DE60108256T3

DE60108256T3 - Allergen-assay auf basis von mikroanordnungen

Info

Publication number: DE60108256T3
Application number: DE60108256.7T
Authority: DE
Inventors: Reinhard Hiller; Christian Harwanegg; Manfred MÜLLER
Original assignee: Phadia Multiplexing Diagnostics GmbH
Current assignee: Phadia Multiplexing Diagnostics GmbH
Priority date: 2000-10-03
Filing date: 2001-10-03
Publication date: 2014-04-10
Anticipated expiration: 2021-10-04
Also published as: DE60108256D1; US20050101031A1; CA2424661C; ZA200302172B; ATE286597T1; ES2234909T3; CN1527943A; HUP0303663A3; EE05465B1; HU228066B1; DK1322960T3; CA2424661A1; HK1066276A1; HUP0303663A2; PT1322960E; EP1322960B2; WO2002029415A1; CZ20031219A3; CZ305183B6; EP1322960B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion eines Immunglobulins E (IgE), das in einer Probe an ein Allergen bindet, sowie ein Verfahren zur In-vitro-Diagnose von Allergien bei einem Patienten.
Eine Allergie ist eine vom Immunsystem des Körpers erzeugte Reaktion auf eine Substanz, die man normalerweise als harmlos erachten würde. Es ist diese Antwort, die die Symptome verursacht, die als allergische Reaktionen klassifiziert werden. Eine Allergie ist daher kein Versagen des Immunsystems, sondern vielmehr dessen Überaktivität. Die Antwort einer allergischen Person auf ein Allergen kann vielerlei Symptome erzeugen. Einige Personen erleiden Symptome, wie Asthma, Ekzem, Ausschläge, Augenjucken, Sinusitis, Nasenverstopfung oder Nasenrinnen und Heuschnupfen, es können jedoch auch ernstere Symptome auftreten. Bei Allergien, wie jenen auf Gifte, Nüsse und Schalentiere, kann beispielsweise ein potentiell lebensbedrohlicher Zustand, anaphylaktischer Schock genannt, auftreten. Dies geschieht, wenn der Körper eine so starke Reaktion erzeugt, dass der Hals anschwillt, der Blutdruck abfällt, und die Person Schwierigkeiten beim Atmen hat. In einigen Fällen kann diese Art von Reaktion tödlich sein.
Das Auftreten von Allergien in den entwickelten Ländern (z. B. in Europa, Nordamerika und Japan) nimmt zu. Schätzungen zufolge sind 20 bis 50% der Bevölkerung betroffen. Man weiß nun, dass Allergien das Ergebnis eines Ungleichgewichts im T-Zellen-Kompartiment des Immunsystems sind. Genauer gesagt, gehen Allergien mit einer gesteigerten Aktivität der so genannten T-Helfer-2(Th2)-Zellen im Vergleich zu T-Helfer-1(Th1)-Zellen einher, was zu einer gesteigerten IgE-Produktion führt.
IgE (Immunglobulin E) ist mindestens eine der Substanzen, die allergische Reaktionen verursachen. IgE, das für ein Allergen spezifisch ist, wird im Blut normalerweise nicht nachgewiesen und wird nur dann erzeugt, wenn eine Person gegenüber einer Substanz sensibilisiert wird. Substanzen, die eine Allergie bewirken (Allergen genannt), erzeugen ein spezifisches IgE, das für dieses einzigartig ist und nur mit diesem reagiert. Diese Reaktion zwischen IgE und dem Allergen ist wie ein Schloss und ein Schlüssel. Bei Kombination mit dem Allergen bewirkt IgE, dass Zellen Chemikalien (z. B. Histamine) freisetzen, die die Symptome der Allergie bewirken. Eine Person kann spezifisches IgE für mehr als eine Substanz aufweisen und daher auf mehr als eine Substanz allergisch sein. Die Ergebnisse für den IgE-Test werden als eine Stufe ausgedrückt, die anzeigt, wieviel für die Substanz, auf die getestet wurde, spezifisches IgE im Blut vorhanden ist. Je höher die Stufe, desto größer ist die Wahrscheinlichkeit, dass der Patient allergisch ist. Im Laufe der letzten Jahrzehnte wurden allergische Erkrankungen unter Verwendung kaum gereinigter Extrakte, die aus den Haupt-Allergen-Quellen stammten, diagnostiziert. Offensichtlich sind diese rohen Mischungen komplex und in ihrer Zusammensetzung variabel. Infolgedessen kann das diagnostische Potential dieser Extrakte unterschiedlich sein und zu falsch negativen Ergebnissen führen. Letztere wurden vor allem der Instabilität von Allergenen in Extrakten zugeschrieben. Ein weiterer Nachteil der Verwendung von Extrakten zur Diagnostizierung von Allergien ist die schlechte Standardisierung von handelsüblichen Produkten im Hinblick auf ihre allergene Zusammensetzung. Einheiten, die die Stärken ausdrücken, und die Methoden der Berechnung sind für jede Firma auf dem Markt verschieden. Infolgedessen sind diagnostische Produkte verschiedener Firmen kaum vergleichbar.
Die wichtigsten krankheitsbezogenen Komponenten, die Haupt-Allergene, wurden im Laufe der letzten Jahrzehnte identifiziert, jedoch wird ihre Quantifizierung nicht als Basis für die Standardisierung von Allergen-Extrakten verwendet. Monoklonale Antikörper gegen die meisten der Haupt-Allergene sind jetzt verfügbar.
Das Testen auf Allergien gemäß bekannter Verfahren ist kein einfacher Prozess. Diese Verfahren können nützliche Vorgehensweisen sein, wenn eine Anamnese gemacht wird, um festzustellen, welche Tests am geeignetsten wären. Es gibt jedoch nur sehr wenige anerkannte medizinische Tests, mit denen Allergien identifiziert werden können, und im Allgemeinen sind diese auf klinische Labors oder Spezialisten-Zentren beschränkt. Obgleich die Diagnose einer Atopie oder einer Allergie durch einen qualifizierten Arzt oder Allergie-Spezialisten relativ leicht durchführbar ist, sind oft weitere Tests notwendig, um diese zu bestätigen.
Es stehen verschiedene Arten von Allergie-Tests zur Verfügung:

1. ”Skin Prick”-Testen Vermutete Allergene werden direkt unter die Hautoberfläche injiziert, und die Reaktion wird von einer qualifizierten Krankenschwester oder einem Arzt beobachtet. Während sich die Reaktion entwickelt, entsteht eine Rötungszone, und je stärker die Reaktion, desto größer ist die Zone. Das Haut-Testen ist ziemlich empfindlich, auch wenn nicht alle Allergien mit dieser Methode identifiziert werden können.
2. Testen mit einem Pflaster (”Patch”-Testen) Das ”Patch”-Testen kann in Fällen von Kontakt-Dermatitis nützlich sein. Die Testsubstanzen werden gewöhnlich auf die von einem Pflaster bedeckte Haut aufgetragen und 48 Stunden dort belassen. Eine positive Reaktion erzeugt eine kleine Ekzem-Fläche. Auch hier wird die Reaktion von einer qualifizierten Krankenschwester oder einem Arzt beobachtet.
3. Alternatives Allergie-Testen Es gibt viele alternative Arten von Allergie-Tests, und leider sind nur wenige genau oder von der Medizin anerkannt. Diese alternativen Tests sind oft irreführend und auch kostspielig.
4. Vega-Test Der Vega-Test ist ein elektrischer Test, der als bioenergetisch regulierende Technik beschrieben wird. Die Maschine misst die Leitfähigkeit mit Hilfe einer Wheatstone-Schaltung. Elektroden werden mit Akupunktur-Punkten verbunden oder in der Hand des Patienten gehalten. Verschiedene Lösungen werden dann in eine Metall-Schale gegeben. Die Maschine wird anschließend geeicht, indem eine Glasphiole, die eine toxische Substanz enthält, in die Schale gegeben wird. Die Phiole bewirkt eine Verringerung der elektrischen Leitfähigkeit. Es werden dann andere Substanzen in die Schale gegeben, und wenn sie eine ähnliche Ablesung ergeben, wird dies als allergische oder ”sensible” Reaktion berichtet. Diese Technik findet in Bioläden weit verbreitete Verwendung, ihr Wert ist jedoch unbewiesen, und es gibt keine gültigen Versuche, die die Behauptungen untermauern.
5. Leukozytotoxischer Test Beim leukozytotoxischen Test werden die weißen Blutkörperchen des Patienten mit einem Extrakt eines speziellen Nahrungsmittels gemischt, und danach werden die Zellen auf verschiedene Weise gemessen, um einen Nachweis für irgendeine Art von Veränderung zu finden. Es gibt eine große Anzahl falsch positiver und falsch negativer Reaktionen, und die ”American Academy of Allergy” kam zu dem Schluss, dass es keinen Beweis dafür gibt, dass der Test für die Diagnose von Nahrungsmittel- oder Inhalationsallergie wirksam ist.
6. Haaranalyse Eine weitere Form von Test ist die Haaranalyse. Das Haar kann auf das Vorhandensein toxischer Metalle, wie Blei, Quecksilber und Cadmium oder geringe Mengen an Selen, Zink, Chrom, Mangan und Magnesium analysiert werden. In der Gerichtsmedizin ist die Schwermetallvergiftung allgemein anerkannt und dokumentiert, und die Haaranalyse kann eine Einwirkung von Metallen aufzeigen. Die Haaranalyse als Mittel zur Diagnostizierung einer Allergie durch Methoden wie ”Rutengehen” wurde jedoch niemals für gültig erklärt.
7. Angewandte Kinesiologie Proben von Nahrungsmitteln werden unter die Zunge gegeben oder in einem Glasbehälter in der Hand des Patienten gehalten. Der Patient wird dann gebeten, seinen freien Arm gegen den des Prüfers zu drücken. Wenn eine allergische Reaktion festgestellt wird, so manifestiert sich dies als eine verringerte Muskelreaktion, und es fällt dem Patienten schwer, den Arm zu heben. Diese Technik hält einer Doppelblind-Studie nicht stand. Desweiteren gibt es verschiedene In-vitro-Methoden zur Diagnostizierung von Allergien, welche das Vorhandensein von IgE- oder IgG-Antikörpern im Blut eines Patienten nachweisen.
8. Herkömmliche Methoden, wie ELISA oder Western Blots werden verwendet, um im Serum eines Patienten vorhandene Antikörper (IgE) mit Hilfe (rekombinanter) Allergene nachzuweisen.
9. Radio-Allergo-Sorbens-Test (RAST^®): Bei dieser Vorgangsweise wird ein spezifisches Allergen mit einer Papier-Scheibe gekoppelt: immunspezifisches JgE, sofern es im Test-Serum (des Patienten) vorhanden ist, wird an die Scheibe binden; die Detektion erfolgt mittels radioaktiv markiertem anti-IgE. Verschiedene Bewertungssysteme, die die Testergebnisse mit der absoluten Bindung einer negativen Kontrolle vergleichen, sind in Verwendung. Im Allgemeinen folgt auf das modifizierte RAST^®-Verfahren eine Inkubation über Nacht, was zu größerer Empfindlichkeit führt.
10. Quantitative IgE-Inhibierungs-Versuche auf RAST-Basis, bei welchen Allergen-Extrakt auf Nitrozellulose-Streifen punktförmig aufgetragen wird. Aliquots der Seren werden mit einer Mischung aus spezifischen rekombinanten Allergenen vorinkubiert; anschließend wird diese Mischung auf den Nitrozellulose-Streifen inkubiert. Gebundenes IgE wird mit anti-human-IgE-Antikörpern nachgewiesen. In einem letzten Schritt wird der Prozentsatz der Hemmung der IgE-Bindung der natürlichen Extrakte nach einer Präabsorption mit rekombinanten Allergenen berechnet.
11. Zellulärer Antigen-Stimulations-Test (CAST), gemäß welchem basophile Zellen des Patienten mit Interleukin-3 und Allergen stimuliert werden, gefolgt von einer Messung der ”de novo” erzeugten und freigesetzten Sulfidoleukotrien (SLT) In einem ELISA.
12. UniCAP: Rekombinante Allergene werden auf einer Festphasen-Struktur immobilisiert; anschließend wird die Bindung von im Serum eines Patienten vorhandenen Antikörpern an die Allergene nachgewiesen.

