DE60123079T2

DE60123079T2 - Stress-gekoppelter transkriptionsfaktor und dessen verwendung in pflanzen

Info

Publication number: DE60123079T2
Application number: DE60123079T
Authority: DE
Inventors: Oswaldo Apex DA COSTA SILVA; J. Hans Champaign BOHNERT; Nocha Cary VAN THIELEN; Ruoying Apex CHEN
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2001-04-06
Publication date: 2007-04-05
Anticipated expiration: 2021-04-07
Also published as: US7915484B2; US7838731B2; EP1881073B1; US20040216183A1; ATE339509T1; ATE348181T1; DE60123079D1; EP2169069A2; ES2272461T3; US7427696B2; US20020066124A1; US20090031451A1; AU2001255261A1; EP1795600A2; EP1728870A2; US7608757B2; EP1268828B1; ATE380248T1; US7714190B2; US20080201799A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft allgemein Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine kodieren, die mit abiotischen Stressreaktionen und Toleranz gegenüber abiotischem Stress bei Pflanzen in Zusammenhang stehen. Insbesondere betrifft die Erfindung Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine kodieren, welche Pflanzen Toleranz gegenüber Trockenheit verleihen.
Hintergrund des Fachbereichs
Abiotischer umweltbedingter Stress, wie zum Beispiel Stress durch Trockenheit, Stress durch Salz, Stress durch Wärme sowie Stress durch Kälte, sind die wesentlichen einschränkenden Faktoren von Pflanzenwachstum und Produktivität. Ernteverluste und Ernteertragsverluste von pflanzenbaulichen Hauptkulturen, wie zum Beispiel Reis, Mais (Korn) und Weizen, welche durch diesen Stress verursacht wurden, stellen einen wesentlichen wirtschaftlichen und politischen Gesichtspunkt dar und tragen in vielen unterentwickelten Ländern zu Nahrungsmittelknappheit bei.
Pflanzen sind üblicherweise während ihres Entwicklungszyklus Bedingungen von umweltbedingtem verminderten Wassergehalt ausgesetzt. Die meisten Pflanzen haben Strategien entwickelt, um sich selbst gegenüber diesen Bedingungen der Austrocknung zu schützen. Wenn jedoch die Schwere und Dauer der Trocknungsbedingungen zu groß ist, sind die Wirkungen auf Pflanzenentwicklung, Wachstum und Ausbeute der meisten Nutzpflanzen schwerwiegend. Darüber hinaus sind die meisten der Nutzpflanzen gegenüber hohen Salzkonzentrationen im Boden sehr empfindlich. Andauernde Belastung gegenüber Trockenheit und hoher Salzkonzentrationen verursacht wesentliche Veränderungen im Pflanzenstoffwechsel. Diese großen Veränderungen im Stoffwechsel führen schließlich zu Zelltod und folglich zu Ertragsverlusten.
Die Entwicklung von Pflanzen mit Toleranz gegenüber Stress stellt eine Strategie dar, die das Potenzial hat, zumindest einige dieser Probleme zu lösen oder zu vermitteln. Herkömmliche Pflanzenzüchtungsstrategien zur Entwicklung neuer Pflanzenzuchtlinien, die Resistenz (Toleranz) gegenüber diesen Stressarten aufweisen, sind verhältnismäßig langsam und erfordern spezielle resistente Zuchtlinien zur Kreuzung mit der gewünschten Zuchtlinie. Begrenzte Keimplasmaquellen für Stresstoleranz und Unverträglichkeit bei Kreuzungen zwischen entfernt verwandten Pflanzenarten stellen wesentliche Probleme dar, auf die man bei der herkömmlichen Züchtung stößt. Darüber hinaus sind die zellulären Prozesse, die am Modell zu Toleranz gegenüber Trockenheit, Kälte und Salz führen, Pflanzen mit Toleranz gegenüber Trockenheit und/oder Salz in Natur kompliziert und bringen vielfältige Mechanismen der zellulären Anpassung und zahlreiche Stoffwechselwege mit sich. Diese Mehrkomponenten-Beschaffenheit von Toleranz gegenüber Stress hat nicht nur zu einer weitgehend erfolglosen Züchtung im Hinblick auf Toleranz geführt, sondern auch die Fähigkeit zur gentechnischen Veränderung von Pflanzen mit Toleranz gegenüber Stress unter Verwendung biotechnologischer Verfahren eingeschränkt.
Daher besteht ein Bedarf zur Identifizierung von Genen und Proteinen, die an diesen Mehrkomponenten-Prozessen, die zu Toleranz gegenüber Stress führen, beteiligt sind. Die Aufklärung der Funktion von Genen, die in Pflanzen mit Toleranz gegenüber Stress exprimiert werden, verbessert nicht nur unser Verständnis von Pflanzenanpassung und Toleranz gegenüber umweltbedingtem Stress, sondern stellt wahrscheinlich auch wichtige Informationen zur Entwicklung neuer Strategien für die Verbesserung des Ernteertrags dar.
Eine Modellpflanze, die zur Untersuchung von Toleranz gegenüber Stress verwendet wird, ist Arabidopsis thaliana. Es bestehen mindestens vier verschiedene Signalübertragungswege, die in der Modellpflanze Arabidopsis thaliana zu Toleranz gegenüber Stress führen. Diese Wege stehen unter der Kontrolle bestimmter Transkriptionsfaktoren (Shinozaki et al., 2000 Curr. Op. Pl. Biol. 3: 217–23). Regulatoren von Genen, insbesondere Transkriptionsfaktoren, die an diesen Toleranzwegen beteiligt sind, sind zur Konstruktion von Toleranz in Pflanzen geeignet, da ein einzelnes Gen eine gesamte Kaskade von Genen aktivieren kann, die zu dem toleranten Phänotyp führt. Folglich sind Transkriptionsfaktoren wichtige Zielstrukturen beim Bestreben zur Identifizierung von Genen, die Stresstoleranz auf Pflanzen übertragen.
Ein Transkriptionsfaktor, der im Fachbereich identifiziert worden ist, ist der Arabidopsis thaliana-Transkriptionsfaktor CBF (Jaglo-Ottosen et al., 1998 Science 280: 104–6). Überexpression dieses Gens in Arabidopsis übertrug Toleranz gegenüber Trockenheit auf diese Pflanze (Kasuga et al., 1999 Nature Biotech. 17: 287–91). CBF ist jedoch bisher das einzige Beispiel eines Transkriptionsfaktors, der zur Übertragung von Toleranz gegenüber Trockenheit auf Pflanzen bei Überexpression in der Lage ist.
Obwohl einige Gene, die an Stressreaktionen in Pflanzen beteiligt sind, charakterisiert worden sind, bleibt die Charakterisierung und Klonierung von Pflanzengenen, die Stresstoleranz übertragen, größtenteils unvollständig und bruchstückhaft. Zum Beispiel haben bestimmte Untersuchungen darauf hingedeutet, dass Stress durch Trockenheit und Salz in einigen Pflanzen auf zusätzliche Genwirkungen zurückgeführt werden kann, während im Gegensatz dazu andere Forschungen darauf hindeuten, dass spezifische Gene in vegetativem Gewebe von Pflanzen unter osmotischen Stressbedingungen transkriptionell aktiviert werden. Obwohl im Allgemeinen angenommen wird, dass Stress-induzierte Proteine eine Rolle bei der Toleranz spielen, fehlt immer noch ein direkter Nachweis dafür, und die Funktionen vieler Stress-reaktiver Gene sind unbekannt.
Daher besteht ein Bedarf zur Identifizierung von Genen, die in Pflanzen mit Toleranz gegenüber Stress exprimiert werden und die Fähigkeit zur Übertragung von Resistenz gegenüber Stress auf ihre Wirtspflanze und auf andere Pflanzenarten aufweisen. Neu erzeugte Pflanzen mit Toleranz gegenüber Stress weisen viele Vorteile auf, wie zum Beispiel eine Vergrößerung des Bereichs, in welchem Nutzpflanzen kultiviert werden können, wie zum Beispiel durch Vermindern des Wasserbedarfs einer Pflanzenart.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung erfüllt teilweise den Bedarf zur Identifizierung neuer, einzigartiger Transkriptionsfaktoren, die in der Lage sind, Toleranz gegenüber Stress bei Überexpression auf Pflanzen zu übertragen. Die vorliegende Erfindung stellt eine transgene Pflanzenzelle bereit, die mit einer für ein Transcription Factor Stress-Related Protein (TFSRP) kodierenden Nukleinsäure transformiert ist, wobei die Expression der Nukleinsäuresequenz in der Pflanzenzelle im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanzenzelle zu einer gesteigerten Toleranz gegenüber Stress durch Trockenheit führt, und wobei das TFSRP aus gemäß SEQ ID NO: 20 definiertem Zinc-Finger Factor-4 Protein (ZF-4) und Sequenzen ausgewählt ist, die mindestens 60% homolog zu der gesamten, in SEQ ID NO: 20 gezeigten Aminosäuresequenz sind.
Die Erfindung stellt in einigen Ausführungsformen bereit, dass das TFSRP und die kodierende Nukleinsäure in Mitgliedern der Gattung Physcomitrella vorkommen. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stammen die Nukleinsäure und das Protein aus Physcomitrella patens. Die Erfindung stellt bereit, dass der umweltbedingte Stress Stress durch Trockenheit sein kann.
Die Erfindung stellt weiterhin Saatgut bereit, welches durch eine transgene Pflanze hergestellt wurde, die durch eine für TFSRP kodierende Nukleinsäure transformiert wurde, wobei die Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanze für eine gesteigerte Toleranz gegenüber Stress durch Trockenheit reinrassig ist. Die Erfindung stellt weiterhin Saatgut bereit, das durch eine transgene Pflanze erzeugt wurde, die TFSRP exprimiert, wobei die Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanze für eine gesteigerte Toleranz gegenüber Stress durch Trockenheit reinrassig ist.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Agrarerzeugnis bereit, welches durch eine beliebige der im Folgenden beschriebenen transgenen Pflanzen, Pflanzenteile oder Saatgut erzeugt wird. Die Erfindung stellt weiterhin ein wie im Folgenden beschriebenes isoliertes TFSRP bereit. Die Erfindung stellt weiterhin eine isolierte Nukleinsäure bereit, die für TFSRP kodiert, wobei die für TFSRP kodierende Nukleinsäure für ein wie im Folgenden beschriebenes TFSRP kodiert.
Die Erfindung stellt weiterhin einen isolierten rekombinanten Expressionsvektor bereit, der eine wie unten beschriebene für TFSRP kodierende Nukleinsäure umfasst, wobei Expression des Vektors in einer Wirtszelle im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Wirtszelle zu gesteigerter Toleranz gegenüber umweltbedingtem Stress führt. Die Erfindung stellt weiterhin eine Wirtszelle bereit, die den Vektor und eine Pflanze enthält, welche die Wirtszelle enthält.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit einer für TFSRP kodierenden Nukleinsäure bereit, wobei Expression der Nukleinsäure in der Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanze zu einer gesteigerten Toleranz gegenüber Stress durch Trockenheit führt, umfassend: (a) Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor, der eine für TFSRP kodierende Nukleinsäure umfasst, und (b) Erzeugen einer transgenen Pflanze mit einer im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanze gesteigerten Toleranz gegenüber Stress durch Trockenheit aus der Pflanze. In bevorzugten Ausführungsformen sind TFSRP und die für TFSRP kodierende Nukleinsäure wie im Folgenden beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zum Modifizieren von Toleranz gegenüber Stress einer Pflanze bereit, umfassend das Modifizieren der Expression eines TFSRP in der Pflanze, wobei TFSRP wie im Folgenden beschrieben ist. Die Erfindung stellt bereit, dass dieses Verfahren so durchgeführt werden kann, dass die Toleranz gegenüber Stress gesteigert ist. Bevorzugt ist die Toleranz gegenüber Stress in einer Pflanze über Steigerung der Expression eines TFSRP gesteigert.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die partielle cDNA-Sequenz ZF-4 (SEQ ID NO: 4) von Physcomitrella patens.
2 zeigt die Volllängen-cDNA-Sequenz von ZF-4 (SEQ ID NO: 12) von Physcomitrella patens.
3 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz von ZF-4 (SEQ ID NO: 20) von Physcomitrella patens.
4 zeigt ein Diagramm des Pflanzenexpressionsvektors pBPSSC022, der den Superpromotor enthält, der die Expression von SEQ ID NO: 12 steuert („Desired Gene"). Die Komponenten sind: NPTII-Kanamycin-Resistenzgen (Hajdukiewicz et al. 1994 Pl. Mol Biol. 25: 989–98), AtAct2-i-Promotor (An et al. 1996 Plant J. 10: 107–21), OCS3-Terminator (Weigel et al. 2000 Pl. Physiol. 122: 1003–13).
5 zeigt die Ergebnisse eines Tests über Stress durch Trockenheit mit überexprimierenden transgenen PpZF-4-Pflanzen und Wildtyp-Arabidopsis-Zelllinien. Die transgenen Zelllinien zeigen einen toleranten Phänotyp an.
Individuelle Transformantenlinien sind gezeigt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung kann unter Bezugnahme auf die folgende ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung und die hierin umfassten Beispiele einfacher verstanden werden. Bevor jedoch die vorliegenden Verbindungen, Zusammensetzungen und Verfahren offenbart und beschrieben werden, ist es selbstverständlich, dass diese Erfindung nicht auf spezielle Nukleinsäuren, spezielle Polypeptide, spezielle Zellarten, spezielle Wirtszellen, spezielle Bedingungen oder spezielle Verfahren etc. eingeschränkt ist, da solche selbstverständlich variieren können, und die zahlreichen Modifizierungen und Variationen dem Fachmann hierzu offensichtlich sind.
Es ist auch selbstverständlich, dass die hierin verwendete Terminologie nur zum Zwecke der Beschreibung spezifischer Ausführungsformen dient und es nicht beabsichtigt ist, dass sie einschränkend sind. Insbesondere schränkt die Bezeichnung der Aminosäuresequenzen als Protein „Transcription Factor Stress-Related Proteins" (TFSRPs) in keiner Weise die Funktionalität dieser Sequenzen ein.
Die vorliegende Erfindung stellt eine transgene Pflanzenzelle bereit, die mit einer für ein TFSRP kodierenden Nukleinsäure wie in Anspruch 1 definiert, transformiert ist, wobei die Expression der Nukleinsäuresequenz in der Pflanzenzelle im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanzenzelle zu einer gesteigerten Toleranz gegenüber Stress durch Trockenheit führt. Die Erfindung stellt weiterhin transgene Pflanzenteile und transgene Pflanzen bereit, die die hierin beschriebenen Pflanzenzellen enthalten. Ebenso wird ein Pflanzensaatgut bereitgestellt, welches durch eine transgene Pflanze erzeugt wurde, die durch eine für TFSRP kodierende Nukleinsäure transformiert wurde, wobei das Saatgut die für TFSRP kodierende Nukleinsäure enthält, und wobei die Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanze für gesteigerte Toleranz gegenüber Stress durch Trockenheit reinrassig ist. Die Erfindung stellt weiterhin Saatgut bereit, welches durch eine transgene Pflanze erzeugt wurde, die ein TFSRP exprimiert, wobei das Saatgut das TFSRP enthält, und wobei die Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanze für gesteigerte Toleranz gegenüber Stress durch Trockenheit reinrassig ist. Die Erfindung stellt auch ein Agrarerzeugnis bereit, welches durch eine beliebige der im Folgenden beschriebenen transgenen Pflanzen, Pflanzenteile und Pflanzensaatgut hergestellt wurde.
Wie hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung „Sorte" auf eine Gruppe von Pflanzen innerhalb einer Art, die gleichbleibende Merkmale gemeinsam haben, die sie von der üblichen Form und von anderen möglichen Sorten innerhalb der Art trennen. Während sie mindestens ein unterscheidendes Merkmal besitzen, ist eine Sorte auch durch eine geringe Variation zwischen den Individuen innerhalb der Sorte gekennzeichnet, in erster Linie auf Grundlage der Mendelschen Segregation von Merkmalen innerhalb der Nachkommenschaft nachfolgender Generationen. Eine Sorte wird für ein bestimmtes Merkmal als „reinrassig" betrachtet, wenn sie für das Merkmal bis zu einem solchen Grad genetisch homozygot ist, dass keine wesentliche Menge an unabhängiger Segregation des Merkmals innerhalb der Nachkommenschaft beobachtet wird, wenn die reinrassige Sorte selbstbestäubt wird. In der vorliegenden Erfindung geht das Merkmal aus der transgenen Expression einer oder mehrerer DNA-Sequenzen hervor, die in eine Pflanzensorte eingeführt werden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt zum ersten Mal, dass das Physcomitrella patens-TFSRP ZF-4 zur Steigerung der Toleranz einer Pflanze gegenüber Stress durch Trockenheit geeignet ist.
PpZF-4 zeigt zur Zink-Finger-Klasse von Transkriptionsfaktoren Sequenzähnlichkeit. Zink-Finger-Transkriptionsfaktoren haben eine spezielle Sekundärstruktur gemeinsam, wobei ein Zinkmolekül durch Wechselwirkung mit Cystein- oder Histidin-Aminosäureresten abgegrenzt ist. Durch diese „Finger" stehen die Proteine mit ihren spezifischen DNA-Zielstrukturen in Wechselwirkung und regulieren die Transkription der Zielgene. Zinkfinger-Faktoren stehen mit einer Vielzahl biologischer Erscheinungen in Zusammenhang. Zum Beispiel stehen Zinkfinger in Hefe mit der Regulation vielfacher Gene in Beziehung, zum Beispiel Gene, die am allgemeinen Stoffwechsel beteiligt sind. In Pflanzen ist ein Zink-Finger-Protein, CONSTANS, für die Bestimmung der Blütezeit verantwortlich (Putterill et al. 1995 Cell 80: 847–57). Sakamoto et al. (2000 Gene 248: 23–32) berichtet auch über die Aktivierung der Genexpression von drei Zinkfinger-Proteinen in Arabidopsis während Stressbehandlungen mit Wasser. Sie stellten jedoch keine beliebigen Daten dar, die diese gesteigerte Expression mit Toleranz gegenüber Stress in Verbindung bringen. Schließlich haben Lippuner et al. (1996 JBC 271: 12859–F6) berichtet, dass eine bestimmte Klasse von Zink-Finger-Proteinen in der Lage war, Toleranz gegenüber Salz auf Hefemutanten zu übertragen, es wurden jedoch keine Daten dargelegt, die gesteigerte Salztoleranz gegenüber ganzen Pflanzen zeigten.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein isoliertes TFSRP ZF-4 und Homologe davon bereit. Das TFSRP ist ein Zinc-Finger Factor-4 (ZF-4) Protein, welches gemäß SEQ ID NO: 20 definiert ist, sowie Sequenzen, die mindestens 60% zu der gesamten, in SEQ ID NO: 20 gezeigten Aminosäuresequenz homolog sind. Homologe und Orthologe der Nukleotidsequenz sind im Folgenden definiert.
Das TFSRP der vorliegenden Erfindung wird bevorzugt durch rekombinante DNA-Methoden hergestellt. Zum Beispiel wird ein Nukleinsäuremolekül, dass für das Protein kodiert, in einen Expressionsvektor kloniert (wie im Folgenden beschrieben), und das TFSRP wird in der Wirtszelle exprimiert. Das TFSRP kann anschließend durch ein geeignetes Reinigungsschema unter Verwendung von Standardproteinreinigungsmethoden aus den Zellen isoliert werden. Alternativ zu rekombinanter Expression kann ein TFSRP-Polypeptid oder ein Peptid chemisch unter Verwendung von Standardpeptidsynthesemethoden synthetisiert werden. Darüber hinaus kann natives TFSRP zum Beispiel unter Verwendung eines anti-TFSRP-Antikörpers, welcher mittels Standardmethoden unter Verwendung eines TFSRP oder eines Fragments davon hergestellt wird, aus Zellen (z.B. Physcomitrella patens) isoliert werden.
Die Erfindung stellt weiterhin eine isolierte, für TFSRP kodierende Nukleinsäure bereit. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Nukleinsäure und das Protein aus der Pflanzengattung Physcomitrella isoliert. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stammt die Nukleinsäure und das Protein aus einer Physcomitrella patens(P. Patens)-Pflanze.
Wie hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung „Stress durch Trockenheit" auf eine beliebige suboptimale Wachstumsbedingung und umfasst suboptimale Bedingungen, die mit Trockenheit in Zusammenhang stehen, ist jedoch nicht darauf eingeschränkt. In einer bevorzugten Ausführungsform kann Stress durch Trockenheit ein niedriger Wassergehalt sein. Es ist auch selbstverständlich, dass „ein", wie in der Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet, abhängig vom Zusammenhang, in welchem es verwendet wird, eines oder mehrere bedeuten kann.
Wie ebenso hierin verwendet, sollen die Bezeichnungen „Nukleinsäure" und „Nukleinsäuremolekül" DNA-Moleküle (z.B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z.B. mRNA) und Analoga der unter Verwendung von Nukleotidanaloga erzeugten DNA oder RNA umfassen. Diese Bezeichnung umfasst auch untranslatierte Sequenzen, die sowohl an den 3'- als auch 5'-Enden der kodierenden Region des Gens positioniert sind: mindestens etwa 1000 Nukleotide der Sequenz stromaufwärts des 5'-Endes der kodierenden Region und mindestens etwa 200 Nukleotide der Sequenz stromabwärts des 3'-Endes der kodierenden Region des Gens. Das Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, bevorzugt ist es jedoch doppelsträngige DNA.
Ein „isoliertes" Nukleinsäuremolekül ist ein solches Nukleinsäuremolekül, das im Wesentlichen von anderen Nukleinsäuremolekülen, welche in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure vorliegen, abgetrennt ist. Bevorzugt ist eine „isolierte" Nukleinsäure frei von einigen der Sequenzen, welche in der genomischen DNA des Organismus, aus welchem die Nukleinsäure stammt, auf natürliche Weise an die Nukleinsäure angrenzen (d.h. Sequenzen, die an den 5'- und 3'-Enden der Nukleinsäure positioniert sind). Zum Beispiel kann das isolierte TFSRP-Nukleinsäuremolekül in verschiedenen Ausführungsformen weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb Nukleotidsequenzen enthalten, welche in der genomischen DNA der Zelle, aus welcher die Nukleinsäure stammt (z.B. einer Physcomitrella patens-Zelle) auf natürliche Weise an das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA angrenzen. Darüber hinaus kann ein „isoliertes" Nukleinsäuremolekül, wie zum Beispiel ein cDNA-Molekül, frei von einigen der anderen Zellmaterialien sein, mit welchen es auf natürliche Weise in Zusammenhang steht, oder frei von Kulturmedium sein, wenn dieses durch rekombinante Methoden hergestellt wird, oder frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien sein, wenn diese chemisch synthetisiert werden.
