DE60119170T2 - Nachweismethode mittels verstärkter silberfärbung - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft mehrere Gebiete, insbesondere den Nachweis bestimmter Nukleinsäuren, Proteine, Kohlenhydrate oder organischer Verbindungen, die auf einer festen Oberfläche immobilisiert sind. Genauer betrifft sie Nachweissysteme, in dem der immobilisierte Target von einer metallischen Nanopartikelsonde erkannt wird und für die das Signal zum Nachweis durch die reduktive Abscheidung von Silber auf der Nanopartikelsonde verstärkt wurde.
  • ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
  • (a) Gold-Nanopartikelsonden:
  • Die Verwendung von Gold-Nanopartikeln als Signalgeber für den Nachweis biologischer Polymere wurde erstmals von W. P. Faulk und G. M. Taylor beschrieben, die die Nanopartikel als immunozytochemische Sonden für Oberflächenantigene einsetzten [Immunochemistry, 8, 1081 (1971)]. Seither sind Goldkolloide weithin für die Nachweis verschiedener Proteine verwendet worden, wobei Elektronen- oder Lichtmikroskopie zur Beobachtung der Partikel verwendet wurde [zu Berichten siehe Hacker, G. W. in Colloidal Gold; Principles, Methods, and Applications, Vol. 1, Academic Press, Inc. (1998), S. 297 und Garzon, S. und Bendayan, M. in Immuno-Gold Electron Microscopy in Virus Diagnosis and Research, Hrsg. Hyatt, A. D. und Eaton, B. T., CRC Press, Ann Arbor, (1993), S. 137]. In jüngster Zeit wurden Anwendungen von Gold-Nanopartikeln oder -Clusterkonjugaten als Sonden für den Nachweis von Oligonukleotiden und Nukleinsäuren vorgeschlagen [Kidwell, D. A. und Conyers, S. M., US-Patentschrift 5,384,265 (1995); Hainfeld, J. F. u.a., US-Patentschrift 5,521,289 (1996)] und beschrieben [Tomlinson, S. u.a., Analytical Biochemistry, 171, 217 (1988); Mirkin u.a., Nature, 15, 607 (1996); Storhoff, J. J. u.a., J. Am. Chem. Soc., 120, 1959 (1998)].
  • (b) Steigerung des Signals mit Silber:
  • Es wurde festgestellt, dass die Empfindlichkeit bei Assays, die Goldmarker für Proteine in Geweben verwenden [Danscher, G. Histochemistry, 71, 1 (1981); Holgate, C. S. u.a. J. Histochem. Cytochem. 31, 938 (1983)], bei Nukleinsäuren, die in situ in immobilisierten biologischen Systemen sichtbar gemacht werden [Gassell, G. J. u.a.; J. Cell Biology, 126, 863 (1994); Zehbe, I u.a., Am. J. of Pathology, 150, 1553 (1997); Hacker, G. W., Eur. J. Histochem 42, 111 (1998)] und bei Goldsonden, die auf Oligonukleotide gerichtet sind, welche an Oligonukleotid-Arrays auf einer Glasoberfläche festgehalten sind [T. A. Taton, C. A. Mirkin, R. L. Letsinger, Science, 289, 1757 (2000)] mit Hilfe von Silberfärbung deutlich erhöht werden kann. In diesem Prozess werden die Goldpartikel, die auf einer Oberfläche festgehalten sind, mit einer Lösung behandelt, die Silberionen und ein Reduktionsagens (z.B. Hydroquinon) enthält. Das Gold katalysiert die Reduktion der Silberionen, so dass Silber auf dem Goldpartikel abgeschieden wird, und das zuerst abgeschiedene Silber kann selbst die weitere Reduktion von Silberionen katalysieren. Infolgedessen wird die Metallmenge, die sichtbar gemacht werden kann, bedeutend erhöht. Leider jedoch hört nach einer gewissen Zeit die Silberreduktion, die durch das abgeschiedene Silber katalysiert wird, auf, also ist das Ausmaß der erzielbaren Verstärkung begrenzt. Wenn zur Steigerung der Sichtbarkeit von Gold-Nanopartikeln auf einer Glasplatte eingesetzt, beobachtet man die Verdunklung des Flecks, die charakteristisch für die von einer Targetsequenz festgehaltenen Goldsonden ist. Tatsächlich kann ein guter Silberfleck in Fällen beobachtet werden, wo die anfänglich abgeschiedene Goldmenge zu gering ist, um mit bloßem Auge sichtbar zu sein. Typischerweise ist die Reaktionszeit für den Silberfärbungsschritt kurz, in einer Größenordnung von fünf Minuten oder weniger. Lang andauernder Kontakt mit der Silberlösung führt zur nicht-selektiven Abscheidung von Silbermetall und einer starken Hintergrundfärbung. Die Silberionenlösung und das Reduktionsagens werden kurz vor der Anwendung gemischt, um die unkatalysierte Reduktion zu minimieren.
