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FACHGEBIET DER ERFINDUNG
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Die
Erfindung betrifft im Allgemeinen Molekularbiologie und spezieller
Fehlpaarungsendonucleaseenzyme und deren Verwendungen in Verfahren
zur Herstellung von Populationen verwandter Nucleinsäuremoleküle oder
in der Detektion von Einzelnucleotidpolymorphismen.
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HINTERGRUNDINFORMATION
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DNA-Neukombination
ist ein wichtiges Instrument zur Gewinnung von Rekombinanten zwischen
zwei oder mehreren DNA-Sequenzen, um diese schneller zu entwickeln.
Die Eltern- oder Input-DNAs für
das Verfahren der DNA-Neukombination sind typischerweise Mutanten
oder Varianten eines bestimmten Gens, das eine gewisse verbesserte
Eigenschaft im Vergleich zum Wildtyp aufweist. Die Produkte der
DNA-Neukombination
repräsentieren
einen Pool von im Wesentlichen willkürlichen Neuordnungen von Gensequenzen
aus den Elternnucleinsäuren,
die auf additive oder synergistische Wirkungen aus neuen Sequenzkombinationen analysiert
werden können.
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Rekursive
Sequenzneuordnung ist analog zu einem Evolutionsverfahren, wo nur
Varianten mit geeigneten Eigenschaften ihr genetisches Material
zur Produktion der nächsten
Generation beitragen dürfen.
Optimierte Varianten werden durch DNA-Neukombination-vermittelte Sequenzneuordnung
erzeugt, gefolgt von Testen auf zunehmende Verbesserung der Leistung.
Zusätzliche
Zyklen von Neuordnung und Testen führen zur Produktion von Genen,
die neue Kombinationen von genetischen Verbesserungen enthalten,
die in vorherigen Verfahrensrunden identifiziert worden sind. Neuordnung
und Kombination vorteilhafter genetischer Veränderungen ermöglichen
die Entstehung einer optimierten Sequenz ohne alle möglichen
Sequenzkombinationen individuell herstellen und screenen zu müssen.
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Neukombination
unterscheidet sich stark von willkürlicher Mutagenese, wo spätere Verbesserungen einer
schon verbesserten Sequenz großteils
vom glücklichen
Zufall abhängen.
Um ein Protein zu erhalten, das eine erwünschte Reihe von verbesserten
Eigenschaften aufweist, kann es z.B. notwendig sein, eine Mutante zu
identifizieren, die eine Kombination aus verschiedenen vorteilhaften
Mutationen enthält.
Wenn für
die Kombination dieser vorteilhaften genetischen Veränderungen
kein Verfahren verfügbar
ist, ist eine weitere willkürliche
Mutagenese erforderlich. Jedoch erfordert willkürliche Mutagenese wiederholte
Zyklen von Produktion und Screening großer Anzahlen von Mutanten,
was zu einem Verfahren führt,
das langwierig und höchst
arbeitsintensiv ist. Weiters erhöht
die Geschwindigkeit, mit welcher Sequenzen Mutationen mit unerwünschten Wirkungen
erfahren, den Informationsgehalt einer Sequenz. Da der Informationsgehalt,
die Bibliotheksgröße und Mutagenesegeschwindigkeit
zunehmen, nimmt das Verhältnis
von schädlichen
Mutationen zu vorteilhaften Mutationen zu, was die Auswahl von weiteren
Verbesserungen zunehmend maskiert. Letztlich haben einige Computersimulationen
vermuten lassen, dass Punktmutagenese alleine oft zu langsam ist,
um Blockveränderungen
in großem
Umfang zu ermöglichen,
die zur kontinuierlichen und drastischen Sequenzentwicklung erforderlich
sind.
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Fehlerauslösende PCR
verwendet Polymerisierungsbedingungen mit geringer Genauigkeit,
um ein geringes Ausmaß an
Punktmutationen willkürlich über einer
Sequenz einzuführen.
Eine Einschränkung
dieses Verfahrens ist jedoch, dass veröffentlichte fehlerauslösende PCR-Protokolle
unter einer geringen Verarbeitbarkeit der Polymerase leiden, was
diesen Ansatz in der Produktion von zufälliger Mutagenese in einem
durchschnittlich großen
Gen ineffizient macht.
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Bei
oligonucleotidgerichteter Zufallsmutagenese wird eine kurze Sequenz
durch ein synthetisch mutagenisiertes Oligonucleotid ersetzt. Zur
Erzeugung von Kombinationen von entfernten Mutationen müssen verschiedene
Stellen gleichzeitig durch verschiedene Oligonucleotide angesteuert
werden. Die eingeschränkte Bibliotheksgröße, die
auf diese Weise erhalten wird, im Vergleich zur Bibliotheksgröße, die
erforderlich ist, um alle Stellen zu sättigen, macht viele Auswahlrunden
zur Optimierung erforderlich. Mutagenese mit synthetischen Oligonucleotiden
macht Sequenzierung von einzelnen Klonen nach jeder Auswahlrunde,
gefolgt von Gruppierung dieser in Familien, erforderlich, wobei
willkürlich
eine einzelne Familie ausgewählt
wird und sie auf ein Consensusmotiv reduziert wird. Ein solches
Motiv wird resynthetisiert und in ein einzelnes Gen, gefolgt von
zusätzlicher
Selektion, reinsertiert. Dieser Schritt schafft einen statistischen
Engpass, ist arbeitsintensiv und für viele Mutageneserunden unpraktisch.
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Aus
diesen Gründen
können
fehlerauslösende
PCR und oligonucleotidgerichtete Mutagenese für Mutageneseprotokolle verwendet
werden, die relativ wenige Zyklen von Sequenzänderung erfordern, wie z.B.
zur Sequenz-Feinabstimmung, sind aber in ihrer Nützlichkeit auf Verfahren eingeschränkt, die
zahlreiche Mutagenese- und Selektionszyklen erfordern, insbesondere
auf großen
Gensequenzen.
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Wie
zuvor beschrieben sind Verfahren nach dem Stand der Technik zur
Produktion von verbesserten Genprodukten von willkürlich mutierten
Genen von eingeschränkter
Nützlichkeit.
Ein anerkanntes Verfahren zur Produktion von willkürlich neu
angeordneten Gensequenzen verwendet Enzyme, um eine lange Nucleotidkette
in kleine Stücke
zu spalten. Die Spaltmittel werden dann aus dem genetischen Material
getrennt und das Material auf solche Weise amplifiziert, dass das
genetische Material sich als Ketten von Polynucleotiden neu anordnen
kann, wobei ihre Neuordnung entweder zufällig oder gemäß einer
spezifischen Anordnung erfolgt. Das Verfahren erfordert mehrere
Amplifikationsrunden, um Varianten von Genen zu assemblieren, die
in willkürliche
Fragmente gebrochen wurden (Stemmer, P.N.A.S. 91, 10747-10751 (1994), Stemmer,
Nature 370, 389-391 (1994),
US-Patent
Nr. 5.605.793 ,
US-Patent Nr. 5.811.238 ,
US-Patent Nr. 5.830.721 ,
US-Patent Nr. 5.928.905 ,
US-Patent Nr. 6.096.548 ,
US-Patent Nr. 6.117.679 ,
US-Patent Nr. 6.165.793 ,
US-Patent Nr. 6.153.410 ).
Eine Variation dieses Verfahrens verwendet Primer und eingeschränkte Polymeraseextensionen, um
vor Neuordnung Fragmente zu erzeugen (
US-Patent
Nr. 5.965.408 ,
US-Patent
Nr. 6.159.687 ).
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Jedoch
sind beide Verfahren eingeschränkt.
Diese Verfahren leiden darunter, technisch komplex zu sein. Dies
schränkt
die Anwendbarkeit dieser Verfahren auf Einrichtungen ein, die über ausreichend
erfahrenes Personal verfügen.
Zusätzlich
daszu gibt es Komplikationen, die aus der Neuordnung von Molekülen aus Fragmenten entstehen,
einschließlich
unbeabsichtigter Mutagenese und zunehmender Schwierigkeit der Neuordnung
großer
Targetmoleküle
steigender Größe, welche
die Nützlichkeit
dieser Verfahren zur Neuordnung langer Polynucleotidstränge einschränken.
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Eine
andere Einschränkung
dieser Verfahren zur Fragmentation und auf Neuordnung basierenden Gen-Neukombination
tritt auf, wenn die Eltern-Matrizen-Polynucleotide zunehmend heterogen
sind. Im Annealingschritt dieser Verfahren hängen die kleinen Polynucleotidfragmente
von stabilisierenden Kräften
ab, die aus Basenpaarungswechselwirkungen resultieren, um sich wieder
geeignet zu anellieren. Da die kleinen Annealing-Regionen aufgrund
ihrer kurzen Länge
eingeschränkte
stabilisierende Kräfte
aufweisen, ist Annealing von höchst
komplementären
Sequenzen gegenüber
abweichenderen Sequenzen bevorzugt. In solchen Fällen haben diese Verfahren
eine starke Tendenz dazu, die Eltern-Matrizen-Polynucleotide aufgrund
des Annealings komplementärer
Einzelstränge
aus einer besonderen Elternmatrize zu regenerieren. Deshalb ordnen
sich die Elternmatrizen im Wesentlichen so neu an und erzeugen einen
Hintergrund unveränderter
Polynucleotide in der Bibliothek, welche die Schwierigkeit der Detektion
rekombinanter Moleküle
erhöht.
Dieses Problem wird zunehmend ernst, da die Elternmatrizen heterogener
werden, d.h. da der Prozentsatz der Sequenzidentität zwischen
den Elternmatrizen abnimmt. Dieses Ergebnis wurde von Kikuchi et
al., Gene 243, 133-137 (2000), gezeigt, die versuchten, Rekombinanten
zwischen xy1E und nahes zu erzeugen, unter Verwendung der Verfahren
der Familienneukombination, die von Patten et al., Curr. Opin. Biotechnol.
8, 724-723 (1997); Crameri et al., Nature 391, 288-291 (1998); Harayama,
Trends Biotechnol. 16, 76-82 (1998); Kumamaru et al., Nat. Biotechnol.
16, 663-666 (1998); Chang et al., Nat. Biotechnol. 17, 793-797 (1999);
Hansson et al., J. Mol. Biol. 287, 265-276 (1999), berichtet wurden.
Kichuchi et al. stellten fest, dass im Wesentlichen keine Rekombinanten
(<1 %) erzeugt
wurden. Sie offenbarten auch ein Verfahren zur Verbesserung der
Bildung von chimären Genen
durch Fragmentation und Neuordnung von einzelsträngigen DNAs. Unter Verwendung
dieses Verfahrens erhielten sie chimäre Gene in einer Rate von 14
Prozent, wobei die anderen 86 Prozent Elternsequenzen waren.
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Die
Eigenschaft von Gewinnung mit niedriger Effizienz von Rekombinanten
schränkt
die Nützlichkeit dieser
Verfahren zur Erzeugung neuer Polynucleotide aus Elternmatrizen
mit einem geringeren Prozentsatz von Sequenzidentität, d.h.
Elternmatrizen, die vielfältiger
sind, ein.
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Dementsprechend
besteht Bedarf an einem Verfahren zur Erzeugung von Gensequenzen,
die diese Bedürfnisse
erfüllen.
Es ist ein Verfahren entwickelt worden, um Mutationen unter verwandten
Polynucleotiden in vitro durch die Bildung von Heteroduplexmolekülen und
Ansteuern der Fehlpaarungen neu anzuordnen, sodass Sequenzinformation
an Stellen von Fehlpaarungen von einem Strang zum anderen transferiert
wird. Die Fehlpaarungen werden durch Inkubation der Heteroduplexmoleküle in einer
Rektion angesteuert, die (a) ein Enzym, das einen Sequenzstrang
an einer Fehlpaarungsstelle erkennt und nickt, b) eine Polymerase
mit einer Korrekturaktivität
in Gegenwart von dNTPS und c) eine Ligase enhält. Die jeweiligen Aktivitäten wirken
zusammen, sodass an einer bestimmten Stelle einer Fehlpaarung der
Heteroduplex genickt wird, ungepaarte Basen aus einem der Stränge herausgeschnitten
werden, dann unter Verwendung des entgegengesetzten Strangs als
Matrize ersetzt werden und Nicks versiegelt werden. Entstehende
Polynucleotide können
vor Klonierung amplifiziert werden oder direkt kloniert werden und
auf verbesserte Eigenschaften getestet werden. Zusätzliche
Zyklen von Fehlpaarungsauflösungs-Neuordnung und Testen
können
zu weiterer Verbesserung führen.
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Dieses
Verfahren verwendet eine Fehlpaarungsendonuclease, die in der Lage
ist, an der Stelle einer Fehlpaarung zwischen einer Base oder einer
Sequenz von Basen entlang entgegengesetzten Strängen einer Nucleinsäuresequenz
zu erkennen und zu nicken.
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WO 02/079468 A beschreibt
ein Verfahren zur Neuordnung von Sequenzinformation zwischen verwandten
Nucleinsäuresequenzen
durch Auflösung
von Fehlpaarungen in einem Heteroduplex.
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WO 99/29902 A beschreibt
ein Verfahren zur Entwicklung eines Polynucleotids zum Erwerb einer
gewünschten
funktionellen Eigenschaft durch Transformation eines Heteroduplexmoleküls in eine
kompetente DNA-Reparaturzelle oder einen Zellextrakt und Screening
und Selektion der neu kombinierten Polynucleotidvarianten für die gewünschte funktionelle
Eigenschaft.
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Solaro
et al. (J. Molec. Biol. 230, 868-877 (1993)) beschreiben die Neubildung
des Bakteriophagen-T4-Fehlpaarungskorrektursystems in vitro zur
Korrektur einer DNA-Fehlpaarung.
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Um
den Bedarf an Enzymen zu decken, die eine Fehlpaarung erkennen,
haben die Erfinder das Gen für
das CEL-I-Enzym und ein neues Enzym kloniert, das RES I genannt
wird. Beide dieser Enzyme sind Fehlpaarungsendonucleasen und beide
sind besonders geeignet, um eine Basenpaarfehlpaarung entlang einer Nucleinsäuresequenz
zu erkennen, wie z.B. eines Chromosoms, eines Plasmids, eines Gens,
eines Abschnitts eines Gens oder einer beliebigen künstlichen
Sequenz von Nucleinsäuren.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt das Enzym RES I bereit, das in der
Lage ist, eine Basenfehlpaarung in einer Nucleotidsequenz zu detektieren
und die Sequenz an der Stelle der Basenfehlpaarung zu nicken. Es ist
auch CEL I mit derselben Nützlichkeit
beschrieben. Diese Enzyme können
aus den nativen Pflanzen erhalten werden, in welchen sie auftreten.
Es sind hierin Verfahren bereitgestellt, um sie als rekombinante
Enzyme in einem Wirtsorganismus herzustellen, indem sie in den Wirtsorganismus
kloniert werden.
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CEL
I und RES I sind in Genshufflingtechnologie zur Entwicklung neuer
Gene und der Detektion eines Einzelnucleotidpolymorphismus (SNP)
für z.B.
Detektion von Beweisen für
Krebsanfälligkeit
nützlich.
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Es
ist auch ein Verfahren zum Klonieren von Res-I-Genen in ein Plasmid
oder einen Virusvektor zum Transfer zu einem Wirtsorganismus bereitgestellt,
der die Anzahl von Kopien des Gens amplifiziert oder das Enzym,
für welches
im Plasmid oder Virusvektor kodiert wird, herstellt.
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Es
ist auch ein Verfahren zur Herstellung eines Pflanzenwirts aus Res-I-Enzymen
bereitgestellt.
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Die
CeI-I- und Res-I-Nucleinsäuresequenzen
sind bei der ATCC unter den Bestimmungen des Budapester Vertrags
hinterlegt.
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Es
ist auch eine vollständige
Beschreibung eines Verfahrens bereitgestellt, bei welchem RES I
zur In-vitro-Neuordnung von Mutationen unter verwandten Polynucleotiden
verwendet wird, indem Heteroduplex-Moleküle gebildet werden und dann
die Fehlpaarungen angesteuert werden, sodass Sequenzinformationen
an Stellen der Fehlpaarung von einem Strang auf einen anderen transferiert
werden. Die Fehlpaarungen werden durch Inkubation der Heteroduplex-Moleküle in einer
Reaktion angesteuert, die RES-I-Fehlpaarungsendonucleaseenzym, das
eine Fehlpaarung erkennt und einen der Stränge an der Fehlpaarungsstelle
nickt, eine Polymerase mit einer Korrekturaktivität in Gegenwart
von dNTPs und eine Ligase enthält.
Diese jeweiligen Aktivitäten
wirken zusammen, sodass an einer bestimmten Fehlpaarungsstelle der
Heteroduplex genickt wird, ungepaarte Basen aus einem der Stränge herausgeschnitten
werden, dann unter Verwendung des entgegengesetzten Strangs als
Matrize ersetzt werden und Nicks versiegelt werden. Entstehende
Polynucleotide können
vor Klonierung amplifiziert werden oder direkt kloniert werden und
auf verbesserte Eigenschaften getestet werden. Weitere Zyklen von
Fehlpaarungsauflösungs-Neuordnung und Testen
können
zu weiterer Verbesserung führen.
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Das
Verfahren ist auch als Verfahren zur Erhöhung der Anzahl von komplementären Basenpaaren
in einer Heteroduplexpolynucleotidsequenz beschrieben, wo die Heteroduplexpolynucleotidsequenz
zumindest zwei nicht-komplementäre
Nucleotidbasenpaare aufweist, das Verfahren umfasst die Mischung
der Heteroduplexpolynucle otidsequenz mit einem wirksamen Ausmaß von fehlpaarungsgerichteter
Strangspaltungsaktivität,
die von RES-I-Enzym bereitgestellt wird, Korrekturaktivität und Ligaseaktivität und die
Bereitstellung von ausreichend Zeit für eine Reihe an nicht-komplementären Nucleotidbasenpaaren,
in komplementäre
Basenpaare umgewandelt zu werden, worin die Homogenität zwischen
den Strängen
um zumindest ein komplementäres
Basenpaar erhöht
wird.
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Das
Verfahren ist auch als In-vitro-Verfahren zur Herstellung einer
Population von Sequenzvarianten aus einer Heteroduplexpolynucleotidsequenz
beschrieben, worin die Heteroduplexpolynucleotidsequenz zumindest
zwei nicht-komplementäre
Nucleotidbasenpaare aufweist, wobei das Verfahren die Mischung von
Kopien der Heteroduplexpolynucleotidsequenz mit einem wirksamen
Ausmaß von
fehlpaarungsgerichteter Strangspaltungsaktivität, die von RES-I bereitgestellt
ist, Proof-Reading-Aktivität
und Ligaseaktivität
und Bereitstellung von ausreichend Zeit für eine Anzahl von nicht-komplementären Nucleotidbasenpaaren
umfasst, um in komplementäre
Basenpaare überführt zu werden,
worin sich eine vielfältige
Population von Polynucleotidsequenzen ergibt.
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Das
Verfahren ist auch als In-vitro-Verfahren zur Gewinnung einer Polynucleotidsequenz,
die für
eine gewünschte
funktionelle Eigenschaft kodiert, beschrieben, umfasst die Herstellung
von zumindest einer Heteroduplexpolynucleotidsequenz, Mischung von
Kopien von Heteroduplexpolynucleotidsequenz mit einem wirksamen
Ausmaß von
fehlpaarungsgerichteter Strangspaltungsaktivität, die durch RES-I-Enzym bereitgestellt ist,
Proof-Reading-Aktivität
und Ligaseaktivität
und Bereitstellung von ausreichend Zeit, sodass der Prozentsatz
von Komplementarität
zwischen Strängen
der Heteroduplexpolynucleotidsequenz steigt, worin Sequenzvielfalt
in der Population erhöht
wird, und Screening oder Selektion einer Population von Varianten
auf die gewünschte
funktionelle Eigenschaft.
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Das
Verfahren ist auch als In-vitro-Verfahren zur Gewinnung eines Polynucleotids
beschrieben, das für
eine gewünschte
funktionelle Eigenschaft kodiert, umfasst die Herstellung von zumindest
einem Heteroduplexpolynucleotid, Mischung von Kopien der Heteroduplexpolynucleotidsequenz
mit einem wirksamen Ausmaß von
fehlpaarungsgerichteter Strangspaltungsaktivität, bereitgestellt durch RES-I-Enzym,
Proof-Reading-Aktivität und Ligaseeaktivität, Bereitstellung
von ausreichend Zeit, sodass einige oder alle fehlgepaarte(n) Nucleotidbasenpaare
in der Heteroduplexpolynucleotidsequenz in komplementäre Basen überführt werden, worin
eine vielfältige
Population von Polynucleotidsequenzen resultiert, Screening oder
Selektion einer Population von Varianten mit einer gewünschten
funktionellen Eigenschaft, Denaturierung der Population von Varianten,
um eine Population einzelsträngiger
Polynucleotidsequenzen zu erhalten, Annealing der Population von einzelsträngigen Polynucleotidsequenzen,
um eine vielfältige
Population von Heteroduplexpolynucleotidsequenzen zu bilden, Mischung
der Heteroduplexpolynucleotidsequenz mit einem wirksamen Ausmaß von fehlpaarungsgerichteter
Strangspaltungsaktivität,
Proof-Reading-Aktivität und Ligaseaktivität, Bereitstellung
von ausreichend Zeit, sodass einige oder alle fehlgepaarte(n) Nucleotidbasenpaare
in der Heteroduplexpolynucleotidsequenz in gepaarte Basenpare überführt werden,
worin eine vielfältige
Population von Polynucleotidsequenzen resultiert, und Screening
oder Selektion einer Population von Varianten mit einer gewünschten
funktionellen Eigenschaft. DNA kann in RNA vor Screening durch Transkription
der DNA überführt werden.
Eine Ligaseaktivität
kann hinzugefügt
werden, um die Stränge
nach Proof-Reading zu versiegeln.
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Einer
der Vorteile dieses Verfahrens ist, dass die Sequenz entweder zirkulär oder linear
ist. Dies ermöglicht
eine Neukombination von nahezu unbegrenzter Sequenzlänge. Die
Variantenpolynucleotidsequenzen weisen verschiedene Ausmaße an Komplementärität auf. Die
Erfinder berichten von Erhöhung
der Komplementarität
in einem Polynucleotidheteroduplex zwischen zwei Polynucleotiden
mit einer geringen Sequenzhomologie von 47 %.
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Dieses
Verfahren kann gleichzeitig an mehreren Stellen und an beiden Strängen eines
bestimmten Heteroduplex-DNA-Moleküls stattfinden. Das Ergebnis
ist eine Randomisierung von Sequenzunterschieden unter Inputsträngen, um
eine Population von Sequenzvarianten zu ergeben, die vielfältiger ist
als die Population von Startsequenzen.
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In
einer anderen Ausführungsform
umfasst ein Verfahren zur Identifikation eines neu angeordneten DNA-Moleküls, das
für ein
Protein mit einer gewünschten
funktionellen Eigenschaft kodiert, die Bereitstellung von zumindest
einem einzelsträngigen
uracilenthaltenden DNA-Molekül,
dessen einzelsträngiges
uracilenthaltendes DNA-Molekül
oder ein komplementärer
Strang dazu für
ein Protein kodiert; die Bereitstellung eines oder einer Vielzahl
von nicht-identischen einzelsträngigen
DNA-Molekülen,
die in der Lage sind, an ein einzelsträngiges uracilenthaltendes DNA-Molekül zu hybridisieren,
worin die DNA-Moleküle
für zumindest
eine zusätzliche
Variante des Proteins kodieren; Kontaktieren des einzelsträngigen uracilenthaltenden
DNA-Moleküls
mit zumindest einem einzelsträngigen
DNA-Molekül
aus Schritt (b), wodurch ein anelliertes DNA-Molekül produziert
wird; Inkubieren des anellierten DNA-Moleküls mit einer Fehlpaarungsendonuclease,
Proof-Reading-Poylmerase und einer Ligase, wodurch ein sequenzneuanordnender
DNA-Strang hergestellt wird, der an das uracilenthaltende DNA-Molekül anelliert
ist; Amplifizieren des neu angeordneten DNA-Strangs unter Bedingungen,
worin das uracilenthaltende DNA-Molekül nicht amplifiziert wird,
wodurch eine Population von neu angeordneten DNA-Molekülen produziert
wird; und Screening oder Selektion der Population von neu angeordneten DNA-Molekülen, um
jene zu identifizieren, die für
ein Polypeptid kodieren, das die gewünschte funktionelle Eigenschaft
aufweist, wodurch ein oder mehrere DNA-Molekül(e) identifiziert werden,
die für
ein Polypeptid mit der gewünschten
funktionellen Eigenschaft kodieren. Dieses Verfahren kann auch unter
Verwendung eines RNA-Moleküls
als Matrize erfolgen.
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Jedes
der oben beschriebenen Verfahren kann alternativ mit dem Enzym CEL
I wie hierin beschrieben durchgeführt werden.
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Wie
hierin beschrieben ist Cel I ein Nucleinsäuremolekül, das die Nucleinsäuresequenz
von Seq.-ID Nr. 1 oder Seq.-ID Nr. 2, oder Seq.-ID Nr. 3 oder Seq.-ID
Nr. 4 umfasst.
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Es
ist ebenfalls ein rekombinantes Virus beschrieben, das eine Nucleinsäuresequenz
von Cel I, repräsentiert
durch die Seq.-ID Nr. 1, Seq.-ID Nr. 2, oder Seq.-ID Nr. 3 oder
Seq.-ID Nr. 4, umfasst.
