DE60112073T2

DE60112073T2 - Impfstoffzusammensetzung und verfahren zur herstellung derselben sowie verfahren zur impfung von wirbeltieren

Info

Publication number: DE60112073T2
Application number: DE60112073T
Authority: DE
Inventors: L. Terry BOWERSOCK; Paul Guimond; R. Tzu-Chi JU; Argaw Kidane
Original assignee: Pharmacia and Upjohn Co LLC
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co LLC
Priority date: 2000-05-12
Filing date: 2001-05-11
Publication date: 2006-04-20
Anticipated expiration: 2021-05-12
Also published as: US20040071727A1; WO2001087270A3; EP1280521A2; PT1280521E; ES2243497T3; US6656470B2; US7160544B2; WO2001087270A2; EP1280521B1; US20020009457A1; WO2001087270B1; DE60112073D1; ATE299696T1; AU2001261433A1; HK1049800A1; DK1280521T3

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Im Allgemeinen bezieht sich die Erfindung auf eine Zusammensetzung und auf die Verwendung dieser Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments für die Impfung von Wirbeltierarten und auf ein Verfahren, die Zusammensetzung herzustellen. Im Speziellen bezieht sich die Erfindung auf eine Impfstoffzusammensetzung, welche ein Antigen in modifizierten Alginat-Mikropartikeln umfaßt, ein Verfahren, die Impfstoffzusammensetzung herzustellen und die Verwendung dieser Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zum Impfen unter Verwendung der Zusammensetzung, um Immunität auszulösen.
Kurze Beschreibung der verwandten Technologie
In der Vergangenheit hat die Immunisierung auf die Induktion der humoralen Immunität durch die parenterale Verabreichung von Impfstoffen beruht. Durch parenterale Verabreichung induzierte Antikörper erreichen jedoch nicht unbedingt die Schleimhautoberflächen, die Eintrittsstellen der meisten ansteckenden Erreger. Die Immunität der Schleimhaut, welche sich auf den Schleimhautoberflächen als ein Ergebnis des Kontakts des Antigens mit lymphoiden Schleimhautgeweben entwickelt, ist ein bedeutender erster Abwehrschritt gegen ansteckende Erreger.
Die Induktion der Immunität auf Schleimhautoberflächen erfordert den direkten Kontakt des Antigens mit einer Schleimhautoberfläche. Dieser ist jedoch, aufgrund von Handhabungs- bzw. Verabreichungsproblemen und aufgrund der Toxizität von manchen Antigenen zu Schleimhautoberflächen, nicht immer möglich oder praktisch. Ein alternativer Weg, um schützende Immunität an Schleimhautoberflächen auszulösen, ist die Stimulierung des gemeinsamen Schleimhautimmunsystems (CMIS), ein Netzwerk, welches immunologisch alle Schleimhautstellen miteinander verknüpft.
Das CMIS besteht aus lymphoidem Gewebe auf Stellen der Schleimhaut, welches Antigene auswählt, um eine Immunantwort auszulösen. Tuftzellen (M-Zellen) sind die spezialisierten Zellen, welche Antigene auswählen, so daß sie durch Lymphozyten und Makrophagen weiterverarbeitet werden können. Große Konzentrationen von Schleimhaut assoziiertem lymphoiden Gewebe werden im oberen Respirationstrakt, im unteren Respirationstrakt und im Magen-Darm-Trakt gefunden.
Das Magen-Darm-Gebiet enthält die größte Konzentration von Lymphozyten im Körper, hauptsächlich in Regionen, die als Peyer's-Flecken bezeichnet werden. Die Stimulierung von lymphoidem Gewebe im Darm (Darm assoziiertes lymphoides Gewebe oder GALT) durch orale Impfstoffe kann Antigen-spezifische Lymphozyten, welche in die Gewebeflüssigkeit oder in den allgemeinen Blutkreislauf eindringen, zur Folge haben. Diese Lymphozyten zielen auf die (wandern zurück zur) Lamina Propria, das Gebiet von dem sie abstammen, wo sie dann einen Antikörper produzieren, welcher die Schleimhautoberfläche überzieht. Als Teil des CMIS wandert ein erheblicher Bestand dieser Lymphozyten zu anderen Schleimhautstellen. Auf diese Weise kann die orale Verabreichung von Antigenen verwendet werden, um eine Reaktion der Schleimhaut zu induzieren, um systemischen Schutz vor Infektionen zu liefern und um Infektionen an einer Vielzahl von Schleimhautstellen im Körper zu verhindern.
Der orale Verabreichungsweg ist der attraktivste Weg, um Antigene zu verabreichen, aber gleichzeitig sehr anspruchsvoll. Für eine angemessene Immunogenität durch die orale Verabreichung von Antigenen unter Verwendung von Mikropartikeln, müssen die Mikropartikel von den M-Zellen aufgenommen werden, zu den lymphoiden Follikeln transferiert werden und von den Lymphozyten und Makrophagen, die den Follikeln zugrunde liegen, verarbeitet werden. Die Aufnahme von Mikropartikeln durch die M-Zellen hängt stark von der Beschaffenheit der Mikropartikel, wie zum Beispiel der Größe, Hydrophobie und möglicher Oberflächenladung ab.
Orale Impfstoffträger, welche zur Behandlung einer Vielzahl von humanen Krankheiten nützlich sind, werden zur Verabreichung von Impfstoffen untersucht. Häufig werden orale Impfstoffe unter Verwendung von Tiermodellen entwickelt. Die erhaltenen Informationen von für eine Tierart entwickelten, oralen Impfstoffen können für die effizientere Entwicklung von Impfstoffen für andere Tierarten verwendet werden.
Die orale Verabreichung von Impfstoffen ist einfach und ökonomisch und erfordert wenig Mühe. Die orale Verabreichung reduziert die Möglichkeit von Nebenwirkungen und eliminiert Reaktionen der Injektionsstelle, welche den Tierkörper oder das Fell des Tieres schaden können. Jedoch müssen oral verabreichte Antigene vor dem niedrigen pH-Wert und vor den Magenenzymen geschützt werden, bis sie das GALT im Dünndarm erreichen. Andernfalls können die Antigene beschädigt oder verändert werden, was zu einer verringerten Stimulierung und zu einer weniger effektiven Immunantwort führt.
Im Allgemeinen ist bekannt, daß Alginatgel-Mikropartikel (oder Mikrosphären) als eine Matrix für die orale Verabreichung von Impfstoff-relevanten Antigenen verwendet werden können. Siehe Bowersock et al., US Patent-Nummer 5,674,495, herausgegeben am 7. Oktober, 1997. Die Vorteile dieser Matrix umfassen die Verträglichkeit mit einer großen Vielfalt von Antigenen, einschließlich schwacher Antigene, die Verträglichkeit mit lebenden Organismen, die Verträglichkeit mit Nukleinsäuren und die Bereitstellung eines Hilfsstoff-Effekts durch das Alginat-System selbst. Obwohl die grundlegende Technik bekannt ist, gibt es viele Variablen, die die Bildung von Alginat-Mikropartikeln, ihre resultierende Größe, ihre Effizienz Antigene zu laden, ihre Hydrophobie, ihre Aufnahme durch Antigen-auswählende Zellen, ihre Antigenfreisetzenden Eigenschaften und die alles umfassende Immunantwort, welche wenn Mikropartikel verwendet werden, entsteht, beeinflussen können.
Lemoine et al., (1998) Int. J. Pharm. 176: 9–19 beschreibt im Allgemeinen eine Emulgierungstechnik, um Alginatpartikel für die Verabreichung von Antigenen herzustellen, welche ein einzelnes Kation für die Vernetzung des Alginats verwendet.
Obwohl es bekannt ist, daß Antigene, die in kleineren Alginat-Mikropartikeln (z.B. Durchmesser weniger als 10 μm) verkapselt sind, eine größere Chance haben durch das GALT aufgenommen zu werden (Phagozytose), kann die Ausbildung von Mikropartikeln mit einem Durchmesser von weniger als 10 μm unter Verwendung herkömmlicher Verfahren die Antigenbeladung gefährden. Folglich kann das Verringern der Größe der Alginat-Mikropartikel bei Aufrechterhaltung oder Vergrößerung der Antigenbeladung, die Verabreichung von kleineren Volumina von Impfstoffen ermöglichen, was zu einer Materialerhaltung führt.
Obwohl es bekannt ist, daß sich die Phagozytose von Mikropartikeln erhöht, wenn sich die Hydrophobie der Mikropartikel erhöht und wenn die Ladung des Moleküls positiver ist, sind herkömmliche, mit Alginat-verkapselten Antigenen hergestellte Impfstoffe, etwas hydrophil, was die Aufnahme (Phagozytose) durch das GALT behindert, und das Alginat trägt normalerweise eine negative Ladung. Herkömmliche Antigen-enthaltende Alginat-Mikropartikel erfordern, um eine immunologische Antwort zu erzielen, die Beschichtung mit Polymeren, einschließlich Poly-Kationen wie Poly-L-Lysin, um den Mikropartikeln eine positive Ladung zu geben und um ihre Hydrophobie zu erhöhen. Folglich würde die Verstärkung der Hydrophobie und der positiven Oberflächenladung von Antigen-enthaltenen Alginat-Mikropartikel die Notwendigkeit von Polymerbeschichtungen eliminieren oder reduzieren, die Aufnahme durch das GALT erhöhen und die Immunantwort verbessern.
Schließlich erfordern herkömmliche, Alginat-Mikropartikel verwendende Impfstoffe vielfache Verabreichungen im Zeitablauf, um eine nachhaltige Antigenabgabe an den erforderlichen Zielorten zu bewirken, da die zeitliche Regulierung der Stimulierung des Immunsystems, im Anschluß an die Verabreichung der durch herkömmliche Verfahren hergestellten Impfstoffe, unvorhersehbar ist und nicht gesteuert werden kann. Zum Beispiel setzen Alginat-Mikropartikel, hergestellt von Cho et al., J. Control. Rel., 53, p. 215–224 (1998), 80% ihrer Antigene innerhalb von 24 Stunden frei. Folglich können Antigen-enthaltende Alginat-Mikropartikel, welche ein vorhersehbares und kontrollierbares Antigen-Freisetzungsprofil haben, die Notwendigkeit vielfacher Impfstoffverabreichungen eliminieren oder reduzieren und für eine nachhaltige Antigenabgabe an den erforderlichen Zielorten sorgen.
Folglich wäre es wünschenswert, Verfahren und Zusammensetzungen für die Behandlung von Krankheiten in Wirbeltierarten zur Verfügung zu stellen, welche eine verbesserte Antigenbeladung, eine verringerte Mikropartikelgröße, eine erhöhte Hydrophobie, eine verbesserte Aufnahme durch Antigen-auswählende Zellen, kontrollierte Antigen-freisetzende Eigenschaften und eine verbesserte Immunogenität haben.
Zusammenfassung der Erfindung
Folglich stellt die Erfindung eine Impfstoffzusammensetzung und ein Verfahren zur Herstellung bereit, welches die folgenden Schritte umfaßt: Bildung einer Wasser-in-Öl Emulsion, welche ein Alginat in Wasser, ein Öl, ein Antigen und wenigstens eines von (a) einem Celluloseether und wenigstens ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel; und (b) ein oberflächenaktives Mittel aus einem Dreiblockcopolymer aus Poly(ethylenoxid)-poly(propylenoxid)-poly(ethylenoxid) und wenigstens ein nichtionisches oberflächenaktives Mittel umfasst; anschließende Vernetzung des Alginats in der Emulsion mit wenigstens zwei Kationen, die aus der Gruppe, bestehend aus Aluminium, Barium, Calcium, Lithium, Mangan, Strontium und Zink, ausgewählt sind, um Antigen-enthaltende vernetzte Alginat-Mikropartikel zu bilden und Abernten der Mikropartikel.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung der Zusammensetzung für die Herstellung eines Medikaments zur Impfung einer Wirbeltierart, einschließlich des Schritts, eine nach dem Verfahren der Erfindung hergestellte Impfstoffzusammensetzung der Tierart zu verabreichen.
Ein anderer Aspekt der Erfindung ist die Verwendung der Zusammensetzung für die Herstellung eines Medikaments zur Auslösung einer Immunantwort in einer Wirbeltierart, einschließlich des Schritts, eine nach dem Verfahren der Erfindung hergestellte Impfstoffzusammensetzung der Tierart zu verabreichen.
Weitere Aspekte und Vorteile der Erfindung können für den Fachmann aus dem Review der folgenden detaillierten Beschreibung, in Verbindung mit den angefügten Ansprüchen, offensichtlich werden. Obwohl die Erfindung in verschiedenen Ausführungsformen anwendbar ist, sind nachfolgende spezielle Ausführungsformen unter der Voraussetzung beschrieben, daß die Offenbarung erläuternd ist, und nicht darauf gerichtet ist, die Erfindung auf diese speziellen Ausführungsformen zu beschränken.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Diagramm, das den Einfluß von einem oberflächenaktiven Mittel aus einem Copolymer aus Poly(ethylenoxid)-poly(propylenoxid)-poly(ethylenoxid) (abgekürzt PEO-PPO-PEO) und Methylcellulose auf die durchschnittliche Volumenpartikelgröße der Alginat-Mikropartikel zeigt.
2 ist ein Diagramm, das den Einfluß des Hinzufügens von unterschiedlichen Mengen von verschiedenen oberflächenaktiven Mitteln aus einem Copolymer aus PEO-PPO-PEO auf die Beladungseffizienz von Rinderserum-Albumin (BSA) zeigt.
3 ist ein Diagramm, das den Einfluß der Poly-L-Lysin-Beschichtung auf die durchschnittliche Volumenpartikelgröße für drei verschiedene Alginat-Formulierungen zeigt.
4 ist ein Diagramm, das den Einfluß von Methylcellulose und einem oberflächenaktiven Mitteln aus einem Copolymer aus PEO-PPO-PEO auf die Hydrophobie von Alginat-Mikropartikeln, gemessen durch Phasentrennung, zeigt.
5 ist ein Diagramm, das den Einfluß der Poly-L-Lysin-Beschichtung auf die Hydrophobie von Alginat-Mikropartikeln, gemessen durch Phasentrennung, zeigt.
6 ist ein Diagramm, das den Einfluß von METHOCEL A4C Methylcellulose und dem oberflächenaktiven Mittel PLURONIC L61 auf die Hydrophobie von Alginat-Mikropartikeln, gemessen durch Kontaktwinkelmessung, zeigt.
7 ist ein Diagramm, das den Einfluß von verschiedenen Kationen-Lösungen und oberflächenaktiven Mitteln auf die Antigen-Beladungseffizienz zeigt.
8 bis 17 sind Diagramme, die Meßwerte von Antikörper-Titern von Mäusen zeigen, die subkutan mit Mikropartikeln, die Ovalbumin, das unter Verwendung mehrerer verschiedener Emulsionsrezepte hergestellt wurde, enthielten und mit verschiedenen Kontrollsubstanzen injiziert wurden.
18 ist ein Diagramm, das den Einfluß des Hinzufügens von mehreren oberflächenaktiven Mitteln aus einem Copolymer aus PEO-PPO-PEO und Methylcellulose zu einer Alginat-Grundrezeptur mit dem oberflächenaktiven Mittel Tween 85 auf die Hydrophobie der Alginat-Mikropartikeln zeigt.
