin behandelte Ratten (0%) eine Carotis-Thrombose entwickelten. Eine Chi-Quadrat-Analyse des Wahrscheinlichkeitsverhältnisses ergab einen Chancen-Anteil von 16,238, was nahe legt, dass die Chancen der Kontrollgruppe, eine verschließende Thrombose zu entwickeln, 16 Mal größer war als bei den Ratten, die mit Saratin P = 0,0156 behandelt waren.
Es erfolgte kein gesteigertes Bluten längs der Arteriennahtlinie in der Saratingruppe. Die Blutungszeiten und die systemischen Blutplättchenzahlen änderten sich Befunden zufolge nicht signifikant in den mit Saratin behandelten Ratten verglichen mit den Kontrollratten 3 und 24 Std. nach der Endarterektomie.
Das CEA-Modell ähnelt sehr der CEA-Operation beim Mensch, und folglich schlagen die Ergebnisse einen Mechanismus zur Senkung der schädlichen Auswirkungen der Blutplättchen-Haftung und der Aggregation an der Endarterektomiestelle ohne systemische Beeinflussung der Blutplättchenfunktion oder Verminderung der Hämostase vor. Die einfache topische Anwendung von Saratin während einer Ratten-CEA senkt die Blutplättchen-Haftung, Aggregation und die anschließende Restenose in dem Carotis-Bett aufgrund der Intima-Hyperplasie.
Die Tabelle 3 zeigt die Ergebnisse der Blutungszeiten und Plättchenzahlen. Keine statistisch signifikanten Unterschiede wurden zwischen den Blutungszeiten vor und nach der Operation beobachtet. Es gab keinen statistisch signifikanten Unterschied bei den Unterschieden der Blutplättchen-Zahlen zwischen den Saratin- und den Kontrollratten.
Wir haben eine signifikante Abnahme der Blutplättchen-Adhäsion und der Akkumulation nach einer Gefäßverletzung ähnlich der Endarterektomie gezeigt. Die verminderte Blutplättchen-Adhäsion wird sowohl direkt nach der Endarterektomie (3 Std.) sowie nach 24 Std. beobachtet. Die Wirkung nach 24 Std. ist insofern signifikant als wir annehmen, dass diese Wirkung nicht auf der direkten inhibitorischen Wirkung von Saratin auf das Kollagen beruht (die Serum-Halbwertszeit von Saratin beträgt 90 min), und sie beruht nicht auf der anfänglichen Hemmung der Blutplättchenaggregation und der anschließenden Unterbrechung der Blutplättchen-Aktivierungs kaskade. Sobald die Blutplättchen zu Beginn daran gehindert werden, dass sie an freiliegendes Kollagen binden, kann die Blutplättchen-Kaskade nicht weiter fortschreiten. Die 4 und 5 zeigen, dass das topische Aufbringen von Saratin auf das vor Kurzem verletzte Gefäß die Blutplättchen-Adhäsion in einem signifikanten Ausmaß hemmen kann. Saratin hemmte die Blutplättchen-Adhäsion um 60% bzw. 75% nach 3 bzw. 24 Std. Diese Hemmung macht sich in sichtbaren Unterschieden bei der Zellelement-Abscheidung zwischen den Kontroll- und mit Saratin behandelten Arterien nach 3 und 24 Std. bemerkbar (7 und 8). Dieses Fehlen der Zellantwort beruht unserer Meinung nach auf der Hemmung der Blutplättchen-Adhäsion. Dies veranschaulicht einen einzigartigen Therapiemodus für die Hemmung der Blutplättchenadhäsion an einem verletzten Gefäß. Kontrollratten hatten einen signifikant verringerten Lumen-Durchmesser 2 Wochen nach der Carotis-Endarterektomie verglichen mit den mit Saratin behandelten Ratten (9). Das Ausmaß der Intima-Hyperplasie-Entwicklung war in den mit Saratin behandelten Ratten signifikant reduziert, was mit einer reduzierten Blutplättchenadhäsion und -ansammlung korrelierte. Die Entdeckung der verminderten Intima-Hyperplasie und Thrombose, die mit einer verminderten Blutplättchen-Adhäsion assoziiert ist, liefert klinisch relevante Endpunkte und Auswirkungen der reduzierten Blutplättchen-Adhäsion. Dies zeigte, dass die stellenspezifische nicht-systemische Hemmung der Blutplättchenaggregation und -Adhäsion zu einer verminderten Thrombose- und Verschlussrate führt, und somit das Auftreten der Post-Carotis-Endarterektomie-verwandten cerebrovaskulären Ereignisse verringert. Das Ausmaß der Intima-Hyperplasie und der Lumenstenose-Verbesserung wird weiter durch den signifikanten Befund einer gesenkten Thromboserate bei mit Saratin behandelten Ratten gezeigt. Insgesamt 33% der Kontrollratten zeigten eine Thrombose, wohingegen keine der mit Saratin behandelten Carotis-Arterien thrombierten. Von besonderer klinischer Bedeutung ist das Fehlen der systemischen Wirkungen, die dieses Mittel aufweist. Das lokale Aufbringen von Saratin beeinflusste die systemischen Blutungszeiten oder die Blutplättchenzahlen nicht. Dies lässt darauf schließen, dass die verringerte Blutplättchen-Adhäsion und die darauffolgende Verringerung der Thrombose und Intima-Hyperplasie das Ergebnis der lokalen Wirkungen sind. Diese neuen Befunde hinsichtlich Saratin sind sicherlich insofern wichtig als es viele Spektren der klinischen Anwendungen für eine Modalität gibt, die die schädlichen Wirkungen der Blutplättchen-Adhäsion und die Aktivierung ohne Störung des systemischen Hämostase-Mechanismus lokal hemmen kann.
