DE60132442T2

DE60132442T2 - Diagnostischer assay mit dem makrophagen-inhibitorischen-zytokin-1 (mic-1)

Info

Publication number: DE60132442T2
Application number: DE60132442T
Authority: DE
Inventors: Samuel Norbert Gordon BREIT; David Alexander Bondi Beach BROWN
Original assignee: St Vincents Hospital Sydney Ltd
Current assignee: St Vincents Hospital Sydney Ltd
Priority date: 2000-04-20
Filing date: 2001-04-20
Publication date: 2009-01-22
Anticipated expiration: 2021-04-21
Also published as: ATE384265T1; ES2346918T3; DE60142372D1; EP1279039A1; EP1279039A4; JP2003532079A; ATE470863T1; EP1914554A2; US7968303B2; AU2001250182B2; EP1914554B1; ES2300325T3; CA2405680C; WO2001081928A1; JP4920851B2; EP1914554A3; DE60132442D1; US20040053325A1; EP1279039B1; US7514221B2

Description

Bereich der Erfindung
Diese Erfindung betrifft den Bereich der medizinischen Diagnostik. Insbesondere stellt die Erfindung Verfahren zur Diagnose des Risikos einer Fehlgeburt und/oder einer Frühgeburt und fötaler Anomalien zur Verfügung.
Hintergrund der Erfindung
Die TGF-β(transforming growth factor-β)-Superfamilie besteht aus einer wachsenden Anzahl von Molekülen, welche eine Vielzahl zellulärer Prozesse, wie beispielsweise Wachstum, Differenzierung und Onkogenese, regulieren. Mitglieder der TGF-β-Superfamilie wurden in Hauptfamilien klassifiziert, welche TGF-β, Knochen-Morphogenese-Proteine (bone morphogenetic Proteins, BMP), Wachstums- und Differenzierungsfaktor (growth and differentiation factor, GDF), Inhibin/Activin, die Müller'sche inhibitorische Substanz (mullerian inhibitory substance, MIS), den von Glia(zellen) stammenden neurotrophen Faktor (GDNF) und, neuerdings, das Makrophagen-inhibitorische Cytokin-1 (Bootcov et al., 1997), umfassen. Der Nachweis von TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, Activin und Inhibin in amniotischer Flüssigkeit (Fruchtwasser) und die Lokalisierung von TGF-β1, Activin und Inhibin in den Plazentazotten weist auf eine Rolle der TGF-β-Superfamilie in der humanen Schwangerschaft hin (Graham et al., 1992; Petraglia et al., 1993a; Petraglia et al., 1992; Minami et al., 1992; Lang and Searle, 1994; Qu and Thomas, 1992; Altman et al., 1990; Canniggia et al., 1999, Wallace et al., 1997).
Aufgrund ihrer biologischen Bedeutung und ihres therapeutischen Potentials wurde die TGF-β-Superfamilie intensiv untersucht. Ihre Biologie und Funktionen sind bestens bekannt und ausgiebig beschrieben (z. B. Miyazono et al., 1993; Wahl, 1992; und Roberts et al., 1993). Sie stellen potente chemotaktische Faktoren für Makrophagen und Fibroblasten dar und inhibieren im Allgemeinen Zellproliferation, vermutlich aufgrund ihrer Rolle bei der Differenzierung. Im Zusammenhang mit Entzündung (Inflammation) stellt TGF-β einen potenten Stimulator von Fibroblasten, Kollagen(-) und Matrixprotein-Synthese dar, fördert Angiogenese, moduliert die Expression von Adhäsionsmolekülen und inhibiert Lymphocyten-Proliferation, Produktion einiger Lymphokine und NK-Zellfunktion. TGF-β-Proteine werden ebenso mit der Pa thogenese chronischer Entzündungsprozesse und -mechanismen stark in Verbindung gebracht.
Es wird davon ausgegangen, dass die TGF-β-Superfamilie eine Vielzahl von Rollen während der Schwangerschaft spielt. Die Fähigkeit der TGF-β-Isoformen, Zell-Zell-Adhäsion, Zell-Migration und Gewebeumbau ("remodelling") zu modulieren, führte zu der Annahme einiger Autoren, dass diese Moleküle die Trophoblasten-Invasion und -Implantation in der frühen Schwangerschaft regulieren könnten. Weitere mögliche Rollen umfassen die Regulation des fötalen Wachstums und die Suppression des maternalen Immunsystems. Plazentazellen stellen eine Hauptquelle der Moleküle der TGF-β-Superfamilie dar, und sie werden durch zumindest TGF-β1, TGF-β3, Activin und Inhibin reguliert. Beispielsweise unterdrückt Activin die Produktion von Inhibin und verstärkt Progesteron, das humane chorionische Gonadotropin (hCG) und das Gonadotropin-freisetzende Hormon (GnRE) durch Plazentazellen (Petraglia et al., 1989). Inhibin unterdrückt Plazenta-hCG, GnRH und Activin-induzierte Progesteron-Freisetzung (Petraglia et al., 1989), während TGF-β1 die Produktion von aus Plazenta stammendem humanem Plazenta-Lactogen (hPL) unterdrückt. Es wurde ebenso gezeigt, dass Activin und TGF-β3 gegensätzliche Effekte bei der Regulation der extravillösen Trophoblasten-Invasion in der frühen Schwangerschaft aufweisen (Caniggia et al., 1997; Caniggia et al., 1999). Diese Ergebnisse legen nahe, dass TGF-β1, TGF-β3, Activin und Inhibin das Wachstum und die Differenzierung der Plazenta auf autokrine Weise regulieren. TGF-β1, Activin und Inhibin liegen ebenso im Embryo selbst vor, wo sie, wie gezeigt wurde, Wachstum und Differenzierung regulieren. Insbesondere ist von den Mitgliedern der TGF-β-Superfamilie gut bekannt, dass sie Mesoderm-Induktion fördern können.
Ferner wurde vorgeschlagen, dass Proteine der TGF-β-Superfamilie fötales Überleben unterstützen. Experimente weisen darauf hin, dass die Konzentration der pro-inflammatorischen Cytokine Interleukin-1 (IL-1), IL-6 und Tumor-Nekrosefaktor-α (TNF-α) im Fruchtwasser während der Wehen ansteigen. Des Weiteren wurde pro-inflammatorische Cytokinproduktion, welche intrauterine Infektion begleitet, mit fötaler Abstoßung oder vorzeitigen Wehen in Verbindung gebracht (Romero et al., 1992; Hillier et al., 1993; Opsjon et al., 1993). Es wurde gezeigt, dass TGF-β1 und Inhibin die Produktion pro-inflammatorischer Cytokine von Makrophagen bzw. Lymphocyten unterdrücken (Bogdan und Nathan, 1993; Petraglia et al., 1991), während Activin pro-inflammatorische Wirkungen auf Makrophagen und das Amnion besitzt (Nusing und Barsig, 1997; Petraglia et al., 1993b). Dies führte zu der Annahme, dass TGF-β1 und Inhibin fötales Überleben durch Unterdrücken der Produktion pro-inflammatorischer Cytokine durch das maternale Immunsystem fördern.
WO-A-9906445 schlägt die Verwendung von GDF-15, welches ebenso als MIC-1 bekannt ist, unter anderem zur Verhinderung vorzeitiger Wehen vor. Es wird lediglich das murine GDF-15 offenbart und keine tatsächliche Aktivität oder Gewebeexpression von GDF-15 gezeigt.
Die Anmelder der vorliegenden Erfindung klonierten und charakterisierten kürzlich ein abweichendes Mitglied der TGF-β-Superfamilie, das Makrophagen-inhibitorische Cytokin-1 (MIC-1) (Bootcov et al., 1997), dessen Expression mit Makrophagenaktivierung assoziiert ist. Um zu bestimmen, welche Rolle MIC-1 in der Schwangerschaft spielen könnte, entwickelten die gegenwärtigen Anmelder einen sensitiven Enzym-gekoppelten Immunadsorptionsassay (ELISA) vom Sandwichtyp zur Quantifizierung von MIC-1; dieser wurde eingesetzt, um die zeitliche Beziehung zwischen den MIC-1-Konzentrationen in humanem maternalem Serum und dem Gestationsalter zu untersuchen und außerdem dessen Konzentration in Fruchtwasser und Plazentaextrakten zu bestimmen. Des Weiteren führten die gegenwärtigen Anmelder Experimente durch, um die Ursprünge von MIC-1 zu bestimmen, wobei die Kapazität einer Plazenta-Trophoblasten-Zelllinie (BeWo) hinsichtlich der Synthese des Cytokins untersucht wurde. Die hierin dargestellten Ergebnisse zeigen, dass MIC-1 fötales Überleben durch Unterdrückung der Produktion maternaler pro-inflammatorischer Cytokine innerhalb des Uterus unterstützen kann. Somit eröffnen quantitative diagnostische Assays von MIC-1 in Proben maternalen Serums, Fruchtwasser und Plazentaextrakten die Möglichkeit, schwangere Frauen mit abnormalen Niveaus von MIC-1 zu detektieren, bei denen dadurch das Risiko einer Fehlgeburt und/oder Frühgeburt besteht.
Zudem fanden die gegenwärtigen Anmelder, dass eine Anzahl allelischer Varianten von MIC-1 existieren, wobei sämtliche kleinere Aminosäuresequenz-Unterschiede an den Positionen 9, 48 und 202 zeigen (siehe Internationale Patentveröffentlichung Nr. WO 97/00958 , deren gesamter Inhalt hiermit durch Bezug aufgenommen wird, worin MIC-1 als CL13 bezeichnet wird). Die signifikanteste dieser Positionen stellt die Aminosäure an Position 202 dar, da dies der Position 6 der rei fen Form von MIC-1 entspricht (d. h., mit der Leader-Sequenz, welche durch Abspaltung entfernt wurde). In einigen dieser identifizierten Varianten ist der normale Histidin(H)-Rest an Position 202 (oder "H6") durch Asparaginsäure (D) substituiert. Der Grund dafür liegt in einer einzigen Nukleotidsubstitution innerhalb des MIC-1-Gens, derart, dass ein Cytosin (C) an Position 604 durch ein Guanosin (G) substituiert ist. Die Anmelder der vorliegenden Erfindung fanden nun heraus, dass Individuen, welche entweder heterozygot oder homozygot für die Asp²⁰²-MIC-1 (oder "D6") allelische Variante sind, eine veränderte Prädisposition und einen veränderten Krankheitsverlauf für entzündliche Erkrankung(en) und/oder Krebs aufweisen.
Offenbarung der Erfindung
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der Nachweis verminderter Mengen an MIC-1 in einer Körperprobe, bevorzugt einer Probe aus Blutserum, Fruchtwasser oder Platentaextrakten, einer schwangeren Testperson indikativ für einen Zustand, in dem ein erhöhtes Risiko einer Fehlgeburt und/oder einer Frühgeburt bestehen könnte.
Somit stellt in einem ersten Aspekt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose des Risikos einer Fehlgeburt und/oder einer Frühgeburt zur Verfügung, wobei das Verfahren umfasst:

