DE60202374T2

DE60202374T2 - Methode und Vorrichtung zur Aufnahme dreidimensionaler Abbildungen von schwebend gehaltenen Mikroobjekten unter Verwendung hochauflösender Mikroskopie

Info

Publication number: DE60202374T2
Application number: DE60202374T
Authority: DE
Inventors: Spencer Shorte; Torsten Müller; Thomas Schnelle
Original assignee: Evotec Technologies GmbH; Institut Pasteur de Lille
Current assignee: PerkinElmer Cellular Technologies Germany GmbH; Institut Pasteur de Lille
Priority date: 2002-10-25
Filing date: 2002-10-25
Publication date: 2005-12-08
Anticipated expiration: 2022-10-26
Also published as: EP1413911A1; EP1413911B1; AU2003298099A8; WO2004038484A3; WO2004038484A2; ATE285590T1; AU2003298099A1; DE60202374D1; US7738695B2; US20060126921A1

Description

Die Erfindung betrifft Verfahren und Vorrichtungen für hochauflösende Bildaufzeichnung von wenigstens einem Objekt, insbesondere mit einem Mikroskop.
1) Der Stand der Technik
A) Mikroskopie – in der biologischen Forschung
Die Entwicklung von fluoreszierenden biomolekularen Sonden, insbesondere fluoreszierenden Proteinen, welche die Beobachtung von sub-zellulären Prozessen und der Struktur innerhalb der lebenden Zellen ermöglicht, hat sich als eine Renaissance für die Lichtmikroskopie herausgestellt. Nun beinhalten oder beruhen eine Vielzahl von sich entwickelnden biochemischen Techniken auf der Kombination von fluoreszierenden Molekularsonden und Lichtmikroskopie. Sie stellen sowohl eine qualitative als auch eine quantitative Visualisierung spezifischer Molekulardynamiken bereit, welche den lebenden Zellaktivitäten zu Grunde liegen. Jedoch insofern, wie es jetzt deutlich ist, dass diese biologischen Vorgänge von räumlich-zeitlicher Untergliederung abhängen, liegt das Hauptgewicht für die Entwicklung in der Lichtmikroskopie in der Überwindung gewisser systematischer Probleme, welche unsere Fähigkeit, einfache, jedoch quantitativ genaue dreidimensionale Abbildung von fluoreszierenden Signalen innerhalb der lebenden Zellen wiederzugeben (nämlich 3-D Mikroskopie), behindern.
Drei systematische Hauptprobleme in der 3-D Mikroskopie Die Fähigkeit, dreidimensionale Abbildungen von fluoreszierenden Signalen von Mikroobjekten, welche durch Lichtmikroskopie sichtbar gemacht werden, wiederzugeben, wird hauptsächlich durch drei systematische Fehler begrenzt.
a) Axiale Abberation – der Verlängerungseffekt
Eine zentrale Frage in der Lichtmikroskopie ergibt sich aus den Beschränkungen auf Grund der räumlichen Auflösung von Bildern. Diese hängt von der Objektivlinse ab, welche verwendet wird, und von der Geometrie des Lichts, welches durch die Linse fokussiert wird. Im Allgemeinen werden Mikroskopobjektive mit einer starken Vergrößerung und einer hohen numerischen Blende zum Erzielen der besten Auflösung verwendet (z. B. 63x; 100x/N. A. 1,4 Ölimmersionslinse). Jedoch gibt es physikalische Beschränkungen für die Lichtsammlung durch eine Glaslinse eines jeglichen Objektivs. Insbesondere ist die xy-Auflösung immer (wenigstens zweimal) größer als in der z-Achse (genannt „optische" Achse). Im Besonderen liegt die xy-Auflösung bei ungefähr 100–150 nm, wohingegen die Auflösung entlang der z-Achse viel geringer (ungefähr 300 bis 500 nm) ist, und diese Tatsache ergibt einen systematischen Hauptfehler der Lichtmikroskopie – d. h. „axiale Aberration", wobei ein sphärisches Objekt im Brennpunkt eines Mikroskopobjektivs tatsächlich als elliptisch in seiner Form erscheint mit seiner größten Ausdehnung entlang der z-Achse, d. h. dem Lichtweg. Eine schematische Darstellung dieses Typs einer optischen Abberation (der "Verlängerungseffekt") wird in 9 gezeigt. Die Achsen der Mikroskopoptik sind x (9.1), y (9.2) und z (9.3). Ein Merkmal 9.4, welches ursprünglich in der Wirk lichkeit rund ist, erscheint als das verlängerte 9.5 auf Grund der optischen Abberation, und dieses Problem ist eines der Haupthindernisse, welches in 3-dimensionaler Abbildungsmikroskopie zu überwinden ist.
b) Chromatische Aberration – axiale Falschausrichtung vielfacher Wellenlängen
Zusätzlich zu den Problemen des optischen Aberrations und der verringerten axialen Auflösung, welche die Fähigkeit verringern, in 3-D mit einem Lichtmikroskop darzustellen, wird ein anderes Problem als „chromatische Aberration" oder „axiale chromatische Aberration" bezeichnet. Die chromatische Aberration tritt in Anwendungen auf, wo Vielfarbenbilder erzielt werden (Beyer). Wenn z-Abtastungen mit unterschiedlichen Wellenlängen durchgeführt werden, hängt die Lichtbeugung an der Glas-zu-Medium-Grenzfläche und innerhalb des gesamten Mikroskopaufbaus von der Wellenlänge ab. Als Folge daraus verändert sich der Brennpunkt für verschiedene Wellenlängen als eine Funktion der z-Achsen-Verschiebung. Verschiedene Typen an Korrekturmaßnahmen werden eingesetzt, um die chromatische Aberration zu überwinden, zum Beispiel in der konfokalen Mikroskopie (siehe unten) kann eine Kalibrierung der „Null"-Position (einzigartig für genau eine z-Achsenposition) für alle Farben durch eine Ausrichtung der Lichtwege für die unterschiedlichen Wellenlängen unter Verwendung vielfärbiger (künstlicher) räumlicher Kalibrierungsproben (so genannte „Fokusprüfmikropartikel") ausgeführt werden. Jedoch insofern als die Kalibrierung für genau eine z-Achsenposition passt, wird, wenn eine Verschiebung im Brennpunkt auftritt, wiederum eine systematische Fehlausrichtung auftreten.
c) Licht außerhalb des Brennpunkts und Beugungseffekte
Das dritte Problem der dreidimensionalen Fluoreszenzmikroskopie besteht darin, dass das Mikroobjekt selbst eine komplexe dreidimensionale Form umfasst und als solches die Bildvisualisierung von der Fokalebene stört. Diese Tatsache ruft eine Unzahl von damit in Verbindung stehenden Problemen hervor, für welche es keine einzelne allgemeine Lösung gibt. Nichtsdestoweniger sind diese Probleme untrennbar verbunden und müssen kritisch betrachtet werden, um eine wahre dreidimensionale Wiedergabe zu erzielen. Im Allgemeinen rühren diese Probleme von der Lichtverzerrung her, welche sowohl durch das Objekt selbst als auch von den nichtlinearen Eigenschaften der Lichtbeugung zwischen den unterschiedlichen Fokalebenen verursacht werden. Diese Arten von Problemen werden in der Fluoreszenzmikroskopie kritisch, wo so genanntes „Licht außerhalb des Brennpunkts" (Licht von Teilen eines Objekts, welche außerhalb der Fokalebene liegen) zu dem beitragen, was auf der Fokalebene beobachtet wird. Dieses Licht beeinträchtigt die Schärfe des Bildes insofern, als es einen „Schleier" von außerhalb des Brennpunktes in die Bildfokalebene einführt.
Es gibt zwei Wege, den Schleier von außerhalb des Brennpunktes auszuschalten oder zu verringern: i) Konfokalmikroskopie (siehe unten) und ii) Dekonvolution. Das Letztere ist ein berechnungsintensives, mathematisches Verfahren auf Grundlage eines Algorithmus zum Schärfen von Bildern (von jeder beliebigen Quelle), welche Licht von außerhalb des Brennpunkts enthalten. Im Allgemeinen erfordert das Verfahren, dass ein axialer Stapel an Bildern von der Probe in kleinen (z. B. 50–500 nm) Schritten gesammelt werden muss. Der axiale Stapel kann dann unter Verwendung besonderer Algorithmen verarbeitet werden, welche eine Vielzahl von optischen Parametern, darunter die Objektivlinse und Anregungs/Emissionswellenlängen miteinbeziehen. Der korrigierte Bilderstapel wird dann in ein dreidimensionales Modell des Objekts entweder durch Entfernen oder Neuzuweisen des identifizierten Lichts von außerhalb des Brennpunkts (Egner, Markham) umgewandelt. Unter Einsatz von entsprechender Graphikverarbeitungsleistung kann dieses dreidimensionale Modell dann in Animationen wiedergegeben werden, welche das Betrachten des Objekts von jedem beliebigen Betrachtungspunkt aus erlauben.
