DE60125751T2

DE60125751T2 - Zusammensetzungen und verfahren zur behinderung der vervielfältigung von hiv-1

Info

Publication number: DE60125751T2
Application number: DE60125751T
Authority: DE
Inventors: Gideon Short Hills GOLDSTEIN
Original assignee: Thymon LLC
Current assignee: Thymon LLC
Priority date: 2000-04-28
Filing date: 2001-04-20
Publication date: 2007-10-31
Anticipated expiration: 2021-04-21
Also published as: CA2406746A1; US6399067B1; ZA200208632B; NZ522824A; NO20025153L; ES2278741T3; JP2004514406A; US20050245454A1; AU5376201A; US6524582B2; PT1278534E; ATE350049T1; NO20025153D0; AU2001253762B9; CN1426306A; DE60125751D1; US20020192232A1; IL152507A0; MXPA02010632A; PL363071A1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Zusammensetzungen und Verfahren, die geeignet sind zum Inhibieren der Vervielfältigung des humanen Immundefizient Virus-1 (HIV-1) in infizierten symptomatischen oder asymptomatischen Patienten und zum Vermindern einer HIV-1 Vervielfältigung, welche einer Primärinfektion in vorher nicht infizierten Subjekten folgt, und so die Progression zu AIDS minimieren.
Hintergrund der Erfindung
Eine Vielzahl von Ansätzen zur Behandlung des humanen Immundefizienz Virus Typ 1 (HIV-1) hat sich auf das Transaktivierungs-(tat)-Gen von HIV-1 gerichtet, welches ein Protein (Tat) herstellt, welches wesentlich für die Transkription des Virus ist. Das tat-Gen und sein Protein wurden sequenziert und auf ihre Beteiligung an den vorgeschlagenen Behandlungen von HIV untersucht [siehe z.B. die U.S. Patente Nr. 5,158,877; 5,238,882 und 5,110,802; die internationalen Patentanmeldungen Nr. WO 92/07871, WO 91/10453, WO 91/09958 und WO 87/02989, veröffentlicht jeweils am 14. Mai 1992, 25. Juli 1991, 11. Juli 1991 und 21. Mai 1987]. Das Tat-Protein wird extrazellulär freigesetzt, was es verfügbar macht, um von anderen infizierten Zellen, um die Transkription von HIV-1 in den Zellen zu verstärken, und von nicht infizierten Zellen, um die Wirtszellgenaktivierungen zu verändern aufgenommen zu werden. Tat macht die Zellen anfällig für eine Infektion durch das Virus. Die Aufnahme von Tat durch Zellen ist sehr groß, und es wurde berichtet, dass sie durch eine kurze basische Sequenz des Proteins vermittelt wird [S. Fawell et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 664–668 (1994)].
Eine Immunisierung mit HIV-1 Tat-Protein als einem potenziellen AIDS-Impfstoff wird aktuell untersucht. Die HXB/LAV HIV-1 Tat-Sequenz wurde in den berichteten Studien als das Immunogen verwendet, entweder als ein rekombinantes Protein [A. Cafaro et al., Nat. Med. 5: 643–650 (1999)], ein DNA-Impfstoff [S. Calarota et al., Lancet, 351: 1320–5 (1998)], ein inaktiviertes Protein (Tat-Toxoid) [S. S. Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96(19): 10842–10847 (1999); A. Gringeri et al., J. Hum. Virol., 1: 293–8 (1998)] oder als ein DNA-Impfstoff, welcher inaktives Tat exprimiert [E. Caselli et al., J. Immunol., 162: 5631–5638 (1999)]. Immunisierungen mit der vollständigen Tat-Sequenz induzierten sowohl zelluläre als auch humorale Immunität. [Siehe ebenfalls M. C. Rhe et al., J. Acguir. Immune Defic. Syndr. Hum Virol. 10: 408–416 (1995); C. J. Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 8116–8120 (1997); und andere].
Die internationale Patentanmeldung Nr. WO 92/14755, veröffentlicht am 3. September 1992, betrifft das Tat-Protein und den Integrin Zelloberflächenrezeptor, welcher in der Lage ist, das Tat-Protein zu binden. Zwei Tat-Sequenzen, die Integrin binden, sind identifiziert: -Arg-Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg- [SEQ ID NR: 1], sowie -Gly-Arg-Gly-Asp-Ser-Pro- [SEQ ID NR: 2]. Diese Sequenzen stellen die basische Region oder Domäne dar, welche die dominante Bindungsstelle für das Integrin darstellt. Diese Beschreibung zeigt, dass eine Anzahl von Peptiden, die diesen Tat-Sequenzen entsprechen und die entsprechenden Integrine eine Zellbindung an Tat beschichtete Platten in vitro blockieren, so wie es Antikörper gegen die dazugehörigen Integrine tun. Diese Beschreibung zeigt jedoch ebenfalls, dass diese Reagenzien eine Aufnahme von funktionellem Tat durch Zellen nicht blockieren (siehe Beispiel 9 in der WO 92/14755), und daher den vorgeschlagenen Wirkungsmechanismus für einen therapeutischen Nutzen bei einer HIV-Infektion aufheben. Die in dieser internationalen Anmeldung beschriebenen Tat-Sequenzen sind unterschiedlich zu den erfindungsgemäßen Peptidimmunogenen.
Sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper gegen Tat-Protein wurden leicht in Tieren hergestellt, und es wurde gezeigt, dass sie die Aufnahme von Tat- Protein in vitro blockieren [siehe z.B. D. Brake et al., J. Virol., 64: 962 (1990); D. Mann et al., EMBO J., 10: 1733 (1991); J. Abraham et al., oben zitiert; P. Auron et al., oben zitiert, M. Jaye et al., oben zitiert; G. Zauli et al., oben zitiert]. Neuere Berichte zeigten, dass monoklonale oder polyklonale Antikörper gegen Tat-Protein, die zu Gewebskulturmedium hinzugefügt wurden, eine HIV-1 Infektion in vitro attenuierten [L. Steinaa et al., Arch. Virol., 139: 263 (1994); M. Re et al., oben zitiert und G. Zauli et al., J. Acg. Imm. Def. Syndr. Hum. Retrovirol., 10: 306 (1995)].
Die eigenen Veröffentlichungen des Erfinders [G. Goldstein, Nature Med., 2: 960 (1996) und die internationale Patentanmeldung Nr. WO 95/31999, veröffentlicht am 30. November 1995] gaben einen Überblick über den Beleg, der darauf hinweist, dass eine Sekretion von HIV-1 Tat-Protein von infizierten Zellen und die Aufnahme durch sowohl infizierte als auch nicht infizierte Zellen wichtig für die Infektiösität von HIV-1 war. Frühere Untersuchungen zeigten ebenfalls, dass Antikörper gegen Tat-Protein die Aufnahme von Tat in vitro blockierten und die Infektiösität in vitro inhibierten. Eine aktive Immunisierung von Säugern wurde vorgeschlagen, um Antikörper gegen HIV-1 Tat-Protein als einen möglichen AIDS-Impfstoff zu induzieren. Siehe ebenfalls, G. Goldstein et al., "Minimization of chronic plasma viremia in rhesus macaques immunized with synthetic HIV-1 Tat peptides and infected with a chimeric simian/human immunodeficiency virus (SHIV₃₃)", Vaccine, 18: 2789 (2000).
Andere Veröffentlichungen des Erfinders, die internationale Patentanmeldung Nr. WO 99/02185, veröffentlicht am 21. Januar 1999 und das U.S. Patent Nr. 5,891,994, erteilt am 06. April 1999, legten ein neues Konzept zur Behandlung und Verhinderung von einer HIV-1 Infektion offen, welches Tat-Sequenzen verwendet, welche als Epitope durch das Kaninchen Immunsystem erkannt wurden. Anders als die oben diskutierten Offenbarungen des Standes der Technik betreffen diese Veröffentlichungen therapeutische und immunogene Kombinationen, die mindestens zwei und vorzugsweise alle vier der Tat-Peptide oder -Polypeptide erfordern, welche die "Epitop I"-Sequenzen umfassen, welche sich wie folgt über die Tat-Aminosäurereste 4 (oder 5) bis 10 erstrecken: -Asp-Pro-X₇-Leu-Glu-Pro- [SEQ ID NR: 3] oder R¹-Val-Asp-Pro-X₇-Leu-Glu-Pro-R² [SEQ ID NR: 4], wobei X₇ Arg, Lys, Ser oder Asn ist. Solche Zusammensetzungen induzieren Antikörper, die mit den meisten HIV-1 Tat-Proteinen reagieren und die Vervielfältigung von HIV-1 beeinträchtigen. Gemäß dieser Veröffentlichung können bestimmte andere Tat-Sequenzen, die ein "Epitop II"-Peptid oder -Polypeptid umfassen, welches sich auf die Tat-Aminosäurereste 41–50 erstreckt, mit der Formel R3-Lys-X₄₂-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-R4 [SEQ ID NR: 5], wobei X₄₂ aus der Gruppe, bestehend aus Gly oder Ala ausgewählt wurde, zu dieser Zusammensetzung hinzugefügt werden. Alternativ kann ein "Epitop III"-Peptid oder -Polypeptid zu dieser Zusammensetzung hinzugefügt werden, welches sich auf die Tat-Aminosäurereste 56–62 mit der Formel R5-Arg-Arg-X₅₈-Z₅₉-A₆₀-Y₆₁-Ser-R6 [SEQ ID NR: 6] erstreckt, wobei X₅₈ aus der Gruppe, bestehend aus Ala, Pro, Ser und Gln ausgewählt wurde; wobei Y₆₁ aus der Gruppe, bestehend Asp, Asn, Gly und Ser ausgewählt wurde; wobei Z₅₉ aus der Gruppe, bestehend aus Pro und His ausgewählt wurde; wobei A₆₀ aus der Gruppe, bestehend aus Gln und Pro ausgewählt wurde. Weiterhin alternativ kann ein "Epitop IV"-Peptid oder -Polypeptid zu dieser Zusammensetzung hinzugefügt werden, welches sich auf die Tat-AS-Reste 62–73 mit der Formel R7-Ser-Gln-X₆₄-His-Gln-Y₆₇-Ser-Leu-Ser-Lys-Gln-Pro-R8 [SEQ ID NR: 7] erstreckt, wobei X₆₄ aus der Gruppe, bestehend aus Asn und Thr ausgewählt ist; wobei Y₆₇ aus der Gruppe, bestehend aus Ala und Val ausgewählt ist. Die Zusammensetzung selber kann verwendet werden, um Antikörper gegen eine große Zahl von Tat-Sequenzen zu induzieren, die charakteristisch für die multiplen Varianten von HIV-1 sind. Die Zusammensetzungen oder Antikörper, die erzeugt wurden, werden als Impfstoff oder prophylaktische Behandlungen gegen diese multiplen Varianten verwendet.
Trotz des wachsenden Wissens über HIV-1 Erkrankungsprogression bleibt ein Bedarf im Stand der Technik für die Entwicklung von Zusammensetzungen und Verfahren zur sowohl prophylaktischen als auch therapeutischen Behandlung von HIV-1 bestehen, die geeignet sind, die viralen Spiegel von HIV-1 zur Behandlung und möglichen Prävention der nachfolgenden, allgemein tödlichen AIDS-Erkrankung zu senken.
Zusammenfassung der Erfindung
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die mindestens zwei Varianten eines Peptids oder Polypeptids der Epitop I Formel R1-Asp-Pro-Y₇-Leu-X₉-Pro-Trp-Z₁₂-R2 [SEQ ID NR: 8] umfasst, wobei Y₇ aus der Gruppe, bestehend aus Arg, Lys, Ser und Asn ausgewählt ist; wobei X₉ aus der Gruppe, bestehend aus Glu und Asp ausgewählt ist; wobei Z₁₂ aus der Gruppe, bestehend aus Lys und Asn ausgewählt ist; wobei R1 aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, einer Niederalkylgruppe, einer Niederalkanoylgruppe und einer Sequenz von zwischen 1 bis etwa 5 Aminosäuren, gegebenenfalls mit einer Niederalkylgruppe oder Niederalkanoylgruppe substituiert, ausgewählt ist; wobei R2 aus der Gruppe, bestehend aus einem freien Hydroxyl, einem Amid und einer Sequenz von einer oder bis zu etwa 5 zusätzlichen Aminosäuren, gegebenenfalls mit einem Amid substituiert, ausgewählt ist. In dieser Zusammensetzung sollte mindestens eine der zwei Varianten die Formel aufweisen, wobei Y₇ Arg ist und Z₁₂ Lys ist, und mindestens sollte eine zweite der beiden Varianten die Formel aufweisen, in welcher Y₇ Asn ist und Z₁₂ Asn ist. Jedes Peptid dieser Zusammensetzung wird als ein HIV-1 Tat Epitop I durch ein Primatenimmunsystem erkannt. Diese Formel erlaubt die Konstruktion und Verwendung einer Vielzahl von Peptidkombinationen.
In einem anderen Aspekt enthält die oben beschriebene Zusammensetzung weiterhin ein oder mehrere zusätzliche(s) Peptid(e) oder Polypeptid(e), welche(s) andere Aminosäuresequenzen darstellten, das/die den HIV-1 Tat-Aminosäureresten 5 bis Aminosäurerest 12 entspricht/entsprechen. Diese optionalen Aminosäuresequenzen werden unten im Detail beschrieben. Diese Sequenzen stammen vorzugsweise von einem HIV-1-Stamm mit einer Tat-Proteinvariante an dieser Position.
In einem anderen Aspekt stellt diese Erfindung eine oben beschriebene Zusammensetzung bereit, die Peptide oder Polypeptide enthält, welche mindestens die zwei benötigten Epitop I Peptide umfassen, die von Primaten erkannt werden (und vorzugsweise zusätzliche Epitop I Peptide), in Kombination mit einem oder mehreren HIV-1 Tat Epitopen II, III und/oder IV. Die Epitope II, III und IV sind die HIV-1 Tat-Peptidformeln, die in der internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 99/02185 beschrieben werden. Solche Zusammensetzungen können angemessen HIV-1 Tat-Peptide kombinieren, um eine Zusammensetzung bereitzustellen, die Antikörper induziert, die mit mehr als etwa 95% aller bekannten HIV-1 Tat-Proteine reagieren.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung eine Antikörperzusammensetzung bereit, die vorzugsweise in einem Primaten erzeugte Antikörper umfasst, die spezifisch an ein Peptid oder Polypeptid der Formel R1-Asp-Pro-Y₇-Leu-X₉-Pro-Trp-Z₁₂-R2 [SEQ ID NR: 8] binden, wobei Y₇ aus der Gruppe, bestehend aus Arg, Lys, Ser und Asn ausgewählt ist; wobei X₉ aus der Gruppe, bestehend aus Glu und Asp ausgewählt ist; wobei Z₁₂ aus der Gruppe, bestehend aus Lys und Asn ausgewählt ist; wobei R1 aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, einer Niederalkylgruppe, einer Niederalkanoylgruppe und einer Sequenz von zwischen 1 bis etwa 5 Aminosäuren, gegebenenfalls mit einer Niederalkylgruppe oder Niederalkanoylgruppe substituiert, ausgewählt ist; wobei R2 aus der Gruppe, bestehend aus einem freien Hydroxyl, einem Amid und einer Sequenz von 1 bis zu etwa 5 zusätzlichen Aminosäuren, gegebenenfalls mit einem Amid substituiert, ausgewählt ist. Diese Antikörper-Zusammensetzung umfasst einen Antikörper, der an die Epitop I Variante bindet, in der Y₇ Arg ist und Z₁₂ Lys ist und mindestens einen zweiten Antikörper, der an eine zweite Epitop I Variante bindet, in der Y₇ Asn ist und Z₁₂ Asn ist. Andere Antikörper, die gegen andere Varianten als die zwei beschriebenen Varianten gerichtet sind, können ebenfalls in diese Zusammensetzung eingeschlossen werden. Diese Antikörper in der Zusammensetzung binden an Epitop I Sequenzen, die durch das Primatenimmunsystem erkannt werden, deren Epitop auf vielfältigen Varianten von HIV-1 Tat-Proteinen anwesend ist. Diese Antikörper schließen, wie unten im Detail beschrieben, eine Vielzahl von Antikörperkonstrukten, wie monoklonale Antikörper, ein.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein synthetisches Gen bereit, welches nacheinander ein Peptid oder Polypeptid kodiert, das mindestens zwei Varianten eines Peptids oder Polypeptids der wie oben definierten Epitop I Formel R1-Asp-Pro-Y₇-Leu-X₉-Pro-Trp-Z₁₂-R2 [SEQ ID NR: 8] enthält. In diesem synthetischen Gen sollte mindestens eine der zwei Varianten die Formel aufweisen, in welcher Y₇ Arg ist und Z₁₂ Lys ist, und mindestens eine zweite der beiden Varianten sollte die Formel aufweisen, in welcher Y₇ Asn ist und Z₁₂ Asn ist. Dieses synthetische Gen umfasst, gegebenenfalls ein carboxyl-terminales Epitop II Peptid, wie es durch das Primaten Immunsystem erkannt wird. Alternativ enthält das rekombinante oder synthetische Gen die sieben oder acht bevorzugten, von Primaten erkannten Epitop I Aminosäuresequenzen, die unten ausgewiesen werden. Das synthetische Gen kann jede Aminosäuresequenz enthalten, die durch eine Spacersequenz abgetrennt ist oder kann jedes Peptid/Polypeptid in einem offenen Leserahmen mit einem Trägerprotein exprimieren. Das synthetische Gen kann vom Trägerprotein durch einen Spacer abgetrennt sein, wenn der Spacer mit einer von Primaten erkannten Epitop I Sequenz fusioniert ist, eine Epitop II Sequenz am Carboxyl-Terminus des rekombinanten Proteins übrig lassend. Weitere Ausführungsformen schließen vielfältige Epitop I Peptide der oben genannten Formel ein, die miteinander und an das Trägerprotein fusioniert sind.
