DE60131856T2 - Motiv auf Basis von Leucin und Clostridium-Neurotoxine - Google Patents

Motiv auf Basis von Leucin und Clostridium-Neurotoxine Download PDF

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Description

  • Hintergrund
  • Die vorliegende Erfindung betrifft modifizierte Neurotoxine, insbesondere modifizierte Clostridien-Neurotoxine und die Verwendung davon, um verschiedene Zustände zu behandeln, einschließlich Zuständen, die unter Verwendung von natürlich auftretenden Botulinumtoxinen behandelt wurden.
  • Botulinumtoxin, z. B. Botulinumtoxin Typ A wurde bei der Behandlung zahlreicher Zustände verwendet, einschließlich Schmerz, Skelettmuskelzuständen, Zuständen der glatten Muskulatur und glandulären Zuständen. Botulinumtoxine werden auch für kosmetische Zwecke verwendet.
  • Es gibt zahlreiche Beispiele für die Behandlung unter Verwendung von Botulinumtoxin. Für Beispiele der Schmerzbehandlung siehe Aoki, et al., US 6,113,915 und Aoki, et al., US 5,721,215 . Für ein Beispiel der Behandlung einer neuromuskulären Störung US-Patent Nr. 5,053,005 , das die Behandlung der Verkrümmung der juvenilen Wirbelsäule, d. h. Skoliose, mit einem Acetylcholin-Freisetzungsinhibitor, vorzugsweise Botulinumtoxin A, vorschlägt. Für die Behandlung von Strabismus mit Botulinumtoxin Typ A, siehe Elston, J. S., et al., British Journal of Ophthalmology, 1985, 69, 718–724 und 891–896. Für die Behandlung von Blepharospasmus mit Botulinumtoxin Typ A siehe Adenis, J. P., et al., J. Fr. Ophthalmol., 1990, 13 (5), auf Seiten 259–264. Für die Behandlung von spasmodischer und oromandibulärer Dystonia torticollis, siehe Jankovic et al., Neurology, 1987, 37, 616–623. Spasmodische Dystonie wurde auch mit Botulinumtoxin Typ A behandelt. Siehe Blitzer et al., Ann. Otol. Rhino. Laryngol, 1985, 94, 591–594. Linguale Dystonie wurde nach Aussage von Brin et al., Adv. Neurol. (1987) 50, 599–608 mit Botulinumtoxin Typ A behandelt. Cohen et al., Neurology (1987) 37 (Suppl. 1), 123–4 offenbart die Behandlung von Schreibkrampf mit Botulinumtoxin Typ A.
  • WO 96/39166 A stellt Mutationen in dem Botulinumtoxin bereit, die das Molekül mit einer längeren Halbwertszeit in neuromuskulärem Gewebe bereitstellen.
  • Es würde nützlich sein, Botulinumtoxine mit veränderter biologischer Persistenz und/oder veränderter biologischer Aktivität zu haben. Zum Beispiel kann ein Botulinumtoxin verwendet werden, um Muskeln zu immobilisieren und Extremitätenbewegungen nach Sehnenoperation zu verhindern, um die Erholung zu erleichtern. Es würde nützlich sein, ein Botulinumtoxin (wie ein Butulinumtoxin Typ A) zu haben, das einen reduzierten Zeitraum von biologischer Persistenz aufweist, so dass ein Patient die Muskelverwendung und Mobilität zu ungefähr dem Zeitpunkt wiedergewinnen kann, wenn er sich von der Operation erholt. Darüber hinaus kann ein Botulinumtoxin mit einer veränderten biologischen Aktivität, wie einer gesteigerten biologischen Aktivität, eine Nützlichkeit als ein effizienteres Toxin aufweisen (d. h. stärker pro Einheitsmenge des Toxins), so dass weniger Toxin verwendet werden kann.
  • Zusätzlich besteht ein Bedarf an modifizierten Neurotoxinen (wie modifizierten Clostridien-Toxinen), die einen gesteigerten Zeitraum biologischer Persistenz aufweisen können und modifizierten Neurotoxinen (wie modifizierten Clostridientoxinen) mit reduzierter biologischer Persistenz und/oder biologischer Aktivität und Verfahren zur Herstellung solcher Toxine.
  • Definitionen
  • Bevor damit fortgefahren wird, die vorliegende Erfindung zu beschreiben, werden die folgenden Definitionen zur Verfügung gestellt und hier verwendet.
  • "Schwere Kette" bedeutet die schwere Kette eines Clostridien-Neurotoxins. Sie besitzt ein Molekulargewicht von ungefähr 100 kDa und kann hier als schwere Kette oder als H bezeichnet werden.
  • "HN" bedeutet ein Fragment (mit einem Molekulargewicht von ungefähr 50 kDa), das von der schweren Kette eines Clostridien-Neurotoxins abstammt, das ungefähr äquivalent zu dem Aminoendsegment der schweren Kette ist, oder den Anteil, der zu diesem Fragment in der intakten schweren Kette korrespondiert. Man glaubt, dass es den Anteil des natürlichen oder Wildtyp-Clostridien-Neurotoxins enthält, der in die Translokation der leichten Kette über eine intrazelluläre endosomale Membran involviert ist.
  • "HC" bedeutet ein Fragment (ungefähr 50 kDa), das von der schweren Kette eines Clostridien-Neurotoxins stammt, das ungefähr äquivalent zu dem Carboxylendsegment der schweren Kette ist, oder den Anteil, der zu diesem Fragment in der intakten schweren Kette korrespondiert. Man glaubt, dass es immunogen ist und den Anteil des natürlichen oder Wildtyp-Clostridien-Neurotoxins enthält, der in die Hochaffinitätsbindung an verschiedenen Neurone (einschließlich motorische Neurone) und andere Arten von Zielzellen involviert ist.
  • "Leichte Kette" bedeutet die leichte Kette eines Chlostridien-Neurotoxins. Sie weist ein Molekulargewicht von ungefähr 50 kDa auf und kann als eine leichte Kette, L oder als die proteolytische Domäne (Aminosäuresequenz) eines Chlostridien-Neurotoxins bezeichnet werden. Man glaubt von der leichten Kette, dass sie als ein Inhibitor der Exozytose effektiv ist, einschließlich als ein Inhibitor von Neurotransmitter (d. h. Acetylcholin)-Freisetzung, wenn die leichte Kette in dem Cytoplasma einer Zielzelle vorliegt.
  • "Neurotoxin" bedeutet ein Molekül, das in der Lage ist, die Funktionen einer Zelle, einschließlich eines Neurons, zu stören. Das "Neurotoxin" kann natürlich auftreten oder künstlich hergestellt sein. Die gestörte Funktion kann Exozytose sein.
  • "Modifiziertes Neurotoxin" bedeutet ein Neurotoxin, das eine strukturelle Modifikation beinhaltet. In anderen Worten ist ein "modifiziertes Neurotoxin" ein Neurotoxin, das durch eine strukturelle Modifikation modifiziert wurde. Die strukturelle Modifikation ändert die biologische Persistenz, wie die biologische Halbwertszeit (sprich die Dauer der Wirkung des Neurotoxins), und/oder die biologische Aktivität des modifizierten Neurotoxins relativ zu dem Neurotoxin, aus dem das modifizierte Neurotoxin hergestellt wird oder stammt. Das modifizierte Neurotoxin ist strukturell unterschiedlich zu einem natürlich auftretenden Neurotoxin.
  • "Mutation" bedeutet eine strukturelle Modifikation eines natürlich auftretenden Proteins oder einer Nucleinsäuresequenz. Zum Beispiel kann in dem Fall von Nucleinsäuremutationen eine Mutation, eine Deletion, Addition oder Substitution von einem oder mehreren Nucleotiden in der DNA-Sequenz sein. In dem Fall einer Proteinsequenzmutation kann die Mutation eine Deletion, Addition oder Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren in einer Proteinsequenz sein. Zum Beispiel kann eine spezifische Aminosäure, die eine Proteinsequenz umfasst, durch eine andere Aminosäure substituiert werden, z. B. eine Aminosäure, die aus einer Gruppe ausgewählt wird, die die Aminosäuren Alanin, Asparagin, Cystein, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Phenylalanin, Glycin, Histidin, Isoleucin, Lysin, Leucin, Methionin, Prolin, Glutamin, Arginin, Serin, Threonin, Valin, Tryptophan, Tyrosin oder irgendeine andere natürliche oder nicht natürlich auftretende Aminosäure oder chemisch modifizierte Aminosäuren beinhaltet. Mutationen an einer Proteinsequenz können das Ergebnis von Mutationen an DNA-Sequenzen sein, die, wenn sie transkribiert werden, und die resultierende mRNA translatiert wird, die mutierte Proteinsequenz herstellen. Mutationen an einer Proteinsequenz können auch durch Fusionierung einer Peptidsequenz, die die erwünschte Mutation enthält, mit einer erwünschten Proteinsequenz geschaffen werden.
  • "Strukturelle Modifikation" bedeutet jede Änderung an einem Neurotoxin, die es physikalisch oder chemisch unterschiedlich zu einem identischen Neurotoxin ohne die strukturelle Modifikation macht.
  • "Biologische Persistenz" oder "Persistenz" bedeutet die Zeitdauer der Interferenz oder des Einflusses, die/der durch ein Neurotoxin oder ein modifiziertes Neurotoxin mit einer zellulären (wie einer neuronalen) Funktion hervorgerufen wird, einschließlich der temporären Dauer einer Inhibition von Exozytose (wie Exozytose von Neurotransmitter, z. B. Acetylcholin) aus einer Zelle, wie einem Neuron.
  • "Biologische Halbwertszeit" oder "Halbwertszeit" bedeutet die Zeit, während der die Konzentration eines Neurotoxins oder eines modifizierten Neurotoxins, vorzugsweise der aktive Teil des Neurotoxins oder modifizierten Neurotoxins, z. B. die leichte Kette von Clostridien-Toxinen, auf die Hälfte der ursprünglichen Konzentration in einer Säugerzelle, wie in einem Säugerneuron, reduziert wird.
  • "Biologische Aktivität" oder "Aktivität" bedeutet die Menge an zellulärer Exozytose, die von einer Zelle pro Zeiteinheit inhibiert wird, wie einer Exozytose von einem Neurotransmitter aus einem Neuron.
  • "Zielzelle" bedeutet eine Zelle (einschließlich einem Neuron) mit einer Bindungsaffinität für ein Neurotoxin oder für ein modifiziertes Neurotoxin.
  • Zusammenfassung
  • Es wurden neue strukturell modifizierte Neurotoxine entdeckt. Die vorliegenden strukturell modifizierten Neurotoxine können wesentliche Vorteile darstellen, z. B. verlängerte oder verkürzte biologische Persistenz und/oder biologische Halbwertszeit und/oder gesteigerte oder verringerte biologische Aktivität im Vergleich mit dem nicht-modifizierten Neurotoxin.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden strukturell modifizierte Neurotoxine bereitgestellt, die ein Neurotoxin und eine strukturelle Modifikation beinhalten. Die strukturelle Modifikation ist effektiv, um eine biologische Persistenz des strukturell modifizierten Neurotoxins relativ zu einem identischen Neurotoxin ohne die strukturelle Modifikation zu verändern. Das strukturell modifizierte Neurotoxin ist auch strukturell unterschiedlich zu einem natürlich auftretenden Neurotoxin.
  • Die vorliegende Erfindung umfasst auch ein modifiziertes Neurotoxin, umfassend ein Neurotoxin mit einer strukturellen Modifikation, worin die besagte strukturelle Modifikation effektiv ist, um eine biologische Aktivität des besagten modifizierten Neurotoxins relativ zu einem identischen Neurotoxin ohne die besagte strukturelle Modifikation zu ändern, und worin das besagte modifizierte Neurotoxin sich strukturell von einem natürlich vorkommenden Neurotoxin unterscheidet. Diese strukturelle Modifikation kann effektiv sein, um eine Exozytose von einer Zielzelle um mehr als die Menge der Exozytose, die aus der Zielzelle durch ein identisches Neurotoxin ohne die besagte strukturelle Modifikation reduziert wird, zu reduzieren. Alternativ kann die strukturelle Modifikation effektiv sein, um eine Exozytose aus einer Zielzelle um weniger als die Menge der Exozytose, die von der Zelle durch ein identisches Neurotoxin ohne die strukturelle Modifikation reduziert wird, zu reduzieren. Signifikanterweise kann die Exozytose die Exozytose eines Neurotransmitters sein und das modifizierte Neurotoxin kann eine veränderte biologische Aktivität ohne Auftreten einer veränderten biologischen Persistenz aufweisen. Die strukturelle Modifikation kann ein Motiv auf Leucinbasis umfassen. Zusätzlich kann das modifizierte Neurotoxin sowohl eine veränderte biologische Aktivität wie auch eine veränderte biologische Persistenz aufweisen. Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch die Umstände, wo: (a) das modifizierte Neurotoxin eine gesteigerte biologische Aktivität wie auch eine gesteigerte biologische Persistenz aufweist; (b) das modifizierte Neurotoxin eine gesteigerte biologische Aktivität und eine verringerte biologische Persistenz aufweist; (c) das modifizierte Neurotoxin eine verringerte biologische Aktivität und eine verringerte biologische Persistenz aufweist und (d) das modifizierte Neurotoxin eine verringerte biologische Aktivität und eine gesteigerte biologische Persistenz aufweist.
  • Wichtigerweise kann eine Einheitsmenge (sprich auf einer molaren Basis) des modifizierten Neurotoxins effizienter bei der Reduktion einer Exozytose aus einer Zelle sein, als eine Einheitsmenge des natürlich vorkommenden Neurotoxins ist. In anderen Worten kann eine Einheitsmenge eines modifizierten Neurotoxins, wie eines modifizierten Botulinumtoxin Typ A, sein intrazelluläres Substrat (SNAP) auf eine Weise spalten, dass sich eine größere Inhibition der Neurotransmitter-Exozytose ergibt (sprich weniger Neurotransmitter wird aus der Zelle freigesetzt), im Vergleich zu der Inhibition von Neurotransmitter-Exozytose, die von dem natürlich auftretenden Neurotoxin gezeigt wird.
  • Weiter sind strukturell modifizierte Neurotoxine in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung, bei denen eine strukturelle Modifikation effektiv ist, um eine biologische Persistenz des modifizierten Neurotoxins zu steigern. Die gesteigerte biologische Persistenz des strukturell modifizierten Neurotoxins kann aufgrund von zumindest teilweise einer gesteigerten Halbwertszeit und/oder biologischen Aktivität der strukturell modifizierten Neurotoxins bestehen.
  • Noch weiter gemäß der vorliegenden Erfindung werden strukturell modifizierte Neurotoxine bereitgestellt, bei denen eine biologische Persistenz des strukturell modifizierten Neurotoxins relativ zu derjenigen eines identischen Neurotoxins ohne die strukturelle Modifikation reduziert ist. Diese Reduktion in der biologischen Persistenz kann zumindest teilweise aufgrund einer verringerten biologischen Halbwertszeit und/oder Aktivität der strukturell modifizierten Neurotoxine bestehen.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden strukturell modifizierte Neurotoxine bereitgestellt, worin die strukturelle Modifikation ein Motiv auf Leucinbasis umfasst.
  • Noch weiter gemäß der vorliegenden Erfindung werden strukturell modifizierte Neurotoxine bereitgestellt, die eine strukturelle Modifikation beinhalten können. Das Neurotoxin kann drei Aminosäuresequenzregionen umfassen. Die erste Region kann als ein zellulärer Bindungsanteil effektiv sein. Dieser Bindungsanteil kann ein Bindungsanteil für eine Zielzelle, wie ein Neuron, sein. Der Bindungsanteil kann ein Carboxylende einer schweren Kette von Botulinumtoxin sein. Es ist gut bekannt, dass das Carboxylende einer schweren Kette von Botulinumtoxin effektiv sein kann, um z. B. Rezeptoren, die in bestimmten Zellen gefunden werden, einschließlich bestimmter Nervenzellen, zu binden. Bei einer Ausführungsart bindet das Carboxylende an Rezeptoren, die auf einer präsynaptischen Membran einer Nervenzelle gefunden werden. Die zweite Region kann effektiv sein, um ein strukturell modifiziertes Neurotoxin oder einen Teil eines strukturell modifizierten Neurotoxins über eine Endosommembran zu translozieren. Die dritte Region kann effektiv sein, um Exozytose aus einer Zielzelle zu inhibieren. Die Inhibition der Exozytose kann eine Inhibition von Neurotransmitter-Freisetzung, wie Acetylcholin aus einer präsynaptischen Membran, sein. Zum Beispiel ist es gut bekannt, dass die leichte Kette von Botulinumtoxin effektiv ist, um z. B. Acetylcholin (wie auch andere Neurotransmitter)-Freisetzung aus verschiedenen neuronalen und nicht-neuronalen Zellen zu inhibieren.
  • Zumindest eine der ersten, zweiten oder dritten Regionen kann im Wesentlichen von einem Clostridien-Neurotoxin abgeleitet werden. Die dritte Region kann die strukturelle Modifikation enthalten. Zusätzlich kann das modifizierte Neurotoxin sich strukturell von einem natürlich vorkommenden Neurotoxin unterscheiden. Auch kann die strukturelle Modifikation effektiv sein, um eine biologische Persistenz des modifizierten Neurotoxins, relativ zu einem identischen Neurotoxin ohne die strukturelle Modifikation, zu ändern.
  • Bei einer Ausführungsart werden strukturell modifizierte Neurotoxine bereitgestellt, worin das Neurotoxin Botulinum Serotyp A, B, C1, C2, D, E, F, G, Tetanustoxin und/oder Mischungen davon sein kann.
  • Bei einer anderen Ausführungsart werden strukturell modifizierte Neurotoxine bereitgestellt, wo die dritte Region von Botulinumtoxin Serotyp A abgeleitet werden kann. Zusätzlich werden strukturell modifizierte Neurotoxine bereitgestellt, worin die dritte Region nicht von Botulinum Serotyp A abgeleitet werden kann.
  • Bei noch einer anderen Ausführungsart werden strukturell modifizierte Neurotoxine bereitgestellt, worin die strukturelle Modifikation eine biologische Persistenz steigernde Komponente beinhaltet, die effektiv ist, um die biologische Persistenz des strukturell modifizierten Neurotoxins zu steigern. Die Steigerung der biologischen Persistenz kann mindestens teilweise auf eine Steigerung der biologischen Halbwertszeit und/oder Aktivität des strukturell modifizierten Neurotoxins zurückzuführen sein.
  • Weiter werden gemäß der vorliegenden Erfindung strukturell modifizierte Neurotoxine bereitgestellt, umfassend eine die biologische Persistenz steigernde Komponente, worin die die biologische Persistenz steigernde Komponente ein Motiv auf Leucinbasis umfassen kann. Das Motiv auf Leucinbasis kann eine Strecke von 7 Aminosäuren umfassen, wo ein Quintett von Aminosäuren und ein Duplett von Aminosäuren das Motiv auf Leucinbasis umfassen kann. Das Quintett der Aminosäuren kann das aminoterminale Ende des Motivs auf Leucinbasis definieren. Das Duplett der Aminosäuren kann das Carboxylende des Motivs auf Leucinbasis definieren. Es werden strukturell modifizierte Neurotoxine bereitgestellt, worin das Quintett der Aminosäuren ein oder mehrere saure Aminosäuren umfassen kann. Zum Beispiel kann die saure Aminosäure Glutamat oder Aspartat sein. Das Quintett der Aminosäuren kann eine Hydroxyl enthaltende Aminosäure umfassen. Die Hydroxyl enthaltende Aminosäure kann z. B. ein Serin, ein Threonin oder ein Tyrosin sein. Diese Hydroxyl enthaltende Aminosäure kann phosphoryliert sein. Mindestens eine Aminosäure, die das Duplett von Aminosäuren umfasst, kann ein Leucin, Isoleucin, Methionin, Alanin, Phenylalanin, Tryptophan, Valin oder Tyrosin sein. Zusätzlich kann das Duplett von Aminosäuren in dem Motiv auf Leucinbasis Leucin-Leucin, Leucin-Isoleucin, Isoleucin-Leucin oder Isoleucin-Isoleucin, Leucin-Methionin sein. Das Motiv auf Leucinbasis kann eine Aminosäuresequenz von Phenylalanin-Glutamat-Phenylalanin-Tyrosin-Lysin-Leucin-Leucin sein.
  • Weiter kann gemäß der vorliegenden Erfindung die dritte Region von Botulinumtoxin Serotyp A oder von einem der anderen Botulinumtoxin-Serotypen abgeleitet werden.
  • Noch weiter gemäß der vorliegenden Erfindung werden strukturell modifizierte Neurotoxine bereitgestellt, wo die biologische Persistenz des strukturell modifizierten Neurotoxins relativ zu einem identischen Neurotoxin ohne die strukturelle Modifikation reduziert sein kann. Die reduzierte biologische Persistenz kann teilweise auf eine verringerte biologische Halbwertszeit und/oder eine verringerte biologische Aktivität des Neutoxins zurückgeführt werden.
  • Bei einer Ausführungsart werden strukturell modifizierte Neurotoxine bereitgestellt, wo die strukturelle Modifikation ein Motiv auf Leucinbasis mit einer Mutation von einer oder mehreren Aminosäuren, die das Motiv auf Leucinbasis umfasst, beinhalten kann. Die Mutation kann eine Deletion oder Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren des Motivs auf Leucinbasis sein.
  • Bei einer Ausführungsart der vorliegenden Erfindung werden strukturell modifizierte Neurotoxine bereitgestellt, worin die ersten, zweiten und/oder dritten Regionen der strukturell modifizierten Neurotoxine durch rekombinante DNA-Methodologien hergestellt werden können, sprich rekombinant hergestellt werden.
  • Bei einer anderen Ausführungsart der vorliegenden Erfindung werden strukturell modifizierte Neurotoxine bereitgestellt, worin die erste, zweite und/oder dritte Region des Neurotoxins aus einem natürlich vorkommenden Clostridien-Neurotoxin isoliert wird.
  • Eine andere Ausführungsart der vorliegenden Erfindung stellt ein modifiziertes Neurotoxin bereit, umfassend ein Botulinumtoxin (wie ein Botulinumtoxin Typ A), das eine strukturelle Modifikation beinhaltet, die effektiv ist, um eine biologische Persistenz des modifizierten Neurotoxins, relativ zu einem identischen Neurotoxin ohne die strukturelle Modifikation, zu verändern. Die strukturelle Modifikation kann eine Deletion von Aminosäuren 416 bis 437 aus einer leichten Kette des Neurotoxins umfassen (3).
  • Noch weiter gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein modifiziertes Botulinumtoxin bereitgestellt, wie ein modifiziertes Botulinumtoxin Typ A, das eine strukturelle Modifikation beinhaltet, die effektiv ist, um eine biologische Persistenz des modifizierten Neurotoxins, relativ zu einem identischen Neurotoxin ohne besagte strukturelle Modifikation, zu verändern. Die strukturelle Modifikation kann eine Substitution von Leucin an Position 427 für ein Alanin oder eine Substitution von Leucin an Position 428 für ein Alanin in einer leichten Kette des besagten Neurotoxins umfassen (3).
  • Zusätzlich beinhaltet der Umfang der vorliegenden Erfindung auch Verfahren zur Steigerung der biologischen Persistenz und/oder zur Steigerung der biologischen Aktivität eines Neurotoxins. Bei diesen Verfahren kann eine strukturelle Modifikation an das Neurotoxin fusioniert oder dem Neurotoxin zugefügt werden, z. B. kann die strukturelle Modifikation eine die biologische Persistenz steigernde Komponente und/oder die eine biologische Aktivität steigernde Komponente sein. Die strukturelle Modifikation, die an das Neurotoxin fusioniert oder dem Neurotoxin zugegeben werden kann, ist ein Motiv auf Leucinbasis.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung werden auch Verfahren zur Reduktion der biologischen Persistenz und/oder zur Reduktion der biologischen Aktivität von einem Neurotoxin bereitgestellt. Diese Verfahren können einen Schritt der Mutation einer Aminosäure des Neurotoxins umfassen. Zum Beispiel kann eine Aminosäure mit einem Motiv auf Leucinbasis innerhalb des Neurotoxins mutiert werden. Diese Mutationen können z. B. Aminosäuredeletionen oder Aminosäuresubstitutionen sein.
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch Verfahren für die Behandlung eines Zustandes. Die Verfahren können einen Schritt der Verabreichung einer effektiven Dosis eines strukturell modifizierten Neurotoxins an einen Säuger umfassen, um einen Zustand zu behandeln. Das strukturell modifizierte Neurotoxin kann eine strukturelle Modifikation beinhalten. Die strukturelle Modifikation ist effektiv, um die biologische Persistenz und/oder die biologische Aktivität des Neurotoxins zu verändern. Diese Verfahren zur Behandlung eines Zustandes können ein Neurotoxin verwenden, das nicht ein Motiv auf Leucinbasis umfasst. Diese Verfahren zur Behandlung eines Zustandes können auch ein Neurotoxin verwenden, das eine biologische Persistenz-steigernde Komponente und/oder eine biologische Aktivität-steigernde Komponente beinhaltet. Die die biologische Persistenz oder Aktivität steigernde Komponente ist ein Motiv auf Leucinbasis. Der Zustand, der behandelt wird, kann eine neuromuskuläre Störung, eine autonome Störung oder Schmerz sein. Die Behandlung einer neuromuskulären Störung kann einen Schritt der lokalen Verabreichung einer effektiven Menge eines modifizierten Neurotoxins an einen Muskel oder eine Muskelgruppe umfassen. Ein Verfahren zur Behandlung einer autonomen Störung kann einen Schritt der lokalen Verabreichung einer effektiven Menge eines modifizierten Neurotoxins an eine Drüse oder Drüsen umfassen. Ein Verfahren zur Behandlung von Schmerz kann einen Schritt der Verabreichung einer effektiven Menge eines modifizierten Neurotoxins an den Ort des Schmerzes umfassen. Zusätzlich kann die Behandlung von Schmerz einen Schritt der Verabreichung einer effektiven Menge eines modifizierten Neurotoxins an das Rückenmark umfassen.
  • Noch weiter werden in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung Verfahren zur Behandlung von Zuständen mit modifizierten Neurotoxinen bereitgestellt, einschließlich spasmodischer Dysphonie, laryngealer Dystonie, oromandibulärer Dysphonie, lingualer Dystonie, zervikaler Dystonie, fokaler Handdystonie, Blepharospasmus, Strabismus, hemifazialem Spasmus, Augenlidstörung, zerebraler Lähmung, fokaler Spastik, spastischer Kolitis, neurogener Blase, Anismus, Extremitätenspastik, Tics, Tremorformen, Bruxismus, Analfissur, Achalasie, Dysphagie, Lakrimation, Hyperhydrose, exzessive Salivation, exzessive gastrointestinale Sekretionen, Schmerz aufgrund von Muskelspasmus, Kopfschmerz, Brauenfurchen und Hautfalten.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die Lokalisierung von GFP-Botulinumtoxin.
  • Eine leichte Kette in (Nervenwachstumsfaktor) NGF-differenzierten lebenden PC12-Zellen, visualisiert auf einem gestürztem Fluoreszenzmikroskop.
  • 2 zeigt die Lokalisierung von GFP-gekürzter Botulinumtoxin A-leichter Kette in NGF-differenzierten lebenden PC12-Zellen, visualisiert auf einem gestürzten Fluoreszenzmikroskop.
  • 3 zeigt die Aminosäuresequenz für die Botulinum Typ A-leichte Kette. Die Aminosäuresequenz, die gezeigt wird, minus die unterstrichenen Aminosäuren, repräsentiert Botulinum Typ A-gekürzte leichte Kette.
  • 4 zeigt die Lokalisierung von GFP-Botulinumtoxin A-leichter Kette mit LL- zu AA-Mutation an Position 427 und 428 in NGF-differenzierten lebenden PC12-Zellen, visualisiert auf einem gestürzten Fluoreszenzmikroskop.
  • 5 zeigt die Lokalisierung von Fluoreszenz-markierten Anti-SNAP-25, visualisiert in horizontalen konfokalen Schnitten von Staurosporindifferenzierten PC12-Zellen.
  • 6 zeigt eine röntgenkristallographische Struktur von Botulinumtoxin Typ A.
  • 7 zeigt die Lokalisierung von GFP-Botulinum Typ B-Neurotoxin-leichter Kette in NGF-differenzierten lebenden PC12-Zellen, visualisiert auf einem gestürzten Fluoreszenzmikroskop.
  • 8 zeigt die Sequenzanordnung und Konsensussequenz für Botulinumtoxin Typ A-HallA-leichte Kette und Botulinumtoxin Typ B-Danish I-leichte Kette.
  • 9 ist ein Graph, der die Ergebnisse eines in vitro-ELISA-Assays veranschaulicht, der durch die Erfinder durchgeführt wurde, der zeigt, dass ein gekürztes LC/A in vitro das Substrat mit einer geringeren Geschwindigkeit oder weniger effizient spaltet als es das nicht-gekürzte LC/A tut.
  • 10 zeigt einen Vergleich von LC/A-Konstrukten, die von E. coli für in vitro-Analysen exprimiert wurden.
  • Ausführliche Beschreibung
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung, dass die biologische Persistenz und/oder die biologische Aktivität eines Neurotoxins durch strukturelle Modifikation des Neurotoxins verändert werden kann. In anderen Worten kann ein modifiziertes Neurotoxin mit einer veränderten biologischen Persistenz und/oder biologischen Aktivität aus einem Neurotoxin gebildet werden, das eine strukturelle Modifikation enthält oder beinhaltet. In einer Ausführungsart beinhaltet die strukturelle Modifikation die Fusion einer die biologische Persistenz steigernden Komponente an die primäre Struktur eines Neurotoxins, um seine biologische Persistenz zu steigern. Die die biologische Persistenz steigernde Komponente ist ein Motiv auf Leucinbasis. Noch mehr vorzuziehen wird die biologische Halbwertszeit und/oder die biologische Aktivität des modifizierten Neurotoxins um ungefähr 100% gesteigert. Allgemein gesprochen weist das modifizierte Neurotoxin eine biologische Persistenz von ungefähr 20% bis 300% über der eines identischen Neurotoxins ohne die strukturelle Modifikation auf. Das bedeutet z. B., dass das modifizierte Neurotoxin, das die biologische Persistenz-steigernde Komponente beinhaltet, in der Lage ist, eine substantielle Inhibition der Neurotransmitter-Freisetzung von z. B. Acetylcholin aus einem Nervenende um ungefähr 20% bis ungefähr 300% länger als ein Neurotoxin, das nicht modifiziert ist, hervorzurufen.
  • Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch innerhalb ihres Umfanges ein modifiziertes Neurotoxin mit einer biologischen Aktivität, die im Vergleich zu der biologischen Aktivität des nativen oder unmodifizierten Neurotoxins verändert ist. Zum Beispiel kann das modifizierte Neurotoxin eine reduzierte oder eine gesteigerte Inhibition von Exozytose (wie die Exozytose eines Neurotransmitters) aus einer Zielzelle mit oder ohne irgendeine Veränderung in der biologischen Persistenz des modifizierten Neurotoxins aufweisen.
  • Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Motiv auf Leucinbasis eine Strecke von sieben Aminosäuren. Die Strecke ist in zwei Gruppen organisiert. Die ersten fünf Aminosäuren, ausgehend von dem Aminoende des Motivs auf Leucinbasis bilden ein "Quintett von Aminosäuren". Die zwei Aminosäuren, die dem Quintett von Aminosäuren sofort folgen, bilden ein "Duplett von Aminosäuren". Bei einer bevorzugten Ausführungsart ist das Duplett von Aminosäuren in der Carboxylendregion des Motivs auf Leucinbasis lokalisiert. Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsart beinhaltet das Quintett von Aminosäuren mindestens eine azidische Aminosäure, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einem Glutamat und einem Aspartat besteht.
  • Das Duplett von Aminsäuren beinhaltet mindestens eine hydrophobe Aminosäure, z. B. Leucin, Isoleucin, Methionin, Alanin, Phenylalanin, Tryptophan, Valin oder Tyrosin. Vorzugsweise ist das Duplett von Aminosäure ein Leucin-Leucin, ein Leucin-Isoleucin, ein Isoleucin-Leucin oder ein Isoleucin-Isoleucin, Leucin-Methionin. Noch mehr vorzuziehen ist das Duplett ein Leucin-Leucin.
  • Bei einer Ausführungsart ist das Motiv auf Leucinbasis xDxxxLL (SEQ ID NO: 1), worin x irgendeine Aminosäure sein kann. Bei einer anderen Ausführungsart ist das Motiv auf Leucinbasis xExxLL (SEQ ID NO: 2), worin E Glutaminsäure ist. Bei einer anderen Ausführungsart kann das Duplett von Aminosäuren ein Isoleucin oder ein Methionin beinhalten, was xDxxxLI (SEQ ID NO: 3) bzw. xExxxLM (SEQ ID NO: 4) bildet. Zusätzlich kann die Asparaginsäure, D, durch eine Glutaminsäure, E, ersetzt werden, um xExxxLI (SEQ ID NO: 5), xExxxIL (SEQ ID NO: 21) und xExxxLM (SEQ ID NO: 6) zu bilden. Bei einer bevorzugten Ausführungsart ist das Motiv auf Leucinbasis Phenylalanin-Glutamat-Phenylalanintyrosin-Lysin-Leucin-Leucin, SEQ ID NO: 7.
  • Bei einer anderen Ausführungsart umfasst das Quintett von Aminosäuren mindestens eine Hydroxyl-enthaltende Aminosäure, z. B. ein Serin, ein Threonin oder ein Tyrosin. Vorzugsweise kann die Hydroxyl enthaltende Aminosäure phosphoryliert sein. Mehr vorzuziehen ist die Hydroxyl-enthaltende Aminosäure ein Serin, das phosphoryliert werden kann, um die Bindung von Adapterproteinen zu ermöglichen.
  • Obwohl nicht-modifizierte Aminosäuren als Beispiele bereitgestellt werden, wird eine modifizierte Aminosäure auch als innerhalb des Umfanges dieser Erfindung liegend betrachtet. Zum Beispiel kann das Motiv auf Leucinbasis ein halogeniertes, vorzugsweise fluoriertes Leucin enthalten.
  • Verschiedene Motive auf Leucinbasis werden in verschiedenen Arten gefunden. Eine Liste von möglichen Motiven auf Leucinbasis, die von verschiedenen Arten abgeleitet werden, die gemäß dieser Erfindung verwendet werden können, wird in Tabelle 1 gezeigt. Diese Liste soll nicht begrenzend sein. Tabelle 1
    Art Sequenz SEQ ID NO:
    Botulinum Typ A FEFYKLL 7
    Ratte VMAT1 EEKRAIL 8
    Ratte VMAT2 EEKMAIL 9
    Ratte VACht SERDVLL 10
    Ratte δ VDTQVLL 11
    Maus δ AEVQALL 12
    Frosch γ/δ SKDQNLL 13
    Huhn γ/δ SDRQNLI 14
    Schaf δ ADTQVLM 15
    Menschliches CD3 γ SDKQTLL 16
    Menschliches CD4 SQIKRLL 17
    Menschliches δ ADTQALL 18
    S. cerevisae Vam3p NEQSPLL 22
  • VMAT ist vesikulärer Monoamintransporter; VACht ist vesikulärer Acetylcholintransporter und S. cerevisiae Vam3p ist ein Hefehomolog von Synaptobrevin. Kursive Serinreste sind mögliche Orte der Phosphorylierung.
  • Das modifizierte Neurotoxin kann aus irgendeinem Neurotoxin gebildet werden. Das modifizierte Neurotoxin kann auch aus einem Fragment eines Neurotoxins gebildet werden, z. B. einem Botulinumtoxin, bei dem ein Teil der leichten Kette und/oder der schweren Kette entfernt wurde. Vorzugsweise ist das verwendete Neurotoxin ein Clostridien-Neurotoxin. Ein Clostridien-Neurotoxin umfasst ein Polypeptid mit drei Aminosäuresequenzregionen. Die erste Aminosäuresequenzregion kann einen Zielzellen (sprich ein Neuron)-Bindungsanteil beinhalten, der im Wesentlichen vollständig von einem Neurotoxin stammt, das aus einer Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus Berattitoxin; Butyricumtoxin; Tetanustoxin; Botulinum Typ A, B, C1, D, E, F und G. Vorzugsweise stammt die erste Aminosäuresequenzregion von der Carboxylendregion einer Toxin-schweren Kette, HC. Die erste Aminosäuresequenzregion kann auch einen Zielgebungsanteil umfassen, der ein Molekül (wie eine Aminosäuresequenz) umfassen kann, das an einen Rezeptor, wie ein Zelloberflächenprotein oder einen anderen biologischen Bestandteil auf einer Zielzelle, binden kann.
  • Die zweite Aminosäuresequenzregion ist wirksam, um das Polypeptid oder einen Teil davon über eine Endosommembran in das Zytoplasma eines Neurons zu translozieren. Bei einer Ausführungsart umfasst die zweite Aminosäuresequenzregion des Polypeptids ein Aminende einer schweren Kette, HN, stammend von einem Neurotoxin, das aus einer Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus Berattitoxin; Butyricumtoxin; Tetanustoxin; Botulinum Typ A, B, C1, D, E, F und G.
  • Die dritte Aminosäuresequenzregion besitzt therapeutische Aktivität, wenn sie in das Zytoplasma einer Zielzelle, wie einem Neuron, freigesetzt wird. Bei einer Ausführungsart umfasst die dritte Aminosäuresequenzregion des Polypeptids eine Toxin-leichte Kette, L, stammend von einem Neurotoxin, das aus einer Gruppe ausgewählt wird, bestehend aus Berattitoxin; Butyricumtoxin; Tetanustoxin; Botulinum Typ A, B, C1, D, E, F und G.
  • Das Clostridien-Neurotoxin kann ein Hybrid-Neurotoxin sein. Zum Beispiel kann jede der Aminosäuresequenzregionen des Neurotoxins von einem verschiedenen Clostridien-Neurotoxin-Serotyp stammen. Zum Beispiel umfasst in einer Ausführungsart das Polypeptid eine erste Aminosäuresequenzregion, die von dem HC des Tetanustoxins stammt, eine zweite Aminosäuresequenzregion, die von dem HN von Botulinum Typ B stammt und eine dritte Aminosäuresequenzregion, die von der leichten kette von Botulinum Serotyp E stammt. Alle anderen möglichen Kombinationen sind innerhalb des Umfanges der vorliegenden Erfindung mit eingeschlossen.
  • Alternativ können alle drei der Aminosäuresequenzregionen des Clostridien-Neurotoxins von derselben Art und demselben Serotyp stammen. Wenn alle drei Aminosäuresequenzregionen des Neurotoxins von derselben Clostridien-Neurotoxin-Art und demselben Serotyp stammen, wird das Neurotoxin durch den Art- und den Serotypnamen bezeichnet. Zum Beispiel kann ein Neurotoxinpolypeptid seine ersten, zweiten und dritten Aminosäuresequenzregionen von Botulinum Typ E ableiten. In diesem Fall wird das Neurotoxin als Botulinum Typ E bezeichnet.
  • Zusätzlich kann jede der drei Aminosäuresequenzregionen von der natürlich auftretenden Sequenz, von der sie abgeleitet sind, modifiziert werden. Zum Beispiel kann die Aminosäuresequenzregion im Vergleich zu der natürlich auftretenden Sequenz mindestens ein oder mehrere Aminosäuren aufweisen, die zugefügt oder entfernt wurden.
  • Ein Motiv auf Leucinbasis kann mit irgendeinem der oben beschriebenen Neurotoxine fusioniert werden, um ein modifiziertes Neurotoxin mit einer gesteigerten biologischen Persistenz und/oder einer gesteigerten biologischen Aktivität zu bilden. "Fusionierung", wie es in dem Zusammenhang dieser Erfindung verwendet wird, beinhaltet die kovalente Addition an oder die kovalente Insertion zwischen einer primären Struktur eines Neurotoxins. Zum Beispiel kann eine die biologische Persistenz steigernde Komponente und/oder die biologische Aktivität steigernde Komponente zu einem Clostridien-Neurotoxin zugefügt werden, das kein Motiv auf Leucinbasis in seiner primären Struktur aufweist. Bei einer Ausführungsart wird ein Motiv auf Leucinbasis mit einem Hybridneurotoxin fusioniert, worin die dritte Aminosäuresequenz von Botulinum Serotyp A, B, C1, C2, D, E, F oder G stammt. Bei einer anderen Ausführungsart wird das Motiv auf Leucinbasis mit einem Botulinum Typ E fusioniert.
  • Bei einer anderen Ausführungsart wird eine die biologische Persistenz steigernde Komponente und/oder eine biologische Aktivität steigernde Komponente zu einem Neurotoxin durch Veränderung einer klonierten DNA-Sequenz, die das Neurotoxin codiert, zugefügt. Zum Beispiel wird eine DNA-Sequenz, die eine die biologische Persistenz steigernde Komponente gemäß der vorliegenden Erfindung und/oder eine die biologische Aktivität steigernde Komponente gemäß der vorliegenden Erfindung codiert zu einer klonierten DNA-Sequenz zugefügt, die das Neurotoxin codiert, in das die die biologische Persistenz steigernde Komponente und/oder eine die biologische Aktivität steigernde Komponente zugefügt werden soll. Dies kann auf einer Anzahl von Wegen durchgeführt werden, die einem Molekularbiologen mit gewöhnlicher Bewanderung bekannt sind. Zum Beispiel kann ortsgerichtete Mutagenese oder PCR-Klonierung verwendet werden, um die erwünschte Änderung in der das Neurotoxin codierenden DNA-Sequenz hervorzurufen. Die DNA-Sequenz kann dann in einen nativen Wirtsstamm rückgeführt werden. In dem Fall von Botulinumtoxinen wäre der native Wirtsstamm ein Clostridium-Botulinumstamm. Vorzugsweise mangelt es diesem Wirtsstamm an nativem Botulinumtoxingen. Bei einem alternativen Verfahren kann die veränderte DNA in ein heterologes Wirtssystem, wie E. coli oder andere Prokaryoten, Hefe, Insektenzelllinien oder Säugerzelllinien, eingeführt werden. Nachdem die veränderte DNA einmal in ihren Wirt eingeführt wurde, kann das rekombinante Toxin, das die zugeführte die biologische Persistenz steigernde Komponente und/oder eine die biologische Aktivität steigernde Komponente beinhaltet, z. B. durch Standardfermentierungsverfahren hergestellt werden.
  • Ähnlich kann eine die biologische Persistenz steigernde Komponente von einem Neurotoxin entfernt werden. Zum Beispiel kann ortsgerichtete Mutagenese verwendet werden, um die biologische Persistenz steigernde Komponenten, z. B. ein Motiv auf Leucinbasis, zu eliminieren.
  • Standardmolekularbiologische Techniken, die verwendet werden können, um diese und andere genetische Manipulationen zu erreichen, werden in Sambrook et al. (1989) gefunden, welches in seiner Gesamtheit hier durch Verweis mit eingeschlossen ist.
  • Bei einer Ausführungsart ist das Motiv auf Leucinbasis mit der dritten Aminosäuresequenzregion des Neurotoxins fusioniert oder daran gefügt. Bei einer bevorzugten Ausführungsart ist das Motiv auf Leucinbasis mit der Region zu dem Carboxylende der dritten Aminosäuresequenzregion fusioniert oder daran angefügt. Mehr vorzuziehen ist das Motiv auf Leucinbasis mit dem Carboxylende der dritten Region eines Neurotoxins fusioniert oder daran angefügt. Noch mehr vorzuziehen ist das Motiv auf Leucinbasis mit dem Carboxylende der dritten Region von Botulinum Typ E fusioniert oder daran angefügt. Die dritte Aminosäuresequenz, mit der das Motiv auf Leucinbasis fusioniert ist oder woran sie angefügt ist, kann eine Komponente eines Hybrid- oder chimären modifizierten Neurotoxins sein. Zum Beispiel kann das Motiv auf Leucinbasis an die dritte Aminosäuresequenzregion (oder ein Teil davon) eines Botulinumtoxintyps (sprich eines Botulinumtoxins Typ A) fusioniert oder daran angefügt sein, wobei die Motiv-auf-Leucinbasis-dritte Aminosäuresequenzregion selbst mit den ersten und zweiten Aminosäuresequenzregionen von einem anderen Typ (oder Typen) eines Botulinumtoxins (wie eines Botulinumtoxins Typ B und/oder E) fusioniert oder konjugiert wurde.
  • Bei einer anderen Ausführungsart beinhaltet eine strukturelle Modifikation eines Neurotoxins, dass eine zuvor existierende die biologische Persistenz steigernde Komponente und/oder eine die biologische Aktivität steigernde Komponente, z. B. ein Motiv auf Leucinbasis, aufweist, die Deletion oder Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren des Motivs auf Leucinbasis. Zusätzlich beinhaltet ein modifiziertes Neurotoxin eine strukturelle Modifikation, die zu einem Neurotoxin führt, bei dem ein oder mehrere Aminosäuren in dem Motiv auf Leucinbasis entfernt oder substituiert wurden. Die Entfernung oder Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren aus dem zuvor existierenden Motiv auf Leucinbasis ist effektiv, um die biologische Persistenz und/oder eine biologische Aktivität eines modifizierten Neurotoxins zu reduzieren. Zum Beispiel reduziert die Deletion oder Substitution von einer oder mehreren Aminosäuren des Motivs auf Leucinbasis von Botulinum Typ A die biologische Halbwertszeit und/oder die biologische Aktivität des modifizierten Neutoxins.
  • Aminosäuren, die für Aminosäuren, die in einer die biologische Persistenz steigernden Komponente enthalten sind, substituiert werden können, beinhalten Alanin, Asparagin, Cystein, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Phenylalanin, Glycin, Histidin, Isoleucin, Lysin, Leucin, Methionin, Prolin, Glutamin, Arginin, Serin, Threonin, Valin, Tryptophan, Tyrosin und andere natürlich vorkommenden Aminosäuren, wie auch Nichtstandard-Aminosäuren.
  • Bei der vorliegenden Erfindung wurde von der leichten Kette des nativen Botulinums Typ A gezeigt, dass sie sich an differenzierte PC12-Zellmembranen in einem charakteristischen Muster lokalisiert. Von die biologische Persistenz steigernden Komponenten wird gezeigt, dass sie wesentlich zu dieser Lokalisierung beitragen.
  • Die Daten der vorliegenden Erfindung zeigen, dass, wenn die Botulinumtoxin Typ A-leichte Kette gekürzt oder wenn das Motiv auf Leucinbasis mutiert wird, die leichte Kette im Wesentlichen ihre Fähigkeit, an die Membran in ihrem charakteristischen Muster zu lokalisieren, verliert. Man glaubt, dass die Lokalisierung an die zelluläre Membran ein Schlüsselfaktor bei der Bestimmung der biologischen Persistenz und/oder der biologischen Aktivität eines Botulinumtoxins ist. Dies kommt daher, da die Lokalisierung an eine Zellmembran das lokalisierte Protein vor interzellulärem Proteinabbau schützen kann.
  • Die 1 und 2 zeigen, dass die Deletion des Motivs auf Leucinbasis von der leichten Kette von Botulinum Typ A die Membranlokalisierung der Typ A-leichten Kette ändern kann. 1 zeigt die Lokalisierung von GFP-leichter Kette A-Fusionsprotein in differenzierten PC12-Zellen. Die GFP-Fusionsproteine werden in differenzierten PC12-Zellen unter Verwendung von Verfahren, die denjenigen, die auf dem Fachgebiet bewandert sind, gut bekannt sind, hergestellt und visualisiert, z. B. wie in Galli et al. (1998) Mol. Biol. Cell 9:1437–1448 beschrieben wird, hier in seiner Gesamtheit durch Verweis mit eingeschlossen; auch wie z. B. in Martinez-Arca et al. (2000) J. Cell Biol. 149:889–899 beschrieben wird, auch hier in seiner Gesamtheit durch Verweis mit eingeschlossen. Die Lokalisierung einer GFP-gekürzten leichten Kette A wird in 2 gezeigt. Beim Vergleich der 1 und 2 kann gesehen werden, dass das Muster der Lokalisierung durch die Deletion des N-Endes und C-Endes, umfassend das Motiv auf Leucinbasis, vollständig verändert wird. 3 zeigt die Aminosäuresequenz der Botulinum Typ A-leichten Kette. Die unterstrichenen Aminosäuresequenzen weisen auf die Aminosäuren hin, die in der gekürzten Mutante entfernt wurden. Das Motiv auf Leucinbasis wird durch die Klammer mit Sternchen angezeigt.
  • Weitere Studien wurden bei der vorliegenden Erfindung durchgeführt, um den Effekt von spezifischen Aminosäuresubstitutionen innerhalb des Motivs auf Leucinbasis zu analysieren. Zum Beispiel wurden bei einer Studie beide Leucinreste, die in dem Motiv auf Leucinbasis enthalten sind, durch Alaninreste substituiert. 4 zeigt das Fluoreszenzbild von differenzierten PC12-Zellen, die mit DNA transfiziert wurden, die diese Dileucin-zu-Dialaninsubstituierte GFP-Botulinum A-leichte Kette codiert. Wie gesehen werden kann, ändert die Substitution von Alanin für Leucin an den Positionen 427 und 428 in der Botulinum Typ A-leichten Kette wesentlich die Lokalisierungscharakterisierung der leichten Kette.
  • Es liegt innerhalb des Umfanges dieser Erfindung, dass ein Motiv auf Leucinbasis verwendet werden kann, um auch die schwere Kette zu schützen. Ein zufälliger Knäuelgürtel erstreckt sich von der Botulinum Typ A-Translokationsdomäne und umgibt die leichte Kette. Es ist möglich, dass dieser Gürtel die zwei Untereinheiten innerhalb der Zelle in Nähe zueinander hält, während die leichte Kette an die Zellmembran lokalisiert wird. Die Struktur von nativem Botulinumtoxin Typ A wird in 6 gezeigt.
  • Zusätzlich zeigen die Daten der vorliegenden Erfindung, dass das Motiv auf Leucinbasis wertvoll bei der Lokalisierung des Botulinum A-Toxins in großer Nähe zu dem SNAP-25-Substrat innerhalb der Zelle wertvoll sein kann. Dies kann bedeuten, dass das Motiv auf Leucinbasis nicht nur für die Bestimmung der Halbwertszeit des Toxins, sondern auch für die Bestimmung der Aktivität des Toxins wichtig sein kann. Das bedeutet, dass das Toxin eine größere Aktivität aufweisen wird, wenn es in großer Nähe zu dem SNAP-25-Substrat innerhalb der Zelle gehalten wird. 5 zeigt die Lokalisierung von SNAP-25 in horizontalen konfokalen Schnitten von differenzierten PC12-Zellen (von Martinez-Arca et al. (2000) J. Cell Biol. 149:889–899). Die Ähnlichkeit in dem Muster der Lokalisierung kann gesehen werden, wenn man die Lokalisierung von Botulinum Typ A-leichter Kette, wie sie in 1 gesehen wird, mit der Lokalisierung von SNAP-25, wie sie in 5 gesehen wird, vergleicht.
  • Die Daten der vorliegenden Erfindung zeigen deutlich, dass die Verkürzung der leichten Kette, wodurch das Motiv auf Leucinbasis entfernt wird, oder Aminosäuresubstitution innerhalb des Motivs auf Leucinbasis die Membranlokalisierung der Botulinum Typ A-leichten Kette in Nervenzellen wesentlich ändert. Sowohl bei der Verkürzung wie auch bei der Substitution kann ein Prozentsatz der veränderten leichten Kette zu der Zellmembran in einem Muster lokalisieren, das dem der nativen Typ A-leichten Kette unähnlich ist (siehe 1, 2 und 4). Diese Daten unterstützen die Gegenwart von die biologische Persistenz steigernden Komponenten, die anders sind, als ein Motiv auf Leucinbasis, wie Typrosinmotive und Aminosäurederivate.
  • In einem wesentlichen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung eines Zustandes unter Verwendung eines modifizierten Neurotoxins bereitgestellt. Die Zustände können z. B. Skelettmuskelzustände, Zustände der glatten Muskulatur, Schmerz und Drüsenzustände beinhalten. Das modifizierte Neurotoxin kann auch für Kosmetik verwendet werden, z. B. um Brauenfurchen zu behandeln.
  • Die neuromuskulären Störungen und Zustände, die mit einem modifizierten Neurotoxin behandelt werden können, beinhalten z. B. spasmodische Dysphonie, laryngeale Dystonie, oromandibuläre und linguale Dystonie, zervikale Dystonie, fokale Handdystonie, Blepharospasmus, Strabismus, hemifazialen Spasmus, Augenlidstörungen, spastischen Torticollis, zerebrale Lähmung, fokale Spastik und andere Stimmstörungen, spastische Kolitis, neurogene Blase, Anismus, Extremitätenspastik, Tics, Tremorformen, Bruxismus, Analfissur, Achalasie, Dysphagie und andere Muskeltonusstörungen und andere Störungen, die durch unwillkürliche Bewegungen von Muskelgruppen charakterisiert werden, können unter Verwendung der vorliegenden Verfahren der Verabreichung behandelt werden. Andere Beispiele für Zustände, die unter Verwendung der vorliegenden Verfahren und Zusammensetzungen behandelt werden können, sind Lakrimation, Hyperhydrose, exzessive Salivation und exzessive gastrointestinale Sekretionen, wie auch andere sekretorische Störungen. Zusätzlich kann die vorliegende Erfindung verwendet werden, um dermatologische Zustände zu behandeln, z. B. Reduktion von Brauenfurchen, Reduktion von Hautfalten. Die vorliegende Erfindung kann auch bei der Behandlung von Sportverletzungen verwendet werden.
  • Borodic, US-Patent 5,053,005 , offenbart Verfahren zur Behandlung von juveniler Wirbelsäulenverkrümmung, sprich Scoliose, unter Verwendung von Botulinum Typ A. Die Offenbarung von Borodic ist in ihrer Gesamtheit hier durch Verweis mit eingeschlossen. Bei einer Ausführungsart kann unter Verwendung von im Wesentlichen ähnlichen Verfahren, wie durch Borodic offenbart wird, ein modifiziertes Neurotoxin an einen Säuger, vorzugsweise einen Menschen, verabreicht werden, um Wirbelsäulenverkrümmung zu behandeln. Bei einer bevorzugten Ausführungsart wird ein modifiziertes Neurotoxin, das Botulinum Typ E, fusioniert mit einem Motiv auf Leucinbasis, umfasst, verabreicht. Noch mehr vorzuziehen wird ein modifiziertes Neurotoxin, das ein Botulinum Typ A–E mit einem Motiv auf Leucinbasis, fusioniert an das Carboxylende seiner leichten Kette umfasst, an den Säuger, vorzugsweise einen Menschen, verabreicht, um Wirbelsäulenverkrümmung zu behandeln.
  • Zusätzlich kann das modifizierte Neurotoxin verabreicht werden, um andere neuromuskuläre Störungen unter Verwendung von gut bekannten Techniken, die gewöhnlich mit Botulinum Typ A durchgeführt werden, verabreicht werden. Zum Beispiel kann die vorliegende Erfindung verwendet werden, um Schmerz, z. B. Kopfschmerz, Schmerz durch Muskelspasmus und verschiedene Formen von entzündlichem Schmerz zu behandeln. Zum Beispiel offenbaren Aoki, US-Patent Nr. 5,721,215 , und Aoki, US-Patent Nr. 6,113,915 , Verfahren der Verwendung von Botulinumtoxin Typ A zur Schmerzbehandlung. Die Offenbarung dieser zwei Patente wird hier in ihrer Gesamtheit durch Verweis mit eingeschlossen.
  • Autonome Nervensystemstörungen können auch mit einem modifizierten Neurotoxin behandelt werden. Zum Beispiel ist eine glanduläre Fehlfunktion eine autonome Nervensystemstörung. Glanduläre Fehlfunktion beinhaltet exzessives Schwitzen und exzessive Salivation. Respiratorische Fehlfunktion ist ein anderes Beispiel für eine autonome Nervensystemstörung. Respiratorische Fehlfunktion beinhaltet chronisch obstruktive pulmonale Erkrankung und Asthma. Sanders et al. offenbaren Verfahren zur Behandlung des autonomen Nervensystems; z. B. Behandlung von autonomen Nervensystemstörungen, wie exzessives Schwitzen, exzessive Salivation, Asthma, etc. unter Verwendung von natürlich vorkommenden Botulinumtoxinen. Die Offenbarung von Sander et al. ist in ihrer Gesamtheit hier durch Verweis mit eingeschlossen. Bei einer Ausführungsart können im Wesentlichen ähnliche Verfahren zu denen von Sanders et al. verwendet werden, aber es wird ein modifiziertes Neurotoxin verwendet, um autonome Nervensystemstörungen, wie diejenigen die oben diskutiert werden, zu behandeln. Zum Beispiel kann ein modifiziertes Neurotoxin lokal an die Nasenhöhle des Säugers in einer ausreichenden Menge, um die cholinergen Neurone des autonomen Nervensystems, die die muköse Sekretion in der Nasenhöhle kontrollieren, zu degenerieren, angewendet werden.
  • Schmerz, der durch ein modifiziertes Neurotoxin behandelt werden kann, beinhaltet Schmerz, der durch Muskelspannung oder Spasmus hervorgerufen wird, oder Schmerz, der nicht mit Muskelspasmus assoziiert ist. Zum Beispiel offenbart Binder in US-Patent Nr. 5,714,468 , dass Kopfschmerzen, die durch vaskuläre Störungen, muskuläre Spannung, Neuralgie und Neuropathie hervorgerufen werden, mit einem natürlich auftretenden Botulinumtoxin, z. B. Botulinum Typ A, behandelt werden können. Die Offenbarungen von Binder werden hier in ihrer Gesamtheit durch Verweis mit eingeschlossen. Bei einer Ausführungsart werden im Wesentlichen ähnliche Verfahren zu denen von Binder verwendet, aber es wird ein modifiziertes Neurotoxin verwendet, um Kopfschmerzen zu behandeln, insbesondere diejenigen, die durch vaskuläre Störungen, muskuläre Spannung, Neuralgie und Neuropathie hervorgerufen werden. Schmerz, der durch Muskelspasmus hervorgerufen wird, kann auch durch eine Verabreichung eines modifizierten Neurotoxins behandelt werden. Zum Beispiel kann ein Botulinum Typ E, fusioniert mit einem Motiv auf Leucinbasis, vorzugsweise an dem Carboxylende der Botulinum Typ E-leichten Kette, intramuskulär an den Ort des Schmerzes/Spasmus verabreicht werden, um Schmerz zu lindern.
  • Darüber hinaus kann ein modifiziertes Neurotoxin einem Säuger verabreicht werden, um Schmerz zu behandeln, der nicht mit einer muskulären Störung, wie Spasmus, assoziiert ist. Bei einer weiten Ausführungsart beinhalten die Verfahren der vorliegenden Erfindung, um nicht mit Spasmus in Zusammenhang stehenden Schmerz zu behandeln, die zentrale Verabreichung oder periphere Verabreichung des modifizierten Neurotoxins.
  • Zum Beispiel offenbart Foster et al. in US-Patent 5,989,545 , dass ein Botulinumtoxin, das mit einem zielgebenden Anteil konjugiert ist, zentral (intrathecal) verabreicht werden kann, um Schmerz zu lindern. Die Offenbarungen von Foster et al. sind hier in ihrer Gesamtheit durch Verweis mit eingeschlossen. Bei einer Ausführungsart können im Wesentlichen ähnliche Verfahren zu denjenigen von Foster et al. verwendet werden, aber es wird das modifizierte Neurotoxin gemäß dieser Erfindung verwendet, um Schmerz zu behandeln. Der Schmerz, der behandelt werden soll, kann ein akuter Schmerz oder vorzugsweise ein chronischer Schmerz sein.
  • Ein akuter oder chronischer Schmerz, der nicht mit einem Muskelspasmus assoziiert ist, kann durch eine lokale, periphere Verabreichung des modifizierten Neurotoxins an einen tatsächlichen oder wahrgenommenen Schmerzort auf dem Säuger gemildert werden. Bei einer Ausführungsform wird das modifizierte Neurotoxin subkutan an oder nahe dem Schmerzort, z. B. an oder nahe einem Schnitt, verabreicht. Bei einer anderen Ausführungsart wird das modifizierte Neurotoxin intramuskulär an oder nahe dem Schmerzort, z. B. an oder nahe einem Ort eines blauen Fleckes, verabreicht. Bei einer anderen Ausführungsart wird das modifizierte Neurotoxin direkt in ein Gelenk eines Säugers zur Behandlung oder Linderung von Schmerz, der durch arthritische Zustände hervorgerufen wird, injiziert. Es liegen auch regelmäßig wiederholte Injektion oder Infusion des modifizierten Neurotoxins an einen peripheren Schmerzort innerhalb des Umfanges der vorliegenden Erfindung. Durch die lang andauernden therapeutischen Effekte der vorliegenden Erfindung kann jedoch die regelmäßige Injektion oder Infusion des Neutoxins nicht notwendig sein. Zum Beispiel kann die Ausübung der vorliegenden Erfindung einen analgetischen Effekt von zwei Monaten oder länger, z. B. 27 Monaten, pro Injektion bei Menschen bereitstellen.
  • Ohne dass man die Erfindung durch irgendeinen Mechanismus oder eine Theorie der Anwendung begrenzen will, glaubt man, dass, wenn das modifizierte Neurotoxin lokal an einen peripheren Ort verabreicht wird, es die Freisetzung von Neurosubstanzen, z. B. Substanz P, aus der peripheren primären sensorischen Endigung durch Inhibition von SNARE-abhängiger Exozytose inhibiert. Da die Freisetzung von Substanz P durch die periphere primäre sensorische Endigung den Schmerzübertragungsprozess hervorrufen oder zumindest amplifizieren kann, wird die Inhibition ihrer Freisetzung an der peripheren primären sensorischen Endigung die Übertragung von Schmerzsignalen zur Erreichung des Gehirnes dämpfen.
  • Zusätzlich zu dem Aufweisen von pharmakologischen Wirkungen an dem peripheren Ort kann das modifizierte Neurotoxin der vorliegenden Erfindung auch inhibitorische Effekte in dem zentralen Nervensystem, bei direkter intrathecaler Verabreichung, wie in US-Patent 6,113,915 dargelegt wird, oder bei peripherer Verabreichung, wo vermutlich das modifizierte Toxin durch retrograden Transport über eine primäre sensorische Afferenz wirkt, aufweisen. Diese Hypothese des retrograden axonalen Transports wird durch veröffentlichte Daten unterstützt, die zeigen, dass Botulinum Typ A retrograd zu dem Hinterhorn transportiert werden kann, wenn das Neurotoxin peripher injiziert wird. So zeigten Arbeiten von Weigand et al., Nauny-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1976; 292, 161–165, und Habermann, Nauny-Schmiedeberg's Arch. Pharmacol. 1974; 281, 47–56, dass Botulinumtoxin in der Lage ist, durch retrograden Transport zu dem Spinalbereich zu aszendieren. Als solches kann von einem modifizierten Neurotoxin, z. B. Botulinum Typ A, mit einer oder mehreren Aminosäuren von dem Motiv auf Leucinbasis mutiert, injiziert an einem peripheren Ort, z. B. intramuskulär, erwartet werden, dass es retrograd von der peripheren primären sensorischen Endigung zu einer zentralen Region transportiert wird.
  • Die Menge des modifizierten Neurotoxins, das verabreicht wird, kann gemäß der besonderen Störung, die behandelt wird, ihrer Schwere und anderen verschiedenen Patientenvariablen, einschließlich Größe, Gewicht, Alter und Ansprechen auf die Therapie, breit variieren. Im Allgemeinen wird die Dosis von modifiziertem Neurotoxin, das verabreicht werden soll, mit dem Alter, der vorliegenden Störung und dem Gewicht des Säugers, vorzugsweise eines Menschen, der behandelt werden soll, variieren. Die Wirksamkeit des modifizierten Neurotoxins wird auch in Betracht gezogen.
  • Unter der Annahme einer Wirksamkeit (für ein Botulinumtoxin Typ A), die im Wesentlichen äquivalent zu LD50 = 2.730 U bei einem menschlichen Patienten ist, und dass eine durchschnittliche Person 75 kg wiegt, würde eine letale Dosis (für ein Botulinumtoxin Typ A) ungefähr 36 U/kg eines modifizierten Neurotoxins betragen. Daher wäre es angebracht, wenn ein modifiziertes Neurotoxin mit solch einer LD50 verabreicht wird, weniger als 36 U/kg des modifizierten Neurotoxins bei menschlichen Individuen zu verabreichen. Vorzugsweise wird ungefähr 0,01 U/kg bis 30 U/kg des modifizierten Neurotoxins verabreicht. Mehr vorzuziehen wird ungefähr 1 U/kg bis ungefähr 15 U/kg des modifizierten Neurotoxins verabreicht. Noch mehr vorzuziehen wird ungefähr 5 U/kg bis ungefähr 10 U/kg des modifizierten Neurotoxins verabreicht. Im Allgemeinen wird das modifizierte Neurotoxin als eine Zusammensetzung in einer Dosierung verabreicht, die proportional äquivalent zu ungefähr 2,5 cc/100 U ist. Diejenigen mit normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet werden wissen oder einfach feststellen, wie diese Dosierungen für Neurotoxin mit größerer oder geringerer Wirksamkeit einzustellen sind. Es ist bekannt, dass Botulinumtoxin Typ B in einem Spiegel, der ungefähr 50 Mal höher liegt als derjenige, der für ein Botulinumtoxin Typ A verwendet wird, für einen ähnlichen therapeutischen Effekt verabreicht werden kann. So können die Einheitsmengen, die oben dargelegt werden, um einen Faktor von ungefähr 50 für ein Botulinumtoxin Typ B multipliziert werden.
  • Obwohl Beispiele von Verabreichungswegen und Dosierungen bereitgestellt werden, werden der geeignete Verabreichungsweg und die Dosierung im Allgemeinen auf einer Fall-zu-Fall-Basis durch den behandelnden Arzt bestimmt. Solche Bestimmungen sind für jemanden mit normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet Routine (siehe z. B. Harrison's Principles of Internal Medicine (1998), herausgegeben von Anthony Fauci et al., 14. Auflage, veröffentlicht durch McGraw Hill). Zum Beispiel können der Weg und die Dosierung für die Verabreichung eines modifizierten Neurotoxins gemäß der vorliegenden offenbarten Erfindung, basierend auf Kriterien, wie den Löslichkeitscharakteristiken des modifizierten Neurotoxins, das ausgewählt wurde, wie auch den Störungsarten, die behandelt werden, ausgewählt werden.
  • Das modifizierte Neurotoxin kann durch chemische Bindung des Motivs auf Leucinbasis an ein Neurotoxin unter Verwendung von konventionellen chemischen Verfahren, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, hergestellt werden. Zum Beispiel kann Botulinum Typ E durch Etablierung und Züchten von Kulturen von Clostridium botulinum in einem Fermentor und dann Ernte und Reinigung der fermentierten Mischung in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren erhalten werden.
  • Das modifizierte Neurotoxin kann auch durch rekombinante Techniken hergestellt werden. Rekombinante Techniken sind für die Herstellung eines Neurotoxins mit Aminosäuresequenzregionen von verschiedenen Clostridienarten oder mit modifizierten Aminosäuresequenzregionen vorzuziehen. Die rekombinante Technik ist auch bei der Herstellung von Botulinum Typ A mit dem Motiv auf Leucinbasis, das durch Deletion modifiziert wird, zu bevorzugen. Die Technik beinhaltet die Schritte des Erhaltens von genetischem Material aus natürlichen Quellen oder synthetischen Quellen, die Codes für einen zellulären Bindungsanteil, eine Aminosäuresequenz, die effektiv ist, um das Neurotoxin oder einen Teil davon zu translozieren, und eine Aminosäuresequenz mit therapeutischer Aktivität, wenn sie in ein Zytoplasma einer Zielzelle, vorzugsweise ein Neuron, freigesetzt wird, aufweisen. Bei einer bevorzugten Ausführungsart weisen die genetischen Materialien Codes für die biologische Persistenz steigernde Komponente, vorzugsweise das Motiv auf Leucinbasis, die HC, die HN und die leichte Kette der Clostridien-Neurotoxine und Fragmente davon auf. Die genetischen Konstrukte werden für die Amplifikation durch zuerst Fusionierung der genetischen Konstrukte mit einem Klonierungsvektor, wie Phagen oder Plasmide, eingeschlossen. Dann werden die Klonierungsvektoren in einen Wirt, z. B. Clostridium sp., E. coli oder andere Prokaryoten, Hefe, Insektenzelllinie oder Säugerzelllinien, inseriert. Nach den Expressionen der rekombinanten Gene in Wirtszellen, können die resultierenden Proteine unter Verwendung von konventionellen Techniken isoliert werden.
  • Es gibt viele Vorteile, um diese modifizierten Neurotoxine rekombinant herzustellen. Zum Beispiel muss, um ein modifiziertes Neurotoxin zu bilden, ein Modifizierungsfragment oder ein Bestandteil an Neurotoxin angebracht oder darin inseriert werden. Die Herstellung von Neurotoxin aus anaeroben Clostridiumkulturen ist ein umständlicher und zeitaufwändiger Prozess, der ein Reinigungsprotokoll mit vielen Schritten beinhaltet, das verschiedene Proteinpräzipitationsschritte und entweder lang dauernde und wiederholte Kristallisierung des Toxins oder verschiedene Stadien der Säulenchromatographie involviert. Signifikanterweise diktiert die hohe Toxizität des Produktes, dass das Verfahren unter striktem Containment (BL-3) durchgeführt werden muss. Während des Fermentationsprozesses werden die gefalteten Einzelkettenneurotoxine durch endogene Clostridienproteasen durch ein Verfahren, das als Schneiden ("nicking") bezeichnet wird, aktiviert, um eine Dikette zu erzeugen. Manchmal involviert der Prozess des Schneidens die Entfernung von ungefähr 10 Aminosäureresten aus der Einzelkette, um die Dikettenform zu erzeugen, worin die zwei Ketten über die Intraketten-Disulfidbindung kovalent verbunden bleiben.
  • Das geschnittene Neurotoxin ist viel aktiver als die ungeschnittene Form. Die Menge und die genaue Lokalisierung des Schneidens variiert mit den Serotypen der Bakterien, die das Toxin herstellen. Die Unterschiede bei der Einzelketten-Neurotoxinaktivierung und daher der Ertrag an geschnittenem Toxin beruhen auf Variationen in dem Serotyp und den Mengen der proteolytischen Aktivität, die von einem gegebenen Stamm produziert wird. Zum Beispiel wird mehr als 99% von Clostridium-Botulinum Serotyp A-Einzelketten-Neurotoxin durch den Hall A-Clostridium-Botulinumstamm aktiviert, während Serotyp B- und E-Stämme Toxine mit niedrigeren Aktivierungsmengen produzieren (0 bis 75%, abhängig von der Fermentationszeit). Daher spielt die hohe Toxizität des reifen Neurotoxins eine wichtige Rolle bei der kommerziellen Herstellung von Neurotoxinen als therapeutische Wirkstoffe.
  • Der Aktivierungsgrad von gentechnisch hergestellten Clostridientoxinen ist daher eine wichtige Überlegung für die Herstellung dieser Materialien. Es wäre ein wichtiger Vorteil, wenn Neurotoxine, wie Botulinumtoxin und Tetanustoxin, rekombinant in einem hohen Ertrag in schnell wachsenden Bakterien (wie heterologe E. coli-Zellen) als relativ untoxische Einzelketten (oder Einzelketten mit reduzierter toxischer Aktivität), die sicher, einfach zu isolieren und einfach zu der vollständig aktiven Form zu konvertieren sind, exprimiert werden könnten.
  • Mit der Sicherheit als eine Hauptbesorgnis konzentrierten sich vorangehende Arbeiten auf die Expression in E. coli und die Reinigung von einzelnen H- und leichten Ketten von Tetanus- und Botulinumtoxinen; diese isolierten Ketten sind in sich selbst nicht-toxisch; siehe Li et al., Biochemistry 33:7014–7020 (1994); Zhou et al., Biochemistry 34:15175–15181 (1995). Nach der getrennten Herstellung dieser Peptidketten und unter strikt kontrollierten Bedingungen können die H- und leichten Ketten durch oxidative Disulfidbindung kombiniert werden, um die neuroparalytische Diketten zu bilden.
  • Beispiele
  • Die folgenden, nicht-begrenzenden Beispiele versorgen diejenigen mit normaler Bewanderung auf dem Fachgebiet mit spezifischen bevorzugten Verfahren, um nicht mit Spasmus in Zusammenhang stehendem Schmerz innerhalb des Umfanges der vorliegenden Erfindung zu behandeln, und sollen den Umfang der Erfindung nicht begrenzen.
  • Beispiel 1
  • Behandlung von Schmerz, der mit Muskelstörung assoziiert ist
  • Eine unglückliche 36 Jahre alte Frau hat eine 15-jährige Anamnese mit temporomandibulärer Gelenkerkrankung und chronischem Schmerz entlang dem Masseter- und Temporalis-Muskel. 15 Jahre vor der Evaluierung bemerkte sie eine zunehmende Immobilität des Kiefers, assoziiert mit Schmerz bei Kieferöffnung und -schließung und Empfindlichkeit entlang jeder Seite ihres Gesichtes. Ursprünglich dachte man, dass die linke Seite schlimmer sei als die rechte. Sie erhält die Diagnose einer temporomandibulären Gelenk(TMJ)-Dysfunktion mit Subluxation des Gelenkes und wird mit chirurgischer orthoplastischer Meniskusektomie und Kondylenresektion behandelt.
  • Nach den chirurgischen Eingriffen hat sie weiterhin Schwierigkeiten, ihren Kiefer zu öffnen und zu schließen und aus diesem Grund wird einige Jahre später ein chirurgischer Eingriff durchgeführt, um die prosthetischen Gelenke auf beiden Seiten zu ersetzen. Nach dem chirurgischen Eingriff schließen sich progressive Spasmen und Deviation des Kiefers an. Eine weitere chirurgische Revision wird nach der ursprünglichen Operation durchgeführt, um die prosthetische Gelenklockerung zu korrigieren. Nach diesen chirurgischen Eingriffen weist der Kiefer weiterhin beträchtlichen Schmerz und Immobilität auf. Das TMJ verbleibt empfindlich wie auch der Muskel selbst. Es gibt empfindliche Punkte über dem temporomandibulären Gelenk wie auch einen gesteigerten Tonus in dem gesamten Muskel. Sie erhält die Diagnose eines post-chirurgischen myofaszialen Schmerzsyndroms und wird mit dem modifizierten Neurotoxin in die Masseter- und Temporalis-Muskeln injiziert; das modifizierte Neurotoxin ist Botulinum Typ E, das ein Motiv auf Leucinbasis umfasst. Die spezielle Dosis wie auch die Frequenz der Verabreichungen hängt von einer Vielzahl von Faktoren innerhalb der Bewanderung des behandelnden Arztes ab.
  • Einige Tage nach den Injektionen bemerkte sie eine wesentliche Besserung in ihrem Schmerz und berichtet, dass sich der Kiefer lockerer anfühlt. Dies bessert sich allmählich über einen Zeitraum von 2 bis 3 Wochen, indem sie eine gesteigerte Fähigkeit, den Kiefer zu öffnen, und einen abnehmenden Schmerz bemerkt. Die Patientin erklärt, dass der Schmerz besser ist als zu irgendeiner Zeit in den letzten 4 Jahren. Der verbesserte Zustand hält für bis zu 27 Monate nach der ursprünglichen Injektion des modifizierten Neurotoxins an.
  • Beispiel 2
  • Behandlung von Schmerz infolge von Rückenmarksverletzung
  • Ein Patient, Alter 39, der Schmerz infolge einer Rückenmarksverletzung erlebt, wird durch intrathecale Verabreichung, z. B. durch spinales Anstechen oder durch Katheterisierung (für Infusion) des Rückenmarks, mit dem modifizierten Neurotoxin behandelt; das modifizierte Neurotoxin ist Botulinum Typ E, umfassend ein Motiv auf Leucinbasis. Die spezifische Toxindosis und der Injektionsort, wie auch die Frequenz der Toxinverabreichungen, hängen von einer Vielzahl von Faktoren ab, die innerhalb des Könnens des behandelnden Arztes liegen, wie hier zuvor dargelegt wurde. Innerhalb von ungefähr 1 bis ungefähr 7 Tagen nach der Verabreichung des modifizierten Neurotoxins ist der Schmerz des Patienten wesentlich reduziert. Die Schmerzlinderung hält für bis zu 27 Monate an.
  • Beispiel 3
  • Periphere Verabreichung eines modifizierten Neurotoxins, um "Schulter-Hand-Syndrom" zu behandeln
  • Schmerz in der Schulter, dem Arm und der Hand kann sich mit muskulärer Dystrophie, Osteoporose und Fixierung von Gelenken entwickeln. Während das nach koronarer Insuffizienz am häufigsten ist, kann dieses Syndrom mit zervikaler Osteoarthritis oder lokalisierter Schultererkrankung oder nach einer längeren Erkrankung, die es erforderlich macht, dass der Patient im Bett bleibt, auftreten.
  • Eine 46 Jahre alte Frau stellt sich mit einem Schmerz vom Schulter-Hand-Syndrom-Typ vor. Der Schmerz ist hauptsächlich an der Deltoid-Region lokalisiert. Die Patientin wird mit einer Bolusinjektion eines modifizierten Neurotoxins subkutan in die Schulter behandelt; vorzugsweise ist das modifizierte Neurotoxin Botulinum Typ E, umfassend ein Motiv auf Leucinbasis. Das modifizierte Neurotoxin kann auch z. B. modifiziertes Botulinum Typ A, B, C1, C2, D, E, F oder G sein, das ein Motiv auf Leucinbasis umfasst. Die spezielle Dosis, wie auch die Frequenz der Verabreichungen hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, die innerhalb des Könnens des behandelnden Arztes liegen, wie zuvor dargelegt wurde. Innerhalb von 1 bis 7 Tagen nach der Verabreichung des modifizierten Neurotoxins ist der Schmerz der Patientin wesentlich gelindert. Die Dauer der Schmerzlinderung liegt bei ungefähr 7 bis ungefähr 27 Monaten.
  • Beispiel 4
  • Periphere Verabreichung eines modifizierten Neurotoxins, um postherpetische Neuralgie zu behandeln
  • Postherpetische Neuralgie ist eines der hartnäckigsten chronischen Schmerzprobleme. Patienten, die an diesem qualvoll schmerzhaften Prozess leiden, sind oft älter, weisen schwächende Erkrankung auf und sind für größere interventionelle Eingriffe nicht geeignet. Die Diagnose wird einfach durch das Auftreten der abgeheilten Läsionen von Herpes und durch die Anamnese des Patienten gestellt. Der Schmerz ist intensiv und emotional belastend. Postherpetische Neuralgie kann überall auftreten, aber ist am häufigsten an dem Thorax.
  • Ein 76 Jahre alter Mann stellt sich mit einem Schmerz vom postherpetischen Typ vor. Der Schmerz ist in der abdominellen Region lokalisiert. Der Patient wird mit einer Bolusinjektion eines modifizierten Neurotoxins intradermal in das Abdomen behandelt; das modifizierte Neurotoxin ist z. B. Botulinum Typ A, B, C1, C2, D, E, F und/oder G. Das modifizierte Neurotoxin umfasst ein Motiv auf Leucinbasis und/oder zusätzliche Motiv auf Tyrosinbasis. Die spezielle Dosis wie auch die Frequenz der Verabreichung hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, die innerhalb des Könnens des behandelnden Arztes liegen, wie zuvor dargelegt wurde. Innerhalb von 1 bis 7 Tagen nach der Verabreichung des modifizierten Neurotoxins wird der Schmerz des Patienten wesentlich gelindert. Die Dauer der Schmerzlinderung liegt bei ungefähr 7 bis 27 Monaten.
  • Beispiel 5
  • Periphere Verabreichung eines modifizierten Neurotoxins, um nasopharyngealen Tumorschmerz zu behandeln
  • Diese Tumoren, am häufigsten squamöszellige Karzinome, liegen normalerweise in der Fossa von Rosenmüller und können die Basis des Schädels befallen. Der Schmerz in dem Gesicht ist häufig. Er ist konstant, dumpf-schmerzhaft von Natur.
  • Ein 35 Jahre alter Mann stellt sich mit einem Schmerz vom nasopharyngealen Tumortyp vor. Der Schmerz wird an der unteren linken Wange gefunden. Der Patient wird durch eine Bolusinjektion eines modifizierten Neurotoxins intramuskulär in die Wange behandelt, vorzugsweise ist das modifizierte Neurotoxin Botulinum Typ A, B, C1, C2, D, E, F oder G, umfassend zusätzliche, die biologische Persistenz steigernde Aminosäurederivate, z. B. Tyrosinphosphorylierungen. Die spezielle Dosis wie auch die Frequenz der Verabreichungen hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, die innerhalb des Könnens des behandelnden Arztes liegen. Innerhalb von 1 bis 7 Tagen nach der Verabreichung von modifiziertem Neurotoxin ist der Schmerz des Patienten wesentlich gelindert. Die Dauer der Schmelzlinderung liegt bei ungefähr 7 bis ungefähr 27 Monaten.
  • Beispiel 6
  • Periphere Verabreichung eines modifizierten Neurotoxins, um entzündlichen Schmerz zu behandeln
  • Ein Patient, Alter 45, stellt sich mit einem entzündlichen Schmerz in der Brustregion vor. Der Patient wird durch eine Bolusinjektion eines modifizierten Neurotoxins intramuskulär in die Brust behandelt, vorzugsweise ist das modifizierte Neurotoxin Botulinum Typ A, B, C1, C2, D, E, F oder G, umfassend zusätzliche Motive auf Tyrosinbasis. Die spezielle Dosis wie auch die Frequenz der Verabreichungen hängt von einer Vielzahl von Faktoren ab, die innerhalb des Könnens des behandelnden Arztes liegen, wie zuvor dargelegt wurde. Innerhalb von 1 bis 7 Tagen nach der Verabreichung des modifizierten Neurotoxins ist der Schmerz des Patienten wesentlich gelindert. Die Dauer der Schmerzlinderung liegt bei ungefähr 7 bis ungefähr 27 Monaten.
  • Beispiel 7
  • Behandlung von exzessivem Schwitzen
  • Ein Mann, Alter 65, mit exzessivem einseitigem Schwitzen wird durch Verabreichung eines modifizierten Neurotoxins behandelt. Die Dosis und Frequenz der Verabreichung hängt von dem Grad des erwünschten Effektes ab. Vorzugsweise ist das modifizierte Neurotoxin Botulinum Typ A, B, C1, C2, D, E, F und/oder G. Die modifizierten Neurotoxine umfassen ein Motiv auf Leucinbasis. Die Verabreichung erfolgt an den Drüsennerv-Plexus, das Ganglion, das Rückenmark oder das zentrale Nervensystem. Der spezifische Ort der Verabreichung wird durch die Kenntnisse des Arztes in Anatomie und Physiologie der Zieldrüsen und sekretorischen Zellen bestimmt. Zusätzlich kann die entsprechende Rückenmarkshöhe oder der Gehirnbereich mit dem Toxin injiziert werden. Das Nachlassen des exzessiven Schwitzens nach der Behandlung mit dem modifizierten Neurotoxin beträgt bis zu 27 Monate.
  • Beispiel 8
  • Post-chirurgische Behandlungen
  • Eine Frau, Alter 22, stellt sich mit einer gerissenen Schultersehne vor und unterzieht sich einer orthopädischen Operation, um die Sehne zu reparieren. Nach der Operation wird der Patientin intramuskulär ein modifiziertes Neurotoxin in die Schulter verabreicht. Das modifizierte Neurotoxin kann Botulinum Typ A, B, C, D, E, F und/oder G sein, worin eine oder mehrere Aminosäuren von einer die biologische Persistenz steigernden Komponente aus dem Toxin entfernt wurden. Zum Beispiel kann ein oder mehrere Leucinreste von dem Motiv auf Leucinbasis in Botulinumtoxin Serotyp A deletiert und/oder mutiert sein. Alternativ können eine oder mehrere Aminosäuren des Motivs auf Leucinbasis durch andere Aminosäuren ersetzt werden. Zum Beispiel können die zwei Leucine in dem Motiv auf Leucinbasis durch Alanine ersetzt werden. Die spezielle Dosis wie auch die Frequenz der Verabreichungen hängen von einer Vielzahl von Faktoren ab, die innerhalb des Könnens des behandelnden Arztes liegen. Der spezifische Ort der Verabreichung wird durch das Wissen des Arztes von der Anatomie und Physiologie der Muskeln bestimmt. Das verabreichte modifizierte Neurotoxin reduziert die Bewegung des Armes, um die Erholung von der Operation zu erleichtern. Der Effekt des modifizierten Neurotoxins hält für ungefähr 5 Wochen oder weniger an.
  • Beispiel 9
  • Klonierung, Expression und Reinigung des leichte Kette-Gens von Botulinum-Neurotoxin
  • Dieses Beispiel beschreibt Verfahren, um eine DNA-Nucleotidsequenz, die eine Botulinumtoxin-leichte Kette codiert, zu klonieren und zu exprimieren und das resultierende Proteinprodukt zu reinigen. Eine DNA-Sequenz, die die Botulinumtoxin-leichte Kette codiert, kann durch PCR-Protokolle amplifiziert werden, die synthetische Oligonucleotide mit Sequenzen, die zu den 5'- und 3'-Endregionen des leichte Kette-Gens korrespondieren, verwenden. Das Design der Primer kann die Einführung von Restriktionsorten, z. B. StuI- und EcoRI-Restriktionsorten in die 5'- und 3'-Enden des Botulinumtoxin-leichte Kette-Gen-PCR-Produktes erlauben. Diese Restriktionsorte können darauf folgend verwendet werden, um die unidirektionale Subklonierung der Amplifikationsprodukte zu erleichtern. Zusätzlich können diese Primer ein Stopp-Codon an dem C-Ende der leichten Kette-Codierungssequenz einführen. Chromosomale DNA von C. botulinum, z. B. Stamm HallA, kann als eine Matrize bei der Amplifikationsreaktion dienen.
  • Die PCR-Amplifikation kann in einem 0,1 mL Volumen durchgeführt werden, enthaltend 10 mM Tris-HCl (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM von jedem Desoxynucleotidtriphosphat (dNTP), 50 pmol von jedem Primer, 200 ng von genomischer DNA und 2,5 Einheiten von Taq DNA-Polymerase. Die Reaktionsmischung kann 35 Zyklen Denaturierung (1 Minute bei 94°C), Annealing (2 Minuten bei 55°C) und Polymerisation (2 Minuten bei 72°C) unterworfen werden. Schließlich kann die Reaktion für zusätzliche 5 Minuten bei 72°C ausgedehnt werden.
  • Das PCR-Amplifikationsprodukt kann mit z. B. StuI und EcoRI verdaut werden, um die leichte Kette, codierend kloniertes PCR-DNA-Fragment, freizusetzen. Dieses Fragment kann dann durch z. B. Agarosegelelektrophorese gereinigt werden und in z. B. ein SmaI- und EcoRI-verdautes pBluescriptII-SK-Phagemid, ligiert werden. Bakterielle Transformanten, z. B. E. coli, die dieses rekombinante Phagemid beherbergen, können durch Standardverfahren identifiziert werden, z. B. wie Blau/Weiß-Screening. Klone, die die DNA, die die leichte Kette codiert, umfassen, können durch DNA-Sequenzanalyse, die durch Standardverfahren ausgeführt wird, identifiziert werden. Die klonierten Sequenzen können durch Vergleich der klonierten Sequenzen mit veröffentlichten Sequenzen für Botulinumleichte Ketten verglichen werden, z. B. Binz et al. in J. Biol. Chem. 265, 9153 (1990), Thompson et al. in Eur. J. Biochem. 189, 73 (1990) und Minton, Clostridial Neurotoxins, The Molecular Pathogenesis of Tetanus and Botulism, S. 161–191, herausgegeben von C. Motecucco (1995).
  • Die leichte Kette kann in einen Expressionsvektor, z. B. pMal-P2, subkloniert werden. pMal-P2 beherbergt das malE-Gen, das MBP (Maltosebindungsprotein) codiert, das durch einen stark induzierbaren Promotor, Ptac, kontrolliert wird.
  • Um die Expression der Botulinumtoxin-leichten Kette zu verifizieren, kann eine gut isolierte bakterielle Kolonie, die das leichte Kette-Gen, enthalten pMal-P2, beherbergt, verwendet werden, um die L-Brühe, die 0,1 mg/ml Ampicillin und 2% (G/V) Glucose enthält, zu beimpfen und sie wird über Nacht unter Schütteln bei 30°C gezüchtet. Die Übernacht-Kulturen können 1:10 in frischer L-Brühe, enthaltend 0,1 mg/ml Ampicillin, verdünnt werden und für 2 Stunden inkubiert werden. Die Fusionsproteinexpression kann durch Zugabe von IPTG auf eine endgültige Konzentration von 0,1 mM induziert werden. Nach einer zusätzlichen 4-stündigen Inkubation bei 30°C können die Bakterien durch Zentrifugation bei 6.000 × g für 10 Minuten gesammelt werden.
  • Eine SDS-PAGE-Analyse in kleinem Maßstab kann die Gegenwart einer 90 kDa-Proteinbande in Proben, die von IPTG-induzierten Bakterien stammen, bestätigen. Dieses MW wäre mit der vorhergesagten Größe eines Fusionsproteins mit MBP (~ 40 kDa) und Botulinumtoxin-leichte Kette (~ 50 kDa)-Bestandteilen konsistent.
  • Die Gegenwart der erwünschten Fusionsproteine in den IPTG-induzierten bakteriellen Extrakten kann durch Western-Blotting unter Verwendung der polyklonalen Anti-L-Ketten-Sonde, die durch Cenci di Bello et al., in Eur. J. Biochem. 219, 161 (1993) beschrieben wird, bestätigt werden. Reaktive Banden auf PVDF-Membranen (Pharmacia; Milton Keynes, UK) können unter Verwendung eines Anti-Kaninchen-Immunglobulins, konjugiert mit Meerrettichperoxidase (BioRad; Hemel Hempstead, UK) und dem ECL-Nachweissystem (Amersham, UK) visualisiert werden. Western-Blotting-Ergebnisse bestätigen typischerweise die Gegenwart des dominanten Fusionsproteins zusammen mit verschiedenen schwachen Banden, die zu Proteinen mit niedrigerem MW als das des Fusionsproteins von vollständiger Größe korrespondieren. Diese Beobachtung legt nahe, dass ein begrenzter Abbau des Fusionsproteins in den Bakterien oder während des Isolierungsverfahrens auftritt.
  • Um die subklonierte leichte Kette herzustellen, können Pellets von 1 Liter-Kulturen von Bakterien, die die Wild-Typ-Botulinumneurotoxin-leichte Kette-Proteine exprimieren, in Säulenpuffer [10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 200 mM NaCl, 1 mM EGTA und 1 mM DTT], enthaltend 1 mM Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) und 10 mM Benzamidin, erneut suspendiert und durch Beschallung lysiert werden. Die Lysate können durch Zentrifugation bei 15.000 × g für 15 Minuten bei 4°C geklärt werden. Die Überstände können auf eine Amyloseaffinitätssäule [2 × 10 cm, 30 ml Harz] (New England BioLabs; Hitchin, UK) aufgebracht werden. Ungebundene Proteine können von dem Harz mit Säulenpuffer gewaschen werden, bis das Eluat frei von Protein ist, wie durch eine stabile Absorptionsablesung bei 280 nm beurteilt wird. Das gebundene MBP-L-Kettenfusionsprotein kann darauf folgend mit Säulenpuffer, der 10 mM Maltose enthält, eluiert werden. Fraktionen, die das Fusionsprotein enthalten, können gepoolt und gegen 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), ergänzt mit 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2 und 1 mM DTT, für 72 Stunden bei 4°C dialysiert werden.
  • Die MBP-L-Kettenfusionsproteine können nach der Freisetzung aus den Wirtsbakterien gereinigt werden. Die Freisetzung aus den Bakterien kann durch enzymatischen Abbau oder mechanischen Aufbruch der bakteriellen Zellmembran erreicht werden. Amyloseaffinitätschromatographie kann zur Reinigung verwendet werden. Rekombinante Wildtyp- oder mutierte leichte Ketten können von den Zucker-bindenden Domänen der Fusionsproteine durch ortsspezifische Spaltung mit Faktor Xa getrennt werden. Dieses Spaltungsverfahren ergibt typischerweise freies MBP, freie leichte Ketten und eine kleine Menge von ungespaltenem Fusionsprotein. Während von den resultierenden leichten Ketten, die in solchen Mischungen vorliegen, gezeigt werden kann, dass sie die erwünschten Aktivitäten besitzen, kann ein zusätzlicher Reinigungsschritt angewendet werden. Zum Beispiel kann die Mischung aus Spaltungsprodukten auf eine zweite Amyloseaffinitätssäule aufgebracht werden, die sowohl das MBP wie auch ungespaltenes Fusionsprotein bindet. Freie leichte Ketten können in dem Fluss durch Fraktion isoliert werden.
  • Beispiel 10
  • Wiederherstellung von nativer leichter Kette, rekombinanter Wild-Typ-leichter Kette mit gereinigter schwerer Kette
  • Native schwere und leichte Ketten können von einem BoNT mit 2 M Harnstoff dissoziiert, mit 100 mM DTT reduziert und dann gemäß den etablierten chromatographischen Verfahren gereinigt werden. Zum Beispiel Kozaki et al. (1981, Japan J. Med. Sci. Biol. 34, 61) und Maisey et al. (1988, Eur. J. Biochem. 177, 683). Eine gereinigte schwere Kette kann mit einer äquimolaren Menge von entweder nativer leichter Kette oder einer rekombinanten leichten Kette kombiniert werden. Die Wiederherstellung kann durch Dialyse der Proben gegen einen Puffer, der aus 25 mM Tris (pH 8,0), 50 μM Zinkacetat und 150 mM NaCl besteht, über 4 Tage bei 4°C durchgeführt werden. Nach der Dialyse wird die Assoziierung der rekombinanten leichten Kette und nativen schweren Kette, um Disulfidverbundene 150 kDa-Diketten zu bilden, durch SDS-PAGE beobachtet und/oder durch densitometrisches Scanning quantifiziert.
  • Beispiel 11
  • Herstellung eines modifizierten Neurotoxins mit einer gesteigerten biologischen Persistenz
  • Ein modifiziertes Neurotoxin kann durch Anwendung rekombinanter Techniken in Verbindung mit konventionellen chemischen Techniken hergestellt werden.
  • Eine Neurotoxinkette, z. B. eine Botulinum-leichte Kette, die mit einer die biologische Persistenz steigernden Komponente fusioniert werden soll, um ein modifiziertes Neurotoxin zu bilden, kann rekombinant hergestellt und wie in Beispiel 9 beschrieben gereinigt werden.
  • Die rekombinante Neurotoxinkette, die von den rekombinanten Techniken stammt, kann kovalent mit einer die biologische Persistenz steigernden Komponente, z. B. einem Motiv auf Leucinbasis, einem Motiv auf Tyrosinbasis und/oder einem Aminosäurederivat, fusioniert oder daran gekoppelt werden. Peptidsequenzen, die die biologische Persistenz steigernde Komponenten umfassen, können durch Standard-t-Boc/Fmoc-Technologien in Lösung oder Festphase synthetisiert werden, wie es denjenigen, die auf dem Fachgebiet bewandert sind, bekannt ist. Ähnliche Synthesetechniken werden auch durch den Umfang dieser Erfindung abgedeckt, z. B. Methodiken, die in Milton et al. (1992, Biochemistry 31, 8799–8809) und Swain et al. (1993, Peptide Research 6, 147–154) verwendet werden. Ein oder mehrere synthetisierte, die biologische Persistenz steigernde Komponenten können an die leichte Kette von Botulinum Typ A, B, C1, C2, D, E, F oder G an z. B. dem carboxyterminalen Ende des Toxins fusioniert werden. Die Fusion der die biologische Persistenz steigernden Komponenten wird durch chemische Kopplung unter Verwendung von Reagenzien und Techniken, die denjenigen, die auf dem Fachgebiet bewandert sind, bekannt sind, z. B. PDPH/EDAC und Traut's Reagenzchemie, erreicht werden.
  • Alternativ kann ein modifiziertes Neurotoxin rekombinant ohne den Schritt der Fusionierung der die biologischen Persistenz steigernden Komponente mit einer rekombinanten Botulinumtoxinkette hergestellt werden. Zum Beispiel kann eine rekombinante Neurotoxinkette, z. B. eine Botulinumleichte Kette, stammend aus den rekombinanten Techniken von Beispiel 9, mit einer die biologische Persistenz steigernden Komponente, z. B. einem Motiv auf Leucinbasis, einem Motiv auf Tyrosinbasis und/oder einem Aminosäurederivat, hergestellt werden. Zum Beispiel können eine oder mehrere DNA-Sequenzen, die die Komponenten, die die biologische Persistenz steigern, codieren, zu der DNA-Sequenz zugegeben werden, die die leichte Kette von Botulinum Typ A, B, C1, C2, D, E, F oder G codiert. Diese Zugabe kann durch eine Anzahl von Verfahren, die für die ortsgerichtete Mutagenese verwendet werden, die denjenigen, die auf dem Fachgebiet bewandert sind, bekannt sind, durchgeführt werden.
  • Die rekombinante modifizierte leichte Kette, die die fusionierte oder zugegebene, die biologische Persistenz steigernde Komponente enthält, kann mit einer schweren Kette eines Neurotoxins durch das Verfahren, das in Beispiel 10 beschrieben wird, wieder hergestellt werden, wodurch ein komplettes modifiziertes Neurotoxin hergestellt wird.
  • Die modifizierten Neurotoxine, die gemäß diesem Beispiel hergestellt werden, weisen eine gesteigerte biologische Persistenz auf. Vorzugsweise wird die biologische Persistenz um ungefähr 20% bis ungefähr 300% relativ zu einem identischen Neurotoxin ohne die zusätzliche(n), die biologische Persistenz steigernde Komponente(n) gesteigert.
  • Beispiel 12
  • Herstellung eines modifizierten Neurotoxins mit einer reduzierten biologischen Persistenz
  • Ein modifiziertes Neurotoxin mit einer reduzierten biologischen Persistenz kann durch Anwendung rekombinanter Techniken hergestellt werden. Zum Beispiel kann eine Botulinum-leichte Kette, die von den rekombinanten Techniken aus Beispiel 9 stammt, ohne eine die biologische Persistenz steigernde Komponente hergestellt werden. Zum Beispiel kann eines oder mehrere der Motive auf Leucinbasis, der Motive auf Tyrosinbasis und/oder der Aminosäurederivate mutiert werden. Zum Beispiel kann eine oder mehrere DNA-Sequenzen, die die Komponenten, die die biologische Persistenz steigern, codieren, aus der DNA-Sequenz, die die leichte Kette von Botulinum Typ A, B, C1, C2, D, E, F oder G codiert, entfernt werden. Zum Beispiel kann die DNA-Sequenz, die das Motiv auf Leucinbasis codiert, aus der DNA-Sequenz, die die Botulinum Typ A-leichte Kette codiert, entfernt werden. Die Entfernung der DNA-Sequenzen kann durch irgendeine Anzahl von Verfahren, die denjenigen, die auf dem Fachgebiet bewandert sind, bekannt sind, durchgeführt werden.
  • Die rekombinante modifizierte leichte Kette mit der entfernten, die biologische Persistenz steigernden Komponente kann mit einer schweren Kette eines Neurotoxins durch das Verfahren, das in Beispiel 10 beschrieben wird, wiederhergestellt werden, wodurch ein komplettes modifiziertes Neurotoxin hergestellt wird.
  • Das modifizierte Neurotoxin, das gemäß diesem Beispiel hergestellt wird, weist eine reduzierte biologische Persistenz auf. Vorzugsweise wird die biologische Persistenz um ungefähr 20% bis ungefähr 300% relativ zu einem identischen Neurotoxin, z. B. Botulinum Typ A, mit dem Motiv auf Leucinbasis, reduziert.
  • Obwohl die vorliegende Erfindung detailliert im Hinblick auf bestimmte bevorzugte Verfahren beschrieben wurde, sind andere Ausführungsarten, Versionen und Modifikationen innerhalb des Umfanges der vorliegenden Erfindung möglich. Zum Beispiel kann eine große Bandbreite modifizierter Neurotoxine effektiv bei den Verfahren der vorliegenden Erfindung anstelle von Clostridien-Neurotoxinen verwendet werden. Auch werden die korrespondierenden genetischen Codes, sprich DNA-Sequenz, zu den modifizierten Neurotoxinen als ein Teil dieser Erfindung betrachtet. Zusätzlich beinhaltet die vorliegende Erfindung periphere Verabreichungsverfahren, worin zwei oder mehr modifizierte Neurotoxine, z. B. Botulinum Typ E mit einem fusionierten Motiv auf Leucinbasis und Botulinum Typ B, umfassend ein Motiv auf Leucinbasis, zusammen oder aufeinander folgend verabreicht werden. Während diese Erfindung im Hinblick auf verschiedene spezifische Beispiele und Ausführungsarten beschrieben wurde, sollte verstanden werden, dass die Erfindung nicht darauf begrenzt ist und dass sie vielfältig innerhalb des Umfanges der folgenden Ansprüche ausgeübt werden kann.
  • Beispiel 13
  • Herstellung eines modifizierten Neurotoxins mit einer reduzierten biologischen Persistenz
  • Die Lokalisierung an der zellulären Membran ist vermutlich ein Schlüsselfaktor zur Bestimmung der biologischen Persistenz von Botulinumtoxinen. Dies liegt daran, dass die Lokalisierung an einer Zellmembran das lokalisierte Protein von interzellulären Protein abbauenden Komplexen schützen kann.
  • Es ist gut bekannt und allgemein akzeptiert, dass die biologische Persistenz von Botulinum Typ B-Neurotoxin kürzer ist als die biologische Persistenz von Botulinum Typ A- Neurotoxin. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass, wenn die Botulinumtoxin Typ A-leichte Kette gekürzt wird, was die Entfernung des Motivs auf Leucinbasis umfasst, die leichte Kette ihre Fähigkeit, an die zelluläre Membran in ihrem charakteristischen Muster zu lokalisieren, wesentlich verliert. Tatsächlich lokalisiert gekürzte Typ A-leichte Kette an die zelluläre Membran in einem Muster, das demjenigen von Botulinumtoxin Typ B-leichter Kette ähnlich ist.
  • Daher kann die Hypothese aufgestellt werden, dass gekürztes Botulinum Typ A eine reduzierte biologische Persistenz und/oder eine reduzierte biologische Aktivität aufweist, die derjenigen von Botulinumtoxin Typ B ähnlich ist.
  • Beispiel 14
  • Herstellung eines modifizierten Neurotoxins mit einer geänderten biologischen Persistenz
  • Die Lokalisierung an der zellulären Membran ist vermutlich ein Schlüsselfaktor zur Bestimmung der biologischen Persistenz von Botulinumtoxinen. Dies liegt daran, dass die Lokalisierung an einer Zellmembran das lokalisierte Protein von interzellulärem Protein abbauenden Komplexen schützen kann.
  • In dieser Arbeit wird gezeigt, dass, wenn Botulinumtoxin Typ A-leichte Kette mutiert wird, wobei die zwei Leucine an den Positionen 427 und 428 zu Alaninen geändert werden (3), die leichte Kette ihre Fähigkeit, an die zelluläre Membran in ihrem charakteristischen Muster zu lokalisieren, wesentlich verliert.
  • Aus diesen Daten kann geschlossen werden, dass das mutierte Botulinum Typ A eine veränderte biologische Persistenz aufweist.
  • Beispiel 15
  • In-vitro-Spaltung von SNAP 25 durch gekürzte LC/A
  • Wie durch 9 veranschaulicht wird, wurde ein in-vitro-ELISA-Assay durch die Erfinder durchgeführt, welcher zeigt, dass ein gekürztes LC/A in-vitro SNAP-25-Substrat weniger effizient als nicht-gekürzte LC/A spaltet. Die dargestellten Daten sind nicht ein Maß der Inhibition von Exozytose, aber ein Maß der in-vitro-Bildung von SNAP-Spaltung. Der Assay wurde wie folgt durchgeführt:
  • Materialien:
  • BirA-SNAP25128-206 – dies ist ein rekombinantes Substrat für LC/A, bestehend aus einer BirA-Signalsequenz, fusioniert an das N-Ende von den Resten 128–206 von SNAP25. Dieses Fusionskonstrukt wurde in E. coli hergestellt und die BirA-Signalsequenz wurde durch E. coli biotinyliert.
  • Mikrotiterplatten wurden mit Streptavidin beschichtet. Das Toxin, das verwendet wurde, war BoNT/A-Komplex oder LC/A-Konstrukte. Der primäre Antikörper war Anti-SNAP25197-Antikörper. Dieser Antikörper erkennt das C-Ende von SNAP25 nach der Spaltung durch Typ A-Toxin (BirA-SNAP25128-197). Der sekundäre Antikörper war Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert mit Meerrettichperoxidase. Das ImmunoPure-TMB-Substrat kam von Pierce, ein kolorimetrisches Substrat für Meerrettichperoxidase. Der Antikörper, der das gespaltene Produkt SNAP25197 erkennt, ist für das gespaltene Produkt spezifisch und erkennt nicht das ungespaltene Substrat SNAP25206 mit vollständiger Länge.
  • Verfahren:
  • BirA-SNAP25128-206 wurde auf einer Mikrotiterplatte an Streptavidin gebunden. Zu den Platten wurden serielle Verdünnungen von BoNT/A 900 kDa-Komplex, His6-S-native LC/A oder His6-S-truncLC/A-His6 zugegeben. Alle Toxinproben wurden mit DTT vorinkubiert (das ist nicht für die LC/A-Konstrukte erforderlich, aber sie wurden auf die gleiche Weise wie der BoNT/A-Komplex behandelt). Die Toxinproben wurden mit dem Substrat für 90 Minuten bei 37°C inkubiert. Das Toxin wurde entfernt und das gebundene Substrat wurde mit Anti-SNAP25197-Antikörper inkubiert. Ungebundener Antikörper wurde abgewaschen und die Platten wurden dann mit dem sekundären Antikörper inkubiert (Anti-Kaninchen-IgG, konjugiert an Meerrettichperoxidase). Ungebundener Antikörper wurde wiederum abgewaschen und ein kolorimetrischer Assay für Meerrettichperoxidase wurde durchgeführt. Der Assay wurde durch Ablesung der Absorption bei 450 nm quantifiziert.
  • Bei anderer Arbeit von den Erfindern, die hier offenbart wird, wurden die leichten-Ketten-Konstrukte, die in den PC-12-Zellen exprimiert wurden, direkt in den PC-12-Zellen exprimiert, und sie enthalten keine Markierungen. Die leichte-Ketten-Konstrukte, die von E. coli für diese In-Vitro-Assays exprimiert wurden, enthalten Affinitätsmarker für Reinigungszwecke (diese Markierungen liegen nicht auf den Proteinen vor, die in den PC-12-Zellen exprimiert werden, wie hier offenbart wird). Die LC/A, die in PC12 exprimiert wird, war das Fusionsprotein GFP-LC/A. Zwischen dem GFP und der LC/A gibt es einen Satz von Gly, um die beiden Proteine zu trennen.
  • Eine Erklärung der verschiedenen Konstrukte folgt:
    Komplex (rot in dem Graph) dies ist BoNT/A 900 kDa-Komplex, isoliert aus C. botulinum.
  • Gekürzte LC/A – Konstrukt, dem es an 8 Aminosäuren an dem N-Ende und 22 Aminosäuren an dem C-Ende mangelt. Dieses Konstrukt enthält jedoch ein 6-Histidin und eine S-Markierung an dem N-Ende, wie auch eine 6-Histidin-Markierung an dem C-Ende.
  • Dialysierte gekürzte LC/A – das gleiche wie gekürzte LC/A, aber Imidazol, das aus der Reinigung resultiert, wurde entfernt.
  • Volle LC/A (dunkelgrün im Graph) – natives LC/A-Konstrukt (volle Länge), aber das N-terminale 6-Histidin und die S-Markierung enthaltend. Weist kein C-terminales 6-Histidin auf.
  • Dialysiertes vollständiges LC/A (hellgrün im Graph) – das gleiche wie vollständiges LC/A, aber Imidazol, das aus der Reinigung resultiert, wurde entfernt.
  • Um diese Unterschiede graphisch darzustellen, zeigt 10 das genaue N-Ende und das genaue C-Ende dieser Konstrukte (der mittlere Teil der LC/A-Proteine wird nicht gezeigt). Was als Wildtyp bezeichnet wird, korrespondiert zu der nativen LC/A, die die Erfinder direkt in den PC-12-Zellen exprimiert hatten (dies ist das Konstrukt, bei dem die Erfinder Aktivität über Western-Blot-Analyse des gespaltenen SNAP25-Produktes zeigten). Gekürzte LC/A ist die gekürzte leichte Kette, die die His- und S-Markierungen enthält. N-His-LC/A ist das, was als vollständige LC/A in 9 bezeichnet wurde.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (22)

  1. Modifiziertes Clostridium-Neurotoxin, umfassend mindestens ein zusätzliches Motiv auf Leucinbasis, wobei das zusätzliche Motiv auf Leucinbasis umfaßt: (a) ein Quintett umfassend die ersten fünf Aminosäuren, wobei mindestens eine Aminosäure eine acidische Aminosäure oder mindestens eine Aminosäure einer eine Hydroxylgruppe enthaltenden Aminosäure ist, und (b) ein Dublett umfassend zwei Aminosäuren gefolgt von dem Quintett, wobei mindestens eine der Aminosäuren ein Leucin oder mindestens eine der Aminosäuren ein Isoleucin ist, wobei das zusätzliche Motiv auf Leucinbasis die biologische Persistenz des modifizierten Botulinum-Neurotoxins im Verhältnis zu einem identischen Botulinum-Neurotoxin ohne das zusätzliche Motiv auf Leucinbasis erhöht.
  2. Modifiziertes Clostridium-Neurotoxin nach Anspruch 1, wobei das zu modifizierende Clostridium-Neurotoxin ein Botulinum-Neurotoxin ist.
  3. Modifiziertes Clostridium-Neurotoxin nach Anspruch 2, wobei das Botulinum-Neurotoxin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Botulinumtoxin Typ A, einem Botulinumtoxin Typ B, einem Botulinumtoxin Typ C1, einem Botulinumtoxin Typ D, einem Botulinumtoxin Typ E, einem Botulinumtoxin Typ F, einem Botulinumtoxin Typ G und einem chimeren Botulinumtoxin davon.
  4. Modifiziertes Botulinum-Neurotoxin nach Anspruch 3, wobei das zu modifizierende Botulinumtoxin-Neurotoxin ein Botulinumtoxin Typ A ist.
  5. Modifiziertes Clostridium-Neurotoxin nach Anspruch 1, wobei das zu modifizierende Clostridium-Neurotoxin ein Tetanus-Neurotoxin ist.
  6. Modifiziertes Clostridium-Neurotoxin nach Anspruch 1, wobei das Quintett der Aminosäuren eine acidische Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Glutamat und einem Aspartat umfaßt.
  7. Modifiziertes Clostridium-Neurotoxin nach Anspruch 1, wobei die eine Hydroxylgruppe enthaltende Aminosäure des Quintetts ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Serin, einem Threonin und ein Tyrosin.
  8. Modifiziertes Clostridium-Neurotoxin nach Anspruch 6, wobei die eine Hydroxylgruppe enthaltende Aminosäure phosphorylisiert sein kann.
  9. Modifiziertes Clostridium-Neurotoxin nach Anspruch 1, wobei eine Aminosäure des Dubletts ein Leucin, ein Isoleucin, ein Methionin, ein Alanin, ein Phenylalanin, ein Tryptophan oder ein Valin umfaßt.
  10. Modifiziertes Clostridium-Neurotoxin nach Anspruch 1, wobei das Dublett ein Leucin-Leucin-Dublett, ein Leucin-Isoleucin-Dublett, ein Isoleucin-Leucin-Dublett, ein Isoleucin-Isoleucin-Dublett oder ein Leucin-Methionin-Dublett umfaßt.
  11. Modifiziertes Clostridium-Neurotoxin nach Anspruch 1, wobei das zusätzliche Motiv auf Leucinbasis eine Konsensussequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus der SEQ ID No. 1, SEQ ID No. 2, SEQ ID No. 3, SEQ ID No. 4, SEQ ID No. 5, SEQ ID No. 6 und SEQ ID No. 21 umfaßt.
  12. Modifiziertes Clostridium-Neurotoxin nach Anspruch 1, wobei das zusätzliche Motiv auf Leucinbasis eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID No. 7, SEQ ID No. 8, SEQ ID No. 9, SEQ ID No. 10, SEQ ID No. 11, SEQ ID No. 12, SEQ ID No. 13, SEQ ID No. 14, SEQ ID No. 15, SEQ ID No. 16, SEQ ID No. 17, SEQ ID No. 18 und SEQ ID No. 22 umfaßt.
  13. Modifiziertes Clostridium-Neurotoxin nach Anspruch 1, wobei das Motiv auf Leucinbasis SEQ ID No. 7 umfaßt.
  14. Modifiziertes Clostridium-Neurotoxin nach Anspruch 1, wobei die erhöhte biologische Persistenz auf einen Anstieg der biologischen Halbwertszeit des modifizierten Clostridium-Neurotoxins zurückzuführen ist.
  15. Modifiziertes Clostridium-Neurotoxin nach Anspruch 1, wobei die erhöhte biologische Persistenz auf einen Anstieg der biologischen Aktivität des modifizierten Clostridium-Neurotoxins zurückzuführen ist.
  16. Verwendung eines modifizierten Neurotoxins, wie in den Ansprüchen 1 bis 13 definiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer neuromuskulären Störung, einer autonomen Störung oder von Schmerz.
  17. Verwendung nach Anspruch 16, wobei die Beschwerde ist: spasmische Dysphonie, Kehlkopfdystonie, oromandibuläre Dysphonie, Zungendystonie, Halsdystonie, fokale Handdystonie, Lidkrampf, Strabismus, hemifazialer Spasmus, Augenlidstörung, zerebrale Lähmung, fokale Spastik, krampfhafte Kolitis, neurogene Blase, Animus, Hinken, Gesichtszucken, Tremore, nächtliches Zähneknirschen, Analfissur, Erschlaffungsunfähigkeit eines Schließmuskels, Dysphonie, Tränenfluß, Fußschweiß, übermäßiger Speichelfluß, übermäßige Magendarmabsonderungen, Schmerz durch Muskelspasmen, Kopfschmerzen, Stirnrunzeln und Hautfalten.
  18. Modifiziertes Clostridium-Neurotoxin Typ A, umfassend eine Mutation in einem Motiv auf Leucinbasis der SEQ ID No. 7, wobei die Mutation die biologische Persistenz des modifizierten Botulinumtoxins Typ A im Verhältnis zu einem Botulinum-Neurotoxin Typ A ohne die Mutation des Motivs auf Leucinbasis verringert.
  19. Modifiziertes Botulinumtoxin Typ A von Anspruch 18, wobei die Mutation des Motivs auf Leucinbasis eine Deletion ein oder mehrerer Aminosäuren der SEQ ID No. 7 ist.
  20. Modifiziertes Botulinumtoxin Typ A von Anspruch 18, wobei die Mutation des Motivs auf Leucinbasis eine Substitution ein oder mehrerer Aminosäuren der SEQ ID No. 7 ist.
  21. Modifiziertes Botulinumtoxin Typ A von Anspruch 18, wobei die verringerte biologische Persistenz auf eine Abnahme der biologischen Halbwertszeit des modifizierten Botulinumtoxins Typ A zurückzuführen ist.
  22. Modifiziertes Botulinumtoxin Typ A von Anspruch 18, wobei die verringerte biologische Persistenz auf eine Abnahme der biologischen Aktivität des modifizierten Botulinumtoxins Typ A zurückzuführen ist.
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