Nachteile dieses Lösungswegs sind, dass er berechnungsintensiv ist (was Zeit und Verarbeitungsleistung kostet) und dass er unter Ungenauigkeiten und künstlichen Objekten auf Grund seiner ausgeprägten Abhängigkeit von auf Berechnung basierenden Annahmen und/oder Korrekturen, welche in mehreren Stadien während des Verarbeitungsvorgangs angewendet werden müssen, leidet. Es muss auch beachtet werden, dass die besten Typen von Dekonvolutionsalgorithmen auf vorheriger Messung einer so genannten PSF (Punktausbreitungsfunktion) beruhen, welche für jede gegebene optische Konfiguration (d. h. den Mikroskopaufbau) spezifisch ist. Einfach gesagt, ist die PSF ein Maß der Lichtdiffusion von einem Punkt unterhalb der Auflösung innerhalb einer gegebenen Fokalebene und kann daher verwendet werden, um Licht von außerhalb des Brennpunkts zurück in sein richtiges 3-D-Voxel „wieder einzuordnen". Jedoch besteht ein Hauptproblem mit angewandten Algorithmen, welche eine PSF verwenden, darin, dass es äußerst schwierig ist, eine „gute" PSF zu messen. Insbesondere entsteht ein Hauptproblem aus der Tatsache, dass die PSF in einer beliebigen gegebenen Probe selbst als eine Funktion des axialen Abstands durch die Probe abgeän dert wird (Sedat). Diese Tatsache führt dazu, dass jede einzelne PSF nur für eine einzelne Fokalebene repräsentativ ist und daher Rekonstruktionen, welche auf z-Achsen-Stapel beruhen, verzerrt, wo klarerweise die z-Achse abgelenkt wird, um durch das Volumen einer gegebenen Probe hindurch abzutasten. Schließlich verändert zusätzlich zum Licht von außerhalb des Brennpunkts die Probe (wie oben festgehalten) durch Beugung die Streuung des Lichts durch ihr eigenes Volumen. Dies führt zu einer weiteren Gruppe von Problemen, wobei die Lichtemission von der Fokalebene auf Grund von Abschattung oder Beugung von Licht durch optisch dichte Bereiche innerhalb des Objekts selbst (z. B. Zelle), welche zwischen der Mikroskoplinse und den fluoreszierenden Merkmalen, welche abgebildet werden, liegen, verschlechtert wird.
Fortgeschrittene Techniken für verbesserte 3-D Fluoreszenzmikroskopie
Dreidimensionales Abbilden von Mikroobjekten erfordert, dass die obigen Probleme angegangen werden, und dies kann teilweise erzielt werden, indem man zahlreiche Arten neuartiger Lösungswege verwendet. Hierin fasst eine kurze Beschreibung einige der fortgeschrittenen Mikroskoptechniken am Stand der Technik, welcher derzeit verfügbar ist, zusammen. Jedoch sollte beachtet werden, dass alles wesentlich durch die Nützlichkeit der Erfindung, welche hierin beschrieben ist, verbessert wird. An diesem Punkt, wie auch bei der herkömmlichen Fluoreszenzmikroskopie, erzielen alle diese Techniken (ohne Ausnahme) die 3-D Wiedergabe durch mechanisches Abtasten des Brennpunkts durch vielfache z-Achsenerfassungen mit kleinen (nm) Intervallen, welche aus dem Probenvolumen gesammelt werden. Als solches muss das Mikroobjekt daher durch Haftung an einem optisch transparenten Oberflächensubstrat (normalerweise ein 150 Mikron dickes Deckgläschen) unbeweglich gehalten werden. Der sich daraus ergebende Bilder-"z-Stapel" muss dann durch berechnungsintensive Verarbeitung behandelt werden, um eine 3-D-Wiedergabe zu erzielen. WO 96/24875 beschreibt ein Stereomikroskop, in welchem zwei Ansichten eines Objekts durch Neigen der Aufnahme, in welcher das Objekt angeordnet ist, erzielt werden können. EP 0517454 beschreibt die Handhabung von Mikropartikeln.
Konfokalfluoreszenzmikroskopie mit Einzelphotonenanregung verwendet fokussiertes Laserlicht zur Fluoreszenzanregung und allgemein ein Visierloch im Weg der Fluoreszenzemission, welches es erlaubt, dass Licht vom Brennpunkt, das von der x, y Bildebene herkommt, hindurchgeht, aber welches wirksam Licht von außerhalb des Brennpunkts zurückweist. Fluoreszenzlicht, welches unter Verwendung von Visierlochsystemen gemessen wird, wird durch Einsatz von Photovervielfachern und einer Abtastvorrichtung erfasst. Mittels einer Alternative verwenden einige handelsübliche Konfokalsysteme ein sogenanntes "Drehscheiben"-System (Nipkow-Scheibensystem), welches ziemlich die gleichen Ergebnisse durch Zurückweisen von Licht von außerhalb des Brennpunkts erzielt. Jedoch unterscheidet sich das Detektionssystem insofern, als es eine CCD-Kamera umfasst, welche eine größere Detektionsgeschwindigkeit notwendig macht. Auf jedem Weg besteht der Vorteil der Konfokalmikroskopie darin, dass der Schleier von außerhalb des Brennpunkts stark verringert wird und durch Ausführen einer z-Abtastung können Stapel von konfokalen Bildern aus dem Probenvolumen erzeugt werden, um eine dreidimensionale Wiedergabe des abgebildeten Volumens aufzubauen. Beachten muss man, dass dieser Lö sungsweg noch immer unter den Problemen der chromatischen und der axialen Aberration leidet.
Konfokalfluoreszenzmikroskopie mit Mehrphotonenanregung
Ein Verfahren zur Verbesserung der Auflösung in der Fluoreszenzmikroskopie basiert auf dem Einsatz von Mehrphotonenlaseranregung. Fluoreszenzanregung eines Fluorophors tritt bei einer bestimmten Wellenlänge λ auf, welche nominal durch ihre besonderen Anregungsabsorptionsmaxima bestimmt ist. Wirkungsvolle Absorption eines einzelnen Photons bei dieser Wellenlänge führt zur Anregung und Emission von fluoreszierendem Licht (herkömmliche Fluoreszenzmikroskopie). Jedoch kann die Anregung auch durch gleichzeitige Absorption von zwei Photonen geringerer Energie erzielt werden, welche Wellenlängen von ungefähr der Hälfte der Anregungsmaxima zeigen. Dieser Modus von so genannter "Mehrphotonen"-Anregung wird als "biphotonisch oder Zwei-Photonen-" induzierte Fluoreszenz betrachtet und wird dank mit Hochenergie gepulster Laser möglich gemacht. Im Allgemeinen kann dieser Anregungsmodus als ein Mittel betrachtet werden, um Fluoreszenz von zum Beispiel einem blau-grün absorbierenden Fluorophor unter Verwendung von Mehrphotonenanregung von einem nahezu Infrarotlaser anzuregen, welcher Lichtpulse unter dem Mikrosekundenniveau emittiert. Insofern, als zwei Photonen von nahezu IR-Licht ausgerichtet sind und nur auf der Fokalebene des optischen Aufbaus kollidieren, ist die Energiedichte dieser Mehrphotonenanregung einzig auf ein einzelnes Femtolitervolumen innerhalb der Fokalebene des Mikroskops konzentriert. Als solches ist die Mehrphotonenanregung von Natur aus wirklich konfokal. Tatsächlich ergibt dieser Ansatz ein reines und nützliches Bild, frei von Fluoreszenz von "außerhalb des Brennpunkts".
Der Nachteil von Mehrphotonenfluoreszenzmikroskopie ist das Erfordernis, dass Hochenergie-gepulste Laser am Mikroskop angebracht werden müssen, was zu hohen Kosten und großem, schwer zu handhabendem Ausrüstungsaufbau, zu ebensolcher Wartung sowie Anwendung führt.