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Es
ist ebenfalls ein rekombinantes Plasmid beschrieben, das eine Nucleinsäuresequenz
von Cel I, repräsentiert
durch die Seq.-ID Nr. 1, Seq.-ID Nr. 2, oder Seq.-ID Nr. 3 oder
Seq.-ID Nr. 4, umfasst.
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Es
ist ebenfalls eine Pflanze oder Pflanzenzelle beschrieben, die ein
rekombinantes Virus umfasst, das für eine Nucleinsäuresequenz
von Cel I,. repräsentiert
durch die Seq.-ID Nr. 1, Seq.-ID Nr. 2, oder Seq.-ID Nr. 3 oder
Seq.-ID Nr. 4, kodiert.
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Es
ist ebenfalls eine Pflanze oder Pflanzenzelle beschrieben, die ein
rekombinantes Plasmid umfasst, das für eine Nucleinsäuresequenz
von Cel I, repräsentiert
durch die Seq.-ID Nr. 1, Seq.-ID Nr. 2, oder Seq.-ID Nr. 3 oder
Seq.-ID Nr. 4, kodiert.
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Das
rekombinante Virus kann ein Pflanzenvirus, ein Tiervirus, ein Pilzvirus,
oder ein bakterielles Virus sein.
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Es
ist auch ein Verfahren zur Expression von CEL-I-Endonuclease beschrieben,
das ein rekombinantes Virus verwendet.
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Es
ist auch ein Verfahren zur Verwendung von CEL I in einem In-vitro-Verfahren
zur Herstellung von Sequenzvarianten von zumindest einem Heteroduplexpolynucleotid
beschrieben, wo der Heteroduplex zumindest zwei nicht-komplementäre Nucleotidbasenpaare
aufweist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
- a.
Herstellung von zumindest einem Heteroduplexpolynucleotid;
- b. Mischung des Heteroduplexpolynucleotids mit einer wirksamen
Menge von CEL I, T4-DNA-Polymerase und T4-DNA-Ligase und Bereitstellung
von ausreichend Zeit, sodass der Prozentsatz der Komplementarität steigt,
worin eine oder mehrere Varianten hergestellt werden.
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In
einer Ausführungsform
ist Res I ein Nucleinsäuremolekül, das die
Nucleinsäuresequenz
von Seq.-ID Nr. 16 umfasst. Es ist die RES-I-Aminosäuresequenz
von Seq.-ID Nr.
34 dargestellt.
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In
einer anderen Ausführungsform
ein rekombinantes Virus, das eine Nucleinsäuresequenz von RES I umfasst,
wie durch Seq.-ID Nr. 16 repräsentiert.
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In
einer anderen Ausführungsform
ein rekombinantes Plasmid, das eine Nucleinsäuresequenz von RES I umfasst,
wie durch Seq.-ID Nr. 16 repräsentiert.
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In
einer anderen Ausführungsform
eine Pflanze oder Pflanzenzelle, die ein rekombinantes Virus umfasst,
das für
eine Nucleinsäuresequenz
von RES I kodiert, wie durch Seq.-ID Nr. 16 repräsentiert.
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In
einer anderen Ausführungsform
eine Pflanze oder Pflanzenzelle, die ein rekombinantes Plasmid umfasst,
das für
eine Nucleinsäuresequenz
von RES I kodiert, wie durch Seq.-ID Nr. 16 repräsentiert.
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In
einer anderen Ausführungsform
kann das rekombinante Virus ein Pflanzenvirus, ein Tiervirus, ein Pilzvirus
oder ein bakterielles Virus sein.
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In
einer anderen Ausführungsform
ist das Verfahren zur Expression von RES-I-Endonuclease unter Verwendung eines
rekombinanten Virus dargestellt.
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In
einer anderen Ausführungsform
ist ein Verfahren zur Verwendung von RES I in einem In-Vitro-Verfahren
zur Herstellung von Sequenzvarianten aus zumindest einem Heteroduplexpolynucleotid
dargestellt, wo der Heteroduplex zumindest zwei nicht-komplementäre Nucleotidbasenpaare
aufweist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst:
- a.
Herstellung von zumindest einem Heteroduplexpolynucleotid;
- b. Kombination von Heteroduplexpolynucleotid mit einer wirksamen
Menge von RES I, T4-DNA-Polymerase und T4-DNA-Ligase und
- c. Bereitstellung von ausreichend Zeit, sodass der Prozentsatz
von Komplementarität
erhöht
werden kann, worin eine oder mehrere Varianten hergestellt werden
können.
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KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN
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1 zeigt
das Verfahren der genetischen Neuordnung von Fehlpaarungsauflösung (GRAMMR). Neuordnung
wird zwischen zwei hypothetischen Polynucleotiden erreicht, die
sich in zumindest zwei Nucleotidpositionen unterscheiden. Annealing
zwischen dem oberen Strang von A und dem unteren Strang von B ist dargestellt,
was zu Fehlpaarungen an den zwei Positionen führt. Nach dem Verfahren zur
Neuordnung von Fehlpaarungsauflösung
sind vier verschiedene Produktpolynucleotide zu sehen, die Elterntypen
A und B und die neugeordneten Produkte X und Y.
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2 zeigt eine exemplarische teilweise komplementäre Nucleinsäurepopulation
von zwei Molekülen, 2A zeigt die Sequenz von zwei Nucleinsäuremolekülen „X" und „Y" mit komplett komplementären Ober- und
Untersträngen
1+/2- bzw. 3+/4-. Die Positionen von sich unterscheidenden Nucleotiden
zwischen den Nucleinsäuren
X und Y sind angezeigt (*). 2B zeigt
mögliche
Kombinationen von Einzelsträngen,
die aus Nucleinsäuren
X und Y nach Denaturierung und Annealing gewonnen werden, und zeigt,
welche dieser Kombinationen eine teilweise komplementäre Nucleinsäurepopulation
von zwei umfasst.
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3 zeigt
eine Nucleinsäuresequnez,
die für
RES-I-Endonuclease (Seq.-ID Nr. 16) kodiert, wie in Beispiel 8 beschrieben.
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4 zeigt
eine entsprechende Aminosäuresequenz
für RES
I (Seq.-ID Nr. 34).
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5 zeigt
die Nucleinsäuresequenz
für Plasmid
pBSC3BFP (Seq.-ID Nr. 32), wie in Beispiel 9 beschrieben.
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6 zeigt
die Nucleinsäuresequenz
für das
offene Tobamovirusbewegungsproteinlesegerüst von TMV-Cg (Seq.-ID Nr.
18), wie in Beispiel 15 beschrieben.
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7 zeigt
die Nucleinsäuresequenz
für das
offene Tobamovirusbewegungsproteinlesegerüst von TMV-Ob (Seq.-ID Nr.
19), wie in Beispiel 15 beschrieben.
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8 zeigt
die Nucleinsäuresequenz
für das
offene Tobamovirusbewegungsproteinlesegerüst von TMV-U2 (Seq.-ID Nr.
20), wie in Beispiel 15 beschrieben.
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9 zeigt
einen resultierenden Klon aus TMV-Cg und ToMV-GRAMMR-Reaktion (Seq.-ID
Nr. 21), wie in Beispiel 15 beschrieben.
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10 zeigt einen zweiten resultierenden Klon aus
TMV-Cg und ToMV-GRAMMR-Reaktion
(Seq.-ID Nr. 22), wie in Beispiel 15 beschrieben.
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11 zeigt einen resultierenden Klon aus TMV-Ob
und ToMV-GRAMMR-Reaktion (Seq.-ID Nr. 23), wie in Beispiel 15 beschrieben.
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12 zeigt einen zweiten resultierenden Klon aus
TMV-Ob und ToMV-GRAMMR-Reaktion
(Seq.-ID Nr. 24), wie in Beispiel 15 beschrieben.
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13 zeigt einen resultierenden Klon aus TMV-U2
und ToMV-GRAMMR-Reaktion (Seq.-ID Nr. 25), wie in Beispiel 15 beschrieben.
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14 zeigt einen zweiten resultierenden Klon aus
TMV-U2 und ToMV-GRAMMR-Reaktion
(Seq.-ID Nr. 26), wie in Beispiel 15 beschrieben.
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15 zeigt einen resultierenden Klon aus TMV-U1
und ToMV-GRAMMR-Reaktion (Seq.-ID Nr. 27), wie in Beispiel 15 beschrieben.
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16 zeigt einen zweiten resultierenden Klon aus
TMV-U1 und ToMV-GRAMMR-Reaktion
(Seq.-ID Nr. 28), wie in Beispiel 15 beschrieben.
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17 zeigt die Nucleinsäuresequenz für das offene
Tobamovirusbewegungsproteinlesegerüst von TMV (Seq.-ID Nr. 9),
wie in Beispiel 15 beschrieben.
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18 zeigt die Nucleinsäuresequenz für das offene
Tobamovirusbewegungsproteinlesegerüst von ToMV (Seq.-ID Nr. 10),
wie in Beispiel 15 beschrieben.
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Definitionen
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Um
ein klares und logisches Verständnis
der Beschreibung und der Ansprüche
bereitzustellen, einschließlich
des Schutzumfangs, der hierin solchen Begriffen verliehen wird,
sind folgende Definitionen bereitgestellt:
Wie hierin verwendet
bezieht sich der Begriff „Amplifikation" auf ein Verfahren,
in welchem die Anzahl von Kopien eines Polynucleotids erhöht wird.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Annealing" die Bildung von zumindest teilweise
doppelsträngiger
Nucleinsäure
durch Hybridisierung von zumindest teilweise komplementären Nucleotidsequenzen. Eine
teilweise doppelsträngige
Nucleinsäure
kann auf Hybridisierung eines kleineren Nucleinsäurestrangs an einen längeren Nucleinsäurestrang
zurückzuführen sein,
wo die kleinere Nucleinsäure
100% identisch mit einem Abschnitt der größeren Nucleinsäure ist.
Eine teilweise doppelsträngige
Nucleinsäure
kann auch auf die Hybridisierung von zwei Nucleinsäuresträngen zurückzuführen sein,
die keine 100 % Identität
teilen, aber ausreichend Homologie aufweisen, um unter einer bestimmten
Reihe von Hybridisierungsbedingungen zu hybridisieren.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Klemme" eine einzigartige Nucleotidsequenz,
die an ein Ende eines Polynucleotids hinzugefügt wird, wie z.B. durch Inkorporation
der Klemmensequenz in einen PCR-Primer. Die Klemmensequenzen sollen
Amplifikation nur von Polynucleotiden ermöglichen, die aus Hybridisierung
von Strängen
verschiedener Eltern entstehen (d.h. Heteroduplexmoleküle), wodurch
die Produktion von Hybridprodukten voller Länge wie zuvor beschrieben sichergestellt
wird (Skarfstad, J. Bact., Band 182, Nr. 11, 3008-3016).
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Spalten" den Verdau des Polynucleotids mit Enzymen oder
aber das Aufbrechen von Phosphodiester-Bindungen mit dem Polynucleotid.
Wie hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Strangspaltungsaktivität" oder „Spaltung" das Aufbrechen einer
Phosphodiesterbindung in der Hauptkette des Polynucleotidstrangs,
wie durch die Bildung eines Nicks. Strangspaltungsaktivität kann durch
ein enzymatisches Mittel bereitgestellt werden. Solche Mittel umfassen
CEL 1, RES 1 und ihre Varianten.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „komplementäres Basenpaar" die Entsprechung
von DNA-(oder RNA-)Basen in der Doppelhelix, sodass Adenin in einem
Strang gegenüber
Thymin (oder Uracil) im anderen Strang liegt und Cytosin in einem
Strang gegenüber
Guanin im anderen Strang liegt.
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Wie
hierin verwendet, wird der Begriff „komplementär zu" dazu verwendet,
zu beschreiben, dass die komplementäre Sequenz mit dem Umkehrkomplement
aller oder eines Abschnitts einer Referenzpolynucleotidsequenz identisch
ist oder dass jedes Nucleotid in einem Strang in der Lage ist, ein
Basenpaar mit einem Nucleotid oder einem Analogon davon im entgegengesetzten
Strang zu bilden. Zur Veranschaulichung ist die Nucleotidsequenz „TATAC" komplementär zur Referenzsequenz „GTATA".
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „denaturierend" oder „denaturiert", wenn er zur Bezeichnung
von Nucleinsäuren
verwendet wird, die Überführung einer
doppelsträngigen
Nucleinsäure
an eine einzelsträngige
Nucleinsäure.
Verfahren zum Denaturieren von doppelsträngigen Nucleinsäuren sind
fachbekannt und umfassen zum Beispiel die Hinzufügung von Mitteln, die Basenpaarung
destabilisieren, Erhöhen
der Temperatur, Verringerung der Salzkonzentration oder Kombinationen
davon. Diese Faktoren werden gemäß der Komplementarität der Stränge angewendet,
d.h. die Stränge
sind 100 % komplementär
oder weisen ein oder mehrere nicht-komplementäre Nucleotide auf.
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Wie
hierin verwendet steht der Begriff „gewünschte funktionelle Eigenschaft" für eine phänotypische Eigenschaft,
die unter anderem das Kodieren für
ein Polypeptid, die Förderung
der Transkription von verbundenen Polynucleotiden, die Bindung eines
Proteins, die Verbesserung der Funktion eines Virusvektors und dergleichen
umfasst, die ausgewählt
werden kann und auf die gescreent werden kann. Polynucleotide mit
solchen gewünschten
funktionellen Eigenschaften können
auf verschiedenste Weise verwendet werden, die unter anderem die
Expression aus einer/m geeigneten Pflanze, Tier, Pilz, Hefe oder
Bakterienexpressionsvektor, Integration zur Bildung einer/s transgenen
Pflanze, Tiers oder Mikroorganismus, Funktion eines Ribozyms und dergleichen
umfassen.
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Wie
hierin verwendet, wird der Begriff „DNA-Neukombination" dazu verwendet,
eine Neuordnung von Sequenzinformation zwischen im Wesentlichen
homologen, aber nicht-identischen Sequenzen anzugeben.
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Wie
hierin verwendet, wird der Begriff „wirksame Menge" dazu verwendet,
die Menge eines Mittels zu beschrieben, die notwendig ist, um zu
erreichen, dass das Mittel seine gewünschte Aktivität bereitstellt.
Für die vorliegende
Erfindung liegt diese Bestimmung innerhalb des Wissensbereichs von
Fachleuten.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Wirt" eine Zelle, ein Gewebe oder einen Organismus, die/das/der
in der Lage ist, einen Vektor oder eine Pflanzenvirusnucleinsäure zu replizieren,
und in der Lage ist, mit einem Virus infiziert zu sein, das den
Virusvektor oder die Pflanzenvirusnucleinsäure umfasst. Der Begriff soll,
wo geeignet, prokaryotische und eukaryotische Zellen, Organe, Gewebe
oder Organismen umfassen.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Infektion" die Fähigkeit eines Virus, seine
Nucleinsäure zu
einem Wirt zu transferieren oder Virusnucleinsäure in einen Wirt einzuführen, worin
die Virusnucleinsäure repliziert
wird, Virusproteine werden synthetisiert und neue Viruspartikel
assembliert werden. In diesem Kontext werden die Begriffe „transmissibel" und „infektiös" hierin austauschbar
verwendet.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff "nicht-nativ" eine beliebige RNA-Sequenz, welche die Produktion von subgenomischer
mRNA, einschließlich
aber nicht ausschließlich
von 1) Pflanzenviruspromotoren, wie z.B. ORSV und Trespenmosaik-Virus,
2) Viruspromotoren aus anderen Organismen, wie z.B. menschliche Sindbis-Viruspromotoren,
und 3) synthetische Promotoren, umfasst.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „phänotypisches Merkmal" eine beobachtbare
Eigenschaft, die aus der Expression eines Gens resultiert.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Pflanzenzelle" eine strukturelle
und physiologische Einheit von Pflanzen, bestehend aus einem Protoplasten
und der Zellwand.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Pflanzenorgan" einen anderen und
sichtbar differenzierten Teil einer Pflanze, wie eine Wurzel, Stamm,
Blatt oder Embryo.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Pflanzengewebe" eine beliebiges
Gewebe einer Pflanze in planta oder in Kultur. Dieser Begriff soll
eine gesamte Pflanze, Pflanzenzelle, Pflanzenorgan, Protoplasten, Zellkultur
oder eine beliebige Gruppe von Pflanzenzellen umfassen, die in einer
strukturellen und funktionellen Einheit organisiert sind.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Produktionszelle" eine Zelle, ein
Gewebe oder einen Organismus, die/das/der in der Lage ist, einen
Vektor oder Virusvektor zu replizieren, aber nicht notwendigerweise
einen Wirt für
das Virus ist. Dieser Begriff soll prokaryotische und eukaryotische
Zellen, Organe, Gewebe oder Organismen umfassen, wie z.B. Bakterien-,
Hefe-, Pilz- und Pflanzengewebe.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Promotor" die 5'-flankierende, nicht-kodierende Sequenz, die an eine kodierende
Sequenz angrenzt, die in den Beginn der Transkription der kodierenden
Sequenz involviert ist.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Protoplast" eine isolierte Pflanzenzelle
ohne Zellwände mit
dem Potential zur Regeneration in Zellkultur oder eine gesamte Pflanze.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure" Pflanzenvirusnucleinsäure, die
modifiziert worden ist, um nicht-native Nucleinsäuresequenzen zu erhalten.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „rekombinantes Pflanzenvirus" ein Pflanzenvirus,
das die rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure enthält.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „subgenomischer Promotor" einen Promotor einer
subgenomischen mRNA einer Virusnucleinsäure.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „wesentliche Sequenzhomologie" Nucleotidsequenzen, die
zueinander im Wesentlichen funktionell äquivalent sind. Nucleotidunterschiede
zwischen solchen Sequenzen, die wesentliche Sequenzhomologie aufweisen,
sind de minimus in der Beeinflussung der Funktion der Genprodukte
oder einer RNA, für
welche eine solche Sequenz kodiert.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Transkription" die Produktion eines
RNA-Moleküls
durch RNA-Polymerase als komplementäre Kopie einer DNA-Sequenz.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Vektor" ein selbst-replizierendes DNA-Molekül, das ein DNA-Segment
zwischen Zellen transferiert.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Virus" ein infektiöses Mittel, bestehend aus einer
Nucleinsäure,
die in einem Protein eingekapselt ist. Ein Virus kann wie oben beschrieben
ein mono-, di-, tri- oder mehrteiliges Virus sein.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „genetische Neuordnung durch
Fehlpaarungsauflösung (GRAMMR)" ein Verfahren zur
Neuordnung von Sequenzvariationen unter verwandten Polynucleotiden
durch ein In-vitro-Verfahren zur Neuverteilung von Sequenzvariationen
zwischen nicht-identischen Polynucleotidsequenzen, indem aus zwei
nicht-identischen Polynucleotiden ein Heteroduplexpolynucleotid
hergestellt wird; Einführung
eines Nicks in einem Strang an oder nahe einer Basenpaarfehlpaarungsstelle;
Entfernen von fehlgepaarter/n Base(n) aus der Fehlpaarungsstelle,
wo der Nick auftrat; und Verwenden des entgegengesetzten Strangs
als Matrize, um die entfernte(n) Base(n) durch Basen zu ersetzen,
die Base(n) im ersten Strang komplementieren. Durch dieses Verfahren
wird die Information von einem Strang auf einen anderen an Stellen
der Fehlpaarung transferiert.
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Mehrere
Stellen in einem teilweise komplementären Molekül können unabhängig und gleichzeitig in diesem
Verfahren angesteuert werden. Das Ergebnis ist ein Anstieg des Prozentsatzes
von komplementären Basenpaaren
in der Polynucleotidsequenz.
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Eine
oder mehrere Basenpaarfehlpaarungen zwischen zwei Strängen der
Heteroduplexpolynucleotidsequenz werden in einem In-vitro-Verfahren
durch Mischung der Heteroduplexpolynucleotidsequenz mit einer wirksamen
Menge einer fehlpaarungsgerichteten Strangspaltungsaktivität aufgelöst, die
durch CEL-I- oder RES-I-Enzym bereitgestellt ist, Proof-Reading-Aktivität und Ligase-Aktivität, um eine
oder mehrere der Fehlpaarungen aufzulösen. Durch dieses Verfahren
wird Information von einem Strang zum anderen an Stellen der Fehlpaarung
transferiert.
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Eine
Fehlpaarung kann das Ergebnis zweier nicht-komplementärer Basen
sein, die einander gegenüberliegend
auftreten. Eine Fehlpaarungsstelle kann aus einem Cluster einer
Reihe von ungepaarten Nucleotiden bestehen, einschließlich Nucleotid-Basenpaare, die durch
benachbarte Fehlpaarung instabil gemacht werden. Eine Fehlpaarung
kann auch das Ergebnis einer oder mehrerer Basen sein, die auf einem
Strang auftreten, die kein numerisches Gegenüber auf dem entgegengesetzten
Strang aufweisen. Zum Beispiel können an
der Stelle der Fehlpaarung 1 ungepaarte Base auf einem Strang und
keine ungepaarte Basen auf dem anderen Strang vorliegen. Dies führt an einer
Stelle der Sequenzlängenheterogenität, an welcher
ein einzelnes ungepaartes Nucleotid in einem Strang an jener Stelle
enthalten ist. Abhängig
vom Strang, der anfänglich
an dieser Fehlpaarungsstelle genickt wird, resultiert das Verfahren
der Erfindung entweder in der Insertion einer einzelnen Base, in
Bezug auf den kürzeren
Strang, oder in der Deletion einer einzelnen Base in Bezug zum Strang,
der ursprünglich
das zusätzliche
ungepaarte Nucleotid aufwies. Dieses Prinzip des Transfers von Sequenzlängeninformation
von einem Strang auf den anderen kann auf eine Stelle der Fehlpaarung
angewendet werden, wo die Anzahl der fehlgepaarten Basen auf den
zwei Strängen
einander nicht gleichkommt.
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Für gewöhnlich sind
viele Kopien des Heteroduplexpolynucleotids in der Reaktion vorhanden.
In dieser Situation kann Sequenzinformation an einer Fehlpaarungsstelle
auf dem oberen Strang auf einer Kopie des Polynucleotids und aus
dem unteren Strang in einer anderen Kopie als Matrize dargestellt
werden. Angenommen, eine ausreichende Anzahl an Kopien ist verfügbar, wenn
eine einzelne Fehlpaarung gegenwärtig
ist, dann sind zwei entstehende Varianten möglich. Wenn zwei Fehlpaarungsstellen
gegenwärtig
sind, dann können
2 mal 2 Varianten resultieren, wenn n Fehlpaarungsstellen gegenwärtig sind,
dann sind zumindest 2 zur n-ten Potenz oder 2n genetische
Neuordnungen durch Fehlpaarungsauflösung möglich. Das mögliche Ergebnis
sind zumindest 2n Variantenpolynucleotide.
Die Erfinder sagen zumindest, da der exakte Mechanismus nicht völlig klar
ist. Es kann spekuliert werden, dass für eine Fehlpaarungsstelle,
die zwei oder mehrere Basen lang ist, ein besonderes Ereignis für 1, 2 oder
mehrere der fehlgepaarten Basen eine Matrize darstellen kann. Wenn
das der Fall ist, dann kann das Ergebnis ein Anstieg der möglichen
Anzahl von Varianten sein.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „GENEWARE" oder „GENEWARE®" einen Virusvektor, der
zumindest teilweise von einem Tobamovirus abstammt und mo difiziert
wird, um einen zusätzlichen
(üblicherweise
heterologen) subgenomischen Promotor zu enthalten. Ein Tobamovirus,
das in der Natur anzutreffen ist, enthält typischerweise subgenomische
Promotoren für
das Bewegungsprotein und das Hüllprotein.
GENEWARE® ist
eine eingetragene Marke der Large Scale Biology Corporation.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Granularität" die Menge der Nucleinsäuresequenzinformation
von einer bestimmten Elternpolynucleotidsequenz, die als zusammenhängende Sequenz
in einem bestimmten Nachkommenpolynucleotid auftritt.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Matrizensequenz" eine erste einzelsträngige Polynucleotidsequenz,
die teilweise zu einer zweiten Polynucleotidsequenz komplementär ist, sodass
Behandlung durch GRAMMR zu einem Transfer der genetischen Information
vom Matrizenstrang zum zweiten Strang führt.
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Je
größer die
Einheiten der Sequenzinformation, die von einem Matrizenstrang transferiert
werden, desto höher
die Granularität.
Je kleiner die Blöcke
der Sequenzinformation, die vom Matrizenstrang transferiert werden,
desto geringer oder feiner die Granularität. Geringere Granularität zeigt,
dass ein DNA-Neukombinations- oder -Neuordnungsverfahren in der
Lage ist, kleinere diskrete Blöcke
genetischer Information vom Matrizenstrang zum zweiten Strang zu
transferieren. Der Vorteil eines DNA-Neukombinations- oder -Neuordnungsverfahrens
mit geringerer Granularität
ist es, dass es in der Lage ist, kleinere Nucleinsäuresequenzen von
anderen aufzulösen
und die Sequenzinformation zu transferieren. DNA-Neukombinations-
oder -Neuordnungsverfahren, die primär hohe Granularität zurückbringen,
sind nicht einfach in der Lage, kleine Nucleinsäuresequenzen von anderen aufzulösen.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Heteroduplexpolynucleotid" ein doppelsträngiges Polynucleotid,
das durch Annealing von Einzelsträngen gebildet wird, typischerweise
separater Stränge,
wo die Stränge
nicht-identisch sind. Ein Heteroduplexpolynucleotid kann ungepaarte
Regionen aufweisen, die als Einzelstrangschleifen oder -blasen bestehen.