19 ist ein Diagramm, das den Einfluß von Poly(propylenglycol) auf die Hydrophobie von Alginat-Mikropartikeln zeigt.
20 ist ein Diagramm, das den Einfluß der Poly-L-Lysin-Beschichtung auf die Partikelgröße für verschiedenen Mikropartikel-Formulierungen zeigt.
21 ist ein Diagramm, das die Ergebnisse der Sterbewahrscheinlichkeit für Gruppen von Mäusen, die mit verschiedenen Alginat-Mikroparikel-Formulierungen geimpft wurden und mit lebenden Bakterien konfrontiert wurden, beschreibt.
22 ist ein Diagramm, das den Einfluß von verschiedenen Mikropartikel-Formulierungen auf die durchschnittliche Volumengröße der Alginat-Mikropartikel zeigt.
23 ist ein Diagramm, das den Einfluß von verschiedenen Alginat-Mikropartikel-Formulierungen auf die Hydrophobie der Alginat-Mikropartikel, gemessen durch Kontaktwinkelmessung, zeigt.
24 ist ein Diagramm, das die Zytotoxizität von mit verschiedenen Alginat-Grundrezepturen hergestellten Alginat-Mikropartikeln zu bovinen polymorphkernigen neutrophilen Granulocyten zeigt.
25 ist ein Diagramm, das die zelluläre Aufnahme von Alginat-Mikropartikeln durch Makrophagen, gemessen mittels Durchflußzytometrie, unter der Verwendung von fluoreszierenden FITC-markierten Mikropartikeln zeigt.
Detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Die Erfindung ist auf Impfstoffzusammensetzungen, Verfahren zur Herstellung dieser und Verfahren zur Impfung von Wirbeltierarten mit einer erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung gerichtet.
Ein Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemäßen Impfstoffzusammensetzung umfasst die folgenden Schritte: (A) Bildung einer Wasser-in-Öl Emulsion, welche (a) Wasser, (b) ein Alginat, (c) ein Öl, (d) ein Antigen und (e) entweder (i) einen Celluloseether und wenigstens ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel oder (ii) ein oberflächenaktives Mittel aus einem Dreiblockcopolymer aus PEO-PPO-PEO und wenigstens ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel umfasst; anschließende (B) Vernetzung des Alginats in der Emulsion mit wenigstens zwei Kationen, die aus der Gruppe, bestehend aus Aluminium, Barium, Calcium, Lithium, Mangan, Strontium und Zink, ausgewählt sind, um Antigen-enthaltende, vernetzte Alginat-Mikropartikel zu bilden; und (C) Abernten der Mikropartikel.
Die in dem Verfahren der Erfindung verwendete Wasserkomponente kann jedes geeignete Wasser sein, welches die Herstellung von Alginat-Mikropartikeln ansonsten nicht behindert. Vorzugsweise wird deionisiertes Wasser verwendet, um das Vorhandensein von in hartem Wasser gefundenen Metallionen, die die Steuerung der Vernetzung von Alginat beeinträchtigen könnten, zu eliminieren. Vorzugsweise wird steriles Wasser verwendet, um Kontaminationen der Alginat-Mikropartikeln zu verringern. Am bevorzugtesten wird in dem Verfahren der Erfindung steriles, destilliertes, deionisiertes Wasser (SDDW) verwendet.
„Alginat" ist ein allgemeiner Begriff, der verwendet wird, um Derivate von Alginsäure, einschließlich ein- und zweiwertige Salze, wie Calcium, Natrium, oder Kalium-Salze oder Polypropylenglycol-Alginat, zu beschreiben. Alginate sind hydrophile Kolloide, die von Meeresalgenarten einschließlich, Macrocytis, Ascophyllum und Laminaria abgeleitet sind und zum Beispiel von Acros Organics Co., Fair Lane, NJ erhältlich sind. Obwohl in dem Verfahren der Erfindung jedes einwertige metallische Salz von Alginat benutzt werden kann, wird bevorzugt Natrium-Alginat verwendet. Natrium-Alginat ist ein in Wasser lösliches, lineares Polymer, welches als Blöcke angeordnete, 1,4'-verbundene β-D-Mannuronsäure- und α-L-Guluronsäure-Reste hat.
Alginat ist auch in einer Reihe von geeigneten Viskositätsgraden von Anbietern, einschließlich des Unternehmens Monsanto (z.B. KELTONE HV Natrium-Alginat; durchschnittliche Viskosität von 400 mPa·s für eine 1%ige Lösung) und Acros Organics, Inc., Fair Lane, NJ. (z.B. „mittelvisköser"-Grad von Natrium-Alginat; Durchschnittsviskosität von 350 bis 550 mPa·s für eine 1%ige Lösung) erhältlich. Der Fachmann wird verstehen, daß der Unterschied in den Viskositätsgraden von Alginat, wenn die Konzentration die gleiche bleibt, annähernd mit dem durchschnittlichen Molekulargewicht von Alginat übereinstimmt. Das in dem Verfahren der Erfindung verwendete Alginat wird bevorzugt eine Viskosität von ungefähr 200 mPa·s bis ungefähr 3000 mPa·s für eine 2%ige (w/v) Lösung, bevorzugter von ungefähr 350 mPa·s bis ungefähr 2000 mPa·s für eine 1,5%ige (w/v) Lösung haben. Wenn ein Alginat mit einem niedrigen oder höheren Viskositätsgrad verwendet wird, neigt die Größe der Alginat-Mikropartikel dazu, sich zu erhöhen und die Beladungseffizienz dazu, sich zu verkleinern. Wenn somit ein Alginat mit einem niedrigen oder höherer Viskositätsgrad verwendet werden würde, sollte in dem Verfahren der Erfindung entsprechend mehr oder weniger Alginat-% (w/v) verwendet werden, um der erforderlichen Viskosität der Alginatlösung in etwa zu entsprechen.
Weil der Viskositätsgrad von Alginat und die verwendete Menge verändert wird, kann die Menge von jedem verwendeten oberflächenaktiven Mittel entsprechend des Verfahrens der Erfindung bei Bedarf verändert werden, um optimale Größe, Ladung und Hydrophobie der Mikropartikel zu erreichen. Wenn zum Beispiel eine geringere Konzentration von Alginat oder Alginat mit einem geringeren Viskositätsgrad verwendet wird, wird bevorzugt entsprechend mehr Celluloseether (und oder ein Celluloseether mit einem höheren Molekulargewicht) eingesetzt. Für eine Veränderung der Alginat-Konzentration oder des Viskositätsgrads wird vorzugsweise das PEO/PPO-Verhältnis in einem Dreiblockcopolymer aus PEO-PPO-PEO variieren.
In dem Verfahren der Erfindung kann jedes Öl verwendet werden, um eine Emulsion zu erzeugen, z.B. Maiskeimöl, Distelöl, Olivenöl und Rapsöl. In dem Verfahren der Erfindung wird Distelöl aus einem typischen Lebensmittelgeschäft bevorzugt, um Mikropartikel mit beständiger Größe, Ladungseffizienz und Partikelausbildung zu erhalten. Optional kann ultra-reines Öl(einschließlich ultra-reines Rapsöl), welches keine Zusatzstoffe wie oberflächenaktive Mittel und Verunreinigungen wie Oxidationsmittel enthält, verwendet werden.
In dem Verfahren der Erfindung kann das Öl in einem Verhältnisbereich von ungefähr 1:1 bis ungefähr 5:1 des Volumens des Öls zum Volumen der Antigen-enthaltenen Alginatlösung (v:v), vorzugsweise von ungefähr 3:1 bis ungefähr 5:1 (v:v), am bevorzugtesten von ungefähr 4:1 (v:v), hinzugefügt werden.
Das Wasser wird verwendet, um das Alginat zu verdünnen. Vorzugsweise wird in dem Verfahren der Erfindung eine Lösung von Alginat in Wasser in einem Bereich von ungefähr 1,0% bis ungefähr 1,5% (w/v), vorzugsweise ungefähr 1,2% (w/v) verwendet, wenn ein Alginat mit einer Viskosität von zwischen ungefähr 350 mPa·s und ungefähr 2000 mPa·s eingesetzt wird. Ein besonders vorteilhaftes Verfahren der Erstellung einer Wasserphase in dem Verfahren der Erfindung ist, mit einer Stocklösung von ungefähr 1,5% bis ungefähr 3% (w/v) Alginat-Stocklösung zu beginnen und das Antigen hinzuzufügen, um zur endgültigen Alginat-in-Wasser-Konzentration zu gelangen.
In der Anwesenheit von Kationen quervernetzen sich die Alginat-Kohlenhydrate, um ein festes Hydrogel zu formen. In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden wenigstens zwei Kationen, die aus der Gruppe, bestehend aus Aluminium, Barium, Lithium, Mangan, Strontium und Zink, ausgewählt sind, verwendet, um die Alginat-Kohlenhydrate zu vernetzen. Die Verwendung einer Kombination von zwei verschiedenen Kationen fördert die Quervernetzung zwischen verschiedenen Resten im Mannuronsäure- und Guluronsäure-Teil des Alginats, was einen höheren Vernetzungsgrad und kleinere Poren ergibt. In dem Verfahren der Erfindung wird vorzugsweise eine Kombination von Zink- und Calcium-Kationen eingesetzt.
Die Größe, Ladung, Hydrophobie und Nützlichkeit von Alginat-Mikropartikeln sowie der Beginn, die Dauer und das Ausmaß der Immunantwort, hängen in gewissem Maße alle von den verwendeten Kationen oder von den Kationenkombinationen ab.
Im Allgemeinen können die Kationen von jeder Quelle, die nicht andernfalls die Bildung von Alginat-Mikropartikeln behindert, bereitgestellt werden. Geeignete Kationen-Quellen beinhalten nicht-toxische, wasserlösliche Salze mit zweiwertigen und/oder dreiwertigen Kationen und andere Salze wie Sulfate, Laktate, Citrate, Tartrate und Acetate.
Die bevorzugte Quelle von Zink- und Calcium-Kationen sind Zinkchlorid (ZnCl₂), Calciumchlorid (CaCl₂), Zinkacetat und Calciumacetat, am bevorzugtesten Zinkacetat und Calciumacetat. Die Verwendung von Zink-Kationen ergibt kleinere, festere, brüchigere Mikropartikel, während die Kombination von Zink-Kationen mit anderen Kationen, einschließlich, aber nicht begrenzt auf Calcium-Kationen, Mikropartikel ergibt, die weniger brüchig sind, mit verstärkter Dispergierung.
Entsprechende Kationen-Konzentrationen werden eine erhöhte Mikropartikel-Ladungseffizienz, erhöhte Mikropartikel-Dispergierung und eine verringerte Mikropartikelgröße ergeben. Vorzugsweise wird die Kationen-Quelle in einer Menge von ungefähr 1 Gew.-% bis ungefähr 100 Gew.-%, bevorzugter von ungefähr 5 Gew.% bis ungefähr 80 Gew.-%, am bevorzugtesten von ungefähr 56 Gew.-%, basierend auf dem Trockengewicht von Alginat, wenn mittelvisköses Natrium-Alginat (z.B. ungefähr 350 bis ungefähr 2000 mPa·s) verwendet wird, hinzugefügt. Zum Beispiel wird 8 ml einer Vernetzungslösung, die ungefähr 9,8% (w/v) Zinkacetat und ungefähr 4,2% (w/v) Calciumacetat beinhaltet, pro 8 ml einer 1,5%igen (w/v) mittelviskösen (z.B. 400 mPa·s) Natrium-Alginat Lösung bevorzugt verwendet, um in den Verfahren der Erfindung eine Charge von Mikropartikeln im Labormaßstab herzustellen.
Im Allgemeinen kann jedes nicht-ionische oberflächenaktive Mittel in den Verfahren der Erfindung verwendet werden. Wenn ein Emulsionssystem erzeugt wird (z.B. eine Wasser-in-Öl Emulsion), ist die innere Phase (z.B. die wäßrige Phase) innerhalb der kontinuierlichen äußeren Phase (z.B. der Ölphase) fein verteilt. Die oberflächenaktiven Mittel überziehen die fein verteilten Tröpfchen unter Bildung einer schützenden Schicht. Ohne an irgendeine bestimmte Theorie gebunden zu sein wird geglaubt, daß diese schützende Schicht von oberflächenaktiven Mitteln unter Erzeugung einer stabilen Emulsion, die Interaktion zwischen fein verteilten Tröpfchen minimiert. Die Dicke der schützenden Schicht und die Oberflächenabdeckung hängt von Faktoren ab, die die Eigenschaft und die Konzentration des oberflächenaktiven Mittels einschließen. Oberflächenaktive Moleküle sind aufgrund ihrer amphiphilen Eigenschaft vorzugsweise an der Oberfläche der Mikropartikel oder des dispergierten Systems lokalisiert. In Abhängigkeit von der Eigenschaft des oberflächenaktiven Moleküls, können die Oberflächeneigenschaften eines dispergierten Mikropartikels durch das oberflächenaktive Mittel modifiziert werden.
Ein oberflächenaktives Mittel (oder ein System von oberflächenaktiven Mitteln, welches mehr als ein oberflächenaktives Mittel umfaßt) kann durch dessen hydrophilen/lipophilen Ausgleichswert (HLB) beschrieben werden. HLB-Werte werden experimentell bestimmt und einer beliebigen Skala von 1 bis 40 zugeteilt. Wenn der HLB-Wert gering ist, dann sind weniger hydrophile Gruppen auf dem oberflächenaktiven Mittel und es ist lipophiler (Öl-löslich) als hydrophil (wasserlöslich). Wenn der HLB-Wert hoch ist, dann sind mehr hydrophile Gruppen auf dem oberflächenaktiven Mittel und es ist hydrophiler als lipophil.
Die Art des oberflächenaktiven Mittels (und des Systems oberflächenaktiver Mittel), der HLB und individuelle Komponenten der/des oberflächenaktiven Mittels) können alle die Größe, die Ladung, die Hydrophobie und die Nützlichkeit von, mit dem Verfahren der Erfindung hergestellten, Alginat-Mikropartikeln, sowie den Beginn, die Dauer und das Ausmaß der Immunantwort von einer entstehenden, mit Mikropartikeln hergestellten Impfstoffzusammensetzung, beeinflussen. In dem Verfahren der Erfindung haben bevorzugte oberflächenaktive Mittel (und Systeme oberflächenaktiver Mittel) einen HLB von ungefähr 1 bis ungefähr 15, bevorzugter von ungefähr 7 bis ungefähr 9, am bevorzugtesten von ungefähr 8,3. Für die orale Verabreichung von Mikropartikeln werden oberflächenaktive Mittel, deren Verwendung in der Arzneimittel- und Lebensmittelzubereitung erprobt wurde, bevorzugt. Beispiele von entsprechend erprobten Produkten sind jene „Generally Recognized As Safe" (GRAS) von der U.S. Food and Drug Administration (FDA) und solche, die in dem Food Chemicals Codex (FDA), dem International Codex Alimentarius, dem United States Pharmacopoeia (USP), European Pharmacopoeia (EP), dem Japanese Pharmacopoeia (JP) und dem British Pharmacopoeia (BP), verzeichnet sind.
