DE60200412T2

DE60200412T2 - Polyhydroxyalkanoat und Verfahren zu dessen Herstellung, und Omega-(2-Thienylsulfanyl)alkansäure und Verfahren zu deren Herstellung

Info

Publication number: DE60200412T2
Application number: DE60200412T
Authority: DE
Inventors: Takashi Kenmoku; Etsuko Sugawa; Tetsuya Yano; Tsuyoshi Nomoto; Takeshi Imamura; Tomohiro Suzuki; Tsutomu Honma
Original assignee: Canon Inc
Current assignee: Canon Inc
Priority date: 2001-03-01
Filing date: 2002-02-28
Publication date: 2005-05-19
Anticipated expiration: 2022-03-01
Also published as: US6686439B2; KR100485119B1; US20020164726A1; DE60200412D1; EP1236754B1; US6861496B2; US20040062811A1; JP2002327050A; JP3748537B2; EP1236754A2; EP1236754A3; KR20020070834A

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Polyhydroxyalkanoat (PHA) als neuer Typ eines Polyesters. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung dieses PHA unter Verwendung eines Mikroorganismus, der dieses PHA produzieren und das PHA in seinem Körper speichern kann. Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Verbindung, die für die Züchtung dieses Mikroorganismus geeignet verwendet wird.
Einschlägiger Stand der Technik
Bisher wurde von vielen Mikroorganismen berichtet, die Poly-3-hydroxybuttersäure (PHB) und andere PHA produzieren und diese in ihrem Körper speichern ("Biodegradable Plastic Handbook", herausgegeben von Biodegradable Plastic Society, NTS Co. Ltd., S. 178–197 (1995)). Diese Polymere können für die Herstellung einer Vielzahl von Produkten verwendet werden, wobei wie bei herkömmlichen Polymeren eine Verarbeitung aus der Schmelze und dergleichen angewendet werden. Außerdem haben sie den Vorteil, daß sie in der Natur von Mikroorganismen vollständig zersetzt werden, da sie biologisch abbaubar sind, und deshalb nicht die Möglichkeit besteht, daß sie in der Natur verbleiben und eine Verunreinigung hervorrufen, wie es bei vielen herkömmlichen synthetischen Polymerverbindungen der Fall ist. Diese biologisch abbaubaren Polymerverbindungen haben eine hervorragende Biokompatibilität, und es ist zu erwarten, daß sie als weiche medizinische Materialien und dergleichen verwendet werden können.
Es ist bekannt, daß ein solches von Mikroorganismen produziertes PHA eine Vielzahl von Zusammensetzungen und Strukturen aufweisen kann, wobei dies von der Art, der Zusammensetzung der Kultur, der Kulturbedingung und dergleichen des Mikroorganismus für die Verwendung bei der Herstellung von PHA abhängt, und Untersuchungen bezüglich der Steuerung dieser Zusammensetzungen und Strukturen wurden hauptsächlich zur Verbesserung der Eigenschaften des PHA durchgeführt.
[1] Die ersten biosynthetisierten PHA, die durch Polymerisieren von Monomereinheiten mit einer relativ einfachen Struktur, wie 3-Hydroxybuttersäure (hier nachstehend als 3HB abgekürzt) erhalten wurden, schließen ein:

(a) PHA, das 3HB und 3-Hydroxyvaleriansäure (hier nachstehend als 3HV bezeichnet) enthält. Japanische Patentveröffentlichung Nr. 6-15604, japanische Patentveröffentlichung Nr. 7-14352, japanische Patentveröffentlichung Nr. 8-19227 und offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 5-7492.
(b) PHA, das 3HB und 3-Hydroxyhexansäure (hier nachstehend als 3HHx bezeichnet) enthält. Offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 5-93049 und offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 7-265065.
(c) PHA, das 3HB und 4-Hydroxybuttersäure (hier nachstehend als 4HB bezeichnet) enthält. Offengelegte japanische Patentanmeldung Nr. 9-191893.
(d) PHA, das 3-Hydroxyalkanoat mit 6 bis 12 Kohlenstoffatomen enthält. Japanisches Patent Nr. 2642937.
(e) PHA, das mit einer einzigen Fettsäure als Kohlenstoffquelle biosynthetisiert worden ist. Das Produkt ist fast das gleiche wie (d). Appl. Environ. Microbiol., 58 (2), 746 (1992).

