DE60126771T2

DE60126771T2 - Stress-gekoppeltes gtp-bindende protein und dessen verwendung in pflanzen

Info

Publication number: DE60126771T2
Application number: DE60126771T
Authority: DE
Inventors: Oswaldo Apex DA COSTA E SILVA; Hans J. Champaign BOHNERT; Nocha Cary VAN THIELEN; Ruoying Apex CHEN
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2001-04-06
Publication date: 2007-11-15
Anticipated expiration: 2021-04-07
Also published as: US20090138987A1; EP1335986B1; US20040199946A1; CA2405721A1; ATE354666T1; EP1311693A2; EP1881073A3; EP1881073B1; US7514599B2; DE60131772D1; ES2272466T3; US7858847B2; US7259294B2; US7521598B2; US7425666B2; ATE380248T1; EP2357242A1; CA2767275A1; EP1335986A2; US20100011466A1

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft allgemein Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine kodieren, welche mit abiotischen Stressantworten und abiotischer Stresstoleranz in Pflanzen verbunden sind. Im Besonderen betrifft diese Erfindung Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine kodieren, welche Pflanzen eine Trocken- und/oder Frost-Toleranz verleihen.
Hintergrund
Abiotischer Umweltstress, wie beispielsweise Trockenstress, Salzstress, Hitzestress und Kältestress, stellen die Hauptlimitierungsfaktoren für das Pflanzenwachstum und die Ertragsfähigkeit dar. Ernteeinbußen und Ernteertragsverluste von Hauptanbaupflanzen wie Reis, Mais („Korn") und Weizen, die durch diese Belastungen verursacht werden, repräsentieren einen signifikanten ökonomischen und politischen Faktor und tragen zu Nahrungsmittelknappheiten in vielen unterentwickelten Ländern bei.
Pflanzen sind normalerweise während ihres Lebenszyklus den Bedingungen eines verringerten Umweltwassergehaltes ausgesetzt. Die meisten Pflanzen haben Strategien entwickelt, um sich selbst gegen diese Austrocknungsbedingungen zu schützen. Werden jedoch Strenge und Dauer der Trockenperioden zu groß, sind die Auswirkungen auf Pflanzenentwicklung, Wachstum und Ertrag der meisten Anbaupflanzen schwerwiegend. Des Weiteren sind die meisten der Anbaupflanzen sehr anfällig auf hohe Salzkonzentrationen in der Erde. Ein andauerndes Aussetzen gegenüber Trockenheit und Hochsalz verursacht große Veränderungen im Pflanzenstoffwechsel. Diese großen Änderungen im Stoffwechsel führen schließlich zum Zelltod und folglich zu Ertragsverlusten.
Die Entwicklung von stresstoleranten Pflanzen ist eine Strategie, welche die Möglichkeit bietet, zumindest einige dieser Probleme zu lösen oder zu vermitteln. Traditionelle Pflanzenzucht-Strategien, um neue Pflanzenlinien zu entwickeln, welche eine Resistenz (Toleranz) gegenüber diesen Stresstypen aufweisen, sind jedoch relativ langsam und benötigen spezifische resistente Linien zur Kreuzung mit der gewünschten Linie. Begrenzte Protoplasma Ressourcen für Stresstoleranz und Inkompatibilität bei Kreuzungen zwischen entfernt verwandten Pflanzenspezies stellen signifikante Probleme dar, die man in der konventionellen Zucht antrifft.
Zusätzlich zu den zellulären Prozessen, die zu Trocken-, Kälte- und Salztoleranz im Modell führen, sind Trocken- und/oder salztolerante Pflanzen komplexer Natur und umfassen mehrere Mechanismen der zellulären Anpassung und zahlreiche Stoffwechselwege. Diese Mehr-Komponenten Beschaffenheit der Stresstoleranz hat nicht nur die Toleranzzüchtung weitestgehend erfolglos gemacht, sonders hat auch die Möglichkeit begrenzt, stresstolerante Pflanzen unter Verwendung biotechnologischer Methoden gentechnisch zu konstruieren.
Was deshalb nötig ist, ist die Identifikation der Gene und Proteine in diesen, zur Stresstoleranz führenden, Mehrkomponenten-Prozessen. Die Aufklärung der Funktion von Genen, die in stresstoleranten Pflanzen exprimiert werden, wird nicht nur unser Verständnis der Pflanzenanpassung und Toleranz gegenüber Umweltstress verbessern, sondern könnte auch wichtige Informationen für das Entwerfen neuer Strategien zur Ertragsverbesserung liefern.
Es gibt mindestens vier verschiedene Signaltransduktionswege, welche zur Stresstoleranz in der Modellpflanze Arabidobsis thaliana führen. Diese Wege sind unter der Kontrolle verschiedener Transkriptionsfaktoren, Proteinkinasen, Proteinphosphatasen und anderen Signaltransduktionsweg-Komponenten (Shinozaki et al. 2000 Curr, Op. Pl. Biol. 3:217-23). Diese Proteine stellen ideale Ziele für das Erzeugen von Stresstoleranz dar, da sie als Hauptschalter fungieren könnten; Veränderungen in einem einzelnen Gen würden zur Aktivierung einer gesamten Signalübertragungskette, die zur Stresstoleranz führt, führen.
Das Wahrnehmen von osmotischem Stress in Bakterien sowie in Pflanzen wird von einem Zwei-Komponenten System durchgeführt, welches ein Sensor-Protein und ein Effektor-Protein umfasst (Wurgler-Murphy SM and Saito S. 1997 Trends in Biochem. Sci. 22:172-6 and Shinozaki et al. 2000. Curr. Op. Pl. Biol. 3:217-23). Mitogen-aktivierte Proteinkinase-abhängige Signaltransduktionswege sind in diese Prozesse stark involviert. Eine weitere Hauptkomponente dieser Signalübertragungsketten sind GTP-bindende Proteine (G-Proteine). Im Allgemeinen gibt es mindestens drei G-Protein-Klassen: a) Heterotrimere (Alpha, Beta und Gamma Untereinheiten), b) Monomere (kleine) Proteine und c) Dyanine. GTP-bindende Proteine werden so genannt, weil jedes GTP binden muss, um aktiv zu sein. Die Funktionen von GTP-bindenden Proteinen variieren im Bereich von einer direkten Übertragung eines externen Signals (wenn mit einem Membrangebundenen Rezeptor assoziert), über eine Beteiligung am Vesikelverkehr, bis zum Import von Proteinen in subzelluläre Kompartimente.
Die Mitwirkung von trimeren G-Proteinen an der Stresstoleranz wurde bisher noch nicht direkt gezeigt. Da sie jedoch mit Membran-gebundenen Rezeptoren assoziert sind, könnten sie in der Übertragung des wahrgenommenen Stresssignals, das zur Stresstoleranz führt, beteiligt sein. Die Bindung eines Liganden an einen Rezeptor könnte möglicherweise die Aktivierung der Alpha-Untereinheit verursachen und dadurch die Konzentration eines zweiten Botenstoffes („second messenger") mit niedrigem Molekulargewicht verändern. Veränderungen in den Konzentrationen der zweiten Botenstoffe, wie cAMP in Tiersystemen, aktivieren schließlich weitere Komponenten des Signaltransduktionswegs, weshalb die zweiten Botenstoffe wie Inositol-Derivate, mit Stresstoleranz in Pflanzen in Verbindung gebracht worden sind (Ishitani et al. 1996 Pl Journal 9:537-48).
Monomere/kleine G-Proteine sind ebenfalls in viele verschiedene zelluläre Prozesse involviert, weshalb sie mit Vesikelverkehr/-transport, Zellzyklus und Proteinimport in Organellen in Verbindung gebracht worden sind. Verschiedene Gruppen haben kleine G-Proteine identifiziert, die homolog zu der Rab-Familie von kleinen G-Proteinen sind, die nach Austrocknungs-Behandlungen in Pflanzen induziert werden (Bolte et al. 2000 Plant Mol. Biol. 42:923-36; O'Mahony and Oliver 1999 Plant Mol. Biol. 39:809-21). Diese Forscher spekulieren, dass die kleinen G-Proteine in der Erhaltung der Membranintegrität oder Restrukturierung nach der Stressentlastung involviert sein könnten. Sie haben jedoch keine transgenen Pflanzen mit erhöhter Stresstoleranz durch Überexpression dieser kleinen G-Proteine produziert.
Eine andere Klasse von G-Proteinen sind die G-Proteine mit hohem Molekulargewicht. Dynamine sind ein charakteristisches Mitglied dieser Klasse. Es wurden verschiedene Homologe von hochmolekularen G-Proteinen in einer Anzahl von eukaryotischen Systemen, einschließlich Hefe, Mensch, Ratte und Maus, und in Pflanzen-Systemen einschließlich Arabidobsis thaliana, Nicotiana tabacum und Glycine max identifiziert. Obwohl Sequenz und vorgeschlagene Funktionen der verschiedenen Homologe unterschiedlich sind, scheinen sie alle im Proteinverkehr zu fungieren; wahrscheinlich helfen sie bei der Vesikelbildung mit. Das bis heute am gründlichsten charakterisierte Dynamin wurde aus der Ratte isoliert und es wurde gezeigt, dass es an Mikrotubuli bindet und an der Endozytose teilnimmt, während es durch Phosphorylierung reguliert wird (Robinson et al. 1993 Nature 365:163-166). Es wurde zusätzlich herausgefunden, dass Pflanzen-Dynamin, isoliert aus Glycine max, über die gesamte Breite der neu gebildeten Zellmembran während der Zytokinese lokalisiert ist, was eine Rolle des Proteins bei der Ablagerung von Zellmembran-Material durch Exozytosevesikel vermuten lässt (Gu & Verma 1996. EMBO J. 15:695-704). Es wurde gezeigt, dass das Protein ADL1, isoliert aus Arabidopsis, bei einer Sub-Organellfraktionierung von Chloroplasten aus Blättern an den Thylakoid-Membranen lokalisiert ist. Transgene Pflanzen, die eine Mutantenform dieses Gens überexprimieren, zeigen eine verringerte Anzahl an Chloroplasten, wobei diese existierenden Chloroplasten eine verringerte Anzahl an Thylakoiden und Thylakoid-Membranproteinen aufwiesen. Diese Daten deuten eine Rolle von ADL1 im Transport von Proteinen an, die für die Biogenese von Thylakoidmembranen benötigt werden (Park et al. 1998 EMBO J. 17:859-867). Solch ein weiteres Homolog, DMN1, das in Saccharomyces cerevisiae gefunden wurde, nimmt auch an der Endozytose teil, wobei es auf einer neuen Stufe vor der Fusion mit dem Spät-Endosom agiert (Gammie et al. 1995. J. Cell Biol. 130:553-566). Jedoch wurde trotz dieser Forschung die Teilnahme von Dynaminen an der Stresstoleranz nicht gezeigt.
Daher besteht ein bedarf daran, die Gene zu identifizieren, die in stresstoleranten Pflanzen exprimiert werden, welche die Fähigkeit haben, der jeweiligen Wirtspflanze und anderen Pflanzenarten eine StressResistenz zu verleihen. Neu erzeugte stresstolerante Pflanzen werden viele Vorteile haben. Beispielsweise kann der Schwankungsbereich, in dem die Erntepflanzen kultiviert werden können, erhöht werden. Zum Beispiel kann der Wasserbedarf einer Pflanzenart reduziert werden.
Überblick über die Erfindung
Diese Erfindung erfüllt teilweise das Bedürfnis, neue, einzigartige GTP-bindende Proteine zu identifizieren, die geeignet sind, nach Überexpression Pflanzen eine Stresstoleranz zu verleihen. Die vorliegende Erfindung stellt eine transgene Pflanzenzelle, transformiert mit einer GTP-bindendes Stress-spezifisches Protein (GBSRP) kodierenden Nukleinsäure, bereit, worin das GBSRP aus einer Gruppe, bestehend aus einem Polypeptid, definiert in SEQ ID NO:11 und einem Polypeptid, das mindestens 95% Sequenzidentität mit einem Polypeptid von SEQ ID NO:11 über seine gesamte Länge aufweist, ausgewählt wird und worin die Expression der Nukleinsäuresequenz in der Pflanzenzelle, verglichen mit der Wildtyp-Varietät der Pflanzenzelle, zu einer erhöhten Toleranz der Pflanzenzelle gegenüber Trockenstress und/oder Froststress, führt. Namentlich hierin beschrieben sind die G-Proteine: 1) GTP-bindendes Protein-1 (GBP-1) aus Physcomitrella patens.
Die Erfindung stellt in einigen Ausführungsformen bereit, dass das GBSRP und die kodierende Nukleinsäure diejenigen sind, die in Mitgliedern der Gattung Physcomitrella gefunden wurden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die Nukleinsäure und das Protein aus Physcomitrella patens. Diese Erfindung stellt bereit, dass der Umweltstress Trocken- und Temperaturstress sein kann, oder Kombinationen davon sein können. Im Besonderen ist der Umweltstress Trockenheit oder Kälte.
Die Erfindung stellt weiterhin einen Samen bereit, der von einer transgenen Pflanze produziert wird, die mit einer GBSRP kodierenden Nukleinsäure, wie oben beschrieben, transformiert ist, worin der Samen sortenecht für eine, verglichen mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanzenzelle, erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress ist. Die Erfindung stellt weiterhin einen Samen bereit, der von einer transgenen Pflanze produziert wird, die ein GBSRP, wie oben beschrieben, exprimiert, worin der Samen sortenecht für eine, verglichen mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanzenzelle, erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress ist.
Die Erfindung stellt weiterhin die Verwendung einer der oben beschriebenen transgenen Pflanzen oder Samen für die Erzeugung eines agrarwirtschaftlichen Produktes bereit. Die Erfindung stellt weiterhin ein isoliertes GBSRP, wie oben beschrieben, bereit. Die Erfindung stellt weiterhin eine isolierte GBSRP kodierende Nukleinsäure bereit, worin die GBSRP kodierende Nukleinsäure für ein GBSRP, wie oben beschrieben, kodiert.
Die Erfindung stellt weiterhin einen isolierten rekombinanten Expressionsvektor bereit, der eine GBSRP kodierende Nukleinsäure, wie oben beschrieben, umfasst, worin die Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle, verglichen mit einer Wildtyp-Varietät der Wirtszelle, zu einer erhöhten Toleranz gegenüber Trockenstress und/oder Froststress in einer Wirtszelle führt.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Produktion einer transgenen Pflanze mit einer GBSRP kodierenden Nukleinsäure, wie oben beschrieben, bereit, worin die Expression der Nukleinsäure in der Pflanze zu einer, verglichen mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanze, erhöhten Toleranz der Pflanzenzelle gegenüber Trockenstress und/oder Froststress führt, umfassend: (a) Transformation einer Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor, der eine GBSRP kodierende Nukleinsäure, wie oben beschrieben, umfasst, und (b) Erzeugung einer transgenen Pflanze aus der Pflanzenzelle mit einer, verglichen mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanze, erhöhten Toleranz gegenüber Trockenstress und/oder Froststress.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Modifizierung von Stresstoleranz einer Pflanze bereit, umfassend das Modifizieren der Expression eines GBSRP in einer Pflanze, worin das GBSRP wie oben beschrieben ist. Die Erfindung stellt bereit, dass dieses Verfahren so ausgeführt werden kann, dass die Stresstoleranz entweder erhöht oder verringert werden kann. Vorzugsweise ist die Stresstoleranz in einer Pflanze durch Erhöhung der Expression von einem GBSRP erhöht.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1(A-E) zeigt die partiellen cDNA-Sequenzen von GBP-1 (SEQ ID NO:1), GBP-2 (SEQ ID NO:2), GBP-3 (SEQ ID NO:3), GBP-4 (SEQ ID NO:4) und GBP-5 (SEQ ID NO:5) von Physcomitrella patens.
2(A-E) zeigt die vollständigen cDNA-Sequenzen von GBP-1 (SEQ ID NO:6), GBP-2 (SEQ ID NO:7), GBP-3 (SEQ ID NO:8), GBP-4 (SEQ ID NO:9) und GBP-5 (SEQ ID NO:10) von Physcomitrella patens.
3(A-E) zeigt die abgeleiteten Aminosäuresequenzen von GBP-1 (SEQ ID NO:11), GBP-2 (SEQ ID NO:12), GBP-3 (SEQ ID NO:13), GBP-4 (SEQ ID NO:14) und GBP-5 (SEQ ID NO:15) von Physcomitrella patens.
4 zeigt ein Schema des Pflanzenexpressionsvektors pBPSSC022, der den Super-Promotor enthält, der die Expression der SEQ ID NO's: 6, 7, 8, 9 und 10 („gewünschtes Gene") reguliert. Die Komponenten sind: NPTII Kanamycinresistenzgen (Hajdukiewicz et al. 1994 Pl. Mol Biol. 25:989-98), AtAct2-i Promotor (An et al. 1996 Plant J. 10: 107-21), OCS3 Terminator (Weigel et al. 2000 Pl. Physiol. 122:1003-13).
5 zeigt die Ergebnisse eines Trockenstress-Tests mit PpGBP-1 überexprimierenden transgenen Pflanzen und Wildtyp Arabidopsis Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp. Individuelle Transformanden-Linien werden gezeigt.
6 zeigt die Ergebnisse eines Trockenstress-Tests mit PpGBP-2 überexprimierenden transgenen Pflanzen und Wildtyp Arabidopsis Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp. Individuelle Transformanden-Linien werden gezeigt.
7 zeigt die Ergebnisse eines Trockenstress-Tests mit PpGBP-3 überexprimierenden transgenen Pflanzen und Wildtyp Arabidopsis Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp. Individuelle Transformanden-Linien werden gezeigt.
8 zeigt die Ergebnisse eines Trockenstress-Tests mit PpGBP-4 überexprimierenden transgenen Pflanzen und Wildtyp Arabidopsis Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp. Individuelle Transformanden-Linien werden gezeigt.
9 zeigt die Ergebnisse eines Froststress-Tests mit PpGBP-1 überexprimierenden transgenen Pflanzen und Wildtyp Arabidopsis Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp. Individuelle Transformanden-Linien werden gezeigt.
10 zeigt die Ergebnisse eines Froststress-Tests mit PpGBP-2 überexprimierenden transgenen Pflanzen und Wildtyp Arabidopsis Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp. Individuelle Transformanden-Linien werden gezeigt.
11 zeigt die Ergebnisse eines Froststress-Tests mit PpGBP-3 überexprimierenden transgenen Pflanzen und Wildtyp Arabidopsis Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp. Individuelle Transformanden-Linien werden gezeigt.
12 zeigt die Ergebnisse eines Froststress-Tests mit PpGBP-4 überexprimierenden transgenen Pflanzen und Wildtyp Arabidopsis Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp. Individuelle Transformanden-Linien werden gezeigt.
13 zeigt die Ergebnisse eines Froststress-Tests mit PpGBP-5 überexprimierenden transgenen Pflanzen und Wildtyp Arabidopsis Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp. Individuelle Transformanden-Linien werden gezeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung kann durch die Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung und den darin enthaltenen Beispielen leichter verstanden werden. Es ist zu verstehen, dass die hierin verwendeten Fachausdrücke nur dem Zweck der Beschreibung spezifischer Ausführungsformen dienen und keine Beschränkungen beabsichtigen. Im Besonderen beschränkt die Bezeichnung der Aminosäuresequenzen als Protein „GTP-bindende stress-spezifische Proteine" (GBSRPs), in keiner Weise die Funktionalität dieser Sequenzen.
Die vorliegende Erfindung stellt eine transgene Pflanzenzelle bereit, die mit einer GBSRP kodierenden Nukleinsäure transformiert ist, worin das GBSRP ausgewählt wird aus einer Gruppe, bestehend aus aus einem Polypeptid, wie in SEQ ID NO:11 definiert und einem Polypeptid, das eine mindestens 95%ige Sequenzidentität mit einem Polypeptid der SEQ ID NO:11 über seine gesamte Länge aufweist, und worin die Expression der Nukleinsäure in der Pflanzenzelle, verglichen mit der Wildtyp-Varietät der Pflanzenzelle, zu einer erhöhten Toleranz der Pflanzenzelle gegenüber Trockenstress und/oder Froststress führt. Die Erfindung stellt weiterhin eine transgene Pflanze einschließlich einer Pflanzenzelle, wie oben beschrieben, bereit. Es wird auch ein Pflanzensamen bereitgestellt, der von einer transgenen Pflanze, umfassend eine Pflanzenzelle wie oben beschrieben, produziert wird, worin der Samen sortenecht für eine, verglichen mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanzenzelle, erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress ist. Die Erfindung stellt auch den Verwendung einer transgenen Pflanze oder eines Samen wie oben beschrieben für die Erzeugung eines agrarwirtschaftlichen Produktes, bereit.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „Varietät" eine Gruppe von Pflanzen innerhalb einer Art, die konstante Eigenschaften teilen, die sie von der typischen Form und von anderen möglichen Varietäten innerhalb dieser Art trennen. Während sie mindestens ein unterscheidendes Merkmal besitzen, ist eine Varietät auch durch einige Abweichungen zwischen Individuen innerhalb der Varietät, vornehmlich basierend auf der Mendelschen Vererbung der Merkmale unter den Nachkommen nachfolgender Generationen, charakterisiert. Eine Varietät wird als „sortenecht" für ein bestimmtes Merkmal betrachtet, wenn sie genetisch homozygot für dieses Merkmal ist, in dem Ausmaß dass, wenn die sortenechte Varietät selbstbefruchtend ist, eine signifikante Menge an unabhängiger Segregation des Merkmals unter den Nachkommen nicht beobachtet wird. In der vorliegenden Erfindung wird das Merkmal durch die transgene Expression einer oder mehrerer DNA-Sequenzen, die in eine Pflanzen-Varietät eingeführt wurden, hervorgebracht.
Die vorliegende Erfindung beschreibt zum ersten Mal, dass das Physcomitrella patens GBSRP, GBP-1, zur Erhöhung einer Pflanzentoleranz gegenüber Trockenstress und/oder Froststress nützlich ist.
Das vorausgesagte Protein, das durch PpGBP-1 kodiert wird, ist einer besonderen Klasse eines kleinen Hefe G-Proteins, dem Sar-1 Protein (Davies C. 1994. Plant Mol. Biol. 24:525-31) ähnlich. Das Sar-1 ist in Hefe in den Transport von Vesiklen in das Endoplasmatische Retikulum involviert.
Die Überexpression dieser Proteinklasse kann die Stresstoleranz durch Erhaltung der Membranintegrität während dem Stressintervall erhöhen und die Membranrekonstruktion nach dem Stressende beschleunigen.
Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung isolierte GBSRPs bereit, die aus der Gruppe bestehend aus GBP-1 ausgewählt wurden. Im Besonderen wird das GBSRP ausgewählt aus einem GTP-bindenden Protein-1 (GBP-1), wie in SEQ ID NO:11 definiert, und Sequenzen, die eine mindestens 95%ige Identität über ihre gesamte Länge mit diesem aufweisen, sowie Homologe und Orthologe davon. Homologe und Orthologe der Aminosäuresequenzen sind nachstehend definiert.
Die GBSRPs der vorliegenden Erfindung werden vorzugsweise durch rekombinante DNA-Techniken erzeugt. Zum Beispiel wird ein Nukleinsäuremolekül, das für ein Protein kodiert, in einen Expressionsvektor (wie oben beschrieben) kloniert, der Expressionsvektor wird in eine Wirtszelle (wie oben beschrieben) eingeführt und das GBSRP wird in der Wirtszelle exprimiert. Das GBSRP kann dann von den Zellen durch ein geeignetes Reinigungssystem unter Verwendung von Standard-Protein-Reinigungstechniken isoliert werden. Alternativ zur rekombinanten Expression kann ein GBSRP Polypeptid oder Peptid unter Verwendung von Standard-Peptid-Synthesetechniken chemisch synthetisiert werden. Darüber hinaus kann das native GBSRP beispielsweise unter Verwendung eines anti-GBSRP-Antikörpers, welcher mittels Standardtechniken, die ein GBSRP oder Fragment davon nutzen, produziert werden kann, aus Zellen (zum Beispiel Physcomitrella patens) isoliert werden.
Die Erfindung stellt weiterhin eine isolierte GBSRP kodierende Nukleinsäure, wie oben beschrieben, bereit.
Im Besonderen wird die GBSRP kodierende Nukleinsäure von einer GTP-bindende Protein-1 (GBP-1) Nukleinsäure, wie in SEQ ID NO:6 definiert, und Sequenzen, die eine mindestens 80%ige Identität über ihre gesamte kodierende Region damit aufweisen, ausgewählt.
Homologe und Orthologe der Nukleinsäuresequenzen sind nachstehend definiert. In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Nukleinsäure und das Protein aus der Pflanzengattung Physcomitrella isoliert. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die Nukleinsäure und das Protein aus einer Physcomitrella patens (P. patens) Pflanze.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Umweltstress" auf jegliche suboptimale Wachstumsbedingungen und beinhaltet suboptimale Bedingungen, die mit Trocken- und Temperaturstress oder Kombinationen davon verbunden sind. Im Besonderen ist der Umweltstress Trockenheit oder Temperaturstress oder Kombinationen davon und im Besonderen kann er ein niedriger Wassergehalt oder eine niedrige Temperatur sein. Es ist auch zu verstehen, dass „ein" oder „eine", wie in der Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet, ein oder mehr bedeuten kann, abhängig vom Zusammenhang in welchem sie verwendet werden. Folglich, kann zum Beispiel unter Bezugnahme auf „eine Zelle", bedeuten, dass mindestens eine Zelle verwendet werden kann.
Wie ebenfalls hierin verwendet, beabsichtigen die Begriffe „Nukleinsäure" und „Nukleinsäuremolekül", DNA-Moleküle (zum Beispiel cDNA oder genomische DNA) und RNA Moleküle (zum Beispiel mRNA) und Analoge von DNA oder RNA, die unter Verwendung von Nukleotid-Analogen generiert wurden, einzuschließen. Dieser Begriff umfasst auch untranslatierte Sequenzen, die sowohl an den 3'- als auch an den 5'-Enden der kodierenden Region eines Gens lokalisiert sind: mindestens etwa 1000 Sequenz-Nukleotide stromaufwärts des 5'-Endes der kodierenden Region und mindestens etwa 200 Sequenz-Nukleotide stromabwärts des 3'-Endes der kodierenden Region des Gens. Das Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, ist jedoch vorzugsweise doppelsträngige DNA.
Ein „isoliertes" Nukleinsäuremolekül ist eines, das im Wesentlichen von anderen Nukleinsäuremolekülen, welche in der natürlichen Bezugsquelle der Nukleinsäure vorhanden sind, getrennt ist. Vorzugsweise ist eine „isolierte" Nukleinsäure frei von einigen der Sequenzen, die natürlicherweise die Nukleinsäure (d.h. Sequenzen die an den 5'- und 3'-Enden der Nukleinsäure lokalisiert sind) in der genomischen DNA des Organismus, aus welchem die Nukleinsäure stammt, flankieren. Zum Beispiel kann in verschiedenen Ausführungsformen das isolierte GBSRP Nukleinsäuremolekül weniger als etwa 5kb, 4kb, 3kb, 2kb, 1kb, 0.5kb oder 0.1kb an Nukleotidsequenzen enthalten, welche natürlicherweise das Nukleinsäuremolekül in der genomischen DNA der Zelle, aus welcher die Nukleinsäure stammt (zum Beispiel einer Physcomitrella patens Zelle), flankieren. Darüber hinaus kann ein „isoliertes" Nukleinsäuremolekül, wie zum Beispiel ein cDNA-Molekül, frei von Teilen des anderen zellulären Materials, mit dem es natürlicherweise verbunden ist, sein, oder frei von Kulturmedium sein, wenn es durch rekombinante Techniken produziert wird, oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien sein, wenn es chemisch synthetisiert wird.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, zum Beispiel ein Nukleinsäuremolekül, das die Nukleotidsequenz SEQ ID NO:6 aufweist, kann unter Verwendung von Standardtechniken der Molekularbiologie und der Sequenzinformation, die hierin bereitgestellt wird, isoliert werden. Zum Beispiel kann eine P. patens GBSRP cDNA aus einer P. patens Bibliothek unter Verwendung der gesamten oder eines Teils der Sequenz SEQ ID NO:1 isoliert werden.
Darüber hinaus kann ein Nukleinsäuremolekül, das den gesamten oder einen Teil der Sequenz SEQ ID NO:1 umfasst, durch die Polymerase-Kettenreaktion, unter Verwendung von Oligonukleotid-Primern, die basierend auf dieser Sequenz entworfen wurden, isoliert werden. Zum Beispiel kann mRNA von Pflanzenzellen (zum Beispiel durch das Guanidinium-Thiocyanat-Extraktionsverfahren von Chirgwin et al., 1979 Biochemistry 18:5294-5299) isoliert werden und cDNA kann durch die Verwendung von reverser Transkriptase (zum Beispiel Moloney MVL Reverse Transkriptase, erhältlich von Gibco/BRL, Bethesda, MD; oder AMV Reverse Transkriptase, erhältlich von Seikagaku Amerika, Inc., St. Petersburg, FL) aufbereitet werden. Synthetische Oligonukleotid-Primer für die Amplifizierung mittels Polymerase-Kettenreaktion können basierend auf der Nukleotidsequenz wie in SEQ ID NO:1 gezeigt, entworfen werden.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann durch die Verwendung von cDNA oder alternativ, genomischer DNA als Templat, und geeigneten Oligonukleotid-Primern gemäß Standard PCR Amplifikations-Techniken, amplifiziert werden. Das Nukleinsäuremolekül, das so amplifiziert wird, kann in einen geeigneten Vektor kloniert werden und durch DNA-Sequenz-Analyse charakterisiert werden. Weiterhin können Oligonukleotide, die einer GBSRP Nukleotidsequenz entsprechen, durch Standard-Synthese-Techniken, zum Beispiel unter Verwendung eines automatisierten DNA-Syntheseapparates, angefertigt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein isoliertes erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül die in SEQ ID NO:6 gezeigte Nukleotidsequenz.
Diese cDNAs umfassen Sequenzen, die für die GBSRPs (d.h. die in Tabelle 1 gezeigte „kodierende Region") kodieren, sowie die 5'-nichttranslatierten Sequenzen und 3'-nichttranslatierten Sequenzen. Es ist zu verstehen, dass SEQ ID NO:6 sowohl kodierende Regionen und 5'- und 3'-nichttranslatierte Regionen umfasst. Alternativ können die Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung nur die kodierende Region der in SEQ ID NO:6 gezeigten Sequenz umfassen oder sie können vollständige genomische Fragmente, isoliert aus genomischer DNA, enthalten. Eine kodierende Region dieser Sequenzen ist als „ORF-Position" angegeben.