  • (c) Oligo- und Polynukleotid-Arrays:
  • Eine jüngere wichtige Erfindung in der Biologie verwendet Arrays von Oligonukleotiden oder Polynukleotiden, die an eine feste Oberfläche gebunden sind. Diese Oligomere dienen als Einfangsonden, um komplementäre DNA- oder RNA-Targetsequenzen zu binden. Die eingefangenen Sequenzen können wiederum an fluoreszierenden Markern, die zuvor an sie angehängt wurden, oder an fluoreszierenden oder colorimetrischen Sonden erkannt werden, die an ein Segment des Targets binden. Wie Eric Lander feststellt [Nature Genetics Supplement, 21, 3 (1999)]: „Arrays offer the first great hope ... by providing a systematic way to survey DNA and RNA variation. They seem likely to become a standard tool of both molecular biology research and clinical diagnostics. These prospects have attracted great interest and investment from both the public and the private sectors."
  • Die Array-Technik beschleunigt nun in der Tat stark Entwicklungen in unserem Verständnis genetischer Veränderungen und der Genexpression. Dennoch unterliegt die aktuelle Verfahrenstechnik mehreren Beschränkungen, von denen eine wichtige in der relativ geringen Empfindlichkeit bei dem Nachweis fluoreszierend markierter Targets auf den Chiparrays besteht. Typischerweise müssen Targets im Bereich pikomolarer Konzentrationen oder höher eingesetzt werden. Die genetische Analyse natürlicher Targets im attomolaren oder zeptomolaren Bereich erfordert daher die Verstärkung durch PCR. Dieses Verfahren erfordert Zeit und Arbeitaufwand, und die Targetverstärkung kann zu Fehlern in der zu testenden Sequenz führen.
  • Es besteht ein Bedarf an einem empfindlicheren, einfacheren und billigeren Nachweisverfahren für Polynukleotide, die in Arrays auf Chips angeordnet sind. Ein Fortschritt in der Nachweistechnik wurde durch die Verwendung von Gold-Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugaten als Sonden und der Signalverstärkung durch Silberionen erzielt, was es ermöglicht, Assays aus Polynukleotiden mit einer Konzentration von 50 fM ohne weiteres nachzuweisen [zur Verfahrenstechnik siehe T. A. Taton, C. A. Mirkin, R. L. Letsinger, Science, 289, 1757 (2000)]. Wir beschreiben vorliegend eine Entdeckung, die die Targetkonzentration, die für Assays notwendig ist, welche Gold-Nanopartikel und andere metallische Nanopartikel einsetzen, erheblich weiter verringert.
  • KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Verstärkung eines Signals durch die Steigerung der Abscheidung von Silber in Nachweissystemen, in denen die Bildung eines Silberflecks als ein Signalgeber für die Gegenwart eines Moleküls, einschließlich biologischer Polymere (z.B. Proteine und Nukleinsäuren) und kleiner Moleküle, dient. Die Nachweissysteme umfassen den Nachweis von Molekülen in situ (z.B. in Zellen oder in einer Gewebeprobe) und Assays, in denen das nachzuweisende Molekül (das Targetmolekül) an ein Substrat gebunden ist oder von einem anderen Molekül, das an das Substrat gebunden ist, eingefangen wird (das Einfangmolekül). Die Erfindung weist besondere Nützlichkeit bei der Erhöhung der Signalstärke in diagnostischen und Screening-Anwendungen auf, die den Nachweis von Targetmolekülen umfassen, welche an diskreten Stellen auf einer festen Oberfläche in einem Array angeordnet sind. Daher stellt sie ein Mittel zur starken Steigerung der Empfindlichkeit von Tests bereit, die an Mikroarrays oder Mikrochips durchgeführt werden. Das Verfahren zeichnet sich durch die Einfachheit und Sparsamkeit seiner Ausführung und die starke Steigerung des Signals und somit der realisierten Empfindlichkeit aus.
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf den Entdeckungen, dass (1) Gold-Nanopartikel, die mit Oligonukleotiden beschichtet sind, an Silber binden, das vorher auf Gold-Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugaten abgeschieden wurde, welche durch Hybridisierung auf einem Glassubstrat oder einer Glasplatte immobilisiert wurden, und dass (2) die daraus resultierenden (Gold-Nanopartikel-Oligonukleotid-Silber-(Gold-Oligonukleotid)-Strukturen als Katalysator für die weitere Abscheidung von Silber durch Reduktion von Silberionen fungiert. Die erste Entdeckung ist überraschend, da man erwarten würde, dass die an die Oberfläche gebundenen Oligonukleotide, die die Nanopartikel gegen nicht-spezifische Bindung an die Glasoberfläche und die auf der Glasoberfläche immobilisierten Oligonukleotide abschirmen, auch die Nanopartikel gegen Wechselwirkung mit der Silberoberfläche abschirmen. Tatsächlich haben andere Arbeiten gezeigt, dass Oligonukleotide Gold-Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate vor Fusion zu Gold-Gold-Bindungen zwischen den einzelnen Nanopartikeln schützen, selbst wenn die Mischungen getrocknet sind. Die zweite Erfindung ist wesentlich, da sie ein Mittel zur beträchtlichen Erhöhung der metallischen Masse an der Stelle der ursprünglich immobilisierten Nanopartikel bereitstellt. Zusammen mit der Entwicklung von Pufferbedingungen, die es ermöglichen, dass Gold-Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate, die durch Hybridisierung oder Wechselwirkung mit Silber ungebunden sind, sauber von der Glasoberfläche gewaschen werden, eröffneten diese Feststellungen Möglichkeiten für die Assay-Zubereitung von Polynukleotidtargets mit extrem niedrigen Targetkonzentrationen.