Ein Nukleinsäuremolekül der vorliegenden Erfindung, z.B. ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 12 oder ein Abschnitt davon kann unter Verwendung von molekularbiologischen Standardmethoden und der hierin bereitgestellten Sequenzinformation isoliert werden. Zum Beispiel kann eine TFSRP-cDNA aus P. patens aus einer P. patens-Bibliothek unter Verwendung der gesamten oder eines Abschnitts der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 4 isoliert werden. Darüber hinaus kann ein Nukleinsäuremolekül, das die gesamte oder einen Abschnitt der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 4 umfasst, mittels Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von Oligonukleotidprimern, die auf Grundlage dieser Sequenz entworfen wurden, isoliert werden. Zum Beispiel kann mRNA aus Pflanzenzellen isoliert werden (z.B. durch das Guanidinium-Thiocyanat-Extraktionsverfahren von Chirgwin et al., 1979 Biochemistry 18: 5294–5299) und cDNA kann unter Verwendung von reverser Transkriptase hergestellt werden (z.B. Moloney MLV-reverse Transkriptase, erhältlich von Gibco/BRL, Bethesda, MD; oder AMV-reverse Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Synthetische Oligonukleotidprimer zur Polymerasekettenreaktion-Amplifizierung können auf Grundlage einer der in SEQ ID NO: 4 gezeigten Nukleotidsequenzen entworfen werden. Ein Nukleinsäuremolekül der Erfindung kann unter Verwendung von cDNA oder wahlweise von genomischer DNA als Matrize und geeigneten Oligonukleotidprimern gemäß Standard-PCR-Amplifizierungstechniken amplifiziert werden. Das so amplifizierte Nukleinsäuremolekül kann in einen geeigneten Vektor kloniert und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Ferner können Oligonukleotide, die einer TFSRP-Nukleotidsequenz entsprechen, durch Standardsynthesemethoden hergestellt werden, zum Beispiel unter Verwendung eines automatisierten DNA-Synthesizers.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung eine gemäß SEQ ID NO: 12 gezeigte Nukleotidsequenz. Diese cDNA umfasst Sequenzen, die für TFSRPs kodieren (d.h. die „kodierende" Region, die in Tabelle 1 angezeigt ist) sowie 5'-untranslatierte Sequenzen und 3'-untranslatierte Sequenzen. Es ist selbstverständlich, dass SEQ ID NO: 12 sowohl kodierende Regionen als auch 5'- und 3'-untranslatierte Regionen umfasst. Alternativ können die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung nur die kodierende Region der Sequenz in SEQ ID NO: 12 oder vollständige genomische Fragmente, welche aus genomischer DNA isoliert sind, enthalten. Eine kodierende Region dieser Sequenzen wird als „ORF-Position" bezeichnet. Die vorliegende Erfindung umfasst auch für TFSRP kodierende Nukleinsäuren, die für die hierin beschriebenen TFSRPs kodieren. Bevorzugt ist eine für TFSRP kodierende Nukleinsäure, die für ein TFSRP gemäß ZF-4 (SEQ ID NO: 20) kodiert.
Darüber hinaus kann das Nukleinsäuremolekül der Erfindung nur einen Abschnitt der kodierenden Region der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 12 umfassen, zum Beispiel ein Fragment, welches als Sonde oder Primer verwendet werden kann oder ein Fragment, welches für einen biologisch aktiven Abschnitt eines TFSRP kodiert. Die Nukleotidsequenzen, die durch das Klonieren der TFSRP-Gene aus P. patens bestimmt wurden, ermöglichen die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Verwendung bei der Identifizierung und/oder Klonierung von TFSRP-Homologen in anderen Zellarten und Organismen sowie von TFSRP-Homologen aus anderen Moosen und verwandten Arten entworfen wurden.
Abschnitte von Proteinen, die durch die TFSRP-Nukleinsäuremoleküle der Erfindung kodiert sind, sind bevorzugt biologisch aktive Abschnitte eines der hierin beschriebenen TFSRPs. Wie hierin verwendet, soll die Bezeichnung „biologisch aktiver Abschnitt" eines TFSRP einen Abschnitt umfassen, zum Beispiel eine Domäne/Motiv, eines TFSRP, die/das an einer Toleranzreaktion gegenüber Stress in einer Pflanze teilnimmt, eine gemäß Tabelle 1 dargelegte Aktivität aufweist oder an der Transkription eines Proteins teilnimmt, das an einer Toleranzreaktion gegenüber Stress in einer Pflanze beteiligt ist. Zur Bestimmung, ob ein TFSRP oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon an der Transkription eines Proteins teilnimmt, welches an einer Toleranzreaktion gegenüber Stress in einer Pflanze beteiligt ist, oder ob Hemmung eines TFSRP zu gesteigerter Toleranz gegenüber Stress in einer Pflanze führt, kann eine Stressanalyse einer Pflanze durchgeführt werden, die das TFSRP umfasst. Solche Analysetechniken, wie in Beispiel 7 ausführlich beschrieben, sind dem Fachmann wohl bekannt. Insbesondere können Nukleinsäurefragmente, die für biologisch aktive Abschnitte eines TFSRP kodieren, durch Isolieren eines Abschnitts der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 20, Exprimieren des kodierten Abschnitts des TFSRP oder des Peptids (z.B. durch rekombinante Expression in vitro) und Feststellen der Aktivität des kodierten Abschnitts des TFSRP oder Peptids hergestellt werden.
Biologisch aktive Abschnitte eines TFSRP umfassen Peptide, die Aminosäuresequenzen umfassen, die sich von der Aminosäuresequenz eines TFSRP ableiten, z.B. einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 20, oder die Aminosäuresequenz eines Proteins, welches zu einem TFSRP homolog ist, welches weniger Aminosäuren als ein Volllängen-TFSRP oder das Volllängenprotein umfasst, welches zu einem TFSRP homolog ist, und mindestens eine Aktivität eines TFSRP aufweist. Üblicherweise umfassen biologisch aktive Abschnitte (z.B. Peptide, welche zum Beispiel 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 oder mehr Aminosäuren lang sind) eine Domäne oder ein Motiv mit mindestens einer Aktivität eines TFSRP. Darüber hinaus können weitere biologisch aktive Abschnitte, in welchen andere Regionen des Proteins selektiert sind, durch rekombinante Methoden hergestellt werden und im Hinblick auf eine oder mehrere der hierin beschriebenen Aktivitäten beurteilt werden. Bevorzugt umfassen die biologisch aktiven Abschnitte eines TFSRP eine oder mehrere ausgewählte Domänen/Motive oder Abschnitte davon mit biologischer Aktivität.
Chimäre TFSRP-Proteine oder TFSRP-Fusionsproteine sind auch vorgesehen. Wie hierin verwendet, umfasst ein TFSRP-"chimäres Protein" oder ein TFSRP-"Fusionsprotein" ein TFSRP-Polypeptid, welches operativ mit einem Nicht-TFSRP-Polypeptid verknüpft ist. Ein TFSRP-Polypeptid bezieht sich auf ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die einem TFSRP entspricht, während sich ein Nicht-TFSRP-Polypeptid auf ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz bezieht, welche einem Protein entspricht, das im Wesentlichen nicht zu einem TFSRP homolog ist, z.B. einem Protein, das sich von dem TFSRP unterscheidet und aus dem selben oder einem unterschiedlichen Organismus stammt. Innerhalb des Fusionsproteins soll die Bezeichnung „operativ verknüpft" anzeigen, dass das TFSRP-Polypeptid und das Nicht-TFSRP-Polypeptid miteinander so fusioniert sind, dass beide Sequenzen die vorgeschlagene Funktion erfüllen, welche der verwendeten Sequenz zugesprochen wird. Das Nicht-TFSRP-Polypeptid kann mit dem N-Terminus oder C-Terminus des TFSRP-Polypeptids fusioniert sein. Zum Beispiel ist in einer Ausführungsform das Fusionsprotein ein GFT-TFSRP-Fusionsprotein, in welchem die TFSRP-Sequenzen mit dem C-Terminus der GST-Sequenzen fusioniert sind. Solche Fusionsproteine können die Reinigung von rekombinanten TFSRPs erleichtern. In einer anderen Ausführungsform ist das Fusionsprotein ein TFSRP, das eine heterologe Signalsequenz an seinem N-Terminus enthält. In bestimmten Wirtszellen (z.B. Säugetierwirtszellen) kann die Expression und/oder Sekretion eines TFSRP durch die Verwendung einer heterologen Signalsequenz gesteigert werden.
Bevorzugt wird ein chimäres TFSRP-Protein oder ein TFSRP-Fusionsprotein mittels rekombinanter Standard-DNA-Methoden hergestellt. Zum Beispiel sind DNA-Fragmente, die für verschiedene Polypeptidsequenzen kodieren, im Leserahmen gemäß herkömmlicher Methoden aneinander ligiert, zum Beispiel unter Verwendung von glatten oder überhängenden Enden zur Ligation, Restriktionsenzymverdau, um die entsprechenden Enden bereitzustellen, Auffüllen der klebrigen Enden, soweit erforderlich, Behandlung mit alkalischer Phosphatase zur Vermeidung von unerwünschter Bindung und enzymatischer Ligation. In einer weiteren Ausführungsform kann das Fusionsgen durch herkömmliche Methoden einschließlich automatisierten DNA-Synthesizern synthetisiert werden. Alternativ kann die PCR-Amplifizierung von Genfragmenten unter Verwendung von Ankerprimern ausgeführt werden, welche zu komplementären Überhängen zwischen zwei benachbarten Genfragmenten führen und welche anschließend zur Erzeugung einer chimären Gensequenz aneinander gefügt und re-amplifiziert werden können (siehe zum Beispiel Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Darüber hinaus sind viele Expressionsvektoren kommerziell erhältlich, die bereits für einen Fusionsrest kodieren (z.B. ein GST-Polypeptid). Eine für TFSRP kodierende Nukleinsäure kann in einen solchen Expressionsvektor so kloniert werden, dass der Fusionsrest im Leseraster mit dem TFSRP verknüpft ist.
Zusätzlich zu Fragmenten und Fusionsproteinen der hierin beschriebenen TFSRPs sind auch Homologe und Analoga von natürlich vorkommenden TFSRPs und für TFSRP kodierende Nukleinsäuren in einer Pflanze vorgesehen. „Homologe" sind hierin als zwei Nukleinsäuren oder Proteine definiert, die ähnliche oder „homologe" Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenzen aufweisen. Homologe umfassen Allelvarianten, Orthologe, Paraloge, Agonisten und Antagonisten von TFSRPs, wie hierin im Folgenden definiert. Die Bezeichnung „Homolog" umfasst weiterhin Nukleinsäuremoleküle, die sich von der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 12 (und Abschnitte davon) aufgrund der Degeneration des genetischen Codes unterscheiden und daher für dasselbe TFSRP kodieren wie dasjenige, das durch die gemäß SEQ ID NO: 12 kodierte Nukleinsäure kodiert ist. Wie hierin verwendet, betrifft ein „natürlich vorkommendes" TFSRP eine TFSRP-Aminosäuresequenz, die in der Natur vorkommt. Bevorzugt umfasst ein natürlich vorkommendes TFSRP eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 20.
Ein Agonist des TFSRP kann im Wesentlichen die gleiche oder einen Teil der biologischen Aktivitäten des TFSRP beibehalten. Ein Antagonist des TFSRP kann eine oder mehrere der Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form des TFSRP hemmen. Zum Beispiel kann der TFSRP-Antagonist ein stromabwärts oder stromaufwärts gelegenes Element der Stoffwechselkaskade der Zellmembrankomponente, die TFSRP umfasst, kompetitiv binden, oder an ein TFSRP binden, das den Transport von Verbindungen über solche Membranen vermittelt und dadurch das Vorkommen von Translokation verhindert.
Nukleinsäuremoleküle, die natürlichen Allelvarianten und Analoga, Orthologen und Paralogen einer TFSRP-cDNA entsprechen, können auf Grundlage ihrer Identität zu hierin beschriebenen TFSRP-Nukleinsäuren aus Physcomitrella patens unter Verwendung von TFSRP-cDNAs oder einem Abschnitt davon als Hybridisierungssonde gemäß Standardhybridisierungsmethoden unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden. In einer alternativen Ausführungsform können Homologe von TFSRP durch Durchmustern kombinatorischer Bibliotheken von Mutanten, z.B. Trunkation-Mutanten, von TFSRP im Hinblick auf TFSRP-Agonist- oder -Antagonistaktivität identifiziert werden. In einer Ausführungsform wird eine vielfältige Bibliothek von TFSRP- Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäureebene erzeugt und durch eine vielfältige Genbibliothek kodiert. Eine vielfältige Bibliothek von TFSRP-Varianten kann zum Beispiel durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide in Gensequenzen hergestellt werden, so dass ein degenerierter Satz möglicher TFSRP-Sequenzen als einzelne Polypeptide exprimierbar ist, oder dass alternativ ein Satz großer Fusionsproteine (z.B. zum Phage-Display), der den Satz von TFSRP-Sequenzen darin enthält, exprimierbar ist. Es besteht eine Vielfalt an Verfahren, die zur Herstellung von Bibliotheken potenzieller TFSRP-Homologen aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz verwendet werden kann. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem automatisierten DNA-Synthesizer durchgeführt werden, und das synthetische Gen wird anschließend in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert. Die Verwendung eines degenerierten Satzes von Genen ermöglicht die Bereitstellung der gesamten Sequenzen in einem Gemisch, die für den gewünschten Satz möglicher TFSRP-Sequenzen kodieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind im Fachbereich bekannt (siehe z.B. Narang, S. A., 1983 Tetrahedron 39: 3; Itakura et al., 1984 Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., 1984 Science 198: 1056; Ike et al., 1983 Nucleic Acid Res. 11: 477).
Zusätzlich können Bibliotheken von Fragmenten der für TFSRP-kodierenden Regionen zur Erzeugung einer vielfältigen Population von TFSRP-Fragmenten zum Durchmustern und zur anschließenden Auswahl von Homologen eines TFSRP verwendet werden. In einer Ausführungsform kann eine Bibliothek kodierender Sequenzfragmente durch Behandeln eines doppelsträngigen PCR-Fragments einer für TFSRP kodierenden Sequenz mit einer Nuklease unter Bedingungen erzeugt werden, wobei ein Schnitt nur etwa einmal pro Molekül auftritt, Denaturieren der doppelsträngigen DNA, Renaturieren der DNA zur Bildung einer doppelsträngigen DNA, welche Sense/Antisense-Paare aus verschiedenen geschnittenen Produkten umfassen kann, Entfernen der einzelsträngigen Abschnitte der wiedergebildeten Duplexe durch Behandlung mit S1-Nuklease und Ligieren der sich ergebenden Fragmentbibliothek in einen Expressionsvektor. Durch dieses Verfahren kann eine Expressionsbibliothek abgeleitet werden, die für N-terminale, C-terminale und innere Fragmente von verschiedenen Größen des TFSRP kodiert.
Verschiedene Methoden zum Durchmustern von Genprodukten aus kombinatorischen Bibliotheken, welche durch Punktmutation oder Trunkation hergestellt wurden, und zum Durchmustern von cDNA-Bibliotheken nach Genprodukten mit einer ausgewählten Eigenschaft sind im Fachbereich bekannt. Solche Methoden können zum schnellen Durchmustern von Genbibliotheken, die durch kombinatorische Mutagenese von TFSRP-Homologen erzeugt werden, angepasst werden. Die am weitesten verbreiteten Methoden, welche für eine Hochdurchsatz-Analyse zum Durchmustern großer Genbibliotheken zugänglich sind, umfassen üblicherweise Klonieren der Genbibliothek in replizierbare Expressionsvektoren, Transformieren geeigneter Zellen mit der sich ergebenden Bibliothek von Vektoren und Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter welchen der Nachweis einer gewünschten Aktivität die Isolierung des Vektors ermöglicht, der für das Gen kodiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde. Rekursive Ensemble-Mutagenese (recursive ensemble mutagenesis; REM), eine neue Methode, die die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Bibliotheken verstärkt, kann in Kombination mit den Durchmusterungsassays zur Identifizierung von TFSRP-Homologen verwendet werden (Arkin und Yourvan, 1992 PNAS 89: 7811–7815; Delgrave et al., 1993 Protein Engineering 6(3): 327–331). In einer weiteren Ausführungsform können Assays auf Zellgrundlage zum Analysieren einer vielfältigen TFSRP-Bibliothek unter Verwendung von im Fachbereich wohl bekannten Techniken verwendet werden. Ein Verfahren zur Identifizierung eines neuen TFSRP umfasst (a) Erzeugen einer spezifischen Antikörperreaktion auf ein TFSRP oder ein Fragment davon hin, wie es oben beschrieben ist; (b) Durchmustern von mutmaßlichem TFSRP-Material mit dem Antikörper, wobei spezifisches Binden des Antikörpers an das Material auf das Vorliegen eines potenziellen neuen TFSRPs hindeutet; und (c) Analysieren des gebundenen Materials im Vergleich zu bekanntem TFSRP zur Bestimmung von dessen Neuheit.
Zur Bestimmung der prozentualen Homologie von zwei Aminosäuresequenzen (z.B. die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 20 oder einer Mutantenform davon) werden die Sequenzen zu optimalen Vergleichszwecken aneinander gefügt (z.B. können für ein optimales Alignment mit dem anderen Protein oder der anderen Nukleinsäure Lücken in die Sequenz eines Proteins oder einer Nukleinsäure eingeführt werden). Die Aminosäurereste an entsprechenden Aminosäurepositionen werden anschließend verglichen. Wenn eine Position in einer Sequenz (z.B. die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 20) durch denselben Aminosäurerest wie die entsprechende Position in der anderen Sequenz besetzt ist (z.B. eine Mutantenform der Sequenz aus dem Polypeptid gemäß SEQ ID NO: 20), dann sind die Moleküle an dieser Position homolog (d.h. wie hierin verwendet, entspricht Aminosäure- oder Nukleinsäure-"Homologie" Aminosäure- oder Nukleinsäure-"Identität"). Dieselbe Vergleichsart kann zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen durchgeführt werden.
Die prozentuale Homologie zwischen den zwei Sequenzen stellt eine Funktion der Anzahl an identischen Positionen dar, die die Sequenzen gemeinsam haben (d.h. % Homologie = Anzahl identischer Positionen/Gesamtzahl an Positionen × 100). Die Aminosäuresequenzen, die von der vorliegenden Erfindung umfasst sind, sind zu der gesamten, in SEQ ID NO: 20 gezeigten Aminosäuresequenz mindestens etwa 60%, bevorzugt mindestens etwa 60–70%, und stärker bevorzugt mindestens etwa 70–80%, 80–90%, 90–95% und am stärksten bevorzugt mindestens etwa 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr homolog. In noch einer anderen Ausführungsform sind mindestens etwa 60%, bevorzugt mindestens etwa 60–70%, und stärker bevorzugt mindestens etwa 70–80%, 80–90%, 90–95% und am stärksten bevorzugt mindestens 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr der gesamten Aminosäuresequenz, die durch eine in SEQ ID NO: 12 gezeigte Aminosäuresequenz kodiert wird, homolog. In anderen Ausführungsformen beträgt die bevorzugte Länge an Sequenzvergleich für Proteine mindestens 15 Aminosäurereste, stärker bevorzugt mindestens 25 Aminosäurereste und am stärksten bevorzugt mindestens 35 Aminosäurereste.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung eine Nukleotidsequenz, welche mindestens etwa 60%, bevorzugt mindestens etwa 60–70%, stärker bevorzugt mindestens etwa 70–80%, 80–90%, oder 90–95%, und noch stärker bevorzugt mindestens etwa 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr zu einer in SEQ ID NO: 12 gezeigten Nukleinsäuresequenz oder einem Abschnitt davon homolog ist. Die bevorzugte Länge an Sequenzvergleich für Nukleinsäuren beträgt mindestens 75 Nukleotide, stärker bevorzugt mindestens 100 Nukleotide und am stärksten bevorzugt die gesamte kodierende Region.
Es ist ebenso bevorzugt, dass das homologe Nukleinsäuremolekül für ein Protein oder einen Abschnitt davon kodiert, welcher eine Aminosäuresequenz umfasst, welche zu einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 20 ausreichend homolog ist, so dass das Protein oder der Abschnitt davon dieselbe oder eine ähnliche Funktion wie die Aminosäuresequenz beibehält, mit welcher sie verglichen wird. Funktionen der TFSRP-Aminosäuresequenzen umfassen die Fähigkeit zur Teilnahme an einer Toleranzreaktion gegenüber Stress in einer Pflanze, oder insbesondere zur Teilnahme an der Transkription eines Proteins, welches an einer Toleranzreaktion gegenüber Stress in einer Physcomitrella patens-Pflanze beteiligt ist. Ein Beispiel solcher Aktivitäten ist in Tabelle 1 beschrieben.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Verfahren kann eine Bestimmung der prozentualen Homologie zwischen zwei Sequenzen unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus durchgeführt werden. Ein bevorzugtes, nicht einschränkendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus, welches für den Vergleich von zwei Sequenzen verwendet wurde, stellt der Algorithmus von Karlin und Altschul dar (1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873–5877). Ein solcher Algorithmus ist in den NBLAST- und XBLAST-Programmen von Altschul, et al. (1990 J. Mol. Biol. 215: 403–410) berücksichtigt.