Vorzugsweise wird ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel aus der Gruppe, bestehend aus oberflächenaktiven Mitteln aus Polyoxyethylen, Anhydrosorbitester, ethoxylierten Anhydrosorbitester und Mischungen davon, ausgewählt.
Oberflächenaktive Mittel aus Polyoxyethylen, auch Polyoxyethylen-gelöste nichtionische Stoffe (oder Ethoxylate) genannt, erlangen ihre Löslichkeitseigenschaften von wiederkehrenden Ether-Bindungen in einer Polyoxyethylen-Kette, -O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-CH₂-CH₂-O-, worin eine einzelne Oxyethylen-Gruppe, -O-CH₂-CH₂-, etwas mehr zur Hydrophobie beiträgt als eine einfache Methylen-Gruppe, CH₂, zur Hydrophobie beiträgt. Ein oberflächenaktives Mittel aus Polyoxyethylen, welches in dem Verfahren der Erfindung verwendet wird, ist am bevorzugtesten ein Alkoholethoxylat. Alkoholethoxylate werden unter dem Markennamen BRIJ von ICI Americas, Incorporated; ALFONIC, von Condea Vista Corporation; RHODASURF, von Rhone Poulenc, Incorporated; NEDOL, von Shell Chemical Company; und PLURAFAC, von BASF Corporation, verkauft. Polyoxyethylen(2)olylether (auch Oleth-2 genannt), welches unter dem Namen BRIJ 93 von ICI Americas, Inc. verkauft wird, ist am bevorzugtesten.
Oberflächenaktive Mittel aus Anhydrosorbitester beinhalten Fettsäureester von Anhydrosorbit, insbesondere die Mono-, Di-, und Triester von Anhydrosorbitolen und Fettsäuren. Oberflächenaktive Mittel aus Anhydrosorbitester werden unter dem Markennamen SPAN und ARLACEL von ICI Americas, Inc.; ARMOTAN, von Akzo Chemical Company; EMSORB, von Henkel/Emery Corporation; GLYCOMUL, von Lonza, Incorporated; und HODAG, von Calgene Chemical Incorporated, verkauft.
Geeignete oberflächenaktive Mittel aus Anhydrosorbitester beinhalten Sorbitanmonolaurat (z.B. SPAN 20 und ARLACEL 20), Sorbitanmonostearat (z.B. SPAN 60), Sorbitanmonooleat (z.B. SPAN 80 und ARLACEL 80), Sorbitantrioleat (z.B. SPAN 85), Sorbitansesquioleat (z.B. ARLACEL C und ARLACEL 83) und Glycerolmonooleat (z.B. ARLACEL 186). Am bevorzugtesten sind Sorbitantrioleat (SPAN 85) und Sorbitansesquioleat (ARLACEL 83).
Bevorzugte, in dem Verfahren der Erfindung nützliche, nicht-ionische Zusammensetzungen oberflächenaktiver Mittel, beinhalten auch ethoxylierte Anhydrosorbitester, welche ebenfalls Polyoxyethylen-Derivate von Sorbitan-Fettsäureestern sind. Ethoxylierte Anhydrosorbitester sind üblicherweise hydrophilere oberflächenaktive Mittel. Oberflächenaktive Mittel aus ethoxylierten Anhydrosorbitester werden unter dem Markennamen TWEEN, von ICI Americas, Inc., ARMOTAN, von Akzo Chemical Co., EMSORB, von Henkel/Emery Corp., GLYCOSPERSE, von Lonza, Inc., und HODAG, von Calgene Chemical Inc., verkauft. Geeignete oberflächenaktive Mittel aus ethoxylierten Anhydrosorbitester beinhalten Polyoxyethylen(20)-Sorbitanmonolaurat, -monopalminat, -monostearat, -monooleat und -trioleat (z.B. TWEEN 20, 40, 60, 80 und 85, auch bekannt als Polysorbat 20, 60,80 und 85). Am bevorzugtesten ist Polyoxyethylen(20)-Sorbitantrioleat (Tween 85).
Polyoxyalkylen-Derivate von Propylenglycol umfassen Dreiblockcopolymere der Formel Poly(ethylenoxid)-poly(propylenoxid)-poly(ethylenoxid) („PEO-PPO-PEO Copolymere"). Die PEO-Kette ist sehr hydrophil, während die PPO-Kette hydrophob ist, was das wirksame Oberflächenverhalten der Verbindung ergibt. PEO ist eine flexible Kette die, wenn sie mit einer Mikropartikeloberfläche befestigt ist, Aggregationen durch die Ausbildung einer sterischen Barriere minimiert. Dreiblockcopolymere wie zum Beispiel die, die sich in ihren PEO- und/oder PPO-Kettenlängen (z.B. Zahl der Ethylenoxid-(EO)-Reste und Propylenoxid-(PO)-Reste) unterscheiden, sind zum Beispiel unter dem Markennamen PLURONIC, verkauft von BASF Corp., verfügbar.
Ohne an irgendeine bestimmte Theorie gebunden zu sein, könnte die PPO-Kette, als Teil des PLURONIC oberflächenaktiven Moleküls, welches hydrophob ist, eine Rolle in der Verstärkung der Hydrophobie der Mikropartikel spielen. Die mit 16 PO-Resten (L31) und 39 PO-Resten (L81) getesteten PLURONIC-oberflächenaktiven Mittel, versagten, um die Hydrophobie der Mikropartikel zu verstärken, während jene mit PO-Resten im Bereich von ungefähr 21 bis ungefähr 30, die Hydrophobie außerordentlich verstärkten.
Die Interaktion von hydrophilen und/oder hydrophoben Bereichen von PLURONICoberflächenaktiven Molekülen mit der wäßrigen und/oder öligen Phase des Emulsionssystems kann bedeutend für die Bestimmung der Effektivität der oberflächenaktiven Mittel sein, die Hydrophobie zu verstärken. Im Emulsionssystem sind die wäßrigen Alginat-Tropfen innerhalb der kontinuierlichen Ölphase fein verteilt. Ein PO-Restwert, welcher zu hoch ist, kann das oberflächenaktive Mittel aus PEO-PPO-PEO zu hydrophob machen, so daß es in der kontinuierlichen Ölphase verbleibt. Auch die Orientierung dieses oberflächenaktiven Moleküls an der Öl/Wasser-Grenzfläche hängt von den gemeinsamen Effekten der PPO- und PEO-Kettenlänge ab. Die hydrophobe PPO-Kette des oberflächenaktiven Mittels tendiert dazu, sich selbst in Richtung der Ölphase auszurichten, während die hydrophile PEO-Kette bevorzugt mit der Alginat-Oberfläche interagiert.
Geeignete PEO-PPO-PEO Copolymere, die als PLURONIC-oberflächenaktive Mittel verkauft werden, enthalten die von BASF Corp. als L31, L43, L44, L61 und L81 bezeichneten. Nachstehende Tabelle 1 führt einschlägige Daten von diesen PLURONIC-oberflächenaktiven Mitteln an.
Tabelle 1
Vorzugsweise hat ein PEO-PPO-PEO Copolymer, welches in dem Verfahren der Erfindung verwendet wird, ungefähr 15 bis ungefähr 70 PO-Reste, am bevorzugtesten ungefähr 30 PO-Reste. Zum Beispiel wird ein bevorzugtes PEO-PPO-PEO Copolymer, welches in der Erfindung nützlich ist und die Formel (EO)₃(PO)₃₀(EO)₃ hat, unter dem Handelsnamen PLUORONIC L61 von BASF Corporation verkauft.
In einer Form des erfindungsgemäßen Verfahrens werden verschiedene Zusammensetzungen oberflächenaktiver Mittel vermischt, um eine Zusammensetzung oberflächenaktiver Mittel herzustellen, welche eine optimale Balance der erforderlichen Eigenschaften liefert. In einem bevorzugten Verfahren der Erfindung wird eine Mischung aus Polyoxyethylensorbitantrioleat (HLB = 11) und dem oberflächenaktiven Mittel PLURONIC L61 (HLB = 3) als eine Zusammensetzung oberflächenaktiver Mittel verwendet.
Die in dem Verfahren der Erfindung verwendbaren Mengen der oberflächenaktiven Mittel und der Mischungen oberflächenaktiver Mittel sind jene, welche zu der besten Antigenladung, der kleinsten Mikropartikelgröße (und infolge dessen größten Mikropartikelausbeute), dem größten Hydrophobie-Wert der Mikropartikel und letztendlich zur besten Aufnahme der Mikropartikel durch die Antigenaufzunehmenden Zellen und der gesamten erzeugten Immunantwort führen. Wahlweise kann eine Mischung oberflächenaktiver Mittel gebildet werden, um Mikropartikel mit einem kontrollierten Antigenabgabe-Profil zur Verfügung zu stellen.
In einem bevorzugten Verfahren der Erfindung wird Polyoxyethylensorbitantrioleat, in einem Bereich von ungefähr 8,3 ml/g Alginat bis ungefähr 50 ml/g Alginat, mit dem Copolymer (EO)₃(PO)₃₀(EO)₃, in einem Bereich von ungefähr 8,8 ml/g Alginat bis zu ungefähr 24,6 ml/g Alginat, verwendet. Am bevorzugtesten wird Polyoxyethylensorbitantrioleat, zu ungefähr 33,3 ml/g Alginat, mit dem Copolymer (EO)₃(PO)₃₀(EO)₃, zu ungefähr 16,7 ml/g Alginat, verwendet.
Die Verfahren und Komponenten der Erfindung sind hinsichtlich der Art des Antigens, welches verwendet werden kann, nicht limitiert. Das Antigen kann, ohne Anwendung von Wärme oder von organischen Lösungsmitteln, mit dem Alginat vermischt werden, welche andernfalls die Antigene verändern und beschädigen können. Deshalb kann Alginat verwendet werden, um eine große Auswahl von Antigenen, einschließlich lebender Viren und Bakterien, labiler Proteine und Nukleinsäuren, einzukapseln. Bevorzugt wird das Antigen aus der Gruppe, bestehend aus lebenden Viren, lebenden Bakterien, abgetöteten Bakterien, Nukleinsäuren, Untereinheiten-Antigenen von infektiösen Mitteln und Mischungen davon, ausgewählt. Antigene, die durch das Verfahren der Erfindung eingekapselt worden sind, umfassen ein lebendes syncitiales Atmungsvirus; einen lebenden und getöteten Influenza-Virus; geleerte Capside von felinem Calicivirus; lebende Pseudomonas aeuroginosa; getötete Pasteurella multocida und haemolytica; E.coli; bovines, canines, humanes, equines und porcines Serum Albumin und Ovalbumin; Exotoxin und äußere Membranproteine von P. multocida und haemolytica; die Untereinheit-Antigene von H. pylori; Cytochrom C und Plasmid-DNA.
Eine große Auswahl von geeigneten Antigenkonzentrationen sind in dem Verfahren der Erfindung nützlich. Die Menge der Antigenzugabe wird, basierend auf den Faktoren die das verwendete Antigen, das erforderliche Ergebnis und die verwendete Dosierungskur umfassen, variieren. Vorzugsweise wird das Antigen in einem Puffer oder in SDDW auf eine erforderlichen Konzentration gelöst (z.B. ungefähr 5 mg/ml bis ungefähr 50 mg/ml für Albuminprodukte) und die Stocklösung zur Alginatlösung hinzugefügt. In einem bevorzugten Verfahren der Erfindung ist die endgültige Konzentration des Antigens ungefähr 0,5 bis ungefähr 2,0 mg/ml, bevorzugter ungefähr 1 mg/ml in einer 1:1 (w/w) Suspension von Mikropartikeln in Wasser. Optional kann ein dehydratisiertes Antigen oder ein konzentriertes lösliches Antigen direkt vor der Hydratisierung zu dem Alginat gegeben werden, um die Konzentration von Antigen in der Alginatlösung und in den entstehenden Mikropartikeln zu erhöhen.
In einer anderen Form des Verfahrens der Erfindung wird Celluloseether entweder anstelle oder zusätzlich zum PEO-PPO-PEP-Copolymer in die Wasser-in-Öl Emulsion gegeben. Mikropartikel, die mit Celluloseether hergestellt wurden, tendieren dazu kleiner und kugelförmiger zu sein, eine höhere Ladungseffizienz aufzuweisen und eine höhere Hydrophobie zu haben, im Vergleich zu Alginat-Mikropartikeln, die nur mit einer einzigen oberflächenaktiven Zusammensetzung hergestellt wurden (z.B. Polyoxyethylen(20)sorbitantrioleat). Je nach dem Typ des verwendeten Celluloseethers können die Mikropartikel auch anhaltende Arzneimittelfreigabe-Profile aufweisen, insbesondere, wenn viskösere Celluloseether verwendet werden. Nicht-ionische Celluloseether werden bevorzugt; wasserlösliche Celluloseether werden ebenfalls bevorzugt.
Vorzugsweise wird der Celluloseether aus der Gruppe, bestehend aus Ethylcellulose, Methylcellulose, Hydroxyetylcellulose, Hydroxymethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose und Mischungen davon, ausgewählt. Besonders bevorzugt sind Methylcellulose und Hydroxypropylmethylcellulose.
Methylcellulose und Hydroxypropylmethylcellulose sind wasserlösliche Polymere, die von Cellulose, dem häufigsten Polymer in der Natur, abgeleitet sind. Diese Cellulosederivate werden zur Stabilisierung von Emulsionen und Suspensionen verwendet, indem sie ein schützendes Kolloid um den dispergierten Tropfen oder Partikel erzeugen. Zusätzlich können sie als oberflächenaktive Mittel wirken, um die Emulgierung zu unterstützen und die Aggregatbildung von Mikropartikeln zu minimieren.
Methylcellulose (verkauft als METHOCEL A-Familie von Celluloseethern von der Dow Chemical Company) hat ein Polymergrundgerüst aus Cellulose, welches eine einfache, sich wiederholende Struktur von Anhydroglucose, mit Methyl-Substitutionen an den Anhydroglucose-Einheiten, enthält. Hydroxypropylmethylcellulose-Produkte (z.B. METHOCEL E-, F-, J- und K-Familien von Celluloseethern, verkauft von Dow Chemical) haben Methyl-Substitutionen und Hydroxypropyl-Substitutionen an den Anhydroglucose-Einheiten. Methylcellulose und Hydroxypropylmethylcellulose sind mit unterschiedlichen Viskositätsgraden, unterschiedlichen Methyl- und Hydroxypropyl-Substitutionsgraden und verschiedenen Oberflächenbehandlungen erhältlich. Zum Beispiel ist eine besonders bevorzugte Methylcellulose, METHOCEL A4C, ein hochwertiges Lebensmittel unbedenkliches Produkt, das einen Methyloxyl-Substitutionsgrad von 1,8 und eine Viskosität von 400 mPa·s (Millipascal-Sekunde; Centipoise) hat. Andere bevorzugte Coblock-Cellulosepolymere umfassen solche, die als METHOCEL K3 und METHOCEL F50 von der Dow Chemical Company verkauft werden.