4Pi-Konfokal(theta)mikroskopie, Standing-Wave-Mikroskop (SWM), Interferenzmikroskop mit Interferenzbild aus inkohärenter Beleuchtung (I5M)
Die Erzeugung von höher aufgelösten dreidimensionalen Bildern von Zellen kann durch eine Kombination der oben erwähnten Techniken und Modifikationen des opto-mechanischen Aufbaus verbessert werden. Der Einsatz von zwei getrennten Objektivlinsen zur Anregung und Sammlung von Licht aus Fluoreszenzemission führt zu einem kleineren Detektionsvolumenelement und einer gleichseitigen Auflösung, in etwa viermal höher als für herkömmliche Fluoreszenzmikroskopie (Egner). Diese Technik wird in Verbindung mit Mehrphotonenfluoreszenzmikroskopie verwendet. In einem 4Pi-Konfokalfluoreszenzmikroskop werden zwei gegenüberliegende Mikroskopobjektivlinsen verwendet, um ein fluoreszierendes Objekt von beiden Seiten zu beleuchten und die fluoreszierenden Emissionen auf beiden Seiten zu sammeln. Konstruktive Interferenz von jeder der Beleuchtungswellenfronten im gemeinsamen Brennpunkt oder der Detektionswellenfronten in der gemeinsamen Detektionslochblende ergibt eine axiale Auflösung, welche ungefähr viermal höher ist als in einem Konfokalfluoreszenzmikroskop (Hell). Das Anregungs/Beobachtungsvolumen kann beträchtlich verringert werden, wenn die Detektionsachse um einen Winkel Theta (z. B. 90°) relativ zur Beleuchtungsachse wie in der Thetamikroskopie gedreht wird (Lindek). Beide Verfahren bringen wesentliche Beschränkungen für den Probenträger und das Mikroskopobjektiv, welche verwendet werden können, mit sich. Zusätzlich ist ein großer Aufwand damit verbunden, wenn die zwei Fokalvolumen der Objektivlinsen gefluchtet werden, was mit einer Genauigkeit unter Mikrometerniveau gemacht werden muss.
B) Mikroelektrode/Fluidische Kammer(n) für dreidimensionale Handhabung von Mikroobjekten
Halten und Anheben von Mikroobjekten durch negative Dielektrophorese in einem gut definierten elektrischen Feldminimum wurde seit 1992 beschrieben (Fuhr, G. et al. "Biochim. Biophys. Acta" 1108, 1992, 215–223). Zuerst wurden planare zweidimensionale Anordnungen von Mikroelektroden verwendet. Sie enthielten zum Beispiel vier Elektroden mit einem Spitze-zu-Spitze-Abstand von 100 bis 200 Mikrometern. Halten und Anheben von Objekten in diesen so genannten "Feldfallen" war nur möglich unter Verwendung von Wechselfeldern. Drehfelder hatten nur begrenzten Einfangwirkungsgrad und waren sehr empfindlich für hydrodynamisches Strömen (Schnelle, Th. et al. "J. Electrostatics" 46, 1993, 13–28, Schnelle, Th. et al. "J. Electrostatics" 50, 2000, 17–29, Schnelle, Th. et al. Appl. Phys. B" 70, 2000, 267–274, Reichle, Ch. et al. "Biochim. Biophys. Acta" 1459, 2000, 218–229). Die Entwicklung so genannter Zellenprozessoren – dreidimensionale Elektrodenanordnungen – führte zu "Feldkäfigen", welche aus acht Elektroden bestehen und geschlossene elektrische Feldkäfige aufbauen (Schnelle, Th. et al., 1993, siehe oben, Müller, Th. et al. "Biosensors & Bioelectronics" 14, 1999, 247–256, Reichle Chr. et al. "Electrophoresis" 22/2, 2001, 272–282). "Zellenprozessoren", welche dielektrische Feldkäfige (DFCs) enthalten, wurden in Verbindung mit einer Vielzahl von hochauflösenden optischen Techniken, welche auf Mikroobjekte angewendet wurden, verwendet, wie der Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS, Schnelle, Th. et al "Electrophoresis" 21, 2000, 66–73), der Kraftmessungen unter Einsatz von Laser-Tweezern (Fuhr, G. et al. "Appl. Phys. A." 67, 1998, 385–390), der Elektrorotation (Schnelle et al., siehe oben), der Messung der Bindungskräfte von Ligand-Rezeptoren (Reichle et al. 2001, siehe oben) und der konfokalen Laserabtastmikroskopie (Müller, Th. et al. "European Piophysics Journal" 29/4–5, 2000, 12D-3 (Poster); Wissel, H. et al. "American Journal of Physiology Lung Cell Mol. Physiol." 281, 2001, L345–L360).
2) Aufgabe der Erfindung
Die Aufgabe der Erfindung ist es, verbesserte hochauflösende Messverfahren bereitzustellen, insbesondere Abbildungsverfahren, welche die Nachteile herkömmlicher Verfahren vermeiden. Es ist eine besondere Aufgabe der Erfindung, eine allgemein anwendbare Lösung bereitzustellen, welche die hochauflösenden 3-D Abbildungsverfahren durch Überwinden, Verringern oder völliges Vermeiden der systematischen Fehler der auf Licht basierenden Mikroskopie, die oben beschrieben sind, verbessert. Die Erfindung soll einen insgesamt neuen Lösungsweg für die Erzeugung von dreidimensionalen Bildserien bereitstellen, welche sowohl quantitativ als auch qualitativ eine genauere räumliche Abbildung eines jeden gegebenen fluoreszierenden, biolumineszenten oder autofluoreszenten Mikroobjekts – z. B. einer lebenden Säugetierzelle, welche mit fluoreszierenden Molekülen gekennzeichnet ist, beschreiben. Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung bereitzustellen, welche in jede (und in alle) existierende(n) Fluoreszenzmikroskop technik(en) (wie oben beschrieben) implementiert werden kann.
Diese Aufgabe wird durch die Verfahren und Vorrichtungen gemäß der Ansprüche 1 beziehungsweise 15 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen der Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen definiert.
3) Zusammenfassung der Erfindung
Im Allgemeinen umfasst die hochauflösende Bildaufzeichnung gemäß der Erfindung ein Positionieren von wenigstens einem Objekt in einer Aufnahme in der optischen Achse eines Mikroskopabbildungssystems, Erzeugen von mindestens zwei Zwischenbildern des Objekts mit unterschiedlichen Orientierungen im Raum und Auswerten eines Objektbildes aus den Zwischenbildern, wobei die unterschiedlichen Orientierungen des Objekts durch Bewegen des Objekts als solches relativ zur Aufnahme bereitgestellt werden. Das Merkmal des bloßen Objektbewegens, während das Abbildungssystem und die Aufnahme an festen Positionen gehalten werden (z. B. in einem Laborsystem), weist den Vorteil des Bereitstellens von hochauflösenden Bildern ohne die mühsamen Veränderungen der opto-mechanischen Merkmale des Abbildungssystems auf. Der Begriff unterschiedliche Orientierung bezieht sich allgemein auf unterschiedliche geometrische Anordnungen des Objekts relativ zur optischen Achse. Die Anordnungen können durch Translationen und/oder Rotationen erzielt werden.
Die Erfindung kann die folgenden Probleme in der 3-D Lichtmikroskopie völlig vermeiden (1 und 2) oder minimieren (3):

1. Axiale Aberration – Verlängerungseffekt der abgebildeten Merkmale.
2. Chromatische Aberration – axiale Fehlausrichtung bei mehrfachen Wellenlängen.
3. Schattierungs/Beugungseffekte auf Grund von optisch dichten Bereichen.

Die Erfindung kann die folgenden Verfahren in der 3-D Lichtmikroskopie völlig optimieren (4 und 5) und stark verbessern (6):

4. 3-D Objektwiedergabe – leicht machbare 3-D Charakterisierung, KEINE BERECHNUNG NOTWENDIG.
5. Wiedereingliederung des "Schleiers" mittels auf PSF basierenden Algorithmus – PSF nur von einzelnem Voxel erforderlich.
6. Optische Auflösung – durch Verwenden von Abtastung von nur einer x, y Ebene, um die axiale Gestaltverteilung zu erfassen.

Eine grundlegende Idee der Erfindung, die hierin beschrieben ist, besteht darin, insbesondere eine DFC zu verwenden, um das Mikroobjekt selbst frei zu verschieben und/oder zu drehen, um die unterschiedlichen Bildebenen aufzuzeichnen, und das Messungsvolumen selbst bewegungslos zu halten (oder es in genau eine Dimension zu bewegen, z. B. Abtasten).
Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung werden diese Bewegungen des Mikroobjekts – z. B. eine lebende, suspendierte biologische Zelle – vorzugsweise durch zeitabhängige elektrische Wechselfelder und negativ dielektrophoretische Kräfte verwirklicht. Sie werden vorzugsweise in fluidischen Mikrochips erzeugt, welche DFCs enthalten, die so angepasst sind, um bestimmte Bewegungen des Mikroobjekts im dreidimensionalen Raum zu erzielen. In diesem Zusammenhang haben wir umgesetzt und nachgewiesen, dass ein DFC, welcher acht Mikroelektroden umfasst, die einen geschlossenen Feldkäfig bilden, ausreichende Stabilität und Steuerung bereitstellen, um diese Bewegungen zu erzielen. Idealerweise sind die Abmessungen – Durchmesser und Abstand zwischen den Elektroden – vorzugsweise innerhalb des Bereichs der Abmessung des Objekts, d. h. zwischen 1 und 1000 μm. Die Elektroden wurden innerhalb einer mikrofluidischen Kammer fest angebracht, die aus einem durchsichtigen Material hergestellt war, welches geeignet für hochauflösende Mikroskopie ist, z. B. Glas mit 150 μm Dicke. Negative Dielektrophorese wurde durch Anlegen von elektrischen Wechselfeldern in einem Frequenzbereich von 100 kHz bis 100 MHz induziert. Feldkäfige wurden erzeugt, zum Beispiel, durch Anlegen von Drehfeldern an die zwei Ebenen der vier Elektroden, jedes mit einer Phasenverschiebung von 90° zwischen den Elektroden innerhalb einer Ebene und von 180° zwischen den Ebenen. Während der Mikroobjektrotation ergab dieser Modus einen wirksamen dielektrischen Feldkäfig und eine hochstabile Positionierung in den x-, y- und z-Richtungen.