Zum Erhalten von Nukleinsäuresequenzen, die zu den TFSRP-Nukleinsäuremolekülen der Erfindung homolog sind, können BLAST-Nukleinsäure-Suchen mit dem NBLAST-Programm, Score = 100, Wortlänge = 12, durchgeführt werden. Zum Erhalten von Aminosäuresequenzen, die zu TFSRPs der vorliegenden Erfindung homolog sind, können zusätzlich BLAST-Protein-Suchen mit dem XBLAST-Programm, Score = 50, Wortlänge = 3, durchgeführt werden. Zum Erhalten von Alignments mit Lücken für Vergleichszwecke kann Gapped BLAST verwendet werden, wie es in Altschul et al. (1997 Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402) beschrieben ist. Bei Verwendung von BLAST- und Gapped BLAST-Programmen können die Fehlerparameter der entsprechenden Parameter (z.B. XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Ein weiteres bevorzugtes nicht-einschränkendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus, der zum Vergleich von Sequenzen verwendet wird, stellt der Algorithmus von Myers und Miller (CABIOS 1989) dar. Ein solcher Algorithmus ist in dem ALIGN-Programm (Version 2.0) berücksichtigt, welches Teil des GCG-Sequenz-Alignments-Software-Pakets ist. Bei Verwendung des ALIGN-Programms zum Vergleich von Aminosäuresequenzen, kann eine PAM120-Gewichtungstabelle (weight residue table), eine Strafe für Lückenlängen (gap length penalty) von 12 und eine Lückenstrafe (gap penalty) von 4 zum Erhalten von Aminosäuresequenzen verwendet werden, die zu den TFSRPs der vorliegenden Erfindung homolog sind. Zum Erhalten von Alignments mit Lücken (gapped alignments) für Vergleichszwecke kann Gapped BLAST, wie in Altschul et al. (1997 Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402) beschrieben, verwendet werden. Bei Verwendung von BLAST- und Gapped BLAST-Programmen können die Fehlerparameter der entsprechenden Programme (z.B. XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Ein weiteres bevorzugtes nicht-einschränkendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus, der zum Vergleich von Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus von Myers und Miller (CABIOS 1989). Ein solcher Algorithmus ist in dem ALIGN-Programm (Version 2,0) berücksichtigt, welches Teil des GCG-Sequenz-Alignment-Software-Pakets ist. Bei Verwendung des ALIGN-Programms zum Vergleich von Aminosäuresequenzen kann eine PAM120-Gewichtungstabelle (weight residue table), eine Strafe für Lückenlängen (gap length penalty) von 12 und eine Lückenstrafe (gap penalty) von 4 verwendet werden.
Schließlich kann Homologie zwischen Nukleinsäuresequenzen auch unter Verwendung von dem Fachmann bekannten Hybridisierungsmethoden bestimmt werden. Entsprechend umfasst ein isoliertes Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, welche z.B. unter stringenten Bedingungen an die in SEQ ID NO: 12 gezeigte Nukleotidsequenz oder einen Abschnitt davon hybridisiert. Insbesondere ist ein isoliertes Nukleinsäuremolekül mindestens 15 Nukleotide lang und hybridisiert unter stringenten Bedingungen an das Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 12 umfasst. In weiteren Ausführungsformen ist die Nukleinsäure mindestens 30, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotide lang.
Wie hierin verwendet, soll die Bezeichnung „hybridisiert unter stringenten Bedingungen" Bedingungen zur Hybridisierung und Wasch-Schritte beschreiben, unter welchen Nukleotidsequenzen mit mindestens 60% Homologie zueinander üblicherweise aneinander hybridisiert bleiben. Bevorzugt sind die Bedingungen so gewählt, dass Sequenzen mit mindestens etwa 65%, stärker bevorzugt mit mindestens etwa 70% und noch stärker bevorzugt mit mindestens etwa 75% oder mehr Homologie zueinander üblicherweise aneinander hybridisiert bleiben. Solche stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und können in Current Protocols in Molecular Biology, 6.3.1–6.3.6, John Wiley & Sons, N. Y. (1989) nachgelesen werden. Ein bevorzugtes, nicht-einschränkendes Beispiel von stringenten Hybridisierungsbedingungen ist die Hybridisierung in 6 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Wasch-Schritten in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 50–65°C. Bevorzugt entspricht ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen an eine Sequenz gemäß SEQ ID NO: 12 hybridisiert, einem natürlich vorkommenden Nukleinsäuremolekül. Wie hierin verwendet, bezieht sich ein „natürlich vorkommendes" Nukleinsäuremolekül auf ein RNA- oder DNA-Molekül mit einer Nukleotidsequenz, die in Natur vorkommt (z.B. für ein natürliches Protein kodiert). In einer Ausführungsform kodiert die Nukleinsäure für ein natürlich vorkommendes TFSRP aus Physcomitrella patens.
Unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren und anderen dem Fachmann bekannten Verfahren kann ein Fachmann Homologe des TFSRP isolieren, welches eine in SEQ ID NO: 20 gezeigte Aminosäure umfasst, und der TFSRP-Nukleinsäuren, die die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 12 umfassen. Ein Teil dieser Homologen sind Allelvarianten. Wie hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung „Allelvariante" auf eine Nukleotidsequenz, die Polymorphismen enthält, welche zu Veränderungen in den Aminosäuresequenzen eines TFSRP führen und die innerhalb einer natürlichen Population (z.B. einer Pflanzenart oder -sorte) vorkommen. Solche natürlichen Allelvariationen können üblicherweise zu 1–5% Varianz in einer TFSRP-Nukleinsäure führen. Allelvarianten können durch Sequenzieren der Nukleinsäuresequenz von Interesse in einer Vielzahl von unterschiedlichen Pflanzen identifiziert werden, welche leicht unter Verwendung von Hybridisierungssonden zur Identifizierung desselben genetischen TFSRP-Locus in solchen Pflanzen ausgeführt werden können. Beliebige und sämtliche solcher Nukleinsäurevariationen und sich daraus ergebende Aminosäurepolymorphismen oder Variationen in einem TFSRP, die die Folge einer natürlichen Allelvariation sind, und solche, die die funktionelle Aktivität eines TFSRP nicht verändern, sollen innerhalb des Umfangs der Erfindung liegen.
Darüber hinaus sind Nukleinsäuremoleküle, die für TFSRPs aus derselben Art oder anderen Arten wie zum Beispiel TFSRP-Analoga, -Orthologe und -Paraloge kodieren, vorgesehen. Wie hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung „Analoga" auf zwei Nukleinsäuren, die dieselbe oder eine ähnliche Funktion aufweisen, die sich jedoch getrennt in nicht-verwandten Organismen entwickelt haben. Wie hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung „Orthologe" auf zwei Nukleinsäuren aus unterschiedlichen Arten, die sich jedoch durch Artbildung aus einem Gen von einem gemeinsamen Vorfahren entwickelt haben. Üblicherweise kodieren Orthologe für Proteine mit denselben oder ähnlichen Funktionen. Wie ebenso hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung „Paraloge" auf zwei Nukleinsäuren, die durch Duplikation innerhalb eines Genoms miteinander in Beziehung stehen. Paraloge weisen üblicherweise unterschiedliche Funktionen auf, diese Funktionen können jedoch miteinander in Beziehung stehen (Tatusov, R. L. et al. 1997 Science 278 (5338): 631–637). Analoga, Orthologe und Paraloge eines natürlich vorkommenden TFSRP können sich durch post-translationale Modifizierungen, durch Unterschiede in der Aminosäuresequenz, oder durch beides, unterscheiden. Post-translationale Modifizierungen umfassen chemische Derivatisierung von Polypeptiden, z.B. Acetylierung, Carboxylierung, Phosphorylierung oder Glycosylierung in vivo und in vitro, und solche Modifizierungen können während Polypeptidsynthese oder Prozessierung oder im Anschluss an Behandlung mit isolierten modifizierenden Enzymen vorkommen. Insbesondere weisen Orthologe der Erfindung im Allgemeinen mindestens 80–85%, stärker bevorzugt 90%, und am stärksten bevorzugt 95%, 96%, 97%, 98% oder sogar 99% Identität oder Homologie mit der gesamten oder einem Teil einer natürlich vorkommenden TFSRP-Aminosäuresequenz auf und weisen eine Funktion auf, die einem TFSRP ähnlich ist. Orthologe der vorliegenden Erfindung sind auch bevorzugt in der Lage, an Stressreaktion in Pflanzen teilzunehmen. In einer Ausführungsform behalten die TFSRP-Orthologe die Fähigkeit zur Teilnahme am Stoffwechsel von Verbindungen bei, die zur Konstruktion von zellulären Membranen in Physcomitrella patens oder zum Transport von Molekülen über diese Membranen erforderlich sind.
Zusätzlich zu natürlich vorkommenden Varianten einer TFSRP-Sequenz, die in einer Population vorkommen können, versteht der Fachmann ferner, dass Veränderungen durch Mutation in einer Nukleotidsequenz, wie zum Beispiel der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 12 eingeführt werden können und dabei zu Veränderungen der Aminosäuresequenz des kodierten TFSRP führen, ohne dabei die funktionelle Fähigkeit von TFSRP zu verändern. Zum Beispiel können Nukleotidsubstitutionen, die an „nicht-essentiellen" Aminosäureresten zu Aminosäuresubstitutionen führen, in den Proteinen einschließlich einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 12 durchgeführt werden. Ein „nicht-essentieller" Aminosäurerest ist ein Rest, der in der Wildtyp-Sequenz von einem der TFSRPs ohne Veränderung der Aktivität des TFSRP verändert werden kann, wohingegen ein „essentieller" Aminosäurerest für die TFSRP-Aktivität erforderlich ist. Andere Aminosäurereste sind jedoch wahrscheinlich nicht für die Aktivität essentiell (z.B. diejenigen, die in der Domäne mit TFSRP-Aktivität nicht oder nur semi-konserviert sind) und sind daher wahrscheinlich ohne Veränderung der TFSRP-Aktivität einer Veränderung zugänglich.
Entsprechend betrifft ein weiterer Aspekt der Erfindung Nukleinsäuremoleküle, die für TFSRPs kodieren, welche Veränderungen in Aminosäureresten enthalten, die für die TFSRP-Aktivität nicht essentiell sind. Solche TFSRPs unterscheiden sich in der Aminosäuresequenz von einer Sequenz, die in SEQ ID NO: 20 enthalten ist, behalten jedoch mindestens eine der hierin beschriebenen TFSRP-Aktivitäten bei. In einer Ausführungsform umfasst das isolierte Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die für ein Protein kodiert, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz umfasst, welche zu einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 20 mindestens 60% homolog ist. Bevorzugt ist das Protein, welches durch das Nukleinsäuremolekül kodiert wird, mindestens 60% zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 20 homolog, stärker bevorzugt mindestens etwa 60–70% zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 20 homolog, noch stärker bevorzugt mindestens etwa 70–80%, 80–90%, 90–95% zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 20 homolog, und am stärksten bevorzugt mindestens 96%, 97%, 98% oder 99% zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 20 homolog. Die bevorzugten TFSRP-Homologe der vorliegenden Erfindung sind zur Teilnahme an der Toleranzreaktion gegenüber Stress in einer Pflanze in der Lage, stärker bevorzugt zur Teilnahme an der Transkription eines Proteins, welches in einer Physcomitrella patens-Pflanze an einer Toleranzreaktion gegenüber Stress beteiligt ist, oder sie weisen eine oder mehrere in Tabelle 1 dargelegte Aktivitäten auf.
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches für ein TFSRP kodiert, das zu einer Proteinsequenz gemäß SEQ ID NO: 20 homolog ist, kann durch Einführen einer oder mehrerer Nukleotidsubstitutionen, Additionen oder Deletionen in eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 12 so erzeugt werden, dass eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, Additionen oder Deletionen in das kodierte Protein eingeführt werden. Mutationen können mittels Standardmethoden, wie zum Beispiel ortsspezifischer Mutagenese und PCR-vermittelter Mutagenese eingeführt werden. Vorzugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einem oder mehreren vorhergesagten nicht-essentiellen Aminosäureresten durchgeführt. Eine „konservative Aminosäuresubstitution" ist eine solche, in welcher der Aminosäurerest mit einem Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ersetzt wird.
Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten sind im Fachbereich definiert worden. Diese Familien umfassen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z.B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z.B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z.B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), nicht-polaren Seitenketten (z.B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), beta-verzweigten Seitenketten (z.B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z.B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin). Daher wird ein vorhergesagter nicht-essentieller Aminosäurerest in einem TFSRP vorzugsweise mit einem weiteren Aminosäurerest aus derselben Seitenkettenfamilie ersetzt. Alternativ können in einer weiteren Ausführungsform Mutationen zufällig über die gesamte oder einen Teil einer für TFSRP-kodierenden Sequenz eingeführt werden, wie zum Beispiel durch Sättigungsmutagenese, und die sich ergebenden Mutanten können nach hierin beschriebener TFSRP-Aktivität zur Identifizierung von Mutanten, die TFSRP-Aktivität beibehalten, durchmustert werden. Im Anschluss an die Mutagenese der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 12 kann das kodierte Protein rekombinant exprimiert werden, und die Aktivität des Proteins kann durch Analysieren der Toleranz gegenüber Stress einer Pflanze bestimmt werden, die das wie in Beispiel 7 beschriebene Protein exprimiert.
Zusätzlich zu den für TFSRPs kodierenden Nukleinsäuremolekülen, die oben beschrieben wurden, betrifft ein weiterer Aspekt der Erfindung isolierte Nukleinsäuremoleküle, die antisense dazu sind. Eine „Antisense"-Nukleinsäure umfasst eine Nukleotidsequenz, die zu einer für ein Protein kodierenden „Sense"-Nukleinsäure komplementär ist, z.B. komplementär zu dem kodierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Sequenz. Entsprechend kann eine Antisense-Nukleinsäure über Wasserstoffbrückenbindungen an eine Sense-Nukleinsäure binden. Die Antisense-Nukleinsäure kann zu einem vollständigen, für TFSRP-kodierenden Strang oder nur zu einem Abschnitt davon komplementär sein. In einer Ausführungsform ist ein Antisense-Nukleinsäuremolekül zu einer „kodierenden Region" des kodierenden Strangs einer Nukleotidsequenz, welche für ein TFSRP kodiert, antisense. Die Bezeichnung „kodierende Region" bezieht sich auf die Region der Nukleotidsequenz, welche Kodons umfasst, die in Aminosäurereste translatiert werden (z.B. die vollständige kodierende Region von ,,,,, umfasst Nukleotide 1 bis ....). In einer weiteren Ausführungsform ist das Antisense-Nukleinsäuremolekül zu einer „nicht-kodierenden Region" des kodierenden Strangs einer Nukleotidsequenz, die für ein TFSRP kodiert, antisense. Die Bezeichnung „nicht-kodierende Region" bezieht sich auf 5'- und 3'-Sequenzen, welche an die kodierende Region angrenzen und welche nicht in Aminosäuren translatiert werden (d.h. auch als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen bezeichnet).
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nukleinsäuremolekül der Erfindung ein Nukleinsäuremolekül, welches ein Komplement zu der in SEQ ID NO: 12 gezeigten Nukleotidsequenz oder eines Abschnitts davon ist. Ein Nukleinsäuremolekül, welches zu der in SEQ ID NO: 12 gezeigten Nukleotidsequenz komplementär ist, ist ein solches, welches ausreichend komplementär zu der in SEQ ID NO: 12 gezeigten Nukleotidsequenz ist, so dass es an die Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 12 hybridisieren und dabei ein stabiles Duplex bilden kann.
Wenn die hierin offenbarten Sequenzen des kodierenden Strangs, welche für TFSRP kodieren, vorliegen (z.B. die in SEQ ID NO: 12 dargelegte Sequenz), können Antisense-Nukleinsäuren der Erfindung gemäß den Basenpaarungsregeln von Watson und Crick entworfen werden. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann zu der vollständigen kodierenden Region der TFSRP-mRNA komplementär sein, stärker bevorzugt ist jedoch ein Oligonukleotid, welches nur zu einem Abschnitt der kodierenden oder nicht-kodierenden Region der TFSRP-mRNA antisense ist. Zum Beispiel kann das Antisense-Oligonukleotid zu der Region komplementär sein, die die Translations-Startstelle der TFSRP-mRNA umgibt. Ein Antisense-Oligonukleotid kann zum Beispiel etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotide lang sein.
Eine Antisense-Nukleinsäure der Erfindung kann unter Verwendung von chemischer Synthese und enzymatischer Ligationsreaktionen unter Verwendung von im Fachbereich bekannten Verfahren konstruiert werden. Zum Beispiel kann eine Antisense-Nukleinsäure (z.B. ein Antisense-Oligonukleotid) unter Verwendung von natürlich vorkommenden Nukleotiden oder verschieden modifizierten Nukleotiden, welche zur Steigerung der biologischen Stabilität der Moleküle oder zur Steigerung der physikalischen Stabilität des Duplex, das sich zwischen den Antisense- und Sense-Nukleinsäuren bildet, chemisch synthetisiert werden, zum Beispiel können Phosphorothioat-Derivate und Acridin-substituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele modifizierter Nukleotide, welche zur Erzeugung der Antisense-Nukleinsäure verwendet werden können, umfassen 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5- Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, Beta-D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, Beta-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure(v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure(v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (acp3)w, und 2,6-Diaminopurin. Wahlweise kann die Antisense-Nukleinsäure biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors, in welchen eine Nukleinsäure in Antisense-Orientierung subkloniert worden ist, hergestellt werden (d.h. RNA, welche von der insertierten Nukleinsäure transkribiert wurde, befindet sich in Antisense-Orientierung zu einer Zielnukleinsäure von Interesse, was in dem nachfolgenden Unterabschnitt näher beschrieben ist.
Die Antisense-Nukleinsäuremoleküle der Erfindung werden üblicherweise derart an eine Zelle verabreicht oder in situ erzeugt, dass sie mit zellulärer mRNA und/oder genomischer DNA, die für ein TFSRP kodieren, hybridisieren oder daran binden, um so die Expression des Proteins zu hemmen, z.B. durch Hemmung der Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch herkömmliche Nukleotidkomplementarität unter Ausbildung einer stabilen Duplex erfolgen oder, zum Beispiel, für den Fall eines Antisense-Nukleinsäuremoleküls, welches an DNA-Duplexe bindet, durch spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix. Das Antisense-Molekül kann so modifiziert werden, dass es spezifisch an einen Rezeptor oder an ein Antigen, welche auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, bindet, z.B. durch Verknüpfen des Antisense-Nukleinsäuremoleküls mit einem Peptid oder einem Antikörper, welcher an einen Zelloberflächenrezeptor oder an ein Antigen bindet. Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch unter Verwendung der hierin beschriebenen Vektoren an Zellen abgegeben werden. Zum Erreichen von ausreichenden intrazellulären Konzentrationen der Antisense-Moleküle sind Vektorkonstrukte bevorzugt, in welchen das Antisense-Nukleinsäuremolekül unter der Kontrolle eines starken prokaryotischen, viralen oder eukaryotischen (einschließlich pflanzlichen) Promotors angeordnet ist.
In noch einer weiteren Ausführungsform ist das Antisense-Nukleinsäuremolekül ein α-anomerisches Nukleinsäuremolekül. Ein α-anomerisches Nukleinsäuremolekül bildet mit komplementärer RNA spezifische doppelsträngige Hybride, in welchen, im Gegensatz zu den üblichen β-Einheiten, die Stränge jeweils parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al., 1987 Nucleic Acids. Res. 15: 6625–6641). Das Antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al., 1987 Nucleic Acids Res. 15: 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon (Inoue et al., 1987 FEBS Lett. 215: 327–330) umfassen.
In noch einer weiteren Ausführungsform ist eine Antisense-Nukleinsäure der Erfindung ein Ribozym. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonukleaseaktivität, welche in der Lage sind, eine einzelsträngige Nukleinsäure, wie zum Beispiel eine mRNA, gegenüber welchen sie eine Komplementärregion aufweisen, zu spalten. Daher können Ribozyme (z.B. Hammerhead-Ribozyme, beschrieben in Haselhoff und Gerlach, 1988 Nature 334: 585–591) zur katalytischen Spaltung von TFSRP-mRNA-Transkripten verwendet werden, um so die Translation von TFSRP-mRNA zu hemmen. Ein Ribozym mit Spezifität für eine für TFSRP kodierende Nukleinsäure kann auf Grundlage der Nukleotidsequenz einer TFSRP-cDNA, wie hierin offenbart, entworfen werden (d.h. SEQ ID NO: 12) oder auf Grundlage einer heterologen Sequenz, die gemäß den hierin in dieser Erfindung gelehrten Verfahren zu isolieren ist. Zum Beispiel kann ein Derivat von Tetrahymena L-19 IVS RNA konstruiert werden, wobei die Nukleotidsequenz der aktiven Stelle zu der zu spaltenden Nukleotidsequenz in einer für TFSRP kodierenden RNA komplementär ist. Siehe z.B. Cech et al. U.S.-Patent Nr. 4,987,071 und Cech et al. U.S.-Patent Nr. 5,116,742. Wahlweise kann TFSRP-mRNA zum Auswählen einer katalytischen RNA mit einer spezifischen Ribonukleaseaktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen verwendet werden. Siehe z.B. Bartel, D. und Szostak, J. W., 1993 Science 261: 1411–1418.
Wahlweise kann die TFSRP-Genexpression durch Zielstruktur-Nukleotidsequenzen, die zu der regulatorischen Region einer TFSRP-Nukleotidsequenz komplementär sind (z.B. ein TFSRP-Promotor und/oder -Enhancer) gehemmt werden, um tripel-helikale Strukturen zu bilden, die die Transkription eines TFSRP-Gens in Zielzellen verhindern. Siehe allgemein Helene, C., 1991 Anticancer Drug Des. 6(6): 569–84; Helene, C. et al., 1992 Ann. N. Y. Acad. Sci. 660: 27–36; und Maher, L. J., 1992 Bioassays 14(12): 807–15.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen TFSRP-Nukleinsäuren und -Proteinen sind auch Nukleinsäuren und Proteine berücksichtigt, die an einen Rest angefügt sind. Diese Reste umfassen Detektionsreste, Hybridisierungsreste, Aufreinigungsreste, Abgabereste, Reaktionsreste, Bindungsreste und dergleichen, sind jedoch nicht darauf eingeschränkt. Eine übliche Nukleinsäuregruppe, die an einen Rest angefügt ist, sind Sonden und Primer. Die Sonde/der Primer umfasst üblicherweise eine Region einer Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen an mindestens etwa 12, bevorzugt etwa 25, stärker bevorzugt etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Sense-Strangs der in SEQ ID NO: 12 dargelegten Sequenz, eine Antisense-Sequenz der in SEQ ID NO: 12 dargelegten Sequenz oder natürlich vorkommende Mutanten davon umfasst. Primer auf Grundlage einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 12 können zur Klonierung von TFSRP-Homologen in PCR-Reaktionen verwendet werden. Sonden auf Grundlage der TFSRP-Nukleotidsequenzen können zum Nachweisen von Transkripten oder genomischen Sequenzen verwendet werden, die für dieselben oder homologe Proteine kodieren. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Sonde weiterhin eine daran angefügte Markierungsgruppe, z.B. kann die Markierungsgruppe ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder ein Enzym-Cofaktor sein. Solche Sonden können als Teil eines genomischen Testmarkerkits zur Identifizierung von TFSRP-exprimierenden Zellen verwendet werden, wie beispielsweise durch Messen der Menge einer für ein TFSRP-kodierenden Nukleinsäure in einer Zellprobe, zum Beispiel durch Nachweisen der TFSRP-mRNA-Mengen oder durch Bestimmen, ob ein genomisches TFSRP-Gen mutiert oder deletiert worden ist.
