DE602004010251T2

DE602004010251T2 - Reduktion von mikroarray-schwankungen durch interne referenzpunkte

Info

Publication number: DE602004010251T2
Application number: DE602004010251T
Authority: DE
Inventors: Parameswara Meda Brea REDDY; Kurt Mission Viejo BRILLHART; Firdous Brea Farooqui; Daniel A. Irvine KEYS
Original assignee: Beckman Coulter Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 2003-05-16
Filing date: 2004-05-14
Publication date: 2008-09-25
Anticipated expiration: 2024-05-15
Also published as: DE602004010251D1; EP1625233A1; WO2004104230A1; EP1625233B1; CN1771333A; JP2007500851A; US20040229226A1

Description

Hintergrund
Die folgende Beschreibung stellt eine Zusammenfassung von Informationen bereit, die für die vorliegende Erfindung relevant sind und ist kein Zugeständnis, dass jedwede der hier angegebenen Informationen oder der hier zitierten Veröffentlichungen Stand der Technik für die vorliegend beanspruchte Erfindung ist.
Ein Mikroarray ist ein Array oder ein Muster getrennter Einfangmittel, die als kleine Flecken (etwa 1 mm oder weniger) auf einem geeigneten festen Träger abgeschieden sind. Ein Beispiel für einen geeigneten festen Träger für den Mikroarray ist eine Polypropylenplatte oder eine andere Platte mit einer Vielzahl von Testbereichen, auf denen ein Array von Flecken in den Testbereichen abgeschieden werden kann. Reagenzien und ein Volumen einer Probe werden den Testbereichen zugesetzt, um Zielliganden nachzuweisen.
Ein Assay bzw. Test unter Verwendung eines Mikroarrays kann in verschiedener Weise durchgeführt werden, einschließlich der bekannten Sandwich-Technik. Bei der Sandwich-Technik werden Zielliganden, Zielliganden-Detektoren und Einfangliganden in dem Test verwendet. „Zielliganden" und „Antiliganden" sind Antigene, Antikörper, bindende Proteine, Haptene, Hormonrezeptoren und andere biologische Moleküle, die durch Binden an andere Moleküle Komplexe bilden können. Ein Einfangligand ist ein Antiligand, der an den Zielliganden bindet. Der „Zielliganden-Detektor" ist ein markierter Antiligand, der auch an den Zielliganden oder einen Zielligand-Einfangligand-Komplex bindet.
In dem Sandwichtest bindet der Einfangligand an mindestens eine Stelle auf einem Zielliganden zur Bildung eines ersten Komplexes, wodurch der Zielligand eingefangen wird oder eine Verknüpfung mit dem Zielliganden stattfindet. Ein Zielliganden-Detektor bindet ebenfalls an den Zielliganden zur Bildung eines zweiten Komplexes. Der markierte Bestandteil in dem Sandwich des Komplexes kann die Gegenwart eines Zielliganden an einer bestimmten Stelle in einem Mikroarray anzeigen.
Mikroarrays sind zum Nachweisen der Gegenwart eines oder mehrerer Zielliganden unter Verwendung kleiner Probenvolumina geeignet. Mikroarrays bestimmen jedoch im Allgemeinen, ob ein Zielligand vorliegt, und quantifizieren den Zielliganden nicht. Die Quantifizierung jedes Zielliganden in einem Mikroarray kann für viele Anwendungen extrem nützlich oder entscheidend sein und würde die Eignung von Mikroarrays erweitern.
Eine genaue Quantifizierung von Zielliganden in einem Mikroarrayformat ist komplex; variable Bedingungen auf jedweder Stufe des Testverfahrens können die Genauigkeit beeinträchtigen. Diese Variationen können signifikant sein und die Genauigkeit vermindern. Variable Bedingungen können auf einer oder mehreren Stufe(n) des Testverfahrens von 1) dem Abscheiden von Einfangmitteln als Flecken auf dem Mikroarray, 2) der Probe und Reagenzien auf dem Mikroarray, 3) dem Inkubieren der Probe und von Reagenzien, und/oder 4) während des Nachweisens und Messens der Signale, die jedem Zielliganden entsprechen, auftreten. Das Verfahren des Zugebens der Probe oder von Einfangmitteln in den Mikroarray kann zur Abscheidung variabler Mengen führen. Wenn zum Nachweisen eines Zielliganden ein visueller Marker verwendet wird, dann kann bzw. können Staub, eine ungleichmäßige Beleuchtung, Fokussierungsprobleme und/oder Geräteprobleme eine Variabilität beim Nachweisen und Messen der Intensität des Markers erzeugen. Die Temperatur, die Feuchtigkeit, der Inkubationszeitraum und das Schütteln sind andere Variablen, die während des Tests unter Verwendung des Mikroarrays auftreten können. Eine Variation kann auch zwischen verschiedenen Testbereichen innerhalb des Arrays auftreten. Alle diese Faktoren können die Leistung und die Genauigkeit des Mikroarrays beim Nachweisen und Messen von Zielliganden beeinflussen. Es gibt einen Bedarf für ein Mikroarray-Testverfahren, das Variablen beim Nachweisen und Messen von Zielliganden in Betracht zieht und diesbezüglich eine Abstimmung vornimmt.
Die europäische Patentanmeldung EP 1 190 762 A2 beschreibt diesbezüglich ein Verfahren zum Anzeigen von Ergebnissen von Hybridisierungsexperimenten unter Verwendung eines Biochips, bei dem eine Vielzahl von Kontrollflecken, die in jedem einer Vielzahl von Abschnitten als Flecken vorliegen, die auf einem Biochip definiert sind, gemessen wird. Die gemessenen Daten werden für jeden Abschnitt auf einem Graphen aufgetragen und alle Graphen werden gleichzeitig auf einem einzelnen Bildschirm in der gleichen Anordnung wie diejenige der Abschnitte auf dem Biochip angezeigt. Durch gleichzeitiges Anzeigen aller Graphen auf einem einzelnen Bildschirm ist es möglich, den gesamten Biochip im Überblick zu prüfen, um experimentelle Fehler zu finden. Experimentelle Fehler können auch bezüglich der Verteilung von Kontrolldaten auf der Basis der Linearität der Datenpunkte und Steigungswinkel quantifiziert werden, die für jeden der Datenpunkte auf einem Graphen definiert sind.
Das Nachweisen und Quantifizieren der Intensität des Signals, das jedem Marker entspricht, der direkt oder indirekt an jeden Zielliganden gebunden ist, wird aufgrund der geringen Grö ße der Flecken noch komplizierter gemacht. Eine genaue Identifizierung der Position jeder Einfangstelle innerhalb jedes Testbereichs und der entsprechenden Identität jedes Zielliganden in dem markierten Komplex ist entscheidend. Mikroarrays weisen typischerweise keine interne Marker oder Referenzpunkte auf, die es dem Anwender ermöglichen, den Flecken, der jedem Zielliganden entspricht, der in dem Mikroarray getestet wird, einfach und schnell zu bestimmen. Der Mangel an internen Referenzpunkten führt zu einem Mikroarray, bei dem ein Anwender zeitaufwändige Verfahren durchführen muss, um die Flecken, die dem Zielliganden entsprechen, der in dem Mikroarray eingefangen ist, zu orientieren oder auszurichten. Abhängig von der Anzahl verschiedener Zielliganden, die in dem Mikroarray einem Testen unterzogen werden, kann dies die Analyse der Testergebnisse verzögern.
Demgemäß besteht ein Bedarf für ein Testverfahren für einen Mikroarray, das quantitativ ist, die Genauigkeit des Mikroarray-Tests erhöht, die Orientierung oder Ausrichtung des Mikroarrays, um einen genauen Nachweis von Flecken in jedem Array sicherzustellen, erleichtert, und die eingefangenen Zielliganden ohne teure und zeitaufwändige Verfahren quantifiziert.
Zusammenfassung
Die vorliegende Erfindung erfüllt dieses Bedürfnis. Die vorliegende Erfindung stellt ein System bereit, das interne Referenzflecken nutzt, um die Genauigkeit zu erhöhen und eine Variation des Mikroarrays zu vermindern. Das System der vorliegenden Erfindung umfasst Mikrotestvorrichtungen, Testverfahren und Verfahren zur Bildung von Mikrotests.
Eine Mikroarray-Vorrichtung zum Bestimmen der Menge einer Vielzahl von Zielliganden in einer Probe umfasst erfindungsgemäß einen festen Träger mit einer Vielzahl von Testbereichen, eine Vielzahl verschiedener Zieleinfangliganden, welche auf den Testbereichen immobilisiert sind, und mindestens einen Referenzeinfangliganden, welcher auf den Testbereichen immobilisiert ist, wobei der Referenzeinfangligand ausgewählt ist, um einen normalerweise nicht in der Probe vorliegenden Referenzliganden einzufangen.
Eine andere Mikroarray-Vorrichtung zum Bestimmen der Menge einer Vielzahl von Zielliganden in einer Probe umfasst erfindungsgemäß einen festen Träger mit einer Vielzahl von Testbereichen mit im Wesentlichen der gleichen Geometrie auf dem festen Träger, eine Vielzahl verschiedener Zieleinfangliganden, welche auf den Testbereichen immobilisiert sind, und mindestens einen Referenzeinfangliganden, welcher auf den Testbereichen immobilisiert ist, wobei der Referenzeinfangligand ausgewählt ist, um einen normalerweise nicht in der Probe vorliegenden Referenzliganden einzufangen, wobei die Referenzeinfangliganden im Wesentlichen an der gleichen Stelle in jedem Testbereich vorliegen.
Ausführungsformen der vorstehend beschriebenen Mikrotestvorrichtungen umfassen Vorrichtungen, die eines oder mehrere von dem Folgenden aufweisen: Mindestens ein Testbereich ohne Referenzeinfangligand, mindestens ein Testbereich ohne Zieleinfangligand, und wobei die Zieleinfangliganden in einem vorbestimmten Array angeordnet worden sind.
Bevorzugte Ausführungsformen für die vorstehend beschriebenen Mikrotestvorrichtungen umfassen Vorrichtungen, bei denen der Zieleinfangligand und der Referenzeinfangligand in einem vorbestimmten Array angeordnet sind, und bei denen der Zieleinfangligand an mindestens zwei beabstandeten Stellen in dem Array angeordnet ist. Mehr bevorzugt ist der Referenzeinfangligand an mindestens zwei Eckstellen in dem Array angeordnet. Insbesondere ist der Referenzeinfangligand an mindestens drei Eckstellen in dem Array angeordnet.
Ein erfindungsgemäßes Assay-Verfahren bzw. Testverfahren zum Bestimmen der Menge einer Vielzahl verschiedener Zielliganden umfasst einen Schritt des Auswählens der erfindungsgemäßen Mikroarray-Vorrichtung, die vorstehend beschrieben worden ist. Ein weiterer Schritt ist das Anordnen in mindestens einem der Testbereiche (i) einer Zielliganden enthaltenden Probe, wobei mindestens einige der Zielliganden durch Zieleinfangliganden eingefangen werden, (ii) eines Referenzliganden, wobei mindestens einiges des Referenzligandens durch den Referenzeinfangliganden eingefangen wird, (iii) eines Referenzliganden-Detektors zum Bilden eines Komplexes mit eingefangenem Referenzliganden, und (iv) eines Zielliganden-Detektors zum Bilden eines Komplexes mit eingefangenen Zielliganden. Ein weiterer Schritt in diesem Verfahren ist das Nachweisen der Menge von Referenzliganden-Detektor und Zielliganden-Detektor, welche im Komplex vorliegen.
In einer Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Testverfahrens sind Zieleinfangliganden und Referenzeinfangliganden in einem vorbestimmten Array auf der Mikroarrayvorrichtung immobilisiert und die Zieleinfangliganden sind an mindestens zwei Eckstellen in dem Array immobilisiert.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Bilden eines Mikroarrays zum Bestimmen der Menge einer Vielzahl von Zielliganden in einer Probe umfasst einen Schritt des Auswählens eines festen Trägers mit einer Vielzahl von Testbereichen mit im Wesentlichen der gleichen Geometrie. Ein weiterer Schritt ist das Immobilisieren einer Vielzahl verschiedener Zieleinfangliganden und mindestens eines Referenzeinfangliganden in einem vorbestimmten Array auf dem Testbereich, wobei der Referenzeinfangligand ausgewählt ist, um einen normalerweise nicht in der Probe vorliegenden Referenzliganden einzufangen.
Ausführungsformen des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Bildung des Mikroarrays umfassen das Bilden des Mikroarrays, wobei mindestens ein Testbereich keinen Referenzeinfangliganden aufweist und wobei mindestens ein Testbereich keinen Zieleinfangliganden aufweist. Vorzugsweise umfasst der Schritt des Immobilisierens von mindestens einem Referenzeinfangliganden wie in dem vorstehend beschriebenen Verfahren des Bildens des Mikroarrays das Immobilisieren des Referenzeinfangliganden an mindestens zwei Eckstellen in dem Array. Insbesondere umfasst in dem vorstehend beschriebenen Verfahren des Bildens des Mikroarrays der Schritt des Immobilisierens von mindestens einem Referenzeinfangliganden das Immobilisieren des Referenzeinfangliganden an mindestens drei Eckstellen in dem Array.
Zeichnungen
Diese Merkmale, Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung sind mittels der folgenden Beschreibung, der beigefügten Ansprüche und der beigefügten Figuren besser verständlich, wobei:
1 einen Array innerhalb des Testbereichs eines Mikroarrays zeigt und Stellen innerhalb des Arrays angibt, die den internen Referenzflecken und Testflecken oder Zielligandenflecken entsprechen.
2 einen Graphen zeigt, bei dem der Variationskoeffizient („CV") unter Verwendung normalisierter Ergebnisse eines Immunassays bzw. -tests auf der Basis eines IL-8-Mikroarrays gemäß der vorliegenden Erfindung verglichen wird und bezüglich Differenzen bei dem Druckverfahren und dem Mischen während des Tests angepasst ist.
3 einen Graphen zeigt, der demjenigen der 2 ähnlich ist, mit normalisierten Ergebnissen eines IL-8-Mikroarraytests der vorliegenden Erfindung, bei dem Anpassungen bezüglich verschiedener Inkubationszeiten, wie z. B. 30, 45, 60 und 75 min, als Variable vorgenommen worden sind.
4 ein vorbestimmtes Gitter oder Muster zeigt, das in der vorliegenden Erfindung zum Abscheiden spezifischer Einfangoligonukleotide verwendet wird, die einem spezifischen Ziel liganden entsprechen, der in einem Array innerhalb eines Testbereichs eingefangen werden soll.
Beschreibung
Die folgende Diskussion beschreibt Ausführungsformen der Erfindung und verschiedene Variationen dieser Ausführungsformen. Diese Diskussion sollte jedoch nicht so ausgelegt werden, dass sie die Erfindung auf diese speziellen Ausführungsformen beschränkt. Für den Fachmann sind auch zahlreiche andere Ausführungsformen ersichtlich.
a. Definitionen
Der Begriff „Mikroarray" bezieht sich hier auf ein Array oder Muster von getrennten Einfangmitteln, die als kleine Flecken in einem Testbereich auf einem geeigneten festen Substrat abgeschieden sind.
Der Begriff „Testbereich" bezieht sich hier auf jedweden Oberflächenbereich, der einem Array innerhalb des Mikroarrays entspricht und diesen unmittelbar umgibt. Beispielsweise umfasst der „Testbereich" einen Oberflächenbereich innerhalb einer Vertiefung in einer Mikroplatte oder den Oberflächenbereich eines Glasmikroskopobjektträgers oder den Oberflächenbereich eines Kügelchens, wobei die Flecken als ein Array abgeschieden sind.
Der Begriff „Testvertiefung" bezieht sich hier auf einen Oberflächenbereich innerhalb einer Vertiefung in einer Mikroplatte oder den Oberflächenbereich eines Glasmikroskopobjektträgers, wobei die Flecken als ein unterscheidbarer Array abgeschieden sind.
Der Begriff „Einfangmittel" bezieht sich hier entweder auf einen „Einfangliganden" oder ein Einfangoligonukleotid, das unter geeigneten Bedingungen an ein komplementäres Oligonukleotid, das an einen Einfangliganden gebunden ist, hybridisieren kann.
Der Begriff „Einfangligand" bezieht sich hier auf jedwedes biologische Molekül, das einen „Zielliganden" einfängt oder an diesen bindet.
Der Begriff „Einfangoligonukleotid" bezieht sich hier auf ein Oligonukleotid, das an einem festen Träger immobilisiert oder an diesen gebunden ist, der ein komplementäres Oligonukleotid binden kann, das an einen Einfangliganden gebunden ist.
Der Begriff bzw. Ausdruck „komplementäres Oligonukleotid" oder „Oligonukleotid, das zu einem Einfangoligonukleotid komplementär ist" bezieht sich hier auf eine Nukleotidsequenz, die an einen Einfangliganden gebunden ist, der an das Einfangoligonukleotid unter Bedingungen hybridisiert, die zum Hybridisieren geeignet sind, wodurch doppelsträngige Nukleinsäure-Duplexe gebildet werden.
Der Begriff bzw. Ausdruck "biologisches Molekül" oder „Zielligand" oder „Antiligand" umfasst hier jedwedes organische Molekül und umfasst unter anderem Oligonukleotide, Nukleinsäuren, wie z. B. DNA und RNA, Polypeptide, Haptene und Kohlenhydrate.
Der Begriff „Polypeptid" umfasst hier unter anderem Proteine und Antikörper und jedwede Fragmente davon.
Der Begriff „Haptene" bezieht sich hier auf kleine Moleküle, wie z. B. Arzneistoffe, Hormone und synthetische Verbindungen, einschließlich unter anderem Verbindungen, die mit der Verwendung von therapeutischen Arzneistoffen und Missbrauchsdrogen zusammenhängen. Beispiele für Haptene, die mit Missbrauchsdrogen zusammenhängen, umfassen unter anderem Verbindungen, die mit dem Metabolismus oder dem Gebrauch von Kokain, Morphin und Nikotin zusammenhängen. Beispiele für Haptene bezüglich therapeutischer Arzneistoffe umfassen unter anderem Verbindungen, die mit der Verwendung von Tobramycin, Phenobarbital, Theophyllin, Digoxin und Gentamicin zusammenhängen.
Der Begriff „Zielliganden-Detektor" bezieht sich hier auf einen markierten Antiliganden, der auch an den Zielliganden zur Bildung eines Konjugats bindet.
Der Begriff „Referenzligand" bezieht sich hier auf ein „biologisches Molekül", das von dem gleichen Typ biologisches Molekül wie der „Zielligand" ist, und das zur Normalisierung der Mikroarray-Testergebnisse für Zielliganden in dem Array verwendet wird.
Der Begriff „Referenzliganden-Detektor" bezieht sich hier auf einen markierten Antiliganden, der auch an den Referenzliganden zur Bildung eines Konjugats bindet.
Der Begriff „Orientieren" oder „Orientierung" oder „Ausrichten" oder „Ausrichtung" des Mikroarrays bezieht sich hier auf das Positionieren des Mikroarrays oder des Nachweisgeräts zum Ausrichten jedes Flecks in dem Array zum Nachweis und zur Messung. Die Stelle der Flecken innerhalb jedes Testbereichs kann auf der Basis des Abscheidungsverfahrens gering fügig variieren, und eine kleine Variation der Stelle von kleinen Flecken kann die Genauigkeit beeinflussen.
Der Ausdruck „Normalisieren des Signals" bezieht sich hier auf das Anpassen des Signals, das mit den Zielliganden zusammenhängt, als Reaktion auf die Intensität der bekannten Menge an nachgewiesenem Referenzliganden, und dadurch das Verbessern der Genauigkeit der Messung der Zielliganden.
b. Die vorliegende Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zum quantitativen Messen von Zielliganden in dem Mikroarray, zum Anpassen bezüglich einer Variation, die während des Mikroarraytests stattfinden kann, zur Verbesserung der Genauigkeit des Tests, und das die Orientierung des Mikroarrays für eine genauere Analyse erleichtert und die Messung von eingefangenen Zielliganden unter Verwendung von relativ kostengünstigen und zeitsparenden Verfahren erlaubt, bereit, wie es in den unabhängigen Ansprüchen definiert ist.
Die Erfindung ist in diagnostischen Verfahren wie z. B. Assays bzw. Tests bezüglich einer Vielzahl von Zielliganden oder biologischen Molekülen geeignet. Die Erfindung kann z. B. in einem Test verwendet werden, der die Menge und die Gegenwart von Cytokinen, die Gegenwart eines Krankheitszustands in einem Organismus, die Menge und die Gegenwart eines therapeutischen Arzneistoffs und den Nachweis von Nukleinsäuren, die von zugrunde liegenden Infektionen resultieren, umfasst.
Die Erfindung nutzt Einfangmittel, die als getrennte Flecken auf einem geeigneten Mikroarray-Substrat abgeschieden sind. Ein geeignetes Mikroarray-Substrat kann jedwede Oberfläche mit der geeigneten Chemie sein, bei der ein Mikroarray-Drucker oder eine andere Vorrichtung zum Abscheiden von Einfangmitteln als mikroskopische Flecken auf dem Substrat verwendet werden kann. Mikroarray-Substrate umfassen unter anderem die Oberfläche von flachen Mikroskopobjektträgern, flexiblen Membranen, die aus Nitrocellulose, Nylon und PVDF hergestellt sind, und Mikrovertiefungsplatten, die aus Glas, Polyacrylaten, Polystyrol, Polypropylen und Polycarbonat hergestellt sind. Mikroarrays mit Einfangmitteln, die bereits auf deren Oberfläche immobilisiert sind, können auch von einem Hersteller gekauft werden. Beispielsweise verkauft Pierce Chemical Co., PO Box 117, Rockford, IL 61105, Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen, die Vertiefungen mit einem Array geringer Dichte von Einfangmitteln enthält (Teilnummern 84682 bis 84689).
In der Erfindung werden die Einfangmittel als kleine Flecken auf dem Mikroarray-Substrat in einem vorbestimmten Muster abgeschieden, das einer Stelle zur Identifizierung der Gegenwart und zum Quantifizieren jedes spezifischen Zielliganden und Referenzliganden in dem Array entspricht. Jeder Fleck in dem Muster entspricht einem Einfangmittel für einen bestimmten Zielliganden oder Referenzliganden oder ein Fleck in dem Array kann leer sein (d. h. kein Einfangmittel). Der Referenzligand stellt einen internen Referenzfleck oder interne Referenzflecken in jedem Testbereich bereit, die den gleichen Bedingungen ausgesetzt sind wie die Einfangmittel für die Zielliganden. In dem Test werden die internen Referenzflecken in jedem Testbereich den gleichen Bedingungen ausgesetzt, die den Nachweis und die Messung der Zielliganden in dem Testbereich beeinflussen, wie z. B. einer Variabilität bei der Abscheidung der Flecken, bei der Probe, den Reagenzien, der Temperatur oder anderen Variablen in dem Testverfahren.
Ein Beispiel eines vorbestimmten Musters oder „vorbestimmten Gitters", das spezifischen Positionen in dem Gitter entspricht, wo Zielliganden und Referenzliganden eingefangen würden, ist in der 4 gezeigt. In der 4 entsprechen die Flecken Stellen, bei denen ein Zielligand oder ein Referenzligand durch den Test gemäß der vorliegenden Erfindung eingefangen werden soll.
Die spezifischen Zielliganden, die in dem in der 4 gezeigten Muster eingefangen werden sollen, sind:

IL-1b (Interleukin 1b),
IL-2 (Interleukin 2),
IL-4 (Interleukin 4),
IL-6 (Interleukin 6),
IL-8 (Interleukin 8),
I1-10 (Interleukin 10),
I1-12 (Interleukin 12),
FGFb (basischer Fibroblastenwachstumsfaktor)
GM-CSF (Granulocyten/Monocyten-Kolonie-stimulierender Faktor)
INFg (gamma-Interferon)
TNFa (Tumornekrosefaktor alpha)
VEGF (Gefäßendothelwachstumsfaktor) und
USER (ein Zielligand, der vom Anwender ausgewählt wird, oder ein leerer Fleck (kein Zielligand)), und es handelt sich dabei üblicherweise um einen von den vorstehend genannten Zielliganden verschiedenen Liganden. Dem Fachmann ist klar, dass es verschiedene Permu tationen von vorbestimmten Mustern gibt, die in einem Array in einem Testbereich angeordnet werden können.

Die Bezeichnung REF in der 4 ist ein Referenzligand, der normalerweise nicht in der Probe vorhanden ist, die dem Test unterzogen wird. In dem im Beispiel 1 beschriebenen Experiment war der Referenzligand REF TNFa und die USER-Zielligandenstelle wurde nicht verwendet (d. h. es handelte sich um einen leeren Fleck).
In der vorliegenden Erfindung kann bzw. können ein oder mehrere interne(r) Referenzfleck(en) auf dem Testbereich abgeschieden werden und diese sind nur durch die Anzahl von Flecken in dem Testbereich beschränkt. Mit zunehmender Anzahl von internen Referenzflecken in dem Testbereich gibt es jedoch eine damit einhergehende Verminderung der Anzahl von Flecken, die zum Testen von Zielliganden zur Verfügung stehen.
In der Erfindung sind interne Referenzflecken an identischen Stellen innerhalb jedes Testbereichs abgeschieden. Die internen Referenzflecken können an jedweder Stelle innerhalb des Testbereichs abgeschieden werden. Die bevorzugte Stelle für interne Referenzflecken ist jedoch an einer oder mehreren Ecke(n), wenn in der Konfiguration der Form Ecken vorliegen. Die 1 zeigt einen Array innerhalb eines Testbereichs eines Mikroarrays und gibt Testflecken (oder Zielligandeneinfangflecken) und Referenzflecken (oder interne Referenzligandeneinfangflecken) an.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung sind die Einfangmittel für den Referenzliganden in den gleichen drei Ecken jedes Testbereichs abgeschieden. Das Anordnen der Einfangmittel für den Referenzliganden in den Ecken erlaubt eine einfachere Orientierung oder Ausrichtung des Geräts oder des Mikroarrays für einen genaueren Nachweis jedes Flecks in dem Array. Als Referenzen zur Verbesserung der Quantifizierung könnten die Referenzflecken an einer beliebigen Stelle angeordnet werden. Das Anordnen der Flecken in 3 der 4 Ecken gibt der Analysesoftware getrennte und reproduzierbare Referenzpunkte zum Anordnen einer „Karte", die zur Identifizierung und Quantifizierung der verbleibenden Flecken verwendet wird. Mit Hilfe dieser getrennten und reproduzierbaren Referenzpunkte kann eine Software so gestaltet oder modifiziert werden, dass sie die Mikroarrays nach der Erfassung der digitalen Photographie ohne Einwirken des Experimentators automatisch lokalisiert und kartiert.
Biologische Moleküle, die als Einfangmittel in dem Verfahren der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind Moleküle, die eine reaktive Gruppe aufweisen, die während des Schritts des Abscheidens von Einfangmitteln auf dem Mikroarray an ein geeignetes Mikroarray-Substrat binden. Biologische Moleküle mit mindestens einer reaktiven Amino-, Thiol- oder Hydroxylgruppe können an ein Mikroarray-Substrat zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung binden. Polypeptide, Haptene und Kohlenhydrate mit mindestens einer reaktiven Amino-, Thiol- oder Hydroxylgruppe können von Sigma, P.O. Box 14508, St. Louis, MO 63178, erworben werden. Oligonukleotide, die während des Schritts des Abscheidens von Einfangmitteln auf dem Mikroarray an ein geeignetes Mikroarray-Substrat binden können, umfassen Amino-derivatisierte Oligonukleotide und Oligonukleotide mit mindestens einer freien Thiolgruppe. Aminooligonukleotide können auf einem 3'-Amino-Modifiziermittel C7 CPG (von Glen Research, 22825 Davis Drive, Sterling, Virginia 20164 erworben) gemäß der Vorschrift des Herstellers unter Verwendung eines DNA-Synthesegeräts ABI 394 (von Applied Biosystems, 850 Lincoln Centre Drive, Foster City, CA 94404) synthetisiert werden. Die Aminogruppe kann am 3'-Ende oder am 5'-Ende eines Oligonukleotids angeordnet werden. Das 3'-Aminooligonukleotid wird vorzugsweise bei der Herstellung von Aminooligonukleotiden für die vorliegende Erfindung verwendet. Ein Verfahren zur Herstellung von Amino-derivatisierten Oligonukleotiden ist auch im US-Patent Nr. 6,110,669 beschrieben. Darüber hinaus können Oligonukleotide mit mindestens einer freien Thiolgruppe, die von Glen Research erworben worden sind, gemäß den Vorschriften des Herstellers auf Trägern synthetisiert werden.
Flecken können unter Verwendung einer Anzahl verschiedener Verfahren auf einem geeigneten Mikroarray-Substrat abgeschieden oder darauf gedruckt werden. Verfahren zum Abscheiden von Flecken auf einem Mikroarray sind dem Fachmann bekannt. Vgl. z. B. das US-Patent Nr. 6,312,960 . Beispielsweise wurden unter anderem eine Tintenstrahltechnologie und eine piezoelektrische Mikrostrahldrucktechnologie verwendet, um kleine Lösungsvolumina abzugeben, und dies wird als „Drucken" von Flecken auf die festen Träger bezeichnet. Ein Verfahren zum Drucken von biologischen Molekülen auf einen festen Träger ist in dem US-Patent Nr. 6,146,833 beschrieben. Ein anderes Verfahren zum Abscheiden von Flecken ist ein Kontaktdrucken, bei dem ein Stift in eine Lösung des zu druckenden Moleküls getaucht und mit einer Oberfläche in Kontakt gebracht wird, wobei ein reproduzierbares Flüssigkeitsvolumen freigesetzt wird. Ein Kapillardrucken ist ein weiteres Verfahren zum Abscheiden von Flecken in einem Mikroarray.
Abhängig von der Art von Einfangmitteln, die als Flecken auf dem Mikroarray abgeschieden sind, können die Bedingungen, die zur effektiven Durchführung des Tests erforderlich sind, variieren. Bedingungen zur Verwendung spezifischer Tests sind dem Fachmann jedoch bekannt, einschließlich unter anderem Tests unter Verwendung von Einfangmitteln wie z. B. Oligonukleotiden, Zellen, Polypeptiden, wie z. B. Antikörpern. Vgl. z. B. H. Wang, H. Wang, W. Zhang, G. N. Fuller, Tissue Microarrays: applications in neuropathology research, diagnosis, and education, Brain Pathol. Jan. 2002, 12(1), 95–107 (Gewebemikroarrays), S. Mousses, A. Kallioniemi, P. Kauraniemi, A. Elkahloun, O. P. Kallioniemi, Clinical and functional target validation using tissue and cell microarrays, Curr. Opin. Chem. Biol. Feb. 2002, 6(1), 97–101 (Zellmikroarrays), D. S. Wilson, S. Nock, Functional Protein microarrays, Curr. Opin. Chem. Biol., Feb. 2002, 6(1), 81–5 (allgemeine Protein-Mikroarrays), B. Schweitzer, S. F. Kingsmore, Measuring Proteins an microarrays, Curr. Opin. Biotechnol., Feb. 2002, 13(1), 14–9 (Antikörper-Mikroarrays) und D. D. Shoemaker und P. S. Linsley, Recent developments in DNA microarrays, Curr. Opin. Microbiol. 5(3), 334–7, Juni 2002 (DNA-Mikroarrays).
Wenn Einfangoligonukleotide auf dem Mikroarray als Flecken abgeschieden werden, werden Einfangliganden, die an komplementäre Oligonukleotide gebunden sind, an einem gewissen Punkt in dem Test zugesetzt. Bei dem Einfangliganden, der an das komplementäre Oligonukleotid gebunden ist, kann es sich um Antigene, Antikörper, bindende Proteine, Haptene, Hormonrezeptoren, Hormone, Lectine, Kohlenhydrate, Metaboliten, Arzneistoffe, Enzymsubstrate oder virale Proteine handeln. Das Binden von Oligonukleotiden an Antigene, Antikörper, bindende Proteine, Haptene, Hormonrezeptoren, Hormone, Lectine, Kohlenhydrate, Metaboliten, Arzneistoffe, Enzymsubstrate und virale Proteine ist dem Fachmann bekannt. Vgl. das US-Patent Nr. 5,648,213 . Ein bevorzugtes Verfahren zum Binden von Antikörpern als Konjugate an Oligonukleotide ist in der laufenden Nummer 10,032592, angemeldet am 24. Oktober 2001, mit dem Titel „Efficient Synthesis of Protein-Oligonucleotide Conjugates" beschrieben.
An einem gewissen Punkt in dem Test, bei dem Oligonukleotide verwendet werden, müssen die Bedingungen geeignet sein, um das Hybridisieren komplementärer Oligonukleotide zu erlauben, um Oligonukleotide zur Bildung von Nukleinsäureduplexen einzufangen. Die Bedingungen, die der Bildung von Nukleinsäurekomplexen durch Oligonukleotide zuträglich sind, sind dem Fachmann bekannt (wie es z. B. in Sambrook und Russel, Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 3. Auflage, Cold Spring Harbor Laborstory Press, New York, oder in Current Protocols in Molecular Biology, herausgegeben von Frederick Ausubel, John Wiley and Sons Publishing, New York, 1987, beschrieben ist).
Einfangoligonukleotide und komplementäre Oligonukleotide, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, umfassen Oligonukleotide mit etwa 15 bis etwa 45 Basen. Die Einfangoligonukleotide und komplementären Oligonukleotide weisen vorzugsweise Oligonukleotide mit jeweils etwa 20 bis etwa 30 Basen auf.
Bevorzugte Paare von Einfangoligonukleotiden und komplementären Oligonukleotiden sind in der Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 10/419,020, angemeldet am 18. April 2003, Aktennummer 13796, mit dem Titel „Oligonucleotide Pairs for Multiplexed Binding Arrays" beschrieben. Die bevorzugten Oligonukleotidpaare hybridisieren unter Bildung von Nukleinsäureduplexen bei Raumtemperatur und weisen keine wesentliche Kreuzhybridisierung auf. Dies ist für einen Test geeignet, der bezüglich der Gegenwart mehrerer Targetliganden testet. Wenn erfindungsgemäß ein Testen bezüglich mehrerer Zielliganden durchgeführt wird, wären dies die bevorzugten Sequenzen.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Flecken, die auf dem Mikroarray abgeschieden sind, Einfangoligonukleotide, die sich für jeden Zielliganden und Referenzliganden unterscheiden. Die Einfangoligonukleotide und komplementären Oligonukleotide werden aus den vorstehend angegebenen Paaren ausgewählt.
Eine Anzahl verschiedener Arten von nachweisbaren Markern kann direkt an die Einfangoligonukleotide oder komplementären Oligonukleotide gebunden und in der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Diese nachweisbaren Marker umfassen unter anderem Fluorophore, radioaktive, chemilumineszierende, biolumineszierende, Enzym-, nephelometrische, turbidometrische und sichtbare Marker. Beispiele für Fluorophore, die in der Erfindung verwendet werden können, umfassen unter anderem Rhodamin 110, Rhodal, Fluorescein, Cumarin und Derivate von Rhodamin 110, Rhodal oder Fluorescein. Cyaninfarbstoffe, wie z. B. Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5 und Cy7. Beispiele für radioaktive Marker, die in der Erfindung verwendet werden können, umfassen unter anderem ³²P, ³³P, ³⁵S, ³H und ¹²⁵I. Beispiele für chemilumineszierende Marker, die in der Erfindung verwendet werden können, umfassen unter anderem Acridiniumester, Rutheniumkomplexe, Metallkomplexe, Oxalatester-Peroxid-Kombination. Beispiele für Enzymmarker, die in der Erfindung verwendet werden können, umfassen unter anderem alkalische Phosphatase, Meerrettichperoxidase, beta-Galactosidase. Beispiele für sichtbare Marker, die in der Erfindung verwendet werden können, umfassen unter anderem Thiopeptolide, Anthrachinonfarbstoffe, Nitroblautetrazolium, ortho-Nitrophenol-β-D-galactopyranosid (ONPG), kolloidales Gold und Mikroteilchen. Die gleiche Art von Marker, wie sie vorstehend diskutiert worden ist, kann an Detektorliganden verwendet werden. Verfahren zum Binden von nachweisbaren Markern an Oligonukleotide sind dem Fachmann bekannt. Beispielsweise sind solche Verfahren in Yang und Millar, Methods in Enzymology, Band 278, Seiten 417–444, 1997, beschrieben.
Die Messung und der Nachweis der Marker hängen von der Art des in dem Test verwendeten Markers ab und basieren auf den Vorschriften des Herstellers oder anderen Vorschriften, die dem Fachmann bekannt sind. Vgl. z. B. das US-Patent 5,316,906 , das die Verwendung von Enzymsubstraten beschreibt, die fluoreszierende Niederschläge bilden. Wenn Fluorophore als die Marker in dem Test verwendet werden, können Daten in der Form einer digitalen Photographie des gesamten Mikroarrays gesammelt werden. Die Referenzflecken und die Zielligand-spezifischen Flecken können in der digitalen Photographie gleichzeitig nachgewiesen werden.
Bei oder nach dem Nachweis der Marker wird ein Algorithmus mit den gesammelten Daten von den Referenzflecken durchgeführt, um die Daten, die zu den anderen Flecken in dem Mikroarray gehören, zu normalisieren oder zu skalieren. Während viele Normalisierungsalgorithmen möglich sind, wurde ein Algorithmus verwendet, um die in den Tabellen und den Beispielen der Erfindung gezeigten Daten zu erzeugen; insbesondere wurde das Zielligand-spezifische Signal (Fleck) durch den Mittelwert der Ergebnisse von der Anzahl von Referenzflecken dividiert.
Da die Quantifizierung der Referenzflecken auf einer bekannten Menge von Referenzliganden basiert, die den gleichen Bedingungen wie andere Flecken auf dem gleichen Mikroarray ausgesetzt worden sind, können die Ergebnisse von unbekannten Konzentrationen von Zielliganden skaliert werden und deren Reproduzierbarkeit von Vertiefung zu Vertiefung kann verbessert werden. Die 2 ist ein Graph, bei dem normalisierte Ergebnisse eines IL-8-Mikroarrays der vorliegenden Erfindung verwendet werden und Anpassungen werden bezüglich des Druckverfahrens und des Mischens in dem Test durchgeführt. Die 2 zeigt die Verbesserung der Genauigkeit (d. h. die Verminderung von CV) der Signalintensität, die durch dieses Verfahren bei 1000, 100, 10 und 1 pg/ml IL-8 erzeugt worden ist, wenn Druckverfahren vor dem Testverfahren und das Mischen während des Testverfahrens variiert wurden. Die 3 ist ein Graph, der demjenigen von 2 ähnlich ist, mit normalisierten Ergebnissen eines IL-8-Mikrotests der vorliegenden Erfindung, wobei Anpassungen bezüglich verschiedener Inkubationszeiten, wie z. B. 30, 45, 60 und 75 min, als Variable vorgenommen worden sind.
Die vorliegende Erfindung stellt ein System bereit, das interne Referenzflecken zur Verminderung der Mikroarrayvariation nutzt. Das System der vorliegenden Erfindung umfasst Mikrotestvorrichtungen, Testverfahren und Verfahren zum Bilden von Mikrotests.
Eine erfindungsgemäße Mikroarray-Vorrichtung zum Bestimmen der Menge einer Vielzahl von Zielliganden in einer Probe umfasst einen festen Träger mit einer Vielzahl von Testbereichen, eine Vielzahl von verschiedenen Zieleinfangliganden, die auf den Testbereichen immobilisiert sind, und mindestens einen Referenzeinfangliganden, der auf den Testbereichen immobilisiert ist, wobei der Referenzeinfangligand so ausgewählt ist, dass er einen normalerweise nicht in der Probe vorliegenden Referenzliganden einfängt.
Eine andere erfindungsgemäße Mikroarray-Vorrichtung zum Bestimmen der Menge einer Vielzahl von Zielliganden in einer Probe umfasst einen festen Träger mit einer Vielzahl von Testbereichen mit im Wesentlichen der gleichen Geometrie auf dem festen Träger, eine Vielzahl von verschiedenen Zieleinfangliganden, die auf den Testbereichen immobilisiert sind, und mindestens einen Referenzeinfangliganden, der auf den Testbereichen immobilisiert ist, wobei der Referenzeinfangligand so ausgewählt ist, dass er einen normalerweise nicht in der Probe vorliegenden Referenzliganden einfängt, wobei die Referenzeinfangliganden im Wesentlichen an der gleichen Stelle in jedem Testbereich vorliegen.
Ausführungsformen der vorstehend beschriebenen Mikrotestvorrichtungen umfassen Vorrichtungen, die mehr als eines der Folgenden aufweisen: Mindestens einen Testbereich ohne Referenzeinfangligand, mindestens einen Testbereich ohne Zieleinfangligand, und wobei die Zieleinfangliganden in einem vorgegebenen Array angeordnet worden sind.
Bevorzugte Ausführungsformen für die vorstehend beschriebenen Mikrotestvorrichtungen umfassen Vorrichtungen, bei denen das Anordnen der Zieleinfangliganden und der Referenzeinfangliganden in einem vorbestimmten Array erfolgt, und bei denen der Referenzeinfangligand an mindestens zwei beabstandeten Stellen in dem Array angeordnet ist. Mehr bevorzugt ist der Referenzeinfangligand an mindestens zwei Eckstellen in dem Array angeordnet. Insbesondere ist der Referenzeinfangligand an mindestens drei Eckstellen in dem Array angeordnet.
Ein erfindungsgemäßes Assay-Verfahren bzw. Testverfahren zum Bestimmen der Menge einer Vielzahl verschiedener Zielliganden umfasst einen Schritt des Auswählens der erfindungsgemäßen Mikroarray-Vorrichtung, die vorstehend beschrieben worden ist. Ein weiterer Schritt ist das Anordnen in mindestens einer der Testbereiche (i) einer Zielliganden enthaltenden Probe, wobei mindestens einige der Zielliganden durch Zieleinfangliganden eingefangen werden, (ii) eines Referenzliganden, wobei mindestens einiges des Referenzligandens durch den Referenzeinfangliganden eingefangen wird, (iii) eines Referenzliganden-Detektors zum Bilden eines Komplexes mit eingefangenem Referenzliganden, und (iv) eines Zielliganden-Detektors zum Bilden eines Komplexes mit eingefangenen Zielliganden. Ein weiterer Schritt in diesem Verfahren ist das Nachweisen der Menge von Referenzliganden-Detektor und Zielliganden-Detektor, welche im Komplex vorliegen.
In einer Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Testverfahrens sind Zieleinfangliganden und Referenzeinfangliganden in einem vorbestimmten Array auf der Mikroarrayvorrichtung immobilisiert und die Zieleinfangliganden sind an mindestens zwei Eckstellen in dem Array immobilisiert.
Ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Bilden eines Mikroarrays zum Bestimmen der Menge einer Vielzahl von Zielliganden in einer Probe umfasst einen Schritt des Auswählens eines festen Trägers mit einer Vielzahl von Testbereichen mit im Wesentlichen der gleichen Geometrie. Ein weiterer Schritt ist das Immobilisieren einer Vielzahl verschiedener Zieleinfangliganden und mindestens eines Referenzeinfangliganden in einem vorbestimmten Array auf dem Testbereich, wobei der Referenzeinfangligand ausgewählt ist, um einen normalerweise nicht in der Probe vorliegenden Referenzliganden einzufangen.
Ausführungsformen des vorstehend beschriebenen Verfahrens zur Bildung des Mikroarrays umfassen das Bilden des Mikroarrays, wobei mindestens ein Testbereich keinen Referenzeinfangliganden aufweist, und wobei mindestens ein Testbereich keinen Zieleinfangliganden aufweist. Vorzugsweise umfasst der Schritt des Immobilisierens von mindestens einem Referenzeinfangliganden in dem vorstehend beschriebenen Verfahren des Bildens des Mikroarrays das Immobilisieren des Referenzeinfangliganden an mindestens zwei Eckstellen in dem Array. Insbesondere umfasst in dem vorstehend beschriebenen Verfahren des Bildens des Mikroarrays der Schritt des Immobilisierens von mindestens einem Referenzeinfangliganden das Immobilisieren des Referenzeinfangliganden an mindestens drei Eckstellen in dem Array.
Die vorliegende Erfindung ist nicht auf die in diesem Abschnitt beschriebenen bevorzugten Ausführungsformen beschränkt. Die Ausführungsformen sind lediglich beispielhaft und dem Fachmann ist klar, dass gemäß dieser Erfindung viele andere Ausführungsformen möglich sind. Nachdem die Erfindung allgemein beschrieben worden ist, kann sie unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele, die der Veranschaulichung dienen und die vorliegende Erfindung nicht beschränken sollen, falls nichts anderes angegeben ist, leichter verstanden werden.
Beispiel 1
Herstellung und Analyse eines Mikroarray-Tests unter Verwendung einer erfindungsgemäßen Mikroplatte
In diesem Beispiel war eine A² (A² ist eine Abkürzung für einen Array innerhalb eines Arrays)-Platte die als Mikroarray-Substrat verwendete Mikrotiterplatte. Die A²-Platte ist noch nicht käuflich. Die A²-Platte war eine Polypropylenplatte, die aus 96 Testvertiefungen bestand und ist von Beckman Coulter hergestellt worden. Ein Vorbehandlungsverfahren wurde für die Oberfläche der A²-Mikrotiterplatte verwendet, um sie mit einer Chemie zu versehen, die mit den Aminogruppen auf dem Oligonukleotid reagiert, und dieses Verfahren ist in der Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 10/033,308, angemeldet am 24. Oktober 2001, mit dem Titel „Immobilizing Biological Molecules" beschrieben.
42 Flecken einer Lösung, die Einfangoligonukleotide enthält, wurden als Mikroarray in jede der 96 Testvertiefungen unter Verwendung eines käuflichen kontaktlosen Druckers PixSys 4200 (Cartesian Technologies, Inc., 17851 Sky Park Circle Suite C, Irvine, CA, 92614) gedruckt.
Die in diesem Beispiel verwendete Drucklösung bestand aus 20 μM Einfang-Aminooligonukleotid, die unter Verwendung eines 10 nl-Tropfens einer 20 μM-Lösung in einem alkalischen Puffer aus 50 mM Carbonat + 4% w/v Natriumsulfat erzeugt worden ist. Die Einfangoligonukleotide wurden in einer Umgebung mit geringem Staubgehalt und hoher Feuchtigkeit auf die vorbehandelte Oberfläche der A²-Platte gedruckt. Sobald sie auf der Oberfläche abgeschieden worden sind, wurden die Flecken über Nacht (etwa 16 Stunden) inkubiert, bevor sie abgewaschen wurden. Die restliche Aktivierungschemie auf der Platte wurde dann durch Umsetzen der Platte mit einem großen Überschuss an Amin-enthaltenden Molekülen deaktiviert. Nach dem Spülen und Trocknen war die Platte dann gebrauchsfertig.
Die 42 Flecken von Einfangoligonukleotiden in jeder Testvertiefung entsprachen dem Folgenden:

a. 12 verschiedene Zielliganden, die bei jedem Fleck nachzuweisen und zu quantifizieren waren,
b. 1 Satz von Referenzflecken und
c. 1 Satz von Flecken für Zielliganden, die von den 12 vorstehend angegebenen Zielliganden verschieden waren, entsprechend einem vom Anwender ausgewählten Zielliganden oder einem vom Anwender ausgewählten Fleck ohne Zieleinfangliganden (USER) in dem in der 4 gezeigten Gitter.

Jedes der vorstehend genannten Einfangoligonukleotide wurde dreifach an vorbestimmten Stellen in dem Array angeordnet. Daher entsprechen 3 × (mal) 14 Flecken den 42 Flecken in dem Array. Die drei Referenzflecken wurden in den Ecken abgeschieden und stellten Informationen über die Orientierung und die Position des Mikroarrays bereit.
Das vorbestimmte Gitter (Positionen) zum Drucken der Einfangoligonukleotide, die spezifischen Zielliganden in den im Beispiel 1 verwendeten Arrays entsprechen, ist in der 4 gezeigt, die weiter oben in der Beschreibung genannt worden ist. In der 4 bezieht sich REF auf den Referenzliganden und USER bezieht sich auf einen vom Anwender ausgewählten Zielliganden oder eine leere Stelle, wie es vorstehend beschrieben worden ist. Der für das Beispiel 1 verwendete Referenzligand war TNFa und der USER-Fleck wies keinen Zieleinfangliganden auf.
In diesem Beispiel wurde für jeden der 13 verschiedenen Sätze von Flecken ein anderes Einfangoligonukleotid abgeschieden und für den USER-Fleck wurde kein Einfangoligonukleotid abgeschieden. Das Einfangoligonukleotid wurde aus den vorstehend angegebenen, bevorzugten Sequenzpaaren ausgewählt und auf das Mikroarray-Substrat gedruckt. Die (anderen) komplementären Oligonukleotide jedes Sequenzpaares wurden mit dem Verfahren, das in der laufenden Nummer 10,032592, angemeldet am 24. Oktober 2001, mit dem Titel „Efficient Synthesis of Protein-Oligonucleotide Conjugates" beschrieben ist, an einen Antikörper konjugiert, der dessen Zielliganden entsprach. Unter geeigneten Bedingungen hybridisierten die Sequenzpaare unter Bildung von Nukleinsäureduplexen.
Hybridisierungspuffer:
Ein Superblock-Puffer wurde gemäß den Vorschriften des Herstellers hergestellt (Pierce Biotechnology, PO Box 117, Rockford, IL, 61105). Der Superblock-Puffer wurde wie folgt mit Formamid gemischt: Superblock:Formamid = 3:1. Dieser Puffer wurde sofort nach der Formulierung verwendet.
Verfahren:

a) Es wurde ein Gemisch der gewünschten monoklonal-Oligonukleotid-Konjugate (jeweils 1,4 μg/ml) in Hybridisierungspuffer 2 hergestellt. Alle 12 analytspezifischen Konjugate plus das Ovalbumin-Referenzkonjugat wurden in diesem Beispiel verwendet.
b) Die Vertiefungen wurden kurz mit Waschpuffer gespült, dann wurden jeder Vertiefung 70 μl des Antikörper-Oligonukleotid-Konjugatgemischs zugesetzt.
c) Die Platte wurde mit einem Polystyroldeckel bedeckt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gemischt.
d) Die Platte wurde durch Zusetzen von 200 μl Waschpuffer zu jeder Vertiefung und Mischen für 1 min gewaschen. Der größte Teil des Waschpuffers wurde durch schnelles Umdrehen der Platte über einem Ausguss entfernt. Die Platte wurde auf mehrere Schichten von Papierhandtüchern abgeklopft, um restlichen Puffer zu entfernen. Dieses Verfahren wurde zweimal für insgesamt dreimal wiederholt.
e) Eine 1:10-Verdünnung von SuperBlock in TBS wurde zur Verwendung im nächsten Schritt hergestellt.
f) 35 μl des verdünnten SuperBlock wurden jeder Vertiefung zugesetzt, worauf jeder Vertiefung 35 μl Probe zugesetzt wurden.
g) Es wurde inkubiert, wie es im vorstehenden Schritt c) beschrieben ist.
h) Es wurde gewaschen, wie es im vorstehenden Schritt d) beschrieben ist.
i) Ein Gemisch der gewünschten polyklonaler Antikörper-Biotin-Konjugate (jeweils 0,25 μg/ml) in verdünntem SuperBlock-Puffer wurde hergestellt.
j) 70 μl des polyklonaler Antikörper-Biotin-Konjugatgemischs wurden jeder Vertiefung zugesetzt.
k) Es wurde inkubiert, wie es im vorstehenden Schritt c) beschrieben ist.
l) Es wurde gewaschen, wie es im vorstehenden Schritt d) beschrieben ist.
m) Es wurde eine Verdünnung von Streptavidin-PBXL1 (Martek Biosciences Corporation, Columbia, MD) auf 6,7 μg/ml (1:150-Verdünnung der 1 mg/ml-Vorratslösung) in verdünntem SuperBlock-Puffer hergestellt.
n) 70 μl des verdünnten Streptavidin-PBXL1 wurden jeder Vertiefung zugesetzt.
o) Es wurde inkubiert, wie es im vorstehenden Schritt c) beschrieben ist.
p) Es wurde gewaschen, wie es im vorstehenden Schritt d) beschrieben ist.
q) Jeder Vertiefung wurden 200 μl Waschpuffer zugesetzt und die Platte wurde bis zur Bildgebung bei 4°C im Dunklen gelagert. Der Waschpuffer von den Vertiefungen wurde während der Bildgebung nicht entfernt, um die PBXL-Fluoreszenz zu bewahren.

Das zur Messung der Fluoreszenz verwendete Gerät war eine Beckman Coulter Lochrasterversion eines A²-Plattenlesegeräts, das noch nicht käuflich ist. Dieses Gerät bestand aus einem automatisierten Tisch, der die Platte hielt, einer CCD-Kamera (Roper Coolsnap CF) und einer Weißlichtquelle. Die Platten wurden unter Verwendung einer 550 nm-Anregungslichtquelle beleuchtet und mit der CCD-Kamera, an der ein 675 nm-Emissionsfilter montiert war, visualisiert, um die PBXL1-Marker für die gebundenen Antigene in dem Array nachzuweisen. Die Antigene korrelierten mit den Positionen, die auf dem in der 4 gezeigten Gitter angegeben sind. Unter Verwendung der Roper Coolsnap CF wurde eine digitale Photographie des Arrays aufgenommen.
Die resultierenden Bilder wurden unter Verwendung der vorstehend angegebenen käuflichen Software Imagene gemäß den Vorschriften des Herstellers quantifiziert. Die zur Normalisierung der Ergebnisse verwendete Formel war das für den Zielliganden spezifische Signal (Fleck) dividiert durch den Mittelwert der Ergebnisse von der Anzahl von Referenzflecken.
Beispiel 2
Herstellung und Analyse eines Mikroarraytests unter Verwendung einer Mikroplatte und Biotinresten gemäß der vorliegenden Erfindung
In diesem Beispiel war eine A²-Platte die als Mikroarray-Substrat verwendete Mikrotiterplatte. Die A²-Platte ist noch nicht käuflich. Die A²-Platte war eine Polypropylenplatte, die aus 96 Testvertiefungen bestand und ist von Beckman Coulter hergestellt worden. Ein Vorbehand-lungsverfahren wurde für die Oberfläche der A²-Mikrotiterplatte verwendet, um sie mit einer Chemie zu versehen, die mit den Aminogruppen auf dem Oligonukleotid reagiert, und dieses Verfahren ist in der Patentanmeldung mit der laufenden Nummer 10/033,308, angemeldet am 24. Oktober 2001, mit dem Titel „Immobilizing Biological Molecules" beschrieben.
42 Flecken einer Lösung, die Einfangoligonukleotide enthält, wurden als Mikroarray in jede der 96 Testvertiefungen unter Verwendung eines herkömmlichen kontaktlosen Druckers PixSys 4200 (Cartesian Technologies, Inc., 17851 Sky Park Circle Suite C, Irvine, CA, 92614) gedruckt.
Die in diesem Beispiel verwendete Drucklösung bestand aus 20 μM Einfang-Aminooligonukleotid, die unter Verwendung eines 12 nl-Tropfens einer 20 μM-Lösung in einem alkalischen Puffer erzeugt worden ist. Die Einfangoligonukleotide wurden in einer Umgebung mit geringem Staubgehalt und hoher Feuchtigkeit auf die vorbehandelte Oberfläche der A²-Platte gedruckt. Sobald sie auf der Oberfläche abgeschieden worden sind, wurden die Flecken über Nacht (etwa 16 Stunden) inkubiert, bevor sie abgewaschen wurden. Die restliche Aktivierungschemie auf der Platte wurde dann durch Umsetzen der Platte mit einem großen Überschuss an Amin-enthaltenden Molekülen deaktiviert. Nach dem Spülen und Trocknen war die Platte dann gebrauchsfertig.
Die 42 Flecken von Einfangoligonukleotiden in jeder Testvertiefung entsprachen dem Folgenden:

Jedes der vorstehend genannten Einfangoligonukleotide wurde dreifach an vorbestimmten Stellen in dem Array angeordnet. Daher entsprechen 3 × (mal) 14 Flecken den 42 Flecken in dem Array. Die drei Referenzflecken wurden in den Ecken abgeschieden und stellten Informationen über die Orientierung und die Position des Mikroarrays bereit.
Das vorbestimmte Gitter (Positionen) zum Drucken der Einfangoligonukleotide, die spezifischen Zielliganden in den im Beispiel 1 verwendeten Arrays entsprechen, ist in der 4 gezeigt, die weiter oben in der Beschreibung genannt worden ist. In der 4 bezieht sich REF auf den Referenzliganden und USER bezieht sich auf einen vom Anwender ausgewählten Zielliganden oder eine leere Stelle, wie es vorstehend beschrieben worden ist. Der für das Beispiel 2 verwendete Referenzligand war TNFa und der USER-Fleck wies keinen Zieleinfangliganden auf.
In diesem Beispiel wurde für jeden der 14 verschiedenen Sätze von Flecken, einschließlich der Referenzflecken, ein anderes Einfangoligonukleotid abgeschieden. Einfangoligonukleotide wurde aus den vorstehend angegebenen, bevorzugten Sequenzpaaren ausgewählt und auf das Mikroarray-Substrat gedruckt. Die komplementären Oligonukleotide jedes Sequenzpaares wurden mit dem Verfahren, das in der laufenden Nummer 10,032592, angemeldet am 24. Oktober 2001, mit dem Titel „Efficient Synthesis of Protein-Oligonucleotide Conjugates" beschrieben ist, mit der Ausnahme des Oligonukleotids, das zu der Sequenz komplementär war, die an die Referenzflecken des Mikroarrays gebunden war, an einen Antikörper konjugiert, der dessen Zielliganden entsprach. Die Sequenz, die zu den Referenzflecken komplementär war, wurde mit einem Biotinrest in der 3'-Position synthetisiert. Unter geeigneten Bedingungen hybridisierten die Sequenzpaare unter Bildung von Nukleinsäureduplexen.
Hybridisierungspuffer:
Ein Superblock-Puffer wurde gemäß den Vorschriften des Herstellers hergestellt (Pierce Biotechnology, PO Box 117, Rockford, IL, 61105). Der Superblock-Puffer wurde wie folgt mit Formamid gemischt: Superblock:Formamid = 3:1. Dieser Puffer wurde sofort nach der Formulierung verwendet.
Verfahren:

a) Es wurde ein Gemisch der gewünschten monoklonal-Oligonukleotid-Konjugate (jeweils 1,4 μg/ml) und des biotinylierten Referenzoligonukleotids bei 20 nM in Hybridisierungspuffer hergestellt.
b) Die Vertiefungen wurden kurz mit Waschpuffer gespült, dann wurden jeder Vertiefung 70 μl des Antikörper-Oligonukleotid-Konjugat/biotinyliertes Referenzoligonukleotidgemischs zugesetzt.
c) Die Platte wurde mit einem Polystyroldeckel bedeckt und 1 Stunde bei Raumtemperatur gemischt.
d) Die Platte wurde durch Zusetzen von 200 μl Waschpuffer zu jeder Vertiefung und Mischen für 1 min gewaschen. Der größte Teil des Waschpuffers wurde durch schnelles Umdrehen der Platte über einem Ausguss entfernt. Die Platte wurde auf mehrere Schichten von Papierhandtüchern abgeklopft, um restlichen Puffer zu entfernen. Dieses Verfahren wurde zweimal für insgesamt dreimal wiederholt.
e) Eine 1:10-Verdünnung von SuperBlock in TBS wurde zur Verwendung im nächsten Schritt hergestellt.
f) 35 μl des verdünnten SuperBlock wurden jeder Vertiefung zugesetzt, worauf jeder Vertiefung 35 μl Probe zugesetzt wurden.
g) Es wurde inkubiert, wie es im vorstehenden Schritt c) beschrieben ist.
h) Es wurde gewaschen, wie es im vorstehenden Schritt d) beschrieben ist.
i) Ein Gemisch der gewünschten polyklonaler Antikörper-Biotin-Konjugate (jeweils 0,25 μg/ml) in verdünntem SuperBlock-Puffer wurde hergestellt.
j) 70 μl des polyklonaler Antikörper-Biotin-Konjugatgemischs wurden jeder Vertiefung zugesetzt.
k) Es wurde inkubiert, wie es im vorstehenden Schritt c) beschrieben ist.
l) Es wurde gewaschen, wie es im vorstehenden Schritt d) beschrieben ist.
m) Es wurde eine Verdünnung von Streptavidin-PBXL1 (Martek Biosciences Corporation, Columbia, MD) auf 6,7 μg/ml (1:150-Verdünnung der 1 mg/ml-Vorratslösung) in verdünntem SuperBlock-Puffer hergestellt.
n) 70 μl des verdünnten Streptavidin-PBXL1 wurden jeder Vertiefung zugesetzt.
o) Es wurde inkubiert, wie es im vorstehenden Schritt c) beschrieben ist.
p) Es wurde gewaschen, wie es im vorstehenden Schritt d) beschrieben ist.
q) Jeder Vertiefung wurden 200 μl Waschpuffer zugesetzt und die Platte wurde bis zur Bildgebung bei 4°C im Dunklen gelagert. Der Waschpuffer von den Vertiefungen wurde während der Bildgebung nicht entfernt, um die PBXL-Fluoreszenz zu bewahren.

Das zur Messung der Fluoreszenz verwendete Gerät war eine Beckman Coulter Lochrasterversion eines A²-Plattenlesegeräts, das noch nicht käuflich ist. Dieses Gerät bestand aus einem automatisierten Tisch, der die Platte hielt, einer CCD-Kamera (Roper Coolsnap CF) und einer Weißlichtquelle. Die Platten wurden unter Verwendung einer 550 nm-Anregungslichtquelle beleuchtet und mit der CCD-Kamera, an der ein 675 nm-Emissionsfilter montiert war, visualisiert, um die PBXL1-Marker für die gebundenen Antigene in dem Array nachzuweisen. Die Antigene korrelierten mit den Positionen, die auf dem in der 4 gezeigten Gitter angegeben sind. Unter Verwendung der Roper Coolsnap CF wurde eine digitale Photographie des Arrays aufgenommen.
Die resultierenden Bilder wurden unter Verwendung der vorstehend angegebenen käuflichen Software Imagene gemäß den Vorschriften des Herstellers quantifiziert. Die zur Normalisierung der Ergebnisse verwendete Formel war das für den Zielliganden spezifische Signal (Fleck) dividiert durch den Mittelwert der Ergebnisse von der Anzahl von Referenzflecken.
Beispiel 3
Potenzielles Beispiel unter Verwendung der Erfindung mit einem Test auf Antikörperbasis
Ein Mikroarray, das aus verschiedenen spezifischen Antikörpern besteht, kann unter Verwendung der Techniken, der Chemie und der Oberflächen erzeugt werden, die gegenwärtig für Proteinmikroarrays verwendet werden. Diese können anschließend für eine Quantifizierung spezifischer Antigene durch entweder kompetitive oder nicht-kompetitive Tests verwendet werden. Kompetitive Tests werden durch Konkurrierenlassen von Antigenen in der Probe mit begrenzenden Mengen an markiertem (häufig biotinyliertem) Antigen oder Antigen-Analogon zum Binden an den spezifischen Antikörper durchgeführt. Die Menge an markiertem Antigen, die an den spezifischen Antikörpergebunden ist, hängt invers mit der Antigenkonzentration in der Probe zusammen. Referenzflecken, die aus einem Antikörper für einen Analyten bestehen, der nicht in der Probe vorliegt, könnten zusammen mit einer sorgfältig gesteuerten Konzentration an markiertem Referenzantigen verwendet werden, um sowohl eine interne Referenz zur Normalisierung anderer Testergebnisse innerhalb des Mikroarrays als auch einen Satz interner Referenzpunkte für eine automatisierte Datenerfassung bereit zustellen. Nicht-kompetitive Tests können durch Bindenlassen von Antigenen in der Probe an die immobilisierten spezifischen Antikörper durchgeführt werden. Überschüssiges Material kann durch Waschen entfernt werden, worauf ein zweiter Antikörper oder Satz von Antikörpern, der bzw. die für verschiedene Stellen auf dem gleichen antigenischen Molekül spezifisch ist bzw. sind, zugesetzt und binden gelassen wird bzw. werden. Diese können direkt mit einem fluoreszierenden oder enzymatischen „Marker"-Molekül markiert werden oder indirekt mit einem Rest (wie z. B. Biotin), der anschließend in einem späteren Schritt markiert wird, markiert werden. In jedem Fall ist die Menge des an die Stelle gebundenen zweiten Antikörpers direkt proportional zu der Konzentration an Antigen in der Probe. Referenzflecken, die aus (1) einem Antikörper für einen Analyten, der nicht in der Probe vorliegt, bestehen, können in Verbindung mit sorgfältig gesteuerten Konzentrationen an Referenzantigen und (2) einem zweiten Referenzantigen-spezifischen Antikörper für eine andere Stelle auf dem Referenzantigen verwendet werden, um sowohl eine interne Referenz zur Normalisierung anderer Testergebnisse innerhalb des Mikroarrays als auch einen Satz von internen Referenzpunkten für eine automatisierte Datenerfassung bereitzustellen.
Beispiel 4
Potenzielles Beispiel unter Verwendung der Erfindung mit einem Test auf Zellbasis
Zell- oder Gewebe-Mikroarrays können ebenfalls durch Verteilen verschiedener Zelltypen oder Dünnschnitte, die von spezifischen Geweben entnommen worden sind, auf einer festen Oberfläche aufgebaut werden. Deren Bestandteile können dann bezüglich des genetischen Gehalts durch eine in situ-Hybridisierung mit DNA- oder RNA-Sonden oder bezüglich spezifischer Proteine durch Immunfärben mit markierten Antikörpern untersucht werden. Die Verwendung von reproduzierten Mikroarrays erlaubt eine Charakterisierung der gleichen Proben durch verschiedene Sonden und/oder Antikörper. Ein Satz von Referenzflecken, der aus einem Standard-Zell- oder -Gewebepräparat besteht, würde eine relative Quantifizierung der gewünschten Analyten zusätzlich zur Bereitstellung von Orientierungsmarkierungen für eine Quantifizierungssoftware erlauben.
Obwohl die vorliegende Erfindung bezüglich bestimmter bevorzugter Versionen der Erfindung recht detailliert beschrieben worden ist, sind auch andere Versionen möglich.

Claims

Mikroarray-Vorrichtung zum Nachweisen und Quantifizieren einer Vielzahl von Zielliganden in einer Probe, wobei das Mikroarray a) einen festen Träger mit einer Vielzahl von Testbereichen; b) eine Vielzahl verschiedener Zieleinfangliganden, welche auf den Testbereichen immobilisiert sind, und c) mindestens einen Referenzeinfangliganden umfasst, welcher auf den Testbereichen an einer Stelle immobilisiert ist, an der keine Zieleinfangliganden vorliegen, wobei der Referenzeinfangligand ausgewählt ist, um einen normalerweise nicht in der Probe vorliegenden Referenzliganden einzufangen, wobei sich die Referenzeinfangliganden in jedem Testbereich im Wesentlichen an der gleichen Stelle befinden, wobei der Referenzeinfangligand verwendbar ist, um die Mikroarray-Vorrichtung auszurichten und die Zielliganden in der Probe zu quantifizieren, und wobei Flecken, die einem Einfangmittel für einen speziellen Zielliganden oder Referenzliganden entsprechen, oder Flecken, die kein Einfangmittel enthalten, auf dem Mikroträger-Substrat in einem bestimmten Muster abgelagert sind, welches der Stelle zum Identifizieren der Gegenwart und Quantifizieren jedes spezifischen Zielliganden in dem Array entspricht, wobei die Zieleinfangliganden und der Referenzeinfangligand in einem vorbestimmten Array angeordnet sind und der Referenzeinfangligand an mindestens drei Eckstellen in dem Array vorliegt.
Mikroarray-Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Vielzahl von Testbereichen eine Vielzahl von Testvertiefungen ist.
Mikroarray-Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei die Vielzahl von Testbereichen eine Vielzahl von Testvertiefungen mit im Wesentlichen der gleichen Geometrie ist.
Mikroarray-Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei mindestens eine Testvertiefung keinen Referenzeinfangliganden aufweist.
Mikroarray-Vorrichtung nach Anspruch 3 oder 4, wobei mindestens eine Testvertiefung keinen Zieleinfangliganden aufweist.
Assay-Verfahren zum Bestimmen der Menge einer Vielzahl von verschiedenen Zielliganden in einer Probe, umfassend die Schritte: a) das Auswählen des Mikroarrays von Anspruch 2 oder 3, b) das Anordnen in mindestens einer der Testvertiefungen (i) einer Zielliganden enthaltenden Probe, wobei mindestens einige der Zielliganden durch Zieleinfangliganden eingefangen werden, (ii) eines normalerweise nicht in der Probe vorliegenden Referenzliganden, wobei mindestens einiges des Referenzligandens durch den Referenzeinfangliganden eingefangen wird, (iii) eines Referenzliganden-Detektors zum Bilden eines Komplexes mit eingefangenem Referenzliganden, und (iv) eines Zielliganden-Detektors zum Bilden eines Komplexes mit eingefangenen Zielliganden, c) das Nachweisen der Menge von Referenzliganden-Detektor und Zielliganden-Detektor, welche im Komplex vorliegen, d) das Ausrichten des Mikroarrays mit Bezug zu dem nachgewiesenen Referenzliganden, und e) wobei die Referenzflecken, welche den Referenzliganden enthalten, Referenzen zum Verbessern der Quantifizierung sind und die Ergebnisse von unbekannten Konzentrationen von Zielliganden skaliert werden können, da die Quantifizierung der Referenzflecken auf einer bekannten Menge von Referenzligand basiert, wobei der Schritt des Anordnens in mindestens einer der Testvertiefungen weiter das Immobilisieren der Zieleinfangliganden und Referenzeinfangliganden in einem vorbestimmten Array, und das Immobilisieren des Referenzeinfangliganden an mindestens drei Eckstellen in dem Array umfasst.
Verfahren zum Bilden eines Mikroarrays zum Nachweisen und Quantifizieren einer Vielzahl von Zielliganden in einer Probe, wobei das Verfahren die Schritte a) des Auswählens eines festen Trägers mit einer Vielzahl von Testvertiefungen mit im Wesentlichen der gleichen Geometrie, und b) des Immobilisierens einer Vielzahl verschiedener Zieleinfangliganden und mindestens eines Referenzeinfangliganden in einem vorbestimmten Array auf der Testvertiefung umfasst, wobei der Referenzeinfangligand ausgewählt ist, um einen normalerweise nicht in der Probe vorliegenden Referenzliganden einzufangen, und der Referenzeinfangligand an einer Stelle immobilisiert ist, an der keine Zieleinfangliganden vorliegen, und wobei der Referenzeinfangligand verwendbar ist, um die Mikroarray-Vorrichtung auszurichten und die Zielliganden in der Probe zu quantifizieren, und wobei Flecken, die einem Einfangmittel für einen speziellen Zielliganden oder Referenzliganden entsprechen, oder Flecken, die kein Einfangmittel enthalten, auf dem Mikroträger-Substrat in einem bestimmten Muster abgelagert sind, welches der Stelle zum Identifizieren der Gegenwart und Quantifizieren jedes spezifischen Zielliganden entspricht, wobei der Schritt des Immobilisierens von mindestens einem Referenzeinfangliganden weiter das Immobilisieren der Referenzeinfangliganden an mindestens drei Eckstellen in dem Array umfasst.
Verfahren zum Bilden des Mikroarrays nach Anspruch 7, wobei mindestens eine Vertiefung keinen Referenzeinfangliganden aufweist.
Verfahren zum Bilden des Mikroarrays nach Anspruch 7 oder 8, wobei mindestens eine Vertiefung keinen Zieleinfangliganden aufweist.