Daher basiert die Erfindung auf diesem überraschenden und unerwarteten Ergebnis der Erfinder, gemäß welchem Mikroobjekte, die in einem Fluid suspendiert werden, mit elektrischen Feldkräften mit einer Genauigkeit gehandhabt werden können, die für eine Bewertung des Objektbildes aus den Zwischenbildern ausreicht. Die Genauigkeit der Rotation wurde sogar trotz Asymmetrie- und/oder Gravitationseffekten erzielt. Somit wurde herausgefunden, dass das Objekt stabil in den x-, y- und z-Richtungen positioniert werden kann. Es kann um eine definierte Achse durch Ansprechen der Elektroden mit einem geeigneten Signal gedreht und ausgerichtet werden, welches durch die zeitabhängige Amplitude, Frequenz und Phase charakterisiert ist.
Der physikalische Grund für die Rotation eines Mikroobjekts ist die Polarisierung seiner Ladungen/Dipole innerhalb eines Drehfeldes. Das Drehmoment ist abhängig von der Feldstärke, der Feldfrequenz und den passiven elektrischen Eigenschaften des Objekts in Bezug auf das Suspensionsmedium. Das Drehmoment kann absichtlich durch Verwenden geeigneter Drehfelder, d. h. bestimmter Phasenverschiebungen zwischen den Elektroden und/oder einer bestimmten Geometrie der Elektrodenanordnungen induziert werden. Computer/Benutzergesteuerte Protokolle werden so angepasst, dass es möglich ist, die Elektroden abwechselnd auszulösen, um feststehende Protokolle der Mikroobjektbewegung und leichte machbare Richtungs- und Geschwindigkeitssteuerung zu erzielen. Die sich ergebende Vorrichtung soll in der Lage sein, dem Benutzer zu ermöglichen, die Rotationsachse, die Drehgeschwindigkeit und das Ausmaß/den Winkel der Ablenkung auszuwählen und zu verändern.
Mit dieser Vorrichtung kann das Rotieren des Objekts in einer fortlaufenden Art oder für definierte Zeitspannen und Winkel verwirklicht werden. Zum Beispiel kann eine horizontale Rotation in eine vertikale Rotation oder eine "willkürliche" Rotation verändert werden, während dieselbe z-Position beibehalten wird. Kleine Veränderungen der Rotationsachse können durch Abändern der Amplitude und/oder der Phase mindestens bei einer einzelnen Elektrode verändert werden. Darüber hinaus kann eine gut definierte Abänderung der z-Position durch Abändern der Amplitude und/oder der Phase innerhalb einer Elektrodenebene erzielt werden und die Rotationsachsen können ohne Beeinflussung der Positionierungsstabilität verändert werden.
Zum Einfangen von Objekten innerhalb eines DFC ohne Induzieren eines Drehmoments können Wechselfelder verwendet werden. Das Dipolmoment in z ist dann null und Führen in z-Richtung – d. h. das Positionieren entlang der z-Achse gegen die Schwerkraft – wird bloß durch höhere Momente, z. B. ein Quadrupolmoment, erzielt. Dies funktioniert am besten für ein Verhältnis von Objektdurchmesser im Vergleich zu Spitze-zu-Spitze-Abstand der DFC-Elektroden von 1 : 4 bis 1 : 10. Bevorzugte Feldmodulationen sind angepasst, um eine horizontale Rotation in eine vertikale Rotation oder eine "zufällige" Rotation zu verändern, während dieselbe z-Position beibehalten wird, um kleine Veränderungen der Rotationsachse-typischerweise 1° bis 10° – durch Verändern der Amplitude und/oder der Phase mindestens bei einer Elektrode anzulegen oder um die z-Position – typischerweise um 50 nm bis 10 μm – durch Abändern der Amplitude und/oder der Phase innerhalb einer Elektrodenebene zu verändern. Wenn das Objekt, das untersucht werden soll, eine asymmetrische Gestalt aufweist, können die Elektroden so gesteuert werden, dass das Objekt relativ zu einem feststehenden Rotationszentrum gedreht wird. Eine Abänderung der Winkelgeschwindigkeit und/oder des Rotationszentrums kann durch eine Feldamplitudenmodulation kompensiert werden. Im Sinne einer homogenen Kompensation werden vorzugsweise elektrische Feldkräfte durch eine Mehrzahl von Elektroden (ungefähr 8 oder mehr) erzeugt, welche das Objekt umgeben.
Gemäß einer alternativen Ausführungsform der Erfindung kann das Mikroobjekt durch Halten des Objekts an einer feststehenden Position mittels elektrischer Feldkräfte und durch Rotieren des Objekts mittels optischer Kräfte, wie sie z. B. mit Laser-Tweezern erzeugt werden, bewegt werden.
Bilderserien, die von der Mikroobjektrotation unter Verwendung der Erfindung erzeugt werden, enthalten charakteristische 3-D Rauminformationen, welche frei von Artefakten sind
Im Allgemeinen umfasst die hochauflösende Bildaufzeichnung gemäß der Erfindung ein Positionieren mindestens eines Objekts in einer Aufnahme in der optischen Achse eines Mikroskopabbildungssystems, ein Erzeugen von mindestens zwei Zwischenbildern des Objekts mit unterschiedlichen Orientierungen im Raum und Auswerten eines Objektbildes aus den Zwischenbildern, wobei die unterschiedlichen Orientierungen des Objekts durch Bewegen des Objekts als solches relativ zur Aufnahme bereitgestellt werden. Klarerweise weist das Rotieren eines Mikroobjekts, während das Abbildungssystem, die Optiken und Probenaufnahme in einer festen Position gehalten wird, den Vorteil des Erzeugens von x, y-Bildserien auf, welche implizit 3-D Einzelheiten aufdecken, welche vorübergehend axial zur Fokalebene sind, aber ohne axiale oder chromatische Aberration. Darüber hinaus ist diese 3-D Visualisierung leicht machbar, insofern als sie keine mühsamen axialen Veränderungen in der Fokalebene erfordert, welche normalerweise komplexe opto-mechanische Vorrichtungen erfordern.
Daher erlaubt die Erfindung praktisch, dass on-line "Echtzeit"-3D-Filme von Mikroobjekten erzeugt werden, welche normalerweise "virtuelles" Glätten durch off-line, vielschichtige und teure Methodenansätze erfordern.
Nützlichkeit und weitere Vorteile der Erfindung
Die Verfahren der Erfindung sind mit einem optischen Mikro skopabbildungssystem wie z. B. einem modifizierten herkömmlichen Fluoreszenzmikroskop umgesetzt, welches mit einer zweidimensionalen Kamera oder mit anderen Detektionselementen, die punktweise als eine Linie oder zwei dimensional angeordnet sind, ausgestattet ist. Im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung ist "hochauflösendes Abbilden" als Vermessen von Mikroobjekten im Raum mit maximaler optischer Auslösung (d. h. auf der x, y Ebene der Achsen ~100 nm) ohne Rückwirkung durch z-Achsenablenkung definiert, welche nominell die axiale Aberration und einen Verlust an Auflösung mit sich bringen sollte. Ein Mikroobjekt, welches abgebildet werden soll, ist ein biologisches oder künstliches Objekt mit einem typischen Querschnitt im Bereich von 1–100 μm. Abbilden eines Objekts umfasst im Allgemeinen eine Aufnahme der topographischen Objektmerkmale. Die Objektmerkmale umfassen das gesamte Objekt oder nur Teile desselben, sie sind auf der Oberfläche oder im Volumen des Objekts angeordnet. Die 3-D Objektgestalt kann aus den Zwischenbildern bewertet werden und dank der für die Erfindung besonderen Rotationen der suspendierten Zelle um eine feststehende x, y, z-Koordinate ergibt sich ein optimaler optischer Zugang auf jeden Ort innerhalb der Zelle. Somit macht es die Erfindung möglich, Bildebenen von unterschiedlichen Winkeln und Objektebenen ohne Bewegen des Mikroskopobjektivs oder des Abtasttisches des Mikroskops zu erzeugen. Für die Anwendung von Dekonvolutionsalgorithmen, welche PSF-basierte Kalibrierungen verwenden, weist dies den zusätzlichen Vorteil auf, dass nur eine einzelne PSF (einen feststehenden Abstand zum Objektiv gemessen und zusammenfallend mit der Fokalebene) angewendet werden muss.
