DE60114525T2 - Array-basierende Methoden zur Synthese von Nukleinsäuregemischen - Google Patents

Array-basierende Methoden zur Synthese von Nukleinsäuregemischen Download PDF

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Description

  • Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Erzeugen einer Mischung von Nukleinsäuren, und insbesondere Oligonukleotid-Primern. Das allgemeine Gebiet dieser Erfindung ist die Molekularbiologie und insbesondere eine Genausdrucksanalyse.
  • Die Kennzeichnung eines Zellgenausdrucks (d. h. Genausdrucksanalyse) findet in einer Vielzahl von Disziplinen Anwendung, wie z. B. bei der Analyse eines Differenzausdrucks zwischen unterschiedlichen Gewebetypen, unterschiedlichen Stufen eines Zellwachstums oder zwischen einem normalen und einem krankhaften Zustand.
  • Grundlegend für die Differenzausdrucksanalyse ist die Erfassung unterschiedlicher mRNA-Spezies in einem Testmuster und oft die quantitative Bestimmung unterschiedlicher mRNA-Pegel in diesem Testmuster. Um unterschiedliche mRNA-Pegel in einer bestimmten Testpopulation zu erfassen, wird eine Population etikettierter Ziel-Nukleinsäuren erzeugt, die zumindest teilweise das mRNA-Profil des Testmusters wiedergibt oder wiederspiegelt. Anders ausgedrückt wird eine Population etikettierter Ziel-Nukleinsäuren erzeugt, wobei zumindest ein Teil der mRNA-Spezies in dem Testmuster hinsichtlich eines Vorliegens und oft hinsichtlich einer Menge dargestellt wird. Nach der Zielerzeugung wird die Zielpopulation mit einer oder mehreren Probesequenzen in Kontakt gebracht, wie z. B. auf einer Anordnung bzw. einem Array zu finden ist, wodurch das Vorliegen und oft die Menge spezifischer Ziele in der Zielpopulation erfasst werden. Aus den resultierenden Daten können ohne Weiteres Informationen über die mRNAs, die in dem Muster vorliegen, d. h. das mRNA-Profil und ein Genausdrucksprofil, hergeleitet werden.
  • Ein grundlegender Schritt in Genausdrucksanalyse-Untersuchungen ist deshalb der Schritt einer Erzeugung eines etikettierten Ziels. Zielerzeugungsprotokolle umfassen üblicherweise eine Primer-Erweiterungsreaktion, bei der ein Primer mit einem anfänglichen mRNA-Muster in Kontakt gebracht wird, um eine etikettierte Zielpopulation zu erzeugen, wie oben beschrieben ist. Bei bestimmten Protokollen werden PolyA-Primer und Varianten derselben eingesetzt. Nachteile derartiger Protokolle umfassen die Unfähigkeit, ein Ziel aus einer prokaryotischen mRNA-Spezies zu erzeugen, der ein PolyA-Schwanz fehlt, sowie die Neigung derartiger Protokolle, ein Ziel zu erzeugen, dem 5'-mRNA-Informationen fehlen. Während die Verwendung zufälliger Primer einige dieser Nachteile überwindet, leiden Zufallsprimerprotokolle unter ihren eigenen Nachteilen, z. B. Mangel an Spezifität, der aus einer erhöhten Komplexität in der Primer-Mischung resultiert, die durch den Vorgang erzeugt wird, wobei nicht nur mRNA dargestellt wird, sondern auch rRNA, tRNA und snRNA. Bei wiederum anderen Protokollen werden maßgeschneiderte Primer-Mischungen bei der Zielerzeugung eingesetzt. Während derartige Protokolle die oben beschriebenen Nachteile bei Protokollen auf PolyA- und Zufallsprimerbasis überwinden, können maßgeschneiderte Protokolle auf Primermischungs- oder genspezifischer Primerbasis verbietend teuer sein, insbesondere bei anordnungsbasierten Hybridisierungsprotokollen, bei denen maßgeschneiderte Anordnungen eingesetzt werden.
  • So besteht fortwährend Interesse an der Entwicklung neuer Primererzeugungsprotokolle. Von besonderem Interesse wäre die Entwicklung eines Protokolls, das die Vorteile von Protokollen auf genspezifischer Primerbasis realisiert, während es gleichzeitig wirtschaftlich in der Durchführung ist und deshalb geeignet zur Verwendung in maßgeschneiderten Hybridisierungsuntersuchungen auf Anordnungsbasis ist.
  • Relevante Literatur
  • Siehe U.S.-Patent Nr. 5,795,714 und die dort genannten Referenzen.
  • Die WO 99/07888 offenbart eine Anordnung von oberflächengebundenen, bimolekularen, doppelsträngigen Nukleinsäuremolekülen, wobei die Anordnung einen festen Träger und eine Mehrzahl unterschiedlicher doppelsträngiger Nukleinsäure-Molekülelemente aufweist, wobei ein Element einen ersten Nukleinsäurestrang, der mit dem festen Träger verbunden ist, und einen zweiten Nukleinsäurestrang aufweist, der im Wesentlichen komplementär zu dem ersten Strang ist und durch Watson-Crick-Basenpaarung komplex mit dem ersten Strang verbunden ist, wobei zumindest ein Teil der Elemente einen zweiten Nukleinsäurestrang aufweist, der im Wesentlichen entlang der gesamten Länge des ersten Strangs komplementär zu dem ersten Strang ist und Basenpaare mit demselben bildet.
  • Bulyk u. a. ((1999) Nature Biotechnology 17, 573–7) erzeugte doppelsträngige Oligonukleotid-Anordnungen zur Durchführung von Paralleluntersuchungen von DNA-Protein-Wechselwirkungen. Eine einsträngige Anordnung wurde in eine doppelsträngige Anordnung umgewandelt, indem eine konstante Sequenz an jeder Position auf einer Anordnung synthetisiert und dann geschmolzen und enzymatisch ein Komplementär-Primer erweitert wurde.
  • Die WO 93/17126 offenbart neue Oligonukleotid-Anordnungen und Verfahren zur Verwendung von Oligonukleotid-Anordnungen. Binäre Oligonukleotid-Anordnungen, die binäre Oligonukleotide aufweisen, die durch eine konstante Nukleotidsequenz gekennzeichnet sind, benachbart zu einer variablen Nukleotidsequenz, werden. zum Sortieren und Überwachen von Nukleinsäuresträngen verwendet. Oligonukleotid-Anordnungen werden zum Sortieren von Mischungen von Nukleinsäuresträngen, Unbeweglichmachen von Teilkopien von Nukleinsäure strängen, Ligieren von Strängen oder Einführen ortsgerichteter Mutationen in Stränge verwendet. Informationen werden zum Bestimmen der Sequenz eines Nukleinsäurestrangs, allein oder in einer Mischung, durch ein Erzeugen von Teilstücken des Strangs und, für Gruppen von Teilstücken, die das gleiche variable Abschlussoligonukleotid aufweisen, ein separates Bestimmen des Vorliegens und einer Sequenz aller variabler Oligonukleotide erhalten. Anordnungen werden ebenso verwendet, um zuvor sequenzierte Nukleinsäurefragmente zu ordnen und geordnete Allelenfragmente Chromosomverbindungsgruppen zuzuweisen.
  • Verfahren zum Erzeugen von Mischungen einsträngiger Primer-Nukleinsäuren, z. B. Oligonukleotid-Primer, werden bereitgestellt. Bei den entsprechenden Verfahren wird eine Anordnung verschiedener einsträngiger Probenukleinsäuren mit unterschiedlichen Sequenzen als Schablone verwendet, um Mischungen von Nukleinsäuren über eine schablonengetriebene Primererweiterungsreaktion zu erzeugen, die aus linearer PCR, Strangverschiebungsverstärkung und In-vitro-Transkription ausgewählt wird. Jede Probe auf der Anordnung, die bei den entsprechenden Verfahren eingesetzt wird, weist einen konstanten Bereich und einen variablen Bereich auf, wobei der konstante Bereich ferner dadurch gekennzeichnet ist, dass er zumindest einen Erkennungsbereich und wahlweise einen Funktionsbereich und/oder Verbinderbereich aufweist. Ebenso offenbart sind die Anordnungen, die in den betreffenden Verfahren eingesetzt werden, und Ausrüstungen zum Praktizieren der betreffenden Verfahren. Die betreffenden Verfahren finden in einer Vielzahl von Anwendungen Verwendung, einschließlich der Erzeugung von Zielnukleinsäuren aus einem mRNA-Muster zur Verwendung bei Hybridisierungsuntersuchungen, z. B. Differenzgenausdrucksanalyse.
