DE60116651T2

DE60116651T2 - Methode zur amplifizierung und möglicher charakterisierung von nukleinsäuren

Info

Publication number: DE60116651T2
Application number: DE60116651T
Authority: DE
Inventors: Valentine Thomas McCARTHY; Ruairi Kildorrey COLLINS
Original assignee: University College Cork
Current assignee: University College Cork
Priority date: 2000-11-03
Filing date: 2001-11-01
Publication date: 2006-09-14
Anticipated expiration: 2021-11-02
Also published as: AU2002210862B2; DE60116651D1; WO2002036821A2; ES2254505T3; EP1330546B1; EP1330546A2; IE20000887A1; DK1330546T3; CA2427474A1; AU1086202A; ATE315666T1; CN1473201A; JP2004512843A; US20040067559A1; WO2002036821A3; RU2284357C2

Description

Technisches Gebiet
Diese Erfindung betrifft ein neues Verfahren zum Amplifizieren und Charakterisieren von Nukleinsäuren.
Stand der Technik
Die Verlängerung eines Nukleinsäureprimers auf einem Zielnukleinsäure-Template ist ein sehr wichtiger Prozess mit vielen Anwendungen einschließlich des Nachweises, der Diagnostik und Quantifizierung von Nukleinsäuren. Die Verlängerung eines Primers auf einem Template i) ist insbesondere ein direkter Beweis, dass der Primer sich an das Template angelagert („annealed") hat, ii) bestätigt das Vorhandensein einer Sequenz auf diesem Template, die komplementär zu dem Primer ist und iii) bestätigt daher das Vorhandensein dieses Templates oder dieser Zielnukleinsäure. Unter Verwendung nahe verwandter Primer, die sich nur durch eine einzelne Base unterscheiden, ist es routinemäßig möglich, zwischen Nukleinsäuren zu unterscheiden, die sich in ihrer Sequenz nur durch eine einzige Base unterscheiden. Die hauptsächliche Beschränkung bei der Verwendung der Verlängerung von Primern auf einer Template-Nukleinsäure als ein Verfahren zum Nachweis, der Diagnose und Quantifizierung von Nukleinsäuren liegt darin, dass sich der Primer bei einer typischen Verlängerungsreaktion an das Template „annealed" (mit diesem hybridisiert), aber nur einmal verlängert wird. Daher bestimmt die Menge an Template in einer Probe die Menge an Primer, der verlängert wird. Für die Hauptzahl an Anwendungen in den Gebieten des Nachweises, der Diagnose und Quantifizierung von Nukleinsäuren ist die Menge an Template oft zu gering, um einen direkten Nachweis des verlängerten Primers zu ermöglichen, wenn die Verlängerungsreaktion nicht wiederholt oder in gewisser Weise zyklisch durchgeführt wird.
Amplifikationsprozesse sind notwendig, um diese Schlüsselbegrenzung zu überwinden. Eine Vielzahl dieser Prozesse wurde bereits beschrieben und sie beziehen im Wesentlichen ein entweder: a) zyklische Dissoziationsbedingungen, in denen der verlängerte Primer von dem Template unter Verwendung von Hitze dissoziiert wird, wodurch ein Annealing und anschließende Verlängerung eines neuen Primers ermöglicht wird, b) wiederholte Bildung eines Primers in DNA durch die Verwendung eines Restriktionsenzyms, um einen unmodifizierten Strang einer hemi-modifizierten DNA-Erkennungsstelle einzuschneiden, und die Fähigkeit einer 5'-3'-Exonuklease-defizienten DNA-Polymerase zur Verlängerung des 3'-DNA-Terminus an der Einschneidung und zur Verdrängung des stromabwärts gelegenen DNA-Strangs, c) wo die Template-Nukleinsäure zirkulär gemacht wird, so dass die Primer-Verlängerung kontinuierlich fortschreitet und/oder d) wo die Kopien des Templates durch ein Transkriptionsverfahren hergestellt werden, welche als Templates in anschließenden Primer-Verlängerungsreaktionen dienen.
Die Amplifikation einer Nukleinsäure (Bildung vieler Kopien) auf ein Niveau, bei dem sie nachgewiesen und manipuliert werden können, besitzt eine sehr hohe Nützlichkeit. Solche Amplifikationsverfahren, die ausreichende Mengen einer spezifischen Zielnukleinsäure bilden, sind im Allgemeinen der erste Schlüsselschritt, der bei der Charakterisierung von Nukleinsäuren benötigt wird. Die direkte Amplifikation einer spezifischen Nukleinsäuresequenz aus einer Probe erlaubt die Diagnose der Gegenwart oder der Abwesenheit dieser Nukleinsäure in dieser Probe und hat folglich eine sehr hohe Nützlichkeit in der DNA-/Gen-Diagnostik. Die direkte Amplifikation einer Nukleinsäure aus einer Probe und die anschließende Charakterisierung kann für eine Vielzahl von Zwecken einschließlich der Diagnose der Gegenwart oder der Abwesenheit von DNA-Variationen, wie zum Beispiel Mutationen und Polymorphismen in einer spezifischen Nukleinsäure, durchgeführt werden. Amplifikationsverfahren können in vielen Fällen so entwickelt werden, dass sie sowohl die Amplifikation als auch eine vollständige oder teilweise Charakterisierung des amplifizierten Ziels erlauben.
Die gegenwärtig bekannten Verfahren zum Amplifizieren und Charakterisieren von Nukleinsäuren haben jeweils verschiedene Limitierungen, insbesondere im Hinblick auf das Verfahren, das für die Primer-Dissoziation, die Primer-Bildung, die Spezifität, die Vielseitigkeit, die Bildung von einzelsträngiger DNA und die Erleichterung der Bündelung und der High-throughput-Genotypisierung, insbesondere der Genotypisierung von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNP; single nucleotide polymorphisms) benötigt wird, wie dies nachfolgend beschrieben ist.
Primer-Verlängerung
Die Primer-Verlängerung per se auf einem Template ist sehr gut in der Literatur dokumentiert. Dies kann durch Annealen eines Primers an seine komplementäre Sequenz auf einer Template- oder Zielnukleinsäure gefolgt von Inkubation mit einer DNA-Polymerase in der Gegenwart von DNA-Vorläufern, typischerweise dATP, dGTP, dCTP und dTTP, erreicht werden, was in der Verlängerung des Primers von seinem 3'-OH- (Hydroxy)-Terminus in einer 5'- nach 3'-Richtung (im Hinblick auf den Primer) auf dem Template-Strang resultiert und einen neu synthetisierten DNA-Strang produziert, der zu dem ursprünglichen Template komplementär ist. Die Primer-Verlängerung kann nur auftreten, wenn der Primer einen freien 3'-OH-Terminus besitzt. Die Amplifikation dieses komplementären Strangs von dem Template durch Primer-Verlängerungsverfahren erfordert, dass a) eine Primer-Verlängerung mehr als einmal pro annealtem Primer-Molekül auftritt, b) dem neuen Primer wiederholt erlaubt wird, an das Template zu annealen und verlängert zu werden und/oder c) dass der komplementäre Strang als ein Template für die anschließende Verlängerung eines zweiten Primers dient.
Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die Amplifikation eines Nukleinsäure-Templates kann durch die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erreicht werden (Saiki, R. K. et al., Science. 239: 487–491 (1988)).
Typischerweise wird die Amplifikation eines Zielabschnitts eines Nukleinsäure-Templates durch PCR unter Verwendung geeigneter synthetischer Oligonukleotid-Primer in der PCR zusammen mit einer thermostabilen DNA-Polymerase und DNA-Vorläufern durchgeführt. Viele Zyklen von Denaturierung, Annealing und Primer-Verlängerung resultieren in der exponentiellen Amplifikation des Zielabschnitts. Folglich zeigt der Nachweis des Produkts die Gegenwart einer bestimmten Sequenz an einem spezifischen Locus an. Die Länge des amplifizierten Produkts wird durch die zusammengesetzte Länge der Primer und der Entfernung ihrer 3'-Termini auf dem Template und so weiter bestimmt.
Die PCR hat das absolute Erfordernis einer thermostabilen DNA-Polymerase. Sie bezieht auch ein thermisches zyklisches Verfahren ein, weshalb die Automatisierung dieser Technik eine spezialisierte Ausrüstung erfordert. Eine typische Reaktion erfordert normalerweise zwei Primer, um die Reaktion zu beginnen, daher wird der Reaktion durch dies eine zusätzliche Komplexität hinzugefügt, insbesondere wenn man eine Bündelung einiger verschiedener Amplifikationsreaktionen (d.h. in einem Röhrchen) in Erwägung zu ziehen wünscht. Dies führt zu einer erhöhten Anzahl von Primern, die in der Reaktion vorhanden sind und dadurch erhöht es die Möglichkeit von falschen und nicht spezifischen Amplifikationen. Zusätzlich gibt es auch eine erhöhte Komplexität beim Entwickeln und Optimieren der PCR-Reaktion, da die Annealing-Temperatur der Reaktion zu beiden in der Reaktion verwendeten Primern passen muss. Dies wird zu einem zusätzlichen Nachteil, wenn verschiedene Amplifikationsreaktionen gebündelt werden, da eine einzige Annealing-Temperatur zu allen Amplifikationsreaktionen, die gebündelt werden sollen, passen muss.
Es gibt auch ein Potential für Amplicon-Kontamination, da viele Kopien der Template-Nukleinsäure während der Reaktion hergestellt werden, um als nachfolgende Templates zu wirken.
Amplifikationsverfahren auf Grundlage von Transkription
Amplifikation auf Grundlage von Transkription (Kwoh, D. Y. et al., (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86 1173–1177; Guatelli, J. C. et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 1874–1878; Compton, J. (1991) Nature 350 91–92) ist ein Amplifikationsverfahren, das auf der Primer-Verlängerung von Primern auf einer Zielnukleinsäure beruht, so dass ein RNA-Polymerase-Promoter stromaufwärts der Zielregion, die zu amplifizieren ist, gebildet wird. Im Wesentlichen wird ein Primer-Paar, das die Zielsequenz flankiert, mit einer Template-Nukleinsäure inkubiert. Einer der Primer hat eine RNA-Polymerase-Promotorsequenz stromaufwärts (5') einer Sequenz, die komplementär ist und mit dem Template annealt. Der andere Primer ist zu einem Abschnitt des komplementären Template-Strangs komplementär. Der Primer mit der RNA-Promotorsequenz wird auf dem Template-Strang unter Verwendung einer Nukleinsäure-Polymerase wie z.B. einer reversen Transkriptase und DNA-Vorläufern verlängert. Nach thermischer Denaturierung der Hybrid-Nukleinsäure (des Template-Strangs und des neu synthetisierten komplementären Strangs) oder enzymatischem Abbau des Template-Strangs annealt der zweite Primer an den neu synthetisierten komplementären Strang und wird auf diesem verlängert. Dies resultiert in einem Produkt, das doppelsträngig ist und einen RNA-Polymerase-Promotor besitzt, der mit der Zielsequenz verknüpft ist. Die Inkubation dieses Produkts mit RNA-Polymerase und RNA-Vorläufern resultiert in der Herstellung einer Vielzahl von RNA-Transkripten dieser Zielsequenz. Jedes RNA-Transkript dient wiederum als ein Template für die Herstellung eines komplementären DNA-Strangs und dieses Verfahren wird in einer selbst erhaltenen zyklischen Weise unter isothermen Bedingungen fortgeführt, bis die Bestandteile in der Reaktion limitierend oder inaktiviert werden. Dies resultiert in einer großen Amplifikation der Zielnukleinsäuresequenz.
Ein Hauptnachteil ist, dass diese Techniken eine absolute Abhängigkeit von RNA besitzen, die inhärent weniger stabil als DNA ist und gegenüber Abbau empfänglicher ist. Folglich ist die Reaktion gegenüber kontaminierenden Ribonukleasen ultrasensitiv. Typischerweise erfordert das Verfahren RNA als Template und ist nicht geeignet oder optimal mit einem DNA-Template.
Darüber hinaus erfordert das Verfahren mindestens zwei Primer, um die Reaktion zu beginnen, wobei einer der Primer spezifisch so entwickelt sein muss, dass eine Transkriptions-Initiationsstelle für eine RNA-Polymerase aufgenommen wurde.
Weiterhin gibt es ein Potenzial für Amplicon-Kontaminierung, da eine Vielzahl von Kopien der Template-Nukleinsäure während der Reaktion gebildet wird, um als nachfolgende Templates zu wirken.
Diese Techniken sind zum Nachweis von Mutationen oder Polymorphismen ohne die Hinzufügung weiterer Schritte nicht geeignet.
Strang-Verdrängungs-Amplifikation (SDA; Strand Displacement Amplification)
Die SDA ist ein Amplifikations-Verfahren, das auf der Fähigkeit eines Restriktionsenzyms, den unmodifizierten Strang einer hemi-modifizierten doppelsträngigen DNA an einer spezifischen Erkennungsstelle einzuschneiden, und der Fähigkeit einer 5'-3'-Exonuklease-defizienten DNA-Polymerase beruht, den 3'-Terminus an der resultierenden Einschneidung zu verlängern und hierdurch den stromabwärts gelegenen DNA-Strang zu verdrängen (Walker, G. T. et al., PNAS 89: 392–396 (1992)). Die exponentielle Amplifikation der Ziel-DNA wird durch Koppeln der Reaktionen auf einem Template, in welchem Stränge, die von der Reaktion auf dem Template-Strang verdrängt werden, als Ziel für die Reaktion auf dem komplementären Strang und umgekehrt dienen, erreicht. Im Wesentlichen bildet die Hitze-Denaturierung einer DNA-Probe zwei einzelstränige DNA-Fragmente (T1 und T2). Zwei DNA-Amplifikations-Primer (P1 und P2) sind im Überschuss vorhanden. Das 3'-Ende von P1 bindet an das 3'-Ende von T1, wodurch eine Duplex mit 5'-Überhängen gebildet wird. P2 bindet gleichermaßen an T2. Die 5'-Überhänge von P1 und P2 enthalten eine Erkennungssequenz für ein Restriktionsenzym wie z.B. HincII. Eine 5'-3'-Exonuklease-defiziente Form von DNA-Polymerase aus E. coli verlängert die 3'-Enden der Duplizes unter Verwendung der DNA-Vorläufer dGTP, dCTP, dTTP und dem modifizierten Vorläufer Desoxyadenosin-5-[alpha-thio]-triphosphat, wodurch eine Hemiphosphorthioat-Erkennungsstelle auf P1T1 und P2T2 hergestellt wird. HincII schneidet den ungeschützten Primer-Strang der Hemiphosphorthioat-Erkennungsstellen ein, wodurch die modifizierten komplementären Stränge intakt gelassen werden. Die DNA-Polymerase verlängert das 3'-Ende an dem Einschnitt auf P1T1 und verdrängt den stromabwärts gelegenen Strang, der hinsichtlich seiner Funktion äquivalent zu T2 ist. In ähnlicher Weise resultiert die Verlängerung an dem Einschnitt auf P2T2 in der Verdrängung eines stromabwärts gelegenen Strangs, der hinsichtlich seiner Funktion äquivalent zu T1 ist. Die Einschneide- und Polymerisations-/Verdrängungs-Schritte kehren fortwährend zyklisch auf P1T1 und P2T2 wieder, da die Verlängerung an dem Einschnitt erneut eine einschneidebare HincII-Erkennungsstelle bildet. Die Amplifikation des Ziels ist exponentiell, da von P1T1 verdrängte Stränge als Ziele für P2 dienen und von P2T2 verdrängte Stränge als Ziele für P1 dienen.
Ein Hauptnachteil von SDA ist, dass man spezifisch entwickelte Primer verwenden muss, die eine Stelle für ein spezifisches Restriktionsenzym aufgenommen haben. Typischerweise benötigt man zwei oder mehr Sequenz-spezifische Primer pro Amplicon, um die Reaktion auszuführen. Zusätzlich besitzen die amplifizierten Fragmente, die in dieser Reaktion unter Verwendung eines einzelnen Primers hergestellt wurden, nicht einfach einen definierten 3'-Terminus. Dies ist auch einer der Hauptnachteile von SDA, da ein definierter 3'-Terminus auf einem verdrängten Fragment es einem erlaubt, eine nachfolgende Reaktion mit dem gleichen Fragment zu primen.
WO 97/03210 offenbart ein Verfahren zum schnellen Nachweisen der Gegenwart oder Abwesenheit einer bestimmten Nukleinsäuresequenz an einem Kandidaten-Locus in einer Zielnukleinsäure-Probe umfassend die Schritte: i) Einführen einer modifizierten Base, die ein Substrat für eine DNA-Glycosylase ist, in den Kandidaten-Locus an einer oder mehrerer vorausgewählter Positionen; ii) Ausschneiden der modifizierten Base mittels dieser DNA-Glycosylase, um eine abasische Stelle zu bilden; iii) Spalten von Phosphat-Bindungen an den abasischen Stellen, die in Schritt ii) gebildet wurden; und iv) Analysieren der Spaltprodukte von Schritt iii), um in dieser Zielnukleinsäure-Sequenz die Gegenwart oder Abwesenheit dieser bestimmten Nukleinsäure-Sequenz an diesem Kandidaten-Locus zu identifizieren. Das Verfahren besitzt besondere Anwendung beim Nachweisen spezifischer Mutationen in einer DNA-Probe, einschließlich des Nachweises von mehreren bekannten Mutationen in DNA.
WO 99/54501 offenbart ein Verfahren zum Charakterisieren von Nukleinsäure-Molekülen umfassend die Schritte i) Einführen einer modifizierten Base, z.B. Uracil, welche ein Substrat für eine DNA-Glycosylase ist, in ein DNA-Molekül; ii) Ausschneiden der modifizierten Base mittels dieser DNA-Glycosylase, um eine abasische Stelle zu bilden; iii) Spalten der DNA an der abasischen Stelle, um ein stromaufwärts gelegenes DNA-Fragment zu bilden, das verlängert werden kann; und iv) Inkubieren des verlängerbaren stromaufwärts gelegenen Fragments in Gegenwart eines Enzyms, z.B. einer Polymerase oder einer Ligase, das dessen Verlängerung ermöglicht, und einer Template-Nukleinsäure und Analysieren des/der resultierenden Fragments/e. Allerdings ist im Falle des in WO 99/54501 beschriebenen Verfahrens die Spaltung von DNA an der Stelle, an der die Base ausgeschnitten wurde, kritisch.
Im Falle des wie in WO 99/54501 beispielhaft dargestellten Verfahrens wurde die Reaktionsmischung, die die amplifizierte Zielnukleinsäure trägt, mit Exonuklease I, um die in dem Amplifikationsschritt nicht verlängerten Primer zu verdauen, und mit alkalischer Phosphatase aus Garnelen, um während des Amplifikationsschrittes nicht eingebaute dNTPs zu verdauen, behandelt. Folglich trat keine weitere Amplifikation der Template-Nukleinsäure auf und das Verfahren war auf einen einzigen Zyklus beschränkt.
Folglich ist es wichtig, ein verbessertes Verfahren zur Amplifikation und Charakterisierung von Nukleinsäuren zu entwickeln, das vielseitiger anwendbar, spezifischer ist, einen höheren Durchsatz bietet, das Bündeln von Reaktionen erleichtert und die Bildung von einzelsträngiger DNA erlaubt.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Amplifikation einer Template-Nukleinsäure bereit, das das gleichzeitige Ausführen der folgenden Schritte umfasst:

(i) Umsetzen eines Nukleinsäureprimers mit der Template-Nukleinsäure, normalen DNA-Vorläufer-Nukleotiden, mindestens einem modifizierten DNA-Vorläufer-Nukleotid und einer DNA-Polymerase, um einen verlängerten Nukleinsäureprimer zu erhalten, wobei der Nukleinsäureprimer an das Template gebunden bleibt;
(ii) Spalten des verlängerten Nukleinsäureprimers, der die modifizierte Base enthält, um einen freien 3'-OH-Terminus zu bilden, der durch die DNA-Polymerase verlängerbar ist; und
(iii) Wiederholen der Schritte (i) und (ii) mit den hierdurch gebildeten DNA-Fragmenten.