Ein Celluloseether (z.B. Methylcellulose) wird bevorzugt in einem Verhältnisbereich von ungefähr 1:1 bis ungefähr 1:5 des Gewichts von Celluloseether zu dem Gewicht von Alginat verwendet. Am meisten bevorzugt ist ein Verhältnis von ungefähr 1:2 (w/w).
Der Schritt, eine Wasser-in-Öl Emulsion in den Verfahren der Erfindung zu bilden, kann durch jedes geeignete Verfahren ausgeführt werden. Vorzugsweise wird die Emulsion unter Verwendung eines Hochdruckhomogenisators, wie zum Beispiel des von Avestin Inc. verkauften EMULSIFLEX Model C5 Homogenisatorsystems, gebildet. Wenn die Emulsion unter Verwendung eines Hochdruckhomogenisators gebildet wird, werden das Öl und die Wassermischung vorzugsweise zwei Homogenisierungszyklen, bei einem Druck von ungefähr 138 MPa (ungefähr 20 000 PSI), unterworfen. In einer anderen bevorzugten Form der Erfindung wird die Emulsion unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeitsmixers bei einer Geschwindigkeit von wenigstens ungefähr 500 UpM, vorzugsweise bei wenigstens ungefähr 3000 UpM und am bevorzugtesten bei wenigstens ungefähr 5000 UpM, gebildet.
Die Kationen werden möglichst tropfenweise zu der Emulsion gegeben, während die Emulsion bei einer Geschwindigkeit von wenigstens ungefähr 1000 UpM, vorzugsweise ungefähr 3000 bis ungefähr 6000 UpM, am bevorzugtesten ungefähr 5000 bis ungefähr 6000 UpM, gerührt wird. Auf diese Weise wird die Herstellung von sehr kleinen Mikropartikeln (z.B. kleiner als ungefähr 10 μm) vereinfacht.
Die Mikropartikel können durch jedes geeignete Verfahren, welches die Zentrifugation, Filtrierung, Schwerkraftfällung und Gradientenzentrifugation umfasst, sich aber nicht darauf beschränkt, geerntet werden. Vorzugsweise werden die Mikropartikel durch Zentrifugation abgeerntet, zweimal in SDDW gewaschen, einmal in 10% Ethylalkohol gewaschen, gefolgt von einer weiteren Wäsche in SDDW und in einer Menge, die dem Gewicht des bisher eingesetzten SDDW entspricht, suspendiert.
Die zur Herstellung der Impfstoffzusammnensetzungen mittels der Verfahren der Erfindung verwendete Emulsion, beinhaltet optional Poly(propylenglycol) (PPG; auch Poly(propylenoxid) genannt). Die Verwendung von Poly(propylenglycol) steigert die Hydrophobie der Alginatmikropartikel ohne einen signifikanten Einfluß auf die Mikropartikelgröße oder die Ladungseffizienz zu haben, insbesondere wenn auch ein Celluloseether verwendet wird.
Optional können die geernteten Mikropartikel mit einem Polymer beschichtet werden. Die Beschichtung der Mikropartikel mit einem Polymer kann die Ladungseffizienz der Mikropartikel verbessern, die Stärke und Hydrophobie der Mikropartikel erhöhen und die Freigaberate der Antigene von den Mikropartikeln verringern. Vorzugsweise ist das Polymer ein Polykation, ein kationisches (positiv geladenes) Polymer. Bevorzugte Kationen umfassen, aber ohne Einschränkung darauf, Poly-L-Lysin, Polyhistidin, Polyarginin, Polyethyleneimin, und Mischungen davon. Poly-L-Lysin ist am meisten bevorzugt.
Die Mikropartikel können mit einem Polymer durch jedes geeignete Verfahren beschichtet werden oder durch Suspendieren der Mikropartikel in einem Wirbel, erzeugt in einem konischen Röhrchen und langsames Hinzufügen einer das Polymer enthaltenen Lösung bei Aufrechterhaltung der Wirbelung, was den Mikropartikeln und Polymeren erlaubt sich 30 min zu mischen und anschließendes Waschen mit SDDW, um nicht-reagierte Polymere zu entfernen.
Optional können die Mikropartikel mit einem Schleimhauthilfsmittel(-haftmittel) beschichtet werden. Schleimhauthilfsmittel(-haftmittel) beinhalten Moleküle, für welche es entsprechende Rezeptoren auf M-Zellen, Epithelzellen oder beiden gibt. Bevorzugte Schleimhauthilfsmittel(-haftmittel) umfassen, aber beschränken sich darauf, Lektine, Choleragift, B-Untereinheitgift des Choleragifts, rekombinant abgeleitete Untereinheiten des B-Untereinheitgifts des Choleragifts, Keuchhustengift, hitzeinstabiles Gift von E.coli, Exotoxin A von P. aeruginosa, und Mischungen davon. Schleimhauthilfsmittel(-haftmittel) können alleine oder in Kombination mit einer Polymerbeschichtung, wie zum Beispiel Poly-L-Lysin, verwendet werden. Zum Beispiel binden einige Lektine direkt an Alginat und können ohne eine Polymerbeschichtung verwendet werden. Wenn sie mit einer Polymerbeschichtung verwendet werden, wird das Schleimhauthilfsmittel(-haftmittel) bevorzugt zuletzt aufgetragen.
Die Mikropartikel können mit einem Schleimhauthilfsmittel(-haftmittel) durch jedes geeignete Verfahren beschichtet werden. Vorzugsweise werden die Mikropartikel durch das Hinzufügen des Schleimhauthilfsmittel(-haftmittel) zu einer Mikropartikelsuspension, dem Vortexen zum Mischen der Suspension und dem Waschen mit SDDW beschichtet.
Die Mikropartikel können durch jedes geeignete Verfahren verabreicht werden, welches die subkutane, orale, intranasale, vaginale, rektale Verabreichung und die intramammäre-Verabreichung umfasst. Die orale Verabreichung wird bevorzugt.
Beispiele
Die folgenden Beispiele werden zur Verfügung gestellt, um die Erfindung zu veranschaulichen.
Beispiel 1
Einfluß von Methylcellulose und oberflächenaktiven Mitteln aus einem Copolymer aus PEO-PPO-PEO auf die Mikropartikelgröße, Ladungseffizienz und Hydrophobie
Alginat-Mikropartikel wurden durch eine Emulsionsvernetzungstechnik hergestellt. Eine 1,5%ige (w/v, z.B., g/100 ml) Lösung (8 ml/Charge) von Natrium-Alginat mittelviskösen-Grads (Viskosität 400 mPa·s; Acros Organics) wurde mit SDDW hergestellt. Methylcellulose (METHOCEL A4C; Dow Chemicals, Midland, MI), wenn verwendet, wurde zuerst zu der Alginatlösung bis zu einer endgültigen Konzentration von 0,5% (w/v) gegeben. Das oberflächenaktive Mittel TWEEN 85 (4 ml/Charge, zu allen Proben hinzugefügt; Sigma-Aldrich, Inc., St. Louis, MO) und PLURONICoberflächenaktive Mittel (2 ml/Charge, wenn verwendet; BASF Corp., Mount Olive, NJ) wurden zu der Ölphase, die Rapsöl beinhaltet (40 ml/Charge; Meijer, Inc., Kalamazoo, MI), gegeben.
Um Antigen-enthaltende Alginat-Mikropartikel herzustellen, wurde eine 2 ml Lösung von Rinderserumalbumin (BSA, Sigma-Aldrich, Inc.) zuerst mit der 1,5%igen (w/v) Alginat-(plus Methylcellulose, wenn verwendet) Lösung bis zu einer endgültigen Konzentration von 1 mg/ml gemischt. Anschließend wurde die wäßrige Phase zu der Ölphase in einem Volumenverhältnis von 1:4 gegeben. Durch das Homogenisieren der Mischung unter Verwendung eines Homogenisierungsgeräts (EMULSIFLEX Model C-5, Avestin Inc., Ottawa, Kanada) wurde eine Emulsion hergestellt. Die Mischung wurde zur effektiven Emulgierung der Alginat-Tröpfchen in der kontinuierlichen Ölphase zwei Homogenisierungszyklen bei einem Druck von 138 MPa (20 000 PSI unterworfen. Die Alginat-Tröpfchen wurden durch Vernetzung mit einer 8 ml Mischung aus Calciumacetat und Zinkacetat (4 ml von 4,2%igen (w/v) Calciumacetat, EM Sience, Gibbstown, NJ und 4 ml von 9,8%igen (w/v) Zinkacetat, Sigma-Aldrich, Inc.) stabilisiert. Die Vernetzungslösung wurde bei einer Durchflußgeschwindigkeit von 20 ml/min tröpfchenweise zu dem Emulsionssystem hinzugefügt, während die Emulsion bei einer Geschwindigkeit von 5000 UpM gerührt wurde. Die Rührgeschwindigkeit wurde anschließend auf 6000 UpM erhöht und diese Geschwindigkeit für zwei Minuten aufrechterhalten. Die Mikropartikel wurden durch Zentrifugieren bei einer Geschwindigkeit von 3500 UpM bei 5°C für 20 Minuten abgeerntet. Die Mikropartikel wurden drei Mal mit SDDW gewaschen und einmal mit 10% Ethanol gewaschen, dann zu 1:1 (w/w) in SDDW suspendiert und bis zur Beurteilung der Mikropartikelgröße, der BSA-Ladungseffizienz und der Oberflächenhydrophobie bei 4°C gelagert.
Alginat-Mikropartikel wurden mit Poly-L-Lysin (PLL, Molekulargewicht (MW) 20 000 Daltons; Sigma-Aldrich, Inc.) beschichtet, um die Stabilität zu verbessern und die Hydrophobie zu erhöhen. Eine frische 0,2%ige (w/v) Lösung von PLL in SDDW wurde hergestellt. Ein Volumen der PLL-Lösung wurde entsprechend dem Volumen der Mikropartikelsuspension zu einer ultraschallbehandelten (Branson Sonifier 450, Danbury, CT; 40% von einem Arbeitszyklus von 60 Hz für 15 Sekunden pro Röhrchen) Alginat-Mikropartikel Suspension hinzugefügt, und das Röhrchen wurde für 2 Minuten gevortext. Es wurde dann auf einem mechanischem Schüttler (S/P ROTATOR V, Baxter Diagnostics Inc., Deerfield, IL) für 10 Minuten bei 180 UpM geschüttelt. Das Röhrchen wurde bei 3000 UpM für 10 Min bei Raumtemperatur zentrifugiert, um die PLL-beschichteten Mikropartikel zu ernten. Das Pellet wurde einmal mit SDDW gewaschen und zu 1:1 (w/w) in SDDW resuspendiert.
Die Bindung von Poly-L-Lysin an den Alginat-Mikropartikeln wurde unter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Fluorometers (Cambridge Technology, Inc., Watertown, MA) mit Fluorescein-Isothiocyanat ((FITC)-markierten Poly-L-Lysin (PLL-FITC, Sigma-Aldrich, Inc.) überprüft und wurde auch durch Fluoreszenz-Mikroskopie überwacht.
Die Partikelgröße wurde unter Verwendung des optischen Partikelgrößenbestimmungsgeräts ACUSIZER 770, welches mit einem Selbstverdünnungssystem ausgestattet ist (Partikelgrößenbestimmungssystem, Inc., Santa Barbara, CA), gemessen. Das optische Partikelgrößenbestimmungsgerät ACUSIZER 770 mißt unmittelbar die Anzahl und die Größen von Partikeln größer als 1 μm oder gleich 1 μm durch eine optische-Abtastungsmethode des einzelnen Partikels, die auf der Behinderung des Lichts beruht. Es bestimmt auch eine durchschnittliche Größe des Volumengewichts. Eine 10-fache Verdünnung (bezogen auf das Volumen) der ursprünglichen Mikropartikelsuspension wurde in SDDW hergestellt. Die Größe der Mikropartikel wurde vor und nach 16 Zyklen Ultraschallbehandlung bestimmt.
Die Ladungseffizienz wurde unter Verwendung des (BCA) Proteintest-Reagenzkitmittels Mikro-Bicinchoninsäure von Pierce (Pierce, Inc., Rockford, IL) bestimmt. Die Alginat-Mikropartikel wurden lysiert, indem sie mit dem gleichen Volumen von 10 × Phosphat-gepuffertem Salz ohne Calcium und Magnesium in einem Teströhrchen vermischt wurden. Das Teströhrchen wurde auf einer schwenkbaren Plattform (Orbitron Rotator I, Boekel Indus., Inc., Feasterville, PA) plaziert und über Nacht geschwenkt. Die Mischung wurde zentrifugiert, um die Alginat-Fragmente von der BSA-Lösung zu trennen. Der Überstand wurde auf BSA, unter Verwendung von BCA als Nachweisreagenz, untersucht.
Die Hydrophobie der Mikropartikel wurde sowohl unter Verwendung einer Phasentrennungsmeßtechnik als auch einer Kontaktwinkelmeßtechnik bewertet. In der Phasentrennungstechnik wurde die Hydrophobie der Mikropartikel durch Partitionierung einer verdünnten Suspension von Mikropartikeln zwischen n-Octan und Wasser in einem modifizierten Verfahren, welches verwendet wurde, um die Hydrophobie von Bakterien zu ermitteln, bewertet. Siehe Magnusson et al. „Partitionierung von Bakterien, Viren und Phagen" in Partitioning in aqueous two phase systems, H. Walter, D. Brooks und D. Fisher, Anlage, Academic Press, Inc., NY p. 415 (1985). Eine wäßrige Alginat-Mikropartikelsuspension mit einem optische Dichte-Wert von 0,5 bei 400 nm wurde als wäßrige Phase verwendet. Die optische Dichte wurde bei 400 nm in der wäßrigen Suspension unter Verwendung eines UV/sichtbaren Spektrophotometers (DU Spektrophotometer, Beckman Co., Fullerton, CA) abgelesen. Octan (n-Octan, 0,2 ml) wurde dann zu dem die Alginat-Mikropartikelsuspension (1,2 ml) enthaltenden Teströhrchen hinzugefügt und bei Raumtemperatur für zehn Minuten inkubiert. Das die zwei Phasen enthaltende Teströhrchen wurde für zwei Minuten gevortext und zur vollständigen Trennung der wäßrigen und organischen Phase für 15 Minuten stehen gelassen. Messungen der optischen Dichte wurden in der wäßrigen Phase bei 400 nm durchgeführt. Der Index der hydrophilen Eigenschaft (HI) wurde als das Verhältnis zwischen den Anfangs- und End-Meßwerten der optischen Dichte ermittelt.
Die Phasentrennungstechnik wurde unter Verwendung von Latex-Kügelchen bekannter Oberflächeneigenschaften bestätigt. Polystyrol- und Polystyroldivinylbenzol-Mikrokügelchen (durchschnittlicher Durchmesser 2,9 μm, Sigma-Aldrich, Inc.) wurden verwendet. Die gewaschenen Polystyrol-Mikrokügelchen wurden auch auf Hydrophobie untersucht, weil die erhaltene Polystyrol-Suspension oberflächenaktive Mittel enthielt, um die Suspension zu stabilisieren.
