DE60126920T2

DE60126920T2 - Stress-gekoppeltes zellzyklus protein sowie dessen verwendung in pflanzen

Info

Publication number: DE60126920T2
Application number: DE60126920T
Authority: DE
Inventors: Oswaldo da Apex COSTA E SILVA; Hans J. Champaign BOHNERT; Nocha Chapel Hill VAN THIELEN; Ruoying Apex CHEN; Rodrigo Morrisville SARRIA-MILLAN
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2001-04-06
Publication date: 2007-06-21
Anticipated expiration: 2021-04-07
Also published as: US7915484B2; US7838731B2; EP1881073B1; US20040216183A1; ATE339509T1; ATE348181T1; DE60123079D1; EP2169069A2; ES2272461T3; US7427696B2; US20020066124A1; US20090031451A1; DE60123079T2; AU2001255261A1; EP1795600A2; EP1728870A2; US7608757B2; EP1268828B1; ATE380248T1; US7714190B2

Description

Hintergrund der Erfindung
Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft allgemein Nukleinsäuresequenzen, die Proteine kodieren, welche mit abiotischen Stressantworten und abiotischer Stresstoleranz in Pflanzen im Zusammenhang stehen. Die Erfindung betrifft insbesondere Nukleinsäuresequenzen, die Proteine kodieren, welche Pflanzen Toleranz gegenüber Trockenheit und/oder Kälte verleihen.
Hintergrund des Fachgebiets
Abiotischer Umweltstress, wie beispielsweise Trockenheitsstress, Salzgehaltstress, Hitzestress und Kältestress, sind Hauptfaktoren, welche Pflanzenwachstum und Produktivität begrenzen. Ernteausfälle und Ertragsverluste der Ernte der wichtigsten Getreidesorten, wie beispielsweise Reis, Mais und Weizen, die durch solche Arten von Stress verursacht werden, stellen einen bedeutenden ökonomischen und politischen Faktor dar und tragen zur Nahrungsmittelknappheit in vielen unterentwickelten Ländern bei.
Pflanzen sind während ihres Lebenszyklus typischerweise Bedingungen eines verminderten Umgebungswassergehalts ausgesetzt. Die meisten Pflanzen haben Strategien entwickelt, um sich selbst gegen diese Austrocknungsbedingungen zu schützen. Wenn Dauer und Schwere der Trockenheitsbedingungen jedoch zu extrem sind, so sind die Auswirkungen auf die Pflanzenentwicklung, Wachstum und Ausbeute der meisten Erntepflanzen gravierend. Außerdem sind die meisten Erntepflanzen sehr empfindlich gegenüber höheren Salzkonzentrationen im Boden. Eine andauernde Aussetzung gegen Trockenheit und hohen Salzgehalt verursacht bedeutende Veränderungen des Pflanzenmetabolismus. Diese bedeutenden Veränderungen des Metabolismus führen letztendlich zum Zelltod und folglich zu Ertragsverlusten.
Die Entwicklung von stresstoleranten Pflanzen ist eine Strategie, die das Potenzial besitzt, wenigstens einige dieser Probleme zu lösen oder zu mildem. Traditionelle Pflanzenzuchtstrategien für die Entwicklung neuer Pflanzenlinien, die Resistenz (Toleranz) gegenüber diesen Arten von Stress aufweisen, sind jedoch relativ langsam und es sind spezielle resistente Linien für die Kreuzung mit der gewünschten Linie erforderlich. Die begrenzten Ressourcen an Protoplasma für Stresstoleranz und die Inkompatibilität der Kreuzung von entfernt verwandten Pflanzenspezies stellen signifikante Probleme dar, die bei der herkömmlichen Züchtung auftreten. Außerdem sind die zellulären Vorgänge, die zu Trockenheits-, Kälte- und Salztoleranz im Modell, in trockenheits- und/oder salztoleranten Pflanzen führen, komplex und schließen multiple Mechanismen der zellulären Anpassung und zahlreiche Metabolismuswege ein. Aufgrund dieses mehrteiligen Charakters der Stresstoleranz ist nicht nur das Züchten der Toleranz weitgehend erfolglos gewesen, Sonden auch die Möglichkeit, stresstolerante Pflanzen unter Verwendung von biotechnologischen Verfahren gentechnisch zu erzeugen, begrenzt.
Erforderlich ist daher die Identifizierung von Genen und Proteinen, die in diesen Mehrkomponenten-Prozessen, die zu Stresstoleranz führen, beteiligt sind. Die Bestimmung der Funktion von Genen, die in stresstoleranten Pflanzen exprimiert werden, wird nicht nur unser Verständnis der pflanzlichen Anpassung und Toleranz gegenüber Umweltstress verbessern, sondern auch wichtige Informationen für den Entwurf neuer Strategien zur Verbesserung von Nutzpflanzen bereitstellen.
Eine Gruppe von Proteinen, die mit Stressantworten in Pflanzen und Tieren im Zusammenhang zu stehen scheinen, sind Proteine, die mit Zellteilung und dem Zellzyklus in Beziehung stehen. Anzeichen für diese Verwandtschaft liegen in der Tatsache, dass unterschiedliche Arten von Umweltstress bezüglich Wassergehalt des Erdbodens, Auflicht und variierender Blatttemperatur jeweils zu einer Veränderung der Zellteilungsrate führen. Beispielsweise erfolgt in Sonnenblumenblättern in Verbindung mit Stress und Alterung eine Verlängerung des Zellzyklus. Zellen in den Sonnenblumenblättern tendieren dazu, auf der G1-Phase des Zellzyklus anzuhalten, wobei keine Veränderung der Dauer der S-G2-M-Phasen des Zellzyklus erfolgt. Ähnliche Beobachtungen wurden bei anderen Pflanzenspezies gemacht, die Umweltstress, wie beispielsweise Saccharosemangel, (Van't Hof 1973 Bookhaven Symp. 25: 152), oxidativem Stress (Reichheld et al. 1999 Plant J. 17: 647) und Wassermangel (Schuppler et al. 1998 Plant Physiol. 117: 667) ausgesetzt wurden. Diese Beobachtungen und Ergebnisse lassen vermuten, dass es einen wichtigen „Kontrollpunkt" in der Regulierung des Zellzyklus bei dem G1-S-Übergang gibt, während andere Studien einen anderen „Kontrollpunkt" bei dem G2-M-Übergang mit einem Halt der Zellen in der G2-Phase nahelegen. Es wurde außerdem festgestellt, dass die Temperatur die Dauer aller Zellzyklusphasen in einem ähnlichen Maß beeinflusst, ohne bevorzugtes Anhalten in irgendeiner bestimmten Phase des Zellzyklus (Tardieu und Granier, 2000 Plant Mol. Biol. 43: 555). Obwohl sich diese zuvor genannten Antworten auf Umweltstress unterscheiden, zeigen alle diese Ergebnisse die Zusammenschaltung des Stressantwortsystems dieser Pflanzen und der Zellteilungsproteine darin.
Im Fachbereich werden verschiedene Proteine beschrieben, die mit Zellteilung und dem Zellzyklus im Zusammenhang stehen. Ein solches Protein oder Proteinkomplex ist der Cyclin-CDK-Komplex, der die Progression der Zellzyklusphasen kontrolliert. Cyclinabhängige Proteinkinasen (CDKs) benötigen Cyclinbindung für die Aktivität und ihre Mitwirkung an den Kontrollpunken des eukaryotischen Zellzyklus ist heute weithin anerkannt. Die weitreichende Bedeutung von CDKs wurde vor fast zehn Jahren anhand unabhängiger genetischer Ansätze in Hefe und biochemischer Untersuchungen mitotischer Kontrollen in befruchteten Eiern von Meeressäugern erkannt.
Eine bekannte Komponente eines CDK-Komplexes ist ein Cdc2-Protein namens P34^cdc2, das an beiden Kontrollpunkten (G1-S und G2-M) benötigt wird. Verschiedene andere Cdc2-Homologe sind aus Menschen und aus Pflanzenspezies einschließlich Hefe isoliert worden. Eine solches Hefe-Homologon ist Cdc48, welches in der Spindel-Polkörperchen-Trennung in Saccharomyces cerevisiae eine Rolle spielt. Eine anderes Cdc2-Homologon ist in Arabidopsis beschrieben worden (Feiler et al. 1995 EMBO J 14: 5626), welches in den proliferierenden Zellen der vegetativen Triebe, Wurzeln, Blütenstände und Blüten und in rasch wachsenden Zellen stark exprimiert ist. Das Arabidopsis Cdc48-Gen ist in den sich entwickelnden Mikrosporen und Samenanlagen aufreguliert und in den meisten differenzierten Zelltypen herunterreguliert. Außerdem ist dieses Gen im Kern und während der Cytokinese zu Fragmoplasten lokalisiert worden.
Eine weitere Gruppe von Proteinen, die an Zellteilung und dem Zellzyklus beteiligt sind, sind pRB-Proteine. Es gibt zunehmende Anzeichen dafür, dass pRB-ähnliche Proteine in Pflanzen unter den nuklearen Zielen von Pflanzen-CDKs sein könnten. In Säugern spielt das pRB eine zentrale Rolle in der Regulierung des G1-zu-S-Übergangs. Durch Phosphorylierung von Säuger-pRB mittels Cyclin D- und Cyclin E-abhängigen Kinasen wird das pRB inaktiviert und dabei die S-Phase unterdrückt und die DNA-Replikation gefördert. Bedeutenderweise ist das pRB-bindende Motiv LXCXE (worin X eine beliebige Aminosäure bedeutet) in allen bekannten pflanzlichen D-Cyclinen vorzufinden. In Pflanzen wurden LXCXE-abhängige Wechselwirkungen zwischen D-Cyclinen von Arabidopsis und Mais-pRB-Proteinen in vitro und in einem Hefe Zwei-Hybrid-Assay nachgewiesen. Die Rolle von pRBs in der pflanzlichen Zellteilung im Zusammenhang mit Signalkaskaden wird weiter durch die Tatsache gestützt, dass verschiedene pRBs und insbesondere das Mais-pRB mehrfache putative CDK-Phosphorylierungsstellen aufweisen und in vitro durch G1- und S-spezifische Säuger-CDKs effizient phosphoryliert werden. Es ist auch bekannt, dass Mais-pRB-Proteine Veränderungen durchlaufen bei der Phosphorylierung während des Übergangs zur Endoreduplikation in dem Endosperm. Die Phosphorylierung durch pflanzliche CDKs ist jedoch noch nachzuweisen.
Obwohl also verschiedene pflanzliche Zellzyklusproteine aufgeklärt wurden, müssen die Signaltransduktionskaskaden des pflanzlichen Zellzyklus im Fachbereich noch im Detail beschrieben werden. Im Stand der Technik wird auch die Beziehung zwischen pflanzlichen Zellzyklusproteinen und der Antwort einer Pflanze auf Umweltstress, so dass eine stresstolerante Pflanze erzeugt werden kann, nicht beschrieben. Dementsprechend besteht ein Bedarf, Gene zu identifizieren, die in stresstoleranten Pflanzen exprimiert werden, welche die Fähigkeit besitzen, ihrer Wirtspflanze und anderen Pflanzenspezies Stressresistenz zu verleihen. Neu erzeugte stresstolerante Pflanzen werden zahlreiche Vorteile aufweisen, wie z.B. eine Ausweitung des Bereichs, in dem Nutzpflanzen angebaut werden können, indem beispielsweise der Wasserbedarf einer Pflanzenspezies verringert wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung erfüllt zum Teil das Erfordernis, neue einzigartige Zellzyklusproteine zu identifizieren, die dazu in der Lage sind, bei Überexpression Pflanzen Toleranz gegenüber Trockenheits- und/oder Froststress zu verleihen. Die vorliegende Erfindung stellt eine transgene Pflanzenzelle bereit, die mit einer für ein stressbezogenes Zellzyklusprotein (CCSRP) kodierenden Nukleinsäure transformiert ist, welche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CC-1, wie in SEQ ID NO: 7 definiert, und einem Polypeptid mit wenigstens 80% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 7 über seine Gesamtlänge, wobei die Expression der Nukleinsäuresequenz in der Pflanzenzelle zu erhöhter Toleranz gegenüber Umweltstress im Vergleich zu einer Wildtyp-Varietät der Pflanzenzelle führt. Hierin beschrieben sind die Zellzyklusproteine 1) Zellzyklus-1 (CC-1); 2) Zellzyklus-2 (CC-2) und 3) Zellzyklus-3 (CC-3), jeweils aus Physcomitrella patens. CC-2 und CC-3 sind nicht Gegenstand der Erfindung.
Die Erfindung sieht in einigen Ausführungsformen vor, dass das CCSRP und die kodierende Nukleinsäure in Mitgliedern der Gattung Physcomitrella vorkommen. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform sind die Nukleinsäuren und Proteine jeweils aus einer Physcomitrella patens. Die Erfindung sieht vor, dass der Umweltstress Trockenheit oder kalte Temperatur ist.
Die Erfindung stellt ferner ein Saatgut bereit, welches von einer transgenen Pflanze produziert ist, die mit einer ein CCSRP kodierenden Nukleinsäure transformiert ist, wobei die Pflanze reinrassig ist für erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress im Vergleich zu einer Wildtyp-Varietät der Pflanze. Die Erfindung stellt ferner ein Saatgut bereit, welches von einer transgenen Pflanze, die ein CCSRP exprimiert, erzeugt ist, wobei die Pflanze reinrassig ist für erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress im Vergleich zu einer Wildtyp-Varietät der Pflanze.
Die Erfindung stellt ferner ein landwirtschaftliches Produkt bereit, welches durch eine beliebige der nachstehend beschriebenen transgenen Pflanzen, Pflanzenteile oder des Saatgut erzeugt ist. Die Erfindung stellt ferner ein isoliertes CCSRP bereit, wie nachstehend beschrieben. Die Erfindung stellt ferner eine isolierte CCSRP kodierende Nukleinsäure bereit, wobei die CCSRP kodierende Nukleinsäure für ein CCSRP wie es nachstehend beschrieben ist, kodiert.
Die Erfindung stellt ferner einen isolierten rekombinanten Expressionsvektor bereit, umfassend eine CCSRP kodierende Nukleinsäure, wie nachstehend beschrieben, wobei die Expression des Vektors in einer Wirtszelle zu einer erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress im Vergleich zu einer Wildtyp-Varietät der Wirtszelle führt. Die Erfindung stellt ferner eine Wirtszelle, welche den Vektor enthält und eine Pflanze, welche die Wirtszelle enthält, bereit.
Die Erfindung stellt ein ferner ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit einer CCSRP kodierenden Nukleinsäure bereit, worin die Expression der Nukleinsäure in der Pflanze zu einer im Vergleich zu einer Wildtyp-Varietät der Pflanze erhöhten Toleranz gegenüber Umweltstress führt, umfassend: (a) Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor, umfassend eine CCSRP kodierende Nukleinsäure, und (b) Erzeugen einer transgenen Pflanze mit erhöhter Toleranz gegenüber Trockenheits- und/oder Froststress im Vergleich zu einer Wildtyp-Varietät der Pflanze aus der Pflanzenzelle. Das CCSRP und die CCSRP kodierende Nukleinsäure sind nachstehend beschrieben.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zur Modifizierung der Trockenheits- und/oder Froststresstoleranz einer Pflanze bereit, welche das Modifizieren der Expression eines CCSRP in der Pflanze umfassen, worin das CCSRP wie nachstehend beschrieben ist. Die Erfindung sieht vor, dass dieses Verfahren derart durchgeführt werden kann, dass die Trockenheits- und/oder Froststresstoleranz erhöht wird. Vorzugsweise wird die Trockenheits- und/oder Froststresstoleranz in einer Pflanze durch Steigerung der Expression eines CCSRP erhöht.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 (A–C) zeigen die partiellen cDNA-Sequenzen von CC-1 (SEQ ID NO: 1), CC-2 (SEQ ID NO: 2) und CC-3 (SEQ ID NO: 3) aus Physcomitrella patens.
2 (A–C) zeigen die Volllängen-cDNA-Sequenzen von CC-1 (SEQ ID NO: 4), CC- 2 (SEQ ID NO: 5) und CC-3 (SEQ ID NO: 6) aus Physcomitrella patens.
3 (A–H) zeigen die abgeleiteten Aminosäuresequenzen von CC-1 (SEQ ID NO: 7), CC-2 (SEQ ID NO: 8) und CC-3 (SEQ ID NO: 9) aus Physcomitrella patens.
4 zeigt ein Diagramm des pflanzlichen Expressionsvektors ppBPSsc022, welcher den Superpromotor enthält, der die Expression von SEQ ID NO: 4, 5 und 6 steuert („Gewünschtes Gen"). Die Komponenten sind: NPTII Kanamycin-Resistenz-Gen, ATAct2-i Promoter, OCS3 Terminator, NOSpA Terminator (Jefferson et al., 1987 EMBO J 6: 3901–7).
5 zeigt die Ergebnisse eines Trockenheitsstress-Tests mit transgenen Pflanzen, welche PpCC-1 überexprimieren und Wildtyp Arabidopsis Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp. Einzelne transformierte Linien sind gezeigt.
6 zeigt die Ergebnisse eines Froststress-Tests mit transgenen Pflanzen, welche PpCC-1 überexprimieren und Wildtyp Arabidopsis Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp. Einzelne transformierte Linien sind gezeigt.
7 zeigt die Ergebnisse eines Trockenheitsstress-Tests mit transgenen Pflanzen, welche PpCC-2 überexprimieren und Wildtyp Arabidopsis Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp. Einzelne transformierte Linien sind gezeigt.
8 zeigt die Ergebnisse eines Trockenheitsstress-Tests mit transgenen Pflanzen, welche PpCC-3 überexprimieren und Wildtyp Arabidopsis Linien. Die transgenen Linien zeigen einen toleranten Phänotyp. Einzelne transformierte Linien sind gezeigt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung ist durch die folgende ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung und die enthaltenen Beispiele leichter verständlich Selbstverständlich dient die hierin verwendete Terminologie nur der Beschreibung spezieller Ausführungsformen und soll nicht einschränkend verstanden werden. Insbesondere schränkt die Bezeichnung der Aminosäuresequenzen als „stressbezogene Zellzyklusproteine" (CCSRPs) die Funktionalität dieser Sequenzen in keiner Weise ein. Gemäß der Erfindung ist CCSRP ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus CC-1, wie es in SEQ ID NO: 7 definiert ist, und einem Polypeptid mit wenigstens 80% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 7 über seine gesamte Länge.
Die vorliegende Erfindung stellt eine transgene Pflanzenzelle bereit, welche mit einer CCSRP kodierenden Nukleinsäure transformiert ist, worin die Expression der Nukleinsäuresequenz in der Pflanzenzelle zu erhöhter Toleranz gegenüber Umweltstress im Vergleich zu einer Wildtypvarietät der Pflanzenzelle führt. Die Erfindung stellt ferner transgene Pflanzenteile und transgene Pflanzen bereit, welche die hierin beschriebenen Pflanzenzellen enthalten. Ebenfalls bereitgestellt wird ein pflanzliches Saatgut, welches von einer transgenen Pflanze produziert ist, die mit einer CCSRP kodierenden Nukleinsäure transformiert ist, worin das Saatgut die CCSRP kodierende Nukleinsäure enthält und worin die Pflanze reinrassig ist für erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress, im Vergleich zu einer Wildtyp-Varietät der Pflanze. Ferner stellt die Erfindung ein Saatgut bereit, welches von einer transgenen Pflanze produziert ist, die ein CCSRP exprimiert, wobei das Saatgut das CCSRP enthält und worin die Pflanze reinrassig ist für erhöhte Toleranz gegenüber Umweltstress, im Vergleich zu einer Wildtyp-Varietät der Pflanze. Die Erfindung stellt außerdem ein landwirtschaftliches Produkt bereit, das durch beliebige der nachstehend beschriebenen transgenen Pflanzen, Pflanzenteile und Pflanzensaatgut hergestellt ist.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „Varietät" auf eine Gruppe von Pflanzen innerhalb einer Spezies, die gemeinsame konstante Merkmale aufweisen, welche sie von der typischen Form und von anderen möglichen Varietäten innerhalb dieser Spezies unterscheiden. Während eine Varietät wenigstens ein unterscheidendes Merkmal aufweist, zeichnet sie sich auch durch eine gewisse Variation zwischen Individuen innerhalb der Varietät aus, vorrangig auf Grundlage der Mendelschen Segregation von Merkmalen unter den Abkömmlingen nachfolgender Generationen. Eine Varietät wird als „reinrassig" für ein bestimmtes Merkmal angesehen, wenn sie für dieses Merkmal genetisch homozygot ist, in einem solchen Ausmaß, dass dann, wenn die reinrassige Varietät selbst-befruchtet wird, kein signifikantes Ausmaß unabhängiger Segregation des Merkmals unter den Abkömmlingen beobachtet wird. In der vorliegenden Erfindung ist das Merkmal auf die transgene Expression einer oder mehrerer der in eine Pflanzenvarietät eingebrachen DNA-Sequenzen zurückzuführen.
Die vorliegende Erfindung beschreibt erstmals das Physcomitrella patens CCSRP. CC-1 ist geeignet zur Steigerung der Toleranz einer Pflanze gegenüber Umweltstress. Dementsprechend stellt die vorliegende Erfindung isolierte CCSRPs bereit, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Zellzyklus-1 (CC-1) Protein, wie es in SEQ ID NO: 7 definiert ist, und Homologen und Orthologen davon. Homologe und Orthologe der Aminosäuresequenzen sind nachstehend definiert.
Die erfindungsgemäßen CCSRPs werden vorzugsweise über rekombinante DNA-Techniken hergestellt. Zum Beispiel wird ein Nukleinsäuremolekül, welches das Protein kodiert, in einen Expressionsvektor kloniert (wie nachstehend beschrieben), der Expressionsvektor wird in eine Wirtszelle eingebracht (wie nachstehend beschrieben) und das CCSRP wird in der Wirtszelle exprimiert. Das CCSRP kann dann aus den Zellen über ein geeignetes Reinigungsschema unter Verwendung von Standardtechniken der Proteinreinigung isoliert werden. Alternativ zu der rekombinanten Expression kann ein CCSRP Polypeptid oder Peptid chemisch synthetisiert werden, unter Verwendung von Standardtechniken der Peptidsynthese. Außerdem kann natives CCSRP aus Zellen isoliert werden (z.B. Physcomitrella patens), beispielsweise unter Verwendung eines anti-CCSRP Antikörpers, der durch Standardtechniken unter Verwendung eines CCSRPs oder eines Fragments davon hergestellt werden kann.
Die Erfindung stellt ferner eine isolierte CCSRP kodierende Nukleinsäure bereit. Die CCSRP kodierende Nukleinsäure ist ausgewählt aus einer Zellzyklus-1 (CC-1) Nukleinsäure, wie in SEQ ID NO: 4 definiert.
Homologe und Orthologe der Nukleotidsequenzen sind nachstehend definiert. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Nukleinsäure und das Protein aus der Pflanzengattung Physcomitrella isoliert. In einer anderen bevorzugten Pflanzengattung stammen Nukleinsäure und Protein jeweils aus einer Physcomitrella patens (P. patens)-Pflanze.
Wie hierin verwendet betrifft die Bezeichnung „Umweltstress" beliebige suboptimale Wachstumsbedingungen und beinhaltet, ist aber nicht beschränkt auf suboptimale Bedingungen bezüglich Salzgehalt, Trockenheit, Temperatur, Metall, Chemikalien, pathogene und oxidative Stressarten oder Kombinationen davon. Bei dem beanspruchten Gegenstand der Erfindung handelt es sich bei Umweltstress um geringen Wassergehalt oder niedrige Temperatur. Es ist außerdem selbstverständlich, dass, wie in der Beschreibung und in den Ansprüchen verwendet, „ein" oder „eine" ein oder mehrere bedeuten kann, abhängig von dem Zusammenhang, in dem es verwendet wird. Wenn beispielsweise auf „eine Zelle" Bezug genommen wird, so kann das bedeuten, dass wenigstens eine Zelle verwendet werden kann.
Wie ebenfalls hierin verwendet, sollen die Bezeichnungen „Nukleinsäure" und „Nukleinsäuremolekül" DNA-Moleküle (z.B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z.B. mRNA) und unter Verwendung von Nukleotid-Analoga erzeugte Analoga der DNA oder RNA bedeuten. Diese Bezeichnung umfasst auch eine untranslatierte Sequenz, die sich sowohl an dem 3' als auch dem 5'-Ende der kodierenden Region des Gens befindet: wenigstens etwa 1000 Nukleotide der Sequenz stromaufwärts von dem 5'-Ende der kodierenden Region und wenigstens etwa 200 Nukleotide der Sequenz stromabwärts der kodierenden Region des Gens. Das Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, vorzugsweise ist es doppelsträngige DNA.
Ein „isoliertes" Nukleinsäuremolekül ist ein Nukleinsäuremolekül, das im Wesentlichen von anderen Nukleinsäuremolekülen, die in der natürlichen Quelle der Nukleinsäure vorhanden sind, abgetrennt ist. Bevorzugt ist eine „isolierte" Nukleinsäure frei von einigen der Sequenzen, welche die Nukleinsäure natürlicherweise flankieren (d.h. Sequenzen, die sich an den 5'- und 3'-Enden der Nukleinsäure befinden) in der genomischen DNA des Organismus, aus dem die Nukleinsäure abgeleitet ist. Beispielsweise kann in verschiedenen Ausführungsformen das isolierte CCSRP Nukleinsäuremolekül weniger als etwa 5 kb, 4 kb, 3 kb, 2 kb, 1 kb, 0,5 kb oder 0,1 kb an Nukleotidsequenzen enthalten, die natürlicherweise das Nukleinsäuremolekül in genomischer DNA der Zelle, aus der die Nukleinsäure abgeleitet ist (z.B. eine Physcomitrella patens Zelle), flankieren. Außerdem kann ein „isoliertes" Nukleinsäuremolekül, wie beispielsweise ein cDNA-Molekül, frei sein von einigem anderen zellulären Material, mit dem es natürlicherweise verbunden ist, oder Kulturmedium, wenn es durch rekombinante Techniken hergestellt wird, oder chemische Vorläufer oder andere Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert ist.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, z.B. ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 4 oder ein Teil davon, kann unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken und den hierin bereitgestellten Sequenzinformationen isoliert werden. Zum Beispiel kann eine P. patens CCSRP-cDNA aus einer P. patens Bibliothek unter Verwendung der gesamten oder eines Teils der Sequenz aus SEQ ID NO: 1 isoliert werden. Außerdem kann ein Nukleinsäuremolekül, das die vollständige oder einen Teil der Sequenz aus SEQ ID NO: 1 umfasst, durch die Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von Oligonukleotidprimern isoliert werden, die auf Grundlage dieser Sequenz entworfen wurden. Beispielsweise kann mRNA aus Pflanzenzellen isoliert werden (z.B. durch das Guanidinium-Thiocyanat-Extraktionsverfahren von Chirgwin et al., 1979 Biochemistry 18: 5294–5299) und cDNA kann unter Verwendung reverser Transkriptase hergestellt werden (z.B. Moloney MLV reverse Transkriptase, erhältlich von Gibco/BRL, Bethesda, MD; oder AMV reverse Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL). Synthetische Oligonukleotidprimer zur Polymerasekettenreaktion-Amplifizierung können auf Basis der Nukleinsäuresequenz, die in SEQ ID NO: 1 gezeigt ist, erstellt werden. Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann unter Verwendung von cDNA oder wahlweise von genomischer DNA als eine Matrize und geeigneten Oligonukleotidprimern nach Standard-PCR-Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Das so amplifizierte Nukleinsäuremolekül kann in einen geeigneten Vektor kloniert und durch DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Ferner können Oligonukleotide entsprechend einer CCSRP-Nukleotidsequenz durch Standard-Synthesetechniken hergestellt werden, z.B. unter Verwendung eines automatisierten DNA-Synthesizers.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül die Nukleinsäuresequenz, die in SEQ ID NO: 4 gezeigt ist. Diese cDNAs umfassen sowohl Sequenzen, welche die CCSRPs kodieren (d.h. die "kodierende Region", in Tabelle 1 gezeigt) als auch 5'-untranslatierte Sequenzen und 3'-untranslatierte Sequenzen. Es ist selbstverständlich, dass SEQ ID NO: 4 sowohl kodierende Regionen als auch 5'- und 3'-untranslatierte Regionen umfasst. Wahlweise können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle nur die kodierende Region der Sequenz aus SEQ ID NO: 4 oder vollständige genomische Fragmente, welche aus genomischer DNA isoliert sind, umfassen. Eine kodierende Region für diese Sequenzen wird als "ORF-Position" bezeichnet. Bevorzugt ist eine CCSRP-kodierende Nukleinsäure, welche das CCSRP CC-1 (SEQ ID NO: 7) kodiert.
Darüber hinaus kann das Nukleinsäuremolekül nur einen Teil der kodierenden Region einer der Sequenzen aus SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 umfassen, beispielsweise ein Fragment, das als Sonde oder Primer verwendet werden kann, oder ein Fragment, welches einen biologisch aktiven Abschnitt eines CCSRP kodiert. Die Nukleinsäuresequenzen, die durch die Klonierung der CCSRP-Gene aus P. patens bestimmt wurden, erlauben die Erstellung von Sonden und Primern, die zur Verwendung bei der Identifizierung und/oder Klonierung von CCSRP-Homologen in anderen Zelltypen und Organismen konzipiert sind, sowie CCSRP-Homologe aus anderen Moosen und verwandten Spezies.
Abschnitte von Proteinen, die durch die CCSRP-Nukleinsäuremoleküle kodiert werden, sind vorzugsweise biologisch aktive Abschnitte eines der hierin beschriebenen CCSRPs. Wie hierin verwendet, soll die Formulierung "biologisch aktiver Abschnitt" eines CCSRPs einen Abschnitt zu umfassen, z.B. eine Domäne/ein Motiv eines CCSRPs, der an einer Stresstoleranzantwort in einer Pflanze beteiligt ist, der eine in Tabelle 1 angegebene Aktivität aufweist, oder der an der Transkription eines Proteins beteiligt ist, das in eine Stresstoleranzantwort einer Pflanze involviert ist. Um zu bestimmen, ob ein CCSRP oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon an der Transkription eines Proteins beteiligt sein kann, das in eine Stresstoleranzantwort in einer Pflanze involviert ist, kann eine Stressanalyse einer Pflanze, die das CCSRP umfasst, durchgeführt werden. Solche Analyseverfahren, wie sie in Beispiel 7 ausführlich beschrieben sind, sind dem Fachmann gut bekannt. Spezieller können Nukleinsäurefragmente, die biologisch aktive Abschnitte eines CCSRP kodieren durch Isolierung eines Abschnitts der Sequenz aus SEQ ID NO: 7, Exprimieren des kodierten Abschnitts des CCSRP oder des Peptids (z.B. durch rekombinante Expression in vitro) und Bestimmung der Aktivität des kodierten Abschnitts des CCSRPs oder Peptids, hergestellt werden.
Biologisch aktive Abschnitte eines CCSRPs sind inbegriffen und schließen Peptide umfassend Aminosäuresequenzen, die von der Aminosäuresequenz eines CCSRPs, z.B. einer Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 7 oder von der Aminosäuresequenz eines Proteins, welches homolog zu CCSRP ist und welches weniger Aminosäuren umfasst als ein Volllängen-CCSRP oder das Volllängen-Protein, welches homolog zu einem CCSRP ist, abgeleitet sind, und wenigstens eine Aktivität eines CCSRPs aufweisen, ein. Typischerweise umfassen biologisch aktive Abschnitte (z.B. Peptide, welche beispielsweise 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 oder mehr Aminosäuren lang sind) eine Domäne oder ein Motiv mit wenigstens einer Aktivität eines CCSRPs. Darüber hinaus können andere biologisch aktive Abschnitte, in welchen andere Regionen des Proteins deletiert sind, durch rekombinante Techniken hergestellt werden und für eine oder mehrere der hierin beschriebenen Aktivitäten evaluiert werden. Vorzugsweise schließen die biologisch aktiven Abschnitte eines CCSRPs eine oder mehrere ausgewählte Domänen/Motive oder Abschnitte davon mit biologischer Aktivität ein.
CCSRP chimäre Proteine oder Fusionsproteine können bereitgestellt werden. Wie hierin verwendet, umfasst ein CCSRP "chimäres Protein" oder "Fusionsprotein" ein CCSRP-Polypeptid, welches operativ mit einem nicht-CCSRP-Polypeptid verknüpft ist. Ein CCSRP-Polypeptid betrifft ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz entsprechend einem CCSRP, wohingegen ein nicht-CCSRP-Polypeptid ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz betrifft, entsprechend einem Protein, welches im Wesentlichen nicht homolog zu dem CCSRP-Protein ist, z.B. einem Protein, welches sich von dem CCSRP unterscheidet und welches aus dem gleichen oder einem unterschiedlichen Organismus abgeleitet ist. Innerhalb des Fusionsproteins soll die Formulierung "operativ verknüpft" ausdrücken, dass das CCSRP-Polypeptid und das nicht-CCSRP-Polypeptid aneinander fusioniert sind, so dass beide Sequenzen die vorgeschlagene Funktion, welche der verwendeten Sequenz zugeschrieben wird, erfüllen. Das nicht-CCSRP-Polypeptid kann an den N-Terminus oder C-Terminus des CCSRP-Polypeptids fusioniert sein. Beispielsweise ist in einer Ausführungsform das Fusionsprotein ein GST-CCSRP-Fusionsprotein, in welchem die CCSRP-Sequenzen an den C-Terminus der GST-Sequenzen fusioniert sind. Solche Fusionsproteine können die Reinigung von rekombinanten CCSRPs erleichtern. In einer anderen Ausführungsform ist das Fusionsprotein ein CCSRP mit einer heterologen Signalsequenz an seinem N-Terminus. In bestimmten Wirtszellen (z.B. Säugerwirtszellen) kann die Expression und/oder Sekretion eines CCSRP durch die Verwendung einer heterologen Signalsequenz gesteigert werden.
Ein CCSRP chimäres Protein oder Fusionsprotein wird vorzugsweise unter Verwendung von rekombinanten DNA-Standardtechniken hergestellt. Beispielsweise können DNA-Fragmente, welche für die unterschiedlichen Polypeptidsequenzen kodieren, im Leserahmen entsprechend konventionellen Techniken ligiert werden, beispielsweise unter Verwendung von glatten oder überhängenden Enden zur Ligation, Restriktionsenzymverdau, um die entsprechenden Enden bereitzustellen, Auffüllen der kohäsiven Enden soweit erforderlich, alkalische Phosphotase-Behandlung, um unerwünschtes Binden zu vermeiden und enzymatische Ligation. In einer anderen Ausführungsform kann das Fusionsgen durch konventionelle Techniken einschließlich automatisierter DNA-Synthesizer synthetisiert werden. Wahlweise kann die PCR-Amplifizierung von Genfragmenten unter Verwendung von Ankerprimern, welche zu komplementären Überhängen zwischen zwei konsekutiven Genfragmenten führen und welche anschließend annealed und reamplifiziert werden können, um eine chimäre Gensequenz zu erzeugen, durchgeführt werden (siehe beispielsweise Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992). Darüber hinaus sind viele Expressionsvektoren kommerziell erhältlich, die bereits einen Fusionsrest kodieren (z.B. ein GST-Polypeptid). Eine CCSRP-kodierende Nukleinsäure kann so in einen solchen Expressionsvektor kloniert werden, dass der Fusionsrest im Leseraster mit dem CCSRP verknüpft ist.
Zusätzlich zu Fragmenten und Fusionsproteinen der hierin beschriebenen CCSPPs können auch Homologe und Analoge von natürlich auftretenden CCSRPs und CCSRP-kodierenden Nukleinsäuren in einer Pflanze bereitgestellt werden. „Homologe" sind hierin definiert als zwei Nukleinsäuren oder Proteine, die ähnliche oder „homologe" Nukleotid- bzw. Aminosäuresequenzen aufweisen. Homologe schließen allelische Varianten, Orthologe, Paraloge, Agonisten und Antagonisten der nachstehend definierten CCSRPs ein. Der Begriff „Homologon" umfasst ferner Nukleinsäuremoleküle, die sich von einer der in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 (und Teilen davon) gezeigten Nukleinsäure aufgrund der Degenerierung des genetischen Codes unterscheiden, und somit das selbe CCSRP kodieren, das von den in SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 6 gezeigten Nukleinsäuren kodiert wird. Wie hierin verwendet, betrifft ein „natürlich auftretendes" CCSRP eine CCSRP-Aminosäuresequenz, die in der Natur vorkommt. Vorzugsweise umfasst ein natürlich auftretendes CCSRP eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8 und SEQ ID NO: 9.
Ein CCSRP-Agonist kann im Wesentlichen die gleiche biologische CCSRP-Aktivität oder eine Teilmenge der biologischen CCSRP-Aktivitäten behalten. Ein CCSRP-Antagonist kann eine oder mehrere Aktivitäten der natürlich auftretenden Form des CCSRPs hemmen. Beispielsweise kann der CCSRP-Antagonist ein Stromabwärts- oder Stromaufwärtselement der metabolischen Kaskade der Zellmembrankomponenten, die CCSRP umfasst, kompetitiv binden, oder an ein CCSRP, welches den Transport von Verbindungen über solche Membranen hinweg vermittelt binden, und somit ein Stattfinden der Translokation verhindern.
Nukleinsäuremoleküle, die zu natürlichen allelischen Varianten und Analogen, Orthologen und Paralogen einer CCSRP-cDNA korrespondieren können auf Grundlage ihrer Identität zu den hierin beschriebenen Physcomitrella patens CCSRP-Nukleinsäuren unter Verwendung von CCSRP-cDNAs oder eines Teils davon, als Hybridisierungssonde, gemäß Hybridisierungs-Standardtechniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen hergestellt werden. In einer alternativen Ausführungsform können CCSRP-Homologe durch Durchmustern kombinatorischer Bibliotheken von CCSRP-Mutanten, z.B. Trunkation-Mutanten, nach CCSRP-Agonist- oder -Antagonistaktivität identifiziert werden. In einer Ausführungsform wird eine reichhaltige Bibliothek von CCSRP-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf der Stufe von Nukleinsäuren erzeugt und wird durch eine reichhaltige Genbibliothek kodiert. Eine reichhaltige Bibliothek von CCSRP-Varianten, kann beispielsweise durch enzymatisches Ligieren eines Gemisches synthetischer Oligonukleotide in Gensequenzen hergestellt werden, so dass ein degenerierter Satz möglicher CCSRP-Sequenzen als einzelne Polypeptide exprimierbar ist, oder alternativ ein Satz großer Fusionsproteine (z.B. zum Phagen-Display), der den Satz CCSRP-Sequenzen enthält, hergestellt wird. Es gibt eine breite Auswahl an Verfahren, welche verwendet werden können, um Bibliotheken potenzieller CCSRP-Homologer aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz herzustellen. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem automatisierten DNA-Synthesizer durchgeführt werden, und das synthetische Gen wird anschließend in einen geeigneten Expressionsvektor kloniert. Die Verwendung eines degenerierten Satzes von Genen erlaubt die Bereitstellung aller der Sequenzen, die für den gewünschten Satz möglicher CCSRP-Sequenzen kodieren, in einer Mischung. Verfahren zur Synthese degenerierter Oligonukleotide sind im Fachbereich bekannt (siehe z.B. Narang, S. A., 1983 Tetrahedron 39: 3; Itakura et al., 1984 Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., 1984 Science 198: 1056; Ike et al., 1983 Nucleic Acid Res. 11: 477).
Zusätzlich können Bibliotheken von Fragmenten der CCSRP-kodierenden Regionen verwendet werden, um eine variierte Population von CCSRP-Fragmenten zum Durchmustern und anschließende Auswahl von CCSRP-Homologen zu erzeugen. In einer Ausführungsform kann eine Bibliothek kodierender Sequenzfragmente durch Behandlung eines doppelsträngigen PCR-Fragments einer CCSRP-kodierenden Sequenz mit einer Nuklease unter Bedingungen, bei denen ein Schnitt nur etwa einmal pro Molekül auftritt, Denaturierung der doppelsträngigen DNA, Renaturierung der DNA, um eine doppelsträngige DNA zu bilden, welche sense-/antisense-Paare aus verschiedenen geschnittenen Produkten einschließen kann, Entfernen der einzelsträngigen Abschnitte von den wieder gebildeten Duplexen durch Behandlung mit S1-Nuklease und Ligieren der sich ergebenden Fragmentbibliothek in einen Expressionsvektor erzeugt werden. Durch dieses Verfahren kann eine Expressionsbibliothek abgeleitet werden, die N-terminale, C-terminale und interne CCSRP-Fragmente mit verschiedenen Größen kodiert.
Zum Durchmustern von Genprodukten aus kombinatorischen Bibliotheken, welche durch Punktmutationen oder Trunkation hergestellt wurden, und zum Durchmustern von cDNA-Bibliotheken nach Genprodukten mit einer ausgewählten Eigenschaft, sind im Fachbereich einige Techniken bekannt. Solche Techniken können zum schnellen Durchmustern von Genbibliotheken, die durch kombinatorische Mutagenese von CCSRP-Homologen erzeugt wurden, angepasst werden. Die am häufigsten verwendeten Techniken, die einer Hochdurchsatz-Analyse zum Durchmustern großer Genbibliotheken zugänglich sind, schließen typischerweise die Klonierung der Genbibliothek in replizierbare Expressionsvektoren, die Transformierung geeigneter Zellen mit der sich ergebenden Vektorbibliothek und die Expression der kombinatorischen Gene unter Bedingungen ein, unter welchen die Detektion einer gewünschten Aktivität die Isolierung des Vektors ermöglicht, der das Gen kodiert, dessen Produkt detektiert wurde. Rekursive Ensemble-Mutagenese (recursive ensemble mutagenesis; REM), eine neue Technik, welche die Häufigkeit funktioneller Mutanten in den Bibliotheken erhöht, kann in Kombination mit den Durchmusterungsassays verwendet werden, um CCSRP-Homologe zu identifizieren (Arkin und Yourvan, 1992 PNAS 89: 7811–7815; Delgrave et al., 1993 Protein Engineering 6(3): 327–331). In einer anderen Ausführungsform können Assays auf Zellbasis verwendet werden, um eine vielfältige CCSRP-Bibliothek unter Verwendung von im Fachbereich gut bekannten Verfahren zu analysieren. Ein Verfahren zur Identifizierung eines neuen CCSRPs kann bereitgestellt werden, umfassend (a) Erzeugen einer spezifischen Antikörperantwort auf ein CCSRP oder ein Fragment davon, wie oben beschrieben; (b) Durchmustern von mutmaßlichem CCSRP-Material mit dem Antikörper, worin das spezifische Binden des Antikörpers an das Material die Gegenwart eines potentiellen neuen CCSRPs anzeigt und; (c) Analysieren des gebundenen Materials im Vergleich zu bekanntem CCSRP, um dessen Neuheit zu bestimmen.
Um die prozentuale Homologie zweier Aminosäuresequenzen zu bestimmen (z.B. der Sequenz aus SEQ ID NO: 7 und einer Mutantenform davon), werden die Sequenzen zu optimalen Vergleichszwecken aligned (z.B. können Lücken in die Sequenz eines Proteins oder einer Nukleinsäure eingeführt werden, für ein optimales Alignment mit dem anderen Protein oder der anderen Nukleinsäure). Die Aminosäurereste an korrespondierenden Aminosäurepositionen oder Nukleotidpositionen werden anschließend verglichen. Wenn eine Position in einer Sequenz (z.B. in der Sequenz aus SEQ ID NO: 7) durch denselben Aminosäurerest besetzt ist wie die korrespondierende Position in der anderen Sequenz (z.B. einer Mutantenform der Sequenz des Polypeptids von SEQ ID NO: 7), so sind die Moleküle an dieser Position homolog (d.h. wie hierin verwendet entspricht Aminosäure- oder Nukleinsäure-"Homologie" Aminosäure- oder Nukleinsäure-"Identität"). Derselbe Vergleich kann zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen angestellt werden.
Die prozentuale Homologie zwischen den zwei Sequenzen ist eine Funktion der Anzahl an identischen Positionen, die die Sequenzen gemeinsam haben (d.h. % Homologie = Anzahl identischer Positionen/Gesamtzahl an Positionen × 100). Die in der vorliegenden Erfindung enthaltenen Aminosäuresequenzen sind wenigstens 80–90%, 90–95%, und am meisten bevorzugt wenigstens etwa 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr homolog zu einer gesamten Aminosäuresequenz, die in SEQ ID NO: 7 gezeigt ist. In einer anderen Ausführungsform zu wenigstens 80–90%, 90–95% und am meisten bevorzugt wenigstens etwa 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr homolog zu einer gesamten Aminosäuresequenz, die von einer in SEQ ID NO: 4 gezeigten Nukleinsäuresequenz kodiert ist.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfasst ein isoliertes erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die wenigstens 80–90% oder 90–95% und noch weiter bevorzugt wenigstens etwa 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr homolog zu einer in SEQ ID NO: 4 gezeigten Nukleotidsequenz ist. Die Länge des Sequenzvergleichs für Nukleinsäuren ist die gesamte kodierende Region der Nukleinsäure.
Es ist außerdem bevorzugt, dass das homologe Nukleinsäuremolekül ein Protein oder einen Abschnitt davon kodiert, der eine Aminosäuresequenz enthält, die ausreichend homolog zu einer Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 7 ist, sodass das Protein oder der Abschnitt davon dieselbe oder eine ähnliche Funktion behält, wie die Aminosäuresequenz, mit der sie verglichen wird. Funktionen der CCSRP-Aminosäuresequenzen beinhalten die Fähigkeit, sich an einer Stresstoleranzantwort in einer Pflanze zu beteiligen, oder insbesondere, an der Transkription eines Proteins teilzunehmen, das an einer Stresstoleranzantwort in einer Physcomitrella patens-Pflanze beteiligt ist. Beispiele für solche Aktivitäten sind in Tabelle 1 beschrieben.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Verfahren kann eine Bestimmung der prozentualen Homologie zwischen zwei Sequenzen unter Verwendung eines mathematischen Algorithmus durchgeführt werden. Ein bevorzugtes nicht-beschränkendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus, welcher für den Vergleich von zwei Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus von Karlin und Altschul (1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873–5877). Ein solcher Algorithmus fließt in die in NBLAST- und XBLAST-Programme von Altschul et al. (1990 J. Mol. Biol. 215: 403–410) ein.
Um Nukleinsäuresequenzen, die homolog zu erfindungsgemäßen CCSRP-Nukleinsäuremolekülen sind, zu erhalten, können BLAST-Nukleinsäure-Suchen mit dem NBLAST-Programm durchgeführt werden, Score = 100, Wortlänge = 12. Um Aminosäuresequenzen, die homolog zu erfindungsgemäßen CCSRPs sind, zu erhalten, können außerdem BLAST-Protein-Suchen mit dem XBLAST-Programm durchgeführt werden, Score = 50, Wortlänge = 3. Um Alignments mit Lücken (gapped Alignments) für Vergleichszwecke zu erhalten, kann Gapped BLAST, wie in Altschul et al. (1997 Nucleic Acid Res. 25: 3389–3402) beschrieben, verwendet werden. Wenn BLAST und Gapped BLAST-Programme verwendet werden, können die Fehlerparameter der jeweiligen Programme (z.B. XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Ein anderes bevorzugtes nicht limitierendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus, der für den Vergleich von Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus von Myers und Miller (CABIOS 1989). Ein solcher Algorithmus fließt in das ALIGN-Programm (Version 2.0) ein, welches Teil des GCG-Sequenz-Alignment-Software-Pakets ist. Wenn das ALIGN-Programm für den Vergleich von Aminosäuresequenzen verwendet wird, kann eine PAM120 Gewichtungstabelle (weight residue table), eine Strafe für Lückenlängen (gap length penalty) von 12 und eine Lückenstrafe (gap penalty) von 4 verwendet werden, um Aminosäuresequenzen zu erhalten, die homolog zu den erfindungsgemäßen CCSRPs sind. Um für Vergleichszwecke Alignments mit Lücken (gapped Alignments) zu erhalten, kann Gapped BLAST, wie in Altschul et al. (1997 Nucleic Acid Res. 25: 3389–3402) beschrieben, verwendet werden. Wenn BLAST und Gapped BLAST-Programme verwendet werden, können die Fehlerparameter der jeweiligen Programme (z.B. XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Ein anderes bevorzugtes nicht limitierendes Beispiel eines mathematischen Algorithmus, der zum Vergleich von Sequenzen verwendet wird, ist der Algorithmus von Myers und Miller (CABIOS 1989). Ein solcher Algorithmus fließt in das ALIGN-Programm (Version 2.0) ein, welches Teil des GCG-Sequenz-Alignment-Software-Pakets ist. Wenn das ALIGN-Programm für den Vergleich von Aminosäuresequenzen verwendet wird, kann eine PAM120 Gewichtungstabelle (weight residue table), eine Strafe für Lückenlängen (gap length penalty) von 12 und eine Lückenstrafe (gap penalty) von 4 verwendet werden.
Schließlich kann Homologie zwischen Nukleinsäuresequenzen auch unter Verwendung von Hybridisierungs-Standardtechniken, die dem Fachmann bekannt sind, bestimmt werden. Entsprechend umfasst ein isoliertes Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die, z.B. unter stringenten Bedingungen, an die in SEQ ID NO: 4 gezeigte Nukleotidsequenz oder einen Abschnitt davon hybridisiert. Insbesondere weist ein isoliertes Nukleinsäuremolekül eine Länge von wenigstens 15 Nukleotiden auf, und hybridisiert unter stringenten Bedingungen an das Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 4 umfasst. In anderen Ausführungsformen weist die Nukleinsäure eine Länge von wenigstens 30, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotiden auf.
Wie hierin verwendet, soll die Formulierung "hybridisiert unter stringenten Bedingungen" Bedingungen für die Hybridisierung und Wasch-Schritte beschreiben, unter denen Nukleotidsequenzen mit wenigstens 60% Homologie zueinander typischerweise aneinander hybridisiert bleiben. Vorzugsweise sind die Bedingungen so, dass Sequenzen typischerweise mit wenigstens etwa 65%, stärker bevorzugt mit wenigstens etwa 70% und nochmals stärker bevorzugt, mit wenigstens etwa 75% oder mehr Homologie aneinander hybridisiert bleiben. Solche stringenten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt und können Current Protocols in Molecular Biology, 6.3.1–6.3.6, John Wiley & Sons, N.Y. (1989) entnommen werden. Ein bevorzugtes, nicht beschränkendes Beispiel von stringenten Hybridisierungsbedingungen ist die Hybridisierung in 6× Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei etwa 45°C, gefolgt von einem oder mehreren Wasch-Schritten in 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 50–65°C. Vorzugsweise entspricht ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen an eine Sequenz aus SEQ ID NO: 4 hybridisiert, einem natürlich vorkommenden Nukleinsäuremolekül. Wie hierin verwendet, betrifft ein "natürlich vorkommendes" Nukleinsäuremolekül ein RNA- oder DNA-Molekül mit einer Nukleotidsequenz, die in der Natur vorkommt (die z.B. ein natürliches Protein kodiert). In einer Ausführungsform kodiert die Nukleinsäure ein natürlich vorkommendes Physcomitrella patens-CCSRP.
Unter Verwendung der oben beschriebenen Verfahren und anderer Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, kann ein Fachmann Homologe der CCSRPs, die die in SEQ ID NO: 7 gezeigte Aminosäuresequenz umfassen, isolieren. Eine Untergruppe dieser Homologen sind allelische Varianten. Wie hierin verwendet betrifft der Begriff „allelische Variante" eine Nukleotidsequenz, die Polymorphismen enthält, die zu Veränderungen der Aminosäuresequenzen eines CCSRPs führen, und die in einer natürlichen Population (z.B. einer Pflanzenspezies oder Varietät) vorkommen. Solche natürlichen allelischen Variationen können typischerweise zu 1–5% Varianz in einer CCSRP-Nukleinsäure führen. Allelische Varianten können identifiziert werden, indem die Nukleinsäuresequenz von Interesse in mehreren unterschiedlichen Pflanzen sequenziert wird, was leicht durch Verwendung von Hybridisierungssonden erfolgen kann, um dieselbe CCSRP-Genstelle in diesen Pflanzen zu identifizieren.
Außerdem können Nukleinsäuremoleküle in Betracht gezogen werden, die CCSRPs derselben oder anderer Spezies kodieren, wie beispielsweise CCSRP Analoge, Orthologe und Paraloge. Wie hierin verwendet betrifft der Begriff „Analoge" zwei Nukleinsäuren, die dieselbe oder eine ähnliche Funktion aufweisen, die sich aber separat in nicht verwandten Organismen entwickelt haben. Wie hierin verwendet betrifft der Begriff „Orthologe" zwei Nukleinsäuren von unterschiedlichen Spezies, die sich aber aus einem gemeinsamen Stammgen durch Speziation entwickelt haben. Normalerweise kodieren Orthologe Proteine, welche dieselben oder ähnliche Funktionen besitzen. Wie ebenfalls hierin verwendet betrifft der Begriff „Paraloge" zwei Nukleinsäuren, die durch Duplikation innerhalb eines Genoms verwandt sind. Paraloge weisen üblicherweise unterschiedliche Funktionen auf, diese Funktionen können aber verwandt sein (Tatusov, R. L. et al. 1997 Schience 278 (5338): 631–637). Analoge, Orthologe und Paraloge eines natürlich auftretenden CCSRPs können sich von dem natürlich auftretenden CCSRP durch post-translationale Modifikationen, durch Aminosäuresequenzunterschiede oder durch beides unterscheiden. Post-translationale Modifikationen beinhalten chemische Derivatisierung von Polypeptiden in vivo und in vitro, z.B. Acetylierung, Carboxylierung, Phosphorylierung oder Glycosylierung, und solche Modifikationen können während der Polypeptidsynthese oder Verarbeitung oder nach der Behandlung mit isolierten modifizierenden Enzymen auftreten. Orthologe werden insbesondere wenigstens 80–85%, weiter bevorzugt 90% und am meisten bevorzugt 95%, 96%, 97%, 98% oder sogar 99% Identität oder Homologie mit der ganzen oder einem Teil der natürlich auftretenden CCSRP-Aminosäuresequenz aufweisen und sie werden eine ähnliche Funktion wie ein CCSRP zeigen. Orthologe sind außerdem vorzugsweise in der Lage, an der Stressantwort in Pflanzen teilzunehmen. In einer Ausführungsform behalten die CCSRP-Orthologe die Fähigkeit, sich an dem Metabolismus von Verbindungen, die für die Erzeugung von Zellmembranen in Physcomitrella patens notwendig sind, oder an dem Transport von Molekülen über diese Membranen zu beteiligen.
Zusätzlich zu natürlich vorkommenden Varianten einer CCSRP-Sequenz, die in der Population auftreten können, wird der Fachmann ferner erkennen, dass Veränderungen durch Mutation in eine Nukleotidsequenz von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 6 eingefügt werden können, die zu Veränderungen in der Aminosäuresequenz des kodierten CCSRPs führen ohne die funktionelle Fähigkeit des CCSRPs zu verändern. Beispielsweise können Nukleotidsubstitutionen, die zu Aminosäuresubstitutionen an „nicht-essentiellen" Aminosäureresten führen, in einer Sequenz von SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 oder SEQ ID NO: 6 erfolgen. Ein „nicht-essentieller" Aminosäurerest ist ein Rest, der von der Wildtyp-Sequenz eines der CCSRPs verändert werden kann, ohne die Aktivität des CCSRPs zu verändern, wohingegen ein „essentieller" Aminosäurerest für die CCSRP-Aktivität benötigt wird. Andere Aminosäurereste (z.B. solche, die in der Domäne mit CCSRP-Aktivität nicht konserviert sind oder nur teilweise konserviert sind) können jedoch für die Aktivität nicht essentiell sein und daher eher verändert werden, ohne die CCSRP-Aktivität zu verändern.
Entsprechend betrifft eine andere Ausführungsform Nukleinsäuremoleküle, die CCSRPs kodieren, welche Veränderungen in Aminosäureresten enthalten, die für die CCSRP-Aktivität nicht essentiell sind. Solche CCSRPs unterscheiden sich in der Aminosäuresequenz von einer Sequenz, die in SEQ ID NO: 7 enthalten ist, behalten jedoch wenigstens eine der hierin beschriebenen CCSRP-Aktivitäten. In einer Ausführungsform umfasst das isolierte Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die ein Protein kodiert, worin das Protein eine Aminosäuresequenz umfasst, welche wenigstens zu etwa 80% homolog zu einer Aminosäuresequenz aus SEQ ID NO: 7 ist, noch weiter bevorzugt zu wenigstens 80–90%, 90–95% homolog zu der Sequenz aus SEQ ID NO: 7 ist, und am meisten bevorzugt zu wenigstens etwa 96%, 97%, 98% oder 99% homolog zu der Sequenz aus SEQ ID NO: 7 ist. Die bevorzugten CCSRP-Homologe der vorliegenden Erfindung sind vorzugsweise in der Lage, an der Stresstoleranzantwort in einer Pflanze teilzunehmen, oder insbesondere an der Transkription eines Proteins teilzunehmen, das in eine Stresstoleranzantwort in einer Physcomitrella patens Pflanze involviert ist, oder eine oder mehrere der in Tabelle 1 dargelegten Aktivitäten aufweist.
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, welches ein CCSRP-Homologon zu einer Proteinsequenz aus SEQ ID NO: 7 kodiert, kann durch Einführen einer oder mehrerer Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen in eine Nukleotidsequenz aus SEQ ID NO: 4 erzeugt werden, so dass eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen in das kodierte Protein eingeführt werden. Mutationen können in die Sequenz aus SEQ ID NO: 4 durch Standardtechniken wie z.B. sitedirected Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese eingeführt werden. Vorzugsweise werden konservative Aminosäuresubstitutionen an einem oder mehreren vorausgesagten nicht-essentiellen Aminosäureresten durchgeführt. Eine "konservative Aminosäuresubstitution" ist eine Substitution, bei welcher der Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest, der eine ähnliche Seitenkette aufweist, ersetzt wird.
Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten sind im Fachgebiet definiert. Diese Familien schließen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z.B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z.B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), ungeladenen polaren Seitenketten (z.B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), unpolaren Seitenketten (z.B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), beta-verzweigten Seitenketten (z.B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z.B. Tyrosin, Phenylalanin, Tryptophan, Histidin) ein. Daher wird ein vorausgesagter nicht-essentieller Aminosäurerest in einem CCSRP vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest aus derselben Seitenkettenfamilie ersetzt. Wahlweise können in einer anderen Ausführungsform Mutationen zufällig über die gesamte oder einen Teil einer CCSRP-kodierenden Sequenz, beispielsweise durch Saturations-Mutagenese, eingefügt werden und die sich daraus ergebenden Mutanten können nach einer hierin beschriebenen CCSRP-Aktivität durchmustert werden, um so Mutanten zu identifizieren, die CCSRP-Aktivität beibehalten. Nach der Mutagenese der Sequenz aus SEQ ID NO: 4 kann das kodierte Protein rekombinant exprimiert werden und die Aktivität des Proteins kann durch Analyse der Stresstoleranz einer Pflanze bestimmt werden, wobei das Protein wie in Beispiel 7 beschrieben exprimiert wird.
Zusätzlich zu den CCSRP-kodierenden Nukleinsäuremolekülen, die oben beschrieben wurden, betrifft eine andere Ausführungsform isolierte Nukleinsäuremoleküle, die antisense dazu sind. Eine "antisense"-Nukleinsäure umfasst eine Nukleotidsequenz, die komplementär zu einer ein Protein kodierenden "sense"-Nukleinsäure ist, z.B. komplementär zu dem kodierenden Strang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls oder komplementär zu einer mRNA-Sequenz. Entsprechend kann eine antisense-Nukleinsäure über Wasserstoffbrückenbindungen an eine sense-Nukleinsäure binden. Die antisense-Nukleinsäure kann komplementär zu einem vollständigen CCSRP-kodierenden Strang sein oder nur zu einem Abschnitt davon. In einer Ausführungsform ist ein antisense-Nukleinsäuremolekül antisense zu einer "kodierenden Region" des kodierenden Strangs einer Nukleotidsequenz, welche ein CCSRP kodiert. Die Formulierung "kodierende Region" betrifft die Region der Nukleotidsequenz, welche Codons umfasst, die in Aminosäurereste translatiert werden (z.B. die vollständige kodierende Region von ,,, umfasst Nukleotide 1 bis ...). In einer anderen Ausführungsform ist das antisense-Nukleinsäuremolekül antisense zu einer "nicht kodierenden Region" des kodierenden Strangs einer Nukleotidsequenz, welche ein CCSRP kodiert. Die Formulierung "nicht kodierende Region" betrifft 5'- und 3'-Sequenzen, welche die kodierende Region flankieren und die nicht in Aminosäuren translatiert werden (d.h. auch als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen bezeichnet werden).
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein isoliertes Nukleinsäuremolekül ein Nukleinsäuremolekül, das ein Komplement einer der in SEQ ID NO: 4 gezeigten Nukleotidsequenzen oder eines Teils davon ist. Ein Nukleinsäuremolekül, das komplementär zu der in SEQ ID NO: 4 gezeigten Nukleotidsequenz ist, ist ausreichend komplementär zu der in SEQ ID NO: 4 gezeigten Nukleotidsequenz, sodass es an die in SEQ ID NO: 4 gezeigte Nukleotidsequenz hybridisieren und dabei eine stabile Duplex bilden kann.
Wenn die hierin offenbarten Sequenzen des kodierenden Strangs, welche für die CCSRPs kodieren gegeben sind (z.B. die in SEQ ID NO: 4 dargestellte Sequenz), können antisense-Nukleinsäuren gemäß den Basenpaarungsregeln von Watson und Crick konzipiert werden. Das antisense-Nukleinsäuremolekül kann komplementär zu der vollständigen kodierenden Region der CCSRP-mRNA sein, aber stärker bevorzugt ist ein Oligonukleotid, welches nur zu einem Abschnitt der kodierenden oder nicht kodierenden Region der CCSRP-mRNA antisense ist. Beispielsweise kann das antisense-Oligonukleotid komplementär zu der Region sein, welche die Translationsstartstelle der CCSRP-mRNA umgibt. Ein antisense-Oligonukleotid kann beispielsweise eine Länge von etwa 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotiden aufweisen.
Eine antisense-Nukleinsäure kann unter Verwendung chemischer Synthese oder enzymatischer Ligationsreaktionen unter Verwendung von im Fachbereich bekannten Verfahren konstruiert werden. Beispielsweise kann eine antisense-Nukleinsäure (z.B. ein antisense-Oligonukleotid) unter Verwendung natürlich vorkommender Nukleotide oder verschieden modifizierter Nukleotide, welche konzipiert sind, um die biologische Stabilität der Moleküle zu steigern oder um die physikalische Stabilität der Duplex, die sich zwischen antisense- und sense-Nukleinsäuren bildet, zu steigern, synthetisiert werden, z.B. können Phosphorothioat-Derivate und Acridin-substituierte Nukleotide verwendet werden. Beispiele für modifizierte Nukleotide, die verwendet werden können, um die antisense-Nukleinsäuren zu erzeugen, beinhalten 5-Fluorurazil, 5-Bromurazil, 5-Chlorurazil, 5-Jodurazil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxymethyl)-urazil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethylurazil, Dihydrourazil, beta-D-Galaktosylqueosine, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethylurazil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiourazil, beta-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethylurazil, 5-Methoxyurazil, 2-Methylthio-N6-Isopentenyladenin, Urazil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudourazil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiourazil, 2-Thiourazil, 4-Thiourazil, 5-Methylurazil, Urazil-5-oxyessigsäuremethylester, Urazil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-Thiourazil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)urazil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin. Wahlweise kann die antisense-Nukleinsäure biologisch unter Verwendung eines Expressionsvektors, in welchen eine Nukleinsäure in antisense-Orientierung subkloniert wurde (d.h. RNA, welche von der insertierten Nukleinsäure transkribiert wird, befindet sich in antisense-Orientierung zu einer Zielnukleinsäure von Interesse, was im nachfolgenden Unterabschnitt weiter unten beschrieben ist) hergestellt werden.
Die antisense-Nukleinsäuremoleküle werden typischerweise derart einer Zelle verabreicht oder in situ hergestellt, dass sie an zelluläre mRNA und/oder genomische CCSRP kodierende DNA hybridisieren oder binden, um so die Expression des Proteins zu hemmen, z.B. durch Hemmung der Transkription und/oder Translation. Die Hybridisierung kann durch übliche Nukleotidkomplementarität unter Ausbildung einer stabilen Duplex erfolgen oder beispielsweise für den Fall eines antisense-Nukleinsäuremoleküls, welches an DNA-Duplexe bindet, durch spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix. Das antisense-Molekül kann modifiziert werden, so dass es spezifisch an einen Rezeptor oder an ein Antigen, welche auf einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiert werden, bindet, z.B. durch Verknüpfung des antisense-Nukleinsäuremoleküls mit einem Peptid oder einem Antikörper, welche an einen Zelloberflächenrezeptor oder ein Antigen binden. Das antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch unter Verwendung der hierin beschriebenen Vektoren an Zellen abgegeben werden. Um ausreichende intrazelluläre Konzentrationen an antisense-Molekülen zu erhalten, sind Vektorkonstrukte bevorzugt, in welchen das antisense-Nukleinsäuremolekül unter der Kontrolle eines starken prokaryotischen, viralen oder eukaryotischen (einschließlich pflanzlichen) Promotors angeordnet ist.
In noch einer anderen Ausführungsform ist das antisense-Nukleinsäuremolekül ein α-anomeres Nukleinsäuremolekül. Ein α-anomeres Nukleinsäuremolekül bildet mit komplementärer RNA spezifische doppelsträngige Hybride, in welchen, im Gegensatz zu den gewöhnlichen β-Einheiten, die Stränge jeweils parallel zu einander verlaufen (Gaultier et al., 1987 Nucleic Acids. Res. 15: 6625–6641). Das antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inoue et al., 1987 Nucleic Acids Res. 15: 6131–6148) oder ein chimäres RNA-DNA-Analogon (Inoue et al., 1987 FEBS Lett. 215: 327–330) umfassen.
In noch einer anderen Ausführungsform ist die antisense-Nukleinsäure ein Ribozym. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonuklease-Aktivität, welche in der Lage sind, eine einzelsträngige Nukleinsäure, wie beispielsweise eine mRNA, gegenüber welcher sie eine komplementäre Region aufweisen, zu spalten. Daher können Ribozyme (z.B. Hammerhead-Ribozyme, beschrieben in Haselhoff und Gerlach, 1988 Nature 334: 585–591) verwendet werden, um CCSRP-mRNA-Transkripte katalytisch zu spalten, um so die Translation von CCSRP-mRNA zu hemmen. Ein Ribozym mit Spezifität für eine CCSRP-kodierende Nukleinsäure kann auf Basis der Nukleotidsequenz einer hierin offenbarten CCSRP-cDNA (d.h. SEQ ID NO: 4) oder auf Basis einer heterologen Sequenz, die gemäß den hierin gelehrten Verfahren zu isolieren ist, konzipiert werden. Beispielsweise kann ein Derivat von Tetrahymena L-19 IVS RNA konstruiert werden, in welchem die Nukleotidsequenz der aktiven Stelle komplementär zu der zu spaltenden Nukleotidsequenz in einer CCSRP-kodierenden mRNA ist. Siehe z.B. Cech et al. U.S.-Patent Nr. 4,987,071 und Cech et al., U.S.-Patent Nr. 5,116,742. Wahlweise kann CCSRP-mRNA verwendet werden, um eine katalytische RNA mit einer spezifischen Ribonuklease-Aktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen zu selektieren. Siehe z.B. Bartel, D. und Szostak, J. W., 1993 Science 261: 1411–1418.
Alternativ kann die CCSRP-Genexpression durch Zielstrukturnukleotidsequenzen, die zu der regulatorischen Region einer CCSRP-Nukleotidsequenz komplementär sind (z.B. ein CCSRP-Promotor und/oder Enhancer) gehemmt werden, um tripel-helikale Strukturen zu bilden, welche die Transkription eines CCSRP-Gens in Zielzellen verhindern. Siehe allgemein Helene, C., 1991 Anticancer Drug Des. 6(6): 569–84; Helene, C. et al., 1992 Ann. N.Y. Acad. Sci. 660: 27–36; und Maher, L. J., 1992 Bioassays 14(12): 807–15.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen CCSRP-Nukleinsäuren und -Proteinen können diese Nukleinsäuren und Proteine auch an einen Rest angebunden sein. Diese Reste umfassen, sind aber nicht beschränkt auf Detektionsreste, Hybridisierungsreste, Reinigungsreste, Abgabereste, Reaktionsreste, Bindereste und dergleichen. Eine typische Gruppe von Nukleinsäuren, die an einen Rest gebunden sind, sind Sonden und Primer. Sonden und Primer umfassen typischerweise ein im Wesentlichen isoliertes Oligonukleotid. Das Oligonukleotid umfasst typischerweise einen Abschnitt einer Nukleotidsequenz, der unter stringenten Bedingungen an wenigstens etwa 12, vorzugsweise etwa 25, stärker bevorzugt etwa 40, 50 oder 75 konsekutive Nukleotide eines Sense-Stranges der in SEQ ID NO: 4 gezeigten Sequenz, einer antisense-Sequenz der in SEQ ID NO: 4 gezeigten Sequenz, oder natürlich vorkommender Mutanten davon, hybridisiert. Primer, die auf Nukleotidsequenzen aus SEQ ID NO: 4 basieren, können in PCR-Reaktionen verwendet werden, um CCSRP-Homologe zu klonieren. Sonden, die auf CCSRP-Nukleotidsequenzen basieren, können verwendet werden, um Transkripte oder genomische Sequenzen, welche dasselbe oder homologe Proteine kodieren, zu detektieren. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst die Sonde ferner eine daran angefügte Markierungsgruppe, z.B. kann die Markierungsgruppe ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder ein Enzym-Co-Faktor sein. Solche Sonden können als ein Teil eines genomischen Testmarkerkits zur Identifizierung von CCSRP exprimierenden Zellen verwendet werden, wie beispielsweise durch Messung der Menge einer CCSRP-kodierenden Nukleinsäure in einer Zellprobe, z.B. durch Detektieren der CCSRP-mRNA-Menge oder durch Bestimmung, ob ein genomisches CCSRP-Gen mutiert oder deletiert wurde.
Ein besonders nützliches Verfahren um die Transkriptionsmenge des Gens (ein Indikator für die Menge an mRNA, die zur Translation zu dem Genprodukt zur Verfügung steht) festzustellen, besteht darin, einen Northern Blot durchzuführen (für Referenz siehe z.B. Ausubel et al., 1988 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York). Diese Information zeigt wenigstens teilweise den Transkriptionsgrad für das transformierte Gen. Gesamtzelluläre RNA kann aus Zellen, Geweben oder Organen durch mehrere Verfahren hergestellt werden, die im Fachbereich alle gut bekannt sind, wie zum Beispiel beschrieben in Bormann, E. R. et al., 1992 Mol. Microbiol. 6: 317-326. Um das Vorliegen oder die relative Menge von Protein, welches von dieser mRNA translatiert wird, zu bestimmen, können Standardtechniken wie zum Beispiel ein Western Blot verwendet werden. Diese Techniken sind einem Fachmann vertraut. (siehe z.B. Ausubel et al., 1988 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York).
Die Erfindung stellt ferner einen isolierten rekombinanten Expressionsvektor bereit, der eine CCSRP-kodierende Nukleinsäure, wie oben beschrieben, umfasst, worin die Expression des Vektors in einer Wirtszelle verglichen mit einer Wildtyp-Varietät der Wirtszelle zu einer gesteigerten Toleranz gegenüber Umweltstress führt. Wie hierin verwendet betrifft der Begriff „Vektor" ein Nukleinsäuremolekül, das in der Lage ist, eine andere Nukleinsäure, mit der es verknüpft wurde, zu transportieren. Eine Art von Vektoren ist ein „Plasmid", welches eine zirkuläre, doppelsträngige DNA-Schleife bezeichnet, in die zusätzliche DNA-Segmente ligiert werden können. Eine andere Art eines Vektors ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das virale Genom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren sind zur autonomen Replikation in einer Wirtszelle, in die sie eingebracht werden, in der Lage (z.B. bakterielle Vektoren mit einem bakteriellen Replikationsursprung und episomale Säugervektoren). Andere Vektoren (z.B. nicht-episomale Säugervektoren) werden nach Einführung in die Wirtszelle in das Genom der Wirtszelle integriert und werden so zusammen mit dem Wirtsgenom repliziert. Darüber hinaus sind bestimmte Vektoren in der Lage, die Expression von Genen, mit welchen sie operativ verknüpft sind, zu lenken. Solche Vektoren werden hierin als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Im Allgemeinen liegen Expressionsvektoren zur Verwendung bei rekombinanten DNA-Techniken oft in Form von Plasmiden vor. In der vorliegenden Beschreibung können "Plasmid" und "Vektor" untereinander austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Form eines Vektors darstellt. Jedoch soll die Erfindung auch andere Formen von Expressionsvektoren, wie z.B. virale Vektoren (z.B. replikationsdefekte Retroviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren) einschließen, welche den gleichen Funktionen dienen.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren umfassen eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer Form, die zur Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle geeignet ist, was bedeutet, dass die rekombinanten Expressionsvektoren eine oder mehrere regulatorische Sequenzen einschließen, ausgewählt auf Basis der zur Expression zu verwendenden Wirtszellen, welche operativ mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verknüpft sind. Innerhalb eines rekombinanten Expressionsvektors soll "operativ verknüpft" bedeuten, dass die Nukleotidsequenz von Interesse mit der/den regulatorischen Sequenz(en) in einer Weise verknüpft ist/sind, welche die Expression der Nukleotidsequenz erlaubt (z.B. in einem in vitro-Transkriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingefügt ist). Die Formulierung "regulatorische Sequenz" soll Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (z.B. Polyadenylierungssignale) einschließen. Solche regulatorischen Sequenzen werden beispielsweise in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) beschrieben oder siehe: Gruber und Crosby, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Hrsg. Glick und Thompson, Kapitel 7, 89–108, CRC Press, Boca Raton, Florida, einschließlich der Referenzen darin. Regulatorische Sequenzen schließen diejenigen ein, welche die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Typen von Wirtszellen lenken und diejenigen, welche die Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen oder unter bestimmten Bedingungen lenken. Ein Fachmann erkennt, dass die Konzeption des Expressionsvektors von solchen Faktoren wie der Wahl der zu transformierenden Wirtszelle, der Expressionsmenge des gewünschten Proteins etc. abhängig sein kann. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können in Wirtszellen eingeführt werden, um so Proteine oder Peptide einschließlich Fusionsproteine oder Peptide, herzustellen, die durch Nukleinsäuren wie sie hierin beschrieben sind kodiert werden (z.B. CCSRPs, Mutantenformen von CCSRPs, Fusionsproteine etc.).
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren können zur Expression von CCSRPs in prokaryotischen oder eukaryotischen Zellen konzipiert sein. Beispielsweise können CCSRP-Gene in bakteriellen Zellen wie beispielsweise C. glutamicum, Insektenzellen (unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren), Hefe oder anderen Pilzzellen (siehe Romanos, M. A. et al., 1992 Foreign gene expression in yeast: a review, Yeast 8: 423–488; van den Hondel, C. A. M. J. J. et al., 1991 Heterologous gene expression in filamentous fungi, in: More Gene Manipulations in Fungi, J. W. Bennet & L. L. Lasure, Hrsg., S. 396–428: Academic Press: San Diego; und van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J., 1991 Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J. F. et al., Hrsg., S. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge), Algen (Falciatore et al., 1999 Marine Biotechnology 1(3): 239–251), Ziliaten der Typen: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Pseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella, und Stylonychia, insbesondere der Gattung Stylonychia lemnae mit Vektoren folgend einem Transformationsverfahren wie in der PCT-Anmeldung WO 98/01572 beschrieben und multizellulären Pflanzenzellen (siehe Schmidt, R. und Willmitzer, L., 1988 High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants, Plant Cell Rep. 583–586); Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); F. F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. Kung und R. Wu, 128–43, Academic Press: 1993; Potrykus, 1991 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 42: 205–225 und die darin zitierten Referenzen) oder Säugerzellen exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden ferner in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press: San Diego, CA (1990) diskutiert. Wahlweise kann der rekombinante Expressionsvektor in vitro transkribiert und translatiert werden, z.B. unter Verwendung von T7-Promotor regulatorischen Sequenzen und T7-Polymerase.
Die Expression von Proteinen in Prokaryoten wird oft mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promotoren, welche entweder die Expression von Fusions- oder Nicht-Fusionsproteinen lenken, durchgeführt. Fusionsvektoren addieren eine Anzahl von Aminosäuren an ein darin kodiertes Protein, normalerweise an den Aminoterminus des rekombinanten Proteins, aber auch an den C-Terminus oder fusioniert innerhalb geeigneter Regionen in den Proteinen. Solche Fusionsvektoren erfüllen typischerweise drei Funktionen: 1) die Expression eines rekombinanten Proteins zu steigern; 2) die Löslichkeit eines rekombinanten Proteins zu steigern; und 3) die Reinigung eines rekombinanten Proteins zu unterstützen, indem sie als Ligand bei einer Affinitätsreinigung fungieren. In Fusionsexpressionsvektoren wird häufig eine proteolytische Schnittstelle an der Verbindung zwischen dem Fusionsrest und dem rekombinanten Protein eingefügt, um im Anschluß an die Reinigung des Fusionsproteins die Trennung des rekombinanten Proteins vom Fusionsrest zu ermöglichen. Solche Enzyme und ihre zugehörigen Erkennungssequenzen schließen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase ein.
Typische Fusionsexpressionsvektoren schließen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. und Johnson, K. S., 1988 Gene 67: 31–40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ) ein, welche Glutathion S-Transferase (GST), Maltose-E bindendes Protein bzw. Protein A an das rekombinante Zielprotein fusionieren. In einer Ausführungsform wird die kodierende Sequenz von CCSRP in einen pGEX-Expressionsvektor kloniert, um einen Vektor zu erzeugen, der ein Fusionsprotein kodiert, umfassend, vom N-Terminus zum C-Terminus: GST-Thrombin-Schnittstelle-X-Protein. Das Fusionsprotein kann durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von Glutathion-Agaroseharz aufgereinigt werden. Nicht mit GST fusioniertes rekombinantes CCSRP kann durch Abspalten des Fusionsproteins mit Thrombin wiedergewonnen werden.
Beispiele für geeignete induzierbare nicht-fusionierende E. coli Expressionsvektoren schließen pTrc (Amann et al., 1988 Gene 69: 301–315) und pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 60–89) ein. Die Zielgenexpression vom pTrc-Vektor stützt sich auf die Transkription eines Hybrid-trp-lac-Fusionspromotors durch die RNA-Polymerase des Wirts. Die Zielgenexpression vom pET 11d-Vektor stützt sich auf die Transkription eines T7 gn10-lac Fusionspromotors, wobei die Transkription durch eine co-exprimierte virale RNA-Polymerase (T7 gn1) vermittelt wird. Diese virale Polymerase wird durch die Wirtsstämme BL21(DE3) oder HMS174(DE3) von einem ansässigem λ-Prophagen, der ein T7 gn1-Gen unter der transkriptionellen Kontrolle des lacUV 5-Promotors trägt, zur Verfügung gestellt.
Eine Strategie zur Maximierung der Expression des rekombinanten Proteins ist es, das Protein in Wirtsbakterien in welchen die Fähigkeit zur proteolytischen Spaltung des rekombinanten Proteins abgeschwächt ist, zu exprimieren (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, Kalifornien (1990) 119–128). Eine andere Strategie ist es, die Nukleinsäuresequenz der in einen Expressionsvektor zu insertierenden Nukleinsäure so zu verändern, dass die einzelnen Codons für jede Aminosäure diejenigen sind, welche in dem Bakterium, das für die Expression ausgewählt wird, vorzugsweise verwendet werden, wie z.B. C. glutamicum (Wada et al., 1992 Nucleic Acid Res. 20: 2111–2118). Solche Veränderungen der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen können durch DNA-Standardsynthesetechniken ausgeführt werden.
In einer anderen Ausführungsform ist der CCSRP-Expressionsvektor ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele für Vektoren zur Expression in Hefe S. cerevisiae schließen pYepSec1 (Baldari et al., 1987 Embo J. 6: 229–234), pMFa (Kurjan und Herskowitz, 1982 Cell 30: 933–943), pJRY88 (Schultz et al., 1987 Gene 54: 113–123) und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA) ein. Vektoren und Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, welche zur Verwendung in anderen Pilzen, wie z.B. Fadenpilzen, geeignet sind, schließen die ein, die ausführlich beschrieben sind in: van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentous fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy et al., Hrsg., S. 1–28, Cambridge University Press: Cambridge.
Wahlweise können die erfindungsgemäßen CCSRPs in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren exprimiert werden. Baculovirus-Vektoren, welche zur Expression von Proteinen in kultivierten Insektenzellen (z.B. Sf 9 Zellen) erhältlich sind, schließen die pAc-Serien (Smith et al., 1983 Mol. Cell Biol. 3: 2156–2165) und die pVL-Serien (Lucklow und Summers, 1989 Virology 170: 31–39) ein.
In noch einer anderen Ausführungsform wird eine erfindungsgemäße CCSRP Nukleinsäure in Säugerzellen unter Verwendung eines Säuger-Expressionvektors exprimiert. Beispiele für Säuger-Expressionvektors schließen pCDM8 (Seed, B., 1987 Nature 329: 840) und pMT2PC (Kaufman et al., 1987 EMBO J. 6: 187–195) ein. Wenn sie in Säugerzellen verwendet werden, werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors häufig durch virale regulatorische Elemente bereitgestellt. Beispielsweise sind häufig verwendete Promotoren abgeleitet von Polyoma, Adenovirus 2, Zytomegalovirus und Simianvirus 40. Für weitere geeignete Expressionssysteme, sowohl für prokaryotische als auch eukaryotische Zellen, siehe Kapitel 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsh, E. F., und Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
In einer anderen Ausführungsform ist der rekombinante Säuger-Expressionsvektor in der Lage, die Expression der Nukleinsäure vorzugsweise in einem bestimmten Zelltyp zu lenken (z.B. werden gewebespezifische regulatorische Elemente verwendet, um die Nukleinsäure zu exprimieren). Gewebespezifische regulatorische Elemente sind im Fachbereich bekannt. Nicht-beschränkende Beispiele von geeigneten gewebespezifischen Promotoren schließen den Albuminpromotor (leberspezifisch; Pinkert et al., 1987 Genes Dev. 1: 268–277), lymphspezifische Promotoren (Calame und Eaton, 1988 Adv. Immunol. 43: 235–275), insbesondere Promotoren von T-Zell-Rezeptoren (Winoto und Baltimore, 1989 EMBO J. 8: 729–733) und Immunglobuline (Banerji et al., 1983 Cell 33: 729–740; Queen und Baltimore, 1983 Cell 33: 741–748), neuronspezifische Promotoren (z.B. der Neurofilament-Promotor; Byrne und Ruddle, 1989 PNAS 86: 5473–5477), Pankreas-spezifische Promotoren (Edlund et al., 1985 Science 230: 912–916) und Brustdrüsen-spezifische Promotoren (z.B. Milk Whey Promotor; US Patent Nr. 4,873,316 und Offenlegungsschrift der europäischen Patentanmeldung Nr. 264,166) ein. Entwicklungsspezifisch regulierte Promotoren werden ebenfalls umfasst, beispielsweise die murinen Hox-Promotoren (Kessel und Gruss, 1990 Science 249: 374–379) und der Fetoprotein-Promotor (Campes und Tilghman, 1989 Genes Dev. 3: 537–546).
In einer anderen Ausführungsform können die erfindungsgemäßen CCSRPs in einzelligen Pflanzenzellen (wie beispielsweise Algen) (siehe Falciatore et al., 1999 Marine Biotechnology 1(3): 239–251 und Referenzen darin) und Pflanzenzellen aus höheren Pflanzen (z.B. den Spermatophyten, wie beispielsweise Kulturpflanzen) exprimiert werden. Beispiele für Pflanzenexpressionsvektoren schließen diejenigen ein, die ausführlich beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. und Masterson, R., 1992 New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20: 1195–1197; und Bevan, M. W., 1984 Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12: 8711–8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38.
Eine Pflanzenexpressionskassette enthält vorzugsweise regulatorische Sequenzen, die zum Lenken der Genexpression in Pflanzenzellen fähig sind und die derart operativ verknüpft sind, dass jede Sequenz ihre Funktion erfüllen kann, wie beispielsweise die Termination der Transkription durch Polyadenylierungssignale. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind diejenigen, die aus Agrobacterium tumefaciens t-DNA stammen, wie beispielsweise das Gen 3, bekannt als Oktopinsynthase des Ti-Plasmids pTiACH5 (Gielen et al., 1984 EMBO J. 3: 835) oder funktionelle Äquivalente davon, aber sämtliche anderen in Pflanzen funktionell aktive Terminatoren sind ebenfalls geeignet.
Da die Genexpression in Pflanzen sehr oft nicht auf transkriptionelle Level beschränkt ist, enthält eine Pflanzenexpressionskassette vorzugsweise andere operativ verknüpfte Sequenzen wie zum Beispiel translationale Enhancer, beispielsweise die Overdrive-Sequenz, welche die 5'-untranslatierte Leadersequenz des Tabakmosaikvirus enthält und die das Verhältnis Protein pro RNA verbessert (Gallie et al., 1987 Nucl. Acids Research 15: 8693–8711).
Die Genexpression in Pflanzen muss operativ mit einem geeigneten Promotor verknüpft sein, welcher eine Genexpression in einer zeit-, zell- oder gewebespezifischen Weise überträgt. Bevorzugt sind Promotoren, welche die konstitutive Expression lenken (Benfey et al., 1989 EMBO J. 8: 2195–2202) wie diejenigen, die von Pflanzenviren wie beispielsweise dem 35S CAMV (Franck et al., 1980 Cell 21: 285–294), dem 19S CaMV (siehe auch US Patent Nr. 5,352,605 und WO 8402913) oder Pflanzenpromotoren wie denen aus der kleinen Rubisco-Untereinheit, die in US Patent Nr. 4,962,028 beschrieben ist, abgeleitet sind.
Andere bevorzugte Sequenzen zur Verwendung in Pflanzengenexpressionskassetten sind Zielsequenzen, welche nötig sind, um das Genprodukt in sein zugehöriges Zellkompartiment zu lenken (für eine Übersicht hierzu siehe Kermode, 1996 Crit. Rev. Plant Sci. 15(4): 285–423 und die darin zitierten Referenzen) wie beispielsweise die Vakuole, den Nukleus, alle Typen von Plastiden wie Amyloplasten, Chloroplasten, Chromoplasten, den extrazellulären Raum, Mitochondrien, das endoplasmatische Reticulum, Ölkörperchen, Peroxisome und andere Kompartimente von Pflanzenzellen.
Genexpression in Pflanzen kann auch durch einen induzierbaren Promotor ermöglicht werden (für eine Übersicht hierzu siehe Gatz, 1997 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89–108). Wenn die Genexpression in einer zeitspezifischen Weise erfolgen soll, sind insbesondere chemisch induzierbare Promotoren geeignet. Beispiele für solche Promotoren sind ein Salizylsäure-induzierbarer Promotor (PCT-Anmeldung Nr. WO 95/19443), ein Tetrazyklin-induzierbarer Promotor (Gatz et al., 1992 Plant J. 2: 397–404) und ein Ethanol-induzierbarer Promotor (PCT-Anmeldung Nr. WO 93/21334).
Ebenfalls geeignete Promotoren, die auf biotische oder abiotische Stressbedingungen antworten, sind solche wie beispielsweise der Pathogen-induzierbare PRP1-Gen Promotor (Ward et al., 1993 Plant. Mol. Biol. 22: 361–366), der Hitze-induzierbare hsp80-Promotor aus Tomate (US Patent Nr. 5,187,267), der Kälte-induzierbare Alpha-amylase Promotor aus Kartoffel (PCT-Anmeldung WO 96/12814) oder der Wunden-induzierbare pinII-Promotor (Europäisches Patent EP 375091 ). Für andere Beispiele von Trockenheits-, Kälte- und Salz-induzierbaren Promotoren, wie beispielsweise dem RD29A-Promotor, siehe Yamaguchi-Shinozalei et al. (1993 Mol. Gen. Genet. 236: 331– 340).
Insbesondere sind solche Promotoren bevorzugt, welche die Genexpression in spezifischen Geweben und Organen übertragen, wie beispielsweise Schließzellen und Haarwurzelzellen. Geeignete Promotoren schließen sowohl den Napin-Genpromotor aus Raps (US Patent Nr. 5,608,152), den USP-Promotor aus Vicia faba (Baeumlein et al., 1991 Mol Gen Genet. 225(3): 459–67), den Oleosin-Promotor aus Arabidopsis (PCT-Anmeldung WO 98/45461), den Phaseolinpromotor aus Phaseolus vulgaris (US Patent Nr. 5,504,200), den Bce4-Promotor aus Brassica (PCT-Anmeldung WO 91/13980) oder den Legumin B4-Promotor (LeB4; Baeumlein et al., 1992 Plant Journal, 2(2): 233–9) als auch Promotoren, die eine Saatgut-spezifische Expression in monokotylen Pflanzen wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis etc. verleihen, ein. Besonders zu erwähnende Promotoren sind der lpt2 oder der lpt1-Genpromotor aus Gerste (PCT-Anmeldung Nr. WO 95/15389 und PCT-Anmeldung Nr. WO 95/23230), oder die in PCT-Anmeldung Nr. WO 99/16890 beschriebenen (Promotoren aus dem Hordein-Gen aus Gerste, dem Glutelin-Gen aus Reis, dem Oryzin-Gen aus Reis, dem Prolamin-Gen aus Reis, dem Gliadin-Gen aus Weizen, dem Glutelin-Gen aus Weizen, dem Zein-Gen aus Mais, dem Glutelin-Gen aus Hafer, dem Kasirin-Gen aus Sorghum und Secalin-Gen aus Roggen).
Speziell geeignet sind auch Promotoren, die Plastid-spezifische Genexpression übertragen, da Plastiden das Kompartiment sind, in dem die Lipidbiosynthese erfolgt. Geeignete Promotoren sind der virale RNA-Polymerasepromotor, der in PCT-Anmeldung Nr. WO 95/16783 und PCT-Anmeldung Nr. WO 97/06250 beschrieben ist, und der in PCT-Anmeldung Nr. WO 99/46394 beschriebene clpP-Promotor aus Arabidopsis.
Eine weitere Ausführungsform ist ein rekombinanter Expressionsvektor, der ein erfindungsgemäßes CCSRP DNA-Molekül umfasst, welches in antisense-Orientierung in den Expressionsvektor einkloniert wurde. Das heißt, dass das DNA-Molekül in einer solchen Art operativ mit einer regulatorischen Sequenz verknüpft ist, dass eine Expression (durch Transkription des DNA-Moleküls) eines RNA-Moleküls, welches antisense zu einer CCSRP-mRNA vorliegt, möglich ist. Regulatorische Sequenzen, die operativ mit einem in Antisense-Orientierung klonierten Nukleinsäuremolekül verknüpft sind, können gewählt werden, wobei die regulatorischen Sequenzen die kontinuierliche Expression des antisense-RNA-Moleküls in einer Vielfalt von Zelltypen lenken. Beispielsweise können virale Promotoren und/oder Enhancer oder regulatorische Sequenzen gewählt werden, die eine konstitutive, gewebespezifische oder Zelltypspezifische Expression der antisense-RNA lenken. Der Antisense-Expressionsvektor kann in Form eines rekombinanten Plasmids, Phagemids oder abgeschwächten Virus vorliegen, worin Antisense-Nukleinsäuren unter der Kontrolle einer hocheffizienten regulatorischen Region erzeugt werden, wobei die Aktivität dieser durch den Zelltyp in welchen der Vektor eingeführt wird, bestimmt wird. Für eine Diskussion zur Regulation der Genexpression unter Verwendung von Antisense-Genen siehe Weintraub, H., et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews – Trends in Genetics, Band 1(1) 1986 und Mol et al., 1990 FEBS Letters 268: 427–430.
Ein anderer Aspekt der Erfindung betrifft Wirtszellen, in welche ein erfindungsgemäßer rekombinanter Expressionsvektor eingeführt wurde. Die Begriffe „Wirtszelle" und „rekombinante Wirtszelle" werden hierin untereinander austauschbar verwendet. Es ist selbstverständlich, dass die Begriffe nicht nur den besonderen Gegenstand Zelle betreffen, sondern auch die Nachkommenschaft oder die mögliche Nachkommenschaft einer solchen Zelle betreffen. Da in nachfolgenden Generationen bestimmte Modifizierungen entweder aufgrund von Mutation oder Umwelteinflüssen auftreten können, kann eine derartige Nachkommenschaft in der Tat nicht identisch zur Elternzelle sein, sie ist aber immer noch vom Geltungsbereich des Begriffs, wie er hierin verwendet wird, eingeschlossen.
Eine Wirtszelle kann jede beliebige prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein. Beispielsweise kann ein CCSRP in bakteriellen Zellen wie beispielsweise C. glutamicum, Insektenzellen, Pilzzellen oder Säugerzellen (wie beispielsweise Eierstockzellen des chinesischen Hamsters (CHO) oder COS-Zellen), Algen, Ziliaten, Pflanzenzellen, Pilzen oder anderen Mikroorganismen wie C. glutamicum exprimiert werden. Weitere geeignete Wirtszellen sind dem Fachmann bekannt.
Vektor-DNA kann in prokaryotische oder eukaryotische Zellen mittels herkömmlicher Transformations- oder Transfektionstechniken eingeführt werden. Wie hierin verwendet, sollen die Ausdrücke „Transformation", „Transfektion", „Konjugation" und „Transduktion" eine Vielfalt von fachbekannten Techniken zur Einführung fremder Nukleinsäure (z.B. DNA) in eine Wirtszelle betreffen, einschließlich Calziumphosphat- oder Calziumchlorid-Copräzipitation, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion, natürliche Kompetenz, chemisch vermittelter Transfer und Elektroporation. Geeignete Verfahren zur Transformierung oder Transfektion von Wirtszellen einschließlich Pflanzenzellen können Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Zweite Ausgabe, Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) und anderen Laborhandbüchern, wie beispielsweise Methods in Molecular Biology, 1995, Band 44, Agrobacterium protocols, Hrsg. Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey, entnommen werden. Da biotische oder abiotische Stresstoleranz ein allgemeines Merkmal ist, welches wunschgemäß einer weiten Bandbreite von Pflanzen wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Raps und Canola, Maniok, Pfeffer, Sonnenblume und Tagetes, Nachtschattengewächsen wie Kartoffel, Tabak, Aubergine, Tomate, Vicia-Spezies, Erbse, Alfalfa, Buschgewächsen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Spezies, Bäumen (Ölpalme, Kokosnuss), perennierendem Gras und Futterplanzen verliehen wird, sind diese Nutzpflanzen auch bevorzugte Zielpflanzen zur Genmanipulation als weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
Die Erfindung stellt insbesondere ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit einer CCSRP-kodierenden Nukleinsäure bereit, worin die Expression der Nukleinsäure(n) in der Pflanze zu einer gesteigerten Toleranz gegenüber Umweltstress im Vergleich mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanze führt, umfassend: (a) Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor umfassend eine CCSRP-Nukleinsäure und (b) Erzeugen einer transgenen Pflanze mit einer gesteigerten Toleranz gegenüber Umweltstress im Vergleich mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanze aus einer Pflanzenzelle. Es kann auch ein Verfahren zur Steigerung der Expression eines Gens von Interesse in einer Wirtszelle im Vergleich zu einer Wildtyp-Varietät der Wirtszelle bereitgestellt werden, worin das Gen von Interesse in Antwort auf ein CCSRP transkribiert wird, umfassend (a) Transformieren der Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, umfassend eine CCSRP-kodierende Nukleinsäure und (b) Expression des CCSRPs innerhalb der Wirtszelle, wobei so die Expression des in Antwort auf das CCSRP transkribierten Gens im Vergleich mit einer Wildtyp-Varietät der Wirtszelle gesteigert wird.
Für eine solche Pflanzentransformation können binäre Vektoren, wie beispielsweise pBinAR verwendet werden (Höfgen und Willmitzer, 1990 Plant Science 66: 221–230). Die Konstruktion der binären Vektoren kann durch Ligation der cDNA in sense- oder antisense-Orientierung in die T-DNA durchgeführt werden. Ein Pflanzenpromotor am 5'-Ende der cDNA aktiviert die Transkription der cDNA. Eine Polyadenylierungssequenz befindet sich am 3'-Ende der cDNA. Gewebespezifische Expression kann durch Verwendung eines gewebespezifischen Promotors erreicht werden. Beispielsweise kann eine keimspezifische Expression durch Klonierung des Napin- oder des LeB4- oder des USP-Promotors am 5'-Ende der cDNA erreicht werden. Ferner kann jedes andere keimspezifische Promotorelement verwendet werden. Für eine konstitutive Expression innerhalb der gesamten Pflanze kann der CaMV 35S-Promotor verwendet werden. Unter Verwendung eines Signalpeptids, beispielsweise für Plastiden, Mitochondrien oder das endoplasmatische Reticulum, kann das exprimierte Protein auf ein zelluläres Kompartiment ausgerichtet werden (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci., 1996 4(15): 285–423). Um eine subzelluläre Lokalisierung des Fusionsproteins zu erreichen, wird das Signalpeptid im Leseraster am 5'-Ende der cDNA kloniert. Zusätzlich können Promotoren, die responsiv sind für abiotischen Stress, wie beispielsweise der Arabidopsis Promotor RD29A, mit den hierin offenbarten Nukleinsäuresequenzen verwendet werden. Ein Fachmann wird erkennen, dass der verwendete Promotor mit der Nukleinsäure operativ verknüpft sein sollte, sodass der Promotor die Transkription der Nukleinsäure hervorruft, was zu der Synthese einer mRNA führt, die ein Polypeptid kodiert. Alternativ kann die RNA eine antisense-RNA sein, für die Verwendung für die Beeinflussung der anschließenden Expression desselben oder eines anderen Gens oder derselben oder anderer Gene.
Verschiedene Verfahren zur Transfektion beinhalten die direkte Übertragung von DNA in entwickelnde Blüten über Elektroporation oder Agrobacterium-vermittelten Gentransfer. Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann beispielsweise unter Verwendung des GV3101(pMP90) (Koncz und Schell, 1986 Mol. Gen. Genet. 204: 383–396) oder des LBA4404 (Clontech) Agrobacterium tumefaciens-Stamms durchgeführt werden. Die Transformation kann durch Standard-Transformations- und Regenerierungstechniken durchgeführt werden (Deblaere et al., 1994 Nucl. Acids. Res. 13: 4777–4788; Gelvin, Stanton B. und Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2. Ausg. – Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. – in Sect., Rinbuc Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R.; Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton: CRC Press, 1993 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Beispielsweise kann Raps durch Kotyledon- oder Hypokotyl-Transformation transformiert werden (Moloney et al., 1989 Plant cell Report 8: 238–242; De Block et al., 1989 Plant Physiol. 91: 694–701). Die Verwendung von Antibiotika zur Agrobacterium- und Pflanzenselektion ist vom zur Transformation verwendeten binären Vektor und dem Agrobacterium-Stamm abhängig. Die Selektion von Raps wird üblicherweise unter Verwendung von Kanamyzin als wählbarem Pflanzenmarker durchgeführt. Agrobacterium-vermittelter Gentransfer zu Flachs kann beispielsweise unter Verwendung einer Technik, welche durch Mlynarova et al., 1994 Plant Cell Report 13: 282–285, beschrieben wurde, durchgeführt werden. Zusätzlich kann eine Transformation von Sojabohne beispielsweise unter Verwendung einer in dem Europäischen Patent EP 0 424 047 , US-Patent Nr. 5,322,783, in dem Europäischen Patent EP 0 397 687 , US-Patent Nr. 5,376,543 oder US-Patent Nr. 5,169,770 beschriebenen Technik durchgeführt werden. Eine Transformation von Mais kann unter Verwendung von Partikelbeschuss, Polyethylenglycol-vermittelter DNA-Aufnahme oder durch die Siliziumcarbidfaser-Technik erzielt werden (siehe beispielsweise Freeling und Walbot „The maize handbook" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Ein spezifisches Beispiel zur Transformation von Mais findet sich in US 5,990,387 und ein spezifisches Beispiel zur Transformation von Weizen findet sich in der PCT-Anmeldung WO 93/07256.
Von der stabilen Transfektion von Säugerzellen ist bekannt, dass, abhängig vom verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik nur ein kleiner Teil der Zellen die Fremd-DNA in ihr Genom integrieren kann. Um diese Integranten zu identifizieren und selektieren, wird normalerweise ein Gen, welches einen selektierbaren Marker (z.B. Resistenz gegenüber Antibiotika) kodiert, zusammen mit dem Gen von Interesse in die Wirtszelle eingeführt. Bevorzugte selektierbare Marker schließen diejenigen ein, welche eine Resistenz gegenüber Wirkstoffen, wie beispielsweise G418, Hygromyzin und Methotrexat, verleihen oder in Pflanzen eine Resistenz gegenüber einem Herbizid, wie beispielsweise Glyphosphat oder Glufosinat, verleihen. Nukleinsäuremoleküle, die einen selektierbaren Marker kodieren, können auf dem gleichen Vektor, der ein CCSRP kodiert, in eine Wirtszelle eingeführt werden oder sie können auf einem getrennten Vektor eingeführt werden. Mit dem eingeführten Nukleinsäuremolekül stabil transfizierte Zellen können beispielsweise durch Wirkstoffselektion identifiziert werden (z.B. Zellen, die das selektierbare Markergen aufgenommen haben, überleben, während die anderen Zellen absterben).
Um einen homologen rekombinanten Mikroorganismus zu erzeugen, wird ein Vektor hergestellt, der wenigstens einen Teil eines CCSRP-Gens enthält, in welches eine Deletion, Addition oder Substitution eingeführt wurde, um so das CCSRP-Gen zu verändern, z.B. funktionell zu stören. Vorzugsweise ist das CCSRP-Gen ein Physcomitrella patens CCSRP-Gen, aber es kann ein Homologon aus einer verwandten Pflanze oder sogar aus einer Säuger-, Hefe- oder Insektenquelle sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor so gestaltet, dass nach homologer Rekombination das endogene CCSRP-Gen funktionell gestört ist (d.h. nicht länger ein funktionelles Protein kodiert; auch als Knock-out-Vektor bezeichnet). Wahlweise kann der Vektor so gestaltet sein, dass das endogene CCSRP-Gen nach homologer Rekombination mutiert ist oder auf eine andere Weise verändert ist, aber noch immer ein funktionelles Protein kodiert (z.B. kann die stromaufwärts regulatorische Region verändert sein, um so die Expression des endogenen CCSRP zu verändern). Zur Erzeugung einer Punktmutation durch homologe Rekombination können DNA-RNA-Hybride in einer Technik, welche als Chimeraplastie (chimeraplasty) bekannt ist, verwendet werden (Cole-Strauss et al., 1999 Nucleic Acids Research 27(5): 1323–1330 und Kmiec, 1999 Gene therapy American Scientist. 87(3): 240–247). Homologe Rekombinationsverfahren in Physcomitrella patens sind im Fachbereich ebenfalls bekannt und zur Verwendung hierin vorgesehen.
Im homologen Rekombinationsvektor ist der veränderte Abschnitt des CCSRP-Gens an seinen 5'- und 3'-Enden durch ein zusätzliches Nukleinsäuremolekül des CCSRP-Gens flankiert, um eine homologe Rekombination zwischen dem exogenen CCSRP-Gen, welches vom Vektor getragen wird, und einem endogenen CCSRP-Gen in einem Mikroorganismus oder einer Pflanze zu ermöglichen. Das zusätzliche flankierende CCSRP-Nukleinsäuremolekül ist von ausreichender Länge für eine erfolgreiche homologe Rekombination mit dem endogenen Gen. Typischerweise werden einige hundert Basenpaare bis hin zu Kilobasen flankierender DNA (sowohl an den 5'- als auch den 3'-Enden) in den Vektor eingeschlossen (siehe z.B. Thomas, K. R. und Capecchi, M. R., 1987 Cell 51: 503 für eine Beschreibung homologer rekombinanter Vektoren oder Strepp et al., 1998 PNAS, 95 (8): 4368–4373 zur Rekombination in Physcomitrella patens auf Basis von cDNA). Der Vektor wird in einen Mikroorganismus oder eine Pflanzenzelle eingeführt (z.B. über Polyethylenglykol-vermittelte DNA) und die Zellen, in welchen das eingeführte CCSRP-Gen mit dem endogenen CCSRP-Gen homolog rekombiniert wurde, werden unter Verwendung von Techniken, welche im Fachbereich bekannt sind, selektiert.
In einer anderen Ausführungsform können rekombinante Mikroorganismen, welche ausgewählte Systeme, die eine regulierte Expression des eingeführten Gens erlauben, enthalten, hergestellt werden. Beispielsweise erlaubt die Inklusion eines CCSRP-Gens auf einem Vektor, welches unter Kontrolle des Lac-Operons steht, die Expression des CCSRP-Gens ausschließlich in der Gegenwart von IPTG. Solche regulatorischen Systeme sind im Fachbereich gut bekannt.
Eine erfindungsgemäße Wirtszelle, wie beispielsweise eine prokaryotische oder eukaryotische Wirtszelle in Kultur, kann verwendet werden, um ein CCSRP herzustellen (d.h. zu exprimieren). In einer Ausführungsform umfasst das Verfahren die Kultivierung der erfindungsgemäßen Wirtszellen (in welche ein rekombinanter Expressionsvektor, welcher ein CCSRP kodiert, eingeführt wurde oder in deren Genom ein Gen, welches einen Wildtyp oder ein verändertes CCSRP kodiert, eingeführt wurde) in einem geeigneten Medium, bis CCSRP hergestellt wird. In einer anderen Ausführungsform umfasst das Verfahren ferner die Isolierung von CCSRPs aus dem Medium oder der Wirtszelle.
Eine andere Ausführungsform betrifft isolierte CCSRPs und biologisch aktive Abschnitte davon. Ein „isoliertes" oder „gereinigtes" Protein oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon ist frei von einem Teil zellulären Materials, falls es durch rekombinante DNA-Techniken hergestellt wurde oder frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien, falls es chemisch synthetisiert wurde. Die Formulierung „im Wesentlichen frei von zellulärem Material" umfasst CCSRP-Präparationen in welchen das Protein von irgendeiner der zellulären Komponenten der Zelle, in welchen es natürlich vorkommt oder rekombinant hergestellt wurde, abgetrennt wurde. In einer Ausführungsform umfasst die Formulierung „im Wesentlichen frei von zellulärem Material" CCSRP-Präparationen mit weniger als etwa 30% (in Bezug auf Trockengewicht) nicht-CCSRP (hierin auch als ein „kontaminierendes Protein" bezeichnet), stärker bevorzugt weniger als etwa 20% nicht-CCSRP Material, stärker bevorzugt weniger als etwa 10% nicht-CCSRP Material und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 5% nicht-CCSRP Material.
Wenn das CCSRP oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon rekombinant hergestellt wurde, ist es auch bevorzugt frei von Kulturmedium, d.h. Kulturmedium stellt weniger als etwa 20%, stärker bevorzugt weniger als etwa 10% und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 5% des Volumens der Proteinpräparation dar. Die Formulierung „im Wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien" umfasst CCSRP-Präparationen, in welchen das Protein von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien, die an der Synthese des Proteins beteiligt sind, abgetrennt wurde. In einer Ausführungsform umfasst die Formulierung „im Wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien" CCSRP-Präparationen mit weniger als etwa 30% (im Bezug auf Trockengewicht) von chemischen Vorstufen oder nicht-CCSRP-Chemikalien, stärker bevorzugt weniger als etwa 20% chemischer Vorstufen oder nicht-CCSRP-Chemikalien, nochmals stärker bevorzugt weniger als etwa 10% chemischer Vorstufen oder nicht-CCSRP-Chemikalien und am stärksten bevorzugt weniger als etwa 5% chemischer Vorstufen oder nicht-CCSRP-Chemikalien. In bevorzugten Ausführungsformen weisen isolierte Proteine oder biologisch aktive Teile davon keine verunreinigenden Proteine aus dem selben Organismus, aus welchem das CCSRP abgeleitet ist, auf. Typischerweise werden solche Proteine durch rekombinante Expression beispielsweise eines Physcomitrella patens CCSRP in anderen Pflanzen als Physcomitrella patens oder Mikroorganismen, wie beispielsweise C. glutamicum, Ziliaten, Algen oder Pilzen, hergestellt.
Die hierin beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, Proteine, Proteinhomologe, Fusionsproteine, Primer, Vektoren und Wirtszellen können in einer oder mehreren der folgenden Methoden verwendet werden: Identifizierung von Physcomitrella patens und verwandten Organismen; Kartierung des Genoms von mit Physcomitrella patens verwandten Organismen; Identifizierung und Lokalisierung von Physcomitrella patens-Sequenzen, welche von Interesse sind; evolutive Studien; Bestimmung von CCSRP-Regionen, welche für die Funktion benötigt werden; Modulation einer CCSRP-Aktivität; Modulation des Metabolismus einer oder mehrerer Zellfunktionen; Modulation des Transmembrantransports einer oder mehrerer Verbindungen; und Modulation der Stresswiderstandfähigkeit.
Das Moos Physcomitrella patens repräsentiert ein Mitglied der Moose. Es ist zu anderen Moosen, wie beispielsweise Ceratodon purpureus verwandt, welches bei Abwesenheit von Licht wachstumsfähig ist. Moose wie Ceratodon und Physcomitrella teilen einen hohen Grad an Homologie im Bezug auf die DNA-Sequenz und die Polypeptidebene, was die Anwendung einer heterologen Durchmusterung von DNA-Molekülen mit Sonden, welche von anderen Moosen oder Organismen abstammen, ermöglicht und so die Ableitung einer Konsensus-Sequenz ermöglicht, welche zum heterologen Durchmustern oder funktionellen Annotieren oder Vorhersagen von Genfunktionen in einer dritten Spezies geeignet ist. Die Fähigkeit zur Identifizierung solcher Funktionen kann daher signifikante Bedeutung haben, z.B. die Vorhersage der Substratspezifität von Enzymen. Ferner können diese Nukleinsäuremoleküle als Referenzpunkte beim Kartieren von Moosgenomen oder Genomen verwandter Organismen dienen.
Die erfindungsgemäßen CCSRP-Nukleinsäuremoleküle weisen eine Vielfalt an Verwendungen auf. Am wichtigsten ist es, dass die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen verwendet werden können, um Pflanzen zu transformieren und so Toleranz gegenüber Stress wie beispielsweise Trockenheit, hohem Salzgehalt und Kälte zu induzieren. Die vorliegende Erfindung stellt deshalb eine transgene Pflanze, welche durch eine CCSRP-kodierende Nukleinsäure transformiert ist, bereit, worin die Expression der Nukleinsäuresequenz in der Pflanze zu einer gesteigerten Toleranz gegenüber Umweltstress im Vergleich mit einer Wildtyp-Varietät der Pflanze führt. Die transgene Pflanze kann monokotyl oder dikotyl sein. Die Erfindung ermöglicht ferner, dass die transgene Pflanze beispielsweise ausgewählt werden kann aus Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Raps, Canola, Manjok, Pfeffer, Sonnenblume, Tagetes, Nachtschattengewächsen, Kartoffel, Tabak, Aubergine, Tomate, Vicia-Spezies, Erbse, Alfalfa, Kaffee, Kakao, Tee, Salix-Spezies, Ölpalme, Kokosnuss, perennierendem Gras und Futterpflanzen.
Die vorliegende Erfindung beschreibt insbesondere die Verwendung der Expression von CC-1 aus Physcomitrella patens um Trockenheits-tolerante und/oder kältetolerante Pflanzen zu erstellen. Die Strategie wurde hierin für Arabidopsis thaliana, Raps/Canola, Sojabohnen, Mais und Weizen gezeigt, aber ihre Anwendung ist nicht auf diese Pflanzen beschränkt. Entsprechend stellt die Erfindung eine transgene Pflanze bereit, die ein CCSRP ausgewählt aus CC-1 (SEQ ID NO: 7) enthält, wobei der Umweltstress Trockenheit oder verringerte Temperatur ist.
Die Erfindung stellt auch Verfahren zur Modifizierung der Stresstoleranz einer Pflanze bereit, umfassend Modifizieren der Expression von CC-1 in der Pflanze. Die Erfindung sieht vor, dass dieses Verfahren so durchgeführt werden kann, dass die Stresstoleranz gesteigert wird.
Die Verfahren zur Erhöhung der Expression von CCSRPs können verwendet werden, wenn die Pflanze entweder transgen oder nicht transgen ist. In Fällen, in welchen die Pflanze transgen ist, kann die Pflanze mit einem Vektor, welcher eine beliebige der oben beschriebenen CCSRP-kodierenden Nukleinsäuren enthält, transformiert werden, oder die Pflanze kann beispielsweise mit einem Promotor, der die Expression von nativem CCSRP in der Pflanze lenkt, transformiert werden. Die Erfindung stellt ferner bereit, dass ein derartiger Promotor gewebespezifisch sein kann. Ferner kann ein solcher Promotor entwicklungsabhängig reguliert sein. Alternativ kann bei nicht-transgene Pflanze eine native CCSRP-Expression durch Induktion eines nativen Promotors modifiziert sein.
Die Expression von CC-1 (SEQ ID NO: 7) in Zielpflanzen kann durch eines der folgenden Beispiele erreicht werden, ist aber nicht darauf beschränkt: (a) konstitutiver Promotor, (b) Stress-induzierbarer Promotor, (c) chemisch-induzierter Promotor und (d) konstruierte Promotorüberexpression mit beispielsweise Zinkfinger-abgeleiteten Transkriptionsfaktoren (Greisman und Pabo, 1997 Science 275: 657). Der letztere Fall schließt sowohl die Identifizierung von CC-1-(SEQ ID NO: 7) Homologen in der Zielpflanze als auch von seinem Promotor ein. Zinkfinger-enthaltende rekombinante Transkriptionsfaktoren werden konstruiert, um spezifisch mit dem CC-1-(SEQ ID NO: 7) Homologon zu wechselwirken und die Transkription des entsprechenden Gens wird aktiviert.
Zusätzlich zur Einführung der CCSRP-Nukleinsäuresequenzen in transgene Pflanzen, können diese Sequenzen auch verwendet werden, um einen Organismus als Physcomitrella patens oder einen nahen Verwandten davon zu identifizieren. Sie können auch verwendet werden, um das Vorliegen von Physcomitrella patens oder einem Verwandten davon in einer gemischten Population von Mikroorganismen zu identifizieren. Die Nukleinsäuresequenzen einer Anzahl von Physcomitrella patens-Genen werden bereitgestellt; durch Untersuchen der extrahierten genomischen DNA einer Kultur einer eindeutigen oder gemischten Population von Mikroorganismen unter stringenten Bedingungen mit einer Sonde, welche einen auf diesen Organismus beschränkten Bereich eines Physcomitrella patens-Gens umfasst, kann man feststellen, ob dieser Organismus vorliegt.
Ferner können die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle als Marker für spezifische Regionen des Genoms dienen. Dies ist nicht nur beim Kartieren des Genoms nützlich, sondern auch bei funktionellen Studien von Physcomitrella patens-Proteinen. Um den Abschnitt des Genoms zu identifizieren, an welchen ein bestimmtes Physcomitrella patens-DNA-bindendes Protein bindet, könnte beispielsweise das Physcomitrella patens-Genom verdaut und die Fragmente mit dem DNA-bindenden Protein inkubiert werden. Diejenigen Fragmente, welche Protein binden, könnten zusätzlich mit erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen untersucht werden, vorzugsweise mit einfach zu detektierenden Labels. Das Binden eines solchen Nukleinsäuremoleküls an das Genomfragment ermöglicht die Lokalisierung des Fragments in der Genomkarte von Physcomitrella patens und wenn das Verfahren mehrfach mit verschiedenen Enzymen durchgeführt wurde, ermöglicht es die schnelle Bestimmung der Nukleinsäuresequenz, an welche das Protein bindet. Ferner können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle so ausreichend homolog zu Sequenzen verwandter Spezies sein, dass diese Nukleinsäuremoleküle als Marker zur Konstruktion einer Genomkarte in verwandten Moosen dienen können.
Die erfindungsgemäßen CCSRP CC-1 Nukleinsäuremoleküle sind auch für evolutive und Proteinstruktur-Untersuchungen nützlich. Die metabolischen Prozesse und Transportprozesse, an welchen die erfindungsgemäßen Moleküle partizipieren, werden von einer breiten Vielfalt prokaryotischer und eukaryotischer Zellen benutzt. Durch den Vergleich der erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle mit solchen, die ähnliche Enzyme aus anderen Organismen kodieren, kann die evolutive Beziehung der Organismen beurteilt werden. In ähnlicher Weise erlaubt ein derartiger Vergleich eine Bewertung, welche Sequenzregionen konserviert sind und welche nicht, wobei dies bei der Bestimmung solcher Proteinregionen hilfreich sein kann, die für das Funktionieren des Enzyms essentiell sind. Diese Art der Bestimmung ist von Bedeutung für Studien zur Proteinkonstruktion und kann einen Hinweis darauf geben, was das Protein im Hinblick auf Mutagenese ohne Verlust seiner Aktivität tolerieren kann.
Die Manipulation von erfindungsgemäßen CCSRP-Nukleinsäuremolekülen kann zur Erzeugung von CCSRPs mit funktionellen Unterschieden zu Wildtyp-CCSRPs führen. Die Proteine können in ihrer Effizienz oder Aktivität verbessert sein, können in größerer Anzahl als gewöhnlich in der Zelle vorliegen oder können in ihrer Effizienz oder Aktivität vermindert sein.
Es gibt eine Vielzahl von Mechanismen, durch welche die Veränderung eines erfindungsgemäßen CCSRPs eine Stressantwort und/oder Stresstoleranz direkt beeinflussen kann. Für den Fall, dass Pflanzen CCSRPs exprimieren, kann ein gesteigerter Transport zu einer verbesserten Salzverteilung und/oder Verteilung gelöster Stoffe innerhalb des Pflanzengewebes und der Organe führen. Sowohl durch eine Steigerung der Zahl als auch der Aktivität der Transportermoleküle, welche ionische Moleküle aus der Zelle exportieren, kann es möglich sein, die Salztoleranz der Zelle zu beeinflussen.
Der Einfluss einer genetischen Modifizierung in Pflanzen, C. glutamicum, Pilzen, Algen oder Ziliaten auf Stresstoleranz kann durch Aufzucht des modifizierten Mikroorganismus oder der modifizierten Pflanze unter Bedingungen, die schlechter als geeignete Bedingungen sind, und anschließende Analyse der Wachstumscharakteristika und/oder des Metabolismus der Pflanze bewertet werden. Solche Analysetechniken sind dem Fachmann gut bekannt und schließen Trockengewicht, Nassgewicht, Proteinsynthese, Kohlenhydratsynthese, Lipidsynthese, Evapotranspirationsgeschwindigkeiten, allgemeiner Pflanzen- und/oder Ernteertrag, Blüte, Reproduktion, Samenbeladung, Wurzelwachstum, Atmungsraten, Photosyntheseraten etc. ein (Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biologym, Band 17; Rehm et al., 1993 Biotechnology, Band 3, Kapitel III: Product recovery and purification, Seiten 469–714, VHC: Weinheim; Belter, P. A. et al., 1988 Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley and Sons; Kennedy, J. F. und Cabral, J. M. S., 1992 Recovery processes for biological materials, John Wiley and Sons; Shaeiwitz, J. A. und Henry, J. D., 1988 Biochemical separations, in: Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Band B3, Kapitel 11, Seiten 1–27, VCH: Weinheim; und Dechow, F. J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
Beispielsweise können Hefeexpressionsvektoren konstruiert werden, die die hierin offenbarten Nukleinsäuren oder Fragmente davon umfassen, und unter Verwendung von Standardprotokollen in Saccharomyces cerevisiae transformiert werden. Die resultierenden transgenen Zellen können dann auf ein Ausbleiben oder eine Veränderung ihrer Toleranz gegenüber Trockenheit, Salz und Temperaturstress untersucht werden. In gleicher Weise können Pflanzenexpressionsvektoren konstruiert werden, die die hierin offenbarten Nukleinsäuren oder Fragmente davon umfassen, und in eine geeignete Pflanzenzelle, wie z.B. Arabidopsis, Soja, Raps, Mais, Weizen, Medicago truncatula etc. unter Verwendung von Standardprotokollen transformiert werden. Die sich daraus ergebenden transgenen Zellen und/oder daraus abgeleiteten Pflanzen können dann auf ein Ausbleiben oder eine Veränderung ihrer Toleranz gegenüber Trockenheit, Salz und Temperaturstress untersucht werden.
Die Konstruktion von einem oder mehreren erfindungsgemäßen CCSRP-Genen kann auch zu CCSRPs mit veränderten Aktivitäten führen, welche indirekt auf die Stressantwort und/oder Stresstoleranz von Algen, Pflanzen, Ziliaten oder Pilzen oder anderen Mikroorganismen wie C. glutamicum einwirken. Beispielsweise führen die normalen biochemischen Prozesse des Metabolismus zur Erzeugung einer Vielzahl von Produkten (z.B. Wasserstoffperoxid und andere reaktive Sauerstoffspezies), die aktiv in den selben metabolischen Prozessen wechselwirken können (beispielsweise ist Peroxynitrit dafür bekannt, Tyrosinseitenketten zu nitrieren, wobei solche Enzyme mit Tyrosin im aktiven Zentrum inaktiviert werden) (Groves, J. T., 1999 Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2): 226–235). Während diese Produkte typischerweise ausgeschieden werden, können Zellen genetisch verändert werden, um mehr Produkte als für eine Wildtypzelle typisch, zu transportieren. Durch Optimierung der Aktivität eines oder mehrerer erfindungsgemäßer CCSRPs, die in den Export spezifischer Moleküle involviert sind, wie beispielsweise Salzmoleküle, kann es möglich sein, die Stresstoleranz der Zelle zu verbessern.
Zusätzlich können die hierin offenbarten Sequenzen oder Fragmente davon verwendet werden, um Knock-Out-Mutationen in Genomen verschiedenartiger Organismen zu erzeugen, wie beispielsweise Bakterien, Säugerzellen, Hefezellen und Pflanzenzellen (Girke, T., 1998 The Plant Journal 15: 39–48). Die sich ergebenden Knock-Out-Zellen können dann nach ihrer Fähigkeit oder ihrer Kapazität verschiedene Stressbedingungen zu tolerieren, nach ihrer Antwort auf verschiedene Stressbedingungen und den Effekt auf den Phänotyp oder Genotyp der Mutation bewertet werden. Für andere Verfahren zur Gen-Inaktivierung siehe US-Patent Nr. 6,004,804 "Non-Chimeric Mutational Vectors" und Puttaraju et al., 1999 Spliceosomemediated RNA trans-splicing as a tool for gene therapy Nature Biotechnology 17: 246–252.
Die oben genannten Mutagenesestrategien für CCSRPs zum Erlangen einer gesteigerten Stressresistenz, sind nicht beschränkend zu verstehen; Veränderungen dieser Strategien sind für den Fachmann leicht erkennbar. Unter Verwendung solcher Strategien und unter Berücksichtigung der hierin offenbarten Mechanismen können die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren und Proteinmoleküle verwendet werden, um Algen, Ziliaten, Pflanzen, Pilze oder andere Mikroorganismen wie C. glutamicum zu erzeugen, welche mutierte CCSRP-Nukleinsäuren und Proteinmoleküle exprimieren, so dass die Stresstoleranz verbessert ist.
Antikörper können bereitgestellt werden, welche spezifisch an ein CCSRP oder einen Abschnitt davon, wie es/er durch eine hierin offenbarte Nukleinsäure kodiert wird, binden. Antikörper können durch viele bekannte Verfahren hergestellt werden (siehe z.B. Harlow und Lane, "Antibodies; A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1988)): Gereinigtes Antigen kann in ein Tier in einer Menge und in Abständen, die ausreichend sind, eine Immunantwort auszulösen, injiziert werden. Die Antikörper können entweder direkt gereinigt werden oder es können Milzzellen des Tiers erhalten werden. Die Zellen können dann mit einer unsterblichen Zelllinie fusioniert und nach einer Antikörpersekretion durchmustert werden. Die Antikörper können verwendet werden, um Nukleinsäure-Klonbibliotheken nach Zellen, welche das Antigen absondern, zu durchmustern. Solche positiven Klone können anschließend sequenziert werden (siehe zum Beispiel Kelly et al., 1992 Bio/Technology 10: 163–167; Bebbington et al., 1992 Bio/Technology 10: 169–175).
Die Formulierungen "bindet selektiv" und "bindet spezifisch" mit dem Polypeptid beziehen sich auf eine Binde-Reaktion, welche die Gegenwart des Proteins in einer heterogenen Population von Proteinen oder anderen biologischen Stoffen anzeigt. Das heißt, unter ausgewiesenen Immunoassay-Bedingungen bindet der spezifizierte Antikörper, der an ein bestimmtes Protein gebunden ist, in keiner signifikanten Menge an andere Proteine, die in der Probe vorliegen. Ein selektives Binden an einen Antikörper unter solchen Bedingungen kann einen Antikörper erfordern, der für seine Spezifität gegenüber einem bestimmten Protein ausgewählt ist. Eine Vielfalt von Immunoassayausführungen kann verwendet werden, um Antikörper auszuwählen, die selektiv mit einem bestimmten Protein binden. Beispielsweise werden Festphasen-ELISA-Immunoassays routinemäßig verwendet, um Antikörper auszuwählen, welche selektiv immunoreaktiv mit einem Protein sind. Siehe Harlow und Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988) für eine Beschreibung von Immunoassayausführungen und Bedingungen, die verwendet werden können, um ein selektives Binden zu bestimmen.
In einigen Fällen ist es wünschenswert, monoklonale Antikörper aus verschiedenen Wirten herzustellen. Eine Beschreibung von Techniken zur Herstellung solcher monoklonaler Antikörper kann Stites et al., Herausgeber, "Basic and Clinical Immunology", (Lange Medical Publications, Los Altos, Kalif., Vierte Ausgabe) und darin zitierten Referenzen und Harlow und Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988) entnommen werden.
Es sollte selbstverständlich sein, dass die vorhergehenden Ausführungen bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung betreffen. Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht, welche im Bezug auf den Umfang der Erfindung in keiner Weise als Beschränkungen zu verstehen sind.
BEISPIELE
Beispiel 1
Aufzucht von Physcomitrella patens-Kulturen
Für diese Studie wurden Pflanzen der Spezies Physcomitrella patens (Hedw.) B.S.G. aus der Sammlung der Abteilung für genetische Studien der Universität Hamburg verwendet. Sie stammen vom Stamm 16/14 ab, welcher von H.L.K. Whitehouse in Gransden Wood, Huntingdonshire (England) eingesammelt wurde und der von Engel aus einer Spore subkultiviert wurde (1968, Am. J. Bot. 55, 438–446). Die Proliferation der Pflanzen wurde mittels Sporen und mittels Regeneration der Gametophyten durchgeführt. Das Protonema entwickelte sich aus der haploiden Spore als ein Chloroplasten-reiches Chloronema und ein Chloroplasten-armes Caulonema, worauf sich nach etwa 12 Tagen Knospen bildeten. Diese wuchsen unter Bildung von Gametangienträgern, welche Antheridien und Archegonien hervorbrachten. Nach der Befruchtung ergab sich die diploide Sporophyte mit einer kurzen Seta und der Sporenkapsel, in welcher die Meiosporen reiften.
Die Kultivierung wurde in einer Klimakammer bei einer Lufttemperatur von 25°C und einer Lichtintensität von 55 Mikromol^–lm2 (weißes Licht; Philips TL 65W/25 Fluoreszenzröhre) und einem Licht-/Dunkelwechsel von 16/8 Stunden durchgeführt. Das Moss wurde entweder in Flüssigkultur unter Verwendung von Knop-Medium gemäß Reski und Abel (1985, Planta 165: 354–358) modifiziert oder unter Verwendung von 0,1% Oxoidagar (Unipath, Basingstoke, England) auf festem Knop-Medium kultiviert. Die für RNA- und DNA-Isolierung verwendeten Protonema wurden in belüfteten Flüssigkulturen kultiviert. Die Protonema wurden alle 9 Tage verkleinert und in frisches Kulturmedium überführt.
Beispiel 2
Isolierung von Gesamt-DNA aus Pflanzen
Die Einzelheiten zur Isolierung von Gesamt-DNA beziehen sich auf die Aufarbeitung von einem Gramm Frischgewicht an Pflanzenmaterial. Die verwendeten Materialien schließen die folgenden Puffer ein: CTAB-Puffer: 2% (w/v) N-Cethyl-N,N,N-trimethylammoniumbromid (CTAB); 100 mM Tris HCl pH 8,0; 1.4 M NaCl; 20 mM EDTA; N-Laurylsarcosin-Puffer: 10% (w/v) N-Laurylsarcosin; 100 mM Tris HCl pH 8,0; 20 mM EDTA.
Das Pflanzenmaterial wurde unter flüssigem Stickstoff in einem Mörser zerrieben, um ein feines Puder zu ergeben und in 2 ml Eppendorf-Gefäße übertragen. Das gefrorene Pflanzenmaterial wurde anschließend mit einer Schicht von 1 ml Zersetzungspuffer (1 ml CTAB-Puffer, 100 μl N-Laurylsarcosin-Puffer, 20 μl β-Mercaptoethanol und 10 μl Proteinase-K-Lösung, 10 mg/ml) bedeckt und für eine Stunde bei 60°C unter ständigem Schütteln inkubiert. Das erhaltene Homogenat wurde auf zwei Eppendorf-Gefäße (2 ml) aufgeteilt und zweimal durch Schütteln mit demselben Volumen Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. Zur Phasentrennung wurde jeweils eine Zentrifugation bei 8000 × g und Raumtemperatur für 15 Minuten durchgeführt. Die DNA wurde anschließend bei –70°C für 30 Minuten unter Verwendung von eisgekühltem Isopropanol präzipitiert. Die präzipitierte DNA wurde bei 4°C und 10 000 g für 30 Minuten sedimentiert und in 180 μl TE-Puffer resuspendiert (Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6). Zur weiteren Reinigung wurde die DNA mit NaCl (1,2 M Endkonzentration) behandelt und wiederum bei –70°C für 30 Minuten unter Verwendung des doppelten Volumens von absolutem Ethanol präzipitiert. Nach einem Wasch-Schritt mit 70%-igem Ethanol, wurde die DNA getrocknet und anschließend in 50 μl H₂O + RNAse (50 mg/ml Endkonzentration) aufgenommen. Die DNA wurde über Nacht bei 4°C gelöst und anschließend wurde der RNAse-Verdau bei 37°C für eine Stunde durchgeführt. Die Lagerung der DNA erfolgte bei 4°C.
Beispiel 3
Isolierung von Gesamt-RNA und Poly-(A)⁺ RNA und Erstellen einer cDNA-Bibliothek aus Physcomitrella patens
Zur Untersuchung von Transkripten wurde sowohl Gesamt-RNA als auch Poly-(A)⁺ RNA isoliert. Die Gesamt-RNA wurde aus 9 Tage alten Wildtyp-Protonerneta unter Befolgung des GTC-Verfahrens (Reski et al. 1994, Mol. Gen. Genet., 244: 352–359) erhalten. Die Poly-(A)⁺-RNA wurde unter Verwendung von Dyna Beads^R (Dynal, Oslo, Norwegen) unter Befolgung der Instruktionen des Herstellerhandbuchs isoliert. Nach Bestimmung der RNA- oder der Poly-(A)⁺ RNA-Konzentration wurde die RNA durch Zugabe von 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat pH 4,6 und 2 Volumina Ethanol präzipitiert und bei –70°C gelagert.
Zur cDNA-Bibliothek-Konstruktion wurde die Erststrangsynthese unter Verwendung von reverser Transkriptase aus murinem Leukämievirus (Roche, Mannheim, Deutschland) und Oligo-d(T)-Primern, die Zweitstrangsynthese durch Inkubation mit DNA-Polymerase I, Klenow-Enzym und RNAseH-Verdau bei 12°C (2 Stunden), 16°C (1 Stunde) und 22°C (1 Stunde) erzielt. Die Reaktion wurde durch Inkubation bei 65°C (10 Minuten) gestoppt und anschließend auf Eis überführt. Doppelsträngige DNA-Moleküle wurden durch T4-DNA-Polymerase (Roche, Mannheim) bei 37°C (30 Minuten) mit glatten Enden versehen. Nukleotide wurden durch Phenol-/Chloroformextraktion und Sephadex G50-Spin-Säulen entfernt. EcoRI-Adapter (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) wurden durch T4-DNA-Ligase (Roche, 12°C, über Nacht) an die cDNA-Enden ligiert und durch Inkubation mit Polynukleotidkinase (Roche, 37°C, 30 Minuten) phosphoryliert. Das Gemisch wurde auf einem niedrig schmelzenden Agarosegel einer Auftrennung unterzogen. DNA-Moleküle, die größer als 300 Basenpaare waren, wurden aus dem Gel eluiert, Phenol-extrahiert und auf Elutip-D-Säulen (Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland) konzentriert und an die Enden eines Vektors ligiert und unter Verwendung des Gigapack Gold Kits (Stratagene, Amsterdam, Niederlande) in Lambda-ZAPII-Phagen oder Lambda-ZAP-Expressphagen verpackt, wobei Material des Herstellers verwendet und die Herstellervorschriften befolgt wurden.
Beispiel 4
Sequenzierung und Funktionsannotierung von Physcomitrella patens ESTs
cDNA-Bibliotheken wie sie in Beispiel 3 beschrieben sind, wurden zur DNA-Sequenzierung gemäß Standardverfahren und insbesondere durch das Kettenabbruchverfahren unter Verwendung des ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer, Weiterstadt, Deutschland) verwendet.
Im Anschluss an eine präperative Plasmidgewinnung aus cDNA-Bibliotheken durch in vivo-Massenexzision, Retransformation und anschließendes Ausplatieren von DH10B auf Agarplatten wurde Random-Sequenzierung durchgeführt (Material und Protokolleinzelheiten von Stratagene, Amsterdam, Niederlande). Plasmid-DNA wurde aus über Nacht aufgezogenen E. coli-Kulturen, welche in Luria-Broth-Medium mit Ampizillin aufgezogen wurden (siehe Sambrook et al., 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) mit einem Qiagen DNA-Präparationsrobotor (Qiagen, Hilden) gemäß dem Herstellerhandbuch hergestellt. Es wurden Sequenzierungsprimer mit den folgenden Nukleotidsequenzen verwendet:
Die Sequenzen wurden unter Verwendung des Softwarepakets EST-MAX, welches kommerziell von Bio-Max (München, Deutschland) angeboten wird, verarbeitet und annotiert. Das Programm berücksichtigt so gut wie alle bioinformatischen Verfahren, die für eine funktionale und strukturelle Charakterisierung von Proteinsequenzen wichtig sind. Zur Referenz dient die Webseite unter pedant.mips.biochem.mpg.de. Die wichtigsten Algorithmen, die durch EST-MAX berücksichtigt werden, sind: FASTA: Sehr sensitive Sequenzdatenbanksuchen mit Abschätzung der statistischen Signifikanz; Pearson W. R. (1990) Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA. Methods Enzymol. 183: 63–98; BLAST: Sehr sensitive Sequenzdatenbanksuchen mit Abschätzung der statistischen Signifikanz. Altschul S. F., Gish W., Miller W., Myers E. W., und Lipman D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology 215: 403–10; PREDATOR: Sekundärstrukturvorhersage von einzelnen und mehreren Sequenzen mit hoher Genauigkeit. Frishman, D. und Argos, P. (1997) 75% accuracy in protein secondary structure prediction. Proteins, 27: 329–335; CLUSTALW: Alignment mehrerer Sequenzen. Thompson, J. D., Higgins, D. G. und Gibson, T. J. (1994); CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22: 4673–4680; TMAP: Vorhersage der transmembranen Region von mehrfach alignten Sequenzen. Persson, B. und Argos, P. (1994) Prediction of transmembrane segments in proteins utilizing multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 237: 182–192; ALOM2: Transmembranregionvorhersage von einzelnen Sequenzen. Klein, P., Kanehisa, M., und DeLisi, C. Prediction of protein function from sequence properties: A discriminate analysis of a database. Biochim. Biophys. Acta 787: 221–226 (1984). Version 2 von Dr. K. Nakai; PROSEARCH: Erkennung von PROSITE-Proteinsequenzmustern. Kolakowski L. F. Jr., Leunissen J. A. M., Smith J. E. (1992) ProSearch: fast searching of protein sequences with regular expression patterns related to protein structure and function. Biotechniques 13, 919–921; BLIMPS: Ähnlichkeitssuchen gegen eine Datenbank von lückenlosen (ungapped) Blöcken. J. C. Wallace und Henikoff S., (1992); PATMAT: Ein Such- und Extraktionsprogramm für Sequenzen-, Muster- und Blockanfragen und Datenbanken, CABIOS 8: 249–254. Geschrieben von Bill Alford.
Beispiel 5
Identifizierung von Physcomitrella patens ORF entsprechend CC-1, CC-2 und CC-3 CC-2 und CC-3 sind Vergleichsversuche
Die unten in Tabelle 1 gezeigten partiellen cDNAs (ESTs) aus Physcomitrella patens wurden mit dem Physcomitrella patens-EST-Sequenzierungsprogramm unter Verwendung des Programms EST-MAX durch BLAST-Analyse identifiziert. Die Sequenzidentifizierungsnummern entsprechend diesen ESTs sind wie folgt: CC-1 (SEQ ID NO: 1), CC-2 (SEQ ID NO: 2) und CC-3 (SEQ ID NO: 3). Tabelle 1

* Vergleichsbeispiel

Tabelle 2 Grad der Aminosäureidentität und Ähnlichkeit von PpCC-1 und anderen homologen Proteinen (ein GCG-Gap-Programm wurde verwendet: Gap penalty 10; Gap extension penalty: 0.1; Score matrix: blosum62)
Tabelle 3 Grad der Aminosäureidentität und Ähnlichkeit von PpCC-2 und anderen homologen Proteinen; ein GCG-Gap-Programm wurde verwendet: Gap penalty 10; Gap extension penalty: 0.1; Score matrix: blosum62 (Vergleichsbeispiel)
Tabelle 4 Grad der Aminosäureidentität und Ähnlichkeit von PpCC-3 und anderen homologen Proteinen; ein GCG-Gap-Programm wurde verwendet: Gap penalty 10; Gap extension penalty: 0.1; Score matrix: blosum62 (Vergleichsbeispiel)
Beispiel 6
Klonierung der Volllängen Physcomitrella patens-cDNA, welche für CC-1, CC-2 und CC-3 kodiert (CC-2 und CC-3 sind Vergleichsbeispiele)
Um die Klone zu isolieren, die für Pp CC-1 (SEQ ID NO: 4), Pp CC-2 (SEQ ID NO: 5) und Pp CC-3 (SEQ ID NO: 6) aus Physcomitrella patens codieren, wurden mit SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech Laboratories) nach Anweisung des Herstellers cDNA-Bibliotheken erzeugt. Gesamt-RNA, die wie in Beispiel 3 beschrieben isoliert wurde, wurde als Matrize verwendet. Die Kulturen wurden vor Isolierung der RNA wie folgt behandelt: Salzstress: 2, 6, 12, 24, 48 Stunden mit 1-M NaCl-ergänztem Medium; Kältestress: 4°C für die gleichen Zeitspannen wie bei Salz; Trockenheitsstress: Kulturen wurden auf trockenem Filterpapier inkubiert, für die gleichen Zeitspannen wie bei Salz.
5' RACE Protokoll
Die bei der in Beispiel 4 beschriebenen Datenbanksuche identifizierten EST-Sequenzen CC-2 (SEQ ID NO: 2) und CC-3 (SEQ ID NO: 3) wurden verwendet, um Oligos für RACE zu erstellen (siehe Tabelle 5). Die verlängerten Sequenzen für diese Gene wurden erhalten, indem RACE PCR (Rapid Amplification of cDNA Ends Polymerasekettenreation) durchgeführt wurde, unter Verwendung des Advantage 2 PCR Kits (Clontech Laboratories) unter Verwendung eines Biometra T3 Thermocyklers, entsprechend Herstelleranweisungen. Die bei den RACE Reaktionen erhaltenen Sequenzen entsprachen den vollen Längen der codierenden Regionen von CC-2 und CC-3 und wurden verwendet, um Oligos für eine Volllängen-Klonierung der entsprechenden Gene zu entwerten (siehe unten Volllängen-Amplifizierung)
Volllängen-Amplifizierung
Volllängen-Klone entsprechend CC-1 (SEQ ID NO: 4), CC-2 (SEQ ID NO: 5) und CC-3 (SEQ ID NO: 6) wurden erhalten, indem Polymerasekettenreaktionen (PCR) mit genspezifischen Primern (siehe Tabelle 5) und dem ursprünglichen EST als Matrize durchgeführt wurden. Die Reaktionsbedingungen waren Standardbedingungen mit PWO DNA Polymerase (Roche). PCR wurde gemäß Standardbedingungen und entsprechend den Herstelleranweisungen durchgeführt (Sambrook et al., 1989 Molecular Coloning, A. Laboratory Manual. 2. Ausgabe. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y., Biometra T3 Thermocykler). Die Reaktionsparameter waren: 5 Minuten bei 94°C, gefolgt von 5 Zyklen von einer Minute bei 94°C, 1 Minute bei 50°C und 1,5 Minuten bei 72°C. Anschließend erfolgten 25 Zyklen von 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 65°C und 1,5 Minuten bei 72°C.
Die amplifizierten Fragmente wurden von Agarosegel extrahiert mit einem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) und in den TOPO pCR 2.1 Vektor (Invitrogen) ligiert, gemäß Herstelleranweisungen. Rekombinante Vektoren wurden unter Verwendung von Standardbedingungen in Top10 Zellen (Invitrogen) transformiert (Sambrook et al. 1989 Molecular Coloning, A. Laboratory Manual. 2. Ausgabe. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY). Transformierte Zellen wurden auf LB-Agar, der 100 μg/ml Carbenizillin, 0,8 mg X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktosid) und 0,8 mg IPTG (Isopropylthio-β-D-galaktosid) enthielt, selektiert und über Nacht bei 37°C aufgezogen. Weiße Kolonien wurden ausgewählt und verwendet, um 3 ml flüssiges LB, welches 100 μg/ml Ampizillin enthielt, anzuimpfen, und über Nacht bei 37°C aufgezogen. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des QIAprep Spin Miniprep Kits (Qiagen) unter Befolgung der Herstellerangaben extrahiert. Analysen der nachfolgenden Klone und Restriktionskartierung wurden nach molekularbiologischen Standardtechniken (Sambrook et al. 1989 Molecular Coloning, A Laboratory Manual. 2. Ausgabe. Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY) durchgeführt.
Tabelle 5 für die Klonierung von Volllängen-Klonen verwendetes Schema und Primer
Beispiel 7
Konstruktion stresstoleranter Arabidopsis-Pflanzen durch Überexpression der Gene CC-1, CC-2 und CC-3 (CC-2 und CC-3 sind Vergleichsbeispiele)
Binäre Vektorkonstruktion: Kanamycin
Das Plasmid-Konstrukt pACGH101 wurde mit PstI (Roche) und FseI (NEB) gemäß Herstellerangaben verdaut. Das Fragment wurde aus einem Agarosegel gereinigt und mit dem Qiaex II DNA Extraction Kit (Qiagen) extrahiert. Dies ergab ein Vektorfragment mit dem Arabidopsis Actin2 Promotor mit internem Intron und dem OCS3 Terminator. Primer für die PCR Amplifizierung des NPTII-Gens waren wie folgt aufgebaut:
5'NPT-Pst:
3'NPT-Fse:
Das 0,9 kb NPTII-Gen wurde durch PCR amplifiziert aus pCambia 2301 Plasmid-DNA [94°C 60 sek, {94°C 60 sek, 61°C (–0,1°C pro Zyklus) 60 sek, 72°C 2 min} × 25 Zyklen, 72°C 10 min an Biometra T-Gradient Maschine] und mittels des Qiaquick PCR Extraction Kits (Qiagen) gemäß Herstelleranweisungen aufgereinigt. Die PCR-DNA wurde dann in den pCR-BluntII TOPO Vektor (Invitrogen) subkloniert, unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers (NPT-TOPO Konstrukt). Diese Ligate wurden in Top10 Zellen (Invitrogen) transformiert und auf LB-Platten mit 50 μg/ml Kanamycinsulfat über Nacht bei 37°C aufgezogen. Kolonien wurden dann verwendet, um 2 ml LB-Medium mit 50 μg/ml Kanamycinsulfat zu beimpfen und über Nacht bei 37°C aufgezogen. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des Qiaprep Spin Miniprep Kits (Qiagen) gewonnen und sowohl in 5' als auch in 3' Richtung unter Verwendung von Standardbedingungen sequenziert. Anschließende Analyse der Sequenzdaten unter Verwendung von VectorNTI Software ergab, dass in der NPTII-Gensequenz keine PCR-Fehler vorlagen.
Das NPT-Topo Konstrukt wurde dann mit PstI (Roche) und FseI (NEB) gemäß Herstellerangaben verdaut. Das 0,9 kb-Fragment wurde aus einem Agarosegel gereinigt und mit dem Qiaex II DNA Extraction Kit (Qiagen) extrahiert. Das Pst/Fse-Einschubfragment von NPT-Topo und das Pst/Fse-Vektorfragment von pACGH101 wurden dann zusammen ligiert, unter Verwendung von T4 DNA-Ligase (Roche), unter Befolgung der Herstellerangaben. Das Ligat wurde dann unter Standardbedingungen in Top10-Zellen (Invitrogen) transformiert, wobei ein pBPSsc019-Konstrukt erzeugt wurde. Kolonien wurden auf LB-Platten mit 50 μg/ml Kanamycinsulfat selektiert und über Nacht bei 37°C aufgezogen. Diese Kolonien wurden dann verwendet, um 2 ml LB-Medium mit 50 μg/ml Kanamycinsulfat zu beimpfen und über Nacht bei 37°C aufgezogen. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des Qiaprep Spin Miniprep Kits (Qiagen) unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers gewonnen.
Das pBPSSC019 Konstrukt wurde mit KpnI und BsaI (Roche) gemäß Herstelleranweisungen verdaut. Das Fragment wurde aus einem Agarosegel gereinigt und dann anweisungsgemäß mit dem Qiaex II DNA Extraction Kit (Qiagen) extrahiert, was zu einer 3 kb Act-NPT-Kassette führte, die den Arabidopsis Actin2 Promotor mit internem Intron, das NPTII-Gen und den OCS3 Terminator enthielt.
Der Vektor pBPSJH001 wurde mit SpeI und ApaI (Roche) verdaut und mit Klenow-Enzym und 0.1 mM dNTPs (Roche) gemäß Herstellerangaben zu glatten Enden aufgefüllt. Dadurch wurde ein 10,1 kb-Vektorfragment abzüglich der Gentamycin-Kassette erzeugt, welches durch selbst-Ligieren mit T4-DNA-Ligase (Roche) rezirkuliert wurde, und unter Standardbedingungen in Top10-Zellen (Invitrogen) transformiert wurde. Transformierte Zellen wurden auf LB-Agar, welches 50 μg/ml Kanamycinsulfat enthielt, selektiert und über Nacht bei 37°C aufgezogen. Die Kolonien wurden dann verwendet, um 2 ml flüssiges LB, welches 50 μg/ml Kanamycinsulfat enthielt, zu beimpfen, und über Nacht bei 37°C aufgezogen. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des QIAprep Spin Miniprep Kits (Qiagen) unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers gewonnen. Das rezirkulierte Plasmid wurde dann mit KpnI (Roche) verdaut und von einem Agarosegel mit dem Qiaex II DNA Extraction Kit (Qiagen) extrahiert, entsprechend der Anweisungen des Herstellers.
Der Act-NPT Kpn-cut Einschub und der Kpn-cut pBPSJH001 rezirkulierte Vektor wurden dann unter Verwendung von T4-DNA-Ligase (Roche) aneinander ligiert, und entsprechend der Anweisungen des Herstellers in Top10-Zellen (Invitrogen) transformiert. Das sich ergebende Konstrukt, pBPS022, enthielt nun den Superpromotor, das GUS-Gen, den NOS-Terminator und die Act-NPT-Kassette. Transformierte Zellen wurden auf LB-Agar, welches 50 μg/ml Kanamycinsulfat enthielt, selektiert und über Nacht bei 37°C aufgezogen. Kolonien wurden dann verwendet, um 2 ml flüssiges LB, welches 50 μg/ml Kanamycinsulfat enthielt, zu beimpfen, und über Nacht bei 37°C aufgezogen. Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des QIAprep Spin Miniprep Kits (Qiagen) unter Befolgung der Anweisungen des Herstellers gewonnen. Nach Bestätigung der erfolgreichen Ligierung durch Restriktionsverdau wurde pBPSsc022 Plasmid-DNA weiter vermehrt und unter Verwendung des Plasmid Midiprep Kits (Qiagen) entsprechend der Anweisungen des Herstellers gewonnen.
Subklonierung von CC-1, CC-2 und CC-3 in den binären Vektor
Die Fragmente, welche die verschiedenen Physcomitrella patens-Transkriptionsfaktoren enthalten, wurden aus den rekombinanten PCR2.1 TOPO Vektoren durch zweifachen Verdau mit Restriktionsenzymen (siehe Tabelle 6) gemäß Herstellerangaben subkloniert. Das Untersequenz-Fragment wurde aus einem Agarosegel mit einem QIAquick Gel Extraction Kit (QIAgen) gemäß Herstellerangaben ausgeschnitten und in die binären Vektoren pGMSG, welche vor der Ligation mit XmaI und Ecl136II geschnitten und dephosphoriliert worden waren, ligiert. Der sich ergebende rekombinante pGSMG enthielt die entsprechenden Transkriptionsfaktoren in sense-Orientierung unter dem konstitutiven Superpromotor. Tabelle 6 Aufgelistet sind die Namen der verschiedenen Konstrukte der Physcomitrella patens Transkriptionsfaktoren, die für die Pflanzentransformation verwendet wurden

* Vergleichsbeispiel

Agrobakterium-Transformation
Die rekombinanten Vektoren wurden nach Standardbedingungen in Agrobacterium tumefaciens C58C1 und PMP90 transformiert (Hoefgen und Willmitzer, 1990).
Pflanzentransformation
Arabidopsis thaliana Ökotyp C24 wurden aufgezogen und gemäß Standardbedingungen transformiert (Bechtold 1993, Acad. Sci. Paris. 316: 1194–1199; Bent et al. 1994, Science 265: 1856–1860).
Durchmustern transformierter Pflanzen
T1-Samen wurde nach Standardprotokollen sterilisiert (Xiong et al. 1999, Plant Molecular Biology Reporter 17: 159–170). Die Samen wurden auf ½ MS 0,6% Agar, der mit 1% Saccharose, 50 μg/ml Kanamycin (Sigma-Aldrich) und 2 μg/ml Benomyl (Sigma-Aldrich) supplementiert war, ausplattiert. Die Samen auf den Platten wurden für vier Tage bei 4°C vernalisiert. Die Samen wurden in einer Klimakammer bei einer Lufttemperatur von 22°C und einer Lichtintensität von 40 Mikromol^–lm2 (weißes Licht; Philips TL 65W/25 Fluoreszenzröhre) und einem Tageslängenzyklus mit 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit gekeimt. Transformierte Keimlinge wurden nach 14 Tagen selektiert und auf ½ MS 0,6% Agarplatten, die mit 1% Saccharose supplementiert waren, übertragen und man ließ sie sich für fünf bis sieben Tage erholen.
Durchmustern nach Trockenheitstoleranz
Die T1-Keimlinge wurden auf trockenes, steriles Filterpapier in einer Petrischale übertragen und man ließ sie für zwei Stunden bei 80% LF (relative Luftfeuchtigkeit) in einem Sanyo Wachstumsschrank MLR-350H, Mikromol^–lm2 (weißes Licht; Philips TL 65W/25 Fluoreszenzröhre) austrocknen. Die LF wurde dann auf 60% abgesenkt und die Keimlinge wurden für weitere acht Stunden ausgetrocknet. Die Keimlinge wurden dann entfernt und auf ½ MS 0,6% Agarplatten platziert, die mit 2 μg/ml Benomyl supplementiert waren, und nach fünf Tagen ausgewertet.
Bei Trockenheitsstress-Bedingungen zeigten die PpCC-1 überexprimierenden Arabidopsis thaliana Pflanzen eine Überlebensrate von 67% (6 Überlebende von 9 gestressten Pflanzen), PpCC-2: 75% (6 Überlebende von 8 gestressten Pflanzen) und PpCC-3: 92% (11 Überlebende von 12 gestressten Pflanzen), wohingegen die Kontrollen nur eine Überlebensrate von 11% (1 Überlebender von 9 gestressten Pflanzen) zeigten (siehe Tabelle 7). Es ist beachtenswert, dass die Analysen dieser transgenen Linien mit T1-Pflanzen durchgeführt wurden, daher werden die Ergebnisse besser sein, wenn ein homozygoter, starker Expressor gefunden wird. Tabelle 7 Zusammenfassung des Trockenheitsstress-Tests

* Vergleichsbeispiel

Durchmustern nach Frosttoleranz
Die Keimlinge wurden auf Petrischalen übertragen, die ½ MS 0,6% Agar enthielten, der mit 2% Saccharose und mit 2 μg/ml Benomyl supplementiert war. Nach vier Tagen wurden die Keimlinge für eine Stunde bei 4°C inkubiert und dann mit geschabtem Eis bedeckt. Die Keimlinge wurden dann in einer Environmental Specialist ES2000 Klimakammer plaziert und für 3,5 Stunden beginnend bei –1,0°C, inkubiert, wobei jede Stunde um –1°C abgesenkt wurde. Die Keimlinge wurden dann für 24 Stunden bei –5°C inkubiert und dann ließ man sie bei 5°C für 12 Stunden auftauen. Das Wasser wurde abgegossen und die Keimlinge wurden nach 5 Tagen ausgewertet.
Bei Froststress-Bedingungen zeigten die PpCC-1 überexprimierenden Arabidopsis thaliana Pflanzen eine Überlebensrate von 89% (8 Überlebende von 9 gestressten Pflanzen), wohingegen die untransformierten Kontrollen nur eine Überlebensrate von 2% (1 Überlebender von 48 gestressten Pflanzen) zeigten (siehe Tabelle 8). Es ist beachtenswert, dass die Analysen dieser transgenen Linien mit T1-Pflanzen durchgeführt wurden, daher werden die Ergebnisse besser sein, wenn ein homozygoter, starker Expressor gefunden wird.
Tabelle 8 Zusammenfassung des Froststress-Tests
Durchmustern nach Salztoleranz (Vergleichsbeispiel)
Die Keimlinge wurden auf Filterpapier, welches mit ½ MS getränkt war, übertragen und die Nacht vor der Durchführung der Durchmusterung auf Salztoleranz auf ½ MS 0,6% Agar platziert, der mit 2 μg/ml Benomyl supplementiert war. Zur Durchmusterung auf Salztoleranz wurde das Filterpapier mit den Keimlingen auf Stapel aus mit 50 mM NaCl getränktem, sterilem Filterpapier in einer Petrischale übertragen. Nach zwei Stunden wurde das Filterpapier mit den Keimlingen auf Stapel von sterilem Filterpapier, welches mit 200 mM NaCl getränkt war, in einer Petrischale übertragen. Nach zwei Stunden wurde das Filterpapier mit den Keimlingen auf Stapel von sterilem Filterpapier, welches in 600 mM NaCl getränkt war, in einer Petrischale übertragen. Nach 10 Stunden wurden die Keimlinge auf Petrischalen übertragen, die ½ MS 0,6% Agar enthielten, der mit 2 μg/ml Benomyl supplementiert war. Die Keimlinge wurden nach fünf Tagen ausgewertet.
Die transgenen Pflanzen werden auf ihre verbesserte Salztoleranz hin durchmustert, wobei gezeigt wird, dass transgene Expression Salztoleranz verleiht.
Beispiel 8
Detektion von CC-1, CC-2 und CC-3 Transgenen in den transgenen Arabidopsis-Linien (CC-2 und CC-3 sind Vergleichsbeispiele)
Ein Blatt eines Wildtyps und einer transgenen Arabidopsis-Pflanze wurden in 250 μl Hexadecyltrimethylammoniumbromid (CTAB)-Puffer (2% CTAB, 1,4 M NaCl, 8 mM EDTA und 20 mM Tris pH 8,0) und 1 μl β-Mercaptoethanol homogenisiert. Die Proben wurden für 30 Minuten bei 60–65°C inkubiert und anschließend wurden zu jeder Probe 250 μl Chloroform hinzugegeben. Die Proben wurden drei Minuten verwirbelt und fünf Minuten bei 18.000 × g zentrifugiert. Der Überstand wurde von jeder Probe abgenommen und 150 μl Isopropanol wurden zugegeben. Die Proben wurden 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und 10 Minuten bei 18.000 × g zentrifugiert. Jedes Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen, getrocknet und in 20 μl TE resuspendiert. 4 μl der obigen Suspension wurden in einer 20 μl PCR-Reaktion unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase (Roche Molecular Biochemicals) gemäß Herstellerangaben eingesetzt. Die in den Reaktionen verwendeten Primer waren:
PpCC-1
Das PCR-Programm war wie folgt: 30 Zyklen für 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 62°C und 4 Minuten bei 72°C, gefolgt von 10 Minuten bei 72°C. Aus der Positivkontrolle und den transgenen Pflanzen wurde ein 1,6 kb Fragment erzeugt.
PpCC-2
Die Primer wurden in der ersten Runde der Reaktionen in dem folgenden Programm verwendet: 30 Zyklen für 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 62°C und 4 Minuten bei 72°C, gefolgt von 10 Minuten bei 72°C. Aus der Positivkontrolle und den T1-transgenen Pflanzen wurde ein 3 kb Fragment erzeugt.
PpCC-3
Das PCR-Programm war wie folgt: 30 Zyklen für 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 62°C und 4 Minuten bei 72°C, gefolgt von 10 Minuten bei 72°C. Aus der Positivkontrolle und den transgenen Pflanzen wurde ein 2,3 kb Fragment erzeugt.
Die Transgenen wurden erfolgreich aus den T1-transgenen Linien amplifiziert, aber nicht aus dem Wildtyp C24. Dieses Ergebnis zeigt, dass die T1-transgenen Pflanzen wenigstens eine Kopie der Transgene enthalten. Es gab keine Anzeichen für die Existenz von identischen oder sehr ähnlichen Genen in der untransformierten Arabidopsis thaliana Kontrolle, die durch dieses Verfahren amplifiziert werden könnten.
Beispiel 9
Detektion der CC-1, CC-2 und CC-3 transgenen mRNA in transgenen Arabidopsis-Linien (CC-2 und CC-3 sind Vergleichsbeispiele)
Die transgene Expression wurde unter Verwendung von RT-PCR detektiert. Gesamt-RNA wurde aus stressbehandelten Pflanzen unter Verwendung eines Verfahrens basierend auf (Verwoerd et al., 1989 NAR 17: 2362) isoliert. Blattproben (50–100 mg) wurden gesammelt und in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver zermahlen. Das zermahlene Gewebe wurde in 500 μl einer 80°C, 1:1 Mischung von Phenol zu Extraktionspuffer (100 mM LiCl, 100 mM Tris pH 8, 10 mM EDTA, 1% SDS) suspendiert, gefolgt von kurzem Verwirbeln, um zu mischen. Nach der Zugabe von 250 μl Chloroform wurde jede Probe kurz verwirbelt. Die Proben wurden anschließend 5 Minuten bei 12.000 × g zentrifugiert. Die obere wässrige Phase wurde in ein frisches Eppendorf-Gefäß abgetrennt. Die RNA wurde durch Zugabe eines 1/10-Volumens 3 M Natriumacetat und 2 Volumina 95% Ethanol präzipitiert. Die Proben wurden durch Invertieren gemischt und für 30 Minuten auf Eis platziert. Die RNA wurde durch Zentrifugation bei 12,000 × g für 10 Minuten pelletiert. Der Überstand wurde entfernt und die Pellets kurz luftgetrocknet. Die RNA-Probenpellets wurden in 10 μl DEPC behandeltem Wasser resuspendiert. Um kontaminierende DNA aus den Proben zu entfernen, wurde jede Probe mit RNase-freier DNase (Roche) gemäß Herstellerempfehlungen behandelt. cDNA wurde aus der Gesamt-RNA unter Verwendung des Erststrang-cDNA-Synthesekits (Boehringer Mannheim) synthetisiert, wobei die Herstellerempfehlungen befolgt wurden.
Die PCR-Amplifikation eines genspezifischen Fragments aus der synthetisierten cDNA wurde unter Verwendung von Taq-DNA-Polymerase (Roche) und genspezifischen Primern (Primer siehe unten) in der folgenden Reaktion durchgeführt: 1 × PCR Puffer, 1,5 mM MgCl₂, 0,2 μl jedes Primers, 0,2 μM dNTPs, ein Unit Polymerase, 5 μl cDNA aus der Synthesereaktion. Die Amplifikation wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Denaturierung, 95°C, 1 Minute, Annealing, 62°C, 30 Sekunden; Verlängerung, 72°C, 1 Minute, 35 Zyklen; Verlängerung, 72°C, 5 Minuten; Halten, 4°C, andauernd. Die PCR-Produkte wurden auf einem 1%-igen Agarosegel aufgetrennt, mit Ethidiumbromid angefärbt und unter UV-Licht unter Verwendung des Quantity-One Geldokumentationssystems (Bio-Rad) sichtbar gemacht.
Die Expression der Transgene wurde in der T1-transgenen Linie detektiert. Dieses Ergebniss zeigt, dass die Transgene in den transgenen Linien exprimiert werden und deutet stark darauf hin, dass ihr Genprodukt die Stresstoleranz der Pflanzen in der transgenen Linie verbesserte. Andererseits konnte durch dieses Verfahren keine Expression identischer oder sehr ähnlicher endogener Gene detektiert werden. Diese Ergebnisse stehen in Übereinstimmung mit den Daten aus Beispiel 7. Dadurch wird unsere Aussage, dass die verbesserte Stresstoleranz auf das eingefügte Transgen zurückzuführen ist, bedeutend gestützt.
Die folgende Primerkombination wurde in den oben beschriebenen Reaktionen verwendet:
PpCC-1
PpCC-2
PpCC-3
Die Amplifizierung wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Denaturierung, 95°C, 1 Minute; Annealing, 62°C, 30 Sekunden; Verlängerung, 72°C, 1 Minute, 35 Zyklen; Verlängerung, 72°C, 5 Minuten; Halt, 4°C, andauernd. Die PCR-Produkte wurden auf einem 1%-igen Agarosegel aufgetrennt, mit Ethidiumbromid angefärbt und unter UV-Licht unter Verwendung des Quantity-One Geldokumentationssystems (Bio-Rad) sichtbar gemacht.
Die Expression von Transgenen wurde in der T1-transgenen Linie detektiert. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Transgene in den transgenen Linien exprimiert werden und sie deuten stark darauf hin, dass ihr Genprodukt die Stresstoleranz der Pflanzen in den transgenen Linien verbesserte. In Übereinstimmung mit der vorhergehenden Aussage konnte durch dieses Verfahren keine Expression identischer oder sehr ähnlicher endogener Gene detektiert werden. Diese Ergebnisse stehen in Übereinstimmung mit den Daten aus Beispiel 7.
Beispiel 10
Konstruktion stresstoleranzer Sojabohnenpflanzen durch Überexpression der CC-1, CC-2 und CC-3-Gene (CC-2 und CC-3 sind Vergleichsbeispiele)
Die Konstrukte pBPSSY032, pBPSsc335 und pBPSLVM186 wurden verwendet, um Sojabohnen wie unten beschrieben zu transformieren.
Sojabohnensamen wurden mit 70% Ethanol für vier Minuten bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln, gefolgt von 20 Minuten 20% (v/v) Clorox, welches mit 0,05% (v/v) Tween supplementiert war, unter kontinuierlichem Schütteln oberflächensterilisiert. Anschließend wurden die Samen viermal mit destilliertem Wasser gespült und auf einem angefeuchteten, sterilen Filterpapier in einer Petrischale bei Raumtemperatur für 6 bis 39 Stunden platziert. Die Samenschalen wurden abgezogen, und die Keimblätter wurden von jeder Embryoachse abgelöst. Die Embryoachse wurde untersucht, um sicherzustellen, dass die meristematische Region nicht beschädigt war. Die ausgeschnittenen Embryoachsen wurden in einer halboffenen, sterilen Petrischale gesammelt und bis zu einem Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 20% (Frischgewicht) in einer verschlossenen Petrischale bis zur weiteren Verwendung luftgetrocknet.
Eine Agrobacterium tumefaciens-Kultur wurde aus einer einzelnen Kolonie in festem LB-Medium plus geeignete Antibiotika (z.B. 100 mg/l Streptomycin, 50 mg/l Kanamycin) gefolgt von der Aufzucht der einzelnen Kolonie in flüssigem LB-Medium bis zu einer optischen Dichte von 0,8 bei 600 nm, hergestellt. Anschließend wurde die Bakterienkultur bei 7000 upm für 7 Minuten bei Raumtemperatur pelletiert und in MS (Murashige und Skoog, 1962)-Medium resuspendiert, welches mit 100 μM Acetosyringon supplementiert war. Vor der Verwendung wurden die Bakterienkulturen in diesem Prä-Induktionsmedium für zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Achsen der Sojabohnen-zygotischen Keimlingembryonen mit etwa 15% Feuchtigkeitsgehalt wurden für zwei Stunden bei Raumtemperatur mit der präinduzierten Agrobacterium-Suspensionskultur imbibiert. Die Embryonen wurden aus der Imbibitionskultur entfernt und auf Petrischalen übertragen, die festes MS-Medium enthielten, welches mit 2% Saccharose supplementiert war, und für zwei Tage in der Dunkelheit bei Raumtemperatur inkubiert. Alternativ wurden die Embryonen auf angefeuchtetem (flüssiges MS-Medium), sterilem Filterpapier in einer Petrischale platziert und unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben inkubiert. Nach dieser Zeitspanne wurden die Embryonen entweder auf festes oder flüssiges MS-Medium übertragen, welches mit 500 mg/L Carbenicillin oder 300 mg/L Kefotaxim supplementiert war, um die Agrobakterien abzutöten. Das flüssige Medium wurde verwendet, um das sterile Filterpapier anzufeuchten. Die Embryonen wurden für vier Wochen bei 25°C unter 150 μmolm^–2sec^–1 und einer 12-Stunden-Photoperiode inkubiert. Nachdem die Keimlinge Wurzeln gebildet hatten, wurden sie auf sterilen Metromixboden übertragen. Vor dem Übertrag der Pflanzen auf den Boden wurde das Medium von den in vitro-Pflanzen abgewaschen. Um den Akklimatisierungsprozess zu begünstigen, wurden die Pflanzen für eine Woche unter einer Plastikbedeckung gehalten. Anschließend wurden die Pflanzen in eine Wachstumskammer überführt, wo sie bei 25°C unter 150 μmolm^–2sec^–1 Lichtintensität und einer 12-Stunden-Photoperiode für etwa 80 Tage inkubiert wurden.
Die transgenen Pflanzen wurden dann auf ihre verbesserte Trockenheits-, Salz- und/oder Kältetoleranz gemäß dem Durchmusterungsverfahren, welches in Beispiel 7 beschrieben ist, durchmustert, wobei es sich zeigte, dass transgene Expression Stresstoleranz verleiht.
Beispiel 11
Konstruktion stresstoleranter Raps-/Canolapflanzen durch Überexpression der CC-1, CC-2 und CC-3-Gene (CC-2 und CC-3 sind Vergleichsbeispiele)
Die Konstrukte pBPSSY032, pBPSsc335 und pBPSLVM186 wurden verwendet, um Raps-/Canolapflanzen wie unten beschrieben zu transformieren.
Das hierin beschriebene Verfahren zur Pflanzentransformation ist auch auf Brassica und andere Kulturpflanzen anwendbar. Canolasamen werden oberflächensterilisiert mit 70% Ethanol für vier Minuten bei Raumtemperatur unter kontinuierlichem Schütteln, gefolgt von 20% (v/v) Clorox, welches mit 0,05% (v/v) Tween supplementiert war, für 20 Minuten unter kontinuierlichem Schütteln. Anschließend werden die Samen viermal mit destilliertem Wasser gespült und für 18 Stunden auf einem angefeuchteten, sterilen Filterpapier in einer Petrischale bei Raumtemperatur platziert. Anschließend werden die Samenschalen entfernt und die Samen werden über Nacht in einer halboffenen, sterilen Petrischale luftgetrocknet. Während dieser Zeitspanne verlieren die Samen etwa 85% ihres Wassergehalts. Die Samen werden anschließend bei Raumtemperatur in einer verschlossenen Petrischale bis zur weiteren Verwendung gelagert. Die DNA-Konstrukte und die Embryoimbibition sind wie in Beispiel 10 beschrieben. Proben der primären transgenen Pflanzen (T0) werden durch PCR analysiert, um das Vorliegen von T-DNA zu bestätigen. Die Ergebnisse werden durch Southern Hybridisierung, in welcher DNA auf einem 1% Agarosegel durch Elektrophorese aufgetrennt und auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) übertragen wird, bestätigt. Der PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics) wird verwendet, um durch PCR eine Digoxigenin-markierte Probe herzustellen, und wird wie vom Hersteller empfohlen verwendet.
Die transgenen Pflanzen werden anschließend auf ihre verbesserte Stresstoleranz gemäß dem Durchmusterungsverfahren, welches im Beispiel 7 beschrieben ist, durchmustert, wobei gezeigt wird, dass transgene Expression Trockenheitstoleranz verleiht.
Beispiel 12
Konstruktion stresstoleranter Maispflanzen durch Überexpression der CC-1, CC-2 und CC-3-Gene (CC-2 und CC-3 sind Vergleichsbeispiele)
Die Konstrukte pBPSSY032, pBPSsc335 und pBPSLVM186 wurden verwendet, um Mais wie unten beschrieben zu transformieren.
Die Transformation von Mais (Zea Mays L.) wird mit dem Verfahren, welches von Ishida et al., 1996, Nature Biotech 14745–50 beschrieben ist, durchgeführt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welche „superbinäre" Vektoren tragen, co-kultiviert und transgene Pflanzen werden durch Organogense gewonnen. Dieses Verfahren stellt eine Transformationseffizienz zwischen 2,5% und 20% bereit. Die transgenen Pflanzen werden dann auf ihre verbesserte Toleranz gegenüber Trockenheit, Salz und/oder Kälte gemäß dem in Beispiel 7 beschriebenen Durchmusterungsverfahren durchmustert, wobei gezeigt wird, dass transgene Expression Stresstoleranz verleiht.
Beispiel 13
Konstruktion stresstoleranter Weizenpflanzen durch Überexpression der CC-1, CC-2 und CC-3-Gene (CC-2 und CC-3 sind Vergleichsbeispiele)
Die Konstrukte pBPSSY032, pBPSsc335 und pBPSLVM186 wurden verwendet, um Weizen wie unten beschrieben zu transformieren.
Die Transformation von Weizen wird mit dem Verfahren, welches von Ishida et al., 1996, Nature Biotech 14745–50 beschrieben ist, durchgeführt. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, welche „superbinäre" Vektoren tragen, co-kultiviert und transgene Pflanzen werden durch Organogense gewonnen. Dieses Verfahren stellt eine Transformationseffizienz zwischen 2,5% und 20% bereit. Die transgenen Pflanzen werden dann gemäß dem Durchmusterungsverfahren, welches in Beispiel 7 beschrieben ist, auf ihre verbesserte Stresstoleranz durchmustert, wobei gezeigt wird, dass transgene Expression Trockenheitstoleranz verleiht.
Beispiel 14
Identifizierung homologer und heterologer Gene
Gensequenzen können verwendet werden, um homologe oder heterologe Gene aus cDNA oder genomischen Bibliotheken zu identifizieren. Homologe Gene (z.B. Volllängen-cDNA-Klone) können durch Nukleinsäurehybridisierung unter Verwendung von beispielsweise cDNA-Bibliotheken isoliert werden. Abhängig von der Abundanz des Gens von Interesse werden 100.000 bis zu 1.000.000 rekombinante Bakteriophagen ausplattiert und auf Nylonmembranen übertragen. Nach Denaturierung mit Alkali wird die DNA auf der Membran immobilisiert, z.B. durch UV-Crosslinking. Die Hybridisierung wird bei Bedingungen von hoher Stringenz durchgeführt. Die Hybridisierung in wässriger Lösung und Waschen wird bei einer Ionenstärke von 1 M NaCl und einer Temperatur von 68°C durchgeführt. Die Hybridisierungssonden werden beispielsweise durch radioaktive (³²P) Nick-Transkriptionsmarkierung erzeugt (High Prime, Roche, Mannheim, Deutschland). Die Signale werden durch Autoradiographie detektiert.
Partiell homologe oder heterologe Gene, die zueinander in Bezug stehen, aber nicht identisch sind, können in einer zu dem oben beschriebenen Verfahren analogen Weise unter Verwendung von Hybridisierungs- und Waschbedingungen von niedriger Stringenz identifiziert werden. Für eine wässrige Hybridisierung wird die Ionenstärke normalerweise bei 1 M NaCl gehalten, während die Temperatur allmählich von 68 auf 42°C abgesenkt wird.
Die Isolierung von Gensequenzen mit Homologien (oder Sequenzidentität/-ähnlichkeit) in nur einer bestimmten Domäne (beispielsweise 10–20 Aminosäuren) kann durch Verwendung synthetischer radiomarkierter Oligonukleotidsonden durchgeführt werden. Radiomarkierte Oligonukleotide werden durch Phosphorilierung am 5'-Ende von zwei komplementären Oligonukleotiden mit T4-Polynukleotidkinase hergestellt. Die komplementären Oligonukleotide werde annealed und ligiert, um Concatemere zu bilden. Die doppelsträngigen Concatemere werden anschließend radiomarkiert, beispielsweise durch Nick-Transkription. Die Hybridisierung wird normalerweise unter Bedingungen von niedriger Stringenz unter Verwendung hoher Oligonukleotidkonzentrationen durchgeführt.
Oligonukleotid-Hybridisierungslösung:

6 × SSC
0,01 M Natriumphosphat
1 mM EDTA (pH 8)
0,5% SDS
100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA
0,1% fettfreie Trockenmilch

Während der Hybridisierung wird die Temperatur schrittweise auf 5–10°C unter die geschätzte Oligonukleotid-Tm oder bis auf Raumtemperatur abgesenkt, gefolgt von Wasch-Schritten und Autoradiographie. Waschen wird mit niedriger Stringenz durchgeführt, beispielsweise drei Wasch-Schritte unter Verwendung von 4 × SSC. Weitere Einzelheiten werden von Sambrook, J. et al., (1989), „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F. M. et al. (1994) „Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons, beschrieben.
Beispiel 15
Identifizierung homologer Gene durch Durchmustern von Expressionsbibliotheken mit Antikörpern
c-DNA-Klone können verwendet werden, um rekombinante Proteine herzustellen, beispielsweise in E. coli (z.B. Qiagen QIAexpress pQE system). Die rekombinanten Proteine werden anschließend normalerweise über Ni-NTA-Affinitätschromatographie (Qiagen) affinitätsgereinigt. Die rekombinante Proteine werden anschließend verwendet, um spezifische Antikörper herzustellen, beispielsweise unter Verwendung von Standardtechniken zur Kaninchenimmunisierung. Die Antikörper werden unter Verwendung einer Ni-NTA-Säule, die mit dem rekombinanten Antigen gesättigt ist, affinitätsgereinigt, wie es von Gu et al., 1994 BioTechniques 17: 257–262, beschrieben ist. Der Antikörper kann anschließend verwendet werden, um Expressions-cDNA-Bibliotheken zu durchmustern, um so homologe oder heterologe Gene durch immunologisches Durchmustern zu identifizieren (Sambrook, J. et al., (1989), „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F. M. et al. (1994) „Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons).
Beispiel 16
In vivo-Mutagenese
Eine in vivo-Mutagenese von Mikroorganismen kann durch eine Passage von Plasmid-(oder anderer Vektor)-DNA durch E. coli oder andere Mikroorganismen (z.B. Bacillus spp. oder Hefen wie beispielsweise Saccharomyces cerevisiae), welche in ihren Fähigkeiten, die Integrität ihrer genetischen Informationen aufrecht zu erhalten, beeinträchtigt sind, durchgeführt werden. Typische Mutator-Stämme tragen Mutationen in den Genen für das DNA-Reparatursystem (z.B. mutHLS, mutD, mutT, etc.; zur Referenz siehe Rupp, W. D. (996) DNA repair mechanisms, in: Escherichia coli und Salmonella, S. 2277–2294, ASM: Washington). Solche Stämme sind dem Fachmann gut bekannt. Die Verwendung solcher Stämme ist beispielsweise in Greener, A. und Callahan, M. (1994) Strategies 7: 32–34 erläutert. Der Transfer mutierter DNA-Moleküle in Pflanzen wird vorzugsweise nach Selektion und Austesten in Mikroorganismen durchgeführt. Transgene Pflanzen werden gemäß den verschiedenen Beispielen innerhalb der Erläuterung dieser Druckschrift erzeugt.
Beispiel 17
In vitro-Analyse der Funktion von Physcomitrella-Genen in transgenen Organismen
Die Bestimmung von Aktivitäten und der kinetischen Parameter von Enzymen ist im Fachbereich etabliert. Versuche zur Bestimmung der Aktivität eines beliebigen gegebenen veränderten Enzyms müssen auf die spezifische Aktivität des Wildtyp-Enzyms zugeschnitten sein, was vollständig im Rahmen der Fähigkeiten eines Fachmanns liegt. Überblicke über Enzyme im Allgemeinen, sowie spezielle Einzelheiten, welche Struktur, Kinetiken, Prinzipien, Verfahren, Anwendungen und Beispiele für die Bestimmung vieler Enzymaktivitäten betreffen, sind beispielsweise in den folgenden Referenzen zu finden: Dixon, M. und Webb, E. C., (1979) Enzymes. Longmans: London; Fersht, (1985) Enzyme Structure and Mechanism. Freeman: New York; Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman: San Francisco; Price, N. C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P. D.. Hrsg. (1983) The Enyzmes, Dritte Ausgabe, Academic Press: New York; Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetik, Zweite Ausgabe, VCH: Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H. U., Bergmeyer, J., Graßl, M., Hrsg. (1983–1986) Methods of Enzymatic Analysis, Dritte Ausgabe, Band I–XII, Verlag Chemie: Weinheim; und Ullmanns Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) Band A9, Enzymes. VCH: Weinheim, S. 352–363.
Die Aktivität von Proteinen, welche an DNA binden, kann durch einige gängige Verfahren, beispielsweise DNA-Band-Shiftassays (auch als Gelretardationsassays bezeichnet) gemessen werden. Die Wirkung solcher Proteine auf die Expression anderer Moleküle kann unter Verwendung von Reportergenassays gemessen werden (beispielsweise wie in Kolmar, H. et al. (1995) EMBO J. 14: 3895–3904 und den darin zitierten Referenzen beschrieben). Reportergen-Testsysteme sind gut bekannt und sowohl für Anwendungen in prokaryotischen als auch in eukaryotischen Zellen unter Verwendung von Enzymen, wie beispielsweise β-Galaktosidase, grünfluoreszierendem Protein und einigen anderen, gängig.
Die Bestimmung der Aktivität von membrangebundenen Transportproteinen kann gemäß den Techniken durchgeführt werden, wie sie beispielsweise in Gennis, R. B. Pores, Channels and Transporters in Biomembranes, Molecular Structure and Function, S. 85–137, 199–234 und 270–322, Springer: Heidelberg (1989) beschrieben sind.
Beispiel 18
Reinigung des gewünschten Produkts aus transformierten Organismen
Die Gewinnung des gewünschten Produkts aus Pflanzenmaterial (d.h. Physcomitrella patens oder Arabidopsis thaliana), Pilzen, Algen, Ziliaten, C. glutamicum-Zellen oder anderen mit den hierin beschriebenen Nukleinsäuren transformierten bakteriellen Zellen, oder aus dem Überstand der oben beschriebenen Kulturen, kann durch verschiedene Verfahren, die im Fachbereich bekannt sind, durchgeführt werden. Wenn das gewünschte Produkt nicht von den Zellen sekretiert wird, kann es aus der Kultur durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit geerntet werden, die Zellen können durch Standardtechniken, wie beispielsweise mechanische Kräfte oder Sonifizierung, lysiert werden. Pflanzenorgane können von anderem Gewebe oder Organen mechanisch abgetrennt werden. Nach der Homogenisierung werden Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt und die Überstandsfraktion, welche die löslichen Proteine enthält, wird zur weiteren Reinigung der gewünschten Verbindung zurückbehalten. Wenn das Produkt von den gewünschten Zellen sekretiert wird, können die Zellen aus der Kultur durch Zentrifugation bei niedriger Geschwindigkeit entfernt werden und die Überstandsfraktion wird zur weiteren Reinigung zurückbehalten.
Die Überstandsfraktion aus beiden Reinigungsverfahren wird einem Chromatographieschritt an einem geeigneten Harz unterzogen, wobei das gewünschte Molekül entweder auf dem Chromatographieharz zurückgehalten wird, während viele der Verunreinigungen in der Probe nicht zurückgehalten werden, oder wobei die Verunreinigungen durch das Harz zurückgehalten werden, während die Probe nicht zurückgehalten wird. Falls notwendig können solche Chromatographieschritte unter Verwendung derselben oder verschiedener Chromatographieharze wiederholt werden. Der Fachmann ist in der Wahl geeigneter Chromatographieharze und ihrer möglichst effektiven Anwendung für ein bestimmtes, aufzureinigendes Molekül erfahren. Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultra-Filtration konzentriert und bei einer Temperatur, bei der die Stabilität des Produkts am größten ist, gelagert werden.
Es gibt eine lange Reihe von Reinigungsverfahren, die im Fachbereich bekannt sind und das vorangehende Reinigungsverfahren ist nicht einschränkend gedacht. Solche Reinigungstechniken werden beispielsweise in Bailey, J. E. & Ollis, D. F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Hill: New York (1986) beschrieben. Zusätzlich kann die Identität und Reinheit der isolierten Verbindungen durch Standardtechniken aus dem Fachbereich festgestellt werden. Diese schließen Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC), spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschicht-Chromatographie, NIRS, enzymatischen Assay oder mikrobiologische Verfahren ein. Solche Analyseverfahren werden besprochen in: Patek et al., 1994 Appl. Environ. Microbiol. 60: 133–140; Malakhova et al., 1996 Biotekhnologiya 11: 27–32; und Schmidt, et al., 1998 Bioprocess Engineer. 19: 67–70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, (1996) Band A27, VCH: Weinheim, S. 89–90, S. 521–540, S. 540–547, S. 559–566, S. 575–581 und S. 581–587; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley and Sons; Fallon, A. et al., Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Band 17.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Transgene Pflanzenzelle, die mit einer für ein stressgekoppeltes Zellzyklusprotein (CCSRP) codierenden Nukleinsäure transformiert ist, worin das CCSRP ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus CC-1 wie in SEQ ID NO: 7 definiert und einem Polypeptid mit einer wenigstens 80%-igen Sequenzidentität zu SEQ ID Nr. 7 über die Gesamtlänge, und worin die Expression der Nukleinsäure in der Pflanzenzelle zu einer erhöhten Toleranz der Pflanzenzelle gegenüber Trockenheits- und/oder Froststress im Vergleich zu einer Wildtyp-Varietät der Pflanzenzelle führt.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, worin das CCSRP wie in SEQ ID NO: 7 definiert ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, worin die für das CCSRP codierende Nukleinsäure wie in SEQ ID NO: 4 definiert ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, worin die für das CCSRP codierende Nukleinsäure wenigstens 80–90% Sequenzidentität zu der Polynukleotidsequenz von SEQ ID NO: 4 über ihre gesamte codierende Region aufweist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, worin die Pflanze monokotyl ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, worin die Pflanze dikotyl ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, worin die Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuss, Baumwolle, Raps, Canola, Maniok, Pfeffer, Sonnenblume, Tagetes, Nachtschattengewächsen, Kartoffel, Tabak, Aubergine, Tomate, Vicia-Spezies, Erbse, Alfalfa, Kaffee, Kakao, Tee, Salix-Spezies, Ölpalme, Kokosnuss, perennierendem Gras und Futterpflanzen.
Transgene Pflanze, umfassend eine Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1–7.
Saatgut, erzeugt von einer transgenen Pflanze, die eine Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1–7 umfasst, worin das Saatgut reinrassig für eine gesteigerte Toleranz gegenüber Trockenheits- und/oder Froststress im Vergleich zu einer Wildtyp-Varietät der Pflanzenzelle ist.
Verwendung einer transgenen Pflanze nach Anspruch 8 oder eines Saatguts nach Anspruch 9 zur Herstellung eines landwirtschaftlichen Erzeugnisses.
Isoliertes stressgekoppeltes Zellzyklusprotein (CCSRP), worin das CCSRP ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Zellzyklus-1 Protein (CC-1) wie in Seq ID NO: 7 definiert und einem Polypeptid mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 7 über seine Gesamtlänge, und worin die Expression der Nukleinsäure in einer Pflanze zu einer Steigerung der Toleranz der Pflanze gegenüber Trockenheits- oder Froststress im Vergleich zu einer Wildtyp-Varietät der Pflanze führt.
CCSRP nach Anspruch 11, worin das CCSRP wie in SEQ ID NO: 7 definiert ist.
Isolierte, für ein stressgekoppeltes Zellzyklusprotein (CCSRP) codierende Nukleinsäure, worin die für das CCSRP codierende Nukleinsäure für ein CCSRP codiert, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Zellzyklus-1 Protein (CC-1) wie in SEQ ID NO: 7 definiert und einem Polypeptid mit wenigstens 90% Sequenzidentität zu SEQ ID NO: 7 über seine Gesamtlänge.
CCSRP-codierende Nukleinsäure nach Anspruch 13, worin die CCSRP-codierende Nukleinsäure wie in SEQ ID NO: 4 definiert ist.
CCSRP-codierende Nukleinsäure nach Anspruch 13, worin die CCSRP-codierende Nukleinsäure wenigstens 80–90% Sequenzidentität zu der Polynukleotidsequenz von SEQ ID NO: 4 über ihre gesamte codierende Region aufweist.
Isolierter rekombinanter Expressionsvektor, umfassend eine Nukleinsäure nach Anspruch 13, 14 oder 15, worin die Expression der Nukleinsäure in der Pflanze zu einer erhöhten Toleranz der Pflanze gegenüber Trockenheits- und/oder Froststress im Vergleich zu einer Wildtyp-Varietät der Pflanze führt.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, welche eine für ein stressgekoppeltes Zellzyklusprotein (CCSRP) codierende Nukleinsäure enthält, worin die Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle zu einer erhöhten Toleranz der Wirtszelle gegenüber Trockenheits- und/oder Froststress im Vergleich zu einer Wildtyp-Varietät der Pflanze führt, umfassend a Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor, der die Nukleinsäure umfasst, und b Erzeugen einer transgenen Pflanze mit erhöhter Toleranz gegenüber Trockenheits- und/oder Froststress im Vergleich zu einer Wildtyp-Varietät der Pflanze aus der Pflanzenzelle worin das CCSRP ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Zellzyklus-1 Protein (CC-1) wie in Seq ID NO: 7 definiert und einem Polypeptid mit wenigstens 80% Sequenzidentität zu dem Polypeptid von SEQ ID NO: 7 über seine Gesamtlänge.
Verfahren nach Anspruch 17, worin das CCSRP wie in SEQ ID NO: 7 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 17, worin die CCSRP-codierende Nukleinsäure wie in SEQ ID NO: 4 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 17, worin die CCSRP-codierende Nukleinsäure wenigstens 80–90% Sequenzidentität zu der Polynukleotidsequenz von SEQ ID NO: 4 über ihre gesamte codierende Region aufweist.
Verfahren zur Modifizierung der Stresstoleranz einer Pflanze, umfassend Modifizieren der Expression eines stressgekoppelten Zellzyklusproteins (CCSRP) in der Pflanze, worin das CCSRP ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Zellzyklus-1 Protein (CC-1) wie in Seq ID NO: 7 definiert und einem Polypeptid mit wenigstens 80% Sequenzidentität zu dem Polypeptid von SEQ ID NO: 7 über seine Gesamtlänge, und worin die Modifizierung der Expression der CCSRP-Nukleinsäure in der Pflanze zu einer modifizierten Toleranz der Pflanze gegenüber Trockenheits- und/oder Froststress im Vergleich zu einer Wildtyp-Varietät der Pflanze führt.
Verfahren nach Anspruch 21, worin das CCSRP wie in SEQ ID NO: 7 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 21, worin die CCSRP-codierende Nukleinsäure wie in SEQ ID NO: 4 definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 21, worin die CCSRP-codierende Nukleinsäure wenigstens 80–90% Sequenzidentität zu einer Polynukleotidsequenz von SEQ ID NO: 4 über ihre gesamte codierende Region aufweist.
Verfahren nach Anspruch 21, worin die Stresstoleranz verringert wird.
Verfahren nach Anspruch 21, worin die Pflanze nicht transgen ist.
Verfahren nach Anspruch 21, worin die Pflanze transgen ist.
Verfahren nach Anspruch 27, worin die Pflanze mit einem Promotor transformiert wird, der die Expression des CCSRP steuert.
Verfahren nach Anspruch 28, worin der Promotor gewebespezifisch ist.
Verfahren nach Anspruch 28, worin der Promotor entwicklungsreguliert ist.