Eine Heteroduplexpolynucleotidregion kann auch durch ein einzelsträngiges Polynucleotid
gebildet werden, worin eine teilweise Selbst-Komplementarität die Bildung
einer Stamm-Schleifenstruktur ermöglicht, wo der Annealingabschnitt
des Strangs nicht-identisch ist.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Heteroduplex-DNA" eine doppelsträngige DNA,
die durch Annealing von Einzelsträngen gebildet wird, typischerweise
separater Stränge,
wobei die Stränge
nicht-identisch sind. Eine Heteroduplex-DNA kann ungepaarte Regionen
aufweisen, die als Einzelstrangschleifen oder -blasen bestehen.
Eine Heteroduplex-DNA-Region kann auch durch ein einzelsträngiges Polynucleotid
gebildet werden, worin eine teilweise Selbst-Komplementarität die Bildung
einer Stamm-Schleifenstruktur ermöglicht, wobei der Annealingabschnitt
des Strangs nicht-identisch ist.
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Wie
hierin verwendet beschreibt der Begriff „homolog", dass eine einzelsträngige Nucleinsäuresequenz
an eine zumindest teilweise komplementäre einzelsträngige Nucleinsäuresequenz
hybridisieren kann. Der Grad der Hybridisierung kann von einer Reihe
von Faktoren abhängen,
einschließlich
des Ausmaßes
der Identität
zwischen den Sequenzen und der Hybridisierungsbedingungen, wie z.B.
Temperatur und Salzkonzentrationen, wie nachstehend beschrieben.
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Nucleinsäuren sind „homolog", wenn sie natürlich oder
künstlich
von einer gemeinsamen Vorgängersequenz
abstammen. Im Verlauf der natürlichen
Evolution tritt dies auf, wenn zwei oder mehrere von einer Elternsequenz
abstammende Sequenzen sich im Verlauf der Zeit unterscheiden, d.h.
aufgrund von Mutation und natürlicher
Selektion. Unter künstlichen
Bedingungen tritt Divergenz auf, z.B. auf eine von zwei Grundarten. Erstens
kann eine bestimmte Sequenz künstlich
mit einer anderen Sequenz rekombiniert werden, wie das z.B. bei
typischem Klonieren auftritt, um eine abstammende Nucleinsäure zu produzieren,
oder eine bestimmte Sequenz kann chemisch modifiziert oder auf andere
Weise manipuliert werden, um das resultierende Molekül zu modifizieren.
Alternativ dazu kann eine Nucleinsäure de novo synthetisiert werden,
indem eine Nucleinsäure synthetisiert
wird, die sich in der Sequenz von einer ausgewählten Elternnucleinsäuresequenz
unterscheidet. Wenn es kein ex plizites Wissen über die Vorfahren zweier Nucleinsäuren gibt,
wird Homologie typischerweise durch Sequenzvergleich zwischen zwei
Sequenzen abgeleitet. Wo zwei Nucleinsäuresequenzen Sequenzähnlichkeit über einen
bestimmten Abschnitt jeder der Nucleinsäuren zeigen, wird davon ausgegangen,
dass zwei Nucleinsäuren
einen gemeinsamen Vorfahren haben. Das genaue Ausmaß der Sequenzähnlichkeit,
das Homologie herstellt, variiert im Fachgebiet abhängig von
einer Vielzahl von Faktoren.
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Für Zwecke
dieser Offenbarung werden zwei Nucleinsäuren als homolog angesehen,
wenn sie ausreichend Sequenzidentität teilen, um GRAAMR-vermittelten
Informationstransfer zu ermöglichen,
der zwischen den Nucleinsäuremolekülen auftritt.
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Wie
hierin verwendet bedeutet der Begriff „identisch" oder „Identität", dass zwei Nucleinsäuresequenzen dieselbe Sequenz
oder eine komplementäre
Sequenz aufweisen. Daher bedeutet „Identitätsbereiche", dass Regionen oder Bereiche eines
Polynucleotids oder das gesamte Polynucleotid zu Bereichen eines
anderen Polynucleotids identisch sind oder dazu komplementär sind.
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Wie
hierin verwendet bedeutet der Begriff „Anstieg der prozentuellen
Komplementarität", dass der Prozentsatz
der komplementären
Basenpaare in einem Heteroduplexmolekül größer gemacht wird.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Ligase" ein Enzym, das eine Phosphodiesterbindung
zwischen angrenzenden Nucleotiden in einer Nucleinsäure schafft.
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Wie
hierin verwendet bezieht sich der Begriff „Fehlpaarung" auf ein Basenpaar,
das nicht in der Lage ist, normale Basenpaar-Wechselwirkungen zu
bilden (d.h. andere als „A" mit „T" (oder „U") oder „G" mit „C").
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Fehlpaarungsauflösung" die Überführung eines
fehlgepaarten Basenpaars in ein komplementäres Basenpaar.
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Wie
hierin verwendet steht der Begriff „Mutationen" für Veränderungen
der Sequenz einer Wildtyp- oder Referenznucleinsäuresequenz oder Veränderungen
in der Sequenz eines Polypeptids. Solche Mutationen können Punktmutationen
sein, wie z.B. Transitionen oder Transversionen. Die Mutationen
können
Deletionen, Insertionen oder Duplikationen sein.
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Wie
hierin verwendet steht der Begriff „Nucleinsäure" oder „Nucleinsäuremolekül" für
ein Polynucleotid, wie Desoxyribonucleinsäure (DNA) oder Ribonucleinsäure (RNA),
und umfasst einzelsträngige
und doppelsträngige
Nucleinsäuren
sowie ein Oligonucleotid. Nucleinsäuren, die in der Erfindung
nützlich
sind, umfassen genomische DNA, cDNA, mRNA, Plasmide, Cosmide, PCR-Produkte
und synthetische Oligonucleotide und können den Sense-Strang, den
Anti-Sense-Strang oder beides repräsentieren. Eine Nucleinsäure umfasst im
Allgemeinen die vier natürlich
auftretenden Nucleotide Adenin, Guanin, Cytosin und Thymidin/Uridin.
Eine Nucleinsäure
der Erfindung kann auch andere natürlich auftretende oder nicht
natürlich
auftretende Nucleotide inkorporieren, einschließlich Derivate davon, solange
die Nucleotidderivate durch eine Polymerase bei einer Wirksamkeit,
die ausreichend ist, um ein gewünschtes
Polynucleotidprodukt zu erzeugen, in ein Polynucleotid inkorporiert
werden können.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „eine Elternnucleinsäure" eine doppelsträngige Nucleinsäure mit
einer Sequenz, die zu 100 % identisch mit einer ursprünglichen
einzelsträngigen
Nucleinsäure
in einer Ausgangspopulation von teilweise komplementären Nucleinsäuren ist.
Elternnucleinsäuren
umfassen zum Beispiel in der Abbildung von 2 Nucleinsäuren X und
Y, wenn eine teilweise komplementäre Nucleinsäurekombination 1+14- oder 2-/3+
als Ausgangspopulation in einem Erfindungsverfahren verwendet wurde.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „teilweise komplementär" eine Nucleinsäure mit
einer im Wesentlichen komplementären
Sequenz zu einer anderen Nucleinsäure, die sich aber von der
anderen Nucleinsäure
durch zumindest zwei oder mehrere Nucleotide unterscheidet.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „teilweise komplementäre Nucleinsäurepopulation" eine Population
von Nucleinsäuren,
die einzelne Gruppen von Nucleinsäuren umfasste, die im Wesentlichen
komplementäre
Sequenzen aufweisen, aber keine Nucleinsäuren, die zu einer besonderen
Gruppe gehören,
die eine exakte komplementäre
Sequenz für
eine andere Gruppe von Sequenzen in der Population aufweisen.
-
Wie
hierin verwendet unterscheidet sich ein beliebiges Element einer
teilweise komplementären
Nucleinsäurepopulation
von einer anderen Nucleinsäure
der Population oder dem Komplement dazu durch zwei oder mehrere
Nucleotide. Als solches schließt
eine teilweise komplementäre
Nucleinsäure
speziell eine Population aus, die Sequenzen enthält, die genau komplementär sind,
d.h. eine komplementäre
Sequenz, die 100 % Komplementarität aufweist. Deshalb unterscheidet
sich jedes Element einer solchen teilweise komplementären Nucleinsäurepopulation
von anderen Elementen der Population durch zwei oder mehrere Nucleotide, einschließlich beider
Stränge.
Ein Strang wird oberer Strang und sein Komplement unterer Strang
genannt.
-
Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „oberer Strang" ein Polynucleotid,
das in der 5'-zu-3'-Richtung gelesen
wird, und der „untere
Strang" ist sein
Komplement. Es versteht sich, dass, während eine Sequenz als unterer
oder oberer Strang bezeichnet wird, eine solche Bezeichnung komplementäre Stränge unterscheiden
soll, da es in Lösung
keine Orientierung gibt, die einen Strang als oberen oder unteren
Strang fixiert.
-
Zum
Beispiel kann eine Population, die zwei Nucleinsäureelemente enthielt, von zwei
doppelsträngigen
Nucleinsäuren
abgeleitet werden, mit einem Potenzial, einen beliebigen der vier
Stränge
dazu zu verwenden, eine einzelsträngige teilweise komplementäre Nucleinsäurepopulation
zu erzeugen. Ein Beispiel für
potenzielle Kombinationen von Strängen zweier Nucleinsäuren, die
verwendet werden können,
um eine teilweise komplementäre
Nucleinsäurepopulation
der Erfindung zu erhalten, ist in 2 dargestellt.
Die zwei Nucleinsäuresequenzen,
die potenzielle Elemente einer teilweise komplementären Nucleinsäurepopulation
sind, werden „X" (AGATCAATTG) und „Y" (AGACCGATTG) (2A) genannt. Die Nucleinsäuresequenzen unterscheiden
sich an zwei Positionen (Positionen 4 und 6, durch „*" angezeigt). Der „obere
Strang" der Nucleinsäuren X und
Y wird als „1+" bzw. „3+" bezeichnet, und
der „untere
Strang" der Nucleinsäuren X und
Y wird „2-" bzw. „4-" genannt.
-
2B zeigt die möglichen
Kombinationen der vier Nucleinsäurestränge. Von
den sechs möglichen Strangkombinationen
umfasst nur die Kombination von 1+/2-, 1+/4-, 2-/3+ oder 3+/4- den
erforderlichen oberen und unteren Strang einer teilweise komplementären Nucleinsäurepopulation.
Von diesen Ober-/Untersequenzkombinationen umfassen nur 1+/4- oder
2-/3+ ein Beispiel für
eine teilweise komplementäre
Nucleinsäurepopulation
von zwei verschiedenen Molekülen,
weil nur diese Kombinationen komplementäre Sequenzen aufweisen, die
sich durch zumindest ein Nucleotid unterscheiden. Die übrigen Kombinationen
1+/2- und 2+/4- enthalten exakt komplementäre Sequenzen und umfassen deshalb
keine teilweise komplementäre
Nucleinsäurepopulation
der Erfindung.
-
Im
obigen Beispiel einer Population von zwei verschiedenen Molekülen schloss
eine teilweise komplementäre
Population von Nucleinsäuremolekülen Kombinationen
von Strängen
aus, die sich durch eine oder mehrere Nucleotide unterschieden,
aber die vom selben Sense sind, z.B. 1+/3+ oder 2-14-. Jedoch ist
es verständlich,
dass eine solche Kombination von gleichsträngigen Nucleinsäuren in
eine größere Population
aufgenommen werden kann, solange die Population zumindest einen
Unterstrang und zumindest einen Oberstrang umfasst. Wenn z.B. eine
dritte Nucleinsäure „Z" mit Strängen 5+
und 6- enthalten ist, umfassen die Kombinationen 1+/3+/6- oder 2-/4-/5+
eine teilweise komplementäre
Nucleinsäurepopulation. Ähnlich kann eine
Anzahl von Nucleinsäuren
und ihre entsprechenden Ober- und Unterstränge kombiniert werden, um eine teilweise
komplementäre
Nucleinsäurepopulation
der Erfindung zu erzeugen, solange die Population zumindest einen
Oberstrang und zumindest einen Unterstrang enthält und solange die Population
keine Elemente enthält,
die das exakte Komplement sind.
-
Die
Populationen von Nucleinsäuren
der Erfindung können
etwa 3 oder mehr, etwa 4 oder mehr, etwa 5 oder mehr, etwa 6 oder
mehr, etwa 7 oder mehr, etwa 8 oder mehr, etwa 9 oder mehr, etwa
10 oder mehr, etwa 12 oder mehr, etwa 15 oder mehr, etwa 20 oder
mehr, etwa 25 oder mehr, etwa 30 oder mehr, etwa 40 oder mehr, etwa
50 oder mehr, etwa 75 oder mehr, etwa 100 oder mehr, etwa 150 oder
mehr, etwa 200 oder mehr, etwa 250 oder mehr, etwa 300 oder mehr,
etwa 350 oder mehr, etwa 400 oder mehr, etwa 450 oder mehr, etwa
500 oder mehr oder sogar etwa 1000 oder mehr verschiedene Nucleinsäuremoleküle sein.
Eine Population kann auch etwa 2000 oder mehr, etwa 5000 oder mehr,
etwa 1 × 104 oder mehr, etwa 1 × 105 oder
mehr, etwa 1 × 106 oder mehr, etwa 1 × 107 oder
mehr oder sogar etwa 1 × 108 oder mehr verschiedene Nucleinsäuren enthalten.
Ein Fachmann kann eine gewünschte
Population einfach bestimmen, um in Erfindungsverfahren abhängig vom
Wesen des gewünschten
Neuordnungsversuchsergebnisses und der verfügbaren Screeningverfahren,
wie hierin offenbart, enthalten zu sein.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Polymerase" ein Enzym, das die
Bildung von Polymeren von Nucleotiden katalysiert, d.h. Polynucleotide
in einer matrizengerichteten Form. Eine Polymerase, die in der Erfindung
nützlich
ist, kann von einem beliebigen Organismus oder Quelle abstammen,
einschließlich
Tier-, Pflanze-, Bakterien- und Viruspolymerasen. Eine Polymerase
kann eine DNA-Polymerase, RNA-Polymerase oder eine reverse Transkriptase
sein, die in der Lage sind, RNA in DNA zu transkribieren.
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Wie
hierin verwendet beschreibt der Begriff „Proof-Reading" die Eigenschaft
eines Enzyms, wo ein Nucleotid, wie z.B. ein fehlgepaartes Nucleotid,
in einer 3'-zu-5'-Richtung entfernt werden kann und typischerweise
durch ein basengepaartes Nucleotid ersetzt werden kann. Im Fall
des Ansteuerns einer Schleife, die durch Insertion oder Deletion
verursacht ist, kann Proof-Reading nur die Entfernung von fehlgepaartem/n
Nucleotid(en) oder nur die Hinzufügung von basengepaartem/n Nucleotid(en)
umfassen.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „rekombinantes" Polynucleotid ein
Polynucleotid, das Sequenzinformation von zumindest zwei verschiedenen
Polynucleotiden umfasst.
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Wie
hierin verwendet beschreibt der Begriff „verwandte Polynucleotide", dass Regionen oder
Bereiche der Polynucleotide identisch sind und Regionen oder Bereiche
der Polynucleotide nicht-identisch sind.
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Wie
hierin verwendet wird der Begriff DNA-„Neuordnung” hierin
verwendet, um eine Neuverteilung von Sequenzvariationen zwischen
nicht-identischen Sequenzen anzugeben.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Replikon" eine genetische Einheit von Replikation,
die eine Länge
von Polynucleotid und seine Stelle zu Initiation von Replikation
umfasst.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Sequenzvielfalt" die Häufigkeit
von nicht-identischen Polynucleotiden. Der Begriff „zunehmende
Sequenzvielfalt in einer Population" bedeutet, die relative Häufigkeit von
nicht-identischen Polynucleotiden in einer Population zu erhöhen.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „Sequenzvariante" ein Molekül (DNA-,
RNA-Polypeptid und dergleichen) mit einem oder mehreren Sequenzunterschieden
im Vergleich zu einem Referenzmolekül. Zum Beispiel führt die
Summe der getrennten unabhängigen
Fehlpaarungsauflösungsereignisse,
die im gesamten Heteroduplexmolekül im GRAMMR-Verfahren auftreten,
zu einer Neuordnung von Sequenzinformation im gesamten Molekül. Die Sequenzinformation
ordnet sich in einer Reihe von Kombinationen neu an, um eine komplexe
Bibliothek von „Sequenzvarianten" zu erzeugen.
-
Wie
hierin verwendet steht der Begriff „fehlpaarungsgerichtete Strangspaltung" für eine Strangspaltungsaktivität durch
ein Mittel, das eine Stelle eines fehlgepaarten Basenpaars, Gruppe
von fehlgepaarten Basenpaaren oder Extrahelixbasen oder Basen auf
einer Heteroduplexpolynucleotidsequenz erkennt und einen Strang
an der Stelle der Fehlpaarung spaltet.
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Wie
hierin verwendet bezeichnet der Begriff „ausreichend Zeit" den Zeitraum, der
notwendig ist, sodass eine Reaktion oder ein Verfahren ein gewünschtes
Produkt ergibt. Für
die vorliegende Erfindung liegt die Bestimmung der ausreichenden
Zeit innerhalb des Wissens jener Fachleute. Es versteht sich, dass „ausreichend
Zeit" stark variieren
kann, abhängig
von den Wünschen
der Fachleute, ohne Einfluss auf die Funktionalität der Reaktion
oder die Qualität
des gewünschten
Produkts zu nehmen.
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Wie
hierin verwendet steht der Begriff „Wildtyp" dafür,
dass ein Nucleinsäurefragment
keine beliebigen Mutationen enthält.
Ein „Wildtyp"-Protein steht dafür, dass
das Protein in einem Ausmaß von
Aktivität
aktiv sein wird, das in der Natur gefunden wird, und typischerweise
die Aminosäuresequenz
ist, die in der Natur zu finden ist. In einem Aspekt kann der Begriff „Wildtyp" oder „Elternsequenz" eine Start- oder
Referenzsequenz vor einer Manipulation der Erfindung angeben.
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In
der Polypeptidbezeichnung, die hierin verwendet wird, ist die linke
Richtung die aminoterminale Richtung und die rechte Richtung die
carboxyterminale Richtung gemäß Standardverwendung
und Konvention. Ähnlich,
wenn nicht anders angegeben, ist das linke Ende der einzelsträngigen Polynucleotidsequenzen das
5'-Ende, die linke
Richtung der doppelsträngigen
Polynucleotidsequenzen wird als 5'-Richtung angegeben. Die Richtung der
5'-zu-3'-Addition von entstehenden
RNA-Transkripten wird als Transkriptionsrichtung bezeichnet.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Nucleinsäuremoleküle, die
eine Nucleinsäuresequenz
umfassen, die Seq.-ID Nr. 1, Seq.-ID Nr. 2, Seq.-ID Nr. 3 oder Seq.-ID
Nr. 4 umfasst, sind als Vektoren oder Plasmide für die Expression von CEL-I-Endonuclease
nützlich.
Die Nucleinsäuremoleküle von Seq.-ID
Nr. 3 und Seq.-ID Nr. 4 sind offene CEL-I-Lesegerüste, die
in Seq-ID Nr. 1 bzw. Seq.-ID Nr. 2 enthalten sind. Die Herstellung
und Verwendung der Nucleinsäuremoleküle von Seq.-ID
Nr. 1, Seq.-ID Nr. 2, Seq.-ID Nr. 3 und Seq.-ID Nr. 4 werden in
Beispiel 2 hierin weiter unterrichtet. Die vorliegende Erfindung
stellt Nucleinsäuremoleküle bereit,
welche die Nucleinsäuresequenzen von
3 (Seq.-ID
Nr. 16) umfassen, die als Vektoren oder Plasmide für die Expression
von RES-I-Endonuclease
nützlich
sind. Fehlpaarungsendonucleasen von Pflanzen haben die Fähigkeit,
Fehlpaarung zwischen hybridisierten Nucleinsäuresträngen zu detektieren, Schleifen
und Insertionen zwischen solchen hybridisierten Strängen zu
detektieren, Polymorphismen zwischen solchen hybridisierten Strängen zu
detektieren, Sequenzunterschiede in Polynucleotidsträngen zu
detektieren und solche Mutationen in einer Targetpolynucleotidsequenz
ohne wesentliche Nebenwirkungen von flankierenden DNA-Sequenzen
zu detektieren (T. Anthony Yeung und Patrick J. Hagan, Internationale
Patentanmeldung Nr.
WO 97/46701 ).
Diese Endonucleasen sind in einer Vielzahl von Pflanzen und wahrscheinlich
im gesamten Pflanzenreich zu finden. Sie sind in den Alfalfa-Spösslingen,
Spargel, Mungobohnensprösslingen,
Stangensellerie, Cha ha, Eisbergsalat, Petersilie, Sellerie, Broccoli-Rosen,
Kohl, Karfiol-Rosen (Blumenkohl-Rosen) und Paradeisern (Tomaten)
zu finden [C.A. Oleykowski et al., Nucleic Acids Research, Band
26, Nr. 20, 4597-4602 (1998)].
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Endonucleasen
von Pflanzen können
nun in einem Verfahren zur Entwicklung von Reihen von Nucleotidsequenzvarianten
aus hybridisierten Sequenzen verwendet werden. Im Verfahren detektiert
die Fehlpaarungsendonuclease fehlgepaarte Basen und nickt zumindest
einen der hybridisierten Stränge.
Ein Polymeraseenzym ersetzt dann eine oder mehrere fehlgepaarte
Basen durch eine oder mehrere Basen, welche die Basen auf dem entgegengesetzten
Strang komplementieren. Der Nick wird dann durch ein Ligaseenzym
versiegelt. Wenn zwei oder mehrere Fehlpaarungsstellen auf dem Hybrid
gegenwärtig
sind, resultiert eine Population von Variantensequenzen, abhängig von
der Zahl und Position der Fehlpaarungen, bei welchen Ersetzen durchgeführt wird,
und dem Strang, auf welchem ein Ersetzen der Base durchgeführt wurde.
In der Entwicklung von Sequenzvarianten ist es nicht notwendigerweise
wünschenswert,
für alle
Fehlpaarungen auf allen Kopien der Sequenz aufgelöst zu werden.
Aus einer Reihe von Sequenzvarianten können eine oder mehrere Varianten, die
bevorzugte Aktivität
aufweisen, ausgewählt
werden. RES I und CEL I geben ein Beispiel für Fehlpaarungsendonucleasen,
die in diesem Verfahren nützlich
sind. Andere von Pflanzen abstammende Fehlpaarungsendonucleasen
sind auch in einer GRAMMR-Reaktion nützlich.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Expression von
RES-I-Endonuclease
unter Verwendung von rekombinanter Pflanzenvirusnucleinsäure bereit,
die eine Nucleinsäuresequenz
aus 3 (Seq.-ID Nr. 16) umfasst.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch eine rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure bereit,
die zumindest einen subgenomischen Promotor umfasst, der in der
Lage ist, RES-I-Endonuclease in einer Pflanzenzelle zu transkribieren
oder zu exprimieren, worin die Pflanzenzelle eine Wirtszelle oder
Produktionszelle ist.
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In
einer anderen Ausführungsform
wird eine Pflanzenvirusnucleinsäure
bereitgestellt, in welcher die native Hüllprotein-Kodiersequenz aus
einer Virusnucleinsäure
deletiert wurde, eine nicht-native Pflanzenvirus-Hüllprotein-Kodiersequenz
und ein nicht-nativer
Promotor, vorzugsweise der subgenomische Promotor der für nicht-natives
Hüllprotein
kodierenden Sequenz, der zur Expression im Pflanzenwirt, Verpackung
der rekombinanten Pflanzenvirusnucleinsäure und Sicherstellung einer
systemischen Infektion des Wirts durch die rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure in der
Lage ist, insertiert wurden. Alternativ dazu kann das Hüllproteingen
durch Insertion der nicht-nativen
Nucleinsäuresequenz
innerhalb inaktiviert werden, sodass ein Fusionsprotein produziert
wird. Die rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure kann eine oder mehrere
zusätzliche nicht-native
subgenomische Promotoren umfassen. Jeder nicht-native subgenomische
Promotor ist in der Lage, angrenzende Gene oder Nucleinsäuresequenzen
im Pflanzenwirt zu transkribieren oder exprimieren, und ist nicht
in der Lage, sich miteinander und mit nativen subgenomischen Promotoren
zu rekombinieren. Nicht-native (fremde) Nucleinsäuresequenzen können angrenzend
an den nativen subgenomischen Pflanzenviruspromotor oder die nativen
und einen nicht-nativen subgenomischen Pflanzenviruspromotor insertiert
werden, wenn mehr als eine Nucleinsäuresequenz enthalten ist. Die
nicht-nativen Nucleinsäuresequenzen
werden transkribiert oder im Pflanzenwirt unter Kontrolle des subgenomischen
Promotors exprimiert, um die gewünschten
Produkte zu produzieren.
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In
einer anderen Ausführungsform
ist eine rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure wie in der ersten Ausführungsform
bereitgestellt, mit der Ausnahme, dass die native Hüllprotein-Kodiersequenz
angrenzend an einen der nicht-nativen subgenomischen Hüllproteinpromotoren
platziert ist anstelle einer nicht-nativen Hüllprotein-Kodiersequenz.
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In
wieder einer anderen Ausführungsform
ist eine rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure bereitgestellt, in welcher
das native Hüllproteingen
an seinen subgenomischen Promotor angrenzt und ein oder mehrere
nicht-native subgenomische Promotoren in die Virusnucleinsäure insertiert
worden sind. Die insertierten nicht-nativen subgenomischen Promotoren
sind in der Lage, angrenzende Gene in einem Pflanzenwirt zu transkribieren
oder zu exprimieren, und sind nicht in der Lage, sich miteinander
und mit nativen subgenomischen Promotoren zu rekombinieren. Nicht-native Nucleinsäuresequenzen
können
angrenzend an die nicht-nativen subgenomischen Pflanzenviruspromotoren
insertiert werden, sodass die Sequenzen in der Wirtspflanze unter Kontrolle
der subgenomischen Promotoren transkribiert oder exprimiert werden,
um das gewünschte
Produkt zu produzieren.