Ein besonders geeignetes Verfahren zur Bestimmung der Transkriptionsmenge des Gens (ein Indikator für die Menge an mRNA, die zur Translation zum Genprodukt hin zur Verfügung steht) stellt die Durchführung eines Northern Blots dar (zum Literaturhinweis siehe zum Beispiel Ausubel et al., 1988 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York). Diese Information zeigt zumindest teilweise das Ausmaß an Transkription des transformierten Gens. Zelluläre Gesamt-RNA kann aus Zellen, Geweben oder Organen mittels verschiedener Verfahren, welche im Fachbereich wohlbekannt sind, wie zum Beispiel dasjenige, welches in Bormann, E. R. et al., 1992 Mol. Microbiol. 6: 317–326 beschrieben ist, hergestellt werden. Zur Bestimmung des Vorliegens oder der relativen Proteinmenge, die aus dieser mRNA translatiert wurde, können Standardmethoden, wie zum Beispiel ein Western Blot, eingesetzt werden. Diese Methoden sind einem Fachmann wohlbekannt (siehe zum Beispiel Ausubel et al., 1988 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York).
Die Erfindung stellt weiterhin einen isolierten rekombinanten Expressionsvektor bereit, der eine wie oben beschriebene TFSRP-Nukleinsäure umfasst, wobei die Expression des Vektors in einer Wirtszelle im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Wirtszelle zu gesteigerter Toleranz gegenüber Stress durch Trockenheit führt. Wie hierin verwendet, bezieht sich die Bezeichnung „Vektor" auf ein Nukleinsäuremolekül, das in der Lage ist, eine andere Nukleinsäure, mit welcher es verknüpft worden ist, zu transportieren. Eine Vektorart ist ein „Plasmid", welches sich auf eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife, in welche zusätzliche Segmente ligiert werden können, bezieht. Eine andere Vektorart ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren sind zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle in der Lage, in welche sie eingeführt werden (z.B. bakterielle Vektoren mit einem bakteriellen Replikationsursprung und episomale Säugervektoren). Andere Vektoren (z.B. nicht-episomale Säugervektoren) werden in das Genom einer Wirtszelle nach Einführung in die Wirtszelle integriert und werden so zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Darüber hinaus sind bestimmte Vektoren in der Lage, die Expression von Genen, mit welchen sie operativ verknüpft sind, zu steuern. Solche Vektoren werden hierin als „Expressionsvektoren" bezeichnet. Im Allgemeinen liegen Expressionsvektoren zur Verwendung bei rekombinanten DNA-Methoden oft in Form von Plasmiden vor. In der vorliegenden Beschreibung können „Plasmid" und „Vektor" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Form eines Vektors darstellt. Es ist jedoch beabsichtigt, dass die Erfindung auch andere Formen von Expressionsvektoren umfasst, wie zum Beispiel virale Vektoren (z.B. replikationsdefekte Retroviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren), welche den gleichen Funktionen dienen.
Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung umfassen eine Nukleinsäure der Erfindung in einer Form, welche zur Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle geeignet ist, was bedeutet, dass die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere regulatorische Sequenzen umfassen, welche auf Grundlage der zur Expression zu verwendenden Wirtszellen ausgewählt sind, welche operativ mit der zu exprimierenden Nukleinsäure verknüpft sind. Innerhalb eines rekombinanten Expressionsvektors soll „operativ verknüpft" bedeuten, dass die Nukleotidsequenz von Interesse mit der/den regulatorischen Sequenz(en) in einer Art und Weise verknüpft ist/sind, welche die Expression der Nukleotidsequenz ermöglicht (z.B. in einem in vitro-Transkriptions-/ Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingeführt wird). Die Bezeichnung „regulatorische Sequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (z.B. Polyadenylierungssignale) umfassen. Solche regulatorische Sequenzen sind beispielsweise in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) beschrieben oder siehe: Gruber und Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Hrgs. Glick und Thompson, Kapitel 7, 89–108, CRC Press: Boca Raton, Florida, einschließlich der Referenzen darin. Regulatorische Sequenzen umfassen diejenigen, die die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Arten von Wirtszellen steuern sowie diejenigen, welche die direkte Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen oder unter bestimmten Bedingungen steuern. Der Fachmann erkennt, dass der Entwurf des Expressionsvektors von solchen Faktoren, wie der Auswahl der zu transformierenden Wirtszelle, der Expressionsmenge des gewünschten Proteins etc. abhängig sein kann. Die Expressionsvektoren der Erfindung können in Wirtszellen eingeführt werden, um so Proteine oder Peptide einschließlich Fusionsproteine oder Peptide herzustellen, die durch eine Nukleinsäure, wie hierin beschrieben, kodiert sind (z.B. TFSRP, mutante Formen von TFSRP, Fusionsproteine etc.).
Die rekombinanten Expressionsvektoren der Erfindung können zur Expression von TFSRP in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen entworfen werden. Zum Beispiel können TFSRP-Gene in bakteriellen Zellen wie zum Beispiel C. glutamicum, Insektenzellen (unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren), Hefe und anderen Pilzzellen (siehe Romanos, M. A. et al., 1992 Foreign gene expression in yeast: a review, Yeast 8: 423–488; van den Hondel, C. A. M. J. J. et al., 1991 Heterologous gene expression in filamentous fungi, in: More Gene Manipulations in Fungi, J. W. Bennet & L. L. Lasure, Hrgs., S. 396–428: Academic Press: San Diego; und van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J., 1991 Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J. F. et al., Hrgs., S. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge), Algen (Falciatore et al., 1999 Marine Biotechnology 1(3): 239–251), Wimperntierchen der Arten: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophyra, Potomacus, Pseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella und Stylonychia, insbesondere der Gattung Stylonychia lemnae mit Vektoren im Anschluss an ein Transformationsverfahren, wie es in WO 98/01572 beschrieben ist, und multizellulären Pflanzenzellen (siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L., 1988 High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants, Plant Cell Rep. 583–586); Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Kapitel 6/7 S. 71–119 (1993); F. F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrgs. Kung und R. Wu, 128–43, Academic Press: 1993; Potrykus, 1991 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42: 205–225 und darin zitierte Referenzen) oder Säugerzellen exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden weiterhin in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press: San Diego, CA (1990) erörtert. Wahlweise kann der rekombinante Expressionsvektor in vitro transkribiert und translatiert werden, zum Beispiel unter Verwendung von regulatorischen T7-Promotor-Sequenzen und T7-Polymerase.
Die Expression von Proteinen in Prokaryoten wird oft mit Vektoren ausgeführt, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, welche entweder die Expression von Fusions- oder von Nicht-Fusionsproteinen steuern. Fusionsvektoren fügen eine Anzahl von Aminosäuren an ein darin kodiertes Protein hinzu, üblicherweise an den Aminoterminus des rekombinanten Proteins, jedoch auch an den C-Terminus oder fusioniert innerhalb geeigneter Regionen in den Proteinen. Solche Fusionsvektoren erfüllen üblicherweise drei Zwecke: 1) Das Steigern der Expression eines rekombinanten Proteins; 2) das Steigern der Löslichkeit eines rekombinanten Proteins; und 3) das Unterstützen der Reinigung eines rekombinanten Proteins durch Fungieren eines Ligands bei einer Affinitätsreinigung. In Fusionsexpressionsvektoren wird häufig eine proteolytische Spaltstelle an der Verbindung zwischen dem Fusionsrest und dem rekombinanten Protein eingefügt, um die Abtrennung des rekombinanten Proteins vom Fusionsrest im Anschluss an die Reinigung des Fusionsproteins zu ermöglichen. Solche Enzyme und ihre zugehörigen Erkennungssequenzen umfassen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase.
Übliche Fusionsexpressionsvektoren umfassen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. und Johnson, K. S., 1988 Gene 67: 31–40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), welche Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose-E-bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusionieren. In einer Ausführungsform wird die kodierende Sequenz des TFSRP zur Erzeugung eines Vektors in einen pGEX-Expressionsvektor kloniert, der für ein Fusionsprotein kodiert, welcher vom N-Terminus zum C-Terminus ein GST-Thrombin-Spaltstelle-X-Protein umfasst. Das Fusionsprotein kann durch Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung von Glutathion-Agaroseharz aufgereinigt werden. Nicht mit GST-fusioniertes rekombinantes TFSRP kann durch Abspalten des Fusionsproteins mit Thrombin gewonnen werden.
Beispiele geeigneter induzierbarer nicht-fusionierender E. coli-Expressionsvektoren umfassen pTrc (Amann et al., 1988 Gene 69: 301–315) und pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60–89). Die Zielgenexpression vom pTrc-Vektor beruht auf der Transkription eines Hybrid-trp-lac-Fusionspromotors durch die RNA-Polymerase des Wirts. Die Zielgenexpression vom pET 11d-Vektor beruht auf der Transkription eines T7 gn10-lac Fusionspromotors, welche von einer co-exprimierten viralen RNA-Polymerase (T7 gn1) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird durch die Wirtsstämme BL21(DE3) oder HMS174(DE3) von einem ansässigen λ-Prophagen, der ein T7 gn1-Gen unter der Transkriptionskontrolle des lacUV 5-Promotors trägt, zur Verfügung gestellt.
Eine Strategie zur Expressionsmaximierung des rekombinanten Proteins stellt das Exprimieren des Proteins in Wirtsbakterien dar, in welchen die Fähigkeit zur proteolytischen Spaltung des rekombinanten Proteins abgeschwächt ist (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119–128). Eine weitere Strategie stellt die Veränderung der Nukleinsäuresequenz der in einen Expressionsvektor zu insertierenden Nukleinsäure dar, so dass die einzelnen Codons für jede Aminosäure diejenigen sind, welche in dem Bakterium, das für die Expression ausgewählt ist, vorzugsweise verwendet werden, wie zum Beispiel C. glutamicum (Wada et al., 1992 Nucleic Acids Res. 20: 2111–2118). Solche Veränderungen der Nukleinsäuresequenzen der Erfindung können durch DNA-Standardsynthesemethoden ausgeführt werden.
In einer weiteren Ausführungsform stellt der TFSRP-Expressionsvektor einen Hefe-Expressionsvektor dar. Beispiele für Vektoren zur Expression in Hefe S. cerevisiae umfassen einen pYepSec1 (Baldari, et al., 1987 Embo J. 6: 229–234), pMFa (Kurjan und Herskowitz, 1982 Cell 30: 933–943), pJRY88 (Schultz et al., 1987 Gene 54: 113–123) und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren und Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, welche zur Verwendung in anderen Pilzen geeignet sind, wie zum Beispiel Fadenpilzen, umfassen diejenigen, die ausführlich beschrieben sind in: van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) „Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy, et al., Hrgs., S. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge.
Wahlweise können die TFSRPs der Erfindung in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren exprimiert werden. Baculovirus-Vektoren, welche zur Expression von Proteinen in kultivierten Insektenzellen (z.B. Sf 9-Zellen) erhältlich sind, umfassen die pAc-Serie (Smith et al., 1983 Mol. Cell Biol. 3: 2156–2165) und die pVL-Serie (Lucklow und Summers, 1989 Virology 170: 31–39).
In noch einer weiteren Ausführungsform wird eine TFSRP-Nukleinsäure der Erfindung in Säugerzellen unter Verwendung eines Säuger-Expressionsvektors exprimiert. Beispiele für Säuger-Expressionsvektoren umfassen pCDM8 (Seed, B., 1987 Nature 329: 840) und pMT2PC (Kaufman et al., 1987 EMBO J. 6: 187–195). Bei Verwendung in Säugerzellen werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors häufig durch virale regulatorische Elemente bereitgestellt. Zum Beispiel stammen häufig verwendete Promotoren von Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus und Simianvirus 40. Für weitere geeignete Expressionssysteme, sowohl für prokaryotische als auch für eukaryotische Zellen siehe Kapitel 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsh, E. F., und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
In einer weiteren Ausführungsform ist der rekombinante Säuger-Expressionsvektor in der Lage, die Expression der Nukleinsäure bevorzugt in einer bestimmten Zellart zu steuern (z.B. werden gewebespezifische regulatorische Elemente zur Expression der Nukleinsäure verwendet). Gewebespezifische regulatorische Elemente sind im Fachbereich bekannt. Nicht-einschränkende Beispiele geeigneter gewebespezifischer Promotoren umfassen den Albuminpromotor (leberspezifisch; Pinkert et al., 1987 Genes Dev. 1: 268–277), lymph-spezifische Promotoren (Calame und Eaton, 1988 Adv. Immunol. 43: 235–275), insbesondere Promotoren von T-Zell-Rezeptoren (Winoto und Baltimore, 1989 EMBO J. 8: 729–733) und Immunoglobuline (Banerji et al., 1983 Cell 33: 729–740; Queen und Baltimore, 1983 Cell 33: 741–748), neuronenspezifische Promotoren (z.B. der Neurofilament-Promotor; Byrne und Ruddle, 1989 PNAS 86: 5473–5477), Pankreas-spezifische Promotoren (Edlund et al., 1985 Science 230: 912–916) und Brustdrüsen-spezifische Promotoren (z.B. Milk whey-Promotor; U.S.-Patent Nr. 4,873,316 und Offenlegungsschrift der Europäischen Patentanmeldung Nr. 264,166). Entwicklungsspezifisch regulierte Promotoren sind ebenfalls umfasst, zum Beispiel die murinen Hox-Promotoren (Kessel und Gruss, 1990 Science 249: 374–379) und der Fetoprotein-Promotor (Campes und Tilghman, 1989 Genes Dev. 3: 537–546).
In einer weiteren Ausführungsform kann das TFSRP der Erfindung in einzelligen Pflanzenzellen (wie beispielsweise Algen) (siehe Falciatore et al., 1999 Marine Biotechnology 1(3): 239–251 und Referenzen darin) und Pflanzenzellen aus höheren Pflanzen (z.B. den Spermatophyten, wie zum Beispiel Nutzpflanzen) exprimiert werden. Beispiele für Pflanzenexpressionsvektoren umfassen diejenigen, die ausführlich beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. und Masterson, R., 1992 New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20: 1195–1197; und Bevan, M. W., 1984 Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12: 8711–8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Bd. 1, Engineering and Utilization, Hrgs.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38.
Eine Pflanzenexpressionskassette enthält bevorzugt regulatorische Sequenzen, die zum Steuern der Genexpression in Pflanzenzellen in der Lage sind und die derart operativ verknüpft sind, dass jede Sequenz ihre Funktion erfüllen kann, zum Beispiel die Termination der Transkription durch Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind diejenigen, die aus Agrobacterium tumefaciens-t-DNA stammen, wie zum Beispiel das Gen 3, bekannt als Octopinsynthase des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., 1984 EMBO J. 3: 835) oder funktionelle Äquivalente davon, jedoch sind auch sämtliche andere in Pflanzen funktionell aktive Terminatoren geeignet.
Da die Genexpression in Pflanzen sehr häufig nicht auf Transkriptionsebene eingeschränkt ist, enthält eine Pflanzenexpressionskassette bevorzugt andere operativ verknüpfte Sequenzen, wie zum Beispiel translationale Enhancer, beispielsweise die Overdrive-Sequenz, welche die 5'-untranslatierte Leadersequenz des Tabakmosaikvirus enthält, und das Verhältnis Protein-zu-RNA verbessert (Gallie et al., 1987 Nucl. Acids Research 15: 8693–8711).
Die Genexpression in Pflanzen muss operativ mit einem geeigneten Promotor verknüpft sein, welcher Genexpression in einer zeit-, zell- oder gewebespezifischen Art und Weise überträgt. Bevorzugt sind Promotoren, welche die konstitutive Expression steuern (Benfey et al., 1989 EMBO J. 8: 2195–2202) wie diejenigen, die von Pflanzenviren stammen, wie zum Beispiel der 35S CAMV (Franck et al., 1980 Cell 21: 285–294), der 19S CaMV (siehe auch U.S.-Patent Nr. 5352605 und PCT-Anmeldung Nr. WO 8402913) oder Pflanzenpromotoren wie diejenigen aus der kleinen Rubisco-Untereinheit, die in U.S.-Patent Nr. 4,962,028 beschrieben ist.
Weitere bevorzugte Sequenzen zur Verwendung in Pflanzengenexpressionskassetten sind Zielsequenzen, die zur Steuerung des Genprodukts in sein zugehöriges Zellkompartiment nötig sind (für eine Übersicht siehe Kermode, 1996 Crit. Rev. Plant Sci. 15(4): 285–423 und die darin zitierten Referenzen), wie zum Beispiel die Vakuole, den Nukleus, alle Arten von Plastiden wie Amyloplasten, Chloroplasten, Chromoplasten, den extrazellulären Raum, Mitochondrien, das endoplasmatische Reticulum, Ölkörperchen, Peroxisomen und andere Kompartimente von Pflanzenzellen.
Genexpression in Pflanzen kann auch durch einen induzierbaren Promotor ermöglicht werden (für eine Übersicht hierzu siehe Gatz, 1997 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89–108). Wenn die Genexpression in einer zeitspezifischen Weise erfolgen soll, sind insbesondere chemisch induzierbare Promotoren geeignet. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salicylsäure-induzierbarer Promotor (PCT-Anmeldung Nr. WO 95/19443), ein Tetracyclin-induzierbarer Promotor (Gatz et al., 1992 Plant J. 2: 397–404) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor (PCT-Anmeldung Nr. WO 93/21334).
Ebenfalls geeignete Promotoren, die auf biotische oder abiotische Stressbedingungen reagieren, sind solche wie beispielsweise der Pathogen-induzierbare PRP1-Genpromotor (Ward et al., 1993 Plant. Mol. Biol. 22: 361–366), der Wärme-induzierbare hsp80-Promotor aus Tomate (U.S.-Patent Nr. 5187267), der Kälte-induzierbare Alpha-Amylase-Promotor aus Kartoffel (PCT-Anmeldung Nr. WO 96/12814) oder der Wunden-induzierbare PinII-Promotor (Europäisches Patent Nr. 375091). Für andere Beispiele von Trockenheit-, Kälte- und Salz-induzierbaren Promotoren, wie beispielsweise dem RD29A-Promotor, siehe Yamaguchi-Shinozalei et al. (1993 Mol. Gen. Genet. 236: 331–340).
Insbesondere sind solche Promotoren bevorzugt, die in speziellen Geweben und Organen Genexpression übertragen, wie zum Beispiel Schließzellen und Haarwurzelzellen. Geeignete Promotoren umfassen den Napin-Genpromotor aus Raps (U.S.-Patent Nr. 5,608,152), den USP-Promotor aus Vicia faba (Baeumlein et al., 1991 Mol Gen Genet. 225(3): 459–67), den Oleosin-Promotor aus Arabidopsis (PCT-Anmeldung Nr. WO 98/45461), den Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris (U.S.-Patent Nr. 5,504,200), den Bce4-Promotor aus Brassica (PCT-Anmeldung Nr. WO 91/13980) oder den Legumin B4-Promotor (LeB4; Baeumlein et al., 1992 Plant Journal, 2(2): 233–9) sowie Promotoren, die in einkeimblättrigen Pflanzen wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis etc. eine Saatgut-spezifische Expression verleihen. Geeignete erwähnenswerte Promotoren sind der Ipt2- oder Ipt1-Genpromotor aus Gerste (PCT-Anmeldung Nr. WO 95/15389 und PCT-Anmeldung Nr. WO 95/23230) oder diejenigen, die in der PCT-Anmeldung Nr. WO 99/16890 beschrieben sind (Promotoren aus dem Hordein-Gen aus Gerste, dem Glutelin-Gen aus Reis, dem Oryzin-Gen aus Reis, dem Prolamin-Gen aus Reis, dem Gliadin-Gen aus Weizen, dem Glutelin-Gen aus Weizen, dem Zein-Gen aus Mais, dem Glutelin-Gen aus Hafer, dem Kasirin-Gen aus Sorghum und dem Secalin-Gen aus Roggen).
Besonders geeignet sind auch Promotoren, die Plastid-spezifische Genexpression übertragen, da Plastide das Kompartiment darstellen, worin Lipidbiosynthese auftritt. Geeignete Promotoren sind der virale RNA-Polymerasepromotor, der in der PCT-Anmeldung Nr. WO 95/16783 und der PCT-Anmeldung Nr. WO 97/06250 beschrieben ist, und der in der PCT-Anmeldung Nr. WO 99/46394 beschriebene clpP-Promotor aus Arabidopsis.
Die Erfindung stellt weiterhin einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der ein TFSRP-DNA-Molekül der Erfindung umfasst, der in Antisense-Orientierung in den Expressionsvektor kloniert wurde. Das heißt, dass das DNA-Molekül in einer solchen Art und Weise operativ mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft ist, die eine Expression (durch Transkription des DNA-Moleküls) eines RNA-Moleküls ermöglicht, welches antisense zu einer TFSRP-mRNA vorliegt. Es können regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die operativ mit einem in Antisense-Orientierung klonierten Nukleinsäuremolekül verknüpft sind, wobei die regulatorischen Sequenzen die kontinuierliche Expression des Antisense-RNA-Moleküls in einer Vielfalt von Zelltypen steuert. Zum Beispiel können virale Promotoren und/oder Enhancer oder regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die eine konstitutive, gewebespezifische oder Zelltyp-spezifische Expression der Antisense-RNA steuern. Der Antisense-Expressionsvektor kann in Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder abgeschwächten Virus vorliegen, in welchen Antisense-Nukleinsäuren unter der Kontrolle einer hocheffizienten regulatorischen Region erzeugt werden. Die Aktivität der regulatorischen Region kann durch die Zellart bestimmt werden, in welche der Vektor eingeführt wird. Für eine Diskussion zur Regulation von Genexpression unter Verwendung von Antisense-Genen siehe Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews – Trends in Genetics, Bd. 1(1) 1986 und Mol et al., 1990 FEBS Letters 268: 427–430.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Wirtszellen, in welche ein rekombinanter Expressionsvektor der Erfindung eingeführt worden ist. Die Bezeichnungen „Wirtszelle" und „rekombinante Wirtszelle" werden hierin austauschbar verwendet. Es ist selbstverständlich, dass sich die Bezeichnungen nicht nur auf den bestimmten Gegenstand Zelle beziehen, sondern auch die Nachkommenschaft oder die mögliche Nachkommenschaft einer solchen Zelle betreffen. Da in nachfolgenden Generationen bestimmte Modifizierungen entweder aufgrund von Mutation oder Umwelteinflüssen auftreten können, kann eine derartige Nachkommenschaft tatsächlich nicht zur Elternzelle identisch sein, ist aber immer noch vom Umfang der Bezeichnung, wie sie hierin verwendet wird, umfasst.
Eine Wirtszelle kann jede beliebige prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Zum Beispiel kann TFSRP in Bakterienzellen wie zum Beispiel C. glutamicum, Insektenzellen, Pilzzellen oder Säugerzellen (wie zum Beispiel Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters (CHO) oder COS-Zellen), Algen, Wimperntierchen, Pflanzenzellen, Pilzen oder anderen Mikroorganismen wie C. glutamicum exprimiert werden. Andere geeignete Wirtszellen sind dem Fachmann bekannt.