In noch einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein synthetisches Molekül, z.B. einen Vektor, bereit, das das oben beschriebene synthetische Gen, gegebenenfalls mit regulatorischen Nukleinsäuresequenzen verbunden, welche die Expression des Produkts des synthetischen Gens in einer Wirtszelle lenken und steuern, umfasst.
Ebenfalls hier beschrieben wird ein rekombinanter Mikroorganismus, z.B. ein Virus oder ein kommensales Bakterium, welcher das oben beschriebene synthetische Gen oder synthetische Molekül enthält. Dieser Mikroorganismus ist in der Lage, Mehrfachkopien des Produkts des Gens oder des Moleküls in einem Wirt zu exprimieren.
Noch ein anderer Aspekt der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die zum Induzieren von Antikörpern geeignet ist, die mit einer großen Anzahl von bekannten HIV-1 Tat-Proteinen, z.B. mehr als 95% und vorzugsweise mehr als 99% der bekannten Tat-Proteine, reagieren. Diese induzierten Antikörper können die Vervielfältigung von HIV-1 beeinträchtigen. Die pharmazeutische Zusammensetzung umfasst in einem pharmazeutisch verträglichen Träger mindestens eine der oben beschriebenen rekombinanten oder synthetischen Peptid/Polypeptid-Zusammensetzungen oder das oben beschriebene synthetische Gen/Molekül oder den oben beschriebenen rekombinanten Mikroorganismus.
Noch ein weiterer Aspekt der Erfindung ist eine pharmazeutische Zusammensetzung, die zum Beeinträchtigen der Vervielfältigung von HIV-1 geeignet ist, wobei diese Zusammensetzung eine oben beschriebene Antikörper-Zusammensetzung oder monoklonale Antikörper-Zusammensetzung enthält.
Ebenfalls offenbart wird ein Verfahren zum Senken der viralen Spiegel von HIV-1, welches einbezieht, dass ein Mensch oder anderer Primat den oben beschriebenen Antikörper induzierenden pharmazeutischen Zusammensetzungen ausgesetzt wird, aktiv Antikörper induziert werden, die mit den meisten HIV-1 Tat-Proteinen reagieren und die Vervielfältigung des Virus in vivo beeinträchtigt wird. Dieses Verfahren ist angemessen für ein HIV-1 infiziertes Subjekt mit einem kompetenten Immunsystem oder für ein nicht infiziertes oder chronisch infiziertes, aber asymptomatisches Subjekt. Das Verfahren induziert Antikörper, die mit HIV-1 Tat-Proteinen reagieren und die eine virale Vervielfältigung während jeder anfänglichen akuten Infektion mit HIV-1 vermindern und die weiterhin eine chronische Virämie minimieren, die zu AIDS führt.
Ebenfalls offenbart wird ein Verfahren zum Senken der viralen Spiegel von HIV-1 durch Verabreichen einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche die oben beschriebenen Antikörper-Zusammensetzungen enthält, an einen Menschen, der nicht in der Lage ist, eine wirksame oder schnelle Immunantwort auf eine Infektion mit HIV-1 auszubilden. Das Verfahren kann dauerhaftes Verabreichen der Zusammensetzung einbeziehen.
Ebenfalls offenbart werden Verfahren zur Herstellung der oben beschriebenen Zusammensetzungen, sowie der Wirtszellen, die mit solchen Zusammensetzungen transfiziert sind.
Ebenfalls offenbart wird ein Kit, das zum Messen und zum Nachweis von Titern und Spezifitäten der Antikörper geeignet ist, die durch Immunisieren mit den oben beschriebenen Zusammensetzungen induziert wurden. Das erfindungsgemäße Kit schließt vorzugsweise die beiden benötigten oben beschriebenen Epitop I Peptide ein, sowie zusätzliche Peptide des Epitop I, die von Primaten erkannt werden und mögliche zusätzliche Peptide der Epitope II bis IV und beschichtete feste Träger, ein markiertes Reagens zum Nachweisen der Bindung von Antikörpern an diese Peptide und verschiedene Substrate und Vorrichtungen zum Hervorrufen und Nachweisen der Signale, die durch die Markierungen bereitgestellt werden, sowie konventionelle Vorrichtungen zum Entnehmen von Blutproben, angemessene Röhrchen und andere diagnostische Assay Komponenten.
Ebenfalls offenbart wird ein Verfahren zum Nachweis der Titer und Reaktionsmuster von Antikörpern in Subjekten, welche mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen immunisiert wurden. Das Verfahren schließt die Schritte des Inkubierens von Verdünnungen der biologischen Flüssigkeit des Subjekts, z.B. Serum, mit Platten oder Kügelchen ein, an welche ein oder mehrere Peptide der erfindungsgemäßen Epitop I Sequenzen und gegebenenfalls die Epitope II bis IV gebunden wurden, des Abwaschens von nicht gebundenen biologischen Materialien und des Messens jeden Antikörpers, welcher an die Peptide mit einem markierten Reagens gebunden hat, z.B. ein Anti-Mensch Immunglobulin, welches mit einem Enzym verbunden ist, ein. Abhängig vom Typ der angewendeten Markierung kann das durch die Markierung hergestellte Signal durch weiteres Hinzufügen eines Substrats hervorgerufen werden, welches mit dem Enzym reagiert, z.B. eine Farbänderung hervorruft. Andere gängige Markierungen können ebenfalls in dieses Assaydesign eingefügt werden.
Andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden weiterhin in der folgenden detaillierten Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen davon beschrieben.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A stellt ein Diagramm von ELISA-Titern von Kaninchen-Antiserum gegen größere lineare Epitop I Peptide auf verkürzten Nachweispeptiden dar, ausgedrückt als prozentualer Anteil der maximalen Bindung an größere Peptide. Die N- oder C-terminalen Aminosäuren der entsprechenden Nachweispeptide sind unter jeder Säule im Einbuchstabencode dargestellt.
1B stellt ein Diagramm von ELISA-Titern von Primaten-Antiserum gegen größere lineare Epitop I Peptide auf verkürzten Nachweispeptiden dar, ausgedrückt als prozentualer Anteil der maximalen Bindung an größere Peptide. Die N- oder C-terminalen Aminosäuren der entsprechenden Nachweispeptide sind unter jeder Säule im Einbuchstabencode dargestellt.
2A stellt ein Diagramm von ELISA-Titern von Kaninchen-Antiserum gegen lineare Epitop II Peptide auf verkürzten Nachweispeptiden dar, ausgedrückt als prozentualer Anteil der maximalen Bindung an größere Peptide. Die N- oder C-terminalen Aminosäuren der entsprechenden Nachweispeptide sind unter jeder Säule im Einbuchstabencode dargestellt.
2B stellt ein Diagramm von ELISA-Titern von Primaten-Antiserum gegen größere lineare Epitop II Peptide auf verkürzten Nachweispeptiden dar, ausgedrückt als prozentualer Anteil der maximalen Bindung an größere Peptide. Die N- oder C-terminalen Aminosäuren der entsprechenden Nachweispeptide sind unter jeder Säule im Einbuchstabencode dargestellt.
3A stellt das Design eines immunogenen pentavalenten Epitop I/Epitop II HIV-1 Tat-Konstrukts im Dreibuchstaben Aminosäurencode dar [SEQ ID NR: 12].
3B stellt das Design eines oktavalenten universalen Epitop I im Dreibuchstaben Aminosäurecode dar [SEQ ID NR: 13].
3C stellt das Design eines immunogenen univalenten universalen Epitop II Konstrukts im Dreibuchstaben Aminosäurecode dar [SEQ ID NR: 14].
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt eine Lösung für das oben angegebene Problem durch Bereitstellen zusätzlicher Zusammensetzungen bereit, die Antikörper in nicht infizierten oder in im frühen Stadium HIV-1 infizierten Subjekten induzieren, die noch in der Lage sind, eine Immunantwort auf ein Immunogen auszubilden, wobei die Antikörper mit einer großen Zahl (d.h. mehr als 95% und vorzugsweise mehr als 99%) der bekannten HIV-1 Tat-Proteinvarianten reagieren. Der Begriff "Tat-Sequenz (oder -Protein) Variante" bezeichnet ein Polypeptid oder Peptid, welches Tat-Protein Aminosäurereste enthält oder eine Sequenz aus einem anderen HIV-1-Stamm Tat-Protein, welches im Wesentlichen ähnlich zu der Konsensussequenz aus Tabelle I [SEQ ID NR: 15] ist. Jede Variante kann sich von der Konsensussequenz und/oder von einer anderen Variante durch mindestens eine Aminosäureänderung innerhalb der Reste von Interesse für die Epitope I bis IV unterscheiden. Diese Änderung kann die gleiche oder eine unterschiedliche antigene Spezifität zu dem besonderen Tat-Epitop bereitstellen, wenn es zu der erfindungsgemäßen Zusammensetzung hinzugefügt wird.
Die durch die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen induzierten Antikörper können eine Vervielfältigung von HIV-1 inhibieren, was eine weitere Erkrankungsprogression zu AIDS verhindert. Antikörper-Zusammensetzungen werden ebenfalls für die Verwendung bei infizierten oder nicht infizierten Menschen bereitge stellt, die nicht in der Lage sind, eine wirksame oder schnelle Immunantwort auf eine HIV-1 Infektion auszubilden. Diese Zusammensetzungen sind in der Lage, mit einer großen Zahl von Tat-Proteinen zu reagieren und reduzieren daher virale Spiegel von HIV-1. Diese Antikörper sind in sowohl therapeutischen als auch prophylaktischen Zusammenhängen geeignet, um die Entwicklung von AIDS in einer großen Population zu kontrollieren, die HIV-1-Stämmen, welche auf eine Infektion immunologisch verschiedene Tat-Proteine herstellen, ausgesetzt ist oder durch sie infiziert ist.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen schließen Peptide oder Proteine, die auf Peptiden basieren, die von einem Epitop eines HIV-1 Tat-Proteins bereitgestellt werden, gegen welches Primaten Antikörper entwickeln oder Nukleinsäuresequenzen, welche die Peptide und Polypeptide, die Antikörper gegen Tat in Primaten induzieren, kodieren, ein. Diese induzierten Antikörper beeinträchtigen wiederum eine Vervielfältigung von HIV-1.
HIV-1 Tat-Protein wird von zwei Exons hergestellt: Exon 1 kodert ein 72 Aminosäuren (AS) Protein, welches ohne Spleißen exprimiert werden kann oder welches mit den ungefähr 15–32 Aminosäuren gespleißt werden kann, die von Exon 2 kodiert werden. Die HIV-1 Tat-Exon I Sequenz tritt in Tabelle I auf und stellt eine Konsensussequenz dar, welche auf Tat-Proteinsequenzen von 31 bekannten HIV-1-Stämmen basiert, die in dem verbreiteten Subtypus B gefunden wurden [NIH Los Alamos Datenbank]. Die Aminosäurepositionen, in denen Variationen auftreten, sind in Kleinbuchstaben dargestellt. In Tabelle I [SEQ ID NR: 15] stellt der Aminosäurerest in Position 73 das erste Pro des Exon 2 von HIV-1 Tat dar. Da das 72 Aminosäurenprodukt von Exon 1 alleine zu zellulärer Aufnahme und Aktivierung in der Lage ist, ist es notwendig, dass Antikörper mit dem 72 Aminosäurenpeptid reagieren und seinen interzellulären Transport verhindern. HIV-1 Tat enthält eine cysteinreiche Region zwischen den AS-Positionen 22 und 37 von Exon 1 [SEQ ID NR: 15], mit einer einzelnen kovalenten Bindung zwischen Cys₂₁ und Cys₃₇, welche eine komplexe Tertiärstruktur erzeugt. Die wissenschaftliche Literatur hat darauf hingewiesen, dass diese Region nicht immunogen zu sein scheint. Die vorwiegenden Antikörper gegen Tat sind gegen die lineare N-terminale Pro-reiche Region (AS1–21) und gegen die lineare basische Region (AS44–65) gerichtet, über einen zusätzlichen Antikörper gegen AS62–73 wurde berichtet.
Der Erfinder hat kürzlich Epitope identifiziert, d.h. Bindungsregionen, die von Kaninchen Antikörpern (antigenen Sequenzen) in der N-terminalen linearen Sequenz 1–22 (22AS) von Exon 1 [SEQ ID NR: 15] der Tat-Varianten erkannt werden und hat vier B-Zellepitope in HIV-1 Tat definiert. Wie kürzlich in der internationalen Patentveröffentlichung WO 99/02185 beschrieben, wurden immunogene Regionen dieser größeren Sequenz vom Kaninchen Immunsystem erkannt. Diese Regionen werden in der Konsensussequenz von Exon 1 in Tabelle I unten identifiziert: Epitop I wurde von Kaninchen Antikörpern als die neun Aminosäurensequenz der AS-Positionen 2–10 von Exon 1 identifiziert. Epitop II wurde als die acht Aminosäurensequenz der AS-Positionen 43–50 von Exon 1 identifiziert. Epitop III wurde als die sieben Aminosäurensequenz der AS-Positionen 56–62 von Exon 1 identifiziert. Epitop IV wurde als die zwölf Aminosäurensequenz der AS-Positionen 62–73 von Tat, einschließlich des ersten Pro (AS 73) von Exon 2, identifiziert und überlappt Ser 62 von Epitop III.
Tabelle I – Konsensus Tat-Sequenz
In der vorliegenden Erfindung hat der Erfinder jedoch eine überraschende Verschiebung in den Aminosäuresequenzen, insbesondere von Epitop I nachgewiesen, welches von B-Zellen in Primaten erkannt wird. In Tabelle I sind Epitop I und II Sequenzen, welche von Primaten erkannt werden, unterstrichen. Das von Primaten erkannte Epitop I erstreckt sich auf die Tat-Aminosäurereste 5 bis 12. Die Sequenz von Epitop II, die von B-Zellen in Primaten erkannt wird, erstreckt sich auf die Aminosäuren 41–50. Die Epitope III und IV sind die gleichen Epitope, die in Kaninchen erkannt werden, wie in der WO 99/02185 berichtet.
A. Immunogene, von Primaten erkannten Epitop I Zusammensetzungen
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die mindestens zwei Varianten eines Peptids oder Polypeptids enthält, welches vom Primaten Immunsystem erkannt wird und die eine spezifische humorale Immunantwort (für den erfindungsgemäßen Zweck) in einem Primaten auslöst, der den Sequenzen in vivo ausgesetzt ist. Diese von Primaten erkannten Epitop I Aminosäuresequenzen entsprechen den Aminosäureresten 5–12 der Tat-Konsensussequenz [SEQ ID NR: 15] aus Tabelle I, die von einer Zahl von "Tat-Sequenzvarianten" abgeleitet wurde. Von Primaten erkanntes Epitop I definiert Peptide der allgemeinen Formel: R1-Asp-Pro-Y₇-Leu-X₉-Pro-Trp-Z₁₂-R2 [SEQ ID NR: 8], wobei Y₇ Arg, Lys, Ser oder Asn ist; X₉ Glu oder Asp ist und Z₁₂ Lys oder Asn ist. Diese Formel erlaubt eine Vielzahl von Varianten der Säuger Epitop I Pep tide. Die erfindungsgemäße Zusammensetzung sollte mindestens eine Peptidvariante enthalten, wobei Y₇ Arg ist und Z₁₂ Lys ist und mindestens eine zweite Peptidvariante, in welcher Y₇ Asn ist und Z₁₂ Asn ist.