Für die Kontaktwinkelmessung wurden zuerst saubere Glasträger für 30 Minuten einer 0,2%igen PLL-Lösung ausgesetzt. Die Träger wurden dann trocken-geblottet und dann Alginat-Mikropartikeln, suspendiert in SDDW (1:1, w:w), ausgesetzt. Die Mikropartikelsuspension wurde sorgfältig gleichmäßig über die Glasoberfläche verbreitet. Die Mikropartikel-beschichteten Glasträger wurden über Nacht bei Raumtemperatur getrocknet. Die lichtmikroskopische Untersuchung offenbarte aufgrund des schonenden Trocknungsprozesses wenige Risse oder Defekte. Der Wasser-Berührungswinkel des getrockneten Films von Mikropartikeln wurde unter Verwendung eines Berührungswinkel Goniometers (Rame-Hart Inc., Mountain Lakes, NJ), welches mit einem festsitzenden Tropfglas ausgestattet ist, gemessen. Für jede Probe wurden fünf Meßwerte genommen und gemittelt.
1 zeigt den Einfluß von PLURONIC-oberflächenaktiven Mitteln und Methylcellulose (METHOCEL A4C) auf die durchschnittliche Volumenpartikelgröße der Alginat-Mikropartikel. Die Rezeptur A war die Alginat-Grundrezeptur (hergestellt mit dem oberflächenaktiven Mittel Tween 85) (nicht erfindungsgemäß), während AA eine Rezeptur kennzeichnet, welche zusätzlich Methylcellulose beinhaltet und PL31-PL81 Rezepturen kennzeichnet, welche zusätzlich TWEEN 85 mit PLURONICoberflächenaktiven Mitteln L31–L81 umfassen. Die Ergebnisse werden als Durchschnittswerte von drei Ablesungen mit Balken für die Standardabweichungen angezeigt. Alginat-Mikropartikel, die unter Verwendung von TWEEN 85 als alleiniges oberflächenaktives Mittel hergestellt wurden, ergaben Mikropartikel, welche jeweils vor und nach der Ultraschallbehandlung eine durchschnittliche Volumenpartikelgröße von 13,15 μm und von 7,81 μm hatten. Die zusätzliche Verwendung von Methylcellulose in dem Verfahren der Formulierung verringerte die durchschnittliche Volumenpartikelgröße auf 10 μm vor der Ultraschallbehandlung, und nach 16 Zyklen der Ultraschallbehandlung wurde die durchschnittliche Volumenpartikelgröße auf 5,8 μm reduziert. In beiden Verfahren ergab die Ultraschallbehandlung eine etwa 50%ige Verminderung der durchschnittlichen Volumenpartikelgröße der Mikropartikel. Mit der Verwendung von PLURONIC-oberflächenaktiven Mitteln wurde der Einfluß der Ultraschallbehandlung auf die Mikropartikelgröße als weniger signifikant befunden. Jedes PLURONIC-oberflächenaktive Mittel verringerte die durchschnittliche Volumenpartikelgröße auf ungefähr 6 μm oder weniger vor der Ultraschallbehandlung und auf ungefähr 4 μm oder weniger nach 16 Zyklen der Ultraschallbehandlung. Die Vergrößerung der Konzentration von jedem PLURONIC-oberflächenaktiven Mittel in der Formulierung von 1 ml pro 10 ml Alginatlösung auf 2 ml pro 10 ml Alginatlösung, beeinflußte die Mikropartikelgröße von PL31, PL61 und PL81 nicht. Jedoch wurde für PL43 und PL44 eine von der Konzentration abhängige Verringerung der durchschnittlichen Volumenpartikelgröße beobachtet.
2 zeigt den Einfluß der Verwendung von unterschiedlichen Mengen von verschiedenen oberflächenaktiven Mitteln in einer Mikropartikel-Formulierung auf die Beladungseffizienz von Rinderserum-Albumin (BSA). Die Proben sind wie in 1 markiert und die Ergebnisse werden als Durchschnittswerte von drei Proben mit Balken für die Standardabweichungen angezeigt. Die prozentuale Ladungseffizienz wurde berechnet, indem die Menge von BSA in den Mikropartikeln mit der verglichen wurde, welche davon ausgeht, daß sämtliches, der Formulierung hinzugefügte BSA in den Mikropartikeln inkorporiert wurde. Das Hinzufügen von Methylcellulose zur Grundrezeptur führte zu einer geringfügigen Erhöhung der Ladungseffizienz, und das Hinzufügen von verschiedenen PLURONIC-oberflächenaktiven Mitteln zur Grundrezeptur führte zu einer sogar größeren Erhöhung der Ladungseffizienz.
3 zeigt den Einfluß der PLL-Beschichtung auf die durchschnittliche Volumenpartikelgröße für drei verschiedene Alginat-Formulierungen. Die Proben sind wie in 1 markiert und die Ergebnisse werden als Durchschnittswerte von drei Proben mit Balken für die Standardabweichungen angezeigt. In allen Fällen beeinflußte die PLL-Beschichtung die durchschnittliche Volumenpartikelgröße der Mikropartikel unbedeutend, was zeigt, daß die PLL-Beschichtung nicht die Aggregation von Mikropartikeln bewirkt.
4 zeigt den Einfluß von Methylcellulose und PLURONIC-oberflächenaktiven Mitteln auf die Hydrophobie von Alginat-Mikropartikeln, gemessen an der Phasentrennung. Die Proben sind wie in 1 markiert; die Resultate repräsentieren eine Probe pro Formulierung. Die Zugabe von Methylcellulose zur Alginat-Grundrezeptur verringerte die HI-Werte (erhöhte Hydrophobie) der Mikropartikel, und die zusätzliche Beimischung der PLURONIC-oberflächenaktiven Mittel L43, L44 und L61 reduzierte den HI-Wert der Mikropartikel weiter.
5 zeigt den Einfluß der PLL-Beschichtung auf die Hydrophobie der Alginat-Mikropartikel, gemessen an der Phasentrennung. Die Proben sind wie in 1 markiert, und die Ergebnisse werden als Durchschnittswerte von drei Proben mit Balken für die Standardabweichungen angezeigt. Die PLL-Beschichtung von mit der Grundrezeptur hergestellten Mikropartikeln verringerte den HI-Wert von 0,9 auf 0,59, und die PLL-Beschichtung der mit der Grundrezeptur plus Methylcellulose hergestellten Mikropartikel führte zu einer Verringerung des HI-Werts von 0,85 auf 0,65.
6 zeigt den Einfluß von METHOCEL A4C Methylcellulose und dem oberflächenaktiven Mittel PLURONIC L61 auf die Hydrophobie von Alginat-Mikropartikeln, gemessen durch die Kontaktwinkelmessung. Die Proben sind wie in 1 markiert, und die Ergebnisse werden als Durchschnittswerte von fünf Proben mit Balken für die Standardabweichungen angezeigt. Größere Berührungswinkel deuten auf eine größere Hydrophobie der Mikropartikel hin.
Beispiel 2
Einfluß der Arten oberflächenaktiver Mittel und der vernetzenden Kationen auf die Ladungseffizienz und Immunantwort (Ausführungsformen sind nicht Teil der Erfindung stellen aber den Stand der Technik dar)
Die Mikropartikel werden unter Verwendung einer Wasser-in-Öl Emulgierungstechnik hergestellt, die 1,5%iges (w/v) Natrium-Alginat (KELTONE HV, Monsanto Co.) verwendet, welches für Studien zur Immnunogenität mit Ovalbumin und für Studien zur Beladungseffizienz mit Fluorescein-Isothiocyanat-markierten Rinderserumalbumin (BSA-FITC, 25 mg/ml Stocklösung, Sigma-Aldrich, Inc.) gemischt wurde. Jedes Antigen wurde einzeln mit Alginat gemischt, gefolgt von der Zugabe des oberflächenaktiven Mittels in Rapsöl. BRIJ 93 (0,67 ml/Charge, wenn verwendet), TWEEN 85 (0,9 ml/Charge, wenn verwendet) und SPAN 85 (0,9 ml/Charge, wenn verwendet) (ICI Americas, Inc.) waren die oberflächenaktiven Mittel, die in dieser Studie verwendet wurden.
Eine Wasser-in-Öl Emulsion wurde durch ein Hochgeschwindigkeitsmischverfahren hergestellt. Eine 1,5%ige (w/v) Natrium-Alginatlösung (8 ml/Charge) und eine Antigenlösung (2 ml/Charge) wurden in ein Becherglas gegeben und für 2 Minuten bei 550 UpM unter Verwendung eines Servodyne Mischers (Cole Palmer, Niles, IL) gemischt. Bei der Verwendung der oberflächenaktiven Mittel TWEEN 85 und SPAN 85 wurde die entsprechende Menge oben auf der Alginat-/Antigenmischung plaziert; das oberflächenaktive Mittel BRIJ 93 wurde der Ölphase hinzugefügt. Das Rapsöl (40 ml/Charge; und BRIJ 93, wenn verwendet) wurde dann in das Becherglas, welches die wäßrige Phase enthält, hinzugefügt und für 1 Minute bei 5,000 UpM gemischt. Eine zweiwertige Kationenlösung (8 ml/Charge) wurde hinzugefügt, während die Emulsion bei 5000 UpM unter Verwendung eines Hochgeschwindigkeitsmischers (SERVODYNE Model 50000-40, Cole-Parmer) gerührt wurde. Die verwendeten Kationenlösungen umfaßten 0,5% (w/v) CaCl₂; 10% (w/v) ZnCl₂; 1,25% (w/v) CaCl₂ und 5% (w/v) ZnCl₂ zusammen; 2,5% (w/v) AlSO₄; und 2,5% (w/v) BaCl₂. Die Mikropartikel wurden durch Zentrifugation geerntet, zwei Mal in SDDW, einmal in 70% Ethylalkohol gewaschen, gefolgt von einer weiteren Wäsche in SDDW und in einer gleichen Menge SDDW, bezogen auf das Gewicht, suspendiert.
Einige Proben wurden mit Poly-L-Lysin (PLL) (MW 158 000 Daltons, Sigma-Aldrich, Inc.) beschichtet. Für die Beschichtung, wurden die Mikropartikel durch Erzeugung eines Wirbels in einem 50 ml konischen Röhrchen aus Polypropylen suspendiert. Eine entsprechende Volumenmenge von PLL wurde tröpfchenweise während des Mischens zu den Mikropartikeln gegeben. Man ließ dann die Mikroteilchen für 30 Minuten mischen, dann wurden sie zur Entfernung von nicht reagiertem PLL zweimal in SDDW gewaschen und bis zur Verwendung in SDDW aufbewahrt.
Um die Ladungseffizienz zu bestimmen, wurden die BSA-FTTC-enthaltenen Mikropartikel in einem Verhältnis von 1:3 v/v mit 5% Natriumtetrapyrophosphat (TSP) in einer 96iger Lochplatte gemischt und bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer über Nacht inkubiert. Jeder Ansatz wurde in Dreifachlöchern getestet. Die Platte wurde bei 800 facher Schwerkraft für 15 Minuten zentrifugiert und 100 Mikroliter (μl) des Überstands wurden dann auf eine 96-Loch-ELISA-Platte mit Flachboden übertragen. Die Absorption von jedem Reaktionsgefäß wurde unter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Fluorometers (Model 7620, Cambridge Technology) bei einer Anregung bei 485 Nanometern (nm) und einer Emission bei 530 nm ermittelt. Eine Standardkurve wurde von fortlaufenden Verdünnungen bekannter Konzentrationen von in TSP verdünnten BSA-FITC hergestellt. Die durchschnittliche Absorption jeder Probe abzüglich des Hintergrunds (TSP alleine) wurde von der Standardkurve interpoliert, um die von jeder Probe geladene Menge an BSA-FITC zu bestimmen. Diese wurde durch die Menge des in Alginat gemischten BSA-FITC's geteilt, um das Verhältnis der Ladungseffizienz zu bestimmen.
In dieser Studie wurden zwölf Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse verwendet, mit 8 Mäusen pro experimenteller Gruppe. Die Mäuse wurden mit Futter und Wasser ad libidum unter Standardtierhaltungsbedingungen gehalten.
Eine 250 μl Dosis der Mikropartikelsuspension wurde unter die Haut (subkutan) in das Gebiet des Halses bei null, drei und sechs Wochen injiziert. Das gleiche Volumen der Mikropartikelsuspension wurde oral durch Sondenernährung, unter Verwendung einer Fütterungsnadel, verschiedenen Mäusen bei null, eins und zwei Wochen verabreicht. Es wurde angenommen, daß jede Dosis 25 Mikrogramm (μg) OVA enthält. ELISA-Tests zeigten, daß die aktuelle Ladung 10 Nanogramm (ng) OVA pro Dosis war. Blut wurde von der kreisförmigen Stirnhöhle in wöchentlichen Intervallen, beginnend bei Woche zwei und abschließend eine Woche nach der endgültigen Impfung, gesammelt. Das Serum wurde gesammelt und bis zur Untersuchung bei –70°C eingefroren. Alle Mäuse wurden, nachdem die abschließende Blutprobe eingesammelt wurde, eingeschläfert, und dann wurden die Darm-Explantate für 24 Stunden in RPM1-1640 plus 2 × Antibiotika (Penicillin, Streptomycin und Amphotericin B) plus 10%iges fötales Kälberserum in 12 Loch-Gewebekulturplatten kultiviert. Vier Gewerbe wurden für jede Maus kultiviert. Nach 24 Stunden wurden die Platten bei –20°C bis zur Untersuchung eingefroren. Vor der Untersuchung wurden die Platten bei 800 facher Schwerkraft für 10 Minuten zentrifugiert, und die Überstände wurden von jeder Maus gesammelt.
Hoch-bindende ELISA-Platten (Costar) wurden über Nacht bei 4°C mit 100 μl OVA, verdünnt in Carbonat-Bicarbonatpuffer (pH 9,6) zu 15 μg/Reaktionsgefäß, beschichtet. Die Platten wurden dann einmal in SDDW gewaschen und dann wurde TRISgepuffertes Salz mit dem oberflächenaktiven Mittel TWEEN 20, welches 10% normales Ziegenserum enthält (TBST-GS), jedem Reaktionsgefäß hinzugefügt. Die Platten wurden dann bei 37°C für 1 Stunde inkubiert, dann zwei Mal mit SDDW gewaschen und dann wurden die Serumproben hinzugefügt. Das Mausserum wurde zu 1:100 in TBST-GS verdünnt. Die Platten wurden dann für 1 Stunde bei 37°C inkubiert, fünf Mal gewaschen und entsprechende Verdünnungen des Meerrettichkonjugierten anti-Maus Isotyp-Antikörpers der Ziege wurden hinzugefügt. Die Platten wurden dann für 1 Stunde bei 37°C inkubiert, gefolgt von sechs Wäschen. Das Substrat ABTS (Kirkegaard und Perry Laboratorien) wurde hinzugefügt, und die Platten wurden bis zur Entwicklung einer adäquaten Farbe (45 Minuten) bei Raumtemperatur inkubiert. Säure/Alkohol (50 μl) wurde zum Stoppen der Reaktion zu jedem Reaktionsgefäß gegeben, und es wurde das Absorptionsvermögen von jedem Reaktionsgefäß unter Verwendung eines Mikrotiterplatten-Lesegeräts (Model 3550, Bio-Rad Co.) bei 450 nm festgestellt. Das durchschnittliche Absorptionsvermögen jeder Gruppe wurde für jeden Antikörper-Isotyp bestimmt. Überstände von Darm-Explantaten wurden in ähnlicher Weise, aber bei einer Verdünnung von 1:2 bewertet.