(i) die Bestimmung der Menge an MIC-1, die in einer Körperprobe vorliegt, welche einer schwangeren Testperson mit bekanntem Gestationsalter. (Schwangerschaftsdauer) entnommen wurde, und
(ii) den Vergleich der bestimmten Menge mit der Menge oder dem Mengenbereich, die/der in (einer) äquivalenten Körperprobe(n) vorliegt, welche (einer) normalen schwangeren Person(en) mit einem Gestationsalter, welches im Wesentlichen äquivalent zu dem bekannten Gestationsalter der Testperson ist, entnommen wurde(n).

Wie oben erwähnt, sind bevorzugte Körperproben zur Verwendung in dem Verfahren gemäß dem ersten Aspekt Proben aus Blutserum, Fruchtwasser oder Plazentaextrakten. Jedoch können auch Proben aus Vollblutplasma, Urin und Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit geeignet sein.
Die Menge oder der Mengenbereich, der in den Körperproben von normalen schwangeren Personen vorliegt, steigt mit zunehmendem Gestationsalter an. Es ist somit wichtig, dass die bestimmte Menge an MIC-1 in der Probe der Testperson mit der/den MIC-1-Menge(n), die in äquivalenter/n Probe(n) von (einer) normalen schwangeren Person(en) mit im Wesentlichen äquivalentem Gestationsalter vorliegt/en, zu vergleichen. Wenn es sich bei den verwendeten Körperproben um Serumproben handelt, wäre somit eine bestimmte Menge von weniger als oder gleich 4 ng/ml von einer Testperson im erster Trimester, weniger als oder gleich 8 ng/ml von einer Testperson im zweiten Trimester und weniger als oder gleich 12 ng/ml von einer Testperson im dritten Trimester indikativ für verminderte MIC-1-Niveaus und folglich ein erhöhtes Risiko einer Fehlgeburt und/oder Frühgeburt. Wenn es sich bei den Körperproben um Fruchtwasserproben handelt, wäre eine bestimmte Menge von weniger als oder gleich 10 ng/ml von einer Testperson im zweiten Trimester indikativ für verminderte MIC-1-Niveaus und folglich ein erhöhtes Risiko einer Fehlgeburt und/oder einer Frühgeburt. Wenn es sich bei den verwendeten Körperproben um Plazentaextrakte handelt, wäre eine bestimmte Menge von weniger als oder gleich 18 ng/ml, bevorzugt weniger als oder gleich 10 ng/ml, in einer Plazentaextraktprobe einer Testperson im dritten Trimester indikativ für verminderte MIC-1-Niveaus und folglich ein erhöhtes Risiko einer Fehlgeburt und/oder Frühgeburt.
Ein erhöhtes Risiko einer Fehlgeburt und/oder Frühgeburt kann das Ergebnis einer abnormalen Schwangerschaft und/oder Plazentaentwicklung in Verbindung mit verminderten MIC-1-Niveaus sein. Das heißt, wenn abnormale Plazentaentwicklung durch Nachweis verminderter MIC-1-Niveaus bestimmt wird, kann dies indikativ für eine frühe Induktion von Wehen sein, da für den Fötus ein Risiko besteht, wenn sich die Plazenta nicht normal entwickelt und wächst.
Das erfolgreiche Feststellen des Risikos einer Fehlgeburt und/oder Frühgeburt bei schwangeren Frauen ermöglicht die Anwendung präventativer Therapien und anderer Maßnahmen (z. B. Ruhe, verbesserte Ernährung usw.).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann der Nachweis verminderter oder erhöhter MIC-1-Mengen in einer Körperprobe einer schwangeren Testperson indikativ für einen Zustand sein, in dem ein erhöhtes Risiko fötaler Anomalien besteht.
Somit stellt in einem zweiten Aspekt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose fötaler Anomalien zur Verfügung, wobei das Verfahren umfasst:

(i) die Bestimmung der Menge an MIC-1, die in einer Körperprobe vorliegt, welche einer schwangeren Testperson mit bekanntem Gestationsalter entnommen wurde, und
(ii) den Vergleich der bestimmten Menge mit der Menge oder dem Mengenbereich, die/der in (einer) äquivalenten Körperprobe(n) von (einer) normalen schwangeren Person(en) mit einem Gestationsalter, welches im Wesentlichen äquivalent zu dem bekannten Gestationsalter der Testperson ist, vorliegt.

Die Menge an MIC-1, welche in einer Körperprobe vorliegt, kann leicht bestimmt werden, beispielsweise durch Immunoassays oder Immunohistochemie (z. B. mit Schnitten von Gewebebiopsien) unter Verwendung von Antikörpern (monoklonal oder polyklonal) oder Fragmenten davon, die gegen MIC-1 gerichtet sind. Anti-MIC-1-Antikörper und Fragmente davon können durch beliebige auf dem Gebiet bekannte Verfahren hergestellt werden.
Bevorzugte Körperproben zur Verwendung in dem Verfahren des ersten Aspekts sind Proben aus Vollblut, Serum, Plasma und Urin. Ebenso können Gewebebiopsien geeignet sein.
Die DNA- und Aminosäuresequenzen des humanen MIC-1 (d. h. "Wildtyp") und der Variante Asp²⁰²-MIC-1 sind in 1 dargestellt.
Die Ausdrücke "umfassen", "umfasst" und "umfassend", wie sie in der Beschreibung verwendet werden, bezeichnen den Einschluss eines bestimmten Schritts, einer Komponente oder eines Merkmals oder einer Gruppe von Schritten, Komponenten oder Merkmalen, mit oder ohne Einschluss eines weiteren Schrittes, einer weiteren Komponente oder eines weiteren Merkmals oder einer Gruppe von Schritten, Komponenten oder Merkmalen.
Die Erfindung wird im Folgenden mit Bezug auf die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele und angefügten Figuren beschrieben.
Kurze Beschreibung der angefügten Figuren
In 1 sind die Aminosäuresequenzen (A) und DNA-Sequenzen (B) des humanen MIC-1 und der Variante Asp²⁰²-MIC-1 dargestellt.
2 stellt eine Grafik dar, welche die Sensitivität von Schaf- und Maus-Anti-MIC-1-Antiseren zeigt. Die Platten wurden mit 1,8 ng rhMIC-1,2 ng rhTGF-β1 oder Beschichtungspuffer allein beschichtet. Der Kulturüberstand, welcher einen monoklonalen Anti-MIC-1-Maus-Antikörper (MAb) enthält, Kulturmedien, welche durch die Maus-Myelom-Zelllinie SP2/0 konditioniert wurden, nicht-konditionierte Kulturmedien (DMEM + Nutridoma) und Antikörper-Verdünnungsmittel (AB dil) wurden unverdünnt untersucht, während IgG-angereichertes normales Schafserum und der po lyklonale Schaf-Antikörper 233-P 1:500.000 in Ab dil verdünnt wurden. Maus-IgG1 wurde mit 20 ng/ml untersucht.
In 3 ist eine rekombinante humane MIC-1-Standardkurve dargestellt, welche durch einen Sandwich-ELISA unter Verwendung des Anti-MIC-1-MAb zum Abfangen ("capture") und des polyklonalen Schaf-Antikörpers 23383-P zur Detektion erzeugt wurde.
In 4 sind die Ergebnisse der Experimente dargestellt, aus denen hervorgeht, dass MIC-1 in maternalem Serum und in Fruchtwasser während der Schwangerschaft in Frauen vorliegt.