Diese sind jeweils ein PHA, das aus Monomereinheiten besteht, die in der Seitenkette jeweils eine Alkylgruppe haben, die über die α-Oxidation eines Kohlenwasserstoffs durch einen Mikroorganismus oder die Synthese von Fettsäure aus Zucker synthetisiert worden sind, und zwar "gewöhnliches PHA".
[2] Angesichts eines weiteren Anwendungsbereichs eines solchen von Mikroorganismen erzeugten PHA, zum Beispiel die Anwendung als funktionelles Polymer, wird jedoch erwartet, daß PHA, bei dem in die Seitenkette ein von einer Alkylgruppe verschiedener Substituent eingeführt worden ist, und zwar "unübliches PHA", sehr vorteilhaft ist. Zu Beispielen des Substituenten gehören Gruppen, die einen aromatischen Ring enthalten (eine Phenylgruppe, Phenoxygruppe usw.), ungesättigte Kohlenwasserstoffe, eine Estergruppe, eine Allylgruppe, eine Cyanogruppe, halogenierte Kohlenwasserstoffe und Epoxid. Davon wurde insbesondere PHA mit einem aromatischen Ring intensiv untersucht.
(a) PHA mit einer Phenylgruppe oder einer teilweise substituierten Phenylgruppe
In Macromol. Chem., 191, 1957–1965 (1990) und Macromolecules, 24, 5256–5260 (1991) wird berichtet, daß Pseudomonas oleovorans unter Verwendung von 5-Phenylvaleriansäure als Matrix PHA produziert, das als eine Einheit 3-Hydroxy-5-phenylvaleriansäure enthält.
In Macromolecules, 29, 1762–1766 (1996) wird berichtet, daß Pseudomonas oleovorans unter Verwendung von 5-(4'-Tolyl)valeriansäure als Matrix PHA erzeugt, das als eine Einheit 3-Hydroxy-5-(4'-Tolyl)valeriansäure enthält.
In Macromolecules, 32, 2889–2895 (1999) wird berichtet, daß Pseudomonas oleovorans unter Verwendung von 5-(2',4'-Dinitrophenyl)valeriansäure als Matrix PHA produziert, das als Einheiten 3-Hydroxy-5-(2',4'-Dinitrophenyl)valeriansäure und 3- Hydroxy-5-(4'-Nitrophenyl)valeriansäure enthält.
(b) PHA, das eine Phenoxygruppe oder eine teilweise substituierte Phenoxygruppe enthält
In Macromol. Chem. Phys., 195, 1665–1672 (1994) wird berichtet, daß Pseudomonas oleovorans unter Verwendung von 11-Phenoxyundecylsäure als Matrix ein PHA-Copolymer von 3-Hydroxy-5-phenoxyvaleriansäure und 3-Hydroxy-9-phenoxynonansäure produziert.
Im japanischen Patent Nr. 2989175 ist eine Erfindung offenbart, die ein Homopolymer, das aus Einheiten von 3-Hydroxy-5-(monofluorphenoxy)pentanoat (3H5(MFP)P) oder Einheiten von 3-Hydroxy-5-(difluorphenoxy)pentanoat (3H5(DFP)P) besteht, und ein Copolymer betrifft, das zumindest 3H5(MFP)P-Einheiten oder 3H5(DFP)P-Einheiten enthält; diese Polymere synthetisierenden Pseudomonas putida; und ein Verfahren zur Herstellung der vorstehend beschriebenen Polymere unter Verwendung von Pseudomonas, und es wird beschrieben, daß als ein Effekt davon eine langkettige Fettsäure mit einem Substituenten assimiliert werden kann, so daß ein Polymer mit einer Phenoxygruppe synthetisiert wird, wobei das Ende der Seitenkette mit einem oder zwei Fluoratomen substituiert ist, und Stereoregularität und Wasserabweisevermögen verliehen werden kann, wobei ein hoher Schmelzpunkt und eine gute Verarbeitbarkeit erhalten bleiben.
Untersuchungen von Substanzen, die mit einer Cyanogruppe und einer Nitrogruppe substituiert sind, wurden zusätzlich zu einer solchen Substanz durchgeführt, die mit einer Fluorgruppe substituiert ist.
In Can. J. Microbiol., 41, 32–43 (1995) und Polymer International, 39, 205–213 (1996) wird berichtet, daß die Stämme Pseudomonas oleovorans ATCC 29347 und Pseudomonas putida KT 2442 verwendet werden, um PHA zu produzieren, das 3-Hydroxy-p-cyanophenoxyhexansäure oder 3-Hydroxy-p-nitrophenoxyhexansäure als Monomereinheit enthält, wobei als Matrix Octansäure und p-Cyanophenoxyhexansäure oder p-Nitrophenoxyhexansäure verwendet werden.
Im Gegensatz zum allgemeinen PHA mit einer Alkylgruppe als Seitenkette haben diese genannten PHA jeweils einen aromatischen Ring als Seitenkette und sind bei der Herstellung eines Polymers mit Eigenschaften vorteilhaft, die sich von diesem PHA ableiten.
[3] Als neue Kategorie wurden außerdem Untersuchungen durchgeführt, die auf die Herstellung von PHA mit einer geeigneten funktionellen Gruppe in der Seitenkette und die Verwendung dieser funktionellen Gruppe für die Erzeugung einer neuen Funktion zielten, die nur über eine Änderung der Eigenschaften hinausgeht.
In Macromolecules, 31, 1480–1486 (1996) und Journal of Polymer Science: Teil A: Polymer Chemistry, 36, 2381–2387 (1998) wird berichtet, daß PHA, das eine Einheit mit einer Vinylgruppe am Ende der Seitenkette enthält, synthetisiert worden ist und danach mit einem Oxidationsmittel epoxidiert worden ist, wodurch PHA synthetisiert werden konnte, das am Ende der Seitenkette eine Epoxygruppe mit einer hohen Reaktivität enthält.
Als ein Beispiel der Synthese von PHA, das eine Einheit mit einem Thioether enthält, von der erwartet wird, daß sie eine hohe Reaktivität aufweist, wird in Macromolecules, 32, 8315–8318 (1999) auch berichtet, daß der Stamm Pseudomonas putida 27N01 unter Verwendung von 11-(Phenylsulfanyl)valeriansäure als Matrix ein PHA-Copolymer von 3-Hydroxy-5-(phenylsulfanyl)valeriansäure und 3-Hydroxy-7-(phenylsulfanyl)heptansäure produziert.
Bei der Entwicklung eines funktionellen PHA wird erwartet, daß von den vorstehend genannten PHA in der Zukunft bei dem PHA, das eine 3-Hydroxy(phenylsulfanyl)alkansäure-Einheit mit einem S-Atom in der Seitenkette enthält, intensivere Untersuchungen in bezug auf seine hohe Reaktivität durchgeführt werden.
Bei diesem Typ eines PHA wurden jedoch noch nicht so viele Untersuchungen durchgeführt, und die aufgeführten Fälle, die ein solches PHA betreffen, sind nur die vorstehend beschriebenen Fälle. Für die Entwicklung eines funktionellen PHA durch chemisches Modifizieren der Seitenkette des erhaltenen PHA ist es erwünscht, daß das PHA eine Seitenkette mit einer größeren Reaktivität als eine Phenylgruppe, zum Beispiel eine Thienylgruppe, aufweist, von irgendeinem Fall der Erzeugung eines solchen PHA wurde jedoch noch nicht berichtet.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Angesichts dieser Probleme ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines neuen PHA und eines Verfahrens zu dessen Herstellung.
Die Erfinder haben intensiv Untersuchungen durchgeführt, um die vorstehend beschriebenen Probleme zu lösen, und gelangten zur folgenden Erfindung. Insbesondere betrifft der erste Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung ein Polyhydroxyalkanoat selbst, das dadurch gekennzeichnet ist, daß es eine Einheit mit der chemischen Formel [1] aufweist:
worin n für eine ganze Zahl von 1 bis 9 steht.
Außerdem ist das erfindungsgemäße Polyhydroxyalkanoat ein Polyhydroxyalkanoat, das dadurch gekennzeichnet ist, daß eine Einheit, die von der mit der chemischen Formel [1] angegeben Einheit verschieden ist, mindestens eine der Einheiten umfaßt, die mit der chemischen Formel [2]:
worin m für eine ganze Zahl von 0 bis 8 steht; und der chemischen Formel [12] angegeben werden:
worin l für 3 oder 5 steht.
Das durch die vorliegende Erfindung erhaltene Polyhydroxyalkanoat ist ein Polyhydroxyalkanoat mit einem Zahlenmittel des Molekulargewichts im Bereich von 10.000 bis 1.000.000.
Das durch die vorliegende Erfindung erhaltene Polyhydroxyalkanoat weist asymmetrische Kohlenstoffatome auf, wie es in den chemischen Formeln [1], [2] und [12] angegeben ist, die für eine große Anzahl möglicher Stereoisomere verantwortlich sind.
Das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren ist jedoch dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus verwendet wird, um Polyhydroxyalkanoat zu produzieren, und folglich liegen die 3-Hydroxyalkanansäure-Monomereinheiten alle in der R-Konfiguration vor.
Ein zweiter Gesichtspunkt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung des vorstehend beschriebenen Polyhydroxyalkanoats, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Mikroorganismus in einem Kulturmedium gezüchtet wird, das eine Verbindung enthält, die mit der chemischen Formel [3] angegeben wird:
worin k für eine ganze Zahl von 3 bis 11 steht.
Insbesondere ist sie ein Verfahren zur Erzeugung eines Polyhydroxyalkanoats, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Mikroorganismus in einem Medium gezüchtet wird, das 5-(2-Thienylsulfanyl)valeriansäure, die mit der chemischen Formel [4] angegeben wird:
oder
6-(2-Thienylsulfanyl)hexansäure enthält, die mit der chemischen Formel [5] angegeben wird:
Ein dritter Gesichtspunkt der Erfindung betrifft ω-(2-Thienylsulfanyl)alkansäure selbst, die mit der chemischen Formel [11] angegeben wird:
worin k für eine ganze Zahl von 4 bis 11 steht, die für die Erzeugung des erfindungsgemäßen Polyhydroxyalkanoats erforderlich ist.
Das Verfahren zur Herstellung von ω-(2-Thienylsulfanyl)alkansäure, die in der vorliegenden Erfindung verwendet und mit der chemischen Formel [11] angegeben wird:
worin k für eine ganze Zahl von 4 bis 11 steht, umfaßt einen Schritt, bei dem irgendeine der Verbindungen Bromalkansäure, ein Derivat von Bromalkansäureester (nachstehend als "Bromalkanoat" bezeichnet), Bromalkanol, Dibromalkan und Lacton mit Thiophen-2-thiol umgesetzt wird.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt den ersten Teil (112) eines detaillierten Fließschemas für die Synthese von 5-(2-Thienylsulfanyl)valeriansäure in Beispiel 1;
2 zeigt den letzten Teil (212) des detaillierten Fließschemas für die Synthese von 5-(2-Thienylsulfanyl)valeriansäure in Beispiel 1;
3 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum der in Beispiel 1 erhaltenen 5-(2-Thienylsulfanyl)valeriansäure;
4 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum der in Beispiel 2 erhaltenen 6-(2-Thienylsulfanyl)hexansäure;
5 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum eines in Beispiel 3 erhaltenen Polymers; und
6 zeigt das ¹H-NMR-Spektrum eines in Beispiel 8 erhaltenen Polymers.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Nachstehend werden Mikroorganismen für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung und Verfahren zu deren Züchtung beschrieben.
Mikroorganismen
Der Mikroorganismus für die Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren kann irgendein Mikroorganismus sein, der in einem Medium gezüchtet werden kann, das ω- (2-Thienylsulfanyl)alkansäure mit der chemischen Formel [3] enthält, wodurch ein Polyhydroxyalkanoat erzeugt wird, das eine Einheit mit der chemischen Formel [1] enthält, ein Beispiel davon ist jedoch ein Mikroorganismus, der zu Pseudomonas sp. gehört. Insbesondere gehören zu diesen Mikroorganismen Pseudomonas cichorii YN2, FERM BP-7375, Pseudomonas cichorii H45, FERM BP-7374 und Pseudomonas jessenii P161, FERM BP-7376. Diese drei Arten von Mikroorganismen sind beim International Patent Organism Depositary (IPOD) im National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST) hinterlegt und in der offengelegten japanischen Patentanmeldung Nr. 2001-178484 beschrieben.
Es folgen Einzelheiten zu diesen Stämmen YN2, H45 und P161.
Bakteriologische Eigenschaften des Stammes YN2
(1) Morphologische Eigenschaften