Darüber hinaus kann das Nukleinsäuremolekül nur einen Teil der kodierenden Region der in SEQ ID NO:6 gezeigten Sequenz umfassen, zum Beispiel ein Fragment, welches als Sonde oder Primer oder als ein Fragment, das einen biologisch aktiven Teil eines GBSRPs kodiert, verwendet werden kann. Die Nukleotidsequenzen, die durch die Klonierung der GBSRP Gene aus P, patens bestimmt sind, erlauben die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Verwendung in der Identifizierung und/oder Klonierung GBSRP Homologer in anderen Zelltypen und Organismen sowie GBSRP Homologer aus anderen Moosen und verwandten Arten konstruiert werden.
Teile von Proteinen, die durch die erfindungsgemäßen GBSRP Nukleinsäuremoleküle kodiert werden, sind vorzugsweise biologisch aktive Teile eines der GBSRPs, die hierin bschrieben sind. Wie hierin verwendet, beabsichtigt der Begriff „biologisch aktiver Teil" eines GBSRPs einen Teil, zum Beispiel eine Domäne/ein Motiv eines GBSRP, die/das an einer Stresstoleranz-Reaktion in einer Pflanze teilnimmt und eine Aktivität wie in Tabelle 1 aufweist, oder an der Transkription eines Proteins teilnimmt, das an einer Sresstoleranz-Reaktion in einer Pflanze beteiligt ist, einzuschließen. Um zu ermitteln, ob ein GBSRP oder ein biologisch aktiver Teil davon an der Transkription eines Proteins, dass an der Stresstoleranz-Reaktion einer Pflanze beteiligt ist, teilnehmen kann, oder ob die Repression eines GBSRPs in einer erhöhten Stresstoleranz der Pflanze resultiert, kann eine Stressanalyse einer GBSRP-umfassenden Pflanze durchgeführt werden. Solche Analysemethoden, wie in Beispiel 7 ausgeführt, sind einem Fachmann gut bekannt. Im Speziellen können Nukleinsäurefragmente, die für biologisch aktive Teile eines GBSRPs kodieren, durch Isolation eines Teils der in SEQ ID NO:11 gezeigten Sequenz erzeugt werden. Der kodierende Teil eines GBSRPs oder des Peptids (zum Beispiel durch rekombinante Expression in vitro) wird exprimiert und die Aktivität des kodierenden Teils eines GBSRPs oder des Peptids wird bewertet.
Es werden biologisch aktive Teile eines GBSRPs vorgestellt. Sie beinhalten Peptide, die Aminosäuresequenzen umfassen, die von der Aminosäuresequenz eines GBSRPs, zum Beispiel von der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:11, abgeleitet sind oder sie umfassen die Aminosäuresequenz eines Proteins, das homolog zu einem GBSRP ist, welches weniger Aminosäuren als das vollständige GBSRP oder das vollständige Protein enthält, welches homolog zu einem GBSRP ist und mindestens eine Aktivität eines GBSRPs zeigt. Üblicherweise umfassen biologisch aktive Teile (zum Beispiel Peptide, welche zum Beispiel 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 oder mehr Aminosäuren lang sind) eine Domäne oder ein Motiv mit mindestens einer Aktivität eines GBSRPs. Darüber hinaus können andere biologisch aktive Teile, in denen andere Regionen des Proteins entfernt wurden, durch rekombinante Techniken bereitgestellt und für ein odere mehrere der hierin beschriebenen Aktivitäten evaluiert werden. Die biologisch aktiven Teile eines GBSRPs enthalten vorzugsweise ein oder mehrere ausgewählte Domänen/Motive oder Teile davon, die eine biologische Aktivität aufweisen.
Die Erfindung umfasst auch GBSRP-Chimäre oder Fusionsproteine. Wie hierin verwendet, umfasst ein GBSRP „chimäres Protein" oder „Fusionsprotein" ein GBSRP Polypeptid, das funktionsfähig mit einem nicht-GBSRP Polypeptid verknüpft ist. Ein GBSRP Polypeptid bezeichnet ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz entsprechend einem GBSRP wie oben beschrieben besitzt, während ein nicht-GBSRP Polypeptid ein Polypeptid bezeichnet, das eine Aminosäuresequenz besitzt, das einem Protein entspricht, welches im Wesentlichen nicht homolog zu dem GBSRP ist, zum Beispiel ein Protein, das anders als das GBSRP ist und aus dem gleichen oder einem anderen Organismus stammt. Innerhalb des Fusionsproteins beabsichtigt die Bezeichnung „funktionsfähig verknüpft" anzugeben, dass das GBSRP Polypeptid und das nicht-GBSRP Polypeptid miteinander so fusioniert sind, dass beide Sequenzen die eingebrachte Funktion, die auf die benutzte Sequenz zurückzuführen ist, erfüllen können. Das nicht-GBSRP Polypeptid kann mit dem N-Terminus oder dem C-Terminus des GBSRP-Polypeptides fusioniert sein. Zum Beispiel ist in einer Ausführungsform das Fusionsprotein ein GST-GBSRP, in welchem die GBSRP-Sequenzen mit dem C-Terminus der GST-Sequenzen fusioniert sind. Solche Fusionsproteine können die Aufreinigung von rekombinanten GBSRP's erleichtern. In einer anderen Ausführungsform ist das Fusionsprotein ein GBSRP, das eine heterologe Signalsequenz an seinem N-Terminus enthält. In bestimmten Wirtszellen (zum Beispiel Säugetier-Wirtszellen) kann die Expression und/oder Sekretion eines GBSRPs durch die Verwendung einer heterologen Signalsequenz erhöht werden.
Vorzugsweise wird ein erfindungsgemäßes GBSRP Chimär oder Fusionsprotein durch rekombinante Standard-DNA-Techniken produziert. Zum Beispiel werden DNA-Fragmente, die für die verschiedenen Polypeptid-Sequenzen kodieren, in-frame, gemäß konventioneller Techniken, miteinander ligiert, zum Beispiel durch die Verwendung stumpf endender oder überhängend endender Enden für die Ligation, Restriktionsenzym-Verdau, um die entsprechenden Enden bereitzustellen, Auffüllen von kohäsiven Enden soweit erforderlich, Alkalische-Phosphatase-Behandlung, um eine unerwünschte Verbindung und enzymatische Ligation zu vermeiden. In einer anderen Ausführungsform kann das Fusionsgen durch konventionelle Techniken, einschließlich automatisierter DNA-Syntheseapparate, synthetisiert werden. Alternativ kann eine PCR-Amplifikation von Genfragmenten durch die Verwendung von Anker-Primern durchgeführt werden, welche komplementäre Überhange zwischen zwei aufeinander folgenden Genfragmenten zur Folge haben, welche anschließend gebunden und reamplifiziert werden können, um eine chimäre Gensequenz zu erzeugen (siehe zum Beispiel, Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Darüber hinaus sind viele Expressionsvektoren kommerziell erhältlich, die bereits ein Fusionsteil kodieren (zum Beispiel ein GST-Polypeptid). Eine GBSRP kodierende Nukleinsäure kann in solch einen Expressionsvektor so kloniert werden, dass der Fusionsteil in-frame mit dem GBSRP verbunden wird.
Zusätzlich zu den hierin beschriebenen Fragmenten und Fusionsproteinen der GBSRPs, sind Homologe und Analoge von natürlich vorkommenden GBSRP's und GBSRP kodierenden Nukleinsäuren in einer Pflanze, wie oben beschrieben, genannt. „Homologe" sind hierin definiert als zwei Nukleinsäuren oder Proteine, die jeweils ähnliche oder „homologe" Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen aufweisen. Homologe beziehen Allelvarianten, Orthologe, Paraloge, Agonisten und Antagonisten von GBSRPs, wie nachstehend definiert, ein. Der Begriff „homolog" umfasst weiterhin Nukleinsäuremoleküle, die von der in SEQ ID NO:6 gezeigten Nukleinsäuresequenz (und Teilen davon) infolge der Degeneration des genetischen Codes abweichen und somit für das gleiche GBSRP kodieren wie das, welches durch die in SEQ ID NO:6 gezeigte Nukleotidsequenzen kodiert ist.
Wie hierin verwendet, bezeichnet ein „natürlich vorkommendes" GBSRP eine GBSRP Aminosäuresequenz, die in der Natur vorkommt. Insbesondere umfasst ein natürlich vorkommendes GBSRP eine Aminosäuresequenz, die von einer Gruppe, bestehend aus SEQ ID NO:11, ausgewählt wurde.
Ein Agonist eines GBSRP kann im Wesentlichen die gleiche oder eine Teilmenge der biologischen Aktivität eines GBSRPs beibehalten. Ein Antagonist eines GBSRPs kann ein oder mehrere der Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form eines GBSRPs hemmen. Zum Beispiel kann der GBSRP Antagonist konkurrierend an ein stromabwärts oder stromaufwärts gelegenes Mitglied der Zellmembranbestandteil-Stoffwechselkaskade binden, welche das GBSRP beinhaltet, oder an ein GBSRP binden, welches den Transport von Verbindungen durch solche Membranen vermittelt, um dadurch das Stattfinden der Translokation zu verhindern.
Nukleinsäuremoleküle, die natürlichen Allelvarianten und Analogen, Orthologen und Paralogen einer GBSRP cDNA entsprechen, können basierend auf ihrer Identität zu den Physcomitrella patens GBSRP Nukleinsäuren, wie hierin beschrieben, unter Verwendung von GBSRP cDNA's oder Teilen davon als eine Hybridisierungs-Sonde gemäß Standard-Hybridisierungs-Techniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen isoliert werden. In einer alternativen Ausführungsform können Homologe eines GBSRPs durch das Screening kombinatorischer GBSRP-Mutanten Bibliotheken, zum Beispiel Trunkierungsmutanten, nach GBSRP Agonisten- oder Antagonisten-Aktivitäten, identifiziert werden. In einer Ausführungsform wird eine variegate Bibliothek aus GBSRP-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäureebene erzeugt, welche durch eine variegate Genbibliothek kodiert wird. Eine variegate Bibliothek von GBSRP-Varianten kann zum Beispiel produziert werden durch emzymatische Ligation eines Gemisches von synthetischen Oligonukleotiden zu Gensequenzen, so dass ein degenerierter Satz möglicher GBSRP Sequenzen als individuelle Polypeptide exprimierbar ist, oder alternativ, als ein Satz größerer Fusionsproteine (zum Beispiel für Phagen-Display), der den Satz an GBSRP Sequenzen hierin enthält. Es gibt eine Vielzahl von Methoden, die verwendet werden können, um Bibliotheken von möglichen GBSRP Homologen einer degenerierten Oligonukleotidsequenz zu produzieren. Chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem automatisierten DNA-Synthesizer durchgeführt werden, wobei das synthetische Gen dann mit dem entsprechenden Expressionvektor ligiert wird. Die Verwendung eines degenerierten Satzes von Genen ermöglicht die Bereitstellung eines Gemisches von all den Sequenzen, die für den gewünschten Satz an möglichen GBSRP-Sequenzen kodieren. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind im Fachgebiet bekannt (siehe zum Beispiel Narang, S.A., 1983 Tetrahedron 39:3; Itakura et al., 1984 Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al., 1984 Science 198:1056; Ike et al., 1983 Nucleic Acid Res. 11:477).
Zusätzlich können Bibliotheken von Fragmenten GBSRP-kodierender Regionen verwendet werden, um variegate Populationen von GBSRP-Fragmenten für ein Screening und eine anschließende Selektion von Homologen eines GBSRPs zu erzeugen. In einer Ausführungsform kann eine Bibliothek von kodierenden Sequenzfragmenten erzeugt werden durch Behandlung eines doppelsträngigen PCR-Fragmentes einer GBSRP kodierenden Sequenz mit einer Nuklease unter Bedingungen, in denen das Einschneiden (Nicking) nur etwa einmal per Molekül stattfindet, Denaturierung der doppelsträngigen DNA, Renaturierung der DNA, um doppelsträngige DNA zu formen, welche Sinn (Sense)/Gegensinn(Antisense) Paarungen verschiedener genickter Produkte enthält, Abtrennung einzelsträngiger Teile aus neu gebildeten Duplexen durch S1-Nuklease Behandlung und Ligation der resultierenden Fragmentbibliothek in einen Expressionsvektor. Durch dieses Vefahren kann eine Expressions-Bibliothek erhalten werden, welche für N-terminale, C-terminale und interne Fragmente des GBSRPs verschiedener Größen kodiert.
Es sind mehrere Techniken für das Screening kombinatorischer Bibliotheken. nach Genprodukten im Fachgebiet bekannt, die durch Punktmutationen oder Trunkierung hergestellt wurden, und für das Screening von cDNA Bibliotheken nach Genprodukten, die eine ausgewählte Eigenschaft besitzen. Solche Techniken sind für das Schnell-Screening von Genbibliotheken, die durch kombinatorische Mutagenese von GBSRP Homologen hergestellt wurden, adaptierbar. Die am meisten verwendeten Techniken für das Screenen großer Genbibliotheken, welche für eine Hochdurchsatz-Analyse zugänglich sind, beinhalten üblicherweise das Klonieren der Gen-Bibliothek in replizierbare Expressionsvektoren, das Transformieren geeigneter Zellen mit der resultierenden Vektorenbibliothek und das Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, unter denen die Detektion einer gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors ermöglicht, der für das Gen kodiert, dessen Produkt detektiert wurde. Rekursive Ensemble Mutagenese (REM), eine neue Technik, die die Häufigkeit von funktionellen Mutanten in den Bibliotheken erhöht, kann in Kombination mit den Screening-Untersuchungen zur Identifikation von GBSRP Homologen verwendet werden (Arkin und Yourvan, 1992 PNAS 89:7811-7815; Delgrave et al., 1993 Protein Engineering 6(3):327-331). In einer anderen Ausführungsform können Zell-basierte Untersuchungen unter Verwendung von im Fachgebiet gut bekannten Verfahren verwendet werden, um eine variegate GBSRP Bibliothek zu analysieren. Ein Verfahren zur Identifikation eines neuen GBSRP wird bereitgestellt, umfassend (a) Erhöhen einer spezifischen Antikörper-Reaktion zu einem GBSRP oder einem Fragment davon, wie hierin beschrieben; (b) Screenen von putativem GBSRP-Material mit dem Antikörper, worin die spezifische Bindung zwischen dem Antikörper und dem Material die Anwesenheit eines potenziellen neuen GBSRPs anzeigt; und (c) Analyse des gebundenen Materials im Vergleich zum bekannten GBSRP, um seine Neuheit zu bestimmen.
Um den Homologieprozentsatz von zwei Aminosäuresequenzen zu bestimmen (zum Beispiel der Sequenz SEQ ID NO:11 und einer Mutantenform davon), werden die Sequenzen für optimale Vergleichszwecke abgeglichen (zum Beispiel können Lücken in die Sequenz eines Proteins oder einer Nukleinsäure für ein optimales Abgleichen (Alignment) mit dem anderen Protein oder mit der anderen Nukleinsäure eingeführt werden). Die Aminosäurereste an den entsprechenden Aminosäurepositionen werden dann verglichen. Wenn eine Position in einer Sequenz (zum Beispiel der Sequenz SEQ ID NO:11) durch den gleichen Aminosäurerest, wie in der entsprechenden Position in der anderen Sequenz (zum Beispiel einer Mutantenform der Sequenz, ausgewählt aus dem Polypeptid SEQ ID NO:11) belegt ist, dann sind die Moleküle an dieser Position homolog (d.h. wie hierin verwendet ist Aminosäure oder Nukleinsäure „Homologie" äquivalent zu Aminosäure oder Nukleinsäure „Identität"). Die gleiche Art von Vergleich kann zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen gemacht werden.
Der Homologieprozentsatz zwischen den zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl identischer Positionen geteilt durch die Sequenzen (zum Beispiel Homologie = Anzahl identischer Positionen/gesamte Anzahl an Positionen × 100). Die Aminosäuresequenzen, die in der vorliegenden Erfindung enthalten sind, sind mindestens 95%, und vorzugsweise mindestens 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr homolog zu der gesamten Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO:11 gezeigt ist. In noch einer anderen Ausführungsform sind die Aminosäuresequenzen mindestens 95%, und vorzugsweise mindestens 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr, homolog zu der gesamten Aminosäuresequenz, die von einer in SEQ ID NO:6 gezeigten Nukleinsäuresequenz kodiert wird.
In anderen Ausführungsformen beträgt die bevorzugte Länge für Proteine in Sequenzvergleichen mindestens 15 Aminosäurereste, bevorzugter mindestens 25 Aminosäurereste und am meisten bevorzugt mindestens 35 Aminosäurereste.
In einer anderen Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, welche mindestens 95% und bevorzugt mindestens 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr homolog zu einer in SEQ ID NO:6 gezeigten Nukleotidsequenz oder einem Teil davon ist. Die bevorzugte Länge für die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren in dem Sequenzvergleich ist die gesamte Länge der kodierenden Region.
Es wird ebenfalls bevorzugt, dass das homologe Nukleinsäuremolekül für ein Protein oder einen Teil davon kodiert, welches eine Aminosäuresequenz beinhaltet, die ausreichend homolog zu der Aminosäuresequenz SEQ ID NO:11 ist, so dass das Protein oder ein Teil davon, die gleiche oder eine ähnliche Funktion wie die Aminosäuresequenz mit welcher es verglichen wird, beibehält. Funktionen der GBSRP Aminosäuresequenzen der vorliegenden Erfindung schließen die Fähigkeit ein, an der Stresstoleranzreaktion in einer Pflanze teilzunehmen, oder genauer, an der Transkription eines Proteins, das in eine Stresstoleranzreaktion in einer Physcomitrella patens Pflanze involviert ist, teilzunehmen. Beispiele für solche Aktivitäten sind in Tabelle 1 beschrieben.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Methoden kann eine Ermittlung des Homologie-Prozentsatzes zwischen zwei Sequenzen durch die Verwendung eines mathematischen Algorithmus durchgeführt werden. Ein bevorzugtes, nicht-limitierendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus, der für den Vergleich von zwei Sequenzen verwendet wird, ist der Algoithmus von Karlin und Altschul (1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877). Solch ein Algorithmus ist in den NBLAST und XBLAST Programmen von Altschul, et al. (1990 J. Mol. Biol. 215:403-410) enthalten.
BLAST Nukleinsäure-Durchsuchungen können mit dem NBLAST Programm durchgeführt werden, Punktzahl=100, Wortlänge=12, um Nukleinsäuresequenzen, die homolog zu den erfindungsgemäßen GBSRP-Molekülen sind, zu erhalten.
Zusätzlich können BLAST Protein Durchsuchungen mit dem XBLAST Programm durchgeführt werden, Punktzahl=50, Wortlänge=3, um Aminosäuresequenzen, die homolog zu erfindungsgemäßen GBSRP's sind, zu erhalten. Um Lücken-Alignments für Vergleichszwecke zu erhalten, kann Lücken (Gapped) BLAST verwendet werden, wie in Altschul et al. (1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402) beschrieben. Wenn BLAST und Gapped BLAST Programme verwendet werden, können die vorgegebenen Parameter der entsprechenden Programme (zum Beispiel XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Ein anderes, nicht-limitierendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus, der für den Vergleich von Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus von Myers und Miller (CABIOS 1989). Solch ein Algorithmus ist in das ALIGN Programm (Version 2.0) eingearbeitet, das Teil des GCG-Sequenz Alignment Software-Pakets ist. Wenn das ALIGN Programm für den Vergleich von Aminosäuresequenzen verwendet wird, kann eine PAM120 Gewichtsrest-Tabelle, eine Gap-Länge-Strafsumme von 12 und eine Gap-Strafsumme von 4 verwendet werden, um Aminosäuresequenzen, die homolog zu den GBSRP's der vorliegenden Erfindung sind, zu erhalten. Um Lücken-Alignments für Vergleichszwecke zu erhalten, kann Lücken (Gapped) BLAST verwendet werden, wie in Altschul et al. (1997 Nucleic Acids Res. 25:3389-3402) beschrieben. Wenn BLAST und Gapped BLAST Programme verwendet werden, können die vorgegebenen Parameter der entsprechenden Programme (zum Beispiel XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Ein anderes, nicht-limitierendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus, der für den Vergleich von Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus von Myers und Miller (CABIOS 1989). Solch ein Algorithmus ist in das ALIGN Programm (Version 2.0) eingearbeitet, das Teil des GCG-Sequenz Alignment Software-Pakets ist. Wenn das ALIGN Programm für den Vergleich von Aminosäuresequenzen verwendet wird, kann eine PAM120 Gewichtsrest-Tabelle, eine Gap-Länge-Strafsumme von 12 und eine Gap-Strafsumme von 4 verwendet werden, um Aminosäuresequenzen, die homolog zu den GBSRP's der vorliegenden Erfindung sind, zu erhalten.
Schließlich können Homologien zwischen Nukleinsäuresequenzen auch durch die Verwendung von Hybridisierungstechniken, die dem Fachmann bekannt sind, ermittelt werden. Dementsprechend umfasst ein isoliertes Nukleinsäuremolekül eine Nukleinsäuresequenz, welche unter stringenten Bedingungen zum Beispiel mit der in SEQ ID NO:6 gezeigten Nukleotidsequenz oder einem Teil davon hybridisiert. Insbesondere hybridisiert ein isoliertes Nukleinsäuremolekül mit einer Länge von mindestens 15 Nukleotiden unter stringenten Bedingungen mit dem Nukleinsäuremolekül, das die Nukleotidsequenz SEQ ID NO:6 umfasst.
In einer anderen Ausführungsform ist die Nukleinsäure mindestens 30, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotide lang.
Wie hierin verwendet, beabsichtig der Begriff „hybridisiert unter stringenten Bedingungen" die Bedingungen für die Hybridisierung und das Waschen zu beschreiben, unter welchen Nukleotidsequenzen, die mindestens 60% homolog zueinander sind, zueinander hybridisiert bleiben. Vorzugsweise sind die Bedingungen derart, dass Sequenzen, die mindestens etwa 65%, bevorzugter mindestens etwa 70% und noch mehr bevorzugt mindestens etwa 75% oder mehr homolog zueinander sind, normalerweise zueinander hybridisiert bleiben. Solche stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und können in Current Protocols in Molecular Biology 6.3.1.-6.3.6., John Wiley & Sons, N.Y. (1989) gefunden werden. Ein bevorzugtes, nicht-limitierendes Beispiel für stringende Hybridisierungsbedingungen ist die Hybridisierung in 6X Natrium-Chlorid/Natrium-Citrat (SSC) bei etwa 45ºC, gefolgt von ein oder mehreren Waschschritten in 0.2X SSC, 0.1% SDS bei 50-65ºC. Vorzugsweise entspricht ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen mit der Sequenz SEQ ID NO:6 hybridisiert, einem natürlich vorkommenden Nukleinsäuremolekül. Wie hierin verwendet, bezeichnet ein „natürlich vorkommendes" Nukleinsäuremolekül ein RNA oder DNA Molekül, das eine Nukleotidsequenz aufweist, die in der Natur vorkommt (zum Beispiel ein natürliches Protein kodiert). In einer Ausführungsform kodiert die Nukleinsäure ein natürlich vorkommendes Physcomitrella patens GBSRP.
Unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren und anderen, dem Fachmann bekannten Verfahren, können Homologe der GBSRP's isoliert werden, die Aminosäuresequenzen umfassen, die in SEQ ID NO:11 gezeigt sind.
Eine Teilmenge dieser Homologen sind Allelvarianten. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „Allelvariante" eine Nukleotidsequenz, die Polymorphismen enthält, die zu Veränderungen in den Aminosäuresequenzen eines GBSRPs führen und die innerhalb einer natürlichen Population (zum Beispiel einer Pflanzenart oder Varietät) existiert. Solche natürlichen Allelvarianten können normalerweise eine 1-5%ige Abweichung in einer GBSRP Nukleinsäure zur Folge haben. Allelvarianten können durch Sequenzierung der interessierenden Nukleinsäuresequenz in einer Anzahl von verschiedenen Pflanzen identifiziert werden, was durch die Verwendung von Hybridisierungs-Sonden, um den gleichen GBSRP Genlocus in diesen Pflanzen zu identifizieren, leicht durchgeführt werden kann. Es wird beabsichtigt, dass jedwede und alle dieser Nukleinsäurevarianten und resultierenden Aminosäure-Polymorphismen oder Variationen in einem GBSRP, die das Ergebnis natürlicher Allelvariationen sind und die nicht die funktionelle Aktivität eines GBSRPs verändern, von der Erfindung umfasst sind.
Darüber hinaus werden Nukleinsäuremoleküle, die für GBSRP's der gleichen Art oder anderer Arten kodieren, wie GBSRP Analoge, Orthologe und Paraloge, betrachtet. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „Analoge" zwei Nukleinsäuren, die die gleiche oder eine ähnliche Funktion haben, aber die sich getrennt in nichtverwandten Organismen entwickelt haben. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „Orthologe" zwei Nukleinsäuren verschiedener Arten, die sich jedoch aus einem gemeinsamen Vorfahren-Gen durch Artentstehung entwickelt haben. Normalerweise kodieren Orthologe für Proteine, die die gleichen oder ähnliche Funktionen haben. Wie ebenfalls hierin beschrieben, bezeichnet der Begriff „Paraloge" zwei Nukleinsäuren, die durch Vervielfältigung innerhalb des Genoms verwandt sind. Paraloge haben gewöhnlich verschiedene Funktionen, wobei diese Funktionen jedoch ähnlich sein können (Tatusov, R.L. et al. 1997 Science 278(5338):631-637). Analoge, Ortologe und Paraloge eines natürlich vorkommenden GBSRPs können sich vom natürlich vorkommenden GBSRP durch posttranslationelle Modifikationen, durch Aminosäuresequenzunterschiede oder beides unterscheiden. Posttranslationelle Modifikationen schließen in vivo und in vitro chemische Derivatisierung von Polypeptiden, zum Beispiel Azetylierung, Carboxylierung, Phosphorylierung oder Glykosylierung ein, wobei solche Modifikationen während der Polypeptidsynthese oder der Prozessierung oder einer anschließenden Behandlung mit isolierten modifizierenden Enzymen stattfinden können. Im Besonderen weisen Orthologe im Allgemeinen mindestens 95%, 96%, 97%, 98% oder sogar 99% Identität oder Homologie mit der gesamten oder einem Teil einer natürlich vorkommenden GBSRP Aminosäuresequenz auf und weisen eine Funktion ähnlich einem GBSRP auf. Orthologe sind vorzugsweise auch fähig, an der Stressreaktion in Pflanzen teilzunehmen. In einer Ausführungsform behalten die GBSRP Orthologe die Fähigkeit, am Metabolismus von Komponenten, die für die Konstruktion der zellulären Membranen in Physcomitrella patens nötig sind, oder am Transport von Molekülen durch diese Membranen teilzunehmen.
Zusätzlich zu natürlich vorkommenden Varianten von einer GBSRP Sequenz, die in der Population existieren kann, wird der Fachmann es zu schätzen wissen, dass Veränderungen durch Mutation in die Nukleotidsequenz SEQ ID NO:6 eingeführt werden können, was zu Veränderungen in der Aminosäuresequenz des kodierten GBSRPs führt, ohne die Funktionsfähigkeit des GBSRPs zu verändern. Zum Beispiel können Nukleotidsubstitutionen, die zu Aminosäuresubstitutionen führen, an „nicht-essenziellen" Aminosäureresten in der Sequenz SEQ ID NO:6 gemacht werden.
Ein „nicht-essenzieller" Aminosäurerest ist ein Rest, der in der Wildtypsequenz von einem der GBSRP's verändert werden kann, ohne die Aktivität des besagten GBSRP zu verändern, wobei ein „essenzieller" Aminosäurerest für die GBSRP Aktivität benötigt wird. Andere Aminosäurereste jedoch (zum Beispiel solche, die nicht konserviert oder nur halb-konserviert in der Domäne sind, die eine GBSRP Aktivität aufweist) sind möglicherweise nicht für die Aktivität essenziell, weshalb sie möglicherweise für Veränderungen zugänglich sind, ohne die GBSRP Aktivität zu ändern.
Dementsprechend betrifft ein anderer Aspekt Nukleinsäuremoleküle, die GBSRP's kodieren, die Veränderungen in Aminosäureresten enthalten, die nicht essenziell für die GBSRP Aktivität sind. Solche GBSRP's unterscheiden sich in der Aminosäuresequenz von einer in SEQ ID NO:11 enthaltenen Sequenz, dennoch behält es mindestens eine der hierin beschriebenen GBSRP Aktivitäten. In einer Ausführungsform umfasst das isolierte Nukleinsäuremolekül eine Nukleinsäuresequenz, die für ein Protein kodiert, worin das Protein eine Aminosäuresequenz umfasst, die mindestens 95% homolog zu einer Aminosäuresequenz von SEQ ID NO:11 ist.
Vorzugsweise ist das Protein, welches durch ein Nukleinsäuremolekül kodiert ist, mindestens 96%, 97%, 98% oder 99% homolog zu der Sequenz SEQ ID NO:11.
Die bevorzugten GBSRP Homologen sind vorzugsweise fähig, an einer Stresstoleranzantwort in einer Pflanze teilzunehmen, oder insbesondere an der Transkription eines Proteins, das in die Stresstoleranzantwort in einer Physcomitrella patens Pflanze involviert ist, teilzunehmen, oder weisen ein oder mehrere der in Tabelle 1 dargelegten Aktivitäten auf.
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das ein GBSRP, welches homolog zu der Protein-Sequenz SEQ ID NO:11 ist, kodiert, kann durch die Einführung von ein oder mehreren Nukleotidsubstitutionen, Additionen oder Deletionen in die Nukleotidsequenz SEQ ID NO:6 erzeugt werden, sodass ein oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, Additionen oder Deletionen in das kodierte Protein eingeführt werden. Mutationen können in die Sequenz SEQ ID NO:6 durch Standardtechniken eingeführt werden, wie zum Beispiel ortsspezifische (sitedirected) Mutagenese und PCR vermittelte Mutagenese. Vorzugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einer oder mehreren vorausgesagten nicht-essenziellen Aminosäureresten gemacht. Eine „konservative Aminosäuresubstitution" ist eine, in welcher der Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest, der eine ähnliche Seitenkette hat, ersetzt wird.
Familien von Aminosäureresten, die ähnliche Seitenketten haben, sind im Stand der Technik definiert. Diese Familien schließen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (zum Beispiel Lysin, Arginin, Histidin), saure Seitenketten (zum Beispiel Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladene polare Seitenketten (zum Beispiel Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), nicht-polare Seitenketten (zum Beispiel Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), beta-verzweigte Seitenketten (zum Beispiel Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatische Seitenketten (zum Beispiel Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin) ein. Folglich wird ein vorhergesagter nicht-essenzieller Aminosäurerest in einem GBSRP vorzugsweise mit einem anderen Aminosäurerest der gleichen Seitenkettenfamilie ersetzt. Alternativ können in einer anderen Ausführungsform Mutationen wahllos über die gesamte GBSRP kodierenden Sequenz oder eines Teils davon zum Beispiel durch Sättigungsmutagenese eingeführt werden, wobei die resultierenden Mutanten können nach einer GBSRP Aktivität, wie hierin beschrieben, durchsucht werden, um Mutanten, die GBSRP Aktivität weiterhin aufweisen, zu identifizieren. Anschließend an die Mutagenese der Sequenz SEQ ID NO:6 kann das kodierte Protein rekombinant exprimiert werden und die Aktivität des Proteins kann durch das Analysieren der Stresstoleranz der Pflanze, die das Protein exprimiert, wie in Beispiel 7 beschrieben, bestimmt werden.
Zusätzlich zu den Nukleinsäuremolekülen, die für die GBSRP's, wie oben beschrieben, kodieren, betrifft ein anderer Aspekt die isolierten Nukleinsäuremoleküle, die antisense dazu sind. Eine „antisense" Nukleinsäure umfasst eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu einer Protein-kodierenden „sense" Nukleinsäure ist, zum Beispiel komplementär zum kodierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA Sequenz ist. Folglich kann eine antisense Nukleinsäure Wasserstoffbrückenbindungen zu einer sense Nukleinsäure aufweisen. Die antisense Nukleinsäure kann dem gesamten GBSRP kodierenden Strang komplementär sein oder nur zu einem Teil davon. In einer Ausführungsform ist das antisense Nukleinsäuremolekül antisense zu einer „kodierenden Region" des kodierenden Stranges der Nukleotidsequenz, die für ein GBSRP kodiert. Der Begriff „kodierende Region" bezeichnet die Region der Nukleotidsequenz, die Codons umfasst, die in Aminosäurereste translatiert werden (zum Beispiel die gesamte kodierende Region von ,,,,, umfasst die Nukleotide 1 bis ....). In einer anderen Ausführungsform ist das antisense Nukleinsäuremolekül antisense zu einer „nicht-kodierenden Region" eines kodierenden Stranges einer Nukleotidsequenz die für ein GBSRP kodiert. Der Begriff „nicht-kodierende Region" bezeichnet 5'- und 3'-Sequenzen, die die kodierende Region flankieren, die nicht in Aminosäuren translatiert werden (d.h. auch bezeichnet als 5' und 3' nicht-translatierte Regionen).
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nukleinsäuremolekül ein Nukleinsäuremolekül, welches ein Komplement der in SEQ ID NO:6 gezeigten Nukleotidsequenz oder eines Teils davon ist. Ein Nukleinsäuremolekül, das komplementär zu einem der in SEQ ID NO:6 gezeigten Nukleotidsequenzen ist, ist eines, welches ausreichend komplementär zu der in SEQ ID NO:6 gezeigten Nukleotidsequenz ist, sodass es mit der in SEQ ID NO:6 gezeigten Nukleotidsequenz hybridisieren kann, wobei es einen stabilen Duplex formt.
In Anbetracht, dass die kodierenden Strang-Sequenzen, die für die GBSRP's kodieren, hierin aufgezeigt sind (zum Beispiel die in SEQ ID NO:6 dargelegte Sequenz), können antisense Nukleinsäuren der Erfindung, entsprechend der Regeln der Watson und Crick Basenpaarung, konstruiert werden. Das antisense Nukleinsäuremolekül kann komplementär zur gesamten kodierenden Region der GBSRP mRNA sein, jedoch wird ein Oligonukleotid bevorzugt, welches antisense nur zu einem Teil der kodierenden oder nicht-kodierenden Region der GBSRP mRNA ist. Zum Beispiel kann das antisense Oligonukleotid komplementär zu der Region sein, die die Translations-Startstelle der GBSRP mRNA umgibt. Ein antisense Oligonukleotid kann zum Beispiel etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotide lang sein.
Eine antisense Nukleinsäure kann durch die Verwendung von chemischer Synthese und enzymatischen Ligationsreaktionen mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren konstruiert werden. Zum Beispiel kann eine antisense Nukleinsäure (zum Beispiel ein antisense Oligonukleotid) chemisch synthetisiert werden unter Verwendung natürlich vorkommender Nukleotide oder verschiedenartig modifizierter Nukleotide, die konstruiert wurden, um die biologische Stabilität der Moleküle zu erhöhen oder die physikalische Stabilität vom Duplex zu erhöhen, der zwischen antisense und sense Nukleinsäuren gebildet wird, es können zum Beispiel Phosphorothioat-Derivate und Akridin substituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele von modifizierten Nukleotiden, welche verwendet werden können, um die antisense Nukleinsäure zu erzeugen, beinhalten 5-Fluoro-Uracil, 5-Bromo-Uracil, 5-Chloro-Uracil, 5-Iodo-Uracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetyl-Cytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl) Uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-Thio-Uridin, 5-Carboxymethylaminomethyl-Uracil, Dihydro-Uracil, Beta-D-Galaktosyl-Queosin, Inosin, N6-Isopentenyl-Adenin, 1-Methyl-Guanin, 1-Methyl-Inosin, 2,2-Dimethyl-Guanin, 2-Methyl-Adenin, 2-Methyl-Guanin, 3-Methyl-Cytosin, 5-Methyl-Cytosin, N6-Adenin, 7-Methyl-Guanin, 5-Methylaminomethyl-Uracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-Thio-Uracil, Beta-D-Mannosyl-Queosin, 5'-Methoxycarboxymethyl-Uracil, 5-Methoxy-Uracil, 2-Methylthio-N6-Isopentenyl-Adenin, Uracil-5-Oxy-Essigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, queosin, 2-Thio-Cytosin, 5-Methyl-2-Thio-Uracil, 2-Thio-Uracil, 4-Thio-Uracil, 5-Methyl-Uracil, Uracil-S-Oxy-Essigsäure-Methylester, Uracil-5-Oxy-Essigsäure (v), 5-Methyl-2-Thio-Uracil, 3-(3-Amino-3-N-2-Carboxypropyl) Uracil, (acp3)w, und 2,6-Diaminopurin. Alternativ kann die antisense Nukleinsäure biologisch, durch die Verwendung eines Expressionsvektors, in welchem eine Nukleinsäure in antisense Orientierung subkloniert wurde, hergestellt werden (zum Beispiel wird RNA aus der eingefügten Nukleinsäure in einer antisense Orientierung zu einer Ziel-Nukleinsäure von Interesse transkribiert, wie im folgenden Unterabschnitt weiter beschrieben).
Die antisense Nukleinsäuremoleküle werden normalerweise einer Zelle verabreicht oder in situ hergestellt, so dass sie mit zellulärer mRNA und/oder genomischer DNA, die für ein GBSRP kodieren, hybridisieren oder daran binden, um dadurch die Expression des Proteins zu hemmen, zum Beispiel durch Hemmung der Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch konventionelle Nukleotid-Komplementarität, um einen stabilen Duplex zu formen, erfolgen oder zum Beispiel, im Fall eines antisense Nukleinsäuremoleküls, welches DNA-Duplexe bindet, durch spezifische Interaktionen in der großen Furche der Doppelhelix. Das antisense Molekül kann so modifiziert werden, dass es spezifisch an einen Rezeptor bindet oder ein Antigen an einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert, zum Beispiel durch die Verknüpfung des antisense Nukleinsäuremoleküls mit einem Peptid oder einem Antikörper, welches bzw. welcher an einen Zelloberflächen-Rezeptor oder ein Antigen bindet. Das antisense Nukleinsäuremolekül kann auch durch die Verwendung des hierin beschriebenen Vektors in die Zelle eingebracht werden. Um eine ausreichende intrazelluläre Konzentrationen des antisense Moleküls zu erhalten, werden Vektor-Konstrukte bevorzugt, in denen das antisense Nukleinsäuremolekül unter der Kontrolle eines starken prokaryotischen, viralen oder eukaryotischen (einschließlich Pflanzen) Promotors platziert ist.
In noch einer anderen Ausführungsform ist das antisense Nukleinsäuremolekül ein alpha-anomeres Nukleinsäuremolekül. Ein alpha-anomeres Nukleinsäuremolekül bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA in welcher die Stränge, im Gegensatz zu den gewöhnlichen beta-Einheiten, parallel zueinander laufen (Gaultier et al., 1987 Nucleic Acids. Res. 15:6625-6641). Das antisense Nukleinsäuremolekül kann auch ein 2'o-Methylribonukleotid umfassen (Inoü et al., 1987 Nucleic Acids Res. 15:6131-6148) oder ein chimäres RNA-DNA Analogon (Inoue et al., 1987 FEBS Lett. 215:327-330).
In noch einer anderen Ausführungsform ist eine antisense Nukleinsäure ein Ribozym. Ribozyme sind katalytische RNA Moleküle mit Ribunuklease Aktivität, welche dazu fähig sind, einzelsträngige Nukleinsäuren, wie zum Beispiel eine mRNA, zu der sie eine komplementäre Region aufweisen, zu schneiden. Folglich können Ribozyme (zum Beispiel Hammerkopf-Ribozyme, die in Haselhoff and Gerlach, 1988 Nature 334:585-591 beschrieben sind) verwendet werden, um GBSRP mRNA Transkripte katalytisch zu schneiden und dadurch die Translation von GBSRP mRNA zu hemmen. Ein Ribozym, das eine Spezifität für eine GBSRP kodierende Nukleinsäure aufweist, kann, basierend auf der Nukleotidsequenz einer GBSRP cDNA, wie hierin offenbart (zum Beispiel SEQ ID NO:6) konstruiert werden oder anhand einer heterologen Sequenz, entsprechend der in dieser Erfindung gelehrten Methoden, isoliert werden. Zum Beispiel kann ein Derivat einer Tetrahymena L19 IVS RNA konstruiert werden, in welcher die Nukleotidsequenz der aktiven Stelle komplementär zu der zu schneidenden Nukleotidsequenz in einer GBSRP kodierenden mRNA ist. Siehe zum Beispiel Cech et al. U.S. Patent Nr. 4,987,071 und Cech et al. U.S. Patent Nr. 5,116,742. Alternativ kann die GBSRP mRNA verwendet werden, um eine katalytische RNA, die eine spezifische Ribonuklease Aktivität aufweist, aus einem Pool von mRNA Molekülen auszuwählen. Siehe zum Beispiel Bartel, D. and Szostak, J.W., 1993 Science 261:1411-1418.
Alternativ kann die GBSRP Genexpression durch das Targeting von Nukleotidsequenzen, die komplementär zu der regulatorischen Region einer GBSRP Nukleotidsequenz sind (zum Beispiel ein GBSRP Promotor und/oder Verstärker) um dreifach Helix-Strukturen zu bilden, die die Transkription eines GBSRP Gens in den Zielzellen verhindern, gehemmt werden. Siehe allgemein, Helene, C., 1991 Anticancer Drug Des. 6(6):569-84; Helene, C. Et al., 1992 Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36; und Maher, L.J., 1992 Bioassays 14(12):807-15.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen GBSRP Nukleinsäuren und Proteinen umfasst die vorliegende Erfindung diese Nukleinsäuren und Proteine in der Form, dass sie an einem Rest fixiert sind. Diese Reste schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf, Detektionsreste, Hybridisierungsreste, Aufreinigungssreste, Anlieferungsreste, Reaktionsreste, Bindungsreste und dergleichen. Eine typische Gruppe von Nukleinsäuren, die an einem Rest fixiert sind, schließt Sonden und Primer ein. Die Sonden und Primer umfassen normalerweise eine Nukleotidsequenzregion, die unter stringenten Bedingungen mit mindestens etwa 12, bevorzugt etwa 25, bevorzugter etwa 40, 50 oder 75 aufeinander folgenden Nukleotiden eines sense Stranges der in SEQ ID NO:6 dargelegten Sequenz, einer antisense Sequenz der in SEQ ID NO:6 dargelegten Sequenz oder natürlich vorkommenden Mutanten davon, hybridisiert. Primer, die auf der Nukleotidsequenz SEQ ID NO:6 basieren, können in PCR Reaktionen zum Klonieren von GBSRP Homologen verwendet werden. Sonden, die auf GBSRP Nukleotidsequenzen basieren, können verwendet werden, um Kopien (Transkripte) oder genomische Sequenzen, die die gleichen oder homologe Proteine kodieren, zu detektieren. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Sonde ußerdem eine daran angehängte Markierungsgruppe, zum Beispiel kann die Markierungsgruppe ein Radioisotop, ein Fluoreszenzverbindung, ein Enzym oder ein Enzym-Co-Faktor sein. Solche Sonden können als ein Teil eines genomischen Marker-Test-Kit's zur Identifikation von Zellen, die GBSRP exprimieren, verwendet werden, wie zum Beispiel durch Messung eines Niveau's einer GBSRP kodierenden Nukleinsäure in einer Zellprobe, zum Beispiel mittels Detektion der GBSRP mRNA Niveau's oder mittels Bestimmung, ob ein genomisches GBSRP Gen mutiert oder deletiert wurde.
Im Besonderen besteht ein nützliches Verfahren zur Bestimmung des Gentranskriptions-Niveaus (ein Indikator der mRNA-Menge, die für die Translation zum Gen-Produkt verfügbar ist) in der Durchführung eines Nothern-Blots (für eine Referenz siehe zum Beispiel Ausubel et al., 1988 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York). Diese Information demonstriert zumindest teilweise den Grad der Transkription des transformierten Gens. Die gesamte zelluläre RNA kann aus Zellen, Geweben oder Organen mittels verschiedener Verfahren präpariert werden, die im Fachgebiet wohl bekannt sind, wie zum Beispiel die in Bormann, E.R. et al., 1992 Mol. Microbiol. 6:317-326 beschrieben Verfahren. Um die Anwesenheit oder die relative Quantität eines Proteins, das von dieser mRNA translatiert wird, zu bewerten, können Standardtechniken, wie zum Beispiel ein Western Blot, verwendet werden. Diese Techniken sind einem Durchschnittsfachmann wohl bekannt. (Siehe zum Beispiel Ausubel et al., 1988 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York).
Die Erfindung stellt weiterhin einen isolierten rekombinanten Vektor bereit, der eine GBSRP Nukleinsäure wie oben beschrieben umfasst, worin die Expression des Vektors in einer Wirtszelle, verglichen mit der Wildtyp-Varietät der Wirtszelle, zu einer erhöhten Toleranz der Wirtszelle gegenüber Trockenstress und/oder Frost-Stress, führt. Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das zum Transport anderer Nukleinsäuren, mit denen es verknüpft wurde, fähig ist. Ein Vektortyp ist ein „Plasmid", welches eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife beschreibt, in welche zusätzliche DNA-Abschnitte ligiert werden können. Eine andere Art von Vektor ist ein viraler Vektor, worin zusätzliche DNA-Abschnitte in das virale Genom ligiert werden können. Gewisse Vektoren sind zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle fähig, in die sie eingeführt wurden (zum Beispiel bakterielle Vektoren, die einen bakteriellen Replikationsursprung aufweisen und episomale Säugervektoren). Andere Vektoren (zum Beispiel nicht-episomale Säugervektoren) werden in das Genom der Wirtszelle, nach Einführung in die Wirtszelle, integriert und werden dabei zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Darüber hinaus, sind gewisse Vektoren fähig, die Expression von Genen, mit denen sie operativ verknüpft sind, zu regulieren. Solche Vektoren werden hierin als „Expressionsvektoren" bezeichnet. Im Allgemeinen sind Expressionsvektoren, die für rekombinante DNA-Techniken verwendet werden, oft in der Form von Plasmiden. In der vorliegenden Ausführung können „Plasmid" und „Vektor" synonym verwendet werden, da das Plasmid die meist üblich verwendete Form eines Vektors ist. Allerdings ist es beabsichtigt, dass die Erfindung solche anderen Formen von Expressionsvektoren, wie zum Beispiel virale Vektoren (zum Beispiel Replikations-defekte Retroviren, Adenoviren und Adeno-verwandte Viren) einschließt, welche äquivalente Funktionen aufweisen.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren umfassen eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer Form, die für die Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle geeignet ist, was bedeutet dass die rekombinanten Expressionsvektoren ein oder mehrere regulatorische Sequenzen umfassen, die auf der Basis der für die Expression zu verwendenden Wirtszellen ausgewählt werden, und die mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz operativ verknüpft sind. Innerhalb eines rekombinanten Expressionsvektors bedeutet „wirkend verknüpft", dass die Nukleotidsequenz von Interesse mit der/den regulatorischen Sequenzen) in einer Weise verknüpft ist, welche die Expression der Nukleotidsequenz gewährleistet (zum Beispiel in einem in vitro Transkription/Translations-System oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingeführt wird). Der Begriff „regulatorische Sequenz" beabsichtigt Promotor, Enhancer und andere Expressionskontroll-Elemente (zum Beispiel Polyadenylierungssignale) einzuschließen. Solche regulatorischen Sequenzen sind, zum Beispiel in Göddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) oder siehe: Gruber und Crosby in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, eds. Glick und Thomson, Kapitel 7, 89-108, CRC Press: Boca Raton, Florida, einschließlich den Referenzen darin, beschrieben. Regulatorische Sequenzen schließen jene ein, die die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Typen von Wirtszellen vermitteln und jene, die die Expression von Nukleotidsequenzen nur in bestimmten Wirtszellen oder unter bestimmten Bedingungen vermitteln. Einem Fachmann ist bekannt, dass das Design des Expressionsvektors von solchen Faktoren wie zum Beispiel der Wahl der zu tranformierenden Wirtszelle, dem Expressionsniveau des gewünschten Proteins, etc. abhängen kann. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können in die Wirtszelle eingeführt werden, um dabei Proteine oder Peptide, einschließlich Fusionsproteine oder Peptide zu produzieren, die von hierin beschriebenen Nukleinsäuren kodiert werden (zum Beispiel GBSRP's, Mutantenformen von GBSRP's, Fusionsproteinen, etc.).
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren können für die Expression von GBSRP's in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen konstruiert werden. Zum Beispiel können GBSRP Gene in bakteriellen Zellen wie zum Beispiel C. glutamicum, Insektenzellen (Verwendung von Baculovirus Expressionsvektoren), Hefe und andere Pilzzellen (siehe Romanos, M.A. et al., 1992 Foreign gene expression in yeast: a review, Yeast 8:423-488; van den Hondel, C.A.M.J.J. et al., 1991 Heterologous gene expression in filamentous fungi, in: More Gene Manipulations in Fungi, J.W. Bennet & L.L. Lasure, eds., p. 396-428: Academic Press: San Diego; und van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J., 1991 Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J.F. et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge), Algen (Falciatore et al., 1999 Marine Biotechnology 1(3):239-251), Ciliaten des Typs: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Pseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella und Stylonychia, besonders der Gattung Stylonychia lemnae mit Vektoren gemäß einem in WO 98/01572 beschriebenen Transformationsverfahren und vielzelligen Pflanzenzellen (siehe Schmidt, R. and Willmitzer, L., 1988 High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants, Plant Cell Rep. 583-586); Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Chapter 6/7, S.71-119 (1993); F.F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds. Kung und R. Wu, 128-43, Academic Press: 1993; Potrykus, 1991 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42:205-225 und darin zitierte Referenzen) oder Säugerzellen, exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden weiterhin in Göddel, Gene Expression Technology. Methods in Enzymology 185, Academic Press: San Diego, CA (1990) diskutiert. Alternativ kann der rekombinante Expressionsvektor in vitro zum Beispiel durch die Verwendung von T7 Promotor regulatorischen Sequenzen und T7 Polymerase transkribiert und translatiert werden.
Die Expression von Proteinen in Prokaryoten wird meistens mit Vektoren durchgeführt, die konstitutive oder induzierbare Promotoren enthalten, die die Expression von entweder Fusions- oder Nichtfusions-Proteinen regulieren. Fusionsvektoren hängen eine Anzahl von Aminosäuren an ein darin kodiertes Protein gewöhnlich an den Aminoterminus des rekombinanten Proteins aber auch an den C-Terminus oder fusioniert innerhalb geeigneter Regionen in den Proteinen. Solche Fusionsvektoren dienen normalerweise drei Zwecken: 1) zur Erhöhung der Expression eines rekombinanten Proteins; 2) zur Erhöhung der Löslichkeit eines rekombinanten Proteins; und 3) zur Unterstützung in der Aufreinigung eines rekombinanten Proteins indem sie als Ligand in der Affinitätsaufreinigung fungieren. Oft wird in Fusionsvektoren eine proteolytische Spaltstelle (cleavage site) an der Kontaktstelle des Fusionsteils und des rekombinanten Proteins eingeführt, um die Trennung des rekombinanten Proteins von dem Fusionsteil nach Aufreinigung des Fusionsproteins zu ermöglichen. Solche Enzyme, und ihre verwandten Erkennungssequenzen, schließen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase ein.
Typische Fusions-Expressionsvektoren schließen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D.B. and Johnson, K.S., 1988 Gene 67:31-40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) ein, welche entsprechend Glutathion-S-Transferase (GST), Maltose E Bindeprotein oder Protein A mit dem rekombinanten Zielprotein fusionieren. In einer Ausführungsform wurde die kodierenden Sequenz des GBSRPs in einen pGEX Expressionsvektor kloniert, um einen Vektor zu erzeugen, der für ein Fusionsprotein kodiert, das in Richtung N-Terminus zu C-Terminus GST-Thrombin Spaltstelle-X Protein umfasst. Das Fusionsprotein kann durch Affinitäts-Chromatographie unter Verwendung von Glutathion-Agarose Granulat aufgereinigt werden. Rekombinantes GBSRP, das nicht mit GST fusioniert ist, kann durch Spaltung des Fusionsproteins mit Thrombin zurückgewonnen werden.
Beispiele für geeignete induzierbare Nichtfusions-E. coli Expressionsvektoren schließen pTrc (Amann et al., 1988 Gene 69:301-315) und pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press: San Diego, Californien (1990)60-89) ein. Die Zielgenexpression von dem pTrc Vektor beruht auf der Wirts-RNA Polymerase Transkription von einem Hybrid trp-lac Fusionspromotor. Die gezielte Genexpression von dem pET 11 d Vektor beruht auf der Transkription von einem T7 gn10-lac Fusionspromotor, vermittelt durch eine coexprimierte virale RNA-Polymerase (T7 gn1). Diese virale Polymerase wird durch die Wirtsstämme BL21(DE3) oder HMS174(DE3) durch einen residenten Lambda Prophagen bereitgestellt, der ein T7 gn1 Gen unter der transkriptionalen Kontrolle des lacUV5 Promotor enthält.
Eine Strategie, um die Expression des rekombinanten Proteins zu maximieren, ist, das Protein in einem Wirtsbakterium mit einer eingeschränkten Fähigkeit zur proteolytischen Spaltung des rekombinanten Proteins zu exprimieren (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press: San Diego, Californien (1990) 119-128). Eine andere Strategie ist, die Sequenz der in einen Expressionsvektor einzufügenden Nukleinsäure zu modifizieren, so dass die individuellen Codons für jede Aminosäure jene sind, die vorzugsweise in dem für die Expression ausgewählten Bakterium, wie zum Beispiel C. glutamicum (Wada et al., 1992 Nuceic Acids Res. 20:2111-2118) benutzt werden. Solche Änderungen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können durch Standard-DNA-Synthesetechniken durchgeführt werden.
In einer anderen Ausführungsform ist der GBSRP Expressionsvektor ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele für Vektoren für die Expression in der Hefe S. cerevisiae schließen pYEPSec1 (Baldari, et al., 1987 Embo J. 6:229-234), pMFa (Kurjan and Herskowitz, 1982 Cell 30:933-943), pJRY88 (Schultz et al., 1987 Gene 54:113-123), und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) ein. Vektoren und Methoden für die Konstruktion von Vektoren, die für die Verwendung in anderen Pilzen, wie zum Beispiel den filamentösen Pilzen, geeignet sind, schließen jene ein, die in: van den Hondel, C.A.M.J.J. & Punt, P.J. (1991) „Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J.F. Peberdy, et al., eds., p. 1-28, Cambridge University Press: Cambridge, aufgeführt sind.
Alternativ können die erfindungsgemäßen GBSRP's in Insektenzellen durch die Verwendung von Baculovirus Expressionsvektoren exprimiert werden. Baculovirus Vektoren, die für die Expression von Proteinen in kultivierten Insektenzellen (zum Beispiel Sf9 Zellen) zur Verfügung stehen, schließen die pAc Serie (Smith et al., 1983 Mol. Cell Biol. 3:2156-2165) und die pVL Serie (Lucklow and Summers, 1989 Virology 170:31-39) ein.
In noch einer anderen Ausführungsform wird eine erfindungsgemäße GBSRP Nukleinsäure in Säugerzellen durch die Verwendung eines Säuger-Expressionsvektors exprimiert. Beispiele für Säuger-Expressionsvektoren schließen pCDM8 (Seed, B., 1987 Nature 329:840) und pMT2PC (Kaufman et al., 1987 EMBO J. 6:187-195) ein. Wenn in Säugerzellen verwendet, werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors oft durch virale regulatorische Elemente bereitgestellt. Zum Beispiel sind häufig verwendete Promotoren aus Polyoma, Adenovirus 2, Cytomegalovirus und Simian Virus 40 abgeleitet. Für andere geeignete Systeme, für sowohl prokaryotische und eukaryotische Zellen, siehe Kapitel 16 und 17 in Sambrook, J., Fritsh, E.F., und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
In einer anderen Ausführungsform ist der rekombinante Säuger-Expressionsvektor dazu fähig, die Expression der Nukleinsäure, bevorzugt in einem bestimmten Zelltyp (zum Beispiel werden gewebsspezifische regulatorische Elemente verwendet, um die Nukleinsäure zu exprimieren) zu regulieren. Gewebsspezifische regulatorische Elemente sind im Fachgebiet bekannt. Nicht-beschränkende Beispiele geeigneter gewebsspezifischer Promotoren schließen den Albumin Promotor (Leber-spezifisch; Pinkert et al., 1987 Genes Dev. 1:268-277), Lymphoid-spezifische Promotoren (Calame and Eaton, 1988 Adv. Immunol. 43:235-275), insbesondere Promotoren von T-Zell Rezeptoren (Winoto and Baltimore, 1989 EMBO J. 8:729-733) und Immunglobuline (Banerji et al., 1983 Cell 33:729-740; queen and Baltimore, 1983 Cell 33:741-748), Neuron-spezifische Promotoren (zum Beispiel der Neurofilament-Promotor; Byrne and Ruddle, 1989 PNAS 86:5473-5477), Pankreas-spezifische Promotoren (Edlund et al., 1985 Science 230:912-916), und Brustdrüsen-spezifische Promotoren (zum Beispiel Milchserum-Promotor; U.S. Patent Nr. 4,873,316 und Europäische Antragsveröffentlichung Nr.264,166) ein. Wachstumsregulatorische Promotoren sind auch inbegriffen, zum Beispiel der Maus hox-Promotor (Kessel and Gruss, 1990 Science 249:374-379) und der Fetoprotein-Promotor (Campes and Tighman, 1989 Genes Dev. 3:537-546).
In einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen GBSRP's in einzelligen Pflanzenzellen (wie zum Beispiel Algen) (siehe Falciatore et al., 1999 Marine Biotechnology 1(3):239-251 und Referenzen darin) und Pflanzenzellen höherer Pflanzen (zum Beispiel den Spermatophyten, wie zum Beispiel Getreide-Pflanzen) exprimiert werden. Beispiele von Pflanzenexpressionsvektoren schließen jene ein, die in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. And Masterson, R., 1992 New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20:1195-1197; und Bevan, M.W., 1984 Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12:8711-8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, eds.: Kung and R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38, aufgeführt sind.
Eine Pflanzenexpressionskassette enthält vorzugsweise regulatorische Sequenzen, die dazu fähig sind, die Genexpression in Pflanzenzellen zu steuern und operativ verknüpft sind, so dass jede Sequenz seine Funktion, zum Beispiel die Beendigung der Transkription durch Polyadenylierungssignale, erfüllen kann. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind jene, die aus Agrobacterium tumefaciens t-DNA stammen, wie zum Beispiel das Gen 3, bekannt als Octopin-Synthase des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., 1984 EMBO J. 3:835) oder funktionelle Äquivalente davon, aber auch alle anderen Terminatoren, die in Pflanzen funktionell aktiv sind, sind geeignet.
Weil die Pflanzengenexpression sehr oft auf transkriptionellem Niveau nicht beschränkt ist, enthält eine Pflanzenexpressionskassette vorzugsweise andere operativ verknüpfte Sequenzen wie Translationsenhancer, wie zum Beispiel die Übersteuerungssequenz, die die 5'-nichttranslatierte Leadersequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus enthält, welche das Protein-zu-RNA-Verhältnis erhöht (Gallie et al., 1987 Nucl. Acids Research 15:8693-8711).
Die Pflanzengenexpression muss operativ an einen geeigneten Promotor geknüpft sein, der die Genexpression in einer zeitgemäßen, zell- oder gewebespezifischen Art und Weise gewährleistet. Bevorzugt werden Promotoren, die die konstitutive Expression steuern (Benfey et al., 1989 EMBO J. 8:2195-2202), wie jene, die von Pflanzenviren wie dem 35S CAMV (Franck et al., 1980 Cell 21:285-294), dem 19S CaMV (siehe auch U.S. Patent Nr. 5352605 und PCT Anmelde-Nr. WO 8402913) abgeleitet sind oder Pflanzen Promotoren, wie jene der in U.S. Patent Nr. 4,962,082 beschriebenen kleinen Rubisco-Untereinheit.
Andere bevorzugte Sequenzen für die Verwendung in Pflanzengenexpressionskassetten sind Targeting-Sequenzen, die nötig sind, um das Genprodukt in sein geeignetes Zellkompartiment (für einen Oberblick siehe Kermode, 1996 Crit. Rev. Plant Sci. 15(4):285-423 und darin zitierte Referenzen) wie zum Beispiel die Vakuole, den Nukleus, alle Typen von Plastiden wie Amyloplasten, Chloroplasten, Chromoplasten, dem extrazellulären Zwischenraum, Mitochondrien, das Endoplasmatische Retikulum, Ölkörper, Peroxisomen und andere Kompartimente der Pflanzenzelle, zu dirigieren.
Die Pflanzengenexpression kann auch durch einen induzierbaren Promotor realisiert werden (siehe Gatz, 1997 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48:89-108). Chemisch induzierbare Promotoren sind besonders geeignet, wenn die Genexpression in einer zeitspezifischen Art und Weise stattfinden soll. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salicylsäure induzierbarer Promotor (PCT Anmelde-Nr. WO 95/19443), ein Tetrazyklin induzierbarer Promotor (Gatz et al., 1992 Plant J. 2:397-404) und ein Ethanol induzierbarer Promotor (PCT Anmelde-Nr. WO 93/21334).
Auch sind geeignete Promotoren, die auf biotische oder abiotische Stressbedingungen reagieren, solche wie beispielsweise der pathogene induzierbare PRP1-Gen Promotor (Ward et al., 1993 Plant. Mol. Biol. 22:361-366), der Hitzeinduzierbare hsp80-Promotor der Tomate (U.S. Patent Nr. 5187267), der Kälteinduzierbare Alpha-Amylase Promotor der Kartoffel (PCT Anmelde-Nr. WO 96/12814) oder der Wunden-induzierbare pinII-Promotor (Europäisches Patent Nr. 375091). Für andere Beispiele Trocken-, Kälte- und Salz-induzierbarer Promotoren, wie zum Beispiel der RD29A Promotor, sei auf Yamaguchi-Shinozalei et al. (1993 Mol. Gen. Genet. 236:331-340) verwiesen.
Besonders bevorzugt sind solche Promotoren, die die Genexpression in spezifischen Geweben und Organen, wie zum Beispiel Leitzellen und die Wurzelhaarzellen gewährleisten. Geeignete Promotoren schließen den Napin-Gen Promotor aus Raps (U.S. Patent Nr. 5,608,152), den USP-Promotor aus Vicia faba (Bäumlein et al., 1991 Mol Gen Genet. 225(3):459-67), den Oleosin-Promotor aus Arabidopsis (PCT Anmelde-Nr. WO 98/45461), den Phaseolin-Promotor aus Phaseolus vulgaris (U.S. Patent Nr. 5,504,200), den Bce4-Promotor aus Brassica (PCT Anmelde-Nr. WO 91/13980) oder den Legumin B4 Promotor (LeB4; Bäumlein et al., 1992 Plant Journal, 2(2):233-9) sowie Promotoren ein, die eine keimspezifische Expression in monokotyledonen Pflanzen wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis, etc. gewährleisten. Geeignete Promotoren, die zu erwähnen sind, sind der Ipt2 oder Ipt1-Gen Promotor aus Gerste (PCT Anmelde-Nr. WO 95/15389 und PCT Anmelde-Nr. WO 95/23230) oder jene, die in PCT Anmelde-Nr. WO 99/16890 (Promotoren von dem Gerste Hordein-Gen, Reis Glutelin Gen, Reis Oryzin Gen, Reis Prolamin Gen, Weizen Gliadin Gen, Weizen Glutelin Gen, Mais Zein Gen, Hafer Glutelin Gen, Hirse Kasirin-Gen und Roggen Secalin Gen) beschrieben sind.
Außerdem sind Promotoren besonders geeignet, die eine Plastidenspezifische Genexpression gewähren, da Plastiden das Kompartiment sind, wo die Lipid-Biosynthese stattfindet. Geeignete Promotoren sind der virale RNA-Polymerase Promotor, der in PCT Anmelde-Nr. WO 95/16783 und PCT Anmelde-Nr. WO 97/06250 beschrieben ist und der in PCT Anmelde-Nr. WO 99/46394 beschriebene clpP-Promotor aus Arabidopsis.
Ein rekombinanter Expressionsvektor, der ein erfindungsgemäßes GBSRP DNA Molekül umfasst, dass in den Expressionsvektor in einer antisense Orientierung kloniert wurde, kann bereitgestellt werden. Das heißt, dass das DNA Molekül funktionsfähig mit einer regulatorischen Sequenz in einer Art und Weise verknüpft ist, die die Expression (durch Transkription des DNA Moleküls) eines RNA Moleküls, das antisense zu einer GBSRP mRNA ist, erlaubt. Es können regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, die funktionsfähig mit einem Nukleinsäure Molekül, das in der antisense Orientierung kloniert wurde, verknüpft sind, welche die kontinuierliche Expression des antisense RNA Moleküls in einer Vielzahl von Zelltypen regulieren. Zum Beispiel können virale Promotoren und/oder Enhancer, oder regulatorische Sequenzen ausgewählt werden, welche die konstitutive, gewebsspezifische oder zellspezifische Expression der antisense RNA regulieren. Der antisense Expressionsvektor kann in der Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder abgeschwächten Virus sein, worin die antisense Nukleinsäure unter Kontrolle einer hoch-effizienten regulatorischen Region produziert wird. Die Aktivität der regulatorischen Region kann durch den Zelltyp, in welchen der Vektor eingeführt wird, bestimmt werden. Für eine Diskussion der Regulation der Genexpression unter Verwendung von antisense Genen wird auf Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Review – Trends in Genetics, Vol. 1(1) 1986 und Mol et al., 1990 FEBS Letters 268:427-430 verwiesen.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft Wirtszellen, in welche ein rekombinanter erfindungsgemäßer Expressionsvektor eingeführt wurde. Die Begriffe „Wirtszelle" und „rekombinante Wirtszelle" werden hierin synonym verwendet. Es ist verständlich, dass solche Begriffe nicht nur auf den bestimmten Gegenstand Zelle verweisen, sondern auch auf den Nachkommen oder möglichen Nachkommen einer solchen Zelle anwendbar sind. Da bestimmte Modifikationen in nachfolgenden Generationen infolge von entweder Mutationen oder Umwelteinflüssen auftreten können, können solche Nachkommen faktisch nicht mit der Mutterzelle identisch sein, sie werden jedoch noch vom Umfang des hierin benutzten Begriffs eingeschlossen.
Eine Wirtszelle kann eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Zum Beispiel kann ein GBSRP in bakteriellen Zellen wie zum Beispiel C. glutamicum, Insektenzellen, Pilzzellen oder Säugerzellen (wie zum Beispiel Chinesische Hamster Ovarium-Zellen (CHO) oder COS Zellen), Algen, Ciliaten, Pflanzenzellen, Pilzen oder anderen Mikroorganismen wie C. glutamicum exprimiert werden. Andere geeignete Wirtszellen sind dem Fachmann bekannt.
Vektor-DNA kann in prokaryotische oder eukaryotische Zellen durch konventionelle Transformations- oder Transfektionstechniken eingeführt werden. Wie hierin verwendet, sollen die Begriffe „Transformation", „Transfektion", „Konjugation" und „Transduktion" auf ein Vielfalt von fachlich anerkannten Techniken für die Einführung einer fremden Nukleinsäure (zum Beispiel DNA) in eine Wirtszelle verweisen, einschließlich Calcium-Phosphat oder Calcium-Chlorid Co-Präzipitation, DEAE-Dextran vermittelte Transfektion, Lipofektion, natürliche Kompetenz, chemisch-vermittelter Transfer und Elektroporation. Geeignete Methoden zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen, einschließlich Pflanzenzellen, können in Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^nd, ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Labor-Unterlagen, wie zum Beispiel Methods in Molecular Biology, 1995, Vol. 44, Agrobacterium protocols, ed: Gartland and Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey, gefunden werden. Da biotische und abiotische Stresstoleranz ein allgemeines Merkmal ist, von dem gewünscht wird, dass es innerhalb einer großen Pflanzenvielfalt wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Raps und Canola, Yuccastärke, Paprika, Sonnenblume und Tagetes, Nachtschattenpflanzen wie Kartoffel, Tabak, Aubergine, und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Luzerne, buschige Pflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Arten, Bäume (Ölpalme, Kokosnuss), mehrjähriges Grass und Futterpflanzen vererbt wird, sind diese Erntepflanzen auch bevorzugte Zielpflanzen für eine Genmanipulation als eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Im Besonderen stellt die Erfindung ein Verfahren zur Produktion einer transgenen Pflanze mit einer GBSRP kodierenden Nukleinsäure, wie oben beschrieben, bereit, worin die Expression der Nukleinsäure(n) in der Pflanze, verglichen mit der Wildtyp-Varietät der Pflanze, zu einer erhöhten Toleranz gegenüber Trockenstress und/oder Froststress führt, umfassend: (a) Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor, der eine GBSRP Nukleinsäure, wie oben beschrieben, umfasst und (b) die Erzeugen einer transgenen Pflanze aus der Pflanzenzelle, mit einer, verglichen mit der Wildtyp-Varietät der Pflanze, erhöhten Toleranz gegenüber Trockenstress und/oder Frost-Stress. Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zur Erhöhung der Expression eines Gens von Interesse in einer Wirszelle verglichen mit der Wildtyp-Varietät der Wirtszelle, worin das Gen von Interesse in Antwort auf ein GBSRP transkribiert wird, umfassend (a) Transformieren der Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, der eine GBSRP kodierende Nukleinsäure, wie oben beschrieben, umfasst und (b) Exprimieren des GBSRP in der Wirtszelle, wodurch die Expression des in Antwort auf das GBSRP transkribierten Gens, verglichen mit der Wildtyp-Varietät der Wirtszelle erhöht ist.
Für eine derartige Pflanzentransformation können binäre Vektoren wie zum Beispiel pBinAR verwendet werden (Höfgen and Willmitzer, 1990 Plant Science 66:221-230). Die Konstruktion der binären Vektoren kann mittels Ligation der cDNA in sense oder antisense Orientierung in die T-DNA durchgeführt werden. 5-seitig zu der cDNA aktiviert ein Pflanzenpromotor die Transkription der cDNA. Eine Polyadenylierungssequenz ist 3-seitig zur cDNA lokalisiert. Eine gewebsspezifische Expression kann durch die Verwendung eines gewebsspezifischen Promotors erreicht werden. Zum Beispiel kann die Samen-spezifische Expression durch Klonierung des Napin oder LeB4 oder USP Promotors 5-seitig zu der cDNA erreicht werden. Es kann auch jedes andere Samen-spezifische Promotorelement verwendet werden. Für die kontinuierliche Expression in der ganzen Pflanze kann der CaMV 35S Promotor verwendet werden. Das exprimierte Protein kann durch die Verwendung eines Signalpeptids, zum Beispiel für Plastiden, Mitochondrien oder für das Endoplasmatisches Retikulum (Kermode, 1996 Crit. Rev. Plant Sci. 4 (15):285-423), gezielt auf ein zelluläres Kompartiment gerichtet werden. Das Signalpeptid ist 5-seitig in frame zur cDNA kloniert, um die subzelluläre Lokalisation des Fusionsproteins zu erreichen. Zusätzlich können Promotoren, die auf abiotischen Stress reagieren, wie zum Beispiel der Arabidopsis Promotor RD29A, mit den hierin aufgezeigten Nukleinsäuresequenzen verwendet werden. Ein Fachmann wird erkennen, dass der verwendete Promotor operativ mit der Nukleinsäure verknüpft sein sollte, so dass der Promotor die Transkription der Nukleinsäure bewirkt, was zur Synthese einer mRNA führt, die für ein Polypeptid kodiert. Alternativ kann die RNA eine antisense RNA sein, die verwendet wird, um die anschließende Expression des gleichen oder eines anderen Gens oder Genen zu beeinflussen.
Alternative Transfektionsverfahren schließen den direkten Transfer von DNA in die sich entwickelnden Blüten durch Elektroporation oder Agrobacterium vermittelten Gentransfer ein. Eine Agrobacterium vermittelte Pflanzentransformation kann zum Beispiel durch die Verwendung des GV3101(pMP90) (Koncz and Schell, 1986 Mol. Gen. Genet. 204:383-396) oder des LBA4404 (Clontech) Agrobacterium tumefaciens Stammes durchgeführt werden. Die Transformation kann mittels Standard-Transformations- und Regenerations-Techniken (Deblaere et al., 1994 Nucl. Acids. Res. 13:4777-4788; Gelvin, Stanton B. and Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2^nd Ed. – Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. – in Sect., Ringbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R.; Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993.-360 S., ISBN 0-8493-5164-2) durchgeführt werden. Zum Beispiel kann Raps durch Kotyledon- oder Hypokotyl-Transformation transformiert werden (Moloney et al., 1989 Plant cell Report 8:238-242; De Block et al., 1989 Plant Physiol. 91:694-701). Die Verwendung von Antibiotika für die Agrobacterium- und Pflanzen-Selektion hängt von dem binären Vektor und dem Agrobacterium Stamm, der für die Transformation verwendet wird, ab. Eine Raps-Selektion wird normalerweise durch die Verwendung von Kanamycin, als selektierbarer Marker, durchgeführt. Agrobacterium vermittelter Gentransfer bei Flachs kann zum Beispiel durch die Verwendung einer in Mlynarova et al., 1994 Plant Cell Report 13:282-285, beschriebenen Technik durchgeführt werden. Zusätzlich kann die Transformation von Sojabohne zum Beispiel durch die Verwendung einer in Europäisches Patent Nr. 0424 047, U.S. Patent Nr. 5,322,783, Europäisches Patent Nr. 0397 687, U.S. Patent Nr. 5,376,543 oder U.S. Patent Nr. 5,169,770, beschriebenen Technik durchgeführt werden. Die Transformation von Mais kann durch Partikelbeschuss, Polyethylenglycol vermittelte DNA-Aufnahme oder durch die Silikon-Karbid-Fasertechnik erreicht werden. (Siehe zum Beispiel Freeling and Walbot „The maize handbook" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Ein spezifisches Beispiel der Maistransformation findet sich im U.S. Patent Nr. 5,990,387 und ein spezifisches Beispiel der Weizentransformation findet sich in der PCT-Anmelde-Nr. WO 93/07256.
Für die stabile Transfektion von Säugerzellen ist bekannt, dass in Abhängigkeit des verwendeten Expressionsvektors und der Transfektions-Technik nur ein kleiner Anteil von Zellen die Fremd-DNA in ihr Genom integrieren kann. Um diese Integranten zu identifizieren und zu selektieren, wird im Allgemeinen ein Gen, das für einen selektierbaren Marker kodiert (zum Beispiel Resistenz zu Antibiotika) zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszelle eingeführt. Bevorzugte selektierbare Marker schließen jene ein, die eine Resistenz gegenüber Arzneimitteln verleihen, wie zum Beispiel G418, Hygromycin und Methothrexat oder in Pflanzen die Resistenz gegenüber einem Herbizid, wie zum Beispiel Glyphosat oder Glufosinat, verleihen. Nukleinsäuremoleküle, die für selektierbare Marker kodieren, können in eine Wirtszelle auf dem gleichen Vektor wie der, der für ein GBSRP kodiert, eingeführt werden oder können auf einem separaten Vektor eingeführt werden. Zellen, die stabil mit dem eingeführten Nukleinsäuremolekül transfiziert sind, können zum Beispiel durch Arzneimittel-Selektion (zum Beispielwerden Zellen, die das selektierbare Markergen aufgenommen haben überleben, während die anderen Zellen sterben) identifiziert werden.
Um einen homolog rekombinanten Mikroorganismus zu erzeugen, wird ein Vektor konstruiert, der mindestens einen Teil eines GBSRP-Gens enthält in welchem eine Deletion, Addition oder Substitution eingeführt wurde, um dadurch das GBSRP-Gen zu modifizieren, zum Beispiel es funktionell zu disrumpieren. Vorzugsweise ist das GBSRP-Gen ein Physcomitrella patens GBSRP-Gen, es kann jedoch auch ein Homolog aus einer verwandten Pflanze oder sogar von Säuger-, Hefe- oder Insektenherkunft sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor so gestaltet, dass nach der homologen Rekombination das endogene GBSRP-Gen funktionell disrumpiert ist (zum Beispiel nicht länger für ein funktionelles Protein kodiert; auch bezeichnet als ein Knock-out Vektor). Alternativ kann der Vektor so gestaltet sein, dass nach der homologen Rekombination das endogene GBSRP-Gen mutiert ist oder anderweitig modifiziert ist, aber immer noch für ein funktionelles Protein kodiert (zum Beispiel kann die stromaufwärts gelegene regulatorische Region modifiziert sein, um dadurch die Expression des endogenen GBSRPs zu modifizieren). Um eine Punktmutation durch homologe Mutation zu erzeugen, können DNA-RNA Hybride in einer Technik, die als Chimäroplastik bekannt ist (Cole-Strauss et al., 1999 Nucleic Acids Research 27(5):1323-1330 and Kmiec, 1999 Gene therapy American Scientist 87(3):240-247), verwendet werden. Homologe Rekombinationsmethoden in Physcomitrella patens sind darüber hinaus im Fachgebiet bekannt und ihre Verwendung hierin wird in Erwägung gezogen.
In dem homologen Rekombinationsvektor hingegen ist der modifizierte Teil des GBSRP-Gens an seinem 5'- und 3'-Ende durch ein zusätzliches Nukleinsäuremolekül des GBSRP-Gens flankiert, um die homologe Rekombination zu gestatten, die zwischen dem exogenen vektorkodierten GBSRP-Gen und einem endogenen GBSRP-Gen in einem Mikroorganismus oder einer Pflanze auftritt. Das zusätzliche flankierende GBSRP Nukleinsäuremolekül ist von ausreichender Länge für die erfolgreiche homologe Rekombination mit dem endogenen Gen. Normalerweise, werden mehrere hunderte Basenpaare bis zu Kilobasen an flankierender DNA (sowohl an den 5'- als auch an den 3'-Enden) in den Vektor eingefügt (siehe zum Beispiel Thomas, K.R., and Capecchi, M.R., 1987 Cell 51:503 für eine Beschreibung von homologen Rekombinationsvektoren oder Strepp et al., 1998 PNAS, 95 (8):4368-4373 für cDNA basierende Rekombination in Physcomitrella patens). Der Vektor wird in einen Mikroorganismus oder in eine Pflanzenzelle eingeführt (zum Beispiel durch Polyethylenglycol vermittelte DNA), und Zellen, in welchen das eingeführte GBSRP mit dem endogenen GBSRP-Gen homolog rekombiniert wurde, werden unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Techniken selektiert.
In einer anderen Ausführungsform können rekombinante Organismen produziert werden, die ausgewählte Systeme enthalten, die die regulierte Expression des eingeführten Gens gestatten. Zum Beispiel erlaubt die Aufnahme eines GBSRP-Gens in einen Vektor, wobei das Gen unter der Kontrolle eines lac-Operons steht, die Expression des GBSRP-Gens nur in Gegenwart von IPTG. Solche regulatorischen Systeme sind im Fachgebiet wohl bekannt.
Eine erfindungsgemäße Wirtszelle, wie zum Beispiel eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle in Kultur, kann verwendet werden, um ein GBSRP zu produzieren (zum Beispiel exprimieren). Dementsprechend stellt die Erfindung weiterhin Verfahren bereit, um GBSRP's unter Verwendung von erfindungsgemäßen Wirtszellen zu produzieren. In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die Kultivierung der erfindungsgemäßen Wirtszelle (in welche ein rekombinanter Expressionsvektor, der für ein GBSRP kodiert, eingeführt wurde, oder in das Genom ein Gen, das für ein Wildtyp- oder modifiziertes GBSRP kodiert, eingeführt wurde) in einem geeigneten Medium bis ein GBSRP produziert wird. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin die Isolation von GBSRP's aus dem Medium oder der Wirtszelle.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft die isolierten GBSRP's, wie oben beschrieben, und biologisch aktive Teile davon. Ein „isoliertes" oder „gereinigtes" Protein, oder ein biologisch aktiver Teil davon, ist frei von einigem zellulären Material, wenn es durch rekombinante DNA-Techniken produziert wird, oder von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wird. Die Redewendung „im Wesentlichen frei von zellulärem Material" schließt die Aufbereitungen von GBSRP ein, in denen das Protein von einigen der zellulären Komponenten der Zelle, in der es natürlicherweise oder rekombinant produziert wird, abgetrennt wird. In einer Ausführungsform schließt die Redeweise „im Wesentlichen frei von zellulärem Material" die Aufbereitungen eines GBSRPs ein, die weniger als etwa 30% (an Trockengewicht) an nicht-GBSRP Material (hierin auch bezeichnet als ein „kontaminierendes Protein"), bevorzugter weniger als etwa 20% an nicht-GBSRP Material, noch bevorzugter weniger als etwa 10% an nicht-GBSRP Material, und am meisten bevorzugt weniger als etwa 5% nicht-GBSRP Material aufweisen.
Sobald das GBSRP oder ein biologisch aktiver Teil davon rekombinant hergestellt wird, ist es vorzugsweise auch im Wesentlichen frei von Kulturmedium, zum Beispiel macht das Kulturmedium weniger als etwa 20%, bevorzugter weniger als etwa 10% und am meisten bevorzugt weniger als etwa 5% von des Volumens der Proteinaufbereitung aus. Die Redeweise „im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien" schließt die Aufbereitungen von GBSRP ein, in denen das Protein von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien, die in der Synthese des Proteins involviert sind, abgetrennt wird. In einer Ausführungsform schließt die Redeweise „im Wesentlichen frei von chemischen Vorläufern oder anderen Chemikalien" die Aufbereitungen eines GBSRPs ein, die weniger als etwa 30% (an Trockengewicht) an chemischen Vorläufern oder nicht-GBSRP Chemikalien, bevorzugter weniger als etwa 20% an chemischen Vorläufern oder nicht-GBSRP Chemikalien, noch bevorzugter weniger als etwa 10% an chemischen Vorläufern oder nicht-GBSRP Chemikalien, und am meisten bevorzugt weniger als etwa 5% an chemischen Vorläufern oder nicht-GBSRP Chemikalien aufweisen. In bevorzugten Ausführungsformen fehlen den isolierten Proteinen oder biologisch aktiven Teilen davon kontaminierende Proteine des selben Organismus aus dem das GBSRP stammt. Typischerweise werden solche Proteine durch rekombinante Expression, zum Beispiel eines Physcomitrella patens GBSRPs, in Pflanzen mit Ausnahme von Physcomitrella patens oder Mikroorganismen wie zum Beispiel C. glutamicum, Ciliaten, Algen oder Pilze, produziert.
Die hierin beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, Proteine, Protein-Homologen, Fusionsproteine, Primer, Vektoren und Wirtszellen können in einem oder mehreren der folgenden Verfahren werden: Identifikation von Physcomitrella patens und verwandten Organismen; Kartierung (Mapping) von Genomen von Physcomitrella patens verwandten Organismen; Identifizierung und Lokalisierung von Physcomitrella patens Sequenzen von Interesse; evolutionäre Studien; Bestimmung von GBSRP Regionen, die für die Funktion nötig sind; Regulierung einer GBSRP Aktivität; Regulierung des Stoffwechsels einer oder mehrerer Zellfunktionen; Regulierung des transmembranen Transports einer oder mehrerer Verbindungen und Regulierung der Stressresistenz.
Das Moos Physcomitrella patens repräsentiert ein Mitglied der Moose. Es ist verwandt zu anderen Moosen, wie zum Beispiel Ceratodon purpureus, das zum Wachstum in Abwesenheit von Licht fähig ist. Moose wie Ceratodon und Physcomitrella patens weisen einen hohen Grad an Homologie auf dem DNA-Sequenz- und Polypeptid-Ebene auf, was die Verwendung eines heterologen Screenings von DNA-Molekülen mit Sonden erlaubt, die aus anderen Moosen oder Organismen abgeleitet sind, wodurch die Herleitung einer Konsensus-Sequenz ermöglicht wird, die für ein heterologes Screening oder Funktionsaufklärung und – Vorhersagen von Genfunktionen in dritten Arten geeignet ist. Die Fähigkeit, solche Funktionen zu identifizieren, kann damit zum Beispiel bei Vorhersagen einer Enzym-Substratspezifität eine signifikante Bedeutung haben. Ferner können diese Nukleinsäuremoleküle als Referenz-Punkte für das Kartieren von Moos-Genomen oder von Genomen verwandter Organismen dienen.
Die erfindungsgemäßen GBSRP Nukleinsäuremoleküle haben eine Vielzahl von Anwendungen. Am bedeutendsten ist, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen verwendet werden können, um Pflanzen zu transformieren, wodurch die Toleranz gegenüber Stress wie zum Beispiel Trockenheit und Kälte induziert wird. Die vorliegende Erfindung stellt daher eine transgene Pflanze bereit, die mit einer GBSRP Nukleinsäure, wie oben beschrieben, transformiert ist, worin die Expression der Nukleinsäuresequenz in der Pflanze zu einer, verglichen mit der Wildtyp-Varietät der Pflanze, erhöhten Toleranz gegenüber Trockenstress und/oder Frost-Stress führt.
Die transgene Pflanze kann eine Monokotyledone oder ein Dikotyledone sein. Die Erfindung stellt weiterhin bereit, dass die transgene Pflanze zum Beispiel aus Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Raps, Canola, Yuccastärke, Paprika, Sonnenblume, Tagetes, Nachtschattenpflanzen, Kartoffel, Tabak, Aubergine, Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Luzerne, Kaffee, Kakao, Tee, Salix-Arten, Ölpalme, Kokosnuss, mehrjähriges Grass und Futterpflanzen, ausgewählt werden kann.
Im Besonderen beschreibt die vorliegende Erfindung die Verwendung der Expression von GBP-1 aus Physcomitrella patens, um Trocken-tolerante und/oder Kälte-tolerante Pflanzen zu konstruieren. Diese Strategie ist hierin für Arabidopsis thaliana, Raps/Canola, Sojabohne, Getreide und Weizen dargelegt worden, jedoch ist ihre Anwendung nicht auf diese Pflanzen begrenzt. Dementsprechend stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die ein GBSRP, ausgewählt aus GBP-1 (SEQ ID NO:11), enthält, worin der Umweltstress Trockenheit oder erhöhte Temperatur ist.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Modifikation von Stresstoleranz, zum Beispiel Trocken- und/oder Kälte-Toleranz, einer Pflanze bereit, umfassend das Modifizieren der Expression eines GBSRP, wie oben beschrieben, in der Pflanze.
Die Erfindung stellt bereit, dass dieses Verfahren so durchgeführt werden kann, dass die Stresstoleranz entweder erhöht oder verringert ist. Im Besonderen stellt die vorliegende Erfindung Verfahren zur Erzeugung einer transgenen Pflanze bereit, die eine, verglichen mit der Wildtyp-Varietät der Pflanze, erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress aufweist, umfassend das Erhöhen der Expression eines GBSRPs in einer Pflanze.
Die Verfahren zur Erhöhung der Expression von GBSRP's können verwendet werden, wobei die Pflanze entweder transgen oder nicht transgen ist. In den Fällen, bei denen die Pflanze transgen ist, kann die Pflanze mit einem Vektor, der irgendeine der oben beschriebenen GBSRP kodierenden Nukleinsäuren enthält, transformiert werden oder die Pflanze kann zum Beispiel mit einem Promotor, der die Expression eines nativen GBSRPs in der Pflanze reguliert, transformiert werden. Die Erfindung stellt bereit, dass solch ein Promotor gewebsspezifisch sein kann. Außerdem kann solch ein Promotor wachstumsreguliert sein. Alternativ können nicht-transgene Pflanzen eine modifizierte Expression des nativen GBSRP durch Induktion eines nativen Promotors aufweisen.
Die Expression von GBP-1 (SEQ ID NO:6) in Zielpflanzen kann erreicht werden durch, ist jedoch nicht beschränkt auf, eines der folgenden Beispiele: (a) konstitutiver Promotor, (b) Stress-induzierbarer Promotor, (c) chemisch-induzierter Promotor und (d) konstruierte Promotorüberexpression, beispielsweise mit Zinkfinger-abgeleiteten Transkriptionsfaktoren (Greisman and Pabo, 1997 Science 275:657). Der letzte Fall beinhaltet die Identifizierung von GBP-1 (SEQ ID NO:11) Homologen in der Zielpflanze sowie ihrer Promotoren. Zinkfinger-enthaltende rekombinante Transkriptionsfaktoren werden konstruiert, um spezifisch mit dem GBP-1 (SEQ ID NO:11) Homolog zu interagieren, wobei die Transkription des entsprechenden Gens aktiviert wird.
Zusätzlich zur Einführung der GBSRP Nukleinsäuresequenzen in transgene Pflanzen können diese Sequenzen auch verwendet werden, um einen Organismus wie Physcomitrella patens oder einen nahen Verwandten davon zu identifizieren. Sie können auch verwendet werden, um die Anwesenheit von Physcomitrella patens oder einem Verwandten davon in einer gemischten Population von Mikroorganismen zu identifizieren. Die Erfindung stellt die Nukleinsäuresequenzen einer Anzahl von Physcomitrella patens Genen bereit; durch Erforschung der extrahierten genomischen DNA einer Kultur einer einzelnen oder gemischten Population von Mikroorganismen unter stringenten Bedingungen mit einer Sonde, die eine Region eines Physcomitrella patens Gens umfasst, das einzigartig für diesen Organismus ist, kann man ermitteln, ob dieser Organismus vorliegt.
Ferner können die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Protein-Moleküle als Marker für spezifische Regionen des Genoms dienen. Dies ist nicht nur bei der Genom-Kartierung, sondern auch bei Funktionsstudien von Physcomitrella patens Proteinen nützlich. Um die Region im Genom zu identifizieren, an die ein bestimmtes Physcomitrella patens DNA-Bindeprotein bindet, könnte das Physcomitrella patens Genom beispielsweise verdaut und die Fragmente mit dem DNA-Bindeprotein inkubiert werden. Solche Fragmente, die das Protein binden, können zusätzlich mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen erforscht werden, bevorzugt mit leicht detektierbaren Markierungen. Die Bindung von solch einem Nukleinsäuremolekül an das Genomfragment erlaubt die Lokalisierung des Fragments in der Genomkarte von Physcomitrella patens und, wenn sie mehrere Male mit verschiedenen Enzymen durchgeführt wird, ermöglicht eine schnelle Determination der Nukleinsäuresequenz, an die das Protein bindet. Ferner kann das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül ausreichend homolog zu den Sequenzen verwandter Arten sein, so dass diese Nukleinsäuremoleküle als Marker für die Konstruktion einer genomischen Karte in verwandten Moosen dienen können.
Die erfindungsgemäßen GBSRP Nukleinsäuremoleküle sind auch für evolutionäre und Proteinstruktur-Untersuchungen nützlich. Die Stoffwechsel- und Transport-Prozesse, in welchen die erfindungsgemäßen Moleküle beteiligt sind, werden von einer großen Vielzahl von prokaryotischen und eukaryotischen Zellen verwendet; durch Vergleich der Sequenzen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle mit jenen, die für ähnliche Enzyme aus anderen Organismen kodieren, kann die evolutionäre Verwandtschaft der Organismen beurteilt werden. Auf die gleiche Weise erlaubt solch ein Vergleich eine Beurteilung davon, welche Regionen der Sequenz konserviert sind und welche nicht, was bei der Bestimmung jener Regionen des Proteins, die essenziell für die Funktion des Enzyms sind, helfen kann. Diese Art von Bestimmung ist für Protein-Manipulations-Untersuchungen wertvoll und kann einen Hinweis darauf geben, was das Protein bezüglich einer Mutagenese tolerieren kann, ohne die Funktion zu verlieren.
Die Manipulation der erfindungsgemäßen GBSRP Nukleinsäuremoleküle kann in der Produktion von GBSRP's, die Funktionsunterschiede zu Wildtyp-GBSRP's aufweisen, resultieren. Diese Proteine können im Hinblick auf Effizienz oder Aktivität verbessert sein, können in grösserer Anzahl als gewöhnlich in der Zelle vorliegen oder in ihrer Effizienz oder Aktivität reduziert sein.
Es gibt eine Anzahl von Mechanismen, bei denen die Änderung eines erfindungsgemäßen GBSRPs die Stress-Antwort und/oder Stress-Toleranz direkt beeinflussen kann. In dem Fall von GBSRP exprimierenden Pflanzen kann ein erhöhter Transport zu verbesserter Salz- und/oder gelöste Substanz-Partitionierung innerhalb des Pflanzengewebes und der Organe führen. Durch Erhöhung entweder der Anzahl oder der Aktivität von Transportermolekülen, die Ionenmoleküle aus der Zelle exportieren, ist es möglich, die Salz-Toleranz der Zelle zu beeinflussen.
Die Auswirkung der genetischen Modifikation in Pflanzen, C. glutamicum, Pilzen, Algen oder Ciliaten auf die Stresstoleranz kann durch Wachstum der modifizierten Mikroorganismen oder Pflanzen unter weniger geeigneten Bedingungen und nachfolgendes Analysieren der Wachstumseigenschaften und/oder des Stoffwechsels der Pflanze beurteilt werden. Solche Analysetechniken sind einem Fachmann wohl bekannt und schließen Trockengewicht, Nassgewicht, Protein-Synthese, Kohlenhydrat-Synthese, Lipid-Synthese, Evapotranspirations-Rate, allgemeiner Pflanzen- und/oder Ernteertrag, Blüte, Vermehrung, Samensetzung, Wurzelwachstum, Atmungsrate, Photosyntheserate, etc. ein (Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 17; Rehm et al., 1993 Biotechnology, Vol. 3, Kapitel III: Product recovery and purification, Seite 469-714, VCH: Weinheim; Belter, P.A. et al., 1988 Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J.F. and Cabral, J.M.S., 1992 Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shäwitz, J.A. and Henry, J.D., 1988 Biochemical separations, in: Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. B3, Kapitel 11. Seite 1-27, VCH: Weinheim; and Dechow, F.J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
Zum Beispiel können Hefe-Expressionsvektoren, die die hierin offenbarten Nukleinsäuren oder Fragmente davon umfassen, konstruiert und in Saccharomyces cerevisiae, unter Verwendung von Standard-Protokollen, transformiert werden. Die entstandenen transgenen Zellen können dann auf einen Ausfall oder eine Veränderung ihrer Toleranz gegenüber Trocken- und Temperatur-Stress untersucht werden. Ähnlich können Pflanzenexpressionsvektoren, die die hierin offenbarten Nukleinsäuren oder Fragmente davon umfassen, konstruiert und in eine entsprechende Pflanzenzelle, wie zum Beispiel Arabidopsis, Soja, Raps, Mais, Weizen, Medicago truncatula, etc. unter Verwendung von Standard-Protokollen, transformiert werden. Die entstandenen transgenen Zellen und/oder davon abstammende Pflanzen können dann auf einen Ausfall oder eine Veränderung ihrer Toleranz gegenüber Trocken- und Temperatur-Stress untersucht werden.
Die Manipulation eines oder mehrerer erfindungsgemäßer GBSRP-Gene kann auch zu GBSRP's führen, die veränderte Aktivitäten aufweisen, welche indirekt auf die Stressreaktion und/oder Stresstoleranz von Algen, Pflanzen, Ciliaten oder Pilzen oder anderen Mikroorganismen wie C. glutamicum wirken. Zum Beispiel führen die normalen biochemischen Prozesse des Stoffwechsels zur Produktion einer Vielfalt von Produkten (zum Beispiel Wasserstoffperoxid und andere reaktive Sauerstoff-Arten), welche aktiv mit den gleichen Stoffwechsel-Prozessen interferieren können (zum Beispiel ist Peroxynitrit bekannt, die Tyrosinseitenkette zu nitrieren, und dabei einige Enzyme, die Tyrosin in dem aktiven Zentrum aufweisen, zu inaktivieren (Groves, J.T., 1999 Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2):226-235). Während diese Produkte normalerweise ausgeschieden werden, können Zellen genetisch verändert werden, um mehr Produkte zu transportieren, als es für eine Wildtyp-Zelle typisch ist. Durch Optimierung der Aktivität eines oder mehrerer erfindungsgemäßer GBSRP's, die im Export von spezifischen Molekülen, wie zum Beispiel Salzmolekülen, involviert sind, ist es möglich, die Stresstoleranz der Zelle zu verbessern.
Zusätzlich können die hierin offenbarten Sequenzen oder Fragmente davon verwendet werden, um knockout Mutationen in den Genomen verschiedener Organismen, wie zum Beispiel Bakterien, Säugerzellen, Hefe-Zellen und Pflanzenzellen, zu erzeugen (Girke, T., 1998 The Plant Journal 15:39-48). Die resultierenden knockout Zellen können dann hinsichtlich ihrer Fähigkeit oder Kapazität, verschiedene Stress-Bedingungen zu tolerieren, ihrer Reaktion auf verschiedene Stressbedingungen und der Auswirkungen auf den Phänotypen und/oder Genotypen der Mutation, beurteilt werden. Für andere Verfahren der Geninaktivierung sei auf U.S. Patent Nr. 6004804 „Non-Chimeric Mutational Vectors" und Puttaraju et al., 1999 Spliceosome-mediated RNA trans-splicing as a tool for gene therapy Nature Biotechnology 17:246-252, verwiesen.
Die oben erwähnten Mutagenese-Strategien für GBSRP's, die zu einer erhöhten Stressresistenz führen, sind nicht als beschränkend zu verstehen; Variationen dieser Strategien sind für einen Fachmann offensichtlich. Durch die Verwendung solcher Strategien, und das Einbeziehen der hierin aufgezeigten Mechanismen, können erfindungsgemäße Nukleinsäure- und Protein-Moleküle verwendet werden, um Algen, Ciliaten, Pflanzen, Pilze oder andere Mikroorganismen wie C. glutamicum zu erzeugen, die mutierte GBSRP Nukleinsäure- und Protein-Moleküle exprimieren, so dass die Stresstoleranz verbessert wird.
Die hierin beschriebenen GBSRP's können auch verwendet werden, um Antikörper zu erzeugen, die spezifisch an ein GBSRP, oder einen Teil davon, binden, wenn sie durch eine hierin beschriebene Nukleinsäure kodiert werden. Antikörper können durch viele wohl bekannte Methoden hergestellt werden (siehe zum Beispiel Harlow and Lane, „Antibodies; A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York (1988)). Kurz gefasst, kann einem Tier aufgereinigtes Antigen in einer Menge und in Intervallen injiziert werden, die ausreichend sind, um eine Immunantwort auszulösen. Antikörper können entweder direkt aufgereinigt werden, oder es können Milz-Zellen aus einem Tier bezogen werden. Die Zellen können dann mit einer unsterblichen Zelllinie fusioniert werden und hinsichtlich einer Antikörpersekretion untersucht werden. Die Antikörper können zum Screenen von Nukleinsäure-Klon-Bibliotheken nach Zellen, die das Antigen sekretieren, verwendet werden. Jene positiven Klone können dann sequenziert werden. (Siehe zum Beispiel Kelly et al., 1992 Bio/Technology 10:163-167; Bebbington et al., 1992 Bio/Technology 10:169-175).
Die Formulierungen „selektiv mit dem Polypeptid bindend" und „spezifisch mit dem Polypeptid bindend" bezeichnet eine Bindungsreaktion, die für das Vorliegen des Proteins in einer heterogenen Population von Proteinen und anderen biologischen Präparaten bestimmend ist. Folglich binden unter bestimmten Immuno-Assay Bedingungen die spezifizierten Antikörper, die an ein bestimmtes Protein gebunden sind, nicht in einer signifikanten Menge an andere Proteinen, die in der Probe vorliegen. Die selektive Bindung eines Antikörpers unter solchen Bedingungen kann einen Antikörper erfordern, der nach seiner Spezifität für ein bestimmtes Protein ausgewählt wird. Eine Auswahl an Immuno-Assay Ausführungen kann verwendet werden, um Antikörper auszuwählen, die selektiv an ein bestimmtes Protein binden. Zum Beispiel werden Festphasen-ELISA Immuno-Assays routinemäßig verwendet, um Antikörper auszuwählen, die gezielt immunoreaktiv zu einem Protein sind. Für eine Beschreibung von Immuno-Assay Ausführungen und Bedingungen, die zur Bestimmung ausgewählter Bindungen verwendet werden können sei auf Harlow and Lane, „Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, New York (1988), verwiesen.
In einigen Fällen ist es wünschenswert, monoklonale Antikörper aus verschiedenen Wirten bereitzustellen. Eine Beschreibung von Techniken zur Bereitstellung solcher monoklonalen Antikörper, kann in Stites et al., editors, „Basic and Clinical Immunology," (Lange Medical Publications, Los Altos, Calif., Fourth Edition) und darin zitierten Referenzen gefunden werden sowie in Harlow and Lane („Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988).
In dieser Anmeldung sind verschiedene Publikationen zitiert.
Es wird jedoch zu verstehen gegeben, dass sich das Vorhergehende auf bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung bezieht. Die Erfindung ist ferner durch die folgenden Beispiele erläutert, welche nicht konstruiert wurden, um den Bereich der Erfindung in irgendeiner Art und Weise zu beschränken.
Beispiele
Beispiel 1
Wachstum von Physcomitrella patens Kulturen
Für diese Studie wurden Pflanzen der Art Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. aus der Sammlung der Fachgruppe für genetische Studien der Universität Hamburg verwendet. Sie stammen aus dem Stamm 16/14, der durch H.L.K. Whitehouse in Gransden Wood, Huntingdonshire (England) gesammelt wurde und der aus einer Spore durch Engel (1968, Am. J. Bot. 55, 438-446) subkultiviert wurde. Die Proliferation der Pflanzen wurde mit Hilfe von Sporen und mit Hilfe von Regeneration der Gametophyten durchgeführt. Das Protonema entwickelte sich aus der haploiden Spore als ein Chloroplasten-reiches Chloronema und ein Chloroplasten-armes Caulonema, an welchem sich nach ungefähr 12 Tagen Knopsen bildeten. Diese wuchsen, um Gametophoren zu bilden, die Antheridien und Archegonien tragen. Nach der Befruchtung entstand der diploide Sporophyt mit einer kurzen Seta und der Sporen-Kapsel, in welcher die Meiosporen reiften.
Die Zellkultivierung wurde in einer Klimakammer bei einer Lufttemperatur von 25ºC und einer Lichtintensität von 55 Mikromol^-1m2 durchgeführt (weißes Licht; Philips TL 65W/25 Fluoreszenzröhre) und einem Licht/Dunkelheit-Wechsel von 16/8 Stunden. Das Moos wurde entweder in Flüssigkultur unter Verwendung von Knop Medium entsprechend Reski und Abel (1985, Planta 165:354-358) modifiziert, oder auf Knop Festmedium unter Verwendung von 1% Oxoid-Agar (Unipath, Basingstoke, England) kultiviert. Die Protonemata, die für die RNA und DNA Isolation verwendet wurden, wurden in belüfteten Flüssigkulturen kultiviert. Die Protonemata wurden alle 9 Tage geteilt und in frisches Kulturmedium transferiert.
Beispiel 2
Gesamt-DNA Isolation aus Pflanzen
Die Details für die Isolation von Gesamt-DNA entsprechen der Aufarbeitung von einem Gramm Frischgewicht an Pflanzenmaterial. Die verwendeten Materialien schließen folgende Puffer ein: CTAB-Puffer: 2% (w/v) N-Cethyl-N,N,N-Trimmethylammonium-Bromid (CTAB); 100 mM Tris-HCl pH 8.0; 1.4 M NaCl; 20 mM EDTA; N-Laurylsarcosin-Puffer: 10% (w/v) N-Laurylsarcosin; 100 mM Tris-HCl pH 8.0; 20 mM EDTA.
Das Pflanzenmaterial wurde unter Flüssig-Stickstoff in einem Mörser zerrieben, um ein feines Pulver zu ergeben und in 2 ml Eppendorf-Gefäße transferiert. Das gefrorene Pflanzenmaterial wurde dann mit einer Schicht von 1 ml Aufschluss-Puffer (1 ml CTAB-Puffer, 100 μl von N-Laurylsarcosin-Puffer, 20 μl beta-Mercaptoethanol und 10 μl Proteinase K Lösung, 10 mg/ml) bedeckt und bei 60ºC für eine Stunde unter kontinuierlichem Schütteln inkubiert. Das erhaltene Homogenat wurde in zwei Eppendorf-Gefäße (2 ml) verteilt und zweimal durch Schütteln mit dem gleichen Volumen an Chloroform/Isoamyl-Alkohol (24:1) extrahiert. Für die Phasentrennung wurde jeweils eine Zentrifugation bei 8000 × g für 15 Minuten und Raumtemperatur durchgeführt. Die DNA wurde dann unter Verwendung von eiskaltem Isopropanol bei –70ºC für 30 Minuten präzipitiert. Die präzipitierte DNA wurde bei 4ºC und 10,000 g für 30 Minuten sedimentiert und in 180 μl TE-Puffer resuspendiert (Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6). Für die weitere Aufreinigung wurde die DNA mit NaCl (1.2 M Endkonzentration) behandelt und erneut bei –70ºC für 30 Minuten unter Verwendung des zweifachen Volumens an absolutem Ethanol präzipitiert. Nach einem Waschschritt mit 70% Ethanol wurde die DNA getrocknet und anschließend in 50 μl H₂O + RNAse (50 mg/ml Endkonzentration) aufgenommen. Die DNA wurde über Nacht bei 4ºC aufgelöst und der RNAse-Verdau wurde anschließend bei 37ºC für 1 Stunde durchgeführt. Die Lagerung der DNA erfolgte bei 4ºC.
Beispiel 3
Isolation von Gesamt-RNA und Poly-(A)⁺ RNA und cDNA-Bibliothek Konstruktion aus Physcomitrella patens
Für die Untersuchung von Transkripten wurde sowohl Gesamt-RNA als auch Poly-(A)⁺ RNA isoliert. Die Gesamt-RNA wurde aus 9 Tage altem Wildtyp-Protonemata gemäß der GTC-Methode (Reski et al. 1994, Mol. Gen. Genet., 244:352-359), gewonnen. Die Poly(A)⁺ RNA wurde unter Verwendung von Dyna Beads^R (Dynal, Oslo, Norway) gemäß den Instruktionen des Herstellerprotokolls isoliert. Nach Bestimmung der RNA- oder der Poly(A)⁺ RNA Konzentration wurde die RNA durch Zugabe von 1/10 Volumen an 3 M Natrium-Acetat pH 4.6 und 2 Volumen an Ethanol präzipitiert und bei –70ºC gelagert.
Für die Konstruktion der cDNA Bibliothek wurde die Erststrangsynthese unter Verwendung von reverser Transkriptase des Maus-Leukämie-Virus (Roche, Mannheim, Deutschland) und Oligo-d(T)-Primern, die Zweitstrang-Synthese durch Inkubation mit DNA-Polymerase I, Klenow Enzym und RNAseH Verdau bei 12ºC (2 Stunden), 16ºC (1 Stunde) und 22ºC (1 Stunde), erzielt. Die Reaktion wurde durch Inkubation bei 65ºC (10 Minuten) gestoppt und anschließend auf Eis transferiert. Doppelsträngige DNA-Moleküle wurden durch T4-DNA-Polymerase (Roche, Mannheim) bei 37ºC (30 Minuten) stumpfendig gemacht. Nukleotide wurden durch Phenol/Chloroform Extraktion und Sephadex G50 Rotationssäulen entfernt. EcoRI Adaptoren (Pharmacia, Freiburg, Germany) wurden an die cDNA-Enden durch T4-DNA-Ligase (Roche, 12ºC, über Nacht) ligiert und durch Inkubation mit Polynukleotid-Kinase (Roche, 37ºC, 30 Minuten) phosphoryliert. Dieses Gemisch wurde zur Trennung auf ein niedrig-schmelzendes Agarase-Gel aufgetragen. DNA-Moleküle, die größer als 300 Basenpaare waren, wurden aus dem Gel eluiert, Phenol extrahiert, mit Elutip-D-Säulen (Schleicher und Schüll, Dassel, Deutschland) konzentriert und und unter Verwendung des Gigapack Gold Kit (Stratagene, Amsterdam, Niederlande), gemäß den Herstellerinstruktionen mit den Vektorarmen ligiert, in Lambda ZAPII Phagen oder Lambda ZAP-Express Phagen verpackt.
Beispiel 4
Sequenzierung und Funktionsvermerk von Physcomitrella patens ESTs
cDNA Bibliotheken, wie in Beispiel 3 beschrieben, wurden für die DNA-Sequenzierung, entsprechend den Standardverfahren und insbesondere mittels der Ketten-Abbruch Methode unter Verwendung des ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer, Weiterstadt, Deutschland), verwendet. Eine Zufallssequenzierung wurde im Anschluss an die präparative Plasmidisolation aus den cDNA Bibliotheken mittels in vivo Massen-Ausschluss, Retransformation und anschließendes Plattieren von DH10B auf Agarplatten (Material- und Protokoll-Details von Stragagene, Amsterdam, Niederlande) durchgeführt. Plasmid-DNA wurde aus E. coli über Nacht-Kulturen, welche in Luria-Broth Medium, das Ampicillin enthält, kultiviert wurden (siehe Sambrook et al. 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) an einem Qiagen DNA Präparations-Roboter (Qiagen, Hilden), entsprechend dem Hersteller-Protokoll, präpariert. Sequenzierungs-Primer mit folgenden Nukleotidsequenzen wurden verwendet:
5'-CAGGAAACAGCTATGACC-3' SEQ ID NO:16
5'-CTAAAGGGAACAAAAGCTG-3' SEQ ID NO:17
5'-TGTAAAACGACGGCCAGT-3' SEQ ID NO:18
Die Sequenzen wurden unter Verwendung des von Bio-Max (München, Deutschland) kommerziell bereitgestellten Software-Pakets EST-MAX prozessiert und vermerkt. Das Programm umfasst praktisch alle bioinformatischen Verfahren, die für die funktionelle und strukturelle Charakterisierung von Proteinsequenzen wichtig sind. Für eine Referenz sei auf die Website pedant.mips.biochem.mpg.de verwiesen. Die wichtigsten Algorithmen, die in EST-MAX einbezogen sind, sind: FASTA: sehr sensitive Sequenz-Datenbank Durchsuchungen mit Schätzwerten zur statistischen Signifikanz; Pearson W.R. (1990) Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA. Methods Enzymol. 183:63-98; BLAST: sehr sensitive Sequenz-Datenbank Durchsuchungen mit Schätzwerten zur statistischen Signifikanz. Altschul S.F., Gish W., Miller W., Myers E.W., and Lipman D.J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology 215:403-10; PREDATOR: Hohe Genauigkeit der Sekundär-Struktur-Vorhersage von einzelnen und multiplen Sequenzen. Frishman, D. and Argos, P. (1997) 75% Genauigkeit bei Protein-Sekundär-Struktur Vorhersage. Proteins, 27:329-335; CLUSTALW: Multiples Sequenzen Alignment. Thompson, J.D., Higgins, D.G. and Gibson, T.J. (1994) CLUSTAL W: Erhöhung der Sensitivität des progressiven multiplen Sequenz-Alignments durch Sequenzwichtung, Positionsspezifische Gap-Strafsummen und Gewichtsmatrixauswahl. Nucleic Acids Research, 22:4673-4680; TMAP: Transmembran-Region Vorhersage von vielfach aligned Sequenzen. Persson, B. and Argos, P. (1994) Prediction of transmembrane segments in proteins utilizing multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 237:182-192; ALOM2: Transmembranregion-Vorhersage von Einzelsequenzen. Klein, P., Kanehisa, M., and DeLisi, C. Prediction of protein function from sequence properties: A discriminate analysis of a database. Biochim. Biophys. Acta 787:221-226 (1984). Version 2 von Dr. K. Nakai; PROSEARCH: Nachweis von PROSITE Proteinsequenz-Mustern. Kolakowski L.F. Jr., Leunissen J.A.M., Smith J.E. (1992) ProSearch: schnelle Suche von Proteinsequenzen mit regulärem Expressionsmuster, bezogen auf Protein-Struktur und Funktion. Biotechniques 13, 919-921; BLIMPS: Ähnlichkeits-Durchsuchungen gegen eine Datenbank von lückenlosen Blöcken. J.C. Wallace and Henikoff S., (1992); PATMAT: Ein Durchsuchungs- und Extraktions-Programm für Sequenzen, Muster- und Block-Anfragen und Datenbanken, CABIOS 8:249-254. Geschrieben von Bill Alford.
Beispiel 5
Identifikation von Physcomitrella patens ORFs, die GBP-1 und anderen Proteinen entsprechen, welche nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst sind, wie besipielsweise GBP-2, GBP-3, GBP-4 und GBP-5
Die nachstehend in Tabelle 1 gezeigten Physcomitrella patens partiellen cDNAs (ESTs) wurden in dem Physcomitrella patens EST Sequenzierung-Programm, unter Verwendung des Programms EST-MAX mittels BLAST Analyse identifiziert. Die Sequenz-Identifikationsnummern, die diesen ESTs entsprechen, sind wie folgt: GBP-1 (SEQ ID NO:1) (von der vorliegenden Erfindung umfasst), GBP-2 (SEQ ID NO:2) (nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst), GBP-3 (SEQ ID NO:3) (nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst), GBP-4 (SEQ ID NO:4) (nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst) und GBP-5 (SEQ ID NO:5) (nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst).
Tabelle 1
Tabelle 2
Grad der Aminosäure-Identität und Ähnlichkeit von PpGBP-1 und anderen homologen Proteinen (paarweises Vergleichsprogramm wurde verwendet: Gap-Strafsumme: 10, Gap Ausdehnungs-Strafsumme: 0.1; Punktzahl-Matrix: blosum62)
Beispiel 6
Klonierung der vollständigen Physcomitrella patens cDNA, die für GBP-1 und andere Proteine kodieren, die nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst sind, zum Beispiel GBP-2, GBP-3, GBP-4 und GBP-5.
Um das vollständige PpGBP-2 (SEQ ID NO:7) zu isolieren, wurde eine PCR, wie nachstehend unter Vollständiger Amplifikation beschrieben, durchgeführt, unter Verwendung der in Beispiel 5 beschriebenen Original-ESTs, als Templat, da sie vollständig waren (für Primer siehe Tabelle 3). Um die Klone zu isolieren, die für PpGBP-1 (SEQ ID NO:6), PpGBP-3 (SEQ ID NO:8), PpGBP-4 (SEQ ID NO:9) und PpGBP-5 (SEQ ID NO:10) aus Physcomitrella patens kodieren, wurden cDNA Bibliotheken mit dem SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clonetech Laboratories) gemäß den Herstellerinstruktionen erzeugt. Gesamt-RNA, die wie in Beispiel 3 beschrieben isoliert wurde, wurde als Templat verwendet. Die Kulturen wurden vor der RNA-Isolation wie folgt behandelt: Salzstress: 2, 6, 12, 24, 48 h mit 1 M NaCl supplementiertem Medium; Kältestress: 4ºC für die gleichen Zeitpunkte wie für Salz; Trockenstress: die Kulturen wurden auf trockenes Filterpapier, für die gleichen Zeitpunkte wie oben angegeben, inkubiert. Die RNA wurde dann isoliert und für die Isolation verwendet.
5' RACE Protokoll
Die EST Sequenzen PpGBP-1 (SEQ ID NO:1), PpGBP-3 (SEQ ID NO:3), PpGBP-4 (SEQ ID NO:4), PpGBP-5 (SEQ ID NO:5), die aus der in Beispiel 5 beschriebenen Datenbank-Durchsuchung identifiziert wurden, wurden verwendet, um Oligos für RACE (siehe Tabelle 3) zu konstruieren. Die verlängerten Sequenzen dieser Gene werden mittels Durchführung einer Schnellamplifikation (Rapid Amplification) von cDNA Enden durch Polymerase Kettenreaktion (RACE PCR) erhalten, wobei der Advantage 2 PCR Kit (Clontech Laboratories) und der SMART RACE cDNA Amplifikations-Kit (Clontech Laboratories), unter Verwendung eines Biometra T3 Thermocycler, gemäß den Herstellerangaben verwendet wurde.
Die aus den RACE Reaktionen erhaltenen Sequenzen enthielten das 5' Ende der vollständigen kodierenden Regionen von PpGBP-1, PpGBP-3, PpGBP-4 und PpGBP-5 und wurden für das Konstruieren von Oligos für das vollständige Klonieren der entsprechenden Gene verwendet (siehe unten unter „vollständige-Amplifikation").
Vollständige Amplifikation
Vollständige Klone, die PpGBP-2 (SEQ ID NO:7) entsprechen, wurden mittels Durchführung der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) mit Gen-spezifischen Primern (siehe Tabelle 3) und dem Orginal-EST als Templat, erhalten. Die Bedingungen für die Reaktion waren Standardbedingungen mit PWO DNA Polymerase (Roche). Die PCR wurde entsprechend der Standard-Bedingungen und den Hersteller-Protokollen (Sambrook et al. 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Habor, NY, Biometra T3 Thermocycler) durchgeführt. Die Parameter für die Reaktion waren: fünf Minuten bei 94ºC, gefolgt von fünf Zyklen von einer Minute bei 94ºC, eine Minute bei 50ºC und 1.5 Minuten bei 72ºC. Anschließend wurden fünfundzwanzig Zyklen von einer Minute bei 94ºC, eine Minute bei 65ºC und 1.5 Minuten bei 72ºC durchgeführt. Vollständige Klone für PpGBP-1 (SEQ ID NO:6), PpGBP-3 (SEQ ID NO:8), PpGBP-4 (SEQ ID NO:9), PpGBP-5 (SEQ ID NO:10) wurden durch Wiederholen der RACE Methode, jedoch unter Verwendung von Gen-spezifischen Primern, wie in Tabelle 5 angegeben, isoliert.
Die amplifizierten Fragmente wurden dann aus einem Agarosegel mit einem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) extrahiert und mit dem TOPO pCR 2.1 Vektor (Invitrogen) gemäß den Herstellerinstruktionen ligiert. Rekombinante Vektoren wurden in Top10 Zellen (Invitrogen) unter Verwendung von Standardbedingungen (Sambrook et al. 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Habor, NY) transformiert. Transformierte Zellen wurden auf LB Agar, welcher 100 μg/ml Carbenicillin, 0.8 mg X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-beta-D-Galaktosid) und 0.8 mg IPTG (Isopropylthio-beta-D-Galaktosid) enthält, nach Kultivierung bei 37ºC über Nacht selektiert. Weiße Kolonien wurden selektiert und zum Inokulieren von 3 ml flüssigem LB, 100 μg/ml Ampicillin enthaltend, verwendet und über Nacht bei 37ºC kultiviert. Die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) gemäß den Herstellerinstruktionen extrahiert. Analysen nachfolgender Klone und eine Restriktionskartierung wurden entsprechend den Standardtechniken der Molekularbiologie (Sambrook et al. 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Habor, NY) durchgeführt.
Tabelle 3 Übersicht und Primer, die für die Klonierung von vollständigen Klonen verwendet wurden
Beispiel 7
Konstruktion Stress-toleranter Arabidopsis Pflanzen durch Überexpression des Gens GBP-1 und anderer Gene, die nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst sind, zum Beispiel GBP-2, GBP-3, GBP-4 und GBP-5
Binäre Vektorkonstruktion: gBPSSC022
Das Plasmid-Konstrukt pACGH101 wurde mit Pstl (Roche) und Fsel, entsprechend den Herstellerinstruktionen, verdaut. Das Fragment wurde mittels eines Agarasegels aufgereinigt und durch den Qiaex II DNA Extraction Kit (Qiagen) extrahiert. Dies führte zu einem Vektor-Fragment mit dem Arabidopsis Aktin2 Promotor, mit internem Intron und dem OCS3 Terminator. Primer, für die PCR Amplifikation des NPTII Gens, wurden wie folgt konstruiert:

5' NPT-Pst GCG-CTG-CAG-ATT-TCA-TTT-GGA-GAG-GAC-ACG (SEQ ID NO:33)
3' NPT-Fse CGC-GGC-CGG-CCT-CAG-AAG-AAC-TCG-TCA-AGA-AGG-CG (SEQ ID NO:34)

Das 0.9 Kilobasen NPTII Gen wurde mittels PCR aus pCambia 2301 Plasmid DNA amplifiziert [94ºC 60 sec, (94ºC 60 sec, 61ºC (–0.1ºC pro Zyklus) 60 sec, 72ºC 2Min) × 25 Zyklen, 72ºC 10 min in der Biometra T-Gradienten Maschine], und mittels des Qiaquick PCR Extraction Kits (Qiagen) gemäß den Herstellerinstruktionen aufgereinigt. Die PCR DNA wurde dann in den pCR-BluntII TOPO Vektor (Invitrogen) entsprechend den Herstellerinstruktionen (NPT-Topo Konstrukt) subkloniert. Diese Ligationen wurden in Top10 Zellen (Invitrogen) transformiert und auf LB Platten mit 50 g/ml Kanamycin-Sulfat über Nacht bei 37ºC kultiviert. Die Kolonien wurden dann zur Inokulation von 2 ml LB Medium mit 50 μg/ml Kanamycin-Sulfat verwendet und über Nacht bei 37ºC kultiviert. Die Plasmid DNA wurde unter Verwendung des Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) isoliert und unter Verwendung der Standard-Bedingungen sowohl in der 5'- als auch der 3'-Richtung sequenziert. Die anschließende Analyse der Sequenz-Daten unter Verwendung der VektorNTI Software zeigte keine PCR-Fehler in der vorliegenden NPTII Gen-Sequenz.
Das NPT-Topo Konstrukt wurde dann mit Pstl (Roche) und Fsel (NEB), entsprechend den Herstellerinstruktionen verdaut. Das 0.9 Kilobasen-Fragment wurde aus dem Agarosegel aufgereinigt und mittels des Qiaex II DNA Extraction Kits (Qiagen) extrahiert. Das Pst/Fse Insert-Fragment aus NPT-Topo und das Pst/Fse Vektor Fragment aus pACGH101 wurden dann unter Verwendung von T4 DNA Ligase (Roche) gemäß den Herstellerinstruktionen miteinander ligiert. Die Ligation wurde dann in Top10 Zellen (Invitrogen) unter Standardbedingungen transformiert, wobei das Konstrukt pBPSsc019 erzeugt wurde. Kolonien wurden auf LB-Platten mit 50 μg/ml Kanamycin-Sulfat selektiert und über Nacht bei 37ºC kultiviert. Diese Kolonien wurden dann zur Inokulation von 2 ml LB Medium mit 50 μg/ml Kanamycin-Sulfat verwendet und über Nacht bei 37ºC kultiviert. Die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des Qiaprep Spin Miniprep Kits (Qiagen), entsprechend den Herstellerinstruktionen, isoliert.
Das pBPSSC019 Konstrukt wurde mit Kpnl und Bsal (Roche), entsprechend den Herstellerinstruktionen verdaut. Das Fragment wurde mittels eines Agarosegels aufgereinigt und dann mittels eines Qiaex II DNA Extraction Kits (Qiagen) gemäß den Instruktionen extrahiert, was zum Erhalt einer 3 Kilobasen Act-NPT Kassette führte, welche den Arabidopsis Aktin2 Promotor mit internem Intron, das NPTII Gen und den OCS3 Terminator, einschließt.
Der pBPSJH001 Vektor wurde mit Spel und ApaL (Roche) verdaut und mit Klenow Enzym und 0.1 mM dNTPs (Roche), entsprechend den Herstellerinstruktionen stumpfendig aufgefüllt. Dadurch wurde ein 10.1 Kilobasen Vektor-Fragment minus der Gentamycin Kassette erzeugt, welches durch Selbst-Ligation mittels T4 DNA Ligase (Roche) rezirkularisiert wurde und in Top10 Zellen (Invitrogen) unter Standardbedingungen transformiert wurde. Die transformierten Zellen wurden auf LB Agar, 50 μg/ml Kanamycin-Sulfat enthaltend, selektiert und über Nacht bei 37ºC kultiviert. Die Kolonien wurden dann zur Inokulation von 2 ml flüssigem LB, 50 μg/ml Kanamycin-Sulfat enthaltend, verwendet und über Nacht bei 37ºC kultiviert. Die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des Qiaprep Spin Miniprep Kits (Qiagen), entsprechend den Herstellerinstruktionen, extrahiert. Das rezirkularisierte Plasmid wurde dann mit KpnL (Roche) verdaut und aus einem Agarosegel durch den Qiaex II DNA Extraction Kit (Qiagen) gemäß den Herstellerinstruktionen extrahiert.
Das Act-NPT Kpn-geschnittene Insert und der Kpn-geschnittene pBPSJH001 rezirkularisierte Vektor wurden dann miteinander unter Verwendung der T4 DNA Ligase (Roche) ligiert und in Top10 Zellen (Invitrogen) gemäß den Herstellerinstruktionen transformiert. Das resultierende Konstrukt pBPSsc022 enthielt nun den Super Promotor, das GUS Gen, den NOS Terminator und die Act-NPT Kassette. Die transformierten Zellen wurden auf LB Agar, 50 μg/ml Kanamycin-Sulfat enthaltend, selektiert und über Nacht bei 37ºC kultiviert. Kolonien wurden dann zur Inokulation von 2 ml flüssigem LB, das 50 μg/ml Kanamycin-Sulfat enthielt, verwendet und über Nacht bei 37ºC kultiviert. Die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des Qiaprep Spin Miniprep Kits (Qiagen) gemäß den Herstellerinstruktionen extrahiert. Nach der Bestätigung des Ligationserfolges durch Restriktionsverdau wurde die pBPSsc022 Plasmid-DNA weiter vermehrt und mittels des Plasmid Midiprep Kits (Qiagen) gemäß den den Herstellerinstruktionen fisoliert.
Subklonierung von GBP-1 und anderen Proteinen die nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst sind zum Beispiel GBP-2, GBP-3, GBP-4 und GBP-5, in den binären Vektor
Die Fragmente, die die verschiedenen Physcomitrella patens Transkriptionsfaktoren enthalten, wurden aus den rekombinanten PCR2.1 TOPO Vektoren durch Verdau mit Restriktionsenzymen (siehe Tabelle 4), entsprechend den Herstellerinstruktionen subkloniert. Das anschließende Fragment wurde aus einem Agarosegel mittels eines QIAquick Gel Extraction Kits (QIAgen) gemäß den Herstellerinstruktionen ausgeschnitten und mit den binären Vektoren pBPSsc022 ligiert, mit den entsprechenden Enzymen (siehe Tabelle 4) gespalten und vor der Ligation dephosphoryliert. Das resultierende rekombinante pBPSsc022 enthielt die entsprechende GTP-bindendes Protein Nukleinsäure in der sense Orientierung unter dem konstitutiven Super Promotor.
Tabelle 4
Aufgelisted sind die Namen der verschiedenen Konstrukte der Physcomitrella patens Transkriptionsfaktoren, die für die Pflanzentransformation verwendet wurden

* = nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst

AGrobacterium Transformation
Die rekombinanten Vektoren wurden in Agrobacterim tumefaciens C58C1 und PMP90 entsprechend den Standardbedingungen (Höfgen und Willmitzer, 1990) transformiert.
Pflanzentranformation
Arabidopsis thaliana Ökotyp C24 wurde entsprechend den Standardbedingungen (Bechtold 1993, Acad. Sci. Paris. 316:1194-1199; Bent et al. 1994, Science 265:1856-1860) kultivert und transformiert.
Screening transformierter Pflanzen
T1 Samen wurden entsprechend den Standardprotokollen (Xiong et al. 1999, Plant Molecular Biology Reporter 17: 159-170) sterilisiert. Die Samen wurden auf ½ Murashige und Skoog Medien (MS) (Sigma-Aldrich) pH 5.7 mit KOH, 0.6% Agar, supplementiert mit 1% Saccharose, 0.5 g/L 2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure (MES) (Sigma-Aldrich), 50 μg/ml Kanamycin (Sigma-Aldrich), 500 μg/ml Carbenicillin (Sigma Aldrich) und 2 μg/ml Benomyl (Sigma-Aldrich) plattiert. Die Samen auf den Platten wurden für vier Tage bei 4ºC vernalisiert. Die Samen wurden in einer Klimakammer bei einer Temperatur von 22ºC und einer Lichtintensität von 40 Mikromol^-1m2 (weißes Licht; Philips TL 65W/25 Fluoreszenzröhre) und einem 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit Tag-Länge-Zyklus ausgekeimt. Transformierte Keimlinge wurden nach 14 Tagen selektiert und auf ½ MS Medien pH 5.7 mit KOH 0.6% Agar Platten, supplementiert mit 0.6% Agar, 1% Saccharose, 0.5 g/L MES (Sigma-Aldrich) und 2 μg/ml Benomyl (Sigma-Aldrich) transferiert und es wurde ihnen ermöglicht, sich für fünf-sieben Tage zu erholen.
Trocken-Toleranz-Screening
T1-Keimlinge wurden auf trockenes, steriles Filterpapier in einer Petrischale transferiert, wo sie für zwei Stunden bei 80% RH (relative Luftfeuchte) in einem Percival Wachstum CU3615, Mikromol^-1m2 (weisses Licht; Philips TL 65W/25 Fluoreszenzröhre) austrocknen konnten. Die RH wurde dann auf 60% verringert und die Keimlinge wurden weiter für acht Stunden ausgetrocknet. Die Keimlinge wurden dann entnommen und auf ½ MS 0.6% Agar Platten, supplementiert mit 2 μg/ml Benomyl (Sigma-Aldrich) und 0.5 g/L MES ((Sigma-Aldrich) platziert und nach fünf Tagen ausgezählt.
Unter Trockenstressbedingungen zeigten PpGBP-1 überexprimierende Arabidopsis thaliana Pflanzen in dem Stressscreening eine 45% Überlebensrate (9 Überlebende von 20 gestressten Pflanzen); PpGBP-2, 84% (76 Überlebende von 90 gestressten Pflanzen); PpGBP-3, 44% (4 Überlebende von 9 gestressten Pflanzen); PpGBP-4, 82% (97 Überlebende von 116 gestressten Pflanzen); wobei die nicht-transformierte Kontrolle eine 28%ige Überlebensrate aufwies (16 Überlebende von 57 gestressten Pflanzen) (siehe Tabelle 5). Es ist zu erwähnen, dass die Analysen dieser transgenen Linien mit T1 Pflanzen durchgeführt wurden, weshalb die Ergebnisse besser sein werden, wenn ein homozygoter starker Expresser gefunden wird.
Tabelle 5 Übersicht der Trockenstress-Tests

* = nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst

Frosttoleranz-Screening
Die Keimlinge wurden in Petrischalen transferiert, die ½ MS 0.6% Agar supplementiert mit 2% Saccharose und 2 μg/ml Benomyl enthielten. Nach vier Tagen wurden die Keimlinge für 1 Stunde bei 4ºC inkubiert und dann mit geschabtem Eis bedeckt. Die Keimlinge wurden dann in eine Environmental Specialist ES2000 Umweltkammer platziert und für 3.5 Stunden, beginnend bei –1.0ºC, –1ºC pro Stunde absinkend, inkubiert. Die Keimlinge wurden dann bei –5ºC für 24 Stunden inkubiert, anschließend wurde ihnen erlaubt, für 12 Stunden bei 5ºC aufzutauen. Das Wasser wurde abgegossen und die Keimlinge wurden nach 5 Tagen ausgezählt.
Unter Gefrierstressbedingungen zeigten PpGBP-1 überexprimierende Arabidopsis thaliana Pflanzen in dem Stressscreening eine 60% Überlebensrate (15 Überlebende von 25 gestressten Pflanzen.; PpGBP-2, 75% (44 Überlebende von 59 gestressten Pflanzen); PpGBP-3, 80% (8 Uberlebende von 10 gestressten Pflanzen); PpGBP-4, 87% (34 Uberlebende von 39 gestressten Pflanzen); PpGBP-5, 75% (6 Uberlebende von 8 gestressten Pflanzen); ); wobei die nicht-transformierte Kontrolle eine 28% Überlebensrate aufwies (16 Uberlebende von 57 gestressten Pflanzen) (siehe Tabelle 6). Es ist zu erwähnen, dass die Analysen dieser transgenen Linien mit T1 Pflanzen durchgeführt wurden, weshalb die Ergebnisse besser sein werden, wenn ein homozygoter starker Expresser gefunden wird.
Tabelle 6 Übersicht der Gefrierstress-Tests

* = nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst

Salztoleranz-Screening
Die Keimlinge wurden in der Nacht vor dem Salztoleranz-Screening auf Filterpapier, das in ½ MS getränkt wurde, transferiert und auf ½MS 0.6% Agar, supplementiert mit 2 μg/ml Benomyl, platziert. Für das Salztoleranz-Screening wurde das Filterpapier mit den Keimlingen auf Stapel von sterilem Filterpapier, die in 50 mM NaCl getränkt wurden, in einer Petrischale umgesetzt. Nach zwei Stunden wurde das Filterpapier mit den Keimlingen auf Stapel von sterilem Filterpapier, die in 200 mM NaCl getränkt wurden, in einer Petrischale umgesetzt. Nach zwei Stunden wurde das Filterpapier mit den Keimlingen auf Stapel von sterilem Filterpapier, die in 600 mM NaCl getränkt wurden, in einer Petrischale umgesetzt. Nach 10 Stunden wurden die Keimlinge in Petrischalen, welche ½ MS 0.6% Agar enthielten, der mit 2 μg/ml Benomyl supplementiert war, umgesetzt. Die Keimlinge wurden nach 5 Tagen ausgezählt.
Die transgenen Pflanzen werden für hinsichtlich ihrer verbesserten Salztoleranz untersucht, um nachzuweisen dass die transgene Expression eine Salztoleranz verleiht.
Beispiel 8
Detektion des GBP-1 Transgens und der GBP-2, GBP-3, GBP-4, GBP-5 Transgene (nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst) in den transgenen Arabidopsis Linien
Ein Blatt einer Wildtyp- und einer transgenen Arabidopsis Pflanze wurde in 200 μl Hexadecyltrimethyl-Ammoniumbromid (CTAB) Puffer (2% CTAB, 1.4 M NaCl, 8 mM EDTA und 20 mM Tris pH 8.0) und 1 μl beta-Mercaptoethanol homogenisiert. Die Proben wurden bei 60-65ºC für 30 Minuten inkubiert und anschließend wurden 250 μl Chloroform zu jeder Probe zugesetzt. Die Proben wurden für 3 Minuten gevortext und für 5 Minuten bei 18,000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde von jeder Probe abgenommen und es wurden 150 μl Isopropanol zugesetzt. Die Proben wurden bei Raumtemperatur für 15 Minuten inkubiert und für 10 Minuten bei 18,000 × g zentrifugiert. Jedes Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 20 μl TE resuspendiert. 4 μl der obigen Suspension wurden in einer 20 μl PCR Reaktion unter Verwendung von Taq DNA Polymerase (Roche Molecular Biochemicals) entsprechend den Herstellerinstruktionen verwendet. Das binare Vektor-Plasmid mit jedem hineinklonierten Gen wurde als Positiv-Kontrolle verwendet, die Wildtyp C24 genomische DNA wurde als Negativ-Kontrolle in den PCR-Reaktionen verwendet. 10 μl PCR Reaktion wurden auf einem 0.8% Agarose/Ethidium-Bromid Gel analysiert. Das PCR-Programm, das verwendet wurde, war wie folgt: 30 Zyklen 1 Minute bei 94ºC, 1 Minute bei 62ºC und 4 Minuten bei 70ºC, gefolgt von 10 Minuten bei 72ºC.
Der 5' Primer war wie folgt: 5'GCTGACACGCCAAGCCTCGCTAGTC3' (SEQ ID NO:35). Die Gen-spezifischen Primer und die Größe der amplifizierten Banden (Gen-Produkt Größe) sind nachstehend aufgelistet:

PpGBP-1: Primer: RC587: GCGTTAACTCGTCGCTCTTAAACACCGAGCTAAG Gen-Produkt: 700 Bp (SEQ ID NO:36).
PpGBP-2: (nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst) Primer: RC404: GCGAGCTCGAGGCACTAATCAGAGAACGCCGTA Gen-Produkt: 1000 Bp (SEQ ID NO:37)
PpGBP-3: (nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst) Primer: RC498: GCGAGCTCGACCCTGGCATTTCCCATCGCAGCAA Gen-Produkt: 700 Bp (SEQ ID NO:38)
PpGBP-4: (nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst) Primer: RC569: GCGAGCTCCTGGGAGTTGAGGGCTTGGATGTAA Gen-Produkt: 2100 Bp (SEQ ID NO:39)
PpGBP-5: (nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst) Primer: RC647: GCGAGCTCGCAACTGGCGTACTTATTAACACTA Gen-Produkt: 900 Bp (SEQ ID NO:40)

Die Transgene wurden erfolgreich aus den T1 transgenen Linien amplifiziert, nicht jedoch aus Wildtyp C24. Dieses Ergebnis deutet an, dass die T1 transgenen Pflanzen mindestens eine Kopie der Transgene enthalten. Es gab keinen Hinweis auf die Existenz von entweder identischen oder sehr ähnlichen Genen in der nicht- transformierten Arabidopsis thaliana Kontrolle, welche durch diese Methode amplifiziert werden konnten.
Beispiel 9
Detektion der GBP-1 Transgen-mRNA und der GBP-2, GBP-3, GBP-4, GBP-5 Transgenen-mRNAs (nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst) in den transgenen Arabidopsis Linien
Die Transgenexpression wurde unter Verwendung der RT-PCR detektiert. Gesamt-RNA wurde aus stressbehandelten Pflanzen unter Verwendung eines von (Verwörd et al., 1989 NAR 17:2362) adaptierten Verfahrens isoliert. Blatt-Proben (50-100 mg) wurden gesammelt und in flüssigem Stickstoff zu einem feinem Puder gemahlen. Das gemahlene Gewebe wurde in 500 μl eines 80ºC, Phenol-zu-Extraktions-Puffer (100 mM LiCl, 100 mM Tris pH8, 10 mM EDTA, 1% SDS) 1:1 Gemisches resuspendiert, gefolgt von einem kurzen Vortexen des Gemisches. Nach der Zugabe von 250 μl Chloroform wurde jede Probe kurz gevortext. Die Proben wurden dann für 5 Minuten bei 12,000 × g zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde in ein frisches Eppendorf-Gefäß überführt. RNA wurde durch Zugabe von 1/10 Volumen 3M Natrium-Acetat und 2 Volumen 95% Ethanol präzipitiert. Die Proben wurden durch Invertieren gemischt und für 30 Minuten auf Eis platziert. Die RNA wurde durch Zentrifugation bei 12,000 × g für 10 Minuten pelletiert. Der Oberstand wurde entfernt und die Pellets kurz Luft-getrocknet. RNA-Probenpellets wurden in 10 μl DEPC behandeltem Wasser resuspendiert. Um kontaminierende DNA aus den Proben zu entfernen, wurde jede mit RNase-freier DNase (Roche) entsprechend den Herstellerangaben behandelt. cDNA wurde unter Verwendung des Erststrang cDNA Synthese Kits (Böhringer Mannheim) gemäß den Herstellerangaben aus Gesamt-RNA synthetisiert.
Eine PCR-Amplifikation eines Gen-spezifischen Fragments aus der synthetisierten cDNA wurde unter Verwendung von Taq DNA Polymerase (Roche) und Gen-spezifischen Primern in der folgenden Reaktion durchgeführt: 1 X PCR Puffer, 1.5 mM MgCl₂, 0.2 μM jeder Primer, 0.2 μM dNTPs, 1 Unit Polymerase, 5 μl cDNA aus der Synthesereaktion. Die Amplifikation wurde unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Denaturierung, 95ºC, 1 Minute; Annealing, 62ºC, 30 Sekunden; Extension, 72ºC, 35 Zyklen; Extension, 72ºC, 5 Minuten; Halt 4ºC für immer. Die PCR-Produkte wurden auf einem 1% Agarosegel laufen gelassen, mit Ethidium-Bromid gefärbt und unter UV Licht unter Verwendung des Quantity-One Dokumentations-Systems (BioRad) sichtbar gemacht. Die Expression der Transgene wurde in den T1 transgenen Linien detektiert. Diese Ergebnisse deuten an, dass die Transgene in den transgenen Linien exprimiert werden und weisen stark darauf hin, dass ihre Genprodukte die Pflanzenstress-Toleranz in den transgenen Linien verbessern. In Obereinstimmung mit der vorangegangenen Aussage, konnte keine Expression von identischen oder sehr ähnlichen endogenen Genen durch diese Methode detektiert werden. Diese Ergebnisse stimmen mit den Angaben aus Beispiel 7 überein.
Tabelle 7
Primer, die für die Amplifikation der entsprechenden transgenen mRNA in einer PCR unter Verwendung von RNA als Templat, welche aus transgenen Arabidopsis thaliana Pflanzen isoliert wurde, verwendet wurden.

* = nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst

Beispiel 10
Konstruktion Stress ToleranteR Sojabohne-Pflanzen durch überexression des GBP-1 Gens und der GBP-2, GBP-3, GBP-4, GBP-5 Gene (nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst)
Die Konstrukte pBPSLVM162, pBPSJYW004, pBPSJYW001, pBPSLVM180 und pBPSJYW006 wurden zur Transformation von Sojabohne, wie nachstehend beschrieben, verwendet.
Samen der Sojabohne wurden mit 70% Ethanol für 4 Minuten bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln, gefolgt von 20% (v/v) Clorox, das mit 0.05% (v/v) Tween supplementiert war, für 20 Minuten unter kontinuierlichem Schütteln Oberflächen-sterilisiert. Dann wurde die Samen 4 mal mit destilliertem Wasser gespült und auf angefeuchtetes Filterpapier in einer Petrischale bei Raumtemperatur für 6-39 Stunden platziert. Die Samenhüllen wurden abgelöst und die Kotyledonen wurden von der Embryonen-Achse abgelöst. Die Embryo-Achse wurde begutachtet, um sicher zu stellen, dass die meristematische Region nicht beschädigt ist. Die herausgeschnittenen Embryo-Achsen wurden in einer halbgeöffneten sterilen Petrischale gesammelt und bis zu einem Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 20% (Frischgewicht) in einer verschlossenen Petrischale bis zur weiteren Verwendung luftgetrocknet.
Die Agrobacterium tumefaciens Kultur wurde aus einer Einzelkolonie in LB-Flüssigmedium plus entsprechenden Antibiotika (zum Beispiel 100 mg/L Streptomycin, 50 mg/L Kanamycin) präpariert, gefolgt von einem Wachstum der Einzelkolonie in flüssigem LB Medium bis zu einer optischen Dichte bei 600 nm von 0.8. Die Bakterien wurden dann bei 7000 rpm für 7 Minuten bei Raumtemperatur pelletiert und in MS (Murashige and Skoog, 1962) Medium, supplementiert mit 100 μM Acetosyringon, resuspendiert. Bakterienkulturen wurden in diesem Vorinduktionsmedium für 2 Stunden bei Raumtemperatur vor dem Gebrauch inkubiert. Die Achsen zygotischer Samen-Embryos der Sojabohne wurden bei etwa 15% Feuchtigkeitsgehalt für 2 Stunden bei Raumtemperatur in der vorinduzierten Agrobacterium-Suspensionskultur imbibiert. Die Embryos wurden aus der Imbibitionskultur entfernt und in Petrischalen, welche festes MS Medium enhalten, das mit 2% Saccharose supplementiert war, transferiert und für 2 Tage im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubier. Alternativ wurden die Embyos oben auf ein angefeuchtetes (flüssiges MS Medium) steriles Filterpapier in einer Petrischale platziert und unter den gleichen Bedingungen, wie oben beschrieben, inkubiert. Nach dieser Periode wurden die Embryos entweder auf festes oder flüssiges MS Medium, das mit 500 mg/L Carbenicillin oder 300 mg/L Cefotaxime supplementiert war, um die Agrobakterien zu töten, transferiert. Das Flüssigmedium wurde verwendet, um das sterile Filterpapier zu befeuchten. Die Embryos wurden während 4 Wochen bei 25ºC bei 150 μMol m^-2sec^-1 und 12 Stunden Lichtdauer, inkubiert. Sobald die Keimlinge Wurzeln produziert hatten, wurden sie auf sterile Metromix Erde transferiert. Das Medium der in vitro Pflanzen wurde vor dem Transfer der Pflanze auf Erde abgewaschen. Die Pflanzen wurden unter einer Plastik-Abdeckung für 1 Woche, zugunsten des Akklimatisierungsprozesses, gehalten. Dann wurden die Pflanzen in einen Wachstumsraum transferiert, wo sie bei 25ºC, bei 150 μMol m^-2sec^-1 und 12 Stunden Lichtdauer, für 80 Tage inkubiert wurden.
Die transgenen Pflanzen wurden dann entsprechend dem in Beispiel 7 beschriebenen Screeningverfahren auf ihre verbesserte Trocken-, Salz- und/oder Kälte-Toleranz hin untersucht, um nachzuweisen, dass die transgene Expression eine Stresstoleranz verleiht.
Beispiel 11
Konstruktion Stress-toleranter Raps/Canola-Pflanzen durch Überexression des GBP-1 Gens und der GBP-2, GBP-3, GBP-4, GBP-5 Gene (nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst)
Die Konstrukte pBPSLVM162, pBPSJYW004, pBPSJYW001, pBPSLVM180 und pBPSJYW006 wurden zur Transformation von Raps/Canola, wie nachstehend beschrieben, verwendet.
Die hierin beschrieben Verfahren der Pflanzen-Transformation sind auch für Brassica und andere Kulturpflanzen anwendbar. Samen von Canola wurden mit 70% Ethanol für 4 Minuten bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln, gefolgt von 20% (v/v) Clorox, das mit 0.05% (v/v) Tween supplementiert war, für 20 Minuten bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln Oberflächen-sterilisiert. Dann wurden die Samen 4 mal mit destilliertem Wasser gespült und auf angefeuchtetes Filterpapier in einer Petrischale bei Raumtemperatur für 18 Stunden platziert. Dann wurden die Samenhüllen entfernt und die Samen werden über Nacht in einer halb geöffneten Petrischale luftgetrocknet. Während dieser Periode verlieren die Samen etwa 85% ihres Wassergehaltes. Die Samen werden dann bei Raumtemperatur in einer abgedichteten Petrischale bis zur weiteren Verwendung gelagert. Die DNA-Konstrukte und Embryo-Imbibition sind wie in Beispiel 10 beschrieben. Proben der primären transgenen Pflanzen (T0) wurden mittels PCR analysiert, um das Vorliegen von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse wurden durch Southern Hybridisierung, in der DNA elektrophoretisch in einem 1% Agarosegel aufgetrennt wird und auf eine positiv geladene Nylon Membran (Roche Diagnostics) transferiert wird, bestätigt. Der PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics) wurde gemäß den Herstellerangaben verwendet, um eine Digoxigenin-markierte Probe mittels PCR zu erzeugen und wurde.
Die transgenen Pflanzen wurden dann entsprechend dem in Beispiel 7 beschriebenen Screeningverfahren auf ihre verbesserte Stresstoleranz hin untersucht, um nachzuweisen, dass die transgene Expression eine Trockentoleranz verleiht.
Beispiel 12
Konstruktion Stress-toleranter Getreidepflanzen durch Überexpression des GBP-1 Gens und der GBP-2, GBP-3, GBP-4, GBP-5 Gene (nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst)
Die Konstrukte pBPSLVM162, pBPSJYW004, pBPSJYW001, pBPSLVM180 und pBPSJYW006 wurden zur Transformation von Getreide, wie nachstehend beschrieben, verwendet.
Die Transformation von Mais (Zea Mays L.) wird mit dem in Ishida et al. 1996 Nature Biotech. 14745-50, beschriebenen Verfahren durchgeführt. Unreife Embryos werden mit Agrobacterium tumefaciens kultiviert, die „super-binäre" Vektoren tragen, wobei transgene Pflanzen durch Organogenese isoliert werden. Dieses Verfahren stellt eine Transformationseffizienz zwischen 2.5% und 20% bereit. Die transgenen Pflanzen wurden dann entsprechend dem in Beispiel 7 beschriebenen Screeningverfahren auf ihre verbesserte Trocken-, Salz- und/oder Kälte-Toleranz hin untersucht, um nachzuweisen, dass die transgene Expression eine Stresstoleranz verleiht.
Beispiel 13
Konstruktion Stress-toleranter Weizen-Pflanzen durch Überexpression des GBP-1 Gens und der GBP-2, GBP-3, GBP-4, GBP-5 Gene (nicht von der vorliegenden Erfindung umfasst)
Die Konstrukte pBPSLVM162, pBPSJYW004, pBPSJYW001, pBPSLVM180 und pBPSJYW006 wurden zur Transformation von Weizen, wie nachstehend beschrieben, verwendet.
Die Transformation von Weizen wird mit dem in Ishida et al. 1996 Nature Biotech. 14745-50, beschriebenen Verfahren durchgeführt. Unreife Embryos werden mit Agrobacterium tumefaciens co-kultiviert, die „super-binäre" Vektoren tragen, wobei transgene Pflanzen durch Organogenese isoliert werden. Dieses Verfahren stellt eine Transformations-Effizienz zwischen 2.5% und 20% bereit. Die transgenen Pflanzen wurden dann entsprechend dem in Beispiel 7 beschriebenen Screeningverfahren auf ihre verbesserte Stresstoleranz hin untersucht, um nachzuweisen, dass die transgene Expression eine Trockentoleranz verleiht.
Beispiel 14
Identifikation von homologen und heterologen Genen
Gen-Sequenzen können verwendet werden, um homologe oder heterologe Gene aus cDNA- oder genomischen Bibliotheken zu identifizieren. Homologe Gene (zum Beispiel vollständige cDNA Klone) können mittels Nukleinsäure-Hybridisierung, zum Beispiel unter Verwendung von cDNA Bibliotheken, isoliert werden. Abhängig von der Menge des Gens von Interesse, werden 100,000 bis zu 1,000,000 rekombinante Bakteriophagen ausplattiert und auf Nylon-Membranen transferiert. Nach der Denaturierung mit Alkali, wird die DNA auf der Membran zum Beispiel durch UV-Quervernetzung immobilisiert. Die Hybridisierung wird unter hoch-stringenden Bedingungen durchgeführt. In wässriger Lösung wird die Hybridisierung und das Waschen bei einer Ionenstärke von 1 M NaCl und einer Temperatur von 68ºC durchgeführt. Die Hybridisierung-Proben werden zum Beispiel durch radioaktive (³²P) Lücken-Transkriptions-Markierung (High Prime, Roche, Mannheim, Deutschland) erzeugt. Signale werden durch Autoradiographie detektiert.
Teilweise homologe oder heterologe Gene, die verwandt aber nicht identisch sind, können auf eine Art und Weise analog zu dem oben beschriebenen Verfahren unter Verwendung von niedrig stringenden Hybridisierungs- und Wasch-Bedingungen identifiziert werden. Für eine wässrige Hybridisierung wird die Ionenstärke normalerweise bei 1 M NaCl gehalten, während die Temperatur stufenweise von 68 auf 42ºC verringert wird.
Die Isolation von Gen-Sequenzen mit Homologien (oder Sequenz-Identität/Ähnlichkeit) in nur einer ausgeprägten Domaine (zum Beispiel von 10-20 Aminosäuren) kann unter Verwendung von synthetisch radio-markierten Oligonukleotid-Proben durchgeführt werden. Radio-markierte Oligonukleotide werden durch Phosphorylierung des 5-seitigen-Endes von zwei komplementären Oligonukleotiden mittels T4 Polynukleotidkinase erzeugt. Die komplementären Oligonukleotide werden aneinander gelagert und ligiert, um ein Concatemer zu bilden. Die doppelsträngigen Concatemere werden dann zum Beispiel durch Lücken-Transkription radiomarkiert. Die Hybridisierung wird normalerweise bei niedrig stringenden Bedingungen unter Verwendung von hohen Oligonukleotid-Konzentrationen durchgeführt.
Oligonukleotid-Hybridisierungslösung:

6 × SSC
0.01 M Natrium-Phosphat
1 mM EDTA (pH 8)
0.5% SDS
100 μg/ml denaturierte Lachs-Spermien DNA
0.1% fettfreie Trockenmilch

Während der Hybridisierung wird die Temperatur schrittweise um 5-10ºC, unter die geschätzte Oligonukleotid-Tm, verringert oder auf Raumtemperatur hinunter, gefolgt von Waschschritten und Autoradiographie. Das Waschen wird mit niedriger Stringenz, wie zum Beispiel 3 Waschschritte unter Verwendung von 4 × SSC, durchgeführt. Weitere Details werden von Sambrook, J. et al. (1989), „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, beschrieben.
Beispiel 15
Identifikation von homologen Genen mittels Screening von Expressions-Bibliotheken mit Antikörpern
cDNA Klone können verwendet werden, um ein rekombinantes Protein, zum Beispiel in E. coli (zum Beispiel Qiagen Qlaexpress pQE System) zu produzieren. Die rekombinanten Proteine werden dann normalerweise mittels Ni-NTA Affinitäts-Chromatographie (Qiagen) Affinitäts-gereinigt. Die rekombinanten Proteine werden dann verwendet, um spezifische Antikörper, zum Beispiel unter Verwendung von Standardtechniken für die Kaninchen-Immunisierung, zu produzieren. Die Antikörper werden unter Verwendung einer Ni-NTA Säule, die mit dem rekombinanten Antigen gesättigt ist, Affinitäts-gereinigt, wie durch Gu et al., 1994 BioTechniques 17:257-262 beschrieben. Der Antikörper kann dann zum Scrennen von Expressions-cDNA-Bibliotheken verwendet werden, um homologe oder heterologe Gene mittels eines immunologischen Screenings zu identifizieren (Sambrook, J. et al. (1989), „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F.M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons).
Beispiel 16
In vivo Mutagenese
Eine in vivo Mutagenese von Mikroorganismen kann mittels Passage von Plasmid-(oder anderer Vektor-) DNA durch E. coli oder andere Mikroorganismen (zum Beispiel Bacillus spp. oder Hefe, wie zum Beispiel Saccharomyces cerevisiae) durchgeführt werden, die in ihren Fähigkeiten, die Integrität ihrer genetischen Information zu erhalten, beeinträchtigt sind. Typische Mutator-Stämme haben Mutationen in den Genen für das DNA Reperatur-System (zum Beispiel mutHLS, mutD, mutT, etc.; für eine Referenz siehe Rupp, W.D. (1996) DNA repair mechanisms, in: Escherichia coli and Salmonella, p. 2277-2294, ASM: Washington.) Solche Stämme sind dem Fachmann gut bekannt. Die Verwendung solcher Stämme ist zum Beispiel in Greener, A. and Callahan, M. (1994) Strategies 7: 32-34, dargestellt. Der Transfer von mutierten DNA-Molekülen in Pflanzen wird bevorzugt nach der Selektion und der Prüfung in Mikroorganismen durchgeführt. Die transgenen Pflanzen werden, entsprechend den verschiedenen Beispielen innerhalb der Erläuterungen dieses Dokuments, erzeugt.
Beispiel 17
In vitro Analyse der Funktion von Physcomitrella Genen in transgenen Organismen
Die Bestimmung von Aktivitäten und kinetischen Parametern von Enzymen ist im Fachgebiet gut etabliert. Experimente zur Bestimmung der Aktivität eines vorgegebenen veränderten Enzyms müssen auf die spezifische Aktivität des Wildtyp-Enzyms zugeschnitten werden, was im Bereich der Fähigkeiten eines Fachmanns liegt. Übersichten über Enzyme im Allgemeinen, sowie sezifische Details in Bezug auf Struktur, Kinetik, Prinzipien, Methoden, Applikationen und Beispiele für die Bestimmung zahlreicher Enzymaktivitäten sind zum Beispiel in den folgenden Referenzen zu finden: Dixon, M., and Webb, E.C.,(1979) Enzymes. Longmans: London; Fersht, (1985) Enzyme Structure and Mechanism. Freeman: New York; Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman: San Francisco; Price, N.C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P.D., ed. (1983) The Enzymes, 3^rd ed. Academic Press: New York; Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetik, 2^nd ed. VCH: Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H.U., Bergmeyer, J., Graßl, M., eds. (1983-1986) Methods of Enzymatic Analysis, 3^rd ed., vol. I-XII, Verlag Chemie: Weinheim; und Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) vol. A9, Enzymes. VCH: Weinheim, p. 352-363.
Die Aktivität von Proteinen, welche an DNA binden, kann durch verschiedene gut-etablierten Methoden, wie zum Beispiel DNA bandshifts-Untersuchungen (auch Gel-Retardation-Untersuchungen genannt) gemessen werden. Die Auswirkung von solchen Proteinen auf die Expression anderer Moleküle kann unter Verwendung von Reportergen-Untersuchungen (wie zum Beispiel solche, die in Kolmar, H. et al. (1995) EMBO J. 14:3895-3904 und in den darin zitierten Referenzen beschrieben sind) gemessen werden. Reportergen-Testsysteme für Applikationen sowohl in proals auch eukaryotischen Zellen unter Verwendung von Enzymen wie beispielsweise beta-Galaktosidase, grün-fluoreszierendes Protein und verschiedene andere sind gut bekannt und etabliert.
Die Bestimmung der Aktivität von Membrantransportproteinen kann, entsprechend solche Techniken, wie zum Beispiel in Gennis, R.B. Pores, Channels and Transporters, in Biomembranes, Molecular Structure and Function, pp. 85-137, 199-234 und 270-322, Springer: Heidelberg (1989) beschrieben, durchgeführt werden.
Beispiel 18
Reinigung des gewünschten Produkts von transformierten Organismen
Die Isolation des gewünschten Produktes aus Pflanzenmaterial (zum Beispiel Physcomitrella patens oder Arabidopsis thaliana), Pilzen, Algen, Ciliaten, C. glutamicum Zellen, oder anderen bakteriellen Zellen, die mit den hierin beschriebenen Nukleinsäuresequenzen transformiert sind, oder der Überstand der oben beschriebenen Kulturen, kann durch verschiedene Verfahren, die im Fachgebiet bekannt sind, durchgeführt werden. Wenn das gewünschte Produkt nicht von den Zellen sekretiert wird, können sie von der Kultur mittels Niedrig-Geschwindigkeits-Zentrifugation geerntet werden, und die Zellen können durch Standardtechniken, wie zum Beispiel mechanische Kräfte oder Ultraschall, lysiert werden. Organe von Pflanzen können mechanisch von anderen Geweben oder Organen getrennt werden. Im Anschluss an die Homogenisierung werden die zellulären Trümmer durch Zentrifugation entfernt und die Überstandsfraktion, die die löslichen Proteine enthält, wird für die weitere Reinigung der gewünschten Verbindung aufbewahrt. Wenn das Produkt aus den gewünschten Zellen sekretiert wird, dann werden die Zellen aus der Kultur durch Niedrig-Geschwindigkeits-Zentrifugation entfernt und die Überstandsfraktion wird für die weitere Reinigung aufbewahrt.
Die Überstands-Fraktion einer der beiden Reinigungsverfahren wird einer Chromatographie mit einem geeigneten Granulat unterzogen, wobei das gewünschte Protein entweder an einem Chromatographie-Granulat festgehalten wird, während viele der Verunreinigungen in der Probe nicht zurückgehalten werden oder wo die Verunreinigungen durch das Granulat festgehalten werden, während die Probe es nicht wird. Solche Chromatographie-Schritte können, wenn nötig, unter Verwendung des gleichen Chromatographie-Granulates oder verschiedener Chromatographie-Granulate wiederholt werden. Ein Fachmann wird in der Lage sein, für eine möglichst effiziente Applikation aus geeigneten Chromatographie-Granulaten zur Reinigung eines bestimmten Moleküls auszuwählen. Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration konzentriert werden und bei Temperaturen, bei denen die Stabilität des Produktes maximiert ist, gelagert werden.
Es existiert ein breites Feld von im Fachgebiet bekannten Reinigungsverfahren, wobei das vorangegangene Reinigungsverfahren nicht beschränkend sein soll. Solche Reinigungstechniken sind zum Beispiel in Bailey, J.E. & Ollis, D.F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986) beschrieben. Zusätzlich kann die Identität und Reinheit isolierter Verbindungen mittels Standardtechniken des Fachgebiets beurteilt werden. Diese schließen Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC), spektroskopische Methoden, Färbemethoden, Dünnschicht-Chromatographie, NIRS, enzymatische Untersuchungen oder Mikrobiologische, ein. Solche Analyseverfahren sind in: Patek et al., 1994 Appl. Environ. Microbiol. 60:133-140; Malakhova et al., 1996 Biotekhnologiya 11:27-32; und Schmidt et al., 1998 Bioprocess Engineer. 19:67-70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, (1996) vol. A27, VCH: Weinheim, p. 89-90, p. 521-540, p. 540-547, p. 559-566, 575-581 und p. 581-587; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, vol. 17 überblicksmäßig dargestellt.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Transgene Pflanzenzelle, transformiert mit einer GTP-bindendes Stress-spezifisches Protein (GBSRP)-kodierenden Nukleinsäure, worin das GBSRP aus einer Gruppe, bestehend aus einem Polypeptid, wie in SEQ ID NO:11 definiert und einem Polypeptid, das mindestens eine 95%ige Sequenzidentität zu einem Polypeptid von SEQ ID NO:11 über seine gesamte Länge aufweist, ausgewählt ist und worin die Expression der Nukleinsäure in der Pflanzenzelle, verglichen mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanzenzelle, zu einer erhöhten Toleranz der Pflanzenzelle gegenüber Trockenstress und/oder Frost-Stress führt.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, worin das GBSRP wie in SEQ ID NO:11 definiert ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, worin die GBSRP kodierende Nukleinsäure wie in SEQ ID NO:6 definiert ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, worin die GBSRP-kodierende Nukleinsäure mindestens eine 80-90% Sequenzidentität zu der Polynukleotidsequenz von SEQ ID NO:6 über ihre gesamte kodierende Region aufweist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, worin die Pflanze eine Monokotyledone ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, worin die Pflanze eine Dikotyledone ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, worin die Pflanze aus der Gruppe, bestehend aus Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Raps, Canola-Raps, Maniok, Pfeffer, Sonnenblume, Tagetes, Nachtschattengewächse, Kartoffel, Tabak, Aubergine, Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Alfalfa, Kaffee, Kakao, Tee, Salix-Arten, Ölpalme, Kokosnuss, mehrjähriges Gras und Futterpflanzen, ausgewählt ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, worin die Expression der Nukleinsäure in der Pflanzenzelle zu einer, verglichen mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanzenzelle, erhöhten Wassernutzungseffizienz der Pflanze, führt.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, worin die Expression der Nukleinsäure in der Pflanzenzelle zu einem, verglichen mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanzenzelle, erhöhten Trockengewicht der Pflanze führt.
Transgene Pflanze, die eine Pflanzenzelle gemäß einem der Ansprüche 1-9 umfasst.
Samen, der von einer transgenen Pflanze produziert wird, die eine Pflanzenzelle gemäß einem der Ansprüche 1-9 umfasst, worin der Samen, verglichen mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanzenzelle, sortenecht in Bezug auf eine erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress ist.
Verwendung einer transgenen Pflanze gemäß Anspruch 10 oder eines Samens gemäß Anspruch 11 zur Herstellung eines Landwirtschaftsproduktes.
Isoliertes GTP-bindendes Stress-spezifisches Protein (GBSRP), worin das GBSRP aus einer Gruppe, bestehend aus dem GTP-bindenden Stress-spezifischen Protein-1 (GBP-1), wie in SEQ ID NO:11 definiert und einem Polypeptid, das mindestens eine 95%ige Sequenzidentität zu dem Polypeptid von SEQ ID NO:11 über seine gesamte Länge aufweist, ausgewählt ist und worin die Expression der Nukleinsäure in der Pflanze zu einer, verglichen mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanze, erhöhten Toleranz der Pflanze gegenüber Trockenstress und/oder Froststress führt.
Isoliertes GBSRP nach Anspruch 13, worin das GBSRP GBP-1 wie in SEQ ID NO:11 definiert ist.
Isolierte GTP-bindendes Stress-spezifisches Protein (GBSRP)-kodierende Nukleinsäure, worin das GBSRP aus einer Gruppe bestehend aus GBP-1, wie in SEQ ID NO:11 definiert und einer Polypeptid-Sequenz, die mindestens eine 95%ige Sequenzidentität zu der Polypeptid-Sequenz SEQ ID NO:11 über ihre gesamte Länge aufweist, ausgewählt ist.
Isolierte GBSRP kodierende Nukleinsäure nach Anspruch 15, worin die GBSRP kodierende Nukleinsäure wie in SEQ ID NO:6 definiert ist.
Isolierte GBSRP kodierende Nukleinsäure nach Anspruch 15, worin die GBSRP kodierende Nukleinsäure mindestens eine 80-90%ige Sequenzidentität zu der Polynukleotid-Sequenz von SEQ ID NO:6 über ihre gesamte kodierende Region aufweist.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 15, worin die Expression der Nukleinsäure in einer Pflanze zu einer, verglichen mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanze, erhöhten Wassernutzungseffizienz der Pflanze führt.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 15, worin die Expression der Nukleinsäure in einer Pflanzenzelle zu einem, verglichen mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanze, erhöhten Trockengewicht der Pflanze führt.
Isolierter rekombinanter Expressionsvektor, der eine Nukleinsäure nach den Ansprüchen 15, 16, 17, 18 oder 19 umfasst, worin die Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle zu einer, verglichen mit einer Wildtyp-Varietät der Wirtszelle, erhöhten Toleranz der Wirtszelle gegenüber Trockenstress und/oder Froststress führt.
Rekombinanter Expressionsvektor nach Anspruch 20, worin die Expression der Nukleinsäure in einer Pflanze zu einer, verglichen mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanze, erhöhten Wassernutzungseffizienz der Pflanze führt.
Rekombinanter Expressionsvektor nach Anspruch 20, worin die Expression der Nukleinsäure in einer Pflanze zu einem, verglichen mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanze, erhöhten Trockengewicht der Pflanze führt.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, die eine GTP-bindendes Stress-spezifisches Protein (GBSRP)-kodierende Nukleinsäure enthält, worin die Expression der Nukleinsäure in der Pflanze zu einer, verglichen mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanze, erhöhten Toleranz der Pflanze gegenüber Trockenstress und/oder Froststress führt, umfassend a. Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem die Nukleinsäure umfassenden Expressionsvektor und Erzeugen einer transgenen Pflanze mit einer, verglichen mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanze, erhöhten Toleranz gegenüber Trockenstress und/oder Froststress aus der Pflanzenzelle, worin das GBSRP aus einer Gruppe, bestehend aus GBP-1 wie in SEQ ID NO:11 definiert und einem Polypeptid, das mindestens eine 95%ige Sequenzidentität zu dem Polypeptid der SEQ ID NO:11 über seine gesamte Länge aufweist, ausgewählt wird.
Verfahren nach Anspruch 23, worin das GBSRP wie in SEQ ID NO:11 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 23, worin die GBSRP kodierende Nukleinsäure wie in SEQ ID NO:6 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 23, worin die GBSRP-kodierende Nukleinsäure mindestens eine 80-90%ige Sequenzidentität zu der Polynukleotidsequenz von SEQ ID NO:6 über ihre gesamte kodierende Region aufweist.
Verfahren nach Anspruch 23, worin die Expression der Nukleinsäure in der Pflanze zu einer, verglichen mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanze, erhöhten Wassernutzungseffizienz der Pflanze führt.
Verfahren nach Anspruch 23, worin die Expression der Nukleinsäure in der Pflanze zu einem, verglichen mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanze, erhöhten Trockengewicht der Pflanze führt.
Verfahren zur Stresstoleranz-Modifikation einer Pflanze, umfassend die Modifikation der Expression eines GTP-bindenden Stress-spezifischen Proteins (GBSRP) in der Pflanze, worin das GBSRP aus einer Gruppe bestehend aus GBP-1, wie in SEQ ID NO:11 definiert und einem Polypeptid, das mindestens eine 95%ige Sequenzidentität zu dem Polypeptid der SEQ ID NO:11 über seine gesamte Länge aufweist, ausgewählt istund worin die Modifikation der Expression des GBSRPs in der Pflanze zu einer, verglichen mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanze, modifizierten Toleranz der Pflanze gegenüber Trockenstress und/oder Froststress führt.
Verfahren nach Anspruch 29, worin das GBSRP wie in SEQ ID NO:11 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 29, worin die GBSRP-kodierende Nukleinsäure wie in SEQ ID NO:6 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 29, worin die GBSRP-kodierende Nukleinsäure eine mindestens 80-90%ige Sequenzidentität zu der Polynukleotidsequenz von SEQ ID NO:6 über ihre gesamte kodierende Region aufweist.
Verfahren nach Anspruch 29, worin die Stresstoleranz erhöht wird.
Verfahren nach Anspruch 29, worin die Pflanze nicht transgen ist.
Verfahren nach Anspruch 29, worin die Pflanze transgen ist.
Verfahren nach Anspruch 35, worin die Pflanze mit einem Promotor, der die Expression der GBSRP regelt, transformiert wird.
Das Verfahren nach Anspruch 36, worin der Promotor gewebsspezifisch ist.
Verfahren nach Anspruch 36, worin der Promotor entwicklungsreguliert ist.
Verfahren nach Anspruch 29, worin der Anstieg der Expression des Polypeptids in der Pflanze zu einer, verglichen mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanze, erhöhten Wassernutzungseffizienz der Pflanze führt.
Verfahren nach Anspruch 29, worin der Anstieg der Expression des Polypeptids in der Pflanze zu einem, verglichen mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanze, erhöhten Trockengewicht der Pflanze führt.