DE60311135T2

DE60311135T2 - Vorrichtung und verfahren zur behandlung eines flüssigen mediums mittels ultraschall zur verhinderung des wachstums von hyperproliferativen oder infizierten zellen

Info

Publication number: DE60311135T2
Application number: DE60311135T
Authority: DE
Inventors: D. Eric CORDEMANS DE MEULENAER; Baudouin Hannecart; Yves Canivet
Original assignee: Ashland Licensing and Intellectual Property LLC
Current assignee: Ineos Composites IP LLC
Priority date: 2002-11-04
Filing date: 2003-11-04
Publication date: 2008-01-31
Anticipated expiration: 2023-11-05
Also published as: CA2504585A1; ES2279178T3; EP1562642A1; EP1562642B1; JP2006514857A; BR0315900A; DK1562642T3; BRPI0315900B1; DE60311135D1; WO2004041314A1; AU2003291706A1; US7632413B2; US20080056937A1

Description

Technischer Bereich
Die vorliegende Erfindung betrifft die Anwendung von hochfrequentem niederenergetischem Ultraschall zur Behandlung flüssiger Medien. Bei speziellen Ausführungsformen können die hier aufgeführten Vorrichtungen und Verfahren eine signifikante Apoptose in Zellen induzieren, welche sich in einer physiologischen Flüssigkeit in Suspension befinden.
Stand der Technik
Zellen können dadurch geschädigt werden, dass diese dem Ultraschall ausgesetzt werden. Beispielsweise kann Ultraschall eine irreversible Zellschädigung verursachen und destruktive Modifikationen der Zellmembran auslösen. Mehrere Berichte lassen darauf schließen, dass die Kavitation, welche aus dem Zusammenbruch von durch akustische Druckfelder erzeugten Gasblasen resultiert, die Ursache für die Zellschädigung nach einer Bestrahlung mit Ultraschall sein kann. Es gibt auch Hinweise darauf, dass die Kavitation einsträngige Brüche in der DNA durch die Wirkung von restlichem Wasserstoffperoxid induziert.
Die Anwendung von Ultraschall bei der Krebstherapie ist zu einer wichtigen Kernfrage geworden. Ultraschall setzt man in Verbindung mit der Hyperthermie und in der Photo-, Strahlen- und Chemotherapie ein. Bekanntlich sind bösartige Zellen gegenüber diesen kombinierten Verfahren stärker anfällig als ihre normalen Gegenstücke. Die Wirkung von direkter Bestrahlung (z. B. mit Ultraschall, Laser, Licht) auf bestimmte Moleküle (z. B. klassische Photosensibilisatoren und Schallsensibilisatoren) besteht in der Erzeugung von hochaktiven Sauerstoffarten wie beispielsweise Singulett-Sauerstoff, Hyperoxidradikalen, Hydroperoxiden oder Fettsäureradikalen, welche eine wichtige Rolle bei der Krebsbehandlung spielen können, indem sie selektiv auf bösartige Zellen wirken.
Entsprechend der Herkunft der Strahlung wird die oben beschriebene Therapie als PDT (photodynamische Therapie) oder, wenn sie durch Ultraschall oder Sonolumineszenz entsteht,. als SDT (sonodynamische Therapie) bezeichnet. Die Zugabe eines Photosensibilisators ist für beide Therapien eine Grundvoraussetzung. Während die allgemeinen Wirkungen, die durch die SDT und die PDT bezüglich der Zelllebensfähigkeit induziert werden, unterschiedlich sind, erzeugen sowohl die SDT (ganz speziell in Bezug auf die Kavitationswirkung des Ultraschalls) als auch die PDT aktive, mit Sauerstoff angereicherte Spezies und führen zu einer Verringerung der Pegelwerte an intrazellularem Thiol. Im Fall der PDT durch Ultraviolett-A (UVA) kann die Apoptose von T-Helferzellen durch die Erzeugung von Singulett-Sauerstoff induziert werden, aber diese Wirkung hängt im Wesentlichen von der Anfangskonzentration an Photosensibilisatoren (PS) und von der örtlichen Sauerstoffkonzentration ab. Bei der SDT ist als Folge der hohen Energien, die daran beteiligt sind, die Zellauflösung die herausragende Erscheinung, die vermutlich weitere Wirkungen auf die überlebenden Zellen verdeckt.
Das US-Patent Nr. 4.971.991 , welches an Umemura et al. erteilt wurde, offenbart den Einsatz von Ultraschall zur Behandlung von Tumorzellen, beruht aber auf hohen Ultraschall-Leistungspegeln und beschreibt nicht die Anwendung von Mikroblasen. Weitere Patente, welche Ultraschall und Mikroblasen beschreiben wie beispielsweise das US-Patent Nr. 5.215.680 , welches an D'Arrigo erteilt wurde, beruhen auf der Nutzung der Kavitationswirkungen und der thermischen Wirkungen des Ultraschall zur Behandlung von Tumoren, da im Gegensatz zu individuellen Krebszellen deren Ausmaß durch die Dauer und die Anzahl der Behandlungen bestimmt wird. Bei dieser Art der Behandlung werden eine hohe Leistung und lange Bestrahlungszeiten eingesetzt, wodurch vorwiegend Zellauflösung und Nekrose bewirkt werden. Siehe Kondo, Cancer Letters 178(1), 63-70, (2002).
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine Zeichnung, welche eine Ausführungsform einer hier beschriebenen Vorrichtung zur Ultraschallbehandlung zeigt.
2 ist eine Zeichnung, welche drei Ansichten einer Apparatur darstellt, die zur Behandlung von in Suspension befindlichen hyperproliferativen Zellen mit Ultraschall und Mikroblasen dient. Die Ansicht links ist eine Draufsicht auf die Apparatur, die Ansicht in der Mitte ist eine Vorderansicht, und die Ansicht rechts ist eine Seitenansicht der Apparatur.
3 ist ein Balkendiagramm, welches die Wirkungen der Ultraschallbehandlung auf die Pegelwerte von zellularem Glutathion zeigt. Die Angaben stellen Prozentzahlen derjenigen Zellen dar, welche einen Glutathionpegel aufweisen, der mit demjenigen von unbehandelten Zellen vergleichbar ist. Die Werte sind aus 3 unabhängigen Experimenten die Mittelwerte ± SEM.
4 ist ein Balkendiagramm, welches die Wirkungen von hochfrequentem Ultraschall auf die Aktivität zellularer Caspase-3 darstellt.
5 ist ein Balkendiagramm, welches die Wirkung der Bestrahlung auf die Klonbildungseffizienz von K562-Zellen darstellt. Die Ergebnisse sind als Mittelwert ± SEM aus 3 unabhängigen Experimenten ausgedrückt.
6 ist ein Balkendiagramm, welches den Prozentsatz von apoptotischen K562-Zellen 5 Stunden nach 1 oder 3 Ultraschallbehandlungen zeigt. Die Rate der Apoptose wurde durch Strömungszytometrie nach dem Anfärben mit Annexin-V bestimmt, und die Ergebnisse sind als Mittelwerte ± SEM aus 7 unabhängigen Experimenten ausgedrückt.
7 ist ein Punktediagramm, welches die Veränderungen der Verteilung von Phosphatidylserin in Abhängigkeit von der Zeit und von den aufeinander folgenden Behandlungen mit Ultraschall darstellt. Hier sind die Ergebnisse aus einem repräsentativen Experiment als Prozentsatz der mit Annexin-V-FITC angefärbten Zellen ausgedrückt.
8 ist ein Balkendiagramm, welches die Wirkung der Ultraschallbehandlung auf die Apoptose von normalen einkernigen Zellen (MNC) und Leukämiezellen (Nalm-6, KGla, HL-60 und primäre Leukämiezellen, welche von 5 Patienten erhalten wurden) zeigt. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± SEM aus 5 unabhängigen Experimenten.