Form und Größe der Zellen: Stäbchen, 0,8 μm × 1,5 bis 2,0 μm
Polymorphismus der Zellen: negativ
Mobilität: freibeweglich
Sporulation: negativ
Gramfärbung: negativ
Kolonieform: kreisförmig; ungeteilt, glatter Rand; wenig konvex; glatte Oberfläche; glänzend; durchscheinend

(2) Physiologische Eigenschaften

Katalase: positiv
Oxidase: positiv
O/F-Test: oxidativ (nicht-fermentativ)
Nitratreduktion: negativ
Indolproduktion: positiv
Säureproduktion aus Glucose: negativ
Arginin-Dihydrolase: negativ
Urease: negativ
Äskulinhydrolyse: negativ
Gelatinehydrolyse: negativ
β-Galactosidase: negativ
Erzeugung von fluoreszierendem Pigment auf King's B-Agar: positiv
Wachstum unter 4% NaCl: positiv (geringes Wachstum)
Poly-p-hydroxybutyrat-Akkumulation: negativ
Tween 80-Hydrolyse: positiv

(3) Substratassimilation

Glucose: positiv
L-Arabinose: positiv
D-Mannose: negativ
D-Manitol: negativ
N-Acetyl-D-glucosamin: negativ
Maltose: negativ
Kaliumgluconat: positiv
n-Caprinat: positiv
Adipat: negativ
dl-Malat: positiv
Natriumcitrat: positiv
Phenylacetat: positiv

Bakteriologische Eigenschaften des Stammes H45
(1) Morphologische Eigenschaften

Form und Größe der Zellen: Stäbchen, 0,8 μm × 1,0 bis 1,2 μm
Polymorphismus der Zellen: negativ
Mobilität: freibeweglich
Sporulation: negativ
Gramfärbung: negativ
Kolonieform: kreisförmig; ungeteilt, glatter Rand; wenig konvex; glatte Oberfläche; glänzend; cremefarben

(2) Physiologische Eigenschaften

Katalase: positiv
Oxidase: positiv
O/F-Test: oxidativ
Nitratreduktion: negativ
Indolproduktion: negativ
Säureproduktion aus Glucose: negativ
Arginin-Dihydrolase: negativ
Urease: negativ
Äskulinhydrolyse: negativ
Gelatinehydrolyse: negativ
β-Galactosidase: negativ
Erzeugung von fluoreszierendem Pigment auf King's B-Agar: positiv
Wachstum unter 4% NaCl: negativ
Poly-p-hydroxybutyrat-Akkumulation: negativ

(3) Fähigkeit, Substrate zu assimilieren

Glucose: positiv
L-Arabinose: negativ
D-Mannose: positiv
D-Manitol: positiv
N-Acetyl-D-glucosamin: positiv
Maltose: negativ
Kaliumgluconat: positiv
n-Caprinat: positiv
Adipat: negativ
dl-Malat: positiv
Natriumcitrat: positiv
Phenylacetat: positiv

Bakteriologische Eigenschaften des Stammes P161
(1) Morphologische Eigenschaften

Form und Größe der Zellen: Sphären, Φ 0,6 μm Stäbchen, 0,6 μm × 1,5 bis 2,0 pm
Polymorphismus der Zellen: längliche Form
Mobilität: freibeweglich
Sporulation: negativ
Gramfärbung: negativ
Kolonieform: kreisförmig; ungeteilt, glatter Rand; wenig konvex; glatte Oberfläche; schwach gelb

(2) Physiologische Eigenschaften

Katalase: positiv
Oxidase: positiv
O/F-Test: oxidativ
Nitratreduktion: positiv
Indolproduktion: negativ
Säureproduktion aus Glucose: negativ
Arginin-Dihydrolase: positiv
Urease: negativ
Äskulinhydrolyse: negativ
Gelatinehydrolyse: negativ
β-Galactosidase: negativ
Erzeugung von fluoreszierendem Pigment auf King's B-Agar: positiv

(3) Substratassimilation

Glucose: positiv
L-Arabinose: positiv
D-Mannose: positiv
D-Manitol: positiv
N-Acetyl-D-glucosamin: positiv
Maltose: negativ
Kaliumgluconat: positiv
n-Caprinat: positiv
Adipat: negativ
dl-Malat: positiv
Natriumcitrat: positiv
Phenylacetat: positiv