Es wurde früher hervorgehoben, dass verschiedene therapeutische Eingriffe lokale Verletzungen induzieren, die idealerweise sofort und lokal behandelt werden. Unbehandelt belassen leiten die verletzten Zellen eine Reihe von Prozessen ein, die an der Gerinnung, der Komplement-Aktivierung und der zellulären Reaktion auf die Freisetzung der Cytokine, der Induktion der Proliferation und an anderen biologisch aktiven Verfahren beteiligt sind. Diese komplexen miteinander verwandten Verfahren sind schwierig aufzuhalten, sobald sie begonnen haben.
Erfindungsgemäß ist es daher ein wichtiger Aspekt, dass Saratin sich direkt in den manipulierten Geweben befindet. Ein weiterer Aspekt der lokalen Aufbringung ist die Minimierung der potentiellen Probleme, die mit den systemischen Wirkungen der erfindungsgemäß verwendeten Medikamente verwandt sind.
Idealerweise kann die Saratin-Behandlung gleichzeitig mit der geeigneten therapeutischen Intervention verabreicht werden, was durch Einbringen von Saratin in die Beschichtung einer chirurgischen Vorrichtung, wie einem Ballon-Katheter oder einer anderen Vorrichtung, oder in einen Teil davon, erzielt werden kann. Ein weiterer Aspekt kann auch die direkte Beschichtung der verletzten Gefäße mit Saratin umfassen.
Zudem können auch normale Saratin-Abgabevorrichtungen in der Erfindung verwendet werden, wie die freifließende Form, einschließlich Kombinationen mit anderen Therapeutika. Die Verwendung von Polymer- Hydrogel-Matrizen hat jedoch bestimmte Vorteile gegenüber der freifließenden Abgabe. Die Abgabe eines Mittels, das in eine Polymermatrix eingebracht wurde, erfordert keine zusätzlichen Lumina in dem Stützkatheter, damit die freifließende Medikamentenlösung in die und aus der Behandlungsstelle befördert wird.
Zudem eliminieren die Polymermatrizen die Gefahr eines stromabwärts gelegenen Austritts der Medikamentenlösung aufgrund defekter Ballon-Versiegelung der Gefäßsegmente, wodurch die Gefahr vermieden wird, dass das Nicht-Ziel-Gewebe hohen Medikamenten-Konzentrationen ausgesetzt wird.
Eine allgemeine technische Lösung für das lokale Aufbringen von Saratin entweder auf eine medizinische Vorrichtung oder als Beschichtung für das verletzte Gefäß ist beispielsweise das Einbringen von Saratin in eine Polymer- oder Hydrogelbeschichtung.
In Bezug auf die Polymer-Zusammensetzung umfasst der Begriff "Hydrogel", wie er hier verwendet wird, synthetische Polymere mit Poren oder Zwischenräumen unterschiedlicher Größen und Kapazitäten sowie verschiedenen physikalisch-chemischen Eigenschaften, insbesondere in Bezug auf die Ladung oder die hydrophile/hydrophobe Natur der Gelmatrix, die während der Herstellung der Beschichtung oder der beschichteten Vorrichtung eingebracht werden können. Eine Vielzahl synthetischer Elastomere und natürlich vorkommender Polymermaterialien sind dem Fachmann bekannt. Saratin kann entweder während der Polymerproduktion in die Matrix eingebracht werden oder nach dem Aufbringen oder Formen des Polymers in die gewünschte Form zugegeben werden. Zudem können viele einer Anzahl verschiedener Polymermaterialien und Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäß verwendeten Polymermatrizes verwendet werden. Beispiele für geeignete Polymermaterialien oder Kombinationen umfassen, sind aber nicht eingeschränkt auf biologisch kompatible und/oder biologisch abbaubare Polymere.
Mehrere Alkylalkyl- und Cyanoacrylate wurden für die chirurgische Verwendung untersucht, und einige Isobutylcyanoacrylate haben sich als besonders geeignet erwiesen.
Ein übliches Hydrogelpolymer kann aus einem Monomergemisch hergestellt werden, das 40 bis 60 Gewichtsteile eines gereinigten Monoesters eines Hydroxyalkylalkylacrylates mit einer einfachen olefinischen Doppelbindung, 40 bis 60 Gewichtsteile eines Methacrylmonomers mit einer olefinischen Doppelbindung und 0,001 bis 5 Gewichtsteile eines Polymerisationsstarters enthält. Die Polymerisation kann durch die herkömmlichen Techniken der Block-Polymerisation, Lösungspolymerisation, Suspensions-Polymerisation bewerkstelligt werden. Die verwendete Polymerisationstechnik hängt von dem Volumen des erforderlichen Polymers und der Natur des hergestellten Endproduktes ab. Ein übliches Hydrogelprodukt wird durch ein Molverhältnis von Monoester zum Methacrylmonomer innerhalb des Bereichs von 1 : 1 bis 2,3 : 1, vorzugsweise 1,5 : 1 beschrieben, wobei der Porendurchmesser des Polymers größer als 90 Ångström ist.
Als Monoester eines Hydroxyalkylacrylates mit einer einfachen olefinischen Doppelbindung umfassen verträgliche Verbindungen 2-Hydroxyethylmethacrylat, Glycerylmethacrylat, 2-Hydroxypropylmethacrylat, Glycidylmethacrylat, 2-Hydroxyethylacrylat und 2-Hydroxypropylacrylat, sind aber nicht darauf eingeschränkt. Verträgliche Methacrylmonomere sind Methacrylsäure, Methacrylamid 5 und Methacrylnitril.
Der Polymerisationsstarter kann von dem Polymerisationsverfahren oder dem endgültigen beabsichtigten Gebrauch des Polymers abhängen. Soll das Polymer beispielsweise als festes Objekt gebildet werden, können freie Radikalstarter verwendet werden.
Bevorzugte Starter dieses Typs umfassen difunktionelle Polyester, wie 2,5-Dimethyl-2,5-bis(2-ethylhexoylperoxy)hexan oder tert.-Butylperoxypivilat.