Fortlaufendes Abbilden von gesteuerten Veränderungen in der Position des Objekts durch sein Rotieren um wenigstens eine horizontale Achse und eine vertikale Achse ist sehr nützlich für eine Verringerung des Berechnungsaufwands, welcher für eine dreidimensionale Bildgebung erforderlich ist. Eine Filmserie (siehe Figuren) der Zellrotation, welche mit einer Kamera mit relativ hoher Geschwindigkeit (1–50 Bilder/Sekunde) aufgenommen wird, ergibt eine "echte" Aufzeichnung einer dreidimensionalen Struktur, wodurch sie die virtuelle 3-D Wiedergabe ersetzt, wie sie von herkömmlicher opto-mechanischer z-Stapelerfassung erzeugt wird (wie oben beschrieben). In Abhängigkeit von der Phasenverschiebung der elektrischen Felder an den acht Elektroden des Feldkäfigs können willkürliche Rotationsachsen verwirklicht werden. Eine Rotation einer einzelnen Zelle um zwei unterschiedliche Achsen, welche durch ihre Mitte laufen – zum Beispiel innerhalb der x, y Ebene des Sichtfelds des Mikroskops und um die z-Achse herum – ermöglicht es, mehrfache Bildsätze wiederholt aufzunehmen, und die 3-D Struktur der Zelle kann vollständig aus allen Winkeln, nur durch die Anzahl der Abtastwiederholungen beschränkt, bewertet werden.
Die Erfindung kann leicht mit vielen unterschiedlichen Techniken der Fluoreszenzmikroskopie, darunter alle Konfokaltechniken, als auch mit Verfahren für Einzelmolekülerfassung [z. B. Fluoreszenzkorrelationsspektrokopie, Fluoreszenzintensitätsverteilungsanalyse (FIDA), Momentenanalyse der Fluoreszenzintensitätsverteilung (MAFID)] kombiniert werden. Zum Beispiel kann es vorteilhaft sein, einen Lichtstrahl zu bewegen, welcher durch das Objektiv in einer Dimension wie in einem Laserabtastmikroskop (Abtasten) hindurchgeht. Das Objekt kann langsam um eine horizontale (xy) und/oder vertikale (z) Achse gedreht werden, typischerweise mit einer Frequenz von 0,5 rps (Umdrehungen pro Sekunde) bis 1 rpm (Umdrehungen pro Minute). In die gleiche Richtung gehend, ergibt eine Rotation um die z-Achse und gleichzeitige Fixpunktabtastung in eine einzige Richtung (wie im "In-Sicht"-Ableser von molekuarer Fluoreszenz angewendet, welcher mit einem Linearstrahlabtaster ausgerüstet ist) eine zweidimensionale Abtastung einer Ebene innerhalb der Zelle. Photonenzählungs- und Signalverarbeitungstechniken können dann die fluoreszierenden Moleküle innerhalb einer bestimmten Ebene zählen. In die gleiche Richtung gehend, ist die Fähigkeit der Erfindung, die suspendierte Zelle entlang der z-Achse zu bewegen, von großer Nützlichkeit. Insbesondere beseitigt das Bewegen der Zelle den Bedarf, den Träger in Bezug auf das Mikroskopobjektiv zu bewegen. Daher tritt, sobald das optische System für Mehrfarbbeobachtungen ausgerichtet ist, keine chromatische Aberration auf Grund unterschiedlichen Refraktionsverhaltens von unterschiedlichen Anregungswellenlängen in den Mehrfarbenanwendungen auf.
Die Erfindung verbessert die Anwendung der bestehenden Algorithmen auf PSF-Basis zur 3-D Wiedergabe
Die Fähigkeit ein Mikroobjekt zu drehen, ist für das Abtasten von weiter unterteilten Domänen nützlich. Zum Beispiel kann dank der Erfindung eine lebende Zelle in Schwebe gehalten werden und in ihrer Ausgangsposition abgebildet werden, bevor sie um eine Achse innerhalb der x, y (äquatorialen) Ebene um einen definierten Winkel (z. B. 180°, 90° oder weniger) gedreht wird und dann wiederum in einer zweiten Position abgebildet wird. Derselbe Vorgang wird für eine Achse senkrecht zur ersten in der z-Ebene wiederholt. Dieser wiederholende Vorgang stellt eine Serie von Bildern derselben Zelle aus verschiedenen Winkeln bereit, welche grundsätzlich dazu verwendet werden können, das gesamte 3D- Volumen mit einer Auflösung und Genauigkeit aufzunehmen, die von der Anzahl der Bilder und unterschiedlichen Winkel, die miteinbezogen sind, abhängt (siehe unten). In Verbindung mit der Fähigkeit, das Mikroobjekt zu drehen, erlaubt es die Erfindung, kleine (50 nm–50 μm) Bewegungen auf der z-Achse zu erzielen. Daher kann ein Objekt gedreht und auf der z-Achse verschoben werden, um eine Serie von Bildern von demselben Sub-Volumen, aber von unterschiedlichen Ansichten aufzubauen. Klarerweise erlaubt dieser Typ von kombinierter drehender/axialer Handhabung, dass Objekte in den "optimalen Abbildungsraum", d. h. auf eine Fokalebene, eingeführt werden und innerhalb dieses ausgerichtet werden, wobei die Anwendung von Dekonvolutions- und Bildrekonstruktionsalgorithmen auf PSF-Basis gemäß den Korrekturen optimiert werden kann, welche die Absicht tragen, die räumliche und die chromatische Aberration zu minimieren. Solche bestehende Verfahren müssen immer die Koordinaten des optischen Messungsvolumens miteinbeziehen, welches durch die Position und die Eigenschaften des Mikroskopobjektivs relativ zu einer Probe mit feststehender Position definiert ist. Wenn sich die z-Position verändert (d. h. der Brennpunkt wird bewegt), verändern sich all diese Parameter (d. h. jene, welche die PSF und das axiale Volumen bestimmen) und müssen neu berechnet, neu vermessen oder abgeschätzt werden. Insofern, als es die Erfindung erlaubt, die optische Geometrie fest anzuordnen, verringert sie daher in großem Ausmaß die Fehler, welche der Messung und Anwendung von bestehenden Bildalgorithmen inhärent innewohnen, die für die Dekonvolution und Volumenrekonstruktion von z-Stapelbildserien verwendet werden.
Die Erfindung öffnet den Weg für die Entwicklung neuer Al gorithmen zur dreidimensionalen Bildrekonstruktion
Wie im vorangehenden Absatz erwähnt, öffnet die Erfindung zusätzlich zur Verbesserung der Anwendung der bestehenden Algorithmen auch den Weg zur Entwicklung von Bildverarbeitungsalgorithmen, welche früher auf andere Probleme angewendet wurden. Zum Beispiel werden Objekte in der Röntgencomputertomographie durch Drehung des Detektionssystems um das Objekt abgebildet. Durch Aufnehmen einer Mehrfachbildserie mit Zwischenkoordinaten um das Objekt herum ist es möglich, sowohl das dreidimensionale Volumen des Objekts wiederzugeben als auch die Auflösung der Bilder zu erhöhen. Daher ist es durch Extrapolation im Prinzip möglich, einen analogen algorithmischen Lösungsweg auf das Wiedergeben der Rotationsserie des Mikroobjekts, welche unter Verwendung der hierin beschriebenen Erfindung erzeugt wurde (z. B. siehe Anhang I) anzuwenden. Insofern unterliegt die Erfindung der Entwicklung von völlig neuen "3D Bildrekonstruktions"-Verfahren. Der primäre Vorteil dieser Art von Lösungsweg besteht darin, dass die Erfindung sicherstellt, dass das Abbilden einzig die x,y-Auflösungsebene verwendet, um ein Mikroobjekt von mehrfachen Ansichtspunkten zu visualisieren. Mit dem gegebenen Fehlen von axialer Aberration und der verringerten z-Achsenabtastauflösung müssen diese neuen Verfahren implizit 3D-Rekonstruktionsdarstellungen mit wesentlich höherer Auflösung als bei herkömmlichen Rekonstruktionstechniken liefern. Tatsächlich können solche Verfahren auch mit jenen bereits bestehenden Bildalgorithmentechniken verbunden werden, welche eine Kombination von PSF und Volumenwiedergabe verwenden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Vorrichtung für hochauflösendes Abbilden von mindestens einem Objekt, welche ein optisch-mikroskopisches Abbildungssystem mit einer Aufnahme zum Aufnehmen des Objekts und eine Steuerschaltung zum Steuern der Erzeugung der Zwischenbilder umfasst, wobei dieses Abbildungssystem mit einer Antriebsvorrichtung zum Bewegen des Objekts relativ zur Aufnahme ausgerüstet ist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Aufnahme mit einem fluidischen Mikrosystem mit einer Anordnung von Mikroelektroden ausgestattet, wobei die Antriebsvorrichtung die Antriebselektroden und eine Antriebsschaltung innerhalb der Steuerschaltung umfasst.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung beinhaltet die Steuerschaltung eine Schaltbox, welche ausgelegt ist, um vorbestimmt die Rotationsachse des Objekts umzuschalten. Die Schaltbox erlaubt vorbestimmte Handhabungen des Objekts als auch die Implementierung einer Zeitsteuerung.