7 zeigt den Einfluß von verschiedenen Kationen-Lösungen und oberflächenaktiven Mitteln auf die Ladungseffizienz. Die Abkürzungen Br, Sp und Tw zeigen jeweils die Verwendung der oberflächenaktiven Mittel BRIJ, SPAN und TWEEN an, ca kennzeichnet die Verwendung des Vernetzers CaCl₂; zn kennzeichnet die Verwendung des Vernetzers ZnCl₂; cazn zeigt die Verwendung einer Mischung der Vernetzer CaCl₂ und ZnCl₂ an; pll bezeichnet Poly-L-Lysin beschichtete Mikropartikel. Die Ergebnisse werden als Durchschnittswerte von sechs Wiederholungen mit Balken für die Standardabweichungen angezeigt. Die Ladung des Antigens unter Verwendung von CaCl₂ alleine war unbedeutend. ZnCl₂ alleine ergab die größte Ladungseffizienz für nicht mit Poly-L-Lysin beschichtete Mikropartikel. Die Verwendung der oberflächenaktiven Mittel BRIJ93 und TWEEN 85 ergab eine ähnliche Ladungseffizienz, während die Verwendung des oberflächenaktiven Mittels SPAN 85 eine vergleichbar geringere Ladungseffizienz ergab. Die Poly-L-Lysin-Beschichtung ergab eine höhere Ladung bei allen Proben.
Die 8 bis 17 zeigen Meßwerte von Antikörper-Titern von subkutan, mit Ovalbumin enthaltenen Mikropartikeln injizierten Mäusen. 8 zeigt die Meßwerte für unverkapseltes Ovalbumin in Salzlösung. Die mit CaCl₂ oder BaCl₂ in der Vernetzungslösung hergestellten Mikropartikel zeigten nach der zweiten Impfung erhöhte IgG Antikörper, selbst wenn die durch einen ELISA-Fallentest ermittelte Ladungseffizienz eine OVA-Ladung von nur 10 ng festgestellt hat. Ähnliche Studien der Ladungseffizienz mit BSA-FITC in 7 bestätigten, daß die mit CaCl₂ hergestellten Mikropartikel geringfügig Protein vorhanden hatten. Die mit AlSO₄ hergestellten Mikropartikel hatten die früheste Immunantwort, mit an Tag 11 nach der ersten Impfung erhöhten IgG Antikörper-Titern. Das Profil der Immunantwort war ähnlich zu dem von Mäusen, die mit OVA, unterstützt von dem unvollständigen Freund's-Hilfsmittel (IFA), injiziert wurden, obwohl das Reaktionsausmaß mit IFA größer war. Die mit dem oberflächenaktiven Mittel BRIJ 93 hergestellten Mikropartikel neigten dazu, eine, bis später in der Studie bei Tag 33 oder 40, verzögerte Immunantwort zu haben, während die oberflächenaktiven Mittel SPAN 85 und TWEEN 85 beide eine frühere Zunahme der Antikörper-Titer erzeugten. Der aufgrund des oberflächenaktiven Mittels größte Effekt war der mit dem oberflächenaktiven Mittel TWEEN 85, welches eine frühere und größere Immunantwort mit CaCl₂ und ZnCl₂ in der Vernetzungslösung, verglichen mit Mikropartikeln, hergestellt entweder mit dem oberflächenaktiven Mittel BRIJ 93 oder SPAN 85, zeigte.
Darm-Explantate zeigten schwache, (Meßwert des Absorbtionsvermögens von 0,150 bei einer 1:1-Verdünnung) aber signifikante Zunahmen des Antikörper-Titers gegenüber OVA. IgA-Werte gegenüber OVA für Proben, die mit dem oberflächenaktiven Mittel BRIJ 93 mit CaCl₂, dem oberflächenaktiven Mittel SPAN 85 mit AlSO₄ und BaCl₂, dem oberflächenaktiven Mittel TWEEN 85 mit ZnCl₂ und CaCl₂, mit ZnCl₂ alleine, mit Mikropartikeln alleine und mit Cholera-Toxin plus OVA, hergestellt waren, hatten alle p-Meßwerte von weniger als 0,05, verglichen zu unverkapseltem oralen OVA. Die IgG-Meßwerte gegenüber OVA für das oberflächenaktive Mittel BRIJ 93 mit ZnCl₂, das oberflächenaktive Mittel TWEEN 85 mit ZnCl₂ und CaCl₂ und das oberflächenaktive Mittel TWEEN 85 mit ZnCl₂ und die IgG2b-Meßwerte für alle Gruppen bis auf das oberflächenaktive Mittel SPAN 85 mit AlSO₄, das oberflächenaktive Mittel SPAN 85 mit ZnCl₂ und Mikropartikel alleine, hatten p-Meßwerte, verglichen zu den Meßwerten für die mit unverkapseltem oralen OVA geimpften Gruppen, von weniger als 0,05. Die mit ZnCl₂ alleine oder ZnCl₂ mit CaCl₂ (und BRIJ 93 als oberflächenaktives Mittel) hergestellten Mikropartikel hatten einen langsameren Beginn der Immunantwort, mit der Zunahme des Anteils von ZnCl₂. Die Ergebnisse zeigen, daß die Art des oberflächenaktiven Mittels und die Art des Kations die Effizienz der Ladung des Antigens und die immunogene Aktivität der Mikropartikel beeinflußt.
Die Ergebnisse zeigen, daß Mikropartikel einen Hilfsstoff-ähnlichen Effekt mit größeren Immunantworten als bei einem ohne Hilfsstoff injizierten Antigen und in manchen Fällen einer verspäteten Freigabe des Antigens, ausüben. Die Förderlichkeit der Alginat-Mikropartikeln der Erfindung wird auch durch die in der Maus gesehene Immunantwort, trotz des Nachweises von nur geringen Nanogramm-Mengen des Antigens in den Mikropartikeln, nahe gelegt. Die Förderlichkeit hängt, wie in einigen Fällen gezeigt, von den verwendeten oberflächenaktiven Mitteln und von den verwendeten Kationen ab, in welchen, selbst mit schwacher Ladung, das Antigen in extrem geringen Dosen in den Mikropartikeln immer noch eine Zunahme des Antikörper-Titers induzierte. Versuche, diese Zubereitungen oral zu verabreichen, ergaben keine nachweisbaren Serum-Antikörper-Titer. Jedoch konnte der ELISA-Test nichts anderes bestätigen als geringe (weniger als ein μg) Mengen Protein in diesen Zubereitungen – geringer als für das Antigen bekannt ist, daß es innerhalb der Mikropartikel immunogen ist.
Beispiel 3
Einfluß der oberflächenaktiven Mittel aus PEO-PPO-PEO, Poly(propylenglycol) und Methylcellulose auf die Eigenschaften der Alginat-Mikropartikel
Eine 1,5%ige (w/v) Lösung (8 ml/Charge) von Natrium-Alginat (Viskosität 400 mPa·s, Acros Organics) wurde hergestellt. Das oberflächenaktive Mittel TWEEN 85 wurde zu der Ölphase von jeder Probe zu 4 ml/Charge hinzugefügt. Methylcellulose wurde in manchen Fällen zu der Alginatlösung in einer endgültigen Konzentration von 0,5% hinzugefügt. PLURONIC-oberflächenaktive Mittel (2 ml/Charge, wenn verwendet) und Poly(propylenglycol) (2 ml/Charge; MW 3500 Daltons, Sigma-Aldrich, Inc.) wurden zu der Ölphase (40 ml/Charge Rapsöl, von einem lokalen Lebensmittelgeschäft erworben) hinzugefügt. Die Alginatlösung und Rinderserumalbumin (BSA) wurden mit dem Öl gemischt. Alginat-Mikropartikel wurden durch die in Beispiel 1 beschriebene Emulsionsvernetzungstechnik unter Verwendung von einer 8 ml Mischung aus Calciumacetat und Zinkacetat (4 ml von 4,2% (w/v) Calciumacetat, EM Sience, Gibbstown, NJ und 4 ml von 9,8% (w/v) Zinkacetat, Sigma-Aldrich, Inc.) als Vernetzungslösung, hergestellt.
Die Mikropartikelgröße wurde unter Verwendung eines optischen ACUSIZER 770 Partikelgrößenbestimmungsgeräts, welches mit einem Selbstverdünnungssystem ausgestattet ist (Partikelgrößenbestimmungssystem, Inc.) gemessen. Eine 10 fache Verdünnung (nach Volumen) der ursprünglichen Mikropartikelsuspension wurde in SDDW hergestellt. Die Größe wurde vor und nach 16 Zyklen Ultraschallbehandlung (Branson Sonifier 450; 40% eines Arbeitszyklusses von 60 Hz für 15 Sekunden pro Probe) ermittelt.
Die Ladungseffizienz wurde durch das in Beispiel 2 beschriebene Verfahren, unter Verwendung eines Mikro-BCA-Testkits (Pierce), ermittelt.
Die Hydrophobie der Mikropartikel wurde durch die in Beispiel 1 beschriebene Phasentrennungstechnik, unter Verwendung einer 3,5 mg/ml Mikropartikelsuspension als wäßrige Phase, beurteilt.
18 zeigt den Einfluß des Hinzufügens von verschiedenen oberflächenaktiven Mitteln aus einem Copolymer aus PEO-PPO-PEO (PLURONIC) und Methylcellulose (A4C) zu einer Alginat-Grundrezeptur mit dem oberflächenaktiven Mittel TWEEN 85 (T85) (nicht entsprechend der Erfindung) auf die Hydrophobie von Alginat-Mikropartikeln. Es wurde festgestellt, daß das PLURONIC-oberflächenaktive Mittel L31 die Hydrophobie der mit Methylcellulose hergestellten Mikropartikel signifikant reduzierte, während die PLURONIC-oberflächenaktiven Mittel L43, L44 und L61 die Hydrophobie außerordentlich verbesserten. Eine frühere Arbeit (nicht veröffentlicht) zeigte, daß das PLURONIC-oberflächenaktive Mittel L81 die Hydrophobie verringerte und daß Methylcellulose die Hydrophobie von Alginat-Mikropartikeln verstärkte.
Der HLB des oberflächenaktiven Mittels hat einen Einfluß auf die Hydrophobie der Mikropartikel. Wenn ein oberflächenaktives Mittel mit einem HLB von ≤ 5,0 verwendet wurde, war die Ausbeute (Gewicht des Pellets) erheblich geringer (ungefähr 50% geringer als normalerweise). Wenn jedoch ein oberflächenaktives Mittel mit einem HLB von 7–9 verwendet wurde, waren die Ausbeute und die Ladungseffizienz vergleichbar mit den Ergebnissen, wenn ein oberflächenaktives Mittels mit einem HLB von 11 verwendet wurde (oberflächenaktives Mittel TWEEN 85 alleine).
In einigen Beispielen wurde PPG der Ölphase hinzugefügt und vor dem Hinzufügen des Alginats gründlich gemischt. Die Hydrophobie wurde mit der n-Oktan/Wasser-Phasentrennungstechnik beurteilt. 19 zeigt den Einfluß von PPG auf die Hydrophobie der Alginat-Mikropartikel (nicht entsprechend der Erfindung). Die Hydrophobie der mit Methylcellulose hergestellten Alginat-Mikropartikel erhöhte sich mit der Erhöhung der PPG-Konzentration bis auf 0,5 ml/1X Charge. Höhere Konzentrationen von PPG verringerten die Hydrophobie der Partikel. PGG hatte keinen Einfluß auf die Hydrophobie der mit Alginat alleine hergestellten Mikropartikel, was auf eine Interaktion zwischen den hydrophoben PGG Molekülen und Methylcellulose hinweist.
Tabelle 2 zeigt den Einfluß von PPG auf die Größe der Alginat-Mikropartikel und auf die Ladungseffizienz. Die Partikelgröße veränderte sich durch das Hinzufügen von PGG nicht signifikant. Im Allgemeinen ist die Partikelgröße mit PGG größer als mit PLURONIC-oberflächenaktiven Mitteln. Die BSA-Ladungseffizienz der mit PGG hergestellten Mikropartikel ist vergleichbar mit der mit PLURONICoberflächenaktiven Mitteln hergestellten Mikropartikel.
Tabelle 2
Beispiel 4
Einfluß der PLL-Beschichtung auf die Mikropartikelgröße
Die Mikropartikel wurden durch eine Emulgierungstechnik, unter Verwendung des Verfahrens in Beispiel 3, hergestellt, gefolgt von der Beschichtung mit PLL (MW 25 000). Um mit PLL zu beschichten, wurden die Mikropartikel in SDDW suspendiert, 16 Zyklen mit Ultraschall behandelt und zu einem gleichen Volumen von 0,2% (w/v) PLL hinzugefügt. Die Mikropartikel wurden gründlich gevortext und dann auf eine Schüttelvorrichtung bei 200 UpM bei Raumtemperatur für 5 Minuten gegeben. Die Mikropartikel wurden dann für 10 min zur Bildung eines Pellets zentrifugiert, das Pellet wurde einmal mit SDDW gewaschen und dann 1:1 (w:w) in SDDW resuspendiert.
Wie in 20 gezeigt, ergab die Beschichtung der Mikropartikel mit PLL eine geringere durchschnittliche Volumengröße der Mikropartikel. Beispiele Alg + PL 61 und Alg + PLL sind nicht von dieser Erfindung umfaßt. Dies dürfte auf die Beschichtung kleinerer Mikropartikel, was sie für den Partikel-Analysator, welcher Mikropartikel kleiner als 1 μm im Durchmesser ignoriert, „sichtbar" macht, zurückzuführen sein. Beziehungsweise dürfte es auf eine erhöhte positive Ladung der hydrophoben Mikropartikel, was sie weniger wahrscheinlich verklumpen oder miteinander verbinden lässt, zurückzuführen sein.
Beispiel 5
Einfluß der Variablen der Formulierung auf die Immunantwort in der Maus in folge oraler Verabreichung von Antigen-beladenen Alginat-Mikropartikeln
Alginat-Mikropartikel wurden unter Verwendung einer von zwei Formulierungen oberflächenaktiver Mittel hergestellt. Die erste beinhaltet nur Alginat und das oberflächenaktive Mittel TWEEN 85 (nicht erfindungsgemäß). Die zweite Rezeptur beinhaltet Alginat, das oberflächenaktive Mittel TWEEN 85, METHOCEL A4C Methylcellulose und das oberflächenaktive Mittel PLURONIC L61.
Zwei Antigene wurden für die Ladung der Alginat-Mikropartikel verwendet: (1) der nicht mit einem Adjuvant behandelte Teil des kommerziellen Pasteurella haemolytica Leukotoxoid/Bakterin ONE-SHOT (Pfizer Inc., Exton, PA), wieder hydratisiert mit sterilem Wasser, um die Stärke der normalen Verdünnung zu verdoppeln (d.h. 50 ml Wasser anstatt 100 ml Hilfsstoff wurde verwendet, um das lyophilisierte Produkt wieder zu hydratisieren), und (2) die äußeren Membranproteine (OMPs) von P. haemolytica, erworben von Dr. Tony Confer von der Universität des Staates Oklahoma. Jedes Antigen wurde separat in Mikropartikel verkapselt und die Mikropartikel wurden dann vor der Impfung miteinander kombiniert (50:50 auf Gewichtsbasis).