Vektor-DNA kann in prokaryotische oder eukaryotische Zellen mittels herkömmlicher Transformations- oder Transfektionsmethoden eingeführt werden. Wie hierin verwendet, sollen sich die Bezeichnungen „Transformation", „Transfektion", „Konjugation" und „Transduktion" auf eine Vielfalt von im Fachbereich bekannten Methoden zur Einführung von Fremdnukleinsäure (z.B. DNA) in eine Wirtszelle beziehen, einschließlich Calciumphosphat- oder Calciumchloridcopräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion, natürliche Kompetenz, chemisch-vermittelter Transfer- und Elektroporation. Geeignete Verfahren zum Transformieren oder Transfizieren von Wirtszellen einschließlich Pflanzenzellen können Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2. Ausgabe, Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Laborhandbüchern, wie zum Beispiel Methods in Molecular Biology, 1995, Bd. 44, Agrobacterium protocols, Hrsg.: Garland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey, entnommen werden. Da biotische und abiotische Toleranz gegenüber Stress ein allgemeines Merkmal ist, welches wünschenswerterweise auf eine breite Vielfalt von Pflanzen wie zum Beispiel Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Raps und Canola, Maniok, Pfeffer, Sonnenblume und Studentenblume, Nachtschattengewächse wie Kartoffel, Tabak, Aubergine, und Tomate, Vicia-Spezies, Erbse, Alfalfa, Buschgewächse (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Spezies, Bäumen (Ölpalme, Kokosnuss), perennierendes Gras und Futterpflanzen vererbt wird, sind diese Nutzpflanzen als eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auch bevorzugte Zielpflanzen für eine Genmanipulation.
Insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, die eine für ein TFSRP kodierende Nukleinsäure enthält, bereit, wobei die Expression der Nukleinsäure(n) in der Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanze zu einer gesteigerten Toleranz gegenüber Stress durch Trockenheit führt, umfassend: (a) Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor, der eine TFSRP-Nukleinsäure umfasst, und (b) Erzeugen einer transgenen Pflanze mit einer im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanze gesteigerten Toleranz gegenüber Stress durch Trockenheit aus der Pflanzenzelle. Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Steigerung der Expression eines Gens von Interesse in einer Wirtszelle im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Wirtszelle bereit, wobei das Gen von Interesse in Reaktion auf ein TFSRP transkribiert wird, umfassend: (a) Transformieren der Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der eine für TFSRP kodierende Nukleinsäure umfasst, und (b) Exprimieren des TFSRP innerhalb der Wirtszelle, wodurch die Expression des in Reaktion auf das TFSRP transkribierten Gens im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Wirtszelle gesteigert wird.
Für eine solche Pflanzentransformation können binäre Vektoren, wie beispielsweise pBinAR verwendet werden (Höfgen und Willmitzer, 1990 Plant Science 66: 221–230). Die Konstruktion der binären Vektoren kann durch Ligation der cDNA in Sense- oder Antisense-Orientierung in die T-DNA durchgeführt werden. Ein Pflanzenpromotor am 5'-Ende der cDNA aktiviert die Transkription der cDNA. Eine Polyadenylierungssequenz ist am 3'-Ende der cDNA positioniert. Gewebespezifische Expression kann unter Verwendung eines gewebespezifischen Promotors erreicht werden. Zum Beispiel kann eine Saatgut-spezifische Expression durch Klonierung des Napin- oder des LeB4- oder des USP-Promotors am 5'-Ende der cDNA erreicht werden. Ebenso kann jedes andere Saatgut-spezifische Promotorelement verwendet werden. Für eine konstitutive Expression innerhalb der gesamten Pflanze kann der CaMV 35S-Promotor verwendet werden. Unter Verwendung eines Signalpeptids, zum Beispiel für Plastiden, Mitochondrien oder für das endoplasmatische Reticulum kann das exprimierte Protein auf ein zelluläres Kompartiment ausgerichtet werden (Kermode, 1996 Crit. Rev. Plant Sci. 4(15): 285–423). Das Signalpeptid ist zum Erreichen einer subzellulären Lokalisierung des Fusionsproteins im Leseraster am 5'-Ende der cDNA kloniert. Zusätzlich können auf abiotischen Stress reagierende Promotoren, wie zum Beispiel der Arabidopsis-Promotor RD29A, für die hierin offenbarten Nukleinsäuresequenzen verwendet werden. Ein Fachmann erkennt, dass der verwendete Promotor so mit der Nukleinsäure operativ verknüpft werden sollte, dass der Promotor eine Transkription der Nukleinsäure verursacht, welche zur Synthese einer mRNA führt, die für ein Polypeptid kodiert. Wahlweise kann die RNA eine Antisense-RNA zur Verwendung bei der Beeinflussung der anschließenden Expression desselben oder eines anderen Gens oder von Genen sein.
Abwechselnde Verfahren zur Transfektion umfassen den direkten Transfer von DNA in sich entwickelnde Blumen über Elektroporation oder Agrobacterium-vermittelten Gentransfer. Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann unter Verwendung von zum Beispiel dem GV3101(pMP90) (Koncz und Schell, 1986 Mol. Gen. Genet. 204: 383–396) oder LBA4404 (Clontech) Agrobacterium tumefaciens-Stamm durchgeführt werden. Die Transformation kann durch Standardtransformations- und -regenerationsmethoden durchgeführt werden (Deblaere et al., 1994 Nucl. Acids. Res. 13: 4777–4788; Gelvin, Stanton B. und Schiperoort, Robert A., Plant Molecular Biology Manual, 2. Ausg. – Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. – in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R.; Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993. – 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Zum Beispiel kann Raps durch Cotyledon- oder Hypocotyl-Transformation transformiert werden (Moloney et al., 1989 Plant cell Report 8: 238–242; De Block et al., 1989 Plant Physiol. 91: 694–701). Die Verwendung von Antibiotika zur Agrobacterium- und Pflanzenselektion ist vom zur Transformation verwendeten binären Vektor und Agrobacterium-Stamm abhängig. Die Selektion von Raps wird üblicherweise unter Verwendung von Kanamycin als selektierbarer Pflanzenmarker durchgeführt. Agrobacterium-vermittelter Gentransfer kann zum Beispiel unter Verwendung einer Methode, welche durch Mlynarova et al., 1994 Plant Cell Report 13: 282–285 beschrieben wurde, durchgeführt werden. Zusätzlich kann eine Transformation von Sojabohne beispielsweise unter Verwendung einer in dem Europäischen Patent Nr. 0424 047, U.S.-Patent Nr. 5,322,783, Europäischem Patent Nr. 0397 687, U.S.-Patent Nr. 5,376,543 oder U.S.-Patent Nr. 5,169,770 durchgeführt werden. Transformation von Mais kann durch Partikelbeschuss, Polyethylenglycol-vermittelter DNA-Aufnahme oder durch die Siliciumcarbidfaser-Methode erreicht werden. (Siehe zum Beispiel Freeling und Walbot "The maize handbook" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Ein spezielles Beispiel zur Transformation von Mais ist in U.S.-Patent Nr. 5,990,387 beschrieben, und ein spezielles Beispiel für Transformation von Weizen kann der PCT-Anmeldung Nr. WO 93/07256 entnommen werden.
Von der stabilen Transfektion von Säugerzellen ist bekannt, dass in Abhängigkeit von dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionsmethode nur ein kleiner Teil von Zellen die Fremd-DNA in ihr Genom integrieren kann. Zur Identifizierung und zum Auswählen dieser Integranten wird üblicherweise ein Gen, welches für einen selektierbaren Marker (z.B. Resistenz gegenüber Antibiotika) kodiert, zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszellen eingeführt. Bevorzugte selektierbare Marker umfassen diejenigen, welche Resistenz gegenüber Wirkstoffen, wie zum Beispiel G418, Hygromycin und Methotrexat verleihen, oder welche in Pflanzen Resistenz gegenüber einem Herbizid, wie zum Beispiel Glyphosat oder Glufosinat verleihen. Nukleinsäuremoleküle, die für einen selektierbaren Marker kodieren, können auf dem selben Vektor wie derjenige, der für ein TFSRP kodiert, in eine Wirtszelle eingeführt werden oder sie können auf einem getrennten Vektor eingeführt werden. Mit dem eingeführten Nukleinsäuremolekül stabil transfizierte Zellen können zum Beispiel durch Wirkstoffselektion identifiziert werden (z.B. Zellen, die das selektierbare Markergen aufgenommen haben, überleben, während die anderen Zellen absterben).
Zur Erzeugung eines homologen rekombinanten Mikroorganismus wird ein Vektor hergestellt, der mindestens einen Abschnitt eines TFSRP-Gens enthält, in welches eine Deletion, Addition oder Substitution eingeführt worden ist, um so das TFSRP-Gen zu verändern, zum Beispiel funktionell zu stören. Bevorzugt ist das TFSRP-Gen ein Physcomitrella patens-TFSRP-Gen, es kann jedoch auch ein Homologes von einer verwandten Pflanze oder sogar von einer Säuger-, Hefe- oder Insektenquelle sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor so entworfen, dass das endogene TFSRP-Gen nach homologer Rekombination funktionell gestört ist (d.h. nicht mehr für ein funktionelles Protein kodiert; auch als Knock-Out-Vektor bezeichnet). Wahlweise kann der Vektor so entworfen sein, dass das endogene TFSRP-Gen nach homologer Rekombination mutiert ist oder auf andere Weise so verändert ist, dass es immer noch für ein funktionelles Protein kodiert (z.B. kann die stromaufwärts-gelegene regulatorische Region verändert werden, um so die Expression des endogenen TFSRP zu verändern). Zur Erzeugung einer Punktmutation durch homologe Rekombination können DNA-RNA-Hybride in einer Methode, welche als Chimeraplastie (chimeraplasty) bekannt ist, verwendet werden (Cole-Strauss et al., 1999 Nucleic Acids Research 27(5): 1323–1330 und Kmiec, 1999 Gene therapy American Scientist. 87(3): 240–247). Homologe Rekombinationsverfahren in Physcomitrella patens sind im Fachbereich ebenfalls bekannt und zur Verwendung hierin vorgesehen.
Wobei im homologen Rekombinationsvektor der veränderte Abschnitt des TFSRP-Gens an seinen 5'- und 3'-Enden durch ein zusätzliches Nukleinsäuremolekül des TFSRP-Gens flankiert ist, um eine homologe Rekombination zwischen dem exogenen TFSRP-Gen, welches vom Vektor getragen wird, und einem endogenen TFSRP-Gen in einem Mikroorganismus oder einer Pflanze zu ermöglichen. Das zusätzliche flankierende TFSRP-Nukleinsäuremolekül ist zur erfolgreichen homologen Rekombination mit dem endogenen Gen ausreichend lang. Üblicherweise sind einige hundert Basenpaare bis hin zu Kilobasen flankierender DNA (sowohl an den 5'- als auch an den 3'-Enden) in dem Vektor eingeschlossen (siehe z.B. Thomas, K. R., und Capecchi, M. R., 1987 Cell 51: 503 für eine Beschreibung homologer Rekombinationsvektoren oder Strepp et al., 1998 PNAS, 95(8): 4368–4373 für Rekombination in Physcomitrella patens auf Grundlage von cDNA). Der Vektor wird in einen Mikroorganismus oder eine Pflanzenzelle (z.B. über Polyethylenglycol-vermittelte DNA) eingeführt, und Zellen, in welchen das eingeführte TFSRP-Gen mit dem endogenen TFSRP-Gen homolog rekombiniert wurde, werden unter Verwendung von im Fachbereich bekannten Techniken selektiert.
In einer weiteren Ausführungsform können rekombinante Mikroorganismen hergestellt werden, die ausgewählte Systeme enthalten, welche eine regulierte Expression des eingeführten Gens ermöglichen. Zum Beispiel ermöglicht der Einschluss eines TFSRP-Gens auf einem Vektor, welches unter Kontrolle des Lac-Operons steht, die Expression des TFSRP-Gens ausschließlich in Gegenwart von IPTG. Solche regulatorischen Systeme sind im Fachbereich wohl bekannt.
Eine Wirtszelle der Erfindung, wie beispielsweise eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle in Kultur kann zur Herstellung (d.h. Expression) eines TFSRP verwendet werden. Dementsprechend stellt die Erfindung weiterhin Verfahren zur Herstellung von TFSRPs unter Verwendung der Wirtszellen der Erfindung bereit. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren das Kultivieren der Wirtszelle der Erfindung (in welcher ein rekombinanter Expressionsvektor eingeführt worden ist, der für ein TFSRP kodiert, oder in deren Genom ein Gen eingeführt worden ist, welches für einen Wildtyp oder ein verändertes TFSRP kodiert) in einem geeigneten Medium, bis TFSRP hergestellt wird. In einer weiteren Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin das Isolieren von TFSRPs aus dem Medium oder der Wirtszelle.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft isolierte TFSRPs, und biologisch aktive Abschnitte davon. Ein „isoliertes" oder „gereinigtes" Protein oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon ist frei von einem Teil des zellulären Materials, wenn es durch rekombinante DNA-Methoden hergestellt wurde oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wurde. Die Bezeichnung „im Wesentlichen frei von zellulärem Material" umfasst TFSRP-Präparationen, in welchen das Protein von einigen der zellulären Komponenten der Zellen, in welchen es natürlich oder rekombinant hergestellt wurde, abgetrennt wurde. In einer Ausführungsform umfasst die Bezeichnung „im Wesentlichen frei von zellulärem Material" TFSRP-Präparationen mit weniger als etwa 30% (in Bezug auf Trockengewicht) von Nicht-TFSRP-Material (hierin auch als ein „kontaminierendes Protein" bezeichnet), stärker bevorzugt weniger als etwa 20% von Nicht-TFSRP-Material, noch stärker bevorzugt weniger als etwa 10% von Nicht-TFSRP-Material, und am stärksten bevorzugt von weniger als etwa 5% Nicht-TFSRP-Material.
Bei rekombinanter Herstellung des TFSRP oder einem biologisch aktiven Abschnitt davon ist es ebenso bevorzugt im Wesentlichen frei von Kulturmedium, d.h. Kulturmedium stellt weniger als etwa 20%, stärker bevorzugt weniger als etwa 10% und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 5% des Volumens der Proteinpräparation dar. Die Bezeichnung „im Wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien" umfasst TFSRP-Präparationen, in welchen das Protein von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien, die an der Synthese des Proteins beteiligt sind, abgetrennt wurde. In einer Ausführungsform umfasst die Bezeichnung „im Wesentlichen frei vonchemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien" TFSRP-Präparationen mit weniger als etwa 30% (in Bezug auf Trockengewicht) von chemischen Vorstufen oder Nicht-TFSRP-Chemikalien, stärker bevorzugt weniger als etwa 20% chemischen Vorstufen oder Nicht-TFSRP-Chemikalien, noch stärker bevorzugt weniger als etwa 10% chemischen Vorstufen oder Nicht-TFSRP-Chemikalien, und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 5% chemischen Vorstufen oder Nicht-TFSRP-Chemikalien. In bevorzugten Ausführungsformen weisen isolierte Proteine oder biologisch aktive Abschnitte davon keine verunreinigenden Proteine aus demselben Organismus auf, aus welchen das TFSRP stammt. Üblicherweise werden solche Proteine durch rekombinante Expression von, zum Beispiel, einem Physcomitrella patens-TFSRP in von Physcomitrella patens unterschiedlichen Pflanzen oder in Mikroorganismen, wie zum Beispiel C. glutamicum, Wimperntierchen, Algen oder Pilzen hergestellt.
Die hierin beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, Proteine, Proteinhomologe, Fusionsproteine, Primer, Vektoren und Wirtszellen können in einem oder mehreren der folgenden Verfahren verwendet werden: Identifizierung von Physcomitrella patens und verwandten Organismen; Kartierung von Genomen von Organismen, die mit Physcomitrella patens verwandt sind; Identifizierung und Lokalisierung von Physcomitrella patens-Sequenzen von Interesse; Evolutionsstudien; Bestimmung von TFSRP-Regionen, welche für die Funktion erforderlich sind; Modulierung einer TFSRP-Aktivität; Modulierung des Metabolismus einer oder mehrerer Zellfunktionen; Modulierung des Transmembrantransports einer oder mehrerer Verbindungen; und Modulierung der Resistenz gegenüber Stress.
Das Moos Physcomitrella patens stellt ein Mitglied der Moose dar. Es ist mit anderen Moosen, wie zum Beispiel Ceratodon purpureus, verwandt, welches bei Abwesenheit von Licht wachstumsfähig ist. Moose, wie zum Beispiel Ceratodon und Physcomitrella haben einen hohen Grad an Homologie im Hinblick auf die DNA-Sequenz und auf Polypeptidebene gemeinsam, was die Anwendung heterologer Durchmusterung von DNA-Molekülen mit Sonden ermöglicht, welche von anderen Moosen oder Organismen abstammen, und so die Ableitung einer Konsensussequenz ermöglicht wird, welche zum heterologen Durchmustern oder zum funktionellen Annotieren und Vorhersagen von Genfunktionen in einer dritten Art geeignet ist. Die Fähigkeit zur Identifizierung solcher Funktionen kann daher eine wesentliche Bedeutung haben, zum Beispiel die Vorhersage der Substratspezifität von Enzymen. Ferner können diese Nukleinsäuremoleküle als Referenzpunkte beim Kartieren von Moosgenomen oder von Genomen verwandter Organismen dienen.
Das TFSRP-Nukleinsäuremolekül weist eine Vielfalt an Verwendungen auf. Am wichtigsten ist es, dass die Nukleinsäure- und Aminosäuresequenz der vorliegenden Erfindung zum Transformieren von Pflanzen verwendet werden kann, um so Toleranz gegenüber Stressarten wie zum Beispiel Trockenheit zu induzieren. Die vorliegende Erfindung stellt daher eine transgene Pflanze bereit, die durch eine TFSRP-Nukleinsäure transformiert wurde, wobei Expression der Nukleinsäuresequenz in der Pflanze im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanze zu gesteigerter Toleranz gegenüber Stress durch Trockenheit führt. Die transgene Pflanze kann einkeimblättrig oder zweikeimblättrig sein. Die Erfindung stellt weiterhin bereit, dass die transgene Pflanze ausgewählt sein kann aus zum Beispiel Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Raps, Canola, Maniok, Pfeffer, Sonnenblume, Nachtschattengewächsen, Kartoffel, Tabak, Aubergine, Tomate, Vicia-Spezies, Erbse, Alfalfa, Kaffee, Kakao, Tee, Salix-Spezies, Ölpalme, Kokosnuss, perennierendem Gras und Futterpflanzen.
Insbesondere beschreibt die vorliegende Erfindung die Verwendung der Expression von ZF-4 von Physcomitrella patens zur Konstruktion von Pflanzen mit Toleranz gegenüber Trockenheit. Diese Strategie ist hierin für Arabidopsis thaliana, Raps/Canola, Sojabohnen, Getreide und Weizen gezeigt worden, dessen Anwendung ist jedoch nicht auf diese Pflanzen eingeschränkt. Entsprechend stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die ein TFSRP ausgewählt aus ZF-4 (SEQ ID NO: 20) enthält, wobei der umweltbedingte Stress Trockenheit ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zum Modifizieren von Toleranz gegenüber Stress einer Pflanze bereit, welche das Modifizieren der Expression eines TFSRP in der Pflanze umfassen. Die Erfindung stellt bereit, dass dieses Verfahren so durchgeführt werden kann, dass die Toleranz gegenüber Stress gesteigert ist. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit einem im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanze gesteigerten Toleranz gegenüber Stress durch Trockenheit bereit, welche das Steigern der Expression eines TFSRP in einer Pflanze umfassen.
Die Verfahren zur Steigerung der Expression von TFSRPs können verwendet werden, wenn die Pflanze entweder transgen oder nicht transgen ist. In Fällen, in welchen die Pflanze transgen ist, kann die Pflanze mit einem Vektor, welcher eine beliebige der oben beschriebenen für TFSRP kodierenden Nukleinsäuren enthält, transformiert werden, oder die Pflanze kann zum Beispiel mit einem Promotor transformiert werden, der die Expression von nativem TFSRP in der Pflanze steuert. Die Erfindung stellt bereit, dass ein solcher Promotor gewebespezifisch sein kann. Darüber hinaus kann ein solcher Promotor entwicklungsabhängig reguliert werden. Wahlweise können nicht-transgene Pflanzen native TFSRP-Expression aufweisen, welche durch die Induktion eines nativen Promotors modifiziert wird. Die Expression von ZF-4 (SEQ ID NO: 20) in Zielpflanzen kann durch eines der folgenden Beispiele durchgeführt werden, ist jedoch nicht darauf eingeschränkt: (a) Konstitutiver Promotor, (b) Stress-induzierbarer Promotor, (c) chemisch-induzierter Promotor, und (d) konstruierte Promotorüberexpression mit, zum Beispiel, Zink-Finger-abgeleiteten Transkriptionsfaktoren (Greisman und Pabo, 1997 Science 275: 657). Der letztere Fall umfasst sowohl die Identifizierung von ZF-4 (SEQ ID NO: 20), Homologen in der Zielpflanze als auch von seinem Promotor. Zink-Finger-enthaltende rekombinante Transkriptionsfaktoren werden zur spezifischen Wechselwirkung mit dem ZF-4(SEQ ID NO: 20)-Homologen konstruiert, und die Transkription des entsprechenden Gens wird aktiviert.
Zusätzlich zur Einführung der TFSRP-Nukleinsäuresequenzen in transgene Pflanzen können diese Sequenzen auch zur Identifizierung eines Organismus als Physcomitrella patens oder eines nahen Verwandten davon verwendet werden. Sie können auch zur Identifizierung des Vorliegens von Physcomitrella patens oder einem nahen Verwandten davon in einer gemischten Population von Mikroorganismen verwendet werden. Die Erfindung stellt die Nukleinsäuresequenzen einer Anzahl an Physcomitrella patens-Genen bereit; durch Untersuchen der extrahierten genomischen DNA einer Kultur einer einzelnen oder gemischten Population von Mikroorganismen unter stringenten Bedingungen mit einer Sonde, welche eine für diesen Organismus einzigartige Region eines Physcomitrella patens-Gens umfasst, kann man feststellen, ob dieser Organismus vorliegt.