Weitere vorteilhafte Ausführungsformen des Abbildungssystems sind durch eine mehrfache Elektrodenanordnung in einem fluidischen Mikrosystem charakterisiert. Die Mehrfach-Elektrodenanordnung umfasst z. B. wenigstens 3 Elektroden in einer Ebene, welche das Objekt umgeben. Diese Elektroden können für eine verbesserte Kompensation der Positions- oder Geschwindigkeitsabänderungen von asymmetrischen Objekten gesteuert werden.
Weitere Vorteile ergeben sich aus der Tatsache, dass die Objekthandhabung in der Aufnahme nicht das Objekt (z. B. die Physiologie der biologischen Zelle) beeinflusst. Hochauflösendes Abbilden gemäß der Erfindung kann sogar über eine lange Zeitspanne (z. B. 60 Minuten) ausgeführt werden.
4) Kurzbeschreibung der Zeichnungen
Weitere Einzelheiten und Vorteile der Erfindung werden im Folgenden mit Bezugnahme auf die beigefügten Zeichnungen beschrieben, wobei:
1 eine schematische Ansicht eines Objekts in einer Aufnahme ist,
2 eine Anordnung von Mikroelektroden zeigt,
3 eine Darstellung des Abtastens und der Erzeugung von Spin-Bildserien gemäß der Erfindung ist,
4, 5 weitere Darstellungen von Objektbewegungen in einer Aufnahme sind,
6 eine schematische Ansicht eines Abbildungssystems gemäß der Erfindung ist,
7, 8 Darstellungen von experimentellen Ergebnissen sind, und
9 eine Darstellung des Längungseffekts in herkömmlichen Mikroskopen ist.
5) Bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung
Zuerst werden Beispiele eines Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung mit Bezugnahme auf die 1 bis 5 beschrieben. Zum Veranschaulichen der Bezugsrichtungen zeigt 1 eine Standortansicht eines Objekts, welches unter sucht werden soll (z. B. eine biologische Zelle) in einer Aufnahme des Abbildungssystems, beziehungsweise die Position der Elektroden an der Aufnahme.
1 zeigt die Zelle 1.4, welche ein fluoreszierendes Merkmal 1.5 enthält. Die Zelle ist innerhalb des Feldkäfigs zwischen dem oberen Glassubstrat 1.1, welches die obere Elektrodenebene 1.2a trägt, und dem unteren Glassubstrat 1.3, welches die untere Elektrodenebene 1.2b trägt, durch das elektrische Feld eingefangen. Die Zelle wird um eine horizontale Achse (1.9) und/oder eine vertikale Achse (1.10) gedreht. Sie wird durch eine Mikroskopobjektivlinse 1.11 abgebildet, welche Licht einer bestimmten Wellenlänge 1.7 verwendet, welches auf ein Fokalvolumenelement 1.6 fokussiert ist. x-, y- und z-Achsen des optischen Aufbaus sind in perspektivischer Ansicht (1.8) gekennzeichnet.
Die Position der Elektroden des dielektrischen Feldkäfigs ist in 2 dargestellt. Die Bezugsziffern 1, 2, 3, 4 bezeichnen die Elektrodenspitzen der vier Elektroden innerhalb der oberen Elektrodenebene, d. h. auf dem oberen Glassubstrat des DFC-Kanals. Die Bezugsziffern 1', 2', 3', 4' bezeichnen die Elektrodenspitzen der vier Elektroden innerhalb der unteren Elektrodenebene, d. h. auf dem unteren Glassubstrat des DFC-Kanals, welches dem Mikroskopobjektiv gegenüber liegt. x, y und z sind die Achsen des optischen Aufbaus, wie er im Text beschrieben ist.
Kontinuierliches Abtasten
Das Verfahren der Erfindung basiert auf der Sammlung (Abtastung) von mindestens zwei Zwischenbildern des Objekts. Das Abtasten kann in einer ununterbrochenen Art durchge führt werden, wie mit Bezugnahme auf 3 beschrieben wird. Das Abtasten wird durch Drehen des Objekts zur Erzeugung von Spin-Bildserien erzielt. Die Zelle wird mit einer konstanten Geschwindigkeit von typischerweise 0,1–60 (z. B. ungefähr 1) Drehungen pro Minute gedreht und Datensätze (Zwischenbilder) werden mit einer Geschwindigkeit von typischerweise 1–1000 (z. B. 10) Frames pro Sekunde aufgenommen.
Die Zelle 3.1, welche eine Abmessung 3.2 von mehreren Mikrometern aufweist, wird ununterbrochen während der Rotation der Zelle, welche mit geringer Geschwindigkeit und hoher Genauigkeit erfolgt, in der z-Ebene 3.5, d. h. um die y-Achse (y), abgetastet. Jedes Merkmal (z. B. 3.3) der Zelle liegt innerhalb der Fokalebene 3, 7, welche eine Dicke von mehreren hundert Nanometern aufweist, zu einem bestimmten Zeitpunkt und wird dort mit höchster xy-Auflösung abgebildet. Nicht kontinuierliches Abtasten (siehe unten), d. h. eine xy-Bewegung von 90° (3.6), gefolgt von einer zweiten Rotation der Zelle innerhalb der z-Ebene (3.5), erlaubt das vollständige Abtasten. Dies positioniert ein Merkmal mit der Startposition 3.3 für das erste Abtasten auf die Startposition 3.4.
Nicht-kontinuierliches Abtasten
Beispiele von nicht-kontinuierlichem Abtasten sind in 4 dargestellt. Das nicht-kontinuierliche Abtasten ist durch eine Serie, oder durch einige Verbindungen darin, von Bewegungen gekennzeichnet, welche Rotationen und/oder z-Ablenkungen (4.4) auf einzelne Punkte, wo ein Bild aufgenommen wird oder ein Drehbild-Scan begonnen wird, umfassen. 4 zeigt ein Beispiel von Scannen, welches mehrfache Rotationen einsetzt. Eine Abtastung wird zu t = 0 sec. an der Position 4.1 mit einer Zellenrotationsgeschwindigkeit von ungefähr 1 Umdrehung pro Minute und einer Datenaufnahmegeschwindigkeit von 10 Kadern pro Sekunde begonnen. Die Zelle wird um die Spinachse (4.1.1) unter dem Winkel (4.1.2) gedreht. Die Zelle wird um 180° auf Position 4.2 und um 360° auf Position 4.3 gedreht. Das Merkmal 4.1.3 hat dann den vollen Kreis durchlaufen und das Merkmal 4.1.4 wurde dann zweimal von zwei unterscheidbaren Positionen aus abgetastet. Die 90°-Drehung auf Position 4.4 wird vorzugsweise durch eine Schaltbox ausgeführt, welche ein Teil der Kontroll-Schaltung ist, welche unten beschrieben wird (siehe 6).
Piezoelektischer Abtaster in Verbindung mit feststehenden Mehrfach-Abtastwinkeln
Die Spin-Bildserie der Erfindung kann bei gutem Ergebnis mit feststehendem Abtasten in einem abwechselnden Modus verbunden werden. 5 zeigt die Vorgänge, welche feststehende Abtastwinkel von 90° verwenden. Gemäß alternativer Ausführungsformen können andere Abtastwinkel verwendet werden.
Zuerst wird ein z-Scan von einer bewegungslosen Zelle an einer feststehenden Position 5.1 unter Verwendung eines piezoelektrischen Objektivabtasters (schematisch gezeigt bei 5.1.1) ausgeführt. Die z-Position des Brennpunkts wird in kleinen Schritten verändert, z. B. 0,1 bis 1 μm (z-Scan). Bezugsziffer 5.1.2 kennzeichnet ein Beispiel einer tatsächlichen Fokalebene. Nach dem Aufnehmen einer Serie von Bildern wird die Zelle um die y-Achse 5.1.4 um einen feststehenden Winkel von 90° (5.1.3) auf die Position 5.2 gedreht, worauf ein weiterer z-Scan folgt (5.2.1). Eine zweite Serie von Bildern wird aufgenommen. Eine weitere Rotation um 90° um die x-Achse 5.2.2 auf Position 5.3, gefolgt von einem weiteren z-Scan (5.3.1), schließt die Prozedur ab.