Wird alternativ das Polymer am Schluss als Beschichtung verwendet, die in Form des Monomergemisches aufgebracht wird und in situ polymerisiert wird, kann der Starter durch Strahlung aktiviert werden, wie durch UV-Katalysatoren 2,2-Azobis(2-methylpropionitril) oder Azobisbutyronitril (AIBN). Die Starter sind nicht auf die Verwendung bei einem bestimmten Polymerisationsverfahren oder für ein bestimmtes Endprodukt eingeschränkt. Die freien Radikalstarter können beispielsweise in Beschichtungen eingesetzt werden, und die strahlungsaktivierten Initiatoren können in Form von festen Gegenständen eingesetzt werden.
Zusätzlich zu den im Wesentlichen ähnlichen Fraktionen des Monoesters und des Methacrylmonomers kann das Monomergemisch mit Spurenmengen eines längerkettigen Alkylacrylat- oder Methacrylatester-Comonomers, wie Cyclohexylmethacrylates, Trimethylpropantrimethylacrylates oder Ethylenglycoldimethacrylates, angereichert werden. Solche zusätzlichen Comonomere steigern die Polymervernetzung für Situationen, wobei zusätzliche Polymerfestigkeit gewünscht ist. Die Spurenmengen dieser Comonomere sind gewöhnlich kleiner als 0,1 Gewichtsprozent des Gesamt-Monomergemischs.
Die erfindungsgemäß verwendeten Hydrogelpolymere können zur Herstellung eines Gegenstandes geformt werden, der durch intrinsische Wirkung hinreichend vernetzt ist, dass der resultierende Gegenstand keine zusätzlichen Vernetzungsmonomere benötigt.
Zusätzliche Beispiele für biologisch abbaubare Polymere sind Poly(lactide), Polyglycolide, Polyanhydride, Polyorthoester, Polyacetale, Polydihydropyrane, Polycyanoacrylate und Copolymere davon und Polyethylenglycol. Diese können die Form von Copolymer-Hydrogelen oder vernetzten Polymernetzwerken haben, in die die Medikamente für eine verstärkte lokale Abgabe entweder während der Polymerisation eingebracht werden können, oder im Fall von bestimmten Hydrogelen, anschließend zugegeben werden. Bevorzugte Matrizen werden an die molekularen Eigen schaften des Mittels angepasst, so dass die freie Diffusion nach außen gesteuert wird.
Viele saratinbeschichtete Typen von Kathetern und anderen medizinischen Vorrichtungen können konstruiert werden und gemäß dem jeweiligen therapeutischen Bedarf, für den sie ausgelegt wurden, oder für den spezifischeren Zweck der lokalen Abgabe des mit Saratin beladenen Polymers verwendet werden. Die vorliegende Erfindung wurde mit dem unter dem Namen Blue medical Devices BV GO, erhältlich von Blue medical, verkauften Ballonkatheter getestet, ist aber nicht auf diese Art von Katheter eingeschränkt.
Weitere Beispiele
Beispiel 1
Bindung von gereinigtem vWF und Blutplättchen an Kollagen unter statischen Bedingungen
Die vWF-Bindung an Kollagen wurde in Mikrotiter-Platten im Wesentlichen wie an anderer Stelle beschrieben untersucht (Blood 1995, 85(3): 705–711). Verschiedene Kollagene, und zwar entweder Humankollagen Typ I, Typ III oder Kalbshautkollagen (Sigma) wurden über Nacht aufgebracht durch Pipettieren von 50 μl Kollagen, gelöst in 50 mM Essigsäure bei 125 μg ml^–1 in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen in Gegenwart von 200 μl PBS, so dass die Renaturierung gefördert wurde. Nach dem Blockieren der nicht-beschichteten Stellen mit BSA wurde gereinigter Human-vWF (1,25 μg ml^–1 für mit Kalbshaut- und Kollagen I beschichtete Platten; 0,625 μg ml^–1 für Kollagen III beschichtete Platten) oder verdünntes Normalplasma (Humanplasma: 1/80 auf Kollagen I und III, 1/40 auf Kalbshautkollagen; Hamster-; Maus- und Schweineplasma: 1/80 auf Kollagen III; 1/20 auf Kollagen I und Kalbshautkollagen) in die Vertiefungen in Gegenwart von Saratin gegeben und 2 Std. (verdünntes Plasma) oder 1 Std. (gereinigter vWF) inkubiert. Die Bindung von restlichem vWF an Kollagen wurde bestimmt nach einem weiteren Waschschritt mit Kaninchen-anti-vWF-Antiserum (Dako, Kopenhagen, Dänemark), konjugiert mit Meerrettich-Peroxidase, was entwickelt wurde, und die resultierende Lichtabsorption wurde bei 492 nm gemessen.
Wenn die Mikrotiterplatten entweder mit Human-Kollagen I, Humankollagen III oder Kalbshaut-Kollagen vorinkubiert wurden, ging die anschließende Inkubation von gereinigtem vWF in der Gegenwart von Saratin mit einer dosisabhängigen Hemmung der vWF-Kollagen-Bindung mit IC₅₀-Werten von 0,23 ± 0,004, 0,81 ± 0,04 und 0,44 ± 0,008 μg ml^–1 (1) einher. Wurde gereinigtes vWF durch verdünntes normales Humanplasma ersetzt, wurde die inhibitorische Wirksamkeit von Saratin aufrechterhalten (Tabelle 1). Saratin hemmte auch die Bindung von vWF in verdünntem Schweine-, Hamster- und Maus-Plasma an die verschiedenen untersuchten Kollagene mit der übereinstimmend höchsten Effizienz gegen Kollagen I (Tabelle I).