Diese Verfahren erfordern jedoch eine Vielzahl einzelner Versuchsschritte, um eine größere Anzahl (z. B. 100) verschiedener Allergene zu testen. Desweiteren zeigen diese oben erwähnten Tests keine ausreichend hohe Empfindlichkeit und Zuverlässigkeit und sind sehr zeitaufwändig. Auch sind die Mengen an Proben (z. B. Serum eines Patienten) sowie an gereinigten, gegebenenfalls rekombinanten, teuren Allergenen, die zur Durchführung dieser Tests benötigt werden, groß.
Die US 4.444.879 betrifft Verfahren und Vorrichtungen für Immunoassays zur Bestimmung des gesamten Immunglobulins und IgE. Hier werden Allergene extrahiert und in Polymer-beschichteten Vertiefungen einer Mikrotiterplatte immobilisiert. Die zu analysierende Probe wird dann in die Vertiefung gegeben, und ein herkömmlicher Immunoassay wird durchgeführt.
In der EP 0 556 745 A1 wird ein Verfahren zum Nachweis von Anti-Weizen-Protein-IgE-Antikörpern in Körperflüssigkeiten beschrieben, wobei ein Weizenallergen-Extrakt an einer festen Phase immobilisiert wird, bei der es sich beispielsweise um chromatographisches oder Kapillar-Material oder Faser, Glas, Nylon, Zellulose oder Derivate davon in Form von Glaskügelchen, Mikropartikel, Blätter oder Vertiefungen einer Mikrotiterplatte handelt. Auch hier wird ein herkömmlicher Immunoassay durchgeführt, um Antikörper in einer Probe eines Patienten nachzuweisen.
Die US 3720.760 betrifft ein Verfahren zum Analysieren von Körperflüssigkeit auf Immunglobuline. Auch hier werden handelsübliche Allergen-haltige Extrakte an einem wasserunlöslichen Polymer befestigt; anschließend wird ein herkömmlicher Immunoassay durchgeführt.
Die US 4.849.337 betrifft ebenfalls ein Verfahren zum Identifizieren Allergen-spezifischer IgE-Mengen in einem Patienten-Serum durch Konjugieren des IgEs im Serum mit Allergenen, die an einem unlöslichen Träger haften. Hier kann es sich wiederum beim Allergen um ein Extrakt oder ein direkt von Pollen, Stäuben, Tieren usw. stammendes Allergen handeln.
Die Detektion Allergen-spezifischer Immunglobuline mittels ELISA mit Extrakten von Allergenen, die an eine feste Oberfläche gebunden sind, ist in der US 4.444.879 A und in der EP 0 556 745 A offengelegt. Mendoza et al. (Biotechniques 27(4) (1999)) beschreiben einen ELISA auf Microarray-Basis mit hohem Durchsatz.
Diese herkömmlichen Immunoassay-Methoden sind jedoch nicht dazu geeignet, einen Patienten auf das Vorhandensein von Allergien zu testen, da die Menge der verschiedenen Allergien auf über ein paar Hundert angestiegen ist und ständig zunimmt. Der zum Analysieren eines Patienten-Serums auf alle möglichen und seltenen Allergien notwendige Zeit- und Arbeitsaufwand ist zu hoch, und derartige Tests werden nicht in Labors durchgeführt, in denen täglich die Proben von einigen hundert Patienten analysiert werden müssen.
Daher ist es das Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Detektion eines Immunglobulins E (IgE) vorzusehen, welches an ein Allergen in einer Probe bindet, wobei das Verfahren nicht die oben erwähnten Nachteile aufweist, in kurzer Zeit mit einer nur geringen Menge an Proben und Allergenen durchgeführt werden kann, sehr verlässlich und empfindlich ist und, was von höchster Wichtigkeit ist, die Detektion einer praktisch unbegrenzten Zahl von Allergenen in einem einzigen Test ermöglicht.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur In-vitro-Diagnose von Allergien bei einem Patienten ohne die oben erwähnten Nachteile vorzusehen.
Das oben erwähnte Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere gereinigte einzelne Allergene auf einem Microarray-Chip immobilisiert werden; anschließend wird die Probe mit den immobilisierten Allergenen inkubiert, so dass Immunglobuline, die für die Allergene spezifisch sind, an das spezifische Allergen binden, und danach die Immunglobuline E (IgE), die an die spezifischen immobilisierten Allergene gebunden sind, detektiert werden.
Microarrays wurden in jüngster Zeit für eine Anzahl von DNA-Manipulationstechniken verwendet, die seit langem unter den Wissenschaftern etabliert sind. Diese DNA-Chips sind mittlerweile in einer Anzahl verschiedener Formate verfügbar, und werden letztendlich die Art und Weise, in welcher Versuche in der üblichen Laborarbeit entworfen werden, verändern. Die In-vitro-DNA-Diagnose ist weniger zeit- und arbeitsaufwändig geworden, da diese neue Technologie eine Test-Komplexität bei hohem Durchsatz ermöglicht. Infolgedessen werden auf dem Gebiet der Proteom-Forschung klassische Festphasen-Substrate, wie Mikrotiter-Platten, Membran-Filter und Mikroskop-Objektträger in das Microarray-Format mit hoher Dichte überführt. Die neue und vielseitige Protein-Array-Technologie ermöglicht letztendlich ein Screenen auf Gen-Expression und molekulare Wechselwirkungen mit hohem Durchsatz (Walter et al., Curr. Opin. Microbiol. 2000 Jun; 3(3): 298–302; Emili & Cagney, Nat. Biotechnol. 2000 Apr; 18(4) 393–7). Kürzlich wurde das Konzept der Protein-Arrays zur Verwendung bei immunologischen Tests angenommen.
Ein Biochip wird als geeignet beschrieben, gemultiplexte enzymgekoppelte Immunosorbens-Tests (ELISAs) mit hohem Durchsatz (high throughput, HT) ermöglichen zu können. Diese Biochips können beispielsweise aus einer optisch flachen Glasplatte bestehen, die 96 Vertiefungen enthält, die durch eine umschließende hydrophobe Teflon-Maske gebildet werden. Es sind jedoch auch andere Materialien und Formen von Biochips bekannt und in Verwendung. Versuche zeigen, dass die spezifische Multiplex-Detektion von Protein-Antigenen, die auf einem Glas-Substrat in Reihen angeordnet (”arrayed”) sind, möglich ist. Eine weitere Anwendung dieses neuen Hochdurchsatz-Screening(HTS)-Formats umfasst die direkte zelluläre Protein-Expressions-Profilierung, gemultiplexte Tests zur Detektion infektiöser Agentien und die Krebs-Diagnostik (Mendoza LG et al., Biotechniques 1999 Oct; 27 (4): 778–80).
Bei diesen bekannten Microarray-Chip-Methoden zum Testen von Proteinen sind jedoch die Antikörper am Microarray-Chip immobilisiert. Überraschenderweise zeigte es sich, dass es möglich ist, nicht nur die Antikörper an den Microarray-Chip zu binden, sondern auch Allergene, bei denen es sich um die den spezifischen Antikörpern entsprechenden Antigene handelt, insbesondere IgE bzw. IgG. Diese Tatsache ist besonders überraschend, da funktionelle Allergene eine spezielle Sekundärstruktur aufweisen, die bei Bindung in solch hoher Dichte an eine feste Phase, wie den Microarray-Chip, modifiziert werden kann. Diese Modifikation der Struktur des Allergens würde die Antikörper-Allergen-Bindung stören, was zu falsch negativen Ergebnissen führen würde. Antikörper, Fragmente von Antikörpern oder Peptide sind relativ klein und weisen eine hohe Stabilität auf; daher zeigen Antikörper in Lösung in Bezug auf ihre verwandten Antigene eine größere Stabilität. Bei Immobilisierung an einem festen Träger bleibt jedoch selbst im Fall von Antikörpern nur ein geringer Prozentsatz intakt und aktiv.
Der Artikel von Haab et al. (Genom Biology 2000, I (6): Vorausdruck 0001, 1-0001, 22), welcher am 9. November 2000 eingegangen ist, betrifft Protein-Microarrays zur Detektion und Quantifizierung von Proteinen und Antikörpern in Lösungen. Die Ergebnisse der gemäß dieser Publikation durchgeführten Analyse zeigen, dass nur 50% der angeordneten (”arrayed”) Antigene und 20% der angeordneten Antikörper spezifische und genaue Messungen der verwandten Allergene vorsahen.
Außerdem ist die Diversität möglicher Allergene natürlich viel größer als die Antikörper-Diversitäten im Hinblick auf die Handhabung der Proteine, insbesondere für das Immobilisieren und Färben einer solchen Serie strukturell diverser Allergene. Es zeigte sich jedoch überraschenderweise, dass auf einem Microarray-Chip immobilisierte Allergene bei einem Verfahren zur Detektion von Immunglobulinen E (IgE) in einer Probe sehr verlässlich und empfindlich sind.
Dieses Verfahren ermöglicht die Durchführung eines Tests auf eine Vielzahl von Immunglobulinen E (IgE), die an ein spezifisches Allergen binden, in einem Versuchsschritt, wobei der Test auch atomisiert sein kann: Mehr als 100 verschiedene Allergene können getestet werden, ohne eine Vielzahl einzelner Versuchsschritte durchführen zu müssen, wie es bei Durchführung in herkömmlicher Mikrotiter-Form der Fall ist. Desweiteren ist dieser Test in hohem Maße empfindlich und verlässlich. Auch liegen die Testergebnisse dieses Verfahrens innerhalb kurzer Zeit vor, z. B. nach etwa drei Stunden, wodurch die Test-Zeit im Vergleich zu herkömmlichen RAST- oder ELISA-Tests verkürzt wird.
Desweiteren ist der Microarray-Test in hohem Maße reproduzierbar bei der Durchführung repetitiver Versuche mit Chips, die Proben verschiedener Personen enthalten, z. B. mit einer Mikrotiterplatten-artigen Maske, wobei jede Vertiefung eine Anzahl von Spots verschiedener Allergene umfasst und eine Probe einer Person pro Vertiefung zugegeben wird. Ein weiterer Vorteil dieses Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung ist auf die Tatsache zurückzuführen, dass eine große Anzahl verschiedener Sonden eine relativ kleine Fläche einnimmt, was zu einer hohen Dichte führt. Der kleine Oberflächenbereich des Arrays ermöglicht extrem einheitliche Bindungsbedingungen (Temperaturregulierung, Salzgehalt usw.), wohingegen die extrem große Anzahl von Sonden ein massives Parallel-Prozessieren von Hybridisierungen ermöglicht. Da die Arrays mit hoher Dichte eine so große Anzahl von Sonden enthalten, ist es möglich, zahlreiche Kontrollen vorzusehen, einschließlich beispielsweise Kontrollen für Variationen oder Mutationen bei einem bestimmten Allergen, Kontrollen für Gesamt-Hybridisierungsbedingungen, Kontrollen für Proben-Zubereitungsbedingungen, und Fehlpassungs-Kontrollen (”mismatch controls”) für nicht-spezifische Bindung oder Kreuz-Hybridisierung.
Desweiteren erfordert der Test nur einen minimalen Bruchteil an Material (Allergen sowie Probe) im Vergleich zu herkömmlichen Testsystemen. Dies bedeutet, dass mit einer gleichen Menge an Ausgangsmaterial eine viel größere Anzahl von Test-Kits erzeugt werden kann, wenn die Microarray-Form verwendet wird, und eine kleinere Menge an Probe zum Testen auf eine größere Menge an Immunglobulinen E (IgE), die an Allergene binden, verwendet werden kann. Auch kann in kleinen Volumina die Bindung sehr rasch stattfinden.
Natürliche intakte ”Immunglobuline” oder Antikörper weisen ein im Allgemeinen Y-förmiges tetrameres Molekül mit einer Antigen-Bindungsstelle am Ende jedes oberen Armes auf. Eine Antigen-Bindungsstelle besteht aus der variablen Domäne einer schweren Kette, die mit der variablen Domäne einer leichten Kette assoziiert ist. Insbesondere besteht die Antigen-Bindungsstelle eines Antikörpers im Wesentlichen aus den 3 CDRs (complementarity determining regions (Komplementaritäts-bestimmenden Regionen)) der variablen Domäne einer schweren Kette (V.sub.H) und den 3 CDRs der variablen Domäne der leichten Kette (V.sub.L).
Im Allgemeinen bezieht sich der Ausdruck ”Antigen” auf eine Substanz, die eine Immunantwort hervorrufen kann, und gewöhnlich ist dies auch die Substanz, die für die Detektion der entsprechenden Antikörper mittels eines der vielen immunologischen In-vitro- und In-vivo-Verfahren, die für den Nachweis von Antigen-Antikörper-Wechselwirkungen zur Verfügung stehen, verwendet wird.
In ähnlicher Weise wird der Ausdruck ”Allergen” verwendet, um ein Antigen zu bezeichnen, das die Fähigkeit zur Induktion von und Kombination mit spezifischen (d. h., IgE) Antikörpern hat, die für allgemeine Allergien verantwortlich sind; diese letztere Definition schließt jedoch nicht die Möglichkeit aus, dass Allergene auch reaktive Antikörper induzieren können, die Immunglobuline anderer Klassen als IgE mit einschließen können.
”Immobilisieren” im Zusammenhang mit Proteinen oder Peptiden bezieht sich auf die Bindung oder das Anhaften des Proteins/Peptids an festen Trägern mit herkömmlichen Mitteln, mit oder ohne einen zusätzlichen Abstandhalter (”spacer”) zwischen dem festen Träger und dem Allergen. Das Immobilisieren von Peptiden/Proteinen an einem Träger ist nach dem Stand der Technik allgemein bekannt; die vorliegende Erfindung umfasst jegliche Immobilisierung, z. B. kovalent, nicht-kovalent, insbesondere durch hydrophobe Wechselwirkungen mit beispielsweise Membranen bzw. synthetischen Oberflächen usw.
Ein ”Microarray” ist eine Anordnung (”array”) von Merkmalen (z. B. ”Spots”) mit einer Mindestdichte einzelner Merkmale von etwa 16/cm², vorzugsweise etwa 64/cm², besser noch etwa 96/cm², und am besten etwa 1000/cm². Die Merkmale in einem Microarray haben typische Dimensionen, z. B. Durchmesser, im Bereich von zwischen etwa 10–2000 μm, vorzugsweise etwa 50–500 μm, besser noch etwa 150–250 μm, und sind von anderen Merkmalen im Array durch etwa den gleichen Abstand getrennt. Daher kann ein erfindungsgemäßer Microarray zur Verwendung für routinemäßige Massen-Screenings mindestens 500, vorzugsweise mindestens 1000 einzelne Spots aufweisen, die Allergene, Standards und Kontrollen umfassen.
Der ”Chip” gemäß der vorliegenden Erfindung kann praktisch jegliche Form aufweisen, beispielsweise ein Objektträger oder eine Vertiefung einer Mikrotiterplatte sein, oder sogar eine Vielzahl von Oberflächen, obwohl eine plane Array-Oberfläche bevorzugt ist.
Der Detektionsschritt kann mit jedem herkömmlichen Verfahren, das dem Fachmann bekannt ist, durchgeführt werden, beispielsweise mittels physikalischer, enzymatischer, chemischer Reaktion usw..
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden IgEs als Immunglobuline detektiert. IgE ist als Substanz bekannt, die allergische Reaktionen hervorruft und nur erzeugt wird, wenn eine Person gegen eine Substanz sensibilisiert wird, d. h. eine Allergie hat. Daher wird, um zu testen, ob die Probe von einem Patienten stammt, der gegen das spezifische Allergen allergisch ist, die Probe auf IgE als Immunglobuline getestet. Je höher die Menge an IgE in der Probe, desto wahrscheinlicher ist der Patient, dem die Probe entnommen wurde, allergisch auf das spezifische Allergen.
Es ist bekannt, dass IgG in der Probe eines Patienten, der auf Nahrungsmittel allergisch ist, vorhanden ist.
Vorteilhafterweise werden ein oder mehrere gereinigte Allergene auf dem Microarray-Chip immobilisiert. Diese – einzelnen – Allergene sind beispielsweise aus einem Allergen-Extrakt, z. B. aus einem spezifischen Nahrungsmittel oder Pflanzen, gereinigt. Natürlich können ein oder mehrere Allergene einer spezifischen Spezies auf einmal analysiert werden.
Die Reinigungsverfahren sind dem Fachmann bekannt, beispielsweise chromatographische Reinigung, Reinigung mittels Massentrennung, Reinigung durch spezifische Bindung des Allergens an eine feste Phase, z. B. über einen Antikörper, usw. Die Anwendung hoch gereinigter Allergene für die Massenproduktion von Allergie-Tests wurde bisher noch nicht vorgeschlagen.
”Gereinigte” Allergene beziehen sich – im Gegensatz zu Extrakten – auf einzelne Allergene, die beispielsweise native, rekombinante oder synthetisch erzeugte Allergene sein können. Diese gereinigten Allergene weisen bei der Immobilisation an einem festen Träger eine Anzahl wichtiger Vorteile gegenüber einem Allergen-Extrakt auf: Infolge der Mischung verschiedener Proteine, die in jedem Extrakt vorhanden sind, ist die Konzentration der zu testenden Allergene sehr gering im Vergleich zu gereinigten Einzelallergen-Präparaten. Gereinigte einzelne Allergene können daher auf dem Microarray in sehr hoher Konzentration immobilisiert werden. Infolge der exakten und definierten Moleküle, die in einem gereinigte Allergene aufweisenden Präparat vorhanden sind, werden nur definierte Allergene am Microarray immobilisiert. Daher kann der Microarray und das Verfahren zur Detektion von Antikörpern mit Hilfe gereinigter Allergene standardisiert und genauen Qualitätskontrollen unterzogen werden.
Desweiteren sind die Allergene infolge der hohen Konzentration gereinigter Allergene in der Zusammensetzung in einer größeren Dichte am Microarray immobilisiert, und daher ist jedes Detektionsverfahren mit Hilfe eines solchen Microarrays empfindlicher als entsprechende Microarrays mit Extrakten, die Allergene umfassen. Ein weiterer Vorteil gereinigter einzelner Allergene gegenüber Allergen-Extrakten liegt in der Tatsache, dass die immobilisierten gereinigten Allergene genau definiert sind. Im Gegensatz zu gereinigten Allergenen umfassen Allergen-Extrakte beispielsweise zwei, drei oder mehr verschiedene Allergene eines Organismus oder Objekts. Beispielsweise umfasst im Falle eines Apfels ein Extrakt eine Mischung aus verschiedenen Apfel-Allergenen, wohingegen die erfindungsgemäße Zusammensetzung eines der gereinigten Apfel-Allergene aufweist.
Ein weiterer Vorteil gereinigter Allergene gegenüber nicht-gereinigten Allergenen, die beispielsweise in einem Extrakt vorhanden sind, liegt darin, dass wegen der im Extrakt vorhandenen zusätzlichen Verunreinigungen der Extrakt nur eine bestimmte Zeit lang stabil ist und beispielsweise schimmelig werden kann. Das beeinflusst jedoch den Nachweis von Allergien, da es auch Allergien gegen Schimmelpilz gibt, was in diesem Fall zu einem falsch positiven Resultat führen würde.
Desweiteren sind die Extrakte infolge des Vorhandenseins von Proteasen im Extrakt instabil, was bei gereinigten Allergenen nicht der Fall ist.
Außerdem wäre infolge der derzeit bestehenden Therapien mit Hilfe gereinigter Allergene eine Diagnose mit den selben gereinigten Allergen-Komponenten ein großer Vorteil gegenüber einer Diagnose mit ungereinigten Allergenen. Solche Diagnosen sind besonders vorteilhaft, um die Therapie mit gereinigten Allergenen zu befolgen und um die individuelle Reaktion auf eine spezifische Therapie zu testen und dadurch eine ”auf den Patienten zugeschnittene” Therapie vorzusehen.
Aus den obigen Gründen ist ein Verfahren zur Detektion eines Immunglobulins E (IgE), das an das Allergen in einer Probe bindet, wobei ein oder mehrere gereinigte Allergene am Microarray-Chip immobilisiert sind, besonders vorteilhaft.
Vorzugsweise sind ein oder mehrere rekombinante Allergene am Microarray-Chip immobilisiert. Im Laufe der letzten paar Jahre wurde eine Anzahl rekombinanter Allergene erzeugt. Die Produktion rekombinanter Allergene gehört im Prinzip auch zum bekannten Stand der Technik, hatte jedoch nur wenig Einfluss auf routinemäßige Allergie-Tests. Durch die Verwendung rekombinanter Allergene ist es möglich, eine große Anzahl eines oder mehrerer spezifischer Allergene vorzusehen und daher die Empfindlichkeit des Tests zu optimieren. Es ist desweiteren möglich, die rekombinanten Allergene spezifisch zu modifizieren, um beliebige Allergen-Mutationen zu erzeugen, und somit spezifische Immunglobuline E (IgE) nachzuweisen. Desweiteren bietet die Benutzung der Haupt-Allergene als rekombinante Proteine eine Alternative zu Tests auf Extrakt-Basis im Hinblick auf die Test-Stabilität sowie auf die diagnostische Standardisierung. Die oben erwähnten Vorteile gereinigter Allergene gegenüber den ungereinigten (Extrakt-)Allergenen treffen sogar noch mehr für rekombinante Allergene zu als für gereinigte native Allergene: Rekombinante Allergene können noch spezifischer entworfen werden als die gereinigten nativen Allergene, und es ist daher möglich, die Affinität und Spezifität eines Tests mit rekombinanten Allergenen zu optimieren. Rekombinante Allergene sind auch hinsichtlich ihres Herstellungsverfahrens besser standardisierbar. Außerdem sind Unterschiede zwischen Produktions-Losen geringer bei rekombinanten Allergenen als bei Allergenen, die aus natürlichen Quellen stammen. Überraschenderweise zeigte es sich bei der vorliegenden Erfindung, dass die Verwendung dieser rekombinanten Allergene in den routinemäßigen In-vitro-Diagnosetests gemäß der vorliegenden Erfindung herkömmlichen Test-Systemen auf Extrakt-Basis überlegen ist. Im Gegensatz zu den routinemäßigen Serien-Tests gemäß dem Stand der Technik bringt das vorliegende Allergen-Testen unter Verwendung auch rekombinanter Allergene für Standard-Allergen-Tests eine völlig neue Qualität in Bezug auf die Standardisierung, Steuerbarkeit, Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit, die Möglichkeit, auf diagnostisch relevante Informationen zu testen, usw.