  • Dementsprechend ist es eine Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zum Verstärken eines Nachweissignals bereitzustellen, das umfasst:
    • (a) das Bereitstellen eines Substrates, das abgeschiedenes Silber aufweist,
    • (b) das In-Berührung-Bringen des Substrates, das abgeschiedenes Silber aufweist, mit einer Lösung, die Nanopartikel enthält, an die Oligonukleotide gebunden sind, um so ein Substrat mit einem Nanopartikel-Silber-Sandwich herzustellen,
    • (c) das Waschen des Substrates, das den Sandwich aufweist, und
    • (d) das In-Berührung-Bringen des Substrates, das den Sandwich aufweist, mit Silber-Ionen und einem Reduktionsagens, um Silberabscheidung auf den Nanopartikeln des Sandwiches zu fördern.
  • Die Nanopartikel, an die Oligonukleotide gebunden sind, umfassen Gold, Silber, Platin oder Mischungen daraus. Diese Nanopartikel können in Form von Gold-Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugaten oder -Komplexen vorliegen.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Förderung der Silberabscheidung auf eine Oberfläche, die Silber enthält, bereitzustellen, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:
    • (a) das Bereitstellen einer Oberfläche mit daran gebundenem Silber,
    • (b) das In-Berührung-Bringen der Oberfläche mit einer Lösung, die Nanopartikel enthält, an die Oligonukleo tide gebunden sind, um so eine Oberfläche mit Nanopartikel-Silber-Sandwich herzustellen,
    • (c) das Waschen der Oberfläche, die den Nanopartikel-Silber-Sandwich aufweist,
    • (d) das In-Berührung-Bringen der Oberfläche, die den Nanopartikel-Silber-Sandwich aufweist, mit einer Lösung, die Silber-Ionen enthält, unter Reduktionsbedingungen, um Silberabscheidung auf die Nanopartikel des Nanopartikel-Silber-Sandwiches zu fördern, und
    • (e) das Waschen der Oberfläche mit abgeschiedenem Silber.
  • Gemäß diesem Verfahren kann die Oberfläche Zellen oder Gewebe für den Nachweis in situ von Targetmolekülen enthalten. Vorzugsweise umfassen die Nanopartikel, an die Oligonukleotide gebunden sind, Gold-Nanopartikel, an die in Konjugat- oder Komplexform Oligonukleotide gebunden sind. Bei der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung werden Gold-Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate bevorzugt.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Set zur Nachweissignalverstärkung bereitzustellen, umfassend:
    • (a) Behälter mit Nanopartikeln, an die Oligonukleotide gebunden sind;
    • (b) Behälter mit einem Silbersalz und
    • (c) Behälter mit einem Reduktionsagens.
  • Das Set kann Anweisungen für die Verwendung bei der Verstärkung von Silberfärbungsnachweissignalen enthalten. Vorzugsweise umfassen die Nanopartikel, an die Oligonukleotide gebunden sind, Gold-Nanopartikel, an die in Konjugat- oder Komplexform Oligonukleotide gebunden sind. Bei der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung werden Gold-Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate bevorzugt.
  • BESCHREIBUNG DER FIGUREN
  • 1 ist eine schematische Darstellung der Verstärkung eines Nachweissignals für einen Gold-Nanopartikel, der auf einer festen Oberfläche immobilisiert ist. Schritt (a) ist herkömmliche Silberfärbung. In Schritt (c) werden Gold-Nanopartikel, die Oligonukleotide tragen, an die Silberoberfläche gebunden. Schritt (e) ist gewöhnliche Silberfärbung der Gold-Nanopartikel, die an die vorherige Silberoberfläche gebunden wurden.
  • 2 stellt zwei Platten mit oder ohne Anwendung des Verstärkungsverfahrens der Erfindung dar. Platte (a) wurde einem zweiten Durchlauf herkömmlicher Silberfärbung unterzogen, in dem Versuch, den Fleck weiter zu steigern. Es trat leichte, aber sehr geringe Steigerung ein. Platte (b) wurde dem Signalverstärkungsverfahren der Erfindung unterzogen.
  • 3 stellt zwei Platten mit oder ohne Anwendung des Verstärkungsverfahrens der Erfindung dar. Platte (a) gibt das Signal an, das unter Verwendung der herkömmlichen Silberfärbung für eine Probe erzielt wurde. Platte (b) zeigt die Steigerung, die durch die Anwendung des erfinderischen Signalverstärkungsverfahrens erzielbar ist.
  • 4 stellt zwei Platten mit oder ohne Anwendung des Verstärkungsverfahrens der Erfindung dar. Platte (a) zeigt die Ergebnisse der herkömmlichen Silberfärbung für einen Test, in dem eine Lösung mit 25 fM des Targetoligonukleotids verwendet wurde. Platte (b) zeigt die Ergebnisse für den gleichen Test, in dem der anfänglichen Silberfärbung das Signalverstärkungsverfahren der Erfindung folgte.