Gemäß dem obigen Prinzip wird das Merkmal 5.1.5 zweimal in zwei senkrechten Achsen abgetastet. In Position 5.1 werden die x-y-Bilder in Abhängigkeit von z aufgenommen:
5.1: (x, y → z)
nach Drehung 5.1.3 weist das Merkmal 5.1.5 eine neue z-Position in den x-y-Bildern auf:
5.1.3, 5.2: (z → x, y)
Beide Scans 5.1.1 und 5.2.1 liefern eine Mehrzahl von Bildern, welche Berechnung des x,y,z-Volumens des Merkmals 5.1.5 erlauben. Das Merkmal 5.1.6 wird bis zur zweiten Drehung nicht abgetastet. Das gesamte Objekt wird aus allen Koordinatenstapeln nach der zweiten Rotation nur um die x-Achse rekonstruiert.
6 stellt eine bevorzugte Ausführungsform einer hochauflösenden Abbildungsvorrichtung gemäß der Erfindung dar. Die Abbildungsvorrichtung umfasst ein optisches Mikroskop-Abbildungssystem (10), eine Aufnahme (20) und eine Kontroll-Schaltung (30). Vorzugsweise umfasst das Abbildungssystem (10) ein herkömmliches optisches Mikroskop (11), welches mit einem Objektiv mit Zylinderlinse (12) ausgestattet ist, und eine Abbildungskamera (13). Die Kamera (13) ist z. B. eine CCD-Kamera. Alternativ können Photodioden und Röhrenvervielfacher als Detektoren verwendet werden. Das Mikroskop (11) (schematisch gezeigt) kann relativ zur Aufnahme (20) mit einem Mikroskopantrieb (14) positioniert werden. Die Probenbeleuchtung wird durch das Mikroskop (11) oder (mit gestrichelten Linien gezeigt) mit einer eigenen Beleuchtungsvorrichtung (15) durchgeführt, welche auf der gegenüberliegenden Seite der Aufnahme (20) positioniert ist. Die Anordnung aus 6 kann eine Laser-Tweezer-Vorrichtung (nicht gezeigt) zum zusätzlichen Ausüben von optischen Kräften auf das Objekt umfassen.
Die Aufnahme (20) umfasst ein fluidisches Mikrosystem mit einem Kanal oder einer Kammer (21) zur Aufnahme einer Flüssigkeit mit wenigstens einem suspendierten Objekt, welches untersucht werden soll. Mikroelektroden (22) sind an den Wänden der Kammer (21) angeordnet, wie dies aus der herkömmlichen Mikrosystemtechnologie bekannt ist. Die Kammer (21) ist mit einem Abdeckglas (23) verschlossen und wird durch eine Halterung (24) getragen. Die Halterung (24) kann mit einer Aufnahmeantriebseinheit (25) ausgerichtet werden. Die Kontroll-Schaltung (30) umfasst einen Datensatzspeicher (31), einen Parameterspeicher (32), eine Schaltbox (33), eine Berechnungsschaltung (34) und einen Objektbildspeicher (35). Die Kontroll-Schaltung (30) ist mit weiteren Eingabe/Ausgabe-Vorrichtungen (40), z. B. mit einer Anzeige und einem Drucker, verbunden.
Zum Durchführen des Verfahrens gemäß der Erfindung kann das Objekt, welches untersucht werden soll, in der optischen Achse des Mikroskops (11) positioniert werden. Die Mikroelektroden werden mit einem bestimmten Satz an Parametern, welche in dem Parameterspeicher (32) enthalten sind, gesteuert. Die Parameter umfassen, z. B., die Phase, die Amplitude und Frequenz der elektrischen Felder, Informationen über den Steuermodus als auch die Objekteigenschaften. Gemäß der Parameter wird das Objekt innerhalb der Aufnahme (20), wie oben beschrieben, bewegt. Während der Bewegung wird eine Serie von mindestens zwei Datensätzen mit der Ka mera (13) aufgezeichnet und dem Datensatzspeicher (31) übermittelt. Die Datensätze werden in der Berechnungsschaltung (34) in Abhängigkeit von den Parametern (32) zum Erzielen des Objektbildes ausgewertet, welches dann dem Objektbildspeicher (35) übermittelt wird.
Die Schaltbox (33) ist mit dem Parameterspeicher (32) und der Berechnungsschaltung (34) verbunden. Die Schaltbox (33) ist für die Übermittlung vorbestimmter Schaltparameter an den Parameterspeicher (32) angeordnet. Gemäß den Schaltparametern wird ein Bewegungsmodus des Objekts in der Aufnahme (20) angepasst.
Beispiele/Abbildungsexperimente, durchgeführt mit einem prototypischen Aufbau auf Basis der Erfindung
-A- Visualisierung der Lamin-Struktur von HeLa-Zellen
Als ein Beispiel zum Studium eines zellulären Proteins durch live vorgenommene dreidimensionale Mikroskopie wurden fluoreszierende Kernlaminproteine in einer lebenden suspendierten Zelle unter Verwendung eines Prototyps der Erfindung abgebildet.
Lamine sind die Hauptbestandteile der Kernlamina, einem zweidimensionalen faserigen Netzwerk am Umfang des Kerns in höheren Eukaryoten, direkt unter der inneren Kernmembran liegend. Im Zuge von Zellzyklus-abhängigen dynamischen Vorgängen des Kerns in höheren Eukaryoten scheinen Lamine als auch Lamin-bindende Proteine wichtige Funktionen während verschiedener Schritte des post-mitotischen Kernwiederzusammenbaus zu besitzen und scheinen eine Rolle in verschiedenen pathologischen Vorgängen im Muskelgewebe (Emery- Dreifuss muskuläre Dystrophie, EDMD; dilatative Kardiomyopathie und Leitungssystemdefekt, DCM-CD; und Leyden-Möbius muskuläre Dystrophie, LGMD) und Fettgewebe (familiale partiale Lipodystrophie vom Typ Dunnigan, FPLD) zu spielen. Lamine sind dynamischer als ursprünglich gedacht. Diese Erkenntnisse zusammen zeigen die Notwendigkeit, die Lokalisierung der Lamine innerhalb der Zelle und ihre Dynamiken mit großer Genauigkeit zu untersuchen, um ihre Funktionen und Dysfunktionen in Erfahrung zu bringen. HeLa-Zellen wurden für diesen Zweck, welcher überdeutlich Laminprotein, welches mit dem fluoreszierenden Protein dsRed verschmolzen war, zum Vorschein brachte, verwendet.
Die Zellen wurden aus dem Kulturaufzuchtkolben unter Verwendung von Trypsin ausgesondert und in Cytocon^TM Puffer II, welcher 30 mM Salz/Phosphat-Puffer, ausgeglichen auf normo-osmolare Werte unter Verwendung von 0,3 M Inositol-Lösung, suspendiert. Die Zellen wurden in DFC4 Chips eingeführt und innerhalb des 30 μm Feldkäfigs (Abstand zwischen gegenüberliegenden Elektrodenspitzen innerhalb einer Ebene: 30 μm) unter Verwendung von Cytocon^TM 300 eingesperrt. Der Feldkäfig wurde mit 700 kHz und 1,9–2,6 Vrms unter Energie gesetzt. Die Zellen wurden einem Drehmoment unterworfen, wobei der "rot II"-Modus von Cytocon^TM 300 Verwendung fand. Die DFC4-Chips wurden auf einem Zeiss Axiovert 200 Mikroskop angebracht, welches mit der Photometrics Cool SNAP Kamera Hamamatsu und dem T. I. L. L. Vision-Imaging System ausgerüstet war. Die Zelle drehte sich mit einer konstanten Geschwindigkeit von ungefähr 20 Umdrehungen pro Minute und es wurde eine Spin-Bildserie mit einer Geschwindigkeit von 10 Kadern pro Sekunde mit 50 ms Belichtungszeit erzeugt. Die Rotationsachse wurde durch eine gesteuerte Modulation der Amplitude der oberen und unteren Elektrodenebene des Feldkäfigs ausgewählt.
7 zeigt ein Diagramm der Fluoreszenzintensität innerhalb eines Bildbereichs der HeLa-Zelle während der Spin-Bildserie des Experiments, welches hier beschrieben wird und welches teilweise unten in 9 gezeigt wird. Die Fluoreszenzintensität in willkürlichen Einheiten wird über der Anzahl der Bilder aufgezeichnet, welche mit einer Rate von 10 pro Sekunde aufgenommen werden. Die Position der Spitzen zeigt die Genauigkeit der Frequenz, welche für einen Zell-Spin erzielt werden kann. Die Periode kann aus dem Abstand von zwei Spitzen, z. B. zwischen Spitze 7-1 und 7-2, bestimmt werden.
Spin-Bildserien der HeLa-Zelle mit überdeutlich dargestellten Laminprotein, verschmolzen mit dem fluoreszierenden Protein dsRed, sind in 8 dargestellt. 8-1 zeigt das Bild, welches bei Sekunde 4 aufgenommen worden ist, 8-2 zeigt das Bild, welches bei Sekunde 21 aufgenommen worden ist, und 8-3 zeigt das Bild, welches bei Sekunde 34 aufgenommen worden ist. Das fluoreszierende Objekt 8-4 tritt in Bild 8-1 auf einer bestimmten Position auf, welche durch eine xy-Koordinate 8-5 angegeben ist, und es tritt auf einer identischen Position im Bild 8-3 nach zehn Umdrehungen auf.