Detaillierte Beschreibung
Apoptose oder programmierter Zelltod ist ein normaler Bestandteil der Entwicklung und der Gesundheit von mehrzelligen Organismen. Die Apoptose gewährleistet die Homöostase von Geweben während der Entwicklung, den Schutz des Wirtsorganismus und das Alter und tritt als Reaktion auf eine große Vielfalt von Signalen auf, zu denen die Bestrahlung mit γ-Strahlen und mit ultravioletter Strahlung gehören. Zellen sterben als Reaktion auf eine Vielfalt von Stimuli, typischerweise während der Apoptose jedoch auf eine gesteuerte Art und Weise. Dies unterscheidet die Apoptose von der anderen Form des Zelltods, die Nekrose genannt wird, bei welcher der ungesteuerte Zelltod zur Auflösung der Zellen, zu entzündlichen Reaktionen und möglicherweise zu ernsthaften gesundheitlichen Problemen führt. Dagegen ist die Apoptose ein Vorgang, bei welchem die Zellen bei ihrem eigenen Tod eine aktive Rolle spielen, weswegen die Apoptose häufig auch als Selbstmord der Zelle bezeichnet wird.
Nach dem Empfang von spezifischen Signalen, welche den Zellen die Anweisung geben, sich der Apoptose zu unterziehen, tritt in der Zelle typischerweise eine ganze Anzahl von spezifischen biochemischen und morphologischen Veränderungen auf. Beispielsweise wird in den frühen Stadien der Apoptose typischerweise eine Familie von Proteinen, welche als Caspasen bekannt sind, aktiviert. Diese Proteine zerfallen oder spalten zellulare Substrate mit Schlüsselfunktion, welche für eine normale Zellfunktion erforderlich sind, einschließlich der Strukturproteine im Zytoskelett und der Kernproteine wie beispielsweise DNA-Wiederherstellungsenzyme. Caspasen können auch weitere Abbauenzyme wie beispielsweise DNA spaltende Enzyme aktivieren, welche die DNA im Kern spalten. Im Allgemeinen ist der apoptotische Zelltod durch frühe Veränderungen in der Kernmembran, bei der Chromatinkondensation und bei der DNA-Fragmentierung gekennzeichnet. Diese biochemischen Veränderungen haben morphologische Veränderungen in der Zelle zur Folge.
Die hier dargestellten Aussagen sind auf Vorrichtungen und Verfahren ausgerichtet, welche die in einem flüssigen Medium vorhandenen hyperproliferativen Zellen (z. B. Tumorzellen) unwirksam machen können, ihr Wachstum verhindern können und sie beseitigen können. Bei spezielleren Ausführungsformen induzieren die hier dargestellten Verfahren und Vorrichtungen die Apoptose bei hyperproliferativen Zellen, welche sich in einer Suspension wie beispielsweise einer physiologischen Flüssigkeit befinden.. Zu den behandelbaren physiologischen Flüssigkeiten gehören Blut, Plasma, Serum und Zerebrospinalflüssigkeit, welche von tierischen Lebewesen, zu denen Säugetiere, Menschen und dergl. gehören, extrahiert werden können und/oder diesen verabreicht werden können.
Die Behandlung mit niederenergetischem hochfrequentem Ultraschall gemäß den hier dargestellten Aussagen kann apoptotische Wirkungen in hyperproliferativen Zellen induzieren. Zu diesen Wirkungen gehören beispielsweise eine Wirkung auf die Mitochondrienmembranen (Abfall des Mitochondrialpotentials), der Verlust der Phosphatidylserin-Asymmetrie, das Hervorrufen einer lipidischen Oxidation der Membran (Abfall des Pegels des zellularen Glutathions), morphologische Veränderungen, die DNA-Fragmentierung; der Verlust der Plasmamembran und dergl. Weiterhin kann die durch niederenergetischen Ultraschall induzierte Apoptose die Aktivierung von Caspase-3, den proteolytischen Abbau des Caspasesubstrat-PARP und die Modulation des Verhältnisses Bcl-2/Bax in den Zellen mit sich bringen.
Spezifische Tests (siehe Beispiele) haben die sehr schnelle Auslösung der Apoptose mit begrenzten Ausmaßen der Nekrose bestätigt.
Vorrichtungen und Verfahren
Ausführungsformen von Vorrichtungen, welche zur Durchführung der erfindungsgemäßen Verfahren benutzt werden können, findet man in der vorläufigen US-Patentanmeldung 60/423.308 , der US-Patentanmeldung Nr. 10/358.445 und dem US-Patent Nr. 6.540.922 , welches an Cordemans et al. erteilt wurde. Die Verfahren zur Behandlung von hyperproliferativen Zellen können mit den hier offenbarten Vorrichtungen durchgeführt werden. Eine besondere Ausführungsform einer Vorrichtung, welche zur Behandlung eines flüssigen Mediums wie beispielsweise eines wässrigen Mediums (z. B. physiologische Flüssigkeiten) benutzt werden kann, ist in 1 dargestellt. In bestimmten Ausführungsformen enthalten die zu behandelnden Flüssigkeiten hyperproliferative Zellen. In anderen Ausführungsformen können die zu behandelnden Flüssigkeiten eine physiologische Flüssigkeit sein, von der angenommen wird, dass sie hyperproliferative Zellen enthält wie beispielsweise nach einer Diagnose. Zellen, welche nicht vollständig spezialisiert sind wie beispielsweise Stammzellen, sowie Lösungen, die Viren enthalten, und/oder mit einem Virus infizierte Zellen können ebenfalls behandelt werden. Zu Beispielen von behandelbaren Viren können beispielsweise das HIV, das HCV, das HBV, das Herpes-Virus, das Hanta-Virus, das Grippe- und das Ebola-Virus gehören.
Es soll nun Bezug auf 1 genommen werden. Die hier beschriebenen Vorrichtungen enthalten eine Kammer 2, die vorzugsweise die Gestalt eines Zylinders oder eines Körpers mit rechteckigem Querschnitt hat. Bei bestimmten Ausführungsformen kann die Kammer 2 mit einem (nicht dargestellten) Vorratsbehälter in Verbindung stehen, welcher die zu behandelnde Flüssigkeit enthält. Bei weiteren Ausführungsformen (z. B. wenn eine menschliche oder eine tierische physiologische Flüssigkeit behandelt wird) enthalten die hier vorgestellten Vorrichtungen keinen Vorratsbehälter, welcher sich mit dem menschlichen oder tierischen Körper direkt verbunden ist. Zu derartigen Ausführungsformen gehören solche, bei denen die physiologische Flüssigkeit extrahiert wird und/oder, während sie der extrakorporalen Behandlung unterliegt, dem menschlichen oder sonstigen tierischen Körper verabreicht wird (z. B. durch Reinjektion). Dementsprechend kann ein Lebewesen wie beispielsweise ein Mensch für die hier zur Debatte stehenden Belange durch "Vorratsbehälter" ersetzt werden.
Bei weiteren Ausführungsformen kann eine hyperproliferative Zellsuspension in einer Vorrichtung behandelt werden, wie sie in 2 dargestellt ist. Bei dieser Ausführungsform wird ein Lufteinlassrohr 3 als Emittent von Mikroblasen 5 verwendet, welcher Mikroblasen in die Suspension von hyperproliferativen Zellen 22 hinein emittiert, die in einer Kammer (oder Behandlungsgefäß) 20 enthalten ist. Diese Kammer (oder Behandlungsgefäß) 20, welche die Zellsuspension 22 enthält, kann in ein Wasserbad 24 wie beispielsweise in einen Inkubator eingetaucht sein.
Bei weiteren Ausführungsformen enthält die Kammer 2 (z. B. längs ihrer Wandung oder am Boden) einen oder mehrere Hochfrequenz-Ultraschallsender 1, welche Ultraschall 4 in die Kammer hinein (vorteilhafterweise in Richtung der Mitte dieser Kammer 2) aussenden. Bei anderen Ausführungsformen kann der Behälter ebenfalls einen oder mehrere Emittenten von Mikroblasen 3 für die Aussendung von Gas-Mikroblasen 5 aufweisen, welche dergestalt angeordnet sind, dass sie Gas-Mikroblasen 5 in das Ultraschallfeld 4 hinein aussenden, welches in der Kammer emittiert wird.