In einer Ausführungsform wird der verlängerte Nukleinsäureprimer, der eine modifizierte Base enthält, durch eine 3'-Endonuklease gespalten.
In dieser Ausführungsform ist die 3'-Endonuklease vorzugsweise Endonuklase V aus E. coli oder deren Homologe, die in anderen Organismen gefunden werden.
In einer alternativen Ausführungsform umfasst das Verfahren die Schritte:

(i) Umsetzen eines Nukleinsäureprimers mit der Template-Nukleinsäure, normalen DNA-Vorläufer-Nukleotiden, mindestens einem modifizierten DNA-Vorläufer-Nukleotid, das ein Substrat für eine DNA-Glycosylase ist, und einer DNA-Polymerase, um einen verlängerten Nukleinsäureprimer zu erhalten, wobei der Nukleinsäureprimer an das Template gebunden bleibt;
(ii) Ausschneiden der modifizierten Base des modifizierten DNA-Vorläufer-Nukleotids aus dem verlängerten Nukleinsäureprimer mittels einer DNA-Glycosylase, um eine abasische Stelle zu bilden;
(iii) Spalten des verlängerten Nukleinsäureprimers an der abasischen Stelle, um einen freien 3'-OH-Terminus zu bilden, der durch die DNA-Polymerase verlängerbar ist; und
(iv) Wiederholen der Schritte (i) bis (iii) mit den hierdurch gebildeten DNA-Fragmenten.

Das erfindungsgemäße Verfahren hat viele spezifische Vorteile, wie dies nachfolgend ausgeführt wird. Allerdings hat das erfindungsgemäße Verfahren allgemeine signifikante Vorteile gegenüber den existierenden Technologien, indem es vielseitiger einsetzbar und flexibler im Hinblick auf das Bereitstellen eines einzelnen High-throughput-Verfahrens ist, das einfach an mehrere verschiedene Formate in den Gebieten des DNA-Nachweises, der DNA-Quantifizierung und -Charakterisierung angepasst werden kann.
Die Erfindung wird nachfolgend prinzipiell mit Bezugnahme auf die Ausführungsform, die die Verwendung einer DNA-Glycosylase einbezieht, beschrieben. Wir haben den Begriff Glycosylase-vermittelte Amplifikation (GMA; gycosylase mediated amplification) für dieses erfindungsgemäße Verfahren geprägt. Allerdings wird auf alle Ausführungsformen der Erfindung hierin gemeinsam unter dem Acronym GMA Bezug genommen.
In dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das modifizierte DNA-Vorläufer-Nukleotid folglich ein Substrat für eine DNA-Glycosylase sein oder durch eine 3'-Endonuklease, wie hierin beschrieben, erkannt werden.
Typischerweise kann der Nukleinsäure-Template-Strang jeder beliebige Strang aus einer natürlichen oder künstlich synthetisierten Nukleinsäure sein.
Vorzugsweise ist die Template-Nukleinsäure DNA.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird durch den Nukleinsäureprimer geprimt/initiiert. Der Einfachheit halber wird der Primer, der für die Initiierung der Reaktion verantwortlich ist, hierin als der initiierende Primer (IP) bezeichnet.
Der IP kann jede Nukleinsäure mit einem freien 3'-OH-Terminus sein, der durch eine DNA-Polymerase verlängert werden kann. Der IP kann künstlich synthetisiert sein, z.B. ein synthetisches Oligonukleotid, oder direkt oder indirekt von einer natürlich vorkommenden Nukleinsäure stammen.
In einer Ausführungsform ist der Nukleinsäureprimer ein DNA-Primer.
Die normalen DNA-Vorläufer-Nukleotide sind die Desoxyribonukleotidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP. Unter bestimmten limitierten Umständen können auch Didesoxynukleotidtriphosphate verwendet werden und in die Reaktion eingeschlossen sein. Daher schließen mögliche normale Vorläufer auch ddATP, ddCTP, ddGTP und ddTTP ein.
Vorzugsweise sind die DNA-Vorläufer-Nukleotide ausgewählt aus dATP, dCTP, dGTP und dTTP.
Eine jede einiger Nukleinsäure-Polymerasen kann in der GMA verwendet werden. Wenn ein DNA-Template verwendet wird, wird eine DNA-Polymerase verwendet. Wenn ein RNA-Template verwendet wird, ist eine DNA-Polymerase, die ein RNA-Template verwenden kann, erforderlich, typischerweise ist ein solches Enzym reverse Trankriptase. Typischerweise werden zwei Klassen von DNA-Polymerasen in Abhängigkeit davon verwendet, ob eine Verdrängung oder Verdauung der Nukleinsäure, die stromabwärts von dem verlängernden Primer gelegen ist, erforderlich ist. Wenn eine Strangverdrängung erforderlich ist, wodurch verdrängte Fragmente gebildet werden, wird eine DNA-Polymerase verwendet, die keine 5'-3'-Exonuklease-Aktivität besitzt. Im Gegensatz dazu wird die stromabwärts gelegene DNA in jedem Zyklus der GMA-Reaktion abgebaut, wenn eine DNA-Polymerase mit 5'-3'-Exonuklease-Aktivität verwendet wird. Dies führt auch zu der Bildung eines nachweisbaren Produkts, was nachfolgend näher diskutiert wird.
Es gibt einige modifizierte Vorläufer-Nukleotide, die, wenn sie in DNA eingebaut werden, ein Substrat für eine DNA-Glycosylase werden und/oder durch eine 3'-Endonuklease erkannt werden, wie jeweils anwendbar. In dem letztgenannten Fall steuert das modifizierte Vorläufer-Nukleotid die Spaltung durch ein 3'-Endonuklease-Enzym hin zu einer Phosphodiester-Bindung 3' von der Stelle ihres Einbaus.
In jedem Fall hängt die Spaltung von der Gegenwart der modifizierten Base in der DNA ab und dieses diktiert die Spaltung der DNA und diktiert den Ort der Spaltung auf eine der beiden Arten, nämlich 1) Ausschneiden der modifizierten Base durch die Glycosylase und Spaltung der nachfolgenden abasischen Stelle oder 2) Spaltung des verlängerten Nukleinsäureprimers an der zweiten Phosphodiester-Bindung an der 3'-Seite der Stelle des Einbaus der modifizierten Base durch ein 3'-Endonuklease-Enzym. In einer Ausführungsform ist der modifizierte Nukleinsäure-Vorläufer dUTP.
Das modifizierte Vorläufer-Nukleotid dUTP ist ein Base-Zucker-Phosphat, das die Base Uracil und eine Zucker-Phosphat-Komponente enthält. Die Primer-Verlängerung auf dem Template unter Verwendung der Vorläufer-Nukleotide dATP, dCTP, dGTP und dUTP anstelle von dTTP resultiert in einer neu synthetisierten DNA, die komplementär zu dem Template ist, wobei Thymin vollständig durch Uracil ersetzt wird.
Allerdings wird vom Fachmann anerkannt werden, dass andere modifizierte Nukleinsäure-Vorläufer auch verwendet werden können, wie z.B. dITP und 8-OH-dGTP.
Das modifizierte Vorläufer-Nukleotid dITP ist ein Base-Zucker-Phosphat, das die Base Hypoxanthin und eine Zucker-Phosphat-Komponente enthält. Das modifizierte Vorläufer-Nukleotid 8-OH-dGTP ist ein Base-Zucker-Phosphat, das die Base 8-OH-Guanin und eine Zucker-Phosphat-Komponente enthält.
Die Glycosylase-Substrat-Vorläufer dUTP, dITP und 8-OH-dGTP bilden, wenn sie in DNA eingebaut werden, die Glycosylase-Substrat-Basen Uracil, Hypoxanthin bzw. 8-OH-Guanin.
In einer Ausführungsform ist die DNA-Glycosylase Uracil-DNA-Glycosylase (UDG).
Uracil in der DNA wird spezifisch durch UDG erkannt und aus DNA freigesetzt. UDG erkennt auch andere mit Uracil verwandte Basen, wenn sie in der DNA vorhanden sind.
Viele DNA-Glycosylasen wurden bereits beschrieben. Diese Enzyme spalten die N-glycosidische Bindung, die die Glycosylase-Substrat-Base mit dem DNA-Rückgrat verbindet. Dies setzt die Base aus der DNA frei und bildet eine abasische Stelle.
Andere geeignete DNA-Glycosylasen schließen Alkylpurin-DNA-Glycosylasen (ADG) oder Formamidpyridin-DNA-Glycosylase (FPG) ein.
Hypoxanthin wird spezifisch durch Alkylpurin-DNA-Glycosylasen (ADG) erkannt und aus DNA freigesetzt. Dieses Enzym erkennt auch N3-Methyladenin, N3-Methylguanin, O²-Methylcytosin und O²-Methylthymin, wenn es in DNA vorhanden ist, und setzt es frei. 8-OH-Guanin wird spezifisch durch FPG-DNA-Glycosylasen erkannt und aus DNA freigesetzt. Dieses Enzym ersetzt auch Purine mit geöffnetem Ring, wenn diese in DNA vorhanden sind, und setzt sie frei.
Es sind einige Mittel bekannt, die die Phosphodiester-Bindungen in Nukleinsäuren an abasischen Stellen spalten. Die Spaltung der Bindung kann 5' der abasischen Stelle oder 3' der Stelle sein. Die 5'-Spaltung kann proximal oder distal zu der Phosphat-Komponente auftreten und ein stromaufwärts gelegenes Fragment bilden, das einen 3'-Terminus mit einer freien 3'-OH-Gruppe bzw. 3'-Phosphat-Gruppe besitzt. 3'-OH-Termini sind durch DNA-Polymerasen auf dem Template verlängerbar, wohingegen 3'-Phosphat-Termini nicht verlängerbar sind. Solche 3'-Phosphat-Termini können im Allgemeinen durch eine Behandlung mit einem Phosphatase-Enzym wie z.B. T4-Polynukleotid-Kinase, die eine 3'-Phosphatase-Aktivität besitzt, verlängerbar gemacht werden. Mittel, die 5' von der Phosphat-Komponente spalten und einen 3'-Terminus mit einem freien 3'-OH bilden, sind die Enzyme mit AP-Endonuklease-Aktivität, wie z.B. AP-Endonuklease IV aus E. coli. Mittel, die 3' von der Phosphat-Komponente spalten und einen 3'-Terminus mit einer 3'-P-Gruppe bilden, sind Alkali, Hitze und bestimmte DNA-Reparatur-Enzyme wie z.B. FPG und basische Proteine und Peptide. Mittel, die 3' von der abasischen Stelle spalten, schließen Hitze und DNA-Reparatur-Enzyme mit AP-Lyase-Aktivität ein, wie z.B. Endonuklease III aus E. coli. Solche 3'-Desoxyribophosphat-(dRp)-Termini können im Allgemeinen durch Behandlung mit einer AP-Endonuklease verlängerbar gemacht werden. FPG-DNA-Glycosylase spaltet sowohl 5' als auch 3' der abasischen Stelle.
Vorzugsweise wird die verlängerte Nukleinsäure an der abasischen Stelle mittels eines Enzyms gespalten, das an einer Nukleinsäure der abasischen Stelle spaltet.
Weiterhin bevorzugt ist das Enzym eine AP-Endonuklease, insbesondere AP-Endonuklease IV, die 5' der abasischen Stelle spaltet und einen freien 3'-OH-Terminus bildet.
Wenn der verlängerte Primer durch eine 3'-Endonuklease gespalten wird, hängt die Spaltung des verlängerten Primers durch ein solches Enzym von der Gegenwart einer modifizierten Base in dem verlängerten Primer ab und die Spaltung tritt an einer Phosphodiester-Bindung an der 3'-Seite (d.h. stromabwärts) der Stelle der Aufnahme der modifizierten Base auf. Im Gegensatz zu der Wirkung der Glycosylase und AP-Stellen-Spaltung bezieht die Spaltung des verlängerten Primers durch die 3'-Endonuklease nicht das Ausschneiden der modifizierten Base ein und bezieht nicht die Bildung einer abasischen Stelle ein. Die Spaltung durch die 3'-Endonuklease hängt von der Gegenwart einer modifizierten Base in dem verlängerten Primer und der Erkennung dieser modifizierten Base durch das Enzym ab. Die Spaltung tritt für gewöhnlich bei der zweiten Phosphodiester-Bindung auf der 3'-Seite der modifizierten Base/des modifizierten Nukleotids auf. Dieses Spaltungsereignis resultiert in der Bildung eines Einschnitts in dem DNA-Strang, wobei eine 3'-OH- und eine 5'-Phosphoryl-Gruppe gebildet werden. Die DNA-Polymerase, die in der Reaktion vorhanden ist, kann dann von der freien 3'-OH-Gruppe aus verlängern. Wie vorstehend erwähnt, kann die 3'-Endonuklease die Endonuklease V aus Escherichia coli sein. Endonuklease V erkennt einige modifizierte Basen in DNA einschließlich Uracil, Hypoxanthin (Inosin) und Harnstoffreste. Zusätzlich zur Spaltung von DNA mit modifizierten Basen kann die Endonuklease V auch DNA spalten, die abasische Stellen enthält. Daher könnte unter bestimmten Umständen die Endonuklease V verwendet werden, um den verlängerten Primer in Kombination mit der Wirkung einer DNA-Glycosylase, die eine abasische Stelle in der DNA bildet, zu spalten.
In einer Ausführungsform ersetzt das modifizierte Vorläufer-Nukleotid teilweise eines der normalen Vorläufer-Nukleotide.
Zum Beispiel resultiert die Primer-Verlängerung auf einem Template unter Verwendung der Vorläufer-Nukleotide dATP, dCTP, dGTP und dTTP zusätzlich zu dem modifizierten Vorläufer-Nukleotid dUTP in neu synthetisierter DNA, die zu dem Template komplementär ist, wobei Thymin nach dem Zufallsprinzip durch Uracil ersetzt wird. Das Uracil wird in den neu synthetisierten DNA-Strang während des DNA-Syntheseprozesses an Stellen eingebaut, die zu Adeninresten in dem Template-DNA-Strang komplementär sind. So werden die stromabwärts gelegenen verdrängten Fragmente durch die Position des zufälligen Einbaus des dUMP in die neu synthetisierte DNA abgegrenzt. Dies resultiert in der Bildung von verdrängten Fragmenten mehrerer Größen gemäß dem Austausch von dUTP- mit dTTP-Aufnahme in den komplementären Strang gegenüber den A-Resten in dem Template-Nukleinsäurestrang.
Ein ähnlicher Ansatz, in dem dITP an die Stelle von dGTP oder 8-OH-dGTP an die Stelle von dGTP gesetzt wird, führt zum vollständigen oder teilweise Ersetzen von dGTP durch Hypoxanthin bzw. 8-OH-Guanin, an den Positionen, die zu Cytosin-Resten in dem Template-DNA-Strang komplementär sind, in der neu synthetisierten DNA, die zu dem Template komplementär ist. Das vollständige oder teilweise Ersetzen einer oder mehrere der regulären DNA-Vorläufer mit einem oder mehreren Didesoxy-Terminator-Nukleotiden (ein Nukleotid, das die weitere Verlängerung eines Primers auf einem Template unterbindet, sobald es eingebaut wird) kann verwendet werden, um die Primer-Verlängerung durch eine DNA-Polymerase zu beenden, falls das gewünscht wird. Das teilweise Ersetzen einer oder mehrerer regulärer DNA-Vorläufer mit einem oder mehreren Didesoxy-Terminator-Nukleotiden beendet die Primer-Verlängerung an mehreren verschiedenen Positionen auf dem Template-Strang und bildet terminierte Primer mehrerer verschiedener Längen. Das vollständige Ersetzen einer oder mehrerer regulärer DNA-Vorläufer mit einem oder mehreren Didesoxy-Terminator-Nukleotiden beendet die Primer-Verlängerung an spezifischen Positionen auf dem Template-Strang und bildet terminierte Primer spezifischer Längen. Mehr als ein modifiziertes Vorläufer-Nukleotid kann in der GMA mit einem oder mehreren DNA-Glycosylasen verwendet werden. Zwei DNA-Glycosylasen können verwendet werden, wobei eine eine modifizierte Base aus dem Primer freisetzt, während die andere die modifizierte Base, sobald sie in die neu synthetisierte DNA aufgenommen wurde, freisetzt.
Die Schritte i) und ii) oder i)–iii) können in einer zyklischen Weise, wie dies in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung geeignet ist, fortgeführt werden, bis eines der Reagenzien limitierend wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann unter isothermen Bedingungen durchgeführt werden.
Folglich ist kein Thermocycling erforderlich, wenn das Verfahren isotherm durchgeführt wird.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist die einzige isotherme Amplifikationsreaktion, die in der Lage ist, mehrere neu synthetisierte und diskrete DNA-Abschnitte in einer Primer-Verlängerungsreaktion unter Verwendung eines einzelnen Primers zu amplifizieren.
Es wird erkannt werden, dass das erfindungsgemäße Verfahren in der Ansammlung verdrängter einzelsträngiger stromabwärts gelegener Fragmente von Nukleinsäuren resultiert, die durch die Orte der modifizierten Basen in einem komplementären Nukleinsäurestrang spezifiziert werden.
Folglich stellt das erfindungsgemäße Verfahren ein Mittel zur Bildung mehrerer Kopien diskreter einzelsträngiger Primer bereit, die stromabwärts eines initiierenden Primers gelegen sind. Dies bietet eine exzeptionelle Spezifität für Nachweiszwecke, da die diskreten stromabwärts gelegenen Primer nur gebildet werden können, wenn die Ziel-Template-Nukleinsäure vorhanden ist. Folglich ist für die DNA-Diagnose GMA eine signifikante Verbesserung gegenüber jedem zuvor beschriebenen Amplifizierungsverfahren im Hinblick auf die Spezifität.
Die Amplifikation von mehreren DNA-Abschnitten aus einer einzelnen Template-Probe ist sehr wünschenswert und stellt gegenwärtig eine Limitation für Amplifikationstechnologien dar. Diese Limitation entsteht zum größten Teil aus der Tatsache, dass die existierenden Technologien eine exponentielle Amplifikation verwenden und/oder mühsamer sind und doppelsträngige Produkte oder einzelsträngige Produkte großer Größe bilden.
Das erfindungsgemäße Verfahren bietet signifikante Vorteile gegenüber den existierenden Verfahren für gebündelte Amplifikation von DNA-Abschnitten.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch zur Bildung mehrerer Kopien diskreter einzelsträngiger Primer stromabwärts eines initiierenden Nukleinsäureprimers verwendet werden.
Die verdrängten stromabwärts gelegenen Fragmente können in einer Folgereaktion verlängert werden.
Darüber hinaus können die verdrängten stromabwärts gelegenen Fragmente auf einer zweiten Template-Nukleinsäure verlängert werden.
Auch können mehrere Zweit-Templates auf einem DNA-Chip immobilisiert werden.
Diese Aspekte der Erfindung werde nachfolgend näher beschrieben.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann in Nachweis-Diagnostika verwendet werden. Auch kann das Verfahren z.B. beim Nachweis von Pathogenen verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch beim Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit von Mutationen und beim Nachweis von Polymorphismen verwendet werden.
Es wird anerkannt werden, dass das erfindungsgemäße Verfahren bei der Quantifizierung eines Nukleinsäurespiegels in einer Probe verwendet werden kann.
Das erfindungsgemäße GMA-Verfahren kann sowohl qualitativ als auch quantitativ durch verschiedene Mittel gemessen werden. Daher können die Eigenschaften und die Menge an IP und/oder seiner komplementären Annealing-Stelle auf einer Template-Nukleinsäure durch die Fähigkeit des IPs beurteilt werden, eine GMA-Reaktion auf diesem Template zu primen. Die erfindungsgemäß erzielte Auflösung, falls gewünscht, kann hoch genug sein, um einzelne Basenunterschiede zwischen IPs und/oder dem Template oder Zielnukleinsäure zu bestimmen, und dies basiert auf dem erfolgreichen Primen einer GMA-Reaktion. Da der IP direkt oder indirekt von einer natürlich vorkommenden Nukleinsäure stammen kann und die GMA eine qualitative und quantitative Charakterisierung der IPs erlaubt, kann die GMA daher benutzt werden, um Nukleinsäuren qualitativ und quantitativ zu charakterisieren. Dies hat eine hohe Nützlichkeit in den Gebieten des Nachweises, der Diagnose und Quantifizierung von Nukleinsäuren. Dies schließt z.B. den Nachweis und die Quantifizierung von pathogenen Mikroorganismen wie bestimmten Bakterien und Viren, den Nachweis ihrer Varianten, den Nachweis von Mutationen, die eine humane Krankheit verursachen, den Nachweis von Einzel-Nukleotid-Polymorphismen und die Quantifizierung der Menge/des Titers von spezifischen mRNA-Spezies in Gewebeproben ein.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat signifikante Vorteile gegenüber den existierenden Technologien auf dem Gebiet der Quantifizierung. Da die Kinetiken der GMA linear sind, ist die GMA-Reaktion einfacher als existierende Amplifikationstechnologien mit exponentiellen Kinetiken nachzuweisen und zu messen/quantifizieren.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat auch signifikante Vorteile gegenüber existierenden Technologien auf dem Gebiet der Kontaminationskontrolle. Der Grund hierfür ist, dass im Gegensatz zu existierenden Technologien die GMA in ihrem Grundformat keine neuen Templates für die anschließende Verwendung durch Initiieren der Primer synthetisiert und die Kinetiken des Verfahrens linear sind.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch in der Signalamplifikation von jeder beliebigen Nukleinsäure, die als ein Primer oder Template wirken kann, verwendet werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren hat signifikante Vorteile gegenüber existierenden Technologien, indem sie die Signalamplifikation aus einem initiierenden Primer unter Verwendung eines einzelnen linearen Templates erlaubt. Die GMA nimmt den initiierenden Primer nicht in die amplifizierten verdrängten stromabwärts gelegenen Fragmente auf. Dies bietet den Vorteil, dass die verdrängten stromabwärts gelegenen Fragmente keinen 5'-Schwanz besitzen, der immer der initiierende Primer ist. Darüber hinaus bedeutet dies, dass die verdrängten stromabwärts gelegenen Fragmente in einer Folgereaktion verlängert werden können, um komplementäre verdrängte stromabwärts gelegene Fragmente ohne Sequenzen, die zu dem initiierenden Primer komplementär sind, herzustellen.
Das erfindungsgemäße Verfahren ist dahingehend einzigartig, dass es in einem einzelnen Reaktionsgefäß durchgeführt werden kann, wobei die Verlängerung eines IPs auf einem Template neue Primer bildet und amplifiziert, die von dem IP verschieden sind und die anschließend als IPs auf dem gleichen Template, von dem sie stammen, oder einem anderen Template, dienen können.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein Flussdiagramm einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, das unter anderem in Beispiel 1 beschrieben ist; und
2 zeigt ein Flussdiagramm einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, das in Beispiel 4 beschrieben ist.