Rekombinante Allergene sind beispielsweise jene, die in den Publikationen von Chapman et al., Allergy, 52: 374–379 (1997), Laffer et al. J. Allergy Clin. Immunol. Bd. 98 Nummer 2, 652–658 (1996), Müller et al. Clinical and Experimental Allergy Bd. 279.915–920 (1997), Niederberger et al. J. Allergy Clin. Immunol. Bd. 102 Nummer 4, Teil 1 579–591 (1998), Menz et al. Clinical and Experimental Allergy Bd. 26, 50–60 (1996), welche durch Bezugnahme hierin mit eingeschlossen sind. Weitere Beispiele für (rekombinante) Allergene sind unter anderem rBetv1, rBetv2, rBetv4, rJunO2, Cass1, rPhlp1, rPhlp2, rPhlp4, rPhlp5a, rPhlp6, rPhlp7, rPhlp11, rPhlp12, rParj2, Artv1 a, Beifuß-Profilin, Apig1, Apig1.0201, Dauc1.2, rArah2, rArah5, Mald1, Mald2, rPena1, recCarp, rDerp1, rDerp2.0101, rDerp2, rDerp2b, rDerp5, rDerp5a, rDerp7, rDerp8, rDerp10, rTyrp2, rLepd2.01, rLepd13, rEurm2.0101, rFeld1, rFeld1a, rBosd2, ein repräsentatives Allergen der Katze, ein repräsentatives Allergen vom Hund, ein repräsentatives Allergen von BSA, ein repräsentatives Allergen der Maus, ein repräsentatives Allergen der Ratte, ein repräsentatives Allergen vom Schwein, ein repräsentatives Allergen vom Schaf, ein repräsentatives Allergen vom Huhn, ein repräsentatives Allergen vom Kaninchen, ein repräsentatives Allergen vom Hamster, ein repräsentatives Allergen vom Pferd, ein repräsentatives Allergen der Taube, ein repräsentatives Allergen von Guinea-Albumin, HSA, a-NAC, rPenc3, Penn13, rPenc19a, rPenc19b, rAspf1, rAspf1a, rAspf3, rAspf3a, rAspf4, rAspf4a, rAspf6, rAspf6a, rAspf7, rAspf8, rAlta1 , rAlta2, rMalf1, rMalf5, rMalf6, rMalf7, rMalf8, rMalf9, rHevb1, rHevb1a, rHevb3, rHevb8, rHevb9, rHevb10, rHevb11, rAK, rBlag2, rBlag4, rBlag5, Phospholipase.A, Hyaluronidase, rVesv5, rVesg5.
Gemäß einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform werden ein oder mehrere synthetisch hergestellte Allergene auf dem Microarray-Chip immobilisiert. Hier gelten wiederum dieselben Vorteile gegenüber einem Allergen-Extrakt und auch gegenüber gereinigten nativen Allergenen, wie oben für rekombinante Allergene erwähnt. Das Verfahren zur synthetischen Erzeugung von Peptiden oder Proteinen ist nach dem Stand der Technik allgemein bekannt; durch synthetische Erzeugung von Allergenen ist es möglich, hoch reine Allergene in großer Anzahl und mit geringen Kosten herzustellen, da solche Produktionsmethoden hoch automatisiert sind. Desweiteren kann die genaue Sequenz jedes Allergens mit oder ohne Modifikationen vorgesehen werden, was die Empfindlichkeit und Verlässlichkeit des Verfahrens zur Detektion der Immunglobuline E (IgE) erhöht.
Es ist auch möglich, nur die allergene Determinante oder die allergene Domäne eines spezifischen Allergens beim Test gemäß der vorliegenden Erfindung zu verwenden. Damit können die Risiken und Nachteile des Arbeitens mit großen Proteinen eliminiert werden, weil kürzere Peptid-Strukturen für die routinemäßige Erzeugung von Biochips leichter zu handhaben sind. Dies gilt für alle gereinigten nativen, rekombinanten und synthetischen Allergene. Dies würde es desweiteren ermöglichen, einzelne Peptid-Epitope nachzuweisen, was den diagnostischen Test und Therapien, insbesondere im Hinblick auf die Spezifität, noch weiter verbessern würde.
Es ist von besonderem Vorteil, die native Form des Allergens sowie eine synthetische oder rekombinante Form des Allergens am selben Chip vorzusehen. Auch wenn die Verwendung hauptsächlich rekombinanter oder synthetischer Allergene bevorzugt wird, kann die native Form eines Allergens zumindest als Kontrolle oder als zusätzliche Qualitätsinformation auf dem Chip vorgesehen werden. Ein bevorzugter Chip gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst daher eine native und eine synthetische oder rekombinante Form mindestens eines Allergens. Dies ergibt auch eine verbesserte Qualitätskontrolle und Standardisierung verschiedener Chargen von Allergenen.
Vorzugsweise sind ein oder mehrere Haptene als Allergene auf dem Microarray-Chip immobilisiert. Ein ”Hapten” ist eine Substanz mit niedrigem Molekulargewicht (die typischerweise weniger als etwa 7000 Dalton wiegt), die im Allgemeinen selbst keine signifikante Produktion von Antikörpern bei Verabreichung an den Körper eines Tieres, einschließlich den Körper eines Menschen, bewirken kann. Dies ist deshalb so, weil ein Hapten zu klein ist, um vom Immunsystem des Körpers erkannt zu werden. Wenn jedoch ein Hapten an ein größeres, ein Träger-Molekül gekoppelt wird, kann das Hapten antigene Eigenschaften erwerben. In anderen Worten, das Binden des Haptens an das Trägermolekül (zur Herstellung einer Analyten-Trägermolekül-Kombination) ermöglicht es, dass das gebundene Hapten vom Immunsystem eines Tieres erkannt wird. Eine Immunpräzipitations-Reaktion kann zwischen dem (an das Trägermolekül gekoppelten) Hapten und einem Antikörper gegen das Hapten stattfinden. Durch das Vorsehen von Haptenen, die auf dem Microarray-Chip immobilisiert sind, kann eine höhere Dichte am Chip erreicht werden.
Es ist natürlich möglich, diese oben erwähnten unterschiedlichen Formen von Allergenen zu kombinieren, beispielsweise gleichzeitig rekombinante und (gereinigte) native Allergene zu verwenden. Die Kombination dieser verschiedenen Formen ermöglicht es, sie zu vergleichen und eine Kontrolle der z. B. rekombinanten Allergene durchzuführen, aber auch als Kontrolle für die verschiedenen nativen Lose der Allergene, die infolge von Unterschieden in den biologischen Quellen, Herstellungsmethoden, Reinheit usw., verschieden sein können.
Für einen hoch effizienten Test werden bevorzugt Allergene verwendet, die optimale Merkmale, beispielsweise eine hohe Bindungskapazität, aufweisen. Die Verwendung weniger oder anders aktiver Antigene wird jedoch für die Detektion ineffizient bindender Allergen-Varianten, z. B. für die Verwendung bei Hyposensibilisierungstherapien, bevorzugt.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Allergene auf einem Spot mit 10 bis 2000 μm Durchmesser, vorzugsweise mit 50 bis 500 μm-Durchmesser, besser noch mit 150 bis 250 μm Durchmesser, am Microarray-Chip immobilisiert. Da die Spots einen kleinen Durchmesser aufweisen, ist es möglich, eine große Anzahl verschiedener Allergene und verschiedene Konzentrationen spezifischer Allergene auf separaten Spots des Microarray-Chips zu immobilisieren, womit es ermöglicht wird, einen Microarray-Chip vorzusehen, der in einem – automatisierten – Schritt zum Analysieren einer großen Anzahl von Allergenen oder Allergen-Konzentrationen verwendet werden kann.
Vorzugsweise werden die Allergene auf einem festen Träger, vorzugsweise einem Glas-Träger, einem Kunststoffträger, einem Siliziumplättchen bzw. einer Membran immobilisiert. Solche Chips können beispielsweise gemäß Verfahren hergestellt werden, die in Ge, H. (2000), Nucleic Acids Research, 28, e3 (i–vii): Qian W. et al. (2000), Clinical Chemistry, 46 (1456–1463): MacBeath G. et al. (2000), Science, 289, (1760–1763) beschrieben sind, welche durch Hinweis hierin mit eingeschlossen sind. Jedes dieser Materialien weist spezifische Charakteristika und Vorteile auf, die dem Fachmann hinreichend bekannt sind. Daher wird das Material für den Microarray-Chip gemäß dem zu testenden Allergen, dem Verfahren für die Detektion der gebundenen Immunglobuline E (IgE), den verwendeten Puffern gewählt. Desweiteren ist die Wahl des Materials auch eine finanzielle Frage.
Vorzugsweise wird der Microarray-Chip chemisch modifiziert, vorzugsweise durch eine Amino-reaktive bzw. Carboxy-reaktive Modifizierung. Dadurch wird es möglich, die Art, wie das Allergen an den Microarray-Chip gebunden ist, genau zu bestimmen.
Vorteilhafterweise werden die Allergene kovalent an den Microarray-Chip gebunden. Dies sieht eine stabile Bindung der Allergene an den Microarray-Chip vor, wobei ein Verfahren eingesetzt wird, das besonders verlässlich ist.
Gemäß einer anderen vorteilhaften Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Immunglobuline E (IgE) in Blutserum als Probe detektiert. Bei Patienten, die gegen ein Allergen allergisch sind, werden Immunglobuline hauptsächlich im Blutserum erzeugt, so dass das Analysieren des Blutserums ein verlässliches Verfahren zur Detektion von Immunglobulinen E (IgE) bietet. Desweiteren kann Blutserum dem Patienten leicht und auf sehr einfache Weise entnommen werden, und die Entnahme der Probe kann sogar beim Patienten daheim durchgeführt werden.
Vorzugsweise wird das Blutserum 1:1–1:15, vorzugsweise 1:5, verdünnt. Die Verdünnung kann mit jeder geeigneten Lösung, z. B. 1 × TBST (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,5% TWEEN 20) durchgeführt werden.
Vorteilhafterweise wird die Probe mit den Allergenen 1 Min. bis 24 Stunden, vorzugsweise 1 bis 2 Stunden lang, inkubiert. Natürlich ist es möglich, die Probe mit den Allergenen auch über einen Zeitraum von Tagen zu inkubieren. Dies führt jedoch zu keiner Steigerung der Signalintensität oder -spezifität. Im Allgemeinen reicht eine Inkubationszeit von 1 Stunde für ein verlässliches und empfindliches Ergebnis aus.
Desweiteren wird die Probe vorzugsweise mit den Allergenen bei einer Temperatur zwischen 0 und 60°C, vorzugsweise bei 37°C inkubiert. Inkubationen bei niedrigeren Temperaturen führen zu keiner Signalsteigerung, sondern sie führen eher zu einer Zunahme von unspezifischer Bindung und Hintergrundrauschen. Es zeigte sich, dass eine Inkubation bei 37°C zu exakten und verlässlichen Ergebnissen für Allergen-Tests bei Menschen führt.
Vorteilhafterweise wird das gebundene Immunglobulin E (IgE) mit zumindest einem markierten, spezifischen anti-Immunglobulin E (IgE)-Antikörper detektiert. Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck ”Antikörper” auf intakte Moleküle sowie Fragmente davon, wie Fa, F(ab).sub.2 und Fv, die die Epitop-Determinante binden können. Antikörper können hergestellt werden unter Verwendung von intakten Polypeptiden oder von Fragmenten, die kleine Peptide, an denen ein Interesse besteht, als immunisierendes Antigen enthalten. Das Polypeptid oder Peptid, das zum Immunisieren eines Tieres verwendet wird, kann vom Übergang der RNA abgeleitet sein oder chemisch synthetisiert werden, und es kann, falls gewünscht, mit einem Träger-Protein konjugiert sein. Allgemein verwendete Träger, die chemisch an Peptide gekoppelt werden, umfassen Rinderserumalbumin und Thyroglobulin. Das gekoppelte Peptid wird dann verwendet, um das Tier zu immunisieren (beispielsweise eine Maus, eine Ratte oder ein Kaninchen).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Ausdruck ”Antikörper” auf monoklonale oder polyklonale Antikörper, wobei monoklonale Antikörper unter Verwendung jeder Technik, die die Erzeugung von Antikörper-Molekülen durch kontinuierliche Zelllinien in Kultur vorsieht, hergestellt werden können. Zu diesen zählen unter anderem die Hybridom-Technik, die humane B-Zellen-Hybridom-Technik und die IBV-Hybridom-Technik.
Desweiteren können chimäre Antikörper, Einzelketten-Antikörper sowie synthetisch erzeugte Antikörper hergestellt werden.
Der Antikörper kann nach jeder bekannten Methode, die die Qualifizierung und vorzugsweise die Quantifizierung des gebundenen Antikörpers ermöglicht, markiert werden. Detektierbare Markierungen, die zur Verwendung bei der vorliegenden Erfindung geeignet sind, beinhalten jede Zusammensetzung, die mit spektroskopischen, photochemischen, biochemischen, immunochemischen, elektrischen, optischen oder chemischen Mitteln nachweisbar ist. Zweckmäßige Markierungen umfassen Biotin zur Färbung mit markiertem Streptavidin-Konjugat, magnetische Kügelchen, fluoreszierende Farben (z. B. Fluoreszein, Texas-Rot, Rhodamin, grün fluoreszierendes Protein und dgl.), radioaktive Markierungen (z. B.: ³H, ¹²⁵I, ³⁵S, ¹⁴C oder ³²p), Enzyme (z. B.: Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase und andere, die allgemein in ELISA verwendet werden), sowie kolorimetrische Markierungen, wie kolloidales Gold oder gefärbte Glas- oder Plastik-(z. B. Polystyrol-, Polypropylen-Latex-, usw.)-Kügelchen.
Mittel zur Detektion solcher Markierungen sind dem Fachmann hinreichend bekannt. So können beispielsweise radioaktive Markierungen unter Verwendung von photographischem Film oder Szintillationszählern detektiert werden, fluoreszierende Markierungen können unter Verwendung eines Photodetektors zur Detektion von emittiertem Licht detektiert werden. Enzymatische Markierungen werden typischerweise detektiert, indem das Enzym mit einem Substrat versehen wird und das Reaktionsprodukt, das durch die Wirkung des Enzyms auf das Substrat erzeugt wird, detektiert wird, und kolorimetrische Markierungen werden durch einfaches Sichtbarmachen der gefärbten Markierung detektiert.
Vorzugsweise werden die gebundenen Immunglobuline E (IgE) mit zumindest einem Fluoreszenz- bzw. radioaktiv markierten, spezifischen anti-Immunglobulin E (IgE)-Antikörper detektiert. Dabei handelt es sich um klassische Methoden für die qualitative und quantitative Analyse von gebundenem IgE-Antikörper, die sehr spezifisch und verlässlich sind.
Andere vorteilhafte Detektionssysteme für Microarrays sind beispielsweise jene, die in Schult K. et al. (1999), Anal. Chem., 71 (5430–5435); Vo-Dinh T. et al. (1999), Anal. Chem., 71 (358–363); Brignac SJ Jr. et al. (1999), IEEE Eng. Med. Biol. Mag., 18 (120–122); Otamiri M. et al. (1999), Int. J. Biol. Macromol, 26 (263–268); Wright, GL Jr. et al. (2000), Prostate Cancer and Prostatic Diseases, 2 (264–276); Nelson RW. et al. (2000), Electrophoresis 21 (1155–1163); Rich RL. et al. (2000), Curr. Opin. Biotechnol 11 (54–61); Chen JJ. et al. (1998), Genomics, 51 (313–324) beschrieben sind; diese Publikationen sind durch Bezugnahme hierin mit eingeschlossen.
Vorteilhafterweise werden ein oder mehrere Indoor-Allergene als Allergene immobilisiert. Bei diesen kann es sich unter anderem um Milben, Tyr. put, Lep. dest. oder .mayrei, Fells, Bos, Albumin, Pen. cit., Pen. not., Asp. fumigatus, Alt. alt., Malassezia furfur, Latex, Plodia, Blatella handeln.
Gemäß einer weiter bevorzugten Ausführungsform werden ein oder mehrere Outdoor-Allergene als Allergene immobilisiert. Bei diesen kann es sich unter anderem um Betula, Juniperus, Phleum, Parietaria Judicea handeln.
Desweiteren können ein oder mehrere Nahrungsmittel-Allergene als Allergene immobilisiert werden. Beispiele sind Sellerie, Karotte, Erdnuss, Apfel, Garnele, Fisch.
Desweiteren werden ein oder mehrere Gift-Allergene als Allergene immobilisiert. Bei diesen kann es sich unter anderem um Biene oder Wespe handeln.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur In-vitro-Diagnose von Allergien bei einem Patienten, wobei eine Serumprobe vom Patienten auf an Allergene bindende Immunglobuline E (IgE) nach einem oben erwähnten Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung analysiert wird, wobei ein Microarray-Chip verwendet wird, auf dem zumindest 10, vorzugsweise zumindest 50, besser noch zumindest 90, verschiedene Allergene immobilisiert sind, wonach eine positive Reaktion zwischen der Probe und den immobilisierten Allergenen als Allergie diagnostiziert wird. Die oben erwähnten Definitionen und Vorteile beziehen sich auch auf dieses Verfahren zur In-vitro-Diagnose von Allergien, im Vergleich zu den bekannten Verfahren zur Diagnostizierung von Allergien. Das vorliegende Verfahren weist den Vorteil auf, dass eine große Anzahl von Allergien mit nur einer Probe gleichzeitig diagnostiziert werden kann, da alle Allergene, die getestet werden müssen, an einem einzigen Microarray-Chip immobilisiert sind. Jeder Schritt wird daher nur an einem Chip durchgeführt, wobei der Chip desweiteren Spots ohne immobilisierte Allergene aufweisen kann und daher gleichzeitig eine negative Detektion ermöglicht. Die Menge der zu testenden Allergene ist nicht eingeschränkt und es ist natürlich möglich, zwei oder mehrere Microarray-Chips zu verwenden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Microarray-Chips, an dem ein oder mehrere gereinigte Allergene immobilisiert sind, zur Detektion von Immunglobulin E (IgE). Auch in dieser Hinsicht gelten die oben genannten Definitionen und Vorteile.
Vorzugsweise werden die Allergene auf einem Spot mit einem Durchmesser von 100 bis 500 μm, vorzugsweise mit einem Durchmesser von 200–300 μm, immobilisiert.
In noch mehr bevorzugter Weise handelt es sich beim Microarray-Chip um einen Glasträger, einen Kunststoffträger, ein Siliziumplättchen bzw. eine Membran.
Vorteilhafterweise ist der Microarray-Chip chemisch modifiziert, vorzugsweise durch Amino-reaktive bzw. Carboxy-reaktive Modifizierung.
Vorteilhafterweise sind die Allergene kovalent an den Microarray-Chip gebunden.
Ein weiterer Aspekt gemäß der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines Kits, das einen Microarray-Chip gemäß der vorliegenden Erfindung, wie oben erwähnt, und ein erstes Reagens umfassend zumindest ein Immunglobulin-detektierendes Reagens, vorzugsweise einen anti-Immunglobulin-Antikörper, vorzugsweise in einer bekannten Konzentration, sowie gegebenenfalls als positive Probe ein zweites Reagens umfassend zumindest ein an ein Allergen bindendes Immunglobulin, aufweist. Das erste Reagens, welches das zumindest eine Immunglobulin-detektierende Reagens umfasst, vorzugsweise einen anti-Immunglobulin-Antikörper, kann zur Detektion von gebundenem Immunglobulin verwendet werden; in diesem Fall ist der anti-Immunglobulin-Antikörper vorzugsweise wie oben erwähnt markiert. Vorzugsweise ist ein Antikörper im ersten Reagens in einer bekannten Konzentration vorhanden, was es ermöglicht, reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen. Desweiteren umfasst das Kit vorzugsweise ein zweites Reagens als positive Probe, welche mindestens ein Immunglobulin E (IgE) enthält, das an ein Allergen bindet. Auch hier ist es vorzuziehen, dass das Immunglobulin E (IgE) in einer bekannten Konzentration im zweiten Reagens vorhanden ist, was es ermöglicht, das in der Probe vorhandene Immunglobulin E (IgE) zu quantifizieren durch Vergleich der Ergebnisse der Probe des Patienten mit den Ergebnissen einer positiven Probe (dem zweiten Reagens).
Das Kit ist zur Durchführung eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung, wie oben erwähnt, vorgesehen. Dazu können das erste und das zweite Reagens so ausgelegt sein, dass ein spezifisches Immunglobulin E (IgE), welches an ein spezifisches Allergen bindet, oder eine spezifische Allergie bei einem Patienten detektiert wird. Das Kit kann jedoch auch so ausgelegt sein, dass eine Vielzahl von Immunglobulinen E (IgE), die an spezifische Allergene binden, detektiert, bzw. eine Vielzahl von Allergien bei einem Patienten diagnostiziert wird.
Die vorliegende Erfindung wird nun mit Hilfe der folgenden Beispiele und Figuren, auf die sie natürlich nicht beschränkt ist, genauer beschrieben.
1 zeigt einen Plan eines Allergen-Microarrays;
2 zeigt ein Scan-Bild eines Allergen-Arrays, getestet mit Serum von einer allergischen Person;
3a–3c zeigen einen Scatterplot-Test aus einem Dreifach-Test;
4a–4c zeigen die für immobilisierten Extrakt und immobilisierte rekombinante Allergene gemessene % Fluoreszenz.
Beispiel 1:
Allergen-Spotting
Allergene wurden unter Verwendung eines GMS 417-Spotters von Genetic Microsystems angeordnet (”arrayed”). Die Proteine wurden auf derivatisierte Glas-Objektträger punktweise aufgetragen. Einzelne Allergene wurden mit einem Treffer pro Punkt als Triplikate gespottet. Die Punkte (Merkmale) zeigten einen Durchmesser von etwa 200 μm.
Die Allergene wurden in funktionellen Gruppen wie folgt zusammengestellt:

(A) Outdoor (I. Bäume [1 = rBetv1, 2 = rBetv2, 3 = rBetv4, 4 = rJunO2, 5 = Cass1], II. Gräser [6 = rPhlp2, 7 = rPhlp4, 8 = rPhlp5a, 9 = rPhlp1, 10 = rPhlp6, 11 = rPhlp7, 12 = rPhlp11, 13 = rPhlp12], III. Unkräuter [14 = rParj2, 15 = Artv1a, 16 = Beifuß-Profilin]),
(C) Nahrungsmittel-Allergene (X. Gemüse [17 = Apig1, 18 = Apig1.0201, 19 = Dauc1.2, 20 = rArah2, 21 = rArah5], XI. Früchte [22 = Mald1, 23 = Mald2], XII. Garnelen [24 = rPena1], XIII. Fisch [25 = recCarp]),
(B) Indoor (IV. Milben [26 = rDerp1, 27 = rDerp2.0101, 28 = rDerp2, 29 = rDerp2b, 30 = rDerp5, 31 = rDerp5a, 32 = rDerp7, 33 = rDerp8, 34 = rDerp10, 35 = rTyrp2], V. Tiere [36 = rLepd2.01, 37 = rLepd13, 38 = rEurm2.0101, 39 = rFeld1, 40 = rFeld1a, 41 = rBosd2, 42 = ein repräsentatives Allergen der Katze, 43 = ein repräsentatives Allergen vom Hund, 44 = BSA, 45 = ein repräsentatives Allergen der Maus, 46 = ein repräsentatives Allergen der Ratte, 47 = ein repräsentatives Allergen vom Schwein, 48 = ein repräsentatives Allergen vom Schaf, 49 = ein repräsentatives Allergen vom Huhn, 50 = ein repräsentatives Allergen vom Kaninchen, 51 = ein repräsentatives Allergen vom Hamster, 52 = ein repräsentatives Allergen vom Pferd, 53 = ein repräsentatives Allergen der Taube, 54 = Guinea-Albumin], VI. Schimmelpilze [55 = rPenc3, 56 = rPenc19a, 57 = rPenc19b, 58 = Penn13, 59 = rAspf1, 60 = rAspf3, 61 = rAspf4, 62 = rAspf6, 63 = rAspf1a, 64 = rAspf3a, 65 = rAspf4a, 66 = rAspf6a, 67 = rAspf7, 68 = rAspf8, 69 = rAlta1, 70 = rAlta2], VII. Hefe [71 = rMalf7, 72 = rMalf1, 73 = rMalf5, 74 = rMalf6, 75 = rMalf8, 76 = rMalf9], VIII. Latex [77 = rHevb1, 78 = rHevb1a, 79 = rHevb3, 80 = rHevb8, 81 = rHevb9, 82 = rHevb10, 83 = rHevb11], IX. Insekten [84 = rAK, 85 = rBlag2, 86 = rBlag4, 87 = rBlag5]),
(D) Gifte (XIV. Biene [88 = Ag5, 89 = Phospholipase A, 90 = Hyaluronidase, 91 = rVesv5, 92 = rVesg5], XV. Wespe [93 = Ag5]),
(E) Auto-Allergene (94 = HSA, 95 = a-NAC)

