DE60122286T2

DE60122286T2 - Steigerung der zirkulierenden halbwertzeit von auf antikörpern basierenden fusionsproteinen

Info

Publication number: DE60122286T2
Application number: DE60122286T
Authority: DE
Inventors: D. Stephen Carlisle GILLIES; Christa Burger; Ming Kin Lexington LO
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2000-02-11
Filing date: 2001-02-09
Publication date: 2007-08-02
Anticipated expiration: 2021-02-10
Also published as: US7091321B2; JP5572665B2; CA2399832A1; HUP0204475A2; MXPA02007733A; ES2269366T3; WO2001058957A3; AU4314801A; US20060034836A1; US20090264627A1; ATE336514T1; DK1252192T3; JP2012176969A; US20020147311A1; EP1252192B1; JP5179689B2; WO2001058957A2; NO20023774D0; DE60122286D1; CN1406249A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Fusionsproteine. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zur Erhöhung der Halbwertszeit im Blutkreislauf von Fusionsproteinen auf Antikörper-Basis.
Hintergrund der Erfindung
Die Verwendung von Antikörpern bei der Behandlung von humanen Erkrankungen hat sich bewährt und wurde mit der Einführung der Gentechnologie technisch ausgereifter. Es wurden verschiedene Techniken entwickelt, um die Nützlichkeit der Antikörper zu verbessern. Diese umfassen: (1) die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern durch Zellverschmelzung, um „Hybridomas" zu erzeugen, oder durch molekulares Klonen der schweren (H) und leichten (L) Antikörperketten aus Antikörper-produzierenden Zellen; (2) die Konjugation von anderen Molekülen an Antikörpern, um sie in vivo an bevorzugte Stellen zu liefern, z. B. Radioisotope, toxische Wirkstoffe, Proteintoxine und Cytokine; (3) die Manipulation von Antikörpereffektorfunktionen, um die biologische Aktivität zu verstärken oder zu vermindern; (4) die Verbindung von anderen Proteinen wie Toxinen oder Cytokinen mit Antikörpern auf dem genetischen Niveau, um Fusionsproteine auf Antikörper-Basis zu produzieren; und (5) die Verbindung von einer oder mehreren Reihen von Antikörper-kombinierenden Bereichen auf genetischem Niveau, um bispezifische Antikörper herzustellen.
Proteine können miteinander durch entweder chemische oder genetische Manipulation unter Verwendung von Verfahren nach dem Stand der Technik verbunden werden. Siehe zum Beispiel, Gillies et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 1428–1432 (1992); und U.S. Patent Nr. 5 650 150.
Die Nützlichkeit von rekombinant hergestellten Fusionsproteinen auf Antikörper-Basis kann jedoch durch ihre rasche Clearance in vivo aus dem Blutkreislauf begrenzt sein. Bei Antikörper-Cytokin-Fusionsproteinen wurde, zum Beispiel, nachgewiesen, dass sie eine deutlich geringere in-vivo-Halbwertszeit im Blutkreislauf aufweisen als der freie Antikörper. Bei der Untersuchung einer Vielzahl von Antikörper-Cytokin-Fusionsproteinen, berichteten Gillies et al., dass alle untersuchten Fusionsproteine eine α-Phasen-(Verteilungsphasen)-Halbwertszeit von weniger als 1,5 Stunden aufwiesen. Tatsächlich wurde eine Clearance der meisten Fusionsproteinen auf Antikörper-Basis auf 10% der Serumkonzentration des freien Antikörpers nach zwei Stunden erreicht. Siehe, Gillies et al., BIOCONJ. CHEM. 4: 230–235 (1993). Erst kürzlich wurde gezeigt, dass Fusionsproteinen auf Antikörper-Basis mit verminderter Bindungsaffinität für einen Fc-Rezeptor erhöhte Halbwertszeiten im Blutkreislauf haben. Es wurde auch gezeigt, dass eine verminderte Bindungsaffinität für den Fc-Rezeptor einige der Antikörpereffektorfunktionen wie antikörpervermittelte zelluläre Cytotoxizität (ADCC) beeinträchtigte, aber andere Funktionen wie Komplementfixierung oder Antigenbindung nicht beeinträchtigte. Siehe Gillies et al., Cancer Res. 59 (9): 2159–66 (1999).
In einigen Fällen, wie der Behandlung von Krebs oder viralen Erkrankungen, wäre es wünschenswert, die Antikörpereffektorfunktionen und eine lange Halbwertszeit im Blutkreislauf aufrechtzuerhalten. Daher besteht auf dem Fachgebiet Bedarf an zusätzlichen Verfahren zur Erhöhung der in-vivo-Halbwertszeit im Blutkreislauf von Fusionsproteinen auf Antikörper-Basis.
Zusammenfassung der Erfindung
Immunglobulin-G-(IgG)-Moleküle wechselwirken mit einer Vielzahl an Klassen von zellulären Rezeptoren, einschließlich der drei Klassen Fcγ-Rezeptoren (FcγR), die für die IgG-Antikörperklasse spezifisch sind, nämlich FcγRI, FcγRII und FcγRIII. Sie wechselwirken auch mit der FcRp-Klasse von Rezeptoren auf eine pH-abhängige Weise mit geringer oder keiner Bindung bei neutralem pH-Wert, aber starker Bindung bei einem pH-Wert von 6,0.
Die Halbwertszeit eines Antikörpers im Serum wird durch die Fähigkeit dieses Antikörpers beeinflusst, an einen Fc-Rezeptor (FcR) und an den Fc-Schutzrezeptor (FcRp) zu binden. Die Halbwertszeit der Immunglobulin-Fusionsproteine im Serum wird auch, zum Beispiel, durch Fähigkeit beeinflusst, derartige Rezeptoren zu binden (Gillies et al., Cancer Res. 59: 2159–66 (1999)).
Die Erfindung beschreibt die überraschende Beobachtung, dass innerhalb von Fusionsproteinen, die eine Immunglobulin-(Ig)-Einheit und eine Nicht-Immunglobulin-(Nicht-Ig)-Einheit enthalten, Veränderungen der Aminosäuren nahe der Verbindung der beiden Einheiten die Halbwertszeit des Fusionsproteins im Serum dramatisch erhöhen. Die Beobachtung ist überraschend, da sich die Aminosäureveränderungen auf Proteinoberflächen auswirken, die sich von den Wechselwirkungsoberflächen des Fc-Bereichs mit den Fc-Rezeptoren und mit dem Fc-Schutzrezeptor unterscheiden. Zusätzlich haben die erfindungsgemäßen Aminosäureveränderungen ihre Wirkung sogar dann, wenn der bekannte Fc-Rezeptor und Fc-Schutzrezeptor die Halbwertszeit des Fusionsproteins im Serum nicht vorwiegend bestimmen. So können die erfindungsgemäßen Aminosäureveränderungen mit Aminosäureveränderungen kombiniert werden, die sich auf die Wechselwirkung mit Fc-Rezeptor und/oder Fc-Schutzrezeptor auswirken, um synergistische Wirkungen zu erzielen.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Immunglobulin enthaltende Fusionsproteine bereit, in denen die Halbwertszeit im Serum als Ergebnis von Veränderungen verbessert wird, die sich an Stellen befinden, die sich von der Wechselwirkungsoberfläche des Fc-Bereich mit Fc-Rezeptor und Fc-Schutzrezeptor (FcRp) unterscheiden. Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen zwischen einer Immunglobulineinheit und einem zweiten Nicht-Immunglobulinprotein mit einer verbesserten Halbwertszeit im Serum bereit.
Die Veränderungen in der Aminosäuresequenz des Fusionsproteins befinden sich vorzugsweise an der Verbindung der Ig-Einheit und der Nicht-Ig-Einheit. Der Verbindungsbereich des Fusionsproteins enthält Veränderungen, die, relativ zu den natürlich vorkommenden Sequenzen der schweren Ig-Kette und des Nicht-Ig-Proteins, vorzugsweise innerhalb von 10 Aminosäuren des Verbindungspunktes liegen. Mehr bevorzugt verursachen die Aminosäureveränderungen eine Steigerung der Hydrophobie. Noch mehr bevorzugt beinhalten Aminosäureveränderungen den Austausch von C-terminalem Lysin der Antikörpereinheit durch eine hydrophobe Aminosäure wie Alanin oder Leucin. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das erfindungsgemäße Fusionsprotein eine schwere Ig-Kette, vorzugsweise am N-Terminus eines zweiten Nicht-Ig-Proteins lokalisiert.
In einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Bindungsaffinität der Fusionsproteine für FcRp durch Veränderungen der Wechselwirkungsoberfläche der Fc-Einheit, die mit FcRp in Kontakt steht, optimiert. Es wurde berichtet, dass die wichtigen Sequenzen für die Bindung von IgG an den FcRp-Rezeptor in den CH2- und CH3-Domänen lokalisiert sind. Gemäß der Erfindung werden Veränderungen der Fusionsverbindung in einem Fusionsprotein mit Veränderungen der Fc-Wechselwirkungsoberfläche mit FcRp kombiniert, um eine synergistische Wirkung zu produzieren. In einigen Fällen kann es nützlich sein, die Wechselwirkung der Fc-Einheit mit FcRp bei pH 6 zu verstärken, und es kann auch nützlich sein, die Wechselwirkung der Fc-Einheit mit FcRp bei pH 8 zu vermindern. Derartige Modifizierungen umfassen Veränderungen von Resten, die für einen Kontakt mit Fc-Rezeptoren notwendig sind, oder die Veränderung von anderen, die sich auf Kontakte zwischen anderen Resten von schweren Ketten und dem FcRp-Rezeptor durch induzierte Konformationsänderungen auswirken. So wird in einer bevorzugten Ausführungsform ein Fusionsprotein auf Antikörper-Basis mit verstärkter in-vivo-Halbwertszeit im Blutkreislauf erhalten, indem zunächst die kodierenden Sequenzen eines konstanten Ig-Bereichs und eines zweiten, Nicht-Immunglobulin-Proteins verknüpft werden und dann eine Mutation (wie eine Punktmutation, eine Deletion, eine Insertion oder eine genetische Umlagerung) in einem konstanten Ig-Bereich an oder nahe einer oder mehrerer Aminosäure eingeführt wird, ausgewählt aus He 253, His 310 und His 435. Die resultierenden Fusionsproteine auf Antikörper-Basis haben eine längere in-vivo-Halbwertszeit im Blutkreislauf als die unmodifizierten Fusionsproteine.
Unter bestimmten Umständen ist es nützlich, bestimmte Effektorfunktionen der Fc-Einheit zu mutieren. Zum Beispiel können Komplementfixierungen beseitigt werden. Alternativ, oder zusätzlich, hat in einer anderen Reihe von Ausführungsformen der Ig-Bestandteil des Fusionsproteins mindestens einen Teil des konstanten Bereichs eines IgG, das eine verminderte Bindungsaffinität für mindestens einen aus FcyRI, FcyRII oder FcyRIII hat. Zum Beispiel kann die gamma4-Kette von IgG anstelle von gamma1 verwendet werden. Die Veränderung hat den Vorteil, dass die gamma4-Kette in einer längeren Halbwertszeit im Serum resultiert, was synergistisch mit einer oder mehreren Mutationen an der Fusionsverbindung arbeitet. Demzufolge kann IgG2 auch anstelle von IgG1 verwendet werden. In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung umfasst ein Fusionsprotein einen mutierten konstanten IgG1-Bereich, zum Beispiel einen konstanten IgG1-Bereich mit einer oder mehreren Mutationen oder Deletionen von Leu₂₃₄, Leu₂₃₅, Gly₂₃₆, Gly₂₃₇, Asn₂₉₇ oder Pro₃₃₁. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst ein Fusionsprotein einen mutierten konstanten IgG3-Bereich, zum Beispiel einen konstanten IgG3-Bereich mit einer oder mehreren Mutationen oder Deletionen von Leu₂₈₁, Leu₂₈₂, Gly₂₈₃, Gly₂₈₄, Asn₃₄₄ oder Pro₃₇₈. Für einige Anwendungen kann es jedoch nützlich sein, die Effektorfunktion, die mit der Fc-Rezeptorbindung einhergeht, wie ADCC, zu bewahren.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die zweite, Nicht-Immunglobulineinheit des Fusionsproteins ein Cytokin. Der Begriff „Cytokin" wird hier verwendet, um natürlich vorkommende oder rekombinante Proteine, Analoga davon und Fragmente davon zu beschreiben, die eine spezifische biologische Antwort in einer Zelle hervorruft, die einen Rezeptor für dieses Cytokin hat. Vorzugsweise sind Cytokine Proteine, die von einer Zelle produziert und exkretiert werden können. Cytokine umfassen vorzugsweise Interleukine wie Interleukin-2 (IL-2), IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-10, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16 und IL-18, hämatopoetische Faktoren wie Granulocyten-Makrophagen-Koloniestimulationsfaktor (GM-CSF), Granulozyten-Koloniestimulationsfaktor (G-CSF) und Erythropoetin, Tumornekrosefaktoren (TNF) wie TNFα, Lymphokine wie Lymphotoxin, Regulatoren der metabolischen Prozesse wie Leptin, Interferone wie Interferon-α, Interferon-β und Interferon-γ, und Chemokine. Vorzugsweise zeigt das Antikörper-Cytokin-Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung biologische Aktivität des Cytokins.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform ist die zweite, Nicht-Immunglobulineinheit des Fusionsproteins ein ligandenbindendes Protein mit biologischer Aktivität. Derartige ligandenbindende Proteine können, zum Beispiel, (1) Rezeptor-Liganden-Wechselwirkungen an der Zelloberfläche blockieren, oder (2) die biologische Aktivität eines Moleküls (z. B. eines Cytokins) in der fluiden Phase des Bluts neutralisieren und es so daran hindern, sein zelluläres Ziel zu erreichen. Vorzugsweise umfassen ligandenbindende Proteine CD4-, CTLA-4-, TNF-Rezeptoren oder Interleukinrezeptoren wie die IL-1- und IL-4-Rezeptoren. Vorzugsweise zeigt das erfindungsgemäße Antikörper-Rezeptor-Fusionsprotein die biologische Aktivität des ligandenbindenden Proteins.
In noch einer weiteren alternativen bevorzugten Ausführungsform ist die zweite, Nicht-Immunglobulineinheit des Fusionsproteins ein Proteintoxin. Vorzugsweise zeigt das erfindungsgemäße Antikörper-Toxin-Fusionsprotein die toxische Aktivität des Proteintoxins.
In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die zweite, Nicht-Immunglobulineinheit des Fusionsproteins ein Hormon, Neurotrophin, Körpergewichtsregulator, Serumprotein, Gerinnungsfaktor, Protease, Bestandteil der extrazellulären Matrix, Angiogenesefaktor, Antiangiogenesefaktor oder ein anderes sezerniertes Protein oder sezernierte Domäne. Zum Beispiel CD26, IgE-Rezeptor, polymerer IgA-Rezeptor, andere Antikörper-Rezeptoren, Faktor VIII, Faktor IX, Faktor X, TrkA, PSA, PSMA, Flt-3-Ligand, Endostatin, Angiostatin und Domänen dieser Proteine.
In noch anderen Ausführungsformen ist die zweite, Nicht-Immunglobulineinheit ein nicht-humanes oder Nicht-Säuger-Protein. Zum Beispiel sind HIV gp120, HIV Tat, Oberflächenproteine von anderen Viren wie Adenovirus und RSV, andere HIV-Bestandteile, parasitische Oberflächenproteine wie Malaria-Antigene und bakterielle Oberflächenproteine bevorzugt. Diese nicht-humanen Proteine können, zum Beispiel, als Antigene verwendet werden, oder weil sie nützliche Aktivitäten haben. Zum Beispiel kann die zweite, Nicht-Immunglobulineinheit Streptokinase, Staphylokinase, Urokinase, Gewebe-Plasminogenaktivator oder andere Proteine mit nützlichen enzymatischen Aktivitäten sein.
Gemäß der Erfindung kann die Nicht-Immunglobulineinheit ein Teil eines Proteins sein. Vorzugsweise ist die Nicht-Ig-Proteineinheit ein Proteinteil, der im Wesentlichen die funktionellen und/oder strukturellen Eigenschaften eines intakten Proteins bewahrt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nicht-Ig-Proteineinheit ein funktioneller oder struktureller Teil eines hier beschriebenen Proteins.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthält das Fusionsprotein auf Antikörper-Basis einen variablen Bereich, der für ein Zielantigen spezifisch ist, sowie einen konstanten Bereich, wobei jeder von ihnen durch eine Peptidbindung an ein zweites, Nicht-Immunglobulinprotein gebunden ist. Der konstante Bereich kann der konstante Bereich sein, der normalerweise mit dem variablen Bereich verbunden ist, oder ein anderer, z. B. variable und konstante Bereiche von unterschiedlichen Spezies. Die schwere Kette kann jegliche Kombination von einer oder mehreren CH1-, CH2- oder CH3-Domänen umfassen. Vorzugsweise umfasst die schwere Kette CH1-, CH2- und CH3-Domänen und mehr bevorzugt nur CH2- und CH3-Domänen. In einer Ausführungsform enthält ein Fusionsprotein auf Antikörper-Basis einen Fv-Bereich mit fusionierten variablen Bereichen von schwerer und leichter Kette. Auch im Begriff „Fusionsprotein" enthalten, sind Konstrukte mit einer Bindungsdomäne, die Gerüstbereiche und variable Bereiche (d.h. komplementätsbestimmende Bereiche) von verschiedenen Spezies enthalten, wie sie bei Winter, et al., Great Britain Patent Nr. 2 188 638 beschrieben werden. Fusionsproteine auf Antikörper-Basis die einen variablen Bereich enthalten, zeigen vorzugsweise eine Antigenbindungsspezifizität. In noch einer anderen bevorzugten Ausführungsform enthält das Fusionsprotein auf Antikörper-Basis weiterhin eine leichte Kette. Die Erfindung stellt so Fusionsproteine bereit, in denen die Antigenbindungsspezifizität und Aktivität eines Antikörpers mit der potenten biologischen Aktivität eines zweiten, Nicht-Immunglobulinproteins wie einem Cytokin kombiniert sind. Ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein kann verwendet werden, um das zweite, Nicht-Immunglobulinprotein selektiv zu einer Zielzelle in vivo zu liefern, so dass das zweite, Nicht-Immunglobulinprotein eine lokalisierte biologische Wirkung ausüben kann.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform enthält das Fusionsprotein auf Antikörper-Basis einen konstanten Bereich der schweren Kette, der durch eine Peptidbindung mit einem zweiten, Nicht-Immunglobulinprotein verknüpft ist, aber keinen variablen Bereich der schweren Kette enthält. Die Erfindung stellt so weiterhin Fusionsproteine bereit, welche die potente biologische Aktivität eines zweiten, Nicht-Immunglobulinproteins bewahrt, aber welchen die Antigenbindungsspezifizität und Aktivität eines Antikörpers fehlen.
In bevorzugten Ausführungsformen enthält das Fusionsprotein zwei chimäre Ketten, die mindestens einen Teil einer schweren Kette und ein zweites, Nicht-Ig-Protein enthalten, die durch eine Disulfidbindung verknüpft sind.
In bevorzugten Ausführungsformen sind die erfindungsgemäßen Fusionsproteine nützlich, um Krebs, virale Infektionen, Immunstörungen zu behandeln und das Wachstum (einschließlich Proliferation) von spezifischen Zelltypen zu verstärken.
Die Erfindung weist auch DNA-Konstrukte auf, die die oben beschriebenen Fusionsproteine kodieren, und Zelllinien, z. B. Myelome, die mit diesen Konstrukten transfiziert wurden.
Diese und andere Gegenstände, zusammen mit Vorteilen und Merkmalen dieser hier beschriebenen Erfindung, werden durch die folgende Beschreibung, Abbildungen und Ansprüche offensichtlicher gemacht werden.
Kurze Beschreibung der Abbildungen
1 zeigt das pharmakokinetische Verhalten des KS-IL-2-Fusionsproteins und verschiedener mutierter Fusionsproteine, die Substitutionen der C-terminalen Lysineinheit der schweren Antikörperkette oder andere in den Beispielen beschriebene Veränderungen enthalten. Antikörper- oder Fusionsproteinspiegel wurden durch ein ELISA gemessen, das auf IL-2 (1A) oder Human-Fc (1B) testet.
2 zeigt die pharmakokinetischen Eigenschaften der KS-IL-2-Fusionsproteine, die entweder die gamma1- oder gamma4-Kette mit entweder dem Wildtyp-Lysin oder der Lysin-durch-Alanin-Mutation am C-Terminus der schweren Antikörperkette tragen. Antikörper- oder Fusionsproteinspiegel wurden durch ein ELISA gemessen, das auf die IL-2-Einheit testet.
3 zeigt die pharmakokinetischen Eigenschaften der Fusionen von einem humanen Antikörper an Tumornekrosefaktor alpha (TNFalpha). Fusionsproteinspiegel wurden durch ein ELISA gemessen, das auf den Human-Fc-Bereich testet. Gezeigt werden Spiegel eines intakten Antikörper-TNFalpha-Fusionsproteins (schwarze Diamanten) und die Spiegel von einem ansonsten identischen Fusionsprotein, in welchem das C-terminale Lysin der Antikörpereinheit deletiert wurde (graue Quadrate).
4 zeigt die Bindung von Antikörper-IL-2-Fusionsprotein an Membranen von fixierten J774-Zellen, die reich an der FcγR-Klasse von Rezeptoren sind. Gezeigt sind die Bindung eines nicht-mutierten KS-IL-12-Fusionsproteins (schwarze Diamanten) und eines KS-IL-12-Fusionsproteins, das eine Mutation des C-terminalen Lysins der schweren Kette zu Alanin trägt (graue Quadrate).
5 zeigt die Wirkung der Behandlung mit Antikörper-Cytokin-Fusionsprotein von Balb/C-Mäusen, die subkutane, von CT26-Kolonkarzinomzellen abstammende Tumore tragen, die gentechnisch so hergestellt wurden, dass sie Human-EpCAM exprimieren, das Antigen für KS.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt Antikörper-Fusionsproteine bereit, die eine oder mehrere Mutationen an der Verbindung zwischen den Ig- und Nicht-Ig-Einheiten haben, was die Halbwertszeiten der Fusionsproteine im Blutkreislauf erhöht. Die mutierten erfindungsgemäßen Fusionsproteine haben die vorteilhafte Eigenschaft, dass ihre Halbwertszeit im Serum verbessert ist, ohne das die Wechselwirkung der Antikörpereinheit mit jedem der beiden bekannten Pharmakokinetik-bestimmenden Rezeptoren im Körper beeinträchtig wird: Fc-Rezeptor und FcRp.
Im Allgemeinen enthält ein erfindungsgemäßes Fusionsprotein auf Antikörper-Basis einen Teil eines Immunglobulin-(Ig)-Proteins, das mit einem Nicht-Immunglobulin-(Nicht-Ig)-Protein verbunden ist, so dass die Aminosäuresequenz des Bereichs, der die Verbindung zwischen Ig- und Nicht-Ig-Protein umspannt, mindestens eine Mutation im Vergleich zu den Wildtyp-Aminosäuresequenzen der Ig- und Nicht-Ig-Proteine aufweist.
In einer Ausführungsform ist mindestens eine Mutation im C-terminalen Bereich des Ig-Teils. In einer anderen Ausführungsform ist mindestens eine Mutation im N-terminalen Bereich des Nicht-Ig-Proteins. In einer weiteren Ausführungsform enthält das Fusionsprotein mindestens eine Mutation im C-terminalen Bereich des Ig-Teils und mindestens eine Mutation im N-terminalen Bereich des Nicht-Ig-Proteins. Eine Mutation kann eine Punktmutation, eine Insertion, eine Deletion oder eine Gen-Umlagerung sein. In bevorzugten Ausführungsformen verstärkt die Mutation die Hydrophobie des Verbindungsbereichs. Zum Beispiel ersetzt die Mutation eine geladene oder ionisierbare Aminosäure durch eine nicht geladene oder hydrophobe Aminosäure (z. B., ein Lys, Arg oder anderer ionisierbarer Rest wird durch ein Ala, Leu, Gly, Trp oder anderen nicht geladenen oder hydrophoben Rest ersetzt).
In einer optionalen Ausführungsform wird ein Spacer- oder Linker-Peptid zwischen die Ig- und Nicht-Ig-Proteine eingeführt. Das Spacer- oder Linker-Peptid ist vorzugsweise nicht geladen, mehr bevorzugt unpolar und/oder hydrophob. Die Länge eines Spacer- oder Linker-Peptids beträgt vorzugsweise zwischen 1 und etwa 100 Aminosäuren, mehr bevorzugt zwischen 1 und etwa 50 Aminosäuren oder zwischen 1 und etwa 25 Aminosäuren, und noch mehr bevorzugt zwischen 1 und etwa 15 Aminosäuren. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die Ig- und Nicht-Ig-Einheiten des Fusionsproteins über ein Spacer- oder Linker-Peptid verbunden und es gibt mindestens eine Mutation in entweder einer oder beiden der Ig- und Nicht-Ig-Einheiten. In einer alternativen Ausführungsform der Erfindung werden die Ig- und Nicht-Ig-Einheiten durch einen synthetischen Spacer, zum Beispiel einem PNA-Spacer getrennt, der vorzugsweise nicht geladen, mehr bevorzugt unpolar und/oder hydrophob ist.
Gemäß der Erfindung ist eine Immunglobulin-(Ig)-Kette ein Immunglobulinprotein oder ein Teil eines Immunglobulinproteins, dass eine variable oder eine konstante Domäne umfasst. Eine Ig-Kette ist vorzugsweise ein Teil einer schweren Immunglobulinkette, zum Beispiel ein variabler Bereich des Immunglobulins, der einen vorher ausgewählten Zelltyp binden kann. In einer bevorzugten Ausführungsform enthält die Ig-Kette einen variablen Bereich, der für ein Zielantigen spezifisch ist, sowie einen konstanten Bereich. Der konstante Bereich kann der konstante Bereich sein, der normalerweise mit dem variablen Bereich verbunden ist, oder ein anderer, z. B. variable und konstante Bereiche von unterschiedlichen Spezies. In einer mehr bevorzugten Ausführungsform umfasst eine Ig-Kette eine schwere Kette. Die schwere Kette kann jegliche Kombination von einer oder mehreren CH1-, CH2- oder CH3-Domänen umfassen. Vorzugsweise umfasst die schwere Kette CH1-, CH2- und CH3-Domänen, und mehr bevorzugt nur CH2- und CH3-Domänen. In einer Ausführungsform umfasst der Teil des Immunglobulins einen Fv-Bereich mit fusionierten variablen Bereichen von schwerer und leichter Kette.
Gemäß der Erfindung umfasst ein Nicht-Immunglobulinprotein ein natürlich vorkommendes Protein, dass kein Immunglobulin ist, oder ein synthetisches oder rekombinantes Protein, dass kein Immunglobulin ist, oder ein Fragment von irgendeinem oben genannten. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein Nicht-Immunglobulinprotein eine funktionelle Domäne wie eine ligandenbindende Domäne, eine enzymatische Domäne, eine regulatorische Domäne oder eine Domäne, die mit einem oder mehreren Zellfaktoren wechselwirkt. In einer alternativen Ausführungsform enthält eine Nicht-Immunglobulindomäne eine strukturelle Domäne oder ein Epitop.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Ig-Kette über eine Genfusion mit dem Nicht-Ig-Protein verbunden. Vorzugsweise ist die Genfusion synthetisch oder rekombinant und wird unter Verwendung von Standardtechniken der chemischen Synthese oder Molekularbiologie erzeugt. Typischerweise wird eine Mutation als Teil des Genfusionskonstrukts eingeführt. Alternativ kann eine Mutation nachfolgend eingeführt werden, unter Verwendung von bekannten Verfahren der Mutagenese (zum Beispiel indem das Genfusionskonstrukt einer Strahlung ausgesetzt wird, oder durch chemische oder biologische Mutagenese).
Gemäß der Erfindung ist ein Verbindungsbereich der Bereich des Fusionsproteins, der den Verbindungspunkt zwischen den Ig- und Nicht-Ig-Einheiten des Fusionsproteins umgibt. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der Verbindungsbereich den C-terminalen Teil der Ig-Einheit und den N-terminalen Teil der Nicht-Ig-Einheit. In einer Ausführungsform enthält der Verbindungsbereich auch ein Spacer- oder Linker-Peptid, das am Verbindungspunkt zwischen den Ig- und Nicht-Ig-Einheiten eingeführt wurde.
Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung befindet sich eine Mutation in der Ig-Einheit im C-terminalen Teil der Ig-Einheit, vorzugsweise innerhalb von etwa 100 Resten, mehr bevorzugt innerhalb von etwa 50 Resten oder etwa 25 Resten, und noch mehr bevorzugt innerhalb etwa 10 Resten vom C-Terminus der Ig-Einheit.
Gemäß den bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung befindet sich eine Mutation in der Nicht-Ig-Einheit im N-terminalen Teil der Nicht-Ig-Einheit, vorzugsweise innerhalb von etwa 100 Resten, mehr bevorzugt innerhalb von etwa 50 Resten oder etwa 25 Resten, und noch mehr bevorzugt innerhalb etwa 10 Resten vom N-Terminus der Nicht-Ig-Einheit.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung befindet sich eine Mutation im C-terminalen Bereich der Ig-Einheit, aber die Mutation befindet sich nicht im Teil des Ig-Proteins, das mit dem Fc-Rezeptor (FcR) oder FcRp wechselwirkt.
Ein Antikörper-Fusionsprotein mit einer erfindungsgemäßen Mutation hat eine erhöhte in-vivo-Halbwertszeit im Blutkreislauf verglichen mit der Halbwertszeit im Blutkreislauf der entsprechenden Antikörper-Fusionsproteine ohne die Mutation. Die Halbwertszeit im Blutkreislauf eines Antikörper-Fusionsproteins kann gemessen werden, indem der Serumspiegel des Fusionsproteins als Funktion der Zeit bestimmt wird.
Experimentelle Hinweise deuten darauf hin, dass die Wirkungen von bevorzugten erfindungsgemäßen Mutationen nicht von Wechselwirkungen mit FcR oder FcRp abhängen. Erstens wirken sich bevorzugte Mutationen, die die Halbwertszeit eines Fusionsproteins im Blutkreislauf erhöhen, nicht auf Bereiche des Antikörpers auf, die in der dreidimensionalen Struktur Teil der Wechselwirkungsoberfläche sind, die an FcR oder an FcRp bindet. Zweitens können erfindungsgemäße, bevorzugte Mutationen ein Verbesserung der Halbwertszeit im Serum verursachen, auch wenn die Wechselwirkung mit FcR durch die Verwendung einer IG-gamma4-Kette entfernt wurde und die Wechselwirkung mit FcRp durch Ausführung der Pharmakokinetikuntersuchung in einer beta2-Mikroglobulin-mutierten Maus, in der FcRp fehlt, entfernt wurde. Drittens wirken sich bevorzugte, erfindungsgemäße Mutationen nicht signifikant auf die Bindung der Ig-Fusionsproteine an FcR auf J774-Zellen aus.
Ortsgerichtete Mutagenese-Analysen deuten darauf hin, dass die Oberfläche von Fc, die mit dem Fc-Rezeptor wechselwirkt, sich nahe der Gelenk-Region auf der CH2-Domäne befindet. Die FcR-Wechselwirkungsoberfläche des Fc-Bereichs ist, in drei Dimensionen, sehr weit vom C-Terminus des Fc entfernt. Gleichartige Analysen deuten darauf hin, dass FcRp mit Aminosäureresten wechselwirkt, die an der Grenzfläche zwischen den CH2- und CH3-Domänen lokalisiert sind.
FcRp bindet seinen Liganden mit einer viel höheren Affinität bei saurem pH-Wert (pH 6,0) als bei neutralem oder leicht basischem pH-Wert (pH 7,4). Dies stimmt mit der Rolle des FcRp beim Schutz von Fc-enthaltenden Molekülen wie Antikörpern, gefolgt von ihrer zellulären Internalisierung innerhalb der Endosomen überein. Diese zellulären Kompartimente werden nach Fusion mit Lysosomen angesäuert und ihre Proteinbestandteile werden durch saure Proteasen abgebaut. Die Bindung an membrangebundenen FcRp während dieses Prozesses verhindert den Abbau des Antikörpers und ermöglicht sein Recycling nach außerhalb der Zelle (zurück in den Blutkreislauf) oder durch eine Zellschicht (ein Transzytose genannter Prozess). Dieser letztgenannte Prozess ermöglicht IgG das Passieren durch die neonatale, intestinale Mukosa, das auf die Verdauung von Milch in der sauren Umgebung des Darms folgt.
Die Struktur des Fc/FcRp-Komplexes deutet darauf hin, dass FcRp an die Seite des Fc-Bereichs bindet, mit Kontakten sowohl in der CH2- wie auch der CH3-Domäne, und dass sich der in Kontakt gebrachte Bereich nicht besonders nah beim C-Terminus des Fc- Bereichs befindet. So sind von Veränderung genau dieses C-terminalen Bereichs des Fc keine Veränderungen der Wechselwirkung mit FcRp zu erwarten.
Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass Mutationen in dem Fusionsverbindungsbereich, die die Halbwertszeit im Blutkreislauf eines erfindungsgemäßen Fusionsproteins erhöhen, auch die Spaltung des Fusionsproteins in einem Proteasespaltungs-Assay vermindert, wie in Beispiel 15 dargestellt. Es wird weiterhin angenommen, dass Proteaseverdauung zum Verschwinden von intakten Proteinen aus dem Körper, einschließlich Fusionsproteinen, beitragen kann. So kann die Widerstandsfähigkeit gegenüber Proteasen direkt zur Verbessung der Pharmakokinetik von Proteinen beitragen. Es wird weiterhin angenommen, dass Proteaseverdauung von nichtdenaturierten Proteinen den Zugang durch eine Protease zu einer exponierten Sequenz in der richtigen Konformation, sowie die Erkennung einer spezifischen Sequenz von Aminosäuren umfasst. So können Mutationen in der Fusionsverbindung, die sich auf die allgemeine Konformation eines Proteins auswirken und sich so auf die Zugänglichkeit von Proteasen zu ihren Spaltstellen auswirken, zur Widerstandsfähigkeit gegenüber Protease und zu verbesserter Pharmakokinetik beitragen. Zusätzlich können Mutationen, die spezifische Protease-Erkennungssequenzen verändern, zur Widerstandsfähigkeit gegenüber Proteasen und zu verbesserter Pharmakokinetik beitragen.
Ein Merkmal der erfindungsgemäßen Mutationen ist, dass sie mit anderen Mutationen oder Substitutionen in der Antikörpereinheit kombiniert werden können, um Halbwertszeit im Serum oder andere Eigenschaften der Ig-Einheit synergistisch anzupassen. Zum Beispiel können eine oder mehrere erfindungsgemäße Mutationen, die die Halbwertszeit von Antikörper-Fusionsproteinen im Blutkreislauf erhöhen, mit einer oder mehreren Mutationen kombiniert werden, die sich auf die Wechselwirkung zwischen dem Antikörper-Fusionsprotein und FcR oder FcRp auswirken.
Zusätzlich können die erfindungsgemäßen Mutationen mit einer breiten Vielzahl an Antikörpereinheiten und mit einer breiten Vielzahl an Nicht-Ig-Fusionspartnern verwendet werden. Die Immunglobuline umfassen IgG, IgM, IgA, IgD und IgE. Die Nicht-Ig-Fusions partner umfassen Cytokine, andere sezernierte Proteine, Enzyme oder lösliche Fragmente von Transmembran-Rezeptoren wie ligandenbindende Domänen.
Gemäß der Erfindung kann ein Fusionsprotein auf Antikörper-Basis mit einer erhöhten in-vivo-Halbwertszeit im Blutkreislauf durch Modifizieren innerhalb des Fc-Teils selbst weiter erhöht werden. Diese können Reste sein, einschließlich oder benachbart zu Ile 253, His 310 oder His 435, oder andere Reste, die die ionischen Umgebungen dieser Reste beeinflussen können, wenn das Protein in seine 3-dimensionale Struktur gefaltet wird. Die resultierenden Proteine können auf ihre optimale Bindung bei pH 6 und bei pH 7,4–8 getestet werden, und die mit hohen Bindungsniveaus bei pH 6 und geringer Bindung bei pH 8 werden für in-vivo-Verwendung selektiert. Derartige Mutationen können nutzbringend mit den erfindungsgemäßen Verbindungsmutationen kombiniert werden.
Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung sind nützlich, wenn sie mit Angiogeneseinhibitoren wie solchen in PCT/US99/08335 (WO 99/52562) beschriebenen, oder Prostaglandininhibitoren wie solchen in PCT/US99/08376 (WO 99/53958) beschriebenen, gemeinsam verabreicht werden. Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung können auch in multiplen Cytokin-Protein-Komplexen wie solchen in PCT/US00/21715 beschriebenen verwendet werden. Verfahren und Zusammensetzungen der Erfindung sind auch in Kombination mit anderen, in PCT/US99/03966 (WO 99/43713) beschriebenen Mutationen nützlich, die die Halbwertszeit eines Fusionsproteins im Blutkreislauf erhöhen.
Nichteinschränkende Verfahren zur Synthese von nützlichen Ausführungsformen der Erfindung, sowie Assays, die für eine Untersuchung der pharmakokinetischen Aktivitäten, sowohl in vitro als auch in vorklinischen in-vivo-Tiermodellen nützlich sind, werden in den Beispielen hierin beschrieben. Das bevorzugte Genkonstrukt, das eine chimäre Kette kodiert, umfasst, in 5'- nach 3'-Orientierung, ein DNA-Segment, das mindestens einen Teil eines Immunglobulins kodiert, und DNA, die ein zweites, Nicht-Immunglobulinprotein kodiert. Ein alternatives Genkonstrukt umfasst, in 5'- nach 3'-Orientierung, ein DNA-Segment, das ein zweites, Nicht-Immunglobulinprotein kodiert, und DNA, die mindestens einen Teil eines Immunglobulins kodiert. Das fusionierte Gen wird zusammengesetzt in einem oder eingeführt in einen Expressionsvektor für die Transfektion in die geeigneten Aufnahmezellen, wo es exprimiert wird.
Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Identifizierung von Mutationen bereit, die die Halbwertszeit eines Fusionsproteins auf Antikörper-Basis im Blutkreislauf erhöhen. Die Verfahren enthalten die Einführung einer oder mehrerer Mutationen in einem Bereich, der die Verbindung zwischen der Ig-Einheit und der Nicht-Ig-Einheit eines Fusionsproteins auf Antikörper-Basis umspannt. Die Halbwertszeit des mutierten Fusionsproteins im Blutkreislauf wird untersucht, vorzugsweise durch Überwachung seines Serumspiegels in vivo als eine Funktion der Zeit.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform ist eine Mutation, die die Halbwertszeit eines Fusionsproteins auf Antikörper-Basis im Blutkreislauf erhöht, eine Mutation, die Spaltung des Fusionsproteins in einem Proteasespaltungs-Assay vermindert, wie in Beispiel 15 diskutiert. Die Mutation ist vorzugsweise eine Mutation in einem Bereich, der die Verbindung zwischen der Ig-Einheit und der Nicht-Ig-Einheit des Fusionsproteins (zum Beispiel eine Mutation im oben diskutierten Verbindungsbereich) umspannt. Alternativ kann die Mutation jegliche Mutation in dem Fusionsprotein sein, die Proteasespaltung vermindert und die Halbwertszeit des Fusionsproteins im Blutkreislauf erhöht, wie in Beispiel 16 beschrieben. Demzufolge stellt die Erfindung Verfahren zum Screenen von Mutationen in Proteinen im Allgemeinen und vorzugsweise in einem Ig-Cytokin-Fusionsprotein bereit, um Mutationen zu identifizieren, die die Halbwertszeit des Fusionsproteins im Blutkreislauf erhöhen.
Die Erfindung wird weiter durch die folgenden nichteinschränkenden Beispiele erläutert. Die hier verwendeten Aminosäurerestnummern beziehen sich auf die IgG1-Aminosäuresequenz. Ein durchschnittlicher Fachmann wird verstehen, dass entsprechende Mutationen in Fusionsproteinen, an denen andere Ig-Proteine beteiligt sind, für eine Erhöhung ihrer Halbwertszeit im Blutkreislauf nützlich sind.
Demzufolge sind die hier präsentierten Lehren auf andere Ig-Moleküle wie IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgM, IgD oder IgE anwendbar.
Beispiele
Beispiel 1. Konstruktion von Antikörper-IL-2-Genen mit Substitutionen des Lys-Codons an der Fusionsverbindung
Die Aminosäuresequenz an der Verbindung des Antiköper-IL-2-Fusionsproteins lautet SerProGlyLys-AlaProThr (SEQ ID Nr. 1), in welcher das SerProGlyLys (SEQ ID Nr. 2) der normale Carboxy-Terminus der schweren Kette des Antikörpers und AlaProThr die N-terminale Sequenz des reifen IL-2 ist. Um die Wirkungsveränderungen im Bereich der Fusionsverbindung auf die Pharmakokinetik des Fusionsproteins zu bestimmen, wurden mittels Mutagenese, wie unten beschrieben, Substitutionen oder Deletionen des Restes durchgeführt.
Der Expressionsvektor für Immuncytokine wurde in Gillies et al., (1998) J. Immunol. 160: 6195–6203 beschrieben. In dem Human-gamma-1-Gen, das die schwere Kette kodiert, wurde die 280 bp stromaufwärts des Translationsstoppcodons lokalisierte XmaI-Restriktionsstelle durch Einführung einer stillen Mutation zerstört (TCC zu TCA). Eine andere stille Mutation (TCT zu TCC) wurde zu dem Ser-Codon drei Reste stromaufwärts des C-terminalen Lysins der schweren Kette eingeführt, um die Sequenz TCC CCG GGT AAA (SEQ ID Nr. 3) zu schaffen, die eine neue XmaI-Stelle enthält [Lo et al., (1998) Protein Engineering 11: 495–500]. Die IL-2-cDNA wurde durch chemische Synthese konstruiert, und sie enthält eine neue und einzigartige PvuII-Restriktionsstelle [Gillies et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. 89: 1428–1432]. Sowohl die XmaI wie auch die PvuII-Stellen sind in dem Expressionsvektor einzigartig und sie erleichtern Mutagenese des Lysincodons, der an der Verbindung der CH3- und der IL-2-DNA liegt.
Substitution oder Deletion des Lys-Codons wurde durch Austausch des XmaI-PvuII-Fragments in dem Immuncytokin-Expressionsvektor durch einen Oligonucleotiddoppelstrang erreicht, der die gewünschte Mutation kodiert. In diesem Fall wurden die variablen Bereiche der schweren und leichten Ketten vom humanisierten KS-Antikörper abgeleitet, der ein Human-EpCAM (Epitheliales Zelladhäsionsmolekül) genanntes Antigen erkannte. Die Sequenzen der in der vorliegenden Erfindung verwendeten Oligonucleotiddoppelstränge sind unten aufgelistet, wobei die Codons in Fett die gewünschten Mutationen kodieren, und die Sequenzen in kursiv, CCCGG and CAG das kohäsive Ende der XmaI-Stelle bzw. das stumpfe Ende der PvuII-Stelle sind. Der Oligonucleotiddoppelstrang mit 5'-Hydroxylenden wurde bei der Ligation an den XmaI-PvuII-verdauten Expressionsvektor verwendet. Die Verwendung von Oligonucleotiden mit 5'-Hydroxylenden beseitigte die Selbstligation des Oligonucleotiddoppelstrangs.
1.} Lys-durch-Ala-Substitution
2.} Lys-durch-Arg-Substitution
Eine NarI-Restriktionsstelle (GGCGCC) wurde ebenfalls durch stille Mutation eingeführt, um Screening der rekombinanten Klone zu erleichtern.
3.} Deletion von Lys
4.) Lys-durch-Gly-Substitution
Eine ApaI-Restriktionsstelle (GGGCCC) wurde ebenfalls durch stille Mutation eingeführt, um Screening der rekombinanten Klone zu erleichtern.
5.) Lys-durch-Leu-Substitution
Eine NarI-Restriktionsstelle (GGCGCC) wurde ebenfalls durch stille Mutation eingeführt, um Screening der rekombinanten Klone zu erleichtern.
6.) Lys-zu-AlaAlaAla-Substitution
7.) Lys-durch-Cys-Substitution
Eine FspI-Restriktionsstelle (TGCGCA) wurde ebenfalls durch stille Mutation eingeführt, um Screening der rekombinanten Klone zu erleichtern.
8.) Lys-durch-Asp-Substitution
Die rekombinanten Genkonstrukte, die die verschiedenen Substitutionen oder Deletion des Lys-Codon enthalten, wurden mittels DNA-Sequenzierung bestätigt.
Beispiel 2. Konstruktion der Antikörper-IL-2-Gene, die Extraaminosäurereste an der Fusionsverbindung kodieren
Im Fachgebiet ist es üblich, Domänen in Fusionsproteinen mit flexiblen Linkern zu trennen, die Aminosäurereste wie Glycin und Serin enthalten. Die Bedeutung, die CH3 und IL-2 auf Abstand zu bringen, wurde in den folgenden Mutageneseexperimenten untersucht. Stumpfendige Oligonucleotiddoppelstränge, die unterschiedliche Anzahlen an Aminosäureresten kodieren, wurden durch Ligation in die SmaI-Endonuclease-Restriktionsstelle (gleiche Erkennungsstelle wie das oben erwähnte XmaI) des huKS-IL-2-Expressionsvektors eingeführt, und die richtige Orientierung der Insertion wurde mittels DNA-Sequenzierung bestätigt. Wie oben diskutiert, wurden Oligonucleotiddoppelstränge mit 5'-Hydroxylenden verwendet, um Selbstligation zu beseitigen.
9.) Lys-durch-Cvs-Substitution mit Linkerligation
Der folgenden Linker (Oligonucleotiddoppelstrang) wurde in die SmaI-Endonuclease-Restriktionsstelle des huKS-IL-2-Expressionsvektors mittels Ligation insertiert. Die Sequenz GCATGC kodiert eine SphI-Restriktionsstelle, die Screening der die Linkerinsertion enthaltenden Rekombinanten erleichtert.
Nach Linkerligation in die SmaI-Stelle (CCCGGG) wurde die Sequenz an der Fusionsverbindung zu
Daher setzt der Linker einen Cys-Rest an die Originalposition des Lys-Restes, für eine mögliche interkettige Disulfidbindungsbildung Der originale Lys-Rest wurde um 3 Aminosäurereste nach hinten verschoben (AlaCysGly).
10.) Ein 6 Aminosäurereste kodierender Linker
Der folgenden Linker (Oligonucleotiddoppelstrang) wurde in die SmaI-Endonuclease-Restriktionsstelle des huKS-IL-2-Expressionsvektors mittels Ligation insertiert. Die Sequenz GGATCC kodiert eine BamHI-Restriktionsstelle, die Screening der die Linkerinsertion enthaltenden Rekombinanten erleichtert.
Nach Linkerligation in die SmaI-Stelle, wurde die Sequenz an der Fusionsverbindung zu ProGlySerGlySerGlyGlyGlyLvs (SEQ ID Nr. 24), wobei die sechs insertierten Aminosäurereste unterstrichen sind.
11.) Ein 11 Aminosäurereste kodierender Linker
Der folgenden Linker (Oligonucleotiddoppelstrang) wurde in die SmaI-Endonuclease-Restriktionsstelle des huKS-IL-2-Expressionsvektors mittels Ligation insertiert. Die Sequenz GGATCC kodiert eine BamHI-Restriktionsstelle, die Screening der die Linkerinsertion enthaltenden Rekombinanten erleichtert.
Nach Linkerligation in die SmaI-Stelle, wurde die Sequenz an der Fusionsverbindung zu ProGlySerGlySerGlySerGlySerGlySerGlyGlyLys (SEQ ID Nr. 27), wobei die elf insertierten Aminosäurereste unterstrichen sind.
Beispiel 3. Konstruktion von Antikörper-IL-2-Genen mit Substitutionen des Pro-Codons an der Fusionsverbindung
Das Prolin in der Sequenz ProGlyLys am Carboxyl-Terminus von CH3 wird zu Ala, Leu oder Gly oder anderen Aminosäuren mutiert. Dies wird erreicht, indem ein 25-Basenpaar-SapI-SmaI-Fragment des KS-IL-2-Expressionsvektors durch einen Oligonucleotiddoppelstrang ersetzt wird, der die gewünschte Veränderung kodiert. Jede der folgenden Oligonucleotiddoppelstränge hat ein SapI-kohäsives Ende (3-Basenüberhang) und ein stumpfes Ende (für Ligation an das SmaI-Ende des Restriktionsfragments). Die Substitutionen am Pro-Codon sind in Fett wiedergegeben. Diese Substitutionen haben keine signifikante Wirkung auf die Pharmakokinetik des Fusionsproteins, was darauf hindeutet, dass die strukturellen Eigenschaften des Pro-Restes keine signifikante Wirkung auf die Pharmakokinetik des Fusionsproteins haben.
12.) Pro-durch-Ala-Substitution
13.) Pro-durch-Leu-Substitution
14.) Pro-durch-Gly-Substitution
Beispiel 4. Konstruktion von hu14.18-(Lys-durch-Ala)-IL-2-DNA
Um zu zeigen, dass die Wirkung der Lys-durch-Ala-Substitution auf die Pharmakokinetik des Antikörper-Il-2-Fusionsproteins nicht auf huKS-Antikörper beschränkt ist, wählten wir einen anderen Antikörper, humanisiertes 14.18 (hu14.18), der GD2 erkannte, ein auf der Oberfläche vieler humaner Tumorzellen überexprimiertes Gangliosid. Der Expressionsvektor für hu14.18-(Lys-durch-Ala)-IL-2 wurde wie oben beschrieben konstruiert.
Beispiel 5. Konstruktion von huKS-(deletiertes Lys)-TNFα-DNA
Um zu zeigen, dass die Wirkung des Lys-Restes auf die Pharmakokinetik des Antikörper-IL-2-Fusionsproteins auf andere Cytokine anwendbar war, wählten wir ein anderes Cytokin, TNFα. Die vollständige cDNA-Sequenz von TNFα wurde von Nedwin et al. in Nucleic Acids Res. (1985) 13: 6361–6373 publiziert, und die Expression eines Antikörper-TNFα wurde auch von Gillies et al. in Bioconjugate Chem. (1993) 4: 230–235 beschrieben. Die Fusionsverbindung des Antikörper-TNFα hat die Sequenz SerProGlyLys-ValArgSerSerSer (SEQ ID Nr. 34), wobei Val der N-terminale Rest des reifen TNFα ist. Um mit huKS-TNFα zu vergleichen, wurde huKS-(deletierte Lys)-TNFα kodierende DNA durch ein Überlappungs-PCR-Verfahren [Daugherty et al., (1991) Nucleic Acids Res. 19: 2471–2476] mit mutagenen Primern konstruiert, die die Deletion des Lys-Restes kodieren. Der resultierende Expressionsvektor für huKS-(deletierte Lys)-TNFα kodiert daher die Peptidsequenz SerProGly-ValArgSerSerSer (SEQ ID Nr. 35) an der Fusionsverbindung. Zusätzliche Modifizierungen dieses Fusionsproteins gemäß der neuen Erfindung können die Entfernung des Arg-Restes in der Amino-terminalen Sequenz von TNF umfassen, um die Gesamtladung des Verbindungsbereichs weiter zu vermindern.
Beispiel 6. Konstruktion von huKS (EU)-(Lys-durch-Ala)-IL-2-DNA
Alle in den obigen Beispielen erwähnten Antikörper-Cytokin-Fusionsproteine basierten auf einem bestimmten Allotyp des humanen IgG1, dargestellt durch die Myeloma-H-Kette, KOL. Um zu zeigen, dass die Wirkung der Lys-durch-Ala-Substitution auf die Pharmakokinetik des Antikörper-IL-2-Fusionsproteins nicht auf KOL beschränkt war, wählten wir einen anderen IgG1-Allotyp, der durch die Myeloma-H-Kette EU dargestellt wurde. Der EU-Allotyp unterscheidet sich vom KOL-Allotyp in drei Aminosäureresten in den konstanten Bereichen. Der EU-Allotyp enthält Lys-229 am Ende von CH1 und Asp-356 und Leu-358 am Anfang von CH3. Der KOL-Allotyp enthält Arg-229, Glu-356 und Met-358 an den entsprechenden Positionen. Die den EU-Allotyp kodierende DNA wurde durch Mutagenese der KOL-DNA unter Verwendung von Überlappungs-PCR-Verfahren erhalten. Die resultierende EU-DNA wurde dann verwendet, um das entsprechende Fragment der KOL-DNA zu ersetzen, um den Expressionsvektor zur Produktion von huKS-(EU)-(Lys-durch-Ala)-IL-2 zu erzeugen.
Beispiel 7. Transfektion von Zellen und Expression von Proteinen
Für eine transiente Transfektion wurde das Plasmid in Baby-Hamster-Nieren-(BHK)-Zellen durch Lipofektion unter Verwendung von Lipofectamine Plus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) gemäß dem Protokoll des Lieferanten eingeführt.
Um stabil transfizierte Klone zu erhalten, wurde die Plasmid-DNA in die Maus-Myelom-NS/0-Zellen mittels Elektroporation eingeführt. Die NS/0-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagles Medium, ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum, 2 mM Glutamin und Penicillin/Streptomycin, gezüchtet. Es wurden etwa 5 × 10⁶ Zellen einmal mit PBS gewaschen und in 0,5 ml PBS resuspendiert. Zehn μg linearisierter Plasmid-DNA wurden dann mit den Zellen in einer Gene Pulser Küvette (0,4 cm Elektrodenlücke, BioRad) auf Eis für 10 min inkubiert. Elektroporation wurde unter Verwendung eines Gene Pulser (BioRad, Hercules, CA) mit Einstellungen bei 0,25 V und 500 μF ausgeführt. Die Zellen durften sich 10 min auf Eis erholen, dann wurden sie im Wachstumsmedium resuspendiert und auf zwei 96-Well-Platten ausplattiert. Stabil transfizierte Klone wurden durch Wachstum in Gegenwart von 100 nM Methotrexat (MTX) selektiert, das zwei Tage nach der Transfektion eingeführt wurde. Die Zellen wurden alle 3 Tage zwei oder drei weitere Male gefüttert und die MTX-resistenten Klone erschienen nach 2 bis 3 Wochen. Überstände von Klonen wurden durch anti-Fc-ELISA untersucht, um hoch Produzierende zu identifizieren. Hoch produzierende Klone wurden isoliert und in 100 nM MTX enthaltendem Wachstumsmedium vermehrt.
Für Routinecharakterisierung durch Gelelektrophorese wurden Antikörper-Cytokin-Fusionsproteine in den konditionierten Medien auf Protein A Sepharose (Repligen, Cambridge, MA) gefangen und dann durch Kochen in dem Proteinprobenpuffer mit oder ohne 2-Mercaptoethanol eluiert. Nach Elektrophorese auf einem SDS-Gel wurden die Proteinbanden mittels Coomassie-Färbung sichtbar gemacht. Die schwere IL-2-Antikörperkette und die leichte Kette hatten ein scheinbares MW von etwa 67 bzw. 28 kD auf SDS-PAGE. Zur Reinigung wurden die auf Protein A Sepharose gebundenen Fusionsproteine in einen Natriumphosphatpuffer (100 mM NaH₂PO₄, pH 3, und 150 mM NaCl) eluiert. Das Eluat wurde dann sofort mit 0,1 N NaOH neutralisiert.
Beispiel 8. ELISA-Verfahren
ELISAs wurden zur Bestimmung der Konzentrationen an Proteinprodukten in den Überständen der MTX-resistenten Klone und anderen Testproben verwendet. Das anti-huFc-ELISA besteht aus einem Einfangschritt unter Verwendung von Ziegen-Anti-Human-IgG (sowohl gegen schwere wie auch leichte Ketten) und einem Detektionsschritt unter Verwendung von an Meerrettichperoxidase konjugiertem F(ab')₂-Fragment des Ziegen-Anti-Human-IgG, Fc-Fragment-spezifisch. Daher misst das anti-huFc-ELISA Human-IgG entweder als Antikörper für sich oder als ein Cytokin-Fusionsprotein. Um die Konzentration des intakten Antikörper-IL-2-Fusionsproteins zu bestimmen, wurde ein IL-2-Detektions-ELISA verwendet. Es besteht aus dem gleichen Einfangschritt unter Verwendung von Ziegen-Anti-Human-IgG (sowohl gegen schwere wie auch leichte Ketten), aber der Detektionsschritt verwendet einen Detektionsantikörper, der gegen IL-2 gerichtet ist. In einigen Experimenten wurde EPCAM anstelle eines Einfangantikörpers verwendet, um KS-IL-2-Fusionsproteine zu detektieren, da der KS-Antikörper EPCAM erkennt. In einigen Experimenten wurde ein kommerzielles Human-IL-2-ELISA-Detektionskit verwendet (R&D Systems). All die verschiedenen, IL-2-Detektionsantikörper umfassenden ELISA-Verfahren ergaben gleichartige Ergebnisse. Wie jedoch aus einem Vergleich der 1A und 1B ersichtlich ist, gibt es einen fortschreitenden Verlust an immunreaktivem IL-2-Material verglichen mit immunreaktivem Human-Fc-Material bei späteren pharmakokinetischen Zeitpunkten. Diese Wirkung ist für Fusionsproteine ausgeprägter, die die schlechtesten pharmakokinetischen Eigenschaften haben.
Das anti-huFc-ELISA wird unten im Detail beschrieben.
A. Beschichtung der Platten.
ELISA-Platten wurden mit AffiniPure Ziegen-Anti-Human-IgG (H + L) (Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA) bei 5 μg/ml in PBS and 100 μl/Well in 96-Well-Platten (Nunc-Immuno plate Maxisorp) beschichtet. Beschichtete Platten wurden bedeckt und bei 4°C über Nacht inkubiert. Platten wurden dann 4-mal mit 0,05% Tween (Tween 20) in PBS gewaschen und mit 1% BSA/1% Ziegenserum in PBS, 200 μl/Well blockiert.
Nach Inkubation mit dem Blockierungspuffer bei 37°C für 2 Std. wurden die Platten 4-mal mit 0,05% Tween in PBS gewaschen und auf Papiertüchern trocken geklopft.
B. Inkubation mit Testproben und sekundärem Antikörper
Testproben wurden auf die richtigen Konzentrationen in Probenpuffer verdünnt, der 1% BSA/1% Ziegenserum/0,05% Tween in PBS enthielt. Es wurde eine Standardkurve mit einem chimären Antikörper (mit einem Human-Fc) hergestellt, dessen Konzentration bekannt war. Um eine Standardkurve herzustellen, wurden Reihenverdünnungen im Probenpuffer gemacht, um eine Standardkurve im Bereich von 125 ng/ml bis 3,9 ng/ml zu ergeben. Die verdünnten Proben und Standards wurden zu der Platte gegeben, 100 μl/Well, und die Platte wurde bei 37°C für 2 Std. inkubiert. Nach Inkubation wurde die Platte 8-mal mit 0,05% Tween in PBS gewaschen. Zu jedem Well wurden dann 100 μl des sekundären Antikörpers, das mit Meerrettichperoxidase konjugierte AffiniPure F(ab')₂-Fragment Ziegen-Anti-Human-IgG, Fc-Fragment-spezifisch (Jackson Immuno Research), gegeben, verdünnt auf etwa 1:120.000 in dem Probenpuffer. Die genaue Verdünnung des sekundären Antikörpers muss für jede Charge des HRP-konjugierten Anti-Human-IgG bestimmt werden. Nach Inkubation bei 37°C für 2 Std. wurde die Platte 8-mal mit 0,05% Tween in PBS gewaschen.
C. Entwicklung
Die Substratlösung wurde zu der Platte mit 100 μl/Well gegeben. Die Substratlösung wurde hergestellt durch Lösen von 30 mg OPD (o-Phenylendiamin-Dihydrochlorid, 1 Tablette) in 15 ml 0,025 M Zitronensäure/0,05 M Na₂HPO₄-Puffer, pH 5, der 0,03% frisch zugegebenes H₂O₂ enthielt. Die Farbe durfte sich 30 min bei Raumtemperatur im Dunkeln entwickeln. Die Entwicklungszeit unterliegt Veränderungen, in Abhängigkeit von der Charge-zu-Charge-Variabilität der beschichteten Platten, des sekundären Antikörpers, usw. Beobachten Sie die Farbentwicklung in der Standardkurve, um zu bestimmen, wann die Reaktion zu stoppen ist. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 4 N H₂SO₄, 100 μl/Well gestoppt. Die Platte wurde durch einen Plattenleser ausgelesen, der sowohl auf 490 wie auch auf 650 nm eingestellt und darauf programmiert war, die Hintergrund-OD bei 650 nm von der OD bei 490 nm zu subtrahieren.
Beispiel 9. Pharmakokinetisches Verhalten der Antikörper-Cytokin-Fusionsproteine, die an der Fusionsverbindung Veränderungen tragen.
Die Fusionsproteine wurden nach intravenöser Injektion in Balb/c-Mäuse auf ihr pharmakokinetisches Verhalten getestet. Blut wurde von den Mäusen durch retro-orbitalen Aderlass gesammelt und bei 4°C in Eppendorf-Mikrozentrifugenröhrchen gelagert. In einigen Fällen wurden zwei unterschiedliche ELISA-Verfahren verwendet, um sowohl die Menge an Human-Antikörper als auch die Menge an zweitem, fusioniertem Nicht-Ig-Protein im Blut zu verschiedenen Zeitpunkten zu messen. Alternativ wurde die Gegenwart der Nicht-Ig-Einheit durch Western-Blot-Analyse der pharmakokinetischen Zeitpunkte abgeleitet.
Unter Verwendung der in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Techniken, wurden Mäusen die KS(gamma1)-IL-2-fusionsmutierten Proteine injiziert und die Wirkung auf die Halbwertszeit im Serum wurde bestimmt. Einige der Ergebnisse sind in 1 und 2 dargestellt. Zusätzlich wurde die Wirkung der Deletion des C-terminalen Lysins der schweren Antikörperkette in einer IgG(gamma1)-IL-2-Fusion untersucht, in der der Antikörper eine unterschiedliche Bindungsspezifizität hatte. Die pharmakokinetischen Eigenschaften eines 14.18(Lys → Ala)-IL-2 waren denen von 14.18-IL-2 in einem Maße überlegen, das zu der Verbesserung von KS(Lys → Ala)-IL-2 verglichen mit KS-IL-2 gleichartig war.
Für Antikörper-IL-2-Fusionen, war die Reihenfolge der Wirkung von Mutationen, die sich auf das C-terminale Lysin der schweren Kette beziehen, auf die pharmakokinetischen Eigenschaften (vom besten zum schlechtesten): Lys → Leu ~ Lys → Ala ~ Lys → Ala₃ > Lys → (deletiert) > Lys → Asp ~ Lys → Gly > Lys → (keine Veränderung) ~ Lys → Cys > Lys → Arg.
Die pharmakokinetischen Eigenschaften von KS(Lys → deletiert)-TNFalpha waren verglichen mit KS-TNFalpha (3) signifikant verbessert. Das pharmakokinetische Profil des KS-TNFalpha-Fusionsproteins war ungewöhnlich, insofern dass, wenn die Spiegel an Human-Antikörper mittels Fc-ELISA gemessen werden, es einen scharfen Abfall im Spiegel des detektierten Proteins innerhalb der ersten 30 Minuten gab, gefolgt von einem langsamen Anwachsen des Spiegels an reaktivem Human-Fc-Material. Diese Wirkung war hoch reproduzierbar.
Wenn pharmakokinetische Proben mittels Western-Blotting analysiert wurden, wurde gefunden, dass kreuzreaktives Human-Fc-Material in der Form von intaktem Antikörper vorlag; die TNF-Einheit war abgespalten worden und ging verloren. Gleichartige Analyse des KS-TNFalpha-Fusionsproteins, das eine Deletion des C-terminalen Lysins trug, deutete jedoch darauf hin, dass dieses Protein vorwiegend in einer intakten Form überlebte, wobei TNF noch immer anwesend war.
Zusätzlich wurde ein KS-TNFalpha-Fusionsprotein exprimiert, in dem die ersten acht Aminosäuren der reifen TNFalpha-Sequenz deletiert waren. Die pharmakokinetischen Eigenschaften des deletierten KS-TNFalpha-Fusionsproteins waren entsprechenden Proteinen mit der gesamten reifen TNF-Sequenz überlegen. Dies liegt vermutlich an der Entfernung des geladenen Arg-Restes an der +2-Position des reifen TNF, was die Hydrophobie des Verbindungsbereichs erhöht.
Veränderung der konstanten Bereiche der schweren Kette von KS(Lys → Ala)-IL-2 und KS-IL-2 von KOL zu EU hatte keine Wirkung auf die pharmakokinetischen Eigenschaften von beiden Proteinen.
Zusammengenommen deuten diese Ergebnisse darauf hin, dass Mutation der Verbindung eine signifikante Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaften von Ig-Fusionsproteinen verursacht. Die Wirkung wurde mit verschiedenen Antikörpern und verschiedenen, an die Ig-Einheit fusionierten Nicht-Ig-Proteinen gesehen.
Beispiel 10. Kombination von Mutationen an der Fusionsverbindung mit Veränderung des Ig-Typs von gamma1 zu gamma4 führt zu einer synergistischen Verstärkung der Halbwertszeit im Serum, die von der FcRp-Funktion unabhängig ist.
Der Human-gamma4-Fc-Bereich bindet schlecht an Fc-Rezeptoren. Daher haben Fusionsproteine, die einen gamma4-Fc-Bereich enthalten, im Allgemeinen eine überlegene pharmakokinetische Eigenschaften verglichen mit Fusionsproteinen mit gamma1-Kette. Um darauf einzugehen, ob sich Verbindungsmutationen durch eine Wirkung auf eine Fc-Rezeptorwechselwirkung, eine FcRp-Wechselwirkung oder beide auf die Pharmakokinetik auswirken, wurden die pharmakokinetischen Eigenschaften von gamma1- und gamma4-haltigen Fusionsproteinen mit oder ohne Verbindungsmutationen in Mäusen untersucht, die bezogen auf FcRp entweder normal oder defekt waren. Die Ergebnisse dieser pharmakokinetischen Experimente sind in 2 dargestellt.
2 zeigt das pharmakokinetische Verhalten eines KS(gamma1)-IL-2-Fusionsproteins, eines KS(gamma4)-IL-2-Fusionsproteins, eines KS(gamma1)(Lys-durch-Ala)-IL-2-Fusionsproteins und eines KS(gamma4)(Lys-durch-Ala)-IL-2-Fusionsproteins. Normale Mäuse und mutierte, in beta2-Mikroglobulin defekte Mäuse wurden untersucht.
Diese Daten deuteten darauf hin, dass in einer normalen Maus die Pharmakokinetik eines IgG-gamma1-Anikörper-IL-2-Fusionsproteins durch Einführung einer Lys-durch-Ala-Mutation am C-Terminus der Antikörpereinheit verbessert wurde. Ebenso wurde die Pharmakokinetik eines IgG-gamma4-Antikörper-IL-2-Fusionsproteins durch Einführung einer Lys-durch-Ala-Mutation am C-Terminus der Antikörpereinheit verbessert. Diese Daten deuten darauf hin, dass eine Verbindungsmutation die pharmakokinetischen Eigenschaften eines Fusionsproteins, das bereits als ein Ergebnis von verminderter Fc-Rezeptorbindung verbesserte Pharmakokinetik aufweist, verbessern kann.
2 zeigt auch die pharmakokinetischen Eigenschaften der gleichen Proteine, wenn sie in mutierte Mäuse injiziert wurden, denen das beta2-Mikroglobulin-Protein fehlt, welches eine essentielle Untereinheit von FcRp ist (Junghans and Anderson, Proc. Nat Acad. Sci. (1996) 93: 5512–5516). So sind diese mutierten Mäuse in der FcRp-Aktivität defekt. Als Folge ist der Katabolismus der Antikörper in derartigen mutierten Mäusen etwa 10fach schneller als in normalen Mäusen.
Die Daten aus 2 deuteten darauf hin, dass der KS(gamma1)-Antikörper, ein KS(gamma1)-IL-2-Fusionsprotein, ein KS(gamma4)-IL-2-Fusionprotein, ein KS(gamma1) (Lys-durch-Ala)-IL-2-Fusionsprotein und ein KS(gamma4)(Lys-durch-Ala)-IL-2-Fusionsprotein alle schneller in den beta2-Mikroglobulin-mutierten Mäusen als in den Wild-typ-mäusen katabolisiert wurde. Die relative Reihenfolge der Halbwertszeiten im Serum ist jedoch für diese Proteine in beiden Mausstämmen die gleiche: der unfusionierte Antikörper zeigt das beste pharmakokinetische Verhalten, gefolgt von KS(gamma4)(Lys-durch-Ala)-IL-2-Fusionsprotein, dem KS(gamma4)(Lys-durch-Ala)-IL-2-Fusionsprotein, dem KS(gamma4)-IL-2-Fusionsprotein, wobei das KS(gamma1)-IL-2-Fusionsprotein die schlechtesten pharmakokinetischen Eigenschaften hat. Wenn eine Verbindungsmutation ihre Wirkung ausschließlich durch Veränderung der Wechselwirkung eines Fusionsproteins mit FcRp hatte, dann sollte in der Abwesenheit von FcRP-Funktion die Verbindungsmutation keine Wirkung auf die Pharmakokinetik haben.
Beispiel 11. Mutation des Verbindungsbereichs in einem intakten Antikörper hat keine Wirkung auf Halbwertszeit im Serum.
Eine Mutation in einem Gen, das die schwere Kette des intakten, nicht fusionierten KS-Antikörpers kodiert, wird gentechnisch hergestellt, um das C-terminale Lysin durch Alanin zu tauschen. Der Wildtyp und die mutierten Formen von KS werden durch die oben beschriebenen Verfahren exprimiert und gereinigt, und die pharmakokinetischen Eigenschaften werden verglichen. Die pharmakokinetischen Verhalten der Wildtyp- und mutierten Antikörper erweisen sich als nicht unterscheidbar.
Beispiel 12. Bindung an Fc-Rezeptor durch Antikörper-Fusionsproteine mit oder ohne Mutationen an der Fusionsverbindung
Unter Verwendung einer Standardprozedur wurde die Bindung von KS-IL-2 und KS(K-A)-IL-2 an Fc-Rezeptoren untersucht. Es wurde keine Wirkung der Mutation gefunden. Fusionsproteine wurden wie oben beschrieben exprimiert und gereinigt und wurden auf ihre Fähigkeit hin getestet, an fixierte J774-Zellen zu binden, die den Fc-Rezeptor exprimieren. Ergebnisse sind in 4 dargestellt.
Beispiel 13. Behandlung von Kolonkarzinom in einem Säuger mit einem eine Verbindungsmutation enthaltenden Antikörper-Cytokin-Fusionsprotein
Um zu testen, ob ein Cytokin-Antikörper-Fusionsprotein mit einer Verbindungsmutation bei der Behandlung von Kolonkarzinom in einem Säuger vorteilhaft wäre, wurden die folgenden Experimenten ausgeführt. CT26 ist eine Kolonkarzinomzelllinie, die von Balb/C-Mäusen abstammt. Durch standardmäßige Gentechnologie-Techniken wurde diese Zelllinie gentechnisch hergestellt, um das humane Epitheliale Zelladhäsionsmolekül (EpCAM) zu exprimieren, welches das vom KS-Antikörper erkannte Antigen ist; diese Zellen werden mit CT26/EpCAM-Zellen bezeichnet (Gillies et al. Journal of Immunology (1998) 160: 61950–6203).
Balb/C-Mäuse wurden subkutan mit 2 × 10⁶ CT26/EpCAM-Zellen inokuliert. Wenn Tumore ein Volumen von etwa 50–200 Kubikmillimetern erreichten, wurden die Mäuse für weitere Untersuchung in drei Gruppen von 7 Mäusen randomisiert. Beginnend am Tag 0, wurden die Tumor-tragenden Mäuse mit PBS, etwa 10 Mikrogramm KS-IL2 mit einer schweren IgG1-Kette (KS-IL2gamma1) oder etwa 10 Mikrogramm KS-IL2 mit einer schweren IgG1-Kette und der in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Lys-durch-Ala-Mutation (KS-IL2gamma1 [Lys-durch-Ala]) behandelt. Mäusen wurde einmal pro Tag für fünf Tage intravenöse Injektionen verabreicht. Tumorgrößen wurden mit Tastzirkeln gemessen.
Die Ergebnisse von einem derartigen Experiment sind in 5 dargestellt. In diesem Experiment verursachte KS-IL2gamma1 eine signifikante Abnahme des Volumens bei vielen, aber nicht bei allen Tumoren. In sechs von sieben mit KS-IL2gamma1 behandelten Tieren waren die Tumore an Tag 21 noch immer messbar. In den mit KS-IL2gamma1(Lys-durch-Ala) behandelten Tieren schrumpften die Tumore jedoch, so dass bis Tag 21 die Tumore in allen sieben Tieren nicht messbar waren und bis Tag 16 nur zwei von sieben Tieren messbare Tumore aufwiesen. In 5 geben schwarze Diamanten die durchschnittlichen Tumorvolumina in Mäusen an, denen PBS als Kontrollen an Tagen 0, 1, 2, 3 und 4 injiziert wurde. Gefüllte Kreise geben durchschnittliche Tumorvolumina in Mäusen an, die mit 10 Mikrogramm KS-IL2 gamma1 behandelt wurden. Es wurden intravenöse Injektionen ausgeführt. Die x-Achse gibt die Anzahl an vergangenen Tagen nach der ersten Injektion an; die y-Achse gibt das durchschnittliche Tumorvolumen in Kubikmillilitern an.
Beispiel 14. Inhibierung von Metastasen in einem Säuger, der mit einem Antikörper-Cytokin-Fusionsprotein, das eine Verbindungsmutation enthält, behandelt wurde.
Um zu testen, ob ein Antikörper-Cytokin-Fusionsprotein metastatisches Wachstum von Tumorzellen inhibieren könnte, wurden die folgenden Experimente ausgeführt, Lewis-Lungenkarzinom (LLC) ist eine Lungenkarzinomzelllinie, die von C57/B16-Mäusen abstammt. Durch standardmäßige Gentechnologie-Techniken wurde diese Zelllinie gentechnisch hergestellt, um das humane Epitheliale Zelladhäsionsmolekül (EpCAM) zu exprimieren, welches das vom KS-Antikörper erkannte Antigen ist; diese Zellen werden mit LLC/EpCAM-Zellen bezeichnet.
C57/B16-Mäusen wurden intravenös 1 × 10⁶ LLC/EpCAM-Zellen injiziert. Nach fünf Tagen wurden die Mäuse in drei Gruppen von 6 Mäusen randomisiert und entweder mit PBS, etwa 20 Mikrogramm KS-IL2 oder etwa 20 Mikrogramm KS-Ala-IL2 behandelt (KS-IL2 mit einem Lys-durch-Ala-Austausch am C-Terminus der Ig-Einheit). Metastasen wurden an Tag 24 quantifiziert. Wie in der unten stehenden Tabelle angegeben, hatte die mit PBS behandelte Gruppe große Anzahlen von Metastasen in den Lungen. Mit KS-γ1-IL2 behandelte Tiere hatten eine signifikant verminderte Anzahl an Metastasen. Mit KS-γ1-ala-IL2 behandelte Tiere hatten jedoch noch weniger Metastasen als mit KS-γ1-IL2 behandelte Tiere und in einem Tier wurden überhaupt keine Metastasen gefunden.
Zusammen genommen verdeutlichen Beispiele 13 und 14, dass Antikörper-Cytokin-Fusionsproteine die Etablierung von Metastasen sowie Wachstum von Tumorzellen an den Primärstellen inhibieren kann. Zusätzlich deuten die Ergebnisse darauf hin, dass Antikörper-Cytokin-Fusionsproteine Krankheit, die aus einer Vielzahl von verschiedenen Tumorarten wie Darmkrebs oder Lungenkrebs resultiert, inhibieren kann. Weiterhin sind Antikörper-Cytokin-Fusionsproteine mit mindestens einem erfindungsgemäßen Aminosäure-Austausch im Linker-Bereich effektiver bei der Inhibierung von Metastasen und Tumorwachstum als Antikörper-Cytokin-Fusionsproteine mit keinem Aminosäure-Austausch im Linker-Bereich.
Beispiel 15. Assay von Antikörper-Fusionsproteinen mit Verbindungsmutationen für Widerstandsfähigkeit gegenüber Proteasen.
Um darauf einzugehen, ob Antikörper-Cytokin-Fusionsproteine mit Verbindungsmutationen mehr oder weniger empfindlich gegenüber Proteaseverdauung waren, wurden gereinigte KS-IL2 und KS-Ala-IL2 mit verschiedenen Proteasen über verschiedene Zeiträume hinweg behandelt und die resultierenden Produkte wurden mittels SDS-PAGE analysiert.
In einem Experiment, wurden 4 Mikrogramm KS-IL2 und KS-Ala-IL2 mit 0,1 mU oder 0,4 mU Cathepsin D (Enzyme Systems, Livermore, California) bei 37°C über etwa 16 Stunden behandelt und mittels SDS-PAGE analysiert. Pufferbedingungen wurden gemäß den Angaben des Herstellers verwendet. Wenn KS-IL2 mit 0,4 mU Cathepsin D behandelt wurde, wurden etwa 50% der schweren KS-IL2-Kette in verschiedene Formen mit geringerem Molekulargewicht umgewandelt. Das hauptsächliche Verdauungsprodukt hatte ein Molekulargewicht, dass geringfügig kleiner als das der schweren KS-IL2-Kette, aber viel größer als die schwere KS-Kette war. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die meiste Spaltung durch Cathepsin D nicht an der Verbindung der schweren IL2-Kette stattfand.
Wenn im Gegensatz dazu KS-Ala-IL2 mit 0,4 mU Cathepsin D unter den gleichen Bedingungen inkubiert wurde, war das Ausmaß der Spaltung durch Cathepsin D sehr viel geringer und eine Bande mit dem Molekulargewicht des KS-IL2-Hauptabbauprodukts war im Wesentlichen nicht detektierbar.
In einem zweiten Experiment wurden 4 Mikrogramm KS-IL2 und KS-Ala-IL2 mit 25 mU oder 50 mU Cathepsin L (Enzyme Systems, Livermore, California) bei 37°C über etwa 16 Stunden behandelt und mittels SDS-PAGE analysiert. Pufferbedingungen wurden gemäß den Angaben des Herstellers verwendet. Wenn KS-IL2 mit 50 mU Cathepsin L behandelt wurde, wurde beinahe die gesamte schwere KS-IL2-Kette in verschiedene Formen mit geringerem Molekulargewicht umgewandelt. Das hauptsächliche Verdauungsprodukt hatte in etwa ein Molekulargewicht wie die schwere KS-Kette. Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass viel von der Spaltung durch Cathepsin L nahe oder an der Verbindung der schweren IL2-Kette stattfand.
Wenn im Gegensatz dazu KS-Ala-IL2 mit 50 mU Cathepsin L unter den gleichen Bedingungen inkubiert wurde, war das Ausmaß der Spaltung durch Cathepsin L sehr viel geringer und eine Bande mit dem Molekulargewicht des KS-IL2-Hauptabbauprodukts war noch immer die beobachtete Molekulargewichtshauptspezies.
In einem dritten Experiment wurden 4 Mikrogramm KS-IL2 und KS-Ala-EL2 mit 0,04 mU, 0,1 mU oder 0,2 mU Plasmin (Sigma, St. Louis, Minnesota) bei 37°C über etwa 16 Stunden behandelt und mittels SDS-PAGE analysiert. Pufferbedingungen wurden gemäß den Angaben des Herstellers verwendet. Wenn KS-IL2 mit 0,04 mU Plasmin behandelt wurde, wurden etwa 3/4 der schweren KS-IL2-Kette in Formen mit geringerem Molekulargewicht mit einem scheinbaren Molekulargewicht um etwa 30 Aminosäuren größer als das der schweren KS-Kette umgewandelt. Wenn KS-IL2 mit 0,2 mU Plasmin behandelt wurde, wurde im Wesentlichen die gesamte schwere KS-IL2-Kette in Formen mit geringerem Molekulargewicht mit einem scheinbaren Molekulargewicht um etwa 30 Aminosäuren größer als das der schweren KS-Kette umgewandelt. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Spaltung von KS-IL2 durch Plasmin in der Nähe von, aber nicht an der Verbindung der schweren IL2-Kette stattgefunden hat.
Wurde im Gegensatz dazu KS-Ala-IL2 mit 0,04 mU Plasmin unter den gleichen Bedingungen inkubiert, war das Ausmaß der Spaltung durch Plasmin kaum detektierbar. Wurde KS-Ala-IL2 mit 0,2 mU Plasmin inkubiert, wurde ein wenig ungespaltenes Produkt detektiert. Wurde KS-Ala-IL2 mit Plasmin gespalten, akkumulierte außerdem in einem signifikanten Ausmaß eine Spezies mit einer Molekulargröße um etwa 90 Aminosäuren größer als die schwere KS-IL2-Kette; bei den KS-IL2-Verdauungen durch Plasmin wurde diese +90-Spezies vermutlich schnell zur der +30-Spezies mit geringerem Molekulargewicht gespalten und konnte daher nicht akkumuliert werden. Dennoch verursachte die Lys-durch-Ala-Mutation eine signifikante Stabilisierung von intakter KS-IL2 in der Gegenwart von Plasmin. In jedem Fall war die leichte Antikörperkette unter den verwendeten Bedingungen ungespalten.
Zusammen genommen, deuteten diese Ergebnisse darauf hin, dass die Lys-durch-Ala-Mutation eine allgemeine Widerstandsfähigkeit gegenüber Proteasespaltung verursachte, sogar bei Spaltungen, die nicht an der Mutationsstelle stattfinden. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden sein zu wollen, könnte die Lys-durch-Ala-Mutation die IL-2-Einheit von KS dazu gebracht haben, resistenter gegenüber Proteasen zu werden. Proteasen können eine wichtige Rolle bei den pharmakokinetischen Eigenschaften von Antikörper-Fusionsproteinen spielen. Zum Beispiel wenn Antikörper-Fusionsproteine von Zellen aufgenommen werden, die einen Fc-Rezeptor tragen, und in das frühe Endosom transportiert werden, kann es sein, dass die Antikörpereinheit gegenüber den verwendeten proteolytischen Bedingungen resistent ist, aber dass die Fusionspartnereinheit empfindlicher ist, was in einer teilweisen oder vollständigen Verdauung des Antikörper-Fusionsproteins resultiert.
Beispiel 16. Verwendung von Proteaseverdauung zur Evaluierung von Mutationen in Antikörper-Fusionsproteinen.
Dieses Beispiel stellt ein allgemeines Verfahren zur Verbesserung der pharmakokinetischen Eigenschaften eines Proteins bereit. Ein Protein wird auf seine pharmakokinetischen Eigenschaften und auch auf seine Sensitivität gegenüber Proteasen getestet. Es werden Variantenproteine erzeugt und auf eine größere Widerstandsfähigkeit gegenüber Proteolyse getestet. Diese Varianten mit verstärkter Widerstandsfähigkeit gegenüber Proteolyse werden dann auf ihre pharmakokinetischen Eigenschaften getestet. Es wurde gefunden, dass der Anteil an Proteolyse-resistenten Proteinen mit verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften größer ist als für die Population von Variantenproteinen als ganzes. Einige Variantenproteine mit verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften haben eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, die keine tiefgreifende Veränderung in der Proteinstruktur verursachen, die durch Untersuchung der kodierenden Sequenz abgeleitet werden kann, wie Einführung einer N-verknüpften Glycosylierungsstelle.
Variantenproteine werden, zum Beispiel, durch Mutagenese eines Expressionskonstrukts und Isolierung der individuelle Variantenproteine exprimierenden Klone erzeugt. Jegliche einer Vielzahl von Mutagenesetechniken wird verwendet, einschließlich ortsgerichteter Mutagenese, zufälliger Mutagenese, PCR-Mutagenese und Mutagenesetechniken, die Hybridsequenzen aus verwandten Genen erzeugen.
Es ist nützlich, intrazelluläre Proteasen, wie endosomale Proteasen, für diese Assays zu verwenden. Ohne an eine bestimmte Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, dass die Pharmakokinetik von bestimmten Proteinen, insbesondere von Proteinen, die nicht durch renale Filtration entfernt werden, durch die Proteolyse bestimmt wird, die bei der Endozytose auftritt.
Es ist auch nützlich, extrazelluläre Proteasen wie Trypsin, Chymotrypsin, Plasmin, andere Verdauungsprotease, andere Serumproteasen wie Gerinnungsfaktoren, und Gewebe-spezifische Proteasen zu verwenden. Zum Beispiel werden Tumor-spezifische Proteasen verwendet, um Variantenproteine zu testen und solche Varianten zu identifizieren, die verbesserte pharmakokinetische Eigenschaften und Stabilität innerhalb der Tumormikroumgebung aufweisen. In einem anderen Beispiel werden Proteine, die oral geliefert werden sollen, auf ihre Widerstandsfähigkeit gegenüber im Gastrointestinaltrakt vorkommenden Enzymen, wie Trypsin und Chymotrypsin, getestet. Es wurde gefunden, dass Variantenproteine mit verstärkter Widerstandsfähigkeit gegenüber gastrointestinalen Enzymen verbesserte pharmakokinetische Eigenschaften wie eine größere AUC (Area Under the Curve, Fläche unter der Plasmaspiegelkurve) aufweisen.
Zum Beispiel wird ein Expressionskonstrukt mutagenisiert, das ein Fusionsprotein kodiert, das einen Teil eines oder einen gesamten Antikörper enthält. Klone werden erzeugt, die entsprechenden Proteine werden exprimiert und die Proteine werden, entweder einzeln oder in kleinen Pools, auf relative Sensitivität gegenüber Proteasen getestet. Antikörper-Fusions proteinvarianten mit verstärkter Widerstandsfähigkeit gegenüber Proteasen werden dann auf ihre pharmakokinetischen Eigenschaften getestet und eine signifikante Anzahl an Protease-resistenten Antikörper-Fusionsproteinvarianten weisen verbesserte pharmakokinetische Eigenschaften auf. Die Nucleinsäuren, die die verbesserten Fusionsproteinvarianten kodieren, werden sequenziert, und bei einigen verbesserten Varianten erwies sich, dass sie Mutationen an Stellen außer der Fusionsproteinverbindung enthielten, die den Phänotyp der verstärkten Widerstandsfähigkeit gegenüber Proteolyse und verbesserten Pharmakokinetik verursachen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verändertes Fusionsprotein auf Antikörper-Basis, das in vivo eine längere Halbwertszeit im Blutkreislauf als ein entsprechendes unverändertes Fusionsprotein auf Antikörperbasis hat, umfassend eine schwere Immunglobulin (Ig)-Kette oder einen Teil davon mit einer CH2- und einer CH3-Domäne, deren C-Terminus an den N-Terminus eines sezernierten Nicht-Ig-Proteins oder eines Teils davon gebunden ist, der die funktionellen Eigenschaften des intakten Nicht-Ig-Proteins behält, wobei die Veränderung eine Punktmutation, eine Insertion, eine Deletion oder eine Gen-Umlagerung am C-terminalen Aminosäurerest der Ig-Kette beinhaltet.
Fusionsprotein auf Antikörper-Basis nach Anspruch 1, wobei die Aminosäureveränderung die Hydrophobie des Fusionsproteins auf Antikörperbasis steigert.
Fusionsprotein auf Antikörper-Basis nach Anspruch 1, wobei die Aminosäureveränderung eine Punktmutation, Insertion oder Gen-Umlagerung nicht-geladener Aminosäurereste beinhaltet.
Fusionsprotein auf Antikörper-Basis nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der C-terminale Aminosäurerest der Ig-Kette durch Ala, Leu, Gly und Trp ersetzt ist.
Fusionsprotein auf Antikörper-Basis nach Anspruch 4, wobei der C-terminale Aminosäurerest durch Ala ersetzt ist.
Fusionsprotein auf Antikörper-Basis nach Anspruch 4, wobei der C-terminale Aminosäurerest der Ig-Kette durch Ala-Ala-Ala ersetzt ist.
Fusionsprotein auf Antikörper-Basis nach Anspruch 1 oder 2, wobei der C-terminale Aminosäurerest der Ig-Kette deletiert ist.
Fusionsprotein auf Antikörper-Basis nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei ein Spacer- oder Linker-Peptid mit 1 bis 55 Aminosäureresten zwischen Ig-Kette und Nicht-Ig-Einheit eingeführt ist.
Fusionsprotein auf Antikörper-Basis nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das im Bereich von 10 Aminosäureresten vom C-Terminus der Ig-Einheit weiter mutiert wird, indem ionisierbare Aminosäurereste in dem Bereich durch nicht geladene oder hydrophobe Reste ersetzt werden.
Fusionsprotein auf Antikörper-Basis nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das im Bereich von 10 Aminosäureresten vom N-Terminus der Nicht-Ig-Proteineinheit weiter mutiert wird, indem ionisierbare Aminosäurereste in dem Bereich durch nicht geladene oder hydrophobe Reste ersetzt werden.
Fusionsprotein auf Antikörper-Basis nach einem der Ansprüche 1 bis 8, das im Bereich von 10 Aminosäureresten vom C-Terminus der Ig-Einheit und im Bereich von 10 Aminosäureresten vom N-Terminus der Nicht-Ig-Proteineinheit weiter mutiert wird, indem ionisierbare Reste durch nicht geladene oder hydrophobe Reste ersetzt werden.
Fusionsprotein auf Antikörper-Basis nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Ig-Kette mindestens die CH2-Domäne eines konstanten IgG2- oder IgG4-Bereichs umfasst.
Fusionsprotein auf Antikörper-Basis nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Ig-Kette mindestens einen Teil eines konstanten IgG1-Bereichs umfasst, der an einer oder mehreren Aminosäuren, ausgewählt aus der aus Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Asn297 und Pro331 bestehenden Gruppe, eine Mutation oder Deletion aufweist.
Fusionsprotein auf Antikörper-Basis nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Ig-Kette mindestens einen Teil eines konstanten IgG3-Bereichs umfasst, der an einer oder mehreren Aminosäuren, ausgewählt aus der aus Leu281, Leu282, Gly283, Gly284, Asn344 und Pro378 bestehenden Gruppe, eine Mutation oder Deletion aufweist.
Fusionsprotein auf Antikörper-Basis nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Ig-Kette Bindungsaffinität für einen Immunglobulin-Schutzrezeptor aufweist.
Fusionsprotein auf Antikörper-Basis nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei die Ig-Kette eine im Wesentlichen reduzierte Bindungsaffinität für einen Fc-Rezeptor aufweist, der aus der aus FcyRI, FcyRII, FcyRIII bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Fusionsprotein auf Antikörper-Basis nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei das Nicht-Ig-Protein aus der aus einem Cytokin, einem ligandenbindenden Protein und einem Proteintoxin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Fusionsprotein auf Antikörper-Basis nach Anspruch 17, wobei das Cytokin aus der aus einem Tumornekrosefaktor, einem Interleukin, und einem Lymphokin bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Fusionsprotein auf Antikörper-Basis nach Anspruch 18, wobei der Tumornekrosefaktor Tumornekrosefaktor α ist.
Fusionsprotein auf Antikörper-Basis nach Anspruch 18, wobei das Interleukin Interleukin-2 ist.
Fusionsprotein auf Antikörper-Basis nach Anspruch 18, wobei das Lymphokin ein Lymphotoxin oder ein koloniestimulierender Faktor ist.
Fusionsprotein auf Antikörper-Basis nach Anspruch 21, wobei der koloniestimulierende Faktor ein Granulocyten-Makrophagen-Koloniestimulationsfaktor ist.
Fusionsprotein auf Antikörper-Basis nach Anspruch 17, wobei das ligandenbindende Protein aus der aus CD4, CTLA-4, TNF-Rezeptor und einem Interleukin-Rezeptor bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Verfahren zum Steigern der Halbwertszeit im Blutkreislauf eines Fusionsproteins auf Antikörper-Basis, umfassend eine schwere Immunglobulin (Ig)-Kette oder einen Teil davon mit einer CH2- und einer CH3-Domäne, deren C-Terminus an den N-Terminus eines sezernierten Nicht-Ig-Proteins oder eines Teils davon gebunden ist, der die funktionellen Eigenschaften des intakten Proteins behält, wobei das Verfahren die Veränderung des C-terminalen Rests der Ig-Kette durch Punktmutation, Insertion, Deletion oder Gen-Umlagerung beinhaltet, wobei die Veränderung eine gesteigerte Hydrophobie des Fusionsproteins bewirkt.
Verfahren nach Anspruch 24, umfassend das weitere Verändern von Aminosäureresten durch Punktmutation, Insertion, Deletion oder Gen-Umlagerung in dem Bereich, der die Verbindung zwischen der Ig-Einheit und der Nicht-Ig-Einheit von 10 Aminosäureresten vom C-Terminus der Ig-Kette bis zu 10 Aminosäureresten vom N-Terminus der Nicht-Ig-Einheit überspannt; wobei die Veränderung eine gesteigerte Hydrophobie des Fusionsproteins bewirkt.
Verfahren zum Identifizieren einer Mutation, die die Halbwertszeit im Blutkreislauf eines Fusionsproteins auf Antikörper-Basis steigert, umfassend eine schwere Immunglobulin (Ig)-Kette oder einen Teil davon mit einer CH2- und einer CH3-Domäne, deren C-Terminus an den N-Terminus eines sezernierten Nicht-Ig-Proteins oder eines Teils davon gebunden ist, der die funktionellen Eigenschaften des intakten Proteins behält, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: a) Einbringen von einer oder mehreren Mutationen in den Bereich, der die Verbindung zwischen der Ig-Einheit und der Nicht-Ig-Proteineinheit von 10 Aminosäureresten aus dem C-Terminus des Ig-Proteins bis zu 10 Aminosäureresten vom N-Terminus der Nicht-Ig-Proteineinheit überspannt, zumindest aber von einer Mutation am Amino säurerest am C-Terminus der Ig-Kette, wobei die Mutationen eine gesteigerte Hydrophobie des Fusionsproteins bewirken; b) Vergleichen der Serum-Halbwertszeiten des Fusionsproteins auf Antikörper-Basis mit und ohne Mutation; und c) Auswählen einer Mutation, die die Serum-Halbwertszeit des Fusionsproteins auf Antikörper-Basis steigert.
Verwendung eines Fusionsproteins auf Antikörper-Basis nach einem der Ansprüche 17 bis 23 zur Herstellung eines Medikamentes zur Behandlung tumorbezogener Erkrankungen.
Verwendung nach Anspruch 27, wobei die tumorbezogene Erkrankung Metastasen umfasst.