Züchtungsverfahren
Für die normale Züchtung eines Mikroorganismus für die Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren zur Erzeugung von PHA, zum Beispiel die Herstellung eines Vorratsstammes und die Vermehrung, um die für die Produktion von PHA und den aktiven Zustand erforderliche Anzahl von Zellen zu sichern, wird ein Kulturmedium geeignet ausgewählt, das die Komponenten enthält, die für die Vermehrung des zu verwendenden Mikroorganismus erforderlich sind. Es können zum Beispiel irgendein Typ eines Mediums, wie ein allgemeines natürliches Medium (Bouillonmedium, Hefeextrakt usw.) und ein synthetisches Medium mit einer zugesetzten Nährstoffquelle verwendet werden, sofern das Wachstum und Überleben des Mikroorganismus nicht nachteilig beeinflußt werden. Die Züchtungsbedingungen, die Temperatur, Belüftung und Bewegen, werden in Abhängigkeit vom verwendeten Mikroorganismus geeignet ausgewählt.
Für die Herstellung des gewünschten Polyhydroxyalkanoats unter Verwendung des PHA erzeugenden Mikroorganismus, wie er vorstehend beschrieben worden ist, können verwendet werden: ein Salz-Grundmedium, das zumindest ω-(2-Thienylsulfanyl)alkansäure mit der vorstehend aufgeführten chemischen Formel [3], die der Monomereinheit entspricht, und eine Kohlenstoffquelle für das Wachstum des Mikroorganismus oder dergleichen als Quellenmaterial enthält, das für die Erzeugung von PHA erforderlich ist. Es ist erwünscht, daß der Gehalt an ω-(2-Thienylsulfanyl)alkansäure im Medium 0,01 bis 1% (Gew./Vol.), stärker bevorzugt 0,02 bis 0,2% beträgt.
Die Wasserlöslichkeit der Alkansäure ist nicht sehr gut, es tritt jedoch selbst dann kein Problem auf, wenn sie suspendiert ist, sofern der erfindungsgemäße Mikroorganismus verwendet wird. In einigen Fällen kann sie in Form einer Lösung oder Suspension in einem Lösungsmittel, wie 1-Hexadecen oder n-Hexadecan, im Kulturmedium enthalten sein. In diesem Fall muß die Konzentration eines solchen Lösungsmittels in der Kulturmediumlösung 3% oder weniger betragen.
Für die Kohlenstoffquelle für das Wachstum können Nährstoffe, wie Hefeextrakt, Polypepton und Fleischextrakt, verwendet werden, und in bezug auf die Nützlichkeit als Matrix für den zu verwendenden Stamm können passende Verbindungen je nach Eignung aus Sacchariden, organischen Säuren, die als Zwischenprodukt im TCC-Zyklus erzeugt wurden, und organischen Säuren, die durch ein- oder zweistufige biochemische Reaktionen erzeugt wurden, oder Salzen davon, Aminosäuren oder Salzen davon, linearen Alkansäuren mit 4 bis 12 Kohlenstoffatomen oder Salzen davon ausgewählt werden.
Davon können als Saccharide eine oder mehrere Verbindungen geeignet verwendet werden, ausgewählt aus Aldosen, wie Glyceraldehyd, Erythrose, Arabinose, Xylose, Glucose, Galactose, Mannose und Fructose,
Alditolen, wie Glycerol, Erythritol und Xylitol,
Aldonsäuren, wie Gluconsäure,
Uronsäuren, wie Glucuronsäure und Galacturonsäure, und
Disacchariden, wie Maltose, Saccharose, Lactose und Cellobiose.
Zu geeigneten Beispielen für organische Säuren oder Salze davon gehören: Pyruvinsäure, Oxalessigsäure, Citronensäure, Isocitronensäure, Ketoglutarsäure, Succinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure und Milchsäure, oder es können eine oder mehrere Verbindungen geeignet verwendet werden, die aus deren Salzen ausgewählt sind.
Für Aminosäuren oder Salze davon können geeignet eine oder mehrere Verbindungen verwendet werden, die aus Glutaminsäure, Asparaginsäure und Salzen davon ausgewählt sind.
Davon werden Polypepton und Saccharide vorzugsweise verwendet, und von den Sacchariden ist mindestens ein Saccharid stärker bevorzugt, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Glucose, Fructose und Mannose besteht. Es ist erwünscht, daß der Gehalt dieser Matrizes in jedem Kulturmedium gewöhnlich vorzugsweise 0,1 bis 5% (Gew./Vol.), stärker bevorzugt 0,2 bis 2% beträgt.
Als ein Beispiel wird der Mikroorganismus in einem organischen Medium gezüchtet, das etwa 0,1 bis 5,0% D-Glucose und etwa 0,01 bis 1,0% ω-(2-Thienylsulfanyl)alkansäure der chemischen Formel [3] oder dergleichen enthält, und die Zellen werden während des Zeitraums von der logarithmischen Wachstumsphase bis zur stationären Phase aufgefangen, wodurch das gewünschte PHA extrahiert werden kann. Anstelle von D-Glucose kann die gleiche Menge Hefeextrakt bereitgestellt werden.
Während des Zeitraums, in dem der Mikroorganismus das PHA produzieren und speichern kann, kann die Produktivität verbessert werden, wenn das ausreichende Wachstum des Mikroorganismus abgeschlossen ist, dem folgt das Einbringen der Zellen in ein anderes Medium, wobei der Gehalt der Stickstoffquellen, wie Ammoniumchlorid, auf einen geringen Wert begrenzt ist, und das weitere Züchten des Mikroorganismus mit Verbindungen, die eine gewünschte Matrix mit einer gewünschten Einheit bilden. Insbesondere kann ein mehrstufiges Verfahren gewählt werden, bei dem die vorstehend genannten Prozesse in mehreren Stufen verbunden sind. Es gibt zum Beispiel ein Verfahren, bei dem der Mikroorganismus während des Zeitraums von der logarithmischen Wachstumsphase bis zur stationären Phase in einem anorganischen Medium gezüchtet wird, das etwa 0,1 bis 5,0% D-Glucose und etwa 0,01 bis 10% ω-(2-Thienylsulfanyl)alkansäure mit der chemischen Formel [3] oder dergleichen enthält, und die Zellen durch Zentrifugentrennung oder dergleichen aufgefangen werden, dem folgt das weitere Züchten des Mikroorganismus in einem anorganischen Medium, das etwa 0,01 bis 10% ω-(2-Thienylsulfanyl)alkansäure mit der chemischen Formel [3] enthält, wobei der Gehalt der Stickstoffquellen auf einen geringen Wert oder fast bei Null begrenzt ist.
Die Züchtungstemperatur kann irgendeine Temperatur sein, die es ermöglicht, daß der vorstehend beschriebene Stamm geeignet wächst, und eine geeignete Temperatur beträgt zum Beispiel 15 bis 40°C, vorzugsweise 20 bis 35°C und stärker bevorzugt 20 bis 30°C.
Für die Züchtung kann irgendein Züchtungsverfahren angewendet werden, wie eine Flüssigkultur und eine Festphasenkultur, die es ermöglicht, daß der Mikroorganismus wächst und PHA erzeugt. Außerdem kann irgendein Kulturtyp verwendet werden, einschließlich einer diskontinuierlichen Kultur, einer Zulaufkultur, einer halbkontinuierlichen Kultur und einer kontinuierlichen Kultur. Als Form der Flüssigkultur gibt es ein Verfahren, bei dem mit einem Schüttelkolben eine Schwingung erzeugt wird, um Sauerstoff zuzuführen, und ein Verfahren, bei dem Sauerstoff zugeführt wird, indem ein rührendes Belüftungssystem mit einem Fermentorgefäß verwendet wird.
Das Salz-Grundmedium für die Verwendung im vorstehend beschriebenen Verfahren kann irgendein Medium sein, das Komponenten enthält, die für das Wachstum des Mikroorganismus notwendig sind, wie eine Phosphorquelle (zum Beispiel Phosphat, usw.), eine Stickstoffquelle (zum Beispiel ein Ammoniumsalz, Nitrat, usw.) und dergleichen, und Beispiele eines solchen Mediums schließen zum Beispiel das Kulturmedium MSB und das Kulturmedium M9 ein.
Die Zusammensetzung eines mineralischen Kulturmediums (Kulturmedium M9), das bei einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, ist wie folgt. Kulturmedium M9

Na₂HPO₄ 6,2 g

KH₂PO₄ 3,0 g

NaCl 0,5 g

NH₄CL 1,0 g

(pro Liter Medium, pH = 7,0)
Für ein vorteilhaftes Wachstum und die vorteilhafte Erzeugung von PHA ist es außerdem erforderlich, etwa 0,3% (Vol./Vol.) einer Lösung einer geringfügigen Komponente zuzusetzen, die nachstehend aufgeführt ist.
Lösung der geringfügigen Komponente

Nitrilotriessigsäure: 1,5; MgSO₄: 3,0;
MnSO₄: 0,5; NaCl: 1,0; FeSO₄: 0,1;
CaCl₂: 0,1; CoCl₂: 0,1; ZnSO₄: 0,1;
CuSO₄: 0,1; AlK(SO₄)₂: 0,1;
H₃BO₃: 0,1; Na₂MoO₄: 0,1; NiCl₂: 0,1
(pro Liter Medium, pH = 7,0)

Um das erfindungsgemäße PHA aus der Kulturlösung zu erhalten, kann ein gewöhnlich benutztes Verfahren angewendet werden. Ein Verfahren, bei dem PHA aus der Kulturlösung extrahiert und gereinigt wird, wird angewendet, wenn das PHA in die Kulturlösung ausgeschieden wurde, und ein Verfahren, bei dem PHA aus den Zellen herausgelöst und gereinigt wird, wird angewendet, wenn es in den Zellen gespeichert worden ist. Beim Auffangen des PHA aus den gezüchteten Zellen des Mikroorganismus ist zum Beispiel das Herauslösen mit einem organischen Lösungsmittel, wie Chloroform, das gewöhnlich durchgeführt wird, am bequemsten; anstelle von Chloroform kann jedoch Dioxan, Tetrahydrofuran, Acetonitril oder Aceton verwendet werden. In einer Umgebung, in der die Verwendung irgendeines organischen Lösungsmittels nicht bevorzugt ist, kann zudem ein Verfahren gewählt werden, bei dem die von PHA verschiedenen Zellkomponenten durch Behandlung mit einem oberflächenaktiven Mittel, wie SDS, durch Behandlung mit einem Enzym, wie Lysozym, oder durch Behandlung mit einem Reagenz, wie EDTA, entfernt werden, wodurch die Komponenten in der Zelle entfernt werden, womit das PHA allein aufgefangen wird.
Carbonsäurederivate
Als Carbonsäurederivat für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung wird ω-(2- Thienylsulfanyl)alkansäure mit der chemischen Formel [3] verwendet. Von den Carbonsäurederivaten stellt ω-(2-Thienylsulfanyl)alkansäure mit der chemischen Formel [11] eine neue Verbindung dar.
Verfahren zur Erzeugung von ω-(2-Thienylsulfanyl)alkansäure, wobei in der chemischen Formel [11] k = ω ist (ω ist eine ganze Zahl von 4 bis 11), schließen folgende ein.