Beispiel 2
Blutplättchen-Adhäsion unter erhöhter Scherung
Angesichts der Bedeutung der Scherkräfte bei der Steuerung der vWF-abhängigen Blutplättchen-Adhäsion an Kollagen (J. Lab. Clin. Med. 1974, 83(2): 296–300), wurden Fließkammerperfusionsuntersuchungen durchgeführt, um die inhibitorische Wirkung von Saratin unter ähnlichen Fließbedingungen zu untersuchen, die man bei verletzten oder erkrankten Arterien vorfindet. Kalbshautkollagen wurde auf Kunststoff-Deckgläschen wie zuvor beschrieben (Blood 1995, 85(3): 705–711) aufgebracht. Die Perfusionen wurden in einer Parallelplattenperfusionskammer mit zwei Deckgläschenhaltern und Kammerhöhen von 0,4, 0,6 oder 1,0 mm und einer Breite von 1,0 cm unter einem Pulsfluss (Walzenpumpe, Watson, Marlow 603S, VEL, Leuwen, Belgien) bei ungefähren Scherraten von 2700, 1300 bzw. 300 s^–1 durchgeführt. Antikoaguliertes Vollblut (0,2 IU ml^–1, Heparin mit niedrigem Molekulargewicht, Clexane) wurde über die mit Kollagen beschichteten Deckgläschen für 5 min perfundiert, wonach die gespülten Deckgläschen mit Grünwald-Giemsa gefärbt wurden und durch Lichtmikroskopie und Bildanalyse wie beschrieben (Blood 1995, 85(3): 705–711) auf Blutplättchen-Ablagerung untersucht wurden, wobei eine Oberflächenbedeckung als quantitativer Parameter verwendet wurde.
Bei einer Scherrate von 2700 s^–1 hemmte Saratin die Blutplättchen-Adhäsion dosisabhängig mit einer IC₅₀ = 0,96 ± 0,25 μg ml^–1 (2). Bei einer moderateren Scherrate von 1300 s^–1 wurde eine eindeutige Rechtsverschiebung der Dosisreaktions-Kurve mit einer IC₅₀ = 5,2 ± 1,4 μg ml^–1 beobachtet (2). Bei Venenscherraten von 300 s^–1 konnte das Saratin die Adhäsion der perfundierten Blutplättchen bis zu 10 μg ml^–1 nicht hemmen (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 3
Bindungsanalyse durch Oberflächen-Plasmon-Resonanz (SPR)
Die Protein-Wechselwirkungen wurden durch SPR identifiziert und charakterisiert, wobei ein BIAcore 3000 Instrument (BIAcore, Freiburg, Deutschland) verwendet wurde. Kopplungsreagenzien wurden gemäß den vom Hersteller entwickelten Protokollen verwendet. Die Kopplung an den CM5-Sensor-Chip erfolgte über aktivierte Carboxylatgruppen an freie Aminogruppen des Human-Kollagen-Typs III (Sigma). Die pH-Wert-Beobachtung und die Kopplungs-Chemie wurden unter Standard-Bedingungen durchgeführt (Anal. Biochem. 1991, 182(2): 268–277, JAI Press Ltd., 1992). Zur Kopplung wurde das Kollagen in 10 mM Acetat-Puffer (pH-Wert 4,5) auf 0,125 μg ml^–1 verdünnt, so dass 331 Resonanzeinheiten (RE) immobilisiertes Material erhalten wurden. Diese Matrix wurde zur Untersuchung der Bindung von gereinigtem rekombinantem Saratin verwendet, das in 20 mM Hepes (pH-Wert 7,4), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 0,005% Tween 20 verdünnt wurde. Sämtliche Bindungsexperimente wurden bei 25°C durchgeführt. Die Titrationen mit Saratin wurden bei Konzentrationen im Bereich von 7,8 nM bis 10 μM durchgeführt. Die resultierenden experimentellen RE-Plateau-Werte wurden gemäß der folgenden Gleichung graphisch ausgewertet. Räq/Saratin-Konzentration = (–KA × Räq) + (KA × Rmax).
Die Titration von Saratin auf die immobilisierte Kollagenoberfläche führte zu einer konzentrationsabhängigen Bindung. Die maximale Menge des an Kollagen auf der Sensoroberfläche gebundenen Saratins führte zu einem größeren Signal als das berechnete Maximalsignal für ein 1 : 1-Bindungsmodell. Dies weist auf die Existenz von mehr als einer Bindungsstelle für Saratin an Kollagen Typ III, das durch die Beobachtung erhärtet wird, dass die Anpassung der Daten an ein 1 : 1-Bindungsmodell gemäß Langmuir keine zufriedenstellenden Ergebnisse ergab.
Die Scatchard-Analyse der SPR-Daten zeigte das Vorhandensein der beiden verschiedenen Bindungsstellen mit signifikant anderen Affinitäten für Saratin (3). Die Berechnung der Gleichgewichtskonstanten führte zu einer Dissoziationskonstante von 5 × 10^–8 M für die Hochaffinitätsstelle und 2 × 10^–6 M für die Niederaffinitätsstelle.
Beispiel 4
Blutplättchen-Aggregation
Die Spezifität für Saratin auf die Blutplättchenfunktion wurde weiter über die Aggregationsuntersuchungen an blutplättchenreichem Plasma mittels Kollagen, ADP, Ristocetin, Arachidonsäure oder dem Thromboxan-Mimetikum U46619 als Agonisten bewertet. Citriertes Blut (3,13%) aus nicht medikamentös behandelten, gesunden Freiwilligen wurde zentrifugiert (15 min, 100 g), um blutplättchenreiches Plasma zu gewinnen, dem Saratin (Endkonzentration 0 bis 200 μg ml^–1) zugefügt wurde, und zwar für 1 min vor der Induktion der Blutplättchenaggregation mit Kollagen (0,5 μg ml^–1), ADP (2,5 μM), Ristocetin (0,9 mg ml^–1), Arachidonsäure (1,0 mM) oder U46619 (1,3 μM). Die Maximalaggregation (Amplitude) über einen Zeitraum von 5 min wurde für jeden Agonist beobachtet.
