DE60110094T2 - Vorrichtung und verfahren zur automatisierten synthese von oligosacchariden - Google Patents

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Description

  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung und Verfahren für die automatische Synthese von Oligosacchariden.
  • Stand der Technik
  • Biopolymere, wie Polypeptide und Polynukleotide werden routinemäßig mittels Festphasen-Verfahren synthetisiert, in welchen Polymer-Untereinheiten schrittweise zu einer wachsenden Polymerkette, die an einem Feststoffträger immobilisiert ist, hinzugefügt werden. Für Polynukleotide und Polypeptide kann diese allgemeine synthetische Prozedur mit kommerziell erhältlichen Synthetisierern durchgeführt werden, die die Biopolymere mit definierten Sequenzen in einer automatisierten oder halbautomatisierten Art und Weise konstruieren. Kommerziell erhältliche Synthetisierer ermöglichen jedoch nicht die effiziente Synthese von Oligosacchariden; typischerweise sind die Ausbeuten an Oligosacchariden, die unter Verwendung von kommerziell erhältlichen Vorrichtungen synthetisiert werden, schlecht.
  • Die Glycosylierungsreaktion ist eine der am gründlichsten untersuchten Transformationen in der organischen Chemie. Im allgemeinsten Sinn ist eine Glycosylierung die Bildung eines Acetats, welches zwei Zuckereinheiten verbindet. Die Mehrheit der Glycosylierungsmittel folgen einem ähnlichen Reaktionsmechanismus. Der anomere Substituent wirkt dabei als eine Abgangsgruppe, wodurch ein elektrophiles Zwischenprodukt erzeugt wird. Die Reaktion dieser Spezies mit einem Nukleophil, typischerweise einer Hydroxyl-Gruppe, führt zu der Bildung einer glykosidischen Bindung. Die Reaktion kann über eine Vielzahl von Zwischenprodukten, in Abhängigkeit von der Natur der Abgangsgruppe, dem Aktivierungsreagenz und dem eingesetzten Lösungsmittel stattfinden.
  • Glycosyltrichloracetimidate, Thioglycoside, Glycosylsulfoxide, Glycosylhalogenide, Glycosylphosphite, n-Pentenylglycoside und 1,2-Anhydrozucker zählen zu den zuverlässigsten Glycosyl-Donatoren (siehe 1). Trotz der Fülle an verfügbaren Glycosylierungsmitteln, hat sich kein einziges Verfahren als ein universeller Donator ausgezeichnet. Im Gegensatz zu der Peptid und Oligonukleotid-Synthese machen die inhärenten Unterschiede in den Monosaccharid-Strukturen es unwahrscheinlich, dass sich ein gemeinsamer Donator durchsetzt. Stattdessen werden individuelle Donatoren in der Konstruktion von bestimmten glykosidischen Bindungsklassen Verwendung finden.
  • Chemische Festphasensynthese
  • Lösungsphasen-Oligosaccharid-Synthese bleibt, aufgrund der Notwendigkeit für die iterative Kopplungs- und Schutzeliminierungsschritten mit einer Reinigung bei jedem Schritt entlang des Weges, ein langsamer Prozess. Um das Erfordernis von sich wiederholenden Reinigungsvorgänge zu mindern, wurden Festphasen-Techniken entwickelt. Für die Festphasen-Oligosaccarid-Synthese sind zwei Verfahren verfügbar (siehe 2 und 3). Das Donator-gebundene Verfahren verbindet den ersten Zucker mit dem Polymer durch das nicht-reduzierende Ende der Monomer-Einheit (2). Der Polymer-gebundene Zucker wird dann in einen Glycosyl-Donator umgewandelt und mit einem Überschuss an Akzeptor und Aktivator behandelt. Die produktive Kopplung führt zu der Polymer-gebundenen Disaccharidbildung, während die Abbauprodukte an das Harz gebunden bleiben. Die Verlängerung der Oligosaccharidkette wird durch Umwandeln der neu hinzugefügten Zuckereinheit in einen Glycosyl-Donator und Wiederholung des obigen Zyklus erreicht. Da die meisten Donatorspezies hoch-reaktiv sind, ist bei Verwendung des Donator-gebundenen Verfahrens die Möglichkeit größer, Polymer-gebundene Nebenprodukte zu bilden.
  • Alternativ haben Akzeptor-gebundene Strategien beachtliche Verwendung in der Festphasen-Oligosaccharid-Synthese (3) gefunden. Bei diesem Ansatz wird der erste Zucker an das Polymer am reduzierenden Ende angelagert. Die Entfernung einer einzigartigen Schutzgruppe am Zucker ergibt einen Polymer-gebundenen Akzeptor. Das reaktive Glycosylierungsmittel wird in Lösung geliefert und die produktive Kopplung führt zu Polymer-gebundenen Oligosacchariden, während die unerwünschten Nebenprodukte, die durch den Donatorabbau verursacht werden, weggewaschen werden. Die Entfernung einer einzigartigen Schutzgruppe an dem Polymer-gebundenen Oligosaccharid gibt eine andere Hydroxylgruppe für die Verlängerung frei.
  • Während die Vorzüge des Donator-gebundenen Verfahrens von Danishefsky und Mitarbeiter gezeigt wurden, bleibt das populärste und allgemein anwendbare Verfahren für die Synthese von Oligosacchariden an einem Polymer-Träger die Akzeptor-gebundene Strategie. Für einen Überblick siehe P. H. Seeberger, S. J. Danishefsky, Acc. Chem. Res., 31 (1998), 685. Die Fähigkeit einen Überschuss an Glycosylierungsmittel in Lösung zu verwenden, um die Reaktion in Richtung Vollständigkeit anzutreiben, hat zu einer weit verbreiteten Verwendung dieses Verfahrens geführt. Alle der oben genannten Glycosylierungsmittel sind mit dem Akzeptor-gebundenen Verfahren mit unterschiedlichen Ausmaß an Erfolg benutzt worden.
  • Es besteht ein zunehmender Bedarf an einer automatisierten Synthese von Oligosacchariden. Es ist, zum Beispiel, oft beim Untersuchen der Struktur-Funktions-Beziehungen, welche Zucker mit einbeziehen, von Interesse, eine Mischung von Oligosacchariden, die unterschiedliche Reste an einer bestimmten Position aufweisen oder die sich in der anomeren Konfiguration an einer glycosidischen Bindung unterscheiden, zu erzeugen. Als weiters Beispiel können Oligosaccharide, die eine gewünschte Aktivität, wie eine hohe Bindungsaffinität zu einem gegebenen Rezeptor oder Antikörper aufweisen, durch (a) Erzeugen einer großen Anzahl von Oligosacchariden mit zufälliger Sequenz, und (b) Screenen dieser Oligosaccharide, um ein oder mehrere Oligosaccharide mit der gewünschten Bindungsaffinität zu identifizieren, ermittelt werden.
  • Eine derzeitige Vorrichtung zum Synthetisieren von Oligosacchariden ist sowohl hinsichtlich der Anzahl als auch der Quantität der Oligosaccharide, die synthetisiert werden können, eingeschränkt. Diese Einschränkungen haben die Verfügbarkeit von Oligosacchariden für sowohl Strukturuntersuchung als auch für Auswahlverfahren begrenzt.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • In einem ersten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung für die automatisierte Festphasen-Synthese von Oligosacchriden bereit, welche Folgendes aufweist: ein Reaktionsgefäß mit mindestens einem unlöslichen Harzkügelchen, mindestens ein Donatorgefäß mit einer Sacchariddonatorlösung, mindestens ein Aktivatorgefäß mit einer Aktivatorreagenslösung, mindestens ein Deblockierungsgefäß mit einer Deblockierungsreagenslösung, mindestens ein Lösungsmittelgefäß mit einem Lösungsmittel; ein Lösungstransfersystem, welches in der Lage ist, die Sacchariddonatorlösung, Aktivatorreagenslösung, Deblockierungsreagenslösung und das Lösungsmittel zu übertragen; und einen Computer zur Steuerung des Lösungstransfersystems. Das/Die unlöslichen Harzkügelchen können aus einem Octendiol-funktionalisierten Harz bestehen.
  • Eine Vorrichtung gemäß der Erfindung kann für die wirksame Synthese von Oligosacchariden auf einem Feststoffträger verwendet werden, der z. B. durch die Addition von Untereinheiten an terminale Untereinheiten, die an Festphasen-Partikel immobilisiert sind, gebildet ist. In bestimmten Ausführungsformen wird die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung in kombinatorischen Verfahren verwendet, zum Beispiel, wie hierin beschrieben zum Synthetisieren von Oligosacchariden.
  • Die unlöslichen Harzkügelchen, die innerhalb des Reaktionsgefäßes enthalten sind, können einen Glycosyl-Akzeptor über einen organischen Linker an das Harzkügelchen gebunden haben. Der organische Linker kann Glycosylphosphat aufweisen.
  • Die Vorrichtung kann eine Temperatursteuerungseinheit für das Regulieren der Temperatur des Reaktionsgefäßes aufweisen. Die Temperatursteuereinheit kann durch denselben Computer, der das Lösungssteuerungssystem kontrolliert, gesteuert werden und kann die interne Temperatur des Reaktionsgefäßes messen. Die Temperatursteuereinheit kann in der Lage sein die Reaktionstemperatur auf einer Temperatur zwischen –80°C und +60°C, vorzugsweise zwischen –25°C und +40°C zu halten. In einer Ausführungsform der Erfindung kann das Reaktionsgefäß eine doppelwandige Struktur sein, welche zwei Hohlräume bildet, wobei in dem ersten Hohlraum die Synthese der Oligosaccharide stattfindet, und wobei der zweite Hohlraum ein Kühlmittel der Temperaturregelungseinheit enthält. Die doppelwandige Struktur des Reaktionsgefäßes kann aus Glas bestehen.
  • Die Saccharid-Donatorlösung im Donatorgefäß kann eine Monosaccharid-Donatorlösung sein. Das Lösungstransfersystem kann in der Lage sein, die Lösung während sie unter einem inerten Gasdruck gehalten wird, zu übertragen.
  • Das/die Donatorgefäß(e) kann/können eine Lösung, welche ein Glycosyltrichloracetimidat aufweist und/oder eine Glycosylphosphat-Lösung enthalten.
  • Das/die Aktivatorgefäß(e) kann/können eine Lösung enthalten, welche eine Lewis-Säure, wie ein Silyltrifluormethansulfonat, wie ein Trimethylsilyltrifluormethansulfonat aufweist.
  • Das/die Deblockierungsgefäß(e) kann/können eine Lösung enthalten, welche Natriummethoxid (das in Methanol sein kann) oder Hydrazin aufweist.
  • Das/die Lösungsmittelgefäß(e) kann/können Dichlormethan, Methanol und/oder Tetrahydrofuran enthalten. Ein erstes Lösungsmittelgefäß kann Dichlormethan enthalten, ein zweites Lösungsmittelgefäß kann Methanol enthalten und ein drittes Lösungsmittelgefäß kann Tetrahydrofuran enthalten.
  • Die Vorrichtung kann weiters zumindest ein Blockierungsgefäß aufweisen, welches eine Blockierungsreagenslösung enthält. Das/Die Blockierungsgefäß(e) kann/können eine Lösung enthalten, zum Beispiel, eine Lösung, welche Benzyltrichloracetimidat oder eine Carbonsäure enthält. Die Carbonsäure kann Levulinsäure sein. In einer Ausführungsform enthält ein erstes Lösungsmittelgefäß Dichlormethan, ein zweites Lösungsmittelgefäß enthält Methanol und ein drittes Lösungsmittelgefäß enthält Tetrahydrofuran; ein viertes Lösungsmittelgefäß enthält eine Lösung, welche Pyridin und Essigsäure aufweist und ein fünftes Lösungsmittelgefäß enthält eine 0,2 M Lösung von Essigsäure in Tetrahydrofuran. In einer anderen Ausführungsform enthält ein erstes Donatorgefäß eine Lösung, welche Glycosyltrichloracetimidat aufweist, ein zweites Donatorgefäß enthält eine Lösung, welche ein erstes Glycosylphosphat aufweist, ein drittes Donatorgefäß enthält eine Lösung, welche ein zweites Glycosylphosphat aufweist, das zumindest eine Aktivatorgefäß enthält eine Lösung, welche Trimethylsilyltrifluormethansulfonat aufweist, ein erstes Deblockierungsgefäß enthält eine Lösung, welche Hydrazin aufweist, ein zweites Deblockierungsgefäß enthält eine Lösung, welche Natriummethoxid aufweist, ein erstes Lösungsmittelgefäß enthält Dichlormethan, ein zweites Lösungsmittelgefäß enthält Methanol und ein drittes Lösungsmittelgefäß enthält Tetrahydrofuran, ein viertes Lösungsmittelgefäß enthält eine Lösung, welche Pyridin und Essigsäure aufweist und ein fünftes Lösungsmittelgefäß enthält eine 0,2 M Lösung von Essigsäure in Tetrahydrofuran.
  • In einem zweiten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Bilden einer Kohlenstoff-Heteroatom-Bindung zwischen einem Glycosyl-Donator und einem Substrat bereit, welches Verfahren in Lösung im Reaktionsgefäß einer Vorrichtung der Erfindung, einen Glycosyldonator, welcher einen reaktiven anomeren Kohlenstoff aufweist, ein Substrates, welches ein Heteroatom aufweist, welches einen Wasserstoff trägt, und ein Aktivierungsreagens kombiniert, wobei das Aktivierungsreagens den reaktiven anomeren Kohlenstoff des Glycosyldonators aktiviert, wodurch ein Produkt gebildet wird, welches eine Kohlenstoff-Heteroatom-Bindung zwischen dem anomeren Kohlenstoff des Glycosyldonators und dem Heteroatom des Substrates aufweist. Der Glycosyldonator, welcher einen reaktiven anomeren Kohlenstoff aufweist, kann aus der Gruppe bestehend aus Glycosylphosphaten, Glycosylphosphiten, Glycosyltrichloracetimidaten, Glycosylhalogeniden, Glycosylsulfiden, Glycosylsulfoxiden, n-Pentenylglycosiden und 1,2-Anhydroglycosiden ausgewählt sein. Das Heteroatom, welches einen Wasserstoff des Substrates trägt, kann aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel ausgewählt sein.
  • In bestimmten Ausführungsformen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, ist das Aktivierungsreagens eine Lewissäure. In bestimmten Ausführungsformen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, ist das Aktivierungreagens Silyltrifluoromethansulfonat. In bestimmten Ausführungsformen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist das Aktivierungreagens Trimethylsilyltrifluormethansulfonat.
  • In bestimmten Ausführungsformen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, ist das Substrat, welches ein einen Wasserstoff tragendes Heteroatom aufweist, über einen kovalenten Linker an einen Feststoffträger gebunden. In bestimmten Ausführungsformen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist der kovalente Linker -O-(CH2)3CH=CH(CH2)3-O-. In bestimmten Ausführungsformen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist der feste Träger ein Harzkügelchen.
  • In bestimmten Ausführungsformen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, ist der besagte einen reaktiven anomeren Kohlenstoff aufweisenden Glycosyldonator, über einen kovalenten Linker an einen Feststoffträger gebunden. In bestimmten Ausführungsformen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung, ist der kovalente Linker -O-(CH2)3CH=CH(CH2)3-O-. In bestimmten Ausführungsformen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist der Feststoffträger ein Harzkügelchen.
  • In bestimmten Ausführungsformen des Verfahrens der vorliegenden Erfindung ist das besagte Substrat, welches ein einen Wasserstoff tragendes Heteroatom aufweist, aus der Gruppe bestehend aus Monosacchariden, Oligosacchariden, Polysacchariden und Glycokonjugaten ausgewählt.
  • In bestimmten Ausführungsformen weist ein Verfahren der vorliegen Erfindung weiters die Schritte des Anwendens von Überdruck oder eines Vakuums auf das Reaktionsgefäß der Vorrichtung auf, wodurch die flüssige Phase aus dem Reaktionsgefäß der Vorrichtung entfernt wird, sowie der Zugabe von Lösungsmittel zum Reaktionsgefäß der Vorrichtung.
  • In bestimmten Ausführungsformen weist ein Verfahren der vorliegen Erfindung weiters den Schritt des Behandelns des Produktes im Reaktionsgefäß der Vorrichtung mit einer Lösung auf, welche ein Reagens zur Entfernung des Schutzes aufweist, wodurch eine Schutzgruppe von dem Produkt entfernt wird, um ein zweites Produkt zu erzeugen, welches ein einen Wasserstoff tragendes Heteroatom aufweist, wobei das zweite Produkt über einen kovalenten Linker an einen Feststoffträger gebunden ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen weist ein Verfahren der vorliegen Erfindung weiters in Lösung in dem Reaktionsgefäß der Vorrichtung den Schritt auf, einen Glycosyldonators, welcher einen reaktiven anomeren Kohlenstoff aufweist, wobei das zweite Produkt ein einem Wasserstoff tragendes Heteroatom aufweist, mit einem Aktivierungsreagens zu kombinieren, wobei das Aktivierungsreagens den reaktiven anomeren Kohlenstoff des Glycosyldonators aktiviert, wodurch ein drittes Produkt gebildet wird, welches eine Kohlenstoff-Heteroatom-Bindung zwischen dem anomeren Kohlenstoff des Glycosyldonators und dem Heteroatom des zweiten Produktes aufweist, wobei das dritte Produkt über einen kovalenten Linker an einen Feststoffträger gebunden ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen weist ein Verfahren der vorliegenden Erfindung weiters den Schritt des Behandeln des Produktes im Reaktionsgefäß der Vorrichtung mit einer Lösung auf, welche ein Umwandlungsreagens zum Herstellen eines zweiten Produktes aufweist, welches einen reaktiven anomeren Kohlenstoff aufweist, wobei das zweite Produkt über einen kovalenten Linker an einen Feststoffträger gebunden ist.
  • In bestimmten Ausführungsformen weist ein Verfahren der vorliegen Erfindung weiters in Lösung in dem Reaktionsgefäß der Vorrichtung den Schritt auf, ein Substrates, welches ein einen Wasserstoff tragendes Heteroatom aufweist, wobei das zweite Produkt einen reaktiven anomeren Kohlenstoff aufweist, mit einem Aktivierungsreagens zu kombinieren, wobei das Aktivierungsreagens den reaktiven anomeren Kohlenstoff des zweiten Produktes aktiviert, wodurch ein drittes Produkt gebildet wird, welches eine Kohlenstoff-Heteroatom-Bindung zwischen dem anomeren Kohlenstoff des zweiten Produktes und dem Heteroatom des Substrates aufweist, wobei das dritte Produkt über eine kovalenten Linker an einen Feststoffträger gebunden ist.
  • Kurze Beschreibung der Figuren
  • 1 stellt bestimmte, häufig verwendete Glycosylierungsmittel dar.
  • 2 stellt im Allgemeinen eine Donator-gebundene Festphasen Kohlenhydrat-Synthese dar.
  • 3 stellt im Allgemeinen eine Akzeptor-gebundene Kohlenhydrat-Synthese dar.
  • 4 stellt die Hauptklassen von sich wiederholenden Biooligomeren dar, die für den Signalübertragungsprozess verantwortlich sind.
  • 5 stellt eine Ausführungsform eines automatisierten Oligosaccharid-Synthetisierers gemäß der vorliegenden Erfindung dar.
  • 6 stellt eine andere Ausführungsform eines automatisierten Oligosaccharid-Synthetisierers gemäß der vorliegenden Erfindung dar.
  • 7 stellt eine Ausführungsform eines doppelwandigen, gekühlten Reaktionsgefäßes gemäß der vorliegenden Erfindung dar.
  • 8 stellt einen Vergleich der 2D-NMR Spektra von Harz-gebundenen und Lösungsphasen-Pentasacchariden dar.
  • 9 stellt ein vollkommen geschütztes Phyloalexin-Induktor(PE)-Glucan dar, das unter Verwendung der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung synthetisiert wurde.
  • 10 stellt einen Überblick einer automatisierten Festphasen-Synthese von Oligosacchariden dar.
  • 11 stellt einen Überblick der Schritte einer automatisierten Festphasen-Synthese von Oligosacchariden unter Verwendung von Glycosylphosphaten dar.
  • 12 stellt ein Zyklus der Oligosaccharid-Synthese an dem Feststoffträger unter Verwendung von Glycosylphosphaten dar.
  • 13 stellt den automatisierten Synthese-Zyklus, der in der Synthese eines Hexasaccharid unter Verwendung von Glycosylphosphaten verwendet wird, dar.
  • 14 stellt die HPLC Daten für Hexasaccharid dar, die unter Verwendung der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung synthetisiert wurden.
  • 15 stellt einen Überblick der Schritte der automatisierten Synthese von Oligomannosiden dar.
  • 16 stellt Oligosaccharide, die unter Verwendung der Verfahren und Vorrichtung der Erfindung synthetisiert wurden und den Kopplungzyklus, der für die Synthese der Oligosaccharide verwendet wurde, dar.
  • 17 stellt die HR-MAS HMQC Daten für ein Oligosaccharid dar, die unter Verwendung von sowohl der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung als auch in Lösung synthetisiert wurden.
  • 18 stellt die HPLC Daten für Heptamannosid dar, das unter Verwendung der Vorrichtung der vorliegenden Erfindung synthetisiert wurde.
  • 19 stellt die automatisierte Synthese eines Decamannosid, unter Verwendung von Trichloracetimidat-Glycosyl-Dontoren dar.
  • 20 stellt die automatisierte Synthese der Leishmania-Kappe-Tetrasaccharide dar.
  • 21 stellt die automatisierte Synthese der GlcA Trisaccharide dar.
  • 22 stellt die automatisierte Synthese der Polyglucosamine dar.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Definitionen:
  • Für die Zweckdienlichkeit wurden bestimmte Begriffe in der Beschreibung, den Beispielen, und den angeschlossenen Ansprüchen hier bestimmt.
  • Der Begriff „Heteroatom” wie er hierin verwendet wird, bedeutet ein Atom jedes Elements, das von Kohlenstoff oder Wasserstoff verschieden ist Bevorzugte Heteroatome sind Bor, Stickstoff, Sauerstoff, Phosphor, Schwefel und Selen.
  • Der Begriff „elektronenabziehende Gruppe” ist im Fachgebiet anerkannt und bedeutet die Tendenz eines Substituenten Valenzelektronen von benachbarten Atomen anzuziehen, d. h., in Bezug auf die Nachbaratome ist der Substituent elektronegativ. Eine Quantifizierung des Niveaus der elektronenabziehende Fähigkeit ist durch die Hammett-Sigma()-Konstante gegeben. Diese bekannte Konstante ist in vielen Literaturstellen beschrieben, zum Beispiel, J. March, Advanced Organic Chemistry, McGraw Hill Book Company, New York, (1977 Ausgabe), S. 251–259. Die Werte der Hammet-Konstante sind im Allgemeinen für elektronendonierende Gruppen ([P] = –0,66 für NH2) negativ und für elektronenabziehende Gruppe ([P] = 0,78 für eine Nitrogruppe) positiv, wobei [P] eine Para-Substitution anzeigt. Zu Beispielen von elektronenabziehenden Gruppen zählen Nitro, Acyl, Formyl, Sulfonyl, Trifluoromethyl, Cyano, Chlorid, und dergleichen. Zu Beispielen von elektronendonierenden Gruppen zählen Amino, Methoxy und dergleichen.
  • Der Ausdruck „Alkyl” bezeichnet ein Radikal einer gesättigten aliphatischen Gruppe, einschließlich geradkettiger Alkylgruppen, verzweigtkettiger Alkylgruppen, Cycloalkyl (alicyclisch) Gruppen, Alkyl substitutierte Cyclalkyl-Gruppen und Cyclalkyl substituierte Alkyl-Gruppen. In bevorzugten Ausführungsformen, hat ein geradkettiges oder verzweigtkettiges Alkyl 30 oder weniger Kohlenstoffatome in der Hauptkette (z. B. C1-C30 für geradkettige, C3-C30 für verzweigtkettige), und noch bevorzugter 20 oder weniger. Gleichermaßen weisen bevorzugte Cycloalkyle 3-10 Kohlenstoffatome in ihrer Ringstruktur auf, und noch bevorzugter haben sie 5, 6 oder 7 Kohlenstoffe in ihrer Ringstruktur.
  • Der Begriff „Aralkyl” wie er hierin verwendet wird betrifft eine Alkylgruppe die mit einer Aryl-Gruppe (z. B., eine aromatische oder heteroaromatisehe Gruppe) substituiert ist.
  • Der Begriff „Alkenyl” und „Alkynyl” betrifft ungesättigte aliphatische Gruppen, die in ihre Länge und möglichen Substituion zu den oben beschriebenen Alkylen analog sind, jedoch zumindest eine Doppel- bzw. Dreifachbindung enthalten.
  • Wenn die Anzahl der Kohlenstoffatome nicht anders spezifiziert ist, bedeutet ein „niederes Alkyl” so wie es hierin verwendet wird, eine wie oben definierte Alkyl-Gruppe, jedoch mit einem bis zehn Kohlenstoffen, bevorzugter von einem bis sechs Kohlenstoffatomen in ihrer Hauptkettenstruktur. Gleichermaßen haben „niedere Alkenyl” und „nieder Alkynyl” ähnliche Kettenlängen. Bevorzugte Alkyl-Gruppen sind niedere Alkyle. In bevorzugten Ausführungsformen ist ein hierin als Alkyl bezeichneter Substituent ein niederes Alkyl.
  • Der Begriff „Aryl” wie er hierin verwendet wird umfasst 5-, 6- und 7-gliedrige aromatische Einzelring-Gruppen, wie zum Beispiel Benzen, Pyrrol, Furan, Thiophen, Imidazol, Oxazol, Thiazol, Triazol, Pyrazol, Pyridin, Pyrazin, Pyridazin und Pyrimidin, und dergleichen, die von Null bis Vier Heteroatome enthalten. Jene Aryl-Gruppen mit Heteroatomen in der Ringstruktur können ebenfalls als „Arylheterocyclen” oder „Heteroaromaten” bezeichnet werden. Der aromatische Ring kann an einer oder mehreren Ringpositionen, mit solchen Substituenten, wie oben beschrieben, wie zum Beispiel, Halogen, Azid, Alkyl, Aralkyl, Alkenyl, Alkynyl, Cycloalky, Hydroxyl, Alkoxyl, Amino, Nitro, Sulfhydryl, Imino, Amido, Phosphonat, Phosphinat, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Alkylthio, Sulfonyl, Sulfonamido, Keton, Aldehyde, Ester, Heterocyclyl, aromatische und heteroaromatische Reste, -CF3, -CN, oder dergleichen, substituiert sein. Der Begriff „Aryl” beinhaltet auch polycyclische Ringsysteme mit zwei oder mehr cyclischen Ringen, in welchen zwei angrenzende Ringe zwei oder mehr Kohlenstoffe gemeinsam haben (die Ringe sind „kondensierte Ringe”), wobei zumindest einer der Ringe aromatisch ist, z. B, kann der andere cyclische Ring Cycloalkyle, Cycloalkenyle Cycloalkynyle, Aryle und/oder Heterocyclyle sein.
  • Die Begriffe ortho, meta, und para gelten für 1,2-, 1,3- bzw. 1,4-disubstituierte Benzene. Zum Beispiel sind die Namen 1,2-Dimethylbenzen und ortho-Dimethylbenzen synonym zu verwenden.
  • Die Begriffe „Heterocyclyl” oder „heterocyclische Gruppe” beziehen sich auf 3- bis 10-gliedrige Ringstrukturen, bevorzugter 3- bis 7-gliedrige Ringe, deren Ringstrukturen ein bis vier Heteroatome enthalten. Heterocyclen können ebenso Polycyclen sein. Zu Heterocyclyl-Gruppen zählen zum Beispiel Thiophen, Thianthren, Furan, Pyran, Isobenzofuran, Chromen, Xanthen, Phenoxathiin, Pyrrol, Imidazol, Pyrazol, Isothiazol, Isoxazol, Pyridin, Pyrazin, Pyrimidin, Pyridazin, Indolizin, Isoindol, Indol, Indazol, Purin, Chinolizin, Isochinolin, Chinolin, Phthalazin, Naphthyridin, Chinoxalin, Chinazolin, Chinnolin, Pteridin, Carbazol, Carbolin, Phenanthridin, Acridin, Pyrimidin, Phenanthrolin, Phenazin, Phenarsazin, Phenothiazin, Furazan, Phenoxazin, Pyrrolidin, Oxolan, Thiolan, Oxazol, Piperidin, Piperazin, Morpholin, Lactone, Lactame, wie Azetidinone, und Pyrrolidinone, Sultame, Sultone, und dergleichen. Der heterocyclische Ring kann an einer oder mehreren Positionen mit solchen, wie oben beschriebenen, Substituenten substituiert sein, wie zum Beispiel Halogen, Alkyl, Aralkyl, Alkenyl, Alkynyl, Cycloalkyl, Hydroxyl, Amino, Nitro, Sulfhydryl, Imino, Amido, Phosphonat, Phosphinat, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ether, Alkylthio, Sulfonyl, Keton, Aldehyd, Ester, ein aromatischer oder heteroaromatischer Rest, -CF3, -CN oder dergleichen.
  • Der Begriff „Polycyclyl” oder „polycyclische Gruppe” bezieht sich auf zwei oder mehr Ringe (d. h., Cyclalkyle, Cycloalkenyle, Cycloalkynyle, Aryle und/oder Heterocyclyle), in welchen zwei benachbarte Ringe zwei oder mehr Kohlenstoffatome gemeinsam haben, z. B. die Ringe sind „kondensierte Ringe”. Ringe die durch nicht-benachbarte Atome verbunden sind werden „überbrückte” Ringe genannt. Jeder der Ringe der Polycyclen können durch solche Substituenten, wie oben beschrieben, substituiert werden, wie zum Beispiel Halogen, Alkyl, Aralkyl, Alkenyl, Alkynyl, Cycloalkyl, Hydroxyl, Amino, Nitro, Sulfydryl, Imino, Amido, Phosphonat, Phosphinat, Carbonyl, Carboxyl, Silyl, Ester, Alkylthio, Sulfonyl, Keton, Aldehyd, Ester, ein Heterocyclyl, ein aromatischer oder heteroaromatische Rest, -CF3, -CN, oder dergleichen.
  • Wie hierin verwendet bedeutet der Begriff „Nitro” -NO2; der Begriff „Halogen” bezeichnet -F, -Cl, -Br oder -I; der Begriff „Sulfhydryl” bedeutet -SH; der Begriff „Hydroxyl” bedeutet -OH; und der Begriff „Sulfonyl” bedeutet -SO2.
  • Die Begriffe „Amin” und „Amino” sind im Fach anerkannt und beziehen sich beide auf unsubstituierte und substituierte Amine, z. B., einen Rest der durch die allgemeine Formel dargestellt werden kann:
    Figure 00110001
    wobei R9, R10 und R'10 jeweils unabhängig eine Gruppe, die durch die Valenzregeln zugelassen sind, darstellt.
  • Der Begriff „Acylamino” ist im Fach anerkannt und bezieht sich auf einen Rest, der durch die folgende allgemeine Formel dargestellt werden kann:
    Figure 00110002
    wobei R9 wie oben definiert ist, und R'11 stellt ein Wasserstoff, ein Alkyl, ein Alkenyl oder -(CH2)m-R8 dar, wobei m und R8 wie oben definiert sind.
  • Der Begriff „Amido” ist im Fach als ein Amino-substituiertes Carbonyl anerkannt und beinhaltet einen Rest, der durch die allgemeine Formel dargestellt werden kann
    Figure 00120001
    wobei R9, R10 wie oben definiert sind. Bevorzugte Ausführungsformen des Amids werden keine Imide beinhalten, welche instabil sein können.
  • Der Begriff „Alkylthio” bezieht sich auf eine Alkyl-Gruppe, wie oben definiert, mit einem daran gebundenen Schwefelradikal. In bevorzugten Ausführungsformen ist der „Alkylthio”-Rest durch eines von -S-Alkyl, -S-Alkyl, -S-Alkenyl, -S-Alkynyl, und -S(CH2)m-R8 dargestellt, wobei m und R8 wie oben definiert sind.
  • Der Begriff „Carbonyl” ist im Fachgebiet anerkannt und beinhaltet solche Reste, die wie durch die allgemeine Formel dargestellt sind:
    Figure 00120002
    wobei X eine Bindung ist oder Sauerstoff oder ein Schwefel darstellt, und R11 stellt ein Wasserstoff, ein Alkyl, ein Alkenyl oder -(CH2)m-R8 oder ein pharmazeutisch akzeptables Salz dar, R'11 stellt ein Wasserstoff, ein Alkenyl oder -(CH2)m-R8 dar, wobei m und R8 wie oben definiert sind.
  • Wo X ein Sauerstoff ist und R11 oder R'11 nicht Wasserstoff ist, stellt die Formel einen „Ester” dar. Wo X ein Sauerstoff ist, und R11 wie oben definiert ist, bezieht sich der Rest hierin auf eine Carboxyl-Gruppe, und insbesondere wenn R11 ein Wasserstoff ist, stellt die Formel eine „Carbonsäure” dar. Wo X ein Sauerstoff ist, und R'11 Wasserstoff ist, stellt die Formel ein „Formiat” dar. Im Allgemeinen, wo das Sauerstoff-Atom der obigen Formel durch einen Schwefel ersetzt ist, stellt die Formel eine „Thiolcarbonyl”-Gruppe dar. Wo X Schwefel ist und R11 oder R'11 nicht Wasserstoff ist, stellt die Formel einen „Thiolester” dar. Wo X Schwefel ist und R11 Wasserstoff ist, stellt die Formel eine „Thiolcarbonsäure” dar. Wo X Schwefel ist und R'11 Wasserstoff ist, stellt die Formel einen „Thiolformiat” dar. Andererseits wenn X eine Bindung ist, und R11 nicht Wasserstoff ist, stellt die obige Formel eine „Keton”- Gruppe dar. Wenn X eine Bindung ist, und R11 Wasserstoff ist, stellt die obige Formel eine „Aldehyd”-Gruppe dar.
  • Die Begriffe „Alkoxyl” oder „Alkoxy” wie sie hierin verwendet werden beziehen sich auf eine Alkyl-Gruppe, wie oben definiert, mit einem daran gebundenen Sauerstoffradikal. Repräsentative Alkoxyl-Gruppen beinhalten Methoxy, Ethoxy, Propyloxy, tert-Butoxy und dergleichen. Ein „Ether” besteht aus zwei Kohlenwasserstoffen, die über einen Sauerstoff” kovalent miteinander verbunden sind. Dementsprechend ist oder ähnelt der Substituent eines Alkyls, der das Alkyl zu einem Ether macht, einem Alkoxyl, wie zum Beispiel durch eines von -O-Alkyl, -O-Alkenyl, -O-Alkynyl, -O-(CH2)m-R8 dargestellt sein kann, wobei m und R8 wie oben beschrieben sind.
  • Der Begriff „Sulfonat” ist im Fach anerkannt und beinhaltet einen Rest, der durch die allgemeine Formel dargestellt werden kann:
    Figure 00130001
    wobei R41 ein Elektronenpaar, Wasserstoff, Alkyl, Cycloalkyl, oder Aryl ist.
  • Die Begriffe Triflyl, Tosyl, Mesyl, und Nonaflyl sind im Fach anerkannt und beziehen sich auf Trifluormethansulfonyl, p-Toluensulfonyl, Methansulfonyl, bzw. Nonafluorbutansulfonyl-Gruppen. Die Begriffe Triflat, Tosylat, Mesylat, und Nonaflat sind im Fach anerkannt und beziehen sind auf Trifluormethansulfonatester, p-Toluensulfonatester, Methansulfonatester, und Nonafluorbutansulfonatester funktionelle Gruppen bzw. Moleküle, die solche Gruppen enthalten.
  • Die Abkürzungen Me, Et, Ph, Tf, Nf, Ts, Ms repräsentieren Methyl, Ethyl, Phenyl, Trifluormethansulfonyl, Nonafluorbutansulfonyl, p-Toluensulfonyl bzw. Methansulfonyl. Eine umfangreichere Liste von Abkürzungen, die durch den Durchschnittsfachmann der Organischen Chemie benutzt werden, erscheinen in der ersten Ausgabe jedes Bandes des Journal of Organic Chemistry; diese Liste ist üblicherweise in einer Tabelle mit dem Titel Standard List of Abbreviations dargesellt. Die in dieser Liste enthaltenen Abkürzungen, und alle Abkürzungen die durch den Durchschnittsfachmann der Organischen Chemie benutzt werden sind hiermit durch Bezugnahme aufgenommen.
  • Der Begriff „Sulfat” ist im Fach anerkannt und beinhaltet einen Rest, der durch die allgemeine Formel dargestellt werden kann:
    Figure 00140001
    wobei R41 wie oben definiert ist.
  • Der Begriff „Sulfonylamino” ist im Fach anerkannt und beinhaltet einen Rest, der durch die folgende Formel dargestellt werden kann:
    Figure 00140002
  • Der Begriff „Sulfamoyl” ist im Fach anerkannt und beinhaltet einen Rest, der durch die folgende Formel dargestellt werden kann:
    Figure 00140003
  • Der Begriff „Sulfonyl” ist im Fach anerkannt und beinhaltet einen Rest, der durch die folgende Formel dargestellt werden kann:
    Figure 00140004
    wobei R44 aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Cycloalkyl, Heterocyclyl, Aryl, oder Heteroaryl ausgewählt ist.
  • Der Begriff „Sulfoxido”, wie hierin verwendet, bezieht sich auf einen Rest, der durch die folgende Formel dargestellt werden kann:
    Figure 00140005
    wobei R44 aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Cycloalkyl, Heterocyclyl, Aralkyl, oder Aryl ausgewählt ist.
  • Ein „Selenalkyl” bezieht sich auf eine Alkyl-Gruppe mit einer daran gebundenen, substituierten Selen-Gruppe. Beispielhafte „Selenether”, die auf ein Alkyl substituiert sein können, sind aus einem von -Se-Alkyl, -Se-Alkenyl, -Se-Alkynyl, und -Se-(CH2)m-R7 ausgewählt, wobei m und R7 wie oben definiert sind.
  • Analoge Substitutionen können auf Alkenyl und Alkynyl-Gruppen vorgenommen werden, um zum Beispiel Aminoalkenyle, Aminoalkynyle, Amidoalkenyle, Amidoalkynyle, Iminoalkenyle, Iminoalkynyle, Thioalkenyle, Carbonyl-substituierte Alkenyle oder Alkynyle herzustellen.
  • Wie hierin verwendet, ist beabsichtigt, dass die Definition jedes Ausdrucks, z. B. Alkyl, m, n, etc, wenn er mehr als einmal in einer beliebigen Struktur vorkommt, einabhängig von seiner Definition an einer andere Stelle in der gleichen Struktur sein kann.
  • Es ist verständlich, dass „Substitution” oder „substituiert mit” die implizite Bestimmung mit einschließt, dass eine solche Substitution in Übereinstimmung mit der zugelassenen Valenz des substituierten Atoms und des Substituenten erfolgt, und dass die Substitution zu einer stabilen Verbindung, z. B. welche keine spontane Transformation wie Umordnung, Zyklisierung oder Eliminierung erfährt, führt.
  • Wie hierin verwendet, ist der Begriff „substituiert” so anzusehen, dass er alle zulässigen Substituenten von organischen Verbindungen einschließt. Im weiten Sinn beinhalten die zulässigen Substituenten acyclische und cyclische, verzweigte und unverzweigte, carbocyclische und heterocyclische, aromatische und nicht-aromatische Substituenten organischer Verbindungen. Zu beispielhaften Substituenten zählen, zum Beispiel, jene, die hierin beschrieben sind. Die zulässigen Substituenten können ein oder mehrere und die gleichen oder verschiedene für entsprechende organische Verbindungen sein. Für Zwecke dieser Erfindung, können die Heteroatome, wie Stickstoff Wasserstoff-Substituenten und/oder jeden beliebigen zulässigen Substituenten organsicher Verbindungen aufweisen, die hierin beschrieben sind, welche die Valenzen der Heteroatome erfüllen. Diese Erfindung ist nicht beabsichtigt durch die zulässigen Substituenten organischer Verbindungen in einer beliebigen Art und Weise eingeschränkt zu sein.
  • Die Phrase „Schutzgruppe”, wie sie hierin verwendet wird, bedeutet temporäre Substituenten, welche potentiell reaktive funktionelle Gruppen vor ungewünschten chemischen Transformationen schützt. Zu Beispielen von solchen Schutzgruppen zählen Ester von Carbonsäuren, Silylether von Alkoholen, und Acetale bzw. Ketale von Aldehyden bzw. Ketonen. Das Gebiet der Schutzgruppenchemie wurde besprochen (Greene, T. W.; Wuts, P. G. M. Protective Groups in Organic Synthesis, 2. Ausgabe; Wiley; New York, 1991).
  • Bestimmte Verbindungen der vorliegenden Erfindung können in besonderen geometrischen oder stereoisomerischen Formen existieren. Die vorliegende Erfindung betrachtet alle solche Verbindungen, einschließlich cis- und trans-Isomere, R- und S-Enationmere, Diastereomere, (D)-Isomere, (L)-Isomere, die racemischen Gemische davon, und andere Mischungen davon, als innerhalb des Schutzumfanges der Erfindung fallend. Zusätzliche asymmetrische Kohlenstoffatome können in einem Substituenten, wie einer Alkylgruppe, vorhanden sein. Alle solche Isomere, sowie Mischungen davon, sind beabsichtigt in dieser Erfindung eingeschlossen zu sein.
  • Wenn zum Beispiel ein bestimmtes Enantiomer einer Verbindung der vorliegenden Erfindung gewünscht ist, kann es durch asymmetrische Synthese oder durch Ableitung mit einem chiralen Hilfszusatz, wo die resultierende diastereomerische Mischung getrennt und die Hilfsgruppe abgespalten wird, um das reine gewünschte Enantiomer bereitzustellen, hergestellt werden. Alternativ werden in Fällen wo das Molekül eine basische funktionelle Gruppe, wie etwa Amino oder eine saure funktionelle Gruppe, wie etwa Carboxyl enthält, mit einer entsprechenden optisch-aktiven Säure oder Base gebildet werden, gefolgt von der Trennung der auf diese Weise gebildeten Diastereomere durch fraktionierte Kristallisation oder durch chromatographische Mittel, die im Fach bekannt sind, und im Anschluss daran die Gewinnung der reinen Enantiomere.
  • Betrachtete Äquivalente der oben beschriebenen Verbindungen beinhalten Verbindungen, die sonst damit korrespondieren, und die dieselben allgemeinen Eigenschaften davon aufweisen (z. B. als Analgetika wirkend), wobei eine oder mehrere einfache Variationen der Substituenten gemacht werden, die die Wirksamkeit der Verbindung beim Binden an die Sigma-Rezeptoren nicht nachteilig beeinflussen. Im Allgemeinen können die Verbindungen der vorliegenden Erfindung durch die Verfahren hergestellt werden, die in den allgemeinen Reaktionsschemata dargestellt sind, die zum Beispiel unten beschriebenen sind, oder durch Modifikation davon, mittels Verwendung von leicht verfügbaren Ausgangsmaterialien, Reagenzien und herkömmlichen Synthese-Prozeduren. In diesen Reaktionen ist es auch möglich, von Varianten Gebrauch zu machen, die an sich bekannt sind, jedoch hierin nicht erwähnt sind.
  • Für die Zwecke dieser Erfindung, werden die chemischen Elemente in Übereinstimmung mit dem Periodensystem der Elemente, CAS Version, Handbook of Chemistry and Physics, 67. Ausgabe, 1986–87, Deckelinnenseite identifiziert. Ebenfalls für die Zwecke dieser Erfindung ist der Begriff „Kohlenwasserstoff” vorgesehen alle zulässigen Verbindungen mit zumindest einem Wasserstoff und einem Kohlenstoff-Atom zu beinhalten. Im weitesten Sinn beinhalten die zulässigen Kohlenwasserstoffe, acyclische und cyclische, verzweigte und unverzweigte, carbocyclische und heterocyclische, aromatische und nicht-aromatische organische Verbindungen, die substituiert oder unsubstituiert sein können.
  • Kombinatorische Bibliotheken
  • Die gegenständlichen Reaktionen eignen sich leicht für die Herstellung von kombinatorischen Bibliotheken von Verbindungen für das Screenen von pharmazeutischen, agrochemischen oder anderen biologischen oder medizin-bezogenen Aktivitäten oder objektbezogenen Qualitäten. Eine kombinatorische Bibliothek für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist eine Mischung von chemisch-verwandten Verbindungen, die zusammen auf eine bestimmte Eigenschaft gescreent werden kann; besagte Bibliothek kann in Lösung oder kovalent an einen Feststoffträger gebunden sein. Die Herstellung von vielen verwandten Verbindungen in einer einzigen Reaktion reduziert und vereinfacht die Anzahl der Screening-Prozesse, die durchgeführt werden müssen, stark. Das Screenen auf die entsprechende biologische, pharmazeutische, agrochemische oder physikalische Eigenschaft kann mittels herkömmlicher Verfahren durchgeführt werden.
  • Die Vielfalt in einer Bibliothek kann an einer Vielzahl von unterschiedlichen Ebenen erzeugt werden. Zum Beispiel können die in einem kombinatorischen Ansatz verwendeten Substrat-Aryl-Gruppen bezüglich des Kern-Aryl-Anteils unterschiedlich sein, z. B., Begriffsvielfalt der Ringstruktur, und/oder können in Bezug auf die anderen Substituenten variiert werden.
  • Eine Vielzahl von Techniken sind im Stand der Technik für das Herstellen kombinatorischer Bibliotheken kleiner organischer Moleküle verfügbar. Siehe zum Beispiel, Blondelle et al. (1995) Trends Anal. Chem. 14:83; die Affymax U.S. Patente 5.359.115 und 5.362.899 ; das Ellman U.S. Patent 5.288.514 , die Still et al. PCT Publikation WO 94/08051 ; Chen et al. (1994) JACS 116:2661; Kerr et al. (1993) JACS 115:252; PCT Publikation WO 92/10092 , WO 93/09668 und WO 91/07087 ; und die Lerner et al. PCT Veröffentlichung WO 93/20242 ). Dementsprechend kann eine Vielzahl von Bibliotheken nach Art von etwa 16 bis 1.000.000 oder mehr Diversomere synthetisiert und auf eine bestimmte Aktivität oder Eigenschaft gescreent werden.
  • In einer beispielhaften Ausführungsform, kann eine Bibliothek von substituierten Diversomeren mittels der gegenständlichen Reaktion, die auf in der Still et al. PCT-Veröffentlichung WO 94/08051 beschriebene Technik angepasst ist, synthetisiert werden, z. B. indem sie an ein Polymerkügelchen durch ein hydrolysierbare oder photolysierbare Gruppe gebunden ist, z. B., an einer der Stellen des Substrats lokalisiert. Entsprechend der Still et al. Technik wird die Bibliothek auf einem Satz von Kügelchen synthetisiert, wobei jedes Kügelchen einen Satz an Tags aufweist, um das bestimmte Diversomer auf dem Kügelchen zu identifizieren. Bei einer Ausführungsfrom, die besonders für das Entdecken von Enzyminhibitoren geeignet ist, können die Kügelchen auf einer Oberfläche einer permeablen Membran dispergiert sein, und die Diversomere werden von den Kügelchen durch die Lyse des Kügelchenlinkers freigesetzt. Des Diversomer von jedem Kügelchen wird durch die Membran in eine Untersuchungszone diffundieren, in welcher es mit einer Enzymuntersuchung interagieren wird. Detaillierte Beschreibungen einer Vielzahl von kombinatorischen Methodologien sind unten bereitgestellt.
  • A. Direkte Charakterisierung
  • Ein wachsender Trend auf dem Gebiet der kombinatorischen Chemie ist die Sensitivität von Techniken wie Massenspektroskopie (MS) auszunutzen, welche zum Beispiel verwendet werden kann, um subfemtomolate Mengen einer Verbindung zu charakterisieren und um die chemische Struktur der aus der kombinatorischen Bibliothek ausgewählten Verbindung direkt zu bestimmen. Zum Beispiel, wo die Bibliothek auf einer unlöslichen Trägermatrix bereitgestellt ist, können einzelne Populationen der Verbindung zuerst von dem Träger freigesetzt werden und durch MS charakterisiert werden. In anderen Ausführungsformen, als Teil der MS-Probenvorbereitungstechnik, können MS Techniken wie MALDI verwendet werden, um eine Verbindung von der Matrix freizusetzen, insbesondere dort, wo eine labile Bindung ursprünglich verwendet wurde, um die Verbindung an die Matrix zu binden. Zum Beispiel kann ein aus einer Bibliothek ausgewähltes Kügelchen in einem MALDI-Schritt bestrahlt werden, um das Diversomer von der Matrix freizusetzen und das Diversomer für die MS-Analys zu ionisieren.
  • B. Multipin-Synthese
  • Die Bibliotheken des gegenständlichen Verfahrens können das Multipin-Bibliothekformat einnehmen. In Kürze, Geysen und Mitarbeiter (Geysen et al. (1984) PNAS 81: 3998–4002) führten ein Verfahren für das Herstellen von Verbindungsbibliotheken durch eine parallele Synthese auf Polyacrylsäure-gepfropfte Polyethylen-Pins, welche in einem Mikrotiterplattenformat angeordnet sind, ein. Die Geysen-Technik kann verwendet werden um Tausende von Verbindungen pro Woche unter Verwendung des Multipin-Verfahrens zu synthetisieren und zu screenen, und die gebundenen Verbindungen können für viele Untersuchungen wieder verwendet werden. Geeignete Linker-Reste können auch an die Pins angehängt werden, so dass die Verbindungen von den Trägern nach der Synthese für die Bewertung der Reinheit und weiteren Evaluierung abgespalten werden können (vergleiche, Bray et al. (1990) Tetrahedron Lett 31: 5811–5814; Valerio et al. (1991) Anal Biochem 197: 168–177; Bray et al. (1991) Tetrahedron Lett 32: 6163–6166).
  • C. Trennen-Koppeln-Rekombinieren
  • In einer noch weiteren Ausführungsform kann eine abgewandelte Bibliothek an Verbindungen auf einem Satz von Kügelchen unter Ausnutzung der Trennen-Koppeln-Rekombinieren-Strategie bereitgestellt werden (siehe, z. B., Houghten (1985), PNAS, 82: 5131–5135; und U.S. Patente 4.631.211 ; 5.440.016 , 5.480.971 ). In Kürze, wie der Name impliziert, werden bei jedem Synthese-Schritt, an welchem Degeneration in die Bibliothek eingeführt wird, die Kügelchen in getrennte Gruppen, die gleich der Anzahl an unterschiedlichen Substituenten, die an einer bestimmten Position in der Bibliothek hinzuzufügen sind, geteilt, die unterschiedlichen Substituenten werden in getrennten Reaktionen gekoppelt, und die Kügelchen zu einem Pool für die nächste Wiederholung rekombiniert.
  • In einer Ausführungsform kann die Trennen-Koppeln-Rekombinieren-Strategie unter Verwendung eines zu dem sogenannten „Teebeutel”-Verfahren analogen Ansatzes durchgeführt werden, welches als erstes durch Houghten entwickelt wurden, bei welchem die Verbindungssynthese an Harzen, die innerhalb eines porösen Polypropylen-Beutels versiegelt sind, stattfindet (Houghten et al. (1986) PNAS 82: 5131–5135). Substituenen werden an die Verbindungs-tragenden Harze gekoppelt, indem die Beutel in entsprechende Reaktionslösungen platziert werden, während alle gemeinsamen Schritte, wie Harzwaschung und Schutzeliminierung simultan in einem Reaktionsgefäß durchgeführt werden. Am Ende jeder Synthese enthält jeder Beutel eine einzige Verbindung.
  • D) Kombinatorische Verbindungen durch Licht-gerichtete, räumlich-adreassierbare parallele chemische Synthese.
  • Ein Schema der kombinatorischen Synthese, in welcher die Identität einer Verbindung durch seine Lokalisierung auf einem Synthese-Substrat gegeben ist, wird eine räumlich-adressierbare Synthese genannt. In einer Ausführungsform wird der kombinatorische Prozess durch Kontrollieren der Zugabe eines chemischen Reagens zu einem spezifischen Ort auf einem Feststoffräger durchgeführt (Dower et al. (1991) Annu Rep Med Chem 26: 271–280; Fodor, S. P. A. (1991) Science 251: 767; Pirrung et al. (192) U.S. Patent Nr. 5.143.854 ; Jacobs et al. (1994) Trends Biotechnol 12: 19–26). Die räumliche Auflösung der Photolithographie ermöglicht die Miniaturisierung. Diese Technik kann durch die Verwendung von Schutz/Schutzeliminierungsreaktionen mit photolabilen Schutzgruppen ausgeführt werden.
  • Die wichtigsten Schritte dieser Technologie sind in Gallop et al. (1994) J. Med. Chem. 37: 1233–1251 erklärt. Ein Synthese-Substrat wird für das Koppeln durch die kovalente Anlagerung von photolabilen Nitroveratryloxycarbonyl (NVOC) geschützten Aminolinkern oder andern photolabilen Linkern hergestellt. Licht wird verwendet, um eine spezifische Region des Syntheseträgers für das Koppeln zu aktivieren. Die Entfernung einer photolabilen Schutzgruppe durch Licht (Schutzeliminierung) führt zu der Akivierung von ausgewählten Bereichen. Nach der Aktivierung, wird ein erster Satz von Aminosäure-Analoga, wobei jedes an ihrem Amino-Terminus eine photolabile Schutzgruppe trägt, der gesamten Oberfläche ausgesetzt. Das Koppeln tritt nur in Regionen auf, die im vorangehenden Schritt durch Licht adressiert wurden. Die Reaktion wird gestoppt, die Platten gewaschen, und das Substrat wird nochmals durch eine zweite Maske illuminiert, wodurch eine unterschiedliche Region für die Reaktion mit einem zweiten geschützten Baustein aktiviert wird. Das Muster der Masken und die Sequenz der Reaktanden definieren die Produkte und ihre Lage. Da dieses Verfahren Photolithographie-Techniken ausnutzt, ist die Anzahl der Verbindungen, die synthetisiert werden können, nur durch die Anzahl der Synthesestellen, die mit angemessener Auflösung adressiert werden können, beschränkt. Die Position jeder Verbindung ist exakt bekannt; somit kann ihre Interaktion mit anderen Molekülen direkt bewertet werden.
  • In einer Licht-gerichteten chemischen Synthese hängen die Produkte vom Belichtungsmuster und von der Art der Zugabe der Reaktanden ab. Durch Variieren des lithographischen Musters können viele unterschiedliche Sätze an Testverbindungen gleichzeitig synthetisiert werden; diese Charakteristik führt zu der Entwicklung von vielen unterschiedlichen Maskierungsstrategien.
  • E) Kodierte kombinatorische Bibliotheken
  • In einer noch weiteren Ausführungsform nutzt das Gegenstandsverfahren eine Verbindungsbibliothek, die mit einem kodierenten Tagging-System ausgestattet ist. Eine kürzliche Verbesserung in der Identifizierung von aktiven Verbindungen von kombinatorischen Bibliotheken verwendet chemische Indexsysteme, die Tags verwenden, die die Reaktionsschritte die ein gegebenes Kügelchen durchgemacht hat, einzigartig kodiert und, deren Struktur es durch Rückschluss trägt. Im Konzept ahmt dieser Ansatz die Phagen-Display-Bibliotheken nach, bei welchen die Aktivität von exprimierten Peptiden stammt, wobei die Struktur des aktiven Peptids jedoch von der entsprechenden genomischen DNA Sequenz abgeleitet wird. Die erste Codierung von synthetischen kombinatorischen Bibliotheken verwendete DNA als den Code. Eine Vielzahl von anderen Codierungformen sind berichtet worden, einschließlich der Codierung mit sequenzierbaren Bio-Oligomeren (z. B., Oligonukleotiden und Peptiden), und der binären Codierung mit zusätzlichen nicht-sequenzierbaren Tags.
  • 1) Tagging mit sequenzierbaren Bio-Oligomeren
  • Das Prinzip der Verwendung von Oligonukleotiden, um kombinatorische synthetische Bibliotheken zu kodieren, wurde in 1992 beschrieben (Brenner et al. (1992) PNAS 89: 5381–5383) und ein Beispiel einer solchen Bibliothek erschien das darauffolgende Jahr (Needles et al. (1993) PNAS 90: 10700–10704). Eine kombinatorische Bibliothek von nominell 77 (= 823.543) Peptiden, bestehend aus allen Kombinationen von Arg, Gln, Phe, Lys, Val, D-Val und Thr (Dreibuchstaben-Code für Aminosäuren), von welchen jede durch ein spezifisiches Dinukleotid kodiert war (TA, TC, CT, AT, TT, CA bzw. AC), wurde durch eine Reihen von abwechselnden Runden von Peptid und Oligonukleotid-Synthese auf einem Feststoffträger hergestellt. In dieser Arbeit wurde die Amin-bindende Funktionalität auf dem Kügelchen spezifisch in Richtung Peptid oder Oligonukleotid-Synthese durch gleichzeitige Vorinkubation der Kügelchen mit Reagentien, die geschützte OH Gruppen für die Oligonukleotid-Synthese und geschützte NH2 Gruppen für die Peptidsynthese erzeugen, differenziert (hier in einem Verhältnis von 1:20). Jeder Tag besteht, wenn es komplett ist, aus 69-Meren, von welchen 14 Einheiten den Code trugen. Die Kügelchen-gebundene Bibliothek wurde mit einem Fluoreszenz-markierten Antikörper inkubiert, und die den gebundenen Antiköper aufweisenden Kügelchen, die stark fluoreszierten, wurden durch Fluoreszenzaktivierte-Cell-Sortierung (FACS) geerntet. Die DNA Tags wurden durch PCR amplifiziert und sequenziert, und die vorhergesagten Peptide wurden synthetisiert. In Anlehnung an solche Techniken können Verbindungsbibliotheken für die Verwendung in dem gegenständlichen Verfahren abgeleitet werden, wo die Oligonukleotid-Sequenz des Tags die kombinatorischen Reaktionen, deren ein bestimmtes Kügelchen ausgesetzt war, identifiziert und deshalb die Identität der Verbindung auf dem Kügelchen bereitstellt.
  • Die Verwendung von Oligonukleotid-Tags ermöglicht eine höchst sensitive Tag-Analyse. Trotzdem erfordert das Verfahren die sorgfältige Auswahl von orthogonalen Sätzen von Schutzgruppen, die für die abwechselnde Co-Synthese des Tags und der Bibliotheksmitglieder erforderlich sind. Weiters kann die chemische Labilität des Tags, insbesondere die anomeren Phosphat- und Zucker-Bindungen, die Wahl der Reagenzien und Bedingungen, die für die Synthese von nicht-oligomeren Bibliotheken verwendet werden können, beschränken. In bevorzugten Ausführungsformen verwenden die Bibliotheken Linker, die die selektive Trennung des Testverbindungs-Bibliothek-Mitglieds für die Untersuchung ermöglichen.
  • Peptide sind ebenfalls als Tagging-Moleküle für kombinatorische Bibliotheken verwendet worden. Zwei beispielhafte Ansätze sind im Stand der Technik beschrieben, von denen beide verzweigte Linker an Festphasen verwenden, auf welchen Kodierungs- und Ligandstränge alternativ herausgearbeitet werden. Beim ersten Ansatz (Kerr JM et al. (1993) J Am Chem Soc 115: 2529–2531) wird Orthogonalität in der Synthese durch Anwenden eines säurelabilen Schutzes für den Kodierungsstrang und eines basenlabilen Schutzes für den Verbindungsstrang erreicht.
  • Bei einem alternativen Ansatz (Nikolaiev et al. (1993) Pept Res 6: 161–170) werden verzweigte Linkers verwendet, so dass beide, die Kodierungseinheit und die Testverbindung, an dieselbe funktionelle Gruppe auf dem Harz angelagert werden kann. In einer Ausführungsform kann ein spaltbarer Linker zwischen der Verzweigungsstelle und dem Kügelchen platziert werden, so dass die Spaltung das Molekül freisetzt, welches sowohl den Code als auch die Verbindung enthält (Ptek et al. (1991) Tetrahedron Lett 32: 3891–3894). In einer anderen, Ausführungsform kann der spaltbare Linker so platziert werden, dass die Testverbindung unter Zurücklassung des Codes selektiv vom Kügelchen getrennt werden kann. Dieses letzte Konstrukt ist besonders wertvoll, da es das Screenen der Testverbindung ohne potentielle Beeinträchtigung der Kodierungsgruppen ermöglicht. Beispiele im Stand der Technik der unabhängigen Spaltung und Sequenzierung von Peptid-Bibliothek-Mitgliedern und ihre entsprechende Tags haben bestätigt, dass die Tags die Peptidstruktur genau vorhersagen können.
  • 2) Nicht-sequenzierbares Tagging: Binäre Kodierung
  • Eine alternative Kodierungsform der Testverbindungsbibliothek verwendet einen Satz von nicht-sequenzierbaren elektrophoren Tagging-Molekülen, die als binärer Code verwendet werden (Ohlmeyer et al. (1193) PNAS 90: 10922–10926). Beispielhafte Tags sind haloaromatische Alkylether, die als ihre Trimethylsylyl-Ether bei geringeren als femtomolaren Konzentrationen durch Elektroneneinfang-Gaschromatographie (ECGC) nachweisbar sind. Variationen in der Länge der Alkylkette, sowie der Natur und Position der aromatischen Halogenoid-Substituenten, ermöglichen die Synthese von zumindest 40 solcher Tags, welche prinzipell 240 (z. B. aufwärts von 1012) unterschiedliche Moleküle kodieren können. Im Orginalbericht (Ohlmeyer et al., supra) waren die Tags zu etwa 1% der verfügbaren Amin-Gruppen der Peptid-Bibliothek über einen photospaltbaren o-Nitrobenzyl-Linker gebunden. Dieser Ansatz ist geeignet, wenn kombinatorische Bibliotheken von Peptid-artigen oder anderen Amin-enthaltenden Molekülen hergestellt werden. Ein vielseitigeres System ist jedoch entwickelt worden, welches die Kodierung von im Wesentlichen jeder kombinatorischen Bibliothek ermöglicht. Hier würde die Verbindung über einen photospaltbaren Linker an den Feststoffträger verbunden werden und das Tag ist durch einen Catechol-Ether-Linker über eine Carben-Einfügung in die Kügelchenmatirx gebunden (Nestler et al. (1994) J Org Chem 59: 4723–4724). Diese orthogonale Verbindungsstrategie ermöglicht die selektive Trennung von Bibliotheksmitgliedern für die Untersuchung in Lösung und nachfolgende Decodierung durch ECGC nach der oxidativen Trennung der Tag-Sätze.
  • Obwohl mehrere Amid-verbundene Bibliotheken im Stand der Technik die binäre Codierung mit den elektrophoren Tags, die an die Aminogruppen gebunden sind, verwenden, bietet die direkte Bindung dieser Tags an die Kügelchenmatrix eine viel größere Vielseitigkeit in den Strukturen, die in kodierten kombinatorischen Bibliotheken hergestellt werden können. Auf diese Weise gebunden, sind die Tags und ihre Linker beinahe so unreaktiv wie die Kügelchenmatrix selbst. Zwei Binär-kodierte kombinatorische Bibliotheken wurden berichtet, in welchen die elektrophoren Tags direkt an die Festphase gebunden ist (Ohlmeyer et al. (1995) PNAS 92: 6027–6031) und stellen eine Anleitung für die Herstellung der Gegenstandsverbindungs-Bibliothek dar. Beide Bibliotheken wurden unter Verwendung einer orthogonalen Verbindungsstrategie konstruiert, in welcher das Bibliothekenmitglied an den Feststoffträger durch einen photolabilen Linker gebunden wurde und die Tags wurden durch einen Linker, der nur durch starke Oxidation spaltbar ist, gebunden. Da die Bibliotheksmitglieder wiederholend von dem Feststoffträger teilweise Photo-eluiert werden können, können die Bibliotheksmitglieder in vielen Untersuchungen benutzt werden. Die sukzessive Photoelution ermöglicht ebenfalls eine sehr hohe Durchsatz-Wiederholungs-Screenins-Strategie: erstens werden mehrere Kügelchen in 96-Kammer-Mikrotiter Platten platziert; zweites werden die Verbindungen teilweise getrennt und auf Assayplatten überfüht; drittens identifiziert eine Metall-Bindungsuntersuchung die aktiven Kammern; viertens werden die entsprechenden Kügelchen einzeln in neue Mikrotiter-Platten neu angeordnet; fünftens werden einzelne aktive Verbindungen identifiziert; und sechstens wird die Struktur decodiert.
  • Automatisierung der Festphasen Olgiosaccharid-Synthese
  • Der Zugang zu definierten Sequenzen von Polypeptiden und Nukleinsäuren durch automatisierte Synthese hatte einen signifikanten Einfluss auf die Forschung in einer Vielzahl von Bereichen einschließlich dieser Moleküle. Wichtige Technologien wie PCR wurden möglich, nachdem ein zuverlässiger Zugang zu kurzen DNA Strängen Routine wurde. Das Gebiet der Glycobiologie hat an den Schwierigkeiten, die beim Synthetisieren komplexer, Oligosacchariden auftraten, gelitten. Idealerweise könnten sich Forscher, die an Phänomenen interessiert sind, die komplexe Glycokonjugate beinhalten, auf eine automatisierte Synthese stützen, um die notwendigen Moleküle herzustellen.
  • In einer allgemeinen Anwendung wird die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung für das Herstellen von Oligosacchariden oder Mischungen davon verwendet, welche für Struktur-Funktionsanalyse von Oligosacchariden verwendet werden kann. Zum Beispiel können das/die Oligosaccharid(e) von Interesse antigene Oligosaccharide, Olgiosaccharide, die in Protein-Kohlenhydrat-Erkennungsvorgängen eingebunden sind, oder ein antibiotisches Oligosaccharid sein. Typischerweise ist es zum Beispiel in Struktur-Funktionsstudien wünschenswert, die Auswirkung auf die Aktivität von einem von einer Vielzahl von Zuckersubstituenten an einer oder mehreren ausgewählten Restpositionen zu bestimmen. In einer weiteren allgemeinen Anwendung wird die Vorrichtung verwendet, um Zufallssequenz-Oligosaccharide für das Auswählen von Oligosacchariden mit gewünschter Aktivität, typischerweise Bindungsaktivität an einen bekannten Rezeptor, wie ein Antikörper zu erzeugen.
  • Während kürzlich Fortschritte in der Entwicklung der Festphasen-Oligosaccharid-Synthese erreicht wurden, wurden keine Versuche über die Automatisierung der Festphasen-Oligosaccharid-Synthese berichtet. Angespornt durch den Erfolg unserer Versuche, Oligosaccharide an einem Feststoffträger zu synthetisieren, begannen wir den Zusammenbau von Kohlenhydraten in einem Synthetisierer durchzuführen. Wir bauten ein Pentasaccharid in 8,5 Stunden mit einer Gesamtausbeute von 75% in einer vollautomatisierten Art und Weise zusammen. Ein ABI 393B Peptid-Synthetisierer, der mit einem spezialangefertigten Reaktionsgefäß ausgestattet war, wurde verwendet, um die Lösungen des Mannosetrichloracetimidat-Donators, des Aktivators (TMSOTf), und Natriummethoxid in Methanol als Deblockierungslösung aufzunehmen, Methylenchlorid, THF, und Methanol wurden als Waschlösungsmittel verwendet, während alle Reagenzien unter einer inerten Gasatmosphäre blieben. Der Kopplungszyklus wurde programmiert, um fünf Äquivalente des Donators und katalytische Mengen des Aktivators an das Harz abzugeben, gefolgt von einer 20 minütigen Wartezeit. Nach dem Waschschritt wurde die Glycosylierung wiederholt, um hohe Ausbeuten sicherzustellen. Nach einem Spülen offenbarte eine 20 minütige Schutzeliminierung die nächste Aktzeptorstelle. Wiederholung dieses Protokolls ergab dieses gewünschte Pentasaccharid in ausgezeichneten schrittweisen Kopplungsausbeuten (> 98%) und Reinheit. Die HMQC Spektra von Träger-gebundenem rohen Pentasaccharid, welches durch eine vollautomatisierte Synthese in 500 Minuten hergestellt wurde, wird mit dem Lösungs-HMQC-Spektrum von reinem Referenz-Pentasaccharid n-Pentenylglycosid in Lösung verglichen. Siehe 17. Obwohl sich die Linienbreite des HR-MAS Spektrums aufgrund des Polymers verbreiterte, liefert es überzeugende Hinweise, dass das gewünschte Produkt als die Hauptverbindung nach 10 synthetischen Schritten beobachtet wurde. Wir haben begonnen die Verwendung von anderen Glycosyl-Dontoren in Kombination mit unterschiedlichen Trägern und kürzeren Kopplungsprotokollen zu evaluieren, um die größeren Oligosaccharide von biologischer Signifikanz zusammenzubauen.
  • Protokolle für die automatisierte Festphasen-Synthese von Oligosacchariden
  • Reaktionen an dem Feststoffträger eignen sich besonders gut für die Automatisierung. In einer Vorarbeit haben wir ein Trimannosid mit einer Gesamtausbeute von 91% auf einem Peptidsynthetisierer synthetisiert, welcher bezüglich der Lösungsmittel- und Reagenzzuführung angepasst wurde.
  • Festphasen Linker
  • Ein entscheidendes Element jeder Festphasen-Synthese-Strategie ist die Wahl einer geeigneten Linker-Gruppe, die den ersten Zucker an den Feststoffträger bindet (Tabelle 1). Für einen Überblick an Linkern für die organische Festphasen-Synthese siehe: F. Guillier, D. Orain, M. Bradley, Chem. Rev., 100 (2000), 2091. Der Linker muss gegenüber den Glycosylierungsbedingungen sowie gegenüber den Schutzeliminierungsbedingungen inert sein. Von gleicher Wichtigkeit ist die Notwendigkeit eines Spaltungsvorgangs mit hoher Ausbeute zum Abschluss der Synthese. Etliche säure- und besenlabile Linker, ähnlich zu jenen die in der Peptid und Oligonukleotid-Synthese verwendet werden, sind für die Oligosaccharid-Synthese modifiziert worden.
  • Tabelle 1: Linker und Spaltungsverfahren für die Festphasen-Oligosaccharid-Synthese
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  • Silylether werden am häufigsten für die Monomer-Bindung an den Polymer-Träger unter dem Donator-gebundenen Paradigma verwendet. Linker wie Diisopropylphenylsilylether 1 sind gegenüber mild-sauren und stark basischen Reaktionsbedingungen stabil und haben sich als nützlich erwiesen, wenn Glycosyltrichloroacetimidate, Glycale, Glycosylfluoride und Glycosylsulfoxide verwendet werden. Die Freisetzung vom Polymer-Träger wird durch die Behandlung mit Fluorid-Quellen erreicht, welche das freie Oligosaccharid, welches an der Orginal-Bindungsstelle ungeschützt ist, liefert. Aufgrund der häufigen Verwendung von Silylether als temporäre Schutzgruppen bei der Oligosaccharid-Synthese, führt der Einbau eines Silyl-Linkers oft zu signifikanten Herausforderungen, wenn zwischen den restlichen Hydroxyl-Gruppen differenziert werden soll.
  • Eine Klasse an photolabilen Linkern ist entwickelt worden, um die Verwendung von Silylether als Linker zu umgehen und um die Verwendung von temporären Silyl-Schutzgruppen zu ermöglichen. U. Zehavi, A. Patchomik, J. Am. Chem. Soc., 95 (1973), 5673; R. Rodebaugh, B. Fraser-Reid, H. M. Geysen, Tetrahedron Lett. 38 (1997), 7653. Photolabile Linker, wie 2, beinhalten oft die Verwendung von o-Nitrobenzyl-Ethergruppen. Diese funktionelle Gruppe ist gegenüber einer Reihe von Bedingungen stabil, die Spaltung vom Polymerträger ist jedoch oft sehr langsam und die Ausbeuten variieren. Photolabile Linker bieten trotzdem einen anderen Grad an Orthogonalität, welcher nützlich ist, wenn eine Synthese entworfen wird.
  • Eine für die Oligosaccharid-Synthese einzigartige Linker-Strategie beinhaltet die Bindung des ersten Zuckers an den Polymerträger über ein Thioglycosid. Wie oben diskutiert ist, sind Thioglycoside gegenüber Säure mäßig stabil und unter basischen Bedingungen inert. Thioglycoside, wie 3, werden von dem Polymer-Träger durch den Zusatz von thiophilen Reagenzien, wie N-Bromsuccinimid oder Hg(O2CCF3)2 in Gegenwart eines Alkohols oder Wasser, abgespalten, um entweder acetale oder hemiacetale Produkte zu liefen. Die offensichtlichen Beschränkungen dieses Linkers sind die Inkompatibilität mit Thioglycosid-Donatoren und die beschränkte Stabilität gegenüber der Behandlung mit sauren Aktivatoren. Eine Mischung von Anomeren ist ebenfalls möglich und die Kontrolle des anomeren Verhältnisses ist schwierig, das der Spaltvorgang am reduzierenden Ende auftritt.
  • Erst kürzlich sind Linker, ähnlich zu 4, die die Olefinmetathese als das Spaltverfahren ausnutzten, entwickelt worden. Olefine-Linker sind gegenüber sauren und basischen Reaktionsbedingungen stabil und die Doppelbindung fungiert als Ansatz für den endgültigen Spaltvorgang. Diese Option ist attraktiv, weil die Linkerfunktionalität unter den für gewöhnlich verwendeten Kopplungs- und Schutzeliminierungsbedingungen inert ist und der endgültige Spaltungsschritt mit zahlreichen Schutzgruppen kompatibel ist. Von Bedeutung ist, dass das Spaltprodukt ein Olefin enthält, welches zusätzliche funktionelle Gruppen-Manipulationen ermöglicht.
  • Analog zu der Lösungsphasen-Oligosaccharid-Synthese hat sich kein einziges Glycosylierungsverfahren oder keine Linkerstrategie unter der Vielzahl der verfügbaren Festphasen-Techniken ausgezeichnet. Die Reichhaltigkeit an Linkerstrategien bietet eine nützliche Flexibilität, wenn eine Synthese geplant wird. Es ist vorweggenommen, dass die Entwicklung von neuartigen Linker und Spaltungsstrategien die Synthese von zunehmend komplexen Kohlenhydraten mittels Festphasen-Verfahren ermöglicht.
  • Kopplungszyklus
  • Die von uns entwickelten Festphasen-Kopplungsbedingungen wurden beim Zusammenbau von Oligosacchariden in einer automatisierten Art und Weise angewendet. Viele Glycosylierungsreaktionen können bei Raumtemperatur durchgeführt werden und beinhalten Reagenzien, die vollständig löslich und gegenüber verlängerter Lagerung bei Raumtemperatur stabil sind. Wir verwendeten anfänglich Glycosyltrichloracetimidate- Donatoren als Monosaccharid-Baueinheit, da diese Einheiten bei Raumtemperatur gekoppelt werden können. Ester und Silyl-Schutzgruppen wurden als temporäre Maskierungsgruppen verwendet, das ihre Entfernung mit hoher Ausbeute und schnell erfolgt.
  • Das von uns hergestellte Heptamannosid diente als die erste Testsequenz für den Kopplungszyklus. Da keine Überwachung durchgeführt wurde, musste eine vollständige Kopplung und Schutzeliminierung sichergestellt werden. In einem typischen Kopplungzyklus wurden fünf Äquivalente an Glycosyl-Donator und des Aktivators TMSOTf wurden dem Harz zugeführt. Nach einer Stunde wurde das Harz gespült, und der Kopplungsschritt wiederholt. Nach dem Spülen des Harzes und mehreren Waschschritten wurde Natriummethoxid in Methanol dem Harz hinzugefügt und für eine Stunde reagieren gelassen. Der nächste Kopplungszyklus begann nach einem weiteren Waschschritt. Im Anschluss an den Abschluss der Synthese wurde das Harz einer Cross-Metathese mit Ethylen unterzogen, um das fertige Oligosaccharid in Form eines n-Pentylglycosid zu entfernen. Der Erfolg der automatisierten Synthese wurde durch analytische HPLC, durch Vergleich der Produktmenge zu der Summe von Nebenprodukten (hauptsächlich Deletionssequenzen) bewertet.
  • Einführung eines Capping-Schrittes
  • Deletionssequenzen, denen nur eine Zuckereinheit (n – 1) fehlt, sind am schwierigsten von dem gewünschten Produkt zu trennen und entstehen aus unvollständigen Kopplungsschritten, während jedes beliebigen Kopplungszyklus der Sequenz. Die Oligosaccharidketten, die während eines Zyklus nicht koppeln, können während den folgenden Verlängerungsschritten erfolgreich glycosyliert werden. Es kann deshalb ein schwerwiegendes Reinigungsproblem am Ende der Synthese existieren. Um die Verlängerung von fehlgeschlagenen Sequenzen zu vermeiden kann ein Capping-Schritt (d. h. ein Blockierungsschritt) in den Kopplungszyklus eingeführt werden. Nach jeder kompletten Kopplung kann eine hochreaktive Blockierungsgruppe verwendet werden, um alle freien Hydroxyl-Akzeptoren abzudecken. Zum Beispiel kann Benzyltrichloracetimidat als ein Capping-Reagens (mit TMSOTf aktiviert) verwendet werden, um Benzylether in Positionen, die nicht glycosyliert waren zu erhalten und um diese während der ganzen Synthese unreaktiv zu machen. Unter Verwendung dieses direkten Capping-Schritts, wird erwartet, dass die Reinigung des fertigen Oligosaccharid-Produktes stark vereinfacht ist, da das Vorhanden sein von (n – 1)-Deletionssequenzen minimiert sein wird.
  • Automatisierte Festphasen-Synthese von Oligosacchariden
  • Die Übertragung von Informationen auf molekularer Ebene ist ein zentraler Prozess im Leben, der in zellulären System hauptsächlich auf drei bedeutenden wiederholenden Biopolymeren beruht: Proteine, Nukleinsäuren und Kohlenhydrate (siehe 4). Während die Wichtigkeit von Proteinen und Nukleinsäuren in der Biologie seit Langem anerkannt ist, steckt das Verständnis von Oligosacchariden und Glycokonjugaten in der Natur nach wie vor in seinen Kinderschuhen. R. A. Dwek, Chem. Rev. 96, 683 (1996). Zelloberflächen-Glycokonjugate sind in Signalübertragungswege und zelluläre Erkennungsprozesse eingebunden und sind mit vielen Krankheitszuständen in Zusammenhang gebracht worden. S. Hakomori, Adv. Cancer Res. 52, 257 (1989).
  • Ein bedeutendes Hindernis im schnell-waschsenden Gebiet der molekularen Glycobiologie ist das Fehlen von reinen, strukturell-definierten Kohlenhydraten und Glycokonjugaten. Diese Biomoleküle werden oft in der Natur in geringen Konzentrationen und in mikroheterogener Form gefunden, wodurch ihre Identifizierung und Isolierung äußerst kompliziert wird. Die Beschaffung von ausreichenden Mengen von definierten Oligosacchariden, die für detaillierte biophysikalische und biochemische Studien erforderlich sind, stützt sich deshalb auf effiziente synthetische Verfahren. Während bei der Oligosaccharid-Synthese große Fortschritte gemacht wurden, bleibt die Konstruktion von komplexen Kohlenhydraten zeitaufwendig und wird durch eine kleine Anzahl von spezialisierten Laboratorien durchgeführt. G. J. Bonns, Hrsg., Carbohydrate Chemistry (Blackie Publishers, London, 1998).
  • Historisch gesehen war der Zugang zu strukturell-definierten komplexen Kohlenhydraten sehr aufwändig. Kürzliche Fortschritte in der Festphasen-Synthese haben die Konstruktion von komplexen Oligosacchariden weniger langwierig gemacht, es ist jedoch nach wie vor ein hohes Maß an technischem Fachwissen notwendig, um die gewünschten Strukturen zu erhalten. Wir beschreiben hier eine automatisierte chemische Synthese von mehreren Oligosacchariden auf einem Festphasen-Synthetisierer. Durch die Verwendung von Glycosylphosphat-Baueinheiten und einen neuartigen funktionalisiertem Harz wurde ein verzweigtes Dodecasaccharid synthetisiert. Das Ziel-Oligosaccharid wurde leicht nach dem Abspalten von dem Feststoffträger erhalten. Der Zugang zu komplexen Oligosacchariden wurde nun auch für Nicht-Experten, in einer Art und Weise möglich, und zwar in einer Weise wie die Konstruktion von Oligopeptiden und Oligonukleotiden.
  • Letztendlich wird ein allgemeines, automatisiertes Verfahren für Oligosaccharidzusammenstellung das schnelle Herstellen von interessierenden Strukturen, sogar für einen Nicht-Spezialisten ermöglichen. Oligonukleotide (M. H. Caruthers, Science, 230, 281 (1985)) und Oligopeptide (E. Atherton, R. C. Sheppard, Solid phase peptide synthesis: a practical approach, (Oxford University Press, Oxford, 1989)) werden nun routinemäßig auf eine effiziente Art und Weise unter Verwendung von Festphasen-Strategien mittels automatisierten Synthetisierern hergestellt. Die Auswirkung eines automatisierten Synthetisierers auf das Gebiet der Glycobiologie können sich leicht vergegenwärtigt werden, wenn der signifikante Einfluss, welcher die Peptid- und Nukleotidapparate auf die Biochemie dieser Biopolymere hatten, betrachtet wird.
  • Automatisierte Oligosaccharid-Synthetisierer
  • Wir haben den ersten automatisierten Festphasen-Oligosaccharid-Synthetisierer entwickelt. Das Festphasen-Paradigma eignet sich besonders gut für die Automatisierung von synthetischen Prozessen. Die sich wiederholende Natur der Glycosylierung und Schutzeliminierung kann leicht in einen Kopplungszyklus eingebaut werden. Ein Überschuss an Reagenzien wird verwendet um die Reaktionen zur Vervollständigung zu führen, während Harzwaschungen (durch die Verwendung von Lösungsmitteln) jede lösliche Verunreinigung entfernt. Es ist nur ein einziger Reinigungsschritt erforderlich, nachdem der Zucker vom Feststoffträger freigesetzt wurde.
  • Unter Beachtung der Vorteile der Feststoffträger-Synthese, betrachteten wir mehrere Schlüsselfragen für die Entwicklung eines automatisierten Oligosaccharid-Synthetisierers: a) der Entwurf einer gesamten synthetischen Strategie, wobei entweder das reduzierende oder das nicht-reduzierende Ende der wachsenden Kohlenhydrat-Kette an den Träger gebunden ist (siehe Y. Ito, S. Manabe, Curr. Opin. Chem. Biol. 2, 701 (1998)); b) Auswahl eines Polymers und Linker, die gegenüber allen Reaktionsbedingungen während der Synthese inert sind, jedoch wenn gewünscht effizient gespalten werden; c) Schutzgruppen-Strategie, die mit der Komplexität des Ziel-Oligosaccharids übereinstimmt; d) stereospezifische und hohe Ausbeute liefernde Glycosylierungsreaktionen; und e) ein Instrument, das in der Lage ist, wiederholende, chemische Bearbeitungen bei verschiedenen Temperaturen durchzuführen.
  • Weiters erfordert die Feuchtigkeitsempfindlichkeit der Glycosylierungsreaktion ein System, das kontinuierlich unter einer inerten Gasatmosphäre gehalten werden kann. Zusätzlich, da viele Glycosylierungsreaktionen niederere Temperaturen benötigen, kann ein Glas-Reaktionsgefäß, welches durch einen zweiten Hohlraum umgeben ist, der die Zirkulation eines Kühlmittels ermöglicht, verwendet werden. Die katalytische Verwendung von Aktivatoren, wie Trimethylsilyltrifluormethansulfonat erfordert die sehr genaue Messung und Zuführung dieser Reagenzien.
  • Anstelle ein neues Gerät zu entwerfen, haben wir vorgezogen, eine existierenden Vorrichtung, die in der automatisierten Peptid-Synthese verwendet wird, zu überarbeiten. Der Peptid-Synthetisierer Modell 433A, welcher von Applied Biosystems Inc. erhältlich ist, wurde für unsere Zwecke modifiziert. Mehrere Modifikationen waren notwendig, bevor der kommerziell erhältliche Peptid-Synthetisierer für die Kohlenhydrat-Synthese verwendet werden konnte. Die Vorrichtung wurde mit mehreren Reagensflaschen ausgestattet, einige für das Waschen und andere für die Glycosylierungs- und Schutzeliminierungsreaktionen. Kleine Patronen, die die Donatorspezies enthalten, können manuell vor der Synthese in den Synthetisierer geladen werden. Ein Zyklus wurde programmiert, um alle Schritte ohne jegliche Bedienereingriffe durchzuführen. Die Vorrichtung kontrollierte die Zuführung aller Reagenzien und Donatorspezies zu dem Reaktionsgefäß und das Mischen des Gefäßinhaltes.
  • Bezugnehmend auf 5, wird eine Ausführungsform eines automatisierten Oligosaccharid-Synthetisierers 200, der gemäß der Erfindung konstruiert wurde, gezeigt. Der gezeigte automatisierte Oligosaccharid-Synthetisierer 200 besteht aus einem Reaktionsgefäß 210, zwei Donatorengefäßen 220a–b, welche Monosaccharid Donator-Lösungen enthalten, einem Aktivatorgefäß 230, das eine Aktivierungsreagenslösung enthält, einem Deblockierungsgeäß 240, welches eine Deblockierungsreagenslösung enthält, einem Blockierungsgefäß 250, welches eine Blockierungsreagenslösung enthält, drei Lösungsmittelgefäßen 260a–c, welche Lösungsmittellösungen enthalten, einem Lösungsübertragungssystem 270, einer Temperatursteuereinheit 290 für die Regulierung der Temperatur des Reaktionsgefäßes 210 (halten der Temperatur des Reaktionsgefäßes 210 auf einer gewünschten Temperatur(en)), und einem Computer 280, welcher programmiert werden kann, um das Lösungsübertragungssystem 270 und die Temperatursteuereinheit 290 automatisch zu kontrollieren.
  • Die Donatorgefäße 220a–b können jede geeignete Glycosyl-Donatorlösung, wie ein Glycosyltrichloracetimidat oder ein Glycosylphosphat aufnehmen. Das Aktivatorgefäß 230 kann jede geeignete Aktivierungsreagenslösung aufnehmen. Im Allgemeinen haben Lewis-Säuren gezeigt, dass sie zu der Bildung, d. h. Synthese, von Oligosacchariden beitragen und deshalb als einen geeigneten Aktivator benutzt werden können. Somit kann das Aktivatorgefäß 230 eine Lösung enthalten, welche ein Silyltrifluormethansulfonat aufweist oder kann, alternativ, eine Lösung enthalten, welche Trimethylsilyltrifluormethansulfonat aufweist. Das Deblockierungsgefäß 240 kann jede geeignete Deblockierungsreagenslösung, wie etwa eine Lösung, die Natriummethoxid oder Hydrazin enthält, aufnehmen. Das Blockierungsgefäß 250 kann jede geeignete Blockierungsreagenslösung enthalten, wie etwa eine Lösung, die Benzyltrichloracetimidat oder ein Carbonsäure enthält. Eine solche geeignete Carbonsäure ist Levulinsäure. Die Vielzahl von Lösungsmittelgefäßen 260a–c können jede geeignete Lösungsmittellösung enthalten, unter anderem, wie etwa Dichlormethan, THF, und Methanol.
  • Das Lösungsübertragungssystem 270 muss in der Lage sein, die Donator-, die Aktivierungs-, die Deblockierungs und die Lösungsmittellösungen von ihren entsprechenden Gefäßen in das Reaktionsgefäß 210 zu überführen. Aufgrund der Feuchtigkeitssensitivität bestimmter Glycosylierungsreaktionen, sollte das Lösungsübertragungssystem in der Lage sein, die Reagenzien der Vorrichtung 220 unter einer inerten Gasatmosphäre zu halten, d. h. die Reagenzien unter Überdruck zu halten. Fachleute werden erkennen, dass solche Lösungsübertragungssyteme 270 kommerziell und leicht erhältlich sind; zum Beispiel, das System von Applied Biosystems Inc, Model 443 A Peptid-Synthetisierer. Das im US Patent 5.186.898 beschriebene Lösungsübertragungssystem ist ebenfalls ein System, welches für die Synthese von Oligosacchariden gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet wäre.
  • Der Computer 280 kann jedes geeignete Rechner-Gerät für das Kontrollieren des Arbeitsabläufe des Lösungsübertragungssystems 270 und der Temperatursteuereinheit 290 sein, wie zum Beispiel ein Personalcomputer oder eine Arbeitsplatzstation. Der Computer 280 kann vorprogrammiert sein, so dass er automatisch die Arbeitsabläufe des Lösungsübertragungssystems 270 kontrolliert; das Koppeln, Waschen, Schützen/Capping (d. h. Blockieren), und Schutzeliminierungszyklen können für ein gegebenes Protokoll in den Computer 280 vorprogrammiert werden. Auf diese Weise kann die automatisierte Festphasen-Synthese von Oligosacchariden kontrolliert und erreicht werden. Zusätzlich kann der Computer 280 ein Gerät sein, welches getrennt von dem Lösungsübertragungssystem 270 ist, oder der Computer 280 kann in das Lösungsübertragungssystem 270 eingebaut sein. Wenn der Computer 280 und das Lösungsübertragungssystem 270 getrennte Geräte sind, dann muss ein geeigneter Datenkommunkationweg, wie ein Kommunikationsport/Kabel oder IR Datenverbindung, zwischen den zwei Geräten vorhanden sein. Gleichermaßen, wenn eine automatische Temperatursteuerung des Reaktionsgefäßes 210 gewünscht ist, dann kann der Computer 280 mit dem gewünschten Temperaturenprotokoll vorprogrammiert werden, so dass die Arbeitsabläufe der Temperatursteuereinheit 290 kontrolliert werden. Für die automatische Steuerung der Temperatursteuereinheit 290 über den Computer 280, muss der Computer 280 in Datenkommunikation mit der Temperatursteuereinheit 290 stehen.
  • Die Temperatursteuereinheit 290 kann jedes geeignete Gerät sein, welches in der Lage ist, die Temperatur des Reaktionsgefäßes zu regeln und auf den gewünschten Temperaturen zu halten. Mehrere der externen gekühlten Zirkulatoren, die von Julabo USA Inc, Allentown, PA, erhältlich sind, können als eine akzeptable Temperatursteuereinheit 290 verwendet werden. Um die automatisierte Festphasen-Synthese von vielen unterschiedlichen Arten von Oligosacchariden zu erreichen, sollte die Temperatursteuereinhein 290 in der Lage sein, die Temperatur des Reaktionsgefäßes 210 auf einer eingestellten Temperatur von zwischen –25C und +40, und vorzugsweise auf einer eingestellten Temperatur von zwischen –80C und +60C zu halten. Das Kühlmittel der Temperatursteuereinheit 290 kann um das Reaktionsgefäß 210 über eine Manschette (nicht gezeigt), welche das Reaktionsgefäß ummanteln kann und welche mit der Temperatursteuereinheit 290 über eine Eingangsleitung und Ausgangsleitung verbunden ist, zirkuliert werden. Alternativ kann das Reaktionsgefäß 210 eine doppelwandige Struktur aufweisen, wobei ein externer Hohlraum der doppelwandigen Struktur das Kühlmittel der Temperatursteuereinheit aufnimmt. Die Temperatur des Reaktionsgefäßes 210 kann durch Vorprogrammieren der Temperatursteuereinheit 290 auf die gewünschte Temperatur eingestellt werden und dann dem Kühlmittel ermöglichen, um das Reaktionsgefäß 210 für eine vorbestimmte „Kälte-durchdringende” Periode, wie zum Beispiel 5 Minuten, herum zu zirkulieren. Alternativ kann die Temperatursteuereinheit einen auf die Wand des Reaktiongefäßes 210 platzierten Temperatursensor aufweisen, so dass Echtzeit-Temperaturmessung des tatsächlichen Reaktionsgefäß 210-Hohlraums erhalten werden, d. h. dort wo die automatisierte Synthese der Oligosaccharide stattfindet. Somit kann der Temperatursensor Rückmeldedaten an die Temperatursteuereinheit 290 bereitstellen, so dass die tatsächliche Temperatur des Reaktionsgefäßes 210 genauer aufrechterhalten werden kann.
  • Bezugnehmend auf 7 ist eine Ausführungsform eines doppelwandigen Reaktionsgefäßes 210 (gezeigt in Schnittdarstellung), welches gemäß der Erfindung konstruiert wurde, gezeigt. Die doppelwandige Struktur des Reaktionsgefäßes 210 bildet zwei Hohlräume: der erste Hohlraum 210a beherbergt die Synthese der Oligosaccharide; der zweite Hohlraum 210b nimmt das Kühlmittel der Temperatursteuereinheit 290 auf. Das Kühlmittel der Temperatursteuereinheit 290 zirkuliert über die Rohrleitungen 291 und 292 durch den zweiten Hohlraum 210b. Diese Rohrleitungen 291 und 292 können aus jedem geeigneten Material bestehen, wie zum Beispiel gummierte Materialien oder metallische Materialien. Die Rohrleitungen 291 und 292 können an die zwei Öffnungen in der Außenoberfläche des doppelwandigen Reaktionsgefäßes 210 über mechanische Klemmen, Bänder, Klebungen, Epoxide usw. befestigt werden. Das doppelwandige, gekühlte Reaktionsgefäß 210 kann aus Glass oder jedem anderen geeignetem Material, wie zum Beispiel Titan, gefertigt sein.
  • Die verschiedenen Lösungen werden in den Hohlraum 210a über das Lösungsübertragungssystem 270 eingeführt (5). Ähnlicherweise können diese Lösungen aus dem Hohlraum 210a – durch den Betrieb des Lösungsübertragungssystems 270 – durch das Einführen einer zusätzlichen Lösung oder durch die Einleitung eines komprimierten Inertgases herausgedrängt werden (um als Abfall aufgefangen zu werden). Vor dem Betrieb der Synthetisiervorrichtung können unlösliche Harzkügelchen 214 in dem Hohlraum 210a des Reaktionsgefäßes 210 platziert werden. Die Harzkügelchen 214 können aus einem Octendiol funktionalisiertem Harz bestehen und können weiters einen über einen organischen Linker an das Harzkügelchen 214 gebundenen Glycosyl-Akzeptor aufweisen (nicht gezeigt). Der organische Linker kann aus einem Glycosylphosphat bestehen. Die Lösungen können den Hohlraum 210a über eine poröse Glassfritte 216 verlassen. Die Glassfritte 216 ermöglicht den Durchgang der Lösung, hält jedoch die Harzkügelchen 214 und, noch wichtiger, die darauf gebildeten Oligosaccharide innerhalb des Hohlraums 210a des Reaktionsgefäßes 210 zurück.
  • Erläuterung
  • Die nun allgemein beschriebene Erfindung, wird durch die Bezugnahme auf die folgenden Beispiele besser verständlich, welche lediglich für Illustrationszwecke bestimmter Aspekte und Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung enthalten sind, und nicht beabsichtigt sind, die Erfindung zu beschränken.
  • Beispiel 1
  • Automatisierte Festphasen-Oligosaccharid-Synthese – Allgemeine experimentelle Methoden
  • Allgemeine Verfahren
  • Alle verwendeten Chemikalien waren analysenrein und wurden, außer wo angegeben, wie geliefert verwendet. Für Waschzyklen verwendetes Dichlormethan (CH2Cl2) wurde von Mallinekrodt (HPLC Qualität) gekauft und ohne weitere Reinigung verwendet. Das für die Reagensherstellung verwendete Dichlormethan (CH2Cl2) wurde von J. T. Baker (CycletainerTM) gekauft und vor der Verwendung durch eine neutrale Aluminiumoxid-Säule hindurchgeleitet. Tetrahydrofuran (THF) wurde von J. T. Baker (CycletainerTM) gekauft und vor der Verwendung durch eine neutrale Aluminiumoxid-Säule hindurchgeleitet. Pyridin wurde vor der Verwendung über Calciumhydrid rückflussgekocht und destilliert. Trimethylsilyltrifluormethansulfonat (TMSOTf) wurde von Acros Chemicals gekauft. Natriummethoxid (25 Gew.-/Vol.-% in MeOH), Eisessig (AcOH) und Hyrazinacetat (98%) wurden von Aldrich Chemicals gekauft. Analytische Dünnschichtchromatographie wurde auf E. Merck Silicagel 60 F254 Platten (0,25 mm) durchgeführt. Verbindungen wurden durch Eintauchen der Platten in eine Cersulfat-Ammoniummolybdat-Lösung gefolgt durch Erwärmen, sichtbar gemacht. Flüssigkeitssäulenchromatographie wurde unter Verwendung eines Zwangflusses des angegebenen Lösungmittels an einem Silicycle 230–400 mesh (60 Å Porendurchmesser) Silicagel durchgeführt. H NMR Spektra wurden mit einem Varian VXR-500 Spektrometer (500 MHz) erhalten und sind in Teilen pro Million (parts per million ppm) in Bezug auf CHCl3 (7,27 ppm) angegeben. Kopplungskonstanten (J) sind in Hertz angegeben. C NMR Spektra wurden mit einem Varian VXR-500 Spektrometer (125 MHz) erhalten und sind in Bezug auf CDCl3 (77,23 ppm) als interne Referenz angegeben. Polymer-gebundene Verbindungen wurden durch HR-MAS-NMR unter Verwendung der folgenden Bedingungen analysiert: Alle Spektra wurden auf einem Bruker DRX-600 Spektrometer, betrieben bei 600 MHz (H), der mit einer 4 mm Bruker CCA HR-MAS Sonde ausgestattet ist, analysiert. Proben (10 mg bei 0,45–0,55 mmol g–1) wurden in einen keramischen, Rotor geladen, in 30–100 LCDCL3 suspendiert und beim magischen Winkel bei 3,0 KHz rotiert. 1D-NMR Analyse wurde unter Verwendung eines 1D Spinechos durchgefürt: 32 Scans, 2 s Relaxationszeit, 3 Minuten Gesamtexperimentationszeit. TOCSY Daten wurden erhalten unter Verwendung von: mlevtp Pulssequenz, 80 Millisekunden Mischzeit, 1 Sekunde Relaxationsverzögerung, 16 Scans pro freiem Induktionsabfall (FID), 400 FIDs, 2048 Punkte pro FID, 2,2 Stunden Gesamtexperimentationszeit HMQC Experimente wurde durchgeführt unter Verwendung von: invbtp Pulssequenz (HMQC mit BIRD Sequenz), 1,3 Sekunden Relaxationsverzögerung, 96 Scans pro FID, 256 FIDs, 2048 Punkte pro FID, 13,5 Stunden Gesamtexperimentationszeit. MALDI-TOF Massenspektroskopie wurde auf einem PE Biosystems Voyager System 102 wie folgt durchgeführt: Al 1 Aliquot der Matrixlösung [10 mg/ml 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) in THF] wurde auf den Probenhalter punktweise aufgetragen und trocken gelassen. Zusatz von ein 11 Aliquot der Oligosaccharid-Lösung (5 mg/ml EtOAc) wurde auf die Matrix gleichzeitig punktweise aufgetragen, getrocknet, und im positiven Ion-Modus analysiert. HPLC Analyse wurde auf einem Waters Model 600E Multisolvent Ausgabesystem unter Verwendung von analytischen (Nova-Pak®, 60 Å, 4 m, 3,6 × 150 mm) und präparativen (Nova-Pak®, 60 Å, 6 m, 7,8 × 300 mm) Silica-Säulen durchgeführt.
  • Allgemeine Methode A. Automatisierte Synthes von -(1→2)-Mannosiden:
  • Octenediol funktionalisiertes Harz 1 (25 mol, 83 mg, 0,30 mmol/g Beladung) wurde in ein Reaktionsgefäß geladen und in den Oligosynthetisierer eingefügt. Das Harz wurde unter Verwendung des Donators 2 (10 Äquiv., 0,25 mmol, 160 mg), welcher in CH2CL2 (4 ml) und TMSOTF (0,5 Äquiv, 1 ml, 0,0125 M TMSOTf in CH2Cl2) zugeführt wurde, glycosyliert. Das Mischen der Suspension wurde durchgeführt (10 s Vertex, 50 s Rest) für 30 Minuten. Das Harz wurde dann mit CH2Cl2 (6 × 4 ml jedes) gewaschen und ein zweites Mal glycosyliert. Nach Abschuß der zweiten Glycosylierung wurde das Harz mit CH2Cl2 (6 × 4 ml jedes) und mit 1:9 MeOH:CH2Cl2 (4 × 4 ml, jedes) gewaschen. Die Schutzeliminierung des Acetylesters wurde durch Behandeln des glycosylierten Harzes mit Natriummethoxid (10 Äquiv., 0,5 ml, 0,5 M NaOMe in MeOH) in CH2Cl2 (5 ml) für 30 Minuten durchgeführt. Das Harz wurde dann mit 1:9 MeOH:CH2Cl2 (1 × 4 ml) gewaschen und ein zweites Mal den Schutzeliminierungsbedingungen für 30 Minuten ausgesetzt. Entfernung aller löslichen Verunreinigungen wurde durch Waschen des Harzes mit 1:9 MeOH:CH2Cl2 (4 × 4 ml, jedes), 0,2 M AcOH in THF (4 × 4 ml jedes), THF (4 × 4 ml jedes), und CH2Cl2 (6 × 4 ml jedes) erreicht. Das schutzeliminierte Polymer-gebundene C2-OH-Mannosid wurde dann durch Wiederholen des obigen Glycosylierungs/Schutzeliminierungsprotokols verlängert. Das terminale Glycosid wurde nicht schutzeliminiert, dadurch wurde die NMR Analyse des gespaltenen Produkts vereinfacht.
  • Allgemeine Methode B. Oligosaccharid-Spaltung von dem Polymer-Träger
  • Das glycosylierte Harz (25 mol) wurde im Vakuum über Phosphorpentoxid für 12 Stunden getrocknet und in eine 10 ml Flasche überführt. Die Flasche wurde mit Ethylen gespült und Grubbs Katalysator (Bis(tricyclohexylphosphin)benzylidin-Ruthenium(IV)dichlorid, 4,1 mg, 0,005 mmol, 20 Mol%) wurde hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde mit CH2Cl2 (3 ml) verdünnt und unter etwa 1 Bar (1 atm) Ethylen für 36 Stunden gerührt. Triethylamine (111 ml, 0,80 mmol, 160 Äquiv.) und Trishydroxymethylphosphin (50 mg, 0,40 mmol, 80 Äquiv.) wurden hinzugefügt und die resultierende Lösung wurde bei Raumtemperatur 1 Stunde gerührt. H. D. Maynard, R. H. Grubbs Tetrahedron Lett. 40, 4137 (1999). Die hellgelbe Reaktionsmischung wurde mit CH2Cl2 (25 ml) verdünnt und mit Wasser (3 × 25 ml), gesättigter wässriger NaHCO3 (3 × 25 ml) und Salzlösung (3 × 25 ml) gewaschen. Die wässrige Phase wurde mit CH2Cl2 (25 ml) extrahiert und die kombinierten organischen Phasen wurden über Na2SO4 getrocknet, filtriert und konzentriert. Die resultierenden Oligosaccharide wurden entweder durch Flash-Säulenchromatographie an Silicagel oder Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) gereinigt.
  • Pentamannosid 3.
  • Hergestellt durch Ausführen der allgemeinen Prozedur A. Das H-NMR Spekturm des Pentamers 3 war in jeder Hinsicht mit einer authentischen Probe, die frührer synthetisiert wurde, identisch. R. B. Andrade, O. J. Plante, L. G. Melean, P. H. Seeberger, Org. Lett 1, 1811 (1999). HR-MAS Spektra des Harz-gebundenen Pentamers wurde unter Verwendung der HMQC und TOCSY Verfahren aufgenommen und sind unten eingefügt. All fünf charakteristischen anomeren Protonresonanzen wurden im HR-MAS TOCSY Spektrum (4,8–5,5 ppm) beobachtet, einschließlich von zwei anomeren Protonen, die sich im HMQC Spektrum überdecken.
  • Heptamannosid 4.
  • Hergestellt durch Ausführen der allgemeinen Prozedur A. Die Spektraldaten des Heptamers 4 waren in jeder Hinsicht mit einer authentischen Probe, die führer synthetisiert wurde, identisch. R. B. Andrade, O. J. Plante, L. G. Melcan, P. H. Seeberger, Org. Lett 1, 1811 (1999). Ein H-NMR des durch präparative HPLC Reinigung erhaltenen reinen 4 der Heptamannosid-Synthese ist unten eingefügt.
  • Figure 00380001
  • Analytisches HPLC Chromatogramm der Heptamannosid 4-Synthese, anschließend an die Harzspaltung. Fließrate = 1 ml/min, 20→30% EtOAc/Hexane (20 Minuten): 7,8 Minuten Heptamannosid 4, 6,2 Minuten = Hexamer, 5,4 Minuten = Pentamer.
  • Decamannosid 5
  • Hergestellt durch Ausführen der allgemeinen Prozedur A. Das Decamer wurde durch präparative HPLC gereinigt und durch H-NMR und MALDI-TOF charakterisiert. Charakteristische anomere Resonanzen im 1H-NMR Spektrum (4,9–5,4 ppm) bestätigten die Dekamer-Struktur. Eine einzige Acetat Resonanz (2,1 ppm) und n-Pentenyl Resonanz, zusammen mit massenspektrometrischen Daten (berechnet M+ + Na (4473,6) fand MALDI-TOF (DHB, THF) (M+ + Na (4474,0)) identifizieren das Dekamer 5 eindeutig.
  • Figure 00390001
  • Analytisches HPLC Chromatogramm der Decamannosid 5-Synthese, anschließend an die Harzspaltung. Fließrate = 1 ml/min, 20→25% EtOAc/Hexane (20 Minuten): 5,7 Minuten = Decamannosid 5, 5,0 Minuten = Nonamer, 4,4 Minuten = Octamer.
  • Allgemeine Methode C. Automatisierte Synthese von Phytoalexin-Induktor – Glucan-Oligosaccharide:
  • Octendiol funktionalisiertes Harz 1 (25 mol, 83 mg, 0,30 mmol/g Beladung) wurde in ein Reaktionsgefäß geladen, das mit einem Kühlmantel ausgestattet war, und in einen modifizierten ABI-433A Peptidsynthetisierer eingesetzt. Das Harz wurde unter Verwendung des Donator 8 oder 9 (5 Äquiv., 0,125 mmol, 90 mg bzw. 146 mg), welcher in CH2CL2 (4 ml) unt TMSOTF (5 Äquiv, 1 ml, 0,0125 M TMSOTf in CH2Cl2) bei –15°C zugeführt wurde, glycosyliert. Das Mischen der Suspension wurde durchgeführt (10 s Vertex, 50 s Rest) für 15 Minuten. Das Harz wurde dann mit CH2Cl2 (6 × 4 ml jedes) gewaschen und ein zweites Mal glycosyliert. Nach Abschuß der zweiten Glycosylierung wurde das Harz mit 1:9 MeOH:CH2Cl2 (4 × 4 ml, jedes), THF (4 × 4 ml) und Pyridn:Essigsäure (3:2, 3 × 4 ml) gewaschen und auf 15°C erwärmt. Die Schutzeliminierung des Levulinoylesters wurde durch Behandeln des glycosylierten Harzes mit Hydrazinacetat (40 Äquiv., 4 ml, 0,25 M N2H4-HOAc in Pyridin:Essigsäure 3:2) für 15 Minuten durchgeführt. Das Harz wurde ein zweites Mal den Schutzeliminierungsbedingungen für 15 Minuten ausgesetzt. Entfernung aller löslichen Verunreinigungen wurde durch Waschen des Harzes mit Pyridin:Essigsäure (3:2, 3 × 4 ml), 0,2 M AcOH in THF (4 × 4 ml jedes), THF (4 × 4 ml jedes), und CH2Cl2 (6 × 4 ml jedes) erreicht. Das schutzeliminierte Polymer-gebundene C6-OH-Glucosid wurde dann durch Wiederholen des obigen Glycosylierungs/Schutzeliminierungsprotokols und Verwendung von abwechselnden Dontoren 8 und 9, verlängert. Das terminale Glycosid wurde nicht schutzeliminiert, dadurch wurde die NMR Analyse der durch Verwendung der Prozedur B freigesetzten Produkte vereinfacht.
  • Phytoalexin-Induktor Hexasaccharid 10
  • Hergestellt durch Ausführen der allgemeinen Methode C. Das Hexamer wurde durch präparative HPLC gereinigt und durch 1H-NMR und MALDI-TOF charakterisiert. Die charakteristischem t-Butyl (1,2 ppm), n-Pentenyl (5,7 ppm) und Levulinoyl (2,2, 2,5, 2,7) Resonanzen zusammen mit massenspektrometrischen Daten (berechnet M+ + Na (2776,8) gefunden MALDI-TOF (DHB, THF) M+ + Na (2778,0)) identifizieren das Hexamer 10 eindeutig.
  • Figure 00400001
  • Analytisches HPLC Chromatogramm der PE Hexasaccharid 10-Synthese, anschließend and die Harzspaltung. Fließrate = 1 ml/min, 17% EtOAc/Hexane: 4,75 Minuten Hexamer.
  • Phytoalexin-Induktor Dodecasaccharid 7
  • Hergestellt durch Ausführen der allgemeinen Methode C. Das Dodecamer wurde durch präparative HPLC gereinigt und durch 1H-NMR, 13C-NMR und MALDI-TOF charakterisiert. Die charakteristischem t-Butyl (1,2 ppm), n-Pentenyl (5,7 ppm) und Levulinoyl (2,2, 2,5, 2,7) Resonanzen zusammen mit massenspektrometrischen Daten (berechnet M+ + Na (5345,5) gefunden MALDI-TOF (DHB, THF) M+ + Na (5346,2)) identifizierten das Dodecamer 7 eindeutig.
  • Figure 00410001
  • Analytisches HPLC Chromatogramm der PE Dodecasaccharid 7-Synthese, anschließend and die Harzspaltung. Fließrate = 1 ml/min, 20→25% EtOAc/Hexane: 6,7 Minuten Dodecamer.
  • Beispiel 2
  • Unter Verwendung des modifizierten Peptid-Synthetisierers, wurde eine systematische Untersuchung der Variablen, die in die automatisierte Festphasen-Oligosaccharid-Synthese eingebunden sind, unternommen. Wir wählten die „Akzeptor-gebundene” Strategie für die Festphase-Oligosaccharid-Synthese aus. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 (1963). Bei diesem Verfahren wird das reaktive Glycosylierungsmittel in Lösung zugeführt, während die nukleophile Akzepor-Hydroxyl-Gruppe auf dem Feststoffträger ausgesetzt ist. Die produktiven Kopplungsvorgänge resultieren in Träger-gebundenen Oligosacchariden, die einfach durch Waschen der löslichen Nebenprodukte durch einen Filter gereinigt werden. Entfernung einer temporären Schutzgruppe auf der neu-gebildeten Saccharid-Einheit legte eine andere Hydroxyl-Gruppe frei, wodurch der Kopplungszyklus fortgesetzt werden konnte. Die Synthese von biologisch-wichtigen Mannosiden war der Mittelpunkt einer bedeutenden Forschung; deshalb wurden diese Moleküle (Schema 1, 3–5) ausgewählt, um einen effizienten automatisierten Zyklus zu etablieren. Trichloracetimidat-Donator 2 wurde als die Donator-Baueinheit ausgewählt, da er in einem Multigramm-Maßstab hergestellt und bei Raumtemperatur aktiviert werden kann. Siehe J. Rademann, R. R. Schmidt, J. Org. Chem. 62, 3989 (1997) und Literaturstellen darin. Die Aktivierung von 2 wurde unter sauren Bedingungen unter Verwendung der Lewis Säure Trimethylsilyltrifluormethansulfonat (TMSOTf) durchgeführt. Entfernung der Acetylester-Schutzgruppe wurde unter basischen Bedingungen mit Natriummethoxid erreicht. Schema 1: Automatisierte Oligosaccharid-Synthese unter Verwendung von Trichloracetimidaten
    Figure 00420001
    • Glycosylierungsbedingungen: 25 μmol Maßstab; 25 μmol Harz (83 mg, 0,30 mmol/g Beladung); 10 Äquiv. Donator 2 (160 mg); 0,5 Äquiv. TMSOTf (1 ml, 0,0125 M TMSOTf in CH2Cl2) zweimal für jeweils 30 Minuten wiederholt.
    • Schutz-eliminierungsbedingungen: 25 μmol Maßstab; 10 Äquiv. NaOMe (0,5 ml, 0,5 M NaOMe in MeOH) in 5 ml CH2Cl2, zweimal für jeweils 30 Minuten wiederholt.
  • Um die Verwendung von sauren und basischen Reaktionsbedingungen in dem Kopplungzyklus zu ermöglichen, wurden ein Polymerträger und Linker auf Kompatibilität untersucht. R. B. Andrade, O. J. Plante, L. G. Melean, P. H. Seeberger, Org. Lett 1, 1811 (1999). Eine Vielzahl von kommerziell erhältlichen Polymer-Trägern wurde untersucht. Merrifield's Harz (1% vernetztes Polystyrol) und Polystyrol-basierende Agarose zeigten während des gesamten Kopplungszyklus exzellente Eigenschaften. Unsere Vorarbeit zeigte, dass der olefinische Linker 1 gegenüber den Kopplungszyklus-Bedingungen stabil war, während er leicht vom Feststoffträger am Ende der Synthese durch die Olefin-Cross-Metathese abgespaltete. Durch Variieren der Konzentration und Mengen der Reagenzien sowie der Reaktionszeiten kamen wir zu dem in Tabelle 2 gezeigten Zyklus. Durch Anwenden der Bedingungen in Tabelle 2 mit Octendiol funktionalisiertem 1% vernetztem Polystyrol wurde die Synthese des Pentamannosids 3 in vierzehn Stunden durchgeführt (Schema 1). Tabelle 2: Der mit Trichloracetimidat-Donatoren verwendete Zyklus (25 mol Maßstab)
    Schritt Funktion Reagens Zeit (min)
    1 Kopplen 10 Äquiv. Donator und 0,5 Äquiv. TMSOTF 30
    2 Waschen Dichlormethan 6
    3 Koppeln 10 Äquiv. Donator und 0,5 Äquiv. TMSOTF 30
    4 Waschen Dichlormethan 6
    5 Waschen 1:9 Methanol:Dichlormethan 6
    6 Schutz 2 × 10 Äquiv. NaOMe 80
    eliminierung (1:9 Methanol:Dichlormethan)
    7 Waschen 1:9 Methanol:Dichlormethan 4
    8 Waschen 0,2 M Essigsäure in Tetrahydrofuran 4
    9 Waschen Tetrahydrofuran 6
    10 Waschen Dichlormethan 6
  • Die Fähigkeit das Harz-gebundene Oligosaccharid zu analysieren ist für die erfolgreiche Entwicklung einer Festphasen-Synthese wesentlich. B. Yan, Acc. Chem. Res. 31, 621 (1998). Die zweidimensionale kernmagnetische Resonanz-Analyse des Harz-gebundenen Pentamers 6 wurde durch hoch-auflösende Magic-Angle-Spinning(HR-MAS-NMR)-Techniken durchgeführt (siehe 8). Die Analyse der NMR Spektra offenbarte charakteristische anomere Signale zwischen 97 und 103 ppm. Weiters bestätigte die homonukleare TOCSY HR-MAS Analyse das Vorhandensein von fünf einzigartigen anomeren Protonen. Bezüglich auf Harz TOCSY-Analysen von 6 siehe nächstes Beispiel. In Übereinstimmung mit früheren Experimenten wurde eine geringfügige Linienverbreiterung in den Spektra der Harz-gebundenen Probe beobachtet. P. H. Seeberger, X. Beebe, G. D. Sukenick, S. Pochapsky, S. J. Danishefsky, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 36, 491 (1997). Insgesamt entsprachen die HR-MAS-NMR Daten des Polymer-gebundenen Pentamers eindeutig einer authentischen, in Lösung hergestellten Pentamerprobe. Die bemerkenswerte Reinheit des Harz-gebundenen-Pentasaccharids 6, nach 9 synthetischen Schritten ohne jegliche Reinigung, ermutigte uns, die Synthese größerer Strukturen zu erforschen. Heptamer 4 und Decamer 5 wurden mit Durchschnittsausbeuten von 90–95% pro Schritt hergestellt. Die kurzen Reaktionszeiten, drei Stunden pro Monomereinheit, ermöglichte die Synthese von 4 in 20 Stunden und einer Gesamtausbeute von 42%. Als Vergleich synthetisierten wir Heptamannosid 4 an dem Feststoffträger manuell in 14 Tagen mit einer Gesamtausbeute von 9%.
  • Beispiel 3
  • Angesichts des Erfolges mit der automatisierten – Mannosid-Konstruktion, wurde der vollkommen-geschützte Phytoalexin-Induktor(PE)-Glucan 7 als eine komplexere Zielstruktur ausgewählt (siehe 9). A. Darvill, et al., Glycobiology 2, 181 (1992). Das Vorhandensein eines pilzlichen Glucan-Oligosaccharids löst in der Sojabohnen-Pflanze die Freisetzung antibiotischer Phytoalexine aus. Die durch das PE-Glucan ausgelöste Antwort in der Sojabohnen Wirtspflanze ist der am meisten untersuchte Abwehrmechanismus in Pflanzen. Diese Oligosaccharide sind früher in Lösung und an dem Feststoffträger synthetisiert worden und es wurde erwartet, dass sie in unserer Automatisierungsbestrebung gut als Vergleichspunkt dienen. Siehe P. Fugedi, W. Birberg, P. J. Garegg, A. Pilotti, Carb. Res. 164, 297 (1987) und K. C. Nicolaou, N. Winsisinger, J. Pastor, F. DeRoose, J. Am. Chem. Soc. 119, 449 (1997) und Literaturstellen darin.
  • Für die Synthese der verzweigten, (1→3)/(1→6) PE Struktur sahen wir die Verwendung von zwei unterschiedlichen Glycosylphosphat-Donatoren, 8 und 9, vor. Wir führten vor kurzem Glycosylphosphate als wertvolle Glycosylierungsmittel ein, die leicht aus Glycal-Vorläufern hergestellt werden. O. J. Plante, R. B. Andrade, P. H. Seeberger, Org Lett 1, 211 (1999). Strategische Schutzgruppen Betrachtungen haben uns angespornt, den Levulinoylester als eine 6-O temporäre Schutzgruppe und die 2-O-Pivaloyl Gruppe zu verwenden, um eine vollständige Selektivität in der Glycosylierungsreaktion sicherzustellen. Die Schutzeliminierung des Levulinoylesters wurde mit einer Hydrazinlösung in Pryridin/Essigsäure erreicht, während die Phosphatbaueinheit mit TMSOTf Aktiviert wurde.
  • Im Gegensatz zur Peptid und Nukleinsäure-Synthese, werden viele der in der Oligosaccharid-Chemie eingebundenen Manipulationen nicht bei Raumtemperatur ausgeführt. Aus dem Herleiten von Lösungsphasen-Studien waren wir bewusst, dass die Verwendung von Glycosylphosphaten, wie viele Donatoren, niedere Temperaturen für optimale Ergebnisse erfordern würden. D. Kahne, S. Walker, X. Cheng, D. Van Enger, J. Am. Chem. Sec. 111, 6811 (1989). Um dieses Erfordernis zu adressieren, haben wir ein Temperatur-kontrolliertes Reaktionsgefäß entworfen. Das Gefäß ist durch ein Kühlmantel umhüllt, welcher leicht an eine kommerzielle Kühlvorrichtung angeschlossen werden kann. Modellreaktionen mit Phosphat-Donator 8 demonstrierten die Leichtigkeit, mit welcher eine Temperaturvarialbel in den Automatisierungszyklus eingebaut werden kann.
  • Die Kopplungs- und Schutzeliminierungsbedingungen wurden für die Verwendung von Glycosylphosphaten und Levulinoylesters angepasst, was zu dem in Tabelle 3 gezeigten Zyklus führte. Die Aktvierung des Phosphat-Donators 8 bei –15°C erforderte kürzere Reaktionszeiten, als für Trichloracetimidat 2 benötigt wurden. Die Levulinat-Schutzeliminierung erfolgte bei +15°C und erforderte nur eine fünfzehn minütige Reaktionszeit, im Vergleich zu den längeren Zeiten, die häufig für die Acetylester-Spaltung verwendet werden. Wie in der Synthese der Polymannoside 3–5 wurden eine doppelte Glycosylierung und doppelte Schutzeliminierung verwendet. Der Einbau dieser Modifikationen in den automatisierten Zyklus führte zu einer ausgezeichneten Ausbeute und hohen Reinheit eines Modell (1→6) Trisaccharids. Tabelle 3: Der mit Phosphat-Donatoren verwendete Zyklus (25 mol Maßstab)
    Schritt Funktion Reagens Zeit (min)
    1 Koppelt 5 Äquiv. Donator und 5 Äquiv. TMSOTF 15
    2 Waschen Dichlormethan 6
    3 Koppeln 5 Äquiv. Donator und 5 Äquiv. TMSOTF 15
    4 Wachen 1:9 Methanol:Dichlormethan 4
    5 Waschen Tetrahydrofuran 4
    6 Waschen 3:2 Pyridin:Essigsäure 3
    7 Schutzeliminierung 2 × 20 Äquiv. Hydrazin (3:2 Pyridin:Essigsäure 30
    8 Waschen 3:2 Pyridin:Essigsäure 3
    9 Waschen 1:9 Methanol:Dichlormethan 4
    10 Waschen 0,2 M Essigsäure in Tetrahydrofuran 4
    11 Waschen Tetrahydrofuran 4
    12 Waschen Dichlormethan 6
  • Der automatisierte Zyklus in Tabelle 3 wurde dann auf die Synthese von komplexeren PE Oligosacchariden angewendet, unter der Verwendung von abwechselnden Phosphat-Baueinheiten (Schema 2). Verzweigtes Hexasaccharid 10 wurde in zehn Stunden mit einer Ausbeute von über 80%, wie durch HPLC bewertet wurde, hergestellt. Wir stellten auch Dodecasaccharid 7 in 17 Stunden mit einer Ausbeute von über 50% unter Verwendung des selben Zyklus her. Bemerkenswert war, dass die Lösungsphasen-Synthese von nur zwei Phosphat-Baueinheiten erforderlich war, was die manuelle Arbeit, die notwendig ist, um eine Struktur dieser Größe zusammenzubauen, stark reduziert. Die nützliche Herstellung von Material mittels Automatisierung stellt eine bedeutende Verbesserung gegenüber früheren Verfahren für die Polysaccharid-Synthese dar. Schema 2: Automatisierte Oligosaccharid-Synthese unter Verwendung von Glycosylphosphaten
    Figure 00470001
    • Glycosylierungsbedingungen: 25 μmol Maßstab; 25 μmol Harz (83 mg, 0,30 mmol/g Beladung); 5 Äquiv. Donator 8 oder 9 (90 bzw. 170 mg); 5 Äquiv. TMSOTf (1 ml, 0,125 M TMSOTf in CH2Cl2) zweimal für jeweils 15 Minuten bei –15°C wiederholt. Schutzeliminierungsbedingungen: 25 μmol Maßstab; 4 ml, 0,25 M N2H4 in Pyridin:Essigsäure (3:2), zweimal für jeweils 15 Minuten bei 15°C wiederholt.
  • Beispiel 4
  • Kompexartige Trisaccharide
  • Nach der Entwicklung von Methode für die Aktivierung und Kopplung von anomeren Trichloracetimidat- und Glycosylphosphat-Donatoren sowie für die Schutzeliminierung von Acetyl- und Levulinoylestern, entwarfen wird eine Synthese, die alle Aspekte unserer automatisierten Chemie ausnutzt. Wir wählten Trisaccharid 24, welches auf drei unterschiedlichen Monomereinheiten aufgebaut ist, als Zielmolekül aus und entwickelten eine Synthese, um unterschiedliche Donatoren und temporäre Schutzgruppen einzubauen (Schema 5). Glycane, die dieses Trisaccharid-Motiv enthalten, sind schwierig synthetisch herzustellen, aufgrund des Vorhandenseins von Gal- -(1→4) GlcNAc und GlcNAc- -(1→2)-Man-Bindungen.
  • Figure 00480001
    Schema 5: Synthese von Trisaccharid 24 unter Verwendung von Glycosyltrichloracetimidaten und Glycosylphosphaten
  • Unter Berücksichtung der Aktivierungs- und Schutzeliminierungsbedingungen, die für die Verwendung der Donatoren 11, 22 und 23 notwendig sind, entwickelten wir einen geeigneten Kopplungszyklus (Tabelle 4). Unter Anwenden der in Tabelle 4 dargelegten Aufeinanderfolge, führten wir die Synthese von Trisaccharid 24 auf einem 1% vernetzten Polystylrol-Träger durch (Schema 5). Nach dem 10 stündigen Kopplungszyklus wurde das Trisaccharid 24 vom Träger abgespalten und durch HPLC analysiert, um 24 mit einer Gesamtausbeute von 60% zu ergeben. Wir wurden durch dieses Ergebnis ermutigt, da es das erste Beispiel war, welches alle der automatisierten Protokolle in einen einzigen Kopplungszyklus einbezog. Weiters stellte die erfolgreiche Schutzeliminierung eines Levulinatesters in der Gegenwart einer Phthaloylamin Schutzgruppe eine orthogonale Schutzgruppen-Strategie bereit, welche im Allgemeinen auf andere Sequenzen angewendet werden kann. Es ist verständlich, dass jeder für unser automatisiertes Protokoll entwickelte Grad an Orthogonalität die Geschwindigkeit und Effizienz, mit welcher zunehmend komplexere Kohlenhydrate hergestellt werden können, erhöhen wird. Tabelle 4. Der für die Synthese von Trisaccharid 24 verwendete Zyklus.
    Schritt Funktion Reagens Zeit (min)
    1 Koppeln 4 Äquiv. Donator 11 und 0,4 Äquiv. TMSOTf 30
    2 Waschen Dichlormethan 6
    3 Koppeln 4 Äquiv. Donator 11 und 0,4 Äquiv. TMSOTf 30
    4 Waschen Dichlormethan 6
    5 Waschen 1:9 Methanol:Dichlormethan 4
    6 Schutzeliminierung 2 × 10 Äquiv. NaOMe (1:9 Methanol: Dichlormethan) 80
    7 Waschen 1:9 Methanol:Dichlormethan 4
    8 Waschen 0,2 M Essigsäure in Tetrahydrofuran 4
    9 Waschen Tetrahydrofuran 4
    10 Waschen Dichlormethan 6
    11 Koppeln 4 Äquiv. Donator 22 und 0,4 Äquiv. TMSOTf 30
    12 Waschen Dichlormethan 6
    13 Koppeln 4 Äquiv. Donator 22 und 0,4 Äquiv. TMSOTf 30
    14 Waschen Dichlormethan 6
    15 Waschen 1:9 Methanol:Dichlormethan 4
    16 Waschen Tetrahydrofuran 4
    17 Waschen 3:2 Pyridin:Essigsäure 3
    18 Schutzeliminierung 2 × 20 Äquiv. Hydrazin (3:2 Pyridin:Essigsäure) 30
    19 Waschen 3:2 Pyridin:Essigsäure 3
    20 Waschen 1:9 Methanol:Dichlormethan 4
    21 Waschen 0,2 M Essigsäure in Tetrahydrofuran 4
    22 Waschen Tetrahydrofuran 4
    23 Waschen Dichlormethan 6
    24 Koppeln 5 Äquiv. Donator 23 und 5 Äquiv. TMSOTf 15
    25 26 Waschen Koppeln Dichlormethan 5 Äquiv. Donator 23 und 5 Äquiv. TMSOTf 6 15
    27 Waschen 1:9 Methanol:Dichlormethan 4
    28 Waschen Tetrahydrofuran 4
    29 Waschen Dichlormethan 6
  • Phytoalex-Induktor-Glucane, Hexasaccharid 10 und Dodecasaccharid 7 wurde auf eine schnelle Art und Weise unter Verwendung von Glycosylphosphaten konsturiert. Wir erwarten, dass diese Technologie die schnelle und zuverlässige Beschaffung von synthetischen Oligosacchariden durch einen Nicht-Spezialisten ohne übermäßige Schwierigkeiten ermöglichen wird. Die Befreiung von der langwierigen manuellen Arbeit, die in Kohlenhydrat-Synthese involviert sind, wird den Zugang zu synthetischem Material für biochemische Untersuchungen fördern. Die Leichtigkeit des Erhalten von definierten Strukturen von einem Gerät wird das Gebiet der Glycobiologie beeinflussen, so dass wir eines Tages in der Lage sind, die Wichtigkeit der Oligosaccharide und Glycokonjugate in der Natur vollauf schätzen.
  • Beispiel 5
  • Synthese und Charakterisierung der Baueinheiten 8 und 9
  • Schema I. Synthese der Baueinheiten 8 und 9
    Figure 00500001
  • SYNTHESE von DIBUTYL 3,4-DI-O-BENZYL-6-O-LEVULINOYL-2-O-PIVALOYL-D-GLUCOPYRANOSYL PHOSPHAT B.
  • 3,4-Di-O-benzyl-6-O-levulinoyl-D-arabino-hex-1-enitol (2.12 g, 5.0 mmol) wurde in CH2Cl2 (5 mL) aufgelöst und auf 0° gekühlt. Eine 0,08 M Dimethyldioxiran-Lösung in Aceton (75 ml, 6,0 mmol) wurde hinzugefügt und die Reaktiosmischung wurde 15 Minuten gerührt. Nach dem das Lösungsmittel in einem N2-Strom entfernt wurde und der restliche Rückstand im Vakuum für 15 Minuten bei 0°C getrocknet wurde, wurden 20 ml CH2Cl2 hinzugefügt. Die Lösung wurde auf 78°C für 15 Minuten gekühlt und Dibutylphosphat (1,04 ml, 5,25 mmol) wurde dann tropfenweise über 5 Minuten hinzugefügt. Nach der vollständigen Zugabe, wurde die Reaktionsmischung auf 0°C erwähnt und DMAP (2,44 g, 20,0 mmol) und Pivaloylchlorid (1,23 ml, 10,0 mmol) wurde hinzugefügt. Die Lösung wurde über Stunde auf Raumtemperatur erwärmt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde durch Flash-Säulenchromatogaphie an Silicagel gereinigt, um 3,29 g (90%) von 8 als ein farbloses Öl zu erhalten. 1H NMR (500 MHz) 7,34-7,24 (m, 10H), 5,23 (app t, J = 7,6, 7,9 Hz, 1H), 5,14 (app t, J = 7,9, 9,2 Hz, 1H), 4,81-4,78 (m, 2H), 4,72 (d, J = 11,0 Hz, 1H), 4,57 (d, J = 10,7 Hz, 1H), 4,39 (d, J = 11,3 Hz, 1H), 4,23 (dd, J = 4,0, 12,2 Hz, 1H), 3,67-3,66 (m, 2H), 2,76-2,70 (m, 2H), 2,57-2,54 (m, 2H), 2,19 (s, 3H), 1,67-1,60 (m, 4H), 1,41-1,35 (m, 4H), 1,20 (s, 9H), 0,96-0,90 (m, 6H); 13C NMR (125 MHz) 206,4, 177,0, 172,5, 137,9, 137,5, 128,7, 128,6, 128,4, 128,3, 128,2, 128,0, 127,5, 96,6, 96,6, 82,9, 75,3, 75,2, 73,8, 72,9, 68,2, 68,2, 68,0, 68,0, 62,7, 39,0, 38,0, 32,3, 32,3, 32,3, 32,2, 30,0, 27,9, 27,3, 18,8, 18,8, 13,8, 13,7; 31PNMR (120 MHz) –1,66.
  • Synthese von Dibutyl(2,3,4,6-tetra-O-benyl- -D-glucopyranosyl)-(1→3)-4-O-benzyl-4-6-O-levulinoyl-2-O-pivaloyl- -D-glucopyranosyl phosphat 9.
  • 2,3,4,6-tetra-O-benzyl- -D-glucopyranosyl-(1→3)-4-O-benzyl-6-O-levulinoyl-D-arabino-hex-1-enitol (1.00 g, 1.14 mmol) wurde in CH2Cl2 (5 mL) aufgelöst und auf 0°C gekühlt. Eine 0,08 M Dimethyldioxiran-Lösung in Aceton (25 ml, 1,77 mmol) wurde hinzugefügt und die Reaktionsmischung wurde 15 Minuten gerührt. Nach dem das Lösungsmittel in einem N2-Strom entfernt wurde und der restliche Rückstand im Vakuum für 15 Minuten bei 0°C getrocknet wurde, wurden 20 ml CH2Cl2 hinzugefügt. Die Lösung wurde auf –78°C für 15 Minuten gekühlt und Dibutylphosphat (0,26 ml, 1,30 mmol) wurde dann tropfenweise über 5 Minuten hinzugefügt. Nach der vollständigen Zugabe, wurde die Reaktionsmischung auf 0°C erwärmt und DMAP (0,57 g, 4,72 mmol) und Pivaloylchlorid (0,29 ml, 2,36 mmol) wurde hinzugefügt. Die Lösung wurde über 1 Stunde auf Raumtemperatur erwärmt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand wurde durch Flash-Säulenchromatographie an Silicagel gereinigt, um 950 mg (70%) von 9 als farbloses Öl zu erhalten. 1H NMR (500 MHz) 7,32-7,24 (m, 25H), 5,22 (app t, J = 7,9, 9,4 Hz, 1H), 5,14 (app t, J = 6,4, 7,9 Hz, 1H), 5,01 (d, J = 11,0 Hz, 1H), 4,93 (d, J = 11,6 Hz, 1H), 4,87 (d, J = 11,0 Hz, 1H), 4,81 (d, J = 10,7 Hz, 1H), 4,74 (d, J = 11,0 Hz, 1H), 4,67 (d, J = 7,9 Hz, 1H), 4,64-4,54 (m, 3H), 4,48 (s, 2H), 4,38-4,36 (m, 1H), 4,23 (dd, J = 4,3, 11,9 Hz, 1H), 4,18-4,11 (m, 2H), 4,07-3,98 (m, 4H), 3,80 (d, J = 11,0 Hz, 1H), 3,64-3,54 (m, 4H), 2,20 (s, 3H), 1,63-1,61 (m, 4H), 1,40-1,35 (m, 4H), 1,23 (s, 9H), 0,95-0,90 (m, 6H); 13C NMR (125 MHz) 206,5, 176,6, 172,5, 171,4, 138,6, 138,5, 138,1, 129,0, 128,9, 128,8, 128,6, 128,5, 128,5, 128,3, 128,3, 128,1, 128,0, 127,7, 127,7, 127,6, 103,5, 96,5, 96,5, 84,8, 82,6, 9,2, 78,2, 75,9, 75,4, 75,2, 75,1, 75,0, 73,8, 73,6, 73,6, 73,2, 73,1, 69,3, 68,3, 68,2, 68,0, 67,9, 62,9, 60,6, 39,0, 38,0, 32,3, 32,3, 32,3, 30,0, 27,9, 27,5, 27,4, 27,3, 21,3, 18,8, 18,8, 14,4, 13,8, 13,8; 31P NMR (120 MHz) –2,33.