Zusätzlich wurden Puffer-Punkte zwischen den Allergen-Untergruppen eingestreut, die als Hintergrund-Kontrolle dienen und mit ”X” bezeichnet sind; ”ab” ist der markierte Antikörper (1: 1864×1182 Pixel, 1,86 × 1,18 cm, 1000 Pixel pro cm, Pixeltiefe/Farben 8/256, wobei 1 Pixel 10 μm entspricht).
100 μl Aliquots der Allergene wurden in die Vertiefungen einer Mikrotiter-Platte mit 96 Vertiefungen mit ein er Konzentration von ~200 ng/μl in Spotting-Puffer verteilt (300 mM Natriumphosphat, pH 8,5). Die optimale Konzentration für die Immobilisierung der Allergene wurde aus Titrations-Versuchen mit mehreren Allergenen in verschiedenen Pufferlösungen sowie auf verschiedenen Objektträgern berechnet. Die getesteten Proteine zeigten ein Sättigungsverhalten bei Konzentrationen gleich oder größer 100 ng/μl, wie aus einem konstant starken weißen Signal beim Scannen mit einem GMS-Scanner offenbar wurde. Bei dieser Konzentration war das Bindungsverhalten der Allergene von der Zusammensetzung, der Lagerung sowie vom Spotting-Puffer unabhängig.
Beispiel 2:
SOPHIA (Solid phase Immunosorbent Assay)
Nach Inkubation über Nacht wurden die Objektträger, die entweder von CEL Associates gekauft (Aldehyd-Objektträger) oder firmenintern hergestellt worden waren, in 1 × TBST (10 mM Tris, pH 8,0/150 mM NaCl/0,5% Tween 20) unter heftigem Schütteln in einem Falcon-Röhrchen bei Umgebungstemperatur gewaschen. Als Blockierschritt wurden die Objektträger in eine 1 × TBST-Lösung, enthaltend 0,01% BSA 2 Stunden lang bei Umgebungstemperatur transferiert. Nacheinander wurden die Objektträger in 1 × TBST 15 Min. lang gewaschen und kurz in destilliertem Wasser gespült.
Die Allergen-Anordnung wurde mit verdünntem Serum (1:5 in 1 × TBST) (mindestens) 60 Min. lang bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Verschiedene Grade der Serum-Verdünnung wurden getestet, die im Bereich von 1:1–1:15 lagen. Gewöhnlich ergab eine Verdünnung von 1:5 die besten Ergebnisse. 30 μl verdünntes Serum wurden zu den Objektträgern in Press Seal Chambers, käuflich erworben von SIGMA Technologies, zugegeben. Die Kammern wurden gemäß den Vorschriften des Herstellers verwendet. Verschiedene Inkubationszeiten, welche von 60 Min. bis über Nacht reichten, wurden für das Serum getestet. Eine längere Inkubation mit Serum führte jedoch nicht zu einer Steigerung der Signalintensität oder -spezifität. Nach der Inkubation mit Serum wurden die Objektträger in 1 × TBST (15 Min., Umgebungstemperatur) unter Schütteln gewaschen.
Fünf verschiedene Seren allergischer Patienten, die unter Verwendung herkömmlicher Diagnose-Tests untersucht worden waren (Haut-Prick-Test, RAST, ELISA) und ein Serum eines nicht-atopischen Patienten wurden als adäquat für eine Bewertung (”benchmark test”) der Allergen-Anordnung gewählt. Die einzelnen Seren wurden mindestens zweimal an Allergen-Anordnungen verschiedener erzeugter Chargen getestet.
Fluoreszenz-markierter α-IgE-Antikörper, markiert mit AlexaFluor-Fluoreszenz-Farbe gemäß den Vorschriften des Herstellers (Molecular Probes) wurde zur Allergen-Anordnung in einer Lösung, die 0,01% BSA/1 × TBST enthielt, zugegeben und 60 Min. lang bei Umgebungstemperatur inkubiert. Die Arbeitsverdünnungen für den Antikörper lagen im Bereich von 1:1000–1:5000, je nach Zeit und Effizienz der Markierung. Nach dem Immunoassay wurden die Objektträger mit 1 × TBST (15 Min., Umgebungstemperatur, Schütteln) gewaschen und kurz mit destilliertem Wasser gespült.
Nach dem Immunosorbens-Test wurden die Objektträger mit einem GMS-Zweifarben-Scanner evaluiert. Im Allgemeinen unterschieden sich die Signal-Intensitäten zwischen den verschiedenen Tests und den verschiedenen Objektträgern nur wenig. Die Hintergrundwerte waren jedoch je nach der Art der verwendeten Objektträger verschieden. Ein Beispiel für ein gescanntes Bild einer Allergen-Anordnung, die mit dem Serum eines an einer Allergie leidenden Patienten getestet wurde, ist in 2 dargestellt. Dieser Patient zeigt eine starke Reaktion mit Phleum, Milbe, Felis und Biene (vgl. 1). Es wurden keine aus einer unspezifischen Wechselwirkung mit Puffer-Punkten oder Auto-Allergenen stammenden Hintergrund-Signale beobachtet. Nach der vollständigen Evaluierung der Seren des allergischen Patienten wurden die Ergebnisse mit Daten verglichen, die vorläufig für die identischen Seren unter Verwendung von PAST-Tests erzielt worden waren. Die mit dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung gewonnenen Daten stimmten mit diesen verfügbaren Daten-Sätzen überein.
Beispiel 3:
Reproduzierbarkeits-Test mit Untersuchung von Serum des Patienten C
Serum des Patienten C wurde drei Mal an einzeln hergestellten Allergen-Microarrays getestet. Die Vorgehensweise des Versuchs war im Wesentlichen wie zuvor beschrieben.
Nach dem Test wurden die Objektträger unter Verwendung identischer Hardware-Einstellungen gescannt. Die Daten-Analyse wurde unter Verwendung des GenePix Software Package durchgeführt. Die errechneten Mittelwerte der Signal-intensitäten für jedes Allergen-Triplikat wurden nach drei Wiederholungen des Versuchs verglichen.
Für die endgültige Analyse wurden nur Werte ausgewählt, die Signalen entsprachen, die mindestens 1,5 × höher als der Mittelwert der Puffer-Spot-Signale waren.