Darüber hinaus können die Nukleinsäure- und Proteinmoleküle der Erfindung als Marker für spezifische Regionen des Genoms dienen. Dies ist nicht nur beim Kartieren des Genoms nützlich, sondern auch für funktionelle Studien von Physcomitrella patens-Proteinen. Zum Beispiel könnte zur Identifizierung der Region des Genoms, an welche ein bestimmtes Physcomitrella patens DNA-bindendes Protein bindet, das Physcomitrella patens-Genom verdaut werden, und die Fragmente mit den DNA-bindenden Proteinen inkubiert werden. Diejenigen Fragmente, die das Protein binden, können zusätzlich mit den Nukleinsäuremolekülen der Erfindung untersucht werden, bevorzugt mit einfach zu detektierenden Markierungen. Das Binden eines solchen Nukleinsäuremoleküls an das Genomfragment ermöglicht die Lokalisierung des Fragmentes auf der Genomkarte von Physcomitrella patens, und, bei mehrfacher Durchführung des Verfahrens mit verschiedenen Enzymen ermöglicht es eine schnelle Bestimmung der Nukleinsäuresequenz, an welche das Protein bindet. Weiterhin können die Nukleinsäuremoleküle der Erfindung zu den Sequenzen verwandter Arten ausreichend homolog sein, so dass diese Nukleinsäuremoleküle als Marker zur Konstruktion einer Genomkarte in verwandten Moosen dienen.
Die TFSRP-Nukleinsäuremoleküle der Erfindung sind auch für Evolutions- und Proteinstrukturstudien geeignet. Die Stoffwechsel- und Transportprozesse, an welchen die Moleküle der Erfindung teilnehmen, werden von einer breiten Vielfalt an prokaryotischen und eukaryotischen Zellen benutzt; durch Vergleichen der Sequenzen der Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung mit denjenigen, die für ähnliche Enzyme aus anderen Organismen kodieren, kann die evolutive Verwandschaft der Organismen festgestellt werden. In ähnlicher Weise ermöglicht ein solcher Vergleich eine Beurteilung, welche Sequenzregionen konserviert sind und welche nicht, wobei dies bei der Bestimmung solcher Regionen des Proteins hilfreich sein kann, die für das Funktionieren des Enzyms wesentlich sind. Diese Art der Bestimmung ist für Studien zur Proteinkonstruktion wertvoll und kann einen Hinweis darauf geben, was das Protein im Hinblick auf Mutagenese ohne Verlust seiner Funktion tolerieren kann.
Die Manipulation von TFSRP-Nukleinsäuremolekülen der Erfindung kann zur Herstellung von TFSRPs mit funktionellen Unterschieden zu Wildtyp-TFSRPs führen. Die Proteine können in ihrer Effizienz oder Aktivität verbessert sein, können in größerer Anzahl als gewöhnlich in der Zelle vorliegen oder können in ihrer Effizienz oder Aktivität vermindert sein.
Es besteht eine Vielzahl an Mechanismen, durch welche die Veränderung eines TFSRPs der Erfindung eine Stressreaktion und/oder Toleranz gegenüber Stress direkt beeinflussen kann. Für den Fall, dass Pflanzen TFSRPs exprimieren, kann ein gesteigerter Transport zu einer verbesserten Salzverteilung und/oder Verteilung gelöster Stoffe innerhalb des Pflanzengewebes und der Organe führen. Sowohl durch eine Steigerung der Zahl der Aktivität der Transportermoleküle, welche ionische Moleküle aus der Zelle exportieren, kann es möglich sein, die Salztoleranz der Zelle zu beeinflussen.
Die Wirkung der genetischen Modifizierung in Pflanzen, C. glutamicum, Pilzen, Algen oder Wimperntierchen auf Toleranz gegenüber Stress kann durch Züchten des modifizierten Mikroorganismus oder der Pflanze unter Bedingungen, die schlechter als geeignete Bedingungen sind, und anschließender Analyse der Wachstumscharakteristika und/oder des Metabolismus der Pflanze festgestellt werden. Solche Analysemethoden sind dem Fachmann wohl bekannt und umfassen Trockengewicht, Nassgewicht, Proteinsynthese, Kohlenhydratsynthese, Lipidsynthese, Evapotranspirationsgeschwindigkeiten, allgemeinen Pflanzen- und/oder Ernteertrag, Blüte, Reproduktion, Saatgut-Beladung, Wurzelwachstum, Atmungsgeschwindigkeiten, Photosynthesegeschwindigkeiten etc. (Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17; Rehm et al., 1993 Biotechnology, Bd. 3, Kapitel III: Product recovery and purification, Seite 469–714, VCH: Weinheim; Belter, P. A. et al., 1988 Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J. F. und Cabral, J. M. S., 1992 Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J. A. und Henry, J. D., 1988 Biochemical separations, in: Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Bd. B3, Kapitel 11, Seite 1–27, VHC: Weinheim; und Dechow, F. J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
Zum Beispiel können Hefeexpressionsvektoren, die die hierin offenbarten Nukleinsäuren oder Fragmente davon umfassen, konstruiert werden und unter Verwendung von Standardprotokollen in Saccharomyces cerevisiae transformiert werden. Die sich ergebenden transgenen Zellen können anschließend auf Ausbleiben oder Veränderung ihrer Toleranz gegenüber Stress durch Trockenheit untersucht werden. In ähnlicher Weise können Pflanzenexpressionsvektoren konstruiert werden, die die hierin offenbarten Nukleinsäuren oder Fragmente davon umfassen, und in eine geeignete Pflanzenzelle wie zum Beispiel Arabidopsis, Soja, Raps, Mais, Weizen, Medicago truncatula etc. unter Verwendung von Standardprotokollen transformiert werden. Die sich ergebenden transgenen Zellen und/oder daraus stammenden Pflanzen können anschließend auf ein Ausbleiben oder eine Veränderung ihrer Toleranz gegenüber Stress durch Trockenheit untersucht werden.
Die Konstruktion von einem oder mehreren TFSRP-Genen der Erfindung kann auch zu TFSRPs mit veränderten Aktivitäten führen, welche indirekt die Stressreaktion und/oder Toleranz gegenüber Stress von Algen, Pflanzen, Wimperntierchen oder Pilzen oder anderen Mikroorganismen wie C. glutamicum beeinflussen. Zum Beispiel führen die normalen biochemischen Stoffwechselprozesse zur Produktion einer Vielfalt an Produkten (z.B. Wasserstoffperoxid und andere reaktive Sauerstoffspezies), die aktiv mit denselben Stoffwechselprozessen wechselwirken können (zum Beispiel ist Peroxynitrit dafür bekannt, Tyrosinseitenketten zu nitrieren, wodurch einige Enzyme mit Tyrosin im aktiven Zentrum inaktiviert werden) (Groves, J. T., 1999 Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2): 226–235). Während diese Produkte üblicherweise ausgeschieden werden, können Zellen zum Transportieren von mehr Produkten als für eine Wildtyp-Zelle üblich ist, genetisch verändert werden. Durch Optimieren der Aktivität einer oder mehrerer TFSRPs der Erfindung, welche an dem Export spezifischer Moleküle beteiligt sind, wie zum Beispiel Salzmoleküle, kann es möglich sein, die Toleranz gegenüber Stress der Zelle zu verbessern.
Zusätzlich können die hierin offenbarten Sequenzen oder Fragmente davon zum Erzeugen von Knockout-Mutationen in den Genomen verschiedener Organismen verwendet werden, wie zum Beispiel Bakterien, Säugerzellen, Hefezellen und Pflanzenzellen (Girke, T., 1998 The Plant Journal 15: 39–48). Die sich ergebenden Knockout-Zellen können anschließend nach ihrer Fähigkeit oder Kapazität zur Tolerierung verschiedener Stressbedingungen, nach ihrer Reaktion auf verschiedene Stressbedingungen und nach ihrer Wirkung auf den Phänotyp und/oder Genotyp der Mutation bewertet werden. Für andere Verfahren zur Geninaktivierung siehe U.S.-Patent Nr. 6004804 „Non-Chimeric Mutational Vectors" und Puttaraju et al., 1999 Spliceosome- mediated RNA trans-splicing as a tool for gene therapy Nature Biotechnology 17: 246–252.
Die oben genannten Mutagenesestrategien für TFSRPs, die zu gesteigerter Stressresistenz führen, sollen nicht einschränkend wirken; Variationen dieser Strategien sind für einen Fachmann auf einfache Weise offensichtlich. Unter Verwendung solcher Strategien und unter Berücksichtigung der hierin offenbarten Mechanismen können die Nukleinsäure- und Proteinmoleküle der Erfindung zur Erzeugung von Algen, Wimperntierchen, Pflanzen, Pilzen oder anderen Organismen wie C. glutamicum, welche mutierte TFSRP-Nukleinsäure und -proteinmoleküle exprimieren, verwendet werden, so dass die Stresstoleranz verbessert wird.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Antikörper bereit, die spezifisch an ein TFSRP oder einen Abschnitt davon binden, wie es/er durch eine hierin offenbarte Nukleinsäure kodiert wird. Antikörper können durch viele wohlbekannte Verfahren hergestellt werden (siehe z.B. Harlow und Lane, "Antibodies; A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1988)). In Kürze kann ein gereinigtes Antigen in ein Tier in einer Menge und in Abständen injiziert werden, die ausreichend sind, um eine Immunantwort auszulösen. Antikörper können entweder direkt gereinigt werden oder es können Milzzellen des Tiers erhalten werden. Die Zellen können anschließend mit einer unsterblichen Zelllinie fusioniert und nach einer Antikörperabsonderung durchmustert werden. Die Antikörper können zum Durchmustern von Nukleinsäure-Klonbibliotheken nach Zellen, welche das Antigen absondern, verwendet werden. Solche positiven Klone können anschließend sequenziert werden (Siehe zum Beispiel Kelly et al., 1992 Bio/Technology 10: 163–167; Bebbington et al., 1992 Bio/Technology 10: 169–175).
Die Bezeichnungen „bindet selektiv" und „bindet spezifisch" mit dem Polypeptid beziehen sich auf eine Bindungsreaktion, die für das Vorliegen des Proteins in einer heterogenen Proteinpopulation und anderen biologischen Stoffen bestimmend ist. Daher bindet unter ausgewiesenen Immunoassay-Bedingungen der spezifizierte Antikörper, der an ein bestimmtes Protein gebunden ist, in keiner signifikanten Menge an andere Proteine, die in der Probe vorliegen. Ein selektives Binden eines Antikörpers unter solchen Bedingungen kann einen Antikörper erfordern, der für seine Spezifität gegenüber einem bestimmten Protein ausgewählt ist. Eine Vielfalt von Immunoassay-Ausführungen kann zum Auswählen von Antikörpern verwendet werden, die selektiv an ein bestimmtes Protein binden. Zum Beispiel werden Festphasen-ELISA-Immunoassays routinemäßig zum Auswählen von Antikörpern verwendet, welche selektiv mit einem Protein immunreaktiv sind. Siehe Harlow und Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, Cold Spring Harbor, New York, (1988) für eine Beschreibung von Immunoassay-Ausführungen und -Bedingungen, die zur Bestimmung von selektiver Bindung verwendet werden können.
In einigen Fällen ist es wünschenswert, monoklonale Antikörper aus verschiedenen Wirten herzustellen. Eine Beschreibung von Methoden zur Herstellung solcher monoklonalen Antikörper kann Stites et al., Herausgeber, "Basic and Clinical Immunology," (Lange Medical Publications, Los Altos, Kalif., Vierte Ausgabe) und darin zitierten Literaturhinweisen, und in Harlow und Lane ("Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988) entnommen werden.
Die Erfindung wird weiterhin durch die folgenden Beispiele veranschaulicht, welche im Hinblick auf den Umfang davon in keiner Weise als erhobene Einschränkungen zu verstehen sind.
BEISPIELE
Beispiel 1
Aufzucht von Physcomitrella patens-Kulturen
Für diese Studie wurden Pflanzen der Art Physcomitrella patens (Hedw.) B. S. G. aus der Sammlung der Abteilung für genetische Studien der Universität Hamburg verwendet. Sie stammen vom Stamm 16/14 ab, welcher von H. L. K. Whitehouse in Gransden Wood, Huntingdonshire (England) gesammelt wurde, der von Engel aus einer Spore subkultiviert wurde (1968, Am. J. Bot. 55, 438–446). Die Proliferation der Pflanzen wurde mittels Sporen und mittels Regeneration der Gametophyten durchgeführt. Die Protonema entwickelte sich aus der haploiden Spore als ein Chloroplast-reiches Chloronema und ein Chlorplast-armes Caulonema, auf welchen sich nach etwa 12 Tagen Knospen bildeten. Diese wuchsen unter Bildung von Gametangienträgern, welche Antheridien und Archegonien hervorbrachten. Nach der Befruchtung bildete sich die diploide Sporophyte mit einer kurzen Seta und der Sporenkapsel, in welcher die Meiosporen reiften.
Das Kultivieren wurde in einer Klimakammer bei einer Lufttemperatur von 25°C und einer Lichtintensität von 55 Micromol^(–Im2) (weißes Licht; Philips TL 65 W/25 Fluoreszenzröhre) und einem Licht-/Dunkelwechsel von 16/8 Stunden durchgeführt. Das Moos wurde entweder in Flüssigkultur unter Verwendung von Knop-Medium gemäß Reski und Abel (1985, Planta 165: 354–358) oder auf festem Knop-Medium unter Verwendung von 1% Oxoidagar (Unipath, Basingstoke, England) kultiviert. Die für RNA- und DNA-Isolierung verwendeten Protonema wurden in belüfteten Flüssigkulturen kultiviert. Die Protonema wurden alle 9 Tage verkleinert und auf frisches Kulturmedium überführt.
Beispiel 2
Isolierung von Gesamt-DNA aus Pflanzen
Die Einzelheiten zur Isolierung von Gesamt-DNA beziehen sich auf die Aufarbeitung eines Gramms Frischgewicht von Pflanzenmaterial. Die verwendeten Materialien umfassen die folgenden Puffer: CTAB-Puffer: 2% (w/v) N-Cethyl-N,N,N-trimethylammoniumbromid (CTAB); 100 mM Tris-HCl pH-Wert von 8,0; 1,4 M NaCl; 20 mM EDTA; N-Laurylsarcosin-Puffer: 10% (w/v) N-Laurylsarcosin; 100 mM Tris-HCl pH-Wert von 8,0; 20 mM EDTA.
Das Pflanzenmaterial wurde unter flüssigem Stickstoff in einem Mörser zerrieben, um ein feines Pulver zu ergeben, und in 2 ml-Eppendorf-Gefäße übertragen. Das gefrorene Pflanzenmaterial wurde anschließend mit einer Schicht von 1 ml Zersetzungspuffer (1 ml CTAB-Puffer, 100 μl N-Laurylsarcosin-Puffer, 20 μl β-Mercaptoethanol und 10 μl Proteinase-K-Lösung, 10 mg/ml) bedeckt und für eine Stunde bei 60°C unter ständigem Schütteln inkubiert. Das erhaltene Homogenat wurde auf zwei Eppendorf-Gefäße (2 ml) aufgeteilt und zweimal durch Schütteln mit demselben Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. Zur Phasentrennung wurde jeweils eine Zentrifugation bei 8000 × g und Raumtemperatur für 15 Minuten durchgeführt. Die DNA wurde anschließend bei –70°C für 30 Minuten unter Verwendung von eiskaltem Isopropanol ausgefällt. Die ausgefällte DNA wurde bei 4°C und 10000 g für 30 Minuten sedimentiert und in 180 μl TE-Puffer resuspendiert (Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6). Zur weiteren Reinigung wurde die DNA mit NaCl (1,2 M Endkonzentration) behandelt und wiederum bei –70°C für 30 Minuten unter Verwendung des doppelten Volumens von absolutem Ethanol präzipitiert. Nach einem Wasch-Schritt mit 70%-igem Ethanol wurde die DNA getrocknet und anschließend in 50 μl H₂O + RNAse (50 mg/ml Endkonzentration) aufgenommen. Die DNA wurde über Nacht bei 4°C gelöst und anschließend wurde der RNAse-Verdau bei 37°C für 1 Stunde durchgeführt. Die Lagerung der DNA fand bei 4°C statt.
Beispiel 3
Isolierung von Gesamt-RNA und Poly-(A)⁺-RNA und Konstruktion einer cDNA-Bibliothek aus Physcomitrella patens
Zur Untersuchung von Transkripten wurde sowohl die Gesamt-RNA als auch Poly-(A)⁺-RNA isoliert. Die Gesamt-RNA wurde aus 9 Tage alten Wildtyp-Protonemata gemäß dem GTC-Verfahren erhalten (Reski et al. 1994, Mol. Gen. Genet., 244: 352–359). Die Poly-(A)⁺-RNA wurde unter Verwendung von Dyna Beads^® (Dynal, Oslo, Norwegen) gemäß der Instruktionen des Herstellerhandbuchs isoliert. Nach Bestimmung der Konzentration der RNA oder der Poly-(A)⁺-RNA wurde die RNA durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat mit einem pH-Wert von 4,6 und 2 Volumina von Ethanol ausgefällt und bei –70°C gelagert.
Zur cDNA-Bibliothekskonstruktion wurde die Erststrangsynthese unter Verwendung von reverser Transkriptase aus murinem Leukämievirus (Roche, Mannheim, Deutschland) und Oligo-d(T)-Primern, die Zweitstrangsynthese durch Inkubation mit DNA-Polymerase I, Klenow-Enzym und RNAseH-Verdau bei 12°C (2 Stunden), 16°C (1 Stunde) und 22°C (1 Stunde) erreicht. Die Reaktion wurde durch Inkubation bei 65°C (10 Minuten) gestoppt und anschließend auf Eis überführt. Doppelsträngige DNA-Moleküle wurden durch T4-DNA-Polymerase (Roche, Mannheim) bei 37°C (30 Minuten) mit glatten Enden versehen. Nukleotide wurden durch Phenol-/Chloroform-Extraktion und Sephadex G50-Spinsäulen entfernt. EcoRI-Adapter (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) wurden durch T4-DNA-Ligase (Roche, 12°C, über Nacht) an die cDNA-Enden ligiert und durch Inkubation mit Polynukleotidkinase (Roche, 37°C, 30 Minuten) phosphoryliert. Dieses Gemisch wurde einer Auftrennung auf einem niedrigschmelzenden Agarosegel unterzogen. DNA-Moleküle, die größer als 300 Basenpaare waren, wurden aus dem Gel eluiert, mit Phenol extrahiert, auf Elutip-D-Säulen (Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland) konzentriert und an die Enden eines Vektors ligiert und unter Verwendung des Gigapack Gold Kit (Stratagene, Amsterdam, Niederlande) in Lambda ZAPII-Phagen oder Lambda-ZAP-Expressphagen verpackt, wobei Material des Herstellers verwendet und die Herstellervorschriften befolgt wurden.
Beispiel 4
Sequenzieren und Funktionsannotieren von Physcomitrella patens-ESTs
cDNa-Bibliotheken, wie sie in Beispiel 3 beschrieben sind, wurden zur DNA-Sequenzierung gemäß Standardverfahren, und insbesondere durch das Kettenabbruchverfahren unter Verwendung des ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer, Weiterstadt, Deutschland) verwendet. Im Anschluss an eine präparative Plasmidgewinnung aus cDNA-Bibliotheken durch In vivo-Massenexzision, Retransformation, und anschließendes Ausplattieren von DH10B auf Agarplatten wurde Random-Sequenzierung ausgeführt (Material und Protokolleinzelheiten von Stratagene, Amsterdam, Niederlande). Plasmid-DNA wurde aus über Nacht aufgezogenen E. coli-Kulturen, welche in Luria-Broth-Medium mit Ampicillin aufgezogen wurden (siehe Sambrook et al. 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) mit einem Qiagene DNA-Präparationsrobotor (Qiagen, Hilden) gemäß dem Herstellerhandbuch hergestellt. Es wurden Sequenzierungsprimer mit den folgenden Nukleotidsequenzen verwendet:
Die Sequenzen wurden unter Verwendung des Softwarepakets EST-MAX, welches kommerziell von Bio-Max (München, Deutschland) angeboten wird, verarbeitet und annotiert. Das Programm berücksichtigt so gut wie alle Bioinformatikverfahren, die für eine funktionelle und strukturelle Charakterisierung von Proteinsequenzen wichtig sind. Zur Referenz dient die Webseite unter pedant.mips.biochem.mpg.de. Die wichtigsten Algorithmen, die von EST-MAX berücksichtigt werden, sind: FASTA: Sehr sensitive Sequenzdatenbanksuchen mit Abschätzung der statistischen Signifikanz; Pearson W. R. (1990) Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA. Methods Enzymol. 183: 63–98; BLAST: Sehr sensitive Sequenzdatenbanksuchen mit Abschätzung der statistischen Signifikanz. Altschul S. F., Gish W., Miller W., Myers E. W., und Lipman D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology 215: 403–10; PREDATOR: Sekundärstrukturvorhersage von einzelnen und mehreren Sequenzen mit hoher Genauigkeit. Frishman, D. und Argos, P. (1997) 75% accuracy in protein secondary structure prediction. Proteins, 27: 329–335; CLUSTAL W: Alignment mehrerer Sequenzen. Thompson, J. D., Higgins, D. G. und Gibson, T. J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22: 4673–4680; TMAP: Vorhersage der transmembranen Region von mehrfach aneinander gefügten Sequenzen. Persson, B. und Argos, P. (1994) Prediction of transmembrane segments in proteins utilizing multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 237: 182–192; ALOM2: Transmembranregion-Vorhersage von einzelnen Sequenzen. Klein, P., Kanehisa, M., und DeLisi, C. Prediction of protein function from sequence properties: A discriminate analysis of a database. Biochim. Biophys. Acta 787: 221–226 (1984). Version 2 von Dr. K. Nakai; PROSEARCH: Erkennung von PROSITE-Proteinsequenzmustern. Kolakowski L. F. Jr., Leunissen J. A. M., Smith J. E. (1992) ProSearch: fast searching of protein sequences with regular expression patterns related to protein structure and function. Biotechniques 13, 919–921; BLIMPS: Suche nach Ähnlichkeit gegen eine Datenbank von lückenlosen (ungapped) Blöcken. J. C. Wallace und Henikoff S., (1992); PATMAT: Ein Such- und Extraktionsprogramm für Sequenz-, Muster- und Blockanfragen und -datenbanken, CABIOS 8: 249–254.
Geschrieben von Bill Alford.
Beispiel 5
Identifizierung von Physcomitrella patens-ORF entsprechend ZF-4
Die in Tabelle 1 gezeigte partielle cDNA (EST) aus Physcomitrella patens wurde mit dem Physcomitrella patens-EST-Sequenzierungsprogramm unter Verwendung des Programms EST-MAX durch BLAST-Analyse identifiziert. Die Sequenzidentifizierungsnummer, die diesem EST entspricht, ist ZF-4 (SEQ ID NO: 4).