Die beschriebenen Aminosäuren, die in der Formel des von Primaten erkannten Epitop I oben erscheinen, stellen eine minimale reaktive Primaten Epitop I Sequenz dar. Jedes Immunogen, welches durch die Formel definiert wird, die in erfindungsgemäßen Verfahren zum Erzeugen von Antikörpern gegen die minimale Epitop I Sequenz verwendet wird, kann eine größere Aminosäuresequenz sein. Zum Beispiel werden die minimalen Epitop I Aminosäuren von anderen Aminosäuren flankiert, so dass die gesamte immunogene Epitop I Sequenz zwischen 8 und etwa 25 Aminosäuren lang ist. Die Identität der flankierenden Aminosäuren ist für die biologische Funktion des Epitop I Immunogens nicht wesentlich. Insbesondere beeinträchtigen zusätzliche Aminosäuren am N-Terminus der von Primaten erkannten Epitop I Sequenzen die Immunogenität nicht. Daher kann der N-terminate R1 für jedes von Primaten erkannte Epitop I Peptid ein freier Wasserstoff an der nicht modifizierten N-terminalen Aminosäure sein oder eine Niederalkylgruppe (d.h. C1–C10 Alkyl) oder eine Nieder-C1–C10-Alkanoylgruppe, wie eine Acetylgruppe. R1 kann ebenfalls eine Sequenz von zwischen 1 bis etwa 5 Aminosäuren einschließen, gegebenenfalls mit einer Niederalkylgruppe oder Niederalkanoylgruppe substituiert. Vorzugsweise stellt R1 2 Aminosäuren dar. In einer Ausführungsform stellt R1 Val dar, woraus sich die Sequenz Val-Asp-Pro-Y₇-Leu-X₉-Pro-Trp-Z₁₂ [SEQ ID NR: 37] ergibt, wobei Y₇, X₉ und Z₁₂ wie oben definiert sind. In einer anderen Ausführungsform stellt R1 -X₂-Pro-Val- dar, woraus sich die Sequenz X₂-Pro-Val-Asp-Pro-Y₇-Leu-X₉-Pro-Trp-Z₁₂ [SEQ ID NR: 38] ergibt, wobei X₂ Glu oder Asp ist und wobei Y₇, X₉ und Z₁₂ wie oben definiert sind. Vorzugsweise stellt R1 3 Aminosäuren dar.
Zusätzliche Aminosäuren am C-Terminus der von Primaten erkannten minimalen Epitop I Sequenz können den Antikörpertiter verstärken. Während der C-terminale R2 einfach eine freie Hydroxylgruppe an der C-terminalen Aminosäure sein kann, kann er ebenfalls ein C-terminales Amid sein. Um den Titer zu verstärken, stellt R2 jedoch vorzugsweise eine Sequenz von zwischen 1 bis etwa 14, vorzugsweise etwa 4, zusätzlichen Aminosäuren dar, die am Carboxyl-Terminus amidiert sind. In einer bevorzugten Ausführungsform stellt R2 -His-Pro-Gly-Ser-Amid dar, woraus sich die Sequenz Asp-Pro-Y₇-Leu-X₉-Pro-Trp-Z₁₂-His-Pro-Gly-Ser [SEQ ID NR: 16] ergibt, wobei Y₇, X₉ und Z₁₂ wie oben definiert sind.
Vorzugsweise schließt eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zusätzlich zu den zwei benötigten Peptiden, die oben identifiziert wurden, mindestens fünf oder sechs verschiedene Aminosäuresequenzen der von Primaten erkannten Epitop I Formel ein. Am meisten bevorzugt umfasst die Zusammensetzung sieben oder acht Varianten von Aminosäuresequenzen, die umgehend unten identifiziert werden. Die Zusammensetzung kann ebenfalls andere Peptid- oder Polypeptidsequenzen enthalten, die jede eine unterschiedliche X₉, Y₇ und Z₁₂ Kombination enthalten. Wie in den Beispielen unten gezeigt, kann eine bevorzugte erfindungsgemäße Zusammensetzung mit drei Stellen antigener Variabilität im von Primaten erkannten Epitop I durch Einschließen der zwei "benötigten" Peptide ausreichend Peptide des von Primaten erkannten Epitop I enthalten, um 95% aller bekannten B-Stamm und Nicht-B-Stamm HIV-1 Tat-Varianten zu umfassen:
R1-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SEQ ID NR: 17] und
R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 [SEQ ID NR: 18]; sowie eine bis fünf der folgenden zusätzlichen Epitop I Peptide:
R1-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SEQ ID NR: 19];
R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SEQ ID NR: 20];
R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SEQ ID NR: 21];
R1-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 [SEQ ID NR: 22] und
R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn-R2 [SEQ ID NR: 23]; sowie gegebenenfalls noch die seltene Variante R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 [SEQ ID NR: 24].
Die erfindungsgemäße von Primaten erkannte Epitop I Zusammensetzung kann eine Zahl von zusätzlichen Peptiden oder Polypeptiden enthalten, die andere Sequenzen enthalten, welche den Aminosäureresten zwischen AS 5 bis AS 12 der SEQ ID NR: 15 entsprechen, aber von anderen Tat-Varianten abgeleitet wurden, die nicht gut mit Antikörpern gegen die von Primaten erkannten Epitop I Zusammensetzungen kreuzreagieren. Die erfindungsgemäßen Epitop I Zusammensetzungen können Mehrfachkopien von fünf oder mehr verschiedenen Epitop I Peptiden in jeder Reihenfolge enthalten. In einer Ausführungsform ist mindestens eine Kopie der sieben oder sind alle acht der oben beschriebenen Aminosäuresequenzen [SEQ ID NR: 17–24] anwesend.
Diese errfindungsgemäßen Peptide oder Polypeptide werden synthetisch oder rekombinant hergestellt. Optional können Aminosäuren (z.B. -Gly-Ser-) oder andere Aminosäuren- oder chemische Verbindungs-Spacer an den Enden der Peptide zum Zweck des Verbindens der Peptide untereinander oder mit einem Träger eingeschlossen werden. Diese Zusammensetzung kann die Form eines oder mehrerer der oben beschriebenen Peptide annehmen, welche als ein synthetisches Peptid, das an ein Trägerprotein gekoppelt ist, exprimiert werden. Alternativ kann eine Zusammensetzung mehrere Epitop I Peptide enthalten, jedes als ein mehrfach-antigenes Peptid, gegebenenfalls mit einem Trägerprotein gekoppelt, exprimiert. Alternativ können die ausgewählten Peptide aufeinander folgend verbunden werden und innerhalb eines rekombinant hergestellten Proteins exprimiert werden. In einer Ausführungsform, werden acht oben spezifisch identifizierten Sequenzen aufeinander folgend verbunden, mit oder ohne Spacer Aminosäuren zwischen ihnen, um ein größeres rekombinantes Protein zu bilden. Alternativ kann das rekombinante Protein im Leserahmen mit einem Trägerprotein fusioniert sein. Diese Primaten Epitop I Zusammensetzungen sind entworfen, um Antikörper zu induzieren, die reaktiv mit mehr als 95% der bekannten Varianten des HIV-1 Tat-Proteins, einschließlich der Tat-Proteine der HIV-1 B- und Nicht-B-Stämme, sind.
Von Primaten erkannte Epitop I Zusammensetzungen zeigen eine biologische Aktivität des Induzierens einer aktiven humoralen Immunantwort (d.h. Antikörper) in einem immunisierten, immunkompetenten Primaten, d.h. einem nicht infizierten Menschen oder einem asymptomatisch infizieren Menschen, die gegen mehr als 95% und vorzugsweise mehr als 99% der bekannten Varianten des Tat-Proteins von HIV-1 gerichtet sind. Das Endergebnis einer solchen Behandlung ist eine Beeinträchtigung der Vervielfältigung des HIV-1 im Anschluss an eine akute Infektion. Diese Beeinträchtigung verhindert hohe Nach-Serokonversionsplasmaspiegel von HIV-1, die mit einer Progression zu AIDS verbunden sind. Eine aktive Induktion von Antikörpern in der asymptomatischen Phase der HIV-Infektion kann eine virale Vervielfältigung reduzieren, die virale Beladung des Plasmas senken und die Wahrscheinlichkeit einer Progression zu AIDS reduzieren. Die Zusammensetzung, die mindestens die zwei benötigten von Primaten erkannten Epitop I Immunogene und vorzugsweise sieben oder acht jener Epitop I Sequenzen [z.B. SEQ ID NR: 17–24] enthält, kann eine Immunantwort auf etwa 95% der 294 bekannten Tat-Sequenzen der verbreiteten B-Subtypen von HIV-1 und mit Tat-Proteinen aller 56 Nicht-B HIV-1 Subtypen, die sequenziert worden sind (zur Verfügung gestellt von Dr. Esther Guzman, Los Alamos NIAID HIV Datenbank; GenBank Datenbank] auslösen.
B. Immunogene Zusammensetzungen, die zusätzliche Epitope enthalten
In einer anderen Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung andere Zusammensetzungen bereit, die zwei oder mehr von Primaten erkannte Epitop I Sequenzen kombiniert mit mindestens einer Epitop II Sequenz und gegebenenfalls mit einer oder mehreren Epitop III oder IV Peptiden verwenden. Diese HIV-1 Tat-Epitope II, III und IV, wie vom Kaninchen Immunsystem erkannt, werden detailliert in der internationalen Patentanmeldung Nr. WO 99/02185 beschrieben.
In Kürze beschrieben, löst die Epitop II Sequenz eine spezifische humorale Immunantwort in einem der Epitop II Sequenz in vivo ausgesetzten Primaten aus. Epitop II, wie von Primaten erkannt, definiert Peptide der Formel R3-Lys-X₄₂-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-R4 [SEQ ID NR: 5], wobei X₄₂ Gly oder Ala ist. Das minimale Epitop, welches vom Primaten Immunsystem erkannt wird, ist das der spezifisch identifizierten Aminosäuren dieser Formel, d.h. -Lys-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys- (Aminosäuren 41–50 der SEQ ID NR: 15]. Dies stellt ebenfalls die Sequenz des derzeit bevorzugten Immunogens für Epitop II dar. Dieses Immunogen, in dem X₄₂ Gly ist, induziert Antikörper, welche mit der Sequenz, in der X₄₂ Ala ist, kreuzreaktiv sind. Dieses würde mit mehr als 95% der bekannten HIV-1 Tat-Proteine reagieren/kreuzreagieren. Diese Epitop II Sequenz weist in einer großen Zahl bekannter HIV-1 Tat-Varianten keine antigene Variabilität auf. Der N-terminate R3 kann den Wasserstoff an der nicht modifizierten N-terminalen Aminosäure Lys darstellen, oder R3 kann ein Niederalkyl- oder ein Niederalkanoylsubstituent, wie eine Acetylgruppe, am Lys sein. R3 kann ebenfalls eine Sequenz von zwischen 1 bis etwa 5 Aminosäuren, gegebenenfalls mit einer Niederalkylgruppe oder Niederalkanoylgruppe substituiert, einschließen. Der C-terminale R4 kann das freie Hydroxyl der C-terminalen Aminosäure darstellen, oder R4 kann ein Amid an dieser C-terminalen Aminosäure sein. R4 kann zusätzliche nicht polare Aminosäuren, wie einen Spacer, einschließen. Ein beispielhafter Spacer Gly-Ser-Gly-Ser kann verwendet werden, woraus sich die Sequenz Lys-X₄₂-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-Gly-Ser-Gly-Ser [SEQ ID NR: 25] ergibt, wobei X₄₂ Gly oder Ala ist. R4 kann jedoch nicht die basischen Aminosäuren -Lys-Arg-Arg- darstellen, die natürlicherweise in der Tat-Sequenz nach der letzten Aminosäure in der Epitop II Formel vorkommen. Diese Epitop II Sequenz, die in 294 B-Stamm Tat-Varianten gefunden wird, wird von Primaten erkannt (wie in der WO 99/02185 berichtet wird, erkennt das Kaninchen Immunsystem das Epitop von AS43–50 der SEQ ID NR: 15).
Epitop II ist schwach immunogen, wenn es innerhalb anderer Sequenzen präsentiert wird. Daher wird diese Sequenz für eine optimale Immunogenität als ein synthetisches Peptid hergestellt, welches an ein Trägerprotein fusioniert oder gekoppelt ist oder als ein mehrfach-antigenes Peptid, gegebenenfalls an ein Trägerprotein gekoppelt. Alternativ kann Epitop II als die C-terminate Sequenz eines rekombinanten Proteins exprimiert werden, welches gegebenenfalls im Leserahmen an ein Trägerprotein an seine aminoterminale Sequenz fusioniert ist. In einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung wird ein Epitop II Peptid vorzugsweise alleine oder in Kombination mit einem oder mehreren von Primaten erkannten Epitop I Peptiden präsentiert.
In Kürze beschrieben und wie in der WO 99/02185 identifiziert, definiert Epitop III Peptide der Formel: R5-Arg-Arg-X₅₈-Z₅₉-A₆₀-Y₆₁-Ser-R6 [SEQ ID NR: 6], wobei X₅₈ Ala, Pro, Ser oder Gln sein kann; Y₆₁ Asp, Asn, Gly oder Ser sein kann; Z₅₉ Pro oder His sein kann und A₆₀ Gln oder Pro sein kann. Epitop IV definiert Peptide der Formel: R7-Ser-Gln-X₆₄-His-Gln-Y₆₇-Ser-Leu-Ser-Lys-Gln-Pro-R8 [SEQ ID NR: 7], wobei X₆₄ Asn oder Thr sein kann und Y₆₇ Ala oder Val sein kann.
Daher sind die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, d.h. das Peptid/die Polypeptide, das/die die oben identifizierten Aminosäursequenzen enthält/enthalten, für die immunologische Unterdrückung von extrazellulären Tat-Proteinen der meisten HIV-1-Stämme geeignet, wenn sie einem Menschen angeboten werden. Diese Zusammensetzungen wirken, um eine chronische Vervielfältigung des Virus entscheidend zu reduzieren und erlauben eine wirksame Immunkontrolle des Virus.
Die Immunogene für jedes Epitop werden vorzugsweise entworfen, um Antikörper zu induzieren, die mit dem höchsten Anteil natürlich vorkommender Varianten jeden Epitops reaktiv sind. Für ein Epitop, wie das von Primaten erkannte Epitop I, könnten Mehrfachkopien eines Immunogens in ein synthetisches oder rekombinantes Immunogen einbezogen werden, um die Immunogenität zu verstärken und höhere Antikörpertiter herzustellen. Weiterhin könnten Immunogene für zwei oder mehrere Epitope kombiniert werden, um den Wirkungsbereich zu erweitern, da Variationen in der Sequenz jeden Epitops unabhängig auftreten. Daher enthält, als ein Beispiel, eine erfindungsgemäße Zusammensetzung die zwei benötigten von Primaten erkannten Epitop I Peptide, sowie vier oder fünf der anderen oben spezifisch identifizierten Epitop I Peptide mit einem Cys an dem Ende, welches an ein Trägerprotein gekoppelt ist. Alternativ können mehrfach-antigene Peptide, gegebenenfalls an ein Trägerprotein gekoppelt, hergestellt und kombiniert werden, um eine erfindungsgemäße Zusammensetzung zu bilden. Alternativ könnten Gemische von zwei oder mehreren Immunogenen verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen von Primaten erkannten Epitop I Immunogene, mit oder ohne irgendeinem der Epitope II, III oder IV oder anderen optionalen Immunoge nen, können in immunogenen Zusammensetzungen in einer Vielzahl von Formen, zum Beispiel chemisch synthetisiert oder als rekombinante Peptide, Polypeptide, Proteine, Fusionsproteine oder fusionierte Peptide hergestellt und verwendet werden.
1. Rekombinante(s) oder synthetische(s) Peptid/Proteine, das/die an einen Träger gekoppelt ist/sind
Als eine Ausführungsform kann eine erfindungsgemäße Zusammensetzung ein synthetisches oder rekombinant hergestelltes Peptid sein, welches mindestens die zwei benötigten von Primaten erkannten immunogenen Epitop I Aminosäuresequenzen (sowie zusätzlich andere Epitop I Sequenzen) enthält und ebenfalls eine oder mehrere Epitop II/III/IV immunogene Aminosäuresequenzen enthält, die an ein ausgewähltes Trägerprotein gekoppelt sind. In dieser Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Zusammensetzung können mehrere oben beschriebene von Primaten erkannte Epitop I Aminosäuresequenzen, mit oder ohne flankierenden Sequenzen, aufeinanderfolgend in einem Polypeptid kombiniert werden und an denselben Träger gekoppelt werden.
Alternativ können die Epitop I, II, III oder IV Immunogene einzeln als Peptide an dasselbe oder ein unterschiedliches Trägerprotein gekoppelt werden, und die sich ergebenden Immunogen-Trägerkonstrukte können zusammen gemischt werden, um eine einzelne Zusammensetzung zu bilden. Solche Sequenzen können synthetisch mit gängigen Verfahren der chemischen Synthese oder rekombinant durch Expression in einer ausgewählten Wirtszelle, ebenfalls mit zur Zeit gängigen Hilfsmitteln hergestellt werden.