Der Mittelwert, die Standard-Abweichung und der Prozentsatz der Standard-Abweichung für die relevanten Signale sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

Allergen	Test 1	Test 2	Test 3	Mittelwert	Standard-Abw.	% Mittel
rBet v 1	20731	21325	25060	22372,00	1916,11	8,56
rPhl p 2	17176	15529	14227	15644,00	1206,67	7,71
rPhl p 4	36134	33511	29328	32991,00	2802,76	8,50
rPhl p 5a	56600	53068	55594	55087,33	1485,77	2,70
rPhl p 6	56244	51359	37625	48409,33	7882,14	16,28
rPhl p 12	6291	7003	12289	8527,67	2675,50	31,37
rPar j 2	7552	7678	9444	8224,67	863,73	10,50
Art v 1a	6997	7931	11258	8728,67	1828,70	20,95
Beifuß-Profilin	7901	7669	9260	8276,67	701,74	8,48
Mal d 1	9890	15295	8176	11120,33	3033,74	27,28
HSA	9868	8732	10708	9769,33	809,71	8,29
Schafalbumin	9858	8295	10222	9458,33	835,92	8,84
Pferdalbumin	9602	9061	10559	9740,67	619,37	6,36
rAsp f 1(b)	12216	10129	10781	11042,00	871,77	7,90
rMal f 5	13459	11018	12035	12170,67	1001,14	8,23
rAK	20680	14202	19978	18286,67	2902,48	15,87