Saratin konnte die maximale Aggregation gegenüber allen untersuchten Agonisten, einschließlich Kollagen, bei Endkonzentrationen bis zu 40 μg ml^–1 (Tabelle 2) nicht hemmen. Saratin konnte jedoch die kollageninduzierte Blutplättchenaggregation bei 100 μg ml^–1 partiell hemmen (nicht gezeigt), wobei es zu einer vollständigen Hemmung bei 200 μg ml^–1 kam, obgleich die Aggregation an ADP selbst bei 200 μg ml^–1 Saratin nicht beeinflusst war.
Beispiel 5
Ratten-CEA-Modell
Ein Ratten-CEA-Modell, das eine offene Technik mit Arteriotomie, die direkte Entfernung der Intima und Teile der Media und Nahtverschluss der Arterie einsetzte, wurde verwendet. Eine Gruppe von Ratten erhielt Saratin, wohingegen die andere Gruppe als Kontrollen diente. Die Endpunktmessungen umfassten 1) PLT-Adhäsion, 2) Thrombose-Rate, 3) Intima-Hyperplasie-Entwicklung. Saratin wurde direkt auf die endarterektomierte Oberfläche der Carotis-Arterie vor dem Arterienverschluss aufgebracht. Elektronenmikroskopische Aufnahmen (2000fache Vergr.) der präparierten Carotis-Arterien wurden zur quantitativen Analyse der PLT-Aggregation verwendet. Die Gesamt-PLT-Zahlen wurden mit einem standardisierten Overlay-Raster gezählt. IH- und Thrombose wurden durch computergestützte morphometrische Analyse der elastingefärbten Carotis-Arterienschnitte mit der direkten Messung des IH-Bereichs bestimmt.
Beispiel 6
Carotis-Endarterektomie-Operation
Die Tiere wurden mit Isofluran in einem Glockenkäfig ruhig gestellt, gewogen, und dann mit einer Kombination aus Ketamin (100 mg/kg) und Acepromazinmaleat (1 mg/kg) intraperitoneal anästhetisiert. Nachdem eine angemessene Anästhesie durch das Fehlen der Reaktion auf Hinterpfotenstimulation bestätigt wurde, wurden 4 cm³ Normalsalzlösung subkutan in den Bereich des oberen Mittelrückens injiziert, welche als flüssiger Bolus (10 cm³/kg) zur Kompensation von jeglichem intraoperativen Blutverlust diente. Der Halsbereich wurde dann rasiert und mit 7% Isopropylalkohol vorbereitet. Mittels Steriltechnik und eines Seziermikroskops (40fach, Sz40 Olympus, Olympus America Inc. Melville, NY) wurde ein Mittellinien-Cervixschnitt gemacht. Die darüber liegenden Muskeln wurden geteilt und der Schnitt bis herunter zur Höhe der rechten Carotis-Arterie gemacht. Die Cervix-Nerven im Bereich der Arterie wurden frei geschnitten, damit die Pharynx-Funktion erhalten blieb und eine postoperative Beeinträchtigung der Atemwege verhindert wurde.
Nach einem angemessenen Freilegen der Carotis-Arterie wurde eine proximale und distale Kontrolle an der Gabelungsstelle im Abstand von etwa 1,5 cm mit 3-0 Seidennaht-Staubinden erhalten. Mit Hilfe einer Cornea-Klinge erfolgte eine Arteriotomie, die mit Mikroscheren auf 6 mm Länge vergrößert wurde. Mit einer Nadel der Größe 27 wurde die Intima quer durch das Gefäß in zwei parallelen Linien im Abstand von etwa 2 mm gekerbt. Die Intima- und Medial-Schicht wurden mit Mikro-Pinzetten entfernt. Ratten der Saratin-Gruppe erhielten 5 μl Saratin-Lösung, die direkt auf die endarterektomierte Oberfläche aufgetragen wurde. Die Arteriotomie wurde mit einem laufenden 10-0 Monofilament-Nylonnahtmaterial (MS/9, Ethilon, Ethicon Inc. Somerville, NJ) geschlossen, wobei am distalen Ende begonnen wurde. Die distale Staubinde wurde zuerst entfernt, um die Hämostase an der Nahtlinie zu bestimmen, gefolgt von der Entfernung der proximalen Staubinde. Die Zeit der Saratin-Aufbringung betrug 5 min, welches die Zeit des Arteriotomie-Verschlusses repräsentierte. Jegliche Blutung an der Nahtlinie wurde vorsichtig mit einem Baumwollspitzen-Applikator tamponiert, bis eine Hämostase erzielt wurde. Die endarterektomierte Carotis-Arterie wurde mit einem manuellen Doppler untersucht, um die Durchgängigkeit zu bestätigen. Die darüberliegende Muskelschicht und die Haut wurden dann mit einem laufenden 3-0 absorbierbaren Nahtmaterial geschlossen.
Beispiel 7
Blutplättchen-Adhäsion
Bei den Blutplättchen-Adhäsions-Untergruppen wurden die Ratten anästhetisiert, und die endarterektomierten Carotis-Arterien wurden geerntet und in einer 4% Glutaraldehyd-Lösung 3 Std. oder 24 Std. nach der Carotis-Endarterektomie fixiert. Während des Ernte-Verfahrens wurden die Carotis-Segmente längs entlang der Stelle des Nahtverschlusses geöffnet, wobei dadurch der endarterektomierte Bereich freigelegt wurde. Die Arterien wurden dann mit Osmiumtetroxid nachfixiert, in einer Alkoholverdünnungsreihe dehydratisiert, bis zum kritischen Punkt mit CO₂ (1072 psi und 31,1°C) getrocknet, mit Gold-Palladium beschichtet und in dem Rasterelektronenmikroskop (JEOL JSM 5410, JEOL, USA Peabody, MA) untergebracht. Die endarterektomierten Bereiche wurden bei 2000facher Vergrößerung durchmustert und es wurden Photographien erhalten. Die Photographien wurden auf Übereinstimmung untersucht, und in einer Kollage angeordnet, wobei ein größerer Bereich sichtbar gemacht werden konnte als es mit einem einzelnen Feld des Rasterelektronenmikroskopmonitors möglich war. Sobald die Kollage der Photographien zusammengestellt worden war, wurde sie mit einem durchsichtigen Overlay-Raster bedeckt. Das gleiche Overlay-Raster wurde für sämtliche Proben-Photographien verwendet. Mit Hilfe von 116 Quadraten wurde die Gesamtzahl der Blutplättchen in jeder Photographie gezählt. Die Zahl 116 ist die höchste Zahl an Quadraten, die auf sämtlichen Photographie-Kollagen übereinstimmend gezählt werden konnte. Die Blutplättchen wurden durch zwei Blind-Beobachter gezählt.