1-1. Ein Verfahren, bei dem Thiophen-2-thiol mit ω-Bromalkansäure umgesetzt wird, wodurch ω-(2-Thienylsulfanyl)alkansäure mit der chemischen Formel 11 erhalten wird.
1-2. Ein Verfahren, bei dem Thiophen-2-thiol mit einem ω-Bromalkansäureester (als "Alkanoat" bezeichnet) umgesetzt wird, wodurch ω-(2-Thienylsulfanyl)alkanoat synthetisiert wird, gefolgt von der Hydrolyse des Esters, wodurch ω-(2-Thienylsulfanyl)alkansäure mit der chemischen Formel [11] erhalten wird.
1-3. Ein Verfahren, bei dem Thiophen-2-thiol mit ω-Brom-1-alkanol umgesetzt wird, wodurch ω-(2-Thienylsulfanyl)-1-alkanol synthetisiert wird, gefolgt von dessen Oxidation, wodurch ω-(2-Thienylsulfanyl)alkansäure mit der chemischen Formel [11] erhalten wird.
1-4. Ein Verfahren, bei dem Thiophen-2-thiol mit 1,ω-Dibromalkan umgesetzt wird, wodurch 2-[(ω-Bromalkyl)sulfanyl]tiophen synthetisiert wird, gefolgt vom Herstellen eines Grignard-Reagenz unter Verwendung von metallischem Magnesium, und Einführen von Kohlendioxidgas, wodurch ω-(2-Thienylsulfanyl)alkansäure mit der chemischen Formel [11] erhalten wird.
1-5. Ein Verfahren, bei dem Thiophen-2-thiol mit einem Lacton umgesetzt wird, wodurch ω-(2-Thienylsulfanyl)alkansäure mit der chemischen Formel [11] erhalten wird.

Die vorstehend beschriebenen Verfahren werden ausführlicher beschrieben.
Zuerst werden nachstehend Verfahren zur Herstellung von 5-(2-Thienylsulfanyl)valeriansäure mit der chemischen Formel [4] beschrieben.

2-1. Ein Verfahren, bei dem Thiophen-2-thiol mit 5-Bromvaleriansäure umgesetzt wird, wodurch 5-(2-Thienylsulfanyl)valeriansäure mit der chemischen Formel [4] erhalten wird.
2-2. Ein Verfahren, bei dem Thiophen-2-thiol mit 5-Bromvaleriat umgesetzt wird, wodurch 5-(2-Thienylsulfanyl)valeriat synthetisiert wird, gefolgt von der Hydrolyse des Esters, wodurch 5-(2-Thienylsulfanyl)valeriansäure mit der chemischen Formel [4] erhalten wird.
2-3. Ein Verfahren, bei dem Thiophen-2-thiol mit 5-Brom-1-pentanol umgesetzt wird, wodurch 5-(2-Thienylsulfanyl)-1-pentanol synthetisiert wird, gefolgt von dessen Oxidation, wodurch 5-(2-Thienylsulfanyl)valeriansäure mit der chemischen Formel [4] erhalten wird.
2-4. Ein Verfahren, bei dem Thiophen-2-thiol mit 1,4-Dibrombutan umgesetzt wird, wodurch 2-[(4-Brombutyl)sulfanyl]tiophen synthetisiert wird, gefolgt von der Herstellung eines Grignard-Reagenz, wobei metallisches Magnesium verwendet wird, und dem Einführen von Kohlendioxidgas, wodurch 5-(2-Thienylsulfanyl)valeriansäure mit der chemischen Formel [4] erhalten wird.
2-5. Ein Verfahren, bei dem Thiophen-2-thiol mit δ-Valerolacton umgesetzt wird, wodurch 5-(2-Thienylsulfanyl)valeriansäure mit der chemischen Formel [4] erhalten wird.

Nachstehend werden Verfahren zur Herstellung von 6-(2-Thienylsulfanyl)hexansäure mit der chemischen Formel [5] beschrieben.

3-1. Ein Verfahren, bei dem Thiophen-2-thiol mit 6-Bromhexansäure umgesetzt wird, wodurch 6-(2-Thienylsulfanyl)hexansäure mit der chemischen Formel [5] erhalten wird.
3-2. Ein Verfahren, bei dem Thiophen-2-thiol mit 6-Bromhexanoat umgesetzt wird, wodurch 6-(2-Thienylsulfanyl)hexanoat synthetisiert wird, gefolgt von der Hydrolyse des Esters, wodurch 6-(2-Thienylsulfanyl)hexansäure mit der chemischen Formel [5] erhalten wird.
3-3. Ein Verfahren, bei dem Thiophen-2-thiol mit 6-Brom-1-hexanol umgesetzt wird, wodurch 6-(2-Thienylsulfanyl)-1-hexanol synthetisiert wird, gefolgt von dessen Oxidation, wodurch 6-(2-Thienylsulfanyl)hexansäure mit der chemischen Formel [5] erhalten wird.
3-4. Ein Verfahren, bei dem Thiophen-2-thiol mit 1,5-Dibrompentan umgesetzt wird, wodurch 2-[(5-Brompentyl)sulfanyl]tiophen synthetisiert wird, gefolgt von der Herstellung eines Grignard-Reagenz unter Verwendung von metallischem Magnesium, und dem Einführen von Kohlendioxidgas, wodurch 6-(2-Thienylsulfanyl)hexansäure mit der chemischen Formel [5] erhalten wird.
3-5. Ein Verfahren, bei dem Thiophen-2-thiol mit ε-Caprolacton umgesetzt wird, wodurch 6-(2-Thienylsulfanyl)hexansäure mit der chemischen Formel [5] erhalten wird.