  • Eine Anzahl bevorzugter Ausführungsbeispiele der vorliegenden Erfindung wird nun Bezug nehmend auf die Zeichnungen offenbart, in denen:
  • 1 eine Ansicht des gefärbten Gels liefert, das bei Beispiel 1 des experimentellen Abschnitts unten erzeugt wurde.
  • Der Ausdruck „Nukleinsäure", wie er hierin verwendet wird, bedeutet ein Polymer, das aus Nukleotiden aufgebaut ist, z. B. Deoxyribonukleotiden oder Ribonukleotiden, oder Verbindungen, die synthetisch erzeugt werden (z. B. PNA, wie in dem U.S.-Patent Nr. 5,948,902 sowie den hierin genannten Referenzen beschrieben ist), die mit natürlich auftretenden Nukleinsäuren in einer sequenzspezifischen Weise hybridisieren können, analog wie bei zwei natürlich auftretenden Nukleinsäuren.
  • Die Ausdrücke „Ribonukleinsäure" und „RNA", wie sie hierin verwendet werden, bedeuten ein Polymer, das aus Ribonukleotiden aufgebaut ist.
  • Die Ausdrücke „Deoxyribonukleinsäure" und „DNA" wie sie hierin verwendet werden, bedeuten ein Polymer, das aus Deoxyribonukleotiden aufgebaut ist.
  • Der Ausdruck „Oligonukleotid", wie er hierin verwendet wird, bezeichnet einsträngige Nukleotid-Multimere mit einer Länge von etwa 10 bis 100 Nukleotiden und bis zu 200 Nukleotiden.
  • Der Ausdruck „Polynukleotid", wie er hierin verwendet wird, bezieht sich auf ein ein- oder doppelsträngiges Polymer, das aus Nukleotidmonomeren mit allgemein einer Länge von mehr als 100 Nukleotiden aufgebaut ist.
  • Der Ausdruck „mRNA" bedeutet Boten-RNA.
  • Der Ausdruck „Anordnung" bzw. „Array" bedeutet ein Substrat, das zumindest eine planare Oberfläche aufweist, auf der eine Mehrzahl unterschiedlicher Probenukleinsäuren unbeweglich gemacht ist.
  • Verfahren zum Erzeugen von Mischungen einsträngiger Primer-Nukleinsäuren, wie z. B. Oligonukleotid-Primern, werden bereitgestellt. In den betreffenden Verfahren wird eine Anordnung als eine Schablone verwendet, um Mischungen von Nukleinsäuren über eine schablonengetriebene Primererweiterungsreaktion zu erzeugen. Jede Probe auf der Anordnung, die in den betreffenden Verfahren verwendet wird, weist einen konstanten Bereich und einen variablen Bereich auf, wobei der konstante Bereich ferner dadurch gekennzeichnet sein könnte, dass er zumindest einen Erkennungsbereich und wahlweise einen Funktions- und/oder einen Verbinderbereich aufweist. Ebenso offenbart sind die Anordnungen, die bei den betreffenden Verfahren eingesetzt werden, und Ausrüstungen zum Praktizieren der betreffenden Verfahren. Die betreffenden Verfahren finden in einer Vielzahl von Anwendungen Verwendung, einschließlich der Erzeugung von Zielnukleinsäuren aus einem mRNA-Muster zur Verwendung bei Hybridisierungsuntersuchungen, z. B. Differenzgenausdrucksanalyse. Bei einer weiteren Beschreibung der betreffenden Erfindung werden zuerst die betreffenden Verfahren beschrieben, gefolgt durch eine Besprechung repräsentativer Protokolle, in denen die Nukleinsäuremischungen, die durch die betreffenden Verfahren erzeugt werden, Anwendung finden, sowie eine Beschreibung von Ausrüstungen, die bei der Praktizierung der betreffenden Verfahren Verwendung finden.
  • Bevor die betreffende Erfindung weiter beschrieben wird, wird angemerkt, dass die Erfindung nicht auf die bestimmten unten beschriebenen Ausführungsbeispiele der Erfindung eingeschränkt ist, da Variationen der bestimmten Ausführungsbeispiele durchgeführt werden und dennoch in den Schutzbereich der beigefügten Ansprüche fallen könnten. Es wird ebenso darauf verwiesen, dass die verwendete Terminologie dem Zweck einer Beschreibung bestimmter Ausführungsbeispiele dient und nicht einschränkend beabsichtigt ist. Stattdessen wird der Schutzbereich der vorliegenden Erfindung durch die beigefügten Ansprüche bestimmt.
  • In dieser Beschreibung und den beigefügten Ansprüchen umfassen die Singularformen „einer/eine/eines", und „der/die/das" eine Pluralbezugnahme, es sei denn, der Zusammenhang gibt dies klar anderweitig vor. Mit Ausnahme einer anderen Definition weisen alle technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke, die hierin verwendet werden, die gleiche Bedeutung auf wie üblicherweise für einen Fachmann auf dem Gebiet, zu dem diese Erfindung gehört, verständlich ist.
  • Wie oben zusammengefasst wurde, schafft die betreffende Erfindung Verfahren zum Erzeugen von Mischungen einsträngigen Primer-Nukleinsäuren durch ein schablonengetriebenes Primererweiterungsprotokoll, das aus einer linearen PCR, einer Strangverschiebungsverstärkung und einer In-vitro-Transkription ausgewählt wird, bei denen eine Anordnung als Schablone verwendet wird. Die Mischung von Nukleinsäuren, die durch die betreffenden Verfahren erzeugt wird, ist dadurch gekennzeichnet, dass sie eine bekannte Zusammensetzung aufweist. So ist zumindest die Sequenz jeder einzelnen oder verschiedenen Nukleinsäure in der Mischung einer unterschiedlichen Sequenz bekannt. Bei vielen Ausführungsbeispielen ist die relative Menge oder Kopieanzahl jeder verschiedenen Nukleinsäure einer unterschiedlichen Sequenz bekannt. Jede in der Mischung vorhandene Nukleinsäure umfasst zumindest einen variablen Bereich, der dazu dient, dieselbe von einer anderen Nukleinsäure in der Mischung zu unterscheiden, d. h. einer beliebigen anderen Nukleinsäure, die nicht die ideale Sequenz aufweist – jede Nukleinsäure, die nicht ihre Kopie ist. Der variable Bereich Sij ist eine Nukleinsäure, die unter strengen Bedingungen zu einem Gen i an einem Ort j hybridisiert und in der Lage ist, als ein Primer bei einer Umkehrtranskription, beginnend bei einer Base j, zu dienen. Die Anzahl unterschiedlicher variabler Bereiche Sij, die in der Mischung vorhanden sind, könnte variieren, beträgt allgemein jedoch zumindest etwa 10, üblicherweise zumindest etwa 20 und noch üblicher zumindest etwa 50, wobei die Anzahl ganze 25.000 oder mehr betragen könnte. Bei vielen Ausführungsbeispielen variiert die Anzahl unterschiedlicher variabler Bereiche, die in der Mischung vorhanden sind, von etwa 1.978 bis 25.000, üblicherweise von etwa 4.200 bis 8.400. Zusätzlich zu einer Unterscheidung des variablen Bereichs könnten die Bestandteilselemente der Mischung alle einen oder mehrere Bereiche einer gemeinsamen Sequenz gemeinschaftlich verwenden, abhängig von dem bestimmten Protokoll, das zur Erzeugung der Mischung verwendet wird, wie unten detaillierter beschrieben ist.
  • Bei den betreffenden Verfahren dient der erste Schritt allgemein dazu, eine Anordnung bereitzustellen, d. h. ein Substrat mit einer planaren Oberfläche, auf der eine Mehrzahl verschiedener einsträngiger Nukleinsäureproben einer unterschiedlichen Sequenz unbeweglich gemacht ist, wobei jede Probesequenz auf der Anordnung einen konstanten Bereich und einen komplementären variablen Bereich umfasst. Dieser Bereitstellungsschritt könnte entweder ein Neu-Erzeugen der Anordnung oder ein Erhalten einer zuvor hergestellten Anordnung von einer kommerziellen Quelle umfassen, wobei in jedem Fall die Anordnung die unten beschriebenen Charakteristika aufweist. Anordnungen von Nukleinsäuren sind in der Technik bekannt, wobei repräsentative Anordnungen, die modifiziert werden könnten, um Anordnungen der betreffenden Erfindung zu werden, wie unten beschrieben ist, diejenigen umfassen, die beschrieben sind in: 5,242,974; 5,384,261; 5,405,783; 5,412,087; 5,424,186; 5,429,807; 5,436,327; 5,445,934; 5,472,672; 5,527,681; 5,529,756; 5,545,531; 5,554,501; 5,556,752; 5,561,071; 5,599,695; 5,624,711; 5,639,603; 5,658,734; 5,795,714; WO 93/17126; WO 95/11995; WO 95/35505; EP 742 287 und EP 799 897.
  • Wie oben erwähnt wurde, umfasst jede verschiedene Probenukleinsäure auf der Anordnung einen konstanten Bereich und einen komplementären variablen Bereich. Der komplementäre variable Bereich jeder verschiedenen Probe weist eine Sequenz auf, die das Komplement eines variablen oder unterscheidenden Bereichs ist, der in einem Bestandteilselement der Mischung von Nukleinsäuren zu finden ist, die durch die betreffenden Verfahren erzeugt wird, wie oben beschrieben wurde, wobei mit Komplement gemeint ist, dass die variable und die komplementäre variable Sequenz unter strengen Bedingungen, z. B. bei 50°C oder höher und 0,1 HSSC (15 mM Natriumchlorid/1,5 mM Natrium-Citrat) oder thermodynamisch gleichwertigen Bedingungen hybridisieren. So umfasst die Anordnung eine Mehrzahl verschiedener Proben, die sich voneinander durch einen komplementären variablen Bereich unterscheiden, wobei die Anzahl verschiedener Proben auf einer Anordnung, die bei den betreffenden Verfahren verwendet wird, typischerweise zumindest 10, üblicherweise zumindest 20 und noch üblicher zumindest 50 beträgt, wobei die Anzahl ganze 25.000 oder mehr betragen könnte. Bei vielen Ausführungsbeispielen variiert die Anzahl verschiedener Proben von etwa 1.978 bis 25.000, üblicherweise von etwa 4.200 bis 8400.
  • Aufgrund der Natur der betreffenden Verfahren wird, wie unten beschrieben ist, jeder verschiedene komplementäre variable Bereich in der Nukleinsäuremischung, die unter Verwendung der Anordnung erzeugt wird, dargestellt, d. h. das Komplement jeder verschiedenen komplementären Variabler-Bereich-Sequenz ist in der Mischung von Nukleinsäuren zu finden, die durch die betreffenden Verfahren erzeugt wird. Wo z. B. eine Anordnung 10 unterschiedliche Proben aufweist, die sich durch einen komplementären variablen Bereich unterscheiden, derart, dass es 10 unterschiedliche komplementäre variable Bereiche aufweist, d. h. cV1-10, hat die Nukleinsäuremischung, die durch die betreffenden Verfahren erzeugt wird, wie unten beschrieben wird, 10 unterschiedliche oder verschiedene Nukleinsäuren, wobei jede unterschiedliche Nukleinsäuresequenz in der Mischung eine Sequenz umfasst, die das Komplement von einem von cV1-10 ist, d. h. V1-10.
  • Die relative Kopiezahl jeder Probe auf der Anordnung könnte ausgewählt sein oder auch nicht, um die Nukleinsäuremischung, die mit der Anordnung hergestellt wird, in Bezug auf das mRNA-Muster, mit dem dieselbe verwendet werden soll, zu „normen". Wenn z. B. die Anordnung verwendet werden soll, um eine Nukleinsäuremischung herzustellen, die eine 10fache Erhöhung der Kopiezahl eines Ziels aufweist, das zu einer seltenen mRNA hybridisiert, kann die Kopiezahl der entsprechenden (z. B. identischen oder komplementären) Probe auf der Anordnung geeignet relativ zu anderen Proben, die weniger seltenen mRNA-Spezies in dem mRNA-Muster entsprechen, erhöht werden. Bei vielen Ausführungsbeispielen ist der komplementäre variable Bereich ein Bereich, der eine Sequenz aufweist, die ausgewählt ist, um unter strengen Bedingungen zu einer Sequenz von Interesse zu hybridisieren, die in einer bestimmten mRNA zu finden ist. Bei vielen Ausführungsbeispielen weist die komplementäre variable Sequenz eine Sequenz auf, die als cSij bezeichnet wird, wobei c für Komplement steht und Sij eine Nukleinsäure ist, die als Primer einer Umkehrtranskription eines Gens i beginnend bei einer Base j wirkt. So ist bei vielen Ausführungsbeispielen der Erfindung der komplementäre variable Bereich jeder Probe das Komplement einer Nukleinsäure, die in der Lage ist, zu einem unterschiedlichen Gen von Interesse i an einem Ort oder einer Base j zu hybridisieren und unter Umkehrtranskriptionsbedingungen als ein Primer zu wirken. Wo z. B. 10 unterschiedliche Gene, d. h. Gene 1 bis 10, auf der Anordnung dargestellt sind und die Sequenz von Interesse für jedes Gen bei Basenzahlen 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130 bzw. 140 beginnt (von dem 5'-Ende des mRNA-Moleküls zählend) und jeder komplementäre variable Bereich 20 Basen lang ist, sind die komplementären variablen Bereiche jeder verschiedenen Probe auf der Anordnung, d. h. cV1 bis V10, wie folgt:
  • Figure 00110001
  • Während die Länge des komplementären variablen Bereichs bei dem oben bereitgestellten spezifischen Beispiel 20 Basen oder Reste ist, d. h. 20 nt, könnte die Länge wesentlich variieren und wird basierend auf der erwünschten Länge der resultierenden Nukleinsäuren in der zu erzeugenden Mischung innerhalb der Synthesebeschränkungen des betreffenden Verfahrens ausgewählt. Allgemein variiert die Länge des komplementären variablen Bereichs von etwa 15 bis 40, üblicherweise von etwa 15 bis 30 und noch üblicher von etwa 20 bis 25 nt.
  • Wie oben beschrieben wurde, umfasst jede auf der Anordnung vorliegende Probenukleinsäure zusätzlich zu dem eindeutigen komplementären variablen Bereich einen gemeinsamen oder gemeinschaftlich verwendeten konstanten Bereich 3' des komplementären variablen Bereichs. Dieser konstante Bereich variiert üblicherweise längenmäßig von etwa 20 bis 50, üblicherweise von etwa 20 bis 45 und noch üblicher von etwa 25 bis 40 nt. Der konstante Bereich weist üblicherweise zumindest einen der folgenden konstanten Teilbereiche auf: einen Funktionsbereich; einen Erkennungsbereich und einen Verbinderbereich. Bei vielen Ausführungsbeispielen enthält jede Probe zumindest einen Erkennungsteilbereich und wahlweise einen Funktionsbereich und/oder einen Verbinderbereich. Diese konstanten Teilbereiche könnten auf der Probe zusammen gruppiert oder getrennt sein, um so den variablen Bereich der Probe zu flankieren. So sind bei bestimmten Ausführungsbeispielen diese Teilbereiche allgemein in der Reihenfolge Funktionsbereich, Erkennungsbereich und Verbinderbereich angeordnet, von dem 5'- zu dem 3'-Ende der Probesequenz gehend, derart, dass der Verbinderbereich an dem 3'-Probe-Ende ist und entweder direkt oder indirekt an der Substratoberfläche der Anordnung angebracht ist. Bei wiederum anderen Ausführungsbeispielen könnten einer oder mehrere Bereiche, z. B. der Funktionsteilbereich, an dem 5'-Ende des variablen Bereichs vorliegen.
  • Der optionale Funktionsteilbereich ist allgemein eine Sequenz, die einer Doppelstrangnukleinsäure, in der derselbe vorliegt, eine bestimmte Funktion verleiht oder zu derselben beiträgt. Funktionsbereiche von Interesse umfassen: Polymerase-Promotor-Orte, z. B. T3- oder T7-RNA-Polymerase-Promotor-Orte, Sequenzen, die eindeutig in Bezug auf den beabsichtigten Zielorganismus für das Anordnungsexperiment sind (d. h. eindeutige Primerwirkungsorte) und dergleichen. Die Länge dieses Funktionsbereichs variiert üblicherweise von etwa 10 nt bis 40 nt, üblicherweise von etwa 20 nt bis 30 nt.
  • Die Erkennungssequenz des konstanten Bereichs ist üblicherweise eine Sequenz, die, wenn sie in einem Doppelstrangfor mat vorliegt, durch eine Ristriktions-Endonuklease erkannt und gespalten wird. Eine große Anzahl von Ristriktions-Endonukleasen ist Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt. Bestimmte erkannte Ristriktions-Endonuklease-Orte von Interesse, die die betreffende Erkennungssequenz bilden könnten, umfassen Hinc II und dergleichen, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Allgemein variiert die Länge des Erkennungsbereichs von etwa 4 nt bis 8 nt, üblicherweise von etwa 5 nt bis 6 nt.
  • Der Verbinderteilbereich der betreffenden konstanten Bereiche ist optional. Der Verbinderbereich könnte jede passende Sequenz sein, einschließlich einer Zufallssequenz oder eines Nicht-Polynukleotid-Chemieverbinders (z. B. Polyether-Oligomer auf Ethylen-Glykol-Basis), wobei der einzige Zweck des Verbinderbereichs darin besteht, die anderen Bereiche der Probe weg von der Substratoberfläche zu versetzen. Allgemein weist der Verbinderbereich, falls vorhanden, eine Länge auf, die von etwa 1 bis 20 variiert, üblicherweise von etwa 1 bis 15 und noch üblicher von etwa 1 bis 10, einschließlich 5 bis 10 nt.
  • In vielen, wenn auch nicht allen Ausführungsbeispielen wird jede Oberflächenbindungsprobe auf der bei den betreffenden Verfahren verwendeten Anordnung durch die folgende Formel beschrieben:
    Oberfläche-3'-L-R-F-cV-5'
    wobei:
    L der optionale Verbindungsbereich ist;
    R der Erkennungsbereich ist;
    F der Funktionsbereich ist; und
    cV der komplementäre variable Bereich ist, d. h. das Komplement des variablen Bereichs, cSij, der Nukleinsäure, die durch die betreffenden Verfahren erzeugt wird, zu der es unter strengen Bedingungen hybridisiert;
    wobei jedes dieser Elemente so ist, wie oben beschrieben wurde.
  • Wie oben erwähnt wurde, werden die betreffenden Anordnungen durch ein beliebiges herkömmliches Mittel bereitgestellt, einschließlich Erhalten derselben von einer kommerziellen Quelle oder durch Neu-Synthetisieren derselben. Um die bei den betreffenden Verfahren verwendeten Anordnungen zu synthetisieren, ist der erste Schritt allgemein ein Bestimmen der Natur der Mischung von Nukleinsäuren, die unter Verwendung der betreffenden Anordnung gemäß den betreffenden Verfahren erzeugt werden soll. Bei diesen Ausführungsbeispielen, bei denen die Nukleinsäuremischung als genspezifischer Primer bei der Erzeugung einer Ziel-Nukleinsäure verwendet werden soll, wie unten noch detaillierter beschrieben wird, ist der erste Schritt ein Identifizieren der Gene, die durch einen Primer in der Primermischung dargestellt werden sollen, d. h. derjenigen spezifischen mRNAs, die potentiell in den experimentellen Mustern vorhanden sind, die Primer in der Mischung aufweisen müssen, die in der Lage sind, dieselben unter strengen Bedingungen zu hybridisieren. Einer Identifizierung dieser Gene folgend wird die spezifische Region, d. h. Fläche oder Bereich, jeder mRNA, zu der der Primer hybridisieren soll, identifiziert. Diese spezifischen Bereiche oder Regionen könnten unter Verwendung eines beliebigen herkömmlichen Protokolls und eines Satzes von Auswahlkriterien identifiziert werden, wobei bei vielen Ausführungsbeispielen die Verwendung des Algorithmus- und Auswahlverfahrens basierend darauf, wie in dem U.S.-Patent 6,251,588 beschrieben ist, von Interesse ist. So wird eine Mehrzahl unterschiedlicher Sequenzen von Interesse identifiziert, wobei jede Sequenz durch die Formel Sij beschrieben wird, wobei i das Gen von Interesse ist und j die spezifische Basis ist, bei der die Sequenz beginnt, wie oben beschrieben wurde. Nach einer Identifizierung jeder variablen oder der Sij-Sequenz, wie oben beschrieben wurde, wird eine Probesequenz für jede unterschiedliche variable oder Sij-Sequenz identifiziert, wobei die Probesequenz in vielen Ausführungsbeispielen die folgende Sequenz aufweist:
    3'-L-R-F-cV-5'
    wobei:
    L der Verbindungsbereich ist;
    R der Erkennungsbereich ist;
    F der Funktionsbereich ist; und
    cV das Komplement des variablen Bereichs ist, d. h. cSij,
    wobei jedes dieser Elemente so ist, wie oben definiert ist, und jede der Proben nur in Bezug auf ihren cV-Bereich variiert.
  • Nach einer Identifizierung der Probesequenzen, wie oben beschrieben wurde, wird eine Anordnung erzeugt, in der jede der Probesequenzen des identifizierten Satzes vorhanden ist. Die Anordnung könnte unter Verwendung eines beliebigen herkömmlichen Protokolls erzeugt werden, wobei geeignete Protokolle sowohl eine Synthese der Komplementprobe, gefolgt durch eine Aufbringung auf eine Substratoberfläche, als auch eine Synthese der Probe direkt auf der Substratoberfläche umfassen. Repräsentative Protokolle zur Anordnungssynthese sind beschrieben in: 5,242,974; 5,384,261; 5,405,783; 5,412,087; 5,424,186; 5,429,807; 5,436,327; 5,445,934; 5,472,672; 5,527,681; 5,529,756; 5,545,531; 5,554,501; 5,556,752; 5,561,071; 5,599,695; 5,624,711; 5,639,603; 5,658,734; 5,795,714; WO 93/17126; WO 95/11995; WO 95/35505; EP 742 287 und EP 799 897.
  • Nach einer Bereitstellung der bei den betreffenden Verfahren verwendeten Anordnung, wie oben beschrieben wurde, ist der nächste Schritt ein Kontaktieren der Anordnung mit einem Universal-Primer unter Hybridisierungsbedingungen, die ausreichend sind, um eine Schablonenanordnung zu erzeugen, das eine Mehrzahl von einen Überhang aufweisenden Doppelstrang-Nukleinsäuren auf seiner Oberfläche umfasst, wobei der Überhang aus dem komplementären variablen Bereich jeder Probe der Anordnung besteht. Der Universal-Primer ist in der Lage, zu dem konstanten Bereich zu hybridisieren, oder zumindest einem Abschnitt desselben (z. B. zumindest dem Abschnitt unmittelbar 3' des komplementären variablen Bereichs). Der Universal-Primer weist eine Länge auf, die ausreichend ist, um als Primer einer schablonengetriebenen Primererweiterung zu wirken, wobei die Länge des Universal-Primers allgemein von etwa 10 bis 45 nt, üblicherweise von etwa 15 bis 35 nt und noch üblicher von etwa 20 bis 30 nt variiert. Bei vielen Ausführungsbeispielen ist der Universal-Primer das Komplement des Erkennungs- und/oder Funktions-Teilbereichs des konstanten Bereichs jeder Probe auf der Anordnung. So weist bei vielen Ausführungsbeispielen der verwendete Universal-Primer eine Sequenz auf, die durch folgende Formel beschrieben ist:
    5'-cR-cF-3'
    wobei:
    cR das Komplement des Erkennungsbereichs ist; und
    cF das Komplement des Funktionsbereichs ist.
  • Wie oben erwähnt wurde, ist die durch dieses Verfahren erzeugte Schablonenanordnung eine Anordnung von Doppelstrangprobemolekülen, die aus einer ersten Nukleinsäure, die einen konstanten und einen komplementären variablen Bereich aufweist, und einer zweiten Nukleinsäure gebildet ist, die der Universal-Primer ist und zu dem konstanten Bereich hybridisiert ist (oder zumindest dem Abschnitt des konstanten Bereichs, der 3' des Variabler-Bereich-Komplements ist). So ist die durch diesen Schritt erzeugte Anordnung eine Anordnung von einen Überhang aufweisenden Doppelstrang-Nukleinsäure-, üblicherweise DANN-, Molekülen, wobei der Überhang aus dem komplementären variablen Bereich jeder Probe auf der Anordnung gebildet ist.
  • Diese Schablonenanordnung von einen Überhang aufweisenden Doppelstrangproben wird dann Primer-Erweiterungsreaktionsbedingungen unterzogen, die ausreichen, um die erwünschte Mischung von Nukleinsäuren zu erzeugen. Die spezifischen Primererweiterungsreaktionsbedingungen, denen die Schablonenanordnung von einen Überhang aufweisenden Doppelstrang-Nukleinsäuren unterzogen wird, könnten abhängig von dem bestimmten verwendeten Protokoll und/oder der spezifischen Natur der Nukleinsäuremischung, die aus demselben erzeugt werden soll, variieren. Spezifische Primererweiterungsreaktionsbedingungen von Interesse umfassen, jedoch nicht ausschließlich: eine lineare PCR (Polymerasekettenreaktion); eine Strangverschiebungsverstärkung; und eine In-vitro-Transkription. Jede dieser spezifischen Primererweiterungsreaktionsbedingungen wird nun detaillierter besprochen.
  • Wo die Schablonenanordnung Linear-PCR-Bedingungen ausgesetzt wird, wird die Anordnung in einer wässrigen Reaktionsmischung mit einer Quelle von DNA-Polymerase, dNTPs und anderen erwünschten oder erforderlichen Primererweiterungsreagenten unter Bedingungen kontaktiert, die ausreichend sind, um linear verstärkte Mengen von Nukleinsäuren zu erzeugen, z. B. unter Wärmewechselbeanspruchungsbedingungen. So ist die bei den betreffendend Verfahren verwendete Polymerase allgemein, wenn auch nicht notwendigerweise (z. B. wo eine neue Polymerase nach jedem Zyklus zugegeben wird) eine thermostabile Polymerase. Eine Vielzahl thermo stabiler Polymerasen ist Fachleuten auf dem Gebiet bekannt, wobei repräsentative Polymerasen Taq-Polymerase, Vent®-Polymerase, Pfu-Polymerase und dergleichen umfassen, jedoch nicht darauf beschränkt sind. Die Menge von Polymerase, die in der Reaktionsmischung vorliegt, könnte variieren, ist jedoch ausreichend, um für die erforderliche Menge einer Polymeraseaktivität zu sorgen, wobei die spezifische verwendete Menge ohne Weiteres durch Fachleute auf diesem Gebiet bestimmt werden könnte. Ebenso in der Reaktionsmischung vorhanden ist eine Sammlung der vier dNTPs, d. h. dATP, dCTP, dGTP und dTTP. Die dNTPs könnten in variierenden oder äquimolaren Mengen vorliegen, wobei die Menge jedes dNTP üblicherweise von etwa 10 μM bis 10 mM variiert, üblicherweise von etwa 100 μM bis 300 μM. Andere Reagenten, die in der Reaktionsmischung vorhanden sein könnten, umfassen: monovalente Kationen (z. B. Na+), divalente Kationen (z. B. Mg++), Puffer (z. B. Tris), oberflächenaktive Mittel (z. B. Triton X-100) und dergleichen. Bei diesem Linear-PCR-Ausführungsbeispiel der betreffenden Verfahren wird die Reaktionsmischung Wärmewechselbeanspruchungsbedingungen unterzogen, bei denen die Temperatur der Reaktionsmischung zyklisch durch eine Schmelz-, eine Primererweiterungs- und eine Dissoziationstemperatur geführt wird, in einer Weise, die zu der Erzeugung linear verstärkter Mengen einer Nukleinsäure für jede unterschiedliche Sequenzprobe auf der Schablonenanordnung führt. Die Schmelztemperatur variiert typischerweise von etwa 50°C bis 80°C, üblicherweise von etwa 60°C bis 75°C und wird für einen Zeitraum, der von etwa 10 Sekunden bis 10 Minuten variiert, üblicherweise von etwa 30 Sekunden bis 2 Minuten, beibehalten. Die Primererweiterungstemperatur variiert typischerweise von etwa 55°C bis 75°C, üblicherweise von etwa 60°C bis 70°C und wird für einen Zeitraum, der von etwa 30 Sekunden bis 10 Minuten, üblicherweise von etwa 1 Minute bis etwa 5 Minuten, variiert, beibehalten. Die Dissoziationstemperatur variiert typischerweise von etwa 80°C bis 99°C, üblicherweise von etwa 90°C bis 95°C und wird für einen Zeitraum, der von etwa 1 Sekunde bis 2 Minuten, üblicherweise von etwa 30 Sekunden bis 1 Minute, variiert, beibehalten.
  • Bei einer Strangverschiebungsverstärkung wird die Anordnung von einen Überhang aufweisenden Doppelstrangnukleinsäuren als geprimte Schablone bei Linearverstärkungsvariationen der Exponentialverstärkungsprotokolle verwendet, die beschrieben sind in Walker und andere, Nucleic Acids Res. (1992) 20: 1691–1696 und Walker und andere, Proc. Nat'l Acad. Sci. USA (1992) 89: 392–396; sowie U.S.-Patent Nr. 5,648,211. Kurz gesagt wird eine isotherme lineare Verstärkung wie folgt erzielt. Nach einer Erzeugung der Anordnung von einen Überhang aufweisenden Doppelstrangnukleinsäuren wird die Schablonenanordnung einem Zyklus eines Strangeinkerbens des Universal-Primers nach einer Sequenz cR unterzogen, üblicherweise durch die Verwendung einer Ristriktions-Endonuklease. Allgemein ist der Schablonenstrang oder die Probesequenz über eine geeignet platzierte Phosphorthioat-Verbindung in dem oberflächengebundenen Schablonenstrang geschützt. Eine Erweiterung des 3'-Endes, das durch die Einkerbung frei liegt, darf dann durch ein Verwenden einer DNA-Polymerase fortgeführt werden, der eine 5' → 3'-Exonuklease-Aktivität fehlt, die jedoch eine Strangverschiebungsaktivität besitzt, z. B. Klenow-Fragment. Jeder Zyklus bei diesem Protokoll löst ein Nukleinsäuremolekül, das folgende Formel aufweist: 5'-cF-Sij-3'. Bei verschiedene Varianten dieses Verfahrens könnte das Einkerben dadurch erzielt werden, dass R zu einem Halb-Ort für eine Ristriktions-Endonuklease gemacht wird, die eine Einstrang-Spaltaktivität zeigt, oder indem eine Einkerbungs-Endonuklease verwendet wird, wie z. B. N.BstNBI und dergleichen.
  • Bei wiederum anderen Ausführungsbeispielen wird die betreffende Schablonenanordnung von Doppelstrang-Nukleinsäuren bei einem In-vitro-Transkriptionsverfahren eingesetzt. Bei diesem Ausführungsbeispiel wird die Schablonenanordnung aus demjenigen, das oben beschrieben wurde, modifiziert, um die folgende Formel aufzuweisen:
    (Oberfläche)-L-R-(C)Sij-F-5'
    wobei:
    L und R so sind, wie oben definiert wurde;
    F ein RNA-Polymerase-Promotor ist, z. B. T3- oder T7-Promotor; und
    (C) Sij Sij ist, das modifiziert ist, um in einem C-Rest zu enden.
  • Der bei dieser Anordnung eingesetzte Universal-Primer weist die Formel 5'-cR-3' auf. Wenn die Schablonenanordnung mit NTPs kontaktiert wird, werden eine T3- oder T7-Polymerase und der geeignete Transkriptionspuffer, Ribonukleinsäuren der Formel 5'-(rG)rcSij-rcF-3' erzeugt, wobei r für Ribonukleotid steht. Durch ein Kontaktieren dieser resultierenden Mischungen von Ribonukleinsäuren mit dem DNA-Primer 5'-F-3' und einer Umkehrtraskriptase wird eine Mischung von Deoxyribonukleinsäuren, geeignet zur Verwendung als Primer in Ziel-Erzeugungsprotokolle ist, erzeugt.
  • Die betreffenden Schablonenanordnungen könnten auch in anderen Nukleinsäure-Primererweiterungserzeugungsprotokollen verwendet werden – wobei die obigen lediglich darstellend für die Protokolle sind, in denen die betreffenden Schablonenanordnungen Verwendung finden.
  • Die oben beschriebenen Primererweiterungserzeugungsverfahren auf Anordnungsschablonenbasis führen zu der Erzeugung einer Mischung von Nukleinsäuren, üblicherweise einer Mischung von Deoxyribonukleinsäuren, wobei jeder der unterschiedlichen komplementären variablen Bereiche der Schablonenanordnung in der Mischung dargestellt wird, d. h. es gibt zumindest eine Nukleinsäure in der Mischung, die einen variablen Bereich aufweist, der unter strengen Bedingungen zu jedem unterschiedlichen komplementären variablen Bereich, der auf der Anordnung vorliegt, hybridisiert. Die Länge jeder der Nukleinsäuren, die in der resultierenden Mischung vorliegen, variiert typischerweise von etwa 20 bis 60 nt, üblicherweise von etwa 25 bis 55 nt und noch üblicher von etwa 30 bis 50 nt. Aufgrund der Art und Weise, auf die die betreffenden Mischungen von Nukleinsäuren erzeugt werden, könnten die resultierenden Mischungen von Nukleinsäuren als Mischungen genspezifischer Primer betrachtet werden, wobei die genspezifischen Primer spezifisch für jedes der unterschiedlichen Gene sind, die auf der Schablonenanordnung, die bei der Erzeugung der Nukleinsäuremischung verwendet wird, dargestellt sind. Bei bestimmten Ausführungsbeispielen könnte die Mischung in Bezug auf eine gegebene mRNA-Population, wie oben beschrieben wurde, „genormt" sein.
  • Die Nukleinsäuremischungen, die durch die betreffenden Verfahren erzeugt werden, finden Verwendung in einer Vielzahl unterschiedlicher Anwendungen und sind insbesondere geeignet zur Verwendung als Primer bei der Erzeugung von Zielnukleinsäuren, z. B. für anordnungsbasierte Differenz-Genausdrucksanalyseanwendungen. Wo die betreffenden Nukleinsäuremischungen als Primer für eine Ziel-Erzeugung bei Genausdrucksanalysen verwendet werden, ist der erste Schritt ein Erzeugen einer Population von Ziel-Nukleinsäuren aus einer anfänglichen mRNA-Quelle oder einem -Muster. Mit Ziel-Nukleinsäure ist eine Nukleinsäure gemeint, die eine Sequenz aufweist, z. B. Sij, die entweder gleich wie oder komplementär zu der Sequenz eines mRNA ist, die in einem anfänglichen Muster zu finden ist, wobei das Ziel DNA oder RNA sein könnte und verglichen mit der anfänglichen Menge an mRNA in verstärkten Mengen vorhanden sein könnte, abhängig von dem bestimmten Zielerzeugungsprotokoll, das eingesetzt wird.
  • Bei den betreffenden Verfahren werden die Ziel- oder Bild-Nukleinsäuren aus den betreffenden Nukleinsäuremischungen allgemein durch enzymatische Erzeugungsprotokolle erzeugt. Insbesondere werden die Ziel-Nukleinsäuren üblicherweise unter Verwendung von schablonenabhängigen Polymerisationsprotokollen und einer anfänglichen mRNA-Quelle erzeugt. Die anfängliche mRNA-Quelle könnte in einer Vielzahl unterschiedlicher Muster vorliegen, wobei das Muster üblicherweise von einer physiologischen Quelle hergeleitet wird. Die physiologische Quelle könnte von einer Vielzahl eukariotischer oder prokariotischer Quellen hergeleitet sein, wobei physiologische Quellen von Interesse Quellen umfassen, die aus einzelligen Organismen hergeleitet sind, wie z. B. Hefe, und aus mehrzelligen Organismen, wie z. B. Pflanzen und Tieren, insbesondere Säugetieren, wobei die physiologischen Quellen von mehrzelligen Organismen von bestimmten Organen oder Geweben des mehrzelligen Organismus hergeleitet sein könnten oder aus isolierten Zellen, die von denselben hergeleitet werden. Beim Erhalten des Musters zu analysierender RNA von der physiologischen Quelle, von der dieselbe hergeleitet ist, könnte die physiologische Quelle einer Anzahl unterschiedlicher Verarbeitungsschritte unterzogen werden, wobei derartige Verarbeitungsschritte eine Gewebehomogenisierung, eine Zelltrennung und Cytoplasmaextraktion, Nukleinsäureextraktion oder dergleichen umfassen könnten, wobei derartige Verarbeitungsschritte Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt sind. Verfahren zum Trennen einer RNA von Zellen, Geweben, Organen oder ganzen Organismen sind Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt und sind in Maniatis u. a. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2d Ed. (Cold Spring Harbor Press) beschrieben.
  • Eine Anzahl unterschiedlicher enzymatischer Protokolle zum Erzeugen von Bild- oder Ziel-Nukleinsäuren aus einem anfänglichen mRNA-Muster ist bekannt und wird fortwährend entwickelt. Jedes bequeme Protokoll könnte verwendet werden, wobei das bestimmte verwendete Protokoll zumindest teilweise von einer Anzahl von Faktoren abhängt, die umfassen: ob man verstärkte Mengen einer Ziel- oder Bild-Nukleinsäure erzeugen möchte; ob man geometrisch oder linear verstärkte Mengen einer Ziel-Nukleinsäure erzeugen möchte; ob eine Vorspannung in der Zielmenge toleriert werden kann, usw. Ein häufiges Merkmal der Protokolle, die bei der Herstellung der Bild- oder Ziel-Nukleinsäuren der betreffenden Erfindung Verwendung finden, ist die Verwendung der betreffenden Nukleinsäuremischungen, die unter Verwendung anordnungsbasierter Schablonenprotokolle erzeugt werden, wie oben beschrieben wurde, als Primer.
  • Eine Anzahl von Nukleinsäureverstärkungsverfahren kann eingesetzt werden, um die Zielnukleinsäure aus einer anfänglichen mRNA-Quelle zu erzeugen, wobei diese Verfahren die betreffenden Nukleinsäuremischungen als Primer verwenden können. Derartige Verfahren umfassen die „Polymerasekettenreaktion" (PCR), wie in dem U.S.-Patent Nr. 4,683,195 beschrieben ist, sowie eine Anzahl transkriptionsbasierter Exponentialverstärkungsverfahren, wie z. B. diejenigen, die in den U.S.-Patenten Nr. 5,130,238; 5,399,491 und 5,437,990 beschrieben sind. Jedes dieser Verfahren verwendet eine primerabhängige Nukleinsäuresynthese, um ein DNA- oder RNA-Produkt zu erzeugen, das als eine Schablone für nachfolgende Runden einer primerabhängigen Nukleinsäuresynthese dient. Jeder Vorgang verwendet (zumindest) zwei Primersequenzen, die komplementär zu unterschiedlichen Strängen einer erwünschten Nukleinsäuresequenz sind, und führt zu einem exponentiellen Anstieg der Anzahl von Kopien der Zielsequenz.
  • Alternativ könnten Verstärkungsverfahren, die einen einzelnen Primer verwenden, eingesetzt werden, um Ziel- oder Bild-Nukleinsäuren aus einem anfänglichen mRNA-Muster zu erzeugen, wobei die betreffenden Nukleinsäuremischungen als Primer verwendet werden. Siehe z. B. U.S.-Patent Nr. 5,554,516 und 5,716,785. Die Verfahren, die in diesen Patenten berichtet sind, verwenden einen einzelnen Primer, der eine RNA-Polymerase-Promotor-Sequenz und eine Sequenz beinhaltet, die komplementär zu dem 3'-Ende der einen oder der mehreren erwünschten Nukleinsäure-Zielsequenzen („Pro motor-Primer") ist. Bei beiden Verfahren wird der Promotor-Primer unter Bedingungen zugegeben, bei denen derselbe zu der einen oder den mehreren Zielsequenzen hybridisiert und in ein Substrat für RNA-Polymerase umgewandelt wird. Bei beiden Verfahren wird das Substrat-Zwischenprodukt durch eine RNA-Polymerase erkannt, die mehrere Kopien einer RNA, die komplementär zu der einen oder den mehreren Zielsequenzen ist, erzeugt („cRNA").
  • Welcher Vorgang auch immer verwendet wird, um die Ziel-Nukleinsäure zu erzeugen, wobei repräsentative Protokolle direkt oben bereitgestellt wurde, der Vorgang könnte modifiziert werden, um die Verwendung chemischer Gegenstücke von Nukleotiden zu umfassen, die modifiziert wurden, um eine Etikett-Moietät zu umfassen, z. B. ein organisches Fluorophor, ein isotopes Etikett, einen Erfassungsliganden, z. B. Biotin, usw. Als ein Ergebnis sind die Ziel-Nukleinsäuren, die unter Verwendung der betreffenden Nukleinsäuremischungen als Primer erzeugt werden, entweder direkt oder indirekt zur Verwendung bei nachfolgenden Hybridisierungsuntersuchungen oft etikettiert.
  • Die obigen Zielerzeugungsprotokolle sind lediglich darstellend und keinesfalls inklusive aller unterschiedlichen Typen von Protokollen, in denen die betreffenden Nukleinsäuremischungen Verwendung als Primer finden.
  • Die resultierenden Populationen von Ziel-Nukleinsäuren finden unter anderem Verwendung als Ziel bei Hybridisierungsuntersuchungen, wie z. B. Genausdrucksanalyseanwendungen. Genausdrucksanalyseprotokolle sind Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt und die Populationen von Ziel-Nukleinsären, die durch die betreffenden Verfahren erzeugt werden, finden in vielen, wenn nicht allen dieser Protokolle Verwendung. Bei Genausdrucksanalyseprotokollen, die die betreffenden Populationen eines etikettierten Ziels verwenden, wird die Population des etikettierten Ziels typischerweise mit einer Population von Probenukleinsäuren, z. B. auf einer Anord nung, unter Hybridisierungsbedingungen, üblicherweise strengen Hybridisierungsbedingungen, kontaktiert. Die Anordnung könnte die gleiche Anordnung sein, die als die Schablonenanordnung verwendet wird, oder eine unterschiedliche Anordnung. Nach einer Hybridisierung wird ein nicht-gebundenes Ziel entfernt oder von der Probe getrennt, z. B. durch Waschen. Ein Waschen führt zu einer Struktur eines hybridisierten Ziels, das unter Verwendung eines passenden Protokolls, z. B. mit einer fluoreszierenden Scannervorrichtung, gelesen werden könnte. Aus dieser Struktur könnten Informationen bezüglich des mRNA-Ausdrucksprofils in dem anfänglichen mRNA-Muster, aus dem die Zielpopulation erzeugt wurde, ohne Weiteres hergeleitet oder abgeleitet werden.
  • Bei bestimmten Ausführungsbeispielen umfassen die betreffenden Verfahren einen Schritt eines Übertragens von Daten von zumindest einem der Erfassungs- und Herleitungsschritte, wie oben beschrieben wurde, an einen entfernten Ort. Mit „entfernter Ort" ist ein anderer Ort als der Ort gemeint, an dem die Anordnung vorliegt und eine Hybridisierung auftritt. Ein entfernter Ort könnte z. B. ein weiterer Ort (z. B. Büro, Labor, usw.) in der gleichen Stadt sein, ein anderer Ort in einer unterschiedlichen Stadt, ein anderer Ort in einem unterschiedlichen Staat, ein anderer Ort in einem unterschiedlichen Land, usw. Die Daten könnten zur weiteren Bewertung und/oder Verwendung an den entfernten Ort übertragen werden. Jedes passende Telekommunikationsmittel könnte zum Übertragen der Daten verwendet werden, z. B. Faksimile, Modem, Internet, usw.
  • Ebenso offenbart sind Ausrüstungen zur Verwendung bei der Herstellung der betreffenden Zielpopulationen von Nukleinsäuren. Die Ausrüstungen könnten Behälter aufweisen, jeder mit einem oder mehreren der verschiedenen Reagenten (typischerweise in konzentrierter Form), die bei den Verfahren eingesetzt werden, z. B. einschließlich Puffern, dNTPs, Umkehrtraskriptase, usw., wobei die Ausrüstungen zumindest eine ausreichende Menge eines Universal-Primers umfassen, z. B. eine Menge, die von etwa 25 pmol bis 25 μmol variiert. Zusätzlich könnten die betreffenden Ausrüstungen eine Anordnung einsträngiger Probe-Nukleinsäuren (oder eine Einrichtung zum Herstellen derselben) umfassen, wobei jede Probe eine konstante Region und eine komplementäre variable Region aufweist, wie oben beschrieben wurde. Wo die Ausrüstung eine Einrichtung zum Erzeugen der Schablonenanordnung aufweist, umfasst die Ausrüstung üblicherweise ein Substrat mit einer planaren Oberfläche und eines oder mehrere Reagenten, die zur Synthese der Proben nötig sind, die abhängig von der Natur des zur Erzeugung der Anordnung zu verwendenden Protokolls variieren könnten. Die Ausrüstungen könnten ferner Reagenten umfassen, die zur Erzeugung etikettierter Ziel-Nukleinsäuren notwendig sind, wobei derartige Reagenten Umkehrtraskriptase, etikettierte dNTPs, usw. umfassen könnten. Ein Satz Instruktionen ist typischerweise ebenso enthalten, wobei die Instruktionen einer Paketeinfügung und/oder dem Paketieren der Ausrüstung oder der Komponenten desselben zugeordnet sein könnten.
  • Die folgenden Beispiele werden darstellend und nicht als Einschränkung vorgelegt.
  • Experimentell
  • Beispiel
  • Um die Machbarkeit einer Verwendung einer Oligonukleotid-Anordnung als eine Schablone zur enzymatischen Polynukleotidsynthese zu zeigen, wurde das folgende Experiment durchgeführt:
    • 1. Eine In-Situ-Oligonukleotid-Anordnung wurde hergestellt; die Anordnung beinhaltete 8455 (89 × 95) Merkmale (Durchmesser ~100 μm) mit der folgenden Sequenz:
      Figure 00270001
      In der obigen Sequenz zeigen die grobgestrichelten Unterstreichungen die eindeutige Sequenz cSij an, die kleinen Strichelungen zeigen die Erkennungs/Funktionssequenz F-R an (in diesem Fall eine T7-RNA-Polymerase-Promotor) und die durchgezogene Unterstreichung zeigt eine Verbindersequenz Q an.
    • 2. Die Anordnung wurde eine Stunde lang bei 60°C zu dem folgenden Oligonukleotid (PT7, 250 nM) hybridisiert.
      Figure 00270002
      d. h. der komplementäre Strang des T7-Promotor-Abschnitts des Oligonukleotid auf der Operfläche. Der Zweck dieser Behandlung bestand darin, einen doppelsträngigen T7-Promotor zu erzeugen, der für eine T7-RNA-Polymerase-Aktivität notwendig ist (es wird angemerkt, dass kein doppelsträngiger Schablonenstrang notwendig ist; eine 5'-überhängende einsträngige Schablone ist als ausreichend bekannt).
    • 3. Die Anordnung wurde kurz mit eiskaltem Wasser (um Salze aus dem Hybridisierungspuffer zu entfernen) gewaschen und mit Stickstoff trockengeblasen. Die Hybridisierungskammer wurde wieder aufgebaut und mit einer Transkriptionsmischung (250 μl) gefüllt, die einen T7-Transkriptionspuffer (einschließlich NTPs), T7-RNA-Polymerase, 1% Triton X-100 und das Oligonukleotid aus Schritt 2 (250 nM) enthielt. Die Anordnung wurde über Nacht bei 40°C inkubiert. Eine identische Positiv-Vergleichsprobenanordnung wurde ebenso in einem Kontakt mit der gleichen Transkriptionsmischung inkubiert, wobei eine lösliche Version des anordnungsgebunden Oli gonukleotids aus Schritt 1 zugegeben wurde (HCV185; 250 nM). Schließlich wurde eine zweite Positivvergleichsprobenmischung in einem PCR-Rohr inkubiert.
    • 4. Die Traskriptionsmischungen wurden aus dem experimentellen und der Positivvergleichsprobenanordnung entfernt. Die Hälfte jeder Anordnungsmischung wurde unter Verwendung eines Microcon-3-Ultrafiltrationskonzentrierers > 10× konzentriert.
    • 5. Die verschiedenen Muster wurden auf einem 15%igen Polyacrylamid/4 M-Harnstoff-Gel analysiert, mit Ethidium-Bromid eingefärbt und durch Fluoreszenz sichtbar gemacht. Die Ergebnisse sind in 1 bereitgestellt.
  • Die in 1 bereitgestellten Ergebnisse zeigen klar eine sichtbare Abschrift in dem konzentrierten experimentellen Anordnungsmuster (Bahn 2). Separate Negativvergleichsprobenexperimente zeigten, dass Reaktionen, die das komplementäre Oligonukleotid PT7 oder die T7-RNA-Polymerase wegließen, keine sichtbaren Bänder bei einem ähnlichen Gel erzeugten (Daten nicht gezeigt). Die Microcon-Konzentration von etwa 80 μl von 250 nM PT7-Oligo konnte ebenso kein sichtbares Band bei einem ähnlichen Gel ergeben (Daten nicht gezeigt). So hängt die beobachtete Gelstruktur von dem Vorliegen der T7-RNA-Polymerase und eines doppelsträngigen T7-Promotors ab und ist nicht infolge des hinzugefügten Oligonukleotids PT7 so. Ferner zeigt das Hauptprodukt einer Transkription von einer anordnungsgebundenen Schablone die gleiche Gelmigrationsrate wie das Hauptprodukt von Positivvergleichsprobentranskriptionsreaktionen. Die wahrscheinlichste Erklärung für die beobachteten Daten ist, dass wir eine Praktizierung der T7-RNA-Polymeraseversion einer enzymatischen Oligonukleotidproduktion von einer Anordnungsschablone reduziert haben.
  • Es ist ersichtlich, das die betreffende Erfindung eine Anzahl von Vorteilen gegenüber gegenwärtigen Ziel-Nuklein säureerzeugungsprotokollen schafft. Diese Vorteile umfassen die Bereitstellung eines wirtschaftlichen und schnellen Syntheseverfahrens für kundenspezifische Primer-Mischungen, die insbesondere geeignet zur Verwendung bei einer Ziel-Erzeugung zur Verwendung bei den Nukleinsäureanordnungen sind. Ein Verwenden der betreffenden Verfahren führt zu einer erhöhten Spezifität bei Untersuchungen auf Mikroanordnungsbasis. Unter Verwendung der betreffenden Verfahren könnten Untersuchungen auf Mikroanordnungsbasis entwickelt werden, bei denen die Mikroanordnung speziell empfindlich oder unempfindlich gegenüber verschiedenen Spleißungsvarianten unterschiedlicher Gene von Interesse gemacht ist, selbst dort, wo die Spleißungsvariante nahe an dem 5'-Ende der Codierungssequenz vorhanden ist. Ein allel-spezifisches mRNA-Profilieren ist mit den betreffenden Verfahren durch ein Auswählen der variablen Region möglich, so dass das 3'-Ende des erzeugten Primers an einer Base hybridisiert, wo die beiden Allele unterschiedlich sind. Zusätzlich können die betreffenden Verfahren eingesetzt werden, um ohne Weiteres genormte Ziel-Nukleinsäuremischungen zu erzeugen. Entsprechend stellt die Erfindung einen wesentlichen Beitrag zu der Technik dar.
  • Die Nennung von Veröffentlichungen dient deren Offenbarung vor dem Anmeldedatum und sollte nicht als ein Zugeständnis dessen aufgefasst werden, dass die vorliegende Erfindung nicht berechtigt ist, einen früheren Zeitraum einer derartigen Veröffentlichung Kraft einer früheren Erfindung zu beanspruchen.
  • Obwohl die vorangegangene Erfindung mit bestimmten Details mittels Darstellung und Beispiel zu Zwecken eines klaren Verständnis beschrieben wurde, ist für Fachleute auf diesem Gebiet ohne Weiteres angesichts der Lehren dieser Erfindung zu erkennen, dass bestimmte Veränderungen und Modifizierungen an derselben vorgenommen werden könnten, ohne von dem Schutzbereich der beigefügten Ansprüche abzuweichen.
  • Sequenzauflistung
    Figure 00300001

Claims (10)

  1. Ein Verfahren zum Erzeugen einer Mischung einsträngiger Primer-Nukleinsäuren, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: (a) Bereitstellen einer Anordnung verschiedener einsträngiger Probenukleinsäuren mit unterschiedlichen Sequenzen, wobei jede verschiedene Probe, die in der Anordnung vorhanden ist, einen konstanten Bereich und einen komplementären variablen Bereich aufweist; (b) Kontaktieren der Anordnung einsträngiger Probenukleinsäuren mit Nukleinsäuren, die komplementär zu dem konstanten Bereich sind, unter Hybridisierungsbedingungen, wodurch eine Schablonenanordnung von einen Überhang aufweisenden doppelten Nukleinsäuren erzeugt wird, wobei jede einen Überhang aufweisende doppelte Nukleinsäure der Anordnung einen doppelsträngigen Konstante-Region- und einen einsträngigen Variable-Region-Überhang aufweist; und (c) Aussetzen der Schablonenanordnung der einen Überhang aufweisenden doppelten Nukleinsäuren gegenüber: einer linearen PCR, einer Strangverschiebungsverstärkung oder einem In-Vitro-Transkriptionsprotokoll; um die Mischung einsträngiger Primer-Nukleinsäuren zu erzeugen.
  2. Ein Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, bei dem die Mischung von Nukleinsäuren eine Mischung von Deoxyribo-Oligonukleotiden ist.
  3. Ein Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, bei dem der Überhang aus dem komplementären variablen Bereich der Probenukleinsäure der Anordnung besteht.
  4. Ein Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, bei dem die Sequenz jeder verschiedenen Nukleinsäure in der Mischung bekannt ist.
  5. Ein Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, bei dem jede verschiedene oberflächenimmobilisierte einsträngige Probe, die in der Anordnung vorliegt, durch folgende Formel beschrieben ist: Oberfläche-L-R-F-cV-5' wobei: L ein Verbindungsbereich ist; R ein Erkennungsbereich ist; F ein Funktionsbereich ist; und cV ein Komplementärbereich ist, der eine Sequenz aufweist, die unter strengen Bedingungen zu einem variablen Bereich eines der verschiedenen Oligonukleotide der Mehrzahl hybridisiert; und wobei die Nukleinsäuren, die komplementär zu dem konstanten Bereich sind, folgende Formel aufweisen: 5'-cR-cF-3' wobei: cR das Komplement von R ist; und cF das Komplement von F ist.
  6. Ein Verfahren gemäß Anspruch 5, bei dem der Verbinderbereich eine Länge von 0 bis 10 Basen aufweist.
  7. Ein Verfahren gemäß Anspruch 5 oder 6, bei dem der Funktionsbereich ein RNA-Polymerase-Promotorbereich ist.
  8. Ein Verfahren gemäß Anspruch 5, 6 oder 7, bei dem der Erkennungsbereich durch eine Restriktions-Endonuklease erkannt wird.
  9. Ein Verfahren zum Herstellen einer Population von Ziel-Nukleinsäuren aus einem anfänglichen mRNA-Muster, wobei das Verfahren folgende Schritte aufweist: (a) Erzeugen einer Mischung von Primer-Nukleinsäuren gemäß dem Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8; und (b) Verwenden der Mischung von Nukleinsäuren als Primer in einem Zielerzeugungsschritt, bei dem Ziel-Nukleinsäuren aus dem mRNA-Muster erzeugt werden; wodurch die Population von Ziel-Nukleinsäuren erzeugt wird.
  10. Eine Hybridisierungsuntersuchung mit folgenden Schritten: (a) Erzeugen eines Satzes von Ziel-Nukleinsäuren gemäß dem Verfahren aus Anspruch 9; (b) Kontaktieren des Satzes von Ziel-Nukleinsäuren mit einer Anordnung von Probe-Nukleinsäuren unter Hybridisierungsbedingungen; und (c) Erfassen des Vorliegens von Ziel-Nukleinsäuren, die zu Probe-Nukleinsäuren der Anordnung hybridisiert sind.
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