Eine Ausführungsform der Erfindung wird mit Bezugnahme auf 1 wie folgt illustriert:

Ereignis 1	Die Primer binden an eine komplementäre Sequenz auf dem Template;
Ereignis 2	Nach der Bindung wird der freie 3'-OH-Terminus des Primers durch die DNA-Polymerase verlängert. Dies erfolgt durch Polymerisierung der Vorläufer-Nukleotide an dem 3'-OH-Terminus des Primers. Die Vorläufer-Nukleotide (dATP, dCTP, dGTP und/oder dTTP) werden in den sich verlängernden Primer zusätzlich zu dem modifizierten Vorläufer-Nukleotid gemäß der Sequenz des Templates eingebaut. Das modifizierte Vorläufer-Nukleotid ersetzt normalerweise eines der normalen Vorläufer-Nukleotide entweder vollständig oder teilweise. Der neu synthetisierte DNA-Strang ist zu dem anfänglichen Template komplementär und wird hierin als der komplementäre Template-Strang bezeichnet;
Ereignis 3	Nachdem das modifizierte Vorläufer-Nukleotid in die neu synthetisierte DNA eingebaut wurde, enthält diese DNA dann eine modifizierte Base, die ein Substrat für die spezifische DNA-Glycosylase ist. Folglich wird jedes Mal, wenn eine modifizierte Base in der neu synthetisierten DNA erscheint, diese aus der DNA durch Spaltung der N-glykosidische-Bindung, die die Base mit der Desoxyribose-Komponente in der DNA verbindet, freigesetzt. Dies resultiert in der Herstellung einer abasischen Stelle, die im Wesentlichen eine Desoxyribose-Komponente ist, die mit der flankierenden

	DNA durch eine Phosphodiester-Bindung auf der proximalen und der distalen Seite, d.h. 5' und 3' der Desoxyribose-Komponente, wobei die 5'-Bindung dem ursprünglichen Primer am nächsten ist, verbunden ist; und
Ereignis 4	Die abasische Stelle ist z.B. ein Substrat für das AP-Endonuklease- (APE) -Enzym. Folglich wird jedes Mal, wenn eine abasische Stelle auftritt, diese durch APE gespalten. Dieses Enzym spaltet die Phosphodiester-Bindung 5' der Desoxyribose-Komponente, wodurch ein freier 3'-OH-Terminus auf dem stromaufwärts gelegenen DNA-Abschnitt und eine Desoxyribose-Komponente, die an das 5'-Ende des stromabwärts gelegenen Abschnitts geknüpft ist, gebildet wird.
Ereignis 5	Die DNA-Polymerase, die in der Reaktion vorhanden ist, synthetisiert neue DNA aus diesem neu gebildeten 3'-OH-Terminus des stromaufwärts gelegenen Fragments jedes Mal, wenn dieses gebildet wird, und verdrängt dadurch die DNA, die stromabwärts der Polymerisation als ein einzelner Strang gelegen ist. Dies resultiert in dem Einbau neuer Vorläufer-Nukleotide, einschließlich modifizierter Vorläufer-Nukleotide, in den neu synthetisierten komplementären Template-Strang und dem Erscheinen einer neuen modifizierten Base an jeder Position in dem neu synthetisierten Strang gegenüber seiner komplementären Base in der Template-Nukleinsäure.

