DE60131772T2

DE60131772T2 - Stress-gekoppelte protein-phosphatase und ihre verwendung in pflanzen

Info

Publication number: DE60131772T2
Application number: DE60131772T
Authority: DE
Inventors: e Silva Apex COSTA; Hans J. Research Triangle Park BOHNERT; Manabu Cary ISHITANI; Nocha Cary VAN THIELEN; Ruoying Apex CHEN
Original assignee: BASF Plant Science GmbH
Current assignee: BASF Plant Science GmbH
Priority date: 2000-04-07
Filing date: 2001-04-06
Publication date: 2008-11-20
Anticipated expiration: 2021-04-07
Also published as: EP2169069A3; US6720477B2; EP1760146B1; EP1760146A3; EP1881073A2; AU2002243190A1; US7161063B2; DE60123079D1; US20080189806A1; EP1795600A3; EP1760145A3; DE60124880D1; CA2405703A1; EP1760146A2; EP1294912A2; ATE355383T1; US20040107463A1; US7482510B2; US6677504B2; US20020069432A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine codieren, die mit Reaktionen auf abiotischen Streß und mit der Toleranz von abiotischem Streß bei Pflanzen assoziiert sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine codieren, die Pflanzen Trockenheits- und/oder Temperaturtoleranz vermitteln.
Allgemeiner Stand der Technik
Abiotischer Umweltstreß wie Trockenheitsstreß, Salzstreß, Hitzestreß und Kältestreß sind wichtige Faktoren, die das pflanzliche Wachstum und die pflanzliche Produktivität einschränken. Ernteverluste und Ertragsverluste von Hauptkulturarten wie Reis, Mais und Weizen, die durch diese Arten von Streß verursacht werden, stellen einen wesentlichen ökonomischen und politischen Faktor dar und führen in vielen unterentwickelten Ländern zu Nahrungsmittelknappheit.
Typischerweise werden Pflanzen während ihres Lebenszyklus mit Bedingungen konfrontiert, bei denen der Wassergehalt der Umwelt reduziert ist. Die meisten Pflanzen haben Strategien entwickelt, um sich gegen diese Austrocknungsbedingungen zu schützen. Sind jedoch Schwere und Dauer der Trockenheitsbedingungen zu ausgeprägt, so hat dies weithin Auswirkungen auf die Pflanzenentwicklung, das Wachstum und den Ertrag der meisten Kulturpflanzen. Außerdem sind die meisten Kulturpflanzen gegenüber höheren Salzkonzentrationen im Boden sehr empfindlich. Ein ständiges Ausgesetztsein gegenüber Trockenheit und hohem Salzgehalt führt zu wesentlichen Änderungen im Metabolismus der Pflanze. Diese starken Stoffwechselveränderungen führen schließlich und endlich zum Zelltod und daher zu Ertragsverlusten.
Die Entwicklung von streßtoleranten Pflanzen ist eine Strategie, die eine Möglichkeit bietet, zumindest einige dieser Probleme zu lösen oder zu mildern. Klassische Strategien der Pflanzenzüchtung zur Entwicklung von neuen Pflanzenlinien mit Resistenz (Toleranz) gegenüber solchen Arten von Streß sind jedoch relativ langsam und erfordern spezifische resistente Linien, die mit der gewünschten Linie gekreuzt werden. Die Tatsache, daß nur beschränkt genetische Quellen für Streßtoleranz vorhanden sind, sowie eine Inkompatibilität bei der Kreuzung zwischen weit entfernt verwandten Pflanzenarten stellen wesentliche Probleme der traditionellen Züchtung dar. Außerdem sind die. Vorgänge in der Zelle, die zu Trockenheits-, Kälte- und Salztoleranz in trockenheits- und/oder salztoleranten Modellpflanzen führen, kompliziert und beinhalten vielfältige Mechanismen der Zelladaptation und zahlreiche Stoffwechselwege. Die Tatsache, daß Streßtoleranz aus mehreren Komponenten besteht, hat nicht nur dazu geführt, daß die Züchtung auf Toleranz größtenteils ein Fehlschlag war, sondern hat auch die Möglichkeit, gentechnische Arbeiten an Streßtoleranten Pflanzen mittels biotechnologischer Methoden durchzuführen, eingeschränkt.
Es ist gut bekannt, daß die reversible Phosphorylierung von Proteinen viele Vorgänge in Zellen von Pflanzen und Tieren beeinflußt. Der Phosphorylierungszustand von Proteinen wird durch die entgegengesetzten Wirkungen von Proteinkinasen und Proteinphosphatasen reguliert. Die Phosphorylierung von eukaryontischen Proteinen erfolgt in erster Linie an Serin- und Threoninresten und in geringerem Ausmaß an Tyrosinresten. Bei Tieren spielt die Phosphorylierung von Proteinen gut bekannte Rollen bei unterschiedlichen Vorgängen in der Zelle wie dem Glykogenstoffwechsel, der Kontrolle des Zellcyclus und der Weiterleitung von Signalen (Smith, R. D. und Walker, J. C., 1996, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 47: 101–125).
Über Proteinphosphataseaktivitäten wurde in den meisten Kompartmenten der Pflanzenzelle berichtet, darunter in den Mitochondrien, im Chloroplasten, in den Zellkernen und im Cytosol, und sie sind mit verschiedenen Membran- und Teilchenfraktionen assoziiert. Manche Proteinphosphatasen sind schlecht charakterisiert und können neue Enzyme, die nur bei Pflanzen vorkommen, darstellen. Andere wiederum weisen biochemische Eigenschaften auf, die eine große Ähnlichkeit mit gut bekannten Säugetierproteinphosphatasen aufweisen, wie cytosolische Protein-Serin/Threoninphosphatasen (MacKintosh C. und Cohen P. 1989 Biochem. J. 262: 335–339). Zwei solche pflanzlichen Serin/Threoninphosphatasen, deren Funktion ähnlich den Säugetier-Protein-Serin/Threoninphosphatasen des Typs 1 (PP1) und des Typs 2 (PP2) sind, sind identifiziert worden. Aus biochemischen und genetischen Untersuchungen an Pflanzen geht hervor, daß eine 221- und/oder PP2-Aktivität an der Weiterleitung von Signalen, der Hormonregulation, der Zellteilung und der Kontrolle des Kohlenstoff- und Stickstoffmetabolismus beteiligt sind (Smith, R. D. und Walker, J. C., 1996, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant. Mol. Biol. 47: 101–125).
Aus Versuchen geht hervor, daß Proteinphosphatasen an der pflanzlichen Streßsignalkaskade beteiligt sind, insbesondere an der Streßwahrnehmung und Signaltransduktion, die mit physiologischen Adaptations mechanismen in Pflanzen im Zusammenhang stehen. So wurde zum Beispiel gezeigt, daß die Proteinphosphatase 2C (PP2C) an Streßreaktionen in Pflanzen beteiligt ist (Sheen, J 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 975–980). Außerdem wurde gezeigt, daß die PP2B-Phosphatase Calcineurin (CaN) bei der Hefe eine zentrale Komponente eines Ca²⁺-abhängigen Signalübertragungswegs bildet, der Na⁺, Li^– und Mn²⁺-Toleranz bei Saccharomyces cerecisiae vermittelt (Cunningham, K. W. und Fink, G. R. 1996 Mol. Cell. Biol. 16: 2226–2237). Eine CaN-Funktion besteht darin, die Na⁺-Akkumulation innerhalb der Zelle zu begrenzen, und zwar dadurch, daß Vorgänge reguliert werden, die das Eintreten dieses Kations durch die Plasmamembran beschränken und sein Austreten fördern. CaN nimmt auch an der Ca²⁺-Homöostase des Cytosols teil, und zwar dadurch, daß es eine positive Regulationswirkung auf den Golgi-Apparat und Ionenpumpen des 2-Typs, die in der Vakuolenmembran lokalisiert sind, sowie eine negative Kontrolle eines H⁺/Ca²⁺-Austauschers in der Vakuole ausübt. Interessanterweise vermittelt die Überexpression von Hefe-CaN eine Salztoleranz bei Pflanzen, was stark darauf hindeutet, daß die Modulation von Streßsignalübertragungswegen mittels Expression einer aktivierten Proteinphosphatase die pflanzliche Streßtoleranz beträchtlich verbessert (Pardo, J. M. et al. 1998 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 9681–9686).
Obwohl einige Gene, die an Streßreaktionen in Pflanzen beteiligt sind, charakterisiert worden sind, sind die Charakterisierung und Klonierung von pflanzlichen Genen, die eine Streßtoleranz vermitteln, nach wie vor größtenteils unvollständig und bruchstückhaft. So geht zum Beispiel aus gewissen Untersuchungen hervor, daß bei manchen Pflanzen ein Trockenheits- und Salzstreß auf additiven Geneffekten beruhen könnte, was anderen Forschungen widerspricht, aus denen hervorgeht, daß spezifische Gene unter Osmosestreßbedingungen in vegetativem Gewebe von Pflanzen transkriptionell aktiviert werden. Obwohl allgemein angenommen wird, daß streßinduzierte Proteine eine Rolle bei der Toleranz spielen, fehlt nach wie vor ein unmittelbarer Nachweis, und die Funktionen von vielen Streßreaktionsgenen sind unbekannt.
Andreeva et al., 1999, beschreibt den Nachweis von vier Isoformen der Proteinphosphatase 2A bei Physcomitrella patens. Der Nachweis wurde mittels Polymerase-Kettenreaktion an genomischer DNA und cDNA von Physcomitrella patens durchgeführt. Die Ergebnisse erbringen die ersten Strukturdaten zu den Protein-SER/Thr-Phophatasen bei niederen Landpflanzen.
XP 2272735 beschreibt eine mRNA, die zu 77% mit der PP2A-4-cDNA identisch ist.
WO 00/36121 beschreibt Proteinphosphatasen 2A, insbesondere deren regulatorische Untereinheiten A oder B, isolierte Polynukleotide umfassend eine Nukleotidsequenz codierend für die Proteinphosphatase 2A sowie ein Verfahren zum Auswählen eines isolierten Polynukleotids, das den Gehalt einer Proteinphosphatase 2A beeinflußt.
Es besteht daher ein Bedarf daran, Gene zu identifizieren, die in streßtoleranten Pflanzen exprimiert werden und die fähig sind, ihrer Wirtspflanze sowie anderen Pflanzenarten eine Streßresistenz zu verleihen. Neu erzeugte streßtolerante Pflanzen werden viele Vorteile aufweisen, wie die Erweiterung des Spektrums an Kulturpflanzen, die angebaut werden können, zum Beispiel durch Erniedrigung des Wasserbedarfs einer Pflanzenart.
DARSTELLUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird teilweise dem Bedarf gerecht, neue einzigartige Phophatasen zu identifizieren, die fähig sind, bei ihrer Überexpression Pflanzen Streßtoleranz zu verleihen. Die vorliegende Erfindung sieht eine transgene Pflanzenzelle vor, die mit einer für ein PHosphatase Stress-Related Protein (PHSRP) codierenden Nukleinsäure transformiert ist, wobei die Expression der Nukleinsäuresequenz in der Pflanzenzelle zu einer im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanzenzelle erhöhten Toleranz gegenüber Trockenheits- und/oder Temperaturstreß führt, wobei das PHSRP eine PP2A-4 gemäß SEQ ID NO:13 und Sequenzen mit mindestens 96% Homologie zu der gesamten Aminosäuresequenz in SEQ ID NO:13 ist. Im vorliegenden Text wird also die Proteinphosphatase Proteinphosphatase 2A-4 (PP2A-4) aus Physcomitrella patens beschrieben.
Die Erfindung stellt in manchen Ausführungsformen bereit, daß das PHSRP und die codierende Nukleinsäure in Vertretern der Gattung Physcomitrella auftreten. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform stammen die Nukleinsäure und das Protein von einer Physcomitrella patens. Die Erfindung sieht vor, daß der Umweltstreß Trockenheit oder Temperatur sein kann.
Die Erfindung stellt weiterhin einen Samen bereit, der von einer transgenen Pflanze erzeugt wird, welche mit einer für PHSRP codierenden Nukleinsäure transformiert ist, wobei die Pflanze für eine im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanze erhöhten Toleranz gegenüber Trockenheits- und/oder Temperaturstreß reinerbig ist. Die Erfindung stellt weiterhin einen Samen bereit, der von einer transgenen Pflanze erzeugt wird, die ein PHSRP exprimiert, wobei die Pflanze für eine im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanze erhöhten Toleranz gegenüber Trockenheits- und/oder Temperaturstreß reinerbig ist.
Die Erfindung stellt weiterhin die Verwendung der im folgenden beschriebenen transgenen Pflanzen, Pflanzenteile oder Samen zur Erzeugung eines Agrarprodukts bereit. Die Erfindung stellt weiterhin ein wie oben beschriebenes PHSRP bereit. Die Erfindung stellt weiterhin eine isolierte für ein PHSRP codierende Nukleinsäure bereit, wobei die für ein PHSRP codierende Nukleinsäure für ein wie unten beschriebenes PHSRP codiert.
Die Erfindung stellt weiterhin einen isolierten rekombinanten Expressionsvektor bereit, der eine für ein PHSRP codierende Nukleinsäure wie unten beschrieben umfaßt, wobei die Expression des Vektors in einer Wirtszelle zu einer im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Wirtszelle erhöhten Toleranz gegenüber Trockenheits- und/oder Temperaturstreß führt. Die Erfindung stellt weiterhin eine Wirtszelle, die den Vektor enthält, sowie eine Pflanze, die die Wirtszelle enthält, bereit.
Die Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit einer für ein PHSRP codierenden Nukleinsäure bereit, wobei Expression der Nukleinsäure in der Pflanze zu einer im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanze erhöhten Toleranz gegenüber Trockenheits- und/oder Temperaturstreß führt, bei dem man: (a) eine Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor, der eine für ein PHSRP codierende Nukleinsäure enthält, transformiert und (b) aus der Pflanzenzelle eine transgene Pflanze mit einer im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanze erhöhten Toleranz gegenüber Trockenheits- und/oder Temperatur streß erzeugt, wobei das PHSRP und die für das PHSRP codierende Nukleinsäure in bevorzugten Ausführungsformen wie unten beschrieben sind.
Die vorliegende Anmeldung stellt weiterhin ein Verfahren zum Identifizieren eines neuen PHSRPs bereit, bei dem man (a) eine spezifische Antikörperreaktion gegen ein PHSRP oder ein Fragment davon wie oben beschrieben erzeugt; (b) mutmaßliches PHSRP-Material mit dem Antikörper durchmustert, wobei eine spezifische Bindung des Antikörpers an das Material das Vorhandensein eines möglicherweise neuen PHSRPs anzeigt; sowie (c) ein im Vergleich zu bekannten PHSRPs neues PHSRP in dem gebundenen Material identifiziert. Zum Identifizieren von neuen PHSRP-Nukleinsäuren kann jedoch auch die Hybridisierung mit Nukleinsäuresonden wie unten beschrieben eingesetzt werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch Verfahren zum Modifizieren der. Trockenheits- und/oder Temperaturstreßtoleranz einer Pflanze bereit, bei dem man die Expression eines PHSRP in der Pflanze modifiziert, wobei das PHSRP wie unten beschrieben ist. Die Erfindung sieht vor, daß dieses Verfahren so durchgeführt werden kann, daß die Streßtoleranz entweder erhöht oder erniedrigt wird. Vorzugsweise wird die Streßtoleranz in einer Pflanze dadurch erhöht, daß man die Expression eines PHSRPs erhöht.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die partiale cDNA-Sequenz von PP2A-4 (SEQ ID NO: 3) aus Physcomitrella patens.
2 zeigt die Vollängen-cDNA-Sequenz von PP2A-4 (SEQ ID NO: 8) aus Physcomitrella patens.
3 zeigt die abgeleiteten Aminosäuresequenzen von PP2A-4 (SEQ ID NO: 13) aus Physcomitrella patens.
4 zeigt ein Diagramm des pflanzlichen Expressionsvektors pBPSsc022, der den Superpromoter, der die Expression von SEQ ID NO: 8 ("Gewünschtes Gen") vorantreibt, enthält. Die Bestandteile sind: NPTII-Kanamycinresistenzgen (Bevan M, Nucleic Acids Res. 26: 8711–21, 1984), AtAct2-i-Promoter (An YO et al., Plant J 10: 1007–121 1996), OCS3-Terminator (During K, Transgenic Res. 3: 138–140, 1994), NOSpA-Terminator (Jefferson et al., EMBO J 6: 3901–7 1987).
5 zeigt die Ergebnisse eines Trockenheitsstreßtests mit überexprimierenden PpPP2A-4 transgenen Pflanzen und Wildtyp-Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien weisen einen toleranten Phänotyp auf. Einzelne Transformantenlinien sind dargestellt.
6 zeigt die Ergebnisse eines Gefrierstreßtests mit überexprimierenden PpPP2A-4 transgenen Pflanzen und Wildtyp-Arabidopsis-Linien. Die transgenen Linien weisen einen toleranten Phänotyp auf. Einzelne Transformantenlinien sind dargestellt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird durch Bezugnahme auf die folgende detaillierte Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung und die beiliegenden Beispiele besser verstanden werden. Sie ist auch dahingehend zu verstehen, daß die hier verwendete Terminologie nur der Beschreibung von bestimmten Ausführungsformen dient und nicht einschränkend sein soll. Insbesondere schränkt die Bezeichnung der Aminosäuresequenzen als Protein "Phosphatase Stress- Related Proteins" (PHSRPs) keineswegs die Funktionalität dieser Sequenzen ein.
Die vorliegende Erfindung sieht eine transgene Pflanzenzelle vor, die mit einer für ein PHSRP codierenden Nukleinsäure, bei der es sich um die für Proteinphosphatase 2A-4, codierende Nukleinsäure handelt, transformiert ist, wobei die Expression der Nukleinsäuresequenz in der Pflanzenzelle zu einer im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanzenzelle erhöhten Toleranz gegenüber Trockenheits- und/oder Temperaturstreß führt, wobei das PHSRP eine PP2A-4 gemäß SEQ ID NO: 13 und Sequenzen mit mindestens 96% Homologie zu der gesamten Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 13 ist. Die Erfindung sieht weiterhin transgene Pflanzenteile und transgene Pflanzen, die die hier beschriebenen Pflanzenzellen enthalten, vor. Ebenso vorgesehen ist ein Pflanzensamen, der von einer transgenen Pflanze erzeugt wird, welche mit einer für ein PHSRP codierenden Nukleinsäure transformiert ist, wobei der Samen die für das PHSRP codierende Nukleinsäure enthält, und wobei die Pflanze bezüglich einer im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanze erhöhten Toleranz gegenüber Trockenheits- und/oder Temperaturstreß reinerbig ist. Die Erfindung sieht weiterhin einen Samen vor, der von einer transgenen Pflanze, die ein PHSRP exprimiert, produziert wird, wobei der Samen das PHSRP enthält und wobei die Pflanze bezüglich einer im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanze erhöhten Toleranz gegenüber Trockenheits- und/oder Temperaturstreß reinerbig ist. Die Erfindung sieht auch die Verwendung von einer der oben oder unten beschriebenen transgenen Pflanzen, Pflanzenteile und Pflanzensamen für die Erzeugung eines Agrarprodukts vor.
Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff "Sorte" auf eine Gruppe von Pflanzen innerhalb einer Art, denen gleichbleibende Eigenschaften gemeinsam sind, die sie von der typischen Form und von anderen möglichen Sorten innerhalb dieser Art unterscheiden. Eine Sorte weist zwar mindestens ein spezifisches Merkmal auf, ist jedoch auch durch eine gewisse Variation zwischen Einzelorganismen innerhalb der Sorte gekennzeichnet, die in erster Linie auf der den Mendelschen Regeln gehorchenden Aufspaltung von Merkmalen unter der Nachkommenschaft von Folgegenerationen beruht. Eine Sorte wird für ein bestimmtes Merkmal dann als "reinerbig" betrachtet, wenn es genetisch für dieses Merkmal so homozygot ist, daß bei Selbstbestäubung der reinerbigen Sorte keine wesentliche unabhängige Abspaltung des Merkmals unter der Nachkommenschaft beobachtet wird. In der vorliegenden Erfindung beruht das Merkmal auf der transgenen Expression von einer oder mehreren DNA-Sequenz(en), die in. eine Pflanzensorte eingeführt wird/werden.
Die vorliegende Erfindung beschreibt zum ersten Mal, daß sich das Physcomitrella patens PHSRP PP2A-4 zum Erhöhen der Toleranz einer Pflanze gegenüber Trockenheits- und/oder Temperaturstreß eignet. Das PHSRP PP2A-4 ist zu der katalytischen Untereinheit der Proteinphosphatase 2A homolog, wie dies in Tabelle 2 dargestellt ist. Demnach beinhaltet die vorliegende Erfindung eine transgene Pflanzenzelle, die mit einer für ein PHSRP codierenden Nukleinsäure transformiert ist, wobei die Expression der Nukleinsäuresequenz in der Pflanzenzelle zu einer im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanzenzelle erhöhten Toleranz gegenüber Trockenheits- und/oder Temperaturstreß führt, und wobei das PHSRP ein Proteinphosphatase-2A-Protein oder ein Homolog oder ein Ortholog davon ist.
Der Begriff "Trockenheits- und/oder Temperaturstreß" bezieht sich im vorliegenden Zusammenhang auf jegliche suboptimale Wachstumsbedingung und beinhaltet suboptimale Bedingungen, die mit Trockenheit, Temperatur oder Kombinationen davon assoziiert sind, ist jedoch nicht darauf beschränkt. In bevorzugten Ausführungsformen kann der Trockenheitsstreß niedriger Wassergehalt und der Temperaturstreß niedrige Temperatur sein. Im Zusammenhang mit der Beschreibung und in den Ansprüchen soll auch "ein/es" ein/e/es oder mehr bedeuten, je nach dem Zusammenhang, in dem es verwendet wird. So bedeutet zum Beispiel "eine Zelle", daß mindestens eine Zelle eingesetzt werden kann.
Die Erfindung beschreibt weiterhin ein isoliertes PHSRP. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das PHSRP aus der Pflanzengattung Physcomitrella isoliert. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform stammt das PHSRP von einer Physcomitrella patens (P. patens)-Pflanze. Die vorliegende Erfindung beschreibt zum ersten Mal das vorhergesagte P. patens-Protein PP2A-4 (SEQ ID NO: 13), das zu der Proteinphosphatase 2A homolog ist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform stammt das PHSRP aus der Gruppe bestehend aus PP2A-4 (SEQ ID NO: 13) und dessen Homologen und Orthologen. Homologe und Orthologe von Aminosäuresequenzen sind unten definiert.
Das PHRSP wird vorzugsweise mittels DNA-Rekombinationstechniken hergestellt. So wird zum Beispiel ein Nukleinsäuremolekül, das für das Protein codiert, in einen Expressionsvektor (wie unten beschrieben) kloniert, der Expressionsvektor wird in eine Wirtszelle (wie unten beschrieben) eingeführt und das PHSRP wird in der Wirtszelle exprimiert. Das PHSRP kann dann aus den Zellen mittels eines entsprechenden Aufreinigungsprotokolls, bei dem Standardtechniken der Proteinaufreinigung eingesetzt werden, isoliert werden. Als Alternative zu der rekombinanten Expression kann ein PHSRP-Polypeptid oder -Peptid chemisch mittels Standardtechniken der Peptidsynthese synthetisiert werden. Weiterhin kann natives PHSRP aus Zellen (z. B. Physcomitrella patens) isoliert werden, zum Beispiel mit einem Anti-PHSRP-Antikörper, der nach Standardtechniken mit einem PHSRP oder einem Fragment davon erzeugt werden kann.
Zusätzlich zu dem isolierten PHSRP sieht die Erfindung eine für ein isoliertes PHSRP codierende Nukleinsäure vor. Im vorliegenden Zusammenhang sollen die Begriffe "Nukleinsäure" und "Nukleinsäuremolekül" DNA-Moleküle (z. B. cDNA oder genomische DNA) und RNA-Moleküle (z. B. mRNA) sowie Analoge der DNA oder RNA, die mittels Nukleotidanalogen erzeugt wurden, beinhalten. Dieser Begriff umfaßt auch untranslatierte Sequenz, die sich sowohl am 3'- als auch am 5'-Ende der Codierregion des Gens befindet: mindestens ungefähr 1000 Nukleotide Sequenz stromaufwärts von 5'-Ende der Codierregion und mindestes ungefähr 200 Nukleotide Sequenz stromabwärts vom 3'-Ende der Codierregion des Gens. Das Nukleinsäuremolekül kann einzelsträngig oder doppelsträngig sein, ist jedoch vorzugsweise doppelsträngige DNA.
Ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül ist ein Nukleinsäuremolekül, das von anderen Nukleinsäuremolekülen, die in dem natürlichen Ausgangsmaterial der Nukleinsäure vorliegen, im wesentlichen getrennt ist. Vorzugsweise ist eine "isolierte" Nukleinsäure frei von einigen der Sequenzen, die die Nukleinsäure in der genomischen DNA des Organismus, von dem sich die Nukleinsäure ableitet, auf natürliche Weise flankieren (d. h. Sequenzen, die am 5'- und am 3'-Ende der Nukleinsäure liegen). So kann zum Beispiel in verschiedenen Ausführungsformen das isolierte PHSRP- Nukleinsäuremolekül weniger als ungefähr 5 kB, 4 kB, 3 kB, 2 kB, 1 kB, 0,5 kB oder 0,1 kB Nukleotidsequenzen, die das Nukleinsäuremolekül in genomischer DNA der Zelle, von der sich die Nukleinsäure ableitet (z. B. einer Physcomitrella patens-Zelle), auf natürliche Weise flankieren. Außerdem kann ein "isoliertes" Nukleinsäuremolekül, wie ein cDNA-Molekül, in gewissem Ausmaß frei von sonstigem Zellmaterial, mit dem es auf natürliche Weise assoziiert ist, oder Kulturmedium, wenn es mit Rekombinationstechniken produziert wird, oder chemischen Vorstufen oder sonstigen Chemikalien, wenn es chemisch synthetisiert wird, sein.
Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, z. B. ein Nukleinsäuremolekül mit einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 8 oder einem Teil davon, kann nach standardmäßigen molekularbiologischen Techniken isoliert werden und die Sequenzinformation hier bereitgestellt werden. So kann zum Beispiel eine PHSRP-cDNA aus P. patens aus einer P. patens-Bibliothek mit der gesamten Sequenz gemäß SEQ ID NO: 3 oder einem Teil davon isoliert werden. Weiterhin kann ein Nukleinsäuremolekül, das die gesamte Sequenz gemäß SEQ ID NO: 3 oder einen Teil davon umfaßt, mittels Polymerase-Kettenreaktion mit Oligonukleotid-Primern, die auf der Grundlage dieser Sequenz entwickelt wurden, isoliert werden. So kann zum Beispiel mRNA aus Pflanzenzellen isoliert werden (z. B. nach dem Guanidiniumthiocyanat-Extraktionsverfahren von Chirgwin et al., 1979 Biochemistry 18: 5294–5299), und cDNA kann mittels reverser Transkriptase (z. B. Moloney MLV reverse Transkriptase, erhältlich von Gibco/BRL, Bethesda, MD, USA; oder AMV reverse Transkriptase, erhältlich von Seikagaku America, Inc., St. Petersburg, FL, USA) erzeugt werden. Synthetische Oligonukelotid-Primer für die Polymerase-Kettenreaktionsamplifikation können auf Grundlage der in SEQ ID NO: 3 dargestellten Sequenz entwickelt werden. Ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül kann mittels cDNA oder auch mittels genomischer DNA als Matrize und geeigneten Oligonukleotid-Primern nach standardmäßigen PCR-Amplifikationstechniken amplifiziert werden. Das so amplifizierte Nukleinsäuremolekül kann in einen geeigneten Vektor kloniert und mittels DNA-Sequenzanalyse charakterisiert werden. Weiterhin können Oligonukleotide, die einer PHSRP-Nuleotidsequenz entsprechen, mit standardmäßigen Synthesetechniken, z. B. mit einem DNA-Synthesautomaten, hergestellt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein isoliertes erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül die in SEQ ID NO: 8 dargestellten Nukleotidsequenzen. Diese cDNAs umfaßt eine Sequenz, die für das PHSRP codiert (d. h. die in Tabelle 1 gezeigte "Codierregion") sowie 5'-untranslatierte Sequenzen und 3'-untranslatierte Sequenzen. Es ist klar, daß die SEQ ID NO:8 sowohl Codierregionen als auch 5'- und 3'-untranslatierte Regionen umfaßt. Das erfindungsgemäße Nukleinsäuremolekül kann jedoch auch nur die Codierregion der Sequenz in SEQ ID NO: 8 umfassen, oder ganze genomische Fragmente, die aus genomischer DNA isoliert wurden, enthalten. Eine Codierregion dieser Sequenz wird als "ORF-Position" angegeben. Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch eine für PHSRP codierende Nukleinsäure, die für hierin beschriebenes PHSRP codiert. Bevorzugt ist eine für PHSRP codierende Nukleinsäure, die für das PHSRP PP2A-4 (SEQ ID NO: 13) codiert.