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In
einer anderen Ausführungsform
wird eine rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure wie in der dritten Ausführungsform
bereitgestellt, mit der Ausnahme, dass die native Hüllprotein-Kodiersequenz
durch eine nicht-native Hüllprotein-Kodiersequenz
ersetzt ist.
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Die
Virusvektoren sind durch Hüllproteine
enkapsidiert, für
welche die rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure kodiert, um ein rekombinantes
Pflanzenvirus herzustellen. Die rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure oder
das rekombinante Pflanzenvirus wird zur Infektion von geeigneten
Wirtspflanzen verwendet. Die rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure ist
zur Replikation im Wirt, zur systemischen Verteilung in dem Wirt, zur
Transkription oder Expression des/der fremden Gens/e im Wirt, um
das gewünschte
Produkt herzustellen, in der Lage.
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Eine
andere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist auf rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäuren und
rekombinante Viren ausgerichtet, die zur Aufrechterhaltung und Transkription
oder Expression von nicht-nativen (fremden) Nucleinsäuresequenzen
stabil sind und die in der Lage sind, solche fremden Sequenzen in
der Wirtspflanze systemisch zu transkribieren oder exprimieren.
Genauer umfassen rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäuren gemäß der vorliegenden
Erfindung einen nativen subgenomischen Pflanzenviruspromotor, zumindest
einen nicht-nativen subgenomischen Pflanzenviruspromotor, eine Pflanzenvirushüllprotein-Kodiersequenz
und gegebenenfalls zumindest eine nicht-native Nucleinsäuresequenz.
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Die
vorliegende Erfindung stellt die Infektion eines Pflanzenwirts durch
ein rekombinantes Pflanzenvirus, das eine rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure enthält, oder
durch die rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure bereit, die eine oder mehrere
nicht-native Nucleinsäuresequenzen
enthält,
die im infizierten Gewebe des Pflanzenwirts transkribiert oder exprimiert
werden. Das Produkt der kodierenden Sequenzen kann aus der Pflanze
gewonnen werden oder ein phänotypisches
Merkmal in der Pflanze verursachen.
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Der
erste Schritt bei der Erreichung beliebiger Eigenschaften der Erfindung
ist es, die Nucleotidsequenzen der Pflanzenvirusnucleotidsequenz
durch bekannte herkömmliche
Verfahren zu modifizieren, sodass eine oder mehrere nicht-native
subgenomische Promotoren in die Pflanzenvirusnucleinsäure insertiert
werden, ohne die biologische Funktion der Pflanzenvirusnucleinsäure zu zerstören. Die
subgenomischen Promotoren sind in der Lage, angrenzende Nucleinsäuresequenzen
in einem Pflanzenwirt zu transkribieren oder exprimieren, der durch
rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure oder rekombinantes Pflanzenvirus
infiziert ist. Die native Hüllprotein-Kodiersequenz kann
in zwei Ausführungsformen
deletiert sein, unter die Kontrolle eines nicht-nativen subgenomischen
Promotors in einer zweiten Ausführungsform
gestellt sein oder beibehalten in einer weiteren Ausführungsform
sein. Wenn sie dele tiert oder aber inaktiviert ist, wird ein nicht-natives
Hüllproteingen
unter Kontrolle eines der nicht-nativen subgenomischen Promotoren
oder optional unter der Kontrolle des nativen subgenomischen Hüllproteingenpromotors
insertiert. Das nicht-native Hüllprotein
ist in der Lage, die rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure zu enkapsidieren,
um ein rekombinantes Pflanzenvirus zu produzieren. Daher enthält die rekombinante
Pflanzenvirusnucleinsäure
eine für
Hüllprotein
kodierende Sequenz, die eine native oder eine nicht-native Hüllprotein-Kodiersequenz
sein kann, unter Kontrolle eines der nativen oder nicht-nativen
subgenomischen Promotoren. Das Hüllprotein
ist in die systemische Infektion des Pflanzenwirts involviert.
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Einige
der Viren, die diese Anforderung erfüllen und daher geeignete Viren
sind, umfassen Viren aus der Tabakmosaikvirusgruppe, wie z.B. Tabakmosaikvirus
(TMV); Augenbohnenmosaikvirus (CMV), Alfalfa-Mosaikvirus (AMV),
Gurkengrünscheckungsmosaikvirus-Wassermelonenstamm
(CGMMV-W) und Hafermosaikvirus (OMV), und Viren aus der Trespenmosaikvirusgruppe,
wie z.B. Trespenmosaikvirus (BMV), Ackerbohnenscheckungsvirus und
chlorotisches Augenbohnenscheckungsvirus. Weitere geeignete Viren
umfassen Reis-Nekrose-Virus (RMV) und Geminiviren, wie z.B. Tomaten-Gold-Mosaikvirus
(TGMV), Maniokmosaikvirus (CLV) und Maisstrichelvirus (MVS).
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Eine
andere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung ist eine rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure, die
weiters eine oder mehrere nicht-native Nucleinsäuresequenzen umfasst, die in
der Lage sind, im Pflanzenwirt transkribiert zu werden. Die nicht-native
Nucleinsäuresequenz
wird angrenzend an einen oder die nicht-nativen subgenomischen Viruspromotoren
und/oder den nativen Hüllproteingenpromotor
platziert, abhängig
von der besonderen verwendeten Ausführungsform. Die nicht-native Nucleinsäure wird
durch herkömmliche
Verfahren insertiert, oder die nicht-native Nucleinsäuresequenz kann in oder angrenzend
an die native Hüllprotein-Kodiersequenz insertiert
werden, sodass ein Fusionsprotein produziert wird. Die nicht-native Nucleinsäuresequenz,
die transkribiert wird, kann als RNA transkribiert werden, die in
der Lage ist, die Expression eines phänotypischen Merkmals durch
einen Anti-Sense-Mechanismus zu regulieren. Alternativ dazu kann
die nicht-native Nucleinsäuresequenz
in rekombinanter Pflanzenvirusnucleinsäure im Pflanzenwirt transkribiert
und translatiert werden, um ein phänotypisches Merkmal herzustellen.
Die nicht-native Nucleinsäuresequenz(en)
kann/können
auch für
die Expression von mehr als einer phänotypischen Eigenschaft kodieren. Die
rekombinante Pflanzenvirusnucleinsäure, welche die nicht-native
Nucleinsäuresequenz
enthält,
wird unter Verwendung herkömmlicher
Verfahren hergestellt, sodass sich nicht-native Nucleinsäuresequenz(en)
in richtiger Ausrichtung zu einem subgenomischen Viruspromotor befinden,
welcher auch immer verwendet wird.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch eine Pflanzenzelle bereit, die
einen Vektor oder ein Plasmid umfasst, der/das eine Nucleinsäuresequenz
aus 3 (Seq.-ID Nr. 16) umfasst, worin die Pflanzenzelle
eine Wirtszelle oder Produktionszelle ist.
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Verfahren
zur Herstellung von CEL-I- und RES-I-Enzym sind nicht auf Pflanzenvirusvektoren
beschränkt.
Diese Gene oder deren Varianten können in einen beliebigen Wirtsorganismus
durch eine Reihe verschiedener fachbekannter Verfahren eingeführt werden.
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Verfahren
zur Transformation verschiedener Wirtszellen sind in Klein et al., „Transformation
of microbes, plants and animals by particle bombardment", Bio/Technol., New
York, N. Y., Nature Publishing Company, 10 (3), 286-291 (März 1992),
offenbart. Verfahren zur Transformation einer großen Vielzahl
von höheren
Pflanzenspezies sind bekannt und in der technischen, wissenschaftlichen
und Patentliteratur beschrieben. Siehe zum Beispiel Weising et al.,
Ann. Rev. Genet. 22, 421-477 (1988).
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Zum
Beispiel kann das DNA-Konstrukt unter Verwendung von Verfahren wie
Elektroporation, PEG-vermittelter Transfektion, Teilchenbombardierung,
Siliziumfaserverabreichung oder Mikroinjektion von Pflanzenzellprotoplasten
oder Embryoide bildendem Kallus in die genomische DNA der Pflanzenzelle
eingeführt
werden. Siehe z.B. Tomes et al., Direct DNA Transfer into Intact
Plant Cells via Microprojectile Bombardment, 197-213, in: Plant
Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods, Hrsg. O. L.
Gamborg und G. C: Phillips, Springer-Verlag, Berlin, Heidel berg,
New York (1995). Die Einführung
von DNA-Konstrukten unter Verwendung von Polyethylenglykolausfällung ist
in Paszkowski et al., Embo J. 3, 2717-2722 (1984), beschrieben.
Elektroporationsverfahren sind in Fromm et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. 82, 5824 (1985), beschrieben. Ballistische Transformationsverfahren
sind in Klein et al., Nature 327, 70-73 (1987), beschrieben.
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Alternativ
dazu können
die DNA-Konstrukte mit geeigneten T-DNA-flankierenden Regionen kombiniert werden
und in einen herkömmlichen
Agrobacterium-tumefaciens-Wirtsvektor
eingeführt
werden. Die Virulenzfunktionen des Agrobacterium-tumefaciens-Wirts
steuern die Insertion des Konstrukts und angrenzender Marker in
die Planzenzell-DNA, wenn die Zelle mit den Bakterien infiziert
ist. Agrobacterium-tumefaciens-vermittelte
Transformationsverfahren sind in der wissenschaftlichen Literatur
gut beschrieben. Siehe zum Beispiel Horsch et al., Science 233,
496-498 (1984), und Fraley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 80, 4803
(1983). Zum Beispiel ist Agrobacteriumtransformation von Mais in
US-Patent Nr. 5.981.840 beschrieben.
Agrobacteriumtransformation von Einkeimblättlern ist in
US-Patent Nr. 5.591.616 beschrieben.
Agrobacteriumtransformation von Sojabohnen ist in
US-Patent Nr. 5.563.055 beschrieben.
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Andere
Transformationsverfahren umfassen (1) agrobacterium-rhizogenes-vermittelte
Transformation (siehe z.B. Lichtenstein und Fuller, in: Genetic
Engineering, Band 6, PWJ Rigby, Hrsg., London, Academic Press (1987),
und C. P. Lichtenstein und J. Draper, in: DNA Cloning, Band II,
D. M. Glover, Hrsg., Oxford IRI Press (1985)),
WO 88/02405 , veröffentlicht am 7. April 1988,
beschreibt die Verwendung von A.-rhizogenes-Stamm
A4 und seinem Ri-Plasmid gemeinsam mit A.-tumefaciens-Vektoren pARC8 oder
pARC16, (2) liposomenvermittelte DNA-Aufnahme (siehe z.B. Freeman
et al., Plant Cell Physiol. 25, 1353 (1984)), (3) die Verwirbelungsverfahren
(siehe z.B. Kindle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1228 (1990)).
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DNA
kann auch durch direkten DNA-Transfer in Pollen eingeführt werden,
wie z.B. von Zhou et al., Methods in Enzymology 101, 433 (1983),
D. Hess, intern. Rev. Cytol. 107, 367 (1987); Luo et al., Plane
Mol. Biol. Reporter 6, 165 (1988), beschrieben.
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Expression
von Nucleinsäuren,
die für
Polypeptid kodieren, kann durch Injektion der DNA in reproduktive
Organe einer Pflanze wie von Pena et al., Nature 325, 274 (1987),
beschrieben erhalten werden. DNA kann auch direkt in Zellen unreifer
Embryos injiziert werden, und die Rehydratisierung von ausgetrockneten Embryos
kann wie von Neuhaus et al., Theor. Appl. Genet. 75, 30 (1987),
und Benbrook et al., in Proceedings Bio. Expo. (1986), Butterworth,
Stoneham, Mass. 27-54 (1986), beschrieben durchgeführt werden.
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Transformierte
Pflanzenzellen, die von beliebigen der oben angeführten Transformationsverfahren
abstammen, können
kultiviert werden, um eine gesamte Pflanze zu regenerieren, die
den transformierten Genotyp besitzt. Solche Regenerationsverfahren
basieren auf der Manipulation bestimmter Phytohormone in einem Gewebskulturwachstumsmedium,
typischerweise auf einem Biozid und/oder Herbicidmarker, der gemeinsam mit
einem Polynucleotid der vorliegenden Erfindung eingeführt worden
ist. Zur Transformation und Regeneration von Mais siehe Gordon-Kamm
et al., The Plant Cell 2, 603-618 (1990).
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CEL
I und RES I und deren Varianten können auch durch andere Wirts-
oder Wirt/Vektor-Systeme hergestellt werden. Eine Polynucleotidsequenz
kann in ein rekombinantes Plasmid, Virus oder ein anderes fachbekanntes
Vehikel eingeführt
werden, das durch Insertion oder Inkorporation der genetischen Sequenzen
manipuliert worden ist. Solche Expressionsvektoren enthalten einen
Promotor, eine Sequenz, die eine wirksame Transkription von insertierter
Gensequenz des Wirts erleichtert. Der Expressionsvektor enthält typischerweise einen
Replikationsstartpunkt, einen Promotor. Vektoren, die zur Verwendung
in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, umfassen unter anderem
den T7-basierten Expressionsvektor zur Expression in Bakterien (Rosenberg
et al., Gene 56, 125 (1987)), den pMSXND-Expressionsvektor zur Expression
in Säugetierzellen
(Lee und Nathans, J. Biol. Chem. 263, 3521 (1988)) und von Baculovirus
abstammende Vektoren zur Expression in Insektenzellen. Das DNA-Segment
kann im Vektor gegenwärtig
sein, der operabel mit regulierenden Elementen verbunden ist, z.B.
einen Promotor (z.B. T7, Metallothionein-I oder Polyhedrinpromotoren).
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Polynucleotidsequenzen
können
entweder in Prokaryoten oder Eukaryoten exprimiert werden. Wirte können Mikroben-,
Hefe-, Insekten und nichtmenschliche Säugetierorganismen umfassen.
Verfahren zur Expression von DNA-Sequenzen, die eukaryotische oder
virale Sequenzen aufweisen, in Prokaryoten sind fachbekannt.
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Biologisch
funktionelle virale und Plasmid-DNA-Vektoren, die zur Expression
und Replikation in einem Wirt in der Lage sind, sind fachbekannt.
Solche Vektoren werden zur Inkorporation von DNA-Sequenzen der Erfindung
verwendet.
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Fachbekannte
Verfahren können
zur Herstellung von Expressionsvektoren verwendet werden, die für CEL I
oder RES I kodierende Sequenzen und geeignete Transkriptions/Translationskontrollsignale
enthalten. Diese Verfahren umfassen In-vitro-DNA-Rekombinationsverfahren, synthetische
Verfahren und In-vivo-Rekombination/genetische Verfahren [siehe
zum Beispiel die in Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laborstory Manual,
Cold Spring Harbor Laborstory, N. Y. (1989), beschriebenen Verfahren].
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Eine
Vielzahl von Wirt-Expressionsvektorsystemen kann zur Expression
einer für
CEL I oder RES I kodierenden Sequenz verwendet werden. Diese umfassen
unter anderem Mikroorganismen, wie z.B. Bakterien, die mit rekombinanter
Bakteriophagen-DNA, Plasmid-DNA oder Cosmid-DNA-Expressionsvektoren
transformiert wurden, die eine für
CEL I oder RES I kodierende Sequenz enthalten, Hefe, die mit rekombinanten Hefeexpressionsvektoren
transformiert wurde, die eine für
CEL I oder RES I kodierende Sequenz enthalten, Insektenzellsysteme,
die mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren (z.B. Baculovirus)
infiziert wurden, die eine für
CEL I oder RES I kodierende Sequenz enthalten, oder Tierzellsysteme,
die mit rekombinanten Virusexpressionsvektoren infiziert wurden
(z.B. Retroviren, Adenovirus, Vakziniavirus), die eine für CEL I
oder RES I kodierende Sequenz enthalten, oder transformierte Tierzellsysteme,
die für
stabile Expression hergestellt wurden.
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Abhängig vom
verwendeten Wirt/Vektorsystem kann eine beliebige Zahl von geeigneten
Transkriptions- und Translationselementen, einschließlich konstitutiver
und in duzierbarer Promotoren, Transkriptionsenhancerelemente, Transkriptionsterminatoren
etc., im Expressionsvektor verwendet werden [siehe z.B. Bitter et al.,
Methods in Enzymology 153, 516-544 (1987)]. Zum Beispiel können induzierbare
Promotoren, wie z.B. pL von Bakteriophagen lambda, plac, ptrp, ptac
(ptrp-lac-Hybridpromotor), bei Klonierung in Bakteriensystemen verwendet
werden. Bei Klonierung in Säugetierzellsystemen
können
Promotoren, die vom Genom von Säugetierzellen
(z.B. Metallothioneinpromotor) oder von Säugetierviren (z.B. der langen
terminalen Retroviruswiederholung; dem späten Adenoviruspromotor, dem
Vakziniavirus-7,5-K-Promotor) abstammen, verwendet werden. Promotoren,
die durch DNA-Rekombinations- oder
synthetische Verfahren produziert wurden, können auch zur Bereitstellung
zur Transkription der insertierten RES-I- oder CEL-I-Kodiersequenz
verwendet werden.
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In
Bakteriensystemen kann eine Anzahl von Expressionsvektoren vorteilhaft
abhängig
von der Verwendung ausgewählt
werden, die für
das exprimierte Protein beabsichtigt ist. Zum Beispiel können, wenn
große
Mengen von RES I oder CEL produziert werden sollen, Vektoren, welche
die Expression von hohen Ausmaßen
von Fusionsproteinprodukten steuern, die einfach gereinigt werden,
wünschenswert
sein. Jene, die hergestellt werden, um eine Spaltstelle zu enthalten,
um zur Gewinnung beizutragen, sind bevorzugt. Solche Vektoren umfassen
unter anderem E.-coli-Expressionsvektor
pUR278 (Ruther et al., EMBO J. 2, 1791 (1983)), in welchem eine
für CEL
I oder RES I kodierende Sequenz in den Vektor im Leseraster mit
der für
LacZ kodierenden Region ligiert wird, sodass ein Hybrid-LacZ-Protein
produziert wird, pIN-Vektoren (Inouye & Inouye, Nucleic Acids Res. 13, 3101-3109
(1985); Van Heeke & Schuster,
J. Biol. Chem. 264, 5503-5509 (1989)).
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In
Hefe kann eine Vielzahl von Vektoren verwendet werden, die konstitutive
oder induzierbare Promotoren enthalten. Für einen Bericht siehe Current
Protocols in Molecular Biology, Band 2, Hrsg. Ausubel et al., Green
Publish. Assoc. & Wiley
Interscience, Kapitel 13 (1988); Grant et al., Expression and Secretion
Vectors for Yeast, in: Methods in Enzymology, Hrsg. Wu & Grossman 31987,
Acad. Press, N.Y., Band 153, 516-544 (1987); Glover, DNA Cloning,
Band II, IRL Press, Washington, D.C., Kapitel 3 (1986), und Bitter,
Heterologous Gene Expression in Yeast, Methods in En zymology, Hrsg.
Berger & Kimmel,
Acad. Press, N.Y., Band 152, 673-684 (1987), und The Molecular Biology
of the Yeast Saccharomyces, Hrsg. Strathem et al., Cold Spring Harbor
Press, Band I und 11 (1982). Ein konstitutiver Hefepromotor, wie
z.B. ADH oder LEU2, oder ein induzierbarer Promotor, wie z.B. GAL,
kann verwendet werden (Cloning in Yeast, Kapitel 3, R. Rothstein,
in: DNA Cloning, Band 11, A Practical Approach, Hrsg. D. M. Glover,
IRL Press, Washington, D.C. (1986)). Alternativ dazu können Vektoren
verwendet werden, die Integration von fremden DNA-Sequenzen in das
Hefechromosom fördern.
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Eukaryotische
Systeme und vorzugsweise Säugetierexpressionssysteme
ermöglichen
das Auftreten richtiger Posttranslationsmodifikationen von exprimierten
Säugetierproteinen.
Eukaryotische Zellen, welche die Zellmaschinerie für richtige
Verarbeitung des primären
Transkripts, Glykosylierung, Phosphorylierung und vorteilhafte Sekretion
des Genprodukts besitzen, können
als Wirtszellen für
die Expression von RES I oder CEL I verwendet werden. Säugetierzelllinien
können
bevorzugt sein. Solche Wirtszelllinien können unter anderem CHO, VERO,
BHK, HeLa, COS, MDCK, 293 und WI38 umfassen.
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Säugetierzellsysteme,
die rekombinante Viren oder Viruselemente verwenden, um Expression
zu steuern, können
hergestellt werden. Zum Beispiel kann, wenn Adenovirusexpressionsvektoren
verwendet werden, eine für
CEL I oder RES I kodierende Sequenz an einen Adenovirustranskriptions/translationskontrollkomplex
ligiert werden, z.B. den späten
Promotor und dreiteilige Leadersequenz. Dieses chimäre Gen kann dann
durch In-vitro- oder In-vivo-Rekombination in das Adenovirusgenom
insertiert werden. Insertion in eine nicht-essentielle Region des
Virusgenoms (z.B. Region E1 oder E3) resultiert in einem rekombinanten
Virus, das lebensfähig
und in der Lage ist, das Protein in infizierten Wirten zu exprimieren
[siehe z.B. Logan & Shenk, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 81, 3655-3659 (1984)]. Alternativ dazu kann
der Vaziniavirus-7,5-K-Promotor
verwendet werden [z.B. siehe Mackett et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 79; 7415-7419 (1982); Mackett et al., J. Virol. 49, 857-864
(1984); Panicali et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4927-4931
(1982)]. Vektoren, die auf Rinderpapillomvirus basieren, haben die
Fähigkeit,
sich als extrachromosomales Element zu replizieren (Sarver et al.,
Mol. Cell. Biol. 1, 486 (1981)). Kurz nach Eintreten dieser DNA
in Mauszellen repliziert das Plasmid etwa 100 bis 200 Kopien pro
Zelle. Transkription der insertierten cDNA erfordert keine Integration
des Plasmids in das Wirtschromosom, wodurch ein hohes Ausmaß an Expression
ermöglicht
wird. Diese Vektoren können für stabile
Expression verwendet werden, indem ein selektierbarer Marker in
das Plasmid aufgenommen wird, wie z.B. das Neo-Gen. Alternativ dazu
kann das Retrovirusgenom zur Verwendung als Vektor modifiziert werden,
der in der Lage ist, die Expression eines CEL-I- oder RES-I-Gens
in Wirtszellen einzuführen
und zu steuern (Cone & Mulligan,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6349-6353 (1984)). Hochgradige Expression
kann auch unter Verwendung von induzierbaren Promotoren erreicht
werden, einschließlich
von unter anderem Metallothionein-IIA-Promotor und Hitzeschockpromotoren.
-
Wirtszellen
können
mit einer CEL-I- oder RES-I-cDNA transformiert werden, die durch
geeignete Expressionskontrollelemente (z.B. Promotor, Enhancer,
Sequenzen, Transkriptionsterminatoren, Polyadenylierungsstellen
etc.) und einen selektierbaren Marker kontrolliert werden. Der selektierbare
Marker in dem rekombinanten Plasmid verleiht Widerstand gegen die
Selektion und ermöglicht
Zellen, das Plasmid stabil in deren Chromosome zu integrieren und
zu wachsen, um Foki zu bilden, die wiederum kloniert und in Zelllinien
expandiert werden können.
Zum Beispiel können
nach Einführung
der fremden DNA gentechnisch erzeugte Zellen 1-2 Tage lang in einem
angereicherten Medium wachsen gelassen werden und dann auf ein selektives
Medium gebracht werden. Eine Reihe von Selektionssystemen kann verwendet
werden, einschließlich
unter anderem Herpes-simplex-Virus-Thymidinkinase-[Wigler et al.,
Cell 11, 223 (1977)], Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase-[Szybalska & Szybalski, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 48, 2026 (1962)] und Adeninphosphoribosyltransferase-[Lowy
et al., Cell 22, 817 (1980)] Gene können in tk–,
hgprt–-
bzw. aprt–-Zellen
verwendet werden. Es kann auch die Antimetabolitresistenz als Basis
für die
Selektion von dhfr verwendet werden, das Methotrexatresistenz verleiht
[Wigler et al., Natl. Acad. Sci. USA 77, 3567 (1980); O'Hare et al., Proc.
Natl: Acad. Sci. USA 78, 1527 (1981)]; gtp, das Resistenz gegen
Mycophenolsäure
verleiht [Mulligan & Berg,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78, 2072 (1981)]; neo, das Resistenz
gegen Aminoglycosid G- 418
verleiht (Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150, 1 (1981));
und hygro, das Resistenz gegen Hygromycin-Gene verleiht [Santerre
et al., Gene 30, 147 (1984)]. Kürzlich
sind weitere selektierbare Gene beschrieben worden, nämlich trpB,
das Zellen ermöglicht,
Indol anstelle von Tryptophan zu verwenden; hisD, das Zellen ermöglicht,
Histinol anstelle von Histidin zu verwenden [Hartman & Mulligan, Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 85, 8047 (1988)]; und ODC (Ornithindecarboxylase),
die Resistenz gegen Ornithindecarboxylaseinhibitior, 2-(Difluormethyl)-DL-Ornithin,
DFMO, verleiht [L. McConlogue, in: Current Communications in Molecular
Biology, Cold Spring Harbor Laborstory, Hrsg. (1987)].