So werden die Reaktionsschritte i) bis iii) gemäß dieser Ausführungsform kontinuierlich zyklisch ausgeführt, bis eines der Reagenzien limitierend wird.
Jeder freie in einem Zyklus der Reaktion gebildete 3'-OH-Terminus wird einmal in jedem anschließenden Reaktionszyklus mit gleichzeitiger Verdrängung der stromabwärts gelegenen DNA-Abschnitte verlängert. Da die Reaktion kontinuierlich ist, ist das Nettoergebnis die wiederholte Synthese einer neuen DNA aus jedem 3'-OH-Terminus, der gebildet wird, und die Anhäufung der verdrängten stromabwärts gelegenen DNA als diskrete einzelsträngige Fragmente diskreter Größen, die hierin als verdrängte stromabwärts gelegene Fragmente bezeichnet werden, oder verdrängte Fragmente, die durch die Orte der modifizierten Basen in dem komplementären Strang und/oder dem 3'-Terminus auf Grund der Beendigung der DNA-Synthese durch die Polymerase abgegrenzt sind.
Primer, die verlängert und gespalten werden, können sofort wieder durch die Polymerase durch Einbau von Nukleotiden einschließlich modifizierter Vorläufer-Nukleotide verlängert werden. Da die normalen Vorläufer-Nukleotide, modifizierten Vorläufer-Nukleotide, Polymerase, Glycosylase und Spaltmittel alle gleichzeitig in der gleichen Reaktion vorhanden sind, ergibt dies einen kontinuierlichen Kreislauf von Verlängerung und Spaltung bei der Amplifikation von mehreren Kopien verdrängter stromabwärts gelegener Fragmente.
Wenn das modifizierte Vorläufer-Nukleotid dUTP ist, dann ist die modifizierte Base Uracil und die spezifische DNA-Glycosylase, wenn eine solche verwendet wird, ist Uracil-DNA-Glycosylase. Demzufolge sind die verdrängten stromabwärts gelegenen Fragmente durch die Lokalisationen von Uracil in dem komplementären Strang und daher durch die Lokalisation von Adenin-Basen in der Template-Nukleinsäure abgegrenzt und definiert, da Uracil ein normales Watson-Crick-Basenpaar mit Adenin bildet.
Daher bindet der Primer kurz zusammengefasst an das Template und wird durch die DNA-Polymerase verlängert. DesoxyATP, dCTP, dGTP und dUTP werden in den sich verlängernden Primer eingebaut. Die Uracil-DNA-Glycosylase schneidet dann die Uracil-Basen aus dem neu synthetisierten Strang aus und die resultierenden abasischen Stellen werden durch das AP-Endonuklease-Enzym gespalten.
Alternativ erkennt die 3'-Endonuklease Uracil in dem neu synthetisierten Strang und spaltet den Strang an dem zweiten Phosphodiester 3' von der Uracil-Komponente.
Die DNA-Polymerase beginnt dann damit, neue DNA aus den neu gebildeten 3'-OH-Termini jedes Mal, wenn sie gebildet werden, zu synthetisieren und verdrängt die 3' oder stromabwärts gelegene DNA mit fortlaufender Polymerisation. Dies resultiert wiederum in dem Einbau von mehr Uracil in die neu synthetisierte DNA, welches anschließend ausgeschnitten und/oder erkannt wird; die DNA wird gespalten und die Polymerisation beginnt von dem neuen 3'-OH-Terminus.
Die GMA kann bei mesophilen oder thermophilen Temperaturen ausgeführt werden. Eine DNA-Polymerase, wie z.B. die DNA-Polymerase Klenow-Fragment-Exo^– aus E. coli kann bei mesophilen Temperaturen (üblicherweise zwischen 25°C und 42°C und typischerweise bei 37°C) verwendet werden, wohingegen bei thermophilen Temperaturen (typischerweise zwischen 50°C und 80°C, obwohl sie höher sein kann) thermostabile DNA-Polymerasen wie z.B. eine Strang-verdrängende DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus (Stoffel-Fragment) verwendet werden können. Beide Typen von Polymerase können gemeinsam oder nacheinander zu der Reaktion zugefügt werden. Wenn eine hohe Transkriptionsrate (processivity) erforderlich ist, so dass ein Primer auf eine ansehnliche Länge verlängert wird, bevor die Polymerase von der DNA dissoziiert, kann eine sehr progressiv arbeitende Polymerase verwendet werden. Im Gegensatz dazu kann, wenn eine niedrige Transkriptionsrate erforderlich ist, so dass ein Primer auf eine kurze Länge verlängert wird, bevor die Polymerase von der DNA dissoziiert, eine weniger progressiv arbeitende Polymerase verwendet werden. Wenn ein RNA-Template verwendet wird, kann eine reverse Transkriptase mit Strangverdrängungsaktivität für die GMA-Reaktion verwendet werden.
In dem einfachsten Fall wird ein künstlicher oder synthetischer Primer als der IP zur Verfügung gestellt, um die GMA-Reaktion auf einer gegebenen Template- oder Zielnukleinsäure zu primen. Der IP wird so gewählt, dass er mit einer spezifischen Zielsequenz in dem Template hybridisiert. Nach Hybridisierung des IP beginnt die GMA und der verlängerte IP wird wiederholt in einer zyklischen Reaktion verlängert, was in der Amplifikation der verdrängten, stromabwärts gelegenen Fragmente resultiert. Diese verdrängten Fragmente können unter Verwendung mehrerer verschiedener Ansätze gemäß veröffentlichter Vorgehensweise qualitativ und quantitativ charakterisiert werden.
Der direkte Nachweis von verdrängten Fragmenten kann durch eine Vielzahl von Mitteln erreicht werden, z.B. können sie geeignet markiert sein.
Das Markieren von verdrängten Fragmenten kann durch eine Vielzahl von Mitteln einschließlich der Zugabe eines radioaktiven, fluoreszierenden oder markierten Liganden zu den Fragmenten während oder nach der Synthese durchgeführt werden. Die Verwendung eines markierten Vorläufer-Nukleotids in einer beliebigen der Verlängerungsreaktionen erleichtert den Nachweis dieser Fragmente. Direkte DNA-Färbeverfahren, wie z.B. Silber- oder Ethidiumbromid-Färbung erleichtert ihren Nachweis nach Größentrennung auf Grundlage der Mobilität in der Elektrophorese. Die Hybridisierung von komplementären oder Test-Nukleinsäuren mit diesen Fragmenten kann verwendet werden, um diese zu identifizieren und solche komplementären oder Test-Nukleinsäuren können immobilisiert werden und direkt mit den verdrängten Fragmenten hybridisiert werden. In diesem Zusammenhang sind DNA-Makroarrays, DNA-Mikroarrays und DNA-Chips sehr geeignet. Alternativ können die verdrängten Fragmente auch als ein überbrückendes Hybridisierungs-Molekül dienen, so dass eine Test-Nukleinsäure, die immobilisiert wird, mit einem Teil eines verdrängten Fragments hybridisiert wird und eine zweite Test- oder Reporter-Nukleinsäure mit dem Rest des verdrängten Fragments hybridisiert. Wiederum sind DNA-Makroarrays und DNA-Mikroarrays in diesem Zusammenhang sehr geeignet.
Die komplementären oder Test-Nukleinsäuren können geeigneter Weise mit einer Vielzahl von direkt oder indirekt markierenden Ansätzen wie z.B. Reporter-Quencher-Fluoreszenzfarbstoff-Verfahren markiert werden. Da die verdrängten Fragmente einzelsträngig sind, wird die Hybridisierung mit komplementären Molekülen doppelsträngige Nukleinsäuren schaffen, die unter Verwendung von doppelsträngigen spezifischen Proben wie z.B. SYBR-Grün nachgewiesen werden können. Dies kann in der erfindungsgemäßen GMA-Reaktion durch Einschließen von DNA, die zu den verdrängten Fragmenten komplementär ist, zusätzlich zu dem SYBR-Grün-Reagenz, welches spezifisch doppelsträngige DNA bindet, erreicht werden.
Die Sequenz der verdrängten Fragmente und insbesondere ihre 3'-Enden können auf Grund ihrer Fähigkeit bestimmt werden, als initiierende Primer in einer anschließenden oder der gleichen GMA-Reaktion zu wirken. Im Wesentlichen basiert eine solche Bestimmung auf der Fähigkeit dieser Fragmente und insbesondere ihrer 3'-Enden mit einer ausgewählten komplementären Sequenz auf dem Template unter ausgewählten Bedingungen zu hybridisieren und als ein IP in einer GMA-Folgereaktion zu dienen. Es wird anerkannt werden, dass mehrere Möglichkeiten zur Auswahl von komplementären Sequenzen auf einem Template und von Template-Molekülen selbst bestehen. Gleichwohl ist die Fähigkeit eines verdrängten Fragments, selbst als ein IP in einer GMA-Reaktion zu wirken, ein Maß seiner Hybridisierung zu oder Mangel an Hybridisierung zu einer ausgewählten Zielsequenz und folglich erfolgt die Bestimmung der Natur der Sequenz eines Teils oder des gesamten verdrängten Fragments auf dieser Grundlage.
Der Nachweis des verdrängten Fragments ist vom Gesichtspunkt der Spezifität aus gesehen sehr vorteilhaft, da seine Bildung abhängt von a) der erfolgreichen Hybridisierung des IPs an das Ziel-Template und b) dem Primen einer GMA-Reaktion auf dem richtigen Template. Folglich ist der Nachweis des vorhergesagten, verdrängten Fragments ein Beweis dafür, dass das IP an die korrekte Region auf dem korrekten Template hybridisierte.
Die Identität oder Sequenz des verdrängten Fragments kann unter Verwendung einer Vielzahl von Ansätzen einschließlich Hybridisierung, Messung der Masse und seiner Fähigkeit, direkt an eine Nukleinsäure ligiert zu werden, oder seiner Fähigkeit, als komplementärer Strang, der für die Ligation einer oder mehrerer Nukleinsäure-Moleküle erforderlich ist, zu wirken, festgestellt werden. Zum Beispiel kann es durch Beurteilung seiner Fähigkeit, als ein überbrückendes Hybridisierungs-Molekül für die Ligation des 5'- und 3'-Endes einer linearen Test-DNA dienen, um einen Ring zu bilden, nachgewiesen und charakterisiert werden. Das hybridisierte, verdrängte Fragment oder ein zusätzlicher Primer kann dann als ein IP für eine GMA-Reaktion auf dem neuen zirkulären Template dienen, was in der Amplifikation der DNA durch einen „Rolling Circle Replication-" (RCR) -Mechanismus resultiert.
Es sollte auch festgestellt werden, dass zusätzlich zu seiner Wirkung als ein IP ein verdrängtes stromabwärts gelegenes Fragment auch als ein Template in einer anschließenden GMA-Reaktion wirken kann.
Es gibt viele Verfahren, mit denen ein IP gebildet werden kann. In allen Fällen muss das zur Verfügung gestellte oder gebildete IP einen freien 3'-OH-Terminus haben, so dass es den anschließenden DNA-Polymerisierungsschritt primen kann.
Die künstliche Synthese eines IPs ermöglicht eine Vielzahl von Möglichkeiten im Hinblick auf die Synthese, das Design und die Modifikation des IPs. Viele verschiedene Modifikationen künstlich synthetisierter Primer wurden bereits beschrieben. Diese schließen Modifikationen der Base, des Zuckers und der Phosphodiester-Bindung ein und schließen jene ein, wodurch Glycosylase-Substrat-Basen wie z.B. Uracil, Hypoxanthin und 8-Hydroxy-Guanin in den Primer eingebaut werden.
Typischerweise wird ein Standard- oder modifiziertes IP synthetisiert, um spezifisch mit der vollständigen oder einem Teil seiner komplementären Sequenz auf einer Template-Nukleinsäure übereinzustimmen. Es ist gut etabliert, dass das Komplementärsein zwischen den Basen an dem 3'-Ende eines potentiell verlängerbaren Primers und dem Template einer der Schlüsselparameter ist, der bestimmt, ob der IP auf diesem Template verlängert werden wird. Ein IP, der vollständig komplementär zu einem Abschnitt des Templates ist, kann durch DNA-Polymerase verlängert werden, wohingegen ein IP, der mit Ausnahme der Base an seinem 3'-Terminus vollständig komplementär zu dem Abschnitt des Templates ist, unter stringenten Bedingungen nicht verlängert wird. Folglich wird anerkannt werden, dass die Verlängerung eines IPs auf einem Template verwendet werden kann, um zwischen nahe verwandten IPs zu unterscheiden, die sich lediglich durch eine einzelne Base unterscheiden. In ähnlicher Weise wird anerkannt werden, dass die Verlängerung eines IPs auf dem Template verwendet werden kann, um zwischen nahe verwandten Templates zu unterscheiden, die sich lediglich durch eine einzelne Base unterscheiden. Dieser Ansatz ist von besonderer Wichtigkeit in dem Gebiet der Humangenetik, wo er den Nachweis von Mutationen und Polymorphismen wie z.B. Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) ermöglicht.
Es ist gut etabliert, dass die Stringenz der Hybridisierungsbedingungen zwischen dem IP und einem Template beträchtlich variiert werden kann. Niedrig stringente Bedingungen ermöglichen eine Hybridisierung geringer Spezifität zwischen DNA-Molekülen. Folglich können unter niedrig stringenten Bedingungen DNA-Moleküle miteinander hybridisieren, die teilweise komplementär sind. Daher könnte unter solchen Bedingungen ein teilweise komplementäres IP mit einem Template hybridisieren. Unter solchen Bedingungen kann ein einzelnes IP an eine oder mehrere teilweise komplementäre Stellen auf einer Template-Nukleinsäure hybridisieren und dort verlängert werden. Wenn die Stringenzbedingungen so niedrig sind, dass das Primen an mehreren Stellen auftritt, wird das Verfahren als „Random Priming" bezeichnet (obwohl das Primen nicht vollständig zufällig ist, da eine signifikante Übereinstimmung zwischen den fünf am meisten 3'-gelegenen Basen des IPs und dem Template für gewöhnlich erforderlich ist). Mit steigender Stringenz wird die Hybridisierung zunehmend spezifisch und die Hybridisierungsbedingungen, die nur die Hybridisierung eines vollständig komplementären Primers erlauben, aber die Hybridisierung eines teilweise komplementären Primers ausschließen, sogar wenn er sich nur durch eine Base unterscheidet, können leicht gefunden werden. Während der Hybridisierung gibt es eine Anzahl von Parametern, durch die die Stringenz der Hybridisierung verändert werden kann, wie z.B. die Temperatur. Mit steigender Temperatur steigt die Stringenz der Hybridisierung. Folglich kann in enzymatischen Reaktionen, die von der Hybridisierung zwischen DNA-Molekülen abhängen, eine höhere Spezifität bei höheren Temperaturen erreicht werden. Allerdings erfordert das enzymatische Verfahren bei höherer Temperatur gewöhnlicher Weise thermostabile Enzyme.
Der IP kann nach Spaltung eines künstlich synthetisierten Primers oder einer natürlichen Nukleinsäure gebildet werden, so dass ein neuer freier 3'-OH-Terminus hergestellt wird. Die Spaltung kann entweder Einzel- oder Doppelstrang-abhängig, abhängig von der Gegenwart einer modifizierten Base in einem einzelsträngigen oder doppelsträngigen Kontext, sequenzabhängig, abhängig von der Gegenwart einer Basenfehlpaarung oder abhängig von der Gegenwart einer spezifischen Struktur sein. Folglich kann ein Primer durch Glycosylase-vermittelte Spaltung einer Probe gebildet werden, die eine modifizierte Base trägt, die durch eine spezifische Glycosylase in einem einzelsträngigen oder doppelsträngigen Zusammenhang erkannt wird. Ein IP kann auch durch Spaltung einer Probe gebildet werden, die eine Base mit Fehlpaarung trägt, die von einer Endonuklease, die spezifisch für Fehlpaarungen ist, oder einer Glycosylase in einem doppelsträngigen Zusammenhang erkannt wird, z.B. wenn die Probe mit der Template-Nukleinsäure annealt wird. Dies kann durch Entwickeln des Primers, so dass eine Basenfehlpaarung zwischen dem Primer und dem Template an einer oder mehrerer Stellen in dem hybridisierten Abschnitt geschaffen wird, und Inkubieren mit einer oder mehrerer einer Vielzahl von Endonukleasen oder DNA-Glycosylasen, von denen vorher gezeigt wurde, dass sie spezifisch an Basen mit Fehlpaarung in doppelsträngigen Nukleinsäuren spalten, erreicht werden. Diese schließen T7-Endonuklease I, MutY-DNA-Glycosylase, Thymin-Mismatch-DNA-Glycosylase und Endonuklease V ein.
Ein IP kann auch durch Spaltung eines Komplexes erzeugt werden, der durch Hybridisierung überlappender Oligonukleotid-Sonden unter Verwendung eines strukturspezifischen Enzyms wie z.B. einer Cleavase gebildet wird.
Ein Primer kann mit einem geblocktem 3'-Terminus synthetisiert werden, so dass die Verlängerung des Primers nicht möglich ist, es sei denn, die blockierende Gruppe wird durch die Spaltung des Primers freigesetzt. Ein solcher Primer wird hierin als ein 3'-blockierter Primer bezeichnet. Ein blockierter 3'-Terminus eines Primers kann durch verschiedene Verfahren einschließlich 3'-Phosphorylierung, Einbau eines Didesoxynukleotids am 3'-Terminus, Synthetisieren des Primers mit einer 3'-Amin- oder 3'-Thiolgruppe, Synthetisieren des Primers mit einem oder mehreren invertierten Nukleotiden an dem 3'-Terminus oder Spalten einer abasischen Stelle mit einer DNA-Lyase erreicht werden.
Daher kann in einer Ausführungsform der Erfindung ein Primer mit einem nicht komplementären 3'-Terminus (d.h. an seinem 3'-Terminus nicht komplementär zu dem Template) synthetisiert werden, so dass die Verlängerung des Primers nicht möglich ist, wenn nicht der 3'-Terminus durch Spaltung des Primers freigesetzt wird.
Ein Primer kann mit einem nicht komplementären 5'-Terminus synthetisiert werden, so dass die Spaltung die Dissoziation des Primers von der Template-Nukleinsäure verursacht. Der dissoziierte Primer kann dann als ein IP in einer GMA-Reaktion auf einem anderen Template dienen.
Die Spaltung eines Primers, so dass ein 3'-blockierter Primer entblockiert wird und ein nicht komplementärer 3'-Terminus oder nicht komplementärer 5'-Terminus freigesetzt wird, kann von einer Hybridisierung des Primers zu der vollständigen oder einem Teil der Template-Nukleinsäure abhängig gemacht werden, so dass nach der Spaltung ein IP mit einem neuen freien 3'-OH-Terminus gebildet wird, was die Verlängerung des IPs auf dem gleichen oder einen distinkten Template erlaubt. Die Spaltung des hybridisierten Primers erfordert in diesem Fall, dass der Primer an einer oder mehreren Stellen in dem hybridisierten Abschnitt dieses Primers gespalten wird, so dass er auf dem Template verlängert werden kann. Dies kann durch Entwickeln eines Primers erreicht werden, der die modifizierte Base Hypoxanthin enthält, welche ein Substrat für 3-Alkylpurin-DNA-Glycosylase (z.B. AlkA) ist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist es unter Verwendung von thermostabilen Spaltmitteln möglich, einen hybridisierten Primer an einer modifizierten Base oder einer Base mit Fehlpaarung zu spalten, so dass, sobald die Sonde gespalten wird, zwei oder mehr Fragmente thermisch instabil werden und von der Zielnukleinsäure herunterfallen, wodurch es einem anderen Primer voller Länge erlaubt wird, zu hybridisieren. Dieses oszillierende Verfahren amplifiziert das Signal (erhöhte Bildung des gespaltenen Primers). Das gespaltene Produkt mit einem 3'-OH-Terminus kann als ein IP in einer anschließenden oder gekoppelten GMA-Reaktion dienen.
Ein IP kann auch durch Spaltung eines Primers an einer modifizierten Base gebildet werden, wo eine solche Spaltung von der Verlängerung des Primers auf einem Template abhängt. Dies erlaubt die Bildung eines IPs, der kleiner ist als der ursprüngliche Primer und welcher auf eine Vielzahl von Weisen charakterisiert werden kann. Zum Beispiel wird die Uracil-DNA-Glycosylase aus E. coli Uracil nicht aus der letzten oder vorletzten 3'-Position eines Primers freigesetzt. Allerdings wird das Uracil, welches an der letzten oder vorletzten 3'-Position des Primers war, nun weiter von dem 3'-Terminus der neu verlängerten Nukleinsäure entfernt sein und daher freigesetzt werden, wenn der Primer auf einem Template verlängert wird. Folglich wird ein Primer mit einem freien 3'-OH-Terminus und um ein oder zwei Basen kürzer als der ursprüngliche Primer gebildet und ist daher ein IP für eine anschließende GMA-Reaktion.
Ein IP kann aus einer natürlich vorkommenden oder amplifizierten Nukleinsäure durch vollständige oder teilweise enzymatische oder chemische Spaltung mit DNA- oder RNA-spaltenden Mitteln wie z.B. DNAsen, RNAsen, Restriktions-Endonukleasen, DNA-Glycosylasen nach Umwandlung einer normalen DNA-Base in eine Glycosylase-Substrat-Base oder Einbau einer solchen Base während der Amplifikation, AP-Endonukleasen nach teilweiser oder vollständiger Depurination oder Depyrimidination von DNA, Enzymen, die RNA oder DNA in RNA:DNA-Hybride spalten, wie z.B. RNAseH, und Enzymen, die an DNA-Fehlpaarungen spalten, die nach Denaturieren und erneutem Annealing von Nukleinsäurehybridmolekülen wie z.B. RNA:DNA-Hybriden und DNA:DNA-Hybriden gebildet werden, gebildet werden. Die enzymatische oder chemische Spaltung von DNA oder RNA kann 3'-Termini bilden, die nicht durch DNA-Polymerasen verlängerbar sind. Solche 3'-Termini können im Allgemeinen durch Behandlung mit einem oder mehreren Enzymen wie z.B. AP-Endonuklease IV oder T4-Polynukleotid-Kinase, welche eine 3'-Phosphatase-Aktivität besitzt, verlängerbar gemacht werden. Es ist gut etabliert, dass Spaltmittel Doppelstrang-, Einzelstrang- oder Sequenz-spezifisch sein können. Eine doppel- oder einzelsträngige Nukleinsäure kann vor der GMA in kleine doppel- bzw. einzelsträngige Fragmente unter Verwendung einer oder mehrerer Spaltmittel gespalten werden. Dies stellt ein Mittel bereit, um die Größe der verdrängten Fragmente zu begrenzen.
Die Spaltung oder Einschneidung eines Strangs eines Duplex-Moleküls stellt einen Abschnitt einer Nukleinsäure mit einem freien 3'-OH-Terminus bereit, der direkt als ein IP auf ein Template, an welches er hybridisiert ist, oder auf einem distinkten Template in einer GMA-Reaktion wirken kann. Die Spaltung oder Einschneidung eines Strangs eines Duplex-Moleküls kann unter Verwendung bestimmter Spaltmittel erreicht werden. Die Nukleinsäure kann nicht spezifisch mit einer geringen Menge Nuklease-Enzym wie z.B. DNAse eingeschnitten werden, was zur Bildung vieler verschiedener verdrängter stromabwärts gelegener Fragmente aus vielen Lokalisationen auf dem Nukleinsäure-Template führt.
Die Nukleinsäure kann mit spezifischeren Mitteln wie z.B. dem Restriktionsenzym N.BstNB I eingeschnitten werden, welches die DNA vier Basen stromabwärts der 3'-Stelle der Erkennungssequenz GAGTC einschneidet. Alternativ kann die Nukleinsäure mit einem Restriktionsenzym, z.B. HincII oder BsoBI eingeschnitten werden, welches den nicht-modifizierten Strang einer hemi-modifizierten doppelsträngigen DNA an einer spezifischen Erkennungsstelle einschneidet, wodurch ein freier 3'-OH-Terminus gebildet wird. Die RNA kann nicht-spezifisch mit bestimmten RNAsen und spezifischer mit Sequenz- oder Struktur-spezifischen RNAsen wie z.B. Ribozymen gespalten werden. RNAseH spaltet RNA in einem RNA:DNA-Hybrid. Folglich kann RNA durch RNAseH nach Synthese einer cDNA auf dem RNA-Template durch die reverse Transkriptase gespalten werden. Die RNA kann spezifisch durch RNAseH nach Annealing von Oligonukleotid-DNA-Molekülen an eine oder mehrere Sequenzen auf der RNA gespalten werden.
Insbesondere stellt die Addition von Oligo-/Poly-dT ein Mittel bereit, um den 3'-PolyA-Schwanz von mRNA-Spezies doppelsträngig zu machen. Die Zugabe von RNAseH resultiert in der Verdauung des PolyA-Schwanzes, was einen einzigartigen 3'-Terminus für jede mRNA-Spezies bereitstellt. Dieses Verfahren stellt hierdurch ein Mittel bereit, wodurch jede mRNA-Spezies in einer Probe potentiell als ein IP in einer GMA wirken kann.
Eine doppelsträngige Nukleinsäure kann gespalten werden, um ihren freien 3'-OH-Terminus zu exponieren, wodurch der gespaltenen DNA ermöglicht wird, als ein IP in einer GMA zu funktionieren. Zum Beispiel kann eine doppelsträngige DNA mittels Hitze denaturiert werden. Alternativ kann sie mit der T7-Gen-6-Exonuklease behandelt werden, die Duplex-DNA in einer schrittweisen nicht fortschreitenden Reaktion von den 5'-Termini hydrolysiert. Das Enzym ist auf einzelsträngiger DNA nicht aktiv und stoppt daher, wenn Duplex-Regionen nicht länger vorhanden sind.
Wichtigerweise erzeugt die spezifische Spaltung eines Stranges eines Duplex-Moleküls an einer Fehlpaarung ein Nukleinsäure-Fragment mit einem 3'-OH-Terminus, der direkt als ein IP auf dem Template, an welches er hybridisiert ist, oder auf einem anderen Template funktionieren kann. Dies stellt ein Mittel zum Identifizieren von Mutationen und Polymorphismen in Nukleinsäuren bereit.
Mit Hinblick darauf erlaubt die vorliegende Erfindung es einem, die Gegenwart oder Abwesenheit einer Mutation oder eines Polymorphismus an einer spezifischen Lokalisation in einer Nukleinsäure (Kandidaten-Locus) in folgender Weise zu untersuchen: Annealen eines 3'-blockierten Primers an eine Zielnukleinsäure, so dass an dem Kandidaten-Locus eine Fehlpaarung erzeugt wird. Die Fehlpaarung ist typischerweise im Hinblick auf den Primer intern lokalisiert, d.h. dass die Base, die die Fehlpaarung mit der Kandidaten-Locus-Base auf dem Template bildet, nicht der Basenrest des 5'-terminalen oder 3'-terminalen Nukleotids des Primers ist. Nach Spaltung des Primers an dieser Position der Fehlpaarung mit einer Glycosylase, die spezifisch für Fehlpaarungen ist, und einem Spaltmittel für abasische Stellen hat der 5'-gespaltene Teil des Primers einen 3'-OH-Terminus und ist daher ein IP, welcher nun eine GMA-Reaktion auf diesem gleichen Template oder einem alternativen Template initiieren kann. Daher ist die resultierende GMA Indikativ für die Gegenwart oder Abwesenheit der Mutation in Abhängigkeit davon, ob eine Fehlpaarung durch die Bindung des Primers an das Template und umgekehrt gebildet wurde oder nicht.
Zusätzlich können die erneut annealten Nukleinsäure-Hybrid-Moleküle mit Fehlpaarungsspezifischen Enzymen wie z.B. T7-Endonuklease I, MutY-DNA-Glycosylase, Thymin-Mismatch-DNA-Glycosylase oder Endonuklease V behandelt werden. Kombinationen von Genamplifikation durch PCR-Verfahren gefolgt von erneutem Annealen und Spaltung der DNA an Fehlpaarungen mit einem Reparaturenzym, das spezifisch für Fehlpaarungen ist, erzeugt freie 3'-OH-Termini, die als IPs in einer anschließenden GMA-Reaktion auf einem distinkten Template dienen können, gefolgt von der Dissoziation von ihrem komplementären Strang.
Alternativ produziert die Verlängerung des 3'-OH-Terminus, die an der Stelle mit der Fehlpaarung unter Verwendung einer Strang-Verdrängungs-DNA-Polymerase in einer Standard-„once off"-Strang-Verdrängungsreaktion oder in einer GMA-Reaktion gebildet wird, ein verdrängtes Fragment, das als ein IP in einer anschließenden GMA-Reaktion dienen kann. Da die Bildung des IPs von der Gegenwart einer Fehlpaarung abhängt, ist das Primen einer GMA-Reaktion Indikativ für eine Fehlpaarung. Wenn ein Gesamt-Genom-Amplifikationsverfahren mit diesem Ansatz mit mehreren Proben und/oder mehreren Templates zum Nachweis von verdrängten Fragmenten verwendet wird, können viele Amplifikationsprodukte auf die Gegenwart von Fehlpaarungen getestet werden. Unter Verwendung ausgewählter Sonden und/oder ausgewählter Templates ist es möglich, Fehlpaarungen zu lokalisieren. Unter Verwendung einer Anordnung von Sonden kann dies auf eine breite Suche im Genom oder auf eine Suche nach mehreren amplifizierten Nukleinsäuren gleichzeitig angewendet werden.
Die Verwendung eines degenerierten IPs in einer GMA-Reaktion stellt ein Mittel zum Primen der GMA an mehreren Stellen auf dem Template bereit. Die Degeneration des IPs kann sehr hoch sein und folglich kann ein zufälliges Primen eines Templates erreicht werden. In diesem Fall wird ein IP wie z.B. ein zufälliges Hexamer oder ein längerer Primer mit einem zufälligen Hexamer als seine 3'-Sequenz typischerweise mit einem Template wie z.B. genomischer DNA verwendet. Ein spezifisches mehrfaches Primen kann mit einem IP mit einem geringeren Grad an Degeneration erreicht werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann als ein neues Signalamplifikationsverfahren, das durch die GMA bereitgestellt wird, verwendet werden. Der verlängerte IP und die verdrängten Fragmente, die in einer GMA-Reaktion gebildet werden, haben einen freien 3'-OH-Terminus und können als Primer wirken, die verlängert werden können. Bei der Verwendung einer Strang-Verdrängungs-DNA-Polymerase dürfen die verdrängten Fragmente, die während der GMA auf dem Template gebildet werden, als IPs in einer GMA-Folgereaktion wirken, wenn ein geeignetes Template verfügbar ist. Ein Template kann in der gleichen Reaktion oder in einer nicht-gekoppelten Reaktion als ein Mittel zur Signalamplifikation bereitgestellt werden. Das zur Verwendung in der Signalamplifikation bereitgestellte Template wird hierin als das Signalamplifikations-Template oder Verstärker-Template (Booster-Template) bezeichnet. Dies ist besonders wichtig, wenn die Menge des ursprünglichen Templates niedrig ist, was oft der Fall ist, wenn genomische DNA als das Template oder die Zielnukleinsäure in der anfänglichen GMA verwendet wird. Das Verstärker-Template wird synthetisiert, so dass es eine intrinsische Sequenz besitzt, die komplementär zu jedem beliebigen initiierenden Primer des Interesses ist, der hierin mit „IP-Bindungsstelle" bezeichnet wird. Typischerweise ist diese Sequenz komplementär zu dem verlängerten initiierenden Primer oder einem verdrängten Fragment, das während einer GMA-Reaktion gebildet wird. Typischerweise ist die IP-Bindungsstelle an dem 3'-Ende des Verstärker-Templates (das Verstärker-Template wird von der Polymerase, die das IP in einer 5'- nach 3'-Richtung polymerisiert und verlängert, in einer 3'- nach 5'-Richtung gelesen). Eine oder mehrere Basen sind stromaufwärts (5') der IP-Bindungsstelle auf dem Verstärker-Template vorhanden, die komplementär zu der modifizierten Base sind, die in der GMA-Reaktion verwendet wird. Typischerweise ist diese Base ein Adeninrest. Dies resultiert in dem Einbau einer modifizierten Base, typischerweise einem U, an dieser Position in dem sich verlängernden IP während der GMA-Reaktion. Die Sequenz, die dieser Position folgt (stromaufwärts) und die hierin als die Verstärker-Sequenz (Booster-Sequenz) bezeichnet ist, ist frei von Basen, die zu der modifizierten Base, die in der anfänglichen GMA verwendet wird, komplementär sind. Die Verstärker-Sequenz kann hinsichtlich ihrer Größe variabel sein und ist typischerweise länger als 18 Nukleotide. Typischerweise hat die Verstärker-Sequenz eine 3'-Modifikation wie z.B. ein invertiertes Nukleotid, um ein störendes Selbst-Primen zu verhindern. Eine DNA-Synthese-Blockierung kann auch in das Verstärker-Template in die Region eingeschlossen sein, die komplementär zu dem IP ist, um störendes Selbst-Primen zu verhindern. Wenn ein initiierender Primer eine GMA auf einem Verstärker-Template primt, bildet er das Komplement der Verstärker-Sequenz, das hierin als komplementäre Verstärker-Sequenz bezeichnet wird. Die Nettowirkung dieser Vorgehensweise ist, dass die komplementäre Verstärker-Sequenz auf ein hohes Niveau kopiert/amplifiziert wird, da das Verstärker-Template typischerweise nicht limitierend ist und jedes gebildete IP potentiell dazu dienen kann, jedwelches nicht-geprimte Verstärker-Template in der GMA-Reaktion zu primen. Die komplementäre Verstärker-Sequenz kann auch als ein universeller Reporter für Nachweiszwecke dienen.
Um ein sehr hohes Niveau an Signalamplifikation zu erzielen, können auf die Verstärker-Sequenz (d.h. BS#1) eine oder mehrere Basen folgen, die zu der modifizierten Base in der GMA-Reaktion komplementär sind. Auf diese Verstärker-Sequenz folgt wiederum eine zweite Verstärker-Sequenz (BS#2). BS#2 ist typischerweise mit BS#1 identisch. Wenn ein IP eine GMA-Reaktion auf dem Verstärker-Template primt, bildet er das Komplement von BS#1 und BS#2, welche hierin als komplementäre Verstärker-Sequenz #1 (cBS#1) und komplementäre Verstärker-Sequenz #2 (cBS#2) bezeichnet werden. cBS#1 und cBS#2 sind identisch und wirken als IPs, die das Verstärker-Template aus BS#1 primen. Sie binden auch an BS#2, werden aber in jedem Zyklus der GMA-Reaktion verdrängt. Die Nettowirkung davon ist, dass cBS#2 auf ein hohes Niveau amplifiziert werden kann, da das Verstärker-Template typischerweise nicht limitierend ist und jedes cBS#1 und cBS#2 potentiell als initiierende Primer für jedes beliebige nicht geprimte Verstärker-Template in der GMA-Reaktion dienen kann.
Es gibt viele Möglichkeiten zur Entwicklung eines Verstärker-Templates. Wenn cBS#1 in der primären GMA-Reaktion gebildet wird, dann ist ein Verstärker-Template mit ausschließlich den BS#1- und BS#2-Sequenzen erforderlich, die durch eine zu der modifizierten Base komplementären Base getrennt sind, da das cBS#1 als der initiierende Primer dient. Ein Verstärker-Template kann mit einigen verschiedenen IP-Bindungsstellen entwickelt werden, d.h. es wird vielen verschiedenen sequenzierten IPs erlaubt zu binden und zu primen, gefolgt von identischen oder distinkten Verstärker-Sequenzeinheiten.
Eine weitere Möglichkeit zum Nachweisen oder Kontrollieren des Fortschreitens der initiierten GMA-Reaktion ist durch Überwachen der DNA-Polymerase-Aktivität. Da die GMA in der kontinuierlich wiederholten Verlängerung (d.h. Polymerisation) von DNA-Fragmenten auf einem Template resultiert, gibt es einen kontinuierlichen Einbau von dNMP in die neu synthetisierte DNA und eine kontinuierliche Freisetzung einer Pyrophosphat-Komponente (PPi) für jedes eingebaute Nukleotid-Monophosphat. Daher kann ein PPi-Nachweistest (Nyren, P. (1987) Analytical Biochemistry, 167, 235–238) verwendet werden, um die GMA-Aktivität indirekt nachzuweisen oder zu kontrollieren.
In einer GMA-Reaktion unter Verwendung der Vorläufer-Nukleotide dATP, dCTP, dGTP, dTTP zusätzlich zu einem modifizierten Vorläufer-Nukleotid wie z.B. dUTP, sind die verdrängten Fragmente, die gebildet werden, gemäß den Austauschen von dUTP- mit dTTP-Einbau in den neu synthetisierten komplementären Strang gegenüber den A-Resten in dem Template-Strang mehrerer unterschiedlicher Größen. Eine geeignete IP-Bindungsstelle auf einem Verstärker-Template ist in einem solchen Fall eine Sequenz, die zu einem Teil des anfänglichen Templates identisch ist, das 5' (im Hinblick auf das Template) gelegen ist von der Stelle, an der der IP anfänglich primte. In einer Sequenz von DNA würde erwartet werden, dass ein dUTP oder ein dTTP im Mittel alle vier Basen eingebaut würde, da man erwarten würde, dass ein A-Rest an jeder gegebenen Position in dem Template mit einer Häufigkeit von 0,25 auftreten würde. Folglich wäre die mittlere erwartete Größe eines verdrängten Fragments in einer GMA-Reaktion unter Verwendung von dUTP an Stelle von dTTP drei Nukleotide. Im Gegensatz dazu wird unter Verwendung eines Verhältnisses von dUTP zu dTTP, bei dem die DNA-Polymerase jedes der beiden dNTPs mit einer Wahrscheinlichkeit von 0,5 insertiert, die Größe des erzeugten, verdrängten Fragments in dem Bereich von einer minimalen Größe von drei Nukleotiden zu größeren Größen sein, wobei die Häufigkeit der Bildung jedes verdrängten Fragments mit der steigenden Größe des verdrängten Fragments abnimmt. Allerdings kann die Hybridisierung zwischen dem verdrängten Fragment, das als ein IP wirkt, und der IP-Bindungsstelle umso stringenter sein, je größer das verdrängte Fragment ist. Folglich ist eine IP-Bindungsstelle auf dem Verstärker-Template wünschenswert, die zu einer Sequenz 5' von der IP-Bindungsstelle auf der ursprünglichen Template-Nukleinsäure identisch ist. Beispielsweise ist eine IP-Bindungsstelle auf dem Verstärker-Template, die zu den 40 Nukleotiden auf der verdrängten DNA komplementär ist, geeignet, wenn ein verdrängtes Fragment ausgewählt wird, so dass es 10 Positionen innerhalb eines 40-Nukleotide-Abschnitts besitzt, an denen ein dUTP oder ein dTTP eingebaut werden könnte.
Zum Nachweis von SNPs oder Mutationen kann der IP, der die Template-Nukleinsäure primt, 3' von der Lokalisation des gewählten SNPs im Hinblick auf den Template-Strang positioniert werden, so dass ein einziger Austausch des verdrängten Fragments, das gebildet wird, seinen 3'-Terminus durch die SNP-Stelle definiert bekommt. In diesem Fall führt die Gegenwart des SNP auf der Template-Nukleinsäure zur Bildung eines verdrängten Fragments mit einem einzigartigen 3'-OH-Terminus, der nicht gebildet wird, wenn die SNP-Stelle abwesend ist. Der IP kann so gewählt werden, dass in einer GMA-Reaktion unter Verwendung einer Mischung eines normalen und eines modifizierten Vorläufers wie z.B. dTTP und dUTP ein verdrängtes Fragment geeigneter Größe gebildet wird, um seine Hybridisierung an die IP-Bindungsstelle auf dem Verstärker-Template unter stringenten Bedingungen zu erlauben. Darüber hinaus kann die IP-Bindungsstelle auf dem Verstärker-Template so entwickelt werden, dass sie nur durch dieses verdrängte Fragment mit dem einzigartigen 3'-OH-Terminus, das durch die SNP-Stelle und den Status dieser Stelle definiert wird, geprimt werden kann. Dies kann erreicht werden, indem das Verstärker-Template so entwickelt wird, dass der Schlüssel-Adeninrest, der die GMA unterstützt, ausreichend nahen 5' auf dem Verstärker-Template lokalisiert ist, so dass das 3'-Ende auf dem verdrängten Fragment, das mit einem 3'-OH-Terminus, der durch die nächste Position des dUTP-Einbaus nach der SNP-Stelle auf dem ursprünglichen Template definiert wird, gebildet wird, gegenüber oder 5' des Schlüssel-Adeninrests auf dem Verstärker-Template ist. Unter stringenten Hybridisierungsbedingungen werden verdrängte Fragmente, bei denen der 3'-OH-Terminus von einer Stelle stromaufwärts der SNP-Stelle (im Hinblick auf das Komplement des Strangs, der als ein Template wirkt) gebildet wird, nicht das Verstärker-Template primen, da sie nicht mit der IP-Bindungsstelle hybridisieren.
Nach einer weiteren Ausführungsform der Erfindung kann eine IP-Bindungsstelle so degeneriert sein, dass sie als eine Bindungsstelle für viele verschiedene initiierende Primer dienen kann. Zwei oder mehr Verstärker-Templates können in eine GMA-Reaktion eingeschlossen werden, so dass die cBS, die aus dem ersten Verstärker-Template gebildet wird, als ein initiierender Primer für das zweite Verstärker-Template dienen kann. Dies hat den zusätzlichen Vorteil, dass das zweite Verstärker-Template für mehrere verschiedene GMA-Reaktionen identisch sein kann und so als eine universelle Verstärker-Sequenz dient. Dies erleichtert ein einzelnes rationalisiertes Verfahren zum Nachweisen und zur Signalamplifikation unter Verwendung eines Verstärker-Templates mit einem einzelnen Endpunkt. Typischerweise wird das Endpunkt-Verstärker-Template so entwickelt und synthetisiert werden, dass es direkt oder indirekt als ein Reporter für die GMA dient.
Der IP in einer GMA-Reaktion kann einen stromabwärts gelegenen verlängerten Primer, der als ein IP in einer anschließenden GMA-Reaktion dient, verdrängen. Dies besitzt wichtige Verwendungen für SNP- und Mutationsnachweis. Ein Primer könnte ausreichend nahe an der SNP-Stelle platziert werden, so dass der erste modifizierte Vorläufer an dieser SNP-Stelle oder distal dazu eingebaut wird. Folglich wird der Primer auf eine unterschiedliche Länge verlängert, in Abhängigkeit davon, ob ein SNP an dieser Stelle vorhanden ist oder nicht. Es ist wünschenswert, mehrere Kopien des unterschiedlich verlängerten Primers für die anschließende Charakterisierung durch ein beliebiges mehrerer Mittel einschließlich seiner Fähigkeit, als ein IP in einer anschließenden GMA auf einem Verstärker-Template zu wirken, zu bilden. Mehrere Kopien des unterschiedlich verlängerten Primers können durch ein thermozyklisches Verfahren, wie für die Polymerase-Kettenreaktion beschrieben, erhalten werden. Alternativ kann der unterschiedlich verlängerte Primer wiederholt durch Initiierung einer GMA-Reaktion 5' dieses Primers (d.h. weiter 3' auf dem Template-Strang) verdrängt werden. Dies wird unter Verwendung eines IPs erreicht, der 5' des Primers, der proximal zu der SNP-Stelle lokalisiert ist, hybridisiert und dieser IP initiiert eine GMA-Reaktion. Der stromabwärts gelegene Primer wird in der gleichen Reaktion in jedem Zyklus verlängert, aber er wird auch in jedem Zyklus verdrängt werden. Nach Verdrängung kann der frische Primer hybridisieren und verlängert werden.
Die verdrängten Fragmente, die aus den Template-Nukleinsäuren erzeugt wurden, und die komplementären Verstärker-Sequenzen, die aus dem Verstärker-Template erzeugt wurden, können in einem 5'-Nuklease-Test nachgewiesen werden. Typischerweise ist der 5'-Nuklease-Test ein Test, der eine spezifische Nukleinsäure durch ihre Fähigkeit nachweist, als ein initiierender Primer zur DNA-Synthese auf einem Template unter Verwendung einer DNA-Polymerase mit einer 5'-3'-Exonuklease-Aktivität zu dienen, die zum Abbau einer Sonde führt, die stromabwärts auf dem Template annealt ist. Dieser Abbau basiert auf der Anwesenheit einer 5'-3'-Exonuklease-Aktivität in der in der Reaktion verwendeten Polymerase. Die typische Sonde ist ein Oligonukleotid, das sowohl einen fluoresziierenden Reporterfarbstoff als auch einen Quencherfarbstoff in enger Nachbarschaft trägt. Ein Anstieg der Fluoreszenzintensität entsteht, wenn der Reporter und der Quencher durch Abbau der Sonde getrennt/voneinander entfernt werden. So zeigt ein Anstieg der Fluoreszenz an, dass die Sonde mit dem Template hybridisierte und durch die 5'- nach 3'-Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase abgebaut wurde, da sie den initiierenden Primer auf der Template-Nukleinsäure verlängert.
Eine Variation dieses Tests verwendet einen Ansatz, bei dem die Sonde ein Teil des Templates ist, aber komplementär zu einem Teil des Templates ist. Dies resultiert in einer Sonde, die mit einem Teil des Templates durch Basenpaarung mit ihrem Komplement auf der Template-Nukleinsäure einen Stiel bildet, wodurch wirksam ein doppelsträngiger Stiel mit einem freien 5'-Ende und einem Loop-Ende hergestellt wird.
Alternativ kann eine zu sich selbst komplementäre Probe mit einem Reporter an einem Ende und einem Quencher an dem anderen Ende verwendet werden. In diesem Fall bildet die Sonde einen Stiel und Loop durch Basenpaarung, wodurch der Reporter nah zu dem Quencher gebracht wird, so dass die Fluoreszenz gequencht wird. Die Denaturierung der Stiel-Loop-Struktur in Gegenwart eines vollständig oder teilweise komplementären verdrängten Fragments oder cBS erlaubt die Hybridisierung zwischen der Sonde und dem verdrängten Fragment oder cBS. Dies macht die Sonde doppelsträngig und erhöht die Entfernung zwischen dem Reporter und Quencher, wodurch ein Anstieg der Fluoreszenz-Intensität verursacht wird.
Die Anpassung der GMA an die Verwendung mit einem verbundenen Reporter-Quencher stellt ein einzigartiges Verstärker-Template bereit, das den gleichzeitigen IP-Nachweis und Signalverstärkung erlaubt. Im Wesentlichen wird das Verstärker-Template mit einer IP-Bindungsstelle entwickelt, auf die eine zu sich selbst komplementäre Sequenz folgt, die einen gebundenen Reporter und Quencher durch Bildung einer doppelsträngigen Stiel-Loop-Struktur in enge Nachbarschaft bringt. Die IP-Bindungsstelle und die Sequenz, die die Stiel-Loop-Struktur bildet, sind ohne die Base, die komplementär zu der modifizierten Base in der GMA-Reaktion ist. Die IP-Bindungsstelle ist 3' von der Stiel-Loop-Sequenz und kann eine Sequenz enthalten, die komplementär zu einem initiierenden Primer und/oder einer Sequenz ist, die komplementär zu einem cBS ist. Eine oder mehrere Basen, die komplementär zu der modifizierten Base in der GMA-Reaktion ist/sind, sind 5' des Stiel-Loops vorhanden und auf sie folgt eine weitere zu einer cBS komplementären Sequenz. Wenn ein initiierender Primer auf dem Reporter-Quencher-Verstärker-Template verlängert wird, ist die Nettowirkung, dass die IP-Bindungsstelle und der Stiel-Loop-Teil des Verstärker-Templates linearisiert werden und während der GMA durch die Strangverdrängung doppelsträngig gemacht werden und doppelsträngig bleiben. Das Signal wird durch die Synthese von weiteren cBSs an dem 5'-Ende des Verstärker- Templates amplifiziert, welche wiederum als initiierende Primer für jedes beliebige nicht geprimte Verstärker-Template in der GMA-Reaktion dienen. Wenn der Stiel-Loop linearisiert wird und doppelsträngig wird, erhöht sich die Fluoreszenz-Intensität und die Messung der Fluoreszenzen funktioniert als ein Maß für den Spiegel an IP in der Reaktion. Ein alternatives erfindungsgemäßes Verfahren zum Signalnachweis bezieht das Entwickeln der Verstärker-Templates ein, so dass ein Teil oder das gesamte verdrängte Fragment zu sich selbst entweder innerhalb von diesem oder zwischen anderen Kopien von diesem komplementär ist und doppelsträngige DNA bildet. Die doppelsträngige DNA kann dann leicht durch Binden von Doppelstrang-spezifischen Sonden wie z.B. SYBR-Grün nachgewiesen werden.
Das Verstärker-Template kann zirkulär sein. Ein solches zirkuläres Verstärker-Template stellt ein Mittel für die verlängernde DNA-Polymerase bereit, um kontinuierlich in einem „Rolling Circle Replication"-Format vorzuschreiten. Es gibt mehrere Variationen, die mit einem zirkulären Verstärker-Template verwendet werden können. In der einfachsten Form kann das zirkuläre Verstärker-Template als ein Template für eine „Rolling Circle"-Amplifikation dienen, bei der ein IP als ein Initiator der DNA-Replikation auf einem Kreis dienen kann. In einem solchen Fall wird die DNA kontinuierlich synthetisiert, bis die Polymerase oder die DNA-Vorläufer limitierend werden. Der Einschluss eines solchen Verstärker-Templates in eine GMA-Reaktion erfordert, dass das Verstärker-Template so entwickelt wird, dass es keine Reste enthält, die komplementär zu dem modifizierten Vorläufer-Nukleotid in der GMA-Reaktion sind.
Alternativ kann das Verstärker-Template mit einem oder mehreren IP-Bindungsstellen entwickelt werden, auf die ein Rest folgt, der den Einbau eines modifizierten Vorläufers auf dem verlängernden IP während der GMA unterstützt. Auf dies können darüber hinaus ein oder mehrere Verstärker-Sequenzen folgen. Vor oder nach den Verstärker-Sequenzen können ein oder mehrere Basen sein, die komplementär zu der modifizierten Base in der GMA-Reaktion sind. Das Komplement der Verstärker-Sequenz, wenn erzeugt, dient als ein IP für alle nicht geprimten Verstärker-Templates. Das Primen von nachfolgenden Verstärker-Templates stellt ein zusätzliches IP für zusätzliche nicht geprimte Verstärker-Templates bereit und die Reaktion dauert an, bis alle Verstärker-Templates geprimt sind und die Replikation dauert an, bis eines der Reagenzien limitierend wird. Die Nettowirkung dieses Verfahrens ist, dass eine lineare Kopie des gesamten Verstärker-Templates oder eines Teils davon in jedem Zyklus gebildet wird. Der Einschluss eines zweiten komplementären Verstärker-Templates mit einer selbstprimenden Verstärker-Sequenz stellt ein Mittel zur Erzeugung mehrerer linearer Kopien des Verstärker-Templates bereit. Die linearen Kopien der beiden Verstärker-Templates werden dann miteinander hybridisieren, wodurch eine doppelsträngige DNA erzeugt wird, die durch einige Mittel einschließlich Doppelstrang-spezifischer DNA-Bindungsmittel wie z.B. SYBR-Grün nachgewiesen werden können.
Ein einzelnes Verstärker-Template kann auch so entwickelt werden, dass es cBSs herstellt, deren Basenpaare sich miteinander paaren, wodurch doppelsträngige DIVA erzeugt wird. Das Verstärker-Template ist für diese Anwendung besonders geeignet, da Regionen mit einem Komplementärsein zu sich selbst in einem DNA-Kreis ohne Denaturierung durch IPs, die an IP-Bindungsstellen hybridisieren, die nicht in der selbstkomplementären Region sind, geprimt werden können. Im Gegensatz dazu ist die Denaturierung von vollständig doppelsträngiger linearer komplementärer DNA erforderlich, um einen IP-Zugang an einer IP-Bindungsstelle zu ermöglichen.
In einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das Verstärker- oder sekundäre Template auf einem festen Träger, z.B. einem Mikro- oder Makroarray oder DNA-„Chip" immobilisiert werden. Mehrere verschiedene Verstärker- oder sekundäre Templates können auf einem DNA-Chip immobilisiert werden, der dann verwendet werden kann, um mehrere verschiedene Nukleinsäuren und mehrere verschiedene GMA-Reaktionen in einer „High-throughput"-Weise zu charakterisieren. In einer bevorzugten Ausführungsform heftet man die sekundären Templates über ihre 3'-Termini an. Dies macht die sonst reaktive 3'-OH-Gruppe unzugänglich, daher kann sie durch eine Polymerase nicht verlängert werden und wirkt nur als ein Template, wodurch jede nicht spezifische Hintergrundverlängerung reduziert wird.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt die Verwendung von GMA bei DNA-Rechenverfahren bereit. Es wird nun zunehmend anerkannt, dass DNA auf Grund ihrer intrinsischen physikalischen und chemischen Eigenschaften eine Möglichkeit zur Berechnung von Lösungen schwieriger mathematischer Aufgabenstellungen auf einem Computer bereitstellen könnte. Es wird anerkannt werden, dass durch die Entwicklung initiierender Primer, Templates und/oder Verstärker-Templates, um als individuelle oder kombinierte Teile von Information, sei es Probleme und/oder Lösungen, zu wirken, die Lösungen von mathematischen Problemen unter Verwendung der GMA-Reaktion mittels Computer berechnet werden können. Vorzugsweise sind die IPs und Templates künstlich synthetisiert. Es wird auch anerkannt werden, dass die Verwendung von GMA im DNA-Rechenverfahren gleichzeitig Operationen und parallele Suchen erlaubt und zu vollständigen Sätzen potentieller Lösungen führen kann.
Folglich stellt die vorliegende Erfindung die Verwendung eines wie hierin vorstehend beschriebenen Verfahrens beim DNA-Rechenverfahren und/oder als ein „Werkzeug" in DNA-Rechenverfahren, die hierin zusammenfassend als DNA-Rechenverfahren bezeichnet werden, bereit.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden Beispiele illustriert.
Arten zur Ausführung der Erfindung
Verschiedene Enzyme werden in den folgenden Beispielen verwendet. Einige dieser Enzyme sind kommerziell erhältlich, wohingegen andere wie nachfolgend beschrieben aus Überexpression in E. coli-Stämmen gereinigt wurden.
UDG aus Thermatoga maritima (TmaUDG)
Der offene Leserahmen für das TmaUDG-Protein wurde aus genomischer DNA von T. maritima durch PCR amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde in den pBAD-TOPO-Überexpressionsvektor nach den Anweisungen des Herstellers (InVitrogen) insertiert. Kompetente TOP-10 E. coli (InVitrogen) wurden dann mit dem Konstrukt durch Hitzeschock nach den Anweisungen des Herstellers transformiert. Die Zellen, die das pBAD-TOPO/TmaUDG-Konstrukt enthielten, wurden auf eine OD₆₀₀ von 0,6 (1.000 ml) wachsen gelassen und die Überexpression wurde durch Arabinose, die auf eine Endkonzentration von 0,2% zugegeben wurde, induziert. Nach Inkubation bei 37°C für 4 Stunden wurden die Zellen lysiert und das Fusionsprotein durch immobilisierte Metallaffinitäts-Chromatographie und Verwendung von ProBond-Harz (InVitrogen) nach den Angaben des Herstellers gereinigt. Eine 15 ml Fraktion, die das eluierte Protein enthielt, was durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt wurde, wurde gesammelt. Die Fraktion wurde dann weiter durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von Mono-S-Harz gereinigt und 0,5 ml der am stärksten konzentrierten eluierten Proteinfraktion wurden gesammelt und nach Zugabe von Glycerin auf 50% bei –20°C gelagert, bis sie benötigt wurden.
Endonuklease IV aus Thermatoga maritima (TmaEndoIV)
Der offene Leserahmen für das TmaEndoIV-Protein wurde aus genomischer DNA von T. maritima durch PCR amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde in den pBAD-TOPO-Überexpressionsvektor nach den Anweisungen des Herstellers (InVitrogen) insertiert. Kompetente TOP-10 E. coli (InVitrogen) wurden dann mit dem Konstrukt durch Hitze schock nach den Anweisungen des Herstellers transformiert. Die Zellen, die das pBAD-TOPO/TmaEndoIV-Konstrukt enthielten, wurden auf eine OD₆₀₀ von 0,6 (1.000 ml) wachsen gelassen und die Überexpression wurde durch Arabinose, die auf eine Endkonzentration von 0,2% zugegeben wurde, induziert. Nach Inkubation bei 37°C für 4 Stunden wurden die Zellen lysiert und das Fusionsprotein durch immobilisierte Metallaffinitäts-Chromatographie und Verwendung von ProBond-Harz (InVitrogen) nach den Angaben des Herstellers gereinigt. Eine 15 ml Fraktion, die das eluierte Protein enthielt, was durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt wurde, wurde gesammelt. Die Fraktion wurde dann weiter durch Ionenaustausch-Chromatographie unter Verwendung von Mono-S-Harz gereinigt und 0,5 ml der am stärksten konzentrierten eluierten Proteinfraktion wurden gesammelt und nach Zugabe von Glycerin auf 50% bei –20°C gelagert, bis sie benötigt wurden.
Endonuklease V aus Thermatoga maritima (TmaEndoV)
Der offene Leserahmen für das TmaEndoV-Protein wurde aus genomischer DNA von T. maritima durch PCR amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde in den pBAD-TOPO-Überexpressionsvektor nach den Anweisungen des Herstellers (InVitrogen) insertiert. Kompetente TOP-10 E. coli (InVitrogen) wurden dann mit dem Konstrukt durch Hitzeschock nach den Anweisungen des Herstellers transformiert. Die Zellen, die das pBAD-TOPO/TmaEndoV-Konstrukt enthielten, wurden auf eine OD₆₀₀ von 0,5 (1.000 ml) wachsen gelassen und die Überexpression wurde durch Arabinose, die auf eine Endkonzentration von 0,2% zugegeben wurde, induziert. Nach Inkubation bei 37°C für 8 Stunden wurden die Zellen lysiert und das Fusionsprotein durch immobilisierte Metallaffinitäts-Chromatographie und Verwendung von ProBond-Harz (InVitrogen) nach den Angaben des Herstellers gereinigt. 15 × 1 ml Fraktionen, die das eluierte Protein enthielten, was durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt wurde, wurden gesammelt und gepoolt. Die gepoolten Fraktionen wurden dann weiter durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von Mono-S-Harz gereinigt und 0,5 ml der am stärksten konzentrierten eluierten Proteinfraktion wurden gesammelt und nach Zugabe von Glycerin auf 50% bei –20°C gelagert, bis sie benötigt wurden.
Endonuklease IV aus E. coli (EcoEndoIV)
Der offene Leserahmen für das EcoEndoIV-Protein wurde aus genomischer DNA von E. coli durch PCR amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde in den pBAD-TOPO-Überexpressionsvektor nach den Anweisungen des Herstellers (InVitrogen) insertiert. Kompetente TOP-10 E. coli (InVitrogen) wurden dann mit dem Konstrukt durch Hitze schock nach den Anweisungen des Herstellers transformiert. Die Zellen, die das pBAD-TOPO/EcoEndoIV-Konstrukt enthielten, wurden auf eine OD₆₀₀ von 0,6 (1.000 ml) wachsen gelassen und die Überexpression wurde durch Arabinose, die auf eine Endkonzentration von 0,2% zugegeben wurde, induziert.
Nach Inkubation bei 37°C für 4 Stunden wurden die Zellen lysiert und das Fusionsprotein durch immobilisierte Metallaffinitäts-Chromatographie und Verwendung von ProBond-Harz (InVitrogen) nach den Angaben des Herstellers gereinigt. Eine 15 ml Fraktion, die das eluierte Protein enthielt, was durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt wurde, wurde gesammelt. Die gepoolten Fraktionen wurden dann weiter durch Ionenaustauschchromatographie unter Verwendung von Mono-S-Harz gereinigt und 0,5 ml der am stärksten konzentrierten eluierten Proteinfraktion wurden gesammelt und nach Zugabe von Glycerin auf 50% bei –20°C gelagert, bis sie benötigt wurden.
UDG-Thioredoxin aus Archaeoglobus fulgidus (AfUDG-Thio)
Der offene Leserahmen für das AfUDG-Protein wurde aus genomischer DNA von A. fulgidus durch PCR amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde in den pBAD-TOPO-ThioFusion-Überexpressionsvektor nach den Anweisungen des Herstellers (InVitrogen) insertiert. Kompetente TOP-10 E. coli (InVitrogen) wurden dann mit dem Konstrukt durch Hitzeschock nach den Anweisungen des Herstellers transformiert. Die Zellen, die das pBAD-TOPO-ThioFusion/AfUDG-Konstrukt enthielten, wurden auf eine OD₆₀₀ von 0,6 (2.000 ml) wachsen gelassen und die Überexpression wurde durch Arabinose, die auf eine Endkonzentration von 0,2% zugegeben wurde, induziert. Nach Inkubation bei 37°C für 4 Stunden wurden die Zellen lysiert und das Fusionsprotein durch immobilisierte Metallaffinitäts-Chromatographie und Verwendung von ProBond-Harz (InVitrogen) nach den Angaben des Herstellers gereinigt. Eine 15 ml Fraktion, die das eluierte Protein enthielt, was durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese bestimmt wurde, wurde gesammelt und bei 4°C gelagert, bis sie benötigt wurde.
Beispiel 1
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde verwendet, um ein 25-meres Oligonukleotid (Initiierender Primer – IP) zyklisch zu verlängern, der komplementär zu einer Region eines 80-meren Oligonukleotids (Template-Nukleinsäure) war, die als ein Template für die Polymerisationsreaktion diente. Die komplementäre Region erstreckte sich von 10 Basen vom 3'-Ende des 80-mers zu 35 Basen von dem 3'-Ende des 80-mers. Die Region des 80-mers 5' zu dieser IP-komplementären Region (IP-Bindungsstelle) wurde entwickelt, so dass sie eine Anzahl von A-Resten enthielt, welche nach zyklischer Verlängerung des 25-mers zu der Herstellung von DNA-Fragmenten diskreter Größen nach der GMA-Reaktion führen würden. Das 80-mer wurde auch so entwickelt, dass eine spezifische Anzahl von G-Resten zwischen jedem A-Rest liegt. Dies wurde gemacht, um die Markierung, durch Einbau von α³²P-dCTP, der verdrängten stromabwärts gelegenen DNA-Fragmente, die während der Reaktion hergestellt wurden, zu ermöglichen. Ein Flussdiagramm des Verfahrens ist in 1 gezeigt. Beide Oligonukleotide wurden künstlich synthetisiert und durch Ausschneiden aus einem Polyacrylamid-Gel nach Elektrophorese gereinigt. Das Ziel war es zu bestimmen, ob das 25-mer an das 80-mer annealte und zyklisch/wiederholt durch das erfindungsgemäße Verfahren verlängert werden konnte, wodurch mehrere Kopien markierter einzelsträngiger DNA-Fragmente (verdrängte Fragmente) hergestellt werden sollten.
Vor Zugabe der Enzyme enthielten die Reaktionen 100 fmole jedes Oligonukleotids, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM MgCl₂, 7 mM Dithiothreitol, jeweils 0,2 mM dATP, dGTP und dUTP, 0,02 mM dCTP und 0,2 μl α³²PdCTP (10 mCi/ml, ~800 Ci/mmol) in einem Gesamtvolumen von 17 μl. Diese Mischung wurde mit Mineralöl überschichtet und auf 95°C für 2 Minuten aufgeheizt. Die Reaktionstemperatur wurde dann auf 37°C gesenkt und bei dieser Temperatur gehalten. 5 Einheiten Klenow-Fragment (3' → 5' Exo^–), 1 Einheit Uracil-DNA-Glycosylase aus E. coli und 2 Einheiten von entweder Endonuklease IV aus E. coli oder 2 μl Endonuklease IV aus Thermatoga maritima wurden dann in dieser Reihenfolge zugegeben, wodurch das Endvolumen der Reaktion auf 20 μl gebracht wurde. Im Falle der Kontrollreaktionen, die keine Endonuklease IV enthielten, und der Kontrollreaktionen, die weder Endonuklease IV noch Uracil-DNA-Glyocosylase enthielten, wurde Wasser zugegeben, um das Endvolumen auf 20 μl zu bringen. Proben von 5 μl wurden den Reaktionen in 30-minütigen Intervallen nach Zugabe der Endonuklease IV entnommen. NaOH wurde zu den Proben auf eine Endkonzentration von 50 mM zugegeben und dann auf 95°C für 15 Minuten erhitzt. Ein gleiches Volumen Formamid-Ladungsfarbstoff (98% Formamid, 0,025% Bromphenol-Blau, 0,025% Xylolcyanol) wurde dann zugegeben. Die Proben wurden dann auf ein 20%iges denaturierendes (7 M Harnstoff) Polyacrylamid-Gel geladen und eine Elektrophorese wurde zur Größenanalyse der DNA-Fragmente durchgeführt. Nach der Gelelektrophorese wurde das Gel einem Phosphor-Screen unterzogen und das Bild anschließend durch ein „Storm" (Markenzeichen) 860 gescannt.
Die Analyse des Bildes zeigte, dass die Reaktionen, die Endonuklease IV enthielten, eine Reihe markierter DNA-Fragmente unterschiedlicher Größen mit weniger als 70 Basen enthielten, die zahlenmäßig über die Zeit anstiegen und die nicht in Kontrollreaktionen, denen die Endonuklease IV fehlte, oder in der Kontrollreaktion, der sowohl die Endonuklease IV als auch die Uracil-DNA-Glycosylase fehlte, auftraten.
Es wurde bemerkt, dass die Endonuklease IV-Zubereitungen aus Thermatoga maritima eine intrinsische und/oder kontaminierende 3'- nach 5'-Exonuklease-Aktivität enthielten. Dies führte zu einer nichtspezifischen Hintergrund-Amplifikation während einer GMA-Reaktion. Um diese Aktivität und die nichtspezifische Amplifikation auszuschließen, wurde das Endonuklease IV-Enzym vor seiner Verwendung in der GMA-Reaktion Hitzebehandelt. Die Stocklösung des Endonuklease IV-Enzyms wurde für 10 Minuten auf 90°C erhitzt, dann für ≥ 5 Minuten auf Eis gestellt und anschließend für ≥ 5 Minuten zentrifugiert. Es wurde auch beobachtet, dass die Endonuklease IV-Zubereitungen aus E. coli eine solche Aktivität enthielten und die Zubereitungen benötigten auch die Inaktivierung der Exonuklease-Aktivität vor der Verwendung.
Beispiel 2
Die erfindungsgemäßen Verfahren wurden verwendet, um ein 41-meres Oligonukleotid (Initiierender Primer – IP) zyklisch zu verlängern, der an seinem 3'-Ende zu sich selbst komplementär, d.h. palindromisch, war und daher als das Template für sich selbst für die GMA-Reaktion diente. Die komplementäre Region erstreckte sich über 20 Basen vom 3'-Ende des 41-mers und dieser Teil des Oligonukleotids wirkte im Wesentlichen als der IP. Die Region des 41-mers 5' zu dieser IP-komplementären Region (IP-Bindungsstelle) wurde so entwickelt, dass sie einen A-Rest nach der IP-Bindungsstelle enthält, der nach zyklischer Verlängerung des 41-mers zur Herstellung eines diskreten DNA-Fragments von 20 Nukleotiden nach der GMA-Reaktion führen würde. Das 41-mer wurde auch so entwickelt, dass es eine Anzahl von G-Resten enthielt. Dies diente dazu, ein Markieren, durch Einbau von α³²P-dCTP, der verdrängten stromabwärts gelegenen DNA-Fragmente, die während der Reaktion hergestellt wurden (20-mer) zu ermöglichen. Das Oligonukleotid wurde künstlich synthetisiert und durch Ausschneiden aus einem Polyacrylamidgel nach Elektrophorese gereinigt. Das Ziel war es zu bestimmen, ob das 41-mer an sich selbst annealte und zyklisch/wiederholt durch das erfindungsgemäße Verfahren verlängert werden könnte, wodurch mehrere Kopien des markierten einzelsträngigen 20-meren DNA-Fragments (verdrängtes Fragment) hergestellt werden könnten.
Vor Zugabe der Enzyme enthielten die Reaktionen 100 fmole des 41-meren Oligonukleotids, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM MgCl₂, 7 mM Dithiothreitol, jeweils 0,2 mM dATP, dGTP und dUTP, 0,02 mM dCTP und 0,2 μl α³²PdCTP (10 mCi/ml, ~800 Ci/mmol) in einem Gesamtvolumen von 17 μl. Diese Mischung wurde mit Mineralöl überschichtet und auf 95°C für 2 Minuten aufgeheizt. Die Reaktionstemperatur wurde dann auf 37°C gesenkt und bei dieser Temperatur gehalten. 5 Einheiten Klenow-Fragment (3' → 5' Exo^–), 1 Einheit Uracil-DNA-Glycosylase aus E. coli und 2 Einheiten von entweder Endonuklease IV aus E. coli oder 2 μl Endonuklease IV aus Thermatoga maritima wurden dann zugegeben, wodurch das Endvolumen der Reaktion auf 20 μl gebracht wurde. Im Falle der Kontrollreaktionen, die keine Endonuklease IV enthielten, und der Kontrollreaktionen, die weder Endonuklease IV noch Uracil-DNA-Glycosylase enthielten, wurde Wasser zugegeben, um das Endvolumen auf 20 μl zu bringen. Die Reaktion wurde für mehr als oder gleich 30 Minuten laufen gelassen. EDTA wurde auf eine Endkonzentration von 10 mM zugegeben, um die Reaktion zu stoppen.
Ein gleiches Volumen Formamid-Ladungsfarbstoff (98% Formamid, 0,025% Bromphenol-Blau, 0,025% Xylolcyanol) wurde dann zugegeben. Die Proben wurden dann auf ein 20%iges denaturierendes (7 M Harnstoff) Polyacrylamid-Gel geladen und eine Elektrophorese wurde zur Größenanalyse der DNA-Fragmente durchgeführt. Nach der Gel-Elektrophorese wurde das Gel einem Phosphor-Screen unterzogen und das Bild anschließend durch ein „Storm 860" (Storm ist ein Markenzeichen) gescannt.
Die Analyse des Bildes zeigte, dass eine nachweisbare Menge des markierten und amplifizierten 20-meren Oligonukleotids in jeder Testreaktion, aber nicht in den Kontrollreaktionen, hergestellt wurde.
Beispiel 3
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde wie in Beispiel 2 beschrieben mit einigen Modifikationen, die wie folgt waren, durchgeführt:
Vor Zugabe der Enzyme enthielt die Reaktion 100 fmole des 41-meren palindromischen Oligonukleotids, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 10 mM KCl, 3 mM MgCl₂, jeweils 0,2 mM dATP, dUTP und dGTP, 0,02 mM dCTP und α³²PdCTP in einem Volumen von 20 μl. Diese Mischung wurde mit Mineralöl überschichtet und auf 95°C für 2 Minuten aufgeheizt. Die Temperatur wurde dann auf 60°C gesenkt und dort gehalten. 10 Einheiten AmpliTaq- (Markenzeichen) -DNA-Polymerase-Stoffel-Fragment, 2 μl Einheiten UDG Thermatoga maritima und 4 Einheiten Endonuklease IV aus E. coli (oder Wasser im Falle der Kontrollreaktion, die keine Endonuklease IV enthielt) wurden in dieser Reihenfolge zu der Reaktion zugegeben, um das Endvolumen der Reaktion auf 25 μl zu bringen. Proben der Reaktionen von 5 μl wurden in 30-minütigen Intervallen nach der Zugabe der Endonuklease IV entnommen. Die Proben wurden auf eine Endkonzentration von 10 mM EDTA gebracht. Ein gleiches Volumen Formamid-Ladungsfarbstoff (98% Formamid, 0,025% Bromphenol-Blau, 0,025% Xylolcyanol) wurde dann zugegeben. Die Größenanalyse der DNA-Proben wurde wie in Beispiel 1 ausgeführt.
Die Analyse des Bildes zeigte, dass die Reaktionen, die Endonuklease IV enthielten, große Mengen markierter DNA enthielten, die in den Kontrollreaktionen nicht vorhanden waren, denen die Endonuklease IV fehlte. Die Menge an DNA in den Testreaktionen stieg über die Zeit und erreichte einen Spitzenwert 90 Minuten nach der Zugabe der Endonuklease IV.
Beispiel 4
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde wie in Beispiel 2 beschrieben mit einigen Modifikationen, die wie folgt waren, durchgeführt:
Vor Zugabe der Enzyme enthielt die Reaktion 100 fmole des 41-meren Oligonukleotids, 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 10 mM KCl, 3 mM MgCl₂, jeweils 0,2 mM dATP, dUTP und dGTP, 0,02 mM dCTP und 0,2 μl α³²PdCTP (10 mCi/ml, ~800 Ci/mmol) in einem Volumen von 20 μl. Diese Mischung wurde mit Mineralöl überschichtet und auf 95°C für 2 Minuten aufgeheizt. Die Temperatur wurde dann auf 70°C gesenkt und dort gehalten. 10 Einheiten AmpliTaq-DNA-Polymerase-Stoffel-Fragment, 2 μl AfUDG-Thio und 2 μl EcoEndoIV (oder Wasser im Falle der Kontrollreaktion, die keine Endonuklease IV enthielt) wurden in dieser Reihenfolge zu der Reaktion zugegeben, um das Endvolumen der Reaktion auf 25 μl zu bringen. Die Reaktion wurde nach Zugabe von EDTA auf eine Endkonzentration von 10 mM nach 60 Minuten beendet. Ein gleiches Volumen Formamid-Ladungsfarbstoff (98% Formamid, 0,025% Bromphenol-Blau, 0,025% Xylolcyanol) wurde dann zugegeben. Die Größenanalyse der DNA-Proben wurde wie in Beispiel 1 ausgeführt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel einem Phosphorscan unterzogen und das Bild unter Verwendung eines Storm- (Markenzeichen) -860-Phosphobildgebers nachgewiesen.
Die Analyse des Bildes zeigte, dass die Reaktionen, die Endonuklease IV enthielten, große Mengen des erwarteten markierten 20-mers und zu einem geringeren Ausmaß einige kleine Fragmente enthielten, die in den Kontrollreaktionen in Abwesenheit der zugegebenen Endonuklease IV abwesend waren.
Beispiel 5
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde verwendet, um die Primerverlängerung von Mengen des 41-meren palindromischen Oligonukleotids im attomolaren Bereich nachzuweisen. Der Uracil-DNA-Glycosylase-Verdau gefolgt von Endonuklease IV-Verdau des Produkts, das durch Polymerase-katalysierte Verlängerung des 41-meren Oligonukleotids unter Verwendung von sich selbst als Template gebildet wurde, ergibt als eines seiner Produkte ein 20-meres einzelsträngiges Oligonukleotid (d.h. verdrängtes Fragment, das anschließend als ein IP wirken kann). Dieses Oligonukleotid wirkt als ein sekundärer Primer. In diesem Beispiel erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren den Nachweis der zyklischen Verlängerung des 20-meren Oligonukleotids durch eine Reaktion mit Rückkopplungsschleife. Ein 42-meres Oligonukleotid (Verstärker-Template) wurde, wie schematisch in 2 dargestellt, entwickelt. Die komplementäre Sequenz des 20-meren sekundären Primers/verdrängten Fragments wird in diesem 42-mer zweimal wiederholt. Die wiederholten Sequenzen werden durch eine AT-Sequenz getrennt (beim Lesen von 5' nach 3'). Dieses Oligonukleotid wurde synthetisiert und in der gleichen Weise wie das 41-mer palindromische Oligonukleotid gereinigt. Dieses 42-mer wurde in großem Überschuss in die Reaktion eingeschlossen. Sobald der 20-mere sekundäre Primer wie vorstehend beschrieben hergestellt wurde, kann er dann an das 42-mere Oligonukleotid annealen und, durch das erfindungsgemäße Verfahren, selbst zyklisch verlängert werden, wodurch als ein Ergebnis zahlreiche Kopien von ihm selbst hergestellt werden. Diese neu hergestellten 20-meren sekundären Primer können dann sich selbst an andere Kopien des 42-meren Oligonukleotids annealen, wodurch neue Runden der zyklischen Verlängerung initiiert werden usw. Das Ziel war es, Mengen des 41-meren palindromischen Oligonukleotids, die normalerweise zu klein sind, um, wie in Beispiel 2 beschrieben, nachgewiesen werden zu können, durch Herstellung nachweisbarer Mengen des 20-meren sekundären Primers durch die Anwendung des oben beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahrens mit Rückkopplungsschleife nachzuweisen.
Die in Beispiel 2 beschriebenen Reaktionen wurden in Dreifachbestimmungen mit Ausnahme der folgenden Modifikationen wiederholt. Das oben beschriebene 42-mer wurde in jede Reaktion in einer Endkonzentration von 40 ng/Reaktion eingeschlossen. Die Konzentration des 41-meren palindromischen Oligonukleotids betrug 1,0 fmol, 10^–2 oder 10^–4 fmol pro Reaktion in den verschiedenen Sätzen von Kontroll- (keine Endonuklease IV in die Reaktion eingeschlossen) und Testreaktionen (Endonuklase IV in die Reaktion eingeschlossen). Die Reaktionen wurden für 2 Stunden vor Zugabe der NaOH auf eine Endkonzentration von 50 mM laufen gelassen. Der Gehalt an markiertem DNA-Fragment der Reaktionen wurde durch Analyse des Äquivalents von 5 μl der ursprünglichen Reaktion (vor Zugabe der NaOH und des Formamid-Ladungsfarbstoffs), wie in Beispiel 1 beschrieben, analysiert.
Die Analyse des Bildes zeigte, dass eine nachweisbare Menge des markierten 20-meren Oligonukleotids in jeder Testreaktion, aber nicht in den Kontrollreaktionen hergestellt wurde.
Ein ähnliches Ergebnis wurde beobachtet, wenn das obige Experiment unter Verwendung der thermostabilen Enzyme, DNA-Stoffel-Fragment, UDG aus Thermatoga maritima und Endonuklease IV aus Thermatoga maritima wiederholt wurde. Um jegliche nichtspezifische Amplifikation, die aus dem Selbstprimen des Verstärker-Templates herrührt, zu vermeiden, enthält das 3'-Ende des Verstärkers für gewöhnlich eine Blockierungsgruppe, die die Verlängerung durch DNA-Polymerase verhindert. Die Blockierungsgruppe, die auf dem vorstehend beschriebenen 42-meren Verstärker verwendet wurde, war ein Didesoxycytosinnukleotid.
Beispiel 6
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde verwendet, um ein selbst-annealendes 41-mer zyklisch zu verlängern. Diese Reaktion produziert ein 20-mer, das dann als ein Initiationsprimer auf einem 42-mer (Verstärker) mit einem blockierten 3'-Terminus (der verwendete Block war ein invertiertes Cytidinnukleotid) wirkt. Der Verstärker wurde so entwickelt, dass seine sekundäre Reaktion auch das gleiche 20-mer durch zyklische Verlängerung produzieren würde (siehe 2). Diese 20-mere würden dann die weitere Verlängerung auf anderen Verstärker-Molekülen primen, wodurch das Signal aus der ursprünglichen Reaktion auf dem 41-mer amplifiziert würde. Die 41-meren und 42-meren Verstärker wurden so entwickelt, dass sie den Einbau von radioaktiv markierten α³²PdCTP erlauben. Die Reaktionen enthielten entweder (1) 100 fmol des 41-mers, (2) 1 fmol des 41-mers, (3) 100 fmol des Verstärkers oder (4) 1 fmol des 41-mers und 100 fmol eines Verstärkers in Taq-Stoffel-Fragment-Puffer (10 mM Tris-HCl, 10 mM KCl, pH 8,3), ergänzt mit 3 mM MgCl₂, 0,2 mM dATP, 0,2 mM dGTP, 0,2 mM dUTP und 0,02 mM und 0,2 μl α³²PdCTP (10 mCi/ml, ~800 Ci/mM). Dieses Reaktionsgemisch wurde mit Öl überschichtet und bei 95°C für 2 Minuten inkubiert, bevor es auf 70°C gebracht wurde und dort gehalten wurde. 10 U Taq-Stoffel-Fragment, 2 μl AfUDG-Thio und 2 μl EcoEndoIV wurden in dieser Reihenfolge dann zugefügt, wodurch das Endvolumen der Reaktion auf 25 μl gebracht wurde. Die Reaktionen wurden bei 70°C für 60 Minuten inkubiert und dann durch Zugabe von EDTA auf eine Endkonzentration von 10 mM beendet. Ein gleiches Volumen von 98% Formamid-Ladungspuffer (enthaltend 0,025% Bromphenolblau, 0,025% Xylolcyanol) wurde zugefügt und die Proben wurden durch denaturierende 20%ige Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert. Nach der Gelelektrophorese wurde das Gel einem Phosphorscreen unterzogen und das Bild unter Verwendung eines Storm- (Markenzeichen) -860-Phosphobildgebers nachgewiesen.
Die Analyse des Bildes zeigte, dass es in Reaktion (1) die Herstellung eines 20-meren markierten DNA-Produkts und zu einem geringeren Ausmaß eines ~60-mers und einer Reihe von Produkten mit weniger als 20-mer gab. Das gleiche Produkt wurde in Reaktion (2) hergestellt, aber in einem viel geringeren Ausmaß. Es gab keine markierten Reaktionsprodukte in Reaktion (3), allerdings wurde in Reaktion (4) ein markiertes 20-mer, was intensiver war als das, das in Reaktion (2) produziert wurde, und in einem geringeren Ausmaß eine Anzahl von markierten Produkten mit weniger als 20-mer produziert. Es wurde beobachtet, dass die Verwendung von invertierten Nukleotiden als 3'-terminale Blockierungen wirksamer war als die Verwendung von Didesoxynukleotiden als terminale Blockierungen.
Beispiel 7
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde verwendet, um ein 41-meres Oligonukleotid (Initiierender Primer – IP) zyklisch zu verlängern, das an seinem 3'-Ende zu sich selbst komplementär, d.h. palindromisch, war und daher als ein Template für sich selbst für die GMA-Reaktion diente. Die komplementäre Region erstreckte sich von über 20 Basen von dem 3'-Ende des 41-mers und dieser Teil des Oligonukleotids wirkte im Wesentlichen als der IP. Die Region des 41-mers 5' zu dieser IP-komplementären Region (IP-Bindungsstelle) wurde so entwickelt, dass sie einen A-Rest nach der IP-Bindungsstelle enthielt, welcher nach zyklischer Verlängerung des 41-mers in der Herstellungs eines diskreten DNA-Fragments von 20 Nukleotiden nach der GMA-Reaktion führen würde. Das 41-mer wurde auch so entwickelt, dass es eine Reihe von G-Resten enthielt. Hierdurch wurde ein Markieren, durch Einbau von α³²PdCTP, der verdrängten stromabwärts gelegenen DNA-Fragmente, die während der Reaktion hergestellt wurden (20-mer) ermöglicht. Das Oligonukleotid wurde künstlich synthetisiert und durch Ausschneiden aus einem Polyacrylamidgel nach Elektrophorese gereinigt. Das Ziel war es zu bestimmen, ob das 41-mer an sich selbst annealte, und zyklisch/wiederholt durch das erfindungsgemäße Verfahren mit Exonuklease III aus E. coli anstelle von Endonuklease IV aus E. coli verlängert werden könnte, wodurch mehrere Kopien des markierten, einzelsträngigen 20- meren DNA-Fragments (verdrängtes Fragment) hergestellt werden würden. Vor Zugabe der Enzyme enthielten die Reaktionen 100 fmol des 41-meren Oligonukleotids, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 5 mM MgCl₂, 7 mM Dithiothreitol, jeweils 0,2 mM dATP, dGTP und dUTP, 0,02 mM dCTP und 0,2 μl α³²PdCTP (10 mCi/ml, ~800 Ci/mmol) in einem Gesamtvolumen von 22 μl. Diese Mischung wurde mit Mineralöl überschichtet und auf 95°C für 2 Minuten aufgeheizt. Die Reaktionstemperatur wurde dann auf 37°C gesenkt und bei dieser Temperatur gehalten. 5 Einheiten Klenow-Fragment (3' → 5' Exo^–), 10 Einheit Uracil-DNA-Glycosylase aus E. coli und 0,1 Einheit Exonuklease III aus E. coli wurden dann zugegeben, wodurch das Endvolumen der Reaktion auf 25 μl gebracht wurde. Im Falle der Kontrollreaktionen, die keine Exonuklease III enthielten, wurde Wasser zugegeben, um das Endvolumen auf 25 μl zu bringen. Die Reaktion wurde für mehr als oder gleich 30 Minuten laufen gelassen. EDTA wurde auf eine Endkonzentration von 10 mM zugegeben, um die Reaktion zu stoppen. Ein gleiches Volumen Formamid-Ladungsfarbstoff (98% Formamid, 0,025% Bromphenol-Blau, 0,025% Xylolcyanol) wurde dann zugegeben. Die Proben wurden dann auf ein 20%iges denaturierendes (7 M Harnstoff) Polyacrylamid-Gel geladen und eine Elektrophorese wurde zur Größenanalyse der DNA-Fragmente durchgeführt. Nach der Gelelektrophorese wurde das Gel einem Phosphor-Screen unterzogen und das Bild anschließend durch einen „Storm-" (Markenzeichen) -860-Phosphobildgeber gescannt.
Die Analyse des Bildes zeigte, dass eine nachweisbare Menge des markierten 20-meren Oligonukleotids in jeder Testreaktion, aber nicht in den Kontrollreaktionen hergestellt wurde.
Beispiel 8
Das erfindungsgemäße Verfahren wurde verwendet, um ein 21-meres Oligonukleotid (Initiierender Primer – IP) zyklisch zu verlängern, das komplementär zu einer Region eines 40-meren Oligonukleotids (Template-Nukleinsäure) war, das als das Template für die Polymerisationsreaktion diente. Die komplementäre Region erstreckte sich von dem 3'-Ende des 40-mers. Die Region des 40-mers 5' zu dieser IP-komplementären Region (IP-Bindungsstelle) wurde so entwickelt, dass sie eine Anzahl von C-Resten enthielt, die nach zyklischer Verlängerung des verlängerten 21-mers zu der Herstellung von DNA-Fragmenten diskreter Größen nach der GMA-Reaktion führen würden. Das 40-mer wurde auch so entwickelt, dass eine Anzahl von G-Resten zwischen jedem A-Rest liegt. Dies diente dazu, eine Markierung, durch Einbau von α³²PdCTP, der verdrängten stromabwärts gelegenen DNA-Fragmente, die während der Reaktion hergestellt wurden, zu ermöglichen.
Beide Oligonukleotide wurden künstlich synthetisiert und durch Ausschneiden aus einem Polyacrylamidgel nach Elektrophorese gereinigt. Das Ziel war es zu bestimmen, ob das 21-mer an das 40-mer annealen würde und zyklisch/wiederholt durch das erfindungsgemäße Verfahren verlängert werden könnte, wodurch mehrere Kopien der markierten einzelsträngigen DNA-Fragmente (verdrängte Fragmente) hergestellt werden würden. Vor Zugabe der Enzyme enthielt die Reaktion 100 fmole jedes Oligonukleotids, 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl₂, 10 mM KCl, jeweils 0,2 mM dATP, dITP und dTTP, 0,02 mM dCTP und 0,2 μl α³²PdCTP (10 mCi/ml, ~800 Ci/mmol) in einem Volumen von 22 μl. Diese Mischung wurde mit Mineralöl überschichtet und auf 95°C für 2 Minuten aufgeheizt. Die Reaktionstemperatur wurde dann auf 70°C gesenkt und dort gehalten. 10 Einheiten Taq-Polymerase-Stoffel-Fragment und 800 pg TmaEndoV wurden in der Reihenfolge zugegeben, um das Endvolumen der Reaktion auf 25 μl zu bringen. Im Falle der Kontrollreaktionen, die keine Endonuklease V enthielten, wurde Wasser zugegeben, um ein Endvolumen von 25 μl zu erreichen. Die Reaktionen wurden nach Zugabe von EDTA auf eine Endkonzentration von 10 mM beendet. Ein halbes Volumen Formamid-Ladungsfarbstoff (98% Formamid, 0,025% Bromphenol-Blau, 0,025% Xylolcyanol) wurde dann zugegeben und die Reaktionsprodukte durch Erhitzen auf 95°C für 5 Minuten denaturiert. Die Proben wurden auf ein 20%iges denaturierendes (7 M Harnstoff) Polyacrylamidgel geladen und eine Elektrophorese zur Größenanalyse der DNA-Fragmente durchgeführt. Nach der Elektrophorese wurde das Gel einem Phosphorscan unterzogen und das Bild unter Verwendung eines Storm- (Markenzeichen) -860-Phosphobildgebers nachgewiesen.
Die Analyse des Bildes zeigte, dass die Reaktionen, die Endonuklease V enthielten, eine Anzahl von markierten DNA-Fragmenten unterschiedlicher Größe enthielten, die durch die relevante Position des dITP-Einbaus in der Verlängerung beschrieben werden und die mit der Zeit in ihrer Zahl zunahmen und die in den Kontrollreaktionen, denen die Endonuklease V fehlte, nicht auftraten.

Claims

Verfahren zur Amplifikation einer Template-Nukleinsäure, das das gleichzeitige Ausführen der folgenden Schritte umfasst: (i) Umsetzen eines Nukleinsäureprimers mit der Template-Nukleinsäure, normalen DNA-Vorläufer-Nukleotiden, mindestens einem modifizierten DNA-Vorläufer-Nukleotid und einer DNA-Polymerase, um einen verlängerten Nukleinsäureprimer zu erhalten, wobei der Nukleinsäureprimer an das Template gebunden bleibt; (ii) Spalten des verlängerten Nukleinsäureprimers, der die modifizierte Base enthält, um einen freien 3'-OH-Terminus zu bilden, der durch die DNA-Polymerase verlängerbar ist; und (iii) Wiederholen der Schritte (i) und (ii) mit den hierdurch gebildeten DNA-Fragmenten.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der verlängerte Nukleinsäureprimer, der die modifizierte Base enthält, durch eine 3'-Endonuklease gespalten wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die 3'-Endonuklease die Endonuklease V aus E. coli ist.
Verfahren nach Anspruch 1, das die Schritte umfasst: (i) Umsetzen eines Nukleinsäureprimers mit der Template-Nukleinsäure, normalen DNA-Vorläufer-Nukleotiden, mindestens einem modifizierten DNA-Vorläufer-Nukleotid, das ein Substrat für eine DNA-Glycosylase ist, und einer DNA-Polymerase, um einen verlängerten Nukleinsäureprimer zu erhalten, wobei der Nukleinsäureprimer an das Template gebunden bleibt; (ii) Ausschneiden der modifizierten Base des modifizierten DNA-Vorläufer-Nukleotids aus dem verlängerten Nukleinsäureprimer mittels einer DNA-Glycosylase, um eine abasische Stelle zu bilden; (iii) Spalten des verlängerten Nukleinsäureprimers an der abasischen Stelle, um einen freien 3'-OH-Terminus zu bilden, der durch die DNA-Polymerase verlängerbar ist; und (iv) Wiederholen der Schritte (i) bis (iii) mit den hierdurch gebildeten DNA-Fragmenten.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die Template-Nukleinsäure DNA ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der Nukleinsäureprimer ein DNA-Primer ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die DNA-Vorläufer-Nukleotide ausgewählt sind aus dATP, dCTP, dGTP und dTTP.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei die DNA-Polymerase „strand displacement"-Aktivität besitzt.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei der modifizierte Nukleinsäurevorläufer dUTP ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 9, wobei die DNA-Glycosylase Uracil-DNA-Glycosylase (UDG) ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 10, wobei die verlängerte Nukleinsäure an der abasischen Stelle mittels eines Enzyms, das eine Nukleinsäure an einer abasischen Stelle spaltet, gespalten wird.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei das Enzym eine AP-Endonuklease ist.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das modifizierte Vorläufer-Nukleotid teilweise eines der normalen Vorläufer-Nukleotide ersetzt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, 5 bis 9 und 13, wobei die Schritte (i) und (ii) in einer zyklischen Weise fortgesetzt werden, bis eines der Reagenzien limitierend wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 13, wobei die Schritte (i) bis (iii) in einer zyklischen Weise fortgesetzt werden, bis eines der Reagenzien limitierend wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, das unter isothermischen Bedingungen durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche, das in der Anhäufung von verdrängten (displaced) einzelsträngigen stromabwärts gelegenen Fragmenten der Nukleinsäure resultiert, die durch die Lokalisationen von modifizierten Basen in einem komplementären Nukleinsäurestrang spezifiziert werden.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche zur Bildung von mehreren Kopien diskreter einzelsträngiger Primer, die stromabwärts eines initiierenden Nukleinsäureprimers gelegen sind.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, wobei die verdrängten stromabwärts gelegenen Fragmente in einer Folgereaktion verlängert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei die verdrängten stromabwärts gelegenen Fragmente auf einer zweiten Template-Nukleinsäure verlängert werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, wobei mehrere Zweittemplates auf einem DNA-Chip immobilisiert sind.
Verfahren nach einem vorangegangenen Anspruch zur Verwendung in Nachweis-Diagnostika.
Verfahren nach Anspruch 22, das zum Nachweis von Pathogenen verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 22, das zum Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit von Mutationen verwendet wird.
Verfahren nach Anspruch 22, das zum Nachweis von Polymorphismen verwendet wird.
Verfahren nach einem vorangegangenen Anspruch zur Quantifizierung eines Nukleinsäurespiegels in einer Probe.
Verfahren nach einem der vorangegangenen Ansprüche zur Verwendung bei der Signalverstärkung einer beliebigen Nukleinsäure, die als ein Primer oder Template wirken kann.
Verfahren nach einem vorangegangenen Anspruch zur Verwendung beim DNA-Rechenverfahren.