DE60126072T2

DE60126072T2 - Auf lipiden basierende arzneistoffabgabesysteme zur topischen anwendung

Info

Publication number: DE60126072T2
Application number: DE60126072T
Authority: DE
Inventors: Kent Jorgensen; Jesper Davidsen; Charlotte Vermehren; Sven Frokjaer; G. Ole MOURITSEN
Original assignee: LiPlasome Pharma ApS
Current assignee: LiPlasome Pharma ApS
Priority date: 2000-04-12
Filing date: 2001-04-11
Publication date: 2007-11-08
Anticipated expiration: 2021-04-12
Also published as: US20030170297A1; DK1272160T3; DE60132184D1; JP2003530338A; DE60122304T2; ES2270991T3; EP1272160A2; EP1272160B1; JP2003530362A; US20030162748A1; ES2280355T3; WO2001076556A3; WO2001076555A2; EP1272225A2; US20030175205A1; PT1272160E; US7166297B2; WO2001076644A2; EP1272161A2; JP2003530339A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft auf Lipiden beruhende pharmazeutische oder kosmetische Zusammensetzungen für die Nutzung bei der Behandlung, Verhinderung oder Linderung von Krankheiten oder Leiden der Haut oder der Schleimhäute von Säugetieren, die mit erhöhten Werten der extrazellularen Phospholipase A₂ (PLA₂)-Aktivität im Gewebe verbunden sind oder sich aus ihnen ergeben.
DER ERFINDUNG ZUGRUNDELIEGENDER ALLGEMEINER STAND DER TECHNIK
Die Haut als ein Organ ist von Interesse von biologischen, medizinischen und kosmetologischen Gesichtspunkten aus. Es gibt eine große Anzahl von Hautkrankheiten, die entweder organspezifisch sind, zum Beispiel Psoriasis und Ekzeme, oder die Manifestationen von Allgemeinerkrankungen sind, wie zum Beispiel allgemeine allergische Reaktionen. Eine Anzahl dieser auf die Haut oder die Schleimhäute von Menschen oder Tieren beschränkten Krankheiten könnte durch eine lokale topische Anwendung von pharmazeutischen Zubereitungen geheilt oder gelindert werden, vorausgesetzt dass die Anwendung zur Aufnahme der Wirkungskomponente führen würde. Viele Zubereitungen werden topisch auf die Haut aufgebracht, um das Aussehen der Person/des Tieres zu verändern, um sie vor dem Umfeld zu schützen, oder um in der Haut oder in einem anderen Gewebe eine biologische Veränderung für therapeutische, vorbeugende oder kosmetische Zwecke hervorzurufen. Die Haut bildet jedoch eine der effektivsten Barrieren des Körpers gegen Fremdstoffe, und auf Grund der Undurchlässigkeit der Haut müssen zum Beispiel viele therapeutische Wirkstoffe per os oder parenteral angewandt werden, obwohl die Haut das Zielorgan ist.
Es gibt viele Berichte über verschiedene Versuche, die Durchlässigkeit der intakten Haut mit Hilfe geeigneter Manipulationen zu erhöhen (Karzel K., Liedtke, R.K. (1989) Arzneim. Forsch/Drug Res. 39, 1487-1491). Zum Beispiel: Sprühinjektion (Siddiqui & Chien (1987) Crit. Rev. Ther. Drug. Carrier. Syst. 3, 195-208), die Nutzung elektrischer Felder (Burnette & Ongpipattanakul (1987) J. Pharm. Sci 76, 765-773) oder chemische Penetrationsverstärker, wie zum Beispiel Lösungsmittel und grenzflächenaktive Stoffe, sind besonders erwähnenswert. Eine lange Liste von Zusatzstoffen, die genutzt wurden, um das Penetrationsvermögen eines wasserlöslichen Mittels in die Haut hinein zu erhöhen, wird in der Arbeit von Aungst et al. (1986, Int. J. Pharm. 33, 225-234) aufgeführt. Diese Liste umfasst nicht-ionogene Stoffe (einschließlich von langkettigen Alkoholen, grenzflächenaktiven Stoffen, zwitterionischen Phospholipiden, usw.), anionische Stoffe (vor allem Fettsäuren), kationische Langkettenamine, Sulfoxide sowie verschiedene Aminoderivate; amphotere Glycinate und Betaine sind ebenfalls erwähnt. Ungeachtet all dessen ist das Problem der Wirkstoffpenetration in die Haut bis jetzt überhaupt noch nicht – oder nicht zufriedenstellend – gelöst worden.
Liposomale Zubereitungen stehen im Mittelpunkt umfangreicher Untersuchungen als Abgabemodus für viele Medikamente. Es gibt eine zunehmende Anzahl von Beweisen dafür, dass für die topische Verabreichung Liposome mehrere Vorteile gegenüber anderen Zubereitungen bieten. Diese Vorteile schließen geringere Nebenwirkungen ein, die mit der hohen systemischen Absorption des verabreichten Medikaments verbunden sind, eine erhöhte Akkumulation des verabreichten Medikaments am gewünschten Ziel, und die Möglichkeit, eine breite Vielfalt von Medikamenten, sowohl hydrophil als auch hydrophob, in die Haut zu verabreichen. Verbindungen, einschließlich von Analgetika, Antikörpern, Hormonen und DNA mit hohem Molekulargewicht sind der Haut verabreicht worden. Obwohl die Mehrheit der Anwendungen zur Abzielung auf die obere Epidermis (US Patent 6,180,353) führte, scheint der Einsatz von lipoidalen Trägern, Liposomen, weiterhin ein sehr vielversprechendes Verfahren für die Erhöhung der Durchlässigkeit der Haut zu sein (Egbaria & Weiner, Adv. Drug Delivery Rev. 5, 287 (1990)).
Interessanterweise ist eine Reihe von Beispielen pharmazeutisch wirksamer Lipid-Komponenten oder Lipid-Derivaten auf dem Fachgebiet beschrieben worden.
Das US 5,827,836 offenbart retinoyl-substitutierte Glycerophosphoethanolamine. Es wird erklärt, dass die Verbindungen und Salze derselben Antitumor-, Antipsoriasis- und entzündungshemmende Aktivitäten zeigen. Eine mögliche Klasse von Verbindungen weist einen Fettethersubstituenten in der 1-Position auf, einen Retinoi dester(Retinoyl)sub-stituenten in der 2-Position und einen Phosphoethanolaminsubstituenten in der 3-Position. Es wird erwähnt, dass einige der Verbindungen in einer Liposomzubereitung dargeboten werden können.
Das US 4,372,949 offenbart einen krebshemmenden und immunstimulierenden Wirkstoff, der ein Lysophospholipid und ein Phospholipid enthält. Beispiele von Verbindungen sind 3-Phosphorylcholin mit einem C_5-22-acyloxy- oder C_5-22-alkoxy-Substituenten in der 1-Position, und einem Wasserstoff, Hydroxy, C_1-5acyloxy- oder C_1-5-alkoxy-Substitutenten in der 2-Position. Es wird erwähnt, dass die Wirkstoffe in Form von Mizellen oder Lipidvesikeln dispergiert sein können.
Das US 5,484,911 offenbart Nucleosid 5'-Diphosphatkonjugate von Etherlipiden, die eine antivirale Aktivität aufweisen. Die Verbindungen können einen Fettether-/Thioether-Substituenten in der sn-1-Position aufweisen, und einen Fettsäureester-Substituenten in der sn-2-Position. Die Verbindungen sind so gestaltet, dass sie die Zellmembran durchdringen, wonach das Nucleosid-Medikament durch Abtrennung durch intrazellulare Phosphatasen freigesetzt wird. Es wird weiterhin nahegelegt, dass die ebenfalls freigesetzten Etherlipide nachfolgend durch intrazellulare PLA₂ abgetrennt werden können. Es wird nahegelegt, dass die Konjugate in Form von Mizellen dargeboten werden können, die leichter durch Makrophagen aufgenommen werden können.
Das US 4,622,392 offenbart zytotoxische Verbindungen des Nukleotid-Lipid-Konjugat-Typs.
Xia und Hui offenbart die chemische Synthese einer Reihe von Etherphospholipiden von D-Mannitol und ihre Eigenschaften als tumorzytotoxische Mittel.
Die US 5,985,854 ; US 6,077,837 ; US 6,136,796 und US 6,166,089 beschreiben Prodrugs mit erhöhter Penetration in Zellen, die besonders nützlich für die Behandlung eines Leidens oder einer Krankheit bei einem Menschen sind, bezogen auf supranormale intrazellulare Enzymaktivität. Die Prodrugs können sn-2-Ester von Lysophospholipiden sein. Diese Medikamente sind so ausgefegt, dass sie durch intrazellulare PLA₂ abgetrennt werden.
Cevc et al. (Biochem Biophys Acta (1998) 1368, Seiten 201-215; US Patent 6,165,500) beschreiben eine Zubereitung von Liposomen (Transfersome^®), die zu sehr flexiblen Liposomteilchen führt, welche – auf Grund ihrer Flexibilität – in der Lage sind, selbst intakte Säugetierhaut zu penetrieren.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Arzneistoffabgabesysteme, die von besonderem Nutzen bei der Behandlung oder Linderung von Krankheiten oder Leiden in der Haut oder in Schleimhäuten von Säugetieren sind, die mit einer Erhöhung der extrazellularen Phospholipase A₂-Tätigkeit im Gewebe (Phosphatidylcholin 2-Acylhydrolase) (PLA₂) verbunden sind.
Somit betrifft die vorliegende Erfindung die Nutzung eines auf Lipiden basierenden Arzneistoffabgabesystems in Form eines Liposoms für die Verabreichung eines Arzneiwirkstoffs, ausgewählt aus Lysolipid-Derivaten, wobei das System eine randaktive Verbindung umfasst und der Arzneiwirkstoff im auf Lipiden basierenden System in Form einer Prodrug vorliegt, wobei die Prodrug ein Lipidderivat ist mit (a) einer aliphatischen Gruppe mit einer Länge von zumindest 7 Kohlenstoffatomen und einem organischen Radikal mit zumindest 7 Kohlenstoffatomen und (b) einem hydrophilen Anteil, wobei die Prodrug des Weiteren ein Substrat für extrazellulare PLA₂ dergestalt ist, dass das organische Radikal hydrolytisch abgetrennt werden kann, während die aliphatische Gruppe im Wesentlichen unbeeinträchtigt bleibt, wodurch der Arzneiwirkstoff in Form eines Lysolipid-Derivats freigesetzt wird, das kein Substrat für Lysophospholipase ist, für die Zubereitung eines Medikaments für die Behandlung oder die Verhinderung der Behandlung von Krankheiten oder Leiden, die mit einer lokalisierten Erhöhung der extrazellularen PLA₂-Tätigkeit im kutanen oder subkutanen Gewebe eines Säugetieres verbunden sind.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls die Nutzung eines auf Lipiden basierenden Arzneistoffabgabesystems in Form eines Liposoms für die Verabreichung eines zweiten Arzneiwirkstoffs, wobei das System eine randaktive Verbindung umfasst und der zweite Arzneiwirkstoff in das System inkorporiert ist, das System Lipidderivate einschließt, und das (a) eine aliphatische Gruppe mit einer Länge von zumindest 7 Kohlenstoffatomen und ein organisches Radikal mit zumindest 7 Kohlenstoffatomen und (b) einen hydrophilen Anteil aufweist, wobei das Lipidderivat des Weiteren ein Substrat für extrazellulare PLA₂ dergestalt ist, dass das organische Radikal hydrolytisch abgetrennt werden kann, während die aliphatische Gruppe im Wesentlichen unbeeinträchtigt bleibt, was zu einem organischem Säurefragment oder einem organischen Alkoholfragment und einem Lysolipidfragment führt, wobei das Lysolipidfragment kein Substrat für Lysophospholipase ist, für die Zubereitung eines Medikaments für die Behandlung oder die Verhinderung der Behandlung von Krankheiten oder Leiden, die mit einer lokalisierten Erhöhung der extrazellularen PLA₂-Tätigkeit im kutanen oder subkutanen Gewebe eines Säugetieres verbunden sind.
BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1. Wärmekapazitätskurven, erhalten durch die Nutzung von Differenzialscanning-Kalorimetrie. (a) Multilamellare, MLV (obere Kurve) und unilamellare, LUV (untere Kurve) Liposome, aus 1 mM 1-O-Hexadexyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (1-O-DPPC). (b) MLV (obere Kurve) und LUV (untere Kurve) Liposome aus Dipalmitoylphosphatidylcholin (DPPC).
2. Charakteristisches Reaktionszeitprofil bei 41°C für Phospholipase A₂, PLA₂, (A. piscivorus piscivorus) Hydrolyse unilamellarer Liposome, zusammengesetzt aus 1-O-DPPC. Die PLA₂ Hydrolysereaktion wird überwacht durch Eigenfluroreszenz (fette Linie) des Enzyms und 90° statische Lichtstreuung (gestrichelte Linien) von der Lipidsuspension. Nach dem Hinzufügen von PLA₂ zur ausgeglichenen Liposomsuspension bei 800 Sek. folgt eine charakteristische Verzögerungszeit, ehe eine plötzliche Erhöhung der katalytischen Tätigkeit stattfindet. Proben für HPLC wurden vor dem Hinzufügen des Enzyms und 20 Minuten nach der beobachteten Verzögerungszeit entnommen.
3. HPLC Chromatogramme, welche die Wirkung der Phospholipase A₂ Hydrolyse von Liposomen aus 1-O-DPPC veranschaulichen. Die Chromatogramme zeigen die Menge von 1-O-DPPC (100 %, fette Linie), ehe Phospholipase A₂ (A. piscivorus piscivorus) der Liposomsuspension hinzugefügt wurde, und die Menge von 1-O-DPPC (21 %, gestrichelte Linie) nach dem Lag-Burst.
4. PLA₂-gesteuerte Freisetzung des fluoreszierenden Modell-Arzneistoff-Calceins aus Liposomen, bestehend aus 25 μM 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (1-O-DPPC), suspendiert in einem 10 mM HEPES-Puffer (pH = 7,5), als eine Funktion der Zeit. 25 nM Phospholipase A₂ (A. piscivorus piscivorus) wurden bei Zeit 900 Sek. hinzugefügt, die Temperatur betrug 37°C. Der Prozentsatz von freigesetztem Calcein wird bestimmt als % Freisetzung = 100 (I_F(t)_I_B)/(I_T_I_B) wobei I_F(t) die gemessene Fluoreszenz zum Zeitpunkt t nach dem Hinzufügen des Enzyms ist, I_B die Hintergrundfluoreszenz ist und I_T die Gesamtfluoreszenz ist, gemessen nach dem Hinzufügen von Triton X-100, was zur vollständigen Freisetzung von Calcein durch das Aufbrechen der Liposome führt.
5. PLA₂-gesteuerte Freisetzung des fluoreszierenden Modell-Arzneistoff-Calceins über die Zielmembran nicht-hydrolysierbarer Membranen (siehe 9) hinweg, als eine Funktion der Zeit für Liposome aus 25 μM 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphocholin (1-O-DPPC), suspendiert in einem 10 mM HEPES-Puffer (pH = 7,5). 25 nM Phospholipase A₂ wurden bei Zeit 0 Sek. hinzugefügt, und die Temperatur betrug 37°C. Der Prozentsatz von freigesetztem Calcein wurde bestimmt, wie in 4 beschrieben.
6. Charakteristische Reaktionszeitprofile bei 41°C für PLA₂ ((A. piscivorus piscivorus) Hydrolyse von unilamellaren Liposomen, inkorporiert mit 0 und 5 % negativ geladenen 1-O-DPPE-PEG350 Lipopolymeren. Die PLA₂ Hydrolysereaktion wird überwacht durch Eigenfluroreszenz (fette Linie) des Enzyms und 90° statische Lichtstreuung (gestrichelte Linien) von der Suspension. Nach dem Hinzufügen von PLA₂ zur ausgeglichenen Liposomsuspension folgt eine charakteristische Verzögerungszeit, ehe eine plötzliche Erhöhung der katalytischen Tätigkeit stattfindet.
7. PLA₂-gesteuerte Freisetzung des fluoreszierenden Modell-Arzneistoff-Calceins über die Zielmembran nicht-hydrolysierbarer D-O-SPC-Membranen hinweg, als eine Funktion der Zeit für Mizellen aus 25 μM 1-O-DPPE-PEG350 (gepunktete Linie), DSPE-PEG750 (gestrichelte Linie), 1-O-DPPE-PEG2000 (fette Linie), sus pendiert in einem 10 mM HEPES-Puffer (pH = 7,5). Phospholipase A₂ (25 nM) wurde bei Zeit 1200 Sek. hinzugefügt und die Temperatur betrug 41°C. Der Prozentsatz von freigesetztem Calcein wird bestimmt, wie in 4 beschrieben. Die PLA₂-katalysierte Hydrolyse von 1-O-DPPE-PEG350 führte die schnellste und höchste Freisetzung herbei.
8. HPLC Chromatogramme, welche die Wirkung der Phospholipase A₂ Hydrolyse von Mizellen aus DSPE-PEG750 (0,150 nM) veranschaulichen. Die Chromatogramme zeigen die Menge von Stearinsäure, die erzeugt wurde, ehe (fette Linie) Phospholipase A₂ (A. piscivorus piscivorus) der Mizellensuspension hinzugefügt wurde, und die Menge (gestrichelte Linie) von DSPE-PEG750 nach dem Lag-Burst. Die gestrichelte Linie zeigt reine Stearinsäure (0,4 mM). Die Prozentsatzhydrolyse wurde auf der Grundlage des integrierten Bereiches des Stearinsäurestandards (115850 Einheiten) und des integrierten Bereiches der Probe (45630 Einheiten) berechnet. Die Konzentration der Stearinsäure in der Probe wurde berechnet auf (45630/115850 × 0,4 mM) 0,157 mM, was bedeutet, dass 100 % des DSPE-PEG750 zu Lyso-DSPE-PEG750 und Stearinsäure hydrolysiert wurden.
9. Beschreibt das Prinzip des flexiblen Prodrug-Liposom-Zielens, der Freisetzung und Absorption durch extrazellulare Enzyme.

(I) Stratum corneum mit kleinen Poren
(II) Flexibles Prodrug-Liposom
(III) Zielzelle und Zellmembran
(IV) Prodrug (d.h. Monoether-Lipid), Proverstärker (Lipid), Proaktivator (Lipid)
(V) Arzneistoffe (d.h. Ether-Lysolipid und Fettsäurederivate), Verstärker (Lyso-Lipid + Fettsäure) PLA₂ Aktivatoren (Lysolipid + Fettsäure).

10. Schematische Veranschaulichung eines liposomalen Arzneistoff-Zielprinzips, welches den Transport der flexiblen liposomalen Arzneistoffträger in das erkrankte Gewebe und die nachfolgende Freisetzung des Arzneistoffes und den Transport über die Zielmembran hinweg über extrazellulare PLA₂-Tätigkeit involviert.

(I) Flexibles Prodrug-Trägerliposom
(II) Nichtabbaubare Ziel-Liposommembran
(III) Nichthydrolisierbare Ether-Lipide
(IV) Proverstärker (Lipid), Prodrug (d.h. Monoether-Lipid), Proaktivator (Lipid)
(V) Verstärker (Lysolipid + Fettsäure), Arzneistoffe (d.h. Ether-Lysolipid und Fettsäurederivate), PLA₂ Aktivatoren (Lysolipid + Fettsäure).

11(a) PLA₂-gesteuerte Freisetzung des fluoreszierenden Modell-Arzneistoff-Calceins über die Zielmembran hinweg, als eine Funktion der Zeit für unterschiedliche Zusammensetzungen der Trägerliposome. Die Temperatur ist 37°C. Im Vergleich zu bloßen DPPC-Trägern ist die Freisetzungsrate des Modell-Arzneistoffes dramatisch erhöht für die negativ geladenen Träger, DPPC + 2,5 Mol% 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglycol)-2000] (DPPE-PEG2000). Eine weitere Erhöhung der Rate der Freisetzung wird erzielt, wenn der Träger ebenfalls ein kurzkettiges Phospholipid, Didecanoylphosphatidylcholin (DCPC) enthält, das als lokaler Aktivator für das Enzym fungiert. Der Prozentsatz von freigesetztem Calcein wird bestimmt als % Freisetzung = 100 (I_F(t)_I_B)/(I_T_I_B) wobei I_F(t) die gemessene Fluoreszenz zum Zeitpunkt t nach dem Hinzufügen des Enzyms ist, I_B die Hintergrundfluoreszenz ist, und I_T die Gesamtfluoreszenz ist, gemessen nach dem Hinzufügen von Triton X-100, was zur vollständigen Freisetzung von Calcein durch das Aufbrechen der Zielliposome führt (b) PLA₂-gesteuerte Freisetzung des fluoreszierenden Modell-Arzneistoff-Calceins über die Zielmembran hinweg, als eine Funktion der Zeit für unterschiedliche Temperaturen. Wenn die Temperatur erhöht wird, wird die Rate der Freisetzung erhöht auf Grund einer verstärkten Tätigkeit des Enzyms, ausgelöst durch strukturelle Veränderungen im Lipid-Doppelschichtsubstrat des Trägerliposoms. Beim vorliegenden Versuch wird eine maximale Freisetzung von zirka 70 % in allen Fällen erzielt. Der Einsatz zeigt die Zeit von 50 % Calceinfreisetzung t_50%, als eine Funktion der Temperatur. Die Konzentration der Ziel- und Trägerliposome ist 25 μM, und PLA₂ wird in einer 25 nM Konzentration in einen HEPES-Puffer mit pH = 7,5 beigefügt.
12. Gesamtfreisetzung nach 20 Min. des fluoreszierenden Modell-Arzneistoff-Calceins über die Zielmembran hinweg, als eine Funktion des separaten Hinzufügens von steigenden Mengen von Lyso-palmitoylphospholipid und Palmitinsäure, und in einem 1:1 Gemisch. Die Konzentration der Zielmembranen ist 25 μM in einem HEPES-Puffer mit pH = 7,5 bei einer Temperatur von 39°C.
13. PLA₂-gesteuerte Freisetzung des fluoreszierenden Modell-Arzneistoff-Calceins aus Liposomen aus 25 μM 90 Mol% 1-O-DPPC und 10 Mol% des negativ geladenen 1-O-DPPE-PEG350 Lipids, suspendiert in einem 10 mM HEPES-Puffer (pH = 7,5), als eine Funktion der Zeit. 50 nM (gerade Linie), 1 nM (fette Linie) und 0,02 nM (gepunktete Linie) Phospholipase A₂ (A. piscivorus piscivorus) wurde bei Zeit 300 Sek. hinzugefügt, die Temperatur betrug 35,5°C. Der Prozentsatz von freigesetztem Calcein wird bestimmt, wie in 4 beschrieben wird.
14. Emissionsspektrum von 1 Mol% bis-py-DPC, inkorporiert in negativ geladene Liposome (0,100 mM) vor dem (fette Linie) und nach dem (gestrichelte Linie) Hinzufügen von 100 nM PLA₂ (Agkistrodon piscivorus piscivorus) zur Liposomsuspension, ausgeglichen bei 41°C.
15. Charakteristisches Reaktionszeitprofil bei 41°C für rattenphospholipasekatalysierte Hydrolyse negativ geladener Liposome. Die katalytische Reaktion wurde eingeleitet durch das Hinzufügen von zellfreier Peritonealflüssigkeit zu 2,5 ml der temperaturgeregelten Liposomsuspension, ausgeglichen für 60 Sek. vor der Hinzufügung der Peritonealflüssigkeit. Die Hydrolysereaktion wird überwacht durch Monomerfluoreszenz (fette Linie) und Eximerfluoreszenz (gestrichelte Linie) vom bis-py-DPC. Nach der Hinzufügung unverdünnter Peritonealflüssigkeit, bei 60 Sek., zur ausgeglichenen Liposomsuspension wird eine plötzliche Erhöhung der Monomerfluoreszenz und eine gleichzeitige Verringerung der Eximerfluoreszenz beobachtet, wenn das bis-py-DPC-Substrat hydrolysiert wird. Der Einsatz zeigt das Reaktionszeitprofil der ersten 120 Sek.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Hauptfunktion der Haut ist, das Einzelwesen vor der Umwelt zu schützen. Die Säugetierhaut ist ein komplexes Organ, das aus drei gut definierten Schichten besteht, die äußerste Epidermisschicht, gefolgt von der Dermis und der Subkutis. Wenn er hierin verwendet wird, wird der Begriff „Haut" als Synonym des Begriffes „kutanes und subkutanes Gewebe" betrachtet. Die hauptsächliche physikalisch-chemische Barriere der Haut befindet sich in der äußersten verhornten Schicht der Haut, dem Stratum corneum. Das Stratum corneum ist die spezialisierteste Struktur der Haut und ist das Endprodukt des Differenzierungsprozesses der Epidermis. Die Mehrheit der Zellen der Epidermis besteht aus Keratinozyten in verschiedenen Stadien der Differenzierung. Die untersten Keratinozyten, die Basalzellen, befinden sich auf einer Basalmembran im Kontakt mit der Dermis, das heißt dem Bindegewebe der Haut, und sie sind die einzigen Keratinozyten, die ein Teilungsvermögen aufweisen. Ein Bruchteil der Basalzellen verläßt kontinuierlich die Basalmembran und durchläuft einen Differenzierungsprozess, wodurch die Zellen schließlich zu Bausteinen des Stratum corneum werden. In diesem Prozess durchlaufen die Keratinozyten eine Reihe von adaptiven Veränderungen. Es gibt einen erhöhten Gehalt an Zellskelett, das aus epidermisspezifischen Zytokeratinen besteht. Die Zwischenfäden von benachbarten Zellen werden durch eine erhöhte Anzahl von Desmosomen zu einer funktionellen Einheit verbunden. Die dramatischsten Veränderungen finden während des Übergangs von der obersten lebenden Zellschicht, dem Stratum granulosum, zum nicht lebensfähigen Stratum corneum in einem Prozess statt, der gewöhnlich Verhornung genannt wird. Das Ergebnis der Differenzierung sind die nicht lebensfähigen Zellen des Stratum corneum, die Corneozyten. Die einzelnen Corneozyten-Zellen werden zusammengehalten durch mechanisch widerstandsfähige Strukturen, die Desmosomen, und sie bilden die mikroporöse physikalisch-chemische Barriere der Haut. Die Poren im Stratum corneum und den darunterliegenden Strukturen sind normalerweise so schmal, dass die Haut nur den Durchgang von Gebilden erlaubt, die kleiner als 400 Da sind, jedoch sind Lipidvesikel, die in der Lage sind, Poren zu passieren, die kleiner als 30 nm sind, in der Lage, die Haut zu penetrieren (Cevc et al. (Biochem Biophys Acta (1998) 1368, Seiten 201-215, US Patent 6,180,353).
Für die Bereitstellung des Wirkstoffs an die entsprechenden Zielzellen ist Durchlässigkeit nur ein Teil der Herausforderung. Genau so wichtig wie die Einbringung des Wirkstoffes in den Körper ist es, zu gewährleisten, dass vorrangig die entsprechenden Zellen der pharmazeutischen Wirkungskomponente ausgesetzt werden. Die vorliegende Erfindung offenbart ein neuartiges Arzneistoffabgabesystem, welches gewährleistet, dass die pharmazeutische Wirkungskomponente/Wirkungskomponenten speziell an die Zielzellen in der Haut abgegeben werden können.
Im Besonderen wendet sich die vorliegende Erfindung sowohl der wichtigen Frage der Gewährleistung zu, dass vorrangig die entsprechenden Zellen der pharmazeuti schen Wirkungskomponente ausgesetzt werden als auch der Tatsache, dass nur sehr flexible Liposome, welche „randaktive Stoffe" enthalten (siehe unten), in der Lage sind, das Stratum corneum zu passieren und tief in die Haut oder in die Schleimhäute von Menschen oder Tieren einzudringen (nachstehend „Haut" genannt). Es ist wichtig festzustellen, dass die vorliegende Erfindung nicht für das Einbringen einer Verbindung in den Blutstrom über die Haut bestimmt ist.
Es ist festgestellt worden, dass die Tätigkeit von extrazellularer Phospholipase A₂ (PLA₂) bei einer Reihe von entzündlichen Krankheiten der Haut erhöht wird, vor allem Psoriasis und Ekzeme (Forster et al. (1985) Br J Dermatol 112:135-47; Forster et al. (1983) Br J Dermatol 108:103-5). Es ist weiterhin festgestellt worden, dass extrazellulares PLA₂ in der Lage ist, Monoether/Monoester-Lipidderivate so abzutrennen, um Monoether-Lysolipidderivate zu erzeugen, die als solche, oder in Kombination mit anderen Wirkverbindungen, einen therapeutischen Effekt zeigen werden. Somit basiert die vorliegende Erfindung auf dem Gedanken, dass die pharmazeutische Wirkungskomponente/Wirkungskomponenten speziell an den Zielzellen in der Haut abgegeben werden können, wobei eine erhöhte Tätigkeit von PLA₂ in dem Teil des Gewebes ausgenutzt wird, in welchem sich die Zielzellen befinden. Bei einer besonderen Ausführungsform der Erfindung kann eine spezielle Lipidanalogon-Verbindung in das Trägerliposom inkorporiert werden und als Prodrug fungieren, die durch Hydrolyse über das PLA₂ zu einem wirksamen Arzneistoff wird. Ein mögliches Beispiel könnten therapeutisch wirksame Verbindungen sein (zum Beispiel regulative Fettsäurederivate und andere lipophile Gruppen, zum Beispiel Vitaminderivate, Steroidderivate etc, wie zum Beispiel Cholecalciferol- und Tocopherol-Analoga), das heißt Ester, gebunden an das Phospholipid in der sn-2 Position und daher das Lipidderivat zu einem Substrat für PLA₂ macht.
Die Möglichkeit der Einfügung des pharmazeutischen Wirkstoffs in die Liposome als „zweiter Arzneistoff" – siehe unten – erscheint besonders interessant in Bezug auf dermale Anwendungen.
Somit bietet die hierin offengelegte Erfindung eine Lösung sowohl für die Frage der Penetration der intakten Haut und Schleimhäute als auch für die Frage des speziel len Abzielens auf Zellen, Gewebe oder Teile von Geweben, die durch ein erhöhtes Niveau von PLA₂ gekennzeichnet sind.
Lipidderivate
Das Arzneistoffabgabesystem (Liposome) für die Nutzung bei der vorliegenden Erfindung basiert auf einem Lipidderivat mit (a) einer aliphatischen Gruppe mit einer Länge von zumindest 7 Kohlenstoffatomen und einem organischen Radikal mit zumindest 7 Kohlenstoffatomen und (b) einem hydrophilen Anteil, wobei die Prodrug des Weiteren ein Substrat für extrazellulare PLA₂ dergestalt ist, dass das organische Radikal hydrolytisch abgetrennt werden kann, während die aliphatische Gruppe im Wesentlichen unbeeinträchtigt bleibt, wodurch der Arzneiwirkstoff in Form eines Lysolipid-Derivats freigesetzt wird, das kein Substrat für Lysophospholipase ist.
Obwohl die Begriffe „Lipid" und „Lysolipid" (im Kontext von Phospholipiden) bekannte Begriffe für den Fachmann sein werden, sollte betont werden, dass in der vorliegenden Beschreibung und in den Ansprüchen der Begriff „Lipid" Triester von Glycerin mit folgender Formel bedeuten soll:
wobei R^A und R^B Fettsäureanteile sind (C_9-30-alkyl/alkylen/alkyldien/alkyltrien/alkyltetraen-C(=O)-) und R^C eine Phosphatidsäure (PO₂-OH) ist oder ein Derivat der Phosphatidsäure. Somit sind die Gruppen R^A und R^B an das Glycerinrückgrat über Esterbindungen gebunden.
Der Begriff „Lysolipid" soll ein Lipid bedeuten, bei dem die R^B Fettsäuregruppe fehlt (zum Beispiel hydrolytisch abgetrennt), das heißt ein Glycerinderivat der obigen Formel, wobei R^B Wasserstoff ist, jedoch die anderen Substituenten im Wesentlichen unbeeinträchtigt sind. Die Umwandlung eines Lipids in ein Lysolipid kann mit Hilfe der Wirkung eines Enzyms stattfinden, speziell mit Hilfe der Wirkung von zellularem sowie extrazellularem PLA₂.
Die Begriffe „Lipidderivat" und „Lysolipidderivat" sollen sich auf mögliche Derivate der obigen möglichen Verbindungen innerhalb der Gruppen „Lipid" bzw. „Lysolipid" erstrecken. Beispiele biologisch wirksamer Lipidderivate und Lysolipidderivate sind angegeben bei Houlihan et al., Med. Res. Rev., 15, 3, 157-223. Somit sollte, wie offensichtlich ist, die Erweiterung „Derivat" im weitesten Sinne verstanden werden.
Bei der vorliegenden Anmeldung sollten Lipidderivate und Lysolipide jedoch bestimmte funktionelle Kriterien (siehe oben) erfüllen und/oder strukturellen Anforderungen genügen. Es ist besonders relevant festzustellen, dass die geeigneten Lipidderivate diejenigen sind, die (a) eine aliphatische Gruppe mit einer Länge von zumindest 7, vorzugsweise zumindest 9 Kohlenstoffatomen und ein organisches Radikal mit zumindest 7 Kohlenstoffatomen und (b) einen hydrophilen Anteil enthalten. Es ist offensichtlich, dass die aliphatische Gruppe und das organische Radikal den zwei Fettsäureanteilen in einem normalen Lipid entsprechen werden, und dass der hydrophile Anteil dem Phosphatteil eines (Phospho)lipids oder einem Bioisoster desselben entsprechen wird.
Somit sollten, da der allgemeine Gedanke, welcher der Erfindung zugrundeliegt, darin besteht, das erhöhte Niveau der extrazellularen PLA₂ Tätigkeit in lokalisiertem kutanen und subkutanen Gewebe auszunutzen, die Lipidderivate, welche im Rahmen der vorliegenden Erfindung genutzt werden können, Substrate für extrazellulares PLA₂ sein, das heißt die Lipidderivate sollten in der Lage sein, einer hydrolytischen, enzymatischen Abtrennung des organischen Radikals ausgesetzt zu werden, welches der Fettsäure in der 2-Position in einem Lipid entspricht. Es ist bekannt, dass extrazellulares PLA₂ zur Enzymklasse (EC) 3.1.1.4 gehört. Somit sollten durch Bezugnahme auf (extrazellulares) PLA₂ alle extrazellularen Enzyme dieser Klasse verstanden werden, zum Beispiel Lipasen, welche hydrolytisches Abtrennen des organischen Radikals herbeiführen können, welches der Fettsäure in der 2-Position in einem Lipid entspricht. Ein besonderer Vorteil des auf Lipiden basierenden Arznei stoffabgabesystems (als Liposome) ist, dass extrazellulare PLA₂ Tätigkeit signifikant zu organisierten Substraten hin im Vergleich zu monomeren Substraten erhöht ist.
Angesichts der Anforderung an die Hydrolysierbarkeit durch extrazellulares PLA₂ ist es offensichtlich, dass das organische Radikal (zum Beispiel die aliphatische Gruppe) vorzugsweise über eine Esterfunktionalität verbunden ist, die durch extrazellulares PLA₂ abgetrennt werden kann, vorzugsweise dergestalt, dass die Gruppe, die abgetrennt wird, eine Karbonsäure ist.
Weiterhin besteht ein wichtiges Merkmal darin, dass die aliphatische Gruppe (die Gruppe, welche der Fettsäure in der 1-Position in einem Lipid entspricht) des Lipidderivats, d.h. das Lysolipidderivat nach der Abtrennung durch extrazellulares PLA₂, im Wesentlichen unbeeinträchtigt von der Wirkung des extrazellularen PLA₂ bleibt. Mit „im Wesentlichen unbeeinträchtigt" ist gemeint, dass die Integrität der aliphatischen Gruppe erhalten bleibt und dass weniger als 1 Mol%, vorzugsweise weniger als 0,1 Mol% der aliphatischen Gruppe (die aliphatische Gruppe in der 1-Position) unter der Wirkung von Lysophospholipase abgetrennt wird.
Ebenfalls sollte das Lysolipidderivat, das sich aus der hydrolytischen Abtrennung des organischen Radikals ergibt, nicht per se ein Substrat für Lysophospholipase sein. Es ist bekannt, dass Lysophospholipase zur Enzymklasse (EC) 3.1.1.5 gehört. Somit sollten durch Bezugnahme auf Lysophospholipase alle Enzyme dieser Klasse verstanden werden, welche die Reaktion Lyso(phospho)lipid + Wasser katalysiert, was Phosphoglycerin + Fettsäure ergibt. Der Begriff „keine Substrat für Lysophospholipase" soll bedeuten, dass Lysophospholipase eine Tätigkeit von weniger als 1 % in Richtung auf das Substrat hin im Vergleich zum entsprechenden Esterlipid aufweist, d.h. praktisch keine Enzymtätigkeit.
Geeignete Beispiele dieser Lysolipidderivate sind diejenigen, die keiner hydrolytischen Abtrennung unter der Wirkung von Lysophospholipasen unterliegen. Somit sind die Lysolipidderivate im Besonderen nicht Lysolipide und Lysolipidderivate, die eine Esterbindung in der 1-Position des Lysolipids oder der Position eines Lysolipidderivats aufweisen, welche der 1-Position eines Lysolipids entspricht.
Eine bevorzugte Klasse von Lipidderivaten für die Inkorporation in die Arzneistoffabgabesysteme kann durch die folgende Formel dargestellt werden:
wobei
X und Z unabhängig aus O, CH₂, NH, NMe, S, S(O) und S(O)₂, vorzugsweise aus O, NH, NMe und CH₂, im Besonderen O, ausgewählt werden;
Y -OC(O)- ist, Y dann mit R² entweder über das Sauerstoff- oder das Carbonylkohlenstoffatom, vorzugsweise über das Carbonylkohlenstoffatom, verbunden ist;
R¹ eine aliphatische Gruppe der Formel Y¹Y² ist;
R² ein organisches Radikal mit zumindest 7 Kohlenstoffatomen ist, wie zum Beispiel eine aliphatische Gruppe mit einer Länge von zumindest 7, vorzugsweise zumindest 9 Kohlenstoffatomen ist, vorzugsweise eine Gruppe der Formel Y¹Y²;
wobei Y¹ -(CH₂)n₁-(CH=CH)n₂-(CH₂)n₃-(CH=CH)n₄-(CH₂)n₅-(CH=CH)n₆-(CH₂)n₇-(CH=CH)n₈-(CH₂)n₉ ist, und die Summe von n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 eine Ganzzahl von 9 bis 29 ist; n1 Null oder eine Ganzzahl von 1 bis 29 ist, n3 Null oder eine Ganzzahl von 1 bis 20 ist, n5 Null oder eine Ganzzahl von 1 bis 17 ist, n7 Null oder eine Ganzzahl von 1 bis 14 ist und n9 Null oder eine Ganzzahl von 1 bis 11 ist und jede von n2, n4, n6 und n8 unabhängig Null oder 1 ist; und Y² CH₃ oder CO₂H ist; wobei jedes Y¹-Y² unabhängig durch Halogen oder C_1-4-Alkyl ersetzt werden kann, jedoch wird Y¹-Y² vorzugsweise nicht ersetzt;
R³ ausgewählt wird aus Phosphatidsäure (PO₂-OH), Derivaten der Phosphatidsäure und Bioisosteren zu Phosphatsäure und Derivaten derselben.
Wie oben erwähnt, implizieren bevorzugte Ausführungsformen, dass Y -OC(O)- ist, wobei Y mit R² über das Carboxylatom verbunden ist. Die bevorzugtesten Ausführungsformen implizieren, dass X und Z O sind und dass Y -OC(O)- ist, wobei Y mit R² über das Carboxylatom verbunden ist. Dies bedeutet, dass das Lipidderivat eine Verbindung des Typs 1-Monoether-2-Monoesterphospholipid ist.
Eine weitere bevorzugte Gruppe von Lipidderivaten ist die eine, bei der die Gruppe X S ist.
Bei einer Ausführungsform sind R¹ und R² aliphatische Gruppen der Formel Y¹-Y², wobei Y² CH₃ oder CO₂H ist, jedoch vorzugsweise CH₃, und wobei Y¹-(CH₂)n₁(CH=CH)n₂(CH₂)n₃(CH=CH)n₄(CH₂)n₅(CH=CH)n₆(CH₂)n₇(CH=CH)n₈(CH₂)n₉ ist, die Summe von n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 eine Ganzzahl von 9 bis 23 ist; das heißt die aliphatische Gruppe, Y¹Y² eine Länge von 10-24 Kohlenstoffatomen hat, n1 gleich Null oder eine Ganzzahl von 1 bis 23 ist; n3 gleich Null oder eine Ganzzahl von 1 bis 20 ist; n5 gleich Null oder eine Ganzzahl von 1 bis 17 ist; n7 gleich Null oder eine Ganzzahl von 1 bis 14 ist; n9 gleich Null oder eine Ganzzahl von 1 bis 11 ist und jede von n2, n4, n6 und n8 unabhängig gleich Null oder 1 ist.
Obwohl die aliphatischen Gruppen ungesättigt und sogar ersetzt durch Halogene (Fluor-, Chlor-, Brom-, Jod-) und C_1-4 Gruppen sein können (das heißt verzweigte aliphatische Gruppen ergebend), sind die aliphatischen Gruppen wie R¹ und R² bei einer Ausführungsform vorzugsweise gesättigt sowie unverzweigt, das heißt sie weisen vorzugsweise keine Doppelbindungen zwischen benachbarten Kohlenstoffatomen auf, wobei jede n2, n4, n6 und n8 dann gleich Null ist. Demgemäß ist Y¹ vorzugsweise (CH₂)_n1. Besser noch (bei dieser Ausführungsform) sind R¹ und R2 jedes unabhängig (CH₂)_n1CH₃ und am besten (CH₂)₁₇CH₃ oder (CH₂)₁₅CH₃. Bei alternativen Ausführungsformen können die Gruppen eine oder mehr Doppelbindungen haben, das heißt, sie können ungesättigt sein, und ein oder mehr n2, n4, n6 und n8 können gleich 1 sein. Zum Beispiel ist, wenn der ungesättigte Kohlenwasserstoff eine Doppelbindung aufweist, n2 gleich 1, n4, n6 und n8 sind jeweils gleich Null, und Y¹ ist (CH₂)_n1, CH=CH(CH₂)_n3. n1 ist gleich Null oder eine Ganzzahl von 1 bis 21, und n3 ist ebenfalls gleich Null oder eine Ganzzahl von 1 bis 20, wobei zumindest eines von n1 oder n3 nicht gleich Null ist.
Bei einer besonderen Ausführungsform sind die Lipidderivate diejenigen, welche Monoetherlipide sind, wobei X und Z O sind, R¹ und R² unabhängig aus Alkylgruppen, (CH₂)_nCH₃, ausgewählt werden, wobei n 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, oder 29 ist, vorzugsweise 14, 15 oder 16, im Besonderen 14; Y -OC(O)- ist und Y dann mit R² über das Carbonylkohlenstoffatom verbunden ist.
Hinsichtlich des hydrophilen Anteils (oft bekannt als die „Kopfgruppe"), welcher R³ entspricht, wird angenommen, dass eine breite Vielfalt von Gruppen, welche Phosphatidsäure (PO₂-OH), Derivaten von Phosphatidsäure und Bioisosteren zu Phosphatsäure und Derivaten derselben entsprechen, genutzt werden können. Wie ersichtlich sein wird, ist das Haupterfordernis an R³, dass die Gruppen das enzymatische Abtrennen der R² Gruppe (tatsächlich R²-C(=O) oder R²-OH) durch extrazellulares PLA₂ gestatten sollten. „Bioisostere zu Phosphatidsäure und Derivate derselben" impliziert in der Tat, dass diese Gruppen – wie Phosphatidsäure – das enzymatische Abtrennen durch extrazellulares PLA₂ gestatten sollten.
R³ wird typischerweise ausgewählt aus Phosphatidsäure (PO₂-OH), Phosphatidylcholin (PO₂-O-CH₂CH₂N(CH₃)₃), Phosphatidylethanolamin (PO₂-O-CH₂CH₂NH₂), N-Methylphosphatidyl-ethanolamin (PO₂-O-CH₂CH₂N₂), Phosphatidylserin, Phosphatdidylinositol und Phosphatidylglycerin (PO₂-O-CH₂CHOH CH₂OH). Andere mögliche Derivate der Phosphatidsäure sind diejenigen, bei denen Dicarbolsäuren, wie zum Beispiel Glutarsäuren, Sebacinsäuren, Succinsäuren und Weinsäuren an den terminalen Stickstoff von Phosphatidylethanolaminen, Phosphatidylserin, Phosphatidylinositol usw. gekoppelt sind.
Ein hoch interessanter Aspekt ist die Möglichkeit des Modifizierens der pharmazeutischen Wirkung des Lipidderivats durch das Modifizieren der Gruppe R². Selbstverständlich sollte R² ein organisches Radikal sein, das zumindest 7 Kohlenstoffatome aufweist (wie zum Beispiel eine aliphatische Gruppe, die eine bestimmte Länge aufweist (zumindest 7, vorzugsweise 9 Kohlenstoffatome)), ein hoher Grad der Variabili tät ist möglich, zum Beispiel ist es nicht unbedingt erforderlich, dass R² ein Langkettenrest ist, sondern es kann komplexere Strukturen repräsentieren.
Es wird im Allgemeinen angenommen, dass R² entweder ziemlich inert gegenüber der Umgebung ist, in welcher es durch extrazellulares PLA₂ freigesetzt werden kann, oder dass R² eine aktive pharmazeutische Rolle spielen kann, zum Beispiel typischerweise als ein Arzneihilfsstoff für die Behandlung von Hautleiden oder als ein Wirksamkeitsveränderer für das Lysolipidderivat und/oder alle anderen (zweiten) Arzneiwirkstoffe, die in der Umgebung vorhanden sind.
Bei einigen Ausführungsformen wird die Gruppe R² ein Langkettenrest sein, zum Beispiel ein Fettsäurerest (die Fettsäure wird ein Carbonyl aus der Gruppe Y einschließen). Dies ist oben im Detail beschrieben worden. Interessante Beispiele von Arzneihilfsstoffen wie R² innerhalb dieser Untergruppen sind mehrfach ungesättigte Säuren, zum Beispiel Oleatsäure, Linolsäure, Linolensäure sowie Derivate von Arachidonoylsäure (einschließlich des Carbonyls von Y), zum Beispiel Prostaglandine, wie zum Beispiel Prostaglandin E₁, da Arachidonsäurederivate bekannte Regulatoren von Hormonwirkung sind, einschließlich der Wirkung von Prostaglandinen, Thromboxanen und Leukotrinen. Beispiele von Wirksamkeitsveränderern wie R² sind diejenigen, welche die Durchlässigkeit der Zielzellenmembran erhöhen sowie die Tätigkeit von extrazellularem PLA₂ oder des Arzneiwirkstoffes oder von zweiten Arzneistoffen erhöhen. Beispiele hiervon sind kurzkettige (C_8-12) Fettsäuren.
Es wird jedoch ebenfalls ins Auge gefasst, dass andere Gruppen von Nutzen als das organische Radikal R² sein könnten, zum Beispiel Vitamin D Derivate, Steroidderivate, Retinoesäure (einschließlich All-Trans-Retinoesäure, All-Cis-Retinoesäure, 9-Cis-Retinoesäure, 13-Cis-Retinoe-säure), Cholecalciferol und Tocopholanaloga, pharmazeutisch wirksame Karbonsäuren, wie zum Beispiel verzweigt-kettige aliphatische Karbonsäuren (zum Beispiel Valproinsäure und diejenigen, die in der WO 99/02485 beschrieben sind), Salicylsäuren (zum Beispiel Acetylsalicylsäure), Steroidcarbonsäuren (zum Beispiel Lysergsäuren und Isolysergsäuren), monoheterozyklische Carbonsäuren (zum Beispiel Nikotinsäure) und polyheterozyklische Carbonsäuren (zum Beispiel Penicilline und Cephalosporine), Diciofenac, Indomethacin, Ibuprofen, Naproxen, 6-Methoxy-2-Naphthylacetsäure sowie Fettsäurederivate, wie zum Beispiel N-(ω-3)-Fettsäurederivate.
Es versteht sich, dass auf die verschiedenen Beispiele möglicher R² Gruppen mit dem Namen einer gesonderten Spezies Bezug genommen wird anstatt mit dem Namen des Radikals. Des Weiteren versteht sich, dass die möglichen Beispiele die Karbonylgruppe oder Karbongruppe der Bindung einschließen können, über die das organische Radikal mit dem Lipidskelett (welches „Y" in der obigen Formel entspricht) verbunden ist. Dies wird für den Fachmann selbstverständlich sein.
Obwohl dies nicht ausdrücklich in der allgemeinen Formel für die geeigneten Beispiele von Lipidderivaten, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung genutzt werden sollen, angegeben worden ist, versteht es sich, dass der Glykolanteil der Lipidderivate ersetzt werden kann, zum Beispiel um die Abtrennrate durch extrazellulares PLA₂ zu verändern, oder einfach um die Eigenschaften der Liposome zu verändern, welche die Lipidderivate umfassen.
Lipidderivate als Prodrugs
Wie oben beschrieben ist, sorgt die vorliegende Erfindung für die Nutzung eines auf Lipiden basierenden Arzneistoffabgabesystems für die Zubereitung eines Medikaments für die Behandlung oder Verhinderung der Behandlung von Krankheiten oder Leiden, die mit einer lokalisierten Erhöhung der extrazellularen PLA₂-Tägigkeit in der Haut eines Säugetieres in der Form eines Liposoms für die Verabreichung eines Arzneiwirkstoffs, ausgewählt aus Lysolipidderivaten, verbunden sind, wobei das System eine randaktive Verbindung umfasst und der Arzneiwirkstoff im auf Lipiden basierenden System in Form einer Prodrug vorliegt, die Prodrug ein Lipidderivat ist mit (a) einer aliphatischen Gruppe mit einer Länge von zumindest 7 Kohlenstoffatomen und einem organischen Radikal mit zumindest 7 Kohlenstoffatomen und (b) einem hydrophilen Anteil, wobei die Prodrug des Weiteren ein Substrat für extrazellulare PLA₂ dergestalt ist, dass das organische Radikal hydrolytisch abgetrennt werden kann, während die aliphatische Gruppe im Wesentlichen unbeeinträchtigt bleibt, wodurch der Arzneiwirkstoff in Form eines Lysolipidderivats freigesetzt wird, das kein Substrat für Lysophospholipase ist.
Der Begriff „Arzneiwirkstoff" bedeutet jede chemische Einheit, die für einen prophylaktischen oder therapeutischen Effekt im Körper eines Säugetieres, im Besonderen eines Menschen sorgt, speziell im Hinblick auf Hautkrankheiten. Stoffe, die Anwendung für kosmetische Zwecke finden können, werden hier ebenfalls als „Arzneiwirkstoff betrachtet.
Der Begriff „Prodrug" ist im normalen Sinne zu verstehen, nämlich als ein Arzneistoff, der maskiert oder geschützt wird, um zum beabsichtigten Arzneistoff umgewandelt zu werden (typischerweise durch Abtrennen, jedoch ebenfalls durch in vivo chemische Umwandlung). Der Fachmann wird den Umfang des Begriffes „Prodrug" erkennen. Stoffe, die Anwendung für kosmetische Zwecke finden können, werden hier ebenfalls als „Prodrug" betrachtet.
Der Arzneiwirkstoff wird aus Lysolipidderivaten ausgewählt, und wie es aus der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen hervorgeht, werden die Lysolipidderivate, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung relevant sind, eine therapeutische Wirkung – zumindest – im Zusammenhang mit den hierin angegebenen Krankheiten und Leiden haben, das heißt bestimmte Erkrankungen und Leiden, bei denen ein lokaler Bereich des Körpers des Säugetieres ein Niveau der extrazellularen PLA₂ Tätigkeit aufweist, welche das Lysolipidderivat freisetzen kann.
Wie sich aus der vorstehenden Beschreibung und den Ansprüchen ergibt, wird das Lipidderivat oft die Prodrug darstellen, auf die oben Bezug genommen wird, und das Lysolipidderivat wird dadurch den Arzneiwirkstoff darstellen, oft ein Monoetherlysolipidderivat. Es ist jedoch davon auszugehen, dass dies nicht die Möglichkeit ausschließt, andere Arzneistoffe, auf die als zweite Arzneistoffe Bezug genommen wird, in das Arzneistoffabgabesystem einzufügen, noch schließt es aus, dass das organische Radikal, welches hydrolytisch durch die Wirkung von extrazellularem PLA₂ abgetrennt werden kann, eine bestimmte pharmazeutische Wirkung haben kann (zum Beispiel als ein Arzneihilfsstoff oder als ein Wirksamkeitsveränderer, wie an anderer Stelle hierin beschrieben wird). Des Weiteren ist es nicht erforderlich, dass die pharmazeutische Wirkung des „Arzneiwirkstoffes", das heißt des Lysolipidderivats, die vorherrschendste Wirkung ist, wenn ein zweiter Arzneistoff eingeschlossen ist, und tatsächlich könnte die Wirkung des zweiten Arzneistoffes sehr wohl die vorherrschendste sein, wie dies bei der anderen Hauptausführungsform offensichtlich werden wird (siehe unten „Lipidderivatliposome als Arzneistoffabgabesysteme").
Es wird angenommen, dass der Arzneiwirkstoff (Lysolipidderivat), der aus der Prodrug (Lipidderivat) freigesetzt wird, wie im nachfolgenden Beispiel veranschaulicht wird, stattfindet:
Des Weiteren kann der Substituent R² einen Arzneiwirkstoff oder einen Wirksamkeitsveränderer für den Arzneiwirkstoff darstellen, und er wird gleichzeitig unter der Wirkung des extrazellularen PLA₂ freigesetzt:
Es ist oben unter der Definition von R² beschrieben worden, wie die Gruppe R² verschiedene unabhängige oder synergistische Wirkungen in Verbindung mit dem Arzneiwirkstoff haben kann, zum Beispiel als ein Arzneihilfsstoff oder als ein Wirksamkeitsveränderer, zum Beispiel Durchlässigkeits- oder Zelllysisveränderer. Es sollte beachtet werden, dass die Gruppen, welche R² (zum Beispiel R₂-OH oder R²-COOH) entsprechen, eine pharmazeutische Wirkung haben könnten, welche vorherrschend im Verhältnis zur Wirkung des Lysolipidderivats (Arzneiwirkstoff) ist.
Wie für die Fachleute offensichtlich ist, sind die Kriterien für die Wirkung weniger streng für Bestandteile kosmetischer Zubereitungen.
Lipidderivate, zubereitet als Liposome
Der Begriff „auf Lipiden basierendes Arzneimittelabgabesystem in Form eines Liposoms" sollte makromolekulare Strukturen einschließen, welche als Hauptbestandteil Lipid oder Lipidderivate einschließen, und die gleichzeitig zu einer Deformation in der Lage sind, die ausreicht, um es der Struktur zu ermöglichen, durch das Stratum corneum und tief in die Haut eines Säugetieres hinein zu gehen. Ein bevorzugtes Beispiel hierfür sind flexible Liposome (zum Beispiel Transfersome^®), wie vom Unternehmen IDEA AG, Deutschland, im US 6,165,500 beschrieben ist.
Bei einer wichtigen Variante, die vorteilhaft mit den hierin beschriebenen Ausführungsformen kombiniert werden kann, ist das Lipidderivat (zum Beispiel die Prodrug) in Liposome in Kombination mit anderen Bestandteilen (grenzflächenaktive Stoffe, andere Lipide, Mittel, usw.) dergestalt eingefügt, dass das Liposom ausreichend flexibel wird. Somit haben die hierin beschriebenen auf Lipiden basierenden Systeme vorzugsweise die Form von Liposomen, wobei die Liposome aus Schichten aufgebaut sind, welche das Lipidderivat umfassen (zum Beispiel eine Prodrug).
Andere wichtige Bestandteile von Liposomen, nämlich die Bestandteile, welche für die flexiblen Eigenschaften der Liposome sorgen, können im Allgemeinen als pharmazeutisch annehmbare „randaktive Stoffe" charakterisiert werden, das heißt solche Bestandteile, welche die Lipidmembran „glätten" oder „weich machen".
Ein „randaktiver Stoff" gemäß dieser Anmeldung ist jeder Stoff, der in der Lage ist, die Fähigkeit des Trägersystems, Ränder, Vorsprünge oder relativ stark gekrümmte Oberflächen auszubilden, herbeiführen oder erhöhen; diese Eigenschaft manifestiert sich ebenfalls in der Fähigkeit, Poren in Lipidstrukturen, wie zum Beispiel Membranen, herbeizuführen oder sogar eine Solubilisation (Lysis) in den Bereichen höherer Konzentrationen zu veranlassen. Genauer gesagt werden alle diejenigen Stoffe als randaktiv betrachtet, welche eine Tendenz aufweisen, sich an oder nahe den Rändern zwischen den polaren und apolaren Teilen von Molekülen und/oder nahe den oder an den Rändern zwischen den polaren und apolaren Teilen der supramolekularen Anhäufungen anzusammeln, wodurch sie die freie Energie für die Ausbildung von Rändern und/oder stark gekrümmten Oberflächen herabsetzen. Alle grenzflächenaktiven Stoffe und viele Lösungsmittel sowie asymmetrische und somit amphiphatische Moleküle oder Polymere, wie zum Beispiel viele Oligo- und Polykohlenhydrate, Oligo- und Polypeptide, Oligo- und Polynucleotide oder ihre Derivate gehören ebenfalls zu dieser Kategorie. Der grenzflächenaktive Stoff oder das einem grenzflächenaktiven Stoff ähnliche Material ist vorzugsweise ein nichtionogener, ein zwitterionischer, ein anionischer oder ein kationischer grenzflächenaktiver Stoff, besonders ein Fettsäure-Oralkohol, ein Alkyltri/di/methylammoniumsalz, ein Alkylsulfatsalz, ein monovalentes Salz von Cholat, Deoxycholat, Glycocholat, Glycodeoxycholat, Taurodeoxycholat, Taurocholat usw., ein Acyl- oder Alkanoyldimethylaminoxid, besonders ein Dodecyldimethylaminoxid, ein Alkyl- oder Alkanoyl-Nmethyl-glucamid, N-Alkyl-N, N-Dimethylglycin, 3(Acyldimethyl-ammonio)-alkansulphonat, N-Acylsulphobetain, ein Polyethylenglycoloctylphenylether, speziell ein Nonaethylenglycoloctylphenylether, ein Polyethylenacylether, speziell ein Nonaethylendodecylether, ein Polyethylenglycolisoacylether, besonders ein Octaethylenglycolisotridecylether, Polyethylenacylether, besonders Octaethylendodecylether, Polyethylenglycolsorbitanacylester, wie zum Beispiel Polyethylenglykol-20monolaurat (Tween 20) oder Polyethylenglykol-20-sorbitanmonooleat (Tween 80), ein Polyhydroxyethylenacylether, speziell Polyhydroxyethylenlauryl, -myristoyl, -cetylstearyl, oder -oleoylether, wie in Polyhydroxyethlen 4 oder 6 oder 8 oder 10 oder 12, etc., -laurylether (wie in der Brij Serie), oder im entsprechenden Ester, zum Beispiel vom Polyhydroxyethylen-8-stearat (Myrj 45), laurat oder -oleattyp, oder im polyethoxylierten Rizinusöl 40, ein Sorbitanmonoalkylat (zum Beispiel in Arlacel oder Span), besonders Sorbitan-monolaurat, ein Acyloralkanoyl-N-methylglucamid, besonders in Or-Decanoyl-ordodecanoyl-Nmethylglucamid, ein Alkylsulphat (Salz), zum Beispiel in Lauryl-oleoylsulphat, Natriumdoxycholat, Natriumglycodeoxycholat, Natriumoleat, Natriumtaurat, ein Fettsäuresalz, wie zum Beispiel Natriumelaidat, Natriumlinoleat, Natriumlaurat, ein Lysophospholipid, wie zum Beispiel n-octadecylen(=oleoyl)glycerophosphatidsäure, -Phosphorylglycerol, or phosphorylserin, Nacyl-, zum Beispiel Lauryl oder Oleoylglycerophosphatidsäure, -Phos-phorylglycorol, or-Phosphorylserin, n-tetradecyl-glycerophosphatidsäure, Phosphorylglycerol, or-Phosphorylserin, ein entsprechendes Palmitoeloyl-, Elaidoyl-, Vaccenyl-lysophospholipid oder ein entsprechendes kurzkettiges Phospholipid oder ansonsten ein grenzflächenaktives Polypeptid. Zahlreiche andere Beispiele randaktiver Stoffe, von denen viele als pharmazeutisch annehmbar betrachtet werden können, sind im US 6,165,500 angegeben, welches hiermit durch Bezugnahme inkorporiert wird.
Wie von den Fachleuten erkannt werden wird, bestimmt die Art der Krankheit oder des Leidens, die zu behandeln sind, sowie die Art der Haut die speziellen Anforderungen hinsichtlich des relativen Verhältnisses der Bestandteile. Das Verhältnis zwischen dem Lipid und der randaktiven Substanzen/den randaktiven Substanzen ist im Allgemeinen zirka 50:1 bis zirka 1:500, wie zum Beispiel von zirka 5:1 bis zirka 1:500, von 20:1 bis 1:500, von 10:1 bis 1:500, von 10:1 bis 1:200, von 10:1 bis 1:100, von 5:1 bis 1:200, von 5:1 bis 1:100, von 5:1 bis 1:50, von 5:1 bis 1:20 oder von 5:1 bis 1:10, vorzugsweise von 5:1 bis 1:5.
„Liposome" sind bekannt als selbstassemblierende Strukturen, welche eine oder mehr Lipid-Doppelschichten umfassen, wobei jede einen wässrigen Zwischenraum umgibt und zwei einander gegenüberliegende Einschichten amphiphatischer Lipidmoleküle umfasst. Amphiphatische Lipide (hierin inter alia Lipidderivate) umfassen einen polaren (hydrophilen) Kopfgruppen-Bereich (dem Substituenten R³ in den Lipidderivaten entsprechend), der kovalent mit einer oder zwei nicht-polaren (hydrophoben) aliphatischen Gruppen (R₁ und R² in den Lipidderivaten entsprechend) verbunden sind. Es wird im Allgemeinen angenommen, dass energetisch ungünstige Kontakte zwischen den hydrophoben Gruppen und dem wässrigen Medium Lipidmolekule dazu veranlassen, sich neu so anzuordnen, dass die polaren Kopfgruppen sich hin zum wässrigen Medium ausrichten, während sich die hydrophoben Gruppen neu hin zum Inneren der Doppelschicht ausrichten. Es wird eine energetisch stabile Struktur ausgebildet, in welcher die hydrophoben Gruppen wirksam davor abgeschirmt werden, in Kontakt mit dem wässrigen Medium zu kommen.
Liposome können eine einzige Lipid-Doppelschicht (unilamellare Liposome – „ULV") oder mehrfache Lipid-Doppelschichten (multilamellare Liposome – „MLV") aufweisen, und sie können mit einer Vielfalt von Verfahren hergestellt werden (für eine Übersicht wird zum Beispiel verwiesen auf Deamer and Uster, Liposomes, Marcel Dekker, N.Y., 1983, 27-52). Diese Verfahren schließen die Bangham Verfahren für die Herstellung multilamellar Liposome (MLV) ein; sowie die Verfahren von Lenk, Fountain und Cullis für die Herstellung von MLV mit einer im Wesentlichen gleichen interlamellaren Verteilung des Lösungsprodukts (siehe zum Beispiel US 4,522,803 ; US 4,588,578 ; US 5,030,453 ; US 5,169,637 und US 4,975,282 ); und das Umkehrphasen-Evaporationsverfahren von Papahadjopoulus et al. ( US 4,235,871 ) für die Herstellung von oligolamellaren Liposomen. ULV können aus MLV hergestellt werden mit solchen Verfahren, wie Beschallung (siehe Papahadjopoulus et al., Biochem. Biophys. Acta, 135, 624 (1968)) oder Extrusion ( US 5,008,050 und US 5,059,421 ). Das Liposom kann durch die Verfahren einer dieser Offenlegungen hergestellt werden sowie durch das Verfahren, welches im US 6,165,500 genutzt wird, wobei der Inhalt von all diesen hierin durch Bezugnahme inkorporiert wird.
Verschiedene Verfahren, wie zum Beispiel Beschallung, Homogenisation, French Press Anwendung und Mahlen können genutzt werden, um Liposome einer kleineren Größe aus größeren Liposomen herzustellen. Extrusion (siehe US 5,008,050 ) kann genutzt werden, um die Größe von Liposomen zu verringern, das heißt, um Liposome mit einer vorgegebenen mittleren Größe zu erzielen, indem die Liposome unter Druck durch Filterporen einer vorgegebenen, gewählten Größe hindurch gepresst werden. Tangentiale Flussfiltration (siehe WO 89/08846) kann ebenfalls genutzt werden, um die Größe von Liposomen zu regulieren, das heißt, um Liposome herzustellen, die eine Population von Liposomen mit einer geringeren Größenheterogenität und einer homogeneren, festgelegten Größenverteilung aufweisen. Der Inhalt dieser Dokumente wird hierin durch Bezugnahme inkorporiert. Die Liposomgrößen können ebenfalls durch eine Anzahl von Techniken bestimmt werden, wie zum Beispiel quasi-elektrische Lichtstreuung, und mit Geräten, zum Beispiel Nicomp^®-Teilchen-Größenbestimmer, über die Fachleute sehr wohl verfügen.
Es ist ganz interessant festzustellen, dass die Lipidderivate zusammen mit der randaktiven Substanz/Sustanzen den Hauptteil des auf Lipiden basierenden Systems (Liposomsystem) darstellen. Diese Tatsache beruht auf der strukturellen (jedoch nicht funktionellen) Ähnlichkeit zwischen den Lipidderivaten und Lipiden. Es wird somit angenommen, dass die Lipidderivate und randaktive Stoffe der alleinige Bestandteil von Liposomen sein können, d.h. bis zu 100 Mol% der gesamten dehydrierten Liposome können durch die Lipidderivate und randaktive Stoffe gebildet werden. Dies steht im Gegensatz zu den bekannten Monoether-Lysolipiden, die nur einen geringeren Teil der Liposome ausmachen können.
Dies vorausgeschickt, wird angenommen, dass die Kombination von Lipidderivaten und randaktiven Stoffen typischerweise 50-100 Mol%, wie zum Beispiel 60-100 Mol%, vorzugsweise 75-100 Mol%, im Besonderen 90-100 Mol% ausmacht, basierend auf dem gesamten dehydrierten Liposom.
Liposome können ebenfalls andere Bestandteile einschließen, welche eine pharmazeutische Wirkung haben können oder nicht, die jedoch die Liposomstruktur annehmbarer für die topischen Anwendungen auf der Haut machen werden. Beispiele hierfür sind andere Lipide, Steroidverbindungen und Ziel-Verbindungen, usw. Bei einigen interessanten Ausführungsformen umfassen die Liposome ebenfalls andere Lipide, zum Beispiel Diacylphospholipide.
Die Liposome, welche Lipidderivate umfassen, können (im Prinzip) ausschließlich aus den Lipidderivaten bestehen. Um die Liposome jedoch zu modifizieren, können „andere Lipide" ebenfalls eingefügt werden. Andere Lipide werden wegen ihrer Fähigkeit ausgewählt, kompatible Packungsgestaltungen so an die Lipidderivatbestandteile der Doppelschicht anzupassen, dass alle Lipidbestandteile dicht gepackt sind und die Freisetzung der Lipidderivate aus der Doppelschicht gehemmt wird. Auf Lipiden basierende Faktoren, die zu kompatiblen Packungsgestaltungen beitragen, sind den Fachleuten bekannt und schließen uneingeschränkt Acylkettenlänge und Grad der Nichtsättigung ein sowie Größe und Ladung der Kopfgruppe. Dementsprechend können geeignete andere Lipide, einschließlich von verschiedenen Phosphatidylethanolaminen („PE"); wie zum Beispiel Ei- oder Sojaphospholipide oder Dioleoylphosphatidylethanolamin („DOPE") von den Fachleuten ohne übermäßiges Experimentieren ausgewählt werden. Lipide können auf verschiedene Weise modifiziert werden, zum Beispiel durch Kopfgruppenderivatisierung mit Dikarbonsäuren, wie zum Beispiel Glutarsäuren, Sebacinsäuren, Succinsäuren und Weinsäuren; vorzugsweise ist die Dikarbonsäure Glutarsäure („GA").
Dementsprechend schließen geeignete kopfgruppenderivatisierte Lipide Phosphatidylethanolamin-Dikarbonsäuren ein, wie zum Beispiel Dipalmitoyl-Phosphatidylethanolamin-glutarsäure („DPPE-GA"), Palmitoyloleoyl-Phosphatidylethanolaminglutarsäure („POPE-GA") und Dioleoyl-Phosphatidylethanolaminglutarsäure („DOPE-GA"). Vorzugsweise ist das derivatisierte Lipid DOPE-GA.
Der Gesamtgehalt „anderer Lipide" wird typischerweise im Bereich von 0-30 Mol% liegen, im Besonderen von 1-10 Mol% oder 0-10 Mol%, basierend auf dem gesamten dehydrierten Liposom.
Eine in das Liposom eingefügte Steroidverbindung kann im Allgemeinen die Fluidität von Lipid-Doppelschichten beeinflussen. Demgemäß hemmen Steroidwechselwirkungen mit umgebenden Kohlenwasserstoffgruppen im Allgemeinen die Emigration dieser Gruppen aus der Doppelschicht. Ein Beispiel einer Steroidverbindung (Steroid), welche in das Liposom einzufügen ist, ist Cholesterin, jedoch ist eine Vielfalt von anderen Steroidverbindungen möglich. Es wird im Allgemeinen angenommen, dass sich der Gehalt an einer Steroidverbindung, falls sie vorliegt, im Bereich von 0-25 Mol%, im Besonderen 0-10 Mol%, wie zum Beispiel 0-5 Mol% bewegen wird, basierend auf dem gesamten dehydrierten Liposom.
Noch weitere Bestandteile können 0-2 Mol%, im Besonderen 0-1 Mol% ausmachen, basierend auf dem gesamten dehydrierten Liposom.
Auf Lipiden basierende Teilchensysteme, das heißt Liposome, mit Größen, welche einen breiten Bereich abdecken, können gemäß den oben erwähnten Verfahren hergestellt werden. Abhängig von der besonderen Anwendung werden sich geeignete Größen für pharmazeutische Anwendungen normalerweise im Bereich von 20-10 000 nm, im Besonderen im Bereich von 30-1000 nm bewegen. Größen im Bereich von 50-200 nm werden normalerweise bevorzugt.
Die Liposome können unilamellar oder multilamellar sein. Einige bevorzugte Liposome sind unilamellar, und sie haben Durchmesser von weniger als zirka 200 nm, besser noch von größer als zirka 50 nm bis weniger als zirka 200 nm.
Die Liposome werden typischerweise – wie auf dem Fachgebiet bekannt ist – mit Hilfe eines Verfahrens hergestellt, welches die folgenden Schritte umfasst: (a) Auflösen des Lipidderivats und von randaktiven Stoffen und anderen Bestandteilen in einem organischen Lösungsmittel; (b) Entfernen des organischen Lösungsmittels aus der Lipidderivatlösung von Schritt (a); und (c) Hydrieren des Produkts von Schritt (b) mit einem wässrigen Lösungsmittel, um Liposome auszubilden.
Das Verfahren kann weiterhin einen Schritt des Hinzufügens eines zweiten Arzneiwirkstoffes (siehe unten) zum organischen Lösungsmittel von Schritt (a) oder der wässrigen Phase von Schritt (c) umfassen.
Nachfolgend kann das Verfahren einen Schritt des Extrudierens der in Schritt (c) hergestellten Liposome durch einen Filter hindurch umfassen, um Liposome einer bestimmten Größe, zum Beispiel 100 nm herzustellen.
Die Liposome können dehydriert, gelagert und dann derart wiederhergestellt werden, dass ein wesentlicher Teil ihres inneren Gehalts beibehalten wird. Die Liposomdehydration erfordert im Allgemeinen die Nutzung eines hydrophilen Trocknungs-Schutzmittels, wie zum Beispiel ein Disaccharidzucker sowohl an den inneren als auch an den äußeren Oberflächen der Liposom-Doppelschichten (siehe US 4,880,635 ). Es wird im Allgemeinen angenommen, dass diese hydrophile Verbindung das Neuanordnen der Lipide im Liposom verhindert, so dass die Größe und der Gehalt während des Trocknungsverfahrens und während der nachfolgenden Rehydratation aufrechterhalten werden. Geeignete Eigenschaften für diese Trockungs-Schutzmittel sind, dass sie starke Wasserstoffbindungsakzeptoren sind, und dass sie stereochemische Merkmale aufweisen, welche die intramolekulare Beabstandung der Bestandteile der Liposom-Doppelschicht erhalten. Alternativ kann das Trocknungs-Schutzmittel entfallen, wenn die Liposomzubereitung vor der Dehydratation nicht gefroren wird, und wenn nach der Dehydratation genügend Wasser in der Zubereitung verbleibt.
Lipidderivat-Liposome als Arzneistoffträgersysteme
Wie oben erwähnt, können die Liposome, einschließlich der Lipidderivate, ebenfalls zweite Arzneistoffe einschließen. Bei einer besonderen Ausführungsform hat das oben beschriebene auf Lipiden basierende Arzneistoffabgabesystem die Form von Liposomen, wobei ein zweiter Arzneistoff inkorporiert ist. Es versteht sich, dass zweite Arzneistoffe pharmazeutische Wirkstoffe umfassen können, die eine individuelle oder synergistische pharmazeutische Wirkung in Kombination mit dem Lipidderivat und mit Lysolipidderivaten haben können. Der Begriff „zweiter" impliziert nicht unbedingt, dass die pharmazeutische Wirkung des zweiten Arzneistoffes geringer ist im Verhältnis, zum Beispiel, zu der des Arzneiwirkstoffes, welcher aus der Prodrug abgeleitet ist, sondern er wird lediglich verwendet, um zwischen den zwei Gruppen von Stoffen zu unterscheiden.
Ein möglicher „zweiter Arzneistoff" ist jede Verbindung oder Zusammensetzung von Stoffen, welche an Säugetiere, vorzugsweise an Menschen, verabreicht werden kann. Diese Mittel können bei Säugetieren eine biologische Tätigkeit haben. Zweite Arzneistoffe, die mit Liposomen verbunden sein können, schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf: antivirale Mittel, wie zum Beispiel Acyclovir, Zidovudin und die Interferone; antibakterielle Mittel, wie zum Beispiel Aminoglykoside, Cephalosporine und Tetrazykline; Mittel gegen Pilzbefall, wie zum Beispiel Polyen-Anti-biotika, Imidazole und Triazole; antimetabolitische Mittel, wie zum Beispiel Folsäure, und Purin und Pyrimidin-Analoga; antineoplastische Mittel, wie zum Beispiel die Anthrazyklin-Antibiotika und Pflanzenalkaloide; Steroide, wie zum Beispiel Cholesterin, Kohlehydrate, zum Beispiel Zucker und Stärken; Aminosäuren, Peptide, Proteine, wie zum Beispiel Zellrezeptorproteine, Immunoglobuline, Enzyme, Hormone, Neurotransmitter und Glykoproteine; Farbstoffe, lokale Anaesthetika; und dergleichen.
Liposome können mit einem oder mehr zweiten Arzneistoffen beladen werden, indem der Arzneistoff in der Lipid- oder wässrigen Phase, die für die Zubereitung der Liposome benutzt wird, gelöst wird. Alternativ können ionisierbare zweite Arzneistoffe in Liposome hinein geladen werden, indem zuerst die Liposome gebildet werden, ein elektrochemisches Potential, zum Beispiel mit Hilfe eines pH Gradienten, über die äußerste Liposom-Doppelschicht hinweg erzeugt wird und danach der ionisierbare zweite Arzneistoff dem wässrigen Medium außerhalb des Liposoms hinzugefügt wird (siehe zum Beispiel US 5,077,056 und WO 86/01102).
Verfahren der Zubereitung von lipophilen Arzneistoffderivaten, die für die Liposomzubereitung geeignet sind, sind auf dem Fachgebiet bekannt (siehe zum Beispiel US 5,534,499 und US 6,118,011 , welche das kovalente Befestigen von Therapeutika an einer Fettsäurekette eines Phospholipids beschreiben). Eine mizellare Zubereitung von Taxol wird bei Alkan-Onkyuksel et al., Pharmaceutical Research, 11:206 (1994) beschrieben.
Demgemäß kann der zweite Arzneistoff jeder aus einer breiten Vielfalt von bekannten und möglichen pharmazeutischen Wirkstoffen sein, die anwendbar für Krankheiten und Leiden im epidermalen, dermalen oder subkutanen Gewebe der Haut sind. Auf Grund des beim Abbau der Liposome involvierten Mechanismus wird es bevorzugt, dass der zweite Arzneistoff einer ist, der sich auf Hautkrankheiten und/oder -leiden bezieht, die mit einer lokalisierten Erhöhung bei der extrazellularen PLA₂ Tätigkeit verbunden sind, wie zum Beispiel: Arachidonoylderivate.
Es wird ins Auge gefasst, dass der zweite Arzneistoff in den Liposomen gemäß deren Hydrophilizität verteilt werden wird, das heißt hydrophile zweite Arzneistoffe werden dazu neigen, in der Kavität der Liposome vorzuliegen, und hydrophobe zweite Arzneistoffe werden dazu neigen, in der hydrophoben Doppelschicht vorzuliegen. Verfahren für die Inkorporation von zweiten Arzneistoffen sind auf dem Fachgebiet bekannt, wie oben deutlich gemacht worden ist.
Aus dem Obigen versteht sich, dass die Lipidderivate – als Prodrugs oder als einzelne Bestandteile – eine pharmazeutische Wirksamkeit aufweisen können. Bei einer besonderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung jedoch des Weiteren die Nutzung eines auf Lipiden basierenden Arzneistoffabgabesystems in Form eines Liposoms für die Verabreichung eines zweiten Arzneistoffes, wobei der zweite Arzneistoff in das System inkorporiert ist (zum Beispiel wo der zweite Arzneistoff im Inneren des Liposoms oder im Membranteil des Liposoms eingekapselt ist), und wobei das System Lipidderivate einschließt mit (a) einer aliphatischen Gruppe mit einer Länge von zumindest 7 Kohlenstoffatomen und einem organischen Radikal mit zumindest 7 Kohlenstoffatomen und (b) einem hydrophilen Anteil, wobei das Lipidderivat des Weiteren ein Substrat für extrazellulare PLA₂ dergestalt ist, dass das organische Radikal hydrolytisch abgetrennt werden kann, während die aliphatische Gruppe im Wesentlichen unbeeinträchtigt bleibt, was zu einem organischen Säurefragment oder zu einem organischen Alkoholfragment und einem Lysolipidfragment führt, wobei das Lysolipidfragment kein Substrat für Lysophospholipase ist.
Wie oben bei dem System gemäß der anderen Ausführungsform kann das organische Radikal, welches hydrolytisch abgetrennt werden kann, ein Arzneihilfsstoff sein oder ein Wirksamkeitsveränderer für den zweiten Arzneistoff. Es versteht sich, dass das Lipidderivat ein Lipidderivat, wie oben weiter definiert, ist. Typischerweise macht die Kombination des Lipidderivats und des randaktiven Stoffes 50-100 Mol%, wie zum Beispiel 90-100 Mol% des gesamten dehydrierten (Liposom)-Systems aus.
Pharmazeutische Präparate und therapeutische Nutzungen
Die Krankheiten oder die Leiden, die behandelt oder gelindert werden sollen, werden typischerweise ausgewählt aus Hautkrebs, Psoriasis und entzündlichen Leiden.
Die pharmazeutische Zusammensetzung, welche der Person, die sie benötigt, verabreicht werden soll, umfasst daher typischerweise einen pharmazeutisch annehmbaren Träger und das Liposom.
„Pharmazeutisch annehmbare Träger", wie hierin verwendet, sind diejenigen Medien, welche im Allgemeinen annehmbar für die Nutzung im Zusammenhang mit der Verabreichung von Liposomen, einschließlich von Liposom-Arzneistoffzubereitungen, an Säugetiere, einschließlich von Menschen, sind. Pharmazeutisch annehmbare Träger werden im Allgemeinen entsprechend einer Anzahl von Faktoren zubereitet, die dem Fachmann wohlbekannt sind, und welche uneingeschränkt bestimmen und berücksichtigen: den verwendeten speziellen Arzneiwirkstoff und/oder den zweiten Arzneistoff, die Liposomzubereitung, deren Konzentration, Stabilität und vorgesehene Bioverfügbarkeit; die Krankheit, die Störung oder das Leiden, die mit der Liposomzusammensetzung behandelt werden; das Lebewesen, sein Alter, seine Größe und sein Allgemeinzustand, und den vorgesehenen Verabreichungsweg der Zusammensetzung (hier: dermal). Pharmazeutisch annehmbare Träger können zusätzliche Bestandteile enthalten, zum Beispiel solche, welche die Stabilität der eingeschlossenen Wirkstoffe erhöhen, wie zum Beispiel Konservierungsmittel und Antioxidantien.
Die topischen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können zu einer breiten Vielfalt von Produkttypen gestaltet werden. Diese schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf Lösungen, Lotionen, Cremes, Strandprodukte, Gele, Stifte, Sprays, Kissen, Salben, Pasten, Mousses und Kosmetika. Diese Produkttypen können mehrere Arten von Liposomträgersystemen umfassen, einschließlich der Stoffe, welche in der vorliegenden Erfindung beschrieben werden.
Die Zubereitung und Herstellung dieser Zusammensetzungen sind den Fachleuten auf dem Gebiet der pharmazeutischen Zubereitung bekannt. Spezielle Zubereitungen sind im Lehrbuch mit dem Titel „Remingtons's Pharmaceutical Sciences" zu finden.
In der Dermatologie werden Anwendungsdosierungen von bis zu 50 mg, oft bis 10 mg und sehr oft weniger als 2,5 mg (oder sogar weniger als 1 mg) der Trägersubstanz pro Quadratzentimeter Hautoberfläche genutzt, wobei die angegebenen Mengen sich auf die Grund-Trägersubstanz beziehen. Die optimale Menge hängt von der Trägerzusammensetzung, der gewünschten Penetrationstiefe und der Dauer der Wirkung ab, sowie vom detaillierten Anwendungsort.
Für dermale Anwendungen werden vorzugsweise Teilchen oder Vesikel mit einem Durchmesser in der Größenordnung von 100-10 000 nm, oft im Bereich von 100 bis 400 nm und am häufigsten mit Größen von 100 bis 200 nm als Träger verwendet.
Die Erfindung wird anhand der folgenden nicht einschränkenden Beispiele veranschaulicht.
BEISPIELE
Beispiel 1
Liposomzubereitung
Unilamellare vollständig hydrierte Liposome mit einer schmalen Größenverteilung wurden hergestellt aus 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-Phosphocholin (1-O-DPPC) und Di-hexadecanoyl-sn-glycero-3-Phosphocholin (DPPC). DPPC wurde erhalten aus Avanti Polar Lipiden, und 1-O-DPPC wurde in unserem Labor synthetisiert. Kurz gesagt wurden gewogene Mengen von DPPC oder 1-O-DPPC in Chloroform aufgelöst. Das Lösungsmittel wurde durch einen sanften Strom von N₂ entfernt, und die Lipidfilme wurden über Nacht bei niedrigem Druck getrocknet, um Spurenmengen des Lösungsmittels zu entfernen. Multilamellare Vesikel wurden hergestellt, indem die getrockneten Lipide in einer Pufferlösung dispergiert wurden, die enthielt: 150 mM KCL, 10 mM HEPES (PH = 7,5), 1 mM NaN₃, 30 μM CaCl₂ und 10 μM EDTA.
Die multilamellaren Vesikel wurden zehn Mal durch zwei gestapelte Polykarbonatfilter mit einer Porengröße von 100 nm hindurch extrudiert, wie durch Mayer et al., Biochim. Biophys. Acta, 858, 161-168 beschrieben.
Wärmekapazitätskurven wurden erhalten durch den Einsatz eines N-DSC II Differentialscanningkalorimeters (Calorimetry Sciences Corp., Provo) des Energieausgleichstyps mit einem Zellvolumen von 0,34 mL. Vor dem Scannen wurde die Liposomsuspension 50 Minuten im Kalorimeter bei der Anfangstemperatur ausgeglichen. Eine Scanrate von +10°C/h wurde genutzt. Die Lipidkonzentration betrug 1 mM. Der Gel-zu-Fluid-Übergang der multilamellaren Liposome (MLV) wird gekennzeichnet als ein scharfer Übergang erster Ordnung, widergespiegelt durch die schmale Spitze in den Wärmekapazitätskurven, die in 1a und 1b (obere Kurven) für 1-O-DPPC und DPPC gezeigt werden. Die scharfe Spitze widerspiegelt das Übergangsverhalten von multilamellaren Liposomen und steht im Kontrast zu dem breiteren Gel-zu-Fluid-Übergang, der für unilamellare Liposome (LUV) (Pedersen et al., 1996, Biophys. J. 71, 554-560) festgestellt wurde, wie in 1a und 1b (untere Kurven) für die unilamellaren extrudierten 1-O-DPPC und DPPC Liposome gezeigt wird.
Beispiel 2
Phospholipase A₂ Reaktionsprofil- und Verzögerungszeitmessungen. Gereinigte Schlangengift-Phospholipase A₂ (PLA₂ von Agikistrodon piscivorus piscivorus) wurde gemäß dem Verfahren von Maraganore et al., J. Biol. Chem. 259, 13839-13843, isoliert. Dieses PLA₂ Enzym gehört zu der Klasse sekretorischer Enzyme von niedrigem Molekulargewicht 14 kD, welche eine strukturelle Ähnlichkeit mit menschlicher extrazellularer Phospholipase A₂ zeigen, was auf einen gemeinsamen molekularen Mechanismus der durch Phospholipase katalysierten Hydrolyse an der Lipid-Membran-Schnittstelle hinweist. (Wery et al., Nature 352, 79-82; Honger et al., Biochemistry 35, 9003-9006; Vermehren et al., Biochimica et Biophysica Acta 1373, 27-36). Unilamellare vollständig hydrierte Liposome mit einer schmalen Größenverteilung wurden hergestellt aus 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-Phosphocholin (1-O-DPPC) und aus 1-O-DPPC mit 5 Mol% 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-Phospho-ethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglycol)-350] (1-O-DPPE-PEG350). Die Testbedingungen für das PLA₂ Raktionszeitprofil, das in 2 gezeigt wird, und die in Tabelle 1 angegebene Verzögerungszeit und Prozenthydrolyse waren: 0,15 mM unilamellare Liposome, 150 nM PLA₂, 150 mM KCL, 10 mM HEPES (pH 7,5) 1 mM NaN₃, 30 μM CaCl₂ und 10 μM EDTA.
Tabelle 1: Verzögerungszeit und Prozent hydrolysiertes 1-O-DPPC bei 41°C, wie bestimmt durch HPCL. Die Lipidkonzentration betrug 0,150 mM in einem 10 mM HEPES-Puffer (pH = 7,5).
Die katalytische Reaktion wurde eingeleitet durch das Hinzufügen von 8,9 μL einer 42 μM PLA₂ (150 nM) Vorratslösung zu 2,5 ml der temperaturgeregelten Liposomsuspension (0,150 mM), ausgeglichen über einen Zeitraum von 800 Sek. vor dem Hinzufügen von PLA₂. Das charakteristische Lag-Burst-Verhalten von PLA₂ gegen über den Liposomen wird signalisiert durch eine plötzliche Erhöhung bei der innewohnenden Fluoreszenz vom PLA₂ bei 340 nm nach der Erregung bei 285 nm, gefolgt von einer gleichzeitigen Verringerung bei der 90° Lichtstreuung von der Lipidsuspension (Honger et al., Biochemistry 35, 9003-9006). Proben für die HPLC Analyse der verbleibenden Menge von nicht hydrolysiertem 1-O-DPPC und folglich der erzeugten Menge von 1-O-Hexadecyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-Phosphocholin (Lyso-1-O-PPC) wurden entnommen vor dem Hinzufügen von PLA₂ und 1200 Sek. nach der festgestellten Verzögerungszeit. 100 μl Aliquoten wurden aus der Lipidsuspension entnommen und schnell mit 1 ml Chloroform-/Methanol-/Essigsäure-Lösung (2:4:1) gemischt, um die enzymatische Reaktion zu löschen. Die Lösung wurde mit 1 ml Wasser gewaschen, und 20 μl der schweren organischen Phase wurden für HPLC verwendet. Die HPLC Chromatogramme in 3 zeigen die Mengen von 1-O-DPPC vor und nach (Zeit = 3000 Sek) dem Hinzufügen von PLA₂ (Zeit = 800 Sek.) zur Liposomsuspension. Die HPLC Analyse wurde vorgenommen unter Nutzung einer 5 μm Diolsäule, einer mobilen Phase, bestehend aus Chloroform/Methanol/Wasser (730:230:30, v/v) und eines Verdampfungs-Lichtstreuungsdetektors. Der Übergang der durch PLA₂ katalysierten Lipidhydrolyse von 1-O-DPPC zu Lyso-1-O-PPC wurde durch HPLC (siehe Tabelle 1) gemessen. Die innewohnende Enzymfluoreszenz und 90° Lichtstreuung wurden als eine Funktion der Zeit gemessen, wie in 2 gezeigt wird.
Beispiel 3
Durch Phospholipase A₂ herbeigeführte Freisetzung eines verkapselten wasserlöslichen Modell-Arzneistoffes
Multilamellare 1-O-DPPC-Liposome wurden hergestellt beim Vorliegen von fluoreszierendem Calcein in einer selbst-löschenden Konzentration von 20 mM durch die Hydradation eines Films von 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-Phosphocholin in einer HEPES Pufferlösung bei pH = 7,5 über eine Stunde bei 10°C oberhalb der Phasenübergangstemperatur. Unilamellare Liposome wurden ausgebildet, indem die multilamellaren Liposome zehn Mal durch zwei gestapelte 100 nm Polykarbonatfilter hindurch extrudiert wurden. Die unilamellaren Liposome wurden schnell auf eine Temperatur unterhalb der Übergangstemperatur abgekühlt, und die calceinenthaltenden 1-O-DPPC Liposome wurden vom freien Calcein unter Nutzung einer Chromatografiesäule, gepackt mit Sephadex G-50, getrennt.
Testbedingungen für die durch PLA₂ herbeigeführte Calceinfreisetzung waren 25 μM unilamellare 1-O-DPPC Liposome, 25 nM PLA₂, 150 mM KCL, 10 mM HEPES (pH 7,5 oder 8,0), 1 mM NaN₃, 30 μM CaCl₂ und 10 μM EDTA. PLA₂ wurde bei Zeit 900 Sek. zu 2,5 ml der temperaturgeregelten 1-O-DPPC Liposomsuspension hinzugefügt, ausgeglichen für zumindest 20 Min. bei 37°C vor dem Hinzufügen von PLA₂. Der Prozentsatz von freigesetztem Calcein wird bestimmt als: % Freisetzung = 100 × (I_F(t)-I_B)/I_T-I_B), wobei I_F(t) die gemessene Fluoreszenz zum Zeitpunkt t nach dem Hinzufügen des Enzyms ist, I_B die Hintergrundfluoreszenz ist und I_T die Gesamtfluoreszenz ist, gemessen nach dem Hinzufügen von Triton X-100, was zur vollständigen Freisetzung von Calcein durch das Aufbrechen der 1-O-DPPC Liposome führt. PLA₂ führte eine Gesamtfreisetzung von 90 Prozent des eingeschlossenen Calceins in den 1-O-DPPC Liposomen herbei, wie in 4 gezeigt wird.
Beispiel 4
Durch Phospholipase A₂ gesteuerte Erhöhung der Durchlässigkeit einer Ziel-Modellmembran
Multilamellare Modellmembran-Zielliposome wurden hergestellt beim Vorliegen von fluoreszierendem Calcein in einer selbst-löschenden Konzentration von 20 mM durch die Hydradation eines Films von 1,2-O-Dioctadecyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholinen (D-O-SPC) in einer HEPES Pufferlösung bei pH = 7,5 über eine Stunde bei 10°C oberhalb der Phasenübergangstemperatur (T_m = 55°C). Unilamellare Liposome wurden ausgebildet, indem die multilamellaren Ziel-Liposome zehn Mal durch zwei gestapelte 100 nm Polykarbonatfilter hindurch extrudiert wurden. Die unilamellaren Liposome wurden schnell auf eine Temperatur unterhalb der Übergangstemperatur abgekühlt, und die calceinenthaltenden Liposome wurden vom freien Calcein unter Nutzung einer Chromatografiesäule, gepackt mit Sephadex G-50, getrennt. Die unilamellaren Träger-Liposome, bestehend aus 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-Phosphocholin wurden zubereitet, wie oben beschrieben.
Die Calceinfreisetzung aus den Ziel-Liposomen wird durch Messen der Fluoreszenzintensität bei 520 nm nach Erregung bei 492 nm bestimmt.
Die Konzentrationen von D-O-SPC und 1-O-DPPC-Liposomen betrugen 25 μM. Schlangengift PLA₂ (Agkistrodon piscivorus piscivorus) wurde hinzugefügt (25 nM), um die hydrolytische Reaktion einzuleiten, welche zur Ausbildung von 1-O-Hexadecyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-Phosphocholin (Lyso-1-O-DPPC) und Fettsäurehydrolyseprodukten führt. Wenn Calcein aus den D-O-SPC Liposomen freigesetzt wird, wird auf Grund der Inkorporation des nicht-doppelschichtbildenden Polymer-Lyso-1-O-DPPC und von Fettsäurehydrolyseprodukten in die Ziel-Lipidmembran eine lineare Zunahme der Fluoreszenz bei 520 nm nach Erregung bei 492 nm beobachtet, wenn Calcein in das umgebende Puffermedium hinein verdünnt wird, wie in 5 gezeigt wird. Der Prozentsatz von freigesetztem Calcein wird bestimmt, wie oben beschrieben ist (siehe Beispiel 3).
Beispiel 5
Erhöhung der Phospholipase A2 Aktivität durch negativ geladene polymergepfropfte 1-O-Lipide
Unilamellare vollständig hydrierte Liposome mit einer schmalen Größenverteilung wurden hergestellt aus 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-Phosphocholin (1-O-DPPC) und 1-O-DPPC mit 5 Mol% 1-O-Hexadecyl-2-hexa-decanoyl-sn-glycero-3-phosphoetanolamin-N[methoxy(poly-ethylenglycol)-350] (1-O-DPPE-PEG350), wie in Beispiel 2 beschrieben. Testbedingungen für die PLA₂ Zeitverzögerungsmessungen waren 0,15 mM unilamellare Liposome, 150 nM PLA₂, 150 mM KCL, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM NaN₃, 30 μM CaCl₂ und 10 μM EDTA. Die katalytische Reaktion wurde eingeleitet durch das Hinzufügen von 8,9 μL einer 42 μM PLA₂ Vorratslösung zu 2,5 ml der temperaturgeregelten Liposomsuspension, ausgeglichen über einen Zeitraum von 800 Sek. bei 41°C vor dem Hinzufügen von PLA₂. Die vor dem Eintreten der schnellen enzymatischen Aktivität verstrichene Zeit wird bestimmt durch eine plötzliche Erhöhung der innewohnenden Fluoreszenz vom PLA₂ bei 340 nm nach Erregung bei 285 nm. Die in 7 gezeigten Ergebnisse zeigen eine signi fikante Reduzierung der Verzögerungszeit, wenn 5 Mol% des negativ geladenen 1-O-DPPE-PEG350 in die 1-O-DPPC Liposome inkorporiert werden.
Beispiel 6
Zubereitung von Mizellen aus 1-O-DPPE-PEG350 und DSPE-PEG750
Mizellen wurden hergestellt aus 1-O-Hexadecyl-2-hexa-decanoyl-sn-glycero-3-phosphoetanolamin-N[methoxy(poly-ethylenglycol)-350] (1-O-DPPE-PEG350), di-octadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoetanolamin-N[methoxy(poly-ethylenglycol)-750] (DSPE-PEG750). Kurz gesagt wurden gewogene Mengen des Polymerlipids in Chloroform aufgelöst. Das Lösungsmittel wurde durch einen sanften Strom von N₂ entfernt. Die Lipidfilme wurden dann über Nacht bei niedrigem Druck getrocknet, um Spurenmengen des Lösungsmittels zu entfernen. Mizellen wurden hergestellt, indem die getrockneten Polymerlipide in einer Pufferlösung dispergiert wurden, die enthielt: 150 mM KCL, 10 mM HEPES (pH = 7,5), 1 mM NaN₃, 30 μM CaCl₂ und 10 μM EDTA.
Beispiel 7
Erhöhung der Durchlässigkeit einer Ziel-Modellmembran, gesteuert durch Phospholipase A₂ Hydrolyse von Mizellen
Multilamellare Modellmembran-Zielliposome wurden hergestellt beim Vorliegen von fluoreszierendem Calcein in einer selbst-löschenden Konzentration von 20 mM durch die Hydradation eines Films von 1,2-O-dioctadecyl-sn-glycero-3-Phosphatidylcholinen (D-O-SPC) in einer HEPES Pufferlösung bei pH = 7,5 über eine Stunde bei 10°C oberhalb der Phasenübergangstemperatur (T_m = 55°C). Unilamellare Liposome wurden ausgebildet, indem die multilamellaren Liposome zehn Mal durch zwei gestapelte 100 nm Polykarbonatfilter hindurch extrudiert wurden. Die unilamellaren Liposome wurden schnell auf eine Temperatur unterhalb der Übergangstemperatur abgekühlt, und die calceinenthaltenden Liposome wurden vom freien Calcein unter Nutzung einer Chromatografiesäule, gepackt mit Sephadex G-50, getrennt. Mizellen aus 1-O-Hexadecyl-2-hexa-decanoyl-sn-glycero-3-phosphoetanolamin-N[methoxy(poly-ethylenglycol)-350] (1-O-DPPE-PEG350), di- octadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoetanolamin-N[methoxy(poly-ethylenglycol)-750] (DSPE-PEG750) wurden hergestellt, wie in Beispiel 6 beschrieben ist. Die Calceinfreisetzung aus den Ziel-Liposomen wird durch das Messen der Fluoreszenzintensität bei 520 nm nach Erregung bei 492 nm bestimmt.
Die Konzentrationen von D-O-SPC und Polymerlipid-Mizellen betrugen 25 μM. Schlangengift PLA₂ (Agkistrodon piscivorus piscivorus) wurde hinzugefügt (25 nM), um die hydrolytische Reaktion einzuleiten, welche zur sofortigen Ausbildung von Polymer-Lyso-1-O-DPPE und der freien Fettsäurehydrolyseprodukte führt. Wenn Calcein aus den D-O-SPC Liposomen freigesetzt wird, wird auf Grund der Inkorporation der nicht-doppelschichtbildenden Polymer-Lyso-1-O-Lipide und von Fettsäure in die Ziel-Lipidmembran eine lineare Zunahme der Fluoreszenz bei 520 nm nach Erregung bei 492 nm beobachtet, wenn Calcein in das umgebende Puffermedium hinein verdünnt wird, wie in 7 gezeigt wird. Der Prozentsatz von freigesetztem Calcein wird bestimmt, wie in Beispiel 3 beschrieben. PLA₂-katalysierte Hydrolyse von 1-O-DPPE-PEG350 führte die schnellste Freisetzungsrate herbei.
Beispiel 8
Hydrolyse von Mizellen aus DSPE-PEG750
Der Hydrolyse von Mizellen aus DSPE-PEG750 folgte die Analyse der Menge an erzeugter Stearinsäure. Die katalytische Reaktion wurde eingeleitet durch das Hinzufügen von 8,9 μL einer 42 μM PLA₂ (150 nM) Vorratslösung zu 2,5 ml einer temperaturgeregelten Mizellensuspension von DSPE-PEG 750 (0,150 nM), ausgeglichen über einen Zeitraum von 600 Sek. bei 45°C vor dem Hinzufügen von PLA₂. Das charakteristische Burst-Verhalten von PLA₂ gegenüber den Mizellen wird signalisiert durch eine plötzliche Erhöhung bei der innewohnenden Fluoreszenz vom PLA₂ bei 340 nm nach der Erregung bei 285 nm, gefolgt von einer gleichzeitigen Verringerung bei der 90° Lichtstreuung von der Lipidsuspension (Honger et al., Biochemistry 35, 9003-9006). Proben für die HPLC Analyse der erzeugten Menge von Stearinsäure wurden entnommen vor dem Hinzufügen von PLA₂ und 100 Sek. nach der festgestellten Verzögerungszeit. Die HPLC Chromatogramme in 8 zeigen die Menge an erzeugter Stearinsäure 100 Sek. nach der festgestellten Verzögerungszeit (10 Sek.) bei 45°C. Die Menge (0,156 mM) an durch Hydrolyse erzeugter Stearinsäure entsprach 100 % Hydrolyse der DSPE-PEG750 Polymerlipide. Die HPLC Analyse erfolgte unter Nutzung einer 5 μm Diolsäule, einer mobilen Phase aus Chloroform/Methanol/Wasser (730:230:30, v/v) und eines Verdampfungs-Lichtstreuungsdetektors (siehe Beispiel 2).
Beispiel 9
Modellbeispiele
Liposome aus neutralen oder negativ geladenen Phospholipiden können als flexible dermale Arzneistoff- und Prodrug-Abgabesysteme fungieren, die eine Reihe von verschiedenen Hauterkrankungen zum Ziel haben, die mit erhöhten Phospholipase A₂ Pegeln am erkrankten Ort in der Haut verbunden sind. Die flexiblen Liposome werden, wenn sie auf die Oberfläche der Haut aufgebracht werden, beginnen, in die Haut hinein zu wandern, wo sie schließlich das erkrankte subkutane Zielgewebe erreichen. Bei den Beispiel hierin wird ein experimentelles Modellsystem beschrieben, welches das Prinzip der verbesserten Arzneistoff- und Prodrug-Abgabe an die Haut veranschaulicht, das eine erhöhte Tätigkeit von extrazellularer Phospholipase A₂ in der erkrankten Haut ausnutzt. Die Phospholipase A₂ hydrolysiert den auf Lipiden basierenden Proverstärker im flexiblen Träger-Liposom, wodurch Lysophospholipid und freie Fettsäure erzeugt werden, welche so gezeigt werden, dass sie synergistisch zu einer verstärkten Liposomdestabilisierung und Arzneistofffreisetzung führen, zur gleichen Zeit wie die Durchlässigkeit der Zielmembran erhöht wird. Das vorgeschlagene System kann wärmeempfindlich gemacht werden und bietet einen rationalen Weg für die Entwicklung von smarten, auf Liposomen basierenden Arzneistoffabgabesystemen durch die Einfügung in den Träger von speziellen auf Lipiden beruhenden Proverstärkern, Prodestabilisatoren oder Prodrugs, die automatisch durch Phospholipase A₂ nur an den infizierten Zielorten aktiviert werden.
Liposome sind selbstassemblierende Lipidsysteme, und ihre Stabilität wird daher in großem Maße durch unspezifische physikalische Wechselwirkungen gesteuert. Das Verstehen der molekularen Steuerung der physikalischen Eigenschaften von Liposomen ist daher wichtig für das Manipulieren und Zuschneiden der Liposomeigen schaften in Bezug auf spezielle Arzneistoffabgabezwecke. Als Beispiel ist der thermisch herbeigeführte Gel-Fluid-Lipidphasenübergang ausgenutzt worden und hat Gestaltungssysteme für verstärkte Freisetzung von Arzneistoffen auf Grund von Hyperthermie optimiert. Es wäre wünschenswert, wenn ein intelligentes und vielseitiges Arzneistoffabgabesystem gestaltet werden könnte, in welches ein dualer virtueller Triggermechanismus der gleichzeitigen (i) verstärkten Arzneistofffreisetzung selektiv in Leber und Milz (Zielgewebe) und (ii) des verstärkten Transports des Arzneistoffes in die infizierten Zellen eingebaut ist. Dieses Prinzip wird schematisch in 9 veranschaulicht.
Durch die Beispiele hierin wird die Entwicklung eines einfachen und operativen experimentellen biophysikalischen Modellsystems beschrieben, welches einen solchen dualen Mechanismus stützt, der im infizierten subkutanen Zielgewebe ausgelöst werden soll. Das Modell geht von einer erhöhten Tätigkeit extrazellularer Phospholipase A₂ im erkrankten Haut-Zielgewebe aus, wie dies der Fall bei erkranktem Gewebe ist, wo der Pegel extrazellularer PLA₂ vielfach vergrößert sein kann. Es hat sich gezeigt, dass die Phospholipide von zum Beispiel negativ geladenen Liposomen, wenn sie extrazellularer PLA₂ ausgesetzt werden, eine verstärkte Hydrolyse im Vergleich zu neutralen Liposomen erleiden. Dies führt zur Destabilisierung des Liposoms und zur verstärkten Freisetzung des verkapselten Arzneistoffes. Die Hydrolyseprodukte, Lyso-Phospholipide und freie Fettsäuren, agieren ihrerseits als Absorptionsverstärker für Arzneistoffdurchdringung über die Zielmembran hinweg. Auf diese Weise verhalten sich die Phospholipide des Träger-Liposoms als Prodestabilisatoren am Ort des Trägers und als Proverstärker am Ort der Zielmembran. Molekulare Einzelheiten dieses Prinzips werden schematisch in 10 veranschaulicht.
Das experimentelle Modellsystem besteht aus einem negativ geladenen Liposomträger und einer Modell-Zielmembran. Der Träger ist ein 100 nm unilamellares Liposom aus Dipalmitoylphosphatidylcholinlipiden (DPPC) mit kleinen Mengen (2,5 Mol%) eines negativ geladenen Lipids des Typs Dipalmitoylphosphatidylethanolamin (DPPE)-PEG₂₀₀₀. Die Zielmembran ist ein weiteres Liposom aus 1,2-O-dioctadecyl-sn-glycerophosphatidylcholin (D-O-SPC), welches ein Phospholipid ist, bei dem die Acylbindungen der Stearoylketten Etherbindungen sind. Im Gegensatz zu DPPC ist D-O-SPC inert gegenüber PLA₂-katalysierter Hydrolyse und ahmt dadurch die Stabilität einer intakten Zielzellenmembran gegenüber dem Abbau durch ihre eigenen Enzyme nach. Diese experimentelle Analyse, welche die gleichzeitige sowie die separate Untersuchung der Wirkung von Destabilisatoren an den Träger-Liposomen und der Wirkung von Verstärkern an der Zielmembran gestattet, involviert das Einschließen eines wasserlöslichen fluoreszierenden Calcein-Modell-arzneistoffes in einer selbstlöschenden Konzentration im Inneren des nicht hydrolysierbaren Ziel-Liposoms anstatt im Träger-Liposom. Der erhöhte Pegel von extrazellularem PLA₂ an der Zielmembran kann dann simuliert werden durch das Hinzufügen von extralzellularem PLA₂ zur Einleitung der hydrolytischen Reaktion in einer Suspension der Träger- und Ziel-Liposome. Das Eindringen des Calceins in die D-O-SPC Zielmembran wird anschließend durch die Erhöhung der Fluoreszenz überwacht. Um die Wirkung des Vorliegens von kleinen Mengen negativ geladener Lipide im Träger-Liposom zu untersuchen, wurde ein ähnliches Experiment mit herkömmlichen nackten DPPC Liposomen durchgeführt. Des Weiteren wurden, um den durchlässigkeitsverstärkenden Effekt der Lyso-Phospholipide gegenüber dem Effekt freier Fettsäuren zu vergleichen und von diesem zu unterscheiden, Experimente ohne Enzyme durchgeführt, bei denen Lysophospholipide und freie Fettsäuren den Ziel-Liposomen gleichzeitig oder separat hinzugefügt wurden.
11a zeigt die Ergebnisse der Freisetzung von Calcein als eine Funktion der Zeit nach der Hinzufügung von PLA₂ zum System. Der Reaktionszeitverlauf des speziellen verwendeten PLA₂ weist ein charakteristisches Lag-Burst-Verhalten mit einer sogenannten Verzögerungszeit auf, die zweckmäßig als ein Maß der enzymatischen Tätigkeit genutzt werden kann. Ein dramatischer Rückgang bei der Verzögerungszeit und eine gleichzeitige Erhöhung der Freisetzungsrate werden festgestellt, wenn die Träger-Liposome das negativ geladene DPPE-PEG₂₀₀₀, in Übereinstimmung mit vorherigen Feststellungen des verstärkten Abbaus von extrazellularem PLA₂ von negativ geladenen polymerbeschichteten Liposomen, enthalten.
Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Produkte der PLA₂ katalysierten Hydrolyse des DPPC Liposom-Trägers, Lysophospholipid und freie Fettsäure, die in einem 1:1 Gemisch erzeugt werden, in die Zielmembran inkorporiert werden, was zu einer starken Erhöhung der Membrandurchlässigkeit führt.
Es ist bekannt, dass diese Produkte, die eine sehr niedrige Wasserlöslichkeit haben, auf Grund ihrer nicht-zylindrischen molekularen Formen ein Krümmungsspannungsfeld in der Membran oder eine kleine laterale Phasentrennung herbeiführen, was zu Membrandefekten und erhöhter Durchlässigkeit führt. Dies wird durch die Daten in 12 nachgewiesen, welche zeigen, dass das separate Hinzufügen von Lysophospholipid oder von Fettsäure zum vorliegenden Zielsystem in Abwesenheit von PLA₂ zu einer erhöhten Rate von Calceinfreisetzung über die Zielmembran hinweg führt. Die entscheidende Feststellung ist jedoch, dass wenn Lysophospholipid und freie Fettsäure gleichzeitig in einem 1:1 Gemisch hinzugefügt werden, eine dramatische Erhöhung bei der Freisetzungsrate beobachtet wird, wie in 12 gezeigt wird. Dies legt nachdrücklich nahe, dass die zwei Verstärker in einer synergistischen Weise agieren, wodurch die einzigartige Möglichkeit beim Ausnutzen der PLA₂-katalysierten Hydrolyse für die kombinierte Destabilisierung des Trägerliposoms und die Verstärkung des Arzneistofftransports über die Zielmembran hinweg hervorgehoben wird. Die synergistische Wirkung wird weiter verstärkt durch die Tatsache, dass extrazellulares PLA₂ durch seine eigenen Hydrolyseprodukte aktiviert wird, was die abbaubaren Phospholipide des Trägerliposoms als eine Art Proaktivatoren enthüllt.
Es sollte hervorgehoben werden, dass die Wirkung beim vorliegenden Arzneistoffabgabe-Modellsystem der Nutzung von Lipiden als Proverstärker und Prodestabilisatoren über extrazellulare PLA₂ Tätigkeit dynamisch ist und sich auf einen innewohnenden Zeitmaßstab bezieht. Dieser Zeitmaßstab ist die effektive Verweilzeit der Trägerliposome nahe der Zielmembran. Je schneller das Enzym aktiv wird, desto schneller ist die Arzneistofffreisetzung, und desto größer ist die Arzneistoffabsorption während der Zeit, welche der Träger nahe dem Ziel verbringt. Darüber hinaus wird das Enzym, je schneller es arbeitet, um so leichter verfügbar für die Hydrolyse anderer arzneistofftragender Liposome, welche sich dem erkrankten Zielort nähern. Sobald festgestellt worden ist, dass extrazellulare PLA₂ Tätigkeit für die Steuerung der Arzneistofffreisetzung genutzt werden kann, eröffnen sich mehrere rationale Wege für intelligente Weiterentwicklungen des vorgesehenen Arzneistoffabgabesystems über die Nutzung bekannter Mechanismen der Änderung der extrazellularen PLA₂ Tätigkeit durch die Manipulation der physikalischen Eigenschaften der Lipiddoppelschicht, von der bekannt ist, dass das Enzym für diese sensitiv ist. Somit besteht die Strategie darin, bestimmte physikalische Eigenschaften der Trägerliposome zu modifzieren, ohne ihre vaskuläre Zirkulationszeit signifikant zu verändern. Wir werden dieses allgemeine Prinzip veranschaulichen, indem wir die Wirkungen sowohl eines physikalisch-chemischen Faktors, die Lipidzusammensetzung des Trägers, als auch eines Umwelt-(thermodynamischen)-Faktors, die lokale Temperatur am Zielort, demonstrieren.
Kurzketten-Phospholipide, wie zum Beispiel Didecanoylphosphatidylcholin (DCPC) aktivieren extrazellulares PLA₂. Die Wirkung auf Calceindurchdringung über die Zielmembranen hinweg, herbeigeführt durch die Inkorporation einer kleinen Menge von DCPC in die Träger-PEG-Liposome, wird ebenfalls in 11a gezeigt. Die Freisetzung ist sehr schnell, auf Grund einer fast sofortigen Aktivierung des Enzyms. Wir haben weiterhin festgestellt, dass extrazellulares PLA₂ deaktiviert wird (Daten nicht gezeigt), wenn eine große Menge an Cholesterin (≈20 Mol%) in Liposome inkorporiert wird. Im Gegensatz dazu stellen wir fest, dass eine kleine Menge an Cholesterin (≈3 Mol%) extrazellulares PLA₂ aktiviert.
Es ist bekannt, dass die Temperatur einen dramatischen und hochgradig nichtlinearen Effekt auf extrazellulare PLA₂ Aktivierung im Bereich des Gel-Fluid-Phasenübergangs von gesättigten Phospholipid-Doppelschichten hat. Dieser Effekt wird nicht durch Änderungen im Enzym bewirkt, sondern durch dramatische laterale strukturelle Änderungen in der Lipid-Doppelschicht. Es ist möglich, diesen Effekt beim vorliegenden Arzneistoffabgabesystem zu nutzen, wie dies durch die Daten in 11b nahegelegt wird. Wenn die Temperatur sich der Übergangstemperatur bei 41°C nähert, wird die Rate der Calceinfreisetzung fortschreitend erhöht, wie quantifiziert durch die Zeit von 50 % Calceinfreisetzung t_50%, die im Einsatz von 11b gezeigt wird. Es ist bereits zuvor nahegelegt worden, dass Hyperthermie ausgenutzt werden könnte, um die Arzneistofffreisetzung zu verstärken, und dass lokale Erwärmung an vorher festgelegten Tumorbereichen genutzt werden könnte, um arzneistofftragende Liposome lokal zu destabilisieren, indem die verstärkte Undichtheit von Liposomen bei ihrem Phasenübergang ausgenutzt wird. Bei dem neuen Modell-Arzneistoffabgabe-system, das hier vorgeschlagen wird, werden diese wärmeempfindlichen Möglichkeiten integriert und voll ausgenutzt über die Wärmeempfindlichkeit von extrazellularem PLA₂ gegenüber den physikalischen Eigenschaften des Trägerli posoms. Im Gegensatz zu dem Fall, wo der thermische Effekt nur durch eine lokale Temperaturerhöhung unter Nutzung von externen Heizquellen an einem vorher bestimmten Tumorort einer gewissen minimalen Größe erzielt werden kann, wird die PLA₂-gesteuerte Freisetzung überall dort verstärkt werden, wo Temperatur und extrazellulare PLA₂ Konzentration erhöht sind, zum Beispiel in entzündetem Gewebe, unabhängig von der Größe des erkrankten Bereiches und ohne dass es erforderlich ist, vorher das erkrankte Gewebe zu lokalisieren.
DPPC, DCPC, D-O-SPC und DPPE-PEG₂₀₀₀ waren erhältlich von Avanti Polar Lipids. Gereinigtes Schlangengift PLA₂ (Agkistrodon piscivorus piscivorus) war ein großzügiges Geschenk von Dr. R. L. Biltonen. Dieses PLA2 Enzym gehört zu der Klasse der sekretorischen Enzyme mit niedrigem Molekulargewicht, 14 kD, welche eine strukturelle Ähnlichkeit mit menschlicher extrazellularer Phospholipase A₂ aufweisen. Multilamellare Ziel-Liposome beim Vorliegen von fluoreszierendem Calcein in einer selbstlöschenden Konzentration von 20 mM wurden hergestellt, indem ein Film von D-O-SPC in einer HEPES Pufferlösung bei pH = 7,5 eine Stunde bei 10°C oberhalb der Phasenübergangstemperatur T_m = 55°C hydriert wurde. Unilamellare Liposome wurden hergestellt, indem die multilamellaren Liposome zehn Mal durch zwei gestapelte 100 nm Polykarbonatfilter extrudiert wurden. Die unilamellaren Liposome wurden schnell auf eine Temperatur unterhalb der Übergangstemperatur abgekühlt, und die calceinenthaltenden Liposome wurden vom freien Calcein unter Nutzung einer mit Sephadex G-50 gepackten Chromatografie- Säule getrennt. Die unilamellaren Trägerliposome von DPPC, DCPC und DPPE-PEG₂₀₀₀ wurden in einer ähnlichen Weise (T_m = 41°C) zubereitet. Die Calceinfreisetzung aus den Ziel-Liposomen wird bestimmt durch das Messen der Fluoreszenzintensität bei 520 nm nach Erregung bei 492 nm. Alle Messungen werden vorgenommen bei Temperaturen, bei denen die Lipide sowohl der Trägerliposome als auch der Ziel-Liposome im Gelzustand sind.
Beispiel 10
Analyse der von der Phospholipase A₂ Konzentration abhängigen Freisetzung
Multilamellare 1-O-DPPC-Liposome mit 10 Mol% 1-Q-DPPE-PEG350 werden hergestellt beim Vorliegen von fluoreszierendem Calcein in einer selbstlöschenden Kon zentration von 20 mM, indem ein Film von 90 % 1-O-Hexadecyl-2-hexa-decanoyl-sn-glycero-3-Phosphocholin und 10 % 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-Phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglycol)-350] in einer HEPES Pufferlösung bei pH = 7,5 eine Stunde bei 10°C oberhalb der Phasenübergangstemperatur hydriert wurde. Unilamellare Liposome wurden hergestellt, indem die multilamellaren Liposome zehn Mal durch zwei gestapelte 100 nm Polykarbonatfilter extrudiert wurden. Die unilamellaren Liposome wurden schnell auf eine Temperatur unterhalb der Übergangstemperatur abgekühlt, und die calceinenthaltenden Liposome wurden vom freien Calcein unter Nutzung einer mit Sephadex G-50 gepackten Chromatografie-Säule getrennt.
Die Analysebedingungen für die durch PLA₂ herbeigeführte Calceinfreisetzung waren 25 μM unilamellare Liposome, 50, 1 und 0,02 nM PLA₂, 150 mM KCL, 10 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM NaN₃, 30 μM CaCl₂ und 10 μM EDTA. PLA₂ wurde zu 2,5 ml der temperaturgeregelten Lipidsuspension, ausgeglichen über zumindest 300 Sek. bei 35,5°C vor der Hinzufügung von PLA₂, hinzugefügt. Der Prozentsatz des freigesetzten Calceins wird bestimmt als: % Freisetzung = 100 × (I_F(t)-I_B)/(I_T-IB), wobei I_F(t) die gemessene Fluoreszenz zum Zeitpunkt t nach dem Hinzufügen des Enzyms ist, I_B die Hintergrundfluoreszenz ist und I_T die Gesamtfluoreszenz ist, gemessen nach dem Hinzufügen von Triton X-100, was zur vollständigen Freisetzung von Calcein durch das Aufbrechen der 1-O-DPPC Liposome führt. 13 zeigt, dass die herbeigeführte Freisetzung von Calcein am langsamsten war, wenn nur 0,02 nM PLA₂ der Liposomsuspension hinzugefügt wurde.
Beispiel 11
Zubereitung von ultraflexiblen Liposomen
Ultraflexible Liposome werden hergestellt durch die Auflösung einer 0,08-0,32 mmol Prodrugmonoetherlipid-(1-O-Lipid) Mischung, mit einer ähnlichen Zusammensetzung, wie sie bei Soja-phosphatidylcholinmischungen gefunden wird, in 80-320 μl absolutem Ethanol und das Hinzufügen von zunehmenden Mengen von Ölsäure, um 18 Proben mit einem Verhältnis von molaren Lipid/grenzflächenaktivem Stoff (L/S), beginnend bei L/S = 0,4 und ansteigend um 0,2 Einheiten auf L/S = 4. Nach dem gründlichen Mischen der Lipide und der grenzflächenaktiven Stoffe werden 5 ml von 10 mM HEPES Puffer (pH = 7,5-8,0) jeder der Lipidproben hinzugefügt, und die Mischungen werden 24 Stunden bei 4-10°C inkubiert. Die ausgebildeten Liposome werden fünf Mal durch zwei gestapelte Polykarbonatfilter mit einer 0,5 μm Porengröße extrudiert, wie beschrieben von Mayer et al, Biochim. Biophys. Acta, 858, 161-168, und sie können sich dann 24 Stunden bei 4-10°C ausgleichen, ehe die Größe durch dynamische Lichtstreuung unter Nutzung eines Malver Master Sizer gemessen wird. Es wird erwartet, dass die Größe der Vesikel 300-400 nm ist, und dass sie relativ unabhängig vom L/S-Verhältnis ist.
Der Durchdringungswiderstand der ultraflexiblen Liposome wird bestimmt, indem der relative Druck gemessen wird, der benötigt wird, um die ultraflexiblen Liposome durch einen 0,2 μm Polykarbonatfilter hindurch zu drücken. Es wird erwartet, dass der relative Druck als eine Funktion des Verhältnisses Lipid/grenzflächenaktiver Stoff innerhalb des Bereiches von 1 bis 10 MPa variiert. Es wird erwartet, dass Zubereitungen mit einem L/S-Verhältnis von zirka 0,5 fast vollkommen durchdringbar sind, mit einem Durchdringungswiderstand ähnlich dem von reinem Wasser.
Beispiel 12
Hydrolyse von negativ geladenen Liposomen durch Phospholipase A2 in zellfreier Ratten-Peritonealflüssigkeit
Zellfreie Peritonealflüssigkeit der Ratte mit einer durch Casein herbeigeführten akuten Entzündung wurde zubereitet, indem 5 ml von 1 %-igem Natriumcaseinat in die Perionealhöhle einer männlichen SRPD Ratte mit einem Gewicht von 250-260 g injiziert wurde. Die Ratte wurde geopfert durch Ausbluten nach 24 Stunden, und die Entzündungsflüssigkeit wurde aus dem Peritoneum entnommen und bei 1500 G 20 Minuten lang zentrifugiert, um eine zellfreie Peritonealflüssigkeit zu erhalten.
Negativ geladene vollständig hydrierte unilamellare Liposome mit einer engen Größenverteilung wurden zubereitet aus 89 Mol% di-hexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoglycerol (DPPG), 10 Mol% 1-O-Hexadecyl-2-hexadecanoyl-sn-glycero-3-Phosphoethanolamin-N-[methoxy(polyethylenglycol)-350) (1-O-DPPE-PEG350) und 1 Mol% 1,2-bis-(1-pyrenedecanoyl)-sn-glycero-3-phosphocholin (bis-py-DPC). Bis-py-DPC ist ein PLA₂ Substrat mit zwei benachbarten Pyrenfluorphoren, welche Dimere(Eximere) im erregten Zustand ausbilden, die bei Erregung bei 342 nm bei 470 nm emittieren. Durch Phospholipase katalysierte Hydrolyse trennt die zwei Fluorophore, die dann bei 380 nm (Monomere) emittieren.
14 zeigt die Emissionsspektren, die nach Erregung bei 342 nm von bis-py-DPC, inkorporiert in negativ geladene Liposome (0,100 mM), erhalten wurden, vor und nach dem Hinzufügen von 100 nM PLA₂ (Agkistrodon piscivorus piscivorus). Die beobachteten Änderungen im Emissionsspektrum nach der durch Phospholipase herbeigeführten Hydrolyse werden bei einem durchgängigen Versuch genutzt, wobei die Eximeremission bei 470 nm gleichzeitig mit der Monomeremission bei 380, bei Erregung bei 342 nm gemessen wird. 15 zeigt das Reaktionszeitprofil von der durch Ratten-Phospholipase A₂ katalysierten Hydrolyse der negativ geladenen Liposome. Die katalytische Reaktion wurde eingeleitet durch das Hinzufügen von zellfreier Peritonealflüssigkeit zu 2,5 ml einer temperaturgeregelten Liposomsuspension, ausgeglichen über 60 Sek. vor dem Hinzufügen von PLA₂. Das charakteristische Lag-Burst-Verhalten der Phospholipase wird signalisiert durch eine plötzliche Erhöhung der Monomerfluoreszenz bei 380 nm und einer nachfolgenden Verringerung der Eximerfluoreszenz, wie im Einsatz bei 15 gezeigt wird.
Die Versuchsbedingungen für das PLA₂ Reaktionszeitprofil, das in 15 gezeigt wird, waren: 0,100 mM unilamellare negativ geladene Liposome, 100 μl unverdünnte zellfreie Peritonealflüssigkeit, 10 mM HEPES (pH 7,5), 5 mM CaCl₂ und 150 mM NaCl.

Claims

Verwendung eines auf Lipiden basierenden Arzneistoffabgabesystems für die Zubereitung eines Medikaments für die Behandlung oder die Verhinderung der Behandlung von Krankheiten oder Leiden, die mit einer lokalisierten Erhöhung der extrazellularen PLA₂-Tätigkeit im kutanen oder subkutanen Gewebe eines Säugetiers verbunden sind, in Form eines Liposoms für die Verabreichung eines Arzneiwirkstoffs, ausgewählt aus Lysolipid-Derivaten, wobei das System eine randaktive Verbindung umfasst und der Arzneiwirkstoff im auf Lipiden basierenden System in Form einer Prodrug vorliegt, wobei die Prodrug ein Lipidderivat ist mit (a) einer aliphatischen Gruppe mit einer Länge von zumindest 7 Kohlenstoffatomen und einem organischen Radikal mit zumindest 7 Kohlenstoffatomen und (b) einem hydrophilen Anteil, wobei die Prodrug des Weiteren ein Substrat für extrazellulare PLA₂ dergestalt ist, dass das organische Radikal hydrolytisch abgetrennt werden kann, während die aliphatische Gruppe im Wesentlichen unbeeinträchtigt bleibt, wodurch der Arzneiwirkstoff in Form eines Lysolipid-Derivats freigesetzt wird, das kein Substrat für Lysophospholipase ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das organische Radikal, welches hydrolytisch abgetrennt werden kann, ein Arzneihilfsstoff oder ein Wirksamkeitsveränderer für den Arzneiwirkstoff ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei die Prodrug ein Lipidderivat mit folgender Formel ist:
wobei X und Z unabhängig aus O, CH₂, NH, NMe, S, S(O) und S(O)₂ ausgewählt werden; Y -OC(O)- ist, Y dann mit R² entweder über das Sauerstoff- oder das Carbonylkohlenstoffatom verbunden wird; R¹ eine aliphatische Gruppe der Formel Y¹Y² ist; R² ein organisches Radikal mit zumindest 7 Kohlenstoffatomen ist; wobei Y¹ -(CH₂)_n1-(CH=CN)_n2-(CN₂)_n3-(CH=CN)_n4-(CN₂)_n5-(CH=CN)_n6-(CN₂)_n7-(CH=CN)_n8-(CH₂)_n9 ist und die Summe von n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 eine Ganzzahl von 9 bis 29 ist; n1 Null oder eine Ganzzahl von 1 bis 29 ist, n3 Null oder eine Ganzzahl von 1 bis 20 ist, n5 Null oder eine Ganzzahl von 1 bis 17 ist, n7 Null oder eine Ganzzahl von 1 bis 14 ist und n9 Null oder eine Ganzzahl von 1 bis 11 ist; und jede von n2, n4, n6 und n8 unabhängig Null oder 1 ist; und Y² CH₃ oder CO₂H ist; wobei jedes Y¹-Y² unabhängig durch Halogen oder C_1-4-Alkyl ersetzt werden kann, R³ ausgewählt wird aus Phosphatidsäure (PO₂-OH), Derivaten von Phosphatidsäure und Bioisosteren zu Phosphatsäure und Derivaten derselben.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei R² eine aliphatische Gruppe mit einer Länge von zumindest 7 Kohlenstoffatomen ist.
Verwendung nach Anspruch 4, wobei R² eine Gruppe der Formel Y¹Y² ist.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Prodrug 15-100 Mol% des gesamten dehydrierten auf Lipiden basierenden Systems darstellt.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, die in Form von Liposomen erfolgt, wobei ein zweiter Arzneistoff inkorporiert ist.
Verwendung eines auf Lipiden basierenden Arzneistoffabgabesystems für die Zubereitung eines Medikaments für die Behandlung oder die Verhinderung der Behandlung von Krankheiten oder Leiden, die mit einer lokalisierten Erhöhung der extrazellularen PLA₂-Tätigkeit im kutanen oder subkutanen Gewebe eines Säugetiers verbun den sind, in Form eines Liposoms für die Verabreichung eines zweiten Arzneistoffes, wobei das System eine grenzaktive Verbindung umfasst, und der zweite Arzneistoff in das System inkorporiert ist und das System Lipidderivate einschließt, die (a) eine aliphatische Gruppe mit einer Länge von zumindest 7 Kohlenstoffatomen und einen organischen Radikal mit zumindest 7 Kohlenstoffatomen und (b) einen hydrophilen Anteil aufweisen, wobei das Lipidderivat des Weiteren ein Substrat für extrazellulare PLA₂ dergestalt ist, dass das organische Radikal hydrolytisch abgetrennt werden kann, während die aliphatische Gruppe im Wesentlichen unbeeinträchtigt bleibt, so dass das Ergebnis ein organisches Säurefragment oder ein organisches Alkoholfragment und ein Lysolipidfragment ist und das Lysolipidfragment kein Substrat für Lysophospholipase ist.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das organische Radikal, welches hydrolytisch abgetrennt werden kann, ein Arzneihilfsstoff oder ein Wirksamkeitsveränderer für den zweiten Arzneistoff ist.
Verwendung nach den Ansprüchen 8-9, wobei das Lipidderivat ein Lipidderivat mit folgender Formel ist:
wobei X und Z unabhängig aus O, CH₂, NH, NMe, S, S(O) und S(O)₂ ausgewählt werden; Y -OC(O)- ist, Y dann mit R² entweder über das Sauerstoff- oder das Carbonylkohlenstoffatom verbunden wird; R¹ eine aliphatische Gruppe der Formel Y¹Y² ist; R² ein organisches Radikal mit zumindest 7 Kohlenstoffatomen ist; wobei Y¹ -(CH₂)_n1-(CH=CH)_n2-(CH₂)_n3-(CH=CH)_n4-(CH₂)_n5-(CH=CH)_n6-(CH₂)_n7-(CH=CH)_n8-(CH₂)_n9 ist und die Summe von n1+2n2+n3+2n4+n5+2n6+n7+2n8+n9 eine Ganzzahl von 9 bis 29 ist; n1 Null oder eine Ganzzahl von 1 bis 29 ist, n3 Null oder eine Ganzzahl von 1 bis 20 ist, n5 Null oder eine Ganzzahl von 1 bis 17 ist, n7 Null oder eine Ganzzahl von 1 bis 14 ist und n9 Null oder eine Ganzzahl von 1 bis 11 ist; und jede von n2, n4, n6 und n8 unabhängig Null oder 1 ist; und Y² CH₃ oder CO₂H ist; wobei jedes Y¹-Y² unabhängig durch Halogen oder C_1-4-Alkyl ersetzt werden kann, R³ ausgewählt wird aus Phosphatidsäure (PO₂-OH), Derivaten von Phosphatidsäure und Bioisosteren zu Phosphatsäure und Derivaten derselben.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei R² eine aliphatische Gruppe mit einer Länge von zumindest 7 Kohlenstoffatomen ist.
Verwendung nach Anspruch 11, wobei R² eine Gruppe der Formel Y¹Y² ist.
Verwendung nach einem der Ansprüche 8-12, wobei das Lipidderivat 15-100 Mol% des gesamten dehydrierten Systems darstellt.
Verwendung nach einem der Ansprüche 7-13, wobei der zweite Arzneistoff ein therapeutischer und/oder prophylaktischer Wirkstoff ist, ausgewählt aus (i) Antitumormitteln, (ii) Antibiotika und Mitteln gegen Pilzbefall und (iii) entzündungshemmenden Mitteln.
Verwendung nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei die Hautkrankheiten oder Hautleiden ausgewählt werden aus der Gruppe, bestehend aus entzündlichen Hautleiden, Hautkrebs und Leiden, hervorgerufen durch eine Infektion der Haut.
Verwendung nach Anspruch 15, wobei die entzündlichen Hautleiden ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus entzündlichen Hautkrankheiten, wie zum Beispiel Psoriasis, Pityriasis rosea, Ichthyosis vulgaris, Prurigo nodularis, Neurodermatitis, Lichen planus, Alopecia, Erythema multiforme, Erythema nodosum, Lupus, Dermatomyositis, Morphoea, Pemphigus, Pemphigoid, Pyoderma gangrenosum, Urticaria, atopische Dermatitis und Ekzeme.
Verwendung nach Anspruch 15 und 16, wobei die Erhöhung der extrazellularen PLA₂-Tätigkeit zumindest 25 % im Vergleich zum normalen Grad der Tätigkeit im entsprechenden Teil der Haut ausmacht.
Verwendung des in einem der vorangehenden Ansprüche beschriebenen auf Lipiden basierenden Abgabesystems für die Zubereitung einer topischen Zusammensetzung.
Verwendung des in einem der vorangehenden Ansprüche beschriebenen auf Lipiden basierenden Abgabesystems, wobei die topische Zusammensetzung eine kosmetische Zusammensetzung ist.