-
Transformation
einer Wirtszelle mit rekombinanter DNA kann durch herkömmliche
sowie durch fachbekannte Verfahren durchgeführt werden. Wo der Wirt prokaryotisch
ist, wie z.B. E. coli, können
kompetente Zellen, die zur DNA-Aufnahme in der Lage sind, aus Zellen
hergestellt werden, die nach exponentieller Wachstumsphase geerntet
werden, und in der Folge durch das CaCl2-Verfahren
unter Verwendung von fachbekannten Verfahren behandelt werden. Alternativ
dazu kann MgCl2 oder RbCl verwendet werden.
Transformation kann auch wenn gewünscht nach Bildung eines Protoplasten
der Wirtszelle durchgeführt
werden.
-
Tier-
und niedrige eukaryotische (z.B. Hefe-)Wirtszellen sind kompetent
für Transformation
oder werden dafür
durch verschiedene Mittel kompetent gemacht. Es gibt mehrere bekannte
Verfahren zur Einführung von
DNA in Tierzellen. Diese umfassen Kalziumphosphatcopräzipitate,
herkömmliche
mechanische Verfahren, wie Mikroinjektion, Elektroporation, Gentransfer
mit Hilfe der Partikelkanone, Insertion eines Plasmids, das in Liposomen
eingekapselt ist, oder es können
Virusvektoren verwendet werden. Eukaryotische Zellen können auch
mit DNA-Sequenzen, die für
ein CEL I oder mit einem RES-I der Erfindung kodieren, und einem
zweiten fremden DNA-Molekül, das für einen
selektierbaren Phänotyp
kodiert, wie das Herpes-simplex-Thymidinkinasegen,
co-transformiert werden. Ein anderes Verfahren ist die Verwendung
eines eukaryotischen Virusvektors, wie z.B. Simian-Virus-40 (SV40),
Sindbis-Virus oder
Rinderpapillomvirus, um eukaryotsiche Zellen vorübergehend zu infizieren oder
zu transformieren und das Protein zu exprimieren [siehe zum Beispiel
Eukaryo tic Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laborstory, Gluzmnan,
Hrsg. (1982)]. Die transfizierten Zellen werden durch fachbekannte
Mittel kultiviert. R. J. Kuchler, Biochemical Methods in Cell Culture
and Virology, Dowden, Hutchinson und Ross, Inc. (1977).
-
Die
vorliegende Erfindung stellt ein In-vitro-Verfahren zur Herstellung
von Sequenzvarianten von zumindest einem Heteroduplexpolynucleotid
bereit, worin der Heteroduplex zumindest zwei nicht-komplementäre Nucleotidbasenpaare
aufweist, wobei das Verfahren Folgendes umfasst: Herstellung von
zumindest einem Heteroduplexpolynucleotid, Kombination des Heteroduplexpolynucleotids
mit einer wirksamen Menge eines Mittels oder Mittel mit Strangspaltungsaktivität, bereitgestellt
von CEL-I- oder
RES-I-Enzym, Proof-Reading-Aktivität und Ligase-Aktivität und Bereitstellung
von ausreichend Zeit, sodass der Prozentsatz der Komplementarität steigt,
worin zumindest eine oder mehrere Varianten hergestellt werden.
-
Ein
anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist jener, wo die Heteroduplexpolynucleotide
zurkulär, linear
oder ein Replikon sind.
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Ein
anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist jener, wo die gewünschten
Varianten verschiedene Komplementaritätsausmaße aufweisen.
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Ein
anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist jener, wo die Strangspaltungsaktivität, Proof-Reading-Aktivität und Ligase-Aktivität nacheinander
oder gleichzeitig hinzugefügt
werden.
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Ein
anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt die Hinzufügung von
Ligaseaktivität
bereit, bereitgestellt durch Mittel, wie z.B. T4-DNA-Ligase, E.-coli-DNA-Ligase,
oder Taq-DNA-Ligase.
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In
einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Strangspaltungsaktivität durch
ein Enzym bereitgestellt, wie z.B. RES I, T4-Endonuclease-VII oder
T7-Endonuclease-I.
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In
einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist Polymeraseaktivität durch
Pol-beta bereitgestellt.
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In
einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung ist Proof-Reading-Aktivität durch
T4-DNA-Polymerase oder T7-DNA-Polymerase bereitgestellt.
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In
einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die wirksame
Menge an Strangspaltungsaktivität
und Proof-Reading-Aktivität
und Ligaseaktivität
durch RES-I-Enzym,
T4-DNA-Polymerase und E.-coli-DNA-Ligase bereitgestellt.
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In
einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung sind die wirksame
Menge der Strangspaltungsaktivität
und Proof-Reading-Aktivität
und Ligase-Aktivität
durch RES-I-Enzym,
T7-DNA-Polymerase und T4-DNA-Ligase bereitgestellt.
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Eine
andere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung stellt ein In-vitro-Verfahren zur Erhöhung der
Diversität
in einer Population von Sequenzen bereit, welche die Herstellung
von zumindest einem Heteroduplexpolynucleotid, Kombination des Heteroduplexpolynucleotids
mit einer wirksamen Menge eines Mittels oder Mittel mit Proof-Reading-Aktivität, Ligaseaktivität und Strangspaltungsaktivität, die durch
Res-I-Enzym bereitgestellt
werden, und Bereitstellung von ausreichend Zeit, sodass der Prozentsatz
der Komplementarität ansteigt,
umfasst, worin die Diversität
in der Population erhöht
wird.
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Eine
andere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Gewinnung eines Polynucleotids
bereit, das für
eine gewünschte
funktionelle Eigenschaft kodiert, umfassend: Herstellung von zumindest
einem Heteroduplexpolynucleotid, Kombination des Heteroduplexpolynucleotids
mit einer wirksamen Menge eines Mittels oder Mittel mit Proof-Reading-Aktivität, Ligase-Aktivität und Strangspaltungsaktivität, bereitgestellt
durch RES-I-Enzym, Bereitstellung von ausreichend Zeit, sodass der
Prozentsatz der Komplementarität
zwischen den Strängen
des Heteroduplexpolynucleotids steigt, worin Diversität in der
Population erhöht
wird, und Screening oder Selektion einer Population von Varianten
für die
gewünschte
funktionelle Eigenschaft.
-
Eine
andere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Gewinnung eines Polynucleotids
bereit, das für
eine gewünschte
funktionelle Eigenschaft kodiert, umfassend: Herstellung von zumindest
einem Heteroduplexpolynucleotid, Kombination des Heteroduplexpolynucleotids
mit einer wirksamen Menge eines Mittels oder Mittel mit Proof-Reading-Aktivität, Ligaseaktivität und Strangspaltungsaktivität, bereitgestellt
durch RES-I-Enzym, Bereitstellung von ausreichend Zeit, sodass der
Prozentsatz von Komplementarität
zwischen Strängen
des Heteroduplexpolynucleotids ansteigt, worin die Diversität in der
Population erhöht
wird; Überführung von
DNA in RNA und Screening oder Selektion einer Population von Ribonucleinsäurevarianten
auf die gewünschte
funktionelle Eigenschaft.
-
Wieder
eine andere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Gewinnung eines
Polypeptids bereit, das eine gewünschte
funktionelle Eigenschaft aufweist, umfassend: Herstellung von zumindest
einem Heteroduplexpolynucleotid, Kombination des Heteroduplexpolynucleotids
mit einer wirksamen Menge eines Mittels oder von Mitteln mit Proof-Reading-Aktivität, Ligase-Aktivität, bereitgestellt
durch RES-I-Enzym, Bereitstellung von ausreichend Zeit, sodass der
Prozentsatz von Komplementarität
zwischen Strängen
des Heteroduplexpolynucleotids steigt, Überführung des Heteroduplexpolynucleotids
in RNA und der RNA in ein Polypeptid und Screening oder Selektion
einer Population von Polypeptidvarianten auf die gewünschte funktionelle
Eigenschaft.
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Wieder
eine andere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Gewinnung eines
Polynucleotids bereit, das für
eine gewünschte
funktionelle Eigenschaft kodiert, umfassend: Herstellung von zumindest
einem Heteroduplexpolynucleotid, wo der Heteroduplex optional etwa
95 %, 90 %, 85 %, 80 %, 75 %, 62 %, 58 %, oder 47 % identisch ist
und etwa 100 Basenpaare, 1.000 Basenpaare, 10.000 Basenpaare oder
100.000 Basenpaare oder größer ist,
Kombination des Heteroduplexpolynucleotids mit einer wirksamen Menge
eines Mittels oder von Mitteln mit Proof-Reading-Aktivität, Ligase-Aktivität und Strangspaltungsaktivität, bereitgestellt
durch RES-I-Enzym, Bereitstellung von ausreichend Zeit, sodass der
Prozentsatz von Komplementarität
zwischen Strängen
des Heteroduplexpolynucleotids steigt, Screening oder Selektion
einer Population von Varianten mit einer gewünschten funktionellen Eigenschaft,
Denaturieren der Population von Varianten, um einzelsträngige Polynucleotide
zu erhalten, Annealing der einzelsträngigen Polynucleotide, um zumindest
ein zweites Heteroduplexpolynucleotid zu bilden, Kombination des
zweiten Heteroduplexpolynucleotids mit einer wirksamen Menge eines
Mittels oder von Mitteln mit Proof-Reading-Aktivität, Ligase-Aktivität und Strangspaltungsaktivität, bereitgestellt
durch RES-I-Enzym, und Bereitstellung von ausreichend Zeit, sodass der
Prozentsatz von Komplementarität
zwischen Strängen
des Heteroduplexpolynucleotids steigt.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer
verbesserten Polynucleotidsequenz oder einer Population von verbesserten
Polynucleotidsequenzen, typischerweise in Form von amplifizierten
und/oder klonierten Polynucleotiden, wodurch die verbesserte(n)
Polynucleotidsequenz(en) zumindest eine gewünschte phänotypische Eigenschaft aufweisen
(z.B. für
ein Polypeptid kodieren, Transkription von verbundenen Polynucleotiden
fördern,
ein Protein binden, die Funktion eines Virusvektors verbessern und
dergleichen), die ausgewählt
werden können
und auf die gescreent werden kann. Solche gewünschten Polynucleotide können auf
eine Reihe von Arten wie z.B. Expression eines geeigneten Pflanzen-,
Tier-, Pilz-, Hefe- oder Bakterienexpressionsvektors, Integration
zur Bildung einer transgenen Pflanze, nicht-menschlichen Tiers oder Mikroorganismus,
Expression eines Ribozyms und dergleichen verwendet werden.
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GRAMMR
stellt Auflösung
von fehlgepaarten Basenpaaren auf Heteroduplex-DNA-Strängen in
einer In-vitro-Reaktion bereit. Diese Reaktion beginnt mit Spaltung
eines Strangs oder des anderen an oder nahe einer Fehlpaarung; gefolgt
vom Herausschneiden von fehlgepaarten Basen aus dem gespaltenen
Strang und Polymerisierung, um die resultierende Lücke mit
Nucleotiden zu füllen,
die als Matrize für
die Sequenz des anderen Strangs dienen. Der resultierende Nick kann
durch Ligation versiegelt werden, um das Gerüst wieder zusammenzufügen. Die
Summe der separaten unabhängigen
Fehlpaarungsauflösungsereignisse,
die im gesamten Heteroduplexmolekül auftreten, resultiert in
der Neuordnung von Sequenzinformation in diesem gesamten Molekül. Die Sequenzinformation
wird sich in einer Vielzahl von Kombinationen neu anordnen, um eine komplexe
Bibliothek von Sequenzvarianten zu erzeugen.
-
In
einer Ausführungsform
von GRAMMR wird eine Bibliothek von Mutanten durch ein beliebiges
fachbekanntes Verfahren, wie z.B. mutagene PCR, chemische Mutagenese
etc., gefolgt von Screening oder Selektion von Mutanten mit einer
gewünschten
Eigenschaft erzeugt. Die mutierten DNAs werden gemischt, auf Einzelstränge denaturiert
und anellieren gelassen. Teilweise komplementäre Stränge, die hybridisieren, weisen
nicht-basengepaarte Nucleotide an den Stellen der Fehlpaarungen
auf. Behandlung mit CEL I [Oleykowski et al., Nuc. Acids Res., Band
26, Nr. 20, 4597-4602 (1998); Yang et al., Biochemistry 39, 3533-3541
(2000)] oder einer ähnlichen
fehlpaarungsgerichteten Aktivität,
wie z.B. RES I, verursacht Nicken eines oder mehrerer Polynucleotidstränge an oder
nahe der Fehlpaarungen. Außerdem
kann CEL I oder RES I an oder nahe einer Insertion/Deletion nicken.
Die Gegenwart einer Polymerase, die eine Proof-Reading-Aktivität enthält (z.B. T4-DNA-Pol),
ermöglicht
Exzision der Fehlpaarung, und nachfolgende Polymeraseaktivität füllt die
Lücke unter Verwendung
eines anderen Strangs als Matrize. Eine Polymerase, der 5'-zu-3'-Exonuclease-Aktivität und Strangersetzungsaktivität fehlt,
füllt die
Lücke und
hört auf
zu polymerisieren, wenn sie das 5'-Ende von DNA erreicht, die an der ursprünglichen
CEL-I-Spaltstelle zu finden ist, wodurch nur kurze Bereiche der
Sequenz resynthetisiert werden. DNA-Ligase (z.B. T4-DNA-Ligase oder
E.-coli-DNA-Ligase) kann dann den Nick durch Wiederherstellung des
Phosphatgerüsts
versiegeln. Dieses Verfahren kann gleichzeitig an mehreren Stellen und
an beiden Strängen
eines bestimmten Heteroduplex-DNA-Moleküls auftreten. Das Ergebnis
ist eine Randomisierung von Sequenzunterschieden unter Inputsträngen, um
eine Population von Sequenzvarianten zu ergeben, die vielfältiger ist
als die Population der Startsequenzen. Diese entstehenden Polynucleotide
können direkt
in einen geeigneten Vektor kloniert werden oder durch PCR vor Klonierung
amplifiziert werden. Alternativ dazu kann die Reakti on auf Heteroduplexregionen
innerhalb des Kontextes eines doppelsträngigen runden Plasmidmoleküls oder
eines anderen geeigneten Replikons durchgeführt werden, das direkt in den
geeigneten Wirt nach der GRAMMR-Reaktion eingeführt werden kann. In einer anderen
Alternative können
die entstehenden Polynucleotide in RNA-Polynucleotide transkribiert
werden und direkt verwendet werden, zum Beispiel durch Inokulation
eines Pflanzenvirusvektors auf eine Pflanze, wie z.B. im Fall eines
Virusvektortranskriptionsplasmids. Die resultierenden Klone werden
einer Selektion oder einem Screen auf Verbesserungen einer gewünschten
Eigenschaft unterworfen. Das gesamte Verfahren kann dann ein oder
mehrere Male mit den ausgewählten
Klonen in einem Versuch wiederholt werden, um zusätzliche
Verbesserungen zu erreichen.
-
Wenn
die entstehenden Polynucleotide direkt kloniert werden, besteht
die Möglichkeit,
dass unvollständig
aufgelöste
Moleküle,
die bestehen bleiben, bei Replikation in dem Klonierungswirt zu
zwei verschiedenen Plasmiden in derselben Zelle führen können. Diese
Plasmide können
möglicherweise
zu gemischten Plasmidkolonien führen.
Wenn es gewünscht
ist, eine solche Möglichkeit
zu vermeiden, können
die entstehenden Polynucleotidmoleküle im Wirt gezüchtet werden,
um Replikation/Auflösung
zu ermöglichen,
die Polynucleotide isoliert werden und in die neuen Wirtszellen
zurücktransformiert
werden.
-
In
einer anderen Ausführungsform
wird, wenn Sequenzinput von mehr als zwei Eltern pro Molekül wünschenswert
ist, das obige Verfahren in einer zyklischen Art durchgeführt, bevor
Klonierung von entstehenden Polynucleotiden durchgeführt wird.
Nach der GRAMMR-Reaktion werden die doppelsträngigen Polynucleotide denaturiert,
anellieren gelassen und das Fehlpaarungsauflösungsverfahren wiederholt.
Nach einer gewünschten
Zahl solcher Zyklen können
entstehende Polynucleotide direkt kloniert werden, in einen geeigneten Vektor
eingeführt
werden, oder sie können
durch PCR vor Klonierung amplifiziert werden. Die resultierenden Klone
werden Selektion oder einem Screen auf die Verbesserungen einer
gewünschten
Eigenschaft unterworfen.
-
In
einer anderen Ausführungsform
wird eine „molekulare
Rückkreuzung" durchgeführt, um
den Hintergrund schädlicher
Mutationen aus den gewünschten
Mutationen zu entfernen. Ein Pool gewünschter mutierter DNAs kann
an Wildtyp-DNA hybdridisiert werden, um dieses Verfahren durchzuführen. Klone
können
für Verbesserung
ausgewählt,
gepoolt und zum Wildtyp rückgekreuzt
werden, bis es keine weiteren signifikanten Veränderungen gibt.
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Die
Wirksamkeit des Verfahrens wird durch verschiedene Verfahren zum
Anreichern der Ausgangspopulation um Heteroduplexmoleküle verbessert,
wodurch die Anzahl von ungeänderten
entstehenden Elternmolekülen
reduziert wird. Die fehlgepaarten Hybride können unter Verwendung von Aptameren,
Farbstoffen oder anderen Mitteln, die sich an fehlgepaarte DNA binden,
affinitätsgereinigt
werden. Eine bevorzugte Ausführungsform
ist die Verwendung von Mut-S-Proteinaffinitätsmatrix (Wagner et al., Nucleic
Acids Res. 23 (19), 3944-3948 (1995); Su et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 83, 5057-5061 (1986)) oder fehlpaarungsbindenden, aber
nicht-spaltenden Mutanten von Phagen-T4-Endonuclease-VII [Golz und
Kemper, Nucleic Acids Research 27, e7 (1999)].
-
In
einer Ausführungsform
wird das Verfahren modifiziert, sodass die Inputpolynucleotide aus
einem Einzelstrang jeder Sequenzvariante bestehen. Zum Beispiel
werden einzelsträngige
DNAs von entgegengesetzter Strangbeschaffenheit aus verschiedenen
Elternsequenzen durch asymmetrische PCR erzeugt, um teilweise komplementäre einzelsträngige Moleküle zu erzeugen.
Annealing der Stränge
miteinander zur Herstellung von Heteroduplex wird wie in Beispiel
2 beschrieben durchgeführt.
Alternativ dazu können
einzelsträngige DNAs
durch bevorzugten Verdau eines Strangs jeder doppelsträngigen Eltern-DNA
mit Lambda-Exonuclease erzeugt werden, gefolgt von Annealing der übrigen Stränge aneinander.
In dieser Ausführungsform
weisen die Annealing-Stränge
keinen 100 % komplementären
Strang auf, mit dem sie reanellieren können. Daher gibt es einen niedrigeren
Hintergrund von nicht-modifizierten
Polynucleotiden, d.h. „Elternpolynucleotide" unter den entstehenden
Polynucleotiden, die zu einer höheren
Wirksamkeit von neuanordnenden Sequenzvariationen führen. Diese
erhöhte
Wirksamkeit ist besonders in Situationen wertvoll, wo ein Screen
statt einer Selektion verwendet wird, um auf die gewünschten
Polynucleotide zu testen.
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Ein
anderes Verfahren zur Heteroduplexbildung ist es, doppelsträngige Eltern-DNAs
zu mischen, sie zu denaturieren, um die Stränge zu trennen, und einzelsträngige DNAs
aneinander anellieren zu lassen, um eine Population von Heteroduplexen
und Eltern-Homoduplexen zu erzeugen. Die Heteroduplexe können dann selektiv
mit einem Heteroduplex-Fangverfahren, wie z.B. dem oben beschriebenen,
unter Verwendung von MutS oder einer nicht-spaltenden T4-Endonuclease-VII-Mutante
angereichert werden. Alternativ dazu können die Eltern-Homoduplexmoleküle in der
Population durch Restriktionsenzyme gespalten werden, die sich mit Stellen
der Fehlpaarung überlagern,
sodass sie im Heteroduplex nicht gespalten werden, aber in den Eltern-Homoduplexmolekülen gespalten
werden. Ungespaltene Heteroduplex-DNA kann dann durch Größenfraktionierung
in einem Agarose-Gel isoliert werden, wie es durchgeführt wurde,
um Volllängenplasmid
auf Volllängenplasmid-Heteroduplex-DNA-Molekülen wie
in Beispiel 9 beschrieben herzustellen. Nick-Versiegelung in jenen
heteroduplexierten Plasmidmolekülen
voller Länge
wurde dann durch Inkubation mit DNA-Ligase erzeugt.
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In
einer weiteren Ausführungsform
werden die doppelsträngigen
Eltern-, oder Input-, Polynucleotide durch die Hinzufügung von „Klemmen"-Sequenzen modifiziert.
Ein Inputpolynucleotid oder Pool von Polynucleotiden wird durch
PCR mit der Hinzufügung
einer einzigartigen Sequenz im 5'-Primer
amplifiziert. Das andere Inputpolynucleotid oder Pool wird durch
PCR mit der Hinzufügung
einer einzigartigen Sequenz im 3'-Primer amplifiziert.
Klemmensequenzen können
hergestellt werden, um eine einzigartige Restriktionsenzymstelle
für das
5'-Ende des Gens
von Interesse und eine andere für
das 3'-Ende zu enthalten,
sodass beim Schritt der Klonierung der Produkte der GRAMMR-Reaktion
nur Produkte mit der 5'-Klemme
des ersten Polynucleotids (oder Pools) und dem 3'-Ende des zweiten Polynucleotids (oder
Pools) geeignete Enden für
die Klonierung aufweist. Alternativ dazu können die Produkte der GRAMMR-Reaktion
unter Verwendung der einzigartigen Sequenzen der 5'- und 3'-Klemmen amplifiziert werden, um ein ähnliches
Ergebnis zu erhalten. Daher gibt es einen niedrigeren Hintergrund
der nicht-modifizierten Polynucleotide, d.h. „Elternpolynucleotide", unter den entstehenden
Polynucleotidklonen, die zu einer höheren Wirksamkeit der Neuordnung
von Sequenzvariationen führen.
Diese erhöhte
Wirksamkeit ist besonders in Situationen wertvoll, wo ein Screen
eher als Selektion verwendet wird, um auf gewünschte Polynucleotide zu testen.
Gegebenenfalls können
Oligonucleotidprimer zur GRAMMR-Reaktion hinzugefügt werden,
die zu Klemmenprimersequenzen komplementär sind, sodass jeder Elternteil
als oberer Strang dienen kann, wodurch beiden reziproken Heteroduplexen
ermöglicht
wird, an der Fehlpaarungsauflösungsreaktion
teilzunehmen.
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Ein
anderes Verfahren zur Herstellung von zyklischen heteroduplexierten
Polynucleotiden wird durchgeführt,
wo doppelsträngige
Eltern-DNAs terminale Klemmensequenzen wie oben beschrieben aufweisen,
wo die einzelsträngigen
Klemmensequenzen, die sich von einem Ende des Heteroduplexes erstrecken,
komplementär
zu einzelsträngigen
Klemmensequenzen sind, die sich vom anderen Ende des Heteroduplexes
erstrecken. Diese komplementären,
einzelsträngigen
Klemmen werden anellieren gelassen, wodurch das heteroduplexierte
DNA-Molekül
zirkularisiert wird. Elternhomoduplexe, die aus der Reanellierung
identischer Sequenzen resultieren, haben nur eine Klemmensequenz
und daher keine komplementären
einzelsträngigen
Sequenzen an ihren Termini, mit welchen Zirkularisierung auftreten
kann. Zusätzlich
dazu kann eine DNA-Polymerase und eine DNA-Ligase verwendet werden,
um beliebige Lücken
in den zirkulären
Molekülen
zu füllen
bzw. die Nicks im Rückgrat
zu versiegeln, um in der Bildung einer Population von kovalent geschlossenen
zirkulären Heteroduplexmolekülen zu resultieren.
Da die kovalent geschlossenen zirkulären Heteroduplexmoleküle nicht in
deren Komponentenstränge
dissoziieren, wenn sie weiteren Denaturierungsbedingungen unterworfen
werden, kann das Verfahren der Denaturierung, Zirkularisierung und
Ligation wiederholt werden, um mehr der linearen doppelsträngigen Elternduplexe
in geschlossene zirkuläre
Heteroduplexe zu überführen.
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In
einer anderen Ausführungsform
kann eine Region einer einzelsträngigen
zirkulären
Phagemid-DNA an eine verwandte aber nicht-identische lineare DNA
hybridisiert werden, die dann mit einer Polymerase, wie z.B. T7-DNA-Polymerase
oder T4-DNA-Polymerase
plus T4-Gen-32-Protein, verlängert
werden, dann an das resultierende Nick ligiert werden kann, um ein
zirkuläres,
doppelsträngiges
Molekül
mit heteroduplexierten Regionen an den Stellen der Unterschiede
zwischen den DNAs zu gewinnen. GRAMMR kann dann auf diesem Molekül durchgeführt werden,
um eine Bibliothek von sequenz-neuangeordneten Molekülen zu gewinnen.
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Alternativ
dazu werden zwei einzelsträngige
zirkuläre
Phagemid-DNAs von entgegengesetzter Strangpolarität in Bezug
auf das Plasmidrückgrat
und Elterngensequenzen, die das Target der Neuordnung sind, aneinander
anelliert. Eine Region von übermäßiger Fehlpaarung
tritt auf, wo sich die Ursprungssequenzen des Phagen f1 befinden.