Weiterhin kann das Nukleinsäuremolekül nur einen Teil der Codierregion der Sequenz in SEQ ID NO: 8 umfassen, zum Beispiel ein Fragment, das als Sonde oder Primer verwendet werden kann, oder ein Fragment, das für einen biologisch aktiven Abschnitt eines PHSRPs codiert. Die aufgrund der Klonierung der PHSRP-Gene von P. patens bestimmten Nukleotidsequenzen gestatten die Erzeugung von Sonden und Primern zwecks Identifikation und/oder Klonierung von PHSRP-Homologen in anderen Zelltypen und Organismen sowie PHSRP-Homologen von anderen Mosen und verwandten Arten.
Proteinabschnitte, die von den PHSRP-Nukleinsäuremolekülen codiert werden, sind vorzugsweise biologisch aktive Abschnitte von einem der im vorliegenden Text beschriebenen PHSRP. Im vorliegenden Zusammenhang soll der Begriff "biologisch aktiver Abschnitt von" einem PHSRP einen Abschnitt, z. B. eine Domäne/ein Motiv von einem PHSRP, das an der Streßtoleranzreaktion in einer Pflanze beteiligt ist, eine in Tabelle 1 beschriebene Aktivität aufweist oder an der Transkription eines Proteins, das an einer Streßtoleranzreaktion in einer Pflanze teilnimmt, beteiligt ist, umfassen. Um zu bestimmen, ob ein PHSRP oder ein biologisch aktiver Abschnitt davon an der Transkription. eines Proteins, das. an einer Streßtoleranzreaktion in einer Pflanze teilnimmt, beteiligt ist, kann eine Streßanalyse einer Pflanze mit dem PHSRP durchgeführt werden. Solche Analysemethoden sind dem Fachmann gut bekannt, wie dies in Beispiel 7 dargestellt ist. Genauer gesagt können Nukleinsäurefragmente, die für biologisch aktive Abschnitte eines PHSRPs codieren, dadurch hergestellt werden, daß man einen Abschnitt der Sequenz in SEQ ID NO: 13 isoliert, den codierten Abschnitt des PHSRPs oder Peptids exprimiert (z. B. durch rekombinante Expression in vitro) und die Aktivität des codierten Abschnitts des PHSRPs oder Peptids beurteilt.
Zu biologisch aktiven Abschnitten eines PHSRPs zählen Peptide umfassend Aminosäuresequenzen, die sich von der Aminosäuresequenz eines PHSRPs gemäß SEQ ID NO: 13 oder der Aminosäuresequenz eines Proteins mit Homologie oder Orthologie mit einem PHSRP ableiten und die weniger Aminosäuren umfassen als ein Vollängen-PHSRP, oder das Vollängenprotein mit Homologie oder Orthologie zu einem PHSRP und die mindestens eine Aktivität eines PHSRPs aufweisen. Typischerweise umfassen biologisch aktive Abschnitte (z. B. Peptide mit einer Länge von zum Beispiel 5, 10, 15, 20, 30, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 50, 100 oder mehr Aminosäuren) eine Domäne oder ein Motiv mit mindestens einer Aktivität eines PHSRPs. Weiterhin können sonstige biologisch aktive Abschnitte, in denen andere Regionen des Proteins deletiert sind, mittels Rekombinationstechniken hergestellt werden und auf eine oder mehrere der im vorliegenden Text beschriebenen Aktivitäten ausgewertet werden. Vorzugsweise beinhalten die biologisch aktiven Abschnitte eines PHRSPs ein(e) oder mehr ausgewählte Domänen/Motive oder Abschnitte davon, die eine biologische Aktivität aufweisen.
Chimäre PHSRP-Proteine oder PHSRP-Fusionsproteine sind ebenfalls vorgesehen. Im vorliegenden Zusammenhang umfaßt ein "chimäres PHSRP-Protein" bzw. ein "PHSRP-Fusionsprotein" ein PHSRP-Polypeptid in operativer Verknüpfung mit einem Nicht-PHSRP-Polypeptid. Der Begriff PHSRP-Polypeptid bezieht sich auf ein Polypetid mit einer Aminosäuresequenz, die einem PHSRP entspricht, während ein Nicht-PHSRP-Polypeptid ein Polypeptid bedeutet, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die einem Protein entspricht, das keine wesentliche Homologie mit dem PHSRP aufweist, z. B. einem Protein, das sich von dem PHSRP unterscheidet und von demselben oder einem anderen Organismus abstammt. Bei dem Fusionsprotein soll der Begriff "in operativer Verknüpfung" bedeuten, daß das PHSRP-Polypeptid und das Nicht-PHSRP-Polypeptid so miteinander fusioniert sind, daß beide Sequenzen die vorgeschlagene Funktion ausüben, die der eingesetzten Sequenz zugeschrieben wird. Das Nicht-PHSRP-Polypeptid kann mit dem N- terminalen Ende oder dem C-terminalen Ende des PHSRP-Polypeptids fusioniert sein. So ist zum Beispiel in einer Ausführungsform das Fusionsprotein ein GST-PHSRP-Fusionsprotein, in dem die PHSRP-Sequenzen mit dem C-terminalen Ende der GST-Sequenzen fusioniert sind. Solche Fusionsproteine können die Aufreinigung von rekombinanten PHSRP erleichtern. In einer anderen Ausführungsform ist das Fusionsprotein ein PHSRP, das an seinem N-terminalen Ende eine heterologe Signalsequenz enthält. In gewissen Wirtszellen (z. B. Säugetierwirtszellen) kann die Expression und/oder Sekretion eines PHSRPs dadurch verstärkt werden, daß man eine heterologe Signalsequenz verwendet.
Ein chimäres PHSRP-Protein oder PHSRP-Fusionsprotein wird vorzugsweise mit standardmäßigen DNA-Rekombinationstechniken erzeugt. So werden zum Beispiel DNA-Fragmente, die für die verschiedenen Polypeptidsequenzen codieren, mit traditionellen Techniken leserastergerecht ligiert, zum Beispiel dadurch, daß man stumpfe oder klebrige Enden für die Ligation einsetzt, mittels Restriktionsenzymverdau zur Bereitstellung von entsprechenden Enden, gegebenenfalls Abfüllen von kohäsiven Enden, Behandeln mit alkalischer Phosphatase zwecks Vermeidung von unerwünschtem Aneinangerfügen und enzymatische Ligation. In einer anderen Ausführungsform kann das Fusionsgen mit traditionellen Techniken, darunter DNA-Syntheseautomaten, synthetisiert werden. Es kann jedoch auch eine PCR-Amplifikation von Genfragmenten mit Anker-Primern durchgeführt werden, wodurch man komplementäre Überstände zwischen zwei aufeinanderfolgenden Genfragmenten erhält, die anschließend reassoziieren gelassen und erneut amplifiziert werden können, wozu man zu einer Chimären Gensequenz gelangt (siehe zum Beispiel Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992). Außerdem sind viele Expressionsvektoren, die bereits für einen Fusionsmolekülteil (z. B. ein GST-Polypeptid) codieren, im Handel erhältlich. In solch einem Expressionsvektor kann eine für PHSRP codierende Nukleinsäure so kloniert werden, daß der Fusionsmolekülteil leserastgerecht mit dem PHSRP verbunden ist.
Zusätzlich zu den hier beschriebenen Fragmenten und Fusionsproteinen der PHSRP werden auch Homologe und Analoge von natürlich vorkommenden PHSRP und für PHSRP codierenden Nukleinsäuren in einer Pflanze vorgesehen. Im vorliegenden Zusammenhang werden "Homologe" als zwei Nukleinsäuren oder Proteine mit ähnlichen, oder "homologen", Nukleotid- oder bzw. Aminosäuresequenzen definiert. Zu Homologen zählen Allelvarianten, Orthologe, Paraloge, Agonisten und Antagonisten von PHSRP wie im folgenden definiert. Der Begriff "Homolog" umfaßt weiterhin Nukleinsäuremoleküle, die sich von den in SEQ ID NO: 8 gezeigten Nukleotidsequenzen (und Teilen davon) aufgrund des degenerierten genetischen Codes unterscheiden und so für dasselbe PHSRP codieren, das von der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 8 codiert wird.
Ein Agonist des PHSRPs kann im wesentlichen dieselben biologischen Aktivitäten des PHSRPs oder einen Teil davon beibehalten. Ein Antagonist des PHSRPs kann eine oder mehrere der Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form des PHSRPs hemmen. So kann zum Beispiel der PHSRP-Antagonist kompetitiv an eine stromabwärts oder stromaufwärts gelegene Stufe der Zellmembrankomponenten-Stoffwechselkaskade, die das PHSRP beinhaltet, binden, oder an ein PHSRP, das den Transport von Verbindungen über solche Membranen hinweg vermittelt, binden, wodurch verhindert wird, daß eine Translokation stattfindet.
Im vorliegenden Zusammenhang bezeichnet ein "natürlich vorkommendes" PHSRP eine PHSRP-Aminosäuresequenz, die in der Natur vorkommt. Vorzugsweise umfaßt ein natürlich vorkommendes PHSRP die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 13.
Nukleinsäuremoleküle, die natürlichen Allelvarianten und Analogen, Orthologen und Paralogen einer PHSRP-cDNA entsprechen, können aufgrund ihrer Identität mit den im vorliegenden Text beschriebenen PHSRP-Nukleinsäuren aus Physcomitrella patens isoliert werden und zwar dadurch, daß man jeweils PHSRP-cDNAs oder einen Teil davon als Hybridisierungssonde nach standardmäßigen Hybridisierungstechniken unter stringenten Hybridisierungsbedingungen einsetzt. In einer anderen Ausführungsform können Homologe des PHSRPs dadurch identifiziert werden, daß man kombinatorische Bibliotheken von Mutanten, z. B. Verkürzungsmutanten, des PHSRPs auf PHSRP-Agonisten- oder Antagonistenaktivität durchmustert. In einer Ausführungsform erzeugt man eine variegierte Bibliothek von PHSRP-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf Nukleinsäureebene, die von einer variegierten Genbibliothek codiert wird. Eine variegierte Bibliothek von PHSRP-Varianten kann man zum Beispiel durch enzymatische Ligation von einer Mischung von synthetischen Oligonukleotiden in Gensequenzen derart erzeugen, daß ein degenerierter Satz von möglichen PHSRP-Sequenzen als einzelne Polypeptide oder auch als Satz von größeren Fusionsproteinen (z. B. für Phagen-Display), die den Satz PHSRP-Sequenzen in sich enthalten, exprimierbar ist. Es existieren verschiedene Methoden für die Herstellung von Bibliotheken möglicher PHSRP-Homologe aus einer degenerierten Oligonukleotidsequenz. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz kann in einem DNA-Syntheseautomaten erfolgen, und das synthetische Gen wird anschließend in einen entsprechenden Expressionsvektor ligiert. Dadurch, daß man einen degenerierten Satz Gene verwendet, kann man in einer Mischung alle Sequenzen, die für den gewünschten Satz möglicher PHSRP-Sequenzen codieren, bereitstellen. Verfahren für die Synthese von degenerierten Oligonukleotiden sind in der Fachwelt bekannt (siehe z. B. Narang, S. A., 1983 Tetrahedron 39: 3; Itakura et al., 1984 Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al., 1984 Science 198: 1056; Ike et al., Nucleic Acid Res. 11: 477).
Weiterhin können Bibliotheken von Fragmenten der für PHSRP codierenden Regionen eingesetzt werden, um eine variegierte Population von PHSRP-Fragmenten für die Durchmusterung und ausschließende Selektion von Homologen eines PHSRPs zu Erzeugen. In einer Ausführungsform kann eine Bibliothek von Codiersequenzfragmenten dadurch erzeugt werden, daß man ein doppelsträngiges PCR-Fragment einer PHSRP-Codiersequenz mit einer Nuklease unter Bedingungen behandelt, unter denen ein Einzelstrangbruch nur ungefähr einmal pro Molekül stattfindet, die doppelsträngige DNA denaturiert, die DNA unter Bildung von doppelsträngiger DNA renaturiert, was sense/antisense-Paare aus unterschiedlichen Produkten mit Einzelstrangbruch beinhalten kann, einzelsträngige Abschnitte von neugebildeten Doppelsträngen durch Behandlung mit S1-Nuklease entfernt und die erhaltene Fragmentbibliothek in einen Expressionsvektor ligiert. Mit diesem Verfahren kann eine Expressionsbibliothek abgeleitet werden, die für N-terminale, C-terminale und interne Fragmente des PHSRP mit unterschiedlichen Größen codiert.
Für das Durchmustern von Genprodukten von kombinatorischen Bibliotheken, die durch Punktmutationen oder Verkürzung erzeugt wurden, und für die Durchmusterung von cDNA-Bibliotheken für Genprodukte mit einer ausgewählten Eigenschaft sind in der Fachwelt mehrere Techniken bekannt. Solche Techniken lassen sich auf ein rasches Durchmustern der Genbibliotheken, die durch die kombinatorische Mutagenese von PHSRP-Homologen erzeugt wurden, anpassen. Zu den am häufigsten verwendeten Techniken für das Durchmustern von großen Genbibliotheken, die sich für die Analyse mit hohem Durchsatz eignen, zählen typischerweise das Klonieren der Genbibliothek in replizierbare Expressionsvektoren, das Transformieren von entsprechenden Zellen mit der erhaltenen Vektorbibliothek und das Exprimieren der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, in denen der Nachweis einer gewünschten Aktivität die Isolation des Vektors, der für das Gen codiert, dessen Produkt nachgewiesen wurde, erleichtert. Die "recursive ensemble"-Mutagenese (REM), eine neue Technik, die die Häufigkeit von funktionellen Mutanten in den Bibliotheken erhöht, kann in Kombination mit den Durchmusterungstests für das Identifizieren von PHSRP-Homologen eingesetzt werden (Arkin und Yoderrwan, 1992 PNAS 89: 7811–7815; Delgrave et al., 1993 Protein Engineering 6(3): 327–331). In einer anderen Ausführungsform können Assays auf Zellbasis eingesetzt werden, um eine variegierte PHSRP-Bibliothek zu analysieren, wobei fachlich gut bekannte Verfahren verwendet werden. Ein Verfahren zum Identifizieren eines neuen PHSRPs umfaßt (a) die Erzeugung einer spezifischen Antikörperreaktion auf ein PHSRP oder ein Fragment davon wie oben beschrieben; (b) das Durchmustern von mutmaßlichem PHSRP-Material mit dem Antikörper, wobei eine spezifische Bindung des Antikörpers an das Material anzeigt, daß ein möglicherweise neues PHSRP vorliegt, sowie (c) die Analyse des gebundenen Materials im Vergleich mit bekanntem PHSRP, um seine Neuheit zu bestimmen.
Zur Bestimmung der prozentualen Homologie von zwei Aminosäuresequenzen (z. B. der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 13 und einer Mutantenform davon) werden die Sequenzen zwecks optimalen Vergleichs untereinander geschrieben (z. B. können Lücken in die Sequenz eines Proteins oder einer Nukleinsäure eingeführt werden, um ein optimales Alignment mit dem anderen Protein bzw. der anderen Nukleinsäure zu erreichen). Dann werden die Aminosäurereste an den entsprechenden Aminosäurepositionen oder Nukleotidpositionen verglichen. Ist eine Position in einer Sequenz (z. B. der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 13) von demselben Aminosäurerest wie die entsprechende Position in der anderen Sequenz (z. B. einer Mutantenform der Sequenz des Polypeptides gemäß SEQ ID NO: 13) besetzt, dann sind die Moleküle an dieser Position homolog (d. h. im vorliegenden Zusammenhang ist Aminosäure- oder Nukleinsäure-"homologie" gleichbedeutend mit Aminosäure- oder Nukleinsäure-"identität"). Dieselbe Art von Vergleich kann zwischen zwei Nukleinsäuresequenzen erfolgen.
Die prozentuale Homologie zwischen den zwei Sequenzen hängt von der Anzahl der identischen Positionen, die den Sequenzen gemeinsam sind, ab. (d. h.% Homologie = Anzahl identischer Positionen/Gesamtzahl Positionen × 100). Die in der vorliegenden Erfindung beinhaltete Aminosäuresequenz weist mindestens 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Homologie mit einer Gesamtaminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 13 auf. In einer anderen Ausführungsform mindestens 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Homologie mit einer gesamten Aminosäuresequenz, die von einer Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 8 codiert ist.
In andern Ausführungsformen beträgt die bevorzugte Vergleichssequenzlänge mindestens 15 Aminosäurereste, stärker bevorzugt mindestens 25 Aminosäurereste und am stärksten bevorzugt mindestens 35 Aminosäurereste.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein erfindungsgemäßes isoliertes Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz mit mindestens 90% oder 90–95%, und noch stärker bevorzugt mindestens ungefähr 95%, 96%, 97%, 98%, 99% oder mehr Homologie mit einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 8 über die gesamte Codierregion oder einen Teil davon. Die bevorzugte Vergleichssequenzlänge für Nukleinsäuren beträgt mindestens 75 Nukleotide, stärker bevorzugt mindestens 100 Nukleotide und am stärksten bevorzugt die gesamte Länge der Codierregion.
Ebenso bevorzugt wird, daß ein homologes Nukleinsäuremolekül für ein Protein oder einen Teil davon codiert, das/der eine Aminosäuresequenz beinhaltet, die ausreichende Homologie mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 13 aufweist, so daß das Protein oder der Teil davon dieselbe oder eine ähnliche Funktion wie die Aminosäuresequenz, mit der es/er verglichen wird, beibehält. Zu Funktionen der erfindungsgemäßen PHSRP-Aminosäuresequenzen zählen die Fähigkeit, an einer Streßtoleranzreaktion an einer Pflanze teilzunehmen, genauer gesagt an der Transkription eines Proteins, das an einer Streßtoleranzreaktion in einer Physcomitrella patens-Pflanze beteiligt ist, teilzunehmen. Beispiele für solche Aktivitäten sind in Tabelle 1 beschrieben.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Verfahren kann eine Bestimmung der prozentualen Homologie zwischen zwei Sequenzen mit einem mathematischen Algorithmus erfolgen. Ein bevorzugtes nicht einschränkendes Beispiel für einen mathematischen Algorithmus der für den Vergleich von zwei Sequenzen eingesetzt wird, ist der Algorithmus von Karlin und Altschul (1990 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873–5788). Solch ein Algorithmus ist Bestandteil des NBLAST- und des XBLAST-Programms von Altschul, et al. (1990 J. Mol. Biol.-215: 403–410).
BLAST-Nukleinsäuresuchen können mit dem NBLAST-Programm (score = 100, wordlength = 12) durchgeführt werden, um zu Nukleinsäuresequenzen mit Homologie zu den erfindungsgemäßen PHSRP-Nukleinsäuremolekülen zu gelangen. Zusätzlich können BLAST-Proteinsuchen mit dem XBLAST-Programm (score = 50, wordlength = 3) durchgeführt werden, um zu Aminosäuresequenzen mit Homologie zu den PHSRP der vorliegenden Erfindung zu gelangen. Um zu Alignments mit "gaps" für Vergleichszwecke zu gelangen, kann man "Gapped BLAST" einsetzen, wie dies in Altschul et al. (1997 Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402) beschrieben ist. Verwendet man die Programme BLAST und Gapped BLAST, so können die vorgegebenen Parameter der jeweiligen Programme (z. B. XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Ein weiteres bevorzugtes nicht einschränkendes Beispiel für einen mathematischen Algorithmus, der für den Sequenzvergleich eingesetzt wird, ist der Algorithmus von Myers und Miller (CABIOS 1989). Solch ein Algorithmus ist in dem Programm ALIGN (Version 2.0), das Bestandteil des GCG-Sequenzalignment-Softwarepakets ist, enthalten. Verwendet man das Programm ALIGN für den Vergleich von Aminosäuresequenzen, so kann man dabei die Einstellungen "weight residue table" PAM 120, "gap length penalty" 12 und "gap penalty" 4 verwenden, um zu Aminosäuresequenzen mit Homologie zu den erfindungsgemäßen PHSRP zu gelangen. Um zu Alignments mit "gaps" für Vergleichszwecke zu gelangen, kann man "Gapped BLAST" einsetzen, wie dies in Altschul et al. (1997 Nucleic Acids Res. 25: 3389–3402) beschrieben ist. Verwendet man die Programme BLAST und Gapped BLAST, so können die vorgegebenen Parameter der jeweiligen Programme (z. B. XBLAST und NBLAST) verwendet werden. Ein weiteres bevorzugtes nicht einschränkendes Beispiel für einen mathematischen Algorithmus, der für den Sequenzvergleich eingesetzt wird, ist der Algorithmus von Myers und Miller (CABIOS 1989). Solch ein Algorithmus ist in dem Programm ALIGN (Version 2.0), das Bestandteil des GCG-Sequenzalignment-Softwarepakets ist, enthalten. Verwendet man das Programm ALIGN für den Vergleich von Aminosäuresequenzen, so kann man dabei die Einstellungen "weight residue table" PAM 120, "gap length penalty" 12 und "gap penalty" 4 verwenden.
Schließlich kann die Homologie zwischen Nukleinsäuresequenzen auch dadurch bestimmt werden, daß man Hybridisierungstechniken einsetzt, die dem Fachmann vertraut sind. Demgemäß umfaßt ein isoliertes Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die z. B. unter stringenten Bedingungen mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 8 oder einem Teil davon hybridisiert. Genauer gesagt ist ein isoliertes Nukleinsäuremolekül mindestens 15 Nukleotide lang und hybridisiert unter stringenten Bedingungen an das Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 8 umfaßt. In anderen Ausführungsformen ist die Nukleinsäure mindestens 30, 50, 100, 250 oder mehr Nukleotide lang.
Im vorliegenden Zusammenhang beschreibt der Begriff "hybridisiert unter stringenten Bedingungen" Hybridisierungs- und Waschbedingungen, unter denen Nukleotidsequenzen mit mindestens 60% Homologie zueinander typischerweise aneinander hybridisiert bleiben. Vorzugsweise sind die Bedingungen so, daß Sequenzen, die mindestens ungefähr 65%, stärker bevorzugt mindestens ungefähr 70% und noch stärker bevorzugt mindestens ungefähr 75% oder mehr Homologie zueinander aufweisen, typischerweise aneinander hybridisiert bleiben. Solche stringenten Bedingungen sind dem Fachmann vertraut; sie finden sich in Current Protocols in Molecular Biology, 6.3.1–6.3.6, John Wiley & Sons, N. Y. (1989). Ein bevorzugtes nicht einschränkendes Beispiel für stringente Hybridisierungsbedingungen sind die Hybridisierung in 6X Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei ungefähr 45°C und danach ein- oder mehrmaliges Waschen mit 0,2 × SSC, 0,1% SDS bei 50–65°C. Vorzugsweise entspricht ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das unter stringenten Bedingungen mit einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 8 hybridisiert, einem natürlich vorkommenden Nukleinsäuremolekül. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet ein "natürlich vorkommendes" Nukleinsäuremolekül ein RNA- oder DNA-Molekül mit einer Nukleotidsequenz, die in der Natur vorkommt (z. B. die ein natürliches Protein codiert). In einer Ausführungsform codiert die Nukleinsäure für ein natürlich vorkommendes Physcomitrella patens-PHSRP.
Mit den oben beschriebenen sowie anderen dem Fachmann bekannten Verfahren kann der Durchschnittsfachmann Homologe des PHSRP mit einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 13 und die PHSRP-Nukleinsäuren umfassend Nukleinsäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 8 isolieren. Eine Untergruppe dieser Homologen sind Allelvarianten. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff "Allelvariante" eine Nukleotidsequenz, die Polymorphismen enthält, die zu Veränderungen in den Aminosäuresequenzen eines PHSRPs führen und die innerhalb einer natürlichen Population (z. B. einer Pflanzenart oder -sorte) existieren. Solche natürlichen Allelvariationen können typischerweise zu einer Varianz innerhalb einer PHSRP-Nukleinsäure von 1–5% führen. Allelvarianten können dadurch identifiziert werden, daß man die interessierende Nukleinsäuresequenz in einer Anzahl verschiedener Pflanzen sequenziert, was leicht mit Hybridisierungssonden zum Identifizieren desselben PHSRP-Genlocus in diesen Pflanzen durchgeführt werden kann. Alle diese Nukleinsäurevariationen und die dadurch entstehenden Aminosäurepolymorphismen oder -variationen in einem PHSRP, die das Ergebnis von natürlicher Allelvariation sind und die die funktionelle Aktivität eines PHSRPs nicht verändern, sollen von der Erfindung umfaßt sein.
Weiterhin werden Nukleinsäuremoleküle, die für PHSRP von derselben Art oder anderen Arten codieren, wie PHSRP-Analoge, -Orthologe und -Paraloge, vorgesehen. Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff "Analoge" auf zwei Nukleinsäuren, die dieselbe oder eine ähnliche Funktion aufweisen, jedoch getrennt in nicht verwandten Organismen entstanden sind. Im vorliegenden Zusammenhang bedeutet der Begriff "Orthologe" zwei Nukleinsäuren von unterschiedlichen Arten, die jedoch von einem gemeinsamen Vorläufergen. durch Artbildung entstanden sind. Normalerweise codieren Orthologe für Proteine mit derselben oder ähnlichen Funktionen. Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Begriff "Paraloge" auf zwei Nukleinsäuren, die durch Duplikation innerhalb eines Genoms verwandt sind. Paraloge weisen üblicherweise unterschiedliche Funktionen auf, diese Funktionen können jedoch verwandt sein. (Tatusov, R. L. et al. 1997 Science 278(5338): 631–637). Analoge, Orthologe und Paraloge eines natürlich vorkommenden PHSRPs können sich von dem natürlich vorkommenden PHSRP durch posttranslationelle Modifikationen, durch Unterschiede in der Aminosäuresequenz oder durch beide unterscheiden. Zu posttranslationellen Modifikationen zählen die chemische in-vivo- und in-vitro-Derivatisierung von Polypeptiden, z. B. Acetylierung, Carboxylierung, Phosphorylierung oder Glykosilierung, und solche Modifikationen können während der Polypeptidsynthese oder während des Polypeptid-Processings oder Nachbehandlung mit separaten modifizierenden Enzymen stattfinden. Insbesondere weisen Orthologe im allgemeinen mindestens 80–85%, stärker bevorzugt 90% und am stärksten bevorzugt 95%, 96%, 97%, 98% oder sogar 99% Identität oder Homologie mit einer ganzen natürlich vorkommenden PHSRP-Aminosäuresequenz oder einem Teil davon auf und weisen eine Funktion ähnlich einem PHSRP auf. Orthologe können auch vorzugsweise an der Streßreaktion in Pflanzen teilnehmen. In einer Ausführungsform behalten PHSRP-Orthologe die Fähigkeit, am Stoffwechsel von für den Aufbau von Zellmembranen in Physcomitrella patens oder am Transport von Molekülen durch diese Membranen hindurch erforderlichen Verbindungen teilzunehmen, bei.
Zusätzlich zu den natürlich vorkommenden Varianten einer PHSRP-Sequenz, die in der Population vorhanden sein können, ist dem Fachmann weiterhin klar, daß Veränderungen in eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 8 durch Mutation eingeführt werden können, was zu Veränderungen in der Aminosäuresequenz des codierten PHSRPs führt, ohne daß die funktionelle Fähigkeit des PHSRPs verändert wird. Zum Beispiel können Nukleotidsubstitutionen in einer Sequenz gemäß SEQ ID NO: 8 erzeugt werden, die zu Aminosäuresubstitutionen an "nicht essentiellen" Aminosäureresten führen. Ein "nicht essentieller" Aminosäurerest ist ein Rest, der von der Wildtypsequenz eines der PHSRP geändert werden kann, ohne daß die Aktivität des PHSRPs verändert wird, während ein "essentieller" Aminosäurerest für eine PHSRP-Aktivität erforderlich ist. Andere Aminosäurereste (z. B. diejenigen, die in der Domäne mit PHSRP-Aktivität nicht oder nur halb konserviert sind) können jedoch für die Aktivität nicht essentiell sein und sind einer Änderung zugänglich, ohne daß die PHSRP-Aktivität verändert wird.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft daher Nukleinsäuremoleküle, die für PHSRP codieren, die Veränderungen an Aminosäureresten enthalten, die für die PHSRP-Aktivität nicht essentiell sind. Solche PHSRP unterscheiden sich bezüglich der Aminosäuresequenz von einer in SEQ ID NO: 13 enthaltenen Sequenz, behalten jedoch mindestens eine der hier beschriebenen PHSRP-Aktivitäten bei. In einer Ausführungsform umfaßt das isolierte Nukleinsäuremolekül eine Nukleotidsequenz, die für ein Protein codiert, wobei das Protein eine Aminosäuresequenz mit mindestens ungefähr 96% Homologie zu einer Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 13 umfaßt. Vorzugsweise weist das von dem Nukleinsäuremolekül codierte Protein mindestens 96%, 97%, 98% oder 99% Homologie mit der Sequenz von SEQ ID NO: 13 auf. Die bevorzugten PHSRP-Homologe der vorliegenden Erfindung können vorzugsweise an der Streßtoleranzreaktion in einer Pflanze teilnehmen, genauer gesagt an der Transkription eines Proteins, das an einer Streßtoleranzreaktion in einer Physcomitrella patens-Pflanze beteiligt ist, teilnehmen, oder eine oder mehrere Aktivitäten gemäß Tabelle 1 aufweisen.
Ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, das für ein PHSRP mit Homologie zu einer Proteinsequenz gemäß SEQ ID NO: 13 codiert, kann dadurch erzeugt werden, daß man eine oder mehrere Nukleotidsubstitionen, -additionen oder -deletionen in eine Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 8 einführt, so daß eine oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen in das codierte Protein eingeführt werden. Mutationen können in eine der Sequenzen gemäß SEQ ID NO: 8 nach Standardtechniken wie ortsgerichtete Mutagenese und PCR-vermittelte Mutagenese eingeführt werden. Vorzugs weise erfolgen konservative Aminosäuresubstitutionen an einem oder mehreren vorhergesagten nicht essentiellen Aminosäurerest(en). Eine "konservative Aminosäuresubstitution" ist eine Substitution, in der der Aminosäurerest durch einen Aminosäurerest mit einer ähnlichen Seitenkette ersetzt wird.
Familien von Aminosäureresten mit ähnlichen Seitenketten sind in der Fachwelt definiert worden. Zu diesen Familien zählen Aminosäuren mit basischen Seitenketten (z. B. Lysin, Arginin, Histidin), sauren Seitenketten (z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure), neutralen polaren Seitenketten (z. B. Glycin, Asparagin, Glutamin, Serin, Threonin, Tyrosin, Cystein), unpolaren Seitenketten (z. B. Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan), Seitenketten mit Beta-Verzweigungen (z. B. Threonin, Valin, Isoleucin) und aromatischen Seitenketten (z. B. Tyrosin, Phenylalanin, Thryptophan, Histidin). So wird ein vorhergesagter nicht essentieller Aminosäurerest in einem PHSRP vorzugsweise durch einen anderen Aminosäurerest aus derselben Seitenkettenfamilie ersetzt. In einer anderen Ausführungsform wiederum können Mutationen zufallsmäßig entlang der gesamten PHSRP-Codiersequenz oder eines Teils davon eingeführt werden, zum Beispiel durch Sättigungsmutagenese, und die erhaltenen Mutanten können auf eine hierin beschriebene PHSRP-Aktivität durchmustert werden, um Mutanten, bei denen die PHSRP-Aktivität erhalten geblieben ist, zu identifizieren. Nach der Mutagenese der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 8 kann das codierte Protein rekombinant exprimiert werden, und die Aktivität des Proteins kann dadurch bestimmt werden, daß man die Streßtoleranz einer Pflanze, die das Protein exprimiert, wie in Beispiel 7 beschrieben analysiert.
Zusätzlich zu den Nukleinsäuremolekülen, die für die oben beschriebenen PHSRP codieren, werden isolierte Nukleinsäuremoleküle, die zu diesen antisense sind, vorgesehen. Eine "antisense" Nukleinsäure umfaßt eine Nukleotidsequenz, die zu einer "sense"-Nukleinsäure, die für ein Protein codiert, komplementär ist, z. B. zu dem Codierstrang eines doppelsträngigen cDNA-Moleküls komplementär ist oder zu einer mRNA-Sequenz komplementär ist. Dementsprechend kann eine antisense-Nukleinsäure mit einer Sense-Nukleinsäure eine Wasserstoffbindung eingehen. Die antisense-Nukleinsäure kann zu einem vollständigen PHSRP-Codierstrang oder nur einem Teil davon komplementär sein. In einer Ausführungsform ist ein antisense-Nukleinsäuremolekül zu einer "Codierregion" des Codierstrangs einer Nukleotidsequenz, die für ein PHSRP codiert, antisense. Der Begriff "Codierregion" bezieht sich auf die Region der Nukleotidsequenz, die Codons umfaßt, die in Aminosäurereste translatiert werden (z. B. die gesamte Codierregion von ,,,,, umfaßt die Nukleotide 1 bis ....). In einer anderen Ausführungsform ist das antisense-Nukleinsäuremolekül zu einer "Nichtcodierregion" des Codierstrangs einer Nukleotidsequenz, die für ein PHSRP codiert, antisense. Der Begriff "Nichtcodierregion" bezieht sich auf 5'- und 3'-Sequenzen, die die Codierregion flankieren und die nicht in Aminosäuren translatiert werden (d. h. die auch als 5'- und 3'-untranslatierte Regionen bezeichnet werden).
In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein isoliertes Nukleinsäuremolekül ein Nukleinsäuremolekül, das zu der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 8 oder einem Teil davon komplementär ist. Ein Nukleinsäuremolekül, das zu der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 8 komplementär ist, ist ein Nukleinsäuremolekül, das zu der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 8 derart ausreichend komplementär ist, daß es mit der Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 8 hybridisieren kann und dadurch einen stabilen Doppelstrang bildet.
Wenn man die Codierstrangsequenzen, die für das hier beschriebene PHSRP codieren (z. B. die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 8), hat, so können antisense-Nukleinsäuren nach den Watson-Crick-Regeln der Basenpaarung erzeugt werden. Das antisense-Nukleinsäuremolekül kann zu der gesamten Codierregion einer PHSRP-mRNA komplementär sein, ist jedoch stärker bevorzugt ein Oligonukleotid, das nur zu einem Teil der Codier- oder Nichtcodierregion einer PHSRP-mRNA antisense ist. Zum Beispiel kann das antisense-Oligonukleotid zu der Region, die die Translationsstartstelle der PHSRP-mRNA umgibt, komplementär sein. Ein antisense-Oligonukleotid kann zum Beispiel ungefähr 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50 Nukleotide lang sein.
Eine antisense-Nukleinsäure kann mittels chemischer Synthese und enzymatischen Ligationsreaktionen nach fachbekannten Vorgehensweisen konstruiert werden. So kann zum Beispiel eine antisense-Nukleinsäure (z. B. ein antisense-Oligonukleotid) unter Verwendung von natürlich vorkommenden Nukleotiden oder verschiedenartig modifizierten Nukleotiden, mit denen die biologische Stabilität der Moleküle erhöht werden soll oder die physikalische Stabilität des zwischen antisense- und sense-Nukleinsäuren gebildeten Doppelstrangs erhöht werden soll, chemisch synthetisiert werden, z. B. können Phosphorthioatderivate und acridinsubstituierte Nukleotide eingesetzt werden. Zu Beispielen für modifizierte Nukleotide, die zur Erzeugung der antisense-Nukleinsäure eingesetzt werden können, zählen 5-Fluoruracail, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4- Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxymethyl)uracil, 5-carboxymethylaminomethyl-2-thioderridin, 5-Carbomethylaminomethyluracil, Dihydroderracil, beta-D-Galactosylqueosin, Inosin, N6-Isopentyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-Adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thioderracil, beta-D-Mannosylqueosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudoderracil, Queosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thioderracil, 2-Thioderracil, 4-Thioderracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thioderracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (apc3)w und 2,6-Diaminopurin. Die antisense-Nukleinsäure kann jedoch auch biologisch mit einem Expressionsvektor hergestellt werden, in den eine Nukleinsäure in antisense-Orientierung subkloniert wurde (d. h. von der insertierten Nukleinsäure transkribierte RNA wird bezüglich einer interessierenden Zielnukleinsäure in antisense-Orientierung vorliegen, was weiter unten im folgenden Unterabschnitt beschrieben werden wird).
Die antisense-Nukleinsäuremoleküle werden typischerweise an eine Zelle verabreicht oder in situ erzeugt, so daß sie mit Zell-mRNA und/oder genomischer DNA, die für ein PHSRP codiert, hybridisieren oder an diese binden, um so die Expression des Proteins zu hemmen, z. B. dadurch, daß sie die Transkription und/oder Translation hemmen. Die Hybridisierung kann durch traditionelle Nukleotidkomplementarität unter Bildung eines stabilen Doppelstrangs erfolgen oder, zum Beispiel bei einem antisense-Nukleinsäuremolekül, das an DNA-Doppelstränge bindet, durch spezifische Interaktionen in der Hauptfurche der Doppelhelix. Das antisense-Molekül kann so modifiziert sein, daß es spezifisch an einen Rezeptor oder an ein an einer ausgewählten Zelloberfläche exprimiertes Antigen bindet, zum Beispiel durch Bindung des antisense-Nukleinsäuremoleküls an ein Peptid oder einen Antikörper, das bzw. der an einen Zelloberflächenrezeptor oder ein Antigen bindet. Das antisense-Nukleinsäuremolekül kann auch unter Verwendung der im folgenden Text beschriebenen Vektoren an die Zellen abgegeben werden. Zur Erzielung von ausreichenden intrazellulären Konzentrationen der antisense-Moleküle werden Vektorkonstrukte bevorzugt, bei denen sich das antisense-Nukleinsäuremolekül unter der Kontrolle eines starken prokaryontischen, viralen oder eukaryontischen (darunter auch pflanzlichen) Promoters befindet.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist das antisense-Nukleinsäuremolekül ein α-anomeres Nukleinsäuremolekül. Ein α-anomeres Nukleinsäuremolekül bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, wobei die Stränge im Gegensatz zu den üblichen β-Einheiten parallel zueinander verlaufen (Gaultier et al., 1987 Nucleic Acids. Res. 15: 6625–6641). Das antisense-Nukleinsäuremolekül kann außerdem ein 2'-o-Methylribonukleotid (Inodere et al., 1987 Nucleic Acids Res. 15: 6131–6148) oder ein chimäres RNS-DNA-Hybridanalog (Inodere et al., 1987 FERS Lett. 215: 327–330) umfassen.
Bei einer weiteren Ausführungsform ist eine antisense-Nukleinsäure ein Ribozym. Ribozyme sind katalytische RNA-Moleküle mit Ribonukleaseaktivität, die eine einzelsträngige Nukleinsäure, wie eine mRNA, zu der sie einen komplementären Bereich haben, spalten können. Ribozyme (z. B. die Hammerhead-Ribozyme, die bei Haselhoff und Gerlach, 1988 Nature 334: 585–591 beschrieben sind) können daher für die katalytische Spaltung von PHSRP-mRNA-Transkripten verwendet werden, um dadurch die Translation von PHSRP-mRNA zu hemmen. Ein Ribozym mit Spezifität für eine für PHSRP codierende Nukleinsäure kann auf Grundlage der Nukleotidsequenz einer PHSRP-cDNA wie hierin beschrieben (d. h. SEQ ID NO: 8) oder auf der Grundlage einer gemäß den in dieser Erfindung gelehrten Verfahren zu isolierenden heterologen Sequenz gestaltet werden. Beispielsweise kann ein Derivat einer Tetrahymena L-19 IVS-RNA konstruiert werden, in dem die Nukleotidsequenz der aktiven Stelle komplementär zu der Nukleotidsequenz ist, die in einer für PHSRP codierenden mRNA gespalten werden soll. Siehe z. B. Cech et al. US-Patent Nr. 4,987,071 und Cech et al. US-Patent Nr. 5,116,742 . Alternativ kann PHSRP-mRNA zur Selektion einer katalytischen RNA mit einer spezifischen Ribonukleaseaktivität aus einem Pool von RNA-Molekülen verwendet werden. Siehe z. B. (Bartel, D. und Szostak, J. W., 1993 Science 261: 1411–1418).
Alternativ kann die PHSRP-Genexpression dadurch gehemmt werden, daß man Nukleotidsequenzen, die zur Regulationsregion einer PHSRP-Nuleotidsequenz (z. B. einem PHSRP-Promoter und/oder -Enhancer) komplementär sind, so zielsteuert, daß Dreifachhelixstrukturen gebildet werden, die die Transkription eines PHSRP-Gens in Zielzellen hemmen. Siehe allgemein Helene C., 1991 Anticancer Drug Des. 6(6): 569–84; Helene, C. et al., 1992 Ann. N. Y. Acad. Sci. 660: 27–36; und Maher, L. J., 1992 Bioassays 14(12): 807–15.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen PHSRP-Nukleinsäuren und -Proteinen werden auch diese Nukleinsäuren und Proteine, die an ein Molekülteil gebunden sind, vorgesehen. Zu diesen Molekülteilen zählen, jedoch nicht einschränkend, Nachweis-, Hybridisierungs-, Aufreinigungs-, Abgabe-, Reaktions-, Bindungsmolekülteile und dergleichen. Eine typische Nukleinsäure, die an ein Molekülteil gebunden ist, ist eine Sonde bzw. ein Primer. Die Sonde bzw. der Primer umfaßt typischerweise eine Region von Nukleotidsequenz, die unter stringenten Bedingungen mit mindestens ungefähr 12, vorzugsweise ungefähr 25, stärker bevorzugt ungefähr 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgenden Nukleotiden eines sense-Strangs der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 8, einer antisense-Sequenz der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 8 oder natürlich vorkommenden Mutanten davon hybridisiert. Primer auf der Grundlage einer Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 8 können in PCR-Reaktionen zur Klonierung von PHSRP-Homologen eingesetzt werden. Sonden auf der Grundlage der PHSRP-Nukleotidsequenzen können für den Nachweis von Transkripten oder genomischen Sequenzen, die für dasselbe oder homologe Proteine codieren, eingesetzt werden. In bevorzugten Ausführungsformen umfaßt die Sonde weiterhin eine daran gebundene Markergruppe, z. B. kann es sich bei der Markergruppe um ein Radioisotop, eine fluoreszierende Verbindung, ein Enzym oder einen Enzymcofaktor handeln. Solche Sonden können als Bestandteil eines genomischen Markertestkits für die Expression von Zellen, die ein PHSRP exprimieren, eingesetzt werden, wie zum Beispiel durch Bestimmen des Gehalts einer jeweiligen für PHSRP codierenden Nukleinsäure in einer Zellprobe, z. B. Nachweisen des Gehalts von PHSRP-mRNA oder Bestimmen, ob ein genomisches PHSRP-Gen mutiert oder deletiert wurde.
Ein nützliches Verfahren zur Bestimmung, wie stark das Gen transkribiert wurde (was die für die Translation des Genprodukts verfügbare mRNA-Menge anzeigt) besteht insbesondere darin, einen Northern-Blot durchzuführen (siehe zum Beispiel die Literaturstelle Ausubel et al., 1988 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York). Diese Information zeigt zumindest teilweise das Transkriptionsniveau des transformierten Gens. Gesamt-Zell-RNA läßt sich aus Zellen, Geweben oder Organen nach verschiedenen Methoden, die alle gut im Fachgebiet bekannt sind, herstellen, wie nach der von Bormann, E. R. et al., 1992 Mol. Microbiol. 6: 317–326 beschriebenen Methode. Zur Beurteilung des Vorhandenseins bzw. der relativen Menge an Protein, das von dieser mRNA translatiert wurde, können Standardtechniken wie ein Western-Blot eingesetzt werden. Diese Techniken sind dem Durchschnittsfachmann bekannt. (Siehe zum Beispiel Ausubel et al., 1988 Current Protocols in Molecular Biology, Wiley: New York).
Die Erfindung stellt weiterhin einen isolierten rekombinanten Expressionsvektor umfassend eine PHSRP-Nukleinsäure wie oben beschrieben bereit, wobei die Expression des Vektors in einer Wirtszelle zu einer im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Wirtszelle erhöhten Toleranz gegenüber Trockenheits- und/oder Temperaturstreß führt. Im vorliegenden Zusammenhang bezieht sich der Ausdruck "Vektor" auf ein Nukleinsäuremolekül, das eine andere Nukleinsäure, mit der es verbunden worden ist, transportieren kann. Eine Art von Vektor ist ein "Plasmid", was sich auf eine zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleife bezieht, in die zusätzliche DNA-Segmente ligiert werden können. Eine weitere Art Vektor ist ein viraler Vektor, wobei zusätzliche DNA-Segmente in das Virusgenom ligiert werden können. Bestimmte Vektoren von können autonom in einer Wirtszelle, in die sie eingebracht worden sind, replizieren (z. B. bakterielle Vektoren mit bakteriellem Replikationsursprung sowie episomale Säugetiervektoren). Andere Vektoren (z. B. nichtepisomale Säugetiervektoren) werden beim Einbringen in die Wirtszelle in das Genom einer Wirtszelle integriert und daher gemeinsam mit dem Wirtsgenom repliziert.
Außerdem können bestimmte Vektoren die Expression von Genen, mit denen sie operativ verbunden sind, steuern. Solche Vektoren werden im vorliegenden Text als "Expressionsvektoren" bezeichnet. Im allgemeinen weisen Expressionsvektoren, die für DNA-Rekombinationstechniken geeignet sind, oft die Form von Plasmiden auf. In der vorliegenden Beschreibung können "Plasmid" und "Vektor" austauschbar verwendet werden, da das Plasmid die am häufigsten verwendete Vektorform ist. Die Erfindung soll jedoch andere Expressionsvektorformen wie virale Vektoren (z. B. replikationsdefiziente Retroviren, Adenoviren und adenoverwandte Viren), die ähnliche Funktionen ausüben, umfassen.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren umfassen eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einer Form, die sich für die Expression der Nukleinsäure in einer Wirtszelle eignet, was bedeutet, daß die, rekombinanten. Expressionsvektoren eine oder mehrere Regulationssequenzen, die auf der Grundlage der für die Expression verwendeten Wirtszellen ausgewählt sind, umfassen und die operativ mit der zu exprimierenden Nukleinsäuresequenz verbunden ist. Bei einem rekombinanten Expressionsvektor soll "operativ verknüpft" bedeuten, daß die interessierende Nukleotidsequenz mit der Regulationssequenz bzw. den Regulationssequenzen so verbunden ist, daß die Expression der Nukleotidsequenz möglich ist (z. B. in einem in-vitro-Transkriptions-/Translationssystem oder in einer Wirtszelle, wenn der Vektor in die Wirtszelle eingebracht wird). Der Ausdruck "Regulationssequenz" soll Promoter, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente (z. B. Polyadenylierungssignale) umfassen. Solche Regulationssequenzen sind zum Beispiel beschrieben bei Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) oder siehe Gruber und Crosba, in: Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Hrsg. Glick und Thompson, Kapitel 7, 89–108, CRC Press: Boca Raton, Florida sowie die darin enthaltenen Literaturstellen. Zu den Regulationssequenzen zählen solche, die die konstitutive Expression einer Nukleotidsequenz in vielen Arten von Wirtszellen steuern und solche, die die direkte Expression der Nukleotidsequenz nur in bestimmten Wirtszellen unter bestimmten Bedingungen steuern. Der Fachmann weiß, daß die Gestaltung des Expressionsvektors von Faktoren wie der Auswahl der zu transformierenden Wirtszellen, dem Expressionsniveau des gewünschten Proteins usw. abhängen kann. Die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren können in Wirtszellen eingebracht werden, wodurch Proteine oder Peptide, darunter auch Fusionsproteine oder Fusionspeptide, die von Nukleinsäuren, wie im vorliegenden Text beschrieben, codiert werden, (z. B. PHSRP, Mutantenformen von PHSRP, Fusionsproteine usw.) erzeugt werden.
Die erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektoren können zur Expression von PHSRP in prokaryontische oder eukaryontische Zellen gestaltet sein. Zum Beispiel können PHSRP-Gene in Bakterienzellen wie C. glutamicum, Insektenzellen (mit Baculovirus-Expressionsvektoren), Hefezellen und anderen pilzlichen Zellen (siehe Romanos, M. A. et al., 1992, Foreign gene expression in yeast: a review, Yeast 8: 423–488; van den Hondel, C. A. M. J. J. et al., 1991 Heterologoders gene expression in filamentoders fungi, in: More Gene Manipulations in Fungi, J. W. Rennet & L. L. Lasure, Hrsg., S. 396–428: Academic Press: San Diego; und van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, P. J., 1991 Gene transfer systems and vector development for filamentoders fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, Peberdy, J. F. et al., Hrsg., S.1–28, Cambridge University Press: Cambridge), Algen (Falciatore et al., 1999 Marine Biotechnology 1(3): 239–251), Ciliaten der Arten: Holotrichia, Peritrichia, Spirotrichia, Suctoria, Tetrahymena, Paramecium, Colpidium, Glaucoma, Platyophrya, Potomacus, Pseudocohnilembus, Euplotes, Engelmaniella und Stylonychia, inbesondere der Gattung Stylonychia lemnae, mit Vektoren nach einem wie in WO 98/01572 beschriebenen Transformationsverfahren, und in Zellen von mehrzelligen Pflanzen (siehe Schmidt, R. und Willnitzer, L., 1988 High efficiency Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of Arabidopsis thaliana leaf and cotyledon explants, Plant Cell Rep. 583–586); Plant Molecular Biology and Biotechnology, C Press, Boca Raton, Florida, Kapitel 6/7, S. 71–119 (1993); F. F. White, B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg. Kung und R. Wu, 128–143, Academic Press: 1993; Potrykus, 1991 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol., 42: 205–225 und darin zitierte Literaturstellen) oder Säugetierzellen exprimiert werden. Geeignete Wirtszellen werden in Goeddel, Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press: San Diego, CA (1990) weiter erörtert. Alternativ dazu kann der rekombinante Expressionsvektor auch in vitro transkribiert und translatiert werden, zum Beispiel mit T7-Promoter-Regulationssequenzen und T7-Polymerase.
Die Expression von Proteinen in Prokaryonten erfolgt meist mit Vektoren, die konstitutive oder induzierbare Promoter enthalten, welche die Expression von Fusionsproteinen oder Nichtfusionsproteinen steuern. Fusionsvektoren fügen eine Reihe von Aminosäuren an ein darin codiertes Protein an, gewöhnlich an das aminoterminale Ende des rekombinanten Proteins, jedoch auch an das C-terminale Ende oder in Form einer Fusion innerhalb geeigneter Regionen in den Proteinen. Solche Fusionsvektoren haben üblicherweise drei Aufgaben: 1) die Verstärkung der Expression von rekombinantem Protein; 2) die Erhöhung der Löslichkeit eines rekombinanten Proteins; sowie 3) die Unterstützung bei der Reinigung des rekombinanten Proteins dadurch, daß sie als Ligand bei der Affinitätsreiningung agieren. Häufig wird bei Fusionsexpressionsvektoren an der Verbindungsstelle zwischen der Fusionseinheit und dem rekombinanten Protein eine proteolytische Spaltstelle eingeführt, so daß das rekombinante Protein von der Fusionseinheit nach der Reinigung des Fusionsproteins abgetrennt werden kann. Zu solchen Enzymen und ihren entsprechenden Erkennungssequenzen zählen Faktor Xa, Thrombin und Enterokinase.
Zu typischen Fusionsexpressionsvektoren zählen pGEX (Pharmacia Biotech Inc; Smith, D. B. und Johnson, K. S., 1988 Gene 67: 31–40), pMAL (New England Biolabs, Beverly, MA) und pRIT5 (Pharmacia, Piscataway, NJ), die die Glutathion-S-Transferase (GST), das Maltose-E-Bindungsprotein bzw. Protein A, an das rekombinante Zielprotein fusionieren. In einer Ausführungsform wird die Codiersequenz des PHSRPs in einen pGEX-Expressionsvektor kloniert, so daß ein Vektor entsteht, der für ein Fusionsprotein codiert, das vom N-terminalen Ende zum C-terminalen Ende GST-Thrombinspaltstelle-X-Protein umfaßt. Das Fusionsprotein kann mittels Affinitätschromatographie mit Glutathionagarose-Harz gereinigt werden. Rekombinantes PHSRP, das nicht mit GST fusioniert ist, kann durch Spaltung des Fusionsproteins mit Thrombin gewonnen werden.
Zu Beispielen von geeigneten induzierbaren Nichtfusions-E. coli-Expressionsvektoren zählen pTrc (Amann et al., 1988 Gene 69: 301–315) und pET 11d (Studier et al., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 60–89). Die Zielgenexpression vom pTrc-Vektor beruht auf der Transkription durch Wirts-RNA-Polymerase von einem trp-lac Hybridfusionspromoter. Die Zielgenexpression aus dem pET 11d-Vektor beruht auf der Transkription von einem T7 gn10-lac Fusionspromoter, die von einer coexprimierten Virus-RNA-Polymerase (T7 gnl) vermittelt wird. Diese Viruspolymerase wird von den Wirtsstellen BL21 (DE3) oder HMS174 (DE3) von einem residenten λ-Prophagen bereitgestellt, das ein T7 gnl-Gen unter der Transkriptionskontrolle des lacUV 5-Promoters birgt.
Eine Strategie zur Maximierung der Expression von rekombinantem Protein besteht darin, das Protein in einem Wirtsbakterium zu exprimieren, dessen Fähigkeit, das rekombinante Protein proteolytisch zu spalten, gestört ist (Gottesman, S., Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, California (1990) 119–128). Eine weitere Strategie besteht darin, die Nukleinsäuresequenz der. in einen Expressionsvektor zu insertierenden Nukleinsäure zu verändern, so daß die einzelnen Codons für jede Aminosäure diejenigen sind, die vorzugsweise in dem für die Expression ausgewählten Bakterium wie C. glutamicum verwendet werden (Wada et al., 1992 Nucleic Acids Res. 20: 2111–2118). Diese Veränderung der erfindungsgemäßen Nukleinsäuresequenzen kann durch standardmäßige DNA-Synthesetechniken erfolgen.
In einer weiteren Ausführungsform ist der PHSRP-Expressionvektor ein Hefe-Expressionsvektor. Beispiele für Vektoren zur Expression in der Hefe S. cerevisiae, umfassen pYepSecl (Baldari et al., 1987 Embo J. 6: 229–234), pMFa (Kurfan und Herskowitz, 1982 Cell 30: 933–943), pJRY88 (Schultz et al., 1987 Gene 54: 113–123) und pYES2 (Invitrogen Corporation, San Diego, CA). Vektoren und Verfahren zur Konstruktion von Vektoren, die sich, für die Verwendung in anderen Pilzen wie den Fadenpilzen eignen, umfassen diejenigen, die eingehend beschrieben sind in: van den Hondel, C. A. M. J. J. & Punt, PJ. (1991) "Gene transfer systems and vector development for filamentoders fungi, in: Applied Molecular Genetics of Fungi, J. F. Peberdy, et al., Hrsg., S.1–28, Cambridge University Press: Cambridge.
Alternativ dazu können die erfindungsgemäßen PHSRP in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus-Expressionsvektoren exprimiert werden. Baculovirus-Vektoren, die für die Expression von Proteinen in Insektenzellkulturen (z. B. Sf 9-Zellen) verfügbar sind, umfassen die pAc-Reihe (Smith et al., 1983 Mol. Cell. Biol. 3: 2156–2165) und die pVL-Reihe (Lucklow und Summers, 1989 Virology 170: 31–39).
In einer weiteren Ausführungsform wird eine erfindungsgemäße PHSRP-Nukleinsäure in Säugetierzellen unter Verwendung eines Säugetier-Expressionsvektors exprimiert. Säugetier-Expressionsvektoren umfassen zum Beispiel pCDM8 (Seed, B., 1987 Nature 329: 840) und pMT2PC (Kaufman et al., 1987 EMBO J. 6: 187–195). Bei der Verwendung in Säugetierzellen werden die Kontrollfunktionen des Expressionsvektors häufig von viralen Regulationselementen bereitgestellt. Zum Beispiel leiten sich häufig verwendete Promoter vom Polyoma-Virus, Adenovirus 2, Cytomegalievirus und Simian-Virus 40 ab. Weitere geeignete Expressionssysteme für prokaryontische und eukaryontische Zellen sind den Kapiteln 16 und 17 von Sambrook, J., Fritsh, E. F., und Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., Cold Spring Harbor Laboratory, (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989 zu entnehmen.
In einer anderen Ausführungsform kann der rekombinante Säugetier-Expressionsvektors die Expression der Nukleinsäure vorzugsweise in einem bestimmten Zelltyp steuern (z. B. werden für die Expression der Nukleinsäure gewebespezifische Regulationselemente eingesetzt). Gewebespezifische Regulationselemente sind im Fachgebiet bekannt. Zu nicht einschränkenden Beispielen für geeignete gewebespezifische Promoter zählen der Albumin-Promoter (leberspezifisch; Pinkert et al., 1987 Genes Dev. 1: 268–277), lymphoidspezifische Promoter (Calame und Eaton, 1988 Adv. Immunol. 43: 235–275), insbesondere Promoter von T-Zell-Rezeptoren (Winoto und Baltimore, 1989 EMBO J. 8: 729–733) und von Immunglobulinen (Banerji et al., 1983 Cell 33: 729–740; Queen und Baltimore, 1983 Cell 33: 741–748), neuronenspezifische Promoter (z. B. der Neurofilamentpromoter; Byrne und Ruddle, 1989 PNAS 86: 5473–5477), pankreasspezifische Promoter (Edlund et al., 1985 Science 230: 912–916) sowie milchdrüsenspezifische Promoter (z. B. Milchserumpromoter; US-Patent Nr. 4,873,316 sowie europäische Patentanmeldungsveröffentlichung Nr. 264,166 ). Auch entwicklungsregulierte Promoter sind mitumfaßt, zum Beispiel die hox-Promoter der Maus (Kessel und Gruss, 1990 Science 249: 374–379) und der Fetoproteinpromoter (Campes und Tilghman, 1989 Genes Dev. 3: 537–546).
In einer weiteren Ausführungsform können die erfindungsgemäßen PHSRP in einzelligen Pflanzenzellen (wie Algen, siehe Falciatore et al., 1999 Marine Biotechnology 1(3): 239–251 und darin zitierte Literaturangaben) und Pflanzenzellen aus höheren Pflanzen (z. B. die Spermatophyten, wie Kulturpflanzen) exprimiert werden. Beispiele für Pflanzenexpressionsvektoren umfassen solche, die eingehend beschrieben sind in: Becker, D., Kemper, E., Schell, J. und Masterson, R., 1992 New plant binary vectors with selectable markers located proximal to the left border, Plant Mol. Biol. 20: 1195–1197; und Bevan, M. W., 1984 Binary Agrobacterium vectors for plant transformation, Nucl. Acid. Res. 12: 8711–8721; Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in: Transgenic Plants, Band 1, Engineering and Utilization, Hrsg.: Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15–38.
Eine Pflanzenexpressionskassette enthält vorzugsweise Regulationssequenzen, die fähig sind, die Genexpression in Pflanzenzellen zu steuern und die operativ verknüpft sind, so daß jede Sequenz ihre Funktion, wie zum Beispiel Transkriptionstermination durch Polyadenylierungssignale, erfüllen kann. Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind solche, die aus Agrobacterium-tumefaciens-tDNA stammen, wie zum Beispiel das Gen 3 des Ti-Plasmids pTiACH5, das als Octopin-Synthase bekannt ist (Gielen et al., 1984 EMBO J. 3: 835) oder deren funktionelle Äquivalente, aber alle anderen in Pflanzen funktionell aktiven Terminatoren sind ebenfalls geeignet.
Da die pflanzliche Genexpression auf der Transkriptionsebene sehr häufig nicht beschränkt ist, enthält eine Pflanzenexpressionkassette andere operativ verknüpfte Sequenzen wie Translationsenhancer, beispielsweise die "overdrive"-Sequenz, die die 5'-untranslatierte Leitsequenz aus dem Tabakmosaikvirus, welche das Protein/RNA-Verhältnis erhöht, enthält (Gallie et al., 1987 Nucl. Acids Research, 15: 8693–8711).
Die pflanzliche Genexpression muß operativ mit einem geeigneten Promoter verknüpft sein, der die Genexpression auf zeitlich spezifische, zellspezifische oder gewebespezifische Weise herbeiführt. Bevorzugt sind Promoter, die eine konstitutive Expression vorantreiben (Benfey et al., 1989 EMBO J. 8: 2195–2202), wie diejenigen, die von Pflanzenviren abstammen, wie dem 35S CAMV (Franck et al., 1980 Cell 21: 285–294), dem 19S CaMV (siehe auch US-Patent Nr. 5352605 und PCT-Anmeldungsnr. WO 8402913 ) oder pflanzlichen Promotern, wie der in US-Patent Nr. 4 962 028 beschriebenen kleinen Untereinheit der Rubisco.
Andere bevorzugte Sequenzen für den Gebrauch in pfanzlichen Genexpressionskassetten sind Zielsequenzen, die erforderlich sind, um das Genprodukt in sein entsprechendes Zellkompartiment zu adressieren (siehe Übersichtsartikel von Kermode, 1996 Crit. Rev. Plant Sci. 15(4): 285–423, sowie darin zitierte Literaturstellen), beispielsweise in die Vakuole, den Zellkern, alle Arten von Plastiden wie Amyloplasten, Chloroplasten, Chromoplasten, den extrazellulären Raum, die Mitochondrien, das endoplasmatische Retikulum, Ölkörper, Peroxysome sowie andere Kompartimente von Pflanzenzellen.
Die pflanzliche Genexpression läßt sich auch über einen induzierbaren Promoter erleichtern (siehe Übersichtsartikel von Gatz, 1997 Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 48: 89–108). Chemisch induzierbare Promoter eignen sich besonders, wenn es erwünscht ist, daß die Genexpression zeitspezifisch stattfindet. Beispiele für solche Promoter sind ein salicylsäureinduzierbarer Promoter (PCT-Anmeldung Nr. WO 95/19443 ), ein tetracyclininduzierbarer Promoter (Gatz et al., 1992 Plant J. 2: 397–404) und ein ethanolinduzierbarer Promoter (PCT-Anmeldung Nr. WO 93/21334 ).
Geeignete Promoter sind auch Promoter, die auf biotische oder abiotische Streßbedingungen reagieren, wie der pathogeninduzierbare PRP1-Gen-Promoter (Ward et al., 1993 Plant. Mol. Biol. 22: 361–366), der hitzeinduzierbare hsp80-Promoter aus der Tomate ( US-Patent Nr. 5187267 ), der kälteinduzierbare alpha-Amylase-Promoter aus der Kartoffel (PCT-Anmeldung Nr. WO 96/12814 ) oder der wundinduzierbare pinII-Promoter ( Europäisches Patent Nr. 375091 ). Für weitere Beispiele von trockenheits-, kälte- und salzinduzierbaren Promotern, wie der RD29A-Promoter, siehe Yamaguchi-Shinozalei et al. (1993 Mol. Gen. Genet. 236: 331–340).
Insbesondere bevorzugt sind solche Promoter, die die Genexpression in spezifischen Geweben und Organen wie Schließzellen und den Wurzelhaarzellen herbeiführen. Zu geeigneten Promotern zählen der Napin-Gen-Promoter aus Raps ( US-Patent Nr. 5608152 ), der USP-Promoter aus Vicia faba (Baeumlein et al., 1991 Mol Gen Genet. 225(3): 459–467), der Oleosin-Promoter aus Arabidopsis (PCT-Anmeldung Nr. WO 98/45461 ), der Phaseolin-Promoter aus Phaseolus vulgaris ( US-Patent. Nr. 5504200 ), der Bce4-Promoter aus Brassica (PCT-Anmeldung Nr. WO 91/13980 ) oder der Legumin-B4-Promoter (LeB4; Baeumlein et al., 1992 Plant Journal, 2(2): 233–239), sowie Promoter, die die samenspezifische Expression in monokotylen Pflanzen wie Mais, Gerste, Weizen, Roggen, Reis usw. herbeiführen. Geeignete bemerkenswerte Promoter sind der lpt2- oder lpt1-Gen-Promoter aus der Gerste (PCT-Anmeldung Nr. WO 95/15389 und PCT-Anmeldung Nr. WO 95/23230 ) oder diejenigen, die in der PCT-Anmeldung Nr. WO 99/16890 beschrieben sind (Promoter vom Gersten-Hordein-Gen, Reis-Glutelin-Gen, Reis-Oryzin-Gen, Reis-Prolamin-Gen, Weizen-Gliadin-Gen, Weizen-Glutelin-Gen, Mais-Zein-Gen, Hafer-Glutelin-Gen, Sorghum-Kasirin-Gen und Roggen-Secalin-Gen).
Ebenfalls besonders geeignet sind Promoter, die die plastidenspezifische Genexpression herbeiführen, da die Plastiden dasjenige Kompartiment sind, in dem die Lipidbiosynthese stattfindet. Geeignete Promoter sind der virale RNA-Polymerase Promoter, der in der PCT-Anmeldung Nr. WO 95/16783 und der PCT-Anmeldung Nr. WO 97/06250 beschrieben ist sowie der clpP-Promoter aus Arabidopsis, der in der PCT-Anmeldung Nr. WO 99/46394 beschrieben ist.
Die Erfindung stellt außerdem einen rekombinanten Expressionsvektor bereit, der ein erfindungsgemäßes PHSRP-DNA-Molekül, das in den Expressionsvektor in antisense-Richtung kloniert ist, umfaßt. Das heißt, das DNA-Molekül ist operativ so mit einer Regulationssequenz verknüpft, daß es die Expression (durch Transkription des DNA-Moleküls) eines RNA-Moleküls, das antisense zu einer PHSRP-mRNA ist, gestattet. Es können Regulationssequenzen ausgewählt werden, die operativ mit einer in antisense-Richtung klonierten Nukleinsäure verknüpft sind und die die kontinuierliche Expression des antisense-RNA-Moleküls in verschiedensten Zelltypen steuern. Zum Beispiel können virale Promoter und/oder Enhancer oder Regulationssequenzen ausgewählt werden, die die konstitutive, gewebespezifische oder zelltypspezifische Expression von antisense-RNA steuern. Der antisense-Expressionsvektor kann in Form eines rekombinanten Plasmids, eines Phagemids oder eines attenuierten Virus vorliegen, in dem antisense-Nukleinsäuren unter der Kontrolle einer hochwirksamen Regulationsregion produziert werden. Die Aktivität der Regulationsregion kann durch den Zelltyp, in den der Vektor eingebracht worden ist, bestimmt werden. Ein Diskurs über die Regulation der Genexpression mit antisense-Genen findet sich bei Weintraub, H. et al., Antisense RNA as a molecular tool for genetic analysis, Reviews – Trends in Genetics, Band 1(1) 1986 und Mol et al., 1990 FEBS Letters 268: 427–430.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Wirtszellen, in die ein erfindungsgemäßer rekombinanter Expressionsvektor eingebracht worden ist. Die Begriffe "Wirtszelle" und "rekombinante Wirtszelle" werden im vorliegenden Zusammenhang untereinander austauschbar verwendet. Selbstverständlich betreffen solche Begriffe nicht nur die jeweilige Zielzelle, sondern auch die Nachkommenschaft oder potentielle Nachkommenschaft dieser Zelle. Da in Folgegenerationen aufgrund von Mutation oder Umwelteinflüssen bestimmte Modifikationen auftreten können, muß solch eine Nachkommenschaft nicht unbedingt mit der Elternzelle identisch sein, ist jedoch noch immer vom Umfang des Begriffs, wie im vorliegenden Zusammenhang verwendet, umfaßt.
Bei einer Wirtszelle kann es sich um eine beliebige prokaryontische oder eukaryontische Zelle handeln. Zum Beispiel kann ein PHSRP in Bakterienzellen wie C. glutamicum, in Insektenzellen, Pilzzellen oder Säugetierzellen (wie Ovarienzellen des chinesischen Hamsters (CHO) oder COS-Zellen), Algen, Ciliaten, Pflanzenzellen, Pilzen oder anderen Mikroorganismen wie C. glutamicum exprimiert werden. Weitere geeignete Wirtszellen sind dem Fachmann bekannt.
Vektor-DNA kann mittels herkömmlicher Transformations- oder Transfektionstechniken in prokaryontische oder eukaryontische Zellen eingebracht werden. Die Begriffe "Transformation", "Transfektion", "Konjugation" und "Transduktion" bedeuten im vorliegenden Zusammenhang eine Vielzahl von im Stand der Technik bekannten Verfahren zum Einbringen von fremder Nukleinsäure (z. B. DNA) in eine Wirtszelle, darunter die Calciumphosphat- oder Calciumchlorid-Copräzipitation, die DEAE-Dextranvermittelte Transfektion, die Lipofektion, natürliche Kompetenz, chemisch vermittelter Transfer oder Elektroporation. Geeignete Verfahren zur Transformation oder Transfektion von Wirtszellen, darunter auch Pflanzenzellen, finden sich bei Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989) sowie anderen Laborhandbüchern wie Methods in Molecular Biology, 1995, Band 44, Agrobacterium protocols, Hrsg.: Gartland und Davey, Humana Press, Totowa, New Jersey. Eine Toleranz gegenüber biotischem und abiotischem Streß ist ein allgemeines Merkmal, das in verschiedenste Pflanzen wie Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuß, Baumwolle, Raps und Canola, Maniok, Pfeffer, Sonnenblume und Tagetes, Solanaceen-Pflanzen wie Kartoffel, Tabak, Aubergine und Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Luzerne, Strauchpflanzen (Kaffee, Kakao, Tee), Salix-Arten, Bäume (Ölpalme, Kokosnuß), mehrjährige Gräser und Grünfutterkulturen vererbt werden soll, wobei diese Kulturpflanzen auch bevorzugte Zielpflanzen. für eine Gentechnik als eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind.
Insbesondere stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit einer für PHSRP codierenden Nukleinsäure bereit, wobei die Expression der Nukleinsäure(n) in der Pflanze zu einer im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanze erhöhten Toleranz gegenüber Trockenheits- und/oder Temperaturstreß führt, umfassend die folgenden Schritte: (a) Transformieren einer Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor, umfassend eine PHSRP-Nukleinsäure, und (b) Erzeugen, aus der Pflanzenzelle, einer transgenen Pflanze mit einer im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanze erhöhten Toleranz gegenüber Trockenheits- und/oder Temperaturstreß. Außerdem stellt die Erfindung ein Verfahren zum Erhöhen der Expression eines interessierenden Gens innerhalb einer Wirtszelle im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Wirtszelle bereit, wobei das interessierende Gen in Reaktion auf ein PHSRP transkribiert wird, umfassend die folgenden Schritte: (a) Transformieren der Wirtszelle mit einem Expressionsvektor, umfassend eine für PHSRP codierende Nukleinsäure, und (b) Exprimieren des PHSRPs innerhalb der Wirtszelle, wodurch die Expression des in Reaktion auf das PHSRP transkribierten Gens im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Wirtszelle verstärkt wird.
Für solch eine Pflanzentransformation können binäre Vektoren wie pBinAR eingesetzt werden (Höfgen und Willmitzer, 1990 Plant Science 66: 221–230). Die Konstruktion von binären Vektoren kann durch Ligation der cDNA in sense- oder antisense-Orientierung in die T-DNA erfolgen. 5' von der cDNA aktiviert ein pflanzlicher Promoter die Transkription der cDNA. 3' von der cDNA befindet sich eine Polyadenylierungssequenz. Eine gewebespezifische Expression läßt sich durch Verwendung eines gewebespezifischen Promoters erzielen. Zum Beispiel läßt sich eine samenspezifische Expression dadurch erzielen, daß man den Napin- oder LeB4- oder USP-Promoter 5' von der cDNA kloniert. Jedes beliebige andere samenspezifische Promoterelement kann ebenfalls verwendet werden. Zur konstitutiven Expression innerhalb der ganzen Pflanze kann der CaMV 35S Promoter eingesetzt werden. Das exprimierte Protein kann mit einem Signalpeptid, zum Beispiel für Plastiden, Mitochondrien oder das endoplasmatische Retikulum, in ein Zellkompartiment zielgesteuert werden (Kermode, 1996 Crit. Rev. Plant Sci. 4 (15): 285–423). Das Signalpeptid wird 5' leserastergerecht mit der cDNA kloniert, um eine subzelluläre Lokalisierung des Fusionproteins zu erreichen. Außerdem können Promoter eingesetzt werden, die auf abiotische Streßfaktoren reagieren, wie der RD29A-Promoter aus Arabidopsis, wobei die Nukleinsäuresequenzen im vorliegenden Text beschrieben sind. Dem Fachmann wird klar, daß der eingesetzte Promoter so mit der Nukleinsäure operativ verbunden sein soll, daß der Promoter eine Transkription der Nukleinsäure verursacht, was zur Synthese einer mRNA, die für ein Polypeptid codiert, führt. Die RNA kann jedoch auch eine antisense-RNA zur Hervorrufung einer anschließenden Expression desselben oder eines anderen Gens oder von anderen Genen sein.
Zu alternativen Methoden der Transfektion zählen der direkte DNA-Transfer in sich entwickelnde Blüten mittels Elektroporation oder der Agrobacteriumvermittelte Gentransfer. Die Agrobacterium-vermittelte Pflanzentransformation kann zum Beispiel unter Verwendung des Agrobacterium-tumefaciens-Stamm GV3101 (pMP90) (Koncz und Schell, 1986 Mol. Gen. Genet. 204: 383–396) oder LBA4404 (Clontech) durchgeführt werden. Die Transformation kann nach standardmäßigen Transformations- und Regenerationstechniken durchgeführt werden (Deblaere et al., 1994 Nucl. Acids. Res. 13: 4777–4788; Gelvin, Stanton B. und Schilperoort, Robert A, Plant Molecular Biology Manual, 2. Auflage – Dordrecht: Kluwer Academic Publ., 1995. – in Sekt., Ringbuch Zentrale Signatur: BT11-P ISBN 0-7923-2731-4; Glick, Bernard R.; Thompson, John E., Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology, Boca Raton:CRC Press, 1993. – 360 S., ISBN 0-8493-5164-2). Raps beispielsweise kann mittels Kotyledonen- oder Hypokotyltransformation transformiert werden (Moloney et al., 1989 Plant Cell Report 8: 238–242; De Block et al., 1989 Plant Physiol. 91: 694–701). Die Verwendung von Antibiotika für die Agrobacterium- und Pflanzenselektion hängt von dem für die Transformation verwendeten binären Vektor und Agrobacteriumstamm ab.
Die Rapsselektion wird gewöhnlich unter Verwendung von Kanamycin als selektierbarem Pflanzenmarker durchgeführt. Der Agrobacterium-vermittelte Gentransfer bei Flachs läßt sich unter Verwendung von beispielsweise einer von Mlynarova et al., 1994 Plant Cell Report 13: 282–285 beschriebenen Technik durchführen. Außerdem kann die Transformation der Sojabohne unter Verwendung von z. B. einer in dem europäischen Patent Nr. 0424 047 , in dem US-Patent Nr. 5,322,783 , in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0397 687 , in dem US-Patent Nr. 5,376,543 oder in dem US-Patent Nr. 5,169,770 beschriebenen Technik durchgeführt werden. Die Transformation von Mais kann mittels Beschuß mit der Genkanone, der polyethylenglykolvermittelten DNA-Aufnahme oder mit der Siliciumcarbidfasertechnik erzielt werden. (Siehe zum Beispiel Freeling und Walbot "The maize handbook" Springer Verlag: New York (1993) ISBN 3-540-97826-7). Ein spezifisches Beispiel für die Transformation von Mais findet sich in US-Patent Nr. 5,990,387 und ein spezifisches Beispiel für die Transformation von Weizen in der PCT-Anmeldung Nr. WO 93/07256 .
Bei der stabilen Transfektion von Säugetierzellen ist bekannt, daß je nach dem verwendeten Expressionsvektor und der verwendeten Transfektionstechnik nur ein kleiner Teil der Zellen die Fremd-DNA in ihr Genom integriert. Zur Identifikation und Selektion dieser Integranten wird gewöhnlich ein Gen, das für einen selektierbaren Marker (z. B. Resistenz gegen Antibiotika) codiert, zusammen mit dem interessierenden Gen in die Wirtszellen eingebracht. Bevorzugte selektierbare Marker umfassen solche, die Resistenz gegen Medikamente wie G418, Hygromycin und Methotrexat verleihen, oder in Pflanzen solche, die Resistenz gegen ein Herbizid wie Glyphosate oder Glufosinate verleihen. Nukleinsäuremoleküle, die für einen selektierbaren Marker codieren, können in einer Wirtszelle auf demselben Vektor wie derjenige, der für ein PHSRP codiert, oder auf einem separaten Vektor eingeführt werden. Zellen, die mit dem eingebrachten Nukleinsäuremolekül stabil transfiziert worden sind, können zum Beispiel durch Selektion mit Medikamenten identifiziert werden (z. B. überleben Zellen, die den selektierbaren Marker integriert haben, während die andern Zellen absterben.)
Zur Erzeugung eines homolog rekombinierten Mikroorganismus wird ein Vektor hergestellt, der zumindest einen Abschnitt eines PHSRP-Gens enthält, in den eine Deletion, Addition oder Substitution eingebracht worden ist, um auf diese Weise das PHSRP-Gen zu verändern, z. B. funktionell zu stören. Vorzugsweise ist dieses PHSRP-Gen ein PHSRP-Gen aus Physcomitrella patens, es kann jedoch ein Homolog aus einer verwandten Pflanze oder sogar aus einem Säugetier-, Hefe- oder Insektenausgangsmaterial verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Vektor dergestalt, daß das endogene PHSRP-Gen bei homologer Rekombination funktionell gestört wird (d. h. nicht mehr für ein funktionelles Protein codiert, auch als Knock-Out-Vektor bezeichnet). Der Vektor kann jedoch auch dergestalt sein, daß das endogene PISRP-Gen bei homologer Rekombination mutiert oder anderweitig verändert wird, jedoch trotzdem noch ein funktionelles Protein codiert (z. B. kann der stromaufwärts gelegene regulatorische Bereich so verändert sein, daß dadurch die Expression des endogenen PHSRPs verändert wird). Zur Erzeugung einer Punktmutation mittels homologer Rekombination können in einem als Chimeraplastie bekannten Verfahren DNA-RNA-Hybride verwendet werden (Cole-Strauss et al., 1999 Nucleic Acids Research 27(5): 1323–1330 und Kmiec, 1999 Gene therapy American Scientist. 87(3): 240–247).
Homologe Rekombinationsverfahren in Physcomitrella patens sind ebenfalls in der Fachwelt gut bekannt und werden hier für die Verwendung in Betracht gezogen.
In dem homologen Rekombinationsvektor ist jedoch der veränderte Abschnitt des PHSRP-Gens an seinen 5'- und 3'-Enden von einem zusätzlichen Nukleinsäuremolekül des PHSRP-Gens flankiert, so daß eine homologe Rekombination zwischen dem exogenen PHSRP-Gen, das von dem Vektor getragen wird, und einem endogenen PISRP-Gen in einem Mikroorganismus oder einer Pflanze möglich ist. Das zusätzliche flankierende PHSRP-Nukleinsäuremolekül ist für eine erfolgreiche homologe Rekombination mit dem endogenen Gen ausreichend lang. Typischerweise beinhaltet der Vektor mehrere hundert Basenpaare bis zu Kilobasen flankierender DNA (sowohl am 5'- als auch am 3'-Ende) (siehe z. B. Thomas, K. R., und Capecchi, M. R., 1987 Cell 51: 503 für eine Beschreibung von homologen Rekombinationsvektoren oder Strepp et al., 1998 PNAS, 95 (8): 4368–4373 für die Rekombination in Physcomitrella patens auf cDNA-Grundlage). Der Vektor wird in einen Mikroorganismus oder eine Pflanzenzelle eingebracht (z. B. mittels polyethylenglykolvermittelter DNA), und Zellen, in denen das eingebrachte PHSRP-Gen mit dem endogenen PHSRP-Gen homolog rekombiniert hat, werden unter Verwendung von fachbekannten Techniken selektiert.
In einer anderen Ausführungsform können rekombinante Mikroorganismen hergestellt werden, die ausgewählte Systeme enthalten, welche eine regulierte Expression des eingebrachten Gens ermöglichen. So ermöglicht zum Beispiel die Mitverwendung eines PHSRP-Gens auf einem Vektor, wobei es unter die Kontrolle des lac-Operons gebracht wird, die Expression des PHSRP-gens nur in Gegenwart von IPTG. Solche Regulationssysteme sind in der Fachwelt gut bekannt.
Eine erfindungsgemäße Wirtszelle, wie eine prokaryontische oder eukaryontische Wirtszelle, die in Kultur wächst, kann zur Produktion (d. h. Expression) eines PHSRPs verwendet werden. Dementsprechend stellt die Erfindung weiterhin Verfahren zur Herstellung von PHSRP unter Verwendung der erfindungsgemäßen Wirtszellen bereit. In einer Ausführungsform umfaßt das Verfahren die Kultivierung der erfindungsgemäßen Wirtszelle (in die ein rekombinanter Expressionsvektor, der für ein PHSRP codiert, eingebracht worden ist, oder in deren Genom ein Gen eingebracht worden ist, das für ein Wildtyp-PHSRP oder ein verändertes PHSRP codiert) in einem geeigneten Medium, bis das PHSRP produziert worden ist. In einer weiteren Ausführungsform umfaßt das Verfahren ferner das Isolieren des PHSRPs aus dem Medium oder der Wirtszelle.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft isolierte PHSRP und biologisch aktive Teile davon. Ein "isoliertes" oder "aufgereinigtes" Protein oder biologisch aktive Teile davon ist/sind frei von einem Teil des Zellmaterials, wenn die Produktion mittels rekombinanter DNA-Techniken erfolgt, bzw. von chemischen Vorstufen oder sonstigen Chemikalien, wenn die Synthese chemisch erfolgt. Der Ausdruck "im wesentlichen frei von Zellmaterial" beinhaltet PHSRP-Präparate, in denen das Protein von einem Teil der Zellbestandteile der Zellen, in denen es natürlich oder rekombinant produziert wurde, getrennt ist. In einer Ausführungsform beinhaltet der Begriff "im wesentlichen frei von Zellmaterial" Präparate eines PHSRPs mit weniger als ungefähr 30% (Trockengewicht) nicht-PHSRP-Material (im vorliegenden Zusammenhang auch als "verunreinigendes Protein" bezeichnet), stärker bevorzugt mit weniger als ungefähr 20% nicht-PHSRP-Material, noch stärker bevorzugt mit weniger als ungefähr 10% nicht-PHSRP-Material, und am stärksten bevorzugt bevorzugt mit weniger als ungefähr 5% nicht-PHSRP-Material.
Wird das PHSRP oder ein biologisch aktiver Teil davon rekombinant produziert, so ist es/er vorzugsweise auch im wesentlichen frei von Kulturmedium, d. h. Kulturmedium macht weniger als ungefähr 20%, stärker bevorzugt weniger als ungefähr 10% und am stärksten bevorzugt weniger als ungefähr 5% des Volumens des Proteinpräparats aus. Der Begriff "im wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder sonstigen Chemikalien" beinhaltet PHSRP-Präparate, in denen das Protein von chemischen Vorstufen oder anderen Chemikalien, die eine Rolle in der Synthese des Proteins spielen, getrennt ist. In einer Ausführungsform beinhaltet der Begriff "im wesentlichen frei von chemischen Vorstufen oder sonstigen Chemikalien" Präparate eines PHSRPs mit weniger als ungefähr 30% (Trockengewicht) chemischen Vorstufen oder nicht-PHSRP-Chemikalien, stärker bevorzugt weniger als ungefähr 20% chemischen Vorstufen oder nicht-PHSRP-Chemikalien, noch stärker bevorzugt weniger als ungefähr 10% chemischen Vorstufen oder nicht-PHSRP-Chemikalien und am stärksten bevorzugt weniger als ungefähr 5% chemischen Vorstufen oder nicht-PHSRP-Chemikalien. In bevorzugten Ausführungsformen liegen in isolierten Proteinen oder biologisch aktiven Teilen davon keine verunreinigenden Proteine aus demselben Organismus, aus dem das PHSRP stammt, vor. Typischerweise werden solche Proteine durch rekombinante Expression von z. B. einem PHSRP aus Physcomitrella patens in Pflanzen bei denen es sich nicht um Physcomitrella patens handelt oder Mikroorganismen wie C. glutamicum, Ciliaten, Algen oder Pilzen produziert.
Die im vorliegenden Text beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, Proteine, Proteinhomologe, Fusionsproteine, Primer, Vektoren und Wirtszellen können in einer oder mehreren der folgenden Methoden eingesetzt werden: Identifikation von Physcomitrella patens und verwandten Organismen; Kartierung von Genomen von Organismen, die mit Physcomitrella patens verwandt sind; Identifikation und Lokalisierung von interessierenden Physcomitrella patens-Sequenzen; Evolutionsstudien; Bestimmung von PHSRP-Regionen, die für die Funktion erforderlich sind; Modulation einer PHSRP-Aktivität; Modulation des Stoffwechsels von einer oder mehreren Zellfunktionen; Modulation des Transports von einer oder mehreren Verbindungen über die Membranen hinweg; sowie Modulation der Streßresistenz.
Das Moos Physcomitrella patens ist ein Vertreter der Moose. Es ist mit anderen Moosen verwandt, wie Ceratodon purpureus, das in Abwesenheit von Licht wachsen kann. Moose wie Ceratodon und Physcomitrella sind auf DNA-Sequenz- und Polypeptid-Ebene stark homolog zueinander, was die Verwendung von einem heterologen Screening von DNA-Molekülen mit Sonden, die von anderen Moosen oder Organismen stammen, ermöglicht, so daß eine Konsensussequenz abgeleitet werden kann, die sich für das heterologe Screening oder für die funktionelle Annotation und Vorhersage von Genfunktionen in dritten Arten eignet. Die Fähigkeit, diese Funktionen zu identifizieren, z. B. die Vorhersage der Substratspezifität von Enzymen, kann daher von signifikanter Bedeutung sein. Ferner können diese Nukleinsäuremoleküle als Referenzpunkte für die Kartierung von Moosgenomen oder von Genomen von verwandten Organismen dienen.
Das erfindungsgemäße PHSRP-Nukleinsäuremolekül eignet sich für verschiedene Zwecke. Am wichtigsten ist, daß die erfindungsgemäße Nuklein- und Aminosäuresequenz für die Transformation von Pflanzen eingesetzt werden kann, wodurch eine Toleranz gegenüber Streßfaktoren wie Trockenheit induziert wird.
Die vorliegende Erfindung stellt daher eine transgene Pflanze bereit, die mit einer PHSRP-Nukleinsäure transformiert ist, wobei die Expression der Nukleinsäuresequenz in der Pflanze zu einer im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanze erhöhten Toleranz gegenüber Trockenheits- und/oder Temperaturstreß führt. Bei der transgenen Pflanze kann es sich um eine monokotyle oder dikotyle Pflanze handeln. Die Erfindung sieht weiterhin vor, daß die transgene Pflanze aus der Gruppe Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuß, Baumwolle, Raps, Canola, Maniok, Pfeffer, Sonnenblume, Tagetes, Solanaceen-Pflanzen, Kartoffel, Tabak, Aubergine, Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Luzerne, Kaffee, Kakao, Tee, Salix-Arten, Ölpalme, Kokosnuß, mehrjährige Gras- und Futterkulturen stammt.
Insbesondere beschreibt die vorliegende Erfindung die Verwendung der Expression von PP2A-4 (SEQ ID NO: 13) aus Physcomitrella patens zur Konstruktion von trockenheitstoleranten Pflanzen. Diese Strategie wurde hierin für Arabidopsis thaliana, Raps/Canola, Sojabohnen, Mais und Weizen nachgewiesen, ihre Anwendung ist jedoch nicht auf diese Pflanzen beschränkt. Die Erfindung stellt demgemäß eine transgene Pflanze, enthaltend ein PHSRP aus der Gruppe Protein Phosphatase 2A, bereit, wobei der Umweltstreß Trockenheit oder Temperatur ist. In bevorzugten Ausführungsformen ist der Umweltstreß Trockenheit oder erniedrigte Temperatur.
Die vorliegende Erfindung sieht auch Verfahren zum Modifizieren der Streßtoleranz einer Pflanze vor, bei dem die Expression eins PHSRPs in der Pflanze modifiziert wird. Die Erfindung sieht vor, daß dieses Verfahren so durchgeführt werden kann, daß die Streßtoleranz entweder erhöht oder erniedrigt ist. Insbesondere sieht die vorliegende Erfindung Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze mit einer im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanze erhöhten Toleranz gegenüber Trockenheits- und/oder Temperaturstreß vor, wobei die Expression eines PHSRPs in einer Pflanze erhöht ist.
Die Verfahren zur Erhöhung der Expression von PHSRP können eingesetzt werden, wobei die Pflanze entweder transgen oder nicht transgen ist. Ist die Pflanze transgen, so kann die Pflanze zum Beispiel mit einem Vektor transformiert werden, der beliebige der oben beschriebenen, für PHSRP codierenden Nukleinsäuren enthält oder die Pflanze kann mit einem Promoter transformiert werden, der zum Beispiel die Expression von nativem PHSRP in der Pflanze kontrolliert. Die Erfindung sieht vor, daß solch ein Promoter gewebespezifisch sein kann. Weiterhin kann solch ein Promoter entwicklungsreguliert sein. Alternativ dazu können nicht transgene Pflanzen eine native PHSRP-Expression aufweisen, die durch Induktion eines nativen Promoters modifiziert ist.
Die Expression von PP2A-4 (SEQ ID NO: 13) in Zielpflanzen kann mit einem der folgenden Beispiele erreicht werden, ist jedoch nicht auf diese beschränkt: (a) konstitutiver Promoter, (b) streßinduzierbarer Promoter, (c) chemisch induzierbarer Promoter und (d) konstruierte Promoterüberexpression mit zum Beispiel zinkfingerabgeleiteten Transkriptionsfaktoren (Greisman und Pabo, 1997 Science 275: 657). Dieser Fall beinhaltet die Identifikation der PP2A-4 (SEQ ID NO: 13)-Homologen in der Zielpflanze sowie von seinem Promoter. Zinkfingerhaltige rekombinante Transkriptionsfaktoren werden so konstruiert, daß sie spezifisch mit dem PP2A-4 (SEQ ID No: 13)-Homolog interagieren, und daß die Transkription des entsprechenden Gens aktiviert wird.
Zusätzlich zum Einführen der PHSRP-Nukleinsäuresequenzen in transgene Pflanzen können diese Sequenzen auch zum Identifizieren eines Organismus als Physcomitrella patens oder nahen Verwandten davon eingesetzt werden. Außerdem können sie zum Identifizieren des Vorliegens von Physcomitrella patens oder einem Verwandten davon in einer Mikroorganismen-Mischpopulation eingesetzt werden. Die Anmeldung sieht die Nukleinsäuresequenzen von mehreren Physcomitrella patens-Genen vor; dadurch daß man die extrahierte genomische DNA einer Kultur einer einzelnen Population oder einer Mischpopulation von Mikroorganismen unter stringenten Bedingungen mit einer Sonde, die eine Region eines Physcomitrella patens-Gens, das für diesen Organismus einzigartig ist, umfaßt, sondiert, läßt sich bestimmen, ob dieser Organismus vorhanden ist.
Die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle können ferner als Marker für bestimmte Bereiche des Genoms dienen. Dies eignet sich nicht nur für das Kartieren des Genoms, sondern auch für Funktionsstudien von Physcomitrella patens-Proteinen. Zur Identifikation des Genombereichs an den ein bestimmtes Physcomitrella patens DNA-bindendes Protein bindet, kann zum Beispiel das Physcomitrella patens-Genom verdaut und die Fragmente mit dem DNA-bindenden Protein inkubiert werden. Die Fragmente, die das Protein binden, können zusätzlich mit den erfindungsgemäßen Nukleinsäuremolekülen, vorzugsweise mit leicht erkennbaren Markern, sondiert werden. Die Bindung eines solchen Nukleinsäuremoleküls an das Genomfragment ermöglicht die Lokalisierung des Fragments auf der Genomkarte von Physcomitrella patens und, wenn dies mehrmals mit unterschiedlichen Enzymen durchgeführt wird, erleichtert es eine rasche Bestimmung der Nukleinsäuresequenz, an die das Protein bindet. Die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle können außerdem hinreichend homolog zu den Sequenzen von verwandten Arten sein, so daß diese Nukleinsäuremoleküle als Marker zum Erstellen einer Genomkarte in verwandten Moosen dienen können.
Die erfindungsgemäßen PHSRP-Nukleinsäuremoleküle eignen sich auch für Evolutions- und Proteinstrukturstudien. Die Stoffwechsel- und Transportprozesse, an denen die erfindungsgemäßen Moleküle beteiligt sind, werden von einer Vielzahl von prokaryontischen und eukaryontischen Zellen genutzt; durch Vergleich der Sequenzen der Nukleinsäuremoleküle der vorliegenden Erfindung mit solchen, die für ähnliche Enzyme von anderen Organismen codieren, kann der evolutionäre Verwandtschaftsgrad der Organismen bestimmt werden. Auf ähnliche Art und Weise ermöglicht ein solcher Vergleich eine Bestimmung derjenigen Regionen der Sequenz, die konserviert sind und die es nicht sind, was bei der Bestimmung solcher Bereiche des Proteins hilfreich sein kann, die für die Enzymfunktion essentiell sind. Diese Art von Bestimmung ist für proteintechnologische Untersuchungen wertvoll und kann einen Hinweis darauf geben, wieviel Mutagenese das Protein vertragen kann, ohne seine Funktion zu verlieren.
Eine Manipulation der erfindungsgemäßen PHSRP-Nukleinsäuremoleküle kann zur Produktion von PHSRP mit funktionellem Unterschied zu den Wildtyp-PHSRP führen. Diese Proteine können bezüglich ihrer Effizienz oder Aktivität verbessert sein, können in größerer Anzahl als normal in der Zelle vorliegen oder können bezüglich ihrer Effizienz oder Aktivität geschwächt sein. Es gibt verschiedene Mechanismen, über die Veränderung eines erfindungsgemäßen PHSRPs die Streßreaktion und/oder Streßtoleranz direkt beeinflussen kann. Bei Pflanzen, die PHSRPe exprimieren, kann ein erhöhter Transport zu einer verbesserten Verteilung von Salzen und/oder gelösten Bestandteilen innerhalb des Pflanzengewebes und der Organe führen. Dadurch, daß die Anzahl oder Aktivität von Transportermolekülen, die innenartige Moleküle aus der Zelle exportieren, erhöht wird, kann es möglich sein, die Salztoleranz der Zelle zu beeinflussen.
Die Auswirkung der genetischen Modifikation bei Pflanzen, C. glutamicum, Pizen, Algen oder Ciliaten auf die Streßtoleranz kann dadurch beurteilt werden, daß der modifizierte Mikroorganismus bzw. die modifizierte Pflanze unter suboptimalen Bedingungen gezüchtet und anschließend die Wachstumseigenschaften und/oder der Metabolismus der Pflanze analysiert wird. Solche Analysetechniken sind dem Fachmann gut bekannt; dazu zählen Trockengewicht, Frischgewicht, Proteinsynthese, Kohlenhydratsynthese, Lipidsynthese, Evapotranspirationsraten, allgemeiner Pflanzen- und/oder Ernteertrag, Blüte, Reproduktion, Samenansatz, Wurzelwachstum, Respirationsraten, Photosyntheseraten usw. (Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Band 17; Rehm et al., 1993 Biotechnology, Band 3, Kapitel III: Product recovery and purification, S. 469–714, VCH: Weinheim; Belter, P. A. et al., 1988 Bioseparations: downstream processing for biotechnology, John Wiley und Sons; Kennedy, J. F. und Cabral, J. M. S., 1992 Recovery processes for biological materials, John Wiley und Sons; Shaeiwitz, J. A. und Henry, J. D., 1988 Biochemical separations, in: Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Band B3, Kapitel 11, S.1-27, VCH: Weinheim; und Dechow, F. J. (1989) Separation and purification techniques in biotechnology, Noyes Publications).
So können zum Beispiel Hefe-Expressionsvektoren, die die im vorliegenden Text beschriebenen Nukleinsäuren oder Fragmente davon umfassen, konstruiert und nach standardmäßigen Verfahren in Saccharomyces cerevisiae hineintransformiert werden. Die erhaltenen transgenen Zellen können anschließend auf Versagen oder Veränderung ihrer Toleranz gegenüber Trockenheits- und Temperaturstreß getestet werden. Auf ähnliche Art und Weise können pflanzliche Expressionsvektoren, die die im vorliegenden Text beschriebenen Nukleinsäuren oder Fragmente davon umfassen, konstruiert und nach standardmäßigen Verfahren in eine entsprechende Pflanzenelle wie Arabidopsis, Soja, Raps, Mais, Weizen, Medicago truncatula, usw. hineintransformiert werden. Die davon abgeleiteten erhaltenen transgenen Zellen und/oder Pflanzen können dann auf Versagen oder auf Veränderung ihrer Toleranz gegenüber Trockenheits- und Temperaturstreß getestet werden.
Die gentechnische Veränderung von einem oder mehreren erfindungsgemäßen PHSRP-Genen kann auch zu PHSRP führen, die über veränderte Aktivitäten verfügen, die einen indirekten Einfluß auf die Streßreaktion und/oder Streßtoleranz von Algen, Pflanzen, Ciliaten oder Pilzen oder sonstigen Mikroorganismen wie C. glutamicum ausüben. So führen zum Beispiel die normalen biochemischen Stoffwechselwege zur Entstehung von verschiedenen Produkten (z. B. Wasserstoffperoxid und sonstigen reaktionsfähigen Sauerstoffspezies), die aktiv eben diese Stoffwechselvorgänge stören können. Zum Beispiel ist bekannt, daß Peroxynitrit Tyrosinseitenketten nitriert und dadurch gewisse Enzyme, die Tyrosin in ihrem aktiven Zentrum aufweisen, inaktiviert werden. (Groves, J. T., 1999 Curr. Opin. Chem. Biol. 3(2): 226–235). Obwohl diese Produkte im allgemeinen ausgeschieden werden, können Zellen genetisch dahingehend geändert werden, daß sie mehr Produkte als für eine Wildtypzelle typisch ist, transportieren. Dadurch, daß man die Aktivität von einem oder mehreren erfindungsgemäßen PHSRPs, die am Export von spezifischen Molekülen wie Salzmolekülen beteiligt sind, optimiert, kann es möglich sein, die Streßtoleranz der Zelle zu verbessern.
Weiterhin können mit den im vorliegenden Text beschriebenen Sequenzen oder Fragmenten davon Knock-Out-Mutationen in den Genomen von verschiedenen Organismen wie Bakterien, Säugetierzellen, Hefezellen und Pflanzenzellen erzeugt werden (Girke, T., 1998 The Plant Journal 15: 39–48). Die erhaltenen Knock-Out-Zellen können dann auf ihre Fähigkeit oder ihr Vermögen, verschiedene Streßsituationen zu tolerieren, ihre Reaktion auf verschiedene Streßsituationen und die Auswirkung auf den Phänotyp und/oder Genotyp der Mutation ausgewertet werden. Bezüglich anderen Methoden der Geninaktivierung, siehe US-Patent Nr. 6004804 "Non-Chimeric Mutational Vectors" und Puttaraju et al., 1999 Spliceosome-mediated RNA trans-splicing as a tool for gene therapy, Nature Biotechnology 17: 246–252.
Die oben genannten Mutagenesestrategien für PHSRP, die zu einer erhöhten Streßresistenz führen, sollen nicht einschränkend sein; dem Fachmann werden sofort Variationen dieser Strategien klar. Mit solchen Strategien sowie unter der im vorliegenden Text beschriebenen Mechanismen können die erfindungsgemäßen Nukleinsäure- und Proteinmoleküle dazu verwendet werden, um Algen, Ciliate, Pflanzen, Pilze oder sonstige Mikroorganismen, wie C. glutamicum, die mutierte PHSRP-Nukleinsäure- und -Proteinmoleküle exprimieren, so daß ihre Streßtoleranz verbessert ist, zu erzeugen.
Außerdem sieht die vorliegende Anmeldung Antikörper vor, die spezifisch an ein PHSRP oder einen Teil davon, wie es/er von einer im vorliegenden Text beschriebenen Nukleinsäure codiert wird, binden. Antikörper können nach vielen gut bekannten Verfahren erzeugt werden (siehe z. B. Harlow und Lane, "Antibodies; A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, (1988)). Kurzgesagt kann aufgereinigtes Antigen in solch einer Menge und in solchen Zeitabständen einem Tier injiziert werden, daß eine Immunreaktion hervorgerufen wird. Antikörper können entweder direkt aufgereinigt werden, oder es können Milzzellen von dem Tier gewonnen werden. Die Zellen können dann mit einer immortalisierten Zellenlinie fusioniert und auf Antikörpersekretion durchmustert werden. Mit den Antikörpern können Nukleinsäureklonbibliotheken auf Zellen, die das Antigen sezernieren, durchmustert werden. Diese positiven Klone können anschließend sequenziert werden. (siehe zum Beispiel Kelly et al., 1992 Bio/Technology 10: 163–167; Bebbington et al., 1992 Bio/Technology 10: 169–175).
Die Ausdrücke "bindet selektiv" und "bindet spezifisch" an das Polypeptid bezeichnen eine Bindungsreaktion, die das Vorhandensein des Proteins in einer heterogenen Population von Proteinen und sonstigen Biologika bestimmt. Unter festgesetzten Immunassay-Bedingungen binden die genannten Antikörper, die an ein bestimmtes Protein gebunden haben, nicht in wesentlicher Menge an andere Proteine, die in der Probe vorliegen. Die selektive Bindung eines Antikörpers unter solchen Bedingungen kann einen Antikörper erfordern, der aufgrund seiner Spezifität für ein bestimmtes Protein ausgewählt worden ist. Es können verschiedene Immunassay-Formate eingesetzt werden, um Antikörper auszuwählen, die selektiv an ein bestimmtes Protein binden. So werden zum Beispiel routinemäßig Festphasen-ELISA-Immunassays eingesetzt, um Antikörper auszuwählen, die mit einem Protein eine selektive Immunreaktion eingehen. Siehe Harlow und Lane "Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988) für eine Beschreibung der Immunassay-Formate und -bedingungen, die für die Bestimmung der selektiven Bindung eingesetzt werden könnten.
In manchen Fällen ist es wünschenswert, monoklonale Antikörper von verschiedenen Wirten herzustellen. Eine Beschreibung von Techniken zur Herstellung von solchen monoklonalen Antikörpern findet sich bei Stites et al., Hrsg. "Basic and Clinical Immunology", (Lange Medical Publications, Los Altos, Calif., 4. Ausgabe) und darin genannten Literaturhinweisen sowie in Harlow und Lane ("Antibodies, A Laboratory Manual" Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988).
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele genauer erläutert, die jedoch keineswegs den Erfindungsumfang einschränken sollen.
BEISPIELE
Beispiel 1
Züchten von Physcomitrella patens-Kulturen
Für diese Untersuchung verwendete man Pflanzen der Art Physcomitrella patens (Hedw.) B. S. G. aus der Sammlung der Genetikabteilung der Universität Hamburg. Sie stammen von dem von H. L. K. Whitehouse in Gransden Wood, Huntingdonshire (England) gesammelten Stamm 16/14 ab, der von einer Spore von Engel (1968, Am. J. Bot. 55, 438–446) subkultiviert worden war. Pflanzenvermehrung wurde mittels Sporen und mittels Regeneration der Gametophyten durchgeführt. Das Protonema entwickelte sich aus der haploiden Spore als chloroplastenreiches Chloronema und chloroplastenarmes Caulonema, an dem nach ungefähr 12 Tagen Knospen entstanden. Diese wuchsen zu Gametophoren mit Antheridien und Archegonien. Nach der Befruchtung entstand der diploide Sporophyt mit kurzer Seta und Sporenkapsel, in der die Meiosporen reiften.
Die Anzucht erfolgte in einer Klimakammer bei einer Lufttemperatur von 25°C und einer Lichtintensität von 55 Micromol^–1m2 (Weißlicht; Fluoreszenzröhre Typ Philips TL 65W/25) und einem Licht/Dunkel-Wechsel von 16/8 Stunden. Das Moos wurde entweder in Flüssigkultur mit Knop-Medium, das nach Reski und Abel (1985, Planta 165: 354–358) modifiziert wurde oder auf festem Knop-Medium unter Verwendung von einem 1% Oxoid-Agar (Unipath, Basingstoke, England) herangezogen. Die für die RNA- und DNA-Isolation verwendeten Protonemata wurden in belüfteten Flüssigkulturen gezüchtet. Die Protonemata wurden alle 9 Tage zerkleinert und in frisches Kulturmedium überführt.
Beispiel 2
Gesamt-DNA-Isolation von Pflanzen
Die detaillierten Angaben zur Isolation von Gesamt-DNA beziehen sich auf die Aufarbeitung von Pflanzenmaterial mit einem Frischgewicht von einem Gramm. Zu dem verwendeten Material zählen die folgenden Puffer: CTAB-Puffer: 2% (w/v) N-Cethyl-N,N,N-trimethylammoniumbromid (CTAB); 100 mM Tris HCl pH 8,0; 1,4 M NaCl; 20 mM EDTA; N-Laurylsarcosin-Puffer: 10% (w/v) N-Laurylsarcosin; 100 mM Tris HCl pH 8,0; 20 mM EDTA.
Das Pflanzenmaterial wurde unter flüssigem Stickstoff in einem Mörser verrieben, so daß man ein feines Pulver erhielt, das in 2 ml Eppendorfgefäße übergeführt wurde. Das gefrorene Pflanzenmaterial wurde dann mit 1 ml Zersetzungspuffer (1 ml CTAB-Puffer, 100 μl N-Laurylsarcosin-Puffer, 20 μl β-Mercaptoethanol und 10 μl Proteinase-K-Lösung, 10 mg/ml) überschichtet und eine Stunde unter kontinuierlichem Schütteln bei 60°C inkubiert. Das erhaltene Homogenat wurde in zwei Eppendorfgefäße (2 ml) aufgeteilt und zweimal durch Schütteln mit dem gleichen Volumen von Chloroform/Isoamylalkohol (24:1) extrahiert. Zur Phasentrennung wurde jeweils 15 Minuten lang bei 8000 × g und Raumtemperatur zentrifugiert. Anschließend wurde die DNA 30 Minuten lang bei –70°C mit eiskaltem Isopropanol gefällt. Die gefällte DNA wurde 30 Minuten lang bei 10,000 g bei 4°C sedimentiert und in 180 μl TE-Puffer resuspendiert (Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6). Zur weiteren Reinigung wurde die DNA mit NaCl (Endkonzentration 1,2 M) behandelt und erneut 30 Minuten lang bei –70°C mit dem zweifachen Volumen absolutem Ethanol gefällt. Nach einem Waschschritt mit 70% Ethanol wurde die DNA getrocknet und anschließend in 50 μl H₂O + RNAse (50 mg/ml Endkonzentration) aufgenommen. Die DNA wurde über Nacht bei 4°C gelöst und der Verdau mit RNAse wurde anschließend eine Stunde lang bei 37°C durchgeführt. Die Aufbewahrung der DNA erfolgte bei 4°C.
BEISPIEL 3
Isolation von Gesamt-RNA und poly-(A) + RNA und Konstruktion einer cDNA-Bibliothek aus Physcomitrella patens
Für die Untersuchung der Transkripte wurden sowohl Gesamt-RNA und poly-(A)⁺ RNA isoliert. Die Gesamt-RNA wurde von der 9 Tage alten Wildtyp-Protonemata nach dem GTC-Verfahren (Reski et al. 1994, Mol. Gen. Genet., 244: 352–359) gewonnen. Die poly(A)⁺ RNA wurde mit Dyna Beads^R (Dynal, Oslo, Norwegen) nach den Anweisungen des Herstellerprotokolls isoliert. Nach der Bestimmung der RNA-Konzentration bzw. der poly(A)⁺ RNA-Konzentration wurde die RNA durch Zugabe von 1/10 Volumenteilen 3 M Natriumacetat pH 4,6 und 2 Volumenteilen Ethanol gefällt und bei –70°C aufbewahrt.
Für die Konstruktion der cDNA-Bibliothek erfolgte die Erststrangsynthese mit reverser Transkriptase des Murine Leukemia Virus (Roche, Mannheim, Deutschland) und oligo-d(T)-Primern, die Zweitstrangsynthese durch Inkubation mit DNA-Polymerase I, Klenow-Enzym und RNAse-H-Verdau bei 12°C (2 Stunden), 16°C (1 Stunde) und 22°C (1 Stunde). Der Ansatz wurde durch Inkubation bei 65°C (10 Minuten) gestoppt und anschließend auf Eis überführt. Doppelsträngige DNA-Moleküle wurden mit T4-DNA-Polymerase (Roche, Mannheim) bei 37°C (30 Minuten) stumpfendig gemacht. Nukleotide wurden durch Phenol/Chloroform-Extraktion und Sephadex-G50-Spin-Säulen entfernt. EcoRI-Adapter (Pharmacia, Freiburg, Deutschland) wurden an die cDNA-Enden mittels T4-DNA-Ligase (Roche, 12°C, über Nacht) ligiert und durch Inkubation mit Polynukleotidkinase (Roche, 37°C, 30 Minuten) phosphoryliert. Diese Mischung wurde auf einem Low-Melting-Agarose-Gel getrennt. DNA-Moleküle mit einer Größe über 300 Basenpaaren wurden aus dem Gel eluiert, mit Phenol extrahiert, auf Elutip-D-Säulen (Schleicher und Schuell, Dassel, Deutschland) konzentriert und an Vektorarme ligiert und unter Verwendung des Gigapack Gold Kit (Stratagene, Amsterdam, Niederlande) in lambda-ZAPII-Phagen oder lambda-ZAP-Express-Phagen verpackt, wobei Material des Herstellers verwendet und nach seinen Anweisungen vorgegangen wurde.
Beispiel 4
Sequenzierung und Funktionsbeschreibung von Physcomitrella patens ESTs
Wie in Beispiel 3 beschriebene cDNA-Bibliotheken wurden für die Sequenzierung der DNA nach standardmäßigen Methoden, insbesondere nach der Kettenabbruchsmethode mit dem ABI PRISM Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin-Elmer, Weiterstadt, Deutschland), eingesetzt. Anschließend an die präparative Plasmidgewinnung aus cDNA-Bibiliotheken wurde ein zufallsmäßiges Sequenzieren durchgeführt, und zwar mittels in-vivo-Massenexzision, Retransformation und anschließendem Ausplattieren von DH10B auf Agarplatten (detaillierte Angaben zum Material und Methoden von Stratagene, Amsterdam, Niederlande). Plasmid-DNA wurde aus über Nacht gezüchteten E.coli-Kulturen, die in Luria-Bouillon Medium mit Ampicillin (siehe Sambrook et al. 1989 Cold Spring Harbor Laboratory Press: ISBN 0-87969-309-6) gezüchtet worden waren, an einem Qiagen-DNA-Präparationsroboter (Qiagen, Hilden) nach den Protokollen des Herstellers präpariert. Es wurden Sequenzierprimer mit den folgenden Nukleotidsequenzen verwendet:
Die Sequenzen wurden unter Verwendung des Softwarepakets EST-MAX, das kommerziell von Bio-Max (München, Deutschland) erhältlich ist, bearbeitet und annotiert. Das Programm beinhaltet praktisch alle Bioinformatikmethoden, die für die funktions- und Strukturcharakterisierung von Proteinsequenzen wichtig sind. Für Referenzen siehe die Webadresse unter:

pedant.mips.biochem.mpg.de.

Bei den wichtigsten Algorithmen, die einen Bestandteil von EST-MAX bilden, handelt es sich um: FASTA: Very sensitive sequence database searches with estimates of statistical significance; Pearson W. R. (1990) Rapid and sensitive sequence comparison with FASTP and FASTA. Methods Enzymol. 183: 63–98; BLAST: Very sensitive sequence database searches with estimates of statistical significance. Altschul S. F., Gish W., Miller W., Myers E. W., und Lipman D. J. Basic local alignment search tool. Journal of Molecular Biology 215: 403–410; PREDATOR: High-accuracy secondary structure prediction from single and multiple sequences. Frishman, D. und Argos, P. (1997) 75% accuracy in Protein secondary structure prediction. Proteins, 27: 329–335; CLUSTALW: Multiple sequence alignment. Thompson, J. D., Higgins, D. G. und Gibson, T. J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positions-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Research, 22: 4673–4680; TMAP: Transmembrane region prediction from multiple aligned sequences. Persson, B. und Argos, P. (1994) Prediction of transmembrane segments in Proteins utilizing multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 237: 182–192; ALOM2: Transmembrane region prediction from single sequences. Klein, P., Kanehisa, M. und DeLisi, C. Prediction of Protein function from sequence properties: A discriminate analysis of a database. Biochim. Biophys. Acta 787: 221–226 (1984). Version 2 von Dr. K. Nakai; PROSEARCH: Detection of PROSITS Protein sequence Patterns. Kolakowski L. F. Jr., Leunissen J. A. M., Smith J. E. (1992) ProSearch: fast searching of Protein sequences with regular expression Patterns related to Protein structure and function. Biotechniques 13, 919–921; BLIMPS: Similarity searches against a database of ungapped blocks. J. C. Wallace und Henikoff S., (1992); PATMAT: A searching and extraction program for sequence, Pattern and block queries and databases, CABIOS 8: 249–254, geschrieben von Bill Alford.
Beispiel 5
Identifikation eines Physcomitrella patens-ORFs, der PP2A-4 entspricht
Die in Tabelle 1 unten dargestellte Physcomitrella 10 patens Partial-cDNA (EST) wurde in dem Physcomitrella patens EST-Sequenzierprogramm mit dem Programm EST-MAX mittels BLAST-Analyse identifiziert. Die Sequenzidentifikationsnummer, die diesem EST entspricht lautet: PP2A-4 (SEQ ID NO: 3) weist Homologie mit der 15 regulatorischen Untereinheit der Proteinphosphatase 2A von Menschen und von Pflanzen auf. Andererseits weist PP2A-4 eine Homologie mit der katalytischen Untereinheit von mehreren pflanzlichen Proteinphosphatasen 2A auf. Tabelle 1

Bezeichnung Funktionelle Kategorie Funktion Sequenz-Code ORF-Position

PP2A-4 Proteinphosphatase Serin/Threoninphosphatase s_pp001008094f 1-140
Tabelle 2

Grad der Aminosäureidentität und -ähnlichkeit von PpPP2A-4 und anderen homologen Proteinen (es wurde das GCG-Gap-Programm verwendet: gap Penalty: 10; gap 30 extension penality: 0,1; score matrix: blosum62).

Swiss-Prot Nr.	Q9MB06	Q07098	Q9MB05	Q9ZSE4	Q07099
Bezeichnung des Proteins	TYP 2A PROTEINPHOSPHATASE-1	KATALYTISCHE UNTEREINHEIT DER SERIN/ THREONIN PROTEIN-PHOSPHATASE PP2A-1	TYP 2A PROTEINPHOSPHATASS-2	KATALYTISCHE UNTEREINHEIT DER SERIN/THREONIN PROTEINPHOSPHATASE PP2A	KATALYTISCHE UNTEREINHEIT DER SERIN/THREONIN PROTEINPHOSPHATASE PP2A-2
Art	Vicia faba (Ackerbohne)	Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand)	Vicia faba (Ackerbohne)	Hevea brasiliensis (Gummibaum)	Arabidopsis thaliana (Ackerschmalwand)
Identität %	91%	90%	90%	89%	90%
Ähnlichkeit %	94%	94%	93%	93%	94%

Beispiel 6
Klonierung der Vollängen-cDNA von Physcomitrella patens, die für PP2A-4 codiert.
Um Vollängen-PP2A-4 (SEQ ID No: 8) aus Physcomitrella patens zu klonieren, wurden mit dem SMART RACE cDNA-10 Amplifikationskit (Clontech Laboratories) cDNA-Bibliotheken nach den Anweisungen des Herstellers erzeugt. Als Matrize wurde wie in Beispiel 2 beschrieben isolierte Gesamt-RNA eingesetzt. Vor der RNA-Isolation wurden die Kulturen folgendermaßen 15 behandelt: Salzstreß: 2, 6, 12, 24, 48 Stunden mit einem Medium mit einem Zusatz von 1-M NaCl; Kältestreß: 4°C für die gleichen Zeitpunkte wie bei Salz; Trockenheitsstreß: Kulturen wurden für dieselben Zeitpunkte wie bei Salz auf trockenem Filterpapier 20 inkubiert.
5'RACE-Protokoll
Die aus der Datenbanksuche, wie in Beispiel 4 beschrieben, identifizierte EST-Sequenz 4 (SEQ ID No: 3) 25 wurde für den Entwurf von Oligos für die RACE eingesetzt. Die verlängerten Sequenzen für diese Gene wurden dadurch erhalten, daß man eine RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)-Polymerasekettenreaktion (RACE-PCR) durchführte, und zwar mit dem Advantage 2 PCR-Kit (Clontech Laboratories) und dem SMART RACE cDNA-Amplifikationskit (Clontech Laboratories), wobei ein Biometra T3 Thermocycler nach den Anweisungen des Herstellers eingesetzt wurde. Die von den RACE-Reaktionen erhaltenen Sequenzen entsprachen Vollängen- Codierregionen von PP2A-4; mit ihnen wurden Oligos für die Vollängen-Klonierung der jeweiligen Gene entworfen (siehe unten Vollängen-Amplifikation).
Vollängen-Amplifikation
Vollängen-Klone gemäß PP2A-4 (SEQ ID NO: 3) wurden dadurch erhalten, daß man eine Polymerasekettenreaktion (PCR) mit genspezifischen Primern (siehe Tabelle 3) und dem ursprünglichen EST als Matrize durchführte. Bei den Reaktionsbedingungen handelte es sich um Standardbedingungen mit PWO-DNA-Polymerase (Roche). Die PCR wurde unter Standardbedingungen und gemäß den Protokollen des Herstellers durchgeführt. (Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N. Y., Thermocycler Biometra T3). Die Reaktionsparameter lauteten: fünf Minuten bei 94°C, anschließend fünf Zyklen zu je einer Minute bei 94°C, einer Minute bei 50°C und 1,5 Minuten bei 72°C. Darauf folgten fünfundzwanzig Zyklen zu je einer Minute bei 94°C, einer Minute bei 65°C und 1,5 Minuten bei 72°C.
Die amplifizierten Fragmente wurden aus dem Agarosegel mit einem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) extrahiert und gemäß den Anweisungen des Herstellers in den TOPO pCR2.1 Vektor (Invitrogen) ligiert. Die rekombinanten Vektoren wurden unter Standardbedingungen (Sambrook et al., 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY) in Top10-Zellen (Invitrogen) transformiert. Auf LB-Agar mit 100 μg/ml 5 Carbenicillin, 0,8 mg X-gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactosid) und 0,8 mg IPTG (Isopropylthio-β-D-galactosid) wurde auf transformierte Zellen selektiert, wobei über Nacht bei 37°C gezüchtet wurde. Die weißen Kolonien wurden ausgewählt und zum Inokulieren von 3 ml 10 flüssigem LB mit 100 μg/ml Ampicillin verwendet, wobei über Nacht bei 37°C gezüchtet wurde. Plasmid-DNA wurde mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) nach den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die Analysen von den anschließenden Klonen und die 15 Restriktionskartierung erfolgten nach Standardtechniken der Molekularbiologie (Sambrook et al., 1989 Molecular Cloning, A Laboratory Manual. 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N. Y.).
Tabelle 3 Schema und Primer für die Klonierung von Vollängenklonen
Beispiel 7
Konstruktion von streßtoleranten Arabidopsis-Pflanzen durch Überexpression des PP2A-4-Gens
Konstruktion des binären Vektors: Kanamycin
Der Vektor pACGH101 (BPS-Cyanamid) wurde mit PstI (Roche) und Fsel (NEB) nach den Anweisungen der Hersteller verdaut. Das Fragment wurde mittels Agarosegel aufgereinigt und mit dem Qiaex II DNA Extraction Kit (Qiagen) extrahiert. Dies ergab ein Vektorfragment mit dem Actin 2-Promoter von Arabidopsis mit intern gelegenem Intron und dem OCS3-Terminator. Es wurden die folgenden Primer für die PCR-Amplifikation des NPTII-Gens entwickelt:
Das 0,9 Kilobasen große NPTII-Gen wurde mittels PCR ausgehend vom pCambia 2301 Plasmid-DNA amplifiziert [60 s bei 94°C, {60 s bei 94°C, 60 s bei 61°C (–0,1°C pro Zyklus), 2 min bei 72°C} × 25 Zyklen, 10 min bei 72°C, auf einem T-Gradient-Gerät von Biometra] und mit dem Qiaquick PCR Extraction Kit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers aufgereinigt. Anschließend wurde die PCR-DNA nach den Anweisungen des Herstellers (NPT-Togo-Konstrukt) in den Vektor pCR-BluntII TOPO (Invitrogen) subkloniert. Diese Ligationen wurden in Top 10-Zellen (Invitrogen) hineintransformiert und über Nacht bei 37°C auf LB-Platten mit 50 μg/ml Kanamycinsulfat gezüchtet. Mit den Kolonien wurden anschließend 2 ml LB-Medium mit 50 μg/ml Kanamycinsulfat inokuliert und die Kulturen wurden über Nacht bei 37°C gezüchtet. Plasmid-DNA wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) gewonnen und unter Standardbedingungen sowohl in 5'- als auch in 3'- Richtungen sequenziert. Die anschließende Analyse der Sequenzdaten mit der Software VectorNTI zeigte, daß in der NPTII-Gensequenz keine PCR-Fehler vorlagen.
Anschließend wurde das NPT-Topo-Kontrukt nach den Anweisungen der Hersteller mit PstI (Roche) und Fsel (NEB) verdaut. Das 0,9 Kilobasen große Fragment wurde auf Agarosegel aufgereinigt und mit dem Qiaex II DNA Extraction Kit (Qiagen) extrahiert. Das Pst/Fse-Insertfragment von NPT-Topo und das Pst/Fse-Vektorfragment von pACGH101 wurden anschließend nach den Anweisungen des Herstellers mit T4-DNA-Ligase (Roche) miteinander ligiert. Die Ligation wurde anschließend unter Standardbedingungen in Top10-Zellen (Invitrogen) hineintransformiert, wodurch man das Konstrukt pBPSsc019 erhielt. Kolonien wurden auf LB-Platten mit 50 μg/ml Kanamycinsulfat selektiert und über Nacht bei 37°C gezüchtet. Mit diesen Kolonien wurden anschließend 2 ml LB-Medium mit 50 μg/ml Kanamycinsulfat inokuliert und die Kulturen wurden über Nacht bei 37°C gezüchtet. Die Plasmid-DNA wurde mit dem Qiaprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) nach den Anweisungen des Herstellers gewonnen.
Das Konstrukt pBPSSC019 wurde mit Kpnl und BsaI (Roche) nach den Anweisungen des Herstellers verdaut. Das Fragment wurde mittels Agarosegel aufgereinigt und dann mit dem Qiaex II DNA Extraction Kit (Qiagen) nach den beigelegten Anweisungen extrahiert, wodurch man zu einer 3 Kilobasen großen Act-NPT-Kassette gelangte, die den Actin2-Promoter aus Arabidopsis mit intern gelegenem Intron, das NPTII-Gen und den OCS3-Terminator beinhaltete.
Der Vektor pBPSJH001 wurde mit SpeI und ApaI (Roche) verdaut, mit Klenow-Enzym und 0,1 mM dNTPs (Roche) nach den Anweisungen des Herstellers stumpfendig gemacht.
Dadurch erhielt man ein 10,1 Kilobasen großes Vektorfragment minus der Gentamycin-Kassette, das durch Selbstligation mit T4-DNA-Ligase (Roche) rezirkularisiert wurde und unter Standardbedingungen in Top10-Zellen (Invitrogen) hineintransformiert wurde. Auf LB-Agar mit 50 μg/ml Kanamycinsulfat wurde auf transformierte Zellen selektiert und die Kulturen wurden über Nacht bei 37°C gezüchtet. Mit den Kolonien wurden anschließend 2 ml Flüssig-LB mit 50 μg/ml Kanamycinsulfat inokuliert und die Kulturen wurden über Nacht bei 37°C gezüchtet. Die Plasmid-DNA wurde mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) nach den Anweisungen des Herstellers gewonnen. Das rezirkularisierte Plasmid wurde anschließend mit KpnI (Roche) verdaut und aus dem Agarosegel mit dem Qiaex II DNA Extraction Kit (Qiagen) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert.
Das mit Kpn geschnittene Act-NPT-Insert und der mit Kpn geschnittene rezirkularisierte pBPSJH001-Vektor wurden anschließend mit T4-DNA-Ligase (Roche) miteinander ligiert und nach den Anweisungen des Herstellers in Top10-Zellen (Invitrogen) hineintransformiert. Das erhaltene Konstrukt, nämlich pB2Ssc022, enthielt nun den Superpromoter, das GUS-Gen, den NOS-Terminator und die Act-NPT-Kassette. Auf LB-Agar mit 50 μg/ml Kanamycinsulfat wurde auf transformierte Zellen selektiert und die Kulturen wurden über Nacht bei 37°C gezüchtet. Mit den Kolonien wurden anschließend 2 ml Flüssig-LB mit 50 μg/ml Kanamycinsulfat inokuliert und die Kulturen wurden über Nacht bei 37°C gezüchtet. Die Plasmid-DNA wurde mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) nach den Anweisungen des Herstellers gewonnen. Nachdem der Ligationserfolg mittels Restriktionsverdauungen verifiziert wurde, wurde pBPSsc022-Plasmid-DNA weiter vermehrt und mit dem Plasmid Midiprep Kit (Qiagen) nach den Anweisungen des Herstellers gewonnen.
Subklonierung von PP2A-4 in den binärem Vektor
Die Fragmente, die die verschiedenen Proteinphosphatasen aus Physcomitrella patens enthalten, wurden aus den rekombinanten PCR2.1-TOPO-Vektoren durch Doppelverdau mit Restriktionsenzymen (siehe Tabelle 4) nach den Anweisungen des Herstellers herausgeschnitten. Das erhaltene Fragment wurde aus Agarosegel mit einem QIAquick Gel Extraction Kit (QIAgen) nach den Anweisungen des Herstellers herausgeschnitten und in den binären Vektor pBPSsc022 der vor der Ligation mit entsprechenden Enzymen (siehe Tabelle 8) gespalten und dephosphoryliert worden war, hineinligiert. Der erhaltene rekombinante Vektor pBPSscO22 enthielt die entsprechende Phosphatase in sense-Orientierung unter der Kontrolle des konstitutiven Superpromoters. Tabelle 4 Diese Tabelle gibt die Bezeichnung des Konstrukts der für die Pflanzentransformation verwendeten Phosphatase aus Physcomitrella patens an

Gen Für die Erzeugung von Genfragmenten verwendete Enzyme Für die Restriktion von pBPSJS001 verwendete Enzyme Binäres Vektorkonstrukt

Pp222A-4 HpaI/SacI SmaI/SacI pBPSJYW016
Transformation von Agrobakterien
Der rekombinante Vektor wurde gemäß Standardbedingungen (Hoefgen und Willmitzer, 1990) in Agrobacterium tumefaciens C58C1 und PMP90 hineintransformiert.
Transformation von Pflanzen
Arabidopsis thaliana Ökotyp C24 wurden gemäß Standardbedingungen (Bechtold 1993, Acad. Sci. Paris. 316: 1194–1199; Bent et al. 1994, Science 265: 1856–1860) gezüchtet und transformiert.
Durchmustern der transformierten Pflanzen
T1-Samen wurden gemäß Standardprotokollen (Xiong et al. 1999, Plant Molecular Biology Reporter 17: 159–170) sterilisiert. Die Samen wurden auf 1/2 Murashige-Skoog-Medium MS) (Sigma-Aldrich), pH 5,7 mit KOH, 0,6% Agar und mit einem Zusatz von 1% Saccharose, 0,5 g/l 2-[N-Morpholino]ethansulfonsäure (MES) (Sigma-Aldrich), 50 μg/ml Kanamycin (Sigma-Aldrich), 500 μg/ml Carbenicillan (Sigma-Aldrich) und 2 μg/ml Benomyl (Sigma-Aldrich) ausplattiert. Die Samen auf den Platten wurden vier Tage lang bei 4°C vernalisiert. Die Samen wurden in einer Klimakammer bei einer Lufttemperatur von 22°C und einer Lichtintensität von 40 Mikromol^–1m2 (Weißlicht; Fluoreszenzröhre von Philips, Typ TL 65W/25) und einem Tagelängenzyklus von 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkelheit keimen gelassen. Die transformierten Keimpflanzen wurden nach 14 Tagen selektiert und auf 0,6%ige Agarplatten aus ½ MS Medium, pH 5,7 mit KOH, mit einem Zusatz von 0,6% Agar, 1% Saccharose, 0,5 g/l MES (Sigma-Aldrich) und 2 μg/ml Benomyl (Sigma-Aldrich) umgesetzt und fünf-sieben Tage lang erholen gelassen.
Durchmustern auf Trockenheitstoleranz
T1-Keimpflanzen wurden auf trockene, sterile Papierfilter in einer Petrischale umgesetzt und zwei Stunden lang bei 80% relativer Luftfeuchtigkeit in einer Pflanzenwuchskammer von Percieval, Typ MLR-350H, Mikromol^–1m2 (Weißlicht; Fluoreszenzröhre von Philips, Typ TL 65W/25) austrocknen gelassen. Anschließend wurde die relative Luftfeuchtigkeit auf 60% gesenkt und die Keimpflanzen wurden acht Stunden lang weiter austrocknen gelassen. Anschließend wurden die Keimpflanzen entfernt, auf 0,6%ige Agarplatten aus ½ MS, mit einem Zusatz von 2 μg/ml Benomyl (Sigma-Aldrich) und 0,5 g/l MES (Sigma-Aldrich) gesetzt und nach fünf Tagen bonitiert.
Unter Trockenheitsstreßbedingungen wiesen Arabidopsis thaliana-Pflanzen, die PpPP2A-4 überexprimierten, eine Überlebensrate auf die Streßdurchmusterung von 58% auf (7 Überlebende von 12 gestreßten Pflanzen), während die nicht transformierte Kontrolle nur eine Überlebensrate von 28% aufwies. Es ist anzumerken, daß die Analysen dieser transgenen Linien mit T1-Pflanzen durchgeführt wurden, und die Ergebnisse werden daher besser sein, wenn ein homozygotes, stark exprimierendes Material vorhanden ist. Tabelle 5 Zusammenfassung der Trockenheitstreßtests

Name des Gens Trockenheitsstreßtest

Anzahl Überlebende Anzahl Pflanzen insgesamt Prozentsatz Überlebende

PpPP2A-4 7 12 58%

Kontrolle 16 57 28%
Durchmusterung auf Gefriertoleranz
Keimpflanzen wurden in Petrischalen, die ½ MS 0,6%igen Agar mit einem Zusatz von 2% Saccharose und 2 μg/ml Benomyl enthielten umgesetzt. Nach vier Tagen wurden die Keimpflanzen 1 Stunde lang bei 4°C inkubiert und anschließend mit geschabtem Eis bedeckt. Die Keimpflanzen wurden anschließend in eine Klimakammer Typ Environmental Specialist ES2000 gestellt und 3,5 Stunden lang inkubiert, wobei bei –1,0°C begonnen wurde und die Temperatur stündlich um –1°C gesenkt wurde. Anschließend wurden die Keimpflanzen 24 Stunden lang bei –5,0°C inkubiert und dann 12 Stunden lang bei 5°C auftauen gelassen. Das Wasser wurde abgegossen und die Keimpflanzen wurden nach 5 Tagen bonitiert.
Unter Gefrierstreßbedingungen wiesen Arabidopsis thaliana-Pflanzen, die PpPP2A-4 überexprimierten, eine Überlebensrate von 90% auf (9 Überlebende von 10 gestreßten Pflanzen), während die nicht transformierte Kontrolle nur eine Überlebensrate von 2% (1 Überlebende aus 48 getesteten Pflanzen) aufwies. Es ist anzumerken, daß die Anylysen dieser transgenen Linien mit T1- Pflanzen durchgeführt wurden, und die Ergebnisse werden daher besser sein, wenn ein homozygotes, stark exprimierendes Material vorhanden ist. Tabelle 6 Zusammenfassung der Gefrierstreßtests

Name des Gens Gefrierstreßtest

Anzahl Überlebende Anzahl Pflanzen insgesamt Prozentsatz Überlebende

PpPP2A-4 9 10 90%

Kontrolle 1 48 2%
Durchmustern auf Salztoleranz
Die Keimpflanzen wurden am Abend vor dem Durchmustern auf Salztoleranz auf Papierfilter, die mit ½ MS getränkt worden waren, umgesetzt und auf ½ MS 0,6%igen Agar mit einem Zusatz von 2 μg/ml Benomyl gelegt. Für das Durchmustern auf Salztoleranz wurden die Papierfilter mit den Keimlingen auf Stöße von sterilen Papierfiltern, die mit 50 mM NaCl getränkt worden waren und sich in einer Petrischale befanden, umgesetzt. Nach zwei Stunden wurde das Papierfilter mit den Keimlingen auf Stöße von sterilen Papierfiltern, die mit 200 mM NaCl getränkt worden waren und sich in einer Petrischale befanden, umgesetzt. Nach zwei Stunden wurde das Papierfilter mit den Keimlingen auf Stöße von sterilen Papierfiltern, die mit 600 mM NaCl getränkt worden waren und sich in einer Petrischale befanden, umgesetzt. Nach 10 Stunden wurden die Keimpflanzen in Petrischalen umgesetzt, die ½ MS 0,6%igen Agar und einen Zusatz von 2 μg/ml Benomyl enthielten. Die Keimpflanzen wurden nach 5 Tagen bonitiert. Anschließend werden die transgenen Pflanzen auf ihre verbesserte Salztoleranz durchmustert wodurch der Nachweis erbracht wird, daß die Expression des Transgens Salztoleranz vermittelt.
Beispiel 8
Nachweis der PP2A-4 Transgene in den transgenen Arabidopsis-Linien
Um das Vorliegen des PpPP2A-4-Transgens in transgenen Arabidopsis-Linien zu überprüfen, wurde eine PCR an genomischer DNA, die die gezogenen RNA-Proben wie in Beispiel 9 unten beschrieben kontaminiert, durchgeführt. Es wurden 2,5 μl RNA-Probe in einer 50 μl PCR-Reaktion mit Taq-DNA-Polymerase (Roche Molecular Biochemicals) nach den Anweisungen des Herstellers verwendet. Der Primer für die binäre Vektorregion (5'GCTGACACGCCAAGCCTCGCTAGTC3') (SEQ ID NO: 36) und der genspezifische 3'-Primer für jedes Transgen, das für die Vollängen-RT-PCR (siehe Tabelle 7) eingesetzt worden war, wurde für die PCR eingesetzt. Das PCR-Programm lautete folgendermaßen: 30 Zyklen zu je 1 Minute bei 94°C, 1 Minute bei 62°C und 4 Minuten bei 70°C, danach 10 Minuten bei 72°C. Das binäre Vektorplasmid mit den einklonierten Transgenen wurde als Positivkontrolle verwendet und die genomische Wildtyp-C24-DNA wurde in den PCR-Reaktionen als negative Kontrolle verwendet. 10 μl-PCR-Ansatz wurde auf 0,8%igem Agarose-Ethidiumbromid-Gel analysiert.
Die Transgene mit der erwarteten Größe (für PpPP2A-2: 2,5-kB-Fragment; PpPP2A-3: 2,0-kB-Fragment; PpPP2A-4: 1,4-kB-Fragment; PpPP2C-1: 1,4-kB-Fragment; PpPP2C-2: 1,4-kB-Fragment) wurden erfolgreich aus den transgenen T1-Linien amplifiziert, jedoch nicht aus dem Wildtyp C24. Aus diesem Ergebnis geht hervor, daß die transgenen T1-Pflanzen mindestens eine Kopie der Transgene enthalten. Nichts wies darauf hin, daß etwas Identisches oder sehr Ähnliches in nicht transformierten Arabidopsis thaliana-Pflanzen vorlag, was in diesem Verfahren in den Wildtyppflanzen amplifiziert werden kann.
Beispiel 9
Nachweis der PP2A-4-Transgen-mRNA in transgenen Arabidopsis-Linien
Die Expression des Transgens wurde mit RT-PCR nachgewiesen. Gesamt-RNA wurde aus streßbehandelten Pflanzen mit einem Verfahren nach (Verwoerd et al., 1989 NAR 17: 2362) isoliert. Blattproben (50–100 mg) wurden entnommen und in flüssigem Stickstoff zu einem feinen Pulver vermahlen. Das gemahlene Gewebe wurde in 500 μl einer 1:1-Mischung von Phenol und Extraktionspuffer (100 mM LiCl, 100 mM Tris, pH 8, 10 mM EDTA, 1% SDS) bei 80°C resuspendiert und anschließend kurz mit dem Vortex-Mixer gemischt. Nach Versetzen-mit 250 μl Chloroform wurde jede Probe kurz auf dem Vortex-Mixer gemischt. Die Proben wurden anschließend 5 Minuten bei 12,000 × g zentrifugiert. Die obere wäßrige Phase wurde in ein frisches Eppendorf-Röhrchen überführt. Die RNA wurde durch Versetzen mit 1/10 Volumen 3 M Natriumacetat und 2 Volumina 95%igem Ethanol gefällt. Die Proben wurden durch Umkehren vermischt und 30 Minuten lang auf Eis gestellt. Die RNA wurde durch 10minütiges Zentrifugieren bei 12,000 × g pelletiert. Der Überstand wurde entfernt und die Pellets wurden kurz an der Luft getrocknet. Pellets der RNA-Probe wurden in 10 μl DEPC-Wasser resuspendiert.
Um die kontaminierende DNA von den Proben zu entfernen wurde je Probe nach den Empfehlungen des Herstellers mit RNase-freier DNase (Roche) behandelt. cDNA wurde aus der Gesamt-RNA mit den Superscript First-Strand Synthesis System für RT-PCR (Gibco-BRL) nach den Empfehlungen des Herstellers synthetisiert. Die PCR-Amplifikation eines genspezifischen Fragments von der synthetisierten cDNA erfolgte mit Taq-DNA-Polymerase (Roche) und genspezifischen Primern wie unten dargestellt in der folgenden Reaktion: 1X PCR-Puffer, 1,5 mM MgCl₂, jeweils 0,2 μM Primer, 0,2 μM dNTPs, 1 Einheit Polymerase, 5 μl cDNA von der Synthesereaktion. Die Amplifikation erfolgte unter den folgenden Bedingungen: Vordenaturierung 3 Minuten bei 94°C; Denaturierung 30 Sekunden bei 94°C; Reassoziieren 30 Sekunden bei 62°C; Extension 2 Minuten bei 72°C, 30 Zyklen; Extension 5 Minuten bei 72°C; Halten bei 4°C, endlos. Die PCR-Produkte wurden auf einem 1%igen Agarosegel laufen gelassen mit Ethidiumbromid gefärbt und unter UV-Licht mit dem Quantity-One Geldokumentationssystem (Bio-Rad) sichtbar gemacht.
Die Expression der Transgene wurde in der transgenen T1-Linie nachgewiesen. Diese Ergebnisse ergaben, daß die Transgene in den transgenen Linien exprimiert werden und legten deutlich nahe, daß ihr Genprodukt die pflanzliche Streßtoleranz in den transgenen Linien verbesserte. In Übereinstimmung mit dem zuvor Gesagten wurde mit diesem Verfahren keine Expression von identischen oder sehr ähnlichen endogenen Genen nachgewiesen. Diese Ergebnisse stimmen mit den Daten von Beispiel 7 überein.
Tabelle 7 Für die Amplifikation der jeweiligen Transgen-mRNA in PCR mit aus transgenen Arabidopsis thaliana-Pflanzen isolierter RNA als Matrize verwendete Primer
Beispiel 10
Konstruktion von streßtoleranten Sojabohnenpflanzen durch Überexpression des PP2A-4-Gens.
Sojabohnen wurden mit dem Konstrukt pBPSJYW016 wie unten beschrieben transformiert. Sojabohnensamen wurden 4 Minuten bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln mit 70%igem Ethanol und anschließend 20 Minuten lang unter ständigem Schütteln mit 20% (v/v) Clorox mit einem Zusatz von 0,05% (v/v) Tween oberflächensterilisiert. Anschließend wurden die Samen viermal mit destilliertem Wasser gespült und 6–39 Stunden bei Raumtemperatur auf befeuchtetes steriles Paperfilter in einer Petrischale gelegt. Die Samenschalen wurden abgeschält und die Keimblätter von der Embryonalachse abgelöst. Die Embryonalachse wurde untersucht, um sicherzustellen, daß die Meristemregion nicht beschädigt ist. Die herauspräparierten Embryonalachsen wurden in eine halbgeöffnete Petrischale gegeben und auf einen Feuchtigkeitsgehalt von weniger als 20% (Frischgewicht) in einer verschlossenen Petrischale bis zur weiteren Verwendung an der Luft trocknen gelassen.
Eine Agrobacterium tumefaciens-Kultur wurde aus einer Einzelkolonie in LB-Festmedium mit einem Zusatz von entsprechenden Antibiotika (z. B. 100 mg/l Streptomycin, 50 mg/l Kanamycin) und im Anschluß daran durch Kultivieren der Einzelkolonie in flüssigem LB-Medium bis zu einer optischen Dichte von 0,8 bei 600 nm hergestellt. Anschließend wurde die Bakterienkultur 7 Minuten lang bei Raumtemperatur bei 7000 U/min pelletiert und in MS-Medium (Murashige und Skoog, 1962) mit einem Zusatz von 100 μM Acetosyringon resuspendiert. Die Bakterienkulturen wurden in diesem Vorinduktionsmedium 2 Stunden lang bei Raumtemperatur inkubiert, bevor sie verwendet wurden. Die Achse von zygotischen Samenembryonen der Sojabohne mit einem Feuchtigkeitsgehalt von ungefähr 15% wurden 2 Stunden lang bei Raumtemperatur mit der vorinduzierten Agrobakterium-Suspensionskultur getränkt. Die Embryonen werden aus der Tränkkultur entfernt und auf Petrischalen, die festes MS-Medium mit einem Zusatz von 2% Saccharose enthalten, umgesetzt und 2 Tage im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Alternativ dazu wurden die Embryonen auf befeuchtete (flüssiges MS-Medium) sterile Papierfilter in eine Petrischale gegeben und unter denselben Bedingungen wie oben beschrieben inkubiert. Danach wurden die Embryonen entweder auf festes oder flüssiges MS-Medium mit einem Zusatz von 500 mg/l Carbenicillin oder 300 mg/l Cefotaxim zum Abtöten der Agrobakterien umgesetzt. Die sterilen Papierfilter wurden mit dem Flüssigmedium befeuchtet. Die Embryonen wurden 4 Wochen lang bei 25°C, unter einer 150 μmol m^–2s^–1 und einer 12stündigen Photoperiode inkubiert. Sobald die Keimpflanzen Wurzeln entwickelt hatten, wurden sie auf sterilen Metromix-Boden umgesetzt. Das Medium der in-vitro-Pflanzen wurde vor dem Umsetzen der Pflanzen in den Boden abgewaschen. Die Pflanzen wurden 1 Woche lang unter einer Plastikabdeckung gehalten um den Akklimatisierungvorgang zu begünstigen. Anschließend wurden die Pflanzen in eine Wachstumskammer umgestellt, wo sie ungefähr 80 Tage lang bei 25°C bei einer Lichtintensität von 150 μmol m^–2s^–1 und einer 12stündigen Photoperiode inkubiert wurden.
Anschließend wurden die transgenen Pflanzen nach dem in Beispiel 7 beschriebenen Durchmusterungsverfahren auf ihre verbesserte Trockenheits-, Salz- und/oder Kältetoleranz durchmustert, wodurch nachgewiesen wurde, daß die Expression des Transgens Streßtoleranz vermittelt.
Beispiel 11
Konstruktion von streßtoleranten Raps/Canolapflanzen durch Überexpression des PP2A-4-Gens.
Raps/Canola wurden mit dem Konstrukt pBPSJYW016 wie unten beschrieben transformiert.
Das hier beschriebene Pflanzentransformationsverfahren läßt sich auch auf Brassica und andere Kulturen anwenden. Canolasamen wurden 4 Minuten bei Raumtemperatur unter ständigem Schütteln mit 70%igem Ethanol und anschließend 20 Minuten lang unter ständigem Schütteln bei Raumtemparatur mit 20% (v/v) Clorox mit einem Zusatz von 0,05% (v/v) Tween oberflächensterilisiert. Anschließend wurden die Samen viermal mit destilliertem Wasser gespült und 18 Stunden bei Raumtemperatur auf befeuchtetes steriles Papierfilter in eine Petrischale gelegt. Anschließend werden die Samenschalen entfernt und die Samen werden über Nacht in einer halboffenen sterilen Petrischale an der Luft getrocknet. Während dieses Zeitraums verlieren die Samen ungefähr 85% ihres Wassergehalts. Die Samen werden anschließend bei Raumtemperatur in einer verschlossenen Petrischale bis zur weiteren Verwendung aufbewahrt. Die DNA-Konstrukte und das Tränken der Embryonen entsprechen dem in Beispiel 10 Beschriebenen. Proben der primären transgenen Pflanzen (T0) werden mittels PCR analysiert, um das Vorhandensein von T-DNA zu bestätigen. Diese Ergebnisse werden durch Southern-Hybridisierung bestätigt, wobei DNA auf einem 1%igen Agarosegel in der Elektrophorese laufen gelassen wird und dann auf eine positiv geladene Nylonmembran (Roche Diagnostics) übertragen wird. Mit dem PCR DIG Probe Synthesis Kit (Roche Diagnostics) erzeugt man mittels PCR eine digoxigeninmarkierte Sonde; es wird gemäß der Empfehlung des Herstellers eingesetzt.
Anschließend werden die transgenen Pflanzen gemäß dem in Beispiel 7 beschriebenen Durchmusterungsverfahren auf ihre verbesserte Streßtoleranz durchmustert, wodurch nachgewiesen wird, daß die Expression des Transgens Trockenheitstoleranz vermittelt.
Beispiel 12
Erzeugung von streßtoleranten Maispflanzen durch Überexpression des PP2A-4-Gens
Mit dem Konstrukt pPSJYW016 wurde Mais wie unten beschrieben transformiert.
Die Transformation von Mais (Zea Mays L.) erfolgt nach dem Verfahren von Ishida et al. 1996. Nature Biotch 14745–14750. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, die "superbinäre" Vektoren tragen, cokultiviert und die transgenen Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Dieses Verfahren ermöglicht eine Transformationseffizienz zwischen 2,5% und 20%. Anschließend werden die transgenen Pflanzen nach dem in Beispiel 7 beschriebenen Durchmusterungsverfahren auf ihre verbesserte Trockenheits-, Salz- und/oder Kältetoleranz durchmustert, wodurch nachgewiesen wird, daß die Expression des Transgens Streßtoleranz vermittelt.
Beispiel 13
Erzeugung von streßtoleranten Weizenpflanzen durch Überexpression des PP2A-4-Gens
Mit dem Konstrukt pPSJYW016 wurde Weizen wie unten beschrieben transformiert.
Die Transformation von Weizen erfolgt nach dem Verfahren von Ishida et al. 1996 Nature Biotch. 14745–14750. Unreife Embryonen werden mit Agrobacterium tumefaciens, die "superbinäre" Vektoren tragen, cokultiviert und die transgenen Pflanzen werden durch Organogenese gewonnen. Dieses Verfahren ermöglicht eine Transformationseffizienz zwischen 2,5% und 20%. Anschließend werden die transgenen Pflanzen nach dem in Beispiel 7 beschriebenen Durchmusterungsverfahren auf ihre verbesserte Streßtoleranz durchmustert, wodurch nachgewiesen wird, daß die Expression des Transgens Trockenheitstoleranz vermittelt.
Beispiel 14
Identifikation von homologen und heterologen Genen
Für die Identifikation von homologen oder heterologen Genen aus cDNA-Bibliotheken oder genomischen Bibliotheken können Gensequenzen eingesetzt werden. Homologe Gene (z. B. Vollängen-cDNA-Klone) können mittels Nukleinsäurehybridisierung mit z. B. cDNA-Bibliotheken isoliert werden. Je nach der Häufigkeit des interessierenden Gens werden 100,000 bis zu 1,000,000 rekombinante Bakteriophagen ausplattiert und auf Nylonmembranen überführt. Nach Denaturierung mit Alkali wird die DNA auf der Membran z. B. durch UV-Vernetzung immobilisiert. Die Hybridisierung wird unter hochstringenten Bedingungen durchgeführt. Hybridisierung in wäßriger Lösung und Waschen erfolgt bei einer Innenstärke von 1 M NaCl und einer Temperatur von 68°C. Die Hybridisierungssonden werden z. B. durch radioaktive (³²P) Nick-Transkriptionsmarkierung (High Prime, Roche, Mannheim, Deutschland) erzeugt. Die Signale werden durch Autoradiographie nachgewiesen.
Teilweise homologe oder heterologe Gene, die verwandt, jedoch nicht identisch sind, können analog zu dem oben beschriebenen Verfahren mit Niederstringenz-Hybridisierungs- und Waschbedingungen identifiziert werden. Für die wäßrige Hybridisierung wird die Ionenstärke normalerweise bei 1 M NaCl gehalten, während die Temperatur nach und nach von 68 auf 42°C gesenkt wird.
Die Isolation von Gensequenzen mit Homologien (oder Sequenzidentität/Ähnlichkeit) in nur einer begrenzten Domäne von (zum Beispiel 10–20 Aminosäuren) kann dadurch ausgeführt werden, daß man synthetische radioaktiv markierte Oligonukleotidsonden verwendet. Radioaktiv markierte Oligonukleotide werden durch Phosphorylierung des 5'-Endes von zwei komplementären Oligonukleotiden mit T4-Polynukleotidkinase hergestellt. Die komplementären Oligonukleotide werden reassoziieren gelassen und ligiert, wodurch man zu Concatemeren gelangt. Die doppelsträngigen Concatemere werden anschließend radioaktiv markiert, zum Beispiel durch Nick-Transkription. Die Hybridisierung erfolgt üblicherweise unter Niederstringenzbedingungen mit hohen Oligonukleotidkonzentrationen.
Oligonukleotid-Hybridisierungslösung:

– 6 × SSC
– 0,01 M Natriumphosphat
– 1 mM EDTA (pH 8)
– 0,5% SDS
– 100 μg/ml denaturierte Lachssperma-DNA
– 0,1% fettfreie Trockenmilch

Während der Hybridisierung wird die Temperatur schrittweise auf 5–10°C unter die geschätzte Oligonukleotid-Tm oder auf Raumtemperatur erniedrigt, wonach Waschschritte und die Autoradiographie durchgeführt werden. Das Waschen erfolgt mit niedriger Stringenz, wie 3 Waschschritte unter Verwendung von 4 × SSC. Genaueres findet sich bei Sambrook, J. et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F. M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons.
Beispiel 15
Identifikation von homologen Genen durch Durchmustern von Expressionsbibliotheken mit Antikörpern
cDNA-Klone können dazu verwendet werden, um rekombinantes Protein z. B. in E. coli zu produzieren (z. B. Qiagen QIAexpress pQE-System). Die rekombinanten Proteine werden anschließend normal mittels Ni-NTA-Affinitätschromatographie (Qiagen) affinitätsgereinigt. Mit den rekombinanten Proteinen werden anschließend spezifische Antikörper erzeugt, zum Beispiel mittels Standardtechniken für die Immunisierung von Kaninchen. Die Antikörper werden mit einer Ni-NTA-Säule, die mit dem rekombinanten Antigen gesättigt ist, affinitätsgereinigt, wie dies bei Gu et al., 1994 BioTechniques 17: 257–262 beschrieben ist. Mit dem Antikörper können anschließend Expressions-cDNA-Bibliotheken durchmustert werden, um über eine immunologische Durchmusterung homologe oder heterologe Gene zu identifizieren (Sambrook, J. et al. (1989), "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press oder Ausubel, F. M. et al. (1994) "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons).
Beispiel 16
In-vivo-Mutagenese
Die in-vivo-Mutagenese von Mikroorganismen kann durch Passage von Plasmid-DNA (oder einer sonstigen Vektor- DNA) durch E. coli oder andere Mikroorganismen (z. B. Bacillus spp. oder Hefen wie Saccharomyces cerevisiae), deren Fähigkeit, die Integrität ihrer genetischen Information aufrecht zu erhalten, geschwächt ist, durchgeführt werden. Typische Mutatorstämme weisen Mutationen in den Genen für das DNA-Reparatursystem auf (z. B. mutHLS, mutD, mutT, usw.; siehe zum Beispiel Rupp, W. D. (1996) DNA repair mechanisms, in: Escherichia coli and Salmonella, S. 2277–2294, ASM: Washington). Solche Stämme sind dem Fachmann gut bekannt. Die Verwendung solcher Stämme ist zum Beispiel in Greener, A. und Callahan, M. (1994) Strategies 7: 32–34 erörtert. Der Transfer von mutierten DNA-Molekülen in Pflanzen erfolgt vorzugsweise nach der Selektion und der Prüfung in Mikroorganismen. Transgene Pflanzen werden gemäß verschiedenen Beispielen im Beispielteil der vorliegenden Schrift erzeugt.
Beispiel 17
In-vitro-Analyse der Funktion von Physcomitrella-Genen in transgenen Organismen
Die Bestimmung von Aktivitäten und kinetischen Parametern von Enzymen ist in der Fachwelt gut etabliert. Versuche, in denen die Aktivität eines bestimmten veränderten Enzyms bestimmt werden soll, müssen auf die spezifische Aktivität des Wildtyp-Enzyms abgestimmt werden, was vom Fachmann leicht durchgeführt werden kann. Übersichtsartikel über Enzyme im allgemeinen sowie Einzelheiten bezüglich Struktur, Kinetik, Prinzipien, Methoden, Anwendungen und Beispielen für die Bestimmung von vielen Enzymaktivitäten finden sich zum Beispiel in den folgenden Literaturstellen: Dixon, M., und Webb, E. C., (1979) Enzymes. Longmans: London; Fersht, (1985) Enzyme Structure and Mechanism. Freeman: New York; Walsh, (1979) Enzymatic Reaction Mechanisms. Freeman: San Francisco; Price, N. C., Stevens, L. (1982) Fundamentals of Enzymology. Oxford Univ. Press: Oxford; Boyer, P. D., Hrsg. (1983) The Enzymes, 3. Ausgabe, Academic Press: New York; Bisswanger, H., (1994) Enzymkinetik, 2. Ausgabe, VCH: Weinheim (ISBN 3527300325); Bergmeyer, H. U., Bergmeyer, J., Graßl, M., Hrsg. (1983–1986) methods of Enzymatic Analysis, 3. Ausgabe, Band I–XII, Verlag Chemie: Weinheim; und Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry (1987) Band A9, Enzymes. VCH: Weinheim, S. 352–363.
Die Aktivität von Proteinen, die an DNA binden, kann nach mehreren gut etablierten Methoden bestimmt werden, wie DNA-Banden-Shift-Assays (die auch als Gel-Retardations-Assays bezeichnet werden). Die Wirkung dieser Proteine auf die Expression von anderen Molekülen kann mit Reportergen-Assays (wie in Kolmar, H. et al. (1995) EMBO J. 14: 3895–3904 und darin zitierten Literaturstellen beschrieben) gemessen werden. Reportergen-Testsysteme sind gut bekannt und für Anwendungen in prokaryontischen und eukaryontischen. Zellen etabliert, wobei Enzyme wie β-Galactosidase, das grün fluoreszierende Protein und verschiedene andere verwendet werden.
Die Bestimmung der Aktivität von Membrantransportproteinen kann nach Techniken wie sie in Gennis, R. B. Pores, Channels and Transporters, in Biomembranes, Molecular Structure and Function, S. 85–137, 199–234 und 270–322, Springer: Heidelberg (1989) beschrieben sind, erfolgen.
Beispiel 18
Aufreinigung des gewünschten Produkts aus transformierten Organismen
Die Gewinnung des gewünschten Produkts aus Pflanzenmaterial (d. h. Physcomitrella patens oder Arabidopsis thaliana), Pilzen, Algen, Ciliaten, C. glutamicum-Zellen oder sonstigen Bakterienzellen, die mit den hier beschriebenen Nukleinsäuresequenzen transformiert wurden, oder aus dem Überstand der oben beschriebenen Kulturen kann nach verschiedenen Methoden, die in der Fachwelt gut bekannt sind, erfolgen. Wird das gewünschte Produkt nicht von den Zellen sezerniert, so können die Zellen aus der Kultur durch langsame Zentrifugation geerntet werden und die Zellen können nach Standardtechniken wie mechanische Kraft oder Ultraschallbehandlung lysiert werden. Pflanzenorgane können mechanisch von sonstigem Gewebe oder sonstigen Organen getrennt werden. Nach der Homogenisierung werden die Zelltrümmer durch Zentrifugation entfernt und die Überstandsfraktion, die die löslichen Proteine enthält, wird für die weitere Reinigung der gewünschten Verbindung zurückbehalten. Wird das Produkt von den gewünschten Zellen sezerniert, so werden die Zellen durch langsame Zentrifugation aus der Kultur entfernt und die Überstandsfraktion wird für die weitere Aufreinigung beibehalten.
Die Überstandsfraktion aus beiden Reinigungsverfahren wird einer Chromatographie mit einem geeigneten Harz unterzogen, wobei das gewünschte Molekül entweder auf dem Chromatographieharz zurückgehalten wird, viele Verunreinigungen in der Probe jedoch nicht, oder die Verunreinigungen auf dem Harz zurückbleiben, die Probe hingegen nicht. Solche Chromatographieschritte können nötigenfalls wiederholt werden, wobei dieselben oder andere Chromatographieharze verwendet werden. Der Fachmann ist in der Auswahl der geeigneten Chromatographieharze und ihrer wirksamsten Anwendung für ein bestimmtes zu reinigendes Molekül bewandert. Das gereinigte Produkt kann durch Filtration oder Ultrafiltration aufkonzentriert und bei einer Temperatur, bei der die Stabilität des Produkts maximal ist, aufbewahrt werden.
Im Fachgebiet sind viele Reinigungsverfahren bekannt, und das vorhergehende Reinigungsverfahren soll nicht einschränkend sein. Solche Reinigungstechniken sind beispielsweise beschrieben in Bailey, J. E. & Ollis, D. F. Biochemical Engineering Fundamentals, McGraw-Rill: New York (1986). Außerdem können Identität und Reinheit der isolierten Verbindungen nach Techniken des Stands der Technik bestimmt werden. Dazu zählen Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC), spektroskopische Verfahren, Färbeverfahren, Dünnschichtchromatographie, NIRS, Enzym-Assay oder mikrobiologische Verfahren. Diese Analysemethoden sind zusammengefaßt in: Patek et al., 1994 Appl. Environ. Microbiol. 60: 133–140; Malakhova et al., 1996 Biotekhnologiya 11: 27–32; und Schmidt et al., 1998 Bioprocess Engineer. 19: 67–70. Ulmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, (1996) Band A27, VCH und, S. 89–90, S. 521–540, S. 540–547, S. 559–566, 575–581 und S. 581–587; Michal, G. (1999) Biochemical Pathways: An Atlas of Biochemistry and Molecular Biology, John Wiley und Sons; Fallon, A. et al. (1987) Applications of HPLC in Biochemistry in: Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Band 17. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Transgene Pflanzenzelle, die mit einer für ein Phosphatase Stress-Related Protein (PHSRP) codierenden Nukleinsäure, bei der es sich um die für Proteinphosphatase 2A-4 codierende Nukleinsäure handelt, transformiert ist, wobei die Expression der Nukleinsäure in der Pflanzenzelle zu einer im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanzenzelle erhöhten Toleranz gegenüber Trockenheits- und/oder Temperaturstreß führt, wobei das PHSRP eine PP2A-4 gemäß SEQ ID NO: 13 und Sequenzen mit mindestens 96% Homologie zu der gesamten Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 13 ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, wobei das PHSRP die PP2A-4 gemäß SEQ ID NO: 13 ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, wobei die für ein PHSRP codierende Nukleinsäure. die für PP2A-4 codierende Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 8 ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, wobei die für ein PHSRP codierende Nukleinsäure mindestens 80% Homologie über die gesamte Codierregion zu der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 8 aufweist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, wobei die Pflanze eine monokotyle Pflanze ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, wobei die Pflanze eine dikotyle Pflanze ist.
Transgene Pflanzenzelle nach Anspruch 1, wobei die Pflanze aus der Gruppe Mais, Weizen, Roggen, Hafer, Triticale, Reis, Gerste, Sojabohne, Erdnuß, Baumwolle, Raps, Canola, Maniok, Pfeffer, Sonnenblume, Tagetes, Solanaceen, Kartoffel, Tabak, Aubergine, Tomate, Vicia-Arten, Erbse, Luzerne, Kaffee, Kakao, Tee, Salix-Arten, Ölpalme, Kokosnuß, mehrjährige Gras- und Futterkulturen stammt.
Transgene Pflanze, die eine Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 7 umfaßt.
Samen, der von einer transgenen Pflanze, die eine Pflanzenzelle nach einem der Ansprüche 1 bis 8 umfaßt, produziert wird, wobei der Samen für eine im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanzenzelle erhöhte Toleranz gegenüber Trockenheits- und/oder Temperaturstreß reinerbig ist.
Verwendung einer Pflanze oder eines Samens nach einem der Ansprüche 1 bis 9 für die Produktion eines Agrarprodukts.
Isoliertes Phosphatase Stress-Related Protein (PHSRP), wobei das PHSRP eine Proteinphosphatase 2A-4 (PP2A-4) gemäß SEQ ID NO: 13 und Sequenzen mit mindestens 96% Homologie zu der gesamten Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 13 ist.
PHSRP nach Anspruch 11, wobei das PHSRP die PP2A-4 gemäß SEQ ID NO: 13 ist.
Isolierte, für ein Phosphatase Stress-Related Protein (PHSRP) codierende Nukleinsäure, wobei die für ein PHSRP codierende Nukleinsäure für die Proteinphosphatase 2A-4 (PP2A-4) gemäß SEQ ID NO: 13 und Sequenzen mit 96% Homologie zu der gesamten Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 13 codiert.
Für ein PHSRP codierende Nukleinsäure nach Anspruch 13, wobei die für ein PHSRP codierende Nukleinsäure die PP2A-4 gemäß SEQ ID NO: 8 ist.
Für ein PHSRP codierende Nukleinsäure nach Anspruch 13, wobei die für ein PHSRP codierende Nukleinsäure mindestens 90% Homologie über die gesamte Codierregion mit der Sequenz SEQ ID NO: 8 aufweist.
Isolierter rekombinanter Expressionsvektor, der die Nukleinsäure nach Anspruch 14 oder 15 umfaßt, wobei die Expression des Vektors in einer Wirtszelle zu einer im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Wirtszelle erhöhten Streßtoleranz führt.
Verfahren zur Herstellung einer transgenen Pflanze, die eine für ein Phosphatase Stress-Related Protein (PHSRP) codierende Nukleinsäure, bei der es sich um eine für Proteinphosphatase 2A-4 (PP2A-4) codierende Nukleinsäure handelt, enthält, wobei die Expression der Nukleinsäure in der Pflanzenzelle zu einer im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanzenzelle erhöhten Toleranz gegenüber Trockenheits- und/oder Temperaturstreß führt, bei dem man eine Pflanzenzelle mit einem Expressionsvektor, der die Nukleinsäure enthält, transformiert, aus der Pflanzenzelle eine transgene Pflanze mit einer im Vergleich zu einer Wildtyp-Sorte der Pflanze erhöhten Toleranz gegenüber Trockenheits- und/oder Temperaturstreß erzeugt, wobei das PHSRP eine PP2A-4 gemäß SEQ ID NO: 13 und Sequenzen mit mindestens 96% Homologie zu der gesamten Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 13 ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei das PHSRP die PP2A-4 gemäß SEQ ID NO: 13 ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die für das PHSRP codierende Nukleinsäure die für PP2A-4 codierende Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 8 ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die für das PHSRP codierende Nukleinsäure mindestens 80% Homologie über die gesamte Codierregion mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 8 aufweist.
Verfahren zum Modifizieren der Trockenheits- und/oder Temperaturstreßtoleranz einer Pflanze, bei dem man die Expression eines Phosphatase Stress-Related Protein (PHSRP), bei dem es sich um die Proteinphosphatase 2A-4 handelt, in der Pflanze modifiziert, wobei das PHSRP eine PP2A-4 gemäß SEQ ID NO: 13 und Sequenzen mit mindestens 96% Homologie mit der gesamten Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO: 13 ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei das PHSRP die PP2A-4 gemäß SEQ ID NO: 13 ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die für das PHSRP codierende Nukleinsäure die für PP2A-4 codierende Nukleinsäure gemäß SEQ ID NO: 8 ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die für das PHSRP codierende Nukleinsäure mindestens 80% Homologie über die gesamte Codierregion mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 8 aufweist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Streßtoleranz erhöht ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Streßtoleranz erniedrigt ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Pflanze nicht transgen ist.
Verfahren nach Anspruch 21, wobei die Pflanze transgen ist.
Verfahren nach Anspruch 28, wobei die Pflanze mit einem Promoter transformiert ist, der die Expression des PHSRP steuert.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei der Promoter gewebespezifisch ist.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei der Promoter entwicklungsreguliert ist.