(A) Bestimmung der MIC-1-Konzentrationen in gepooltem normalem humanem Serum (NHS), gepooltem maternalem Serum aus verschiedenen Stadien und gepooltem Fruchtwasser (amniotischer Flüssigkeit, AF), wie durch Sandwich-ELISA bestimmt.
(B) Immmunopräzipitation und Western-Blot-Analyse von MIC-1 in gepooltem normalem humanem Serum (Spur 1), gepooltem maternalem Serum aus verschiedenen Stadien (Spuren 2–4) und gepooltem Fruchtwasser (Spur 5).

5 zeigt die maternalen MIC-1-Konzentrationen im Serum von vier schwangeren Frauen von der 30. Schwangerschaftswoche an bis zur Geburt, wie durch Sandwich-ELISA bestimmt.
6 zeigt die Ergebnisse der Messungen der MIC-1-Konzentrationen in fünf verschiedenen humanen Plazentaextraken, wie durch Sandwich-ELISA bestimmt.
7 zeigt die Ergebnisse des Experiments, welches durchgeführt wurde, um MIC-1-Expression und -Sekretion durch die humane Trophoblasten-Zelllinie BeWo zu bestimmen.

(A) MIC-1-Sekretion durch BeWo-Zellen nach 1 und 5 Tagen in Kultur, wie durch Sandwich-ELISA bestimmt.
(B) Immunopräzipitation und Western-Blot-Analyse von sekretiertem MIC-1 durch BeWo-Zellen. Spur 1, nicht konditionierte Kulturmedien; Spur 2, Kulturmedien, welche durch BeWo-Zellen über 5 Tage konditioniert wurden.
(C) Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion(RT-PCR)-Analyse der MIC-1-Expression durch nicht stimulierte BeWo-Zellen. Spur 1, RT-PCR an Gesamt-RNA aus BeWo-Zellen, die 24 Stunden kultiviert wurden; Spur 2, negative Kontrolle (keine Gesamt-RNA); Spur 3, positive PCR-Kontrolle.

8 zeigt eine typische Standardkurve eines MIC-Sandwich-ELISA (rhMIC-1 1.000–7,8 pg/ml, d. h., 8 verdoppelnde Verdünnungen).
Beispiel 1: Bestimmung der MIC-1-Expression in schwangeren Frauen
METHODEN:
Serum- und Fruchtwasserproben:
Die Serumproben wurden von 22 gesunden schwangeren Frauen mit einer normalen Einzelschwangerschaft erhalten. Bei keiner der untersuchten Personen wurde eine Medikation vorgenommen. In jedem Fall wurde das Gestationsalter durch einen frühen Schwangerschafts-Ultraschall-Scan bestimmt. Alle Frauen hatten nachfolgend zum Termin (37.–41. Woche) eine normale vaginale Entbindung eines gesunden, normal entwickelten Säuglings. Die Serumproben wurden von 6 Frauen zwischen der 10. und 14. Schwangerschaftswoche und von 8 Frauen zwischen der 26. und 30. Schwangerschaftswoche und der 37. und 40. Schwangerschaftswoche gewonnen. Die angegebenen Zeiträume entsprechen dem Ende jedes Trimesters. Die Proben, die jedem Trimester entsprachen, wurden vor der Messung der MIC-1-Niveaus gepoolt. Ebenso wurden serielle Serumproben ungefähr wöchentlich von 4 Frauen von der 30. Schwangerschaftswoche an bis zur Entbindung genommen. Wiederum waren alle vier Frauen gesund mit einer normalen Einzelschwangerschaft und hatten zum Termin eine normale vaginale Entbindung eines normalen gesunden Säuglings. Außerdem wurde Fruchtwasser von 10 Frauen erhalten, welche einer Amniozentese in der 15. bis 17. Schwangerschaftswoche zur fötalen Karyotypisierung unterzogen worden waren. In allen Fällen bestand die Indikation für eine Karyotypisierung in dem fortgeschrittenen Alter der Mutter (> 37 Jahre). Das Fruchtwasser wurde ebenso vor der Messung der MIC-1-Niveaus gepoolt.
Plazentaextrakte:
100 bis 150 mg Plazentagewebe (4- bis 5-mal in Salzlösung gespült und in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80°C gelagert) wurde in 1 M Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) homogenisiert. Die Homogenisate wurden bei 10.000 rpm 30 Sekunden zentrifugiert, und der Überstand wurde in Röhrchen überführt. Das Gesamtprotein wurde durch einen BCA-Gesamtprotein-Assay (Pierce) gemäß den Anweisungen des Herstellers gemessen. Die BSA-Lösungen in einem Bereich von 0–1.000 μg/ml wurden als Standard-Lösungen verwendet.
BeWo-Zellkultur:
Die humane Choriokarzinom-Trophoblasten-Zelllinie (BeWo) wurde von ATCC (Rockville, MD) bezogen. Die Zellen wurden in 96-Kammer-Gewebekulturplatten mit 5.000 Zellen pro Kammer in 250 μl Dulbeccosche Modifikation des Eagleschen Medium (DMEM) (Gibco BRL), enthaltend 4,5 g/l D-Glucose, 110 mg/l Natriumpyruvat, 0,584 g/l L-Glutamin, 4 mg/l Pyridoxinhydrochlorid und 1 × Nutridoma-SR (Boehringer Mannheim, Deutschland), ausgesät und bei 37°C in Gegenwart von 5% Kohlenstoffdioxid für 1 bis 5 Tage kultiviert. Anschließend wurden die Kulturplatten bei 1.000 rpm 10 Minuten zentrifugiert; der Überstand wurde entfernt und bei –20°C bis zur Quantifizierung von MIC-1 gelagert.
Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion(RT-PCR)-Analyse der MIC-1-mRNA-Synthese:
Es wurde Gesamt-RNA aus BeWo-Zell-Monolagern in 96-Kammer-Platten unter Verwendung von Tri-Pure-Reagenz (Roche) und Anwendung des durch den Hersteller bereitgestellten Verfahrens isoliert. Die reverse Transkription (RT) wurde in einem Gesamt-Reaktionsvolumen von 20 μl unter Verwendung von 1 μg RNA, einem Poly(T)₁₅-Primer und 50 Units "Expand Reverse Transcriptase" (Roche) unter den vom Hersteller empfohlenen Bedingungen durchgeführt. Ein 5-μl-Aliquot der RT-Reaktion wurde in einer PCR-Reaktion unter Verwendung von Pfu-Polymerase (Promega) und der Primer
welche das einzige Intron von MIC-1 flankieren, amplifiziert. Die PCR-Bedingungen waren folgendermaßen: ein anfänglicher Denaturierungsschritt bei 95°C für 1 Minute, gefolgt von 35 Zyklen, bestehend aus 30 Sekunden bei 95°C, 30 Sekunden bei 60°C, 2 Minuten bei 72°C. Eine RT-Reaktion, in der die RNA weggelassen wurde, wurde als negative Kontrolle eingesetzt, während ein Plasmid, welches die MIC-1-Prä-Pro-MIC/FLAG-kodierende Sequenz trug (Bottcov et al., 1997), als positive Kontrolle eingesetzt wurde. Die PCR-Produkte wurden auf 0,8%igen (w/v) Agarosegelen aufgetrennt.
Erzeugung von MIC-1-Antikörpern:
Ein polyklonaler Schaf-Anti-MIC-1-Antikörper (PAb) 233B3 wurde durch Immunisierung mit rekombinantem humanem MIC-1 (rhMIC-1), welches in Übereinstimmung mit dem in der Internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 97/00958 beschriebenen Verfahren synthetisiert worden war, in Freud'schem Komplett-Adjuvanz erzeugt. Zusätzliche Wiederholungsimpfungen ("boosts") wurden über einen Zeitraum von 6 Monaten gegeben; den Schafen wurde 10 Tage nach der letzten Injektion Blut entnommen. Eine angereicherte IgG-Fraktion von normalem Schafserum und 233B3 wurden durch Caprylsäure-Präzipitation und anschließende Ammoniumsulfat-Präzipitation hergestellt. Die mit IgG angereicherte 233B3-Fraktion wurde als 233-P bezeichnet.
Ein den monoklonalen Maus-Anti-MIC-1-Antikörper (MAb) sekretierendes Hybridom wurde von Mäusen, die mit rhMIC-1 immunisiert wurden, erzeugt. Die Hybridome wurde in DMEM (Gibco BRL), enthaltend 4,5 g/l D-Glucose, 110 mg/l Natriumpyruvat, 0,584 g/l L-Glutamin, 4 mg/l Pyridoxinhydrochlorid, supplementiert mit 20% FCS (CSL, Melbourne), kultiviert. Zur MAb-Gewinnung wurden die Hybridome für 7 Tage in frisches DMEM-Hi-Glucose, supplementiert mit Nutridoma-SR (Boehringer Mannheim), überführt. Die Kulturüberstände wurden bei 2.000 rpm für 10 Minuten zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu entfernen, und bis zur Verwendung eingefroren. Die Sensitivität der PAb- und MAb-Präparationen wurde durch direkten ELISA untersucht.
Direkter ELISA:
96-Kammer-Maxisorp-ELISA-Platten (Nunc) wurden entweder mit 18 ng/ml rhMIC-1 oder 20 ng/ml rhTGF-β1 (R&D Systems) in Beschichtungspuffer (0,1 M Carbonat in destilliertem H₂O, pH 9,4–9,8) bei 40°C für 24 Stunden beschichtet (100 μl/Kammer). Die Platten wurden dann dreimal mit 300 μl Waschpuffer (PBS, enthaltend 0,05% (v/v) Tween-20 (Sigma)) gewaschen; die nicht spezifische Bindung wurde mit 250 μl 1% (w/v) BSA (Boehringer Mannheim) in PBS für 2 Stunden bei 37°C geblockt. Dann wurden Serum-freie Hybridoma-Medien, enthaltend den Anti-MIC-1-MAb, Schaf-PAb 233B3-P, verdünnt 1:500.000 in Antikörper-Verdünnungsmittel (PBS, enthaltend 1% (w/v) BSA und 0,05% (v/v) Tween-20), Kulturmedien, welche durch die Maus-Myelom-Zelllinie SP2/0 konditioniert wurden, DMEM + Nutridoma, Immunoglobin-G-angereichertes normales Schafserum, verdünnt 1:500.000 in Antikörper-Verdünnungsmittel, 200 ng/ml Maus-IgG1 (R&D Systems) in DMEM + Nutri doma, oder Antikörper-Verdünnungsmittel allein zu den Platten (100 μl/Kammer) gegeben und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden dreimal gewaschen; anschließend wurden 100 μl/Kammer biotinyliertes Esel-Anti-Schaf-IgG (Jackson Immunoresearch) oder biotinyliertes Ziegen-Anti-Maus-IgG (Jackson Immunoresearch), verdünnt 1:10.000 in Antikörper-Verdünnungsmittel, zugegeben und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden dreimal gewaschen, und es wurden 100 μl/Kammer Meerrettich-Peroxidase-konjugiertes Streptavidin (Genzyme), verdünnt 1:2.000 in Antikörper-Verdünnungsmittel, zu den Platten gegeben und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden viermal gewaschen, anschließend wurden 100 ml/Kammer Peroxidase-Substrat (1 mg/ml o-Phenylendiamindihydrochlorid (Sigma) in 0,05 M Phosphat-Zitratpuffer, enthaltend 0,014% H₂O₂, pH 5,0 (Sigma)) zugegeben. Die Farbentwicklung wurde für 5–15 Minuten durchgeführt und durch Zugabe von 100 μl/Kammer 4N H₂SO₄ beendet. Die Absorption wurde bei 490 nm in einem Mikroplatten-Lesegerät (Pasteur Diagnostics) gemessen.
MIC-1-Sandwich-ELISA:
Ein MIC-1-Sandwich-ELISA wurde unter Verwendung des Anti-MIC-1-Maus-MAb zum Abfangen ("capture") des Antigens und des Schaf-PAb 233-P zur Detektion etabliert. Die optimale Konzentration beider Antikörper wurde empirisch bestimmt und dann für alle nachfolgenden Studien verwendet. 96-Kammer-Maxisorp-ELISA-Platten wurden mit Anti-MIC-1-MAb-Oberstand, verdünnt 1:5 in Beschichtungspuffer (die Immunoglobin-Endkonzentration betrug ungefähr 20 ng/ml), bei 40°C für 24 Stunden beschichtet. Die Platten wurden dann dreimal mit 300 μl Waschpuffer gewaschen; die nicht-spezifische Bindung wurde mit 250 μl 1% (w/v) BSA in PBS für 2 Stunden bei 37°C geblockt. Dann wurden rhMIC-1-Standards, Gewebekultur-Überstand, maternales Serum, Plazentaextrakte oder Fruchtwasser, verdünnt in Antikörper-Verdünnungsmittel, zu den Platten gegeben (100 μl/Kammer) und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden dreimal gewaschen, anschließend wurden 100 μl/Kammer des Schaf-PAb 233-P, verdünnt 1:5.000 in Antikörper-Verdünnungsmittel, zugegeben und für 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden dann dreimal gewaschen; anschließend wurden 100 μl/Kammer biotinyliertes Esel-Anti-Schaf-IgG, verdünnt auf 1:5.000 in Antikörper-Verdünnungsmittel, zugegeben und für eine Stunde bei 37°C inkubiert. Die Platten wurden dann wie bei dem direkten ELISA entwickelt. Die Konzentration an hMIC-1 in den Proben wurde durch Vergleich mit der rhMIC-1-Standardkurve bestimmt. Das Niveau von rhMIC-1 in dieser Standardkurve wurde auf der Grundlage des Gesamtproteingehalts bestimmt und unterliegt somit als absolute Menge einem signifikanten Fehler. Da jedoch die gleichen Standards durchgängig verwendet wurden, macht dies keinen Unterschied in Bezug auf die in diesem Beispiel geschätzten, relativen Werte. Sämtliche Proben wurden dreifach in wenigstens zweifacher Ausführung untersucht. Die Ergebnisse sind als Mittel +/– SA dargestellt. Die Sensitivität des MIC-1-Sandwich-Assays wurde durch Testen mit Mengen bis zu 500 pg/ml an TGF-β1 und Inhibin-A (welche beide Mitglieder der TGF-β-Superfamilie sind) beurteilt.
Immunopräzipitation:
Die Immunopräzipitation wurde unter Verwendung von 0,2 ml serumfreien Hybridom-Medien, enthaltend den Anti-MIC-1-MAb adsorbiert an Protein-A-Sepharose, durchgeführt. Serum- und Mediumproben (1 ml) wurden mit diesen Antikörpern über Nacht bei 40°C inkubiert; dann wurde 5-mal mit PBS, enthaltend 1% (v/v) Triton X-100, gewaschen. Die gebundenen Proteine wurden unter Verwendung von nicht-reduzierendem Natriumdodecylsulfat(SDS)-Probenpuffer eluiert und durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) (Laemmli, 1970) analysiert; anschließend wurde eine Immunoblot-Analyse mit dem polyklonalen Schaf-Antikörper 233-P durchgeführt. Die Immunoblot-Analyse wurde im Wesentlichen wie von Bootcov et al. (1997) beschrieben durchgeführt, mit dem Unterschied, dass polyklonaler Antikörper 233-P als primärer Antikörper mit einer Verdünnung von 1:7.000 verwendet wurde, und der sekundäre Antikörper Esel-Anti-Schaf-IgG-Biotin mit einer Verdünnung von 1:5.000 war.
ERGEBNISSE:
Sensitivität der Anti-MIC-1-PAb und -MAb:
Die Fähigkeit des Schaf-PAb 233-P und des Maus-MAb, rhMIC-1 zu binden, wurde durch direkten ELISA untersucht. Es stellte sich heraus, dass sowohl der unverdünnte, den MAb enthaltende Gewebekulturüberstand als auch der Schaf-PAb 233-P mit einer Verdünnung von 1:500.000 in dem Antikörper-Verdünnungsmittel stark an 1,8 ng immobilisiertes rhMIC-1 binden (2). Weder die durch die Maus-Myelom-Zelllinie SP2/0 konditionierten Kulturmedien, nicht-konditionierte Kulturme dien, Maus-IgG1, Immunoglobin-angereichertes normales Schafserum, noch Antikörper-Verdünnungsmittel reagierten mit rbMIC-1. Bei allen untersuchten Proben wurde eine minimale Hintergrundbindung an nicht beschichtete Kammern beobachtet. Keine Reaktivität wurde nachgewiesen, wenn der Anti-MIC-1-MAb oder der polyklonale Antikörper 233-P mit immobilisiertem rhTGF-β1 inkubiert wurden.
MIC-1-Sandwich-ELISA:
Es wurde ein Sandwich-ELISA, welcher den Anti-MIC-1-MAb und den PAb 233-P verwendete, etabliert, mit dem rhMIC-1 in einem Bereich von 10–500 pg/ml genau quantifiziert werden konnte (3). Um die Wirkung von in humanem Serum und Kulturmedien vorliegenden Faktoren auf die Bewertung dieses Cytokins zu untersuchen, wurden 500 pg/ml rhMIC-1 zum Antikörper-Verdünnungsmittel, enthaltend entweder 10% (v/v) normales humanes Serum oder 10% (v/v) DMEM + Nutridoma, gegeben und anschließend quantifiziert. Es stellte sich heraus, dass der Sandwich-ELISA auf 5% des tatsächlichen Werts genau war. Die Variation von Lauf zu Lauf betrug weniger als 5%. In einem Sandwich-ELISA mit TGF-β1 und Inhibin-A wurde keine Kreuzreaktion mit diesen strukturell verwandten Cytokinen beobachtet.
MIC-1-Niveaus in maternalen Schwangerschaftsseren aus verschiedenen Stadien steigen während der Schwangerschaft an:
Gepoolte Serumproben wurden vor der Quantifizierung von MIC-1 durch Sandwich-ELISA 1:5 bis 1:20 in Antikörper-Verdünnungsmittel verdünnt. Es wurde bestimmt, dass gepoolte normale humane Seren ungefähr 0,36 (+/–0,04) ng/ml MIC-1 enthalten (4A). Es stellte sich heraus, dass in gepooltem maternalem Serum die MIC-1-Konzentration während der Schwangerschaft dramatisch ansteigt. Maternale Serumproben, welche dem ersten Trimester entsprachen, enthielten ungefähr 6,3 (+/–0,02) ng/ml MIC-1, welches während des zweiten Trimesters auf 12,24 (+/–0,54) ng/ml anstieg und im dritten Trimester mit 15,3 (+/–1,31) ng/ml einen Höhepunkt erreichte.
Immunopräzipitation wurde eingesetzt, um die Anwesenheit von MIC-1 in gepoolten maternalen Serumproben während der Schwangerschaft zu bestätigen. MIC-1 wurde durch Immunopräzipitation mit dem Anti-MIC-1-MAb und anschließende Immunoblot-Analyse mit dem PAb 233B3-P visualisiert. Eine Bande, welche dem durch Disulfidbrücken verbundenen reifen MIC-1-Peptid entspricht (ungefähr 25 kDa) kann in Serumproben aus dem zweiten und dritten Trimester der Schwangerschaft beobachtet werden (4B, Spuren 3–4). Die höchsten Niveaus an MIC-1 wurden in der Probe aus dem dritten Trimester gefunden. Aufgrund der geringeren Sensitivität der Immunoblot-Analyse wurden keine ähnlichen Banden in normalem Serum oder der Probe, die dem ersten Trimester entsprach, beobachtet (4B, Spuren 1–2).
MIC-1-Konzentrationen in maternalem Serum wurden ebenso in seriellen Proben aus vier schwangeren Frauen untersucht. In der 30. Schwangerschaftswoche enthielt das Serum von allen vier untersuchten Frauen ungefähr 4 ng/ml MIC-1 (5). Es stellte sich heraus, dass die MIC-1-Niveaus in maternalem Serum von der 30. Schwangerschaftswoche bis zur Geburt ansteigen. Die als MH und JB bezeichneten Personen wiesen eine leichte Abnahme der MIC-1-Niveaus in maternalem Serum in der letzten Schwangerschaftswoche auf.
MIC-1-kann in Fruchtwasser nachgewiesen werden:
Zusätzlich zu dem maternalen Serum wurde Fruchtwasser, welches von 10 Frauen während des zweiten Trimesters zu Karyotypisierungszwecken gewonnen worden war, gepoolt und die MIC-1-Niveaus durch Sandwich-ELISA quantifiziert. Es wurde bestimmt, dass die gepoolte Fruchtwasserprobe ungefähr 13,68 (+/–0,16) ng/ml MIC-1 enthielt (4A). Immunopräzipitation und Western-Blot-Analyse des gepoolten Fruchtwasser zeigte eine Bande von ungefähr 25 kDa, welche dem durch Disulfidbrücken verbundenen reifen MIC-1-Peptid entspricht (4B, Spur 5).
MIC-1 kann in humanen Plazentaextrakten nachgewiesen werden:
Um zu testen, ob die Plazenta eine Hauptquelle des zirkulierenden MIC-1 im Serum schwangerer Frauen darstellt, wurden 5 humane Plazentaextrakte auf die Anwesenheit von MIC-1 durch Sandwich-ELISA untersucht. Alle fünf Proben stellten sich als positiv für MIC-1 heraus (6), wobei die Konzentration 5,04–54 ng/ml betrug. Bezeichnenderweise enthielt die als PL2 bezeichnete Probe, die als einzige von einer Frühgeburt stammte, sehr viel geringere Niveaus an MIC-1 als die anderen Proben.
Kultivierte BeWo-Zellen exprimieren konstitutiv MIC-1-RNA und sekretieren reifes MIC-1:
Da hohe Niveaus an MIC-1 in Plazentaextrakten nachgewiesen wurden, schien es wahrscheinlich, dass die Plazenta-Trophoblasten-Zelllinie BeWo ebenso dieses Cytokin produziert. Aus diesem Grund wurde eine Untersuchung der Gewebekulturmedien, welche durch BeWo-Zellen unter ruhenden Bedingungen konditioniert wur den, im Hinblick auf das Vorhandensein sekretierten MIC-1 durch Sandwich-ELISA durchgeführt. Es wurde bestimmt, dass die Medien, welche für 24 Stunden zur Kultivierung der BeWo-Zellen verwendet wurden, ungefähr 21,6 (+/–2,95) ng/ml MIC-1 enthielten (7A). Die Konzentration an MIC-1 in den Kulturmedien nach 5-tägiger Inkubation stieg auf ungefähr 117 (+/–7,2) ng/ml an. Die Fähigkeit der nicht stimulierten BeWo-Zellen, MIC-1 zu sekretieren, wurde ebenso durch Immunopräzipitation und Western-Blot-Analyse untersucht. Es wurden hohe Niveaus an sekretiertem reifem MIC-1, wie durch eine Bande bei ungefähr 25 kDa angezeigt wird, in Medien, welche 5 Tage lang durch BeWo-Zellen konditioniert wurden, beobachtet (7B). Es wurden zusätzliche Banden, welche bei 55 kDa und 12,5 kDa migrierten, beobachtet, welche unvollständig prozessiertes MIC-1-Hemidimer bzw. -Monomer darstellen könnten. Kulturmedien, welche keinen BeWo-Zellen ausgesetzt worden waren, enthielten kein nachweisbares MIC-1, wenn sie durch Sandwich-ELISA oder durch Immunopräzipitation untersucht wurden.
RT-PCR wurde eingesetzt, um die Anwesenheit des MIC-1-Transkripts in nicht stimulierten BeWo-Zellen zu untersuchen. Es wurde Gesamt-RNA von BeWo-Zellen, die für 24 Stunden kultiviert worden waren, extrahiert und einer RT-PCR, wie beschrieben, unterworfen. Es wurde ein einziges Produkt von 0,4 kbp beobachtet, was darauf hinweist, dass das MIC-1-Transkript in den BeWo-Zellen vorlag (7C). In Abwesenheit von BeWo oder Plasmid-DNA wurde kein Produkt nachgewiesen.
DISKUSSION:
Die Ergebnisse von Beispiel 1 zeigen, dass MIC-1 in großen Mengen in materalen Seren vorliegt, und dass die Niveaus mit zunehmender Dauer der Schwangerschaft wesentlich ansteigen.
Obwohl erhöhte Niveaus an MIC-1 in maternalem Serum während der Schwangerschaft auftreten, bedeutet dies nicht notwendigerweise, dass der sich entwickelnde Fötus diesem Cytokin ausgesetzt ist. Der Nachweis von MIC-1 in Fruchtwasser liefert jedoch den direkten Beweis für fötale Exposition. Das Niveau an MIC-1 in Fruchtwasser war vergleichbar mit dem in maternalem Serum aus dem zweiten und dritten Trimester und lag deutlich über dem, welches in normalem humanem Serum vorliegt. Während der Schwangerschaft nimmt der Fötus große Mengen an Fruchtwasser auf und kann ebenso Fruchtwasser über die dünne fötale Epidermis absor bieren. Diese Ergebnisse liefern somit einen starken Hinweis darauf, dass der sich entwickelnde Fötus hohen Konzentrationen an MIC-1 ausgesetzt ist.
Um zu untersuchen, ob das MIC-1 in maternalem Serum und Fruchtwasser aus einer fötalen oder maternalen Quelle stammt, wurde MIC-1 in humanen Plazentaextrakten gemessen, wobei sich herausstellte, dass diese große Mengen an MIC-1-Protein enthalten. Interessanterweise war die Menge an MIC-1, welches in vier der fünf Plazentaextrakte vorlag (> 18 ng/ml) höher als die Menge, die in gepooltem maternalem Serum und Fruchtwasser nachgewiesen wurde. Unter Anwendung von Immunohistochemie und In-Situ-Hybridisierung wurde gezeigt, dass das MIC-1-Transkript und -Protein in den terminalen Plazentazotten vorliegen (Paralkar et al., 1998), einer Struktur, die reich an Syncitiotrophoblasten ist. Es wird somit davon ausgegangen, dass die humane Trophoblasten-Zelllinie BeWo dieses Cytokin synthetisieren und sekretieren kann. Die BeWo-Zellen exprimieren das MIC-1-Transkript konstitutiv und sekretieren große Mengen an MIC-1 unter ruhenden Bedingungen. Diese Ergebnisse weisen darauf hin, dass die Trophoblasten-Zellen innerhalb der Plazenta eine Hauptquelle für das im maternalen Serum und Fruchtwasser vorliegende MIC-1 darstellen. Jedoch weist die Lokalisierung des MIC-1-Transkripts und -Proteins in der sich entwickelnden Epidermis an Tag 18 in Rattenembryos (Paralkar et al., 1998) darauf hin, dass das Embryo ebenso zu den beobachteten MIC-1-Niveaus beitragen könnte.
Die genaue Rolle von MIC-1 während der Schwangerschaft ist unbekannt. Auf der Grundlage der oben beschriebenen Ergebnisse und an anderer Stelle veröffentlichter Untersuchungen scheint jedoch MIC-1 eine immunomodulatorische Rolle während der Schwangerschaft zuzukommen. Beispielsweise wurde kürzlich beschrieben, dass rhMIC-1 die Freisetzung pro-inflammatorischer Cytokine aus LPS-aktivierten Makrophagen inhibiert (Bootcov et al., 1997). Des Weiteren ist bekannt, dass MIC-1 die Bildung von Erythrocyten- und Granulocyten/Makrophagen-Zelllinien aus normalen humanen nicht-adhärenten, T-Zell-depletierten Knochenmarkzellen unterdrückt (Hromas et al., 1997). Diese Ergebnisse zeigen, dass MIC-1 ein weitreichender Inhibitor von Entzündung ist, wobei sowohl die Entwicklung der Monocyten/Makrophagen-Linie als auch ihre Fähigkeit, pro-inflammatorische Mediatoren zu produzieren, unterdrückt werden.
Intrauterine Entzündung in Verbindung mit pro-inflammatorischer Cytokin-Produktion wurde mit Abstoßung des Fötus oder vorzeitigen Wehen in Verbindung gebracht (Romero et al., 1992; Hillier et al., 1993; Opsjon et al., 1993). In diesem Zusammenhang nehmen die gegenwärtigen Anmelder an, dass das in der Plazenta und im Fruchtwasser vorliegende MIC-1 die Schwangerschaft aufrechterhält, indem die Produktion pro-inflammatorischer Cytokine innerhalb des Uterus unterdrückt wird. Das Ergebnis des vorliegenden Beispiels, dass Plazentaextrakte, die von einem Fall vorzeitiger Wehen stammen, verminderte Konzentrationen an MIC-1 im Vergleich zu Fällen normaler Schwangerschaften enthielten, unterstützt stark diese Annahme.
Beispiel 2: Detektion einer MIC-1-Variante und Genotypisierung durch Immunoassay
Bei der Klonierung von MIC-1 wurde realisiert, dass zumindest zwei Allele dieses Cytonkins aus der TGF--Superfamilie existieren. Eine nachfolgende Untersuchung menschlichen Materials bestätigte, dass die zwei Allele in der allgemeinen Bevölkerung vorliegen. Diese zwei Allele unterscheiden sich durch eine Punktmutation, die zu einem Austausch von Histidin an Position 6 der Aminosäuresequenz des reifen normalen oder "Wildtyp"-MIC-1 (H6) durch Asparaginsäure an Position 6 (D6) führt. Dies stellt eine nicht konservative Substitution einer schwach basischen, aromatischen Aminosäure zu einer stark acidischen, azyklischen Aminosäure dar.
METHODEN UND ERGEBNISSE:
Erzeugung von Anti-MIC-1-Antikörpern:
Es wurden monoklonale Anti-MIC-1-Antikörper (MAb) sekretierende Hybridome von Mäusen erzeugt, die mit rekombinantem humanem MIC-1 (rhMIC-1), welches in Hefe (Pichia pastoris) gemäß dem in der Internationalen Patentveröffentlichung Nr. WO 97/00958 beschriebenen Verfahren erzeugt worden war, immunisiert wurden. Die Hybridome wurden in DMEM (Gibco BRL), enthaltend 4,5 g/l D-Glucose, 110 mg/l Natriumpyruvat, 0,584 g/l L-Glutamin, 4 mg/l Pyridoxinhydrochlorid, supplementiert mit 20% FCS (CSL, Meldbourne), kultiviert. Zur MAb-Gewinnung wurden die Hybridome für 7 Tage in frisches DMEM-Hi-Glucose, supplementiert mit Nutridoma-SR (Boehringer Mannheim), überführt. Die Kulturüberstände wurden bei 2.000 rpm 10 Minuten zentrifugiert, um die Zelltrümmer zu entfernen und bis zur Verwendung eingefroren.
Die gewonnenen MAbs wurden Epitopkartierungssstudien unter Verwendung von Western-Blut-Analyse einer ausgedehnten Gruppe von MIC-1-Verwandten, -Mutanten und -Chimären unterzogen. Keiner der MAbs konnte mit dem murinen Homologen von MIC-1 oder mit hTGF-β1 kreuzreagieren, und alle MAb-Epitope waren konformationsabhängig. Es wurde ein bestimmtes Kreuz-Reaktivitäts-Muster mit den verschiedenen Antigenen bei sämtlichen MAbs beobachtet, was auf die Anwesenheit von wenigstens fünf immunogenen Regionen auf der MIC-1-Oberfläche hinweist. Zwei der MAbs (13C4H3 und 26G6H6) wurden für weitere Studien auf der Grundlage ihrer hohen Affinitäten (jeweils mit ED50-Werten im Bereich von 1,3–2,5 × 10^–9 M) ausgewählt.
Es stellte sich heraus, dass MAb 13C4H3 an den Aminoterminus (Positionen 1–13) des reifen humanen Wildtyp-MIC-1 (d. h., mit Histidin an Position 6) mit signifikant größerer Affinität als bei dem entsprechenden Epitop Asp²⁰²-MIC-1 bindet und somit in der Lage ist, zwischen dem humanen Wildtyp-MIC-1 und Asp²⁰²-MIC-1 zu unterscheiden. Da MAb 13C4H3 nicht in der Lage war, eine murin-humane MIC-1-Chimäre zu erkennen (in der sämtliche Aminosäuren des Aminoterminus (1–13), welche sich von der humanen Sequenz unterscheiden, durch die entsprechenden Aminosäuren des humanen MIC-1 ersetzt wurden), wurde gefolgert, dass zusätzliche Reste außerhalb des Aminoterminus, welche in den humanen und Maus-Proteinen verschieden sind, möglicherweise eine Rolle spielen.
Es stellte sich heraus, das MAb 26G6H6 gegen ein Epitop gerichtet ist (welches Aminosäuren im Bereich der Positionen 24–37, 56–68 und 91–98 des reifen humanen Wildtyp-MIC-1 umfasst), welches in der Nähe der Spitzen der sogenannten "Finger" von MIC-1 lokalisiert ist. MAb 26G6H6 unterscheidet nicht zwischen MIC-1-Proteinen mit Histidin oder Asparaginsäure an Position 6.
Diese Antikörper ermöglichen somit den Nachweis von heterozygoten und homozygoten Individuen durch Messen gebundener MIC-1-Niveaus in Immunoassays. Das heißt, mit MAb 13C4H3 wäre eine maximale Bindung bei H6/H6-Homozygoten und keine Bindung mit D6/D6-Homozygoten zu erwarten, während ein dazwischen liegendes (z. B. 50%iges) Bindungsniveau bei H6/D6-Heterozygoten zu erwarten wäre.
Die Epitopbindungsspezifitäten der obigen Anti-MIC-1-Antikörper sind detailliert in Fairlie et al., 2001, beschrieben.
Bestimmung von Gesamt-MIC-1 unter Verwendung von 26G6H6:
ELISA-Platten (Maxisorb, Nunc) wurden 24 Stunden lang bei 4°C mit 80 μl 26G6H6, 1:500 in Bicarbonatpuffer pH 9,4–9,8, beschichtet, wobei darauf geachtet wurde, dass keine signifikante Verdampfung auftrat. Die Proben wurden, in Abhängigkeit der geschätzten MIC-1-Konzentration, 1:3–1:100 in Probenpuffer (1% w/v BSA (Progen), 0,05% v/v Tween (Sigma) in PBS, pH 7,2) verdünnt; ein MIC-1-"Standard", hergestellt durch Verdünnen von 1 μg/ml rhMIC-1 (in 1% BSA w/v, 3 mM HCl) wurde 1:1.000 in Probenpuffer verdünnt; anschließend wurden acht Doppelverdünnungen (1.000 pg/ml–7,8 pg/ml) hergestellt.
Die Assays wurden folgendermaßen durchgeführt:
Die beschichteten Platten wurden dreimal mit Waschpuffer (0,05% v/v Tween in PBS), 300 μl/Kammer, gewaschen. Das Blocken wurde durch Inkubation mit 250 μl 1% BSA w/v bei 21°C für 1 Stunde durchgeführt. Der Blockierungspuffer wurde dann entfernt, und es wurden ohne dazwischen liegenden Waschschritt 100 μl/Kammer Standards oder Proben für 1 Stunde bei 21°C zugegeben. Anschließend wurde der Nachweis-Antikörper, 233-P, 1:25.000 in Probenpuffer v/v zugegeben, 100 μl/Kammer, und für 16 Stunden bei 4°C inkubiert. Dann wurde biotinyliertes Esel-Anti-Schaf-IgG (Jacksons's Laborstories) 1:5.000 in Probenpuffer v/v, 100 μl/Kammer, zugegeben und für 1 Stunde bei 21°C inkubiert; anschließend wurde mit Streptavidin-HRP-Konjugat (Genzyme) 1:2.000 in Probenpuffer v/v, 100 μl/Kammer, für 30 Minuten bei 21°C inkubiert. Es wurde OPD (Sigma) 0,4 mg/ml in dem vom Hersteller empfohlenen Puffer mit 100 μl/Kammer inkubiert, bis eine deutliche Differenz zwischen dem 7,8-pg/ml-Standard und dem Null-Standard beobachtet wurde. Der 1.000-pg/ml-Standard sollte eine OD von wenigstens mehr als 1 aufweisen. Schließlich wurde die Reaktion mit 100 μl/Kammer 2N H₂SO₄ gestoppt.
Die Platten können bei 490 nm ausgelesen werden, und eine Standardkurve unter Verwendung einer Zwei-Bindungsstellen-Hyperbole konstruiert werden. Die Probenwerte werden aus dieser Kurve extrapoliert.
Die Platten wurden nach jedem Schritt von vor Zugabe des Nachweis-Antikörpers 233-P bis zur Zugabe von OPD mit 300 μl/Kammer Waschpuffer gewaschen.
Sensitivität und Spezifität des Anti-MIC-1-PAb und -MAb:
Die Fähigkeit des Schaf-PAb 233-P und des Maus-MAb 13C4H3, rhMIC-1 zu binden, wurde durch direkten ELISA untersucht. Es stellte sich heraus, dass sowohl unverdünnter Gewebekulturüberstand, enthaltend den MAb 13C4H3 als auch der/den Schaf-PAb 233-P mit einer Verdünnung von 1:500.000 in Antikörper-Verdünnungsmittel, stark an 1,8 ng immobilisiertes rhMIC-1 bindet. Keine Reaktion wurde zwischen rhMIC-1 und Kulturmedien, welche durch die Maus-Myelom-Zelllinie SP2/0 konditioniert wurden, nicht konditionierten Kulturmedien, Maus-IgG1, Immunoglobin-angereichertem normalem Schafserum oder Antikörper-Verdünnungsmittel beobachtet. Eine minimale Hintergrundbindung an nicht beschichtete Kammern wurde bei allen untersuchten Proben beobachtet. Es wurde keine Reaktivität nachgewiesen, wenn 13C4H3 oder 233-P mit immobilisiertem rhTGF-β1 inkubiert wurden.
Die Spezifität der Antikörper wurde durch Immunopräzipitation von gereinigtem rhMIC-1 mit MAb 13C4H4 und 26G6H6 und anschließende Immunoblot-Analyse mit verschiedenen MIC-1-spezifischen Antikörpern bestimmt. Sämtliche MIC-1-Antikörper erkannten spezifisch das 25-KD-große dimere MIC-1. Außerdem wurde ein Blocken der Antikörper durch Prä-Inkubation der Antikörper mit gereinigtem rhMIC-1 vor der Western-Blot-Analyse durchgeführt. Dadurch wurde die Interaktion des Antikörpers mit der MIC-1-spezifischen 25-kD-Bande deutlich reduziert, was die Spezifität der Antikörper MAb 13C4H4, 26G6H6 und 233-P bestätigt. Des Weiteren erkannten diese getesteten Antikörper nicht das Inhibin, ein weiteres Mitglied der TGF-β-Superfamilie. Eine typische Assay-Standardkurve ist in 10 dargestellt, wobei die Fehlerbalken eine Standardabweichung darstellen.
Bestimmung des MIC-1-Genotyps unter Verwendung von 13C4H4:
Eine höhere Affinität des Nachweis-Antikörpers 233-P zu einer Vielzahl von MIC-1-Epitopen im Vergleich zu 13C4H4 führte zu einem größeren Unterschied des nachgewiesenen MIC-1 zwischen den H6- und D6-Allelen. Dieser Unterschied ist eine Funktion der unterschiedlichen Affinitäten der H6- und D6-Epitope zu 13C4H4. Die Anwesenheit von 233-P führt bei einer langen Inkubation dazu, dass nach und nach weniger D6 an den "Capture"-Antikörper 13C4H4 gebunden wird. Diese, nun ungebundenen Moleküle werden nach und nach an die Komponenten des polyklonalen Antikörpers mit höherer Affinität, die spezifisch für die 13C4H4-Bindungsstelle sind, gebunden. Diese Moleküle sind nun vom messbaren MIC-1 ausgeschlossen.
Ebenso wird ein anderer Effekt beobachtet; und zwar, dass jedes MIC-1-Molekül, welches von der Bindung des Capture-Antikörpers ausgeschlossen ist, eine Vielzahl von 233-P-Antikörpern ausschließt. Dies geschieht, da 233-P polyklonal ist und an mehrere verschiedene Teile des MIC-1-Moleküls bindet. Das Ergebnis ist, dass diese Immunkomplexe zwischen MIC-1 und 233-P vom Assay ausgeschlossen werden. Da der 233-P-Antikörper hauptsächlich zu dem Hintergrund beiträgt, wird die beobachtete Differenz der MIC-1-Konzentration weiter vergrößert. Im Fall eines homozygoten D6/D6-Genotyps wird die Hintergrundfärbung reduziert bis zu dem Punkt, an dem ein Lesen unter Null über große Konzentrationsunterschiede erhalten wird. Im Fall des H6-Allels ist der Anteil von MIC-1, welches frei wird, um ausschließlich den polyklonalen Antikörper zu binden, sehr viel geringer, wodurch eine größere Differenz der beobachteten MIC-1-Konzentration erzeugt wird.
Die beiden enzymgekoppelten Immunadsorptions-Sandwich-Assays, die bei der Bestimmung der MIC-1-Konzentration und des MIC-1-Allels in einer bestimmten Probe eingesetzt werden, verwenden 26G6H6 bzw. 13C4H4 als Capture-Antikörper. Die analysierten Proben können aus Gewebekultur (Gewebekulturmedium oder Zellextrakt), humanem Serum oder Plasma oder einer beliebigen humanen Probe, die in flüssiger Phase vorliegt oder durch ein beliebiges Verfahren in eine Flüssigkeit überführt werden kann, stammen.
Die Assays verwendeten ELISA-Platten (Maxisorb, Nunc), die 24 Stunden lang bei 4°C mit 80 μl 13C4H4, 1:500 in Bicarbonatpuffer pH 9,4–9,8, beschichtet wurden (es sollte darauf geachtet werden, dass signifikante Verdampfung verhindert wird). Die Proben wurden, in Abhängigkeit der geschätzten MIC-1-Konzentration, welche bei dem 13C4H4-Assay bestimmt wurde, 1:3–1:100 in Probenpuffer (1% w/v BSA (Progen), 0,05% v/v Tween (Sigma) in PBS, pH 7,2) verdünnt. Die Probenkonzentration sollte zwischen 50 und 150 pg/ml liegen. Der MIC-1-Standard (1 μg/ml rekombinantes MIC-1 in 1% BSA w/v, 3 mM HCL) wurde 1:1.000 in Probenpuffer verdünnt; dann wurden acht Doppelverdünnungen durchgeführt (1.000 pg/ml–7,8 pg/ml).
Die Assays wurden folgendermaßen durchgeführt:
Die beschichteten Platten wurden dreimal mit Waschpuffer (0,05% v/v Tween in PBS), 300 μl/Kammer, gewaschen. Das Blocken wurde durch Inkubation mit 250 μl 1% BSA w/v bei 21°C für 1 Stunden durchgeführt. Der Blockierungs-Puffer wurde dann entfernt, und es wurden, ohne dazwischen liegenden Waschschritt, 100 μl/Kammer der Standards oder Proben für 1 Stunde bei 21°C zugegeben. Der Nachweis-Antikörper 233-P, 1:10.000 in Probenpuffer v/v, wurde mit 100 μl/Kammer zugegeben und für 16 Stunden bei 4°C inkubiert. Dann wurde biotinyliertes Esel- Anti-Schaf-IgG (Jackson's Laborstories), 1:5.000 in Probenpuffer v/v, 100 μl/Kammer, zugegeben und für 1 Stunde bei 21°C inkubiert; anschließend wurde mit Streptavidin-HRP-Konjugat (Genzyme), 1:2.000 in Probenpuffer v/v, 100 μl/Kammer, für 30 Minuten bei 21°C inkubiert. OPD (Sigma), 0,4 mg/ml in dem vom Hersteller empfohlenen Puffer, wurde mit 100 μl/Kammer inkubiert, bis ein deutlicher Unterschied zwischen dem 7,8-pg/ml-Standard und dem Null-Standard sichtbar wurde. Der 1.000-pg/ml-Standard sollte eine OD von wenigstens mehr als 1 aufweisen. Die Reaktion wurde mit 100 μl/Kammer 2 N H₂SO₄ gestoppt.
Die Platten wurden bei 490 nm ausgelesen, und es wurde eine Standardkurve unter Verwendung eines Zwei-Bindungsstellen-Hyperbolen-Modells erstellt. Die Probenwerte können aus dieser Kurve extrapoliert werden.
Die Platten wurden nach jedem Schritt vor Zugabe des Nachweis-Antikörpers 233-P bis zur Zugabe von OPD mit 300 μl/Kammer Waschpuffer gewaschen.
DISKUSSION:
Um das MIC-1-Allel zu bestimmen, wurde die beobachtete MIC-1-Konzentration, die aus dem 13C4H6-Assay erhalten wurde, durch die Gesamt-MIC-1-Konzentration, die in dem 26G6H6-Assay bestimmt wurde, geteilt. Die Schwellenwert("cut-off")-Verhältnisse für die verschiedenen Allele wurden durch homozygote H6/H6- und D- sowie heterozygote (HD) Kontrollen, die in beiden Assays eingesetzt wurden, bestimmt. Eine Validierung der Daten war, wie unten ausgeführt, inbegriffen.
Ein Verhältnis von weniger als 0 zeigt einen homozygoten D6/D6-Genotyp an, 0–0,6 ist heterozygot, und größer als 0,7 ist homozygot H6/H6. Es sei darauf hingewiesen, dass Verhältnisse größer als 1 vorliegen. Aufgrund der Dynamik des Assays im Hinblick auf das homozygozote D6/D6-Protein führen höhere Konzentrationen zu einem OD weiter unter Null.
Die von 38 gesunden ambulanten Labormitarbeitern erhaltenen Daten sind in Tabellenform dargestellt. Von diesen wurde der MIC-1-Genotyp durch DNA-Sequenzierung bestimmt. Es bestand eine 100%ige Übereinstimmung zwischen der DNA-Sequenz der 18 Personen und dem durch das ELISA-Verfahren bestimmten Genotyp. Es wurden weitere 95 Proben von 48 männlichen und 47 weiblichen gesunden Blutspendern mit einem Alter von 20–69 bzw. 17–71 Jahren analysiert.
Fünf Personen besaßen einen homozygoten D6/D6-Genotyp, 45 Personen einen heterozygoten Genotyp und 45 einen homozygoten H6/H6-Genotyp.
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Sequenzprotokoll

Claims

Verfahren zur Diagnose des Risikos einer Fehlgeburt und/oder einer Frühgeburt, wobei das Verfahren umfasst: (i) die Bestimmung der Menge an MIC-1, die in einer Körperprobe vorliegt, welche einer schwangeren Testperson mit bekanntem Gestationsalter entnommen wurde, und (ii) den Vergleich der bestimmten Menge mit der Menge oder dem Mengenbereich, die/der in (einer) äquivalenten Körperprobe(n) vorliegt, welche (einer) normalen schwangeren Person(en) mit einem Gestationsalter, welches äquivalent zu dem bekannten Gestationsalter der Testperson ist, entnommen wurde(n).
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Körperprobe ausgewählt ist aus Vollblut, Blutserum, Plasma, amniotischer Flüssigkeit (Fruchtwasser), Plazentaextrakten, Urin und Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Körperprobe ausgewählt ist aus Blutserum, Fruchtwasser und Plazentaextrakten.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Körperprobe eine Blutserumprobe ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Testperson im ersten Trimester der Schwangerschaft ist, und wobei eine bestimmte Menge an MIC-1, die in dem Blutserum der Testperson vorliegt, die weniger als oder gleich 4 ng/ml beträgt, Indikativ für ein erhöhtes Risiko einer Fehlgeburt und/oder einer Frühgeburt ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Testperson im zweiten Trimester der Schwangerschaft ist, und wobei eine bestimmte Menge an MIC-1, die in der Blutserumprobe der Testperson vorliegt, die weniger als oder gleich 8 ng/ml beträgt, indikativ für ein erhöhtes Risiko einer Fehlgeburt und/oder einer Frühgeburt ist.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Testperson im dritten Trimester der Schwangerschaft ist, und wobei eine bestimmte Menge an MIC-1, die in dem Blutserum der Testperson vorliegt, die weniger als oder gleich 12 ng/ml beträgt, indikativ für ein erhöhtes Risiko einer Fehlgeburt und/oder einer Frühgeburt ist.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Körperprobe eine Fruchtwasserprobe ist.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei die Testperson im zweiten Trimester der Schwangerschaft ist, und wobei eine bestimmte Menge an MIC-1, die in der Fruchtwasserprobe der Testperson vorliegt, die weniger als oder gleich 10 ng/ml beträgt, indikativ für ein erhöhtes Risiko einer Fehlgeburt und/oder einer Frühgeburt ist.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Körperprobe eine Plazentaextraktprobe ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Testperson im dritten Trimester der Schwangerschaft ist, und wobei eine bestimmte Menge an MIC-1, die in der Plazentaextraktprobe vorliegt, die weniger als oder gleich 18 ng/ml beträgt, indikativ für ein erhöhtes Risiko einer Fehlgeburt und/oder einer Frühgeburt ist.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Testperson im dritten Trimester der Schwangerschaft ist, und wobei eine bestimmte Menge an MIC-1, die in der Plazentaextraktprobe vorliegt, die weniger als oder gleich 10 ng/ml beträgt, indikativ für ein erhöhtes Risiko einer Fehlgeburt und/oder einer Frühgeburt ist.
Verfahren zur Diagnose fötaler Anomalien, wobei das Verfahren umfasst: (i) die Bestimmung der Menge an MIC-1, die in einer Körperprobe vorliegt, welche einer schwangeren Testperson mit bekanntem Gestationsalter entnommen wurde, und (ii) den Vergleich der bestimmten Menge mit der Menge oder dem Mengenbereich, die/der in (einer) äquivalenten Körperprobe(n) von (einer) normalen schwangeren Person(en) mit einem Gestationsalter, welches äquivalent zu dem bekannten Gestationsalter der Testperson ist, vorliegt.
Verfahren nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 13, wobei die Menge an MIC-1, die in einer Körperprobe vorliegt, durch ein Immunoassay oder Immunohistochemie unter Verwendung von Antikörpern oder deren Fragmenten gegen MIC-1 bestimmt wird.