Die mittlere Standard-Abweichung, die aus den nach drei einzelnen Tests erhaltenen Werten berechnet wurde, betrug 12,36%. Dies bedeutet, dass der immunologische Test auf Chip-Basis, der nach dem Vorhandensein von IgE in den Seren der Patienten fragt, hoch reproduzierbar ist. Dies ist auch offensichtlich, wenn man die Scatter-Plots, die aus dem Dreifach-Test 3 stammen, überprüft, s. 3a–3c, wobei 3a einen Scatterplot-Test 1 vs. Test 3, 3b einen Scatterplot-Test 2 vs. Test 3 und 3c einen Scatterplot-Test 1 vs. Test 2 zeigt; dabei bezeichnet A die Allergene und FI die Fluoreszenz-Intensität.
Beispiel 4:
Vergleich verschiedener Microarrays
Um nach dem besten Objektträger für die vorliegende Erfindung zu testen, wurden einzeln hergestellte Objektträger nach einer Anzahl von Kriterien, die nachstehend angeführt sind, bewertet:

– Herstellungsverfahren: Hergestellte Objektträger wurden nach einer Reihe von Parametern, wie Bedarf an gefährlichen Chemikalien und Produktionsdauer, bewertet.
– Produktionskosten: Betriebsintern erzeugte Objektträger und handelsübliche Objektträger wurden nach ihren Kosten verglichen.
– Bindungskapazität: Verschiedene Objektträger wurden gemäß der Bindungs-kapazität eines Fluoreszenz-markierten Proteins bewertet.
– Reproduzierbarkeit: Serienversuche wurden mit verschieden vorbehandelten Objektträgern durchgeführt und nach der gesamten Test-Leistung bewertet.
– Allgemeiner Hintergrund: Alle Objektträger wurden vor und nach einem Allergie-Test auf einen systematischen Oberflächen-Hintergrund, der das Signal/Rausch-Verhältnis verringern könnte, bewertet.
– Nachweisgrenze: Alle Objektträger wurden im Hinblick auf die minimale Protein-Konzentration, die pro Spot in einem Allergie-Screening-Test detektierbar war, bewertet.
– Serum-Toleranz: Im Allgemeinen ist ein Patienten-Serum eine komplexe Mischung aus Proteinen, die sich oft negativ auf einen Immunoassay auf Microarray-Basis mit verschiedenen Chargen des Patienten-Serums auswirkt.
– Blockierung: Alle Objektträger wurden im Hinblick auf die Notwendigkeit eines Blockierungs-Schritts vor dem Allergie-Test bewertet.
– Lagerung: Alle Objektträger wurden im Hinblick auf Langzeit-Lagerung nachdem ein Allergen-Chip erzeugt worden war, bewertet.