  • 5 stellt eine Platte nach der Anwendung des erfinderischen Signalverstärkungsverfahrens der Erfindung dar. Der Fleck, der nach zwei Durchläufen des Verfahrens der Nanopartikel-Oligonukleotid(konjugat I)/Silberfärbung erzielt wurde, setzte sich an, als Gold-Nanopartikelsonden und ein Oligonukleotidtarget (63-mer) auf einer Glasplatte immobilisiert wurden. Die Konzentration des Targetoligonukleotids betrug in diesem Fall nur 1 fM.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Signalverstärkung zum Erkennen von Targetsubstanzen. Insbesondere stellt die Erfindung die Verstärkung von Signal und die Steigerung der Assayempfindlichkeit zum Nachweis von winzigen Mengen von Targetmolekülen, z.B. Nukleinsäuren, bereit, die auf dem Nachweis mittels Silberfärbung basieren. Bei der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung wird das erfinderische Verfahren nach der Anwendung herkömmlicher Silberfärbung verwendet, wo es zur Bildung von Silber-Gold(Oligonukleotid)-Silber-Verbindungen führt, die im Vorliegenden als Silber-Gold'-Silber-Sandwich-Verbindungen bezeichnet werden.
  • Die vorhergehenden Schritte, die zur herkömmlichen Silberfärbung führen und diese einschließen, können beispielsweise umfassen: Einfangen eines Targetoligonukleotids durch eine Oligonukleotideinfangsonde, die an eine Glasoberfläche gebunden ist, Waschen, Hinzugeben von Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugaten, die komplementär zu einem nicht hybridisierten Segment des gebundenen Targetoligonukleotids sind, Waschen, Hinzugeben einer Silberfärbungslösung (Ag+ plus ein Reduktionsagens, von Sigma beziehbar), Waschen, Trocknen und Begutachten, entweder mit bloßem Auge oder mit Hilfe von Bildern, die unter Verwendung eines einfachen Flachbettscanners gewonnen wurden. Dieses Vorgehen wurde von Taton u.a., Science, 289, 1757 (2000) beschrieben, der zeigte, dass, obschon bei Targetkonzentrationen von 100 nM an Oligonukleotid der Goldfleck zu schwach war, um direkt beobachtet zu werden, herkömmliche Silberfärbung einen starken dunklen Fleck hervorbrachte. Die Nachweisgrenze bei diesem System mit herkömmlicher Silberfärbung liegt bei Konzentrationen von 50 fM, für die ein extrem schwacher Fleck beobachtet wird. Der erneute Kontakt mit der Silberlösung steigerte die Intensität des Flecks nicht wesentlich.
  • Zur Verstärkung des Silbersignals durch das erfinderische Silber-Gold'-Silber-Sandwich-Verfahren wird die Glasplatte, die von einer vorherigen Anwendung herkömmlicher Färbung eine Silberfaärbung enthält, wird ferner einer wässrigen Verstärkungslösung aus Nanopartikeln, an die Oligonukleotide gebunden sind, vorzugsweise Gold-Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate oder ein Gold-Nanopartikel-Oligonukleotid-Komplex, ausgesetzt. Die Oligonukleotidsequenz muss nicht mit der Targetoligonukleotidsequenz oder den Sequenzen auf den anfänglichen Sonden verwandt sein. Für Gold-Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate enthält die Verstärkungslösung im Allgemeinen zwischen etwa 1 nM und etwa 5 nM Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate. Die Verstärkungslösung kann Salze wie etwa Puffersalze und Reinigungsmittel wie etwa Phosphat, Citrat, HEPES und NES enthalten, und sie weist vorzugsweise einen pH-Wert von etwa 7 auf. Bei der praktischen Umsetzung der Erfindung hat sich eine wässrige Verstärkungslösung mit wässrigem 0,1-M-NaCl und 10-mM-Phosphat (pH 7,0) als besonders nützlich erwiesen. Für Gold-Nanopartikel-Oligonukleotid-Komplexe ist die Verstärkungslösung die gleiche. Jede geeignete Weise, um die Silberfärbung der Verstärkungslösung auszusetzen, kann verwendet werden. Repräsentative Beispiele umfassen das Aufsprühen, das Tauchen u.ä.