Nach GRAMMR-Behandlung kann diese Region der übermäßigen Fehlpaarung wieder zu
einer der Elterntypsequenzen zurückkehren,
wodurch ein funktioneller f1-Ursprung wiederhergestellt wird. Diese
doppelsträngigen
Moleküle
enthalten auch Fehlpaarungsregionen an den Stellen der Unterschiede zwischen
den Strängen,
die für
die Elterngene von Interesse kodieren. GRAMMR kann dann auf diesem
Molekül
durchgeführt
werden, um eine Bibliothek von sequenz-neuangeordnetem Molekül zu erhalten.
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Wie
in den vorangegangenen Absätzen
besprochen kann die Ausgangs-DNA oder Input-DNA aus einer beliebigen
Zahl von Formen bestehen. Zum Beispiel kann Input-DNA voller Länge einzelsträngig und
von entgegengesetztem Sense sein, wie in Beispiel 2 gezeigt wird.
Alternativ dazu kann die Input-DNA auch ein Fragment des Strangs
voller Länge
sein. Die Input-DNAs können
doppelsträngig
sein, entweder einer oder beide, oder modifiziert, wie z.B. durch
Methylierung, Phosphorthiolatbindungen, Peptid-Nucleinsäure, Inkorporation
von Uracil in die DNA, Substution von RNA in einem oder beiden Strängen oder
dergleichen. Einer der Stränge
eines Duplexes kann entlang beider Stränge kontinuierlich, nicht-kontinuierlich
aber zusammenhängend,
nicht-kontinuierlich mit Überlappungen
oder nicht-kontinuierlich mit Lücken
sein.
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GRAMMR
kann auch auf DNA-Fragmentierung und auf Neuordnung basierende DNA-Neukombinationsschemen
angewendet werden. Zum Beispiel in Verfahren, wo Genfragmente durch
Zyklen von Denaturierung, Anellierung und Extension im Verlauf der
Genneuordnung geführt
werden, kann GRAMMR als Zwischenschritt verwendet werden.
-
In
einer solchen Ausführungsform
wird die DNA aus einem Gen oder Pool von mutierten Genen durch enzymatische,
mechanische oder chemische Mittel fragmentiert und gegebenenfalls
ein Größenbereich
dieser Fragmente durch ein Mittel isoliert, wie z.B. Trennung auf
einem Agarose-Gel. Das Ausgangspolynucleotid, wie z.B. Wildtyp oder
eine gewünschte
Variante oder ein Pool davon, wird zu den Fragmenten hinzugegeben und
das Gemisch denaturiert und dann anellieren gelassen. Die anellierten
Polynucleotide werden mit einer Polymerase behandelt, um die einzelsträngigen Lücken unter
Verwendung des intakten Strangs als Matrize zu füllen. Die resultierenden teilweise
komplementären
doppelten Stränge
haben keine nicht-basen-gepaarte Nucleotide an den Stellen der Fehlpaarungen.
Behandlung mit CEL I [Oleykowski et al., Nucl. Acids Res., Band 26
Nr. 20, 4597-4602 (1998), Yang et al., Biochemistry 39, 3533-3541
(2000)] oder einem Mittel mit ähnlicher Aktivität, wie z.B.
RES I, verursacht Nicking eines oder der anderen Polynucleotidstränge an oder
nahe der Fehlpaarungen. Hinzufügung
einer Polymerase, die eine Proof-Reading-Aktivität enthält, wie z.B. T4-DNA-Polynerase,
ermöglicht
Exzision der Fehlpaarung, und nachfolgende Polymeraseaktivität füllt die
Lücke unter Verwendung
des anderen Strangs als Matrize. Eine DNA-Ligase, wie z.B. T4-DNA-Ligase,
kann dann den Nick durch Wiederherstellung des Phosphatrückgrats
versiegeln. Das Ergebnis ist eine Randomisierung von Sequenzvariation
unter Input-Strängen,
um entstehende Stränge
mit potenziell verbesserten Eigenschaften zu ergeben. Diese entstehenden
Polynucleotide können
direkt in einen geeigneten Vektor kloniert werden, oder sie können vor
Klonierung mittels PCR amplifiziert werden. Die resultierenden Klone
werden einer Selektion oder einem Screen auf Verbesserungen einer
gewünschten
Eigenschaft unterworfen.
-
In
einer solchen Ausführungsform
wird die DNA aus einem Pool von mutierten Genen durch enzymatische,
mechanische oder chemische Mittel fragmentiert, oder Fragmente werden
durch eingeschränkte
Verlängerung
von zufälligen
Oligonucleotiden, anelliert an Elternmatrizen, erzeugt (
US Patent Nr. 5.965.408 ),
und gegebenenfalls wird ein Größenbereich
der Fragmente durch ein Mittel, wie z.B. Trennung auf einem Agarose-Gel,
isoliert. Das Gemisch wird denaturiert und dann anellieren gelassen.
Die anellierten Polynucleotide werden gegebenenfalls mit einer Polymerase
behandelt, um die einzelsträngigen
Lücken
zu füllen.
Die resultierenden, teilweise komplementären doppelsträngigen Fragmente
weisen nicht-basengepaarte Nucleotide an den Stellen der Fehlpaarungen
auf. Behandlung mit CEL I [Oleykowski et al. (1998); Yang et al.
(2000)] oder einem Mittel mit ähnlicher
Aktivität,
wie z.B. RES I, verursacht Nicking eines oder mehrerer Polynucleotidstränge 3' zu jeder Fehlpaarung.
Die Aktivität
einer Polymerase, die eine Proof-Reading-Aktivität aufweist, wie z.B. T4-DNA-Polymerase,
ermöglicht
Exzision der Fehlpaarung, und nachfolgende Polymerase-Aktivität füllt die Lücke unter
Verwendung des anderen Strangs als Matrize. Gegebenenfalls kann
dann eine DNA-Ligase, wie z.B. T4-DNA-Ligase, den Nick durch Wiederherstellung
des Phosphatrückgrats
versiegeln. Das Ergebnis ist eine Randomisierung der Sequenzvariation
unter Input-Strängen,
um entstehende Stränge
mit potenziell verbesserten Eigenschaften zu ergeben. Nachfolgende
Runden von Denaturierung, Annealing und GRAMMR ermöglichen
Genneuordnungen. PCR kann zur Amplifikation des gewünschten
Abschnitts des neuangeordneten Gens verwendet werden. Diese entstehenden
PCR-Polynucleotide können
in einen geeigneten Vektor kloniert werden. Die resultierenden Klone
werden einer Selektion oder einem Screen auf die gewünschte funktionelle Eigenschaft
unterworfen.
-
Eine
andere Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung stellt das Starten mit einem kontinuierlichen Gerüststrang
bereit, an welchen Fragmente eines anderen Gens oder Gene anellieren.
Die Klappen und Lücken
werden getrimmt und wie in Coco et al., Nature Biotech. 19 (01)
354,
US-Patent Nr. 6.319.713 beschrieben
aufgefüllt,
und GRAMMR wird durchgeführt.
In diesem Verfahren lässt
GRAMMR weitere Sequenzanordnung entstehen, indem Transfer von Sequenzinformation
zwischen dem Matrizenstrang und dem Strang entstehen, der aus Lappen-
und Lückentrim mung
und Ligation resultiert. Dieses Verfahren stellt die Vorteile der Einführung von
spezifischen Sequenzbereichen in einen kontinuierlichen Strang bereit,
gefolgt von GRAMMR von Resten, die sich mit dem Gerüst fehlpaaren.
Durch gleichzeitiges Annealing vieler Fragmente mit derselben Sequenz
oder Gen können
viele einzelne Stellen gleichzeitig angesteuert werden, wodurch
eine Neuordnung mehrerer Sequenzen oder Gene auf einmal ermöglicht wird.
In der vorliegenden Ausführungsform
wird das Gerüst
nicht notwendigerweise abgebaut, der Duplex kann eher direkt kloniert
werden oder durch PCR vor Klonierung amplifiziert werden. Übermäßige Fehlpaarungsauflösung führt zu einer
perfekt duplexierten DNA. Teilweise Fehlpaarungsauflösung führt im Wesentlichen
zu zwei verschiedenen neuangeordneten Produkten pro Duplex.
-
Wie
aus der vorliegenden Offenbarung ersichtlich, kann GRAMMR auch auf
eine Vielzahl von Verfahren angewendet werden, welche das Annealing
von verwandten DNAs als Schritt in deren Verfahren umfassen. Zum
Beispiel erfordern viele ortsgerichtete Mutageneseprotokolle das
Annealing von für
Mutanten kodierenden DNA-Molekülen an eine
zirkuläre
DNA in einer einzelsträngigen
Form, entweder Phagemid oder denaturiertes Plasmid. Diese DNAs werden
mit einer Polymerase verlängert,
gefolgt von Behandlung mit Ligase, um den Nick zu versiegeln, mit
weiterer Manipulation, um die Elternsequenz zu entfernen, wobei
die gewünschte
Mutation oder Mutationen, die in den genetischen Elternhintergrund
inkorporiert waren, zurückgelassen
werden. Obwohl diese Protokolle im Allgemeinen verwendet werden,
um spezifische Mutationen in eine bestimmte DNA-Sequenz zu inkorporieren,
ist es möglich,
dass eine GRAMMR-Reaktion auf die heteroduplexierten Moleküle angewendet
werden, die in einem solchen Verfahren erzeugt werden, um Sequenzvariationen
zwischen den zwei Strängen
neuanzuordnen, wodurch eine vielfältige Reihe von Nachkommen
mit neuangeordneter genetischer Variation entsteht.
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Eine
andere Ausführungsform
stellt aufeinander folgende Runden von Neuordnung auf nur einer
besonderen Region der DNA von Interesse bereit. Zum Beispiel werden
DNA-Fragmente an eine zirkuläre
einzelsträngige
Phagemid-DNA anelliert, und GRAMMR wird durchgeführt. Die Fragmente können behandelt werden,
um sie da vor zu bewahren, physikalisch in das entstehende Material
inkorporiert zu werden. Zum Beispiel können sie am 3'-Ende mit Di-Desoxy-Resten
terminiert werden, welche diese nicht-verlängerbar machen. Mehrere Runden
von Neuordnung können
durchgeführt
werden, aber es werden nur modifizierte Moleküle aus dem ursprünglichen
einzelsträngigen
DNA-Klon gewonnen. Die Folge wird sein, dass die DNA-Fragmente, die in
dieser Neuordnung verwendet werden, nur Sequenzinformation zum Endprodukt
beitragen und nicht physikalisch in das gewinnbare Endprodukt integriert
werden.
-
GRAMMR
kann für
Protein-, Peptid- oder Aptamer-Veranschaulichungsverfahren verwendet
werden, um eine Rekombination zwischen Bibliothekselementen zu erhalten,
die ausgewählt
worden sind. Da für GRAMMR
keine Fragmentation der Input-DNAs
erforderlich ist, kann es möglich
sein, Sequenzinformation zwischen sehr kleinen Sequenzbereichen
neu anzuordnen. Zum Beispiel können
DNAs, die für
kleine Peptide kodieren, oder RNA-Aptamere, die aufgrund einer besonderen
Eigenschaft ausgewählt
worden sind, wie z.B. Targetbindung, neu angeordnet werden. Damit
Annealing zwischen den ausgewählten
DNA-Molekülen
auftreten kann, sollte ein gewisses Ausmaß an Sequenzhomologie zwischen
den Molekülen
aufweisen, wie z.B. an den 5'-
und 3'-Regionen
der kodierenden Sequenz, in Regionen des randomisierten Sequenzsegments,
die aufgrund von ähnlichen
Bindungsaktivitäten Ähnlichkeit
aufweisen, oder durch das Biasing von Codon-Wobble-Basen-Identität an eine
bestimmte Gruppe von Standards.
-
Manipulation
der Reaktionstemperatur, bei welcher GRAMMR durchgeführt wird,
kann nützlich
sein. Zum Beispiel tragen niedrigere Temperaturen zur Stabilisation
von Heteroduplexen bei, die ermöglichen,
dass GRAMMR auf stärker
fehlgepaarten Substraten durchgeführt wird. Ähnlich können Zusatzstoffe, die Basenpaarung
zwischen Strängen
beeinflussen, wie z.B. Salze, Formamid etc., verwendet werden, um
die Stabilität des
Heteroduplexes in der GRAMMR-Reaktion zu ändern, wodurch das Ergebnis
der Reaktion beeinflusst wird.
-
Eine
andere Ausführungsform
stellt Zonenmutagenese durch GRAMMR bereit, d.h. willkürliche oder halb-willkürliche Mutationen
an und in der unmittelbaren Nachbarschaft von fehlgepaarten Resten
unter Verwendung von Nucleotidanaloga, die multiples Basenpaarungspotenzial
aufweisen. Dies stellt die Konzentration von im Wesentlichen Zufallsmutagenese
an einem bestimmten Punkt von Interesse bereit und fügt einen anderen
Vorteil zur vorliegenden Erfindung hinzu. Gruppen von Genen, die ähnlich sind,
aber voneinander geringfügig
unterschiedliche Funktionen aufweisen, z.B. viele Enzyme, zeigen
moderate Sequenzunterschiede voneinander in Regionen, die für ihre eigenen
besonderen Aktivitäten
operativ sind. Diese Aktivitäten
können Substratpräferenz,
Bindungspartner, regulierende Stellen oder dergleichen umfassen.
Gensequenzen, die diese Funktionen regeln, sollen innerhalb der
Population verwandter Gene heterogen sein. Da es bekannt ist, dass
die Spezifität
einer solchen Funktion mit diesen Aminosäuren und deren Nachbarn assoziiert
ist, kann GRAMMR-Mutagenese zusätzlich
zur Neuordnung von Sequenzinformation zwischen Genen auch zur Steuerung
von Zufallsmutagenese an diese Regionen verwendet werden, um ihre
Funktion entstehen zu lassen, während
andere Sequenzen nicht gestört
werden, wie z.B. strukturelles Gerüst, invariante Reste und andere solche
wichtigen Stellen, die möglicherweise
gegenüber
Randomisierung weniger tolerant sind.
-
Verschiedene
Enzyme mit unterschiedlichen Funktionen unterscheiden sich nicht
nur in den operativen Regionen, wie z.B. aktiven Stellen und regulierenden
Stellen. Es ist wahrscheinlich, dass sie andere Unterschiede voneinander
aufweisen, die durch genetischen Drift entstehen. Weitere Randomisierung
an den Stellen solcher Veränderungen
kann daher für
das Ergebnis eines Mutagenese-Versuches als neutral, minimal wichtig
oder schädlich
eingestuft werden. Um die Zufallsmutagenese weg von den inkonsequenten
Stellen und in die Richtung von Stellen zu lenken, die ein besseres
Ergebnis für
Zufallsmutagenese darstellen, wie z.B. die aktive Stelle eines Enzyms,
können
die Codonverwendungs-Einflüsse
der Gene manipuliert werden, um das Gesamtausmaß von Nucleotidkomplementarität in diesen
Regionen zu verringern oder zu erhöhen. Wenn Regionen größerer Komplementarität weniger
empfindlich auf GRAMMR sind als Regionen geringerer Komplementarität, wird
der Grad von GRAMMR-gerichteter willkürlicher Zonenmutagenese an
einer bestimmten Stelle moduliert.
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In
einem beliebigen DNA-Neukombinationsversuch ist es wünschenswert,
den Anteil von nicht-neukombinierten oder Eltern-DNAs, die innerhalb
der Population von neukombinierten Nachkommen erhalten werden, zu
minimieren. Mehrere Ansätze
können
verwendet werden, um dies zu erreichen. In einem Plasmid-auf-Plasmid-DNA-Neukombinationsformat,
wo die Gene, die neu kombiniert werden sollen, auf separaten, aber
sonst identischen Plasmiden gegenwärtig sind, wird jedes Plasmid
an einer oder einer anderen unterschiedlichen einzigartigen gegenwärtigen Restriktionsstelle
linearisiert. Nach Entfernung der Restriktionsendonucleasen werden
die linearisierten DNAs gemischt, voneinander geschmolzen und anellieren
gelassen, sodass sich Populationen von Heteroduplex-DNA bilden,
die entweder genickte, geschlossen zirkuläre Heteroduplex-Moleküle oder
doppelsträngige
und lineare Homoduplexe sind. Es ist die Population von zirkulären doppelsträngigen Heteroduplex-DNA-Molekülen, die
das gewünschte
Substrat für
die GRAMMR-Reaktion darstellen. Man kann entweder diese gewünschte Population
durch Gelfraktionierung anreichern oder eines oder eine Vielzahl
von Verfahren verwenden, die keine physikalische Trennung dieser
Population erfordern, aber stattdessen die Gewinnung von nicht-neukombinierten
Elternmolekülen
beeinträchtigen.
Mehrere dieser Verfahren sind nachstehend aufgelistet.
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Zuerst
wird nach der GRAMMR-Reaktion der gemischten Population von linearem
Eltern-Homoduplex und zellulärem
doppelsträngigem
Heteroduplex im Allgemeinen Transformation von E. coli durchgeführt. Da zirkuläre DNA in
der Transformation von E. coli weit wirksamer als ihr linearisiertes
Gegenstück
ist, können
die Elternhomoduplexe in diesem Schritt gut unterschieden werden,
indem ihre Zirkularisierung in transformationskompetente Moleküle vermieden
wird. Die Verwendung von E.-coli-DNA-Ligase
als Ligase-Komponente der GRAMMR-Reaktion dient der Vermeidung von
Rezirkularisierung von Eltern-Homoduplex, da sie wirksamer Nicks
versiegelt als kurze kohäsive
Termini bindet, die aus Restriktionsendonucleasespaltung resultieren.
Weiters ligiert dieses Enzym Blunt-Enden sehr ineffizient. Als Folge
der Verwen dung dieser Strategie werden die Nachkommen, die aus der
Transformation von E. coli mit der GRAMMR-Reaktion resultieren,
aus nicht-neukombinierten Elterngenen abgereichert und mit Molekülen angereichert,
welche in die GRAMMR-Reaktion als Heteroduplex-Substrate eintraten.
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Ein
anderes Verfahren, um Elterngenkontamination aus der Population
von entstehenden GRAMMR-Molekülen
auszuschließen,
ist es, die Plasmidlinearisierungsstellen innerhalb eines selektierbaren Markers
zu positionieren. Die Stellen sollen sich in ausreichender Distanz
voneinander befinden, um zu ermöglichen,
dass Annealing zwischen versetzten Enden eines Heteroduplexes stattfindet,
und sollen entweder Überhänge aufweisen,
die eingefügt
oder abgetrimmt werden können,
oder eine Deletion von Sequenz bei Spaltung verursachen. Wie oben
werden die Plasmide, welche die Gene enthalten, die neu kombiniert
werden sollen, an einer oder anderen Stellen linearisiert. Nach
Entfernung der Restriktionsendonucleasen werden die linearisierten
DNAs gemischt, geschmolzen und anellieren gelassen. Die resultierende
Probe entsteht aus einem Gemisch von zirkulären Heteroduplexen und linearen
Homoduplexen. Diese Probe kann dann mit einer Proof-Reading-Polymerase,
wie z.B. T4-DNA-Polymerase, in der Gegenwart von dNTPs behandelt
werden. Die zirkulären
Homoduplexe sollten nicht betroffen sein, während die linearen Eltern-Homoduplexe
an deren Termini abgestumpft sind, wobei Basen zur Sequenz des selektierbaren
Markers wirksam hinzugegeben oder deletiert werden, wenn das Molekül an einem
beliebigen Punkt in der GRAMMR-Reaktion oder nach Transformation
in E. coli rezirkularisiert wird. Wenn die Hinzufügung oder
Deletion dieser Sequenzen zu einer Unterbrechung der Funktion des
selektierbaren Markers führt,
dann werden die resultierenden Moleküle unter geeigneter Selektion
nicht gewonnen.
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Ein
anderes Verfahren, das zur Prävention
von nicht neu kombinierter Elternkontamination der neu kombinierten
Bibliothek verwendet werden kann, ist, die linearisierten DNAs vor
Schmelzen und Annealing zu dephosphorylieren. Lineare Homoduplex-Moleküle werden
dazu gebracht, unfähig
zu sein, sich in zirkuläre Moleküle zu ligieren,
während
zirkuläre
Heteroduplexe einfach einen einzigen Nick in jedem Strang enthalten, aber
weiter zirkulär
bleiben und daher für
wirksame Transformation in E. coli kompetent sind.
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Ein
anderes Verfahren, das zur Vermeidung von nicht neu kombinierter
Elternkontamination der neu kombinierten Bibliothek verwendet werden
kann, ist, mit Enzymen zu verdauen, deren Erkennungsstellen mit Fehlpaarungen
in heteroduplexierten Molekülen überlappt
werden. Verdau der Elternhomoduplexe an diesen Stellen machen die
resultierenden Moleküle
linear, sodass sie beliebigen oben beschriebenen Behandlungen unterworfen
werden, um Elternkontamination zu vermeiden. Die resultierenden
Moleküle
können
auch kleiner gemacht werden, was eine Trennung der intakten zirkulären Heteroduplexmoleküle ermöglicht.
-
Wenn
zusätzlich
zum Ausschließen
von nicht neu kombinierten Elternmolekülen aus einem Neukombinationsversuch
die Vermeidung von Neukombination zwischen beliebigen zwei oder
mehreren Enden einer Population von zwei oder mehreren Elterngenen
gewünscht
ist, können
dieselben Prinzipien wie beschrieben angewendet werden.
-
In
der vorliegenden Erfindung tritt die willkürliche Neuordnung in einer
In-vitro-DNA-Fehlpaarungsauflösungsreaktion
auf. Dieses Verfahren erfordert keine Schritte von „Genneuordnung", die als Grundlage
für die frühere Mutationsneuordnung
(„Neukombinations-") Verfahren dienen.
Stattdessen basiert es auf der Fähigkeit eines
rekonstituierten oder künstlichen
DNA-Fehlpaarungsauflösungssystems,
um Sequenzvariationen aus einem oder mehreren Strängen von
DNA in einen anderen Strang durch Hybridisierung und Fehlpaarungsauflösung in
vitro zu übertragen.
-
Im
Allgemeinen sind Standardverfahren von DNA-Rekombinationstechnologie
in verschiedenen Publikationen beschrieben, z.B. [Ausubel (1987),
Ausubel (1999), Sambrook et al. (1989)], wovon jedes hierin in seiner
Gesamtheit durch Verweis aufgenommen ist. Polynucleotid-modifizierende
Enzyme wurden gemäß den Empfehlungen
des Herstellers verwendet. Wenn gewünscht können PCR-Amplimere zur Amplifikation
einer vorgegebenen DNA-Sequenz nach Ermessen des Fachmanns ausgewählt werden.
-
Es
versteht sich, dass jede der in der vorliegenden Erfindung gelehrten
Aktivitäten,
die in die GRAMMR-Reaktion involviert sind, mit einem funktionell äquivalenten
Mittel mit ähnlicher
Aktivität
ausgetauscht werden kann und dass solche Veränderungen innerhalb des Schutzumfangs
der vorliegenden Erfindung liegen. Zum Beispiel konnte Taq-DNA-Ligase
wie in Beispiel 6 angegeben T4-DNA-Ligase ersetzen. Andere Ligasen
können
ebenfalls ersetzt werden, wie z.B. E.-coli-DNA-Ligase. Ähnlich wie
in Beispiel 12 dargestellt kann T7-DNA-Polymerase für T4-DNA-Polymerase
substituiert werden. Andere Enzyme mit geeigneter Proof-Reading-Aktivität können anstelle
beliebiger dieser Enzyme für
die Proof-Reading-Aktivität
wirken, die für
die GRAMMR-Reaktion
erforderlich ist. Auf ähnliche
Weise kann eine beliebige Polymerase mit funktionell äquivalenter
Aktivität
zu jenen, von denen gezeigt wurde, dass sie für GRAMMR funktionieren, für Substitution verwendet
werden.
-
Strangspaltung
kann auf eine Vielzahl von Arten erreicht werden. Zusätzlich zu
CEL I kann eine Reihe von funktionell äquivalenten und potenziell ähnlichen
Aktivitäten,
die in Extrakten aus einer Vielzahl von Pflanzenspezies zu finden
sind [Oleykowski, Nucleic Acids Res. 26, 4597-602 (1998)], verwendet
werden. Andere fehlpaarungsgerichtete Endonucleasen, wie z.B. T4-Endonuclease-VII,
T7-Endonuclease-I und SP-Nuclease [Oleykowski,
Biochemistry 38, 2200-5 (1999)], können verwendet werden. Eine
andere besonders nützliche fehlpaarungsgerichtete
Endonuclease ist RES I.
-
CEL
I und RES I können
modifiziert werden, um Enzymvarianten mit gewünschten Eigenschaften zu erhalten.
Homologe Nucleinsäuresequenzen
aus anderen Quellen können
durch Beobachtung von Pflanzen festgestellt werden. Alternativ dazu
können
CEL I oder RES I mutiert werden, und entgegengesetzte Stränge mit
weniger als 100 % Identität
können
zusammengebracht werden, um ein Heteroduplex-Molekül zu bilden. Das
hierin offenbarte vorliegende Verfahren oder ein anderes Verfahren
können
verwendet werden, um neue CEL-I- und RES-I-Enzymvarianten herzustellen.
-
CEL I IST EINE FEHLPAARUNGSENDONUCLEASE
-
CEL
I ist eine Fehlpaarungsendonuclease, die aus Sellerie isoliert wird.
Die Verwendung von CEL I in einem diagnostischen Verfahren zur Detektion
von Mutationen in Polynucleotidsequenzen, auf die gezielt wird, insbesondere
jenen, die mit Krebs assoziiert sind, ist in
US-Patent Nr. 5.869.245 offenbart.