Außerdem sind die Züchtung der Mikroorganismen gemäß der vorliegenden Erfindung, die Produktion von PHA und die Speicherung des PHA in den Zellen durch den Mikroorganismus gemäß der vorliegenden Erfindung, das Auffangen des PHA aus den Zellen in der vorliegenden Erfindung und die Erzeugung des Carbonsäurederivats mit der chemischen Formel [11] nicht auf die vorstehend beschriebenen Verfahren begrenzt.
Nachstehend sind Beispiele beschrieben. Außerdem betrifft "%" in der folgenden Beschreibung den Gewichtsprozentsatz, wenn es nicht anders angegeben ist.
Beispiele
(Beispiel 1) Synthese von 5-(2-Thienylsulfanyl)valeriansäure
Für die Synthese der 5-(2-Thienylsulfanyl)valeriansäure wurde Thiophen-2-thiol mit Ethyl-5-bromvaleriat umgesetzt, wodurch Ethyl-5-(2-thienylsulfanyl)valeriat synthetisiert wurde, und danach wurde der Ethylester an dessen Ende hydrolysiert, wodurch die 5-(2-Thienylsulfanyl)valeriansäure erhalten wurde. Bezüglich Einzelheiten dieser Reaktion wurde die Reaktion gemäß den Fließschemata der Synthese durchgeführt, die in den 1 und 2 gezeigt sind. 39 g 5-(2-Thienylsulfanyl)valeriansäure wurden aus 24,3 g Thiophen-2-thiol aufgefangen, und die Ausbeute betrug 83%. Die Struktur der erhaltenen 5-(2-Thienylsulfanyl)valeriansäure wurde durch ¹H-NMR gemessen (FT-NMR: Bruker DPX400; ¹H-Resonanzfrequenz: 400 MHz; gemessenes Nuclid: ¹H; verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃; Bezug: Kapillare, die TMS/CDCl₃ enthielt; Meßtemperatur: Raumtemperatur). Das ¹H-NMR-Spektrum ist in 3 gezeigt. Außerdem ist die Zuordnung jedes Wasserstoffatoms, die in der nachstehenden chemischen Formel [6] gezeigt ist, in Tabelle 1 angegeben (¹H-NMR).
Tabelle 1 Ergebnis der Zuordnung der ¹H-NMR
(Beispiel 2) Synthese von 6-(2-Thienylsulfanyl)hexansäure
240 ml dehydratisiertes Aceton wurden in einen Rundkolben mit vier Öffnungen gegeben, und es wurden 15,21 g (0,11 Mol) Kaliumcarbonat zugesetzt, darauf wurde in einer Stickstoffatmosphäre gerührt. Dieser Lösung wurden 9,00 g (0,06 Mol) Natriumiodid und 8,14 g (0,07 Mol) Thiophen-2-thiol zugegeben, danach wurde bei Raumtemperatur in einer Stickstoffatmosphäre angemessen gerührt. Außerdem wurden 13,39 g (0,06 Mol) Ethyl-6-bromhexanoat zugesetzt, danach wurde 19 Stunden bei 65°C unter Rückfluß erhitzt.
Nach der Reaktion wurde Aceton mit einem Rotationsverdampfer verdampft, es wurde mit Chloroform extrahiert, Wasser wurde zugesetzt, um die Lösung in Phasen zu trennen, und die organische Phase wurde mit wasserfreiem Magnesiumsulfat dehydratisiert, danach wurde das Chloroform mit einem Rotationsverdampfer verdampft, und es wurde mit einer Vakuumpumpe getrocknet, wodurch 17,56 g des unbehandelten Ethyl-6-(2-thienylsulfanyl)hexanoats erhalten wurden.
Das so erhaltene unbehandelte Ethyl-6-(2-thienylsulfanyl)hexanoat wurde ohne Reinigung folgender Hydrolysereaktion unterzogen.
17,56 g des erhaltenen rohen Esters wurden in 300 ml eines Gemischs aus Ethanol/Wasser (1 : 9 (Vol./Vol.)) gelöst, und es wurde die 10-fache molare Menge Kaliumhydroxid zugesetzt, um die Reaktion 4 Stunden in einem Eisbad vorzunehmen.
Die Reaktionslösung wurde in etwa 2 l einer wäßrigen 0,1 m Salzsäurelösung gegossen, um sie anzusäuern. Die Extraktion erfolgte mit Toluol, und die organische Phase wurde mit wasserfreiem Magnesiumsulfat dehydratisiert, danach wurde das Toluol mit einem Rotationsverdampfer verdampft. Die so erhaltene unbehandelte 6-(2-Thienylthio)hexansäure wurde durch Säulenchromatographie über Kieselgel gereinigt (Entwicklungslösungsmittel: Chloroform : Methanol = 20 : 1), wodurch 7,21 g 6-(2-Thienylsulfanyl)hexansäure erhalten wurden.
Die auf Ethyl-6-bromhexanoat bezogene Gesamtausbeute betrug 52,2%.
Die Struktur der erhaltenen 6-(2-Thienylsulfanyl)hexansäure wurde durch ¹H-NMR bestimmt (FT-NMR: Bruker DPX400; ¹H-Resonanzfrequenz: 400 MHz; gemessenes Nuclid: ¹H; verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃; Bezug: Kapillare, die TMS/CDCl₃ enthielt; Meßtemperatur: Raumtemperatur). Das ¹H-NMR-Spektrum ist in 4 gezeigt. Außerdem ist die Zuordnung jedes Wasserstoffatoms, die in der nachstehenden chemischen Formel [7] gezeigt ist, in Tabelle 2 aufgeführt (¹H-NMR).
Tabelle 2 Ergebnis der Zuordnung der ¹H-NMR
Beispiel 3
Eine Kolonie des Stammes YN2 auf einer Agarplatte wurde in 200 ml Kulturmedium M9 geimpft, die 0,5% Polypepton und 0,1% der in Beispiel 1 erhaltenen 5-(2-Thienylsulfanyl)valeriansäure enthielt, und 30 Stunden bei 30°C in einem Schüttelkolben mit einem Volumen von 500 ml gezüchtet. Nach der Züchtung wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung geerntet und mit Methanol gereinigt und danach gefriergetrocknet. Die getrockneten Zellen wurden gewogen, danach wurde Chloroform zugesetzt und 72 Stunden bei Raumtemperatur (etwa 23°C) gerührt, wodurch ein Polymer herausgelöst wurde. Das Chloroform mit dem herausgelösten Polymer wurde filtriert und mit einem Verdampfer konzentriert, danach folgte das Auffangen der gefällten und fest gewordenen Teile mit kaltem Methanol und deren Trocknen bei reduziertem Druck, wodurch das gewünschte Polymer erhalten wurde. Das Gewicht der getrockneten Zellen betrug 153 mg, und das Gewicht des erhaltenen Polymers lag bei 92 mg.
Das Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gelpermeationschromatographie (GPC) gemessen (Tosoh HLC-8220 GPC, Säule:
Tosoh TSK-GEL Super HM-H, Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrol-Äquivalent). Für das erhaltene Polymer lautete das Ergebnis Mn = 196.000 und Mw = 570.000.
Die Struktur des erhaltenen Polymers wurde durch ¹H-NMR bestimmt (FT-NMR: Bruker DPX400; ¹H-Resonanzfrequenz: 400 MHz; gemessenes Nuclid: ¹H; verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃; Bezug: Kapillare, die TMS/CDCl₃ enthielt; Meßtemperatur: Raumtemperatur). Das ¹H-NMR-Spektrum ist in 5 gezeigt. Außerdem ist die Zuordnung jedes Wasserstoffatoms, die in der nachstehenden chemischen Formel [8] gezeigt ist, in der folgenden Tabelle 3 aufgeführt (¹H-NMR).
Tabelle 3 Ergebnis der Zuordnung der ¹H-NMR
Das Ergebnis der Zuordnung durch ¹H-NMR zeigt, daß die Menge der eingeführten 3-Hydroxy-5-(2-thienylsulfanyl)valeriansäure-Einheit als Prozentsatz von der aller Komponenten mindestens 80% betrug.
Beispiel 4
Eine Kolonie des Stammes YN2 auf einer Agarplatte wurde in 200 ml Kulturmedium M9 geimpft, das 0,5% Glucose und 0,05% 5-(2-Thienylsulfanyl)valeriansäure enthielt, und 45 Stunden bei 30°C in einem Schüttelkolben mit einem Volumen von 500 ml gezüchtet. Nach der Züchtung wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung geerntet und in ein Kulturmedium übertragen, das hergestellt worden war, indem 0,5% Glucose und 0,05% 5-(2-Thienylsulfanyl)valeriansäure zum Kulturmedium M9 gegeben wurde, das keine NH₄Cl-Komponente enthielt, worin die Zellen 48 Stunden bei 30°C gezüchtet wurden. Nach der Züchtung wurden die Zellen durch Zentrifugentrennung geerntet und mit Methanol gereinigt und danach gefriergetrocknet. Die getrockneten Zellen wurden gewogen, danach wurde Chloroform zugesetzt und das Polymer wurde 24 Stunden bei 60°C herausgelöst. Das Chloroform mit dem herausgelösten Polymer wurde filtriert und durch einen Verdampfer konzentriert, danach folgte das Auffangen der gefällten und fest gewordenen Teile durch kaltes Methanol und deren Trocknen bei reduziertem Druck, wodurch das gewünschte Polymer erhalten wurde. Das Gewicht der getrockneten Zellen betrug 332 mg, und das Gewicht des erhaltenen Polymers lag bei 202 mg.
Das Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gelpermeationschromatographie (GPC) gemessen (Tosoh HLC-8220 GPC, Säule: Tosoh TSK-GEL Super HM-H, Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrol-Äquivalent). Das Ergebnis lautete Mn = 212.000 und Mw = 564.000.
Die Struktur des erhaltenen Polymers wurde durch ¹H-NMR bestimmt (FT-NMR: Bruker DPX400; ¹H-Resonanzfrequenz: 400 MHz; gemessenes Nuclid: ¹H; verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃; Bezug: Kapillare, die TMS/CDCl₃ enthielt; Meßtemperatur: Raumtemperatur). Das Ergebnis zeigt, daß die Menge der eingeführten 3-Hydroxy-5-(2-thienylsulfanyl)valeriansäure-Einheit als Prozentsatz von der aller Komponenten mindestens 89% betrug.
Beispiel 5
Es wurde ein Polymer erhalten, wobei das Verfahren von Beispiel 4 angewendet wurde, außer daß anstelle von Glucose Natriumpyruvat verwendet wurde. Das Gewicht der getrockneten Zellen betrug 325 mg, und das Gewicht des erhaltenen Polymers lag bei 210 mg. Das Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gelpermeationschromatographie (GPC) gemessen (Tosoh HLC-8220 GPC, Säule: Tosoh TSK-GEL Super HM-H, Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrol-Äquivalent). Das Ergebnis lautete Mn = 260.000 und Mw = 763.000.
Die Struktur des erhaltenen Polymers wurde durch ¹H-NMR bestimmt (FT-NMR: Bruker DPX400; ¹H-Resonanzfrequenz: 400 MHz; gemessenes Nuclid: ¹H; verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃; Bezug: Kapillare, die TMS/CDCl₃ enthielt; Meßtemperatur: Raumtemperatur). Das Ergebnis zeigt, daß die Menge der eingeführten 3-Hydroxy-5-(2-thienylsulfanyl)valeriansäure-Einheit als Prozentsatz der aller Komponenten mindestens 91% betrug.