  • Beispiel 6
  • Evaluierung der optimalen Temperatur für Phosphat-Glycosylierung
  • Schema II. Trisaccharid-Synthese bei verschiedenen Temperaturen
    Figure 00520001
  • Trisaccharid-Synthese wurde bei Raumtemperatur und bei –15°C unter Verwendung der folgenden Bedingungen durchgeführt. 25 μmol Maßstab: 25 μmol Harz (83 mg, 0,30 mmol/g Beladung); 5 Äquiv. Dunator 8 (90 mg); 5 Äquiv. TMSOTf (1 ml, 0,125 M TMSOTf in CH2Cl2) für 15 Minuten. Schutzeliminierungsbedingungen: 25 μmol Maßstab: 4 ml, 0,25 M N2H4 in Pyridin:Essigsäure (3:2). HPLC Analyse der Spaltprodukte der Raumtemperatur Synthese und der –15°C Synthese sind in 5 bzw. 6 gezeigt.
  • HPLC Daten für Trimer-Synthese unter Verwendung von Phosphat 8 bei Raumtemperatur (Schema II):
    Figure 00530001
    • Analytisches HPLC Chromatogramm der Raumtemperatur Triglucosid-Synthese, anschließend an die Harzspaltung. Fließrate = 1 ml/min, 20→30% EtOAc/Hexane (20 Minuten): 5 Minuten = Trimer.
  • HPLC Daten für Trimer-Synthese unter Verwendung von Phosphat 8 bei –15°C (Schema II):
    Figure 00540001
    • Analytisches HPLC Chromatogramm der –15°C Triglucosid-Synthese, anschließend an die Harzspaltung. Fließrate = 1 ml/min, 20→30% EtOAc/Hexane (20 Minuten); 5 Minuten = Trimer.
  • Äquivalente
  • Fachleute werden erkennen, oder unter Verwendung von nicht mehr als Routine-Experimentation in der Lage sein, viele Äquivalente zu den spezifischen Ausführungsformen der hierin beschriebenen Erfindung zu bestimmen. Solche Äquivalente sind beabsichtigt durch die folgenden Ansprüche mitumfasst zu sein.

Claims (39)

  1. Vorrichtung für die automatisierte Festphasen-Synthese von Oligosacchariden, welche Folgendes umfasst: ein Reaktionsgefäß mit mindestens einem unlöslichen Harzkügelchen; mindestens ein Donatorgefäß mit einer Sacchariddonatorlösung; mindestens ein Aktivatorgefäß mit einer Aktivatorreagenslösung; mindestens ein Deblockierungsgefäß mit einer Deblockierungsreagenslösung; mindestens ein Lösemittelgefäß mit einem Lösemittel; ein Lösungstransfersystem, welches in der Lage ist, die Sacchariddonatorlösung, Aktivatorreagenslösung, Deblockierungsreagenslösung und das Lösemittel zu übertragen; und einen Computer zur Steuerung des Lösungstransfersystems.
  2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das mindestens eine unlösliche Harzkügelchen einen Glycosyl-Akzeptor aufweist, der über einen organischen Linker an dieses gebunden ist.
  3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, welche ferner eine Temperaturregelungseinheit zur Regelung der Temperatur des Reaktionsgefäßes aufweist.
  4. Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei die Temperaturregelungseinheit durch den Computer gesteuert wird.
  5. Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, wobei die Temperaturregelungseinheit die Innentemperatur des Reaktionsgefäßes misst.
  6. Verrichtung nach Anspruch 3, 4 oder 5, wobei das Reaktionsgefäß eine doppelwandige Struktur ist, welche zwei Hohlräume bildet, wobei in dem ersten Hohlraum die Synthese der Oligosaccharide stattfindet, und wobei der zweite Hohlraum ein Kühlmittel der Temperaturregelungseinheit enthält.
  7. Vorrichtung nach Anspruch 6, wobei die doppelwandige Struktur des Reaktionsgefäßes aus Glas besteht.
  8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 3 bis 7, wobei die Temperaturregelungseinheit in der Lage ist, das Reaktionsgefäß auf einer Temperatur zwischen –80°C und +60°C zu halten.
  9. Vorrichtung nach Anspruch 8, wobei die Temperaturregelungseinheit in der Lage ist, das Reaktionsgefäß auf einer Temperatur zwischen –25°C und +40°C zu halten.
  10. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das mindestens eine Donatorgeräß eine Lösung enthält, welche ein Glycosyltrichloracetimidat oder ein Glycosylphosphat enthält.
  11. Vorrichtung eines der vorhergehenden Ansprüche, wobei das mindestens eine Aktivatorgefäß eine Lösung enthält, welche eine Lewis-Säure enthält.
  12. Vorrichtung nach Anspruch 11, wobei das mindestens eine Aktivatorgefäß eine Lösung enthält, welche ein Silyltrifluormethansulfonat enthält.
  13. Vorrichtung nach Anspruch 12, wobei das mindestens eine Aktivatorgefäß eine Lösung enthält, welche Trimethylsilyltrifluormethansulfonat enthält.
  14. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das mindestens eine Deblockierungsgefäß eine Lösung enthält, welche Natriummethoxid oder Hydrazin enthält.
  15. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das mindestens eine Lösemittelgefäß Dichlormethan, Tetrahydrofuran und/oder Methanol enthält.
  16. Vorrichtung nach Anspruch 15, wobei ein erstes Lösemittelgefäß Dichlormethan enthält, ein zweites Lösemittelgefäß Methanol enthält und ein drittes Lösemittelgefäß Tetrahydrofuran enthält.
  17. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, welche ferner mindestens ein Blockierungsgefäß aufweist, welches eine Blockierungsreagenslösung enthält.
  18. Vorrichtung nach Anspruch 17, wobei das mindestens eine Blockierungsgefäß eine Lösung enthält, welche Benzyltrichloracetimidat oder eine Carbonsäure enthält.
  19. Vorrichtung nach Anspruch 18, wobei die Carbonsäure Levulinsäure ist.
  20. Vorrichtung nach Anspruch 19, wobei ein erstes Lösemittelgefäß Dichlormethan enthält, ein zweites Lösemittelgefäß Methanol enthält und ein drittes Lösemittelgefäß Tetrahydrofuran enthält; ein viertes Lösemittelgefäß eine eine Lösung enthält, welche Pyridin und Essigsäure aufweist und ein fünftes Lösemittelgefäß eine 0,2 M Lösung Essigsäure in Tetrahydrofuran enthält.
  21. Vorrichtung nach Anspruch 19, wobei ein erstes Donatorgefäß eine Lösung enthält, welche Glycosyltrichloracetimidat aufweist, ein zweites Donatorgefäß eine Lösung enthält, welche ein erstes Glycosylphosphat aufweist, ein drittes Donatorgefäß eine Lösung enthält, welche ein zweites Glycosylphosphat aufweist, das mindestens eine Aktivatorgefäß eine Lösung enthält, welche Trimethylsilyltrifluormethansulfonat aufweist, ein erstes Deblockierungsgefäß eine Lösung enthält, welche Hydrazin aufweist, ein zweites Deblockierungsgefäß eine Lösung enthält, welche Natriummethoxid aufweist, ein erstes Lösemittelgefäß Dichlormethan enthält, ein zweites Lösemittelgefäß Methanol enthält und ein drittes Lösemittelgefäß Tetrahydrofuran enthält, ein viertes Lösemittelgefäß eine Lösung enthält, welche Pyridin und Essigsäure aufweist und ein fünftes Lösemittelgefäß eine 0,2 M Lösung Essigsäure in Tetrahydrofuran enthält.
  22. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das mindestens eine unlösliche Harzkügelchen aus einem Octendiol-funktionalisierten Harz besteht.
  23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 2 bis 22, wobei der organische Linker aus einem Glycosylphosphat besteht.
  24. Verfahren zur Bildung einer Kohlenstoff-Heteroatom-Bindung zwischen einem Glycosyldonator und einem Substrat, welches in Lösung im Reaktionsgefäß einer Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, den Schritt der Kombination eines Glycosyldonators, welcher einen reaktiven anomeren Kohlenstoff aufweist, eines Substrates, welches ein Heteroatom aufweist, welches einen Wasserstoff trägt, und ein Aktivierungsreagens umfasst, wobei das Aktivierungsreagens den reaktiven anomeren Kohlenstoff des Glycosyldonators aktiviert, wodurch ein Produkt gebildet wird, welches eine Kohlenstoff-Heteroatom-Bindung zwischen dem anomeren Kohlenstoff des Glycosyldonators und dem Heteroatom des Substrates aufweist.
  25. Verfahren nach Anspruch 24, wobei der Glycosyldonator, welcher einen reaktiven anomeren Kohlenstoff aufweist, aus der Gruppe bestehend aus Glycosylphosphaten, Glycosylphosphiten, Glycosyltrichloracetimidaten, Glycosylhalogeniden, Glycosylsulfiden, Glycosylsulfoxiden, n-Pentenylglycosiden und 1,2-Anhydroglycosiden ausgewählt ist.
  26. Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, wobei das Heteroatom, welches einen Wasserstoff des Substrates trägt, aus der Gruppe bestehend aus Sauerstoff, Stickstoff und Schwefel ausgewählt ist.
  27. Verfahren nach Anspruch 24, 25 oder 26, wobei das Aktivierungsreagens eine Lewis-Säure ist.
  28. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 27, wobei das Aktivierungsreagens ein Silyltrifluormethansulfonat ist.
  29. Verfahren nach Anspruch 28, wobei das Aktivierungsreagens Trimethylsilyltrifluormethansulfonat ist.
  30. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 29, wobei das Substrat, welches ein Heteroatom aufweist, welches einen Wasserstoff trägt, über einen kovalenten Linker an einen festen Träger gebunden ist.
  31. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 30, wobei der Glycosyldonator, welcher einen reaktiven anomeren Kohlenstoff aufweist, über einen kovalenten Linker an einen festen Träger gebunden ist.
  32. Verfahren nach Anspruch 30 oder 31, wobei der kovalente Linker -O-(CH2)3CH=CH(CH2)3-O- ist.
  33. Verfahren nach Anspruch 32, wobei der feste Träger ein Harzkügelchen ist.
  34. Verfahren nach Anspruch 33, wobei das Substrat, welches ein Heteroatom aufweist, welches einen Wasserstoff trägt, aus der Gruppe bestehend aus Monosacchariden, Oligosacchariden, Polysacchariden und Glycokonjugaten ausgewählt ist.
  35. Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 34, welches ferner die Schritte der Anwendung positiven Drucks oder eines Vakuums auf das Reaktionsgefäß der Vorrichtung umfasst, wodurch die flüssige Phase aus dem Reaktionsgefäß der Vorrichtung entfernt wird, sowie der Zugabe von Lösemittel zum Reaktionsgefäß der Vorrichtung.
  36. Verfahren nach Anspruch 35, welches ferner den Schritt der Behandlung des Produktes im Reaktionsgefäß der Vorrichtung mit einer Lösung umfasst, welche ein Reagens zur Entfernung des Schutzes aufweist, wodurch eine Schutzgruppe von dem Produkt entfernt wird, um ein zweites Produkt zu erzeugen, welches ein Heteroatom aufweist, welches einen Wasserstoff trägt, wobei das zweite Produkt über einen kovalenten Linker an einen festen Träger gebunden ist.
  37. Verfahren nach Anspruch 36, welches ferner in Lösung in dem Reaktionsgefäß der Vorrichtung den Schritt der Kombination eines Glycosyldonators, welcher einen reaktiven anomeren Kohlenstoff aufweist, wobei das zweite Produkt ein Heteroatom aufweist, welches einen Wasserstoff trägt, mit einem Aktivierungsreagens, wobei das Aktivierungsreagens den reaktiven anomeren Kohlenstoff des Glycosyldonators aktiviert, wodurch ein drittes Produkt gebildet wird, welches eine Kohlenstoff-Heteroatom-Bindung zwischen dem anomeren Kohlenstoff des Glycosyldonators und dem Heteroatom des zweiten Produktes aufweist, wobei das dritte Produkt über einen kovalenten Linker an einen festen Träger gebunden ist.
  38. Verfahren nach Anspruch 35, welches ferner den Schritt der Behandlung des Produktes im Reaktionsgefäß der Vorrichtung mit einer Lösung umfasst, welche ein Umwandlungsreagens zum Herstellen eines zweiten Produktes aufweist, welches einen reaktiven anomeren Kohlenstoff aufweist, wobei das zweite Produkt über einen kovalenten Linker an einen festen Träger gebunden ist.
  39. Verfahren nach Anspruch 38, welches ferner in Lösung in dem Reaktionsgefäß der Vorrichtung den Schritt der Kombination eines Substrates, welches ein Heteroatom aufweist, welches einen Wasserstoff trägt, wobei das zweite Produkt einen reaktiven anomeren Kohlenstoff aufweist, mit einem Aktivierungsreagens umfasst, wobei das Aktivierungsreagens den reaktiven anomeren Kohlenstoff des zweiten Produktes aktiviert, wodurch ein drittes Produkt gebildet wird, welches eine Kohlenstoff-Heteroatom-Bindung zwischen dem anomeren Kohlenstoff des zweiten Produktes und dem Heteroatom des Substrates aufweist, wobei das dritte Produkt über eine kovalenten Linker an einen festen Träger gebunden ist.
DE60110094T 2000-08-18 2001-08-17 Vorrichtung und verfahren zur automatisierten synthese von oligosacchariden Expired - Lifetime DE60110094T2 (de)

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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7723296B2 (en) 2001-01-18 2010-05-25 Genzyme Corporation Methods for introducing mannose-6-phosphate and other oligosaccharides onto glycoproteins and its application thereof
JP4006385B2 (ja) * 2002-11-20 2007-11-14 株式会社日立ハイテクノロジーズ 糖鎖合成装置
EP1640379A1 (de) * 2003-06-30 2006-03-29 Mitsubishi Chemical Corporation Verfahren zur synthese einer zuckerkette
CN100432085C (zh) * 2003-12-22 2008-11-12 叶新山 一种寡糖的合成方法
JP4252922B2 (ja) * 2004-03-31 2009-04-08 株式会社日立ハイテクノロジーズ 糖鎖合成装置
JP2006151948A (ja) * 2004-11-04 2006-06-15 Institute Of Physical & Chemical Research 糖鎖合成方法および糖鎖自動合成装置
US10059736B2 (en) * 2005-03-15 2018-08-28 Mcgill University Ionic liquid supported synthesis
US8420607B2 (en) * 2006-06-30 2013-04-16 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Anthrax carbohydrates, synthesis and uses thereof
CA2656606A1 (en) 2006-06-30 2008-09-25 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Anthrax carbohydrates,synthesis and uses thereof
DK2069558T3 (da) * 2006-10-02 2013-08-05 Sea Lane Biotechnologies Llc Design og konstruktion af forskelligartede syntektiske peptid- og polypeptidbiblioteker
ES2417146T3 (es) * 2007-01-18 2013-08-06 Genzyme Corporation Oligosacáridos que comprenden un grupo aminoxi y conjugados de los mismos
US20100159604A1 (en) * 2007-06-22 2010-06-24 Iowa State University Research Foundation, Inc. Automated solution-phase iterative synthesis
US8211370B2 (en) * 2007-12-07 2012-07-03 Thomas Downing Polymer synthesizer
EP2145895B1 (de) * 2008-07-08 2013-10-30 Commissariat à l'Énergie Atomique et aux Énergies Alternatives Verfahren zur Herstellung von Glycochips
AU2009273998A1 (en) * 2008-07-23 2010-01-28 Ancora Pharmaceuticals Inc. Automated oligosaccharide synthesizer
WO2010075010A2 (en) 2008-12-16 2010-07-01 Genzyme Corporation Oligosaccharide-protein conjugates
US8361396B2 (en) 2010-02-22 2013-01-29 Oligoco, Inc. Automated polymer-synthesis system
WO2011102913A2 (en) * 2010-02-22 2011-08-25 Oligoco Wicking-based reagent-solution draining in an automated system
JP5860871B2 (ja) 2010-06-04 2016-02-16 アンスティチュ ナショナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル 新規免疫アジュバント化合物およびその使用
CN105461767B (zh) * 2014-08-07 2019-03-12 富力 一种连翘苷的化学合成方法
WO2021089623A1 (en) * 2019-11-04 2021-05-14 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Synthesizer for oligo- and polysaccharides on solid phase
EP3815778A1 (de) 2019-11-04 2021-05-05 Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Vorrichtung zur schnellen automatisierten synthese von oligo- und polysacchariden

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4610847A (en) * 1980-09-23 1986-09-09 California Institute Of Technology Conversion flask for sequential performance apparatus
US4598049A (en) * 1983-08-31 1986-07-01 Systec Inc. General purpose gene synthesizer
US5256549A (en) * 1986-03-28 1993-10-26 Chiron Corporation Purification of synthetic oligomers
US5147608A (en) * 1988-04-29 1992-09-15 Millipore Corporation Apparatus and process for performing repetitive chemical processing
FR2673631B1 (fr) * 1991-03-06 1993-05-21 Rhone Poulenc Chimie Procede et appareil de synthese en phase heterogene de macromolecules telles que des peptides, des polynucleotides ou des oligosaccharides.
DE69220888T2 (de) * 1991-11-05 1998-01-29 Perkin Elmer Corp Vorrichtung und Verfahren zur Herstellung von Biopolymeren
DK0649427T3 (da) * 1992-06-01 1998-03-02 Biomembrane Inst Sekventiel fjernelse af monosaccharider fra den reducerende ende af oligosaccharider og anvendelser deraf
DE69302692T2 (de) * 1992-07-06 1996-10-02 Beckman Instruments Inc Flüssigkeitsversorgungssystem mit Mehrwegventil
US5639866A (en) * 1993-02-23 1997-06-17 Princeton University Single-step formation of multiple glycosidic linkages
AUPO190596A0 (en) * 1996-08-26 1996-09-19 Alchemia Pty Ltd Oligosaccharide synthesis
US6890491B1 (en) * 1997-06-10 2005-05-10 Pharmacopeia Drug Discovery, Inc. Method and apparatus for universal fluid exchange
CA2346237A1 (en) 1998-10-06 2000-04-13 Massachusetts Institute Of Technology Synthesis of oligosaccharides, reagents and methods related thereto

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