Die Alginat-Mikropartikel wurden durch die in Beispiel 1 beschriebene Emulsionsvernetzungstechnik hergestellt, mit der Ausnahme, daß Methylcellulose (wenn verwendet) zu der Alginatlösung bis zu einer endgültigen Konzentration von 0,25 Gew.-% hinzugefügt wurde und 5X-Chargengrößen hergestellt wurden. Die Formulierungen wurden unter Verwendung der unten tabellarisierten Reagenzien und Mengen hergestellt:
Tabelle 3
Oral geimpfte Mäuse erhielten ihre Dosis durch eine Darmspülung, unter Verwendung einer rostfreien Stahlnadel. Es gab 8 verschiedene Impfgruppen von Mäusen.
Weibliche BALB/c Mäuse (8–12 Wochen alt) wurden für diese Studie verwendet. Für jede Impfgruppe gab es 30 Mäuse in drei Blöcken zu jeweils 10 Mäusen. Jede Maus einer Gruppe erhielt den gleichen Impfstoff zur gleichen Zeit. Jeder Block von 10 Mäusen wurde mit einer anderen Bakteriendosis konfrontiert. Drei 10-fache Bakterienverdünnungen wurden für jede Gruppe verwendet. In Folge der Konfrontation wurde der prozentuale Sterbeanteil für jeden Mausblock für die drei verschiedenen Impfstoff-Probedosen von Bakterien ermittelt.
Oral geimpfte Mäuse erhielten eine Dosis an 3 aufeinanderfolgenden Tagen, gefolgt von einer zusätzlichen Dosis 4 Tage später. Parenteral geimpfte Mäuse erhielten eine Dosis am Tag null. Alle Mäuse wurden fünf Wochen nach der ersten Impfung konfrontiert. Die Probe wurde als eine intraperitoneale Injektion der Bakterien in tryptischer Sojabrühe plus 2% Hefeextrakt verabreicht. Jede Maus erhielt 200 μl Bakterien von entweder 10^–6, 10^–5, oder 10^–4 CFU/Maus. Die Mäuse wurden für 96 Stunden beobachtet, und die täglichen Todesfälle wurden anhand der täglich entfernten toten und sterbenden Mäuse aufgezeichnet. Der prozentuale Anteil von Mäuse, die pro Gruppe starben, wurde vermerkt.
21 beschreibt die Sterblichkeitsergebnisse für jede Impfgruppe, worin die Blindprobe = keine Antigen enthaltenen Mikropartikel sind; Alg + TWEEN OMP + ONE SHOT = die orale Verabreichung des Antigens in einer einfachen Alginat-Mikropartikel Formulierung mit dem oberflächenaktiven Mittel TWEEN 85 ist (nicht erfindungsgemäß); Alg + TWEEN + A4C + PL61 OMP + ONE SHOT = die orale Verabreichung des Antigens in einer komplexeren, hydrophoben Formulierung von Mikropartikel, unter Verwendung des oberflächenaktiven Mittels TWEEN 85, Methylcellulose und des oberflächenaktiven Mittels PLURONIC L61, ist; Alg + TWEEN OMP + ONE SHOT SC = die subkutane Verabreichung der unter Verwendung einer einfachen Formulierung von Alginat mit dem oberflächenaktiven Mittel TWEEN 85 hergestellten Alginat-Mikropartikeln ist (nicht erfindungsgemäß); OMP + ONE SHOT = die Verabreichung des Impfstoffs durch eine subkutane Impfung von nicht-verkapselten löslichen Antigenen ist (nicht erfindungsgemäß); nichtverkapseltes OMP + ONE SHOT = die orale Verabreichung von nicht-verkapselten löslichen Antigenen ist (nicht erfindungsgemäß); ONE SHOT SC = der gewerblich mit Hilfsstoff versehene nicht-verkapselte Impfstoff ist, der weisungsgemäß (eine Dosis) durch subkutane Impfung in den Nacken zugeführt wurde (nicht erfindungsgemäß); und Naive = die nicht-geimpfte, aber konfrontierte Maus ist (nicht erfindungsgemäß).
Bei den zwei höchsten Probedosen von Bakterien (markiert mit „–1" (am höchsten) und „–2") hatte die Gruppe, die den Impfstoff oral erhielt, eine etwas geringere Streberate als die oral mit der Blindprobe (leer) geimpften Mäuse. Beide, oral mit nicht-verkapseltem Impfstoff, geimpfte Gruppen hatten eine geringere Sterberate als naive Mäuse, oder als oral mit nicht-verkapseltem Antigen geimpfte Mäuse. Diese Daten deuten einen Vorteil der Verkapselung von oral verabreichtem Impfstoff an.
Für beide Probedosen hatten die oral, mit der Formulierung von Alginat Mikropartikeln, die das oberflächenaktive Mittel PLUORONIC L61 und das oberflächenaktive Mittel TWEEN 85 enthielt, geimpften Mäuse, eine geringere Sterberate als die oral, mit dem Antigen in Alginat mit TWEEN 85 als oberflächenaktives Mittel, geimpfte Gruppe.
Die gezeigte verbesserte Wirksamkeit ist höchstwahrscheinlich mit der verbesserten Hydrophobie der Mikropartikel verbunden. Die kleinere Größe und die verbesserte Ladung können auch zu der Effizienz der Antigenabgabe an die Mäuse beigetragen haben, obwohl die Ladungseffizienzen wahrscheinlich nicht ausreichend verschieden waren, um größeren Unterschieden der in den diesen Mäusen verabreichten Antigen-Mengen Rechnung zu tragen.
Beispiel 6
Einfluß der Variablen der Formulierung auf die Eigenschaften der Mikropartikel, zelluläre Aufnahme durch Makrophagen und Zytotoxizität von Alginat-Mikropartikeln gegenüber phagozytischen Zellen
Alginat-Mikropartikel wurden durch die Emulsionsvernetzungstechnik hergestellt. Das oberflächenaktive Mittel TWEEN 85 (Sigma-Aldrich) wurde als ein oberflächenaktives Mittel in allen Proben verwendet. Eine 1,5% ige (w/v) Lösung (8 ml/Charge) von Natrium-Alginat (Viskosität von 400 mPa·s; Acros Organics) wurde in SDDW hergestellt. Entweder wurde zuerst Methylcellulose (METHOCEL A4C) oder Hydroxypropylmethylcellulose (METHOCEL K3), wenn verwendet, zu der Alginatlösung, bis zu einer endgültigen Konzentration von 0,5% (w/v), gegeben. TWEEN 85 (4 ml/Charge, zu allen Proben hinzugefügt) und PLURONICoberflächenaktive Mittel (2 ml/Charge, wenn verwendet) (BASF Corp.) wurden zum Öl (40 ml/Charge; Rapsöl; Meijer Inc., Kalamazoo, MI) hinzugefügt.
Um Antigen-enthaltende Alginat-Mikropartikel herzustellen, wurde eine Rinderserumalbumin (BSA) (2 ml/Charge) enthaltende Lösung zuerst mit einer 1,5%igen (w/v) Alginatlösung (plus Celluloseether, wenn verwendet) bis zu einer Endkonzentration von 1 mg/ml gemischt. Die wäßrige Phase wurde anschließend in einem Volumenverhältnis von 1:4 zu der Ölphase gegeben. Eine Emulsion und dann Alginat-Mikropartikel wurden nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, unter Verwendung einer 8 ml Lösung von Calciumacetat und Zinkacetat (4 ml 4,2% (w/v) Calciumacetat und 4 ml 9,8% (w/v) Zinkacetat) als Vernetzer, hergestellt.
Alginat-Mikropartikel wurden dann nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren mit PLL (Molekulargewicht 21 000 Daltons; Sigma-Aldrich, Inc.) beschichtet.
Die Partikelgröße wurde unter Verwendung eines optischen ACUSIZER 770 Partikelgrößenbestimmungsgeräts, welches mit einem Selbstverdünnungssystem ausgestattet ist (Partikelgrößenbestimmungssystem, Inc. Santa Barbara, CA), gemessen. Eine 10-fache Verdünnung (nach Volumen) der ursprünglichen Mikropartikelsuspension wurde in SDDW hergestellt. Drei Größenbestimmungen wurden für jede Formulierung erstellt und der durchschnittliche Meßwert wird angezeigt.
Die Hydrophobie für jede Alginat-Mikropartikel Formulierung wurde durch die Messung des Berührungswinkels auf einem, nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, mit Mikropartikeln beschichteten Glasträger bestimmt, mit der Ausnahme, daß keine PLL-Beschichtung der Glasträger für die PLL-beschichteten Mikropartikel notwendig war.
Eine aktive, konfluente Kultur der U937 Makrophagen-Zellinie der Maus in der Logphase wurde für die Phagozytose-Studie verwendet. Diese Zellen ähneln genau den M-Zellen der Peyer's-Flecken. Die Zellen wurden geerntet und bei einer Konzentration von 10⁶ Zellen/ml resuspendiert. Lipopolysaccharide (LPS, Sigma-Aldrich Inc. St. Louis MO) wurden zu der Suspension zu einer Endkonzentration von 10 μg/ml hinzugefügt. Die Zellen wurden nach 48 h Inkubation mit LPS eingesammelt und wurden dann mit RPMI 1640 Medium (Life technologies, Grand Island, NY) gewaschen. Dann wurden sie in eine 24 Loch-Gewebekulturplatte zu 0,5 ml/Loch (10⁵ Zellen/ml) transferiert. Man ließ die Zellen auf dem Boden der Reaktionsgefäße bei einer Inkubation bei 37°C und 5% CO₂ für 4 h anwachsen. Dann wurde in jedes Reaktionsgefäß 100 μl Alginat-Mikropartikelsuspension (1:1 w:w in 0,9% (w/v) Salz) oder Mikropartikel-Überstand hinzugefügt. Die Platte wurde bei 37°C und 5% CO₂ für 30 Min inkubiert. Sowohl der Überstand als auch die anhaftenden Zellen wurden dann gesammelt. Die Zellen wurden mit Propidiumiodid (Sigma-Aldrich Inc., St. Louis, MO) in Phosphat-gepuffertem Salz gefärbt, und eine Zwei-Farben-Durchflusscytometrie wurde durchgeführt.
Rinderblut wurde durch Venenpunktion in einer 1,5% EDTA (pH 6,8) enthaltenden 50 ml Spritze gesammelt. Das Blut wurde dann bei 1000 facher Schwerkraft für 25 min zentrifugiert. Die Plasma-Pufferschicht und wenige obere Millimeter wurden verworfen. Die komprimierte Erythrozytenfraktion wurde in ausreichend Volumen suspendiert, um 0,85% NaCl-Phosphatpuffer (pH 6,8) zu suspendieren und 10 ml wurden für 40 Sekunden in 20 ml steriles Wasser gegeben, um die Erythrozyten zu lysieren. Sofort danach wurden 10 ml einer 2,7% igen NaCl-Phosphatpufferlösung hinzugefügt, um die Isotonizität wiederherzustellen. Die Leukozyten, die aus polymorphonuklearen Neutrophilen (PMNs) bestehen, wurden zwei Mal gewaschen und in Hanks-abgestimmter Salzlösung (HBSS) mit Calcium und Magnesium suspendiert. Die PMNs wurden auf eine Endkonzentration von 5 × 10⁶ Zellen/ml in HBSS angeglichen.
Zytotoxische Studien wurden für die folgenden Formulierungen durchgeführt: Alginat (A), Alginat mit Methylcellulose (AA), AA mit PLURONIC L61, mit und ohne PLL-Beschichtung. Polystyrol-Mikrosphären (durchschnittlicher Durchmesser 2,9 μm, Sigma-Aldrich, Inc.) wurden als Kontrolle verwendet. Eine ein Milliliter PMN-Suspension wurde sorgfältig zentrifugiert, um die PMNs zu pelletieren. Eine ein Milliliter PMN-Suspension von Mikropartikeln in HBSS wurde zu dem Pellet hinzugefügt und sorgfältig gevortext, um die PMNs zu resuspendieren. HBSS wurde zu den Kontrollröhrchen gegeben. Die die Suspension enthaltenden Röhrchen wurden bei 37°C und 5% CO₂ für 3 h inkubiert. Eine 10 Mikroliter-Suspension wurde entnommen und mit 10 μl Trypan-Blau gemischt. Eine 10 Mikroliter-Probe dieser Mischung wurde in ein Hämazytometer gegeben und die toten und lebenden Zellen wurden gezählt, und der prozentuale Anteil von lebenden Zellen wurde aufgezeichnet, um die Toxizität jeder Rezeptur zu vergleichen.
22 zeigt den Einfluß von verschiedenen Alginat-Mikropartikel Formulierungen auf die durchschnittliche Volumengröße der Alginat-Mikropartikel. Die fünf untersuchten Formulierungen waren Alginat (A) (nicht erfindungsgemäß), Alginat mit Methylcellulose (AA), AA mit dem oberflächenaktiven Mittel PLURONIC L61 (AA61), Alginat mit Hydroxypropylmethylcellulose (AK3), und Alginat mit Hydroxypropylmethylcellulose und dem oberflächenaktiven Mittel PLURONIC L61 (AK3 61). Die Alginat-Formulierungen führten zu einer durchschnittlichen Volumengröße von 11 μm, während das Hinzufügen von Methylcellulose zu der Alginat-Formulierung Mikropartikel mit einer durchschnittlichen Volumengröße von 10,5 μm ergab. Wenn das oberflächenaktive Mittel PLURONIC L61 zu der Alginat-plus-Methylcellulose-Formulierung hinzugegeben wurde, war die durchschnittliche Volumengröße 3,8 μm. Die Alginat-plus-Hydroxypropylmethylcellulose-Formulierung ergab Mikropartikel mit einer durchschnittlichen Volumengröße von 8,7 μm. Wenn PLURONIC L61 oberflächenaktive Mittel zu der AK3-Formulierung hinzugefügt wurden, wurde die durchschnittliche Volumengröße auf 3,9 μm reduziert. Die Poly-L-Lysin-Beschichtung ergab keine Veränderung der durchschnittlichen Volumengröße.
Ein Kontaktwinkel-Goniometer wurde verwendet, um den Wasser-Kontaktwinkel an den mit Mikropartikel beschichteten Glasträgern zu messen. 23 zeigt die für die verschiedenen Formulierungen gemessenen Berührungswinkel. Die Formulierung mit Alginat alleine (nicht erfindungsgemäß) war mit einem Berührungswinkel von 20° die am stärksten hydrophile. Wenn die Alginat-Mikropartikel mit PLL beschichtet wurden, erhöhte sich der Berührungswinkel auf 49,7°. Die Berührungswinkel an der Alginatplus-Methylcellulose-Formulierung waren ohne und mit PLL-Beschichtung entsprechend 34,8° und 55,8°. Die Beimischung des PLURONIC L61 oberflächenaktiven Mittels zur Alginat- plus Methylcellulose-Formulierung ergab eine Erhöhung des Kontaktwinkels auf 71° ohne PLL-Beschichtung und auf 91° mit PLL-Beschichtung. Wenn die Alginat-Formulierung mit Hydroxypropylmethylcellulose verwendet wurde, waren die Berührungswinkel ohne und mit PLL-Beschichtung entsprechend 29° und 48,3°. Die Beimischung des oberflächenaktiven Mittels PLURONIC L61 zur AK3-Formulierung ergab eine Vergrößerung des Berührungswinkels auf 80°, ohne PLL-Beschichtung und auf 84,8°, mit PLL-Beschichtung.