Verfahren zur Isolation und Herstellung von CEL I sind ebenfalls
in diesem Patent offenbart. Jedoch gibt es keine Offenbarung in
diesem Patent, die eine Verbindung mit der Verwendung von CEL I
in DNA-Sequenzneuordnung herstellt.
-
Nucleinsäuremoleküle, die
für CEL
I kodieren, sind in PCT-Anmeldung mit der Veröffentlichungs-Nr.
WO 01/62974 A1 offenbart.
Wie in
US-Patent Nr. 5.869.245 ist
die Verwendung von CEL I in einem diagnostischen Verfahren zur Detektion
von Mutationen in Polynucleotidsequenzen offenbart, auf die gezielt
wird und die mit Krebs assoziiert sind. Ähnlich gibt es keine Offenbarung,
die eine Verbindung zur Verwendung von CEL I in DNA-Sequenzneuordnung
herstellt.
-
RES I IST EINE FEHLPAARUNGSENDONUCLEASE
-
Die
Verwendung von RES-I-Endonuclaease wird in diagnostischen Verfahren
zur Detektion von Mutationen in Polynucleotidsequenzen, auf die
gezielt wird, in Erwägung
gezogen, insbesondere jenen, die mit Krebs assoziiert sind. Beispiele
für manche
dieser Arten von diagnostischen Verfahren sind in
US-Patent Nr. 5.869.245 und Del Tito
et al. offenbart. Die Verwendung von RES I wird auch in Verfahren
zur Detektion von Mutationen in großen genomischen Regionen, Surenko
et al., und für
Mutationsscreeningverfahren, wie z.B. TILLING, wie in McCallum et
al. offenbart, in Erwägung
gezogen.
-
Die
Reaktivität
von Endonuclease-VII von Phage T4 mit DNA-Schleifen von acht, vier
oder einem Nucleotid oder beliebigen von 8 möglichen Basenfehlpaarungen
in vitro ist in „Endonuclease
VII of Phage T4 Triggers Mismatch Correction in Vitro", Solaro et al.,
J. Mol Biol 230 (93) 868, offenbart. Die Veröffentlichung berichtet von
einem Mechanismus, wo Endonuclease VIII doppelsträngige Unterbrechungen
durch die Herstellung von Nicks und Gegennicks innerhalb von sechs
Nucleotiden 3' zur
Fehlpaarung einführt.
Die Veröffentlichung
offenbart, dass eine Zeitverzögerung
zwischen dem Auftreten des ersten Nicks und des Gegennicks ausreichend
war, um die 3'-5'-Exonucleaseaktivität von gp43
zu ermöglichen,
um die Fehlpaarung und ihre Polymerase-Aktivität zu entfernern, um die Lücke vor
dem Auftreten des Gegennicks zu füllen. Nucleotide werden aus
dem ersten Nick gelöscht,
der sich 3' zur
Fehlpaarung an einem Strang befindet und 5' von der Fehlpaarung am ersten stabilen
Basenpaar stoppt. Die Polymeraseaktivität schreitet in 5'-zu-3'-Richtung in Richtung des
anfänglichen
Nicks voran, der durch DNA-Ligase versiegelt wird. Als Ergebnis
erstrecken sich sehr kurze Reparaturspuren von 3 bis 4 Nucleotiden über die
Stelle der früheren
Fehlpaarung. Die Veröffentlichung
endet mit einer Diskussion über
die verschiedenen Aktivitäten,
die Endonuclease VII innerhalb von Phage T4 aufweisen kann. Jedoch
offenbart die Veröffentlichung
keinen praktischen Nutzen von Endonuclease VII außerhalb von
Phage T4, und es gibt keine Offenbarung hinsichtlich der Anwendbarkeit
in DNA-Neuordnung.
-
Verfahren
zur Schaffung von Bibliotheken von chimären DNA-Sequenzen in vivo in
Escherichia coli sind in Nucleic Acids Research, Band 27, Nr. 18,
e18 (1999), A. A. Volkov, Z. Shao und F. H. Arnold, J. P. Abostado
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(18), 5792-5796 (1984); B.
P. Cami et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81(2), 503-507 (1984), S. D.
Chang et al., Gene 29(3), 255-261 (1984), offenbart. Die Verfahren
verwenden Heteroduplexe, die in vitro gebildet werden, um E. coli
zu transformieren, wo die Reparatur von Regionen von Nicht-Identität in Heteroduplex
eine Bibliotek von neuen, rekombinierten Sequenzen schafft, die
aus Elementen aus jedem Elternteil bestehen. Obwohl die Publikationen
die Verwendung dieses Verfahrens als geeignete Hinzufügung zu
bestehenden DNA-Rekombinationsverfahren offenbaren, sind die offenbarten
Verfahren auf die In-vivo-Umgebung von E. coli beschränkt. A.
A. Volkov et al., Methods in Enzymology 328, 456-463, Academic Press,
Inc. San Diego (2000), behaupten, dass es mehr als einen Mechanismus
gibt, der für
Fehlpaarungsreparatur in E. coli verantwortlich ist, und spekulieren,
dass der Reparatur mechanismus des ,langen Bereichs', der das MutS/L/H-Enzymsystem
verwendet, vermutlich für
die Heteroduplexreparatur verantwortlich war.
-
Die
folgenden nicht-einschränkenden
Beispiele sind bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen.
-
BEISPIEL 1
-
Klonierung, Expression und Reinigung von
CEL-I-Endonuclease
-
Dieses
Beispiel lehrt die Herstellung von Nucleinsäuremolekülen, die zur Expression von
CEL-I-Endonuclease aus Pflanzen verwendet wurden, hierin identifiziert
als p1177MP4-CEL-I-Avr (Seq.-ID Nr. 1) und p1177MP4-CEL-I-6HIS (Seq.-ID
Nr. 2). Insbesondere bezieht sich dieses Beispiel auf Offenbarungen,
die in
US-Patent Nr. 5.316.931 ,
5.589.367 ,
5.866.785 und
5.889.190 , hierin durch Verweis aufgenommen,
gelehrt wurden.
-
Sellerie-RNA-Extraktion:
-
Sellerie
wurde auf einem lokalen Markt gekauft. Kleine Mengen von Selleriegewebe
(0.5 bis 0,75 Gramm) wurden geschnitten, in flüssigem Stickstoff gefroren
und mit Mörser
und Stößel in Gegenwart
von zerkleinertem Glas gemahlen. Nach Hinzufügung von 400 Mikroliter Trizol
und weiterem Mahlen wurden 700 Mikroliter des Extrakts entfernt
und 5 Minuten lang auf Eis belassen. Zweihundert Mikroliter Chloroform
wurden dann hinzugefügt
und die Proben zentrifugiert, bei Raumtemperatur drei Minuten lang
stehen gelassen und bei 15.000 g 10 Minuten lang erneut zentrifugiert.
Die wässrige
Schicht wurde in ein neues Röhrchen
entfernt und ein gleiches Volumen von Isopropanol hinzugefügt. Die
Röhrchen
wurden umgedreht, um sich zu mischen, und bei Raumtemperatur 10
Minuten lang stehen gelassen, gefolgt von 10-minütiger
Zentrifugation bei 15.000 g bei 4 °C. Das Pellet wurde zweimal
in 400 Mikroliter 70 % Ethanol, einmal in 100 % Ethanol gewaschen,
luftgetrocknet und in 40 Mikroliter destilliertem Wasser resuspendiert.
Ein Mikroliter von RNasin wurde hinzugefügt, und 3,5 Mikroliter wurden
auf einem 1 % Agarose-Gel laufen gelassen, um die Qualität von RNA-prep
zu überprüfen (Gel-Bild).
Der Rest wurde bis zur weiteren Verwendung bei -70 °C aufbewahrt.
-
Cel-I-Genklonierung und Expression durch
einen Virusvektor:
-
Die
gesamte RNA von Sellerie wurde einer Umkehrtranskription unterworfen,
gefolgt von PCR, um die cDNA, die für die Cel-I-Gensequenz kodiert,
zu amplifizieren. In separaten Reaktionen wurden elf Mikroliter des
gesamten Sellerie-RNA-prep mit einem Mikroliter (50 Picomol) von
entweder Cel-I-Avr-R, Cel-I-6H-R oder mit zwei Mikroliter von Oligo-dT-Primer
gemischt. CeI-I-Avr-R wurde verwendet, um cDNA zu primen und die native
Cel-I-Sequenz am 3'-Ende
des Gens zu amplifizieren, während
Cel-I-6H-R verwendet wurde, um eine Sequenz hinzuzufügen, die
für ein
Linkerpeptid und eine 6-His-Markierung am 3'-Terminus des Cel-I-Gens kodiert. Die
Proben wurden eine Minute lang auf 70 °C aufgeheizt und vor der Hinzufügung von
4 Mikroliter 5 X Superscript II Puffer, zwei Mikroliter 0,1 M DTT,
1 Mikroliter 10 mM jedes dNTPs und 1 Mikroliter Superscript II (Gibco/BRL)
zu jeder Reaktion auf Eis rasch abgekühlt. Die Reaktionen wurden
bei 42 °C
eine Stunde lang inkubiert.
-
PCR-Amplifikation
der Cel-I-cDNA-Sequenz wurde unter Verwendung des Verfahrens von
W. M. Barnes (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(6), 2216-20 (15. März 1994))
mit einem Taq-Pfu-Gemisch oder mit Pfu alleine durchgeführt. Die
RT-Reaktion, die mit Cel-I-Avr-R geprimt wurde, wurde als Matrize
für eine
PCR unter Verwendung der Primer Cel-I-Pac-F (als Vorwärtsprimer)
gepaart mit Cel-I-Avr-R (als Rückwärtsprimer)
verwendet. In anderen PCRs wurde die RT-Reaktion, die mit Oligo-dT
geprimt wurde, als Matrize für
beide der obigen Primerpaare verwendet. Alle PCR-Reaktionen wurden in 100 Mikroliter
mit 30 Annealing-Zyklen bei 50 °C
und zwei Minuten Extension bei 72 °C durchgeführt. Aliquoten der resultierenden
Reaktionen wurden durch Agarose-Gel-Elektrophorese analysiert. Reaktionen,
in welchen Pfu als einzige Polymerase verwendet wurde, zeigten kein
Produkt. Alle Reaktionen, die mit den Taq/Pfu-Gemischen durchgeführt wurden,
erbrachten ein Produkt der erwarteten Größe. Jedoch ergaben jene, die
von cDNA amplifiziert wurden, die mit Cel-I-spezifischen Primerpaaren geprimt wurden,
mehr Produkt als Reaktionen, die aus cDNA amplifiziert wurden, die
mit Oligo-dT geprimt wurde. DNAs aus den PCR-Reaktionen, welche die meisten Produkte
erhalten, wurden unter Verwendung eines Zymoclean-DNA-Zentrifugationssäulensets
gereinigt und mit Pacl und AvrII verdaut, gel-isoliert und in Pac-I
und Avr-II-verdautes Plasmid pRT130, einen tobamovirusbasierten
GENEWARE
®-Vektor,
ligiert. 2 Mikroliter jeder Ligation wurden in DH5α-kompetentes E. coli
transformiert und über
Nacht auf LB-amp-Agarplatten kultiviert. Kolonien wurden geerntet
und über
Nacht in flüssiger
Kultur gezüchtet,
und Plasmid-DNAs
wurden unter Verwendung eines Qiagen-Plasmid-prep-Sets isoliert.
12 Klone jedes Konstrukts wurden durch Verdau mit Pacl und AvrII
gescreent, und 11 von 12 jedes Sets waren für das Insert der korrekten Größe positiv.
Zehn der Klone für
jedes Konstrukt wurden in vitro transkribiert, und RNA wurde auf
N.-benthamiana-Pflanzen inokuliert. Zusätzlich dazu wurden die CEL-I-Geninserts
in beiden Reihen von zehn Klonen Sequenzanalyse unterworfen. Mehrere
Klone, die Inserts enthielten, die für die native Form von CEL I
kodierten, zeigten Sequenzidentität mit der in
WO 01/62974 A1 veröffentlichten
Cel-I-Sequenz. Ein Klon, der ein Insert enthielt, das für CEL I
kodiert, fusioniert an eine 6-Histidin-Sequenz, war mit der veröffentlichten
Cel-I-Sequenz identisch.
Ein Klon von jedem (pRT130-CEL-I-Avr-B3 bzw. PRT130-CEL-I-6His-A9) wurde
für weitere Arbeit
ausgewählt.
Die für
CEL I kodierenden Sequenzen in diesen Klonen wurden in der Folge
auf einen anderen GENEWARE
®-Vektor transferiert.
Die Sequenzen dieser Klone, p1177MP4-CEL-I-Avr-B3 und p1177MP-4-CEL-I-6His-A9, werden
als Seq-ID Nr. 1 bzw. Seq-ID Nr. 2 bereitgestellt.
-
Test von Aktivitäten von kloniertem CEL I:
-
Zur
Bestimmung, ob die GENEWARE®-Konstrukte, die Cel-I-Sequenzen
enthielten, aktives CEL-I-Enzym produzierten, wurden Proben von
pRT30-CEL-I-Avr und pRT130-CEL-I-6his und mit GFP-GENEWARE-kontrollinfizierte
Plasmide geerntet und in einem kleinen Mörser und Stößel in Tris-HCl bei pH 8,0 homogenisiert.
Extrakte wurden gereinigt und auf Nicking-Aktivität von supergeknäuelter DNA
getestet. Jeder Nicking-Test supergeknäuelter DNA wurde in einer Reaktion
durchgeführt,
die 0,5 Mikrogramm eines supergeknäuelten Plasmid-prep eines pUC19-Derivats
in 1 X NEB-Ligasepuffers in einem Gesamtvolumen von 10 Mikrolitern
durchgeführt.
Die Mengen von Pflanzenextrakt, die zu Reaktionen hinzugegeben wurden,
waren 0,1 Mikroliter, 0,01 Mikroliter oder 0,001 Mikroliter, wurden
30 Minuten lang bei 42 °C
inkubiert und auf einem 1 % TBE-Agarose-Gel in Gegenwart von Ethidiumbromid
laufen gelassen. Wenig oder keine Nicking-Aktivität wurde
in dem GFP-GENEWARE-kontrollinfizierten
Pflanzenextrakt detektiert, während
Extrakte aus Pflanzen, die mit den CEL-I-GENEWARE-Konstrukten infiziert
wurden, wertvolle Ausmaße
an Aktivität
gegen das Plasmid-DNA-Substrat zeigten.
-
Zusätzliche
Aktivitätstests
wurden auf Extrakten von Pflanzen durchgeführt, die mit pRT130-CEL-I-Avr-B3
und pRT130-CEL-I-6His-A9 inokuliert wurden. In diesen Tests wurde
intrazelluläres
Fluid aus infizierten Blättern
gewaschen und separat vom Material, das mit den übrigen gewaschenen Blattgeweben
erhalten wurde, getestet. Tests wurden wie oben beschrieben durchgeführt, mit
der Ausnahme, dass die Inkubation bei 37 °C eine Stunde lang durchgeführt wurde.
Proben wurden auf einem 1 % TBE-Agarose-Gel in
Gegenwart von Ethidiumbromid laufen gelassen und fotografiert.
-
Reinigung von 6-His-markiertem CEL I aus
infizierten N.-benthamiana-Pflanzen:
-
N.-benthamiana-Pflanzen
wurden mit RNA-Transkripten aus pRT130-CEL-I-6His-A9 20-21 Tage
nach Aussaat inokuliert. Gewebe wurden aus 96 infizierten Pflanzen
10 Tage nach Inokulation geerntet und intrazellulären Fluidwaschungen
unterworfen. Kurz gesagt wurde infiziertes Blatt- und Stammmaterial
30 Sekunden lang zweimal mit gekühltem
Infiltrationspuffer vakuuminfiltriert (50 mM Phosphat, pH 4, in
Gegenwart von 7 mM β-ME).
Infiltrierte Gewebe wurden geblottet, um überschüssigen Puffer zu adsorbieren,
und sekretierte Proteine wurden durch Zentrifugation bei 2500 × g 20 min
lang unter Verwendung eines Korbrotors (Beckman) gewonnen. PMSF
wurde zu dem extrahierten intrazellulären Fluid (IF), das rekombinantes
CEL I enthielt, bis zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzugegeben
und bei 25 °C
15 min lang unter Rühren
inkubiert. Nach Hinzufügung
von Imidazol (pH 6,0) und NaCl zum Extrakt auf die Endkonzentration
von 5 mM bzw. 0,5 M wurde IF auf pH 5,2 angepasst und durch 1,2-μ-Sartorius-GF-Membran
(Whatman) filtriert, um das meiste der Rubisco- und grünen Pigmente zu entfernen.
Sofort nach Reinigung wurde der pH unter Verwendung von konzentrierter
NaOH-Lösung
auf 7,0 angepasst und auf Eis 20 min lang inkubiert, um nicht-proteinhältigem Material zu
ermöglichen,
zu präzipitieren.
IF wurde unter Verwendung von 0,8-μ- oder 0,6510,45-μ-Sartorius-GF
(Whatman) weiter gereinigt. Rekombinantes CEL I wurde aus dem gereinigten
IF durch Metallchelatierungs-Affinitätschromatographie unter Verwendung
von Ni2+-Fast-Flow-Sepharose (Amersham Pharmacia
Biotech, New Jersey), das mit Bindungspuffer (50 mM Phosphat, 0,5
M NaCl, pH 7,0), der 5 mM Imidazol enthielt, äquilibiert worden war, mit
einer linearen Geschwindigkeit von 300 cm/h gereinigt. Ungebundenes
Protein wurde mit 20 mM Imidazol/Bindungspuffer gewaschen, und CEL
I wurde aus Ni2+-Sepharose mit einem linearen Gradienten von
20 bis 400 M Imidazol im Bindungspuffer eluiert. Fraktionen, die
immer noch Imidazol enthielten, wurden wie oben beschrieben auf
die Nicking-Aktivität
von supergeknäuelter
DNA getestet, aber es wurde festgestellt, dass diese vernachlässigbare
Aktivität
aufweisen. Dieselben Fraktionen wurden dann gegen 0,1 M Tris-HCl, pH
8,0, in Gegenwart von ZnCl2 unter Verwendung
von 10-kD-Molekulargewicht-Cutoff-Dialyseschlauch (Pierce) dialysiert
und wieder getestet. Die Nicking-Aktivität supergeknäuelter DNA wurde nach dieser
Dialyse wiederhergestellt.
-
IF
und gereinigtes CEL-I-Protein wurden unter Verwendung von vorgegossenem
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese-(SDS-PAGE-)Tris-Glycin-Gels (Invitrogen,
Carlsbad, CA) im Puffersystem von Laemmli mit einem XceII-II-Mini-Cell-Gerät (Invitrogen,
Carlsbad, CA) analysiert. Die Proteinbanden wurden durch Coomassie-Brilliantblau
und durch Silberfärbung
sichtbar gemacht. SDS-PAGE-Gels wurden gescannt und unter Verwendung
von Bio-Rad-Gelbildgeber analysiert.
-
Massenspektrometrie von gereinigtem CEL
I:
-
Die
durchschnittliche Molekularmasse von gereinigtem CEL I wurde durch
matrixbasierte Laser-Desorptions/Ionisations-Flugzeitmassenspektrometrie
(MALDI-TOF) bestimmt. Eine Aliquote von CEL I wurde 1:10 mit 50
% Aetonitril/Wasser verdünnt
und mit Sinapinsäurematrix
(1:1 (Vol./Vol.)) unter Verwendung eines PE-Biosystem-DE- Pro-Massenspektrometers
gemischt. Die Massenspektrometrie wurde unter Verwendung einer Beschleunigungsspannung
von 25 kV und im positiv-linearen Ionenmodus durchgeführt.
-
Massenspektrometrie von Peptiden, die
aus gereinigtem CEL I isoliert werden:
-
CEL
I wurde auf SDS-PAGE auf einem 14 % Gel getrennt und mit Coomassie-Brilliantblau gefärbt. Eine
einzelne homogene Bande war sichtbar. Diese Bande wurde herausgeschnitten
und vollständig
entfärbt. Protein
wurde in Gegenwart von 10 mM DTT in 50 % Acetonitril 30 min lang
bei 37 °C
reduziert, und reduzierte Sulfhydro-Gruppen wurden in Gegenwart
von 28 mM Iodacetamid in 50 % Acetonitril 30 min lang bei 24 °C in Abwesenheit
von Licht blockiert. Gelstücke
wurden mit 50 % Acetonitril gewaschen, und nach Teildehydrierung wurde
die herausgeschnittene CEl-I-Bande in einer Lösung von Trypsin hoher Reinheit
(Promega) aufgeweicht. Der proteolytische Verdau wurde bei 37 °C 16 h lang
fortgesetzt. Die resultierenden Peptide wurden aus Gelstücken mit
einem 50 % Acetonitril und 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) eluiert und in einem
SpeedVac konzentriert. Die Peptide wurden durch MALDI-TOF analysiert. Gemischte
tryptische Verdaue wurden in einer Matrix von α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure kristallisiert und unter
Verwendung eines PerSeptive-Biosystem-DE-STR-MALDI-TOF-Massenspektrometers,
das mit verzögerter
Extraktion ausgerüstet
ist, betrieben in einem reflektorpositiven Ionenmodus und bei Beschleunigungsspannung
von 20 kV, analysiert. Erwartete theoretische Massen wurden durch
MS-Verdau (Protein Prospector) oder GPMAW-Programm (Lighthouse Data, Odense,
Dänemark)
berechnet. Für
Tandem-Massenspektrometrie (Nanoelektrosprayionisierung (ESI)) wurden
Peptidproben mit 5 % Acetonitril/0,1 % Ameisensäure verdünnt und LC-MS/MS unterworfen
und auf einem orthogonalen Quadrupol-Flugzeitmassenspektrometerinstrument
(Micromass, Inc., Manchester, UK) analysiert. Die Daten wurden durch
Mslynx verarbeitet, und die Datenbank wurde durch Sonar durchsucht.
-
Viral
exprimiertes rekombinantes CEL I wurde in das IF sekretiert. Gereinigtes
IF-extrahiertes
Material wurde dazu verwendet, die His-Markierungs-CEL-I-Aktivität zu reinigen.
CEL I wurde unter Verwendung Einschritt-Ni2+-Affinitätschromatographietrennung
gereinigt. Eine höchst
geeignete homogene einzelne Proteinbande wurde, wie durch Coomassie-gefärbte SDS-PAGE
und Massenspektrometrie bestimmt, gereinigt. Die Größe der reifen
Proteine und die prozentuelle Glykosylierung stimmen damit überein,
was für
das CEL-I-Protein berichtet worden ist, das aus Sellerie isoliert
wurde [Yan et al. (2000)]. Das gereinigte CEL I hat eine durchschnittliche
Molekularmasse von 40 kD, wie durch MALDI-TOF-Massenspektrometrie
bestimmt, zeigt 23,5 Masse-% Glykosylierung. CEL I weist vier potenzielle
Glykosylierungsstellen an Aminosäurepositionen
58, 116, 134 und 208 auf. Eine monoisotope Masse von 2152,6086 (2152,0068
theoretisch) Da, die der Masse des Peptids 107-125 (K) DMCVAGAIQNFTSQLGHFR
(H) (Seq.-ID Nr. 35) entspricht, die durch MALDI-TOF gewonnen wurde,
zeigt, dass Asparagin 116 nicht glykosyliert ist. Gemeinsam zeigen
diese Gelanalyse- und Massenspektrometriedaten, dass eine signfikante
Fraktion des CEL-I-Proteins gewinnbar war und dass das Protein in
der N.-benthamiana-Pflanze
korrekt verarbeitet wurde.
-
Für nachfolgende
Versuche wurde das 6-His-markierte CEL-I-Enzym unter Verwendung
von p1177MP4-CEL-I-6His-A9 produziert. Dieser Klon wurde transkribiert
und auf N.-benthamiana-Pflanzen inokuliert, die 8 Tage nach Infektion
geerntet wurden. Das Pflanzenmaterial wurde mit 2 Volumina Extraktionspuffer (500
mM NaCl, 100 mM NaPi, 25 mM Tris, pH 8,0, 7 mM Beta-mercaptoethanol,
2 mM PMSF) kombiniert und vakuuminfiltriert. Nach der Pufferinfiltration
wurde das Gewebe in einem Entsafter aufgeweicht, der resultierende
grüne Saft
auf 4 % (Gew./Vol.) Polyethylenglykol angepasst und bei 4 °C eine Stunde
lang stehen gelassen. Der grüne
Saft wurde entweder durch 20-minütige
Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit (3500 × g) gereinigt
oder mit Perlit (2 % (Gew./Vol.)) kombiniert und durch einen 1,2-μm-Filter
filtriert. Das markierte CEL I kann selektiv aus dem gereinigten
grünen
Saft durch Metallaffinitätschromatographie
gereinigt werden. Der grüne
Saft wurde entweder mit Nickel-NTA-Harz kombiniert, und Chargen-Bindung
von CEL I wurde durchgeführt,
oder Reinigung wurde in Säulenformat
durchgeführt,
wo der grüne
Saft durch ein Bett von Nickel-NTA-Harz fließen konnte. Zur Bindung wurde
der gereinigte grüne
Saft auf 10 % (Gew./Vol.) Glycerin und 10 mM Imidazol angepasst.
Nach der Bin dung wird das Harz umfassend mit Waschpuffer (330 mM
NaCl, 100 mM NaPi, pH 8,0, 10 mM Imidazol) gewaschen und das gebundene
CEL-I-Enzym aus dem Nickel-NTA-Harz in
2 Harzbettvolumina von 1 X phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS)
eluiert, die 400 mM Imidazol enthielt. Die CEL-I-Formulierung wurde
in der Folge gegen 1 X PBS dialysiert, um das Imidazol zu entfernen,
auf Aktivität
getestet und bei 4 °C
oder bei -20 °C
mit oder ohne Glycerin bis zur Verwendung aufbewahrt.