Tabelle 1
Tabelle 2 Ausmaß der Aminosäure-Identität und -ähnlichkeit von PpZF-4 und anderen homologen Proteinen (Paarweises Vergleichsprogramm wurde verwendet: gap penalty: 10; gap extension penalty: 0,1; Scorematrix: Blosum62)
Beispiel 6
Klonierung der Volllängen-cDNA aus Physcomitrella patens, welche für ZF-4 kodiert
Zur Isolierung des für PpZF-4 kodierenden Klons aus Physcomitrella patens wurden cDNA-Bibliotheken mit SMART RACE cDNA Amplifizierungskit (Clontech Laboratories) gemäß den Herstellerangaben erzeugt. Die in Beispiel 3 beschriebene Gesamt-RNA wurde als Matrize verwendet. Die Kulturen wurden vor der RNA-Isolierung wie folgt behandelt: Stress durch Salz: 2, 6, 12, 24, 48 Stunden mit 1-M NaCl-supplementiertem Medium; Stress durch Kälte: 4°C zu denselben Zeitpunkten wie für Salz; Stress durch Trockenheit: Kulturen wurden auf trockenem Filterpapier zu denselben obigen Zeitpunkten inkubiert. RNA wurde anschließend abgezogen und zur Isolierung verwendet.
5' RACE-Protokoll
Die EST-Sequenz PpZF-4 (SEQ ID NO: 4), die aus der Datenbanksuche wie in Beispiel 5 beschrieben identifiziert wurde, wurde zum Entwerfen von Oligos für RACE verwendet (siehe Tabelle 1). Die verlängerte Sequenz für dieses Gen wurde mittels Durchführung der Rapid Amplification of cDNA-Enden-Polymerasekettenreaktion (RACE-PCR) unter Verwendung des Advantage 2 PCR-Kits (Clontech Laboratories) und des SMART RACE cDNA-Amplifizierungskits (Clontech Laboratories) unter Verwendung eines Biometra T3-Thermocycler gemäß den Herstellerangaben erhalten.
Die aus den RACE-Reaktionen erhaltene Sequenz enthielt das 5'-Ende der kodierenden Volllängen-Region für PpZF-4 und wurde zum Entwerfen von Oligos für das Volllängen-Klonieren der entsprechenden Gene verwendet (siehe im Folgenden unter „Volllängen-Amplifizierung").
Volllängen-Amplifizierung
Volllängen-Klon für PpZF-4 (SEQ ID NO: 12) wurde durch Wiederholen des RACE-Verfahrens isoliert, jedoch unter Verwendung der Gen-spezifischen Primer wie in Tabelle 3 angezeigt.
Die amplifizierten Fragmente wurden aus Agarosegel mit einem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) extrahiert und in den TOPO pCR 2.1-Vektor (Invitrogen) gemäß den Herstellerangaben ligiert. Rekombinante Vektoren wurden in Top10-Zellen (Invitrogen) unter Standardbedingungen transformiert (Sambrook et al. 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2. Ausgabe. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY). Transformierte Zellen wurden auf LB-Agar, der 100 μg/ml Carbenicillin, 0,8 mg X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid) und 0,8 mg IPTG (Isopropylthio-β-D-galactosid) enthielt, selektiert und über Nacht bei 37°C aufgezogen. Weiße Kolonien wurden ausgewählt und zur Beimpfung von 3 ml flüssigem LB, welches 100 μg/ml Ampicillin enthielt, verwendet und über Nacht bei 37°C aufgezogen. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) gemäß Herstellerangaben extrahiert. Analysen der nachfolgenden Klone und Restriktionskartierung wurde gemäß molekularbiologischen Standardtechniken durchgeführt (Sambrook et al. 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2. Ausgabe. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY).
Tabelle 3
Beispiel 7
Konstruktion Stress-toleranter Arabidopsis-Pflanzen durch Überexprimieren des Gens ZF-4
Binäre Vektorkonstruktion:
Das Plasmidkonstrukt pACGH101 wurde mit PstI (Roche) und FseI (NEB) gemäß den Herstellerangaben verdaut. Das Fragment wurde mit Agarosegel gereinigt und über den Qiaex II DNA-Extraktionskit (Qiagen) extrahiert. Dies ergab ein Vektorfragment mit dem Arabidopsis Actin2-Promotor mit internem Intron und dem OCS3-Terminator. Primer zur PCR-Amplifizierung des NPTII- Gens wurden wie folgt entworfen:
Das 0,9 Kilobasen-NPTII-Gen wurde mittels PCR aus pCambia 2301-Plasmid-DNA amplifiziert (94°C für 60 Sekunden, {94°C für 60 Sekunden, 61°C (–0,1°C pro Zyklus) für 60 Sekunden, 72°C für 2 Minuten) × 25 Zyklen, 72°C für 10 Minuten auf Biometra T-Gradient-Maschine) amplifiziert, und über den Qiaquick PCR-Extraktionskit (Qiagen) gemäß den Herstellerangaben gereinigt. Die PCR-DNA wurde anschließend in den pCR-BluntII-TOPO-Vektor (Invitrogen) gemäß den Herstellerangaben subkloniert (NPT-Topo-Konstrukt). Diese Ligationen wurden in Top10-Zellen (Invitrogen) transformiert und auf LB-Platten mit 50 μg/ml Kanamycinsulfat über Nacht bei 37°C aufgezogen. Kolonien wurden anschließend zum Beimpfen von 2 ml LB-Medien mit 50 μg/ml Kanamycinsulfat verwendet und über Nacht bei 37°C aufgezogen. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des Qiaprep Spin Miniprep-Kit (Qiagen) gewonnen und unter Standardbedingungen in sowohl die 5'- als auch 3'-Richtung sequenziert. Anschließende Analyse der Sequenzdaten unter Verwendung der Vektor NTI-Software ergab keine PCR-Fehler in der NPTII-Gensequenz.
Das NPT-Topo-Konstrukt wurde anschließend mit PstI (Roche) und FseI (NEB) gemäß den Herstellerangaben verdaut. Das 0,9 Kilobasen-Fragment wurde über Agarosegel gereinigt und mittels Qiaex II DNA-Extraktionskit (Qiagen) extrahiert. Das Pst/Fse-Insertfragment aus NPT-Topo und das Pst/Fse-Vektorfragment aus pACGH101 wurden anschließend zusammen unter Verwendung von T4-DNA Ligase (Roche) gemäß Herstellerangaben ligiert. Die Ligation wurde anschließend in Top10-Zellen (Invitrogen) unter Standardbedingungen transformiert, wobei das pBPSsc019-Konstrukt erzeugt wurde. Kolonien wurden auf LB-Platten mit 50 μg/ml Kanamycinsulfat selektiert und über Nacht bei 37°C aufgezogen. Diese Kolonien wurden anschließend zur Beimpfung von 2 ml LB-Medien mit 50 μg/ml Kanamycinsulfat verwendet und über Nacht bei 37°C aufgezogen. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des Qiaprep Spin Miniprep-Kit (Qiagen) gemäß den Herstellerangaben gewonnen.
Das pBPSSC019-Konstrukt wurde mit KpnI und BsaI (Roche) gemäß den Herstellerangaben verdaut. Das Fragment wurde über Agarosegel gereinigt und anschließend über den Qiaex II DNA-Extraktionskit (Quiagen) gemäß dessen Angaben extrahiert, was zu einer 3 Kilobasen-Act-NPT-Kassette führte, welche den Arabidopsis Actin2-Promotor mit innerem Intron, das NPTII-Gen und den OCS3-Terminator umfasste.
Der pBPSJH001-Vektor wurde mit SpeI und ApaI (Roche) verdaut und mit Klenow-Enyzm und 0,1 mM dNTPs (Roche) gemäß Herstellerangaben zu glatten Enden aufgefüllt. Dies ergab ein 10,1 Kilobasen-Vektor-Fragment abzüglich der Gentamycin-Kassette, welche durch Selbst-Ligieren mit T4 DNA-Ligase (Roche) rezirkularisiert wurde, und in Top10-Zellen (Invitrogen) über Standardbedingungen transformiert wurde. Transformierte Zellen wurden auf LB-Agar, der 50 μg/ml Kanamycinsulfat enthielt, selektiert und über Nacht bei 37°C aufgezogen. Kolonien wurden anschließend zum Beimpfen von 2 ml flüssigem LB verwendet, welches 50 μg/ml Kanamycinsulfat enthielt, und über Nacht bei 37°C aufgezogen. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des QIAprep Spin Miniprep-Kits (Qiagen) gemäß Herstellerangaben extrahiert. Das rezirkularisierte Plasmid wurde anschließend mit KpnI (Roche) verdaut und aus Agarosegel über den Qiaex II DNA-Extraktionskit (Qiagen) gemäß Herstellerangaben extrahiert.
Das Act-NPT Kpn-cut-Insert und der Kpn-cut pBPSJH001-rezirkularisierte Vektor wurden anschließend zusammen unter Verwendung von T4 DNA-Ligase (Roche) gemeinsam ligiert und in Top10-Zellen (Invitrogen) gemäß Herstellerangaben transformiert. Das sich ergebende Konstrukt, pBPSsc022, enthielt nun den Super-Promotor, das GUS-Gen, den NOS-Terminator und die Act-NPT-Kassette. Transformierte Zellen wurden auf LB-Agar selektiert, der 50 μg/ml Kanamycinsulfat enthielt, und bei 37°C über Nacht aufgezogen. Kolonien wurden anschließend zum Beimpfen von 2 ml flüssigem LB verwendet, welches 50 μg/ml Kanamycinsulfat enthielt, und über Nacht bei 37°C aufgezogen. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des QIAprep Spin Midiprep Kit (Qiagen) gemäß den Herstellerangaben extrahiert. Nach Bestätigung der erfolgreichen Ligation über Restriktionsverdau wurde pBPSsc022-Plasmid-DNA weiterhin vermehrt und unter Verwendung des Plasmid Midiprep Kit (Qiagen) gemäß den Herstellerangaben gewonnen.
Subklonieren von ZF-4 in den binären Vektor
Die Fragmente, die unterschiedliche Physcomitrella patens-Transkriptionsfaktoren enthielten, wurden aus den rekombinanten PCR2.1 TOPO-Vektoren durch doppelten Verdau mit Restriktionsenzymen (siehe Tabelle 11) gemäß Herstellerangaben subkloniert. Das folgende Fragment wurde aus einem Agarosegel mit einem QIAquick Gel Extraction Kit (QIAgen) gemäß Herstellerangaben ausgeschnitten und in die binären Vektoren pBPSSC022 ligiert, welche vor der Ligation mit XmaI und EclI36II geschnitten und dephosphoryliert worden waren. Der sich ergebende rekombinante pBPSSC022 enthielt den entsprechenden Transkriptionsfaktor in Sense-Orientierung unter dem konstitutiven Super-Promotor.
Tabelle 4 Aufgelistet ist der Name des Konstrukts des Physcomitrella patens-Transkriptionsfaktors, der zur Pflanzentransformation verwendet wurde
Agrobacterium-Transformation
Die rekombinanten Vektoren wurden gemäß Standardbedingungen in Agrobacterium tumefaciens C58C1 und PMP90 transformiert (Hoefgen und Willmitzer, 1990).
Pflanzentransformation
Arabidopsis thaliana-Ökotyp C24 wurde aufgezogen und gemäß Standardbedingungen transformiert (Bechtold 1993, Acad. Sci. Paris. 316: 1194–1199; Bent et al. 1994, Science 265: 1856–1860).
Durchmustern von transformierten Pflanzen
T1-Samen wurden gemäß Standardprotokollen sterilisiert (Xiong et al. 1999, Plant Molecular Biology Reporter 17: 159–170). Die Samen wurden auf ½ Murashiga- und Skoog-Medien (MS) (Sigma-Aldrich), pH 5,7 mit KOH, 0,6% Agar ausplattiert und mit 1% Saccharose, 0,5 g/L 2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure (MES) (Sigma-Aldrich), 50 μg/ml Kanamycin (Sigma-Aldrich), 500 μg/ml Carbenicillin (Sigma-Aldrich) und 2 μg/ml Benomyl (Sigma-Aldrich) supplementiert. Die Samen auf den Platten wurden für 4 Tage bei 4°C vernalisiert. Die Samen wurden in einer Klimakammer bei einer Lufttemperatur von 22°C und einer Lichtintensität von 40 Mikromol^–1m2 (weißes Licht; Philips TL 65 W/25 Fluoreszenzröhre) und einem Tageslängenzyklus mit 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit gekeimt. Transformierte Keimlinge wurden nach 14 Tagen selektiert und auf ½ MS-Medium pH 5,7 mit KOH 0,6% Agarplatten, die mit 0,6% Agar, 1% Saccharose, 0,5 g/L MES (Sigma-Aldrich) und 2 μg/ml Benomyl (Sigma-Aldrich) ergänzt wurden, überführt und für fünf–sieben Tage zur Erholung stehengelassen.
Durchmustern nach Toleranz gegenüber Trockenheit
T1-Keimlinge wurden auf trockenes, steriles Filterpapier in einer Petrischale übertragen und man ließ sie für zwei Stunden bei 80% RH (relative Luftfeuchtigkeit) in einem Percival Growth CU3615, Mikromol^–1m2 (weißes Licht; Philips TL 65 W/25 Fluoreszenzröhre) austrocknen. Die RH wurde anschließend auf 60% abgesenkt und die Keimlinge wurden für weitere acht Stunden ausgetrocknet. Die Keimlinge wurden anschließend entfernt und auf ½ MS 0,6% Agarplatten positioniert, die mit 2 μg/ml Benomyl (Sigma-Aldrich) und 0,5 g/L MES (Sigma-Aldrich) supplementiert waren, und nach fünf Tagen ausgewertet.
Unter Stressbedingungen durch Trockenheit zeigten PpZF-4 überexprimierende Arabidopsis thaliana-Pflanzen eine Überlebensrate bei der Stressdurchmusterung von 94% (16 Überlebende aus 17 gestressten Pflanzen); während die untransformierte Kontrolle eine Überlebensrate von 28% (16 Überlebende von 57 gestressten Pflanzen) zeigte. Es ist beachtenswert, dass die Analysen dieser transgenen Zelllinien mit T1-Pflanzen durchgeführt wurden, und deshalb die Ergebnisse besser sind, wenn ein homozygoter, starker Expressor gefunden wird.
Tabelle 5 Zusammenfassung der Trockenheits-Stresstests
Beispiel 8
Nachweis des ZF-4-Transgens in den transgenen Arabidopsis-Zelllinien
Ein Blatt eines Wildtyps und eine transgene Arabidopsis-Pflanze wurden in 250 μl Hexadecyltrimethylammoniumbromid(CTAB)-Puffer (2% CTAB, 1,4 M NaCl, 8 mM EDTA und 20 mM Tris pH 8,0) und 1 μl β-Mercaptoethanol homogenisiert. Die Proben wurden für 30 Minuten bei 60–65°C inkubiert und 250 μl Chloroform wurde anschließend zu jeder Probe hinzugefügt. Die Proben wurden für 3 Minuten gevortext und für 5 Minuten bei 18000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde von jeder Probe entnommen und 150 μl Isopropanol wurde hinzugefügt. Die Proben wurden bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert, und für 10 Minuten bei 18000 × g zentrifugiert. Jedes Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 20 μl TE resuspendiert. 4 μl der obigen Suspension wurde in einer 20 μl PCR-Reaktion unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase (Roche Molecular Biochemicals) gemäß den Herstellerangaben verwendet. Ein binäres Vektorplasmid mit jedem klonierten Gen wurde als positive Kontrolle verwendet, und die genomische Wildtyp-C24-DNA wurde in den PCR-Reaktionen als Negativkontrolle verwendet. 10 μl PCR-Reaktion wurde auf 0,8% Agarose/Ethidiumbromidgel analysiert. Das verwendete PCR-Programm war wie folgt: 30 Zyklen von 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 62°C und 4 Minuten bei 70°C, gefolgt von 10 Minuten bei 72°C. Der folgende Primer wurde als 5'-Primer verwendet: Bfwd: 5'GCTGACACGCCAAGCCTCGCTAGTC3'. (SEQ ID NO: 53). Die Gen-spezifischen Primer und die Größe der amplifizierten Banden (Genproduktgröße) sind im Folgenden aufgelistet:
PpZF-4
Das Transgen wurde erfolgreich aus den transgenen T1-Zelllinien amplifiziert, jedoch nicht aus dem Wildtyp-C24. Dieses Ergebnis deutet daraufhin, dass die transgenen T1-Pflanzen mindestens eine Kopie des Transgens enthalten. Es bestand kein Anzeichen des Vorliegens von entweder identischen oder sehr ähnlichen Genen in der nicht-transformierten Arabidopsis thaliana-Kontrolle, welche durch dieses Verfahren amplifiziert werden konnte.
Beispiel 9
Nachweis der transgenen ZF-4-mRNA in transgenen Arabidopsis-Zelllinien
Die transgene Expression wurde unter Verwendung von RT-PCR nachgewiesen. Gesamt-RNA wurde aus Stress-behandelten Pflanzen unter Verwendung eines Verfahrens basierend auf (Verwoerd et al., 1989 NAR 17: 2362) isoliert. Blattproben (50–100 mg) wurden gesammelt und in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver zermahlen. Probengewebe wurde in 500 μl einer 80°C, 1:1 Mischung von Phenol zu Extraktionspuffer (100 mM LiCl, 100 mM Tris pH 8, 10 mM EDTA, 1% SDS) resuspendiert, und anschließend zum Vermischen kurz gevortext. Nach der Zugabe von 250 μl Chloroform wurde jede Probe kurz gevortext. Die Proben wurden anschließend für 5 Minuten bei 12000 × g zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde in ein frisches Eppendorf-Röhrchen abgetrennt. Die RNA wurde durch Hinzufügen von 1/10-Volumen 3 M Natriumacetat und 2 Volumina 95% Ethanol ausgefällt. Die Proben wurden durch Inversion gemischt und für 30 Minuten auf Eis positioniert. Die RNA wurde durch Zentrifugation bei 12000 × g für 10 Minuten pelletiert. Der Überstand wurde entfernt und die Pellets kurz luftgetrocknet. Die RNA-Probenpellets wurden in 10 μl DEPC-behandeltem Wasser resuspendiert.
Zur Entfernung kontaminierender DNA aus den Proben wurde jede Probe mit RNAse-freier DNAse (Roche) gemäß Herstellerempfehlungen behandelt. cDNA wurde aus der Gesamt-RNA unter Verwendung des Erststrang-cDNA-Synthesekits (Boehringer Mannheim) gemäß den Herstellerempfehlungen synthetisiert. Die PCR-Amplifizierung eines Gen-spezifischen Fragments aus der synthetisierten cDNA wurde unter Verwendung von Taq DNA-Polymerase (Roche) und Gen-spezifischen Primern (siehe Tabelle 4 für Primer) in der folgenden Reaktion durchgeführt: 1 × PCR-Puffer, 1,5 mM MgCl₂, 0,2 μM eines jeden Primers, 0,2 μM dNTPs, 1 Unit Polymerase, 5 μl cDNA aus der Synthesereaktion. Die Amplifizierung wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Denaturierung, 95°C, 1 Minute; Annealing, 62°C, 30 Sekunden; Verlängerung, 72°C, 1 Minute, 35 Zyklen; Verlängerung, 72°C, 5 Minuten; Halt, 4°C, andauernd. PCR-Produkte wurden auf einem 1% Agarosegel aufgetrennt, mit Ethidiumbromid angefärbt und unter UV-Licht unter Verwendung des Quantity-One-Geldokumentationsystem (Bio-Rad) sichtbar gemacht. Expression des Transgens wurde in der transgenen T1-Zelllinie nachgewiesen.
Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass das Transgen in der transgenen Zelllinie exprimiert wird und es deutet stark darauf hin, dass ihr Genprodukt Toleranz gegenüber Stress der Pflanze in der transgenen Zelllinie verbesserte. In Übereinstimmung mit der vorhergehenden Aussage konnte durch dieses Verfahren keine Expression identischer oder sehr ähnlicher endogener Gene nachgewiesen werden. Dieses Ergebnis steht in Übereinstimmung mit den Daten aus Beispiel 7.
Tabelle 6 Zur Amplifizierung der entsprechenden transgenen mRNA in der PCR verwendete Primer unter Verwendung von RNA als Matrize, die aus transgenen Arabidopsis thaliana-Pflanzen isoliert wurde
Beispiel 10
Konstruktion Stress-toleranter Sojabohnenpflanzen durch Überexpression des ZF-4-Gens
Zur Transformierung von Sojabohnen wie im Folgenden beschrieben wurde das Konstrukt pBSLVM163 verwendet.
Sojabohnensamen wurden mit 70% Ethanol für 4 Minuten bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln und anschließend 20% (v/v) Clorox, welches mit 0,05% (v/v) Tween supplementiert wurde, für 20 Minuten unter kontinuierlichem Schütteln Oberflächen-sterilisiert. Anschließend wurden die Samen 4-mal mit destilliertem Wasser gespült und auf einem angefeuchteten sterilen Filterpapier in einer Petrischale bei Raumtemperatur für 6 bis 39 Stunden positioniert. Die Samenschalen wurden abgezogen, und die Keimblätter wurden von der Embryoachse abgelöst. Die Embryoachse wurde zum Sicherstellen, dass die meristematische Region nicht beschädigt ist, untersucht. Die ausgeschnittenen Embryoachsen wurden in einer halboffenen, sterilen Petrischale gesammelt und bis zu einem Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 20% (Frischgewicht) in einer verschlossenen Petrischale bis zur weiteren Verwendung luftgetrocknet.