Beispiel 6
Es wurde ein Polymer erhalten, wobei das Verfahren von Beispiel 3 angewendet wurde, außer daß der Stamm H45 als Stamm verwendet wurde. Das Gewicht der getrockneten Zellen betrug 111 mg, und das Gewicht des erhaltenen Polymers lag bei 52 mg. Das Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gelpermeationschromatographie (GPC) gemessen (Tosoh HLC-8220 GPC, Säule: Tosoh TSK-GEL Super HM-H, Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrol-Äquivalent). Das Ergebnis lautete Mn = 203.000 und Mw = 518.000.
Die Struktur des erhaltenen Polymers wurde durch ¹H-NMR bestimmt (FT-NMR: Bruker DPX400; ¹H-Resonanzfrequenz: 400 MHz; gemessenes Nuclid: ¹H; verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃; Bezug: Kapillare, die TMS/CDCl₃ enthielt; Meßtemperatur: Raumtemperatur). Das Ergebnis zeigt, daß die Menge der eingeführten 3-Hydroxy-5-(2-thienylsulfanyl)valeriansäure-Einheit als Prozentsatz der aller Komponenten mindestens 93% betrug.
Beispiel 7
Es wurde ein Polymer erhalten, wobei das Verfahren von Beispiel 3 angewendet wurde, außer daß der Stamm P161 als Stamm verwendet wurde. Das Gewicht der getrockneten Zellen betrug 98 mg, und das Gewicht des erhaltenen Polymers lag bei 46 mg. Das Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gelpermeationschromatographie (GPC) gemessen (Tosoh HLC-8220 GPC, Säule: Tosoh TSK-GEL Super HM-H, Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrol-Äquivalent). Das Ergebnis lautete Mn = 187.000 und Mw = 539.000.
Die Struktur des erhaltenen Polymers wurde durch ¹H-NMR bestimmt (FT-NMR: Bruker DPX400; ¹H-Resonanzfrequenz: 400 MHz; gemessenes Nuclid: ¹H; verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃; Bezug: Kapillare, die TMS/CDCl₃ enthielt; Meßtemperatur: Raumtemperatur). Das Ergebnis zeigt, daß die Menge der eingeführten 3-Hydroxy-5-(2-thienylsulfanyl)valeriansäure-Einheit als Prozentsatz der aller Komponenten mindestens 93% betrug.
Beispiel 8
Es wurde ein Polymer erhalten, wobei das Verfahren von Beispiel 3 angewendet wurde, außer daß anstelle von 5-(2-Thienylsulfanyl)valeriansäure 6-(2-Thienylsulfanyl)hexansäure verwendet wurde. Das Gewicht der getrockneten Zellen betrug 199 mg, und das Gewicht des erhaltenen Polymers lag bei 94 mg. Das Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gelpermeationschromatographie (GPC) gemessen (Tosoh HLC-8220 GPC, Säule: Tosoh TSK-GEL Super HM-H, Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrol-Äquivalent). Das Ergebnis lautete Mn = 32.000 und Mw = 101.000.
Danach wurden beim erhaltenen Polymer ¹H-NMR-Messungen durchgeführt (FT-NMR: Bruker DPX400; ¹H-Resonanzfrequenz: 400 MHz; gemessenes Nuclid: ¹H; verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃; Bezug: Kapillare, die TMS/CDCl₃ enthielt; Meßtemperatur: Raumtemperatur). Das ¹H-NMR-Spektrum ist in 6 gezeigt. Außerdem ist die Zuordnung jedes Wasserstoffatoms, die in den nachstehenden chemischen Formeln [9] und [10] gezeigt ist, in Tabelle 4 aufgeführt (¹H-NMR).
Tabelle 4 Ergebnis der Zuordnung der ¹H-NMR
Das Ergebnis zeigt, daß die Menge der eingeführten 3-Hydroxy-6-(2-thienylsulfanyl)hexansäure-Einheit als Prozentsatz der aller Komponenten 46% oder mehr betrug, und die Menge der eingeführten 3-Hydroxy-4-(2-thienylsulfanyl)buttersäure-Einheit als Prozentsatz der aller Komponenten 36% oder mehr betrug.
Beispiel 9
Es wurde ein Polymer erhalten, wobei das Verfahren von Beispiel 4 angewendet wurde, außer daß anstelle von 5-(2-Thienylsulfanyl)valeriansäure 6-(2-Thienylsulfanyl)hexansäure verwendet wurde. Das Gewicht der getrockneten Zellen betrug 235 mg, und das Gewicht des erhaltenen Polymers lag bei 119 mg. Das Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gelpermeationschromatographie (GPC) gemessen (Tosoh HLC-8220 GPC, Säule: Tosoh TSK-GEL Super HM-H, Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrol-Äquivalent). Das Ergebnis lautete Mn = 29.000 und Mw = 82.000.
Die Struktur des erhaltenen Polymers wurde durch ¹H-NMR bestimmt (FT-NMR: Bruker DPX400; ¹H-Resonanzfrequenz: 400 MHz; gemessenes Nuclid: ¹H; verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃; Bezug: Kapillare, die TMS/CDCl₃ enthielt; Meßtemperatur: Raumtemperatur). Das Ergebnis zeigt, daß die Menge der eingeführten 3-Hydroxy-6-(2-thienylsulfanyl)hexansäure-Einheit als Prozentsatz der aller Komponenten 29% oder mehr betrug und die Menge der eingeführten 3-Hydroxy-4-(2-thienylsulfanyl)buttersäure-Einheit als Prozentsatz der aller Komponenten 62% oder mehr betrug.
Beispiel 10
Es wurde ein Polymer erhalten, wobei das Verfahren von Beispiel 5 angewendet wurde, außer daß anstelle von 5-(2-Thienylsulfanyl)valeriansäure 6-(2-Thienylsulfanyl)hexansäure verwendet wurde. Das Gewicht der getrockneten Zellen betrug 215 mg, und das Gewicht des erhaltenen Polymers lag bei 114 mg. Das Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gelpermeationschromatographie (GPC) gemessen (Tosoh HLC-8220 GPC, Säule: Tosoh TSK-GEL Super HM-H, Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrol-Äquivalent). Das Ergebnis lautete Mn = 37.000 und Mw = 109.000.
Die Struktur des erhaltenen Polymers wurde durch ¹H-NMR bestimmt (FT-NMR: Bruker DPX400; ¹H-Resonanzfrequenz: 400 MHz; gemessenes Nuclid: ¹H; verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃; Bezug: Kapillare, die TMS/CDCl₃ enthielt; Meßtemperatur: Raumtemperatur). Das Ergebnis zeigt, daß die Menge der eingeführten 3-Hydroxy-6-(2-thienylsulfanyl)hexansäure-Einheit als Prozentsatz der aller Komponenten 40% oder mehr betrug und die Menge der eingeführten 3-Hydroxy-4-(2-thienylsulfanyl)buttersäure-Einheit als Prozentsatz der aller Komponenten 49% oder mehr betrug.
Beispiel 11
Es wurde ein Polymer erhalten, wobei das Verfahren von Beispiel 6 angewendet wurde, außer daß anstelle von 5-(2-Thienylsulfanyl)valeriansäure 6-(2-Thienylsulfanyl)hexansäure verwendet wurde. Das Gewicht der getrockneten Zellen betrug 118 mg, und das Gewicht des erhaltenen Polymers lag bei 33 mg. Das Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gelpermeationschromatographie (GPC) gemessen (Tosoh HLC-8220 GPC, Säule: Tosoh TSK-GEL Super HM-H, Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrol-Äquivalent). Das Ergebnis lautete Mn = 26.000 und Mw = 59.000.
Das erhaltene Polymer wurde der Methanolyse nach einem herkömmlichen Verfahren unterzogen, danach wurde die Massenanalyse des Polymers mit einem Gaschromatographie-Massenspektrometer (GC-MS, Shimadzu QP-5050, EI-Methode) durchgeführt. Als Ergebnis wurden Methylester jeder 3-Hydroxy-alkansäure-Einheit mit einer linearen Alkylkette in der Seitenkette zusätzlich zur 3-Hydroxy-6-(2-thienylsulfanyl)hexansäure-Einheit und der 3-Hydroxy-4-(2-thienylsulfanyl)buttersäure-Einheit identifiziert. Die Arten und die Flächenverhältnisse (%) der Monomereinheiten, die durch die GC-MS identifiziert worden waren, sind in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5
Anschließend wurde die Struktur des erhaltenen Polymers durch ¹H-NMR bestimmt (FT-NMR: Bruker DPX400; ¹H-Resonanzfrequenz: 400 MHz; gemessenes Nuclid: ¹H; verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃; Bezug: Kapillare, die TMS/CDCl₃ enthielt; Meßtemperatur: Raumtemperatur). Das Ergebnis zeigt, daß die Menge der eingeführten 3-Hydroxy-6-(2-thienylsulfanyl)hexansäure-Einheit als Prozentsatz der aller Komponenten 28% oder mehr betrug und die Menge der eingeführten 3-Hydroxy-4-(2-thienylsulfanyl)buttersäure-Einheit als Prozentsatz der aller Komponenten 63% oder mehr betrug.
Beispiel 12
Es wurde ein Polymer erhalten, wobei das Verfahren von Beispiel 7 angewendet wurde, außer daß anstelle von 5-(2-Thienylsulfanyl)valeriansäure 6-(2-Thienylsulfanyl)hexansäure verwendet wurde. Das Gewicht der getrockneten Zellen betrug 93 mg, und das Gewicht des erhaltenen Polymers lag bei 21 mg. Das Molekulargewicht des erhaltenen Polymers wurde durch Gelpermeationschromatographie (GPC) gemessen (Tosoh HLC-8220 GPC, Säule: Tosoh TSK-GEL Super HM-H, Lösungsmittel: Chloroform, Polystyrol-Äquivalent). Das Ergebnis lautete Mn = 23.000 und Mw = 46.000.
Die Struktur des erhaltenen Polymers wurde durch ¹H-NMR bestimmt (FT-NMR: Bruker DPX400; ¹H-Resonanzfrequenz: 400 MHz; gemessenes Nuclid: ¹H; verwendetes Lösungsmittel: CDCl₃; Bezug: Kapillare, die TMS/CDCl₃ enthielt; Meßtemperatur: Raumtemperatur). Das Ergebnis zeigt, daß die Menge der eingeführten 3-Hydroxy-6-(2-thienylsulfanyl)hexansäure-Einheit als Prozentsatz der aller Komponenten 21% oder mehr betrug und die Menge der eingeführten 3-Hydroxy-4-(2-thienylsulfanyl)buttersäure-Einheit als Prozentsatz der aller Komponenten 67% oder mehr betrug.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden eine neue Substanz: 5-(2-Thienylsulfanyl)valeriansäure; eine neue Substanz: 6-(2-Thienylsulfanyl)hexansäure; und ein Polyhydroxyalkanoat mit einer Thienylgruppe in der Seitenkette und Verfahren zu deren Herstellung bereitgestellt.