-
BEISPIEL 2
-
Spaltung von fehlgepaartem DNA-Substrat
durch CEL-I
-
Dieses
Beispiel lehrt die Herstellung von CEL-I-Enzym und seine Verwendung
in der Spaltung von fehlgepaartem DNA-Substrat.
-
CEL-I-Enzym
wurde aus Selleriestangen unter Verwendung von Homogenisierung,
Ammoniumsulfat und Concanavalin-A-Sepharose-Protokoll, das von Yang
et al. beschrieben (Biochemistry 39, 3533-3541 (2000)), hierin durch
Verweis aufgenommen, wurde, hergestellt. Eine 1,5-kg-Probe von gekühlten Selleriestangen
wurde mit einem Entsafter homogenisiert. Ein Liter des Safts wurde
gewonnen, auf 100 mM Tris-HCl,
pH 7,7, mit 100 μM
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) angepasst und durch zwei Schichten
Miracloth filtriert. Festes (NH4)2SO4 wurde langsam
bis zu 25 % Sättigung
hinzugegeben, während
auf Eis gerührt
wurde. Nach 30 Minuten wurde die Suspension bei 27.000 g 1,5 Stunden
lang bei 4 °C
zentrifugiert. Die Überstände wurden gewonnen
und mit festem (NH4)2SO4 auf 80 % Sättigung angepasst, während auf
Eis gerührt
wurde, gefolgt durch Zentrifugation bei 27.000 g 2 Stunden lang.
Die Pellets wurden in Puffer B (0,1 M Tris-HCl, pH 7,7, 0,5 M KCl,
100 μM PMSF)
resuspendiert und gegen denselben Puffer dialysiert.
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Conconavalin-A-(ConA-)Sepharoseaffinitätschromatographie
wurde durch ein erstes Inkubieren der dialysierten Probe mit 2 ml
von ConA-Harz über
Nacht unter sanftem Rühren
durchgeführt.
Das ConA-Harz wurde dann in eine Säule mit 0,5 cm Durchmesser
gepackt und mit mehreren Säulenvolumina
von Puffer B gewaschen.
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Elution
wurde unter Verwendung von 0,3 M Alpha-Methylmannosid in Puffer
B durchgeführt.
Fraktionen wurden in 1-ml-Aliquoten gewonnen. Fraktionen wurden
auf Fehlpaarungsspaltungsaktivität
auf einem radiomarkierten Fehlpaarungssubstrat getestet, indem 0,1
Mikroliter jeder Fraktion mit der fehlgepaarten Sonde in Puffer
D (20 mM Tris-HCl, pH 7,4, 25 mM KCl, 10 mM MgCl2)
30 Minuten lang bei 45 °C
wie von Oleykowski et al., Nucleic Acids Research 26, 4597-4602
(1998), beschrieben, hierin durch Verweis aufgenommen, inkubiert
wurden. Reaktionsprodukte wurden durch Trennung auf 10 % TBE-PAGE-Gels,
die 7% Harnstoff enthielten (Invitrogen), sichtbar gemacht, gefolgt
von Autoradiographie. Aliquoten der CEL-I-Fraktionen, die über Fehlpaarungsspaltungsaktivität verfügten, wurden
gefroren bei -20 °C
aufbewahrt. Eine Reihe von Fünffach-Verdünnungen
von CEL-I-Fraktion Nr. 5 wurde dann auf Fehlpaarungsspaltung von
radiomarkiertem Fehlpaarungssubstrat analysiert. Reaktionen wurden
entweder in Puffer D, T4-DNA-Ligasepuffer von New England BioLabs
(NEB) (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2,
10 mM Dithiothreit (DTT), 1 mM ATP, 25 Mikrogramm/ml BSA) oder T4-DNA-Ligasepuffer
von Gibco/BRL (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 10 mM MgCl2,
1 mM DTT, 1 mM ATP, 5 % (Gew./Vol.) Polyethylenglykol-8000) durchgeführt. Reaktionsprodukte
wurden wie oben angegeben sichtbar gemacht. Von Spaltungsaktivität in Puffer
D und in NEB-T4-DNA-Ligasepuffer wurde festgestellt, dass diese
im Wesentlichen äquivalent
sind, während
Spaltung in dem PGE-enthaltendem Gibco/BRL-Ligasepuffer im Vergleich
zu den anderen Puffern um das Fünf-
bis Zehnfache verstärkt
war.
-
Zusätzliche
Analyse von CEL-I-Aktivität
wurde unter Verwendung von definierten Heteroduplex-DNAs aus zwei
verschiedenen Genen von grün
fluoreszierendem Protein (GFP) als Subtrat durchgeführt. Dieses GFP-Heteroduplex-Substrat
wurde durch Annealing einzelsträngiger
DNAs, die dem Zyklus-3-GFP (Seq.-ID Nr. 30) entsprechen, auf dem
Sense-Strang und Wildtyp-GFP (Seq.-ID Nr. 29) auf dem Antisense-Strang
hergestellt. Die einzelsträngigen
DNAs waren durch asymmetrische PCR synthetisiert und durch Agarose-Gel-Elektrophorese
isoliert worden. Nach Annealing durch Erhitzen auf 90 °C und Abkühlen auf
Raumtemperatur in Gegenwart von 1 X NEB-Restriktionsenzympuffer 2 (10 mM Tris-HCl,
pH 7,9, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM Dithiothreit)
wurde die Heteroduplex-DNA durch Agarose-Gelelektrophorese iso liert,
gefolgt vom Herausschneiden der Heteroduplex-Bande und Extraktion
unter Verwendung von Qiaquick-DNA-Zentrifugationssäulen. Eine
Gesamtheit von achtundzwanzig Fehlpaarungen, ein oder zwei Nucleotide
lang, treten auf der gesamten Länge
des Heteroduplex-Moleküls
auf. Die Verteilung der Fehlpaarungen reicht von kleinen Clustern
von mehreren Fehlpaarungen, die durch eine oder zwei Nucleotide
getrennt sind, bis zu Fehlpaarungen, die durch mehr als dreißig Basenpaare
getrennt sind, auf jeder Seite.
-
Eine
Reihe von Dreifach-Verdünnungen
von CEL I in 1 X NEB-T4-DNA-Ligasepuffer wurden hergestellt, und
1-Mikroliter-Aliquoten von jeder wurden in zwei separaten Reihen
von 10-Mikroliter-Reaktionen inkubiert, wobei jede als Substrat
entweder 0,5 Mikrogramm einer supergeknäuelten Plasmidformulierung
oder einhundert Nanogramm des Zyklus-3/Wildtyp-GFP-Heteroduplex
enthielt. Alle Reaktionen fanden in 1 X NEB-T4-DNA-Ligasepuffer
statt. Reaktionen wurden bei 45 °C
30 Minuten lang inkubiert und auf 1,5 % TBE-Agarose-Gel in Gegenwart
von Ethidiumbromid laufen gelassen.
-
Behandlung
von supergeknäuelter
Plasmid-Formulierung mit zunehmenden Mengen von CEL I führte zur
Umkehr von supergeknäuelter
DNA zu genickten, zirkulären,
dann linearen Molekülen
und dann zu kleineren Fragmenten von DNA willkürlicher Größe. Behandlung von fehlgepaartem
GFP-Substrat mit der CEL-I-Formulierung führte zu Verdau von Heteroduplex
voller Länge
in Leiter-DNA-Banden, die wahrscheinlich Spaltung auf entgegengesetzten
DNA-Strängen
in der Nachbarschaft von Clustern von Fehlpaarungen repräsentieren.
Weiterer Verdau führte
zur Umsetzung des fehlgepaarten GFP-Substrats zu kleineren DNAs,
die einen Grenzverdau von Heteroduplex-DNA durch die CEL-I-Formulierung
zeigten.
-
BEISPIEL 3
-
Verwendung von kloniertem CEL I in der
GRAMMR-Reaktion
-
Dieses
Beispiel zeigt, dass CEL I aus einer klonierten Quelle anstelle
von nativem CEL-I-Enzym, das aus Sellerie gereinigt wurde, in genetischer
Neuordnung durch DNA-Fehlpaarungsauflösung ohne jegliche merkliche
Veränderung
in Ergebnissen verwendet werden kann.
-
Die
cDNA von Cel I wurde aus Sellerie-RNA kloniert. Das Gen wurde in
einen TMV-Virusvektor
insertiert und exprimiert. Transkripte des Konstrukts wurden dazu
verwendet, Nicotiana-benthamiana-Pflanzen zu infizieren. Infiziertes
Gewebe wurde geerntet und das CEL-I-Enzym gereinigt. Die Ergebnisse
der GRAMMR-Reaktion, die unter Verwendung des gereinigten Enzyms
erhalten wurden, wurden mit jenen verglichen, die CEL I verwendeten,
das aus Sellerie gereinigt wurde, und es wurde festgestellt, dass
sie ähnlich
sind.
-
Reaktionen
wurden unter Verwendung von einundzwanzig Nanogramm des zirkulären doppelsträngigen heteroduplexierten
GFP-Plasmidsubstrats durchgeführt,
wie in BEISPIEL 3 beschrieben, in zehn Mikroliter, enthaltend 1
X NEB-Ligasepuffer, 0,5 mM pro dNTP, 0,2 Einheiten T4-DNA-Ligase
(Gibco/BRL), 1 Einheit von T4-DNA-Polymerase, und entweder 1,0 Mikroliter
von CEL-I, aus Sellerie gereinigt (Fraktion 5, in Beispiel 2 beschrieben),
oder 0,3 Mikroliter von CEL I, aus einer klonierten Quelle gereinigt.
Nach 30 Minuten wurden 1-Mikroliter-Aliquoten jeder Reaktion in
kompetentes DH5-alpha-E.-coli transformiert, die dann auf LB-amp-Platten
ausplattiert wurden. Kolonien wurden geerntet und kultiviert. Plasmid-DNA
wurde extrahiert und durch RFLP-Analyse, gefolgt von Sequenzanalyse
der GFP-Gensequenzen untersucht. Die RFLP-Ergebnsise zeigten, dass
Neuordnung von Restriktionsstellen, d.h. GRAMMR, sowohl in von Sellerie
abstammendem CEL I als auch in Reaktionen, die kloniertes CEL I
enthielten, aufgetreten war. DNA-Sequenzanalyse bestätigte diese
Ergebnisse. Deshalb zeigten die Daten, dass CEL I aus einer klonierten
Quelle anstelle von CEL I aus Sellerie für GRAMMR verwendet werden kann.
Zusätzlich
dazu zeigten die Daten, dass es die CEL-I-Aktivität ist, die
Teil der GRAMMR-Reaktion ist, anstelle einer zufälligen Wirkung, die aus den
Reinigungsschritten resultiert, die in der Extraktion von CEL I
aus Sellerie verwendet worden sind.
-
BEISPIEL 4
-
Klonierung, Expression und Verwendung
von RES-I-Endonuclease
-
Dieses
Beispiel zeigt die Herstellung einer cDNA-Bibliothek aus Selaginella
lepidophylla, die Identifikation einer Nucleinsäuresequenz aus der Bibliothek,
die für
eine Endonuclease kodiert, und die Expression der neuen Endonuclease,
hierin „RES
1" genannt. RNA
wurde aus Geweben der Auferstehungspflanze, Selaginella lepidophylla,
unter Verwendung des Trizol-Verfahrens extrahiert, und oligo-dT-geprimete
cDNA wurde unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt. Resultierende
cDNAs wurden in einen GENEWARE®-basierten Klonierungsvektor
ligiert, und die Ligationsprodukte wurden in kompetente E.-coli-Zellen transformiert.
Bakterielle Kolonien, die GENEWARE®-cDNA-Klone
enthielten, wurden willkürlich
geerntet und als flüssige
Kulturen vor DNA-Prepping und Bestimmung der klonierten cDNA-Sequenzen
gezüchtet.
Die Sequenzdaten für
die klonierten Selaginella-cDNAs wurden in eine Datenbank geladen,
die dann mittels BLAST-Analyse auf Sequenzen untersucht wurde, die Ähnlichkeit
mit der DNA-Sequenz von Cel-I-Gen aufweisen. BLAST-Analyse wurde auch
auf anderen DNA-Sequenzdatenbanken durchgeführt, die Sequenzen von cDNAS
enthielten, die von einer anderen Spezies erhalten wurden.
-
BLAST-Ergebnisse,
die ein gewisses Ausmaß an
Homologie zur Sellerie-CEL-I-Sequenz
zeigten, wurden in Bibliotheken aus mehreren Spezies identifiziert,
und die entsprechenden GENEWARE®-cDNA-Klone wurden
in eine einzige Reihe von GENEWARE®-cDNA-Klonen
neu angeordnet. Diese Reihe von cDNA-Klonen wurde dann in vitro
transkribiert, um infektiöse
GENEWARE®-Transkripte
zu erreichen, die dann auf Blättern
auf Nicotiana-benthamiana-Pflanzen zur Expressionsanalyse von cDNA-Sequenzen,
für die
innerhalb des GENEWARE®-Virusgenoms kodiert wurde,
inokuliert wurden. Sieben Tage nach Inokulation wurden Blattproben
aus den infizierten Pflanzen entnommen und in zwei Volumina Wasser
homogenisiert. Die Extrakte wurden dann auf Nicking- und Spaltungsaktivität superspiralisierter
DNA getestet.
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Jeder
Nickingtest superspiralisierter DNA wurde in einer Reaktion durchgeführt, die
0,5 Mikrogramm eines superspiralisierten Plasmid-Prep eines pUC19-Derivats
in 1 X NEB-T4-DNA-Ligasepuffers in einem Gesamtvolumen von 10 Mikrolitern
enthielt. Die Mengen des Pflanzenextrakts, das zu den Reaktionen
hinzugegeben wurde, waren 1 Mikroliter, 0,33 Mikroliter oder 0,011
Mikroliter, inkubiert bei 37 °C
30 Minuten lang und auf einem 1 % TAE-Agarose-Gel in Gegenwart von
Gelstar-Fluoreszenz-DNA-Färbungsreagens
laufen gelassen. Wenig oder keine Nicking-Aktivität wurde
in nicht-infizierten
Pflanzenextrakten detektiert, während
nur Extrakte aus Pflanzen, die mit GENEWARE®-Konstrukten
infiziert waren, die cDNAs für
ein einziges Gen aus Selaginella lepidophylla enthielten, wertvolle
Ausmaße
an Aktivität
gegen das Plasmid-DNA-Substrat
zeigten.
-
Die
vollständigen
Gensequenzen dieser Klone wurden bestimmt, und es wurden PCR-Primer
entworfen, um das offene Lesegerüst
minus beliebiger nicht-kodierender 5'- und 3'-Sequenzen zu amplifizieren und um einen
Sechs-Histidin-Schwanz zum C-Terminus
des kodierten Proteins hinzuzufügen.
Die Primer wurden dann zur Amplifikation des ORFs aus einem der
aktiven Selaginella-Klone voller Länge verwendet. Das resultierende
PCR-Produkt wurde dann in den GENEWARE®-Vektor
pDN4 zwischen den Pacl- und AvrII-Stellen zur Expression in planta
kloniert. Der resultierende Klon, pLSB2225, der das ResI-ORF (Seq.-ID
Nr. 16) enthielt und für
das Res-I-Protein
(Seq.-ID Nr. 34) kodierte, wurde sequenziert, um nachzuweisen, dass
das Gen korrekt insertiert worden war, und dann in vitro transkribiert,
gefolgt von Inokulation der infektiösen Transkripte auf N.-benthamiana-Pflanzen.
Sieben Tage nach Inokulation wurden infizierte Pflanzenextrakte
wie oben beschrieben hergestellt und auf Nicking- und Verdauaktivität superspiralisierter
DNA getestet, um die Aktivität des
klonierten Enzyms nachzuweisen.
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Jeder
Nicking-Test superspiralisierter DNA wurde in einer Reaktion durchgeführt, die
0,5 Mikrogramm eines superspiralisierten Plasmid-Preps eines pUC19-Derivats
in 1 X NEB-E.-coli-DNA-Ligasepuffer in Gegenwart von 50 mM KCl in
einem Gesamtvolumen von 10 Mikrolitern enthält. Die Mengen des Pflanzenextrakts, das
zu den Re aktionen hizugegeben wurden, waren 0,2 Mikroliter, 0,04
Mikroliter, 0,008 Mikroliter oder 0,0016 Mikroliter, inkubiert bei
37 °C 30
Minuten lang und auf einem 0,8 % TAE-Agarose-Gel in Gegenwart von
Gelstar-Fluoreszenz-DNA-Färbungsreagens
laufen gelassen. Wenig oder keine Nicking-Aktivität wurde
in nicht-infizierten Pflanzenextrakten detektiert, während Extrakte
aus Pflanzen, die mit GENEWARE®-Selaginella-Konstrukt pLSB2225 infiziert
waren, wertvolle Ausmaße
an Aktivität
gegen das Plasmid-DNA-Substrat zeigten.
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Nachdem
in diesem Test positive Ergebnisse erhalten worden waren, wurden
die Extrakte von pLSB2225-infizierten Pflanzen in einer GRAMMR-Reaktion
verwendet, um die Fähigkeit
dieses Enzyms zu testen, als Komponente der Fehlpaarungsauflösungsreaktion
anstelle des GENEWARE®-produzierten CEL-I-Enzyms
zu wirken.
-
BEISPIEL 5
-
Verwendung von RES I in der GRAMMR-Reaktion
-
Dieses
Beispiel zeigt, dass RES I anstelle eines nativen CEL-I-Enzyms,
das aus Sellerie gereinigt wurde, in genetischer Neuordnung durch
DNA-Fehlpaarungsauflösung
ohne jegliche merkliche Veränderung
der Ergebnisse verwendet werden kann.
-
GRAMMR
wurde zwischen dem Wildtyp-Aequorea-victoria-GFP-Gen (Prasher et
al., Gene 111 (92) 229) in einem pBS-Derivat (Strategene, La Jolla,
CA) durchgeführt,
für welches
pBSWTGFP (Seq.-ID Nr. 31) und eine Variante mit Mutationen kodierte,
um Fluoreszenzintensität
in E. coli zu verstärken
und die Emissionswellenlänge
auf Blaulicht-Emission zu ändern
[Crameri et al., Nat. Biotechnol. 16 (96) 315; Heim et al., PNAS
91 (94) 12501; Yang et al., J. Biol. Chem. 273 (98) 8212). Dieses
Variantengen (Seq.-ID Nr. 33), für
welches das Plasmid pBSC3BFP kodiert, wie in 5 dargestellt
(Seq.-ID Nr. 32), kodiert für
ein Fluoreszenzprotein, das helles blaues Licht emittiert, wenn
es durch Langwellen-UV-Licht angeregt wird.
-
Die
GRAMMR-Reaktionen wurden auf GFP/c3BFP-Heteroduplexen in einem zirkulären, doppelsträngigen Plasmid-DNA-Kontext
durchgeführt.
Die zirkulären
Gesamtplasmid-Heteroduplex-DNA-Substrate wurden durch zuerst Linearisieren
von pBSWTGFP (Seq.-ID Nr. 31) und pBSC3BFP (5, Seq.-ID
Nr. 32) durch Verdau mit Kpn I und NgoM IV und dann durch Reinigen
der verdauten DNA unter Verwendung von DNA-Zentrifugationssäulen hergestellt.
Als Nächstes
wurden 200 Nanogramm jedes der zwei linearisierten Plasmide gemischt
und in einem Volumen von 20 Mikrolitern auf 1 X SSPE gebracht (180
nM NaCl, 10 mM NaH2PO4,
1 mM EDTA bei pH 7,4). Das Gemisch wurde dann bei 95 Grad Celsius
4 Minuten lang inkubiert, in Eiswasser getaucht, wo es 10 Minuten
lang vor Inkubation bei 37 Grad Celsius blieb. Nach 30 Minuten wurde
die anellierte DNA-Probe zurück
auf Eis transferiert, wo sie bis zur Verwendung in GRAMMR-Reaktionen
blieb.
-
Zwei
unabhängige
Reihen von Neukombinationsreaktionen wurden durchgeführt, um
CEL I mit RES I in deren Fähigkeiten
zu vergleichen, Sequenz-Neukombination durch GRAMMR zu erleichtern.
Jede GRAMMR-Reaktion enthielt eine Einheit von T4-DNA-Polymerase,
2 Einheiten von E.-coli-DNA-Ligase und 5 Nanomol jedes dNTP in 1
X NEB-E.coli-DNA-Ligasepuffer, ergänzt mit KCl auf 50 mM. Zwei
separate Enzymverdünnungsreihen
wurden durchgeführt.
Zu jeder von zwei Reihen von Röhrchen,
die Aliquoten des obigen Cocktails enthielten, wurden 1-Mikroliter-Aliquoten von GENEWARE®-exprimierten
CEL-I- oder RES-I-Extraktionen in Verdünnung von 1/3, 1/9, 1/27, 1/81
oder 1/243 hinzugefügt.
Eine endonucleasefreie Kontrollreaktion wurde ebenfalls vorbereitet.
Zu jeder der Reaktionen wurden 1-Mikroliter-Aliquoten,
die 20 Nanogramm des anellierten DNA-Heteroduplexsubstrats enthielten,
hinzugefügt
und die Reaktionen eine Stunde lang bei Raumtemperatur und 30 Minuten
lang auf Eis vor Transformation in kompetentes E. coli inkubiert.
-
Grünfluoreszierendes
Protein (GFP) und blaufluoreszierendes Protein (BFP) konnten in
den resultierenden Kolonien durch Bestrahlung mit langwelligem UV
sichtbar gemacht werden. Das Eltern-Wildtyp-GFP weist schwache Grünfluoreszenz
auf, und das Eltern-c3-BFP ergab starke Blaufluoreszenz. In den
Genen, die für
diese fluoreszierenden Proteine kodieren, befinden sich die Sequezen,
die diese Emissions farbe bestimmen, und jene, die Fluoreszenzintensität regeln,
an unterschiedlichen Positionen. Es wird erwartet, dass DNA-Neukombination
zum „Aufheben
der Verbindung" der
Sequenzen, welche die Emissionsfarbe bestimmen, von jenen, die Fluoreszenzintensität regeln,
führt.
Als Folge ist zu erwarten, dass die resultierenden Nachkommen Neuordnung
der funktionellen Eigenschaften der Emissionsfarbe und Intensität zeigen.
Deshalb konnte ein Maß für das Ausmaß der DNA-Neukombination,
die in jeder Reaktion stattgefunden hatte, durch Untersuchung der
Farbe und Intensität
der Fluoreszenz aus den bakteriellen Kolonien auf den entsprechenden Platten
beurteilt werden. In der Null-Nuclease-Kontrolle wurden nur schwach
grüne und
hellblaue Kolonien beobachtet. Jedoch wurden auf Platten mit Zellen,
die mit DNAs aus den Reaktionen transformiert wurden, die entweder
CEL I oder RES I enthielten, einige stark grüne sowie einige schwach blaue
Kolonien beobachtet, was zeigte, dass eine Neukombination von DNA-Sequenzen
stattgefunden hatte. Die DNA-Sequenzanalyse bestätigte, dass
dies tatsächlich
der Fall war und dass durchschnittlich die Gewinnung von neukombinierten Klonen
größer als
85 % für
beide CEL I und RES I war und dass die Anzahl und Verteilung der
Informationstransferereignisse für
beide Enzyme ähnlich
war. Jedoch erschien es, dass die Aktivität von RES I in diesem Versuch
mehrfach höher
war als jene von CEL I, wie durch die geringe Transformationswirksamkeit
von Reaktionen, die mit höheren
Konzentrationen der RES-I-Formulierung
behandelt wurden, angegeben wurde.
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BEISPIEL 6
-
Konservierung von Volllängen-GFP-Gen
mit Fehlpaarungsauflösungscocktails
-
Dieses
Beispiel zeigt verschiedene Fehlpaarungsauflösungscocktails, die das Volllängen-GFP-Gen konservieren.
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Fehlgepaarte
GFP-Substrate wurden mit verschiedenen Konzentrationen von CEL I
in Gegenwart von Cocktails von Enzymen behandelt, die gemeinsam
ein synthetisches Fehlpaarungsauflösungssystem ausmachen. Die
verwendeten Enzyme waren CEL I, T4-DNA-Polymerase, Taq-DNA-Polymerase
und T4-DNA-Ligase. CEL-I-Aktivität
soll den Heteroduplex 3' zu
fehlgepaarten Basen nicken. T4-DNA-Polymerase enthält 3'-5'-Proof-Reading-Aktivität zur Exzision
der fehlgepaarten Base aus dem genickten Heteroduplex. T4-DNA-Polymerase
und Taq-DNA-Polymerase enthalten DNA-Polymerasen, die in der Lage
sind, die Lücke zu
füllen.
T4-DNA-Ligase versiegelt den Nick im reparierten Molekül. Taq-DNA-Polymerase
weist auch 5'-Klappenase-Aktivität auf.
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Es
wurden Matrixversuche durchgeführt,
um die Reaktionsbedingungen zu identifizieren, die zur Auflösung von
Fehlpaarungen im GFP-Heteroduplexsubstrat dienen. In einem Versuch
wurde Zyklus-3/Wildtyp-GFP-Heteroduplex in einem Matrixformat mit
Reihenverdünnungen
von CEL-I-Fraktion Nummer fünf
(oben beschrieben) in acht verschiedenen Konzentrationen inkubiert.
Jede Reaktion enthielt 100 Nanogramm von Heteroduplexsubstrat und
0,2 Mikroliter von T4-DNA-Ligase (Gibco BRL) in 1 X NