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Technisches Gebiet
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf einen Biosensor für die schnelle
und einfache Quantifizierung eines in einer Probe enthaltenen spezifischen
Bestandteils.
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Stand der Technik
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Mit
der Absicht eine einfache Quantifizierung von Körperflüssigkeitsbestandteilen durch
normale Personen zu verwirklichen, wurden bisher verschiedene Arten
von Biosensoren, welche die spezifische katalytische Wirkung von
Enzymen nutzen, entwickelt.
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Im
Folgenden wird ein Verfahren für
die Glukosequantifizierung als ein Beispiel des Verfahrens für die Quantifizierung
eines in einer Probe enthaltenen Bestandteils beschrieben. Als ein
elektrochemisches Verfahren der Glukosequantifizierung ist ein Verfahren
unter Verwendung der Kombination von Glukoseoxidase und einer Sauerstoffelektrode
oder einer Wasserstoffperoxidelektrode im Allgemeinen gut bekannt
(siehe z.B. „Biosensor", herausgegeben von
Shuichi Suzuki, Kodansha).
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Glukoseoxidase
oxidiert selektiv Glukose als ein Substrat unter Verwendung von
Sauerstoff als ein Elektronenvermittler, bzw. Elektronenmediator,
zu Glukonolakton. Bei der Oxidation von Glukose durch Glukoseoxidase
in der Anwesenheit von Sauerstoff, wird Sauerstoff zu Wasserstoffperoxid
reduziert. Die verminderte Menge an Sauerstoff wird durch die Sauerstoffelektrode
gemessen, oder die erhöhte
Menge an Wasserstoffperoxid wird durch die Wasserstoffperoxidelektrode
gemessen. Da die verminderte Menge an Sauerstoff und die erhöhte Menge
an Wasserstoffperoxid proportional zu dem Glukosegehalt in der Probenlösung sind,
ist die Glukosequantifizierung auf der Grundlage der verminderten
Menge an Sauerstoff oder der erhöhten
Menge an Wasserstoffperoxid möglich.
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Wie
aus dem Reaktionsvorgang ersichtlich, hat das vorherige Verfahren
den Nachteil, dass die Messung durch die Sauerstoffkonzentration
in der Probenlösung
beeinträchtigt
wird, und wenn kein Sauerstoff in der Probenlösung vorhanden ist, ist die Messung
undurchführbar.
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Unter
diese Umständen
wurden Glukosesensoren entwickelt, welche als den Elektronenvermittler
eine organische Verbindung oder einen Metallkomplex, wie etwa Kaliumferricyanid,
ein Ferrocenderivat oder ein Chinonderivat, ohne Verwendung von
Sauerstoff als Elektronenvermittler, verwenden. In dieser Art von
Sensoren wird die reduzierte Form des Elektronenvermittlers, welcher
aus der Enzymreaktion resultiert, an einer Elektrode oxidiert und
auf der Grundlage der Menge dieses Oxidationsstroms kann die in
der Probenlösung
enthaltene Glukosekonzentration bestimmt werden. Unter Verwendung einer
derartigen organischen Verbindung oder eines derartigen Metallkomplexes
als Elektronenvermittler anstelle von Sauerstoff, ist es möglich eine
Reagenzschicht zu bilden, in welcher der Elektronenvermittler mit
Glukoseoxidase auf der Elektrode in einer genauen Menge und in einem
stabilen Zustand getragen wird. Ferner ist es ebenso möglich, die
Reagenzschicht in einem nahezu trockenen Zustand in das Elektrodensystem
zu integrieren, und daher haben Einweg-Glukosesensoren auf der Grundlage dieser Technik
vor kurzem eine große
Aufmerksamkeit auf sich gezogen. Ein typisches Beispiel dafür ist ein
in der japanischen Patentveröffentlichung
Nr. 2517153 offenbarter Biosensor. Mit einem derartigen Einweg-Glukosesensor
kann durch einfaches Einbringen einer Probenlösung in einen mit einer Messvorrichtung
abnehmbar verbundenen Sensor die Glukosekonzentration leicht durch
die Messvorrichtung gemessen werden.
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Gemäß dem Messverfahren
unter Verwendung des vorher beschriebenen Glukosesensors kann die
Konzentration an Glukose in einer Probe in etwa 30 Sekunden auf
der Grundlage des Antwortstroms bestimmt werden, welcher in der
Größe von 1 bis
10 μA/cm2 ist. Jedoch war es in den vergangenen Jahren
in verschiedenen Gebieten sehr erwünscht, Sensoren zu entwickeln,
die Glukose schneller und mit höherer
Empfindlichkeit quantifizieren können.
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Ebenfalls
wird in gewöhnlichen
elektrochemischen Glukosesensoren durch die Zugabe eines hydrophilen
Polymers, wie etwa Carboxymethylcellulose, zu der Reagenzschicht,
die Messung davor geschützt
durch Vibrationen beeinträchtigt
zu werden, die die Vorrichtung von außen empfängt. Das hydrophile Polymer
hat den weiteren Vorzug, dass es als ein Bindemittel dient, um das
Enzym moderat auf der Elektrode zu immobilisieren. Die Anwesenheit
des hydrophilen Polymers kann jedoch Änderungen in der katalytischen
Aktivität
der Glukoseoxidase oder der Thermodynamik der hydrolytischen Reaktion
von Glukonolakton zu Glukonsäure
verursachen, wodurch eine Akkumulation an Glukonolakton verursacht
wird, welches ein Produkt der Oxidationsreaktion von Glukose ist.
Die Akkumulation von Glukonolakton verursacht das Ablaufen der Umkehrreaktion und
verursacht eine Verminderung der Oxidationsreaktionsrate von Glukose.
Im Ergebnis wird die Menge der reduzierten Form des erzeugten Elektronenvermittlers
bei einer kurzen Reaktionszeit vermindert, was in einer Abnahme
der Stärke
der Stromantwort von Glukose resultiert, d.h. in der Empfindlichkeit
des Sensors. Insbesondere wird es notwendig, um eine ausreichende
Empfindlichkeit bei hohen Glukosekonzentrationen zu erhalten, die
Reaktionszeit zur Erzeugung großer
Mengen der reduzierten Form des Elektronenvermittlers zu verlängern, so
dass die Messung dazu neigt mehr Zeit zu benötigen.
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Hinsichtlich
der bestehenden Probleme ist es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung,
einen Biosensor zur Verfügung
zu stellen, der gut anspricht und schnell und sehr empfindlich einen
spezifischen Bestandteil in einer Probe quantifizieren kann.
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WO
01/036955 (
EP 1 235
069 A1 ) bezieht sich auf einen Biosensor mit einer elektrisch
isolierenden Grundplatte, einem Elektrodensystem mit einer Arbeitselektrode
und einer auf der Grundplatte angeordneten Gegenelektrode und einem
Reagenziensystem mit wenigstens einer Oxidoreduktase, einem hydrophilen
Polymer und einem Elektronenvermittler, wobei das Reagenziensystem
ferner eine Substanz umfasst, die eine Funktion zur Umwandlung eines
durch direkte Reaktion eines zu messenden Substrats mit der Oxidoreduktase
erzeugten organischen Produkts zu einer anderen Verbindung aufweist.
WO 01/036955 (
EP 1
235 069 A1 ) fällt
unter den Artikel 54(3) EPÜ und
ist daher nur für
die Zwecke der Neuheit relevant.
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EP 0 992 589 A2 bezieht
sich auf einen Glukosesensor mit einer elektrisch isolierenden Grundplatte,
einem Elektrodensystem einschließlich wenigstens einer Arbeitselektrode
und einer auf der Grundplatte gebildeten Gegenelektrode und einer Reaktionsschicht,
welche in Kontakt mit oder in der Nähe des Elektrodensystems gebildet
ist und wenigstens Glukosedehydrogenase enthält, dessen Coenzym Pyrrolochinolinchinon
ist, wobei die Reaktionsschicht weiterhin wenigstens einen Zusatzstoff ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Phthalsäure,
Phthalat, Maleinsäure,
Maleat, Bernsteinsäure,
Succinat, Triethanolamin, einem Triethanolaminsalz, Citronensäure, Citrat,
Dimethylglutarsäure, 2-(N-morpholino)ethansulfonsäure, ein
2-(N-morpholino)ethansulfonat,
Tris(hydroxymethyl)glycin, einem Tris(hydroxymethyl)glycinsalz,
Tris(hydroxymethyl)aminomethan, einem Tris(hydroxymethyl)aminomethansalz,
Imidazol und Colicin enthält.
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Offenbarung der Erfindung
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Ein
Biosensor gemäß der vorliegenden
Erfindung umfasst: eine elektrisch isolierende Grundplatte; ein
Elektrodensystem mit einer Arbeitselektrode und einer Gegenelektrode,
angeordnet auf der Grundplatte; und ein Reagenziensystem mit einer Oxidoreduktase,
welche eine Oxidationsreaktion von Glukose zu Glukonolakton katalysiert,
Glukonolaktonase und einen Puffer, wobei der Puffer ausgewählt ist
aus der Gruppe bestehend aus Maleinsäure und ihren Salzen, Bernsteinsäure und
ihren Salzen, Tris(hydroxymethyl)aminomethan und Piperazin-N,N'-bis (2-Ethansulfonsäure), und
wobei das Reagenziensystem ferner einen Elektronenmediator umfasst.
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Kurze Beschreibung der
Zeichnungen
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Die 1 ist
eine perspektivische Ansicht eines Biosensors, in welchem das Reagenzsystem
in einem Beispiel der vorliegenden Erfindung weggelassen ist.
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Die 2 ist
eine Längsquerschnittsansicht des Hauptteils
des gleichen Biosensors.
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Die 3 ist
eine graphische Darstellung, die die Antworteigenschaften des gleichen
Biosensors anzeigt.
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Die 4 ist
eine Längsquerschnittsansicht des
Hauptteils eines Biosensors in einem weiteren Beispiel der vorliegenden
Erfindung.
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Bevorzugte Ausführungsform
der Erfindung
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Ein
erfindungsgemäßer Biosensor
umfasst: eine elektrisch isolierende Grundplatte; ein Elektrodensystem
mit einer Arbeitselektrode und einer Gegenelektrode, angeordnet
auf der Grundplatte; und ein Reagenziensystem mit einer Oxidoreduktase, welche
eine Oxidationsreaktion von Glukose zu Glukonolakton katalysiert,
Glukonolaktonase und einen Puffer und einen Elektronenmediator bzw.
Elektronenvermittler.
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Darin
ist der vorher erwähnte
Puffer ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Maleinsäure, Maleaten, Bersteinsäure, Succinaten,
Tris(hydroxymethyl)aminomethan und Piperazin-N,N'-bis (2-ethansulfonsäure).
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Erfindungsgemäß wird Glukonolakton,
welches ein Produkt der Oxidation von Glukose durch die Wirkung
der Oxidoreduktase ist, durch Glukonolaktonase in Glukonsäure umgewandelt.
Dies erleichtert die Oxidationsreaktion von Glukose, so dass eine
ausreichende Antwort erhalten werden kann, selbst wenn die Messzeit
kurz ist. Ebenfalls kann durch Einstellen des pH des Reaktionssystems
die Aktivität
der in dem Biosensor enthaltenen Oxidoreduktase oder Glukonolaktonase,
verbessert werden, so dass die Antworteigenschaften des Sensors
weiter verbessert sind. Von den vorher aufgelisteten Puffern sind
Maleinsäure,
Maleate, Bernsteinsäure,
Succinate und Tris(hydroxymethyl)aminomethan bevorzugt, da sie eine
ausreichend hohe Löslichkeit
haben.
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Das
Reagenziensystem umfasst weiterhin einen Elektronenvermittler. Obwohl
der in der Probenlösung
gelöste
Sauerstoff als der Elektronenvermittler verwendet werden kann, ist
es bevorzugt, dass das Reagenziensystem einen Elektronenvermittler
umfasst. Beispiele des Elektronenvermittlers enthalten Metallkomplexe,
wie etwa Kaliumferricyanid, Osmium-tris(bipyridin) oder Ferrocenderivate, Chinonderivate,
wie etwa p-Benzochinon, Phenaziniumderivate, wie etwa Phenazinmethosulfat,
Phenothiaziniumderivate, wie etwa Methylenblau, Nikotinamidadenindinukleid
und Nikotinamidadenindinukleotidphosphorsäure. Diese Elektronenvermittler
werden einzeln oder in Kombination von zwei oder mehreren verwendet.
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Es
ist bevorzugt, dass das Reagenziensystem ferner ein hydrophiles
Polymer umfasst. Beispiele für
bevorzugte hydrophile Polymer sind Carboxyethylcellulose, Hydroxyethylcellulose,
Hydroxypropylcellulose, Methylcellulose, Ethylcellulose, Ethylhydroxyethylcellulose,
Carboxymethylethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Polyvinylalkohol,
Polyaminsäure, wie
etwa Polylysin, Polystyrolsulfonsäure, Gelatine und ihre Derivate,
ein Polymer von Acrylsäure
oder ihren Salzen, ein Polymer von Methacrylsäure oder ihren Salzen, Stärke und
ihre Derivate, ein Polymer von Maleinsäureanhydrid oder ihren Salzen,
und Agarosegel und seine Derivate. Wenn das Reagenziensystem ein
derartiges hydrophiles Polymer umfasst, wird die Messung nicht durch
Vibrationen beeinträchtigt,
die die Messvorrichtung von außen
empfängt.
Das hydrophile Polymer hat ebenfalls den Nutzen, dass es als ein
Bindemittel wirkt, um die Enzyme moderat auf den Elektroden zu immobilisieren.
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Die
Oxidoreduktase, welche die Oxidationsreaktion von Glukose katalysiert,
Glukonolaktonase und der Puffer können auf dem Sensor getragen
werden, während
sie miteinander gemischt sind. In diesem Fall wird der Herstellungsvorgang
des Biosensors einfach und eine einfache Produktion der Reagenzschicht
ist möglich.
Ferner wird, da die Oxidoreduktase in der Nähe der Glukonolaktonase vorhanden
ist, Glukonolakton, erzeugt durch die Wirkung der Oxidoreduktase,
schneller zu Glukonsäure
durch Glukonolaktonase umgewandelt. Daher ist die Oxidationsreaktivität der Glukose
verbessert, so dass eine genügende
Antwort erhalten werden kann, selbst wenn die Messzeit kürzer ist.
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Die
Oxidoreduktase, welche die Oxidationsreduktion von Glukose katalysiert,
und Glukonolaktonase können
durch den Sensor getragen werden, während sie voneinander getrennt
sind. In diesem Fall kann ein für
jedes Enzym geeigneter Puffer mit jedem Enzym gemischt werden oder
in die Nähe
jedes Enzyms zugegeben werden, so dass die Enzymaktivität jedes
Enzyms wirksamer verbessert werden kann.
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Die
Glukonolaktonase hat bevorzugt ihren Ursprung aus einem ausgewählt aus
der Gruppe bestehend aus Escherichia coli, Hefe, Mensch, Ratte, Schwein,
Rind, Aspergillus niger, Azotobacter vinelandii, Pseudomonas fluorescens,
Zymomonas mobilis, Streptomyces coelicolor, Deinococcus radiodurans
und Xylella fastidiosa. Von ihnen sind diejenigen, die aus Escherichia
coli, Hefe oder Aspergillus niger stammen, aufgrund der hohen Produktivität und der
ausreichenden Aktivität,
bevorzugter.
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Die
durch den Sensor getragene Puffermenge ist bevorzugt 5 nmol/mm2 oder weniger. In diesem Fall kann der pH
der zu messenden Probenlösung derartig
eingestellt werden, dass jedes Enzym ausreichend Aktivität aufweisen
kann ohne die Lösung von
Glukonlaktonase und der Oxidoreduktase, welche die Oxidationsreaktion
katalysiert, zu beeinträchtigen.
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Ferner
wird, wenn eine derartige Menge aufgetragen wird, der Antwortwert
von 0 mg/dl Glukose, d.h. der Leerwert, nicht erhöht und ein
sehr verlässlicher
Biosensor kann daher erhalten werden. Die Menge des aufgetragenen
Puffers ist bevorzugter 0,1 bis 3 nmol/mm2.
Für Einweg-Sensoren,
die zur Messung von 0,04 bis 20 μl
Blut als Probenlösung
ausgelegt sind, ist, vom Standpunkt der wirkungsvollen Glättung der
Schicht, die den Puffer enthält,
und der Verminderung des Leerwerts, die Menge bevorzugt in einem
Bereich von 5 bis 1000 nmol pro Sensor.
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Der
Einschluss des Puffers in der Reagenzschicht dient dazu die Reagenzschicht,
gebildet durch Auftragen und Trocknen einer Lösung, zu glätten. Wenn eine Reagenzschicht
durch Trocknen einer wässrigen
Lösung,
die ein Reagenz löst,
gebildet wird, wird die resultierende Reagenzschicht, da die Reagenzschicht
in groben Kristallen auskristallisiert, oder aus anderen Gründen rau
oder uneben. Dies ist insbesondere offensichtlich, wenn Kaliumferricyanid als
der Elektronenvermittler enthalten ist. Wenn die Reagenzschicht
jedoch den Puffer enthält,
wird die resultierende Schicht ohne derartige Unebenheit glatt.
Dies ist vermutlich so, da die Kristalle, erzeugt durch Trocknen
eines den Puffer lösenden
Lösungsmittels,
kleiner sind.
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Wenn
die Reagenzschicht in einer Probenlösung nach Zufuhr der Probenlösung zu
dem Sensor gelöst
wird, kann Luft zwischen die Probenlösung und die Unebenheit der
Reagenzschicht gelangen, und die Unebenheit der Reagenzschicht entwickelt möglicherweise
Luftblasen in der Probenlösung,
in welcher die Reagenzschicht gelöst wird. Die Entwicklung von
Luftblasen hindert die Probenlösung
daran, sich gleichmäßig in dem
Probenlösungszufuhrweg zu
bewegen, was die Quantifizierung schwierig macht. Daher kann durch
Glätten
der Reagenzschicht das vorher beschriebene Problem gelöst werden.
Ferner ermöglicht
die glatte Reagenzschicht die Verminderung in dem Volumen oder der
Höhe des Probenlösungszufuhrweges,
was eine Verminderung in der Menge der Probenlösung ermöglicht.
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Der
Puffer hat bevorzugt eine Pufferkapazität im Bereich von pH 4 bis 8.
Bei der Verwendung eines derartigen Puffers wird, wenn eine Probenlösung zugeführt und
das in dem Biosensor enthaltene Reagenz in der Probenlösung gelöst wird,
die ein Enzymreaktionssystem bildende Lösung auf etwa pH 4 bis 8 eingestellt.
In diesem pH-Bereich ist die Reaktivität des gesamten Reaktionssystems
verbessert, so dass eine ausreichende Antwort erhalten werden kann
selbst wenn die Messzeit kürzer
ist.
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Die
Oxidoreduktase, welche die Oxidationsreaktion von Glukose katalysiert,
ist bevorzugt ausgewählt
aus der Gruppe bestehend aus Glukoseoxidase, PQQ-abhängiger Glukosedehydrogenase, NAD-abhängiger Glukosedehydrogenase
und Pyranoseoxidase. Wenn Glukoseoxidase als die Oxidoredukaste
verwendet wird, welche die Oxidationsreaktion von Glukose katalysiert,
ist es bevorzugter, einen Puffer mit einer Pufferkapazität in einem
Bereich von pH 4 bis 6 zu verwenden. Wenn PQQ-abhängige Glukosedehydrogenase,
NAD-abhängige
Glukosedehydrogenase oder Pyranoseoxidase als die Oxidoreduktase,
welche die Oxidationsreaktion von Glukose katalysiert, verwendet
wird, ist es bevorzugter, einen Puffer mit einer Pufferkapazität in einem
Bereich von pH 5 bis 8 zu verwenden.
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Der
erfindungsgemäße Biosensor
kann ferner ein Deckelement umfassen, das auf der Grundplatte angeordnet
ist, um einen Probenlösungszufuhrweg
zu dem Elektrodensystem zwischen dem Deckelement und der Grundplatte
zu bilden. Diese Struktur hat den Vorteil, dass die Menge der Probe
in einem konstanten Niveau reguliert werden kann. Ebenso ermöglicht diese
Struktur, in dem Fall der Verwendung eines Puffers mit einer geringen
Löslichkeit,
dass der Puffer separat vom Enzym auf der Deckelementseite getragen
wird. Ferner kann für
den Fall, dass eine amphipathische Verbindung, welche später beschrieben
wird, durch Auftragen der amphipathischen Verbindung auf der Deckelementseite
getrennt von den Enzymen getragen wird, der folgende Vorteil erhalten
werden. Das heißt,
eine amphipathische Verbindungsschicht wird im Allgemeinen durch ein
Verfahren des Aufbringens einer Lösung eines organischen Lösungsmittels
einer amphipathischen Verbindung und Trocknen davon gebildet. Wenn
die amphipathische Verbindungsschicht auf einer enzymhaltige Schicht
gebildet wird, kann das die amphipathische Verbindung lösende organische
Lösungsmittel
einen Einfluss auf das Enzym ausüben. Ein
derartiger Einfluss des organischen Lösungsmittels auf das Enzym
kann durch Bildung der amphipathischen Verbindungsschicht auf der
Deckelementseite getrennt von der enzymhaltigen Schicht vermieden
werden.
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Der
erfindungsgemäße Biosensor
kann weiterhin eine amphipathische Verbindung in dem Reagenzsystem
umfassen. Als die amphipathische Verbindung sind Lecithin, Triton
X-100, und ähnliche,
besonders bevorzugt. Wenn das Reagenzsystem eine amphipathische
Verbindung enthält,
wird der Probenlösungszufuhrweg
des Sensors aufgrund der amphipathischen Wirkung der amphipathischen
Verbindung hydrophil, so dass eine Probenlösung, wie etwa Blut, umgehend
in den Probenlösungszufuhrweg
geführt
wird und die Entwicklung der Luftblasen in dem Probenlösungszufuhrweg
kann vermieden werden.
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Beispiele
für die
Probe, welche in dem erfindungsgemäßen Biosensor verwendet werden
kann, enthalten Blut, Plasma, Serum, wässrige Glukoselösung, Kulturflüssigkeit
und Fermentationsflüssigkeit.
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Im
Folgenden wird die vorliegende Erfindung anhand von Beispielen beschrieben,
aber die vorliegende Erfindung ist nicht nur auf diese Beispiele
beschränkt.
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Beispiel 1
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Die 1 ist
eine auseinandergezogene, perspektivische Ansicht eines Glukosesensors,
bei dem in diesem Beispiel das Reagenziensystem weggelassen ist.
Eine Silberpaste wurde auf eine aus Polyethylenterephthalat hergestellte,
elektrisch isolierende Grundplatte 1 durch Siebdruck aufgedruckt, um
die Leitungen 2 und 3 zu bilden. Nachfolgend wurde
eine gleitfähige
Kohlenstoffpaste, die ein Harzbindemittel enthält, auf die Grundplatte 1 gedruckt, um
eine Arbeitselektrode 4 zu bilden. Diese Arbeitselektrode 4 ist
in Kontakt mit der Leitung 2. Ferner wurde eine isolierende
Paste auf die Grundplatte 1 gedruckt, um eine Isolationsschicht 6 zu
bilden. Die Isolationsschicht 6 bedeckt den äußeren peripheren Bereich
der Arbeitselektrode 4, wodurch eine Fläche des exponierten Bereichs
der Arbeitselektrode 4 konstant gehalten wird. Dann wurde
eine gleitfähige
Kohlenstoffpaste, die einen Harzbinder enthält, auf die Grundplatte 1 gedruckt,
um in Kontakt mit der Leitung 3 zu sein, wodurch eine ringförmige Gegenelektrode 5 gebildet
wurde.
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Nachdem
ein Reagenziensystem auf der Grundplatte 1 in einer später beschriebenen
Art und Weise gebildet wurde, wurde eine Mittelabdeckung 8, mit
einem Schlitz 10, und eine obere Abdeckung 9, mit
einer Entlüftung 11 daran
in einer Positionsbeziehung gebunden, wie durch die gestrichelte
Linie in 1 gezeigt, um einen Biosensor
zu erzeugen. Ein Probenlösungszufuhrweg
wird in einem Bereich des Schlitzes 10 der Mittelabdeckung 8 durch
Kombination des Deckelements bestehend aus der Mittelabdeckung 8 und
der oberen Abdeckung 9 mit der Grundplatte 1 gebildet.
Das offene Ende des Schlitzes 10, welches an dem Ende des
Sensors ist, dient als ein Probenzufuhreinlass zu dem Probenlösungszufuhrweg.
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Die 2 ist
eine Längsquerschnittsansicht des
Biosensors dieses Beispiels. Zunächst
wird auf der Grundplatte 1, auf welcher das Elektrodensystem bestehend
aus der Arbeitselektrode 4 und der Gegenelektrode 5 gebildet
war, eine CMC-Schicht 7a durch Auftropfen einer wässrigen
Lösung
mit 0,5 Gew.-% Carboxymethylcellulose (hiernach als CMC bezeichnet),
welches ein hydrophiles Polymer ist, in einer Menge von 5 μl und Trocknen
davon, gebildet. Als nächstes
wurden Glukoseoxidase, welche ein Oxidoreduktase ist, die die Oxidationsreaktion
von Glukose katalysiert, Kaliumferricyanid, welches ein Elektronenvermittler
ist, und aus Aspergillus niger stammende Glukonolaktonase in einer
1 mM Maleinsäurepufferlösung (pH
6) gelöst,
welche ein Puffer ist. 4 μl
der Lösung
wurde auf die CMC-Schicht 7a aufgetropft und getrocknet,
um eine Reagenzschicht 7b zu bilden. Darin ist die Fläche der
Reagenzschicht 7b 12 mm2 und
die Menge des getragenen Maleinsäurepuffers
ist 0,33 nmol/mm2. In diesem Beispiel wird
ein Reagenziensystem 7 aus der CMC-Schicht 7a und
der Reagenzschicht 7b gebildet.
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Eine
wässrige
Lösung,
die eine bestimmte Menge an Glukose enthält, wurde als eine Probenlösung verwendet.
Wenn die Probenlösung
in Kontakt mit dem offenen Ende des Schlitzes 10 des Sensors gebracht
wird, wurde die Probenlösung
in den Probenlösungszufuhrweg
durch die Kapillarwirkung eingebracht. Nach Ablauf nach einer bestimmten
Zeit (Reaktionszeit), wurde eine Spannung von 500 mV an die Arbeitselektrode 4 in
Beziehung zu der Gegenelektrode 5 angelegt und der Wert
des Stroms, der zwischen der Arbeitselektrode 4 und der
Gegenelektrode 5 fließt,
wurde gemessen. Während
Glukose durch die katalytische Wirkung der Glukoseoxidase zu Glukonolakton
oxidiert wird, werden Ferricyanidionen zu Ferrocyanidionen reduziert.
Die Konzentration der derartig erzeugten Ferrocyanidionen ist proportional
zu der Konzentration an Glukose in der Probenlösung. Daher kann auf der Grundlage
des Oxidationsstroms, die Glukosekonzentration gemessen werden.
Das zu diesem Zeitpunkt gebildete Glukonolakton wird durch die Wirkung
der Glukonolaktonase abgebaut.
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Wie
in der 3 gezeigt, wurde der bei einer Reaktionszeit von
5 Sekunden erhaltene Antwortstrom gegen die Glukosekonzentration
in der Probenlösung
aufgetragen, und als ein Ergebnis wurde eine günstige lineare Beziehung zwischen
ihnen beobachtet. Daraus wurde abgeleitet, dass die Konzentration
eines zu messenden Substrats, mit guter Genauigkeit in einer kurzen
Reaktionszeit von 5 Sekunden quantifiziert werden kann. Dies ist
vermutlich so, weil die Glukonolakkonase aufgrund der Wirkung des in
die Reagenzschicht zugegeben Puffers eine ausreichende Aktivität aufweist.
Folglich wurde Glukonolakton, ein Produkt der Oxidationsreaktion
von Glukose, umgehend durch Glukonolaktonase abgebaut, ohne in der
Lösung
zu akkumulieren, so dass die Oxidationsreaktion der Glukose beschleunigt
wurde.
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Wie
vorher beschrieben kann, da ausreichend Antwortwerte selbst in einer
kurzen Reaktionszeit erhalten werden können, die Messzeit des Sensors
verkürzt
werden.
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Beispiel 2
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Die 4 ist
eine Längsquerschnittsansicht eines
Biosensors dieses Beispiels. Der Unterschied zum Beispiel 1 ist,
dass PQQ-abhängige
Glukosedehydrogenase, welche eine Oxidoreduktase ist, die die Oxidationsreaktion
von Glukose katalysiert, getrennt von der Glukonolaktonase durch
den Sensor getragen wird.
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Auf
einer Grundplatte 1, auf welcher ein Elektrodensystem gebildet
war, wurde eine CMC-Schicht 7a durch Auftropfen einer wässrigen Lösung von
0,5 Gew.-% CMC gebildet, welches ein hydrophiles Polymer ist, in
einer Menge von 5 μl
und Trocknen. Als nächstes
wurde aus Aspergillus niger stammende Glukonolatonase in einer 1
mM Kaliumhydrogenphthalatpufferlösung
(pH 6), welche ein Puffer ist, gelöst. 4 μl der Lösung wurde auf die CMC-Schicht 7a aufgetropft
und getrocknet, um eine Glukonolaktonaseschicht 12 zu bilden.
Darin ist die Fläche
der Glukonolaktonaseschicht 12 12 mm2 und die
aufgetragene Menge des Kaliumhydrogenphthalatpuffers ist 0,33 nmol/mm2. Dann wurde, mit der Absicht der Trennung
von der Glukonolaktonaseschicht 12, eine Schicht 13 aus
Polyvinylpyrrolidon (hiernach als PVP bezeichnet) auf der Glukonolaktonaseschicht 12 durch
Auftropfen einer wässrigen
Lösung mit
0,5 Gew.-% PVP in einer Menge von 5 μl und Trocknen davon gebildet.
Ferner wurde PQQ-abhängige Glukosedehydrogenase,
welche eine Oxidoreduktase ist, die die Oxidationsreaktion von Glukose katalysiert,
und Kaliumferricyanid, welches ein Elektronenvermittler ist, in
einer 1 mM Bernsteinsäurepufferlösung (pH
5), welche ein Puffer ist, gelöst.
4 μl der Lösung wurde
auf die PVP-Schicht 13 getropft und getrocknet, um eine
Glukosedehydrogenaseschicht 14 zu bilden. Darin ist die
Fläche
der Dehyrogenaseschicht 14 12 mm2 und
die aufgetragene Menge an Bernsteinsäurepuffer ist 0,33 nmol/mm2. Das Reagenziensystem dieses Beispiels
wird aus der CMC-Schicht 7a, der Glukonolaktonschicht 12,
der PVP-Schicht 13 und
der Glukosedehydrogenaseschicht 14 gebildet.
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Wie
in diesem Beispiel kann, durch räumliche Trennung
von zwei Enzymen durch ein lösliches Polymer,
wie etwa PVP, jeweils ein für
jedes Enzym geeigneter Puffer zugegeben. In diesem Fall, da ein lösliches
Polymer, wie etwa PVP, umgehend nach Zugabe einer biologischen Probe,
wie etwa Blut oder einer wässrigen
Glukoselösung,
zu dem Biosensor gelöst
wird, gibt es keine Gefahr der Verschlechterung der Reaktivität der Enzyme.
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Mit
dem Biosensor dieses Beispiels wurden unter Verwendung von wässrigen
Lösungen
als Probelösungen,
die bestimmte Mengen an Glukose enthalten, Messungen durchgeführt, und ähnliche
Ergebnisse wie im Beispiel 1 erhalten.
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Wie
vorher beschrieben, kann ebenfalls in dem Fall der Verwendung von
zwei Enzymen ein für jedes
Enzym geeigneter Puffer in die Nähe
jedes Enzyms gegeben werden. Folglich können, selbst wenn die Reaktionszeit
kürzer
ist, ausreichende Antwortwerte bei der Quantifizierung der Konzentration
des zu messenden Substrats erhalten werden, und die Messzeit des
Sensors kann verkürzt
werden.
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In
den vorhergehenden Beispielen war die an das Elektrodensystem angelegte
Spannung 500 mV, aber es gibt keine Beschränkung darauf. Es kann jede
Spannung sein, bei welcher der Elektronenvermittler an der Arbeitselektrode
oxidiert wird. Ebenfalls wurde als das Messverfahren das Verfahren
zum Nachweis des Stroms verwendet, aber der nachzuweisende Gegenstand
kann jede Ausgabe sein, die sich bei Ablauf der elektrochemischen
Reaktion ändert.
Zum Beispiel kann die Quantität
der Elektrizität in
einem bestimmten Zeitraum nachgewiesen werden. Da die Quantität der Elektrizität ein Integralwert des
Stroms in Bezug auf die Zeit ist, kann er mit der Konzentration
des zu messenden Substrats korreliert werden.
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Ein
unlöslicher
Träger
kann in dem Probenlösungszufuhrweg
vorgesehen werden, so dass ein oder mehrere in dem vorher erwähnten Reagenziensystem
enthaltene Reagenzien auf dem Träger
immobilisiert werden. Für
die Immobilisierung ist es bevorzugt, ein kovalentes Bindungsverfahren,
ein quervernetzendes Immobilisierungsverfahren, ein Adsorptionsverfahren
oder ein Immobilisierungsverfahren unter Verwendung der Interaktion
von Koordinationsbindung oder spezifische Bindung zu verwenden.
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In
den vorhergehenden Beispielen wurde Kohlenstoff als das Elektrodenmaterial
verwendet, aber es gibt keine Beschränkung darauf. Als das Arbeitselektrodenmaterial
ist es möglich,
jedes elektrisch leitfähige
Material zu verwenden, welches nicht selbst bei der Oxidation des
Elektronenvermittlers oxidiert wird, wie etwa Kohlenstoff, Platin,
Gold und Palladium. Als das Gegenelektrodenmaterial ist es üblich, jedes
elektrisch leitfähige
Material zu verwenden, welches allgemein verwendet wird, wie etwa
Silber und Platin, zusätzlich
zu Kohlenstoff und Gold. Zusätzlich
zu der Arbeitselektrode und der Gegenelektrode kann eine Elektrode
mit einem stabilen Potential als eine Referenzelektrode verwendet
werden. In diesem Fall wird die Spannung zwischen der Referenzelektrode
und der Arbeitselektrode angelegt. Die Form, Anordnung, Anzahl usw.
des Elektrodensystems sind nicht auf die in den Beispielen gezeigten beschränkt. Ebenso
ist die Form, die Anordnung, die Anzahl usw. der Elektrodenleitungen
und -anschlüsse
nicht auf die in den vorherigen Beispielen gezeigten beschränkt.
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In
den vorhergehenden Beispielen wurde das Reagenziensystem als auf
dem Elektrodensystem gebildet beschrieben, aber es kann in der Nähe des Elektrodensystems,
z.B. auf der oberen Abdeckungsseite, gebildet werden, um so in dem
Probenlösungszufuhrweg exponiert
zu sein.
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Industrielle Anwendbarkeit
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Bei
dem erfindungsgemäßen Biosensor
wird durch die Wirkung der Oxidoreduktase bei der Oxidation von
Glukose erzeugtes Glukonolakton durch Glukonolaktonase in Glukonsäure umgewandelt. Dies
ermöglicht,
dass die Oxidationsreaktion der Glukose gleichmäßig abläuft und eine ausreichende Antwort
erhalten werden kann, selbst wenn die Messzeit kurz ist. Ferner
können,
da die Aktivität
der Glukonolaktonase oder der Oxidoreduktase, welche die Oxidationsreaktion
von Glukose katalysiert, durch den Puffer verbessert wird, die Antworteigenschaften
des Sensors verbessert werden. Wie vorher beschrieben, kann die
vorliegende Erfindung einen Biosensor zur Verfügung stellen, der gut anspricht
und einen in einer Probe enthaltenen spezifischen Bestandteil schnell
und sehr empfindlich quantifizieren kann.