Eine Agrobacterium tumefaciens-Kultur wurde aus einer einzelnen Kolonie in festem LB-Medium plus geeigneten Antibiotika (z.B. 100 mg/ml Streptomycin, 50 mg/l Kanamycin) und anschließend durch Aufzucht der einzelnen Kolonie in flüssigem LB-Medium bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm von 0,8 hergestellt. Anschließend wurde die Bakterienkultur bei 7000 UpM für 7 Minuten bei Raumtemperatur pelletiert und in MS-(Murashige und Skoog, 1962)Medium resuspendiert, welches mit 100 μM Acetosyringon supplementiert war. Vor der Verwendung wurden die Bakterienkulturen in diesem Prä-Induktionsmedium für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Achse der Sojabohnen-zygotischen Keimlingembryonen mit etwa 15% Feuchtigkeitsgehalt wurden für 2 Stunden bei Raumtemperatur mit der prä-induzierten Agrobacterium-Suspensionskultur imbibiert. Die Embryonen wurden aus der Imbibitionskultur entfernt und auf Petrischalen übertragen, die festes MS-Medium enthielten, welches mit 2% Saccharose supplementiert war, und für 2 Tage in der Dunkelheit bei Raumtemperatur inkubiert. Wahlweise wurden die Embryonen an das obere Ende des angefeuchteten (flüssiges MS-Medium) sterilen Filterpapiers in einer Petrischale positioniert, und unter denselben Bedingungen wie oben beschrieben inkubiert. Nach dieser Zeitspanne wurden die Embryonen entweder auf festes oder flüssiges MS-Medium übertragen, welches mit 500 mg/L Carbenicillin oder 300 mg/L Cefotaxim supplementiert war, um die Agrobakterien abzutöten. Das flüssige Medium wurde zur Anfeuchtung des sterilen Filterpapiers verwendet. Die Embryonen wurden für 4 Wochen bei 25°C unter 150 μmol m²sec^–1 und einer 12-Stunden-Photozeitspanne inkubiert. Nachdem die Keimlinge Wurzeln gebildet hatten, wurden sie auf sterilen Metromixboden übertragen. Das Medium wurde vor dem Übertragen der Pflanzen auf den Boden von den in vitro-Pflanzen abgewaschen. Zur Begünstigung des Akklimatisierungsprozesses wurden die Pflanzen für 1 Woche unter einer Plastikbedeckung gehalten. Anschließend wurden die Pflanzen in eine Wachstumskammer überführt, wo sie bei 25°C unter einer 150 μmol m²sec^–1 Lichtintensität und einer 12-Stunden-Photozeitspanne für etwa 80 Tage inkubiert wurden.
Die transgenen Pflanzen wurden dann auf ihre verbesserte Toleranz gegenüber Trockenheit gemäß dem Durchmusterungsverfahren, welches in Beispiel 7 beschrieben ist, durchmustert, wobei es sich zeigte, dass transgene Expression Toleranz gegenüber Stress verleiht.
Beispiel 11
Konstruktion Stress-toleranter Raps-/Canolapflanzen durch Überexpression des ZF-4-Gens
Das Konstrukt pBPSLVM163 wurde zur Transformierung von Raps/Canola, wie unten beschrieben, verwendet.
Das hierin beschriebene Verfahren zur Pflanzentransformation ist auch auf Brassica und andere Nutzpflanzen anwendbar. Canolasamen werden mit 70% Ethanol für 4 Minuten bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln, und anschließend durch 20% (v/v) Clorox, welches mit 0,05% (v/v) Tween supplementiert war, für 20 Minuten bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln Oberflächen-sterilisiert. Anschließend werden die Samen 4-mal mit destilliertem Wasser gewaschen und auf einem angefeuchteten, sterilen Filterpapier in einer Petrischale bei Raumtemperatur für 18 Stunden positioniert. Anschließend werden die Samenschalen entfernt, und die Samen werden über Nacht in einer halboffenen, sterilen Petrischale luftgetrocknet. Während dieser Zeitspanne verlieren die Samen etwa 85% ihres Wassergehalts. Die Samen werden anschließend bei Raumtemperatur in einer verschlossenen Petrischale bis zur weiteren Verwendung gelagert. Die DNA-Konstrukte und die Embryoimbibition sind wie in Beispiel 10 beschrieben. Proben der primären transgenen Pflanzen (T0) werden mittels PCR zur Bestätigung des Vorliegens von T-DNA analysiert. Diese Ergebnisse werden durch Southern-Hybridisierung, bei welcher DNA auf einem 1% Agarosegel durch Elektrophorese aufgetrennt und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) übertragen wird, bestätigt. Der PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics) wird zur Herstellung einer Digoxigenin-markierten Sonde durch PCR verwendet, und wird wie vom Hersteller empfohlen verwendet.
Die transgenen Pflanzen werden anschließend auf ihre verbesserte Toleranz gegenüber Stress gemäß dem Durchmusterungsverfahren, welches in Beispiel 7 beschrieben ist, durchmustert, wobei gezeigt wird, dass transgene Expression Toleranz gegenüber Trockenheit verleiht.
Beispiel 12
Konstruktion Stress-toleranter Maispflanzen durch Überexpression des ZF-4-Gens
Das Konstrukt pBPSLVM163 wurde zur Transformierung von Mais, wie unten beschrieben, verwendet.
Die Transformierung von Mais (Zea Mays L.) wird mit dem Verfahren, welches von Ishida et al., 1996. Nature Biotch 14745–50 beschrieben ist, durchgeführt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welches „super-binäre" Vektoren trägt, co-kultiviert, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Dieses Verfahren stellt eine Transformationseffizienz zwischen 2,5% und 20% bereit. Die transgenen Pflanzen werden anschließend auf ihre verbesserte Toleranz gegenüber Trockenheit gemäß dem Durchmusterungsverfahren, welches in Beispiel 7 beschrieben ist, durchmustert, wobei gezeigt wird, dass transgene Expression Toleranz gegenüber Stress verleiht.
Beispiel 13
Konstruktion Stress-toleranter Weizenpflanzen durch Überexpression des ZF-4-Gens
Zur Transformierung von Weizen, wie unten beschrieben, wurde das Konstrukt pBPSLVM163 verwendet.
Die Transformierung von Weizen wird mit dem Verfahren, welches von Ishida et al. 1996 Nature Biotch. 14745–50 beschrieben ist, durchgeführt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens co-kultiviert, welches „super-binäre" Vektoren trägt, und transgene Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Dieses Verfahren stellt eine Transformationseffizienz zwischen 2,5% und 20% bereit. Die transgenen Pflanzen werden anschließend auf ihre verbesserte Toleranz gegenüber Stress gemäß dem Durchmusterungsverfahren, welches in Beispiel 7 beschrieben ist, durchmustert, wobei gezeigt wird, dass transgene Expression Toleranz gegenüber Trockenheit verleiht.
Beispiel 14
Identifizierung homologer und heterologer Gene
Gensequenzen können zur Identifizierung von homologen oder heterologen Genen aus cDNA oder genomischen Bibliotheken verwendet werden. Homologe Gene (z.B. Volllängen-cDNA-Klone) können durch Nukleinsäurehybridisierung unter Verwendung von z.B. cDNA-Bibliotheken isoliert werden. Abhängig von der Abundanz des Gens von Interesse werden 100000 bis 1000000 rekombinante Bakteriophagen ausplattiert und auf Nylonmembranen übertragen. Nach Denaturierung mit Alkali wird DNA auf der Membran zum Beispiel durch Quervernetzen mittels UV immobilisiert. Die Hybridisierung wird unter Bedingungen von hoher Stringenz ausgeführt. Die Hybridisierung in wässriger Lösung und Waschen wird bei einer Ionenstärke von 1 M NaCl und bei einer Temperatur von 68°C durchgeführt. Die Hybridisierungssonden werden zum Beispiel durch radioaktive (³²P) Nick-Transkriptionsmarkierung erzeugt (High Prime, Roche, Mannheim, Deutschland). Die Signale werden durch Autoradiographie nachgewiesen.
Teilweise homologe oder heterologe Gene, die miteinander in Beziehung stehen, jedoch nicht identisch sind, können in einer Weise unter Verwendung von Hybridisierungs- und Waschbedingungen von geringer Stringenz in einer zu dem oben beschriebenen Verfahren analogen Weise identifiziert werden. Für eine wässrige Hybridisierung wird die Ionenstärke üblicherweise bei 1 M NaCl gehalten, während die Temperatur schrittweise von 68 auf 42°C abgesenkt wird.
Die Isolierung von Gensequenzen mit Homologien (oder Sequenzidentität/-ähnlichkeit) in nur einer bestimmten Domäne (zum Beispiel 10–20 Aminosäuren) kann unter Verwendung synthetisch radiomarkierter Oligonkleotidsonden ausgeführt werden. Radiomarkierte Oligonukleotide werden durch Phosphorylierung am 5'-Ende von zwei komplementären Oligonukleotiden mit T4-Polynukleotidkinase hergestellt. Die komplementären Oligonukleotide werden zur Bildung von Concatemeren aneinander gefügt und ligiert. Die doppelsträngigen Concatemere werden anschließend zum Beispiel durch Nick-Transkription radiomarkiert. Die Hybridisierung wird üblicherweise unter Bedingungen von geringer Stringenz unter Verwendung hoher Oligonukleotidkonzentrationen durchgeführt.
Oligonukleotid-Hybridisierungslösung:

6 × SSC
0,01 M Natriumphosphat
1 mM EDTA (pH-Wert von 8)
0,5% SDS
100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA
0,1% fettfreie Trockenmilch

Während der Hybridisierung wird die Temperatur schrittweise auf 5–10°C unter die geschätzte Oligonukleotid-Tm oder bis auf Raumtemperatur abgesenkt und anschließend werden Wasch-Schritte und Autoradiographie durchgeführt. Waschen wird unter geringer Stringenz durchgeführt, wie zum Beispiel 3 Wasch-Schritte unter der Verwendung von 4 × SSC. Weitere Einzelheiten werden von Sambrook, J. et al. (1989), „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F. M. et al. (1994) „Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, beschrieben.
Beispiel 15
Identifizierung homologer Gene durch Durchmustern von Expressionsbibliotheken mit Antikörpern
c-DNA-Klone können zur Herstellung von rekombinantem Protein, zum Beispiel in E. coli verwendet werden (z.B. Qiagen QIAexpress pQE system).
Rekombinante Proteine werden anschließend üblicherweise über Ni-NTA-Affinitäts-Chromatographie (Quiagen) affinitätsgereinigt. Die rekombinanten Proteine werden anschließend zur Herstellung spezifischer Antikörper verwendet, zum Beispiel unter Verwendung von Standardmethoden zur Kaninchenimmunisierung. Die Antikörper werden unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule affinitäts-aufgereinigt, die mit dem rekombinanten Antigen gesättigt ist, wie es von Gu et al., 1994 BioTechniques 17: 257–262 beschrieben ist. Der Antikörper kann anschließend zum Durchmustern von Expressions-cDNA-Bibliotheken zur Identifizierung homologer oder heterologer Gene über ein immunologisches Durchmustern identifiziert werden (Sambrook, J. et al. (1989), „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F. M. et al. (1994) „Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons).
Beispiel 16
In vivo-Mutagenese
In vivo-Mutagenese von Mikroorganismen kann durch Passage von Plasmid-(oder anderer Vektor-)DNA durch E. coli oder andere Mikroorganismen (z.B. Bacillus spp. oder Hefen wie zum Beispiel Saccharomyces cerevisiae) durchgeführt werden, welche in ihren Fähigkeiten zur Aufrechterhaltung der Integrität ihrer genetischen Information beeinträchtigt sind. Übliche Mutator-Stämme weisen Mutationen in den Genen für das DNA-Reparatursystem auf (z.B. mutHLS, mutD, mutT, etc.; für Referenz siehe Rupp, W. D. (1996) DNA repair mechanisms, in: Escherichia coli und Salmonella, S. 2277–2294, ASM: Washington). Solche Stämme sind dem Fachmann wohl bekannt. Die Verwendung solcher Stämme ist zum Beispiel in Greener, A. und Callahan, M. (1984) Strategies 7: 32–34 veranschaulicht. Das Übertragen mutierter DNA-Moleküle in Pflanzen wird bevorzugt nach Selektion und Austesten in Mikroorganismen durchgeführt. Transgene Pflanzen werden gemäß verschiedenen Beispielen innerhalb der erläuternden Beispiele dieser Druckschrift erzeugt.
Beispiel 17
In vitro-Analyse der Funktion von Physcomitrella-Genen in transgenen Organismen
Die Bestimmung von Aktivitäten und kinetischen Parametern von Enzymen ist im Fachbereich etabliert. Versuche zur Bestimmung der Aktivität eines beliebigen gegebenen veränderten Enzyms müssen auf die spezifische Aktivität des Wildtyp-Enzyms zugeschnitten sein, welches im Rahmen der Fähigkeit eines Fachmanns liegt. Überblicke über Enzyme im Allgemeinen sowie über spezielle Einzelheiten, welche Struktur, Kinetik, Prinzipien, Verfahren, Anwendungen und Beispiele zur Bestimmung vieler Enzymaktivitäten betreffen, können zum Beispiel in den folgenden Referenzen gefunden werden: Dixon, M., und Webb, E. C., (1979) Enzymes. Longmans: London; Fersht, (1985), Enzyme Structure and Mechanism. Freeman: New York; Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman: San Francisco; Price, N. C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P. D., Hrsg. (1983) The Enzymes, 3. Ausg. Academic Press: New York; Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetik, 2. Ausg. VCH: Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H. U., Bergmeyer, J., Graßl, M., Hrgs. (1983–1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3. Ausg, Bd. I–XII, Verlag Chemie: Weinheim; und Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) Bd. A9, Enzymes. VCH: Weinheim, S. 352–363.
Die Aktivität von Proteinen, welche an DNA binden, kann durch verschiedene wohletablierte Verfahren, wie zum Beispiel DNA-Band-Shift-Assays (auch als Gelretardationsassays bezeichnet), gemessen werden. Die Wirkung solcher Proteine auf die Expression anderer Moleküle kann unter Verwendung von Reportergenassays gemessen werden (wie zum Beispiel wie in Kolmar, H. et al. (1995) EMBO J. 14: 3895–3904 und den darin zitierten Literaturhinweisen beschrieben). Reportergen-Testsysteme sind wohlbekannt und sowohl für Anwendungen in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Zellen unter Verwendung von Enzymen, wie zum Beispiel β-Galactosidase, grünes Fluoreszenzprotein und verschiedenen anderen, etabliert.
Die Bestimmung der Aktivität von Membrantransportproteinen kann gemäß den Methoden durchgeführt werden, wie sie zum Beispiel in Gennis, R. B. Pores, Channels and Transporters, in Biomembranes, Molecular Structure and Function S. 85–137, 199–234 und 270–322, Springer: Heidelberg (1989) beschrieben sind.
Beispiel 18
Reinigung des gewünschten Produkts aus transformierten Organismen
Die Gewinnung des gewünschten Produkts aus Pflanzenmaterial (d.h. Physcomitrella patens oder Arabidopsis thaliana), Pilzen, Algen, Wimperntierchen, C. glutamicum-Zellen oder anderen mit den hierin beschriebenen Nukleinsäuren transformierten Bakterienzellen oder aus dem Überstand der oben beschriebenen Kulturen, kann durch verschiedene Verfahren, die im Fachbereich bekannt sind, durchgeführt werden. Wenn das gewünschte Produkt nicht aus den Zellen abgesondert wird, kann es aus der Kultur durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit geerntet werden, die Zellen können durch Standardmethoden, wie zum Beispiel mechanische Kraft oder Beschallung mit Ultraschall, lysiert werden. Pflanzenorgane können mechanisch von anderem Gewebe oder Organen abgetrennt werden. Im Anschluss an die Homogenisierung werden Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt, und die Überstandsfraktion, die die löslichen Proteine enthält, wird zur weiteren Reinigung der gewünschten Verbindung zurückbehalten. Wenn das Produkt aus den gewünschten Zellen abgesondert wird, können die Zellen aus der Kultur durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit entfernt werden, und die Überstandsfraktion wird zur weiteren Reinigung zurückbehalten.
Die Überstandsfraktion aus beiden Reinigungsverfahren wird einem Chromatographie-Schritt an einem geeigneten Harz unterzogen, in welchem das gewünschte Molekül entweder auf dem Chromatographieharz zurückbehalten wird, während viele der Verunreinigungen in der Probe nicht zurückgehalten werden, oder wobei die Verunreinigungen durch das Harz zurückgehalten werden, während die Probe nicht zurückgehalten wird. Falls notwendig, können solche Chromatographie-Schritte unter Verwendung derselben oder unterschiedlicher Chromatographieharze wiederholt werden. Ein Fachmann ist in der Auswahl geeigneter Chromatographieharze und ihrer möglichst effektiven Anwendung für ein bestimmtes aufzureinigendes Molekül erfahren. Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration konzentriert und bei einer Temperatur, bei welcher die Stabilität des Produkts am größten ist, gelagert werden.
Es besteht eine große Anzahl an Reinigungsverfahren, die im Fachbereich bekannt sind, und die vorhergehenden Reinigungsverfahren sollten nicht einschränkend sein. Solche Reinigungsmethoden werden zum Beispiel in Bailey, J. E. & Ollis, D. F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986) beschrieben. Zusätzlich kann die Identität und Reinheit der isolierten Verbindungen durch Standardmethoden aus dem Fachbereich festgestellt werden. Diese umfassen Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC), spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschicht-Chromatographie, NIRS, enzymatischen Assay oder mikrobiologische Verfahren. Solche Analyseverfahren werden besprochen in: Patek et al., 1994 Appl. Environ. Microbiol. 60: 133–140; Malakhova et al., 1996 Biotekhnologiya 11: 27–32; und Schmidt et al., 1998 Bioprocess Engineer. 19: 67–70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, (1996) Bd. A27, VCH: Weinheim, S. 89–90, S. 521–540, S. 540–547, S. 559–566, 575–581 und S. 581–587; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Bd. 17.
Sequenzprotokoll

Claims

Transgene Pflanzenzelle, die mit einer für ein Transcription Factor Stress-Related Protein (TFSRP) kodierenden Nukleinsäure transformiert ist, wobei die Expression der Nukleinsäure in der Pflanzenzelle im Vergleich zu einer Wildtypsorte der Pflanzenzelle zu einer gesteigerten Toleranz gegenüber Stress durch Trockenheit führt, und wobei das TFSRP aus gemäß SEQ ID NO: 20 definiertem Zinc-Finger Factor-4 Protein (ZF-4) und Sequenzen, die mindestens 60% homolog zu der gesamten, in SEQ ID NO: 20 gezeigten Aminosäuresequenz sind, ausgewählt ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, wobei das TFSRP gemäß SEQ ID NO: 20 definiertes ZF-4 ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, wobei die für TFSRP-kodierende Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 12 definiertes ZF-4 ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, wobei die für TFSRP-kodierende Nukleinsäure mindestens 60% zu SEQ ID NO: 12 über die gesamte kodierende Region hinweg homolog ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, wobei die Pflanze eine einkeimblättrige Pflanze ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, wobei die Pflanze eine zweikeimblättrige Pflanze ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, wobei die Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Raps, Canola, Maniok, Pfeffer, Sonnenblume, Studentenblume, Nachtschattengewächsen, Kartoffel, Tabak, Aubergine, Tomate, Vicia-Spezies, Erbse, Alfalfa, Kaffee, Kakao, Tee, Salix-Spezies, Ölpalme, Kokosnuss, perennierendem Gras und Futterpflanzen.
Transgene Pflanze, die eine Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1–7 umfasst.
Saatgut, das durch eine transgene Pflanze erzeugt wurde, die eine Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1–7 umfasst, wobei das Saatgut reinrassig für eine gesteigerte Toleranz gegenüber Stress durch Trockenheit im Vergleich zu einer Wildtypsorte der Pflanzenzelle ist.
Agrarprodukt, welches durch die transgene Pflanze oder das Saatgut nach Anspruch 8 oder 9 erzeugt worden ist.
Isoliertes Transcription Factor Stress-Related Protein (TFSRP), welches aus gemäß SEQ ID NO: 20 definiertem Zinc-Finger Factor-4 Protein (ZF-4) und Sequenzen, die mindestens 60% homolog zu der gesamten, in SEQ ID NO: 20 gezeigten Aminosäuresequenz sind, ausgewählt ist.
Isoliertes TFSRP nach Anspruch 11, wobei das TFSRP gemäß SEQ ID NO: 20 definiertes ZF-4 ist.
Isolierte Nukleinsäure, die für Transcription Factor Stress-Related Protein (TFSRP) kodiert, wobei die für TFSRP-kodierende Nukleinsäure für ein TFSRP kodiert, welches aus gemäß SEQ ID NO: 20 definiertem Zinc-Finger Factor-4 Protein (ZF-4) und Sequenzen, die mindestens 60% homolog zu der gesamten, in SEQ ID NO: 20 gezeigten Aminosäuresequenz sind, ausgewählt ist.
TFSRP-kodierende Nukleinsäure nach Anspruch 13, wobei die TFSRP-kodierende Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 12 definiertes ZF-4 ist.
Isolierter rekombinanter Expressionsvektor, welcher eine Nukleinsäure nach Anspruch 13 oder 14 umfasst, wobei die Expression des Vektors in einer Wirtszelle im Vergleich zu einer Wildtypsorte der Wirtszelle zu einer gesteigerten Toleranz gegenüber Stress durch Trockenheit führt.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, die eine für ein Transcription Factor Stress-Related Protein (TFSRP) kodierende Nukleinsäure enthält, wobei die Expression der Nukleinsäure in der Pflanze im Vergleich zu einer Wildtypsorte der Pflanze zu einer gesteigerten Toleranz gegenüber Stress durch Trockenheit führt, umfassend das Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor, der die Nukleinsäure umfasst, und Erzeugen einer transgenen Pflanze mit einer im Vergleich zu einer Wildtypsorte der Pflanze gesteigerten Toleranz gegenüber Stress durch Trockenheit aus der Pflanze, wobei das TFSRP aus einem gemäß SEQ ID NO: 20 definierten Zinc-Finger Factor-4 Protein (ZF-4) und Sequenzen, die mindestens 60% homolog zu der gesamten, in SEQ ID NO: 20 gezeigten Aminosäuresequenz sind, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei das TFSRP gemäß SEQ ID NO: 20 definiertes ZF-4 ist.
Verfahren nach Anspruch 16, wobei die für TFSRP kodierende Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 12 definiertes ZF-4 ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die für TFSRP kodierende Nukleinsäure mindestens 60% homolog zu SEQ ID NO: 12 über die gesamte kodierende Region hinweg ist.
Verfahren zur Steigerung der Toleranz gegenüber Stress durch Trockenheit einer Pflanze, umfassend das Steigern der Expression eines Transcription Factor Stress-Related Proteins (TFSRP) in der Pflanze, wobei das TFSRP aus gemäß SEQ ID NO: 20 definiertem Zinc-Finger Factor-4 Protein (ZF-4) und Sequenzen, die mindestens 60% homolog zu der gesamten, in SEQ ID NO: 20 gezeigten Aminosäuresequenz sind, ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei das TFSRP gemäß SEQ ID NO: 20 definiertes ZF-4 ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die für TFSRP kodierende Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 12 definiertes ZF-4 ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die für TFSRP kodierende Nukleinsäure mindestens 60% homolog zu SEQ ID NO: 12 über die gesamte kodierende Region hinweg ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Pflanze nicht transgen ist.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die Pflanze transgen ist.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei die Pflanze mit einem Promotor transformiert ist, der die Expression von TFSRP steuert.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei der Promotor gewebespezifisch ist.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei der Promotor entwicklungsabhängig reguliert wird.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei die TFSRP-Expression durch Verabreichung eines Antisensemoleküls modifiziert wird, das die Expression von TFSRP hemmt.