Beispiel 8
Intima-Hyperplasie
Zwei Wochen nach der Carotis-Endarterektomie wurden die Ratten in der Intima-Hyperplasie-Gruppe anästhetisiert und die endarterektomierte Carotis-Arterie wurde freigelegt. Das Abdomen wurde in der Mittellinie geöffnet, und die distale Aorta und die Vena cava inferior wurden freigelegt. Die Vena cava wurde durchgeschnitten, und in die distale Aorta wurde ein Katheter der Größe 20 zur Infusion von Normal-Salzlösung bei 100 mm Hg eingeführt, bis der Ausstrom aus der Vena cava klar lief. Anschließend wurden 10% gepuffertes Formalin bei 100 mm Hg in einem gleichen Volumen infundiert, so dass die Perfusions-Fixierungs-Technik vervollständigt wurde. Ein 1 cm Abschnitt der operierten Carotis-Arterie wurde frei präpariert und in 10% Formalin bis zur weiteren Verarbeitung für die Histologie untergebracht. Die Arterien wurden in Paraffinblöcke aufgenommen, geschnitten und mit Verhoeff's und Van Gieson's Färbung auf Elastin gefärbt. Es wurden mehrere Schnitte in Abständen von 3 um entnommen, die jeweils entlang der Strecke des kontinuierlichen 10-0-Nylonnaht-Arteriotomie-Verschlusses verliefen, so dass der Schnittbereich standardisiert wurde. Die elastingefärbten Objektträger wurde mit einer KODAK DC 120 Zoom-Digitalkamera (Eastman KODAK Company, Rochester, NY) photographiert. Sämtliche thrombierten Schnitte wurde zu diesem Zeitpunkt bemerkt. Nicht-thrombierte Bilder wurden in einen Computer geladen, und die Lumenbereiche der Carotiden wurden mit dem Image) Software Program, Version 0,99i von National Institutes of Health (Bethesda, MD), analysiert. Dieses Software-Paket ermöglichte uns die Beschreibung des Innenbereichs der Intima-Hyperplasie und somit die Gewinnung einer genauen Messung des Querschnitts der Gefäßlumens.
Ebenfalls wurde die Außenfläche der Intima-Hyperplasie bestimmt. Der Unterschied zwischen den beiden Bereichen (Außenbereich der Intima-Hyperplasie minus dem tatsächlichen Lumen) wurde als der absolute Bereich der Intima-Hyperplasie bestimmt. Da der Arterienquerschnitt einzelne Form-Variationen aufwies, wurden die Werte ausgedrückt als das Verhältnis des absoluten Bereichs der Intima-Hyperplasie zur Außengrenze der Intima-Hyperplasie, und wurde beschrieben als Prozentsatz Lungenstenose. Dieses Verhältnis veranschaulicht den Anteil des Lumenbereichs, der von Intima-Hyperplasie eingenommen wird, und ermöglichte den Vergleich der Arterienquerschnitte verschiedener Größen (4). Es wurde eine minimale Variabilität zwischen den Messungen mit zwei Blind-Beobachtern beobachtet.
Beispiel 9
Blutungszeiten und Zahl der Blutplättchen
Zur Bestimmung der Auswirkungen von Saratin auf die systemischen Blutplättchenzahlen und die Blutungszeiten wurden die Blutplättchenzahlen und Blutungszeiten von 12 Ratten bestimmt. Nötigenfalls wurde eine präoperative Blutprobe mit etwa 1 bis 1,5 cm³ aus jeder Ratte gewonnen, was einen signifikanten Anteil des Gesamtblutvolumens einer Ratte darstellt. Diesbezüglich ist es vernünftig, eine Abnahme der postoperativen Blutplättchenzahlen von Kontroll- und Saratin-Ratten zu erwarten. Zur Bestimmung der Auswirkungen von Saratin auf die Blutplätchenzahlen bestimmten wir den Unterschied der Blutplättchenzahlen für jede Ratte durch Subtrahieren der präoperativen Blutplättchenzahl von der postoperativen Blutplättchenzahl, so dass ein Differenzwert erhalten wurde. Unterschiede der Plättchenzahlen wurden mit einer 2 × 2 Faktor-Anordnung von Behandlungen in einem ANOVA-Modell analysiert, was keine statistische Signifikanz der Unterschiede der Blutplättchenzahlen zwischen Kontroll- und mit Saratin behandelten Ratten ergab. Bei sämtlichen Ratten wurden die Blutplättchenzahlen und die Blutungszeiten vor der Operation bestimmt. Sechs Ratten durchliefen eine Carotis-Endarterektomie und wurden 3 Std. nach der Operation geerntet, wobei die Blutungszeiten und die Blutplättchenzahlen gemessen wurden, und die verbleibenden 6 Ratten wurden 24 Std. nach der Operation geerntet, wobei die Blutungszeiten und die Blutplättchenzahlen gemessen wurden. Drei der Ratten in jeder Zeitgruppe erhielten topisches Saratin, und die verbleibenden 3 Ratten dienten als Kontrollen.