Claims

Polyhydroxyalkanoat mit einer Einheit, die mit der chemischen Formel [1] angegeben wird:
worin n für eine ganze Zahl von 1 bis 9 steht.
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1, wobei eine Einheit, die von der mit der chemischen Formel [1] angegeben Einheit verschieden ist, mindestens eine der Einheiten umfaßt, die mit der chemischen Formel [2]:
worin m für eine ganze Zahl von 0 bis 8 steht; und der chemischen Formel [12] angegeben werden:
worin l für 3 oder 5 steht.
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1 oder 2, wobei n = 2 ist.
Polyhydroxyalkanoat nach Anspruch 1 oder 2, wobei n = 1 und/oder 3 ist.
Polyhydroxyalkanoat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, das ein Zahlenmittel des Molekulargewichts im Bereich von 10000 bis 1000000 hat.
Polyhydroxyalkanoat nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei 3-Hydroxylkansäure-Monomereinheiten alle in R-Konfiguration vorliegen.
Verfahren zur Herstellung eines Polyhydroxyalkanoats, das das Züchten eines Mikroorganismus in einem Kulturmedium umfaßt, das eine Verbindung enthält, die mit der chemischen Formel [3] angegeben wird:
worin k für eine ganze Zahl von 3 bis 11 steht, wodurch ein Polyhydroxyalkanoat mit einer Einheit erzeugt wird, die mit der chemischen Formel [1] angegeben wird:
worin n für eine ganze Zahl von 1 bis 9 steht.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei eine Einheit des Polyhydroxyalkanoats, die von der mit der chemischen Formel [1] angegebenen Einheit verschieden ist, mindestens eine der Einheiten umfaßt, die mit der chemischen Formel [2]:
worin m für eine ganze Zahl von 0 bis 8 steht; und der chemischen Formel [12] angegeben werden:
worin l für 3 oder 5 steht.
Verfahren nach Anspruch 8, das das Züchten des Mikroorganismus in einem Kulturmedium umfaßt, das die Verbindung enthält, die mit der chemischen Formel [3] angegeben wird (k = 4), wodurch das Polyhydroxyalkanoat erzeugt wird, das die Einheit, die mit der chemischen Formel [1] angegeben wird (n = 2), und mindestens eine der Einheiten umfaßt, die mit den chemischen Formeln [2] und [12] angegeben werden.
Verfahren nach Anspruch 8, das das Züchten des Mikroorganismus in einem Kulturmedium umfaßt, das die Verbindung enthält, die mit der chemischen Formel [3] angegeben wird (k = 5), wodurch das Polyhydroxyalkanoat erzeugt wird, das mindestens eine Einheit von den Einheiten, die mit der chemischen Formel [1] (n = 1) und mit der chemischen Formel [1] (n = 3) angegeben werden, umfasst, sowie mindestens eine der Einheiten, die mit den chemischen Formeln [2] und [12] angegeben werden, umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 10, wobei das Polyhydroxyalkanoat ein Zahlenmittel des Molekulargewichts im Bereich von 10000 bis 1000000 aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, wobei das Kulturmedium wenigstens eine der Verbindungen Peptide, organische Säuren, Aminosäuren und Saccharide enthält.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Peptid Polypepton ist.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die organische Säure eine oder mehrere organische Säuren oder Salze davon ist, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Pyruvinsäure, Oxalesssigsäure, Citronensäure, Isocitronensäure, Ketoglutarsäure, Succhinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Milchsäure und Salzen davon.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Aminosäure eine oder mehrere Aminosäuren oder Salze davon ist, die ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus Glutaminsäure, Asparaginsäure und Salzen davon.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei das Saccharid ein Saccharid oder mehrere Saccharide sind, die aus Glucose, Fructose, Mannose, Maltose, Cellobiose, Lactose und Saccharose ausgewählt sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 16, das ferner einen Schritt umfaßt, bei dem das Polyhydroxyalkanoat aus einer Zelle des im Medium gezüchteten Mikroorganismus aufgefangen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 17, wobei der Mikroorganismus zu Pseudomonas sp. gehört.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Mikroorganismus Pseudomonas cichorii YN2, FERM BP-7375 ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Mikroorganismus Pseudomonas cichorii H45, FERM BP-7374 ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei der Mikroorganismus Pseudomonas jessenii P161, FERM BP-7376 ist.
ω-(2-Thienylsulfanyl)alkansäure, die mit der chemischen Formel [11] angegeben wird:
worin k für eine ganze Zahl von 4 bis 11 steht.
5-(2-Thienylsulfanyl)valeriansäure, die mit der chemischen Formel [4] angegeben wird:
6-(2-Thienylsulfanyl)hexansäure, die mit der chemischen Formel [5] angegeben wird:
Verfahren zur Herstellung von ω-(2-Thienylsulfanyl)alkansäure, die mit der chemischen Formel [11] angegeben wird:
worin k für eine ganze Zahl von 4 bis 11 steht, wobei das Verfahren einen Schritt umfaßt, bei dem irgendeine der Verbindungen Bromalkansäure, ein Bromalkanoat-Derivat, Bromalkanol, Dibromalkan und Lacton mit Thiophen-2-thiol umgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei irgendeine der Verbindungen Bromalkansäure, ein Bromalkanoat-Derivat, Bromalkanol, Dibromalkan und Lacton eine Verbindung ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 5-Bromvaleriansäure, 5-Bromvalerat, 5-Brom-1-pentanol, 1,4-Dibrombutan und δ-Valerolacton besteht, und 5-(2-Thienylsulfanyl)valeriansäure erzeugt wird, die mit der chemischen Formel [4] angegeben wird.
Verfahren nach Anspruch 25, wobei irgendeine der Verbindungen Bromalkansäure, ein Bromalkanoat-Derivat, Bromalkanol, Dibromalkan und Lacton eine Verbindung ist, die aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus 6-Bromhexansäure, 6-Bromhexanoat, 6-Brom-1-hexanol, 1,5-Dibrompentan und ε-Caprolacton ausgewählt ist, und 6-(2-Thienylsulfanyl)hexansäure erzeugt wird, die mit der chemischen Formel [5] angegeben wird.