  • Nach etwa 5 bis 30 Minuten, vorzugsweise etwa 10 Minuten, werden die ungebundenen Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate oder -Komplexe durch Waschen der Platte mit einer geeigneten wässrigen Lösung, vorzugsweise Wasser, entfernt. Optional wird die Platte mit einem beliebigen geeigneten Verfahren getrocknet, wie etwa Lufttrocknung. Die Platte wird dann für einen geeigneten Zeitraum, im Allgemeinen für etwa 5 bis etwa 10 Minuten, vorzugsweise für etwa 5 Minuten, erneut einer Silberfärbungslösung ausgesetzt. Es versteht sich, dass jedes geeignete Silberfärbungsverfahren verwendet werden kann. Geeignete, aber nicht einschränkende Beispiele für nützliche Silberfärbungsverfahren und – zusammensetzungen sind beispielsweise in M. A. Hayat, Hrsg., "Immunogold-Silver Staining", CRC Press (1995) beschrieben. Im Allgemeinen umfassen Silberfärbungslösungen Silberionen in Form eines Silbersalzes wie etwa Silberacetat (bevorzugt), Silberlactat und Silbernitrat. Diese Lösungen können auch ein Reduktionsagens umfassen, das der Lösung kurz vor der Verwendung beigemischt wird. Geeignete, aber nicht einschränkende Beispiele für Reduktionsagenzien umfassen Hydroquinon, N-Propylgalat, P-Phenylendiamin und Formaldehyd. Falls gewünscht, können andere Agenzien wie etwa Gummiarabikum verwendet werden, um den Silberfärbungsprozess zu vermitteln. Es kann jede beliebige Weise, das Substrat mit der Silberfärbungslösung in Berührung zu bringen, verwendet werden. Repräsentative Beispiele umfassen das Aufsprühen, das Tauchen u.ä.
  • Nach dem Waschen mit Wasser (bevorzugt) oder einer anderen geeigneten Lösung (z.B. wässrige Lösung mit 0,1 M NaCl und 10 mM Phosphat (pH 7,0)), um unreagierte Silberfärbungslösung zu entfernen, wird die erneut behandelte Platte visuell beobachtet oder mit einem Flachbettscanner kopiert. Diese Behandlung führt zu einer großen Verstärkung der Dunkelheit des Flecks. Der Prozess kann so oft wie gewünscht wiederholt werden, um die Menge abgeschiedenen Silbers und die Dunkelheit des Flecks weiter zu steigern.
  • Mit diesem erfinderischen Verstärkungsverfahren kann man ohne weiteres einen dunklen Silberfleck für ein Assay mit 25 fM Targetkonzentration beobachten. Bei zwei Durchläufen des neuen Nanopartikel-Silber-Sandwich-Verfahrens können Targetlösungen mit 1 fM erkannt werden, und bei drei Durchläufen geben Lösungen mit 0,1 fM eindeutige, wenn auch schwache Flecken. Diese Versuche wurden jeweils mit 1 Mikroliter der Targetlösung durchgeführt. Bei dem Assay mit Lösung mit 0,1 fM entspricht dies –60 Targetmolekülen in der behandelten Probe.
  • Es kann jedes Substrat verwendet werden, das die Beobachtung eines Silberflecks als der erkennbaren Veränderung gestattet. Geeignete Substrate umfassen transparente feste Oberflächen (z.B. Glas, Quarz, Kunststoff und andere Polymere). Das Substrat kann jede Form oder Dicke haben, wird aber im Allgemeinen flach und dünn sein. Bevorzugt werden transparente Substrate wie etwa Glas (z.B. Glasobjektträger) oder Kunststoff (z.B. Vertiefungen von Mikrotiterplatten).
  • Das Silberfärbung-Signalverstärkungsverfahren der Erfindung hängt von der Verwendung von Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugaten oder -Komplexen ab, die bestimmte Merkmale erfüllen. Erstens kleben die Nanopartikel nicht an der Oberfläche des getesteten Chips. Gewöhnliche Nanopartikel, die mit dam Citratreduktionsverfahren nach Frens (Frens, G., Nat. Phys. Sci., 241, 20–22 (1973)) hergestellt sind, sind nicht zufrieden stellend, da sie wahllos an die Oligonukleotid-derivatisierte Glasplatte binden, die als das Substrat für diese Assays benutzt wird. Die nachfolgende Silbersteigerung ergibt dann falsche Positive als dunkle Bereiche. Zweitens binden die Nanopartikel solcherart an eine abgeschiedene Silberoberfläche, dass bei dem anschließenden Waschen die angelagerten Nanopartikel an den Silberbereich gebunden bleiben, während die in Lösung suspendierten Nanopartikel sauber entfernt werden. Drittens fungieren die Nanopartikel als Agenzien zur Reduktion von Silberionen unter Silberfärbungsbedingungen. Bei der praktischen Umsetzung der Erfindung sind nützliche Nanopartikel solche, die mit Oligonukleotiden beschichtet sind, welche durch Schwefel an die Oberfläche gebunden sind (Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate), wie etwa die, die in J. J. Storhoff u.a., J. Am. Chem. Soc., 120, 1958 (1999) beschrieben sind (zu einem konkreten Beispiel siehe Konjugat I in Beispiel I unten), oder mit natürlichen Oligonukleotiden, die an die Oberfläche adsorbiert sind (Nanopartikel-Oligonukleotid-Komplexe), wie etwa das in Beispiel 3 beschriebene Konjugat III. Beide Arten von Nanopartikeln funktionieren gut in gering oder moderat konzentrierter Salzlösung (z.B. bis zu 0,1 M), doch werden die Konjugate, die den Schwefelanker enthalten, insbesondere für Tests bevorzugt, die bei hoher Konzentration durchgeführt werden, bei der die Komplexe, die durch einfache Adsorption von Oligonukleotiden gebildet werden, unstabil sind und sich zusammenlagern. Der Durchschnittsfachmann wird verstehen, dass jede Nanopartikelzubereitung, die die oben aufgezählten Kriterien erfüllt, als Vermittlungsagens bei der Bildung der Sandwich-Verbindungen nützlich ist, und die Verfahrenstechnik kann zur Verstärkung des Silbersignals für jeden Target benutzt werden, der durch eine erste Silberabscheidung visualisiert wird. Während Gold-Nanopartikel besonders bevorzugt werden, kann jeder Nanopartikel benutzt werden, der die Reduktion von Silber katalysiert, einschließlich Silber- und Platin-Nanopartikeln.