Die Blutungszeiten wurden durch Durchschneiden der distalen 2 mm des Rattenschwanzes und Eintauchen von etwa 4 cm des Schwanzes in eine Lösung von phosphatgepufferter Lösung bei 37°C bestimmt. Die Menge der verstrichenen Zeit von der Schwanz-Sektion bis zum Beginn der Blutung wurde gemessen, und wurde als Blutungszeit bezeichnet. Die Blutplättchenzahlen wurden bestimmt, indem eine 1 bis 1,5 cm³ Blutprobe aus der internen Jugularvene entnommen und in einem Coulter STKS Blutanalysegerät untersucht wurde, und die Ergebnisse sind angegeben × 10³.
Beispiel 10
Statistische Verfahren
Es sind die Mittelwerte ± Standardabweichungen angegeben. Es erfolgte eine ungepaarte t-Testanalyse mit dem Stat-View Programm (SAS Institute Inc. Cary, NC 27513) Version 5.0, um die mit Saratin behandelten und die Kontrollgruppen auf die Anzahl der haftenden Blutplättchen, prozentuale Lumenstenose und Blutungszeiten zu vergleichen. Eine Chi-Quadrat-Analyse des Wahrscheinlichkeitsverhältnisses wurde zur Bewertung des Chancen-Verhältnisses zur Thrombose-Entwicklung zwei Wochen nach der Carotis-Endarterektomie verwendet. Eine 2 × 2-Faktoranordnung der Behandlungen in einem ANOVA-Modell wurde zur Bewertung der Unterschiede zwischen präoperativen und postoperativen Blutplättchenzahlen verwendet.
Beispiel 11
Versuchstiere
Sprague-Dawley-Ratten (350–400 g) wurden in Carotis-Endarterektomie-Gruppen auf der Basis von zwei Hauptzielen unterteilt. 1) Die Bewertung der Blutplättchen-Adhäsion und 2) die Bewertung der Lumenstenose aufgrund von Intima-Hyperplasie und Thromboserate. Innerhalb dieser beiden Zielpunkte wurden die Ratten in Kontroll- und mit Saratin behandelte Tieren unterteilt. Sämtliche Ratten durchliefen eine Carotis-Endarterektomie (siehe unten), die mit Saratin behandelten Ratten erhielten eine topische Anwendung einer 5 μl Lösung von Saratin auf die Lumenoberfläche des Carotis-Arterie unmittelbar nach der Entfernung der Intima/Media-Schicht. Die Blutplättchen-Adhäsionsgruppe bestand aus der elektronenmikroskopischen Bewertung 3 Std. nach der Carotis-Endarterektomie (n = 17) und 24 Std. nach der Carotis-Endarterektomie (n = 19). Die Intima-Hyperplasie-Gruppe (n = 25) wurde 2 Wochen nach der Carotis-Endarterektomie geerntet.
Beispiel 12
Präparation des mit Saratin beschichteten Hydrogel-Katheters
Die Oberflächen der Materialien auf PA-12-Basis wurden durch Eintauchen der Vorrichtungen in eine Lösung von 2 Mol.-% Makroinitiator (Poly(octadecen-alt-maleinessigsäureanhydrid) mit einem Perester (11–16 Mol.-%), gelöst in Isopropanol und 0,5 Mol Ethylenglycoldimethylacrylat (EGDMA)/1 Mol Makroinitioator aktiviert. Nach dem Trocknen der Makroinitiator-/EGDMA-Beschichtung wurde die Beschichtung für weitere 5 bis 10 min bei 120°C erwärmt, was die Verbesserung der Fixierung des Makroinitiators an die Oberfläche unterstützte, so dass die Vernetzung verbessert wurde.
Zur Optimierung der Beschichtungsbedingungen wurden Hydrogelbeschichtungen auf einem PA-12-Träger-Flächengebilde verwendet. Vor der Beschichtung wurden die Flächengebilde mit Isopropanol oder Aceton gewaschen und getrocknet.
Ballonkatheter vom Typ Blue Medical Devices GO (RX PTCA-Katheter) aus Vestamid (PA-12) wurden zur Beschichtung mit Hydrogel verwendet. Wässrige Lösungen von 100 ml 5 Mol.-% Acrylsäure und 0,2 Bis- 0,8 Mol.-% Methylen-bis-acryl wurden gemischt und zur Beschichtung von Flächengebilden und Kathetern verwendet. Nach der Polymerisation wurde die beschichtete Vorrichtung mit Wasser und weitere 24 Std. in PBS-Puffer gewaschen.
Danach wurde das Polymer im Ofen bei 60 bis 80°C für 0,5 bis 3 Std. gewärmt.
Die Dicke der getrockneten Hydrogelbeschichtungen war im Bereich von 1 bis 4 μm, die Quellung des Hydrogels in wässriger Lösung reichte von 10 bis 50 g Hydrogel feucht/1 g Hydrogel trocken.
Beim Eintauchen (30 min) in eine gepufferte Saratin-PBS-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,4 wurde ein Konzentration von 50 μgml verwendet.
Organische Lösungsmittel wurden zur Herstellung der Beschichtungslösungen verwendet, wenn diese mittels Standard-Sprühbeschichtungsausrüstung im kleinen Maßstab, wie von EFD erhältlich, auf einen Ballonkatheter gesprüht wurden.
Figurenlegenden
1. Wirkung von Saratin auf die Bindung von gereinigtem Human-vWF an Human-Kollagen der Typen I (Kreise) und III (Quadrate) und Kalbshaut-Kollagen (Dreiecke). IC₅₀ mit Typ I = 0,23 ± 0,004 μg ml^–1, Typ III = 0,81 ± 0,04 μg ml^–1 & Kalbshaut-Kollagen = 0,44 ± 0,008 μg ml^–1.
2. Wirkung der Scherung auf die Hemmung durch Saratin der Plättchenaggregatbildung auf Human-Kollagen Typ III in einer Fließkammer in vitro. Die Kreise zeigen eine Scherrate von 2700 s^–1 (IC₅₀ = 0,96 ± 0,25 μg ml^–1), wohingegen die Quadrate eine Scherrate von 1300 s^–1 (IC₅₀ = 5,2 ± 1,4 μg ml^–1) angeben.