Für diese Ausführungsform ist das Trägerprotein wünschenswerterweise ein Protein oder ein anderes Molekül, welches die Immunogenität des ausgewählten Immunogens verstärken kann. So ein Träger kann ein größeres Molekül sein, welches eine Adjuvanz-Wirkung aufweist. Beispielhafte gängige Proteinträger schließen ohne Beschränkung E. coli DnaK Protein, Galactokinase (galK, welche den ersten Schritt des Galactose Stoffwechsels in Bakterien katalysiert), Ubiquitin, α-Paarungsfaktor, β-Galactosidase und Influenza NS-1 Protein ein. Toxoide (d.h. die Sequenz, die das natürlich vorkommende Toxin kodiert mit ausreichenden Modifikationen, um seine toxische Aktivität auszuschalten), wie Diphtherie-Toxoid und Tetanus-Toxoid, können ebenfalls als Träger verwendet werden. Ähnlich kann eine Vielzahl von bakteriellen Hitzeschockproteinen, z.B. mycobakterielles hsp-70, verwendet werden. Glutathionreduktase (GST) ist ein anderer geeigneter Träger. Der Fachmann kann einfach einen angemessenen Träger auswählen.
In einem insbesondere wünschenswerten Immunogen-Trägerproteinkonstrukt können die zwei benötigten Epitop I Immunogene und die drei bis sechs zusätzlichen von Primaten erkannten Epitop I Immunogene und optional die immunogenen Peptide/Polypeptide kovalent mit einem mycobakteriellen E. coli Hitzeschockprotein 70 (hsp 70) verbunden werden [K. Suzue et al., J. Immunol. 156: 873 (1996)]. In einer anderen wünschenswerten Ausführungsform wird die Zusammensetzung durch kovalentes Verbinden der Immunogen enthaltenden Peptid- oder Polypeptidsequenzn mit einem Diphtherie-Toxoid gebildet.
2. Mehrfach-antigenes Peptid
In noch einer anderen Ausführungsform können die Peptide oder Polypeptid Epitop Immunogene und irgendwelche ausgewählten optionalen Immunogene die Form eines mehrfach-antigenen Peptidkonstrukts ("MAP", ebenfalls als ein octameres Lysin-Core-Peptid bezeichnet) annehmen. So ein Konstrukt kann unter Anwendung des MAP-Systems entworfen werden, welches von Tam, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85; 5409–5413 (1988) beschrieben wurde. Dieses System verwendet eine Core-Matrix aus Lysinresten, auf welche Mehrfachkopien desselben erfindungsgemäßen von Primaten erkannten Epitop I wie beschrieben synthetisiert werden [D. Posnett et al., J. Biol. Chem., 263(4): 1719–1725 (1988); J. Tam, "Chemically Defined Synthetic Immunogens and Vaccines by the Multiple Antigen Peptide Approach", Vaccine Research and Developments, Vol. 1, Hrsg. W. Koff und H. Six, S. 51–87 (Marcel Deblau, Inc., New York 1992)]. Jedes MAP enthält Mehrfachkopien von nur einem Peptid. Daher wird eine Zusammensetzung, die MAPs enthält, mindestens zwei und vorzugsweise etwa sieben MAPs enthalten. Ein MAP wird das erste benötigte Peptid oder Polypeptid Epitop I Immunogen aufweisen, welches an jeden Lysin-Core angeheftet ist, ein zweites MAP wird das zweite benötigte Peptid oder Polypeptid Epitop I Immunogen aufweisen, welches an jeden Lysin-Core angeheftet ist. Noch andere MAPs, jedes mit einer unterschiedlichen oben identifizierten von Primaten erkannten Epitop I Aminosäuresequenz kann eingeschlossen werden. Mehrere verschiedene MAPs können verwendet werden, um jede gewünschte Kombination von Epitop I, II, III oder IV Sequenzen zu erhalten. Vorzugsweise sind diese MAP-Konstrukte mit anderen T-Zell stimulierenden Sequenzen verbunden oder als pharmazeutische Zusammensetzungen, die in Verbindung mit T-Zell stimulierenden Mitteln, wie bekannten Hilfsstoffen, verabreicht werden.
3. Spacer
In jeder der oben genannten Zusammensetzungen, z.B. als Peptid-/Polypeptid-Trägerkonstrukte oder MAPs, kann jedes Peptid/Polypeptid Immunogen oder jede Aminosäuresequenz in dem Immunogen gegebenenfalls durch eine optionale Aminosäuresequenz, die "Spacer" genannt wird, getrennt werden. Spacer sind Sequenzen von zwischen 1 bis etwa 4 Aminosäurer, die zwischen zwei Sequenzen eingefügt werden, um eine Verbindung zwischen diesen zu verhindern, ohne die dreidimensionale Struktur des Immunogens ungünstig zu beeinflussen. Spacer können ebenfalls Spaltungsstellen für Restriktionsendonukleasen enthalten, um eine Trennung der Sequenzen zu ermöglichen, wo es gewünscht wird. Geeignete Spacer oder Linker sind bekannt und können vom Fachmann einfach entworfen und ausgewählt werden. Bevorzugte Spacer sind Sequenzen, welche Gly und/oder Ser Aminosäuren enthalten.
F. Erfindungsgemäße Nukleinsäure-Zusammensetzungen, die ein synthetisch oder rekombinant hergestelltes Gen einschließen
Andere erfindungsgemäße Ausführungsformen schließen Nukleinsäuresequenzen ein, welche die oben beschriebenen von Primaten erkannten Epitop I Peptid/Polypeptid-Zusammensetzungen kodieren, einschließlich der Peptid und Polypeptid Immunogene der oben beschriebenen Zusammensetzungen und einschließlich jener Peptide und Polypeptide, die mit Trägerproteinen fusioniert sind. Die Nukleinsäuresequenzen können ebenfalls Sequenzen einschließen, die die Trägerproteine kodieren.
Daher stellt eine bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsform ein "synthetisches Gen" dar, welches aufeinanderfolgend mindestens die zwei benötigten immunogenen von Primaten erkannten Epitop I Peptide/Polypeptide kodiert. Es sei angemerkt, dass obwohl das Gen als "synthetisch" bezeichnet wird, es durch chemische Synthese oder mit rekombinanten Hilfsmitteln, wie gewünscht, entworfen werden kann. Das synthetische Gen kodiert vorzugsweise sieben oder alle acht der spezifisch identifizierten von Primaten erkannten Epitop I Aminosäuresequenzen [SEQ ID NR: 17–24]. Das synthetische Gen kann ebenfalls jede Auswahl eines Epitop II oder III Immunogens kodieren, vorausgesetzt, dass das Epitop II oder III Peptid mit dem C-Terminus der von Primaten erkannten Epitop I Sequenz fusioniert ist und an seinem eigenen C-Terminus nicht weiter modifiziert ist. Das synthetische Gen kann Mehrfachkopien der zwei benötigten Epitop I Aminosäuresequenzen oder Kopien von zusätzlichen mehrfach unterschiedlichen Immunogenen oder Aminosäuresequenzen oder Mehrfachkopien von mehrfach unterschiedlichen Immunogenen oder Aminosäuresequenzen kodieren. Das synthetische Gen kann die ausgewählten Aminosäuresequenzen in einem offenen Leserahmen mit oder fusioniert an eine Nukleinsäuresequenz kodieren, welche ein Trägerprotein kodiert. Eine weitere Eigenschaft des synthetischen Gens kann sein, dass es einen Spacer zwischen jeder Sequenz kodiert, welche ein Immunogen kodiert und/oder zwischen der Sequenz, welche ein Immunogen kodiert und der Sequenz, welche das Trägerprotein kodiert.
Das erfindungsgemäße synthetische Gen kann ebenfalls Teil eines synthetischen oder rekombinanten Moleküls sein. Das synthetische Molekül kann ein Nuklein säurekonstrukt, wie ein Vektor oder Plasmid sein, welches das synthetische Gen enthält, welches das Protein, Peptid, Polypeptid, Fusionsprotein oder Fusionspeptid unter der operativen Kontrolle von Nukleinsäuresequenzen kodiert, die regulatorische Elemente, wie Promotoren, Terminationssignale und desgleichen kodieren. Solche synthetischen Moleküle können verwendet werden, um die Polypeptid/Peptid Immunogen-Zusammensetzungen rekombinant herzustellen. Das synthetische Gen oder synthetische Molekül kann durch die Verwendung chemischer Syntheseverfahren oder vorzugsweise mit rekombinanten Techniken hergestellt werden. Zum Beispiel kann das synthetische Gen oder Molekül bestimmte Präferenzcodons für die Art der ausgewiesenen Wirtszelle enthalten.
Das synthetische Gen oder Molekül, vorzugsweise in Form von DNA, kann in einer Vielzahl von Wegen verwendet werden. Zum Beispiel können diese synthetischen Nukleinsäuresequenzen verwendet werden, um das/die erfindungsgemäße(n) Peptid/Polypeptide in vitro in einer Wirtszellkultur zu exprimieren. Die exprimierten Immunogene können anschließend nach geeigneter Aufreinigung in ein pharmazeutisches Reagens oder einen Impfstoff eingefügt werden. Alternativ kann das erfindungsgemäße synthetische Gen oder synthetische Molekül direkt einem Säuger, vorzugsweise einem Menschen, als sogenannte "nackte DNA" verabreicht werden, um das Protein/Peptid Immunogen in vivo in einem Patienten zu exprimieren. Siehe z.B. J. Cohen, Science, 259: 1691–1692 (19. März 1993); E. Fynan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 11478–11482 (Dez. 1993) und J. A. Wolff et al., Biochtechnigues, 11: 474–485 (1991). Das synthetische Molekül, z.B. ein Vektor oder Plasmid, kann zur direkten Injektion in den Säugerwirt verwendet werden. Dies führt zur Expression des Proteins durch Wirtszellen und nachfolgender Präsentation an das Immunsystem, um eine Antikörperbildung in vivo zu induzieren.
G. Mikroorganismen, die das synthetische Gen exprimieren
In noch einem anderen erfindungsgemäßen Aspekt können die erfindungsgemäßen synthetischen Gene oder Moleküle in einen nicht pathogenen Mikroorganis mus eingefügt werden. Der sich ergebende Mikroorganismus exprimiert und vervielfältigt, wenn er einem Säugerwirt verabreicht wird, die erfindungsgemäßen exprimierten Zusammensetzungen in vivo, um eine spezifische Antikörperbildung zu induzieren. Zum Beispiel können nicht pathogene rekombinante Viren oder kommensale Bakterien, welche die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen oder synthetischen Gene tragen und geeignet zur Verabreichung an einen Säugerpatienten sind, durch Verwendung gängiger Methodik hergestellt und aus bekannten nicht pathogenen Mikroorganismen ausgewählt werden.
Kommensale Bakterien, die für eine exogene Abgabe des synthetischen Moleküls an den Patienten und/oder zum Tragen des synthetischen Gens in den Patienten in vivo geeignet sein können, schließen, ohne Beschränkung, verschiedene Stämme von Streptococcus, z.B. S. gordonii, oder E. coli, Bacillus, Streptomyces und Saccharomyces ein.
Geeignete nicht pathogene Viren, die erzeugt werden können, um das synthetische Gen in die Zellen des Wirts zu tragen, schließen Pockenviren, wie Vaccinia, Adenovirus, Adeno-verbundene Viren, Canarypox Viren, Retroviren und desgleichen ein. Eine Anzahl solcher nicht pathogenen Viren werden verbreitet zur humanen Gentherapie und als Träger für andere Impfstoffmittel verwendet und sind dem Fachmann bekannt und von diesem auswählbar.
H. Herstellung oder Fertigung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und die einzelnen Polypeptide/Peptide, welche die erfindungsgemäßen von Primaten erkannten Epitop I Immunogene und gegebenenfalls ein oder mehrere Epitope II, III oder IV, die erfindungsgemäßen synthetischen Gene und synthetischen Moleküle enthalten, können gängigerweise durch Gebrauch bekannter chemischer Synthesetechniken hergestellt werden, wie von Merrifield, J. Amer. Chem. Soc., 85: 2149–2154 (1963) beschrieben. Alternativ können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen mit bekannten rekombinanten DNA-Techniken durch Klonieren und Exprimieren eines DNA-Fragments, welches eine Sequenz trägt, die ein Peptid/Polypeptid kodiert, welches mindestens die zwei benötigten von Primaten erkannten Epitop I Sequenzen mit anderen optionalen Immunogenen und optionalen Trägerproteinen enthält, in einem Wirtsmikroorganismus oder einer Zelle hergestellt werden. Kodierende Sequenzen für das Epitop I und optionale Immunogene können synthetisch hergestellt werden [W. P. C. Stemmer et al., Gene, 164: 49 (1995)] oder können von viraler RNA mit bekannten Techniken oder von verfügbaren cDNA enthaltenden Plasmiden abgeleitet werden.
Es können Kombinationen dieser Techniken verwendet werden. Zum Beispiel kann ein Zusammenbau von folgenden Immunogenen mit gängigen molekularbiologischen Techniken für die Herstellung des synthetischen Gens verwendet werden, und eine seitengerichtete Mutagenese kann verwendet werden, um gewünschte Sequenzen der Immunogene bereitzustellen. Das Produkt des synthetischen Gens wird anschließend rekombinant hergestellt. Alle diese Manipulationen können mit gängiger Methodik durchgeführt werden.
Systeme zum Klonieren und Exprimieren der erfindungsgemäßen Peptid-/Polypeptid-Zusammensetzungen, die die synthetischen Gene oder Moleküle verwenden, schließen die Verwendung von verschiedenen Mikroorganismen und Zellen ein, die alle in der rekombinanten Technologie gut bekannt sind. Diese schließen zum Beispiel verschiedene Stämme von E. coli, Bacillus, Streptomyces und Saccharomyces, sowie Säuger-, Hefe- und Insektenzellen ein. Geeignete Vektoren sind daher bekannt und von privaten und öffentlichen Laboren und Hinterlegungsstellen und von kommerziellen Anbietern verfügbar. Zur Zeit sind die am meisten bevorzugten Wirte Säugerzellen, wie Ovarienzellen chinesischer Hamster (CHO) oder COS-1-Zellen. Diese Wirte können in Verbindung mit Pockenvirus-Vektoren, wie Vaccinia oder Schweinepocken, verwendet werden. Die Auswahl anderer geeigneter Wirtszellen und Verfahren zur Transformation, Kultur, Vervielfältigung, Screening und Produktherstellung und Aufreinigung können vom Fachmann durch Bezugnahme auf bekannte Techniken durchgeführt werden. Siehe unter anderen z.B. Gething und Sambrook, Nature, 293: 620–625 (1981). Ein ande res bevorzugtes System schließt das Baculovirus Expressionssystem und Vektoren ein.
Wenn mit gängigen rekombinanten Hilfsmitteln hergestellt, können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, d.h. die Polypeptide/Peptide, welche die angegebenen Kopien der von Primaten erkannten Epitop I Immunogene und optionale Immunogene enthalten, entweder aus den Zellinhalten mit gängigen Lysetechniken oder aus Zellmedium mit gängigen Verfahren, wie Chromatographie, isoliert werden. Siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1989). Geeignete Plasmid- und virale Vektoren, die beide für die Herstellung der Peptid-/Polypeptid-Teile als DNA-Impfstoffe verwendet werden, sind dem Fachmann gut bekannt und stellen keine Beschränkung der vorliegenden Erfindung dar. Siehe Sambrook et al., oben zitiert, und die oben genannten Referenzen zur Herstellung des Proteins. Siehe ebenfalls die internationale Patentanmeldung PCT WO 94/01139, veröffentlicht am 20. Januar 1994. In Kürze, die DNA, die das ausgewählte Peptid/Polypeptid kodiert, wird in einen Vektor oder ein Plasmid eingesetzt, welches andere optionale flankierende Sequenzen, einen Promotor, eine mRNA Leader-Sequenz, eine Initiationsstelle und andere regulatorische Sequenzen enthält, die in der Lage sind, die Vervielfältigung und Expression von dieser Sequenz in vivo oder in vitro zu lenken. Diese Vektoren erlauben eine Infektion der Zellen des Patienten und eine Expression der synthetischen Gensequenz in vivo oder eine Expression von ihr als ein Protein/Peptid oder Fusionsprotein/-peptid in vitro.
Die sich ergebende Zusammensetzung kann in eine von Primaten erkannte Epitop I Zusammensetzung mit jeder Anzahl von optionalen Immunogenen formuliert werden und auf die Wirksamkeit mit in vivo Assays gescreent werden. Solche Assays verwenden eine Immunisierung eines Tieres, z.B. eines Affen, mit der Zusammensetzung und eine Überprüfung der Antikörpertiter gegen die Tat-Proteine von HIV-1 oder gegen synthetische Nachweispeptide, die Varianten der Tat-Sequenzen (wie in den Beispielen unten gezeigt) entsprechen.
I. Erindungsgemäße Antikörper-Zusammensetzungen
Eine erfindungsgemäße Antikörper-Zusammensetzung oder Liganden bindende Zusammensetzung umfasst Antikörper, die spezifisch an ein Epitop I der Formel -Asp-Pro-Y₇-Leu-X₉-Pro-Trp-Z₁₂- [SEQ ID NR: 9] binden, wobei Y₇ ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Arg, Lys, Ser und Asn ist; wobei X₉ ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Glu und Asp ist; und wobei Z₁₂ ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lys und Asn ist. Eine solche Antikörper-Zusammensetzung schließt mindestens zwei oder mehr unterschiedliche Antikörper oder Liganden ein, die spezifisch an mindestens die zwei benötigten Epitop I Sequenzen, wie hier definiert, binden. Antikörper (oder andere bindende Liganden) werden gegen die zwei benötigten Sequenzen R1-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 [SEQ ID NR: 17] und R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 [SEQ ID NR: 18] von Epitop I erzeugt. Die Antikörper der Zusammensetzung binden daher ein HIV Tat-Protein, welches auf mehreren Varianten der HIV-1 Tat-Proteine anwesend ist. Zusätzliche Antikörper oder Liganden werden gegen andere Sequenzen, die in die Epitop I Formel oben fallen, erzeugt.
In einer Ausführungsform stellt ein isolierter Antikörper, welcher das erfindungsgemäße Epitop I Peptid oder Polypeptid wie oben beschrieben bindet, ebenfalls einen erfindungsgemäßen Aspekt dar. Solche polyklonalen Antikörper-Zusammensetzungen werden typischerweise durch Immunisieren eines Säugers, vorzugsweise eines Primaten, mit einer Peptid-/Polypeptid-Zusammensetzung, welche die zwei benötigten Epitop I Immunogene, sowie eine Auswahl anderer von Primaten erkannten Epitop I Immunogene und optionale Immunogene, wie oben beschrieben, enthält, hergestellt. Insbesondere wünschenswert als Immunogene sind ein heptavalentes von Primanten erkanntes Epitop I Immunogen (d.h. ohne die seltene Variante) oder ein octavalentes Immunogen, wie das synthetische Gen oder Fusionsprotein, welches in Beispiel 3 unten beschrieben wird und/oder ein univalentes Epitop II Immunogen (d.h. ein einzelnes Epitop II Peptid, gegebenenfalls an einen Träger gebunden). Zusätzlich zum Erzeugt werden in Primaten können solche Antikörper ebenfalls in transgenen Tieren, einschließlich sogenannter "humanisierter" transgener Mäuse, hergestellt werden. Ein wünschenswerter Wirt zum Erzeugen polyklonaler Antikörper gegen eine erfindungsgemäße Zusammensetzung schließt jedoch Menschen ein. Der Titer solcher polyklonaler Antikörper, die in dem Säuger, welcher den Epitop I Zusammensetzungen ausgesetzt war, erzeugt wurden, kann mit Standardtechniken, wie mit einem Enzym gekoppelten Immunosorbens-Assay überwacht werden. Wenn gewünscht, können die Antikörpermoleküle aus dem Säuger, z.B. aus dem Vollblut, dem Plasma oder dem Serum isoliert werden und weiterhin aus dem Plasma oder dem Serum des immunisierten Säugers mit gängigen Techniken aufgereinigt werden. Gängige Sammeltechniken können unter anderem Plasmapherese, Protein-A-Chromatographie einschließen. Solche polyklonalen Antikörper-Zusammensetzungen können selber als erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen verwendet werden.
Alternativ können Antikörper herstellende Zellen von den Säugern erhalten und verwendet werden, um andere Formen von Antikörpern und Liganden herzustellen, z.B. monoklonale Antikörper, chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper, humane Antikörper, durch Phagen-Display-Screening hergestellte Liganden, Antikörperfragmente und Gemische davon und synthetische Antikörper, monoklonale Antikörper, chimäre Antikörper, humanisierte Antikörper und vollständig humane Antikörper. Präparative Techniken zur Erzeugung dieser Typen von Liganden sind bekannt und die Liganden selber können unter Verwendung der offenbarten Aminosäuresequenzen der von Primaten erkannten Epitop I und optionalen Immunogene erzeugt werden. Siehe z.B. Kohler und Milstein (1975) Nature, 256: 495–497; Kozbor et al., (1983) Immunol. Today, 4: 72; Cole et al., 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc. S. 77–96; Harlow et al., Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, (1988); Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 10029–10032 (1989); Hodgson et al., Bio/Technology, 9: 421 (1991); die internationale PCT Anmeldung PCT/GB91/01554, Veröffentlichung Nr. WO 92/04381 und die internationale PCT Anmeldung PCT/GB93/00725, Veröffentlichung Nr. WO 93/20210].
In einer anderen Ausführungsform bindet zum Beispiel ein monoklonaler Antikörper spezifisch an die minimale Epitop I Sequenz, die durch -Asp-Pro-Y₇-Leu-X₉-Pro-Trp-Z₁₂- [SEQ ID NR: 9] eines HIV Tat-Proteins definiert ist, welches jedes größere Immunogen umfasst, das durch die Epitop I Formel mit den wie oben definierten variablen Aminosäuren und R-Gruppen definiert ist. In einer Ausführungsform bindet ein monoklonaler Antikörper spezifisch an die Aminosäuresequenz -Asp-Pro-Asn-Leu-X₉-Pro-Trp-Asn- [SEQ ID NR: 26], wobei X₉ Glu oder Asp ist. Noch andere monoklonale Antikörper, die spezifisch an die minimalen Epitop I Sequenzen binden, die durch die Formel oben definiert sind, stellen einen Teil dieser Erfindung dar.
Andere Anti-Tat-Antikörper können durch Screenen einer rekombinanten kombinatorischen Immunglobulin Bibliothek (z.B. Antikörper-Phagen-Displays) mit erfindungsgemäßen von Primaten erkannten HIV-1 Tat-Epitopen entwickelt werden, um die Vertreter der Immunglobulin Bibliothek zu isolieren, die an das HIV-1 Tat binden [W. D. Huse et al., Science, 246: 1275–1281 (1988)]. Kits zum Erzeugen und Screenen von Phagen-Display-Bibliotheken sind kommerziell verfügbar, z.B. Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, Katalog Nr. 27-9400-91; Strategene Phage Display Kits, usw. Siehe z.B. das U.S. Patent Nr. 5,223,409, die internationale Veröffentlichung Nr. WO 92/09690, WO 90/02809, usw. Chimäre Antikörper können unter Verwendung bekannter Techniken ähnlich entwickelt werden [unter anderen Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851; Takeda et al., Nature, 313: 452 (1984)]. Chimäre Antikörper sind Moleküle, in denen verschiedene Teile von verschiedenen Tierarten abgeleitet wurden. Einkettige Antikörper können ebenfalls mit gängigen Verfahren [siehe z.B. die U.S. Patente Nr. 4,946,778 und 4,704,692] unter Verwendung der variablen Teile der polyklonalen oder monoklonalen Antikörper, die gemäß dieser Erfindung hergestellt wurden, hergestellt werden. Antikörperfragmente, wie die Fab-, F(ab')₂- und Fv-Fragmente und Bibliotheken davon können für verschiedene erfindungsgemäße Aspekte ebenfalls verwendet werden.
Diese Antikörper-/Liganden-Zusammensetzungen binden wünschenswerterweise die meisten bekannten HIV-1 Tat-Proteinvarianten (z.B. mehr als 95% und vorzugsweise mehr als 99% der bekannten Tat-Proteinvarianten) und verhindern, dass die Tat-Proteine eine weitere HIV-1 Vervielfältigung unterstützen. Solche Zusammensetzungen können ein Gemisch von mehreren verschiedenen Antikörpern einschließen, die HIV-1 Tat-Protein Epitopsequenzen von mehreren HIV-1-Stämmen binden. Daher sind diese Antikörper für unten beschriebene pharmazeutische Verfahren und Formulierungen geeignet.
J. Erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzungen
Als ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt kann eine pharmazeutische Zusammensetzung, die geeignet zum Induzieren von Antikörpern ist, die mit den meisten (z.B. mehr als 95%, vorzugsweise mehr als 99%) bekannten HIV-1 Tat-Proteinen reagieren und die Vervielfältigung von HIV-1 beeinträchtigen, als ihre wirksamen Mittel mindestens die zwei benötigten erfindungsgemäßen von Primaten erkannten Epitop I Peptide oder Polypeptide und vorzugsweise zusätzliche Epitop I Peptide umfassen. Mehrere wünschenswerte Zusammensetzungen schließen die folenden, oben beschriebenen Teile ein:

(a) ein Peptid/Polypeptid Immunogen, welches mindestens die zwei benötigten und weiter bevorzugt mindestens sieben der von Primaten erkannten Epitop I Aminosäuresequenzen [SEQ ID NR: 17–24] enthält;
(b) ein Peptid/Polypeptid Immunogen nach (a), welches weiterhin irgendeines der Epitop II, III oder IV Aminosäuresequenzen enthält, vorzugsweise ein univalentes Epitop II Immunogen;
(c) ein synthetisches oder rekombinant hergestelltes Gen, welches die zwei benötigten von Primaten erkannten Epitop I Sequenzen und vorzugsweise sieben der Epitop I Sequenzen [SEQ ID NR: 17–24) und die wie oben beschriebenen optionalen Sequenzen kodiert;
(f) ein synthetisches Molekül, welches das synthetische Gen nach (c) enthält;
(g) ein rekombinantes Virus, welches das oben beschriebene synthetische Gen oder Molekül trägt und
(h) ein kommensales Bakterium, welches das oben beschriebene synthetische Gen oder Molekül trägt.

Der (Die) ausgewählte(n) wirksame(n) Teil(e) ist (sind) in einem pharmazeutisch verträglichen Träger anwesend, und die Zusammensetzung kann zusätzliche Inhaltsstoffe enthalten. Pharmazeutische Formulierungen, welche die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthalten, können andere wirksame Mittel, wie T-Zell stimulierende Mittel für die MAPs, Hilfsstoffe und immunstimulierende Cytokine, wie IL-12 und andere gut bekannte Cytokine, für die Protein-/Peptid-Zusammensetzungen enthalten. Alle diese pharmazeutischen Zusammensetzungen können wirken, um die viralen Spiegel eines Säugers zu senken.
Als pharmazeutische Zusammensetzungen werden die Zusammensetzungen, die von Primaten erkannte Epitop I Peptid- oder Nukleinsäuresequenzen und die optionalen Immunogensequenzen umfassen, mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger vermischt, welcher geeignet zur Verabreichung an Säuger zur Prophylaxe oder Behandlung von Virusinfektionen ist. Die Proteine/Peptide können zur Verabreichung in einem einzelnen pharmazeutischen Präparat kombiniert werden. Geeignete pharmazeutisch verträgliche Träger zur Verwendung in einer erfindungsgemäßen immunogenen Protein-Zusammensetzung sind dem Fachmann gut bekannt. Solche Träger schließen zum Beispiel Salzlösung, gepufterte Salzlösung, einen ausgewählten Hilfsstoff, wie wässrige Suspensionen aus Aluminium- und Magnesiumhydroxiden, Liposomen, Öl-in-Wasser-Emulsionen und andere ein. Geeignete Hilfsstoffe können in den erfindungsgemäßen Protein enthaltenden Zusammensetzungen ebenfalls verwendet werden. Geeignete Träger zum Lenken der DNA-, Plasmidnukleinsäuren- oder rekombinanten Vektor-Verabreichung schließen ohne Beschränkung Salzlösung oder Sucrose, Protamin, Polybren, Polylysin, Polykationen, Proteine, CaPO₄ oder Spermidin ein. Siehe z.B. die PCT Anmeldung WO 94/01139 und die oben zitierten Referenzen. Die Peptid-/Polypeptid-Zusammensetzungen und synthetischen Gene oder Moleküle sind in vivo in der Lage, in einem immunisierten Wirtssäuger, z.B. einem Menschen, eine Immunantwort auszulösen, welche in der Lage ist, mehrere (z.B. mehr als etwa 95 bis etwa 99%) bekannte extrazelluläre Tat-Proteinvarianten von HIV-1 zu unterdrücken und dadurch die viralen Spiegel zu senken.
Noch eine andere pharmazeutische Zusammensetzung, welche zur Beeinträchtigung der Vervielfältigung von HIV-1 geeignet ist, umfasst eine Antikörper-Zusammensetzung, welche einen oder mehrere der oben im Detail beschriebenen Antikörper enthält. In einer pharmazeutischen Zusammensetzung können die Antikörper in einer Salzlösung oder einem anderen geeigneten Träger transportiert werden. Die Antikörper-Zusammensetzungen sind in der Lage, eine sofortige, exogen bereitgestellte Unterdrückung von Tat bereitzustellen.
Die vorliegende Erfindung ist nicht durch die Auswahl der gängigen, physiologisch verträglichen Träger, Hilfsstoffe oder anderen Inhaltsstoffe, die für pharmazeutische Präparate der oben beschriebenen Typen geeignet sind, beschränkt. Die Herstellung dieser pharmazeutisch verträglichen Zusammensetzungen aus den oben beschriebenen Teilen, welche angemessene pH-Isotonizität, Stabilität und andere gängige Eigenschaften aufweisen, liegt innerhalb des Könnens des Fachmanns.
K. Erfindungsgemäßes Verfahren – Beeinträchtigen der Vervielfältigung von HIV-1
Erfindungsgemäß umfasst ein Verfahren zum Reduzieren der viralen Spiegel von HIV-1, dass ein Mensch den oben beschriebenen Tat-Antikörper induzierenden pharmazeutischen Zusammensetzungen ausgesetzt wird, dass aktiv Antikörper induziert werden, die mit mehreren (z.B. mehr als 95%, vorzugsweise mehr als 99% der bekannten) HIV-1 Tat-Proteinen reagieren und dass die Vervielfältigung des Virus in vivo beeinträchtigt wird. Dieses Verfahren ist angemessen für ein HIV-1 infiziertes Subjekt mit einem kompetenten Immunsystem oder für eine aktive Immunisierung eines nicht infizierten Subjekts. Das Verfahren induziert Antikörper, die mit HIV-1 Tat-Proteinen reagieren, reduziert eine virale Vervielfältigung während einer anfänglichen akuten Infektion mit HIV-1 und minimiert eine chronische Virämie, welche zu AIDS führt. Dieses Verfahren senkt ebenfalls eine chronische virale Vervielfältigung in infizierten Subjekten, was wiederum eine Progression zu AIDS minimiert. Die Verwendung dieser Verfahren kann eine chronische HIV-1 Infektion unter Bereitstellung eines neuen Mechanismus zur Behandlung, welcher nicht Gegenstand der Entwicklung einer Resistenz ist, kontrollieren. Die Antikörper gegen Tat inhibieren eine Replikation von HIV-1 Quasi-Arten unabhängig von dem Tat, welches sie herstellen, da das extrazelluläre Tat-Protein nicht mit dem replizierenden Teil des Virus verbunden ist. Daher besteht kein offensichtlicher Mechanismus mit welchem Tat-Antikörper einen selektiven Druck auf nicht reaktive, Escape-Tat-Varianten erzeugen könnten.
Gemäß diesen Verfahrens enthalten die pharmazeutischen Zusammensetzungen vorzugsweise die Peptid-/Polypeptid-Zusammensetzungen, die synthetischen Gene oder Moleküle, das rekombinante Virus oder das kommensale rekombinante Bakterium. Vorzugsweise enthalten die Zusammensetzungen ein heptavalentes synthetisches Gen oder Fusionsprotein (ohne die seltene Variante von Epitop I) oder das octavalente synthetische Gen oder Fusionsprotein aus Beispiel 3 und gegebenenfalls ein univalentes Epitop II Peptid. Jedes dieser wirksamen Teile der pharmazeutischen Zusammensetzung induziert in dem exponierten Menschen aktiv die Bildung von Anti-Tat-Antikörpern, welche den Transfer des Tat von infizierten Zellen zu anderen infizierten oder zu nicht infizierten Zellen blockieren. Diese Wirkung reduziert die Vervielfachung der Infektion und blockiert den Ausbruch der viralen HIV-1 Expansion und senkt daher die viralen Spiegel. Bei bereits infizierten Patienten kann dieses Verfahren der Reduktion der viralen Spiegel eine chronische Virämie und eine Progression zu AIDS reduzieren. Bei nicht infizierten Menschen kann diese Verabreichung der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen eine akute Infektion reduzieren und daher eine chronische Virämie, die zur Progression zu AIDS führt, minimieren.
Noch ein anderer erfindungsgemäßer Aspekt ist ein Verfahren zum Reduzieren der viralen Spiegel von HIV-1 durch Verabreichen einer pharmazeutischen Zusammensetzung, welche die oben beschriebenen Antikörper- Zusammensetzungen enthält, an einen Menschen, welcher nicht in der Lage ist, eine wirksame oder schnelle Immunantwort auf eine Infektion mit HIV-1 auszubilden. Das Verfahren kann eine chronische Verabreichung der Zusammensetzung umfassen. Unter solchen Patienten, die geeignet für eine Behandlung mit diesem Verfahren sind, befinden sich HIV-1 infizierte Patienten, die durch Erkrankung abwehrgeschwächt sind und nicht in der Lage sind, eine starke Immunantwort auszubilden. In späteren Stadien der HIV-Infektion ist die Wahrscheinlichkeit, wirksame Antikörpertiter zu erzeugen aufgrund der mit der Krankheit verbundenen Immunbeeinträchtigung geringer. Unter solchen Patienten befinden sich ebenfalls HIV-1 infizierte schwangere Frauen, Neugeborene von infizierten Müttern und nicht immunisierte Patienten mit einer möglichen Exposition (z.B. ein Mensch, der unbeabsichtigterweise mit einer Nadel "gestochen" wurde, die von einem HIV-1 infizierten Menschen verwendet wurde).
Für solche Patienten verwendet das erfindungsgemäße Verfahren vorzugsweise eine erfindungsgemäße Antikörper-Zusammensetzung als die pharmazeutische Zusammensetzung. Die Antikörper-Zusammensetzung schließt eine polyklonale Antikörper-Zusammensetzung, die in anderen Säugern, vorzugsweise normalen Menschen hergestellt wurde oder alternativ die anderen Formen der oben beschriebenen Antikörper, z.B. monoklonale, usw., ein. Diese Antikörper-Zusammensetzungen werden als passive Immuntherapie verabreicht, um eine virale Vervielfältigung zu inhibieren und die virale Beladung zu senken. Die exogenen Antikörper, die mit mehreren bekannten Tat-Proteinen von HIV-1 reagieren, stellen in dem Patienten eine sofortige Unterdrückung des Transfers des Tat von viral infizierten Zellen zu anderen infizierten oder zu nicht infizierten Zellen bereit. Gemäß diesen Verfahrens kann der Patient dauerhaft über einen langen Behandlungszeitraum mit der Antikörper-Zusammensetzung behandelt werden.
In jedem der oben beschriebenen Verfahren werden die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen über einen angemessenen Weg verabreicht, z.B. über die subkutanen, oralen, intravenösen, intraperitonealen, intramuskulären, nasalen oder Inhalationswege. Der zur Zeit bevorzugte Weg der Verabreichung ist intra muskulär für die immunisierenden (aktive Induktion) Zusammensetzungen und intravenös (i.v.), subkutan (s.c.) oder intramuskulär (i.m.) für die Antikörper (passive Therapie) Zusammensetzungen. Ein rekombinanter viraler Vektor oder nackte DNA wird vorzugsweise intramuskulär verabreicht, andere bestimmte rekombinante virale Vektoren und/oder lebende kommensale Bakterien können jedoch oral abgegeben werden.
Die Menge des erfindungsgemäßen Proteins, Peptids oder der Nukleinsäuresequenzen, die in jeder Impfstoffdosierung anwesend ist, wird unter Berücksichtigung der Betrachtung des Alters, Gewichts, Geschlechts, allgemeinen physischen Zustands und desgleichen des Patienten ausgewählt. Die Menge des wirksamen Teils, welcher benötigt wird, um eine Immunantwort, vorzugsweise eine schützende Antwort, zu induzieren, oder um eine exogene Wirkung in dem Patienten ohne wesentlich ungünstige Nebenwirkungen herzustellen, variiert abhängig von der verwendeten pharmazeutischen Zusammensetzung und der optionalen Anwesenheit eines Hilfsmittels (für die Protein enthaltenden Zusammensetzungen).
Allgemein wird für die Zusammensetzungen, die Protein/Peptid, Fusionsprotein, MAP oder gekoppeltes Protein oder eine Antikörper-Zusammensetzung enthalten, jede Dosierung zwischen etwa 50 μg bis etwa 20 mg der Peptid/Polypeptid Immunogene pro ml einer sterilen Lösung umfassen. Eine weiter bevorzugte Dosierung kann etwa 500 μg des Immunogens betragen. Andere Dosierungsbereiche können vom Fachmann ebenfalls in Erwägung gezogen werden. Wo wünschenswert, können anfänglichen Dosierungen gegebenenfalls wiederholte Auffrischungen folgen.
Die erfindungsgemäßen Antikörper-Zusammensetzungen können bei dauerhaften Behandlungen von Subjekten mit einem Risiko einer akuten Infektion aufgrund von Nadelstichen oder mütterlicher Infektion verwendet werden. Eine Dosierungsfrequenz für solche "aktuen" Infektionen kann von täglichen Dosierungen bis einmal oder zweimal die Woche i.v., s.c. oder i.m. für eine Dauer von etwa 6 Wochen reichen. Die erfindungsgemäßen Antikörper-Zusammensetzungen können eben falls bei dauerhaften Behandlungen von infizierten Patienten oder Patienten mit fortgeschrittenem HIV verwendet werden. Bei infizierten Patienten kann die Frequenz einer chronischen Verabreichung von täglichen Dosierungen bis einmal oder zweimal im Monat i.v., s.c. oder i.m. reichen und kann von der Halbwertszeit des Immunogens (z.B. etwa 7–21 Tage) abhängig sein. Für die Dauer einer dauerhaften Behandlung von solchen infizierten Patienten wird jedoch erwartet, dass sie ein unbegrenzter, aber anhaltender Zeitraum ist.
Alternativ können erfindungsgemäße Zusammensetzungen entworfen werden, um eine Verabreichung von erfindungsgemäßen synthetischen Genen oder Molekülen als "nackte DNA" zu lenken. Wie bei den immunogenen Protein-Zusammensetzungen können die Mengen der Teile in den DNA- und Vektor-Zusammensetzungen und die Art und Weise der Verabreichung, z.B. Injektion oder intranasal, vom Fachmann ausgewählt und angepasst werden. Allgemein wird jede Dosierung zwischen etwa 50 μg bis 1 mg der Immunogen kodierenden DNA pro ml einer sterilen Lösung umfassen.
Für rekombinante Viren, welche die synthetischen Gene oder Moleküle enthalten, können die Dosierungen von etwa 20 bis etwa 50 ml einer Salzlösung, welche Konzentrationen von 1 × 10⁷ bis 1 × 10¹⁰ pfu/ml des erfindungsgemäßen rekombinanten Virus enthalten, reichen. Eine bevorzugte humane Dosierung beträgt etwa 20 ml Salzlösung mit den oben genannten Konzentrationen. Es wird jedoch verstanden, dass der Fachmann solche Dosierungen abhängig von der Identität des rekombinanten Virus und des Aufbaus des Immunogens, welches es an den Wirt abgibt, ändern kann.
Die Mengen der kommensalen Bakterien, die das synthetische Gen oder die Moleküle tragen, die an den Patienten abgegeben werden sollen, werden allgemein von etwa 10³ bis 10¹² Zellen/kg reichen. Diese Dosierungen können vom Fachmann abhängig von dem verwendeten Bakterium und der bestimmten Zusammensetzung, welche Epitop I und optionale Immunogene enthält, welche von dem lebendem Bakterium abgegeben werden sollen, geändert werden.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen werden daher entworfen, um eine Infektion durch das ausgewählte Virus eines nicht infizierten Säugers, z.B. Menschen, zu verzögern oder zu minimieren. Daher weisen solche Zusammensetzungen eine Verwendung als Impfstoffe auf. Anti-Tat-Proteinantikörper sind nicht mit den HIV-1 Proteinen reaktiv, die in diagnostischen Assays verwendet werden, um eine Serokonversion nach Infektion nachzuweisen. Daher würden Subjekte, die mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen behandelt wurden, nicht durch falsch positive Tests für eine HIV-1 Infektion stigmatisiert werden, und es würde möglich bleiben, eine Serokonversion nachzuweisen, wenn behandelte Subjekte sich mit HIV-1 infizieren.
Das Versorgen eines Säugers mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, ob als Protein/Peptid enthaltende Zusammensetzung oder durch Verabreichung einer neuen Nukleinsäuresequenz, welche das Immunogen kodiert, ermöglicht eine grundlegend unterschiedliche Strategie der AIDS Impfung, da es ein Senken der viralen Spiegel durch eine biologische Unterdrückung von wünschenswerter weise mehr als etwa 95% und vorzugsweise mehr als etwa 99% der bekannten Tat-Proteinvarianten von HIV-1 erlaubt, was eine Vervielfältigung von HIV-1 senkt.
Die Verwendung der Tat-Immunogen enthaltenden Zusammensetzungen weist einen insbesondere wünschenswerten Vorteil im Gegensatz zu anderen Behandlungen und prophylaktischen Verfahren auf, die gegen solche Viren verwendet werden. Da eine Unterdrückung des Tat-Proteins die Vervielfältigung aller HIV Quasi-Arten oder Stämme extrazellulär ohne Unterschied inhibiert, erzeugt es keinen selektiven Druck auf das Ausgangsvirus selber für eine Selektion von mutierten Virusvarianten. Daher reduziert ein Blockieren der Aufnahme von Tat-Protein durch die Zellen des Patienten nicht nur den Spiegel der Virämie, sondern tut dies in einer Art und Weise, die der Selektion von "Escape-Varianten" vorbeugt.
Zusätzlich umfasst die Erfindung ein Verfahren des wirksamen Behandelns asymptomatisch infizierter HIV-1 Subjekte mit Virämie, da während des Verlaufs der Erkrankung extrazelluläres Tat-Protein wahrscheinlich bei der persistenten Infektion und den Immunabnormalitäten, die zu diesem Stadium der HIV-1 Infektion anwesend sind, mitwirkt. Unterdrückung von extrazellulärem Tat-Protein durch Antikörper, die durch erfindungsgemäßes Immunisieren induziert wurden, kann eine Virämie mit wirksamerer Immunkontrolle reduzieren und zu einer Verzögerung oder Verhinderung einer Progression zu AIDS führen.
Der wie oben beschriebene erfindungsgemäße Mechanismus ist geeignet zum Behindern des Verlaufs der viralen Infektion und zum Bereitstellen wünschenswerter klinischer Ergebnisse. Spezifischer sind die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in der Lage, eine Virämie durch Blockieren weiterer Aufnahme des Tat-Proteins durch nicht infizierte Zellen in Patienten zu reduzieren, die bereits mit dem Virus infiziert sind. Für die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen, entweder alleine oder zusammen mit anderen therapeutischen Behandlungsplänen für HIV infizierte Patienten verwendet, wird erwartet, dass sie bei der Reduktion einer Virämie und der Verhinderung einer klinischen Verschlechterung mitwirken.
Für solche therapeutischen Verwendungen sind die Formulierungen und Arten der Verabreichung im Wesentlichen identisch zu jenen, die oben spezifisch beschrieben wurden und können gleichzeitig oder simultan mit anderen gängigen Therapeutika für die spezifische virale Infektion verabreicht werden. Für eine therapeutische Verwendung oder eine prophylaktische Verwendung können wiederholte Dosierungen der immunisierenden Zusammensetzungen wünschenswert sein, wie eine jährliche Auffrischung oder eine Auffrischung in anderen Intervallen.
L. Erfindungsgemäße diagnostische Kits
Die oben beschriebenen Peptide und Polypeptide können ebenfalls als Reagenzien eines Kits verwendet werden, welches geeignet für das Messen und den Nachweis von Titern und Spezifitäten von Antikörpern ist, welche durch Impfung mit den oben beschriebenen Zusammensetzungen induziert wurde. Das erfindungsgemäße Kit kann mindestens die zwei oben identifizierten, benötigten Epitop I Peptide und vorzugsweise zwei oder mehr der von Primaten erkannten Epitop I und optionalen Immunogene einschließen. In einer Ausführungsform weist jedes Peptid an seinem N-Terminus das Protein Biotin und einen Spacer, z.B. -Ser-Gly-Ser-Gly- [SEQ ID NR: 27] auf. Alternativ kann das Peptid an seinem C-Terminus einen Spacer, z.B. -Gly-Ser-Gly-Ser- [SEQ ID NR: 39] und das Protein Biocytin aufweisen. Diese Ausführungsformen ermöglichen den Peptiden, an einen Avidin beschichteten festen Träger, z.B. eine Platte oder Kügelchen, gebunden zu werden. Andere, dem Fachmann für diagnostischen Assay bekannte Bindemittel können ebenfalls für die gleichen Zwecke verwendet werden. Ebenfalls in dem Kit bereitgesellt werden markierte Reagenzien, welche das Binden von Antikörper an die immobilisierten Epitop Peptide nachweisen, wie ein Ziege Anti-Mensch Immunglobulin oder desgleichen. Die Markierung an dem Reagens kann aus den vielen bekannten diagnostischen Markierungen, wie radioaktiven Verbindungen, fluoreszenten Verbindungen und Proteinen, kolorimetrischen Enzymen, usw. ausgewählt werden. Daher enthält das Kit ebenfalls verschiedene Reagenzien und Vorrichtungen zum Lesen der Markierungen, z.B. bestimmte Substrate, die mit einer enzymatischen Markierung interagieren, um ein Farbsignal herzustellen, usw., Vorrichtungen zur Entnahme von Blutproben, sowie angemessene Röhrchen und andere Teile eines diagnostischen Assays. Der Fachmann kann ebenfalls leicht andere gängige diagnostische Teile für dieses Kit auswählen.
Solche Kits und Reagenzien können in einem Verfahren zum Nachweisen der Titer und Reaktivitätsmuster von Antikörpern in Subjekten verwendet werden, die mit den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen geimpft wurden. Ein Verfahren zur Bestimmung der Anwesenheit und/oder des Titers von Antikörpern, welche durch Immunisierung gegen ein Tat-Immunogen induziert wurden, schließt die Schritte des Inkontaktbringens einer biologischen Probe von einem immunisierten Subjekt, z.B. eine Körperflüssigkeit, vorzugsweise Blut, Serum oder Plasma, aber ebenfalls möglicherweise Urin, Speichel und andere Flüssigkeiten oder Gewebe, mit einem oder mehreren der Bindungssequenzen der von Primaten erkannten Epitop I und optionalen Immunogene, vorzugsweise immobilisiert auf einem festen Träger, wie einer Platte oder Kügelchen ein. Die von Primaten erkannten Epitop I und optionalen Bindungssequenzen, die in diesem Verfahren verwendet werden, können die nicht modifizierten minimalen Epitop Bindungsregionen sein.
Sobald die biologische Probe den immobilisierten Peptiden für eine ausreichende Zeit ausgesetzt wird, wird der Träger gewaschen, um jedes Material von der biologischen Probe zu entfernen, welches nicht an die Peptide gebunden ist. Solche Waschschritte sind in diagnostischen Assays gängig und werden mit Salzlösung durchgeführt. Wenn Antikörper gegen die. Epitope I und optionalen Immunogene oder eine Kombination davon in dem Subjekt durch die oben beschriebene Behandlung induziert wurden, wurden die immobilisierten Peptide mit Antikörper aus der biologischen Probe gebunden. Nachfolgend wird ein markiertes Reagens zu dem Material auf dem Träger hinzugefügt, um die Bindung zwischen den Peptiden auf dem festen Träger und Antikörper in der biologischen Probe nachzuweisen. Vorzugsweise ist solches Reagens ein Anti-Mensch Immunglobulin, wie ein Ziege Anti-Mensch Immunglobulin. Die Markierung wird aus einer großen Anzahl von gängig verwendeten diagnostischen Markierungen ausgewählt, wie oben diskutiert. In einer Ausführungsform kann die Markierung ein kolorimetrisches Enzym sein, welches bei Kontakt mit einem Substrat ein nachweisbares Farbsignal bildet. Die Anwesenheit und/oder Intensität der Farbe liefert einen Beleg für die Induktion von Antikörper in dem behandelten Subjekt. Dieser Assay kann verwendet werden, um die Wirksamkeit der Immunisierung zu bestimmen, sowie um den Immunstatus eines Patienten zu überwachen.
Die Auswahl bestimmter Assayschritte, sowie eine Vielzahl von nachweisbaren Markierungssystemen liegt sicher innerhalb des Könnens des Fachmanns. Eine solche Auswahl stellt eine Routine dar und beschränkt die vorliegende Erfindung nicht.
M. Vorteile der Erfindung
Einer der Vorteile der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ist die kleine Anzahl von Immunogenen, die zum Einschließen in eine erfindungsgemäße Zusam mensetzung benötigt wird, um mit mehr als 95 bis mehr als 99% der bekannten Tat-Proteinvarianten von HIV-1 des verbreiteten B-Subtypus kreuz zu reagieren. Wie in den Beispielen unten dargestellt, kreuzreagiert die immunogene von Primaten erkannte Epitop I Zusammensetzung, welche die zwei benötigten von Primaten erkannten Epitop I Aminosäuresequenzen, sowie die sechs zusätzlichen Epitop I Sequenzen enthält, mit 95% der Tat-Proteine von HIV-1 des verbreiteten B-Subtypus, sowie mit allen 56 Tat-Proteinsequenzen von weniger häufigen Nicht-B-Subtypen von HIV-1. Daher kann eine einzelne Zusammensetzung geeignet zum Schützen gegen oder Behandeln von einer Infektion verwendet werden, die von der enormen Mehrheit der HIV-1-Stämme verursacht wird, die angetroffen werden können.
Weiterhin können durch das Identifizieren der genauen Epitope von Tat, gegen welche eine Bindung gewünscht ist (d.h. AS5–12 der SEQ ID NR: 15), neue wünschenswerte Tat-Peptidimmunogene von neu vorkommenden HIV-1-Stämmen oder neu entdeckten Stämmen einfach unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren identifiziert werden und in die Zusammensetzungen eingeschlossen werden. Diese Flexibilität ermöglicht den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen prophylaktisch gegen jeden neuen Stamm oder Stämme von HIV-1, die in der Zukunft identifiziert werden, geeignet zu sein. Im Hinblick auf die hier genannten Lehren wird vom Fachmann erwartet, dass er leicht neue Kombinationen von Tat-Immunogenen (und die Nukleinsäurekonstrukte, die sie kodieren) in die Zusammensetzungen einfügen kann.
Zum Beispiel ermöglicht die Verwendung von gängigen Techniken, wie PCR und High Density Olignucleotide Arrays [M. J. Kozal et al., Nature Med., 2: 753 (1996)], dem Fachmann, die Aminosäuresequenzen einer großen Anzahl von HIV-1 Tat-Proteinen zu erhalten, welche Varianten der klinischen Isolate von HIV-1-Stämmen und -Subtypen darstellen. Die Verwendung solcher Techniken erlaubt eine Bestimmung von anderen Varianten des HIV-1 B-Subtypus, sowie anderer Subtypen in unterentwickelten Ländern, die bis heute nicht so intensiv untersucht wurden. Die Bestimmung von neuen Tat-Sequenzen wird einen Einschluss der entsprechenden Peptide als Immunogene in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen leicht ermöglichen, was die Induktion einer Antikörperantwort gegen andere seltene Tat-Proteine von HIV-1 erlaubt.
Kreuzreaktivitätsuntersuchungen mit Antikörpern, die gegen synthetische Peptide, die jeder Tat-Variante entsprechen, erzeugt wurden, können verwendet werden, um den Bedarf des Immunisierens mit Tat-Varianten, in denen die Sequenzänderungen immunologisch stumm sind, zu beseitigen, da diese Peptide stark von Antikörpern gegen die Konsensussequenz oder andere Varianten gebunden werden.
Die folgenden Beispiele stellen bevorzugte Verfahren zum Herstellen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und zur Verwendung dieser Zusammensetzungen zum Induzieren von Antikörpern gegen Tat-Proteine des Virus in einem immunisierten Wirt dar. Diese Beispiele sind nur darstellend und beschränken den Schutzumfang der Erfindung, welcher durch die Ansprüche definiert ist, nicht.
BEISPIEL 1 – IMMUNOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN VON MINIMALEN TAT-PROTEIN AMINOSÄURESEQUENZEN. NÖTIG FÜR DIE BINDUNG AN ANTIKÖRPER FÜR VON PRIMATEN ERKANNTES EPITOP I IN HIV-1 TAT-PROTEIN SEQUENZVARIATIONEN UND IMMUNOLOGISCHE KREUZ-REAKTIVITÄTEN VON ANTISEREN GEGEN DIESE SEQUENZEN
A. Synthetisches Peptid und Konjugate
Die synthetischen Peptide wurden durch eine Festphasensynthese auf derivatisierten Polyethylenträgern synthetisiert [R. M. Valerio et al., Int. J. Peptide Res., 44: 158–165 (1994)]. Immunisierende Peptide wurden mit einem aminoterminalen Cys, welches eingefügt wurde, um ein Koppeln an ein Trägerprotein zu erleichtern und einen amidierten C-Terminus, synthetisiert. Nachweispeptide wurden mit einer aminoterminalen Biotin-Ser-Gly-Ser-Gly-Sequenz [SEQ ID NR: 27] und einer freien Säurefunktion am C-Terminus zur Verwendung in ELISA-Assays zum Nachweis der Reaktivität und Kreuzreaktivität synthetisiert. Immunisierende Peptide, kovalent an Diphtherie-Toxoid (DT) Trägerprotein über die Cysteinyl-Seitenkette konjugiert, mit einem Peptid-Trägerverhältnis von 5–8 [A. C. J. Lee et al., Molec. Immunol., 17: 749 (1980)], wurden mit einer Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC) auf mehr als 95% Reinheit durch analytische HPLC und Massenspektrometrie mit Nachweispeptiden aufgereinigt, die bei mehr als 50% Reinheit verwendet wurden.
B. Immunisierungen
Die Peptidkonjugate wurden in gereinigtem Wasser aufgenommen und 1:1 mit vollständigem Freund'schen Adjuvans (CFA für engl.: complete Freund's adjuvant) oder unvollständigem Freund'schen Adjuvans (IFA für engl.: incomplete Freund's adjuvant) emulgiert [ANTIBODIES – A LABORATORY MANUAL, Hrsg., E. Harlow und P. Lane, Cold Spring Harbor Laboratory (1998)]. Das Gesamtvolumen pro Primat betrug 1 ml, und dies enthielt 100 μg des an DT gekoppelten Peptids.
Rhesusaffen, die Teil einer viralen Belastungsuntersuchung waren, wurden mit Antigen in IFA/CFA wie folgt immunisiert. Mehrere Primaten wurden für das immunisierende Peptid verwendet, mit der anfänglichen intramuskulären (IM) Injektion mit Konjugat in CFA und einer nachfolgenden IM Auffrischung nach 2 Wochen mit Konjugat in IFA. Eine Vorblutprobe (engl.: pre-bleed) wurde vor der ersten Injektion entnommen und größere Blutproben wurden 3 und 5 Wochen nach der Auffrischungsinjektion entnommen.
C. ELISA-Titer
ELISA-Assays wurden wie von H.M. Geysen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 3998 (1983) beschrieben, durchgeführt. Der Antikörper-Titer war der Kehrwert der Serumsverdünnung, die zu einer Absorption von 1,0 OD Einheiten über dem Hintergrund führte. Der geometrische mittlere Titer (GMT) für 2–3 Seren wurde für jede Antwort berechnet, oder es waren nur einzelne Seren für einige Affenimmunisierungen verfügbar.
ELISA-Ergebnisse für diesen Assay in Kaninchen im Vergleich zu Affen werden jeweils in den 1A und 1B gezeigt. Die ELISA-Ergebnisse zeigten, dass die Primaten-Antikörper gegen das Immunogen enthaltende Epitop I mit der Sequenz -Asp-Pro-Arg₇-Leu-Glu₉-Pro-Trp-Lys₁₂- [AS5–12 von SEQ ID NR: 15] reagierten. Wie unten diskutiert, stellen die Positionen 7, 9 und 12 verbreitete Varianten dieses Epitop I Peptids dar, welches von Primaten erkannt wird.
D. Analyse der Aminosäuresequenzdiversität innerhalb der Epitope
Sequenzen des ersten Exons von HIV-1 Tat wurden von den GenBank und Los Alamos Human Retroviruses and AIDS Datenbanken abgerufen [HUMAN RETROVIRUSES and AIDS 1996, veröffentlicht von der Gruppe Theoretische Biologie und Biophysik des Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM und zusätzliche Sequenzen wurden freundlicherweise von GenBank durch Esther Guzman vom Los Alamos Laboratory bezogen]. Unvollständige Sequenzen und Sequenzen mit Stoppcodons oder Basendeletionen, die zu einer Verschiebung des Leserahmens führten, wurden entfernt, ebenso wie offensichtlich identische Sequenzwiederholungen aus der gleichen Isolation. Variationen von Aminosäuren an den Positionen innerhalb der Epitope wurden aufgenommen und tabellarisch dargestellt.
E. Antigene Kreuzreaktivitäten zwischen Varianten
Antiseren gegen die Epitop Konsensussequenz wurden mit einem ELISA auf die Konsensussequenz und auf Sequenzen mit verbreiteten Aminosäurevarianten getitert, um die Wirkungen von Aminosäurepolymorphismen auf die Antigenität zu bestimmen.
F. Variationen in Sequenzen
Die von Primaten erkannte Epitop I Konsensussequenz wurde für eine maximale Häufigkeit und eine Erkennung durch Primaten-Antikörper bestimmt. Die antigene und Sequenzkonservierung bei HIV-1 Tat-Proteinen von 294 HIV-1 Tat-Proteinen von 294 B-Stamm (I) Viren und 56 Nicht-B-Stamm (II) Viren wurde für die Epitope bestimmt, und die Ergebnisse wurden tabellarisch in den Tabellen II bis VI unten dargestellt.
Die obere Zeile der Tabellen II und III weist die Konsenssequenz für maximale Häufigkeit aus. Die mittleren Zeilen enthalten die prozentuale Häufigkeit der Aminosäuren, die in mehr als 5% der Sequenzen an jeder Position gefunden wurden, wenn sie mehrfach vorkamen. Die untere Zeile jeder Tabelle stellt die Gesamthäufigkeit einschließlich der Aminosäuren, die in mehr als 5% der Sequenzen vorkommen, dar, wenn sie mehrfach vorkamen. Alle diese Auswahlen in Tabelle II und alle der Auswahlen in Tabelle III, außer den Einträgen unter Aminosäure 4 erzeugen antigenisch unterschiedliche Epitope (< 25% Kreuzreaktivität). Tabelle II Epitop I – 294-B-Stämme
Tabelle III Epitop I – 56 Nicht-B-Stämme
Wie in den Tabellen II und III gezeigt, weist das von Primaten erkannte Epitop I einen potenziell 16-fachen antigenen Polymorphismus auf, aber ein Hauptantigen ist für die B-Stämme vorhanden und ein anderes Hauptantigen ist für die Nicht-B-Stämme vorhanden. Fünf andere Varianten machen mehr als 95% der bekannten Tat-Varianten aus. Siehe Tabellen IV und V, mit einem Stern ausgewiesene Sequenzen sind sowohl in B- als auch Nicht-B-Stämmen vertreten. Tabelle IV – B-Stämme (294 Sequenzen)
Tabelle V – Nicht-B-Stämme (56 Sequenzen)
Tabelle VI zeigt die schwache antigene Kreuzreaktivität der Position 7 Varianten des Epitop I, die antigene Unterscheidung der Position 9 Varianten und das außergewöhnliche Fehlen einer Kreuzreaktivität der Antiseren gegen GluProValAspProAsn₇LeuGlu₉ProTrpAsn₁₂ [AS225–235 der SEQ ID NR: 13] mit GluProValAspProArg₇LeuGlu₉ProTrpLys₁₂ [AS2–12 der SEQ ID NR: 15], welche Varianten an sowohl den Positionen 7 und 12 enthalten. Sie zeigt weiterhin eine antigene Unterscheidung der Glu9 und Asp9 Varianten. Tabelle VI – ELISA-Reaktivität von Affenantiseren gegen Epitop I Immunogene auf Nachweispeptide mit Variationen der Tat-Aminosäurepositionen 7, 9 und 12
BEISPIEL 2 – IMMUNOLOGISCHE UNTERSUCHUNGEN VON MINIMALEN TAT-PROTEIN AMINOSÄURESEQUENZEN, NÖTIG FÜR BINDUNG AN ANTIKÖRPER FÜR VON PRIMATEN ERKANNTES EPITOP II IN HIV-1 TAT-PROTEIN, SEQUENZVARIATIONEN UND IMMUNOLOGISCHE KREUZREAKTIVITÄTEN DER ANTISEREN GEGEN DIESE SEQUENZEN (VERGLEICHEND)
Unter Verwendung der gleichen, in Beispiel 1 ausgeführten Verfahren, wurde die Häufigkeit der Aminosäuresequenzvariation von 294 B-Stamm und 56 Nicht-B-Stamm HIV-1 Tat-Sequenzen innerhalb der Epitop II Grenzen des Antikörperbindens bei Affen bestimmt. Die Ergebnisse werden in den Tabellen VII und VIII gezeigt. Die oberen Zeilen der Tabellen enthalten die Konsensussequenz. Die mittleren Zeilen enthalten die prozentuale Häufigkeit von Aminosäuren, die in mehr als 5% der Sequenzen an jeder Position gefunden wurden, wenn sie mehrfach vorkamen. Die untere Zeile zeigt die Gesamthäufigkeit, einschließlich der Aminosäuren, die in mehr als 5% der Sequenzen vorkommen, wenn sie mehrfach vorkamen. Die Aminosäurevarianten an Tat-Position 42 waren antigenisch kreuzreaktiv. Tabelle VII Epitop II – 294 B-Stämme
Tabelle VIII Epitop II – 56 Nicht-B-Stämme
Wie in den Tabellen VII und VIII gezeigt, zeigt Epitop II eine fast vollständige antigene Konservierung.
ELISA-Reaktivität von Affenantiseren gegen Epitop II Immunogen auf Nachweispeptide mit Tat-Gly₄₂ oder -Ala₄₂ (Variante) innerhalb der Nachweissequenzen, wurde gemessen und in Tabelle IX unten gezeigt. Siehe 2A und 2B für einen graphischen Vergleich der Ergebnisse in jeweils Kaninchen gegenüber Affen.
Tabelle IX
BEISPIEL 3: ENTWICKLUNG EINER BEHANDLUNG MIT HUMANEM MONOKLONALEN ANTIKÖRPER FÜR ASYMPTOMATISCHE HIV-1 INFEKTIONEN
Kommerziell verfügbare Antikörper-humanisierte Mäuse werden mit einer geeigneten Menge des Epitop II Immunogens: Cys-Gly-Ser-Lys-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-Amid [SEQ ID NR: 34], gekoppelt an ein Diphtherie-Toxoid Trägerprotein, immunisiert. Hybridome werden auf Biotin-Ser-Gly-Ser-Gly-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-OH [SEQ ID NR: 35] auf Streptavidin beschichteten Platten gescreent, und ein IgG monoklonaler Antikörper mit subnanomolarer Bindungsaffinität und keiner Bindung an Komplementrezeptoren wird ausgewählt. Die Spezifität wird mit rekombinantem HIV-1 Tat-Protein bestätigt.
Da der monoklonale Antikörper auf ein Nicht-Eigenantigen gerichtet ist, wird eine gängige vorklinische Herstellung, Aufreinigung und Sicherheitsüberprüfung erwartet. Humane monoklonale Antikörper weisen eine Halbwertszeit von 20 Tagen im Menschen gegen die 18 Stunden Halbwertszeit von OKT3, einem monoklonalen Maus Antikörper auf, welcher umfangreich an internem CD3 verbraucht wird. Täg liche Dosierungen von 5 mg OKT3 halten Talspiegel um 1 Mikrogramm/ml im Menschen aufrecht. Daher wird erwartet, dass eine zweiwöchige Dosierung von 5 mg monoklonalem Anti-Tat-Antikörper ausreichend ist, um ähnliche Talspiegel aufrecht zu erhalten, ein mehr als fünfzigfacher molarer Überschuss über die berechneten maximalen zirkulierenden Spiegel von bis zu 1 ng/ml für HIV-1 Tat-Protein in infizierten Subjekten.
Eine Kontrolle der viralen Beladungen des Plasmas ist jetzt ein anerkanntes Kriterium der Wirksamkeit einer HIV-1 Behandlung. Die Wirksamkeit eines monoklonalen Anti-Tat-Antikörpers kann in asymptomatisch HIV-1 infizierten Subjekten schnell bestimmt werden, zunächst mit einem vierwöchigen Verlauf der Behandlung. Dies Protokoll ist geeignet für nicht behandelte Patienten, für Patienten, bei denen HAART-Protokolle aufgrund verschiedener Gründe scheiterten oder für Patienten, die durch eine HAART-Therapie kontrolliert werden, mit einer Absetzung dieser Therapie für 4 Wochen (virale Beladungen erholen sich schnell, wenn HAART gestoppt wird). Eine Reduktion um 2 bis 3 logarithmische Stufen der viralen Beladungen des Plasmas auf unter die LOD (50 virale RNA-Kopien/ml), unterstützen eine Monotherapie mit dem monoklonalen Antikörper, welcher über einen längeren Zeitraum bewertet wird. Eine Reduktion über eine logarithmische Stufe (90%), aber nicht unter die LOD schlägt die Verwendung des monoklonalen Antikörpers als ein Teil in der Therapie vor.
BEISPIEL 4 – ENTWICKLUNG EINES UNIVERSALIMPFSTOFFS, UM EINE PROGRESSION ZU AIDS IN SUBJEKTEN ZU VERHINDERN
A. Konstruktion eines synthetischen Gens
3A stellt ein synthetisches Gen dar, welches vier Kopien von jedem der vier Polymorphe von Epitop I, welches für die Kaninchen Antikörperantwort nachgewiesen wurde, plus vier Kopien von Epitop II, welche in E. coli als ein lineares Fusionsprotein mit E. coli DnaK (HSP70) exprimiert werden, kodiert. Dieses exprimierte Protein enthielt alle antigenen Epitope, wenn es in einem ELISA mit Epitop spezifischen Kaninchen Antiseren getestet wurde. Wenn sie jedoch zum Immunisieren im Kaninchen oder Affen verwendet wurden, waren alle Epitop I Varianten immunogen, aber Epitop II war es nicht. Daher wird Epitop II am besten als ein synthetisches Peptidkonjugat verwendet, welches an ein geeignetes Trägerprotein gekoppelt ist.
3B stellt ein neues octavalentes synthetisches Gen dar, welches konstruiert wurde, um im Leserahmen acht von Primaten erkannte Epitop I Polymorphe einzuschließen, basierend auf dem Polymorphismus innerhalb der Epitop I Grenzen, welche in Primaten erkannt werden:
Die Epitop I Sequenzen sind durch die Dipeptidspacer getrennt, die Gly- und/oder Ser-Reste enthalten. Das Gen wird wie in W.P.C. Stemmer et al., Gene, 164: 49 (1995) beschrieben, zusammengesetzt. In Kürze, Oberstrang 60-mer Oligonukleotide (Oligos) und Unterstrang Oligos mit 20 Nukleotid(nt)-Überlappungen werden zusammen mit zwei End-50-meren synthetisiert. Die 60-mere werden zusammen unter Hybridisierungsbedingungen inkubiert, und eine Polymerase Kettenreaktion (PCR) wird verwendet, um die Sequenz aufzufüllen und sie zu vervielfältigen. Die End-50-mere werden anschließend hinzugefügt, und der Zusammenbau wird durch PCR vervollständigt, mit einer Isolierung des Gens in gesamter Länge auf einem Agarosegel. Das Gen wird sequenziert, und es wird gefunden, dass es die richtige Sequenz innerhalb der tatsächlichen Epitope aufweist. Ein ähnliches heptavalentes Gen kann durch Entfernen der seltenen Variante R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 [SEQ ID NR: 24] konstruiert werden.
B. Expression des Fusionsproteins
Dieses oben beschriebene Gen wird anschließend mit Restriktionsenzymen herausgeschnitten und in einen geeigneten Expressionsvektor eingefügt, welcher die Sequenz für das Diphtherie-Toxoid (HSP70) im Leserahmen enthält. E. coli wird transfiziert, und Kolonien, die das Protein exprimieren, werden isoliert. Die isolierten Kolonien werden wachsen gelassen, und eine Expression wird induziert. Protein von Kolonien, die das Fusionsprotein exprimieren, wird identifiziert. Das sich ergebende Protein wird unter Verwendung gängiger Verfahren aufgereinigt.
3C stellt ein monovalentes Epitop II Immunogen dar, welches gegebenenfalls als ein Konjugat eines synthetischen Peptids mit einem Trägerprotein, wie einem Diphtherie-Toxoid, unter Verwendung ähnlicher Techniken hergestellt wird.
C. Assays zum richtigen Beurteilen der Expression der Epitope im Fusionsprotein und der Wirksamkeit beim Induzieren von Anti-Tat-Antikörpern
Vier Varianten der Epitope I, in denen Y₇ entweder Arg, Asn, Lys oder Ser ist und X₉ Glu ist und Z₁₂ Lys ist, und beide Varianten von Epitop II werden in einem synthetisches Gen konstruiert und als ein Fusionsprotein exprimiert, wie in den Absätzen A und B oben beschrieben. Um zu bestimmen, ob jedes Epitop in dem Fusionsprotein in einer Form exprimiert wird, die von Primaten Antiseren erkannt werden kann, werden unter Verwendung gängiger Methodik Primaten Antiseren, welche gegen synthetische Peptide erzeugt wurden, die den Epitop I Sequenzen entsprechen, mit einem ELISA getestet. Die Platten werden anfänglich direkt mit dem Fusionsprotein beschichtet und anschließend einer 100 μg/ml Lösung der Antiseren (z.B. Kaninchen Antiseren) ausgesetzt, welche bekannt sind, für die Epitope I und II reaktiv zu sein. Die Varianten Epitop Sequenzen werden in einer Konformation exprimiert, die für Antikörper gegen die entsprechenden synthetischen Peptide erkennbar ist, wie durch einen Titer von mehr als 32.000 für jedes Epitop gezeigt wird.
Um die Immunogenität des multivalenten Immunogens zu bewerten, wurden Affen mit dem Fusionsprotein in IFA immunisiert. Die Affen Antiseren wurden anschließen an synthetischen Peptiden der Epitope I und II beurteilt. Signifikante Titer wurden gegen die Epitop I Varianten entwickelt, d.h. Titer von 28.000 gegen Epitop I, wenn Y₇ Arg ist und Z₁₂ Lys ist; Titer von 16.000 gegen Epitop I, wenn Y₇ Asn ist und Z₁₂ Lys ist; Titer von 37.000 gegen Epitop I, wenn Y₇ Lys ist und Z₁₂ Lys ist und Titer von 4.000 gegen Epitop I, wenn Y₇ Ser ist und Z₁₂ Lys ist. Der Titer gegen Epitop II betrug 700, was darauf hinweist, dass dies Epitop am besten für eine Immunisierung als ein synthetisches Peptid, gekoppelt an einen Träger, präsentiert wird.
BEISPIEL 5: VERFAHREN UND KITS ZUM NACHWEISEN DER TITER UND SPEZIFITÄTEN DER DURCH IMPFUNG INDUZIERTEN ANTIKÖRPER
Um den Titer und die Spezifitäten der Antikörper, die nach einer Immunisierung mit den erfindungsgemäßen Impfstoffen induziert wurden, zu beobachten, kann ein Assayverfahren verwendet werden. In einer Ausführungsform eines solchen Assays werden Peptide verwendet, welche die von Primaten erkannten Epitop I Sequenzen, von denen in Beispiel 1 berichtet wurde, enthalten (abhängig von der Zusammensetzung des immunisierenden Impfstoffs), um Kits zu entwickeln, welche die Titer und Reaktivitätsmuster von Antikörpern in geimpften Subjekten messen.
Diese Peptide werden mit Biotin-Ser-Gly-Ser-Gly- [SEQ ID NR: 36] am N-Terminus synthetisiert. Jedes Peptid wird auf getrennte Avidin beschichtete Platten geschichtet, mit einer Sequenz -Ser-Gly-Ser-Gly- [SEQ ID NR: 27], die als ein Spacer dient, um sicherzustellen, dass die relevante Peptidsequenz außerhalb der Biotin-Bindungstasche des Avidins liegt. Die Platten werden anschließend mit Verdünnungen des Testserums inkubiert, gewaschen, und die Antikörperbindung wird mit einem Reagens gegen humanes Immunglobulin, z.B. Ziege Anti-Mensch Immunglobulin, welches direkt mit einem Enzym markiert ist, bestimmt. Ein Rea gens wird verwendet, um mit dem Enzym zu reagieren und ein kolorimetrisches Signal herzustellen (R&D Kit Bestandteile).
Zahlreiche erfindungsgemäße Modifikationen und Variationen sind in der oben angegebenen Beschreibung eingeschlossen, und es wird erwartet, dass sie dem Fachmann offensichtlich sind. Von solchen Modifikationen und Änderungen der erfindungsgemäßen Zusammensetzungen und Verfahren wird angenommen, dass sie in den Schutzumfang der hier beigefügten Ansprüche eingeschlossen sind. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Zusammensetzung, umfassend mindestens zwei Varianten eines Peptids oder Polypeptids der Formel: R1-Asp-Pro-Y₇-Leu-X₉-Pro-Trp-Z₁₂-R2 SEQ ID NR: 8, wobei Y₇ aus der Gruppe, bestehend aus Asn, Arg, Lys und Ser, ausgewählt ist, wobei X₉ Glu oder Asp ist, wobei Z₁₂ aus der Gruppe, bestehend aus Lys und Asn, ausgewählt ist, wobei R1 aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, einer Niederalkylgruppe, einer Niederalkanoylgruppe und einer Sequenz von zwischen 1 bis etwa 5 Aminosäuren, gegebenenfalls mit einer Niederalkylgruppe oder Niederalkanoylgruppe substituiert, ausgewählt ist, und wobei R2 aus der Gruppe, bestehend aus einem freien Hydroxyl, einem Amid und einer Sequenz von einer oder bis zu etwa 5 zusätzlichen Aminosäuren, gegebenenfalls mit einem Amid substituiert, ausgewählt ist, und wobei in mindestens einer der Varianten Y₇ Asn und Z₁₂ Asn und in der anderen Y₇ Arg und Z₁₂ Lys sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei für jede Variante R1 Val ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei für jede Variante R1 X₂-Pro-Val ist, wobei X₂ aus der Gruppe, bestehend aus Glu und Asp ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei für jede Variante R2 -His-Pro-Gly- Ser ist, wobei der Carboxyl-Terminus gegebenenfalls mit einem Amid substituiert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei mindestens eine Variante R1-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 SEQ ID NR: 17 ist, und die andere Variante R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 SEQ ID NR: 18 ist, und umfassend eine oder mehrere zusätzliche Sequenzen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus: R1-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 SEQ ID NR: 19 R1-Asp-Pro-Lys-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 SEQ ID NR: 22 R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 SEQ ID NR: 20 R1-Asp-Pro-Ser-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 SEQ ID NR: 24 R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Asp-Pro-Trp-Asn-R2 SEQ ID NR: 23 und R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 SEQ ID NR: 21, wobei R1 aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, einer Niederalkylgruppe, einer Niederalkanoylgruppe und einer Sequenz von zwischen 1 bis etwa 5 Aminosäuren, gegebenenfalls mit einer Niederalkylgruppe oder Niederalkanoylgruppe substituiert, ausgewählt ist, und wobei R2 aus der Gruppe, bestehend aus einem freien Hydroxyl, einem Amid und einer Sequenz von einem oder bis zu etwa 5 zusätzlichen Aminosäuren, gegebenenfalls mit einem Amid substituiert, ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, weiter umfassend mindestens sieben der Aminosäuresequenzen.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, weiter umfassend mindestens ein Peptid oder Polypeptid der Formel R3-Lys-X₄₂-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys-R4 SEQ ID NR: 5, wobei X₄₂ aus der Gruppe, bestehend aus Gly oder Ala ausgewählt ist, wobei R3 aus der Gruppe, bestehend aus Wasserstoff, einer Niederalkylgrup pe, einer Niederalkanoylgruppe und einer Sequenz von zwischen 1 bis etwa 5 Aminosäuren, gegebenenfalls mit einer Niederalkylgruppe oder Niederalkanoylgruppe substituiert, ausgewählt ist, wobei R4 aus der Gruppe, bestehend aus einem freien Hydroxyl, einem Amid und einer Sequenz von einem oder bis zu etwa 5 zusätzlichen Aminosäuren, ausgenommen der basischen Aminosäuren -Lys-Arg-Arg-, gegebenenfalls mit einem Amid substituiert, ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, erhältlich auf synthetischen Wegen.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, erhältlich auf rekombinanten Wegen.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei eines oder mehrere der Peptide als synthetische(s) Peptid(e), welche(s) an ein Trägerprotein koppelt/koppeln, exprimiert ist/sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei eines oder mehrere der Peptide als ein mehrfach-antigenes Peptid, gegebenenfalls an ein Trägerprotein gekoppelt, exprimiert ist/sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei eines oder mehrere der ausgewählten Peptide in einem rekombinant hergestellten Protein, gegebenenfalls mit einem Trägerprotein im Leserahmen fusioniert, exprimiert ist/sind.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, wobei das Trägerprotein aus der Gruppe, bestehend aus einem E. coli DnaK Protein, einem GST Protein, einem mycobakteriellen Hitzeschockprotein 70, einem Diphterie-Toxoid, einem Tetanus-Toxoid, einer Galactokinase, einem Ubiquitin, einem α-Paarungsfaktor, einer β-Galactosidase und einem Influenza NS-1 Protein, ausgewählt ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, einen pharmazeutisch verträglichen Träger und ein optionales Hilfsmittel.
Verwendung einer Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14 in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von HIV-1 in einem Säuger.
In vitro-Verfahren zur Bestimmung der Gegenwart und/oder dem Titer von Antikörpern, welche durch Immunisierung an ein Tat Immunogen bewirkt werden, umfassend: (A) Inkontakbringen einer biologischen Probe von einem immunisierten Subjekt mit einer an einen festen Träger gebundenen Peptid- oder Polypeptid-Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, (B) Waschen des Trägers, um jedes Material von der biologischen Probe zu entfernen, welches nicht an die Sequenzen gebunden ist, (C) Inkontaktbringen des Trägers mit einem Reagenz, welches mit einer nachweisbaren Markierung verbunden ist, wobei das Reagenz das Binden zwischen den Sequenzen auf dem festen Träger und dem Antikörper in der biologischen Probe nachweist, und wobei die Markierung ein nachweisbares Signal erzeugt.
Antikörperzusammensetzung, umfassend Antikörper, die auf die Peptide oder Polypeptide gerichtet sind, welche die Zusammensetzungen nach Anspruch 1 bilden, wobei die Zusammensetzung mindestens einen ersten Antikörper, welcher spezifisch an das Epitop R1-Asp-Pro-Y₇-Leu-X₉-Pro-Trp-Z₁₂-R2 SEQ ID NR: 8 bindet, wobei Y₇ Asn ist, Z₁₂ Asn ist und X₉ Glu oder Asp ist, und einen zweiten Antikörper, welcher spezifisch an das Epitop bindet, in dem Y₇ Arg ist und Z₁₂ Lys ist, umfasst.
Antikörperzusammensetzung nach Anspruch 17, umfassend ein Gemisch von mehr als den zwei Antikörpern, wobei die Antikörper HIV-1 Tat Protein Epitop-Sequenzen von vielfachen HIV-1-Stämmen binden.
Antikörperzusammensetzung nach Anspruch 17 und 18, wobei der Antikörper aus der Gruppe, bestehend aus einem isolierten polyklonalen Antikörper, einem monoklonalen Antikörper, einem chimären Antikörper, einem humanisierten Antikörper, einem humanen Antikörper, einem durch Phagen-Display-Screening hergestellten Antikörper, einem einkettigen Antikörper, einem Antikörperfragment und Gemischen davon, ausgewählt ist.
Antikörperzusammensetzung nach Anspruch 17, umfassend einen Antikörper, welcher spezifisch an die Aminosäuresequenz Asp-Pro-Asn-Leu-X₉-Pro-Trp-Asn der SEQ ID NR: 26 bindet, wobei X₉ Glu oder Asp ist.
Antikörperzusammensetzung nach Anspruch 17, umfassend einen Antikörper, welcher spezifisch die Epitop-Sequenz R1-Asp-Pro-Arg-Leu-Glu-Pro-Trp-Lys-R2 SEQ ID NR: 17 bindet, und einen Antikörper, welcher spezifisch die Epitop-Sequenz R1-Asp-Pro-Asn-Leu-Glu-Pro-Trp-Asn-R2 SEQ ID NR: 18 bindet.
Antikörperzusammensetzung nach Anspruch 17, umfassend einen Antikörper gegen ein HIV Tat-1 Protein, welches spezifisch an die Aminosäuresequenz -Lys-X₁-Leu-Gly-Ile-Ser-Tyr-Gly-Arg-Lys- der SEQ ID NR: 10 bindet, wobei die Aminosäure X₁ Gly oder Ala ist.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine Antikörperzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 22 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verwendung einer Antikörperzusammensetzung nach einem der Ansprüche 17 bis 22 in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von HIV-1 durch Vermindern der HIV-1 viralen Spiegel in einem Menschen.
Synthetisches Gen, umfassend eine Nukleinsäuresequenz, welche mindestens zwei Varianten eines wie in Anspruch 1 definierten Peptids oder Polypeptids kodiert.
Synthetisches Molekül, umfassend das synthetische Gen nach Anspruch 25, funktionell mit regulatorischen Nukleinsäuresequenzen verbunden, welche die Expression des Produkts des synthetischen Gens in einer Wirtszelle lenken und steuern.
Säuger-Wirtszelle, enthaltend ein synthetisches Gen nach Anspruch 25.
Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend ein synthetisches Gen nach Anspruch 25 und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.