Die Ergebnisse oben genannter Evaluations-Studie sind in Tabelle 2 gezeigt: Tabelle 2
Tabelle 2: Gezeigt sind die Ergebnisse der im Text beschriebenen Evaluations-Studie.

(++) bedeutet ausgezeichnetes Ergebnis, (+) gut, (-) weniger gut, (-) schlecht. (/) bedeutet, dass der Objektträger für diese bestimmte Kategorie nicht getestet wurde. (1) Objektträger, die eine funktionelle Oberfläche mit Aldehyd-Gruppen enthalten. (2) Objektträger, die eine Amin-reaktive Oberfläche enthalten, deren genaue chemische Eigenschaften nicht bekannt sind. (3) Innerbetrieblich erzeugte Objektträger mit funktionellen Gruppen, wie in Tabelle 2 erwähnt. (4) Objektträger, die eine Membran zur Immobilisierung von Proteinen enthalten. ProteoBind ist der Arbeitstitel für die Oberflächen-Derivatisierung, die für eine optimierte Leistung einer Allergie-Diagnose auf Microarray-Basis adaptiert ist, und (1-[3''-[Trimethoxysilyl)-propyl]-1'-(4''-isothiocyanatphenyl)-thioharnstoff) umfasst, welcher gemäß Chen et al. (Nucleic Acids Research, 199, Bd. 27, Nr. 2) hergestellt wurde; ist durch Bezugnahme hierin mit eingeschlossen.

Gemäß der oben präsentierten Evaluations-Studie wurde ProteoBind als überlegene Oberflächen-Derivatisierung für die Herstellung von Allergen-Microarrays ausgewählt.
Beispiel 5:
Vergleich der Detektion von Immunglobulin in einer Probe mit immobilisierten rekombinanten Allergenen und mit immobilisiertem Extrakt
Um die Empfindlichkeit und die diagnostisch relevanten Informationen von an einem Microarray immobilisierten gereinigten rekombinanten Allergenen und von an einem Microarray immobilisiertem Allergen-Extrakt zu testen, wurden spezifische Allergene einer Quelle mit einem Allergen-Extrakt derselben Quelle verglichen.
Nach der Immobilisierung von Allergen-Zusammensetzungen an einem Microarray, wurden verschiedene Proben, die das besagte spezifische Serum aufwiesen, auf den Microarray gegeben, und die Fluoreszenz, die der Menge des an die Allergene gebundenen Antikörpers entspricht, wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 3, 4 und 5 sowie in den 4a, 4b und 4c gezeigt, wobei ”FL” für % Fluoreszenz steht. Aus diesen Ergebnissen wird klar, dass im Fall der rekombinanten Allergene die Detektion und Quantifizierung viel empfindlicher ist als im Fall der Allergen-Extrakte. Die Fluoreszenz-Intensität eines einzelnen rekombinanten Antigens ist deutlich größer als die Fluoreszenz-Intensität des Extrakts. Desweiteren kann im Fall des Extrakts nur die Quelle des Extrakts getestet werden, und es ist – im Gegensatz zur Detektion mit rekombinanten Allergenen – nicht möglich, zu testen, welches spezifische Antigen der Quelle für die Allergie verantwortlich ist.

Daher ist das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung einzelner, gereinigter Allergene, insbesondere rekombinanter Allergene, vorteilhaft gegenüber Extrakten, die Allergene umfassen. Tabelle 3

Schaubild 1	Serum 1-Sp	Serum 4-Sp	Serum 19-S	Serum 30-S
Bet v 1a	52028	62529	62932	18847
Bet v 1a Mut	6590	237	905	139
Bet v 1d	1576	14352	252	89
Bet v 2	2196	1408	273	1253
BP-Extrakt	21013	39438	11390	3174

Tabelle 4

Schaubild 2	Serum 5-Sp	Serum 7-Sp	Serum 9-S	Serum 17-S	Serum 18-S	Serum 40-S
Phl p I	45611	12148	21588	5838	23497	23424
Phl p II	209	52043	814	2562	10984	14753
Phl p V	64005	63481	62953	40770	63530	62029
Phl-Extrakt	63987	40318	14504	10183	44405	19798

Tabelle 5

Schaubild 3	Serum 11-Sp	Serum 16-Sp	Serum 39-S	Serum 40-S
Hev b 3	416	387	108	235
Hev b 5-Mal	350	519	30601	63897
Hev b 8	11146	7977	134	853
Hev b 9	460	631	105	188
Hev b 10	360	429	73	152
Latex B-Extrakt	264	202	80	3426
Latex C-Extrakt	769	866	5343	30970

Claims

Ein Verfahren zur Detektion eines an ein Allergen bindenden Immunglobulins E (IgE) in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere gereinigte einzelne Allergene auf einem Microarray-Chip immobilisiert werden, wonach die Probe mit den immobilisierten Allergenen inkubiert wird, so dass Immunglobuline E (IgE), die für die Allergene spezifisch sind, an das spezifische Allergen binden, und danach die an die spezifischen immobilisierten Allergene gebundenen Immunglobuline E (IgE) detektiert werden.
Das Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere rekombinante Allergene auf dem Microarray-Chip immobilisiert werden.
Das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere synthetisch hergestellte Allergene auf dem Microarray-Chip immobilisiert werden.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Haptene als Allergene auf dem Microarray-Chip immobilisiert werden.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Allergene auf einem Spot mit einem Durchmesser von 10 bis 2000 μm auf dem Microarray-Chip immobilisiert werden.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Allergene auf einem Spot mit einem Durchmesser von 50 bis 500 μm, vorzugsweise 150–250 μm, auf dem Microarray-Chip immobilisiert werden.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Allergene auf einem festen Träger als Microarray-Chip immobilisiert werden.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Allergene auf einem Glas- bzw. Kunststoffträger als Microarray-Chip immobilisiert werden.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Allergene auf einem Siliziumplättchen als Microarray-Chip immobilisiert werden.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Allergene auf einer Membran als Microarray-Chip immobilisiert werden.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Microarray-Chip chemisch modifiziert wird, vorzugsweise durch eine Amino-reaktive bzw. Carboxy-reaktive Modifizierung.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Allergene kovalent an den Microarray-Chip gebunden werden.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Immunglobuline in Blutserum als Probe detektiert werden.
Das Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das Blutserum 1:1 bis 1:15, vorzugsweise 1:5 verdünnt wird.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mit den Allergenen 1 Min. bis 24 Stunden, vorzugsweise 1 bis 2 Stunden, inkubiert wird.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mit den Allergenen bei einer Temperatur zwischen 0 und 60°C, vorzugsweise bei 37°C inkubiert wird.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, dadurch gekennzeichnet, dass die gebundenen Immunglobuline mit zumindest einem markierten, spezifischen anti-Immunglobulin-Antikörper detektiert werden.
Das Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die gebundenen Immunglobuline mit zumindest einem Fluoreszenz-markierten, spezifischen anti-Immunglobulin-Antikörper detektiert werden.
Das Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die gebundenen Immunglobuline mit zumindest einem radioaktiv markierten, spezifischen anti-Immunglobulin-Antikörper detektiert werden.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Indoor-Allergene als Allergene immobilisiert werden.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Outdoor-Allergene als Allergene immobilisiert werden.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Nahrungsmittel-Allergene als Allergene immobilisiert werden.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass ein oder mehrere Gift-Allergene als Allergene immobilisiert werden.
Ein Verfahren zur In-vitro-Diagnose von Allergien bei einem Patienten, dadurch gekennzeichnet, dass eine Serumprobe vom Patienten auf an Allergene bindende Immunglobuline E (IgE) gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 23 analysiert wird, wobei ein Microarray-Chip verwendet wird, auf dem zumindest 10, vorzugsweise zumindest 50, besser noch zumindest 90, verschiedene Allergene immobilisiert sind; danach wird eine positive Reaktion zwischen der Probe und den immobilisierten Allergenen als Allergie diagnostiziert.
Verwendung eines Microarray-Chips, auf dem ein oder mehrere gereinigte einzelne Allergene zur Detektion von Immunglobulinen E (IgE) immobilisiert sind.
Verwendung eines Microarray-Chips nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Allergene auf einem Spot mit einem Durchmesser von 100 bis 500 μm, vorzugsweise 200 bis 300 μm, immobilisiert sind.
Verwendung eines Microarray-Chips nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Glasträger handelt.
Verwendung eines Microarray-Chips nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen Kunststoffträger handelt.
Verwendung eines Microarray-Chips nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um ein Siliziumplättchen handelt.
Verwendung eines Microarray-Chips nach Anspruch 25 oder 26, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um eine Membran handelt.
Verwendung eines Microarray-Chips nach einem der Ansprüche 25 bis 30, dadurch gekennzeichnet, dass er chemisch modifiziert ist, vorzugsweise durch eine Amino-reaktive bzw. Carboxy-reaktive Modifizierung.
Verwendung eines Microarray-Chips nach einem der Ansprüche 25 bis 31, dadurch gekennzeichnet, dass die Allergene kovalent daran gebunden sind.
Verwendung eines Kits zur Durchführung eines Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass es einen Microarray-Chip, an dem ein oder mehrere gereinigte einzelne Allergene immobilisiert sind, und ein erstes Reagens umfassend zumindest ein Immunglobulin-detektierendes Reagens, vorzugsweise einen anti-Immunglobulin-Antikörper, vorzugsweise in einer bekannten Konzentration, sowie gegebenenfalls als positive Probe ein zweites Reagens umfassend zumindest ein an ein Allergen bindendes Immunglobulin, aufweist.