Die Bezeichnung "Mikroblasen", so wie sie hier verwendet wird, soll sich auf Gasblasen mit einem mittleren Durchmesser kleiner als 1 mm beziehen. Bei einigen Ausführungsformen ist der Durchmesser kleiner oder gleich 50 μm. Bei noch anderen Ausführungsformen weisen die Mikroblasen einen Durchmesser von weniger als 30 μm auf. Bei bestimmten Ausführungsformen wird bezüglich der Mikroblasen eine Auswahl aus Luft-, Sauerstoff- und Ozonmikroblasen getroffen, oder es wird eine Mischung aus diesen gewählt. Um die Betriebskosten zu senken, kann es von Vorteil sein, Mikroblasen zu verwenden, welche keine Ozonmikroblasen sind sondern beispielsweise einfach Mikroblasen aus Luft. Bei vorteilhaften Ausführungsformen der Erfindung stützt man sich nicht auf die Erzeugung eines thermischen Effektes, um die Zellen zu behandeln. Während bei bestimmten Ausführungsformen die Verwendung von stabilisierten Mikroblasen bei der Behandlung von Zellen wirkungsvoll sein kann, ist bei bevorzugten Ausführungsformen die Verwendung von stabilisierten Mikroblasen nicht notwendig. Lipid-Grenzmikroblasen sind ein Beispiel für stabilisierte Mikroblasen.
Der Ausdruck" hyperproliferative Zellen" soll sich auf Zellen beziehen, die sich mit einer verhältnismäßig hohen Rate teilen, reproduzieren oder sonstwie wuchern, und zu ihnen können Krebszellen (z. B. Leukämiezellen), präkanzeröse Zellen, Tumorzellen, Knochenmarkzellen und totipotente Zellen gehören.
Bei bestimmten Ausführungsformen bezieht sich die Bezeichnung "flüssiges Medium" auf physiologische Flüssigkeiten, welche Menschen oder Tieren verabreicht werden können, und/oder Menschen oder Tieren entnommen werden können. Bei speziellen Ausführungsformen werden die physiologischen Flüssigkeiten nach der Behandlung (z. B. bei einer Behandlung ex vivo) reinjiziert. Bei bestimmten Ausführungsformen kann der Ausdruck "physiologische Flüssigkeiten" Blut, Serum, Kopf-Wirbelsäulenflüssigkeit, Zerebrospinalflüssigkeit, Plasma und dergleichen einschließen. Das US-Patent Nr. 5.401.237 , welches an Tachibana et al. erteilt wurde, beschreibt ein Verfahren zur Entnahme und Wiederverabreichung einer physiologischen Flüssigkeit.
Bei speziellen Ausführungsformen betreffen die hier beschriebenen Verfahren und Vorrichtungen den Einsatz von niederenergetischem hochfrequentem Ultraschall, um hyperproliferative Zellen zu behandeln. Der Ausdruck "hohe Frequenz" soll sich auf Frequenzen über 100 kHz bis hinauf zu mehreren MHz beziehen. Bei bestimmten Ausführungsformen liegen die verwendeten hohen Frequenzen zwischen 200 kHz und 20 MHz. Bei verschiedenen Ausführungsformen kann die Ultraschallfrequenz aus einem Bereich von 200 kHz bis 10 MHz ausgewählt werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform liegt die verwendete Frequenz zwischen 200 kHz und 1,8 MHz.
Bei verschiedenen Ausführungsformen der hier beschriebenen Vorrichtungen ist der Mikroblasenemittent 3 für die Aussendung von Gas-Mikroblasen 5 im unteren Bereich 11 der Kammer 2 (d. h. auf dem Boden der Kammer 2) dergestalt angeordnet, dass sich die Mikroblasen dadurch bewegen, dass sie auf natürliche Art und Weise aufsteigen oder das Gas durch die Flüssigkeitsströmung mitgeführt wird.
Bei weiteren Ausführungsformen lösen die hier beschriebenen Vorrichtungen und Verfahren bei den hyperproliferativen Zellen die Apoptose aus. Es wurde entdeckt, dass gesunde Zellen gegenüber hochfrequentem Ultraschall weit weniger empfindlich sind als Leukämiezellen. Dieser Unterschied im Verhalten zwischen den gesunden und den Leukämiezellen kann nicht mit einem Unterschied in der örtlichen Anordnung der endogenen Photosensibilisatoren in Beziehung gebracht werden, ist aber wahrscheinlich auf eine Modifikation des grundlegenden Zellmechanismus wie beispielsweise des p53-Status, der Signalleitungsbahnen und des Widerstandes gegen oxidative Beanspruchung zurückzuführen. Insbesondere kann eine Apoptose bei Krebszellen (z. B. Leukämiezellen), präkanzerösen Zellen, Tumorzellen, Knochenmarkzellen, totipotenten Zellen und dergl. induziert werden.
Bei spezielleren Ausführungsformen können die hier vorgestellten Vorrichtungen und Verfahren Radikale wie beispielsweise ROS (reaktive Sauerstoffspezies) H^., ^.OH und HOO^. erzeugen, welche ebenfalls H₂O₂ bilden können, wobei dieses Molekül und/oder diese Radikale gegenüber hyperproliferativen Zellen toxisch sind und daher deren Inaktivierung und/oder deren Zerstörung mit sich bringen. Lipid-Peroxidationsprodukte, welche aus der oxidativen Beanspruchung herrühren, welche unter den Ultraschallbedingungen geschaffen wird, sind ebenfalls potentielle Beteiligte an diesem Biomechanismus.
Während der Beweis gegen die Bildung von Singulett-Sauerstoff während der sonodynamischen Therapie erbracht worden ist, sind diese Daten nur konsistent mit einer langdauernden und „hochenergetischen" Ultraschallexposition, was zu einer Ansammlung von freien Radikalen führt, die von einem Sensibilisator stammen entweder durch direkte Pyrolyse oder infolge von Reaktionen mit H^.- oder ^.OH-Radikalen, welche durch die Pyrolyse des Lösungsmittels Wasser gebildet werden.
Es wird angenommen, dass die Spezies, die unter Anwendung der offenbarten Verfahren und Vorrichtungen entstehen, aus der Einwirkung von Hochfrequenz-Ultraschall auf ein Wassermolekül stammen, was höchstwahrscheinlich (insbesondere bei Anwesenheit von Sauerstoff) Anlass zu den folgenden Reaktionen gibt: H₂O → H^. + ^.OH H^. + O₂ → HOO^. HOO^. + HOO^. → H₂O₂ + O₂ ^.OH + ^.OH → H₂O₂
Vorteilhafterweise wird die Energie, welche für die Erzeugung dieser toxischen Spezies erforderlich ist, herabgesetzt, wenn der Vorgang in Gegenwart von Mikroblasen abläuft, wie dies hier beschrieben wird. Bei bestimmten Ausführungsformen wird ein Generator dergestalt konfiguriert, dass er eine Leistung von weniger als 1 W/cm² dem Ultraschallsender zuführt. Bei bevorzugten Ausführungsformen wird eine Leistung von mehr oder weniger als etwa 0,5 W/cm² zugeführt, und bei vielen vorteilhaften Ausführungsformen sind es etwa 0,25 W/cm² oder darunter. Bei vorteilhaften Ausführungsformen ist die Leistung, die von diesem an den Sender angelegten Leistungspegel in das Volumen der physiologischen Flüssigkeit abgegeben wird, geringer als 30 mW/cm². Bei einigen Ausführungsformen liegt die abgegebene Leistung bei etwa 7 mW/cm³.
Während bei bestimmten Ausführungsformen die Ultraschallbehandlung kontinuierlich erfolgen kann, ist es möglich, dass bei anderen Ausführungsformen die Ultraschallbehandlung intermittierend unter der Anwendung von EIN/AUS-Zyklen erfolgt.
Fachleute auf diesem Gebiet sind imstande, effektive Zeiten für den EIN/AUS-Zyklus festzulegen, welche vom Volumen der Zellen, vom Typ der Zellen und von sonstigen zutreffenden Veränderlichen abhängen.
Bei weiteren Ausführungsformen betreffen die hier dargestellten Erkenntnisse die Behandlung von in Suspension befindlichen hyperproliferativen Zellen im Gegensatz zu einer Tumor- oder Neoplastikmasse. Bei diesen Ausführungsformen stützen sich die hier dargestellten Erkenntnisse nicht darauf, dass sich Mikroblasen an einer besonderen Tumorstelle konzentrieren oder ansammeln. Dies ermöglicht die Behandlung von unerwünschten hyperproliferativen Zellen, die nicht zufälligerweise angehäuft sind.
Ein weiterer Vorteil der hier dargestellten Verfahren und Vorrichtungen besteht darin, dass die hyperproliferativen Zellen innerhalb kurzer Zeitspannen auf wirkungsvolle Weise behandelt werden können. Bei speziellen Ausführungsformen können hyperproliferative Zellen in weniger als 1 Minute behandelt werden. Bei spezielleren Ausführungsformen können die Zellen in weniger als 30 Sekunden behandelt werden, beispielsweise sogar zwischen 5-20 Sekunden.
Wie auf dem Fachgebiet bekannt ist, werden die biophysikalischen Modi der Ultraschalleinwirkung danach eingruppiert, ob sie thermische Wirkungen, Kavitationswirkungen oder nichtthermische und kavitationslose Wirkungen aufweisen. Es ist wichtig zu bemerken, dass durch Anwendung der weiter oben beschriebenen Leistungsbereiche und kurzen Behandlungszeiträume eine signifikante Flüssigkeits- und/oder Zellerhitzung dergestalt vermieden wird, dass nur ein geringfügiger oder gar kein durch Hitze bewirkter Zelltod auftritt. Beispielsweise gehören Behandlungen, welche bei Temperaturen unter 40 °C, 35 °C und 30 °C ausgeführt werden, zu den Behandlungen, welche eine nichtthermische Wirkung zur Folge haben. Die Leistungspegel sind ebenfalls derart, dass Kavitation nicht in einem signifikanten Ausmaß auftritt, so dass eine Verletzung der Zellmembran, welche auf den Ultraschall zurückzuführen ist, im Wesentlichen vermieden wird.
Kürzlich ist anerkennend festgestellt worden, dass bei höheren Ultraschallleistungen die Injektion von Mikroblasen in das Ultraschallfeld ein Ansteigen der Erscheinung der Sonolumineszenz bewirkt, wobei durch die Überlagerung der Mikroblasen mit den durch Ultraschall induzierten Kavitationsblasen die Anzahl der stimulierten und toxischen Spezies vervielfacht werden kann. Diese Erscheinung wird im makroskopischen Maßstab beobachtet, wenn die Ultraschallbehandlung synergistisch mit der Anwesenheit der Mikroblasen geeigneter Größe kombiniert wird.
Bei zusätzlichen Ausführungsformen weisen die hier vorgestellten Vorrichtungen und Verfahren den Vorteil auf, dass keine Notwenigkeit besteht, den Ultraschall speziellen Bereichen zuzuordnen, da man beobachtet, dass das Behandlungssystem in der Weise funktioniert, dass die Produkte, welche in situ gebildet werden (beispielsweise gebildete Radikale und H₂O₂) in Richtung auf den Vorratsbehälter 6 des zu behandelnden wässrigen Mediums diffundieren.
Bei weiteren Ausführungsformen ist ein oder sind mehrere der hier beschriebenen Sender 1 von Ultraschall 4 derart ausgerichtet, dass sie keinerlei Anlass zu Erscheinungen stehender Wellen geben. Beispielsweise kann oder können bei bestimmten Ausführungsformen ein oder mehrere Ultraschallsender schräg zur Achse 9 der Kammer 2 (im spitzen Winkel, nicht rechtwinklig zur Achse 9) und zur Strömung der Flüssigkeit und zur Strömung der Mikroblasen 5 (siehe 1) ausgerichtet sein. Dieses kennzeichnende Merkmal ermöglicht, dass alle Mikroblasen 5 in der Kammer 2 auf eine statistisch identische Art und Weise behandelt werden, ohne dass in der Kammer 2 stationäre Bereiche entstehen.
Die hier dargestellten Vorrichtungen und Verfahren können die Abgabe von Gas-Mikroblasen mit einem mittleren Durchmesser von weniger als 1 mm in ein Hochfrequenz-Ultraschallfeld im behandelten flüssigen Medium umfassen. Bei einigen Ausführungsformen ist der Durchmesser der Mikroblasen kleiner als oder gleich 50 μm m. Bei noch anderen Ausführungsformen weisen die Mikroblasen einen Durchmesser kleiner als 30 μm auf. Bei bestimmten Ausführungsformen werden die Mikroblasen aus Luft-, Sauerstoff- und Ozonmikroblasen ausgewählt. Bei weiteren Ausführungsformen sind die Mikroblasen keine Ozonmikroblasen.
Gemäß anderen Ausführungsformen können die hier beschriebenen Vorrichtungen und Verfahren einen Lichtsender 12 (z. B. einen Emitter elektromagnetischer Strahlung) enthalten, welcher Strahlung in das Ultraschallfeld 4 in der Kammer 2 mit einer Frequenz aussendet, welche sich zum größten Teil im sichtbaren Bereich befindet. Um bestimmte spezifische hyperproliferative Zellen zu entfernen, ist es für bestimmte Anwendungsfälle jedoch vorteilhaft, eine elektromagnetische Strahlung mit einer Frequenz auszusenden, welche größtenteils im Unsichtbaren liegt wie beispielsweise ultraviolette Strahlung (beispielsweise vom Typ UVA, UVB oder UVC), Infrarotstrahlung, Laserstrahlen oder Mikrowellenstrahlung.
Kürzlich wurde auf unerwartete Weise entdeckt, dass eine Behandlung, welche die Abgabe von Mikroblasen in die Felder umfasst, die eine Kombination mit Ultraschall- und wahlweiser Lichtstrahlung darstellen, besonders wirkungsvoll bei der Inaktivierung und Entfernung hyperproliferativer Zellen ist, welche in einem flüssigen Medium wie beispielsweise einer physiologischen Flüssigkeit vorhanden sind. Die Erscheinung der Lumineszenz kann die Erzeugung von extrem aktiven, mit Sauerstoff angereicherten Spezies wie beispielsweise des Hyperoxidradikals oder des Singulett-Sauerstoffs fördern, welche eine Reihe von biochemischen Reaktionen zur Folge haben können, die für bestimmte hyperproliferative Zellen extrem toxisch sind. Bei bevorzugten Ausführungsformen wird die Strahlung intermittierend in Form von EIN/AUS-Zyklen ausgesandt. Bei spezielleren Ausführungsformen kann der EIN/AUS-Zyklus ein Taktverhältnis bei etwa 5,5 ms/3 ms aufweisen.
Bekanntlich kann Lumineszenz bei Anwesenheit von sogenannten sensibilisierenden Molekülen (d. h. Photosensibilisatoren und Sonosensibilisatoren) stattfinden, so dass sie auf bestimmte Krebszellen eine Antitumorwirkung auslösen. Zu solchen Molekülen können gehören: Porphyrin, Chlor, Tetracyclin, Methylenblau, Fluoreszein, Acridin, Rhodamin und dergl. Diese aktiven Wirkstoffe können in den Organismus injiziert oder oral verabreicht und anschließend durch Sonolumineszenz aktiviert werden. Nach der Aktivierung können diese Wirkstoffe Singulett-Sauerstoff erzeugen, welcher seinerseits insbesondere bei biochemischen Prozessen, die von der oxidativen Beanspruchung herrühren, eine fundamentale Rolle spielt. Insbesondere kann ein Singulett-Sauerstoff die verschiedenen Zellkomponenten wie beispielsweise die Proteine, Lipide, Aminosäuren und Nukleotide oxidieren.
Bei anderen Ausführungsformen können Feststoffteilchen oder Feststoffoberflächen dazu benutzt werden, um die Lumineszenz und/oder die Strahlungsemission auf synergistische Weise zu bewirken. Zu diesen Feststoffen können beispielsweise TiO₂, Tonerden und keramische Stoffe gehören.
Verschiedene Ausführungsformen sind auf Vorrichtungen und Verfahren ausgerichtet, welche keine zusätzlichen chemischen Substanzen wie beispielsweise Photosensibilisatoren und/oder Sonosensibilisatoren erfordern, um das Wachstum von hyperproliferativen Zellen zu verhindern und/oder hyperproliferative Zellen aus einem physiologischen Medium zu entfernen. Es ist nicht immer notwendig, dem zu behandelnden flüssigen Medium einen Photo sensibilisations- oder Sonosensibilisationswirkstoff zuzufügen, da unerwarteterweise beobachtet worden ist, dass Lumineszenz in situ an bestimmten hyperproliferativen Zellen (z. B. Leukämiezellen) erzeugt werden kann, welche in physiologischen Flüssigkeiten (z. B. Blut) vorhanden sind, die diese photosensibilisierenden Moleküle bereits enthalten.
Während die hier vorgestellten Vorrichtungen und Verfahren in Verbindung mit anderen Medikamenten wie beispielsweise Photosensibilisatoren, Sonosensibilisatoren, chemotherapeutischen Wirkstoffen, Antibiotika, antiviralen Medikamenten angewendet werden können, ist es wichtig zu bemerken, dass die Wirksamkeit der vorgestellten Verfahren und Vorrichtungen bei der Behandlung hyperproliferativer Zellen nicht von der Anwendung von weiteren Chemikalien, Reagenzien oder Medikamenten abhängig ist. Folglich können die hier beschriebenen Verfahren und Vorrichtungen ohne zusätzliche Substanzen eingesetzt werden, zu denen Chemikalien, Reagenzien, Hormone, Peptide, Proteine, Nukleinsäuren, Kohlehydrate, DNA-Impfstoffe, Angiogenesestimulatoren oder Arzneimittel gehören. Bei noch spezielleren Ausführungsformen stützen sich die hier dargestellten Erkenntnisse nicht auf die Zellabsorption dieser Substanzen.
Insbesondere können die Wirkungen, die mit den hier dargestellten Erkenntnissen erzielt worden sind, erreicht werden, ohne dass klassische Photosensibilisatoren und Sonosensibilisatoren erforderlich sind. Die physiologischen Wirkungen, welche mit Techniken wie beispielsweise der PDT erreicht werden, hängen gleichzeitig von der Strahlungsdosis, von der Natur der verwendeten Photosensibilisatoren, von ihrer Konzentration und von ihrer Lokalisation ab. Während fair herkömmliche Behandlungen Sensibilisatoren ein Erfordernis darstellen, werden sie für die hier vorgestellten Erkenntnisse nicht benötigt, wodurch die Verfahren und Vorrichtungen beträchtlich vereinfacht werden.
Bei bestimmten Ausführungsformen sind endogene Photosensibilisatoren an den Nutzeffekten der Ultraschallwirkung beteiligt, die in der Struktur, wo ihre lokale Konzentration hoch ist, vorhanden sind. Beispielsweise sind endogene Photosensibilisatoren hauptsächlich in den Membranstrukturen angesiedelt wie beispielsweise den Lysosomen, Mitochondrien, Kernmembranen, Golgi-Apparaten und den Mikrosomen des endoplasmatischen Retikulums, dessen relative Oberfläche nahezu 50 % der Oberfläche der Zellmembran darstellt.
Bei einigen Ausführungsformen kann zu den hier beschriebenen Vorrichtungen und Verfahren eine Pumpe für den Umlauf des flüssigen Mediums gehören, sowie eine oder mehrere Vorrichtungen (wie beispielsweise Zyklone usw.) zur Wiederherstellung von im flüssigen Medium vorhandenen hyperproliferativen Zellen, was vorzugsweise durch Filtration, Zentrifugieren oder Ausfällung geschieht. Bei bestimmten Ausführungsformen sind die Pumpe und/oder die Vorrichtung zur Wiederherstellung zwischen dem Vorratsbehälter (oder Tier), welcher/s das zu behandelnde flüssige Medium enthält, und der Kammer 2 angeordnet.
Bei bestimmten Ausführungsformen können die hier beschriebenen Vorrichtungen und Verfahren dazu verwendet werden, einem Probanden, welcher unter Verdacht steht, Krebs (z. B. Leukämie) zu haben (z. B. diagnostiziert worden ist), physiologische Flüssigkeit (z. B. Blut) zu entnehmen. Nach der Entnahme kann die physiologische Flüssigkeit mit hochfrequentem niederenergetischem Ultraschall und Mikrogasblasen mit einem Durchmesser von weniger als 1 mm behandelt werden. Bei bestimmten Ausführungsformen lösen die Verfahren an den Krebszellen (z. B. Leukämie) Apoptose aus. Nachdem die physiologische Flüssigkeit derart behandelt worden ist, dass die hyperproliferativen Zellen entweder in ausreichendem Maße unwirksam gemacht worden sind, in ihrem Wachstum gehindert worden sind oder entfernt worden sind, kann dann die Flüssigkeit dem Probanden wieder verabreicht werden. Diese Verfahren können ähnlich anderen ex vivo Verfahren wie beispielsweise Hämodialyse durchgeführt werden.
Ein für die Blutbehandlung vorgesehener Proband kann an eine der hier beschriebenen Vorrichtungen angeschlossen werden. Gemäß bestimmten Ausführungsformen kann der Blutstrom des Probanden mit einer hier beschriebenen Ultraschallvorrichtung verbunden werden, und zwar durch eine innere Fistel in seinem Arm. Dies bedeutet, dass eine Arterie und eine Vene chirurgisch angeschlossen werden. Wenn sie verbunden werden, bewirkt der kräftigere Blutstrom von der Arterie, dass die Vene größer wird. Nadeln können in die vergrößerte Vene eingeführt werden, um den Probanden an die Ultraschallvorrichtung anzuschließen.
Eine andere Art, sich Zugang zum Blutstrom zu verschaffen, besteht darin, ein internes Transplantat einzusetzen. Bei dieser Prozedur wird eine Arterie chirurgisch mit einem unter der Haut angeordneten kurzen Stück einer speziellen Rohrleitung an eine Vene angeschlossen, in welche eine Nadel eingeführt werden kann.
Wenn es erforderlich ist, schnell einen Zugang zum Blutstrom zu erlangen oder wenn die Venen im Arm zu klein sind, um ausreichend Blut beispielsweise für eine Ultraschallbehandlung zur Verfügung zu stellen, dann kann bei weiteren Ausführungsformen ein zentraler venöser Katheter verwendet werden. Bei dieser Prozedur wird eine weiche Röhre in eine große Vene im Nacken oder in der Nähe des Schlüsselbeines chirurgisch eingesetzt. Bei einigen Ausführungsformen kann dieses Verfahren zeitweilig angewandt werden, bis eine dauerhafte Zugangsstelle zur Verfügung steht.
Zu den Probanden, bei denen gemäß den hier beschriebenen Verfahren eine Behandlung möglich ist, können jegliches Tier wie beispielsweise Säugetiere, einschließlich Menschen, Mäuse, Affen, Hunde oder Schweine gehören.
Bei weiteren Ausführungsformen verwenden die hier beschriebenen Vorrichtungen und Verfahren niederenergetische, hochfrequente Ultraschallwellen, um durch das Auslösen von Apoptose in den Zellen (z. B. Leukämiezellen) hyperproliferative Zellen zu vermeiden, zu behandeln oder unwirksam zu machen. Das Auslösen von Apoptose in hyperproliferativen Zellen kann zu einer Abfolge von charakteristischen Ereignissen führen, zu denen ein Abfall des Mitochondrialpotentials, der Verlust der Phosphatidylserin-Asymmetrie, morphologische Veränderungen, DNA-Fragmentierung, Verlust der Plasmamembran und dergl. gehören. Weiterhin kann eine durch niederenergetischen Ultraschall ausgelöste Apoptose die Aktivierung von Caspase-3, den proteolytischen Abbau der Caspasesubstrat-PARP und die Modulation des Verhältnisses Bcl-2/Bax in den Zellen nach sich ziehen.
Zusätzliche Verfahren enthalten die Einleitung der Apoptose unter Verwendung der durch Ultraschall ausgelösten sonochemischen Lumineszenz, um die Erzeugung von photosensilibisiertem Singulett-Sauerstoff aus direkter Bestrahlung mit Licht zu triggern. Unter den klassischen Bedingungen der Bestrahlung mit Ultraschall sind die direkten zerstörerischen Kavitationswirkungen gegenüber der Sonolumineszenz dominant, welche bei Abwesenheit einer Grenzfläche zwischen Luft und Flüssigkeit, die in das Medium hinein injiziert wird, ziemlich schwach ist. Dementsprechend kann es von Vorteil sein, Mikroblasen in Verbindung mit Ultraschall zu verwenden, um die Lumineszenz gegenüber den Kavitationswirkungen zu erhöhen..
Die nachfolgenden Beispiele beschreiben die Behandlung der Zellen mit hochfrequentem niederenergetischem Ultraschall und verschiedene Anordnungen, um das Vorhandensein von Apoptose in den genannten Zellen anzuzeigen.
Beispiel 1
Zellpräparation und Behandlung mit Hochfrequenz-Ultraschall
Zelllinien der menschlichen Leukämie (K562, Nalm-6, KGla und HL-60), welche von der American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD, USA) zur Verfügung gestellt worden sind, wurden in RPMI-1640 (BioWhittaker, Walkersville, MD, USA) unter Zugabe von 10 % fötalem Kalbsserum (Gibco, Grand Island, NY, USA) und 1 % L-Glutamin (Gibco) kultiviert. Die Leukämiezellen wurden geerntet, in phosphatgepufferter physiologischer Kochsalzlösung (PBS, pH = 7,2, Gibco) wieder in Suspension gebracht und unmittelbar anschließend für das Experiment verwendet. Heparinisiertes venöses Blut wurde von gesunden Freiwilligen und Leukämiepatienten erhalten. Einkernige Zellen wurden durch Ficoll-Hypaque-Diechtegradienten-Zentrifugierung (International Medical Products, Brüssel, Belgien) abgetrennt.
Nachfolgend soll die Ultraschallbehandlung der Zellen beschrieben werden. Zelllinien der menschlichen Leukämie (K562, HL-60, KGla und Nalm-6), primäre Leukämiezellen und normale einkernige Zellen wurden mit Ultraschall bei einer Frequenz von 1,8 MHz während unterschiedlicher Expositionszeiten bei einer Schallleistung von 7 mW/ml und bei einem Bestrahlungstakt (EIN/AUS) von 5,5 ms/3 ms behandelt.
Nach einer Zellkulturdauer von 18 Stunden im Inkubator (37 °C und 5 % CO₂) wurden die Zellen mittels eines Ausschlusstests mit Trypanblau erfolgreich auf Lebensfähigkeit getestet. An den behandelten Zellen wurden zusätzliche Tests durchgeführt, die in größerer Ausführlichkeit in den nachfolgenden Beispielen beschrieben werden sollen. Die Apoptose wurde anhand von Zellmorphologie, Phosphatidylserineexposition und DNA-Fragmentierung bewertet. Das Mitochondrialpotential, der Glutathiongehalt, die Caspase-3-Aktivierung, die PARP-Spaltung und das Verhältnis Bcl-2/Bax wurden mit Hilfe der Strömungszytometrie untersucht. Die Klonbildungseffizienz wurde mit Hilfe von Tests in Methylzellulose bewertet.
Beispiel 2
Wirkung von Hochfrequenz-Ultraschall auf die DNA-Fragmentierung
Die DNA-Fragmentierung ist mit der Apoptose in Zusammenhang gebracht worden. Die Quantifizierung der Zellen mit degradierter DNA wurde unter Anwendung eines von I. Nicoletti et al. in J. Immunol. Methods 139(2):271 (1991) beschriebenen Verfahrens und eines Gerätesatzes zum DNA-Ladder-Schnellnachweis unter der Bezeichnung ,Apotarget Quick DNA Ladder Detection Kit' (Biosource) durchgeführt. Zellpellets (106 Zellen) wurden in 201 eines Lysepuffers wieder in Suspension gebracht, und die DNA wurde nach den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Nach der Trennung mittels Gel-Elektrophorese (1 % Agarose) wurde die DNA analysiert. Als Positivkontrolle wurden die Zellen 10 Minuten lang (bei einer Intensität von 5 mW/cm²) mit UV-Licht bestrahlt, indem man die Kultur direkt unter ein UV-Durchleuchtungsgerät brachte. Danach wurden die Zellen bei 37 °C über 5 und über 18 Stunden inkubiert, bevor die Apoptose bewertet wurde.
Nach der Permeabilisierung wurden die Zellen mit einer Lösung inkubiert, welche PI und Ribonuklease (Coulter DNA-Prep Reagent) enthielt. Die Röhren wurden über Nacht bei 4 °C im Dunkeln aufbewahrt, bevor die Analyse mittels Strömungszytometrie durchgeführt wurde, um den Sub-G0-Peak, welcher der Apoptose entspricht, zu identifizieren.
Klassischen nukleosomale DNA-Ladder-Muster wurden in DNA-Proben aus Zellen beobachtet, welche mit UV-Licht (Positivkontrolle) und mit Ultraschall behandelt worden waren. Eine internukleosomale DNA-Spaltung war 5 Stunden nach der Ultraschallbehandlung kaum feststellbar, wurde aber 18 Stunden danach deutlich (die Ergebnisse sind nicht dargestellt). Weiterhin wurde mit PI-Färbung 5 Stunden nach der Behandlung ein Anstieg der Anzahl der Kerne mit fragmentierter DNA beobachtet. Insbesondere wiesen 15 % der behandelten Zellen eine fragmentierte DNA auf, während 2 % der unbehandelten Zellen eine fragmentierte DNA aufwiesen (die Daten sind nicht dargestellt).
Beispiel 3
Wirkung von Hochfrequenz-Ultraschall auf das Mitochondrial-Transmembran-Potential
Der frühzeitige Abbruch des Mitochondrial-Transmembran-Potentials (ΔYm), welcher der fortgeschrittenen DNA-Fragmentierung vorausgeht, ist bei mehreren Modellen der Zellapoptose beobachtet worden. Die nachfolgende Untersuchung wurde durchgeführt, um die Wirkung der Behandlung mit hochfrequentem Ultraschall auf das ΔYm zu bestimmen.
Das Mitochondrialpotential wurde durch Einlagerung von kationischem Fluorochrom DiOC6 unmittelbar nach der Zellbehandlung gemäß dem veröffentlichten Protokoll, vorgefunden in A. Macho, et al., Blood 86(7): 2481 (1995), abgeschätzt.
Kurz gesagt, es wurden K562-Zellen (106/ml) im Inkubator mit 2,5 nmol/l 3,3'-Dihexyloxacarbocyanin (DiOC6; Molecular Probes, Eugene, OR) 15 Minuten lang bei 37 °C inkubiert, gefolgt von der Analyse mittels Strömungszytometrie.
Die Ultraschallbehandlung war von einem Anstieg der Zellpopulationen begleitet, die ein niedriges ΔYm anzeigten (die Ergebnisse sind nicht dargestellt). Eine Population der Zellen, welche eine verminderte DiOC6-Einlagerung anzeigt, wurde 30 Minuten nach der Behandlung nachgewiesen, und der Abfall des Mitochondrialpotentials war 5 Stunden nach der Ultraschallbehandlung mit mehr als 50 % der Zellen, welche ein niedrige ΔYm aufwiesen, sehr deutlich. Diese Ergebnisse liefern den Beweis für das Vorliegen zellularer Apoptose.
Beispiel 4
Wirkung von Hochfrequenz-Ultraschall auf zellulare Glutathionpegel
Es ist dargestellt worden, dass während der Apoptose eine Verarmung an Glutathion vorliegt. Es wurde eine Untersuchung durchgeführt, um den Gehalt an zellularem Glutathion nach der Ultraschallbehandlung festzustellen. Für die Bestimmung der Pegel von intrazellularem Glutathion wurde Cell Tracker Green CMFDA (5-Chloromethylfluoresceindiacetat; Molecular Probes) verwendet, wie dies bereits von D. W. Hedley et al. in Cytometry 15: 349 (1994) beschrieben worden ist.
Direkt nach der Ultraschallbehandlung trat eine Subpopulation mit niedrigeren GSH-Levels auf als derjenige, welcher bei unbehandelten Zellen beobachtet wurde (> 50 % der Zellen zeigten einen niedrigen GSH-Level), wie dies in 3 dargestellt ist. Die Ergebnisse von aufeinander folgenden Behandlungen zeigten nach 5 Stunden eine stärkere GSH-Verarmung. Die Ergebnisse sind als Prozentsatz derjenigen Zellen ausgedrückt, welche einen GSH-Level anzeigen, der mit dem von unbehandelten Zellen vergleichbar ist. Diese Ergebnisse zeigen deutlich, dass die Behandlung mit hochfrequentem Ultraschall mit einer GSH-Verarmung im Zusammenhang steht.
Beispiel 5
Wirkung von Hochfrequenz-Ultraschall auf die zellulare Caspase-3-Aktivität
Es ist aufgezeigt worden, dass Caspase-3 eine wichtige Rolle bei der durch Chemotherapie induzierten Apoptose spielt. Insbesondere führt eine Aktivierung von Caspasen über die Spaltung von Zellsubstraten wie beispielsweise Aktin, Gelsolin oder PARP zum Zelltod. Um die Beteiligung von Caspase-3 bei der durch Ultraschall induzierten Apoptose festzustellen, wurde die Caspase-Aktivität ermittelt, wobei die Strömungszytometrie und die kolorimetrischen Analyse zum Einsatz gelangten.
Insbesondere wurde Caspase-3 durch strömungszytometrische Untersuchungen unter Verwendung von Phykoerythrin-(PE)-konjugierten polyklonalen Kaninchen-Antikörpers antiaktiven monoklonalen Caspase-3-Antikörpern (BD-Pharmingen, San Diego, CA, USA) nachgewiesen. Die Zellen wurden 15 Minuten lang bei Raumtemperatur unter Verwendung der Ausrüstung von Fix and Perm (Caltag, Burlingame, CA) fixiert und permeabilisiert. Danach wurden die Zellen mit Anti-Caspase-3-AB gefärbt und 15 Minuten lang inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und mittels Strömungszytometrie analysiert. Die enzymatische Aktivität von Caspase-3 wurde unter Verwendung der Ausrüstung für die kolorimetrische Protease-Untersuchung, (Apotarget Caspase-3/cpp32/colorimetric protease assay kit – Biosource) so bestimmt, wie dies vom Hersteller vorgegeben worden ist. Die Caspase-3-Aktivierung wurde auch auf indirektem Wege durch PARP-Spaltung unter Verwendung eines FITC-konjugierten Kaninchen-Anti-PARP-Spaltstellen-AB (Biosource) abgeschätzt.
Wie in 4 dargestellt ist, führte die Behandlung mit hochfrequentem Ultraschall zur Aktivierung der Caspase-3. Darüber hinaus war diese Proteaseaktivität bei 1 Stunde Nachbehandlung maximal vorhanden. Weiterhin war die Spaltung von PARP 2 Stunden nach der Behandlung deutlich, wobei 40 % der Zellen durch das Kaninchen-Anti-PARP-FITC gegenüber 5 % bei unbehandelten Zellen verfärbt waren (die Ergebnisse sind nicht dargestellt).
Beispiel 6
Wirkung von Hochfrequenz-Ultraschall auf den zellularen Bcl-2/Bax-Quotienten
Unterschiedliche Proteine der Bcl-2-Familie sind an der Auslösung oder der Verhinderung von Apoptose beteiligt. Die folgende Untersuchung wurde durchgeführt um festzustellen, ob Bcl-2 und Bax, die zwei größeren Mitglieder der Bcl-2-Familie, an der Auslösung von Apoptose durch Ultraschall beteiligt waren. Nach der Permeabilisierung wurden die Zellen inkubiert mit Negativkontrolle mit Isotyp-Abgleich, mit FITC-markiertem Antihuman-Mäuse-Bcl-2 (Dako, Glostrup, Dänemark) und mit polyklonalen Kaninchen-Antikörpern für Bax. Nachfolgend wurde dem Bax ein sekundärer FITC-markierter Antikörper (Dako) zugefügt. Um die Bcl-2- und die Bax-Expression zu quantifizieren, wurde das Zytometer unter Verwendung eines Gemisches von Kügelchen, die mit bekannten Mengen an Fluorochrome (Dako) markiert waren, kalibriert. Die Werte der mittleren Fluoreszenzintensität (MFA wurden danach unter Verwendung einer Kalibrierkurve auf die Moleküle des äquivalenten löslichen Fluorochroms (MESF) übertragen.
Die Ergebnisse (die Daten sind nicht dargestellt) zeigten, dass unbehandelte Zellen hohe Pegel des Anti-Apoptose-Proteins Protein-Bcl-2 (47 ± 4 × 10³ MESF) aufwiesen, und diese Expression erscheint als ein unimodaler Fluoreszenz-Peak. Eine Stunde nach der Ultraschallbehandlung war die Expression des Bcl-2-Proteins bereits nach unten reguliert (40 ± 0,9 bzw. 32 ± 0,9 × 10³ MESF in K562-Zellen, welche 1 oder 3 Ultraschallbehandlungen unterzogen worden sind). Zwei Stunden nach der Behandlung erschien die Bcl-2-Expression klar bimodal, die Zellen zeigten entweder ein an Bcl-2 hohes (vergleichbar mit unbehandelten Zellen) oder an Bcl-2 niedriges Phenotype (11 ± 2 × 10³ MESF) an.
Im Gegensatz zu Bcl-2 waren die Pegel des proapoptotischen Proteins Bax in den mit Ultraschall behandelten Zellen höher als im Vergleich mit den unbehandelten Zellen (85 ± 0,5 bzw. 48 ± 5 × 10³ MESF für behandelte bzw. unbehandelte K562-Zellen). Das Verhältnis Bcl- 2/Bax war demzufolge während der Behandlung mit Hochfrequenz-Ultraschall signifikant verringert, was einen Beweis für die zellulare Apoptose darstellt (0,98 für die Kontrollzellen gegenüber 0,38 für die mit Ultraschall behandelten Zellen).
Beispiel 7
Wirkung des Hochfrequenz-Ultraschall auf die Pegel des zellularen Phosphatidylserins
Während der Apoptose springen die Phosphatidylserinreste von der Innenseite zur Außenseite der Plasmamembran, und dieser Wechsel kann unter der Verwendung von Annexin-FITC festgestellt werden, welches sich an die PS-Reste bindet. Im Folgenden wird eine Untersuchung hinsichtlich der Annexin-V-Bindung beschrieben, welche durchgeführt worden ist. Die strömungszytometrische Analyse von mit Annexin-V-Fluoreszeinisothiocyanat (FITC) und Propidiumiodid (PI) angefärbten Zellen wurde unter der Verwendung des Gerätesatzes, welcher von Biosource International (Camarillo, CA, USA) erworben wurde, und gemäß den Empfehlungen des Herstellers durchgeführt. Die Daten wurden als Punktdiagramme dargestellt, welche die Veränderung der mittleren Intensität der Fluoreszenz des Annexin-V-FITC bzw. Propidiumiodids veranschaulichen (nicht dargestellt).
Die aufgeführten Ergebnisse zeigten, dass die Veränderungen der Phosphatidylserinverteilung zeitlich variierten. Insbesondere zeigten die Ergebnisse, dass die Ultraschallbehandlung bei einem geringen Prozentsatz an Zellen eine Verletzung der Plasmamembran hervorrief, was veranschaulicht, dass die nekrotische Wirkung der beim Test angewendeten Ultraschallbehandlung sehr schwach ist. Interessanterweise wurde ein Anstieg der apoptotischen Zellen zwei Stunden nach der Behandlung beobachtet. Fünf Stunden nach der Behandlung waren 35 % der Zellen Annexin-V-positiv, was die Auswirkung des Ultraschalls auf die Apoptose bei K562-Zellen aufzeigt.
Beispiel 8
Wirkung von Hochfrequenz-Ultraschall auf die Koloniebildung
Ein wichtiger Beweis für eine Wirkung auf die Lebensfähigkeit von Zellen ist das Unvermögen einer Zelle, sich zu vermehren und eine Kolonie zu bilden. Im Folgenden wird eine klonogene Untersuchung beschrieben, welche an einer K562-Zelllinie durchgeführt worden ist, um die Wirkung einer Bestrahlung mit hochfrequentem Ultraschall auf die Klonbildungseffizienz zu festzustellen. Kurz gesagt, das Kulturmedium bestand aus IMDM, was mit 20 % FCS und Methylzellulose auf eine Endkonzentration von 4 % ergänzt wurde. Die Kulturen wurden bei 37 °C in Luft mit 5 % CO₂ inkubiert, wobei die Kolonien (> 20 Zellen) nach 5 Tagen einer Bewertung unterzogen wurden. Die klonogene Effizienz der K562-Zelllinie betrug 16 %. Wie in 5 dargestellt ist, wird eine signifikante Reduzierung bei der Klonbildungseffizienz der K562- Zellen nach 1 und 3 Behandlungen (25 % bzw. 42 % Inhibition) beobachtet, was die Empfindlichkeit von Leukämiezellen gegenüber hochfrequentem Ultraschall bestätigt.
Beispiel 9
Wirkung von Sauerstoffspülern auf die Apoptose

Die nachfolgende Prozedur wurde durchgeführt, um die Wirkung von aktiven Sauerstoffspülern auf die künstliche Auslösung der Apoptose durch Hochfrequenz-Ultraschall festzustellen. K562-Zellen wurden mit L-Histidin (10 mM) und/oder Mannitol (100 mM) inkubiert. Einige Zellen wurden mit Hochfrequenz-Ultraschall behandelt und andere nicht. Die Zellapoptose wurde durch eine Untersuchung mit Annexin-V/PI ermittelt. Die Ergebnisse, wie sie in Tabelle 1 dargestellt sind, zeigen, dass die durch Ultraschall eingeleitete Zeltschädigung in Gegenwart von Histidin und Mannitol signifikant herabgesetzt wird (43 % bzw. 47 % Inhibition der Apoptose, welche durch drei aufeinander folgende Behandlungen induziert wurde). Tabelle 1 sAuswirkungen von aktiven Sauerstoffspülern auf die durch Ultraschall induzierte Zellapoptose

	Keine Ultraschallbehandlung	1 Ultraschallbehandlung	3 Ultraschallbehandlungen
Kein Wirkstoff	18 ± 6	42 ± 8	63 ± 5
Histidin	15 ± 5	24 ± 8	36 ± 11
Mannitol	11 ± 4	21 ± 5	30 ± 3
Histidin + Mannitol	11 ± 2	16 ± 3	25 ± 5

Die Ergebnisse sind als Prozentsatz derjenigen Zellen ausgerückt, welche 5 Stunden nach der Behandlung eine Phosphatidylserin-Externalisierung zeigen (Mittelwert ± SEM aus 4 unabhängigen Experimenten).
Die Verknüpfung von Mannitol und Histidin führte zu einer Inhibition der Apoptose von mehr als 60 %. Die Wirksamkeit dieser Wirkstoffe auf die Verringerung der durch Ultraschallbehandlung eingeleiteten Apoptose stellt einen Beweis dafür dar, dass durch Ultraschall induzierter Singulett-Sauerstoff und Hydrxylradikale wichtige Vermittler sind, um Apoptose auszulösen.
Beispiel 10
Wirkung von aufeinander folgenden Behandlungen mit Hochfrequenz-Ultraschall auf Zellen
Eine strömungszytometrische Nachbeobachtung wurde an gezüchteten K562-Zellen 0,5, 2 und 5 Stunden nach der Ultraschallbehandlung durchgeführt. Nach einer Behandlung betrug der Pegel der apoptotischen Zellen das Dreifache desjenigen der Kontrollzellen (26 % bzw. 8 % nach fünfstündiger Kultur für behandelte bzw. unbehandelte Zellen). Eine nekrotische Wirkung wurde ebenfalls beobachtet, welche deutlich unterhalb derjenigen liegt, die festgestellt worden ist, wenn Medikamente oder eine photodynamische Behandlung (PDT) zum Einsatz gelangten. Mit aufeinander folgenden Bestrahlungen unter den gleichen Bedingungen (7 mW/ml, 20 Sekunden) und bei unterschiedlichen Intervallen stieg die Apoptose der K-562-Zellen auf 37 ± 3 % (p < 0,02) und 49 ± 5 % (p < 0,02) nach 1 bzw. 3 aufeinander folgenden Behandlungen an (6). Auch wurden nach den aufeinander folgenden Behandlungen morphologische Veränderungen (z. B. Zellenschrumpfung, Membran-Aufwölbung, Chromatinkondensation) beobachtet (Ergebnisse sind nicht dargestellt). 7 zeigt, dass die Menge an zellularem Phosphatidylserin nach den aufeinander folgenden Behandlungen mit hochfrequentem Ultraschall ansteigt, wie dies durch eine Untersuchung mit Annexin-V-festgestellt worden ist.
Beispiel 11
Wirkung von Hochfrequenz-Ultraschall auf verschiedenartige Zelllinien
Zusätzlich zu K562 wurde die Wirkung der Ultraschallbehandlung an weiteren normalen und bösartigen Zelllinien, einschließlich KGla (immature, minimal differenzierte Stämme von myeloischer Leukämie), HL-60 (Promyelozytenleukämie) und Nalm-6 (ALL-Zelllinie) getestet. Die in 8 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die Sensibilität gegenüber Ultraschall vom Zelltyp abhängt, aber aufeinander folgende Behandlungen führten zu einem signifikanten Anstieg der Anzahl der apoptotischen Zellen für alle Zelllinien, welche der Auswertung unterzogen wurden.
Einkernige Zellen von 5 Patienten (1 hartnäckige Anämie mit einem Überschuss an Stammzellen [RAEB], 1 sekundäre akute myelogene Leukämie [AML], und 3 Fälle von AML nach der Französisch-Amerikanisch-Britischen Klassifikation [FAB] M3, M4 und M4Eo) wurden ebenfalls mit Ultraschall behandelt, und die Stammzellen wurden auf der Grundlage ihrer CD45-Expression zur Verhinderung der Kontaminierung der normalen Zellen abgesondert, wie von F. Lacombe et al. in Leukemia 11:1878 (1997) beschrieben wird. Diese Zellen waren ebenfalls für ihre Phosphatidylserin-Exposition mit FITC-Annexin markiert worden. Dieses Verfahren ermöglicht, das jeweilige apoptotische Verhalten von Leukämie-Stammzellen und normalen Zellen, welche mittels Ultraschall behandelt wurden, zu vergleichen. Die in 8 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass primäre Leukämiezellen gegenüber der Ultraschallbehandlung mit mehr als 37 ± 18 % an apoptotischen Zellen, welche 5 Stunden nach 3 Behandlungen beobachtet wurden, empfindlich sind.

Claims

In-vitro-Verfahren zur Unwirksammachung, Beseitigung und/oder Wachstumsverhinderung von hyperproliferativen undifferenzierten oder viral infizierten isolierten Zellen, welche sich in einer physiologischen Lösung im Schwebezustand befinden, wobei dieses Verfahren umfasst: – Abstrahlung von Ultraschall mit einer Frequenz über 100 kHz und mit einem Leistungspegel unter 30 mW/cm³ in eine Kammer, welche die zu behandelnde physiologische Lösung enthält, und – Abgabe von Mikrogasblasen, welche einen mittleren Durchmesser von weniger als 1 mm aufweisen, in das Ultraschallfeld in der die physiologische Lösung enthaltende Kammer dergestalt, dass die Abstrahlung des Ultraschalls und die Mikroblasen einen signifikanten programmierten Zelltod bei den hyperproliferativen undifferenzierten oder viral infizierten Zellen bewirkt, ohne dabei eine signifikante Kavitation oder eine signifikante Erhitzung der Lösung zu verursachen.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem die Mikrogasblasen keine Ozon-Mikroblasen sind.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem die Mikrogasblasen aus der Gruppe ausgewählt werden, welche aus Luft- und Sauerstoff-Mikroblasen besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem die physiologische Lösung aus der Gruppe ausgewählt wird, welche aus Blut, Plasma, Serum und Zerebrospinalflüssigkeit besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem der mittlere Durchmesser der Mikrogasblasen weniger als 50 μm beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem der mittlere Durchmesser der Mikrogasblasen weniger als 30 μm beträgt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem der in den Behälter abgestrahlte Ultraschall keine Erscheinung eines stationären Feldes erzeugt.
Verfahren gemäß Anspruch 1, welches außerdem die Emission von Licht mit einer elektromagnetischen Strahlung vorwiegend im sichtbaren Bereich in das Ultraschallfeld umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 1, bei welchem die hyperproliferativen Zellen aus der Gruppe ausgewählt werden, welche aus Tumorzellen, Knochenmarkzellen, Krebsstammzellen, präkanzerösen Zellen und Leukämiezellen besteht.
Verfahren gemäß Anspruch 1, welches ferner die Zuführung einer Leistung von weniger als 1 W/cm² zum Ultraschallsender umfasst.