Die Zytotoxizität der von verschiedenen Alginat-Grundrezepturen hergestellten Alginat-Mikropartikel gegen Rinder-PMNs wurde ebenfalls untersucht. Die Zellen wurden Alginat-Mikropartikeln für 3 h bei 37°C ausgesetzt. Die Zellen wurden dann mit Trypan-Blau gefärbt, welches gezielt tote PMNs färbt. Sowohl lebende als auch tote Zellen wurden gezählt, um den prozentualen Anteil lebensfähiger Zellen zu ermitteln. 24 zeigt den Prozentanteil der Gesamtzahl der Zellen, die die Einwirkung der Mikropartikel überlebt haben. Der feste Anteil der ursprünglichen Mikropartikelsuspension war 50%. Die untersuchte Mikropartikelkonzentration (% w/w) war 0,05%, 0,5% und 5% in HBSS. HBSS und Polystyrol-Kügelchen wurden als Kontrolle verwendet.
Wenn PMNs einer 5% igen (w/v) Mikropartikelsuspension in HBSS ausgesetzt wurden, überlebten 30–39% der gesamten Zellen bei allen Formulierungen mit Ausnahme der als AA61PLL ausgewiesen Formulierung, für die die Lebensfähigkeit der Zellen 19% war. Wenn eine 0,5% ige (w/v) Konzentration von Mikropartikeln verwendet wurde, war die Lebensfähigkeit der Zellen in einem Bereich von 77–87%, während für eine 0,05% ige (w/v) Mikropartikelkonzentration, die Lebensfähigkeit der Zellen zwischen 85% und 96% war. Es gab unter den verschiedenen Alginat-Formulierungen keinen statistisch signifikanten Unterschied in der Toxizität zu PMNs. Es gab auch keinen statistisch signifikanten Unterschied in der Toxizität zu PMNs zwischen den auf Alginat-basierenden Mikropartikeln und den Polystyrolkügelchen vergleichbarer Partikelgröße. Es gab keinen statistisch signifikanten Unterschied in der Toxizität zu PMNs zwischen PLL-beschichteten und nicht-beschichteten Mikropartikeln.
Die zelluläre Aufnahme von Alginat-Mikropartikeln durch Makrophagen wurde unter Verwendung Fluoreszenz-gekennzeichneter Mikropartikeln untersucht. Um in der Lage zu sein zwischen fluoreszierenden Zellen und fluoreszierenden FITCgekennzeichneten Mikropartikeln zu unterscheiden, wurden die Zellen mit Propidiumiodid (PI) gefärbt, welches die DNA bindet und in roter Farbe fluoresziert. Die Analyse wurde unter Verwendung einer Durchflusszytometrie an PI-positiven Zellen durchgeführt. Der Prozentanteil von Zellen, deren Fluoreszenz über einem bestimmten Anhaltswert war, wird aufgezeichnet. Der Fluoreszenz-Anhaltswert wurde so gewählt, um eher Zellen, die FITC-BSA aus der Lösung aufgenommen hatten, als die Mikropartikel auszuschließen. Durchweg wurden die gleichen Anhaltswerte verwendet. 25 zeigt den Prozentanteil von fluoreszierenden Zellen für verschiedenen Mikropartikel-Präparationen. Wenn Makrophagen mit Alginat (A)- Mikropartikeln in Kontakt gebracht wurden, war der Prozentwert fluoreszierender Zellen ohne und mit PLL-Beschichtung entsprechend 6,0% und 5,7%. Das in Kontakt bringen der Zellen mit aus Methylcellulose plus dem oberflächenaktiven Mittel PLURONIC L61 (AA61) hergestellten Alginat-Mikropartikeln, ohne und mit PLL-Beschichtung, ergab fluoreszierende Zellen von entsprechend 5,5% und 18,5%. Wenn Zellen mit Alginat plus Hydroxypropylmethylcellulose (AK3) in Kontakt gebracht wurden, war die erhaltene Fluoreszenz ohne und mit PLL-Beschichtung entsprechend 7,4% und 14,7%.
Alginat-Mikropartikel mit und ohne Poly-L-Lysin-Beschichtung zeigten, trotz eines zweifachen Unterschieds in der Hydrophobie zwischen beiden, eine ähnliche Aufnahme durch die Makrophagen-Zellinie der Maus. Eine Alginat-Formulierung, welche Methylcellulose und PLURONIC L61 (AA61) ohne und mit PLL enthielt, ergab Mikropartikel mit einer durchschnittlichen Volumengröße von ungefähr 3,8 μm. Diese Größe ist ungefähr dreimal kleiner als von dem gleichen Verfahren erhaltene Mikropartikel mit Alginat alleine und Alginat mit Methylcellulose Formulierungen. Auch die Hydrophobie der AA61-Formulierung, gemessen mit dem Berührungswinkel Goniometer, war dreimal größer als die Formulierung mit Alginat alleine. Trotz dieser Unterscheide in der Größe und Hydrophobie wurden die AA61-Mikropartikel nicht irgendwie besser als Alginat alleine und Alginat mit Cellulose-Derivaten aufgenommen. Die Beschichtung der Alginat-Mikropartikel (hergestellt ohne oberflächenaktive Mittel) mit PLL konnte die Aufnahme durch die Makrophagen der Maus nicht verstärken. Die Beschichtung von AA61-Mikropartikeln mit PLL verstärkte dennoch die zelluläre Aufnahme um das 3-fache. Auch wurden PLLbeschichtete, mit Hydroxypropylmethylcellulose hergestellte Alginat-Mikropartikel besser im Vergleich zu Mikropartikeln ohne PLL aufgenommen. Dieses zelluläre Aufnahmemuster, welches einzeln betrachtet weder der Mikropartikelgröße noch der Hydrophobie folgt, kann sich aus dem kombinierten Einfluß der Größe, der Hydrophobie und der zellulären Interaktion mit der Mikropartikeloberfläche ergeben.
Alle untersuchten Formulierungen, obwohl sie eine von der Konzentration abhängende Toxizität zu Rinder-PMNs zeigen, versagten, um eine von der Formulierung abhängende Toxizität darzustellen. Die konzentrierteste Mikropartikelsuspension ergab den größten Zelltod. Beide 10- und 100-fachen Verdünnungen der gleichen Mikropartikelsuspension ergaben jedoch keine, irgendwie wesentliche Toxizität, verglichen mit der negativen Kontrolle. Das deutet darauf hin, daß die für die Herstellung von Alginat-basierenden Mikropartikeln verwendeten Formulierungskomponenten sicher sind.

Claims

Verfahren zur Herstellung einer Impfstoffzusammensetzung, welches Verfahren die folgenden Schritte umfasst: (A) Bildung einer Wasser-in-Öl Emulsion umfassend: (a) Wasser (b) ein Alginat (c) ein Öl (d) ein Antigen, und (e) eine Zusammensetzung aus oberflächenaktiven Mitteln, welche wenigstens eines von (i) einem Celluloseether und wenigstens einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel und (ii) einem oberflächenaktiven Mittel aus einem Dreiblockcopolymer aus Poly(ethylenoxid)-poly(propylenoxid)-poly(ethylenoxid) und wenigstens einem nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel umfasst; (B) Vernetzung des Alginats in der Emulsion von Schritt (A) mit wenigstens zwei Kationen, die aus der Gruppe, bestehend aus Aluminium, Barium, Calcium, Lithium, Mangan, Strontium und Zink, ausgewählt sind, um Antigenenthaltende vernetzte Alginat-Mikropartikel zu bilden, und (C) Abernten der Mikropartikel von Schritt (B).
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Mikropartikel kleiner als 10 μm im Durchmesser sind.
Verfahren nach Anspruch 1, worin der Celluloseether aus der Gruppe, bestehend aus Ethylcellulose, Methylcellulose, Hydroxymethylcellulose, Hydroxypropylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, und Mischungen davon, ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin wenigstens eines der nicht-inonischen oberflächenaktiven Mittel der Schritte (A)(e)(i) und (ii) aus der Gruppe, bestehend aus oberflächenaktiven Mitteln aus Polyoxyethylen, Anhydrosorbitester, ethoxylierten Anhydrosorbitester, und Mischungen davon, ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das oberflächenaktive Mittel aus Polyoxyethylen ein Alkoholethoxylat ist.
Verfahren nach Anspruch 5, worin das Alkoholethoxylat Polyoxyethylen-(2)-olylether ist.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel ein Anhydrosorbitester ist.
Verfahren nach Anspruch 7, worin der Anhydrosorbitester Sorbitantrioleat ist.
Verfahren nach Anspruch 4, worin das nicht-ionische oberflächenaktive Mittel ein ethoxylierter Anhydrosorbitester ist.
Verfahren nach Anspruch 9, worin der ethoxylierte Anhydrosorbitester Polyoxyethylensorbitantrioleat ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Dreiblockcopolymer aus Poly(ethylenoxid)-poly(propylenoxid)-poly(ethylenoxid) 15 bis 70 Propylenoxidreste aufweist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin das Dreiblockcopolymer aus Poly(ethylenoxid)-poly(propylenoxid)-poly(ethylenoxid) ungefähr 30 Propylenoxidreste aufweist.
Verfahren nach Anspruch 11, worin das Dreiblockcopolymer aus Poly(ethylenoxid)-poly(propylenoxid)-poly(ethylenoxid) die Formel (EO)₃(PO)₃₀(EO)₃ hat.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Antigen aus der Gruppe, bestehend aus einem lebenden Virus, lebenden Bakterien, abgetöteten Virus, abgetöteten Bakterien, Nukleinsäuren, Untereinheiten-Antigenen von infektiösen Mitteln, und Mischungen davon, ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Kationen Calcium und Zink umfassen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Emulsion Quellen dieser Kationen, die aus der Gruppe, bestehend aus AlSO₄, BaCl₂, CaCl₂, MnCl₂, ZnCl₂, Calciumacetat, Zinkacetat, Strontiumnitrat, und Mischungen davon, ausgewählt sind, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16, worin die Quelle der Kationen CaCl₂ und ZnCl₂ umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16, worin die Quelle der Kationen Calciumacetat und Zinkacetat umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Emulsion von Schritt (A) weiterhin Poly(propylenglykol) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Emulsion von Schritt (A) den Celluloseether und wenigstens zwei nicht-ionische oberflächenaktive Mittel umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, welches weiterhin vor Schritt (A), den Schritt, wenigstens ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel zu dem Öl zu geben, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, welche den Schritt, die in Schritt (C) abgeernteten Mikropartikel mit einem Polymer zu beschichten, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 22, worin das Polymer ein Polykation ist.
Verfahren nach Anspruch 23, worin das Polykation aus einer Gruppe, bestehend aus Poly-l-lysin, Polyhistidin, Polyarginin, Polyethylenimin und Mischungen davon, ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 24, worin das Polykation Poly-l-lysin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, welches den Schritt, die in Schritt (C) abgeernteten Partikel mit einem Schleimhauthilfsmittel/-haftmittel zu beschichten, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 26, worin das Schleimhauthilfsmittel/-haftmittel aus der Gruppe, bestehend aus Lektinen, Choleragift, dem B-Untereinheitgift des Choleragifts, rekombinantabgeleiteten Untereinheiten des B-Untereinheitgifts des Choleragifts, Keuchhustengift, dem hitzeinstabilen Gift von E.coli, Exotoxin A von P.aeruginosa, und Mischungen davon, ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin Schritt (B) das tropfenweise Hinzufügen von Kationen zur Emulsion von Schritt (A) umfasst, während die Emulsion bei einer Geschwindigkeit von wenigstens 1.000 UpM gerührt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin wenigstens eines der nicht-ionischen oberflächenaktiven Mittel der Schritte (A)(e)(i) und (ii) und des Dreiblockcopolymers aus Poly(ethylenoxid)-Poly(propylenoxid)-Poly(ethylenoxid) einen HLB von 1 bis 15 hat.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Zusammensetzung aus oberflächenaktiven Mitteln einen HLB von etwa 8,3 hat.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Emulsion, die das Dreiblockcopolymer aus Poly(ethylenoxid)-poly(propylenoxid)-poly(ethylenoxid) und das nichtionische oberflächenaktive Mittel umfasst, ein oberflächenaktives Mittel aus ethoxyliertem Anhydrosorbitester ist.
Verfahren nach Anspruch 31, worin das oberflächenaktive Mittel aus ethoxyliertem Anhydrosorbitester Polyoxyethylensorbitantrioleat umfasst.
Verfahren nach Anspruch 32, worin das Dreiblockcopolymer aus Poly(ethylenoxid)-poly(propylenoxid)-poly(ethylenoxid) die Formel (EO)₃(PO)₃₀(EO)₃ hat.
Verfahren nach Anspruch 33, worin die Emulsion weiterhin den Celluloseether umfasst.
Verfahren nach Anspruch 1, worin A) die Zusammensetzung aus oberflächenaktiven Mitteln in Schritt A Methylcellulose, Polyoxyethylensorbitantrioleat, und ein oberflächenaktives Mittel, welches ein Dreiblockcopolymer aus Poly(ethylenoxid)-poly(propylenoxid)-poly(ethylenoxid) der Formel (EO)₃(PO)₃₀(EO)₃ ist, umfasst; und B) die Vernetzung von Schritt B mit Zink und Calcium, abgeleitet von Zinkacetat und Calciumacetat, bewirkt wird.
Impfstoffzusammensetzung, welche durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 35 hergestellt wird.
Verwendung der Impfstoffzusammensetzung, welche nach einem der Ansprüche 1 bis 35 erzeugt wird, um ein Arzneimittel zur Impfung einer Wirbeltierart herzustellen.
Verwendung nach Anspruch 37, worin das Arzneimittel oral verabreicht wird.
Verwendung der Impfstoffzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 35, um ein Arzneimittel zur Auslösung einer Immunantwort in einer Wirbeltierart herzustellen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 35, worin das genannte Antigen von lebenden Viren, lebenden Bakterien, instabilen Proteinen, Nukleinsäuren, und Kombinationen davon ausgewählt wird.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 36, worin das genannte Antigen von lebenden Viren, lebenden Bakterien, instabilen Proteinen, Nukleinsäuren und Kombinationen davon ausgewählt wird.
Impfstoffzusammensetzung nach Anspruch 36, worin die Zusammensetzung aus oberflächenaktiven Mitteln ein oberflächenaktives Mittel aus einem Dreiblockcopolymer aus Poly(ethylenoxid)-poly(propylenoxid)-poly(ethylenoxid) und wenigstens ein nicht-ionisches oberflächenaktives Mittel ist.