  • Die Zubereitung von Nanopartikeln, die für die Verwendung bei der praktischen Umsetzung der Erfindung geeignet sind, das Anlagern von Oligonukleotiden an ihnen, die Flachbettscannertechnik und verschiedene Assay-Formate zum Nachweis von Nukleinsäuren unter Benutzung herkömmlicher Silberfärbung sind in den ebenfalls anhängigen Anmeldungen Nr. 09/760,500, eingereicht am 12. Januar 2001; 09/603,830, eingereicht am 26. Juni 2000; 09/344,667, eingereicht am 25.
  • Juni 1999; 09/240,755, eingereicht am 29. Januar 1999; 60/031,809, eingereicht am 29. Juli 1996; 60/176,409 und 60/200,161, eingereicht am 26. April 2000; sowie in den internationalen Anmeldungen Nr. PCT/US97/12783, eingereicht am 21 Juli 1997; PCT/US00/17507, eingereicht am 26. Juni 2000 und PCT/US01/01190, eingereicht am 12. Januar 2001, mit dem Titel „Nanoparticles Having Oligonucleotides Attached Thereto And Uses Therefor" beschrieben.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Zubereitung von mit Oligonukleotiden modifizierten Gold-Nanopartikeln
  • Es wurden Oligonukleotide und 5'-Mercaptoalkyl-Oligonukleotide unter Benutzung von Phosphoramidit-Chemie, wie von Storhoff u.a. beschrieben [J. Am. Chem. Soc. 120, 1959–1964 (1998)], zubereitet. Es wurden Gold-Nanopartikel (–13 nm Durchmesser), wie von Grabar, K. C. u.a. [J. Analyt. Chem., 67, 735–743 (1995)]; Frens, G., Nat. Phys. Sci., 241, 20–22 (1973)] beschrieben, zubereitet.
  • Zur Zubereitung des Nanopartikel-Konjugats (I), das in dem Verstärkungssystem mit Silber-Gold'-Silber-Sandwich benutzt wird, wurde 5'-Mercaptoalkyl-Oligonukleotid (II) zubereitet und mit dem allgemeinen Verbindungsverfahren, das von Storhoff u.a. beschrieben wurde [J. Am. Chem. Soc. 120, 1959–1964 (1998)], mit Goldpartikeln verbunden. Der Nanopartikel-Oligonukleotid-Komplex (III) wurde zubereitet, indem 1 μL einer wässrigen Lösung, die 0,260 A260-Einheiten von Oligonukleotid IV enthielt, mit 100 μL von Citratstabilisiertem Goldkolloid (zubereitet wie von Grabar u.a. [J. Analyt. Chem., 67, 735–743 (1995)] beschrieben, gemischt wurden und die Lösung über Nacht stehen gelassen wurde.
    • I. Konjugat, gebildet aus Gold-Nanopartikeln und II.
    • II. 5'-HS(CH2)6OP(O)(O)O-(A)20TGGGTAGCAGACCTC (SEQ ID-Nr.: 1)
    • III. Komplex, gebildet aus Gold-Nanopartikel und IV
    • IV. 5'-GCTCTAGAATGAACGGTGGAAGGCGGCAGG (SEQ ID-Nr.: 2)
  • BEISPIEL 2: Sandwichverstärkung des Silbersignals
  • In diesem Beispiel wurden vier getrennte Versuche unter Benutzung des Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugats (I) bzw. -Komplexes (III), die wie in Beispiel 1 beschrieben zubereitet wurden, durchgeführt, und unter Verwendung von Glasobjektträgern, die Silberflecken von Oligonukleotid-Assays enthielten, welche unter Benutzung des Silberfärbungsverfahrens durchgeführt wurden, das von T. A. Taton u.a., Science, 289, 1757–60 (2000) beschrieben wurde. Die Glasplatte, die die Silberflecken trug, wurde zehn Minuten lang einer Lösung von Gold-Nanopartikel-Konjugat I (2, 4 und 5) oder Gold-Nanopartikel-Komplex III (3) ausgesetzt, mit 1-M-NaNO3 in nanoreinem Wasser gewaschen und für fünf Minuten bei Raumtemperatur einer 1:1-Mischung frisch gemischter Probe der beiden handelsüblichen Silver-Enhancer-Lösungen (Katalog-Nr. 55020 und 55145, Sigma Corporation, St. Louis, MO) ausgesetzt, dem Sigma-Protokoll für den Silberfärbungsschritt folgend, einschließlich der abschließenden Waschvorgänge mit nanoreinem Wasser, Natriumthiosulfatlösung und nanoreinem Wasser. Die Platte wurde getrocknet und beobachtet, sowohl visuell als auch durch das Kopieren zur Aufzeichnung mit einem Scanner von Hewlett Packard [Modell Nr. 5200C]. Die direkten visuellen Beobachtungen von Flecken entsprachen den Ausdrucken, die mit Hilfe des Scanners gewonnen wurden. Die Figuren sind vergrößert.
  • 2 illustriert die Ergebnisse für den ersten Versuch unter Benutzung von Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugat I. In diesem Versuch wurden zwei Platten benutzt, die jeweils sehr schwache Silberflecken von der vorhergehenden Hybridisierung und Silberfärbung einer verdünnten Targetlösung enthielten. Platte (a) wurde einem zweiten Durchlauf herkömmlicher Silberfärbung unterzogen, in dem Versuch, den Fleck weiter zu steigern. Es fand leichte, aber sehr geringe Steigerung statt. Platte (b) wurde den Bedingungen für die Gold-Sandwich-Verstärkung unterzogen. Dies beinhaltete das In-Kontakt-Bringen der Platte, die die schwachen Silberflecken enthielt, für 10 Minuten mit der Lösung des Nanopartikel-Konjugats I, gefolgt vom Waschen mit Wasser und herkömmlicher Silberfärbung für 4 Minuten. Die Dunkelheit der Flecken in Platte (b) gegenüber denen der Platte (a) zeigt deutlich die Stärke des neuen Metallsandwich- oder Signalverstärkungsverfahrens.
  • 3 illustriert die Ergebnisse für einen Versuch unter Benutzung von Nanopartikel-Oligonukleotid-Komplex (III). Platte (a) zeigt das Signal an, das von einer Probe unter Benutzung der herkömmlichen Silberfärbung gewonnen wurde. Platte (b) zeigt die Steigerung, die mit der Gold-Sandwich-Technologie erzielbar ist. Es wird darauf hingewiesen, dass jeweils zwei Probenflecken dargestellt sind. Für Platte (b) wurde eine Platte, die einen schwachen Silberflecken enthielt, der dem in Platte (a) entsprach, einer Lösung mit Nanopartikel-Oligonukleotid-Komplex (III) ausgesetzt und nach dem Waschen herkömmlicher Silberfärbung unterzogen. In diesem Falle wurden drei Teile von Kolloid (III), das wie oben beschrieben zubereitet wurde, mit sieben Teilen 10-mM-Phosphatpuffer mit pH-Wert 7,0 gemischt. Die Platte wurde dieser Lösung 10 Minuten lang ausgesetzt, mit nanoreinem Wasser gewaschen und wie zuvor für 4 Minuten der Silberfärbungsslösung ausgesetzt.
  • 4 illustriert die Ergebnisse für einen Versuch unter Benutzung von Gold-Nanopartikel-Oligonukleotid I, um das schwache Silbersignal zu steigern, das aus einem Assay eines Targetoligonukleotids mit 63 Nukleotiden
    Figure 00170001
    mit einer Konzentration von 25 fM resultierte. Es wird darauf hingewiesen, dass unser Standardassay unter Benutzung nur von Silberfärbung einen sehr schwachen Fleck (Platte (a)) ergibt. Platte (a) zeigt die Ergebnisse herkömmlicher Silberfärbung für einen Test, in dem eine Lösung mit einer Konzentration von 25 fM des Targetoligonukleotids benutzt wurde. Platte (b) zeigt die Ergebnisse für denselben Test, in dem der anfänglichen Silberfärbung ein 10-minütiges In-Kontakt-Bringen mit der kolloidalen Lösung des Nanopartikel-Konjugats I folgte, gefolgt von Silberfärbung. In diesem Fall war die Goldlösung sechsfach mit einem 0,1-M-NaCl-10-M-Phosphatpuffer verdünnt worden. Es wird auf das starke Signal für einen Target hingewiesen, eingefangen bei einer Konzentration von 25 fM, nach dem Metallsandwich-Verstärkungsverfahren.
  • 5 illustriert die Ergebnisse für einen Versuch unter Benutzung von Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugat I zur Steigerung des Silbersignals, das von einem Assay gewonnen wurde, welches mit einem 63-mer-Target [siehe SEQ ID-Nr.: 3] bei einer Konzentration von 1 fM durchgeführt wurde. In diesem Fall zeigte unser Standardverfahren zur Silberfärbung gar keinen Fleck. Doppelte Steigerung mit der Gold-Silber-Behandlung jedoch zeigte wie dargestellt ein starkes Signal. Dieser Versuch wurde durchgeführt, indem die Platte, die mit dem Standverfahren einer Silberverstärkung unterzogen wurde, nacheinander wie folgt behandelt wurde: (1) Gold-Nanopartikel-Konjugat I (1,5 nM an Goldpartikeln in 0,1-M-NaCl und 10-mM-Phosphatpuffer mit pH-Wert 7,0) für 10 Minuten; (2) Waschen mit 1-M-NaNO3; (3) Behandeln mit einer Mischung aus SilverEnhancer-Lösung (Katalog-Nr. 5020 und S 5145, Sigma Corporation, nach Sigma-Protokoll; (4) Waschen mit 1-M-Natriumnitrat; (5) Wiederholung der Schritte 1–4; (6) Waschen mit Natriumthiosulfat und (7) Waschen mit Wasser.

Claims (28)

  1. Verfahren zum Verstärken eines Signals, umfassend: (a) das Bereitstellen eines Substrates, das abgeschiedenes Silber aufweist, (b) das In-Berührung-Bringen des Substrates, das abgeschiedenes Silber aufweist, mit einer Lösung, die Nanopartikel enthält, an die Oligonukleotide gebunden sind, um so einen Nanopartikel-Silber-Sandwich herzustellen, (c) das Waschen des Substrates, das den Sandwich aufweist, (d) das In-Berührung-Bringen des Substrates, das den Sandwich aufweist, mit Silber-Ionen und einem Reduktionsagens, um Silberabscheidung auf den Nanopartikeln des Sandwiches zu fördern, und (e) das Waschen des Substrates, das den Silber-Nanopartikel-Silber-Sandwich aufweist.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nanopartikel Gold, Silber, Platin oder Mischungen davon umfassen.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Nanopartikel Gold-Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate oder -Komplexe umfassen.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Silber-Ion aus einem Silbersalz gewonnen wird, das Silberacetat, Silberlactat oder Silbernitrat umfasst.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Reduktionsagens Hydroquinon, N-Propylgalat, P-Phenylendiamin oder Formaldehyd umfasst.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das In-Berührung-Bringen nach Schritt (b) für eine Dauer zwischen etwa 5 und 30 Minuten durchgeführt wird.
  7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei das In-Berührung-Bringen nach Schritt (b) für eine Dauer von etwa 10 Minuten durchgeführt wird.
  8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das In-Berührung-Bringen nach Schritt (d) für eine Dauer zwischen etwa 5 und 10 Minuten durchgeführt wird.
  9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei das In-Berührung-Bringen nach Schritt (d) für eine Dauer von etwa 5 Minuten durchgeführt wird.
  10. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das abgeschiedene Silber, das an das Substrat gebunden ist, in der Form eines Arrays angeordnet ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Waschen nach Schritt (c) mit Wasser durchgeführt wird.
  12. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Substrat Glas ist.
  13. Verfahren zur Förderung der Silberabscheidung auf eine Oberfläche, die Silber enthält, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) das Bereitstellen einer Oberfläche mit daran gebundenem Silber, (b) das In-Berührung-Bringen der Oberfläche mit einer Lösung, die Nanopartikel enthält, an die Oligonukleotide gebunden sind, um so eine Oberfläche mit Nanopartikel-Silber-Sandwich herzustellen, (c) das Waschen der Oberfläche, die den Nanopartikel-Silber-Sandwich aufweist, (d) das In-Berührung-Bringen der Oberfläche, die den Nanopartikel-Silber-Sandwich aufweist, mit einer Lösung, die Silber-Ionen enthält, unter Reduktionsbedingungen, um Silberabscheidung auf die Nanopartikel des Nanopartikel-Silber-Sandwiches zu fördern, und (e) das Waschen der Oberfläche aus Schritt (d), wobei die Oberfläche abgeschiedenes Silber aufweist.
  14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Oberfläche Zellen oder Gewebe umfasst.
  15. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Nanopartikel Gold, Silber, Platin oder Mischungen davon umfassen.
  16. Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Nanopartikel Gold-Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate oder -Komplexe umfassen.
  17. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Silber-Ion aus einem Silbersalz gewonnen wird, das Silberacetat, Silberlactat oder Silbernitrat umfasst.
  18. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Reduktionsagens Hydroquinon, N-Propylgalat, P-Phenylendiamin oder Formaldehyd umfasst.
  19. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das In-Berührung-Bringen nach Schritt (b) für eine Dauer zwischen etwa 5 und 30 Minuten durchgeführt wird.
  20. Verfahren nach Anspruch 19, wobei das In-Berührung-Bringen nach Schritt (b) für eine Dauer von etwa 10 Minuten durchgeführt wird.
  21. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das In-Berührung-Bringen nach Schritt (b) für eine Dauer zwischen etwa 5 und 10 Minuten durchgeführt wird.
  22. Verfahren nach Anspruch 21, wobei das In-Berührung-Bringen nach Schritt (d) für eine Dauer von etwa 5 Minuten durchgeführt wird.
  23. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das abgeschiedene Silber, das an die Oberfläche gebunden ist, in der Form eines Arrays angeordnet ist.
  24. Set zur Signalverstärkung, umfassend: (a) Behälter mit Nanopartikeln, an die Oligonukleotide gebunden sind, (b) Behälter mit Silbersalz und (c) Behälter mit einem Reduktionsagens.
  25. Set nach Anspruch 24, wobei die Nanopartikel Gold, Silber, Platin oder Mischungen davon umfassen.
  26. Set nach Anspruch 25, wobei die Nanopartikel Gold-Nanopartikel-Oligonukleotid-Konjugate oder -Komplexe umfassen.
  27. Set nach Anspruch 25, wobei das Silbersalz Silberacetat, Silberlactat oder Silbernitrat umfasst.
  28. Set nach Anspruch 25, wobei das Reduktionsagens Hydroquinon, N-Propylgalat, P-Phenylendiamin oder Formaldehyd umfasst.
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