3. Die Scatchard-Analyse der Saratin-Bindung an immobilisiertes Human-Kollagen wie es durch die Oberflächen-Plasmon-Resonanz erfasst wurde, zeigte die Gegenwart einer hochaffinen (K_d = 5 × 10^–8 M, durchgezogene Linie) und einer niederaffinen (K_d = 2 × 10^–6 M, unterbrochene Linie) Bindungsstelle für Saratin an Kollagen III:
4. Anzahl der Blutplättchen, die an der freiliegenden Subendotheloberfläche 3 Std. nach der Carotis-Endarterektomie hafteten, unter Vergleich der Gruppe mit Saratin-Applikation (n = 7) und Kontrollgruppe (n = 10). Die Daten sind Mittelwerte ± SE. Die Saratin-Gruppe erhielt 5 μl Saratin-Lösung, die topisch auf die freiliegende Subendotheloberfläche aufgebracht wurde. Der Stern veranschaulicht einen P-Wert von 0,05.
5. Anzahl der Blutplättchen, die an der freiliegenden Subendotheloberfläche 24 Std. nach der Carotis-Endarterektomie hafteten, unter Vergleich der Gruppe mit Saratin-Applikation (n = 9) und Kontrollgruppe (n = 10). Die Daten sind Mittelwerte ± SE. Die Blutplättchen wurden mit dem Rasterelektronenmikroskop gezählt. Die Saratin-Gruppe erhielt 5 μl Saratin-Lösung, die topisch auf die freiliegende Subendotheloberfläche aufgebracht wurde. Der Stern veranschaulicht einen P-Wert von 0,01.
6. Elektronenmikroskopische Aufnahme (2000fach) einer endarterektomierten Ratten-Carotis-Arterie 3 Std. nach der Carotis-Endarterektomie. A, Kontrolloberfläche. B, Oberfläche, die topisches Saratin (5 μl) erhielt. Die Kontrolloberfläche zeigt abundante zelluläre Elemente, wie u. a. Fibrinstränge, rote Blutzellen und Blutplättchen. Die mit Saratin behandelte Oberfläche zeigt eine deutliche Abnahme der zellulären Elemente.
7. Elektronenmikroskopische Aufnahme (2000fach) einer endarterektomierten Ratten-Carotis-Arterie 24 Std. nach der Carotis-Endarterektomie. A, Kontrolloberfläche. B, Oberfläche, die topisches Saratin (5 μl) erhielt. Die Kontrolloberfläche zeigt zahlreiche rote Blutzellen und Blutplättchen. Die mit Saratin behandelte Oberfläche zeigt eine deutliche Abnahme der Blutplättchen-Adhäsion.
8. Prozentuale Lumenstenose, sekundär zur Intima-Hyperplasie 2 Wochen nach der Carotis-Endarterektomie. Es sind eine Saratin- (n = 15) und eine Kontroll-Gruppe (n = 10) gezeigt. Die Saratin-Gruppe erhielt 5 μl Saratin, das topisch auf die freiliegende Subendotheloberfläche aufgebracht wurde. Der Stern veranschaulicht einen P-Wert von 0,004.
9. Querschnitte durch Carotis-Arterien, die die Reduktion der Intima-Hyperplasie in mit Seratin behandelten Arterien (B) verglichen mit der unbehandelten Kontrolle (A) in der Ratte zeigt, IH = Intima-Hypreplasie
Tabelle 1. Saratin-IC₅₀-Konzentrationen, die zur Hemmung der Blutplättchen-Adhäsion in PRP aus verschiedenen Speziesbindungen an Human-Kollagen der Typen I & III und Kalbshaut-Kollagen nötig sind.
Tabelle 2. Wirkung von Saratin auf die maximale Blutplättchen-Adhäsion (%) in PRP, induziert durch verschiedene Agonisten, mit den angegebenen Endkonzentrationen an Reagenzien.
Tabelle 3. Präoperative und postoperative Blutungszeiten und Blutplättchen-Zahlen.
Tabelle 1
Tabelle 2
Tabelle 3

Claims

Verwendung des Polypeptids Saratin zur Herstellung eines Arzneimittels zur Hemmung der Ansammlung von Blutplättchen nach Gefäßverletzungen oder Endarterektomie, umfassend das Verabreichen einer therapeutisch wirksamen Menge Saratin, die die Adhäsion der Blutplättchen verhindert, an das Gefäßgewebe, wodurch Thrombose und Restenose verhindert werden.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei die Gefäßverletzung einhergeht mit Atherosklerose, Herztransplantationvaskulopathie, koronärer Restenose nach einem Eingriff am Herzen, Ballonangioplastie, Unterbringung eines Stents, Rotablation, Endarterektomie, einschließlich Carotid-Endarterektomie, Dialyse-Transplantat-Shunts und anderen Transplantat-Anastomosen, instabiler Angina, akutem Myokardinfarkt, Schlaganfall, gutartiger Hypertrophie oder gutartiger Prostata-Hypertrophie.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Saratin lokal über einen Katheter verabreicht wird, oder wobei Saratin in den endoluminalen Belag eines Katheters eingebracht wird, der direkt lokal in das Gewebe eingeführt wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Saratin in ein lokal verabreichtes Polymer eingebracht wird, das eine lokal verzögerte Freisetzung von Saratin ermöglicht.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei das polymerformulierte Saratin lokal über einen Kathether verabreicht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Saratin in einen Stent oder eine Stent-Beschichtung eingebracht wird, die auf oder in dem Gewebe lokal untergebracht wird.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Saratin in ein endovaskulares Transplantat oder eine endovaskulare Transplantatbeschichtung eingebracht wird, die auf oder in dem Gewebe lokal untergebracht wird.