-B- Rotation von Jurkat-Zellen um zwei unterschiedliche Rotationsachsen
Jurkat-Zellen werden in Cytocon^TM Puffer II suspendiert und in einen DFC-Chip eingeführt. Eine einzelne Zelle wurde im Zentrum des 30 μm-Feldkäfigs des Chips unter Verwendung eines Cytoman^TM und einer Frequenz von 700 kHz und einer Amp litude von 1,9–2,6 Vrms gefangen. Die Zelle konnte ununterbrochen um eine horizontale Achse als auch um eine vertikale Achse gedreht werden, ohne ihre Mittenposition zu verändern. Die Spinfrequenz konnte von 0,01 rps (Umdrehungen pro Sekunde) bis 0,5 rps durch Verändern der Amplitude in einem Bereich von 1,5–3 Vrms und/oder der Frequenz in einem Bereich von 0,3 MHz-8 MHz verändert werden.
Das Cytoman^TM stellt zwei unterschiedliche Rotationsfeldmodi und einen Wechselfeldmodus gemäß Tabelle 1 bereit. Eine Schaltbox ermöglicht den Wechsel zwischen zwei unterschiedlichen Spin-Achsen (um eine vertikale und eine horizontale Spin-Achse, siehe 2).
Tabelle 1: Ansprechen der acht DFC-Elektroden für einen Zellen-Spin um eine vertikale und eine horizontale Achse als auch für bewegungsloses Positionieren (keine Rotation). Die Phasenverschiebung des Feldvektors ist gegeben (Schnelle, Th. et al. "J. Electrostatics" 50, 2000, 17–29).
ANHANG I
Eine Dekonvolutions-, Volumsrekonstruktionsoperation basiert auf den folgenden Überlegungen:
"Ein digitales Bild (z. B. mikroskopisches Bild einer Verteilung von fluoreszierenden Molekülen) ist eine gefaltete 2-dimensionale Darstellung einer 3-dimensionalen Wirklichkeit. Die einzelne Information, welche an jedem Pixel gegeben wird, umfasst nicht nur das wahre Signal, welches aus einem einzelnen Punkt in der Fokalebene herauskommt, sondern auch sich verändernde Grade von einem zusätzlichen Signal, welches von fluoreszierenden Volumina von außerhalb des Fokus über und unterhalb der Fokalebene angehäuft wird, aber innerhalb der fokalen Tiefe entlang der z-Achse" (aus Shorte & Bolsover, 1999).
Fluoreszierende Proben wirken als selbstleuchtende Objekte, in welchen Punktquellen sich als unabhängige Quellen verhalten. Unter Vernachlässigung der Lichtstreuung kann die optische Dichte g an jedem Pixel als g = ⇐Hcdzbeschrieben werden, worin H der Extinktionskoeffizient und c die Absorberkonzentration ist. Zum Rekonstruieren eines 3-dimensionalen Bildes eines Objekts muss c aus den Gesamtheiten g und H für eine Mehrzahl von Bildebenen durch Dekonvolution erzielt werden.
Die Dekonvolution wird in Analogie zur herkömmlichen Rekonstruktion von radiographischen Projektionen (Tomographie) erzielt. In der Standardtomographie bewegt sich der Prüf ling nicht, sondern der radiographische Apparat dreht sich um ihn, um einen Satz Bilder zu bekommen. Die Werte c können rekonstruiert werden, wie von B. Chalmond et al. in "Inverse Problems", Vol. 15, 1999, pp. 399–411 beschrieben. Gemäß der vorliegenden Erfindung ist die Situation umgekehrt. Das Objekt, welches untersucht werden soll, wird gedreht, wohingegen das Mikroskop feststeht. Die herkömmlichen Tomographie-Algorithmen können nach einer numerischen Koordinatentransformation des Mikroskopaufbaus in den radiographischen Zusammenhang verwendet werden.

Claims

Verfahren zur hochauflösenden Bildaufzeichnung von mindestens einem Objekt mit einem Mikroskop (10), umfassend die Schritte: – Positionierung des Objekts in einer Aufnahme (20), die in der optischen Achse des Mikroskops angeordnet ist, – Erzeugung von mindestens zwei ersten Datensätzen pro Objekt, die Zwischenbilder des Objekts mit mindestens zwei verschiedenen Orientierungen relativ zur optischen Achse des Mikroskops repräsentieren, und – Bewertung der Datensätze, um eine quantitative, dreidimensionale Information zu erhalten, dadurch gekennzeichnet, dass die verschiedenen Orientierungen des Objekts durch eine Bewegung des Objekts relativ zur Aufnahme (20) bereitgestellt werden.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Bewegung des Objekts relativ zur Aufnahme eine Translation und/oder eine Rotation des Objekts unter dem Einfluss von elektrischen Feldkräften umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Translation mindestens eine Translation parallel und/oder senkrecht relativ zur optischen Achse umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Rotation mindestens eine Rotation mit einer Rotationsachse parallel zur optischen Achse umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Rotation mindestens eine Rotation mit einer Rotationsachse umfasst, die relativ zur optischen Achse geneigt ist.
Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Rotationsachse in einem Winkelbereich von bis zu 90° geneigt ist.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Rotation umfasst: – eine Rotation in einem kontinuierlichen Modus oder für vorbestimmte Perioden und Winkel, und/oder – eine Rotation mit sich ändernden Rotationsachsen.
Verfahren nach Anspruch 2, bei dem die Rotation durchgeführt wird, indem das Objekt mit den elektrischen Feldkräften an einer festen Position gehalten wird und das Objekt mit optischen Kräften gedreht wird.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend die Schritte einer Erzeugung weiterer Zwischenbilder des Objekts jeweils entsprechend mit einer anderen Fokalebene, wobei die Fokalebenen durch ein Scannen eines Objektivs (11) des Mikroskops (10) parallel zur optischen Achse eingestellt werden.
Verfahren nach Anspruch 9, bei dem die verschiedenen Orientierungen des Objekts und das Scannen eines Objektivs (11) in einem wechselweisen Modus durchgeführt werden.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Positionierung ein Suspendieren des Objekts in einer Flüssigkeit in der Aufnahme umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Bewertung der resultierenden Datensätze eine Prozedur umfasst, die dazu vorgesehen ist, Licht außerhalb des Fokus zu entfernen und/oder ein(e) dreidimensionale Karte/Bild des abgebildeten Objekts zu rekonstruieren.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das mindestens eine Objekt mindestens eine eukaryotische Zelle, mindestens eine prokaryotische Zelle und/oder mindestens einen künstlichen Partikel umfasst.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem das Mikroskop als ein Fluoreszenzmikroskop, als ein Phasenkontrastmikroskop, als ein Differenzial-Interferenzkontrastmikroskop oder ein Konfokalmikrospkop verwendet wird.
Abbildungseinrichtung, insbesondere zur hochauflösenden Bildaufzeichnung von mindestens einem Objekt, umfassend: – ein Mikroskop-Abbildungssystem (10) mit einer optischen Achse, – eine Aufnahme (20) zur Aufnahme des Objekts, wobei die Aufnahme in der optischen Achse angeordnet ist, und – eine Kontrollschaltung (30), die zur Erzeugung von mindestens zwei ersten Datensätzen pro Objekt angeordnet ist, die Zwischenbilder des Objekts mit mindestens zwei verschiedenen Orientierungen relativ zu der optischen Achse repräsentieren, und zur Bewertung der Datensätze zum Erhalten eines Objektbildes eingerichtet ist, gekennzeichnet durch eine Antriebseinrichung (22, 32) zur Bewegung des Objekts relativ zur Aufnahme (20).
Abbildungseinrichtung nach Anspruch 15, bei der die Aufnahme (20) eine Kammer (21) eines fluidischen Mikrosystems und die Antriebseinrichtung (22, 32) Mikroelektroden umfassen, die an Wänden der Kammer (21) angeordnet und mit der Kontroll-Schaltung (30) verbunden sind.
Abbildungseinrichtung nach Anspruch 16, bei der die Antriebseinrichtung (22, 32) mindestens drei Mikroelektroden umfasst, die in einer Ebene in der Kammer (21) angeordnet sind.
Abbildungseinrichtung nach Anspruch 17, bei der die Antriebseinrichtung (22, 32) mindestens sechs Mikroelektroden umfasst, die in zwei Ebenen in der Kammer (21) angeordnet sind.
Abbildungseinrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 18, bei der die Kontroll-Schaltung (30) eine Schaltbox (34) umfasst, die zum Schalten einer Rotationsachse des Objekts vorgesehen ist.