DE60115203T2

DE60115203T2 - Beschichtete implantate

Info

Publication number: DE60115203T2
Application number: DE60115203T
Authority: DE
Inventors: Gerald Laurence Farnham HUGHES; Terrence Albert Weydon Lane VICK; Jin Hai Weydon Lane WANG
Original assignee: Biocompatibles UK Ltd
Current assignee: Biocompatibles UK Ltd
Priority date: 2000-01-24
Filing date: 2001-01-24
Publication date: 2006-08-03
Anticipated expiration: 2021-01-25
Also published as: AU2001228653A1; US20030086957A1; US20040197585A1; JP5000826B2; EP1250164B1; ATE310542T1; WO2001052915A1; EP1250164A1; JP2003520107A; DE60115203D1; US6746686B2

Description

Diese Erfindung betrifft Implantate, insbesondere Stents, hauptsächlich für die Einführung in Blutgefäße, die aber auch zur Einführung in andere Körperlumina nützlich sind und eine Beschichtung aus einem biokompatiblen Hydrogel-Polymer aufweisen, das als Reservoir verwendet wird, aus dem Arzneistoffe direkt der Wand des Gefäßes zugeführt wird, in dem der Stent angeordnet ist.
In unserer früheren WO-A-0101957, die am Prioritätsdatum hiervon nicht veröffentlicht war, beschreiben wir Stents mit Beschichtungen aus biokompatiblen vernetzten Polymeren, die unmittelbar vor der Einführung in einen Patienten in Arzneistoffstoff-haltigen Lösungen gequollen werden. Der Arzneistoff wird von dem gequollenen Hydrogel absorbiert und über längere Zeitspannen aus dem implantierten Stent freigesetzt. Das in diesen Anmeldungen beschriebene System ist in Europa für die Vermarktung zur Verwendung mit Arzneistoffen mit Molekulargewichten bis zu 1200 D zugelassen. Beispiele für derartige Arzneistoffe umfassen Dipyridamol, Dicloxacillin, Vitamin B12 und Angiopeptin.
In unserer früheren Anmeldung Nr. WO-A-98/22516 beschreiben wir Polymere, die aus ethylenisch ungesättigten Monomeren gebildet sind, welche ein kationisches Monomer und ein zwitterionisches Monomer einschließen, und zur Bereitstellung von biokompatiblen Beschichtungen auf verschiedenen Substraten nützlich sind. Die kationischen Polymere ziehen anionische Mucopolysaccharide an. Ein Stent, der mit dem Polymer beschichtet ist, kann als Abfangvorrichtung verwendet werden, um systemisches Heparin aus dem Kreislauf eines Patienten zu entfernen. Alternativ wird vorgeschlagen, dass die Vorrichtung beispielsweise mit Heparin vorbeladen werden kann, um eine verlängerte Freisetzung des Arzneistoffs aus einem implantierten Stent in einen Kreislauf zu ermöglichen.
In der EP-A-0809999 wird Heparin unter Verwendung des Carmeda CH5-Heparin-Beschichtungssystems kovalent an einen Stent gebunden.
Angiogenetische Verbindungen sind aus Stents zugeführt worden, um stenotische Läsionen zu behandeln. In der WO-A-97/47253 beispielsweise werden angiogenetische Verbindungen nach einer Strahlungsbehandlung des Herzens zugeführt. Die Zufuhr kann aus einem Stent geschehen, der mit einem Polymer beschichtet ist.
In der US-A-5954706 wird ein anionisches Hydrogel auf einen Stent aufgetragen, eine einwertige kationische Verbindung, wie eine Benzalkonium-Verbindung, wird über dem Hydrogel aufgetragen, und Heparin wird mit der kationischen Verbindung in Kontakt gebracht und elektrostatisch daran gebunden.
Sense- und Anti-Sense-DNA sind in Verbindung mit einer Stent-Anordnung in der WO-A-98/15575 glatten Muskelzellen zugeführt worden. Die DNA kann ein angiogenetisches Protein codieren.
In der US-A-5674192 werden Nukleinsäuren und monoklonale Antikörper zugeführt, indem sie aus einer gequollenen Hydrogel-Beschichtung auf einem Ballon-Katheter ausgedrückt werden. Die Nukleinsäuren können Antisense-Oligonukleotide oder virale Vektoren sein. Bei dem Hydrogel kann es sich um eine Polycarbonsäure, wie Polyacrylsäure, handeln. Nukleinsäure wird den Zellen der Gefäßwand zugeführt.
Ein neues Implantat gemäß der Erfindung weist auf seiner äußeren Oberfläche eine Beschichtung auf, welche umfasst:

a) eine vernetzte, in Wasser quellbare biostabile Polymermatrix und
b) eine pharmazeutisch aktive Verbindung, bei der es sich um eine Nukleinsäure handelt,

Bei den Nukleinsäuren kann es sich um DNA oder RNA handeln, und sie können linear oder ringförmig, einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Die Nukleinsäure kann ein pharmazeutisch nützliches Polypeptid oder Protein codieren, oder sie kann ein Antisense-Oligonukleotid sein, das verwendet wird, um das interessierende Gen in der Zelle zu steuern, welcher die Nukleinsäure zugeführt wird. Eine Nukleinsäure, die ein nützliches Polypeptid oder Protein codiert, kann Kontrollregionen oder andere Sequenzen einschließen, um die Expression des Gens und/oder dessen Zufuhr in die Zelle und/oder den Transport des Proteins zu seinem Ziel zu ermöglichen. Oligonukleotide, die an andere aktive Stoffe konjugiert sind, zum Beispiel für Targeting-Zwecke, werden ebenfalls nützlich durch diese Erfindung zugeführt.
Eine besonders interessierende Gen-Klasse, die durch die Erfindung zugeführt wird, codiert angiogenetische Faktoren, wie vaskuläre Endothelwachstumsfaktoren oder Fibroblasten-Wachstumsfaktoren oder aus Blutplättchen gewonnene Wachstumsfaktoren. Geeignete Kontrollsequenzen können spezifisch die Expression in glatten Muskelzellen regeln. Zum Beispiel können die Kontrollsequenzen so beschaffen sein, wie es in der WO-A-98/15575 beschrieben ist. Oligonukleotide, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, weisen zum Beispiel mindestens 5 Basen, bevorzugt mindestens 15 Basen auf.
Es wird bevorzugt, obwohl es nicht unabdingbar ist, dass die Polymermatrix eine Trockendicke von mindestens 0,1 μm aufweist. Weiter wird es bevorzugt, obwohl es nicht unabdingbar ist, dass die Polymermatrix in Wasser quellbar ist. Wir haben gefunden, dass anionische Wirkstoffe, wie Nukleinsäuren und Proteine, insbesondere jene mit Molekulargewichten von mehr als 1 kD, hauptsächlich an der Oberfläche eines Polymers mit kationischen Gruppen und zwitterionischen Gruppen adsorbiert werden, während wenig in den Körper des Polymers absorbiert wird. Aus diesem Grund sind die Quellbarkeit und die Dicke von weniger Bedeutung.
Das Implantat ist bevorzugt ein Stent. Im Rest dieser Beschreibung wird die Vorrichtung mit Bezug auf Stents beschrieben, aber es versteht sich, dass andere Implantate anstelle von Stents eingesetzt werden können.
Die Vernetzung der Polymer-Matrix stabilisiert die Beschichtung auf den Stent, wobei sie diese biostabil macht. Die Einstellung der Vernetzungsdichte liefert eine gewisse Kontrolle über das Ausmaß, in dem das Polymer in einem Quellungslösungsmittel, gewöhnlich wässriger Natur, quillt. Die Vernetzungsdichte beeinflusst weiter die Porengröße der Polymermatrix. Man nimmt an, dass die Porengröße wiederum die maximale Molekülgröße von pharmazeutisch aktiven Verbindungen beeinflusst, die von der Matrix absorbiert werden können. Es wird bevorzugt, dass das Polymer aus ethylenisch ungesättigten Monomeren gebildet wird, die weniger als 20 Mol% vernetzbares Monomer einschließen.
Das in der vorliegenden Erfindung verwendete Polymer wird bevorzugt aus ethylenisch ungesättigten Monomeren gebildet, welche einschließen:

a) ein zwitterionisches Monomer der Formel I YBX Iin der B eine Bindung oder eine gerade oder verzweigte Alkylen-, Alkylen-oxa-alkylen- oder Alkylen-oligooxa-alkylen-Gruppe ist, von denen jede gegebenenfalls einen oder mehrere Fluor-Substituenten einschließt; X eine organische Gruppe mit einer zwitterionischen Einheit ist; und Y eine ethylenisch ungesättigte polymerisierbare Gruppe ist;
b) ein kationisches Monomer der Formel II Y¹B¹Q¹ IIin der B¹ eine Bindung oder eine gerade oder verzweigte Alkylen-, Alkylen-oxa-alkylen- oder Alkylen-oligooxa-alkylen-Gruppe ist, von denen jede gegebenenfalls einen oder mehrere Fluor-Substituenten einschließt; Y¹ eine ethylenisch ungesättigte polymerisierbare Gruppe ist; und Q eine organische Gruppe mit einer kationischen oder kationisierbaren Einheit ist, und
c) ein vernetzbares Monomer mit der allgemeinen Formel IV: Y³B³Q³ IVin der B³ eine Bindung oder eine gerade oder verzweigte Alkylen-, Alkylen-oxa-alkylen- oder Alkylen-oligooxa-alkylen-Gruppe ist, von denen jede gegebenenfalls einen oder mehrere Fluor-Substituenten einschließt; Y³ eine ethylenisch ungesättigte polymerisierbare Gruppe ist; und Q³ eine organische Gruppe mit einer reaktiven Gruppe ist, die das Polymer vernetzen kann.

Bevorzugte reaktive Comonomere IV, die verwendet werden, um das Comonomer zu vernetzen, sind jene, in denen Q³ eine vernetzbares Cinnamyl-, Epoxy-, -CHOHCH₂Hal- (worin Hal ein Halogenatom ist), Methylol-, reaktive Silyl-, eine ethylenisch ungesättigte vernetzbare Gruppe, wie eine acetylenische, diacetylenische, vinylische oder divinylische Gruppe, oder eine Acetacetoxy- oder Chloralkylsulfon-, bevorzugt Chlorethylsulfongruppe enthält. Für eine optimale Vernetzung wird ein Monomer, das eine reaktive Silylgruppe (z.B. eine Gruppe -SiR⁴ ₃, worin jedes R⁴ eine C_1-4-Alkoxygruppe oder ein Halogenatom ist) einschließt, in Kombination mit einem weiteren Monomer verwendet, das eine Hydroxylgruppe einschließt, z.B. mit der Formel IV' Y³B³Q⁴ IV'worin Y³ und B³ wie in der Verbindung IV definiert sind und Q⁴ eine Hydroxylgruppe ist.
Die ethylenisch ungesättigten Monomere, aus denen das Polymer gebildet ist, können weiter ein Termonomer der Formel III Y²B²Q² IIIeinschließen, worin B² eine Bindung oder eine gerade oder verzweigte Alkylen-, Alkylen-oxa-alkylen- oder Alkylen-oligooxa-alkylengruppe ist, von denen jede gegebenenfalls einen oder mehrere Fluor-Substituenten einschließen kann;
Y² eine ethylenisch ungesättigte polymerisierbare Gruppe ist; und
Q² eine organische Gruppe mit einer hydrophoben Gruppe ist, die aus Alkylgruppen mit mindestens sechs Kohlenstoffatomen, Fluor-substituierten Alkylgruppen und Alkylgruppen mit mindestens einem Siloxan-Substituenten ausgewählt ist.
Für eine optimale Filmbildung und Fähigkeit, hydrophobe Oberflächen zu beschichten, enthalten die Polymere bevorzugt mehr als 10 Molprozent, bevorzugter mehr als 20 Molprozent eines derartigen Termonomers.
Die Polymere können Verdünnungscomonomer einschließen. Ein derartiges Verdünnungscomonomer kann in Mengen bis zu 90 Mol%, gewöhnlich weniger als 50 Mol% verwendet werden. Copolymerisierbare nichtionische Monomere können verwendet werden, wie C_1-24-Alkyl(meth)acrylate und -(meth)acrylamide und Hydroxy-C_1-24-alkyl(meth)acrylate und -(meth)acrcylamide.
In jedem der Monomere I bis IV ist die ethylenisch ungesättigte Gruppe bevorzugt ausgewählt aus CH=CH-(C₆H₄)-K-, CH₂=C(R)C(O)-A-, CH₂=C(R)-CH₂-O-, CH₂=C(R)-CH₂-OC(O)-, CH₂=C(R)OC(O)-, CH₂=C(R)O- und CH₂=C(R)CH₂OC(O)N(R¹)-, worin:
R Wasserstoff oder eine (C₁-C₄)-Alkylgruppe ist;
A für -O- oder -NR¹- steht, worin R¹ Wasserstoff oder eine (C₁-C₄)-Alkylgruppe ist oder R¹ für -B-X, B¹Q¹, B²Q² oder B³Q³ steht, je nach Fall, worin B, B¹, B², B³, Q¹, Q² und Q³ und X wie vorstehend mit Bezug auf eine der Formeln I bis IV definiert sind und
K eine Gruppe -(CH₂)_pOC(O)-, -(CH₂)_pC(O)O-, -(CH₂)_pOC(O)O-, -(CH₂)_pNR²-, -(CH₂)_pNR²C(O)-, -(CH₂)_pC(O)NR²-, -(CH₂)_pNR²C(O)O-, -(CH₂)_pOC(O)NR²-, -(CH₂)_pNR²C(O)NR²- (worin die Gruppen R² gleich oder verschieden sind), -(CH₂)_pO-, -(CH₂)_pSO₃- oder gegebenenfalls in Kombination mit B eine Valenzbindung ist und p für 1 bis 12 steht und R² Wasserstoff oder eine (C₁-C₄)-Alkylgruppe ist.
Bevorzugt sind die ethylenisch ungesättigten Gruppen aller Monomere, die zusammen copolymerisiert sind, entweder vom Acrylat-Typ oder vom Styrol-Typ (CH₂=C(R)C(O)A- oder CH=CH-(C₆H₄)-K-) und am bevorzugtesten weist jede die gleiche Formel auf. Bevorzugt sind die Gruppen A der ethylenisch ungesättigten Gruppen vom Acrylat-Typ des zwitterionischen, kationischen und vernetzbaren Monomers und jeglichen Termonomers die gleichen und am bevorzugtesten sind alle -O-.
Die zwitterionische Gruppe X weist bevorzugt eine Phosphatestergruppe oder das Thioester-Analogon oder Amid-Analogon oder ein Phosphonat als Anion auf. Die kationische Einheit ist bevorzugt eine quartäre Ammoniumgruppe, kann aber auch eine Sulfonium- oder Phosphoniumgruppe sein. Bevorzugt ist die kationische Gruppe am Ende der Gruppe X entfernt von der Gruppe B angeordnet.
Bevorzugt ist die Gruppe X eine Gruppe der Formel V
in der die Einheiten X¹ und X², die gleich oder verschieden sind, für -O-, -S-, -NH- oder eine Valenzbindung, bevorzugt -O-, stehen und W⁺ eine Gruppe ist, die eine kationische Ammonium-, Phosphonium- oder Sulfoniumgruppe und eine Gruppe umfasst, welche die anionische und die kationische Einheit verknüpft und bei der es sich bevorzugt um eine C_1-12-Alkylengruppe handelt.
Bevorzugt enthält W als kationische Gruppe eine Ammoniumgruppe, bevorzugter eine quartäre Ammoniumgruppe.
Die Gruppe W⁺ kann es sich zum Beispiel um eine Gruppe der Formel -W¹-N⁺R⁶ ₃, -W¹-P⁺R⁷ ₃, -W¹-S⁺R⁷ ₂ oder -W¹-Het⁺ handeln, worin:
W¹ Alkylen mit 1 oder mehr, bevorzugt 2–6 Kohlenstoffatomen, das gegebenenfalls eine oder mehrere ethylenisch ungesättigte Doppel- oder Dreifach-Bindungen enthält, disubstituiertes Aryl, Alkylenaryl, Arylalkylen oder Alkylenarylalkylen, disubstituiertes Cycloalkyl, Alkylencycloalkyl, Cycloalkylalkylen oder Alkylencycloalkylalkylen ist, wobei die Gruppe W¹ gegebenenfalls einen oder mehrere Fluor-Substituenten und/oder eine oder mehrere funktionelle Gruppen aufweist; und entweder
die Gruppen R⁶ gleich oder verschieden sind und jede Wasserstoff oder Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, bevorzugt Methyl, oder Aryl, wie Phenyl, ist oder zwei der Gruppen R⁶ zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen heterocyclischen Ring bilden, der 5 bis 7 Atome enthält, oder die drei Gruppen R⁶ zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, eine kondensierte Ringstruktur bilden, die 5 bis 7 Atome in jedem Ring enthält, und wobei gegebenenfalls eine oder mehrere der Gruppen R⁶ mit einer hydrophilen funktionellen Gruppe substituiert ist, und
die Gruppen R⁷ gleich oder verschieden sind und jede R⁶ oder eine Gruppe OR⁶ ist, worin R⁶ wie oben definiert ist; oder
Het ein aromatischer Stickstoff-, Phosphor- oder Schwefel-, bevorzugt Stickstoffhaltiger Ring ist, z.B. Pyridin.
Bevorzugt ist W¹ eine geradkettige Alkylengruppe, am bevorzugtesten 1,2-Ethylen.
Bevorzugte Gruppen X der Formel V sind Gruppen der Formel VI.
Die Gruppen der Formel (VI) sind:
worin die Gruppen R⁸ gleich oder verschieden sind und jeweils Wasserstoff oder C_1-4-Alkyl sind und e für 1 bis 6 steht.
Bevorzugt sind die Gruppen R⁸ die gleichen. Es wird auch bevorzugt, dass mindestens eine der Gruppen R⁸ Methyl ist, und mehr bevorzugt, dass die Gruppen R⁸ alle Methyl sind.
Bevorzugt steht e für 2 oder 3, bevorzugter für 2.
Wenn X eine Gruppe der Formel (VI) ist, ist B bevorzugt eine Gruppe der Formel -(CR⁹ ₂)- oder -(CR⁹ ₂)₂-, z.B. -(CH₂)- oder -(CH₂CH₂).
Bevorzugt weist das zwitterionische Monomer die allgemeine Formel VII
auf, in der R, A und B wie oben definiert sind,
die Gruppen R³ gleich oder verschieden sind und jeweils Wasserstoff, C_1-1-Alkyl, Aryl, Alkaryl, Aralkyl sind oder zwei oder drei der Gruppen R³ mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, einen gesättigten oder ungesättigten heterocyclischen Ring bilden, und e für 1 bis 6, bevorzugt 2 bis 4 steht.
Eine kationisierbare Einheit in der Gruppe Q¹ ist im Allgemeinen eine Gruppe, die leicht protoniert werden kann, um sie kationisch zu machen, zum Beispiel eine, die in wässriger Umgebung bei pH 7 protoniert wird.
Die Gruppe Q¹ des kationischen Monomers ist bevorzugt eine Gruppe N⁺R⁵ ₃, P⁺R⁵ ₃ oder S⁺R⁵ ₂, in der die Gruppen R⁵ gleich oder verschieden sind und jeweils Wasserstoff, C_1-4-Alkyl oder Aryl (bevorzugt Phenyl) sind oder zwei der Gruppen R⁵ zusammen mit dem Heteroatom, an das sie gebunden sind, einen gesättigten oder ungesättigten heterocyclischen Ring bilden, der 5 bis 7 Atome enthält. Bevorzugt ist die Gruppe Q¹ dauerhaft kationisch, d.h., jedes R⁵ ist von Wasserstoff verschieden. Bevorzugt steht Q¹ für N⁺R⁵ ₃, worin jedes R⁵ für C_1-4-Alkyl, bevorzugt Methyl steht.
Die relativen Verhältnisse (Äquivalente) von zwitterionischen zu kationischen seitenständigen Gruppen in dem Molekül mit zwitterionischem und kationischem Monomer liegen im Bereich von 1:100 bis 100:1 (zwitterionisch zu ionisch), bevorzugt 1:10 bis 10:1, bevorzugter 1:2 bis 2:1.
Im Allgemeinen werden die Polymere, welche die vernetzbaren Gruppen einschließen, auf den Stent aufgetragen und nach der Auftragung vernetzt. Die Vernetzung geschieht im Allgemeinen durch Erwärmen gegebenenfalls in Anwesenheit von Feuchtigkeit zum Beispiel auf mindestens 40°C, bevorzugt mindestens 60°C, zum Beispiel etwa 70°C.
Die pharmazeutisch aktive Verbindung kann in die Polymermatrix geladen werden, indem sie aus einer Zusammensetzung mit aufgetragen wird, welche sowohl die Verbindung als auch vernetzbares Polymer enthält. Alternativ und bevorzugt wird der Arzneistoff in oder auf der Matrix absorbiert, nachdem das Polymer auf den Stent aufgetragen und darauf vernetzt worden ist. Dieser Beladungsschritt wird durch In-Kontakt-Bringen des beschichteten Stents, gegebenenfalls gefolgt von einem Vorquellungsschritt, mit einer wässrigen Lösung der pharmazeutisch aktiven Verbindung durchgeführt. Gewöhnlich ist das Lösungsmittel für quellbares Polymer Wasser, so dass das wässrige Lösungsmittel das Polymer quillt. Das Wasser kann aus der den pharmazeutischen Wirkstoff enthaltenen gequollenen Matrix entfernt werden, kann aber alternativ in dem Polymer zurückgehalten werden, zum Beispiel während der Lagerung oder durch sofortige Zufuhr des Stents an den Patienten.
Die Beladungsbedingungen werden so festgelegt, dass eine ausreichende Beladung des Wirkstoffs erzielt wird. Die Temperatur wird so ausgewählt, dass geeignete Eigenschaften auf dem Polymer geschaffen werden. Sie liegt gewöhnlich zwischen Raumtemperatur und etwa 40°C, zum Beispiel zwischen 20 bis 40°C, am bevorzugtesten bei etwa 37°C.
Der Stent kann vor oder nach dem Beladen zum Beispiel durch Gammabestrahlung sterilisiert werden.
Die Polymerbeschichtung und die pharmazeutisch aktive Verbindung können nur auf der Außenseite des Stents aufgetragen werden, von welcher der pharmazeutische Wirkstoff direkt in die Wand des Gefäßes zugeführt wird, in welcher der Stent implantiert ist. Vorzugsweise wird der Stent jedoch mit einer Gesamt-Polymerbeschichtung versehen, so dass die Lumenoberfläche des Stents ebenfalls mit einer Beschichtung versehen wird, die dicker sein kann oder bevorzugt dünner ist als die äußere Beschichtung.
Bei dem Stent kann es sich um einen Formgedächtnis-Metallstent, einen sich selbst ausdehnenden Stent oder einen ausdehnbaren Ballon-Stent handeln. Zum Beispiel kann ein sich selbst ausdehnender Stent eine gerollte Folienvorrichtung oder eine Litzenvorrichtung sein. Am zweckmäßigsten ist der Stent ein ausdehnbarer Ballon-Stent mit rauem Schlauch. Der Stent kann in der Erfindung mit Arzneistoff beladen werden, wenn er an seiner Zufuhrvorrichtung befestigt wird. Ein Decküberzug aus zwitterionischem Polymer kann über der definierten Beschichtung aufgetragen werden, um bei der Verwendung die Freisetzung zu steuern.
1 zeigt die Ergebnisse von Beispiel 2;
die 2 bis 7 zeigen die Ergebnisse von Beispiel 4;
die 8 und 9 zeigen die Ergebnisse von Beispiel 5; und
die 10 und 11 zeigen die Ergebnisse der Beispiele 6a und b;
12 zeigt die Ergebnisse von Beispiel 7b;
die 13 und 14 zeigen die Ergebnisse von Beispiel 6c;
15 zeigt die Ergebnisse von Beispiel 7a;
die 16 bis 18 zeigen die Ergebnisse von Beispiel 3.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Abkürzungen

MPC:

2-Methacryloyloxyethyl-2'-trimethylammoniumethylphosphat

LM:

Laurylmethacrcylat

HPM:

Hydroxypropylmethacrylat – (70% 3-Hydroxypropyl:30% 2-Hydroxy-1-methylethyl)

XL:

3-(Trimethoxysilyl)propylmethacrylat

CM:

Cholinmethacrylat

DMA:

Dimethylacrylamid

Die Monomer-Verhältnisse beruhen auf Gewichtsbasis, bezogen auf die Menge an bei den Polymerisationen verwendeten Monomeren.
Beispiel 1
Das Ziel war es, die Beladung eines einzelsträngigen Oligonukleotids (ASON, c-myc) als Dauerform auf Polymervarianten zu vergleichen, um die Bedeutung von Hydrophobie, Hydrophilie, Vernetzungsdichte und Größe der kationischen Ladung nach der Beladung von Polymerfilm mit ASON zu beurteilen.

Die Polymersysteme beruhten auf zwei Arten: (1) Bezug

1.1 Polymer von EP 99304140.9	MPC₂₉LM₅₁HPM₁₅XL₅
1.2 Hydrophobe Variante	MPC₁₅LM₆₅HPM₁₅XL₅
1.3 Hydrophile Variante	MPC₄₅LM₃₅HPM₁₅XL₅
1.4 Erhöhter Vernetzer	MPC₃₀LM₅₀HPM₁₀XL₁₀
1.5 Polymer von EP 99304092.2	MPC₃₇LM₆₃

(2) Erfindung

2.1 Standard	MPC₂₉LM₅₀CM₅HPM₁₂XL₄
2.2 Ladungserhöhung	MPC_21,5LM_42,5CM₂₀HPM₁₂XL₄
2.3. Hydrophile Variante	MPC₄₈LM₃₀CM₆HPM₁₂XL₄
2.4 Verringerter Vernetzer	MPC₂₅LM₅₀CM₆HPM₁₄XL₂
2.5 Hydrophiles Polymer	MPC₂₈LM₂₀CM₆HPM₁₂XL₄DMA₃₀
2.6 Stark kationisch	MPC₁₈LM₃₁CM₃₅HPM₁₂XL₄

Polymerherstellung
Alle Polymere mit Ausnahme des Polymers 1.1 wurden mittels des gepumpten Einspeisungsverfahrens hergestellt, wie in der WO 98/22516 erörtert. Die Monomere in Isopropanol-Lösung wurden über zwei Stunden in eine refluxierende Mischung von Isopropanol und Isopropylacetat (S.p. 83°C) unter Verwendung von AIBN als Initiator gepumpt.
Beschichtung von Stahlstreifen
Stahlstreifen (1 cm × 1,5 cm) wurden 10 Minuten in Dichlormethan unter Verwendung eines Ultraschallbades gereinigt. 200 μl einer 50 mg/ml-Polymerlösung wurden gleichmäßig auf die Stahlstreifen aufgetragen. Bei jeder Polymerprobe wurden sieben Stahlstreifen beschichtet. Die beschichteten Stahlstreifen wurden dann über Nacht in einem Ofen bei 70°C getrocknet, um die Polymerfilme zu härten.
Beladen des Polymers mit Arzneistoff
Sechs der beschichteten Stahlstreifen wurden mit der Polymerseite nach unten in eine Vertiefung gegeben, die eine 1 mg/ml-Arzneistoff-Lösung enthielt. Eine Kontrollprobe wurde nicht mit Arzneistoff beladen. Die Stahlstreifen wurden 1 Stunde eingetaucht. Die Stahlstreifen wurden dann aus der Vertiefung entfernt, und der überschüssige Arzneistoff wurde durch sehr vorsichtiges Abtupfen der Oberfläche mit Tissue-Papier entfernt. Die Stahlstreifen wurden dann eine weitere halbe Stunde bei Raumtemperatur trocknen gelassen. Jede Probe wurde dann schnell in eine saubere PBS-Lösung eingetaucht, um überschüssigen Arzneistoff von der Beschichtung zu entfernen (3-sekündiges Eintauchen). Jeder Stahlstreifen wurde dann in 3 ml PBS-Lösung gegeben, die in Fläschchen enthalten war. Jedes Fläschchen wurde dann 20 min bei einer Badtemperatur von 35°C beschallt, um den Arzneistoff aus der Polymerbeschichtung zu extrahieren. Jede Lösung wurde dann unter Verwendung von Fluoreszenzspektroskopie gemessen, um die Menge der Arzneistoff-Aufnahme zu bestimmen.
Beispiel 1:1 Beladen von Polymerfilmen mit ASON Tabelle 1 – Fluoreszenzmessungen (Anregung 500 nm, Emission 525 nm)
Anfängliche Ergebnisse für die Polymer-Varianten 1.1 und 1.2, die mit ASON beladenen wurden, zeigten an, dass das Polymer 1.1 keinerlei ASON aufnimmt, während das Polymer 2.1 eine geringe Menge des Arzneistoffs aufnimmt. Es würde zuerst scheinen, dass das Laden von ASON in Polymer 2.1 mit der Anwesenheit einer Ladung auf dem Polymer verbunden ist. Die Ergebnisse zeigen auch, dass, wenn die Ladungsmenge erhöht wird, die Polymerbeschichtung keine weiteren Arzneistoffmengen aufzunehmen scheint. Der Hauptvorteil der Ladungserhöhung besteht darin, die Freisetzungsgeschwindigkeit der aktiven Verbindung (ASON) zu verringern.
Die Aufnahme von ASON in Polymer 2.1 kann auf den Wechselwirkungen der negativen Ladung, die mit dem ASON-Molekül verbunden ist, und der positiven Ladung, die mit der Anwesenheit von CM in der Polymerbeschichtung verbunden ist, beruhen.
Die Proben 2.1 und 2.2 wurden einer weiteren einstündigen Beschallung unterzogen, um festzustellen, ob irgendwelches weitere ASON freigesetzt wurde.
Die Ergebnisse zeigten keinen Unterschied zu jenen, die nach 20 Minuten beobachtet wurden, was anzeigt, dass 1,6 und 1,8 μg wahrscheinlich die Gesamtbeladung waren.
Beispiel 1:2
Es wurden weitere Arbeiten durchgeführt, um zu untersuchen, ob das ASON-Molekül zu groß war, um in die Polymerbeschichtungen einzudringen, indem die Arzneistoff-Aufnahme im Hinblick auf die Filmdicke abgeschätzt wurde. Das Ziel des Experiments war es, anzuzeigen, ob eine ASON-Penetration des Polymers stattgefunden hatte.
Stahlstreifen wurden mit verschiedenen Mengen Polymer 2.1 und 1.1, 200, 500 und 800 μl einer 50 mg/ml-Polymer-Vorratslösung, beschichtet. Jeder Stahlstreifen wurde dann anhand des zuvor beschriebenen Verfahrens mit ASON beladen. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Die Ergebnisse zeigten, dass das Polymer ohne Gesamtladung ASON nicht zu absorbieren schien, während dies bei dem kationischen Polymer der Fall ist. Es würde scheinen, dass die Arzneistoff-Aufnahme im Fall des kationischen Polymers mit dem Polymer-Volumen, nicht nur der Oberfläche in Beziehung steht.
Beispiel 1:3
Die bisherigen Beobachtungen haben gezeigt, dass ASON nur von Polymeren der kationischen Art absorbiert wird. Der nächste Ansatz bestand darin, die Auswirkungen von Hydrophobie, Hydrophilie und Vernetzungsdichten derartiger Polymere zu untersuchen, um festzustellen, ob Änderungen des Polymer-Netzwerkes die Beladung mit dem ASON erhöhen würden. Die für 200 μl-Beschichtungen erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Die erhaltenen Ergebnisse bestätigten frühere Befunde, in denen das kationische Polymer ASON absorbiert, aber dass Änderungen der Polymer-Zusammensetzung nicht den Grad der Aufnahme in die Polymerbeschichtung zu erhöhen scheinen, mit Ausnahme eines geringer vernetzten Polymersystems. Das hydrophile Copolymer könnte bezüglich der Beschichtungseigenschaft nicht optimiert sein, was dessen offensichtliches Versagen, den Arzneistoff zu absorbieren, zur Folge hat.
Beispiel 2 – Doppelsträngige Oligonukleotide (DSON) (Molgew. 10000 D)

BiodivYsio-Stents wurden unter Verwendung der folgenden Bedingungen in einer automatisierten Stent-Beschichtungsvorrichtung beschichtet, welche den Stent mit zwischenzeitlichem Trocknen mehrere Male in die Lösung eintaucht und daraus entfernt.

Polymer	25 mg/ml in Ethanol
Zahl der Tauchvorgänge	×5
Luftdruck (Vakuum)	6 Bar
Eintauchgeschwindigkeit	5 mm/s (25 V an der Stromversorgung)
Trocknungszeit unter Vakuum	2 Minuten pro Eintauchzyklus

Die Stents wurden dann über Nacht bei 70°C gehärtet.
Beladungsstudien
Die Stents wurden mit DSON beladen. Durch Eintauchen in eine Vertiefung, die DSON bei einer Konzentration von 1 mg/ml in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) enthielt, wurde jeder Stent 1 Stunde beladen. Als die Beladung beendet war, wurde der Stent aus der Vertiefung entfernt, und das überschüssige DSON wurde durch sehr vorsichtigtes Abtupfen des Stents mit Tissue-Papier entfernt.
Die Stents wurden in PBS (2 ml) gegeben und 1 Stunde beschallt, um absorbiertes/adsorbiertes DSON aus den Stents zu entfernen. Zwei Verfahren wurden verwendet, um die Menge an geladenem Material zu bestätigen.
(1) Fluoreszenz (Anr. 500 nm/Em. 525 nm)
Gesamt-Arzneistoffbeladung

2 mg/ml-Lösung (DSON in Wasser): 4 μg
1 mg/ml-Lösung (DSON in Wasser/PBS 50:50): 5 μg
Wiederholungstudie – 1 mg/ml-Lösung (DSON in Wasser/PBS 50:50): 6 μg

(2) UV (bei 258 nm)
Gesamt-Arzneistoffbeladung

1 mg/ml-Lösung (DSON in PBS): 16 μg (vor Filtration)
1 mg/ml-Lösung (DSON in PBS) 12 μg (nach Filtration)

Die für die Gesamtbeladung erhaltenen Werte wurden erhalten, nachdem der beladene Stent etwa eine Stunde in ein Schallbad gegeben worden war. Die Ergebnisse zeigen an, dass bei Beschallung etwas der Polymerbeschichtung von dem Stent entfernt werden kann und so Anlass zu viel größeren Werten geben kann, als man erwarten würde, und deshalb wurde es als nötig befunden, die Lösungen vor der Analyse zu filtrieren. Die graphische Darstellung in 1 zeigt die Freisetzung von Oligonukleotiden aus PC-beschichteten BiodivYsio-Stents.
Die BiodivYsio-Stents wurden aus 1 mg/ml in PBS (50:50 Wasser:PBS) mit ASON und DSON beladen. Die Aufnahme auf einen 15 mm-BiodivYsio-Stent, der zu etwa 1–2 μm mit Polymer 2.1 beschichtet war, betrug:
ASON – 5,3 μg (10 mg/ml–52 μg)
DSON – 5–10 μg
Die Elution in PBS wurde bestimmt, wie es oben gezeigt wurde.
Diese Studie, welche die Beladung mit und Freisetzung von ASON untersuchte, wurde unter Verwendung von gammabestrahlten, mit Polymer 2.1 beschichteten 15 mm-BiodivYsio-Stents wiederholt. Die Ergebnisse waren die gleichen wie bei nicht gammabestrahlten Polymer-beschichteten Stents. Dies zeigt an, dass nach Bestrahlung keine Änderung der Fähigkeit des Polymers eintritt, die Verbindungen zu absorbieren/adsorbieren.
Beispiel 3 – Plasmid-DNA
Das Ziel dieses Studienplans war es, die Beladung und Arzneistoff-Freisetzungsprofile von Plasmid-DNA (MG etwa 50 kDa) aus Polymer-beschichteten Scheiben zu bestimmen.
Stahlscheiben mit einem Durchmesser von 13 mm wurden ausgeschnitten. Jede Scheibe wurde gründlich gereinigt. Die Scheiben wurden dann 2 Stunden an Luft getrocknet. Ein Volumen von 20 μl Polymer 2.2- oder 1.2-Beschichtungslösung (15 mgml^–1) wurde auf eine Seite jeder Scheibe gegeben und 2 Stunden trocknen gelassen. Die andere Seite jeder Scheibe wurde auf die gleiche Weise beschichtet. Die beschichteten Scheiben wurden dann thermisch 4 Stunden bei 70°C vernetzt. Zusätzliche Stahlscheiben ohne Beschichtung wurden zum Vergleich untersucht.
Ein Volumen von 20 μl DNA-Plasmid-Lösung (2,325 μg/μl) wurde auf eine Seite jeder Scheibe gegeben. Man ließ die Scheiben 3 Stunden trocknen. Dieses Vorgehen wurde auf der anderen Seite wiederholt.
Einige der Scheiben wurden mit einem Decküberzug versehen. Dies wurde durch Sprühbeschichten der Polymer-beschichteten und beladenen Scheiben mit einer 20 mg/ml-Lösung von Polymer 1.5 in Ethanol vorgenommen.
Die beladenen Scheiben wurden in 2 ml PBS gegeben. Nach einer gegebenen Zeitspanne wurde 1 ml der Lösung entnommen und in ein Kunststofffläschchen gegeben. Der 1 ml Lösung wurde durch 1 ml frische PBS ersetzt. Dieses Verfahren wurde in verschiedenen Zeitabständen wiederholt. Die DNA wird unter Verwendung eines UV/VIS-Spektrophotometers quantitativ bestimmt. Die Freisetzungsdaten sind graphisch dargestellt (siehe die 16–18). 16 zeigt die Freisetzung des DNA-Plasmids aus den zwei Beschichtungen sowohl mit als auch ohne Decküberzug. Die Daten sind als Prozentsatz Verlust über der Zeit ausgedrückt. Etwa 90–100 μg DNA-Plasmid wurden auf jede Scheibe geladen. 17 zeigt wieder die Freisetzung des DNA-Plasmids aus den zwei Beschichtungen sowohl mit als auch ohne Decküberzug. Die Daten sind als tatsächliche Menge an DNA-Plasmid ausgedrückt, die aus der Scheibe verloren geht. 18 zeigt ähnliche Ergebnisse, zeigt aber die Freisetzung aus unbeschichteten Stahlscheiben im Vergleich zu Polymer-beschichteten Scheiben.
Das DNA-Plasmid scheint aus der kationischen Polymerbeschichtung 2.2 langsamer freigesetzt zu werden als aus der neutralen Beschichtung (Polymer 1.1). Es scheint nach 60 Minuten eine signifikante Menge an DNA-Plasmid auf der Polymer 2.2-Beschichtung vorzuliegen, während zu diesem Zeitpunkt sehr wenig auf der Polymer 1.1-Beschichtung verbleibt.
Auf den mit Polymer 2.2 beschichteten Stahlscheiben verbleibt nach mehreren Stunden eine signifikante Menge an DNA-Plasmid, welches wahrscheinlich Material ist, das stark mit der positiv geladenen Oberfläche wechselwirkt. Es gibt wenig Unterschied zwischen der Geschwindigkeit und der Gesamt-Elution aus der Polymer 1.1-Beschichtung und den unbeschichteten Stahlscheiben. Der Decküberzug auf dem Plasmids verringert die Gesamtgeschwindigkeit der Elution bei beiden Polymer-Arten.
Beispiel 4 – Auswirkung von Zeit, Temperatur und Oligomer-Größe und Kationen-Gehalt des Polymers auf die Beladungsmengen bei der Beladung
Ziel dieser Studie war es, die Durchführbarkeit des Ladens von kurzen DNA-Oligonukleotiden auf PC-beschichtete 15 mm-BiodivYsio-Arzneistoffzuführungs-Stents zu überprüfen und die verschiedenen Parameter zu optimieren, welche die Arzneistoffbeladung beeinflussen können. Wir luden unter Verwendung verschiedener Bedingungen ³²P-radiomarkierte einzelsträngige 15-mer- und 32-mer-DNA-Oligonukleotide aus einer 300 μl-Lösung auf PC-beschichtete Stents (unter Verwendung der oben beschriebenen Polymere 2.1, 2.2 und 2.6). Wir überprüften die Auswirkungen von Temperatur (23, 37, 45, 65°C), Einwirkungszeit der Arzneistoff-Lösung (5, 10, 20, 30 Minuten), Arzneistoff-Aktivität (Konzentration) (11–500 μCi/300 μl) und kationischem Monomer-Gehalt in dem Polymer (5, 20 und 35 Gew.-%). Die Gesamtbeladung wurde in einem Szintillationszähler abgeschätzt. Alle Beladungsexperimente waren erfolgreich.
Die Auswirkung der Einwirkungszeit auf die Beladungsmengen bei dem 15-mer, das bei 37°C auf den mit Polymer 2.1 beschichteten Stent geladen wurde, ist in 2 gezeigt.
Die Auswirkung der Änderung der Konzentration des 15-mers in der Beladungslösung auf die Beladungsmenge (unter Verwendung von Polymer 2.1, einer Beladungszeit von 30 min und einer Temperatur von 37°C) ist in 3 gezeigt.
Die Auswirkung der Änderung der Temperatur der Arzneistoff-Lösung auf die Beladungsmengen (unter Verwendung von Polymer 2.1, einer Beladungszeit von 30 min und einer 15-mer-Konzentration von 75 μCi) ist in 4 gezeigt.
Die Auswirkung der Änderung des Anteils an kationischem Monomer in dem Polymer und einer einstündigen Voreinweichung der Beschichtung mit deionisiertem Wasser auf die Beladungsmengen (unter Verwendung einer Beladungszeit von 30 min und bei einer Temperatur von 37°C mit einer anfänglichen Arzneistoff-Konzentration von 211 μCi in 300 μl sowohl beim 15-mer- als auch beim 32-mer-Oligonukleotid) ist in den 5 bis 7 gezeigt.
Die maximale Beladung wurde bei 37°C erhalten (p, 0,05) wobei ein Plateau der Gesamt-Arzneistoff-Beladung nach 10-minütiger Einwirkung der Lösung auf den Stent erhalten wurde. Der Beladungswirkungsgrad betrug unter Verwendung dieser Parameter 10%. Eine optimale Beladung wurde mit zunehmender Arzneistoff-Konzentration erhalten, wobei 45,8 μCi (3,27 μg DNA) unter Verwendung einer 458 μCi (34 μg DNA)-Lösung geladen wurden. Auch ein auf 20% zunehmender CM-Gehalt des Polymers auf dem Stent verbesserte im Vergleich zu anderen Konzentrationen die maximale Beladung (p < 0,05 gegenüber 0 und 6%).
Beispiel 5 – Elution von Olignukleotide aus Stents in vitro
Stents, die mit dem Polymeren 2.1, 2.2 und 2.6 beschichtet und mit ³²P-markierten 15-mer- oder 32-mer-Oligomeren beladen waren (37°C, 30 min, mit oder ohne Voreinweichen in deionisiertem Wasser bei einer Konzentration von 211 μCi in 300 μl in der Einweichungslösung), wurden entweder in menschlichem Blut oder in DMEM-Zellkulturmedium bei 37°C inkubiert. Proben des Inkubationsmediums wurden über eine Zeitspanne entnommen und bezüglich der Radioaktivität ausgewertet. Die Ergebnisse wurden verwendet, um die Prozent Oligomer zu berechnen, die nach Zeitspannen auf dem Stent verblieben.
8 zeigt das Elutionsprofil des 15-mers von Stents, die mit Polymer 2.1 beladen und in Blut und Zellkulturmedium inkubiert wurden.
9 zeigt die Elutionsprofile des 15-mers und 32-mers von Stents, die mit den verschiedenen Polymeren und Polymer 2.1 beladen und in deionisiertem Wasser voreingeweicht waren, bei der Inkubation mit Blut.
Beispiel 6 – Freisetzung von Oligomer in vivo

a) Mit Polymer 2.1 beschichtete Stents (15 mm × 3,5 mm) wurden mit ³²P-markiertem 15-mer ATGCCCCTCAACGTG (Sequenz ID 1) bei einer Gesamt-Markierungsbeladung von 12 μCi pro Stent beladen. Ein beladener Stent wurde dann in der LCX-Arterie eines Schweins entfaltet. Das Schwein wurde nach 30 min geopfert. Eine Blutprobe wurde entnommen, der Stent wurde herausgenommen, der Gehalt an 15-mer wurde im Blut, Stent, in der Arterienwand und im Ballon bestimmt. Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt.
b) Ein ähnliches Experiment wurde durchgeführt, jedoch unter Verwendung von 32-mer bei einer höheren Beladung auf einem mit Polymer 2.2 beschichteten Stent. Blutproben wurden zur Zeit 0, 30 Minuten nach Entfaltung, nach 24 Stunden und bei der Opferung nach 48 Stunden entnommen. Die Ergebnisse sind in 11 gezeigt.
c) Stents, die mit Polymer 2.1 beschichtet und mit dem gleichen ³²P-markierten 32-mer beladen waren, wie es in Experiment 8c) verwendet wurde, wurden auf Ballon-Kathetern angebracht und in vivo in eine Schweine-Halsschlagader eingeführt. Zwei bis drei Tiere wurden zu jedem Zeitpunkt verwendet, nämlich 0, 3,6 und 72 Stunden und 8 und 14 Tage. Zu den angegebenen Zeitpunkten nach der Zufuhr wurde der Gehalt an ³²P-Markierung, der auf dem Stent verblieb, und die Gewebeaufnahme des Olignukleotids aus dem Stent in die Arterie und das Myokard durch Szintillationszählung gemessen.

Die Ergebnisse sind in den 13 und 14 gezeigt.
Schlussfolgerungen
Die Ergebnisse der Beispiele 6a)–c) zeigen, dass Olignukleotide in vivo in die den Stent umgebende Gefäßwand freigesetzt werden, wobei wenig in dem Gewebe, das an das Gefäß angrenzt, in das der Stent implantiert ist, nachgewiesen wird. So wurde in Beispiel 6c) sehr wenig Radioaktivität im Myokard nachgewiesen. Die Wirksamkeit der Zufuhr ist viel höher als unter Verwendung eines lokalen Arzneistoffzufuhr-Katheters, des Infiltrators (TM). Vergleichsergebnisse zeigen, dass die Zufuhr einer Dosis von 1680 μCi ³²P-markiertem ODN die gleiche Markierungskonzentration nach 3 und 6 Stunden in dem Gewebe zum Ergebnis hat wie eine Dosis von nur 100 μCi aus einem Stent. Es können niedrigere Dosen dieser Verbindungen für die Zufuhr an Zielgewebe verwendet werden.
Beispiel 7 – Fluoreszenz-markiertes Olignukleotid
a) Aufnahme und Freisetzung bei einem mit Polymer 2.2 beschichteten Stent
Mit Polymer 2.2 beschichtete Stents wurden mit einem 15-mer-c-myc-Antisense-Oligonukleotid AACGTTGAGGGGCAT (Sequenz ID 2) beladen, das mit einer Fluoreszenz-Markierung markiert war, indem man sie 30 Minuten in eine 5 mg/ml-Lösung der DNA in physiologischer Kochsalzlösung eintauchte.
Die Gesamtbeladung wurde bestimmt, indem man 3 der Stents jeweils in 3 ml PBS gab und 30 Minuten beschallte. Die Fluoreszenz-Markierung wurde quantitativ bestimmt. Man fand, dass die Beladung etwa 20 μg pro Stent betrug. Die Freisetzung in PBS ist in 16 gezeigt.
b) Freisetzung und Aufnahme in Schweine-Halsschlagader
Mit Polymer 2.1 beschichtete Stents wurden mit dem gleichen Oligonukleotid, das in Beispiel 7a verwendet wurde, beladen. Die Stents wurden sauggetrocknet. Jeder Stent wurde in einem 50 mm langen Abschnitt einer Schweine- Halsschlagader durch Anbringen auf einem Ballon und Aufblasen des Ballons in dem Abschnitt entfaltet. Der Schlagaderabschnitt wurde dann auf Kanülen in einer mit Kulturmedium gefüllten Kammer angebracht. Man ließ weiteres Kulturmedium mit einer Geschwindigkeit von 60 ml min^–1 durch einen Kreislauf aus Siliconschläuchen und von dort durch den Abschnitt der Schlagader fließen. Nach 1, 6, 12 oder 24 Stunden wurde der Abschnitt mit dem Stent aus dem Kreislauf entfernt, und die Enden des Gefäßes proximal und distal vom Stent wurden zur Quantifizierung von ODN entfernt. Das Segment des Gefäßes mit dem Stent wurde vorsichtig von dem Stent weggezogen. Alle drei Gefäßsegmente wurden in flüssigem Stickstoff schnell eingefroren, pulverisiert und eine Nacht in Lyse-Puffer inkubiert. Nach Beschallung und Zentrifugation wurden die Überstände bezüglich der Fluoreszenz gemessen, um die Konzentration der Markierung zu bestimmen, von der angenommen wurde, dass sie mit ODN assoziiert verblieb. Die Ergebnisse sind in 12 gezeigt. Die Konzentration der Fluoreszenz-Markierung in der zirkulierenden Flüssigkeit wurde am Ende jedes Experiments erfasst, und es wurde gefunden, dass sie unter der Nachweisgrenze der Messvorrichtung lag. Einer der Anfangsabschnitte des Gefäßes wurde, anstelle bezüglich der Gesamt-Fluoreszenz-Markierung analysiert zu werden, in Abschnitte zerteilt und nach Ethidiumbromid-Färbung mittels konfokaler Mikroskopie betrachtet. Die Ergebnisse zeigen, dass Oligonukleotid mit Ethidiumbromid mit angefärbt wird, wobei man annimmt, dass dies eine Anordnung im Zellkern anzeigt.
Beispiel 7 – Fluoreszenz-markiertes Olignukleotid
a) Aufnahme und Freisetzung bei mit Polymer 2.2 beschichtetem Stent
Mit Polymer 2.2 beschichtete Stents wurden mit einem 15-mer-c-myc-Antisense-Oligonukleotid AACGTTGAGGGGCAT (Sequenz ID 2) beladen, das mit einer Fluoreszenz-Markierung markiert war, indem man sie 30 Minuten in eine 5 mg/ml-Lösung der DNA in physiologischer Kochsalzlösung eintauchte.
Die Gesamt-Beladung wurde bestimmt, indem man 3 der Stents jeweils in 3 ml PBS gab und sie 30 Minuten beschallte. Die Fluoreszenz-Markierung wurde quantitativ bestimmt. Es wurde gefunden, dass die Beladung etwa 20 μg pro Stent betrug. Die Freisetzung in PBS ist in 16 gezeigt.
b) Freisetzung und Aufnahme in Schweine-Halsschlagader
Mit Polymer 2.1 beschichtete Stents wurden mit dem gleichen Oligonukleotid beladen, das in Beispiel 7a verwendet wurde. Die Stents wurden sauggetrocknet. Jeder Stent wurde in einem 50 mm langen Abschnitt einer Schweine-Halsschlagader entfaltet, indem man ihn auf einem Ballon anbrachte und den Ballon in dem Abschnitt aufblies. Der Schlagaderabschnitt wurde dann auf Kanülen in einer mit Kulturmedium gefüllten Kammer angebracht. Man ließ weiteres Kulturmedium mit einer Geschwindigkeit von 60 ml min^–1 durch einen Kreislauf aus Siliconschläuchen und von da durch den Halsschlagladerabschnitt fließen. Nach 1, 6, 12 oder 24 Stunden wurde der Abschnitt mit dem Stent aus dem Kreislauf entfernt, und die Enden des Gefäßes proximal und distal zum Stent wurden für eine Quantifizierung von ODN entfernt. Das Segment des Gefäßes mit dem Stent wurde vorsichtig von dem Stent weggezogen. Alle drei Gefäßsegmente wurden in flüssigem Stickstoff schnell eingefroren, pulverisiert und über Nacht in Lyse-Puffer inkubiert. Nach Beschallung und Zentrifugation wurden die Überstände bezüglich der Fluoreszenz gemessen, um die Konzentration der Markierung zu bestimmen, wobei man annahm, dass sie mit ODN assoziiert verblieb. Die Ergebnisse sind in 12 gezeigt. Die Konzentration der Fluoreszenz-Markierung in der zirkulierenden Flüssigkeit wurde am Ende jedes Experiments erfasst, und es wurde gefunden, dass sie unter der Nachweisgrenze der Messvorrichtung lag. Einer der Anfangsabschnitte des Gefäßes wurde, anstatt bezüglich der Gesamt-Fluoreszenz-Markierung analysiert zu werden, in Abschnitte zerteilt und nach Färbung mit Ethidiumbromid durch konfokale Mikroskopie betrachtet. Die Ergebnisse zeigen, dass Oligonukleotid mit Ethidiumbromid mit angefärbt wird, wobei man annimmt, dass dies eine Anordnung im Zellkern anzeigt.

Claims

Implantat mit einer Beschichtung auf seiner äußeren Oberfläche, umfassend: a) eine vernetzte biostabile Polymer-Matrix und b) eine pharmazeutisch aktive Verbindung, die eine Nukleinsäure ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Polymer seitenständige zwitterionische Gruppen und seitenständige kationische Gruppen aufweist.
Implantat nach Anspruch 1, in dem das Polymer aus ethylenisch ungesättigten Monomeren gebildet ist, die weniger als 20 Mol% vernetzbares Monomer einschließen.
Implantat nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, in dem das Polymer aus ethylenisch ungesättigten Monomeren gebildet ist, welche einschließen a) ein zwitterionisches Monomer der Formel I YBX Iin der B eine Bindung oder eine gerade oder verzweigte Alkylen-, Alkylen-oxa-alkylen- oder Alkylen-oligooxa-alkylen-Gruppe ist, von denen jede gegebenenfalls einen oder mehrere Fluor-Substituenten einschließt; X eine organische Gruppe mit einer zwitterionischen Einheit ist; und Y eine ethylenisch ungesättigte polymerisierbare Gruppe ist; b) ein kationisches Monomer der Formel II Y¹B¹Q¹ IIin der B¹ eine Bindung oder eine gerade oder verzweigte Alkylen-, Alkylen-oxa-alkylen- oder Alkylen-oligooxa-alkylen-Gruppe ist, von denen jede gegebenenfalls einen oder mehrere Fluor-Substituenten einschließt; Y¹ eine ethylenisch ungesättigte polymerisierbare Gruppe ist; und Q¹ eine organische Gruppe mit einer kationischen oder kationisierbaren Einheit ist, und c) ein vernetzbares Monomer mit der allgemeinen Formel IV: Y³B³Q³ IVin der B³ eine Bindung oder eine gerade oder verzweigte Alkylen-, Alkylen-oxa-alkylen- oder Alkylen-oligooxa-alkylen-Gruppe ist, von denen jede gegebenenfalls einen oder mehrere Fluor-Substituenten einschließt; Y³ eine ethylenisch ungesättigte polymerisierbare Gruppe ist; und Q³ eine organische Gruppe mit einer reaktiven Gruppe ist, die das Polymer vernetzen kann.
Implantat nach Anspruch 3, in dem Q³ eine vernetzbare Cinnamyl-, Epoxy-, -CHOHCH₂Hal- (worin Hal ein Halogenatom ist), Methylol- oder reaktive Silylgruppe, eine ethylenisch ungesättigte vernetzbare Gruppe, wie eine acetylenische, diacetylenische, vinylische oder divinylische Gruppe, oder eine Acetacetoxy- oder Chloralkylsulfon-Gruppe ist.
Implantat nach Anspruch 4, in dem Q³ eine Gruppe SiR⁴ ₃ ist, worin jedes R⁴ eine C_1-4-Alkoxygruppe oder ein Halogenatom ist.
Implantat nach Anspruch 5, in dem die Monomere weiter eine Verbindung mit der Formel IV' Y³B³Q⁴ einschließen, in der Y³ und B³ wie in der Verbindung IV definiert sind und Q⁴ eine Hydroxylgruppe ist.
Implantat nach irgendeinem der Ansprüche 3 bis 6, in dem X eine Gruppe der Formel V
ist, in der die Einheiten X¹ und X², die gleich oder verschieden sind, für -O-, -S-, -NH- oder eine Valenzbindung stehen und W⁺ eine Gruppe ist, die eine kationische Ammonium-, Phosphonium- oder Sulfoniumgruppe und eine Gruppe umfasst, welche die anionische und die kationische Einheit verknüpft.
Implantat nach Anspruch 7, in dem X¹ und X² jeweils O sind und W¹ eine C_1-12-Alkylengruppe ist.
Implantat nach Anspruch 7 oder Anspruch 8, in dem W¹ eine geradkettige Alkylengruppe ist.
Implantat nach irgendeinem der Ansprüche 7 bis 9, in dem X eine Gruppe der Formel VI
ist, in der die Gruppen R⁸ gleich oder verschieden sind und jede Wasserstoff oder C_1-4-Alkyl ist und e für 1 bis 6 steht.
Implantat nach Anspruch 10, in dem jedes R⁸ Methyl ist und e für 2 oder 3 steht.
Implantat nach irgendeinem der Ansprüche 3 bis 11, in dem Q¹ eine Gruppe N⁺R⁵ ₃, P⁺R⁵ ₃ oder S⁺R⁵ ₂ ist, worin die Gruppen R⁵ gleich oder verschieden sind und jeweils Wasserstoff, C_1-4-Alkyl oder Aryl sind oder zwei der Gruppen R⁵ zusammen mit dem Heteroatom, an dem sie angebracht sind, einen gesättigten oder ungesättigten heterocyclischen Ring bilden, der 5 bis 7 Atome enthält.
Implantat nach irgendeinem der Ansprüche 3 bis 12, in dem die Monomere weiter ein Termonomer der Formel III Y²B²Q² IIIeinschließen, in der B² eine Bindung oder eine gerade oder verzweigte Alkylen-, Alkylen-oxa-alkylen- oder Alkylen-oligooxa-alkylengruppe ist, von denen jede gegebenenfalls einen oder mehrere Fluor-Substituenten einschließen kann; Y² eine ethylenisch ungesättigte polymerisierbare Gruppe ist; und Q² eine organische Gruppe mit einer hydrophoben Gruppe ist, die aus Alkylgruppen mit mindestens sechs Kohlenstoffatomen, Fluor-substituierten Alkylgruppen und Alkylgruppen mit mindestens einem Siloxan-Substituenten ausgewählt ist.
Implantat nach irgendeinem der Ansprüche 3 bis 13, in dem Y, Y¹, Y², Y³ und/oder Y^3', je nach Fall, unabhängig aus CH=CH-(C₆H₄)-K-, CH₂=C(R)C(O)-A-, CH₂=C(R)-CH₂-O-, CH₂=C(R)-CH₂-OC(O)-, CH₂=C(R)OC(O)-, CH₂=C(R)O- und CH₂=C(R)CH₂OC(O)N(R¹)- ausgewählt sind, worin: R Wasserstoff oder eine (C₁-C₄)-Alkylgruppe ist; A für -O- oder -NR¹- steht, worin R¹ Wasserstoff oder eine (C₁-C₄)-Alkylgruppe ist oder R¹ für -B-X, B¹Q¹, B²Q² oder B³Q³ steht, je nach Fall, worin B, B¹, B², B³, Q¹, Q² und Q³ und X wie vorstehend mit Bezug auf eine der Formeln I bis IV definiert sind und K eine Gruppe -(CH₂)_pOC(O)-, -(CH₂)_pC(O)O-, -(CH₂)_pOC(O)O-, -(CH₂)_pNR²-, -(CH₂)_pNR²C(O)-, -(CH₂)_pC(O)NR²-, -(CH₂)_pNR²C(O)O-, -(CH₂)_pOC(O)NR²-, -(CH₂)_pNR²C(O)NR²- (worin die Gruppen R² gleich oder verschieden sind), -(CH₂)_pO-, -(CH₂)_pSO₃- oder gegebenenfalls in Kombination mit B eine Valenzbindung ist und p für 1 bis 12 steht und R² Wasserstoff oder eine (C₁-C₄)-Alkylgruppe ist.
Implantat nach Anspruch 14, in dem die ethylenisch ungesättigten Gruppen aller Monomere, die zusammen copolymerisiert sind, entweder vom Acrylat-Typ sind oder vom Styrol-Typ (CH₂=C(R)C(O)A- oder CH=CH-(C₆H₄)-K-) sind.
Implantat nach Anspruch 15, in dem jede solche ethylenisch ungesättigte Gruppe die Formel CH₂=C(R)C(O)A aufweist, worin R für H oder CH₃ steht und A für -NH oder -O- steht.
Implantat nach Anspruch 16, in dem in jeder ethylenisch ungesättigten Gruppe A für -O- steht.
Implantat nach irgendeinem der Ansprüche 3 bis 17, in dem das Verhältnis von zwitterionischem zu kationischem Monomer, das verwendet wird, um das Polymer zu bilden, im Bereich von 1:10 bis 10:1 liegt.
Implantat nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in dem die Polymer-Matrix eine Trockendicke von mindestens 0,5 μm aufweist.
Implantat nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in dem die Nukleinsäure DNA oder RNA ist und linear oder ringförmig und einzel- oder doppelsträngig ist.
Implantat nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in dem die Nukleinsäure mindestens 15 Basen aufweist.
Implantat nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, welches ein Stent ist.
Verfahren zur Herstellung eines Implantats nach irgendeinem vorangehenden Anspruch, in dem ein leeres Implantat mit einer (bezüglich eines pharmazeutischen Wirkstoffs) leeren Beschichtung aus einer vernetzten in Wasser quellbaren Polymer-Matrix auf seiner äußeren Oberfläche mit einer wässrigen Lösung eines pharmazeutischen Wirkstoffs in Kontakt gebracht wird, bei dem es sich um eine Nukleinsäure handelt, wodurch die Nukleinsäure in die Polymer-Matrix absorbiert oder auf dieser adsorbiert wird.
Verfahren nach Anspruch 23, in dem die Polymer-Matrix in Wasser quellbar ist und die wässrige Lösung diese in dem Verfahren quellt.
Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, in dem die Polymer-Matrix im Wesentlichen frei von Lösungsmittel ist, wenn sie mit der wässrigen Lösung in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 23 oder 24, in dem die Polymer-Matrix mit einer quellenden Flüssigkeit vorgequollen worden ist, wenn sie mit der wässrigen Lösung in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 23 bis 26, in dem das Implantat mit der Lösung durch Eintauchen desselben in ein Volumen der wässrigen Lösung in Kontakt gebracht wird.
Verfahren nach Anspruch 27, in dem das Implantat ein Stent ist.
Verfahren nach Anspruch 28, in dem der Stent auf einer Zufuhrvorrichtung montiert ist.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 23 bis 29, in dem die Kontaktzeit der wässrigen Lösung und des Implants mindestens 30 s beträgt.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 23 bis 30, in dem die wässrige Lösung bei einer Temperatur im Bereich von 20 bis 40°C vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 31, in dem die Temperatur etwa 37°C beträgt.
Verfahren nach irgendeinem der Ansprüche 23 bis 32, welches den Vorläuferschritt der Beschichtung eines Implantats mit einem vernetzbaren Polymer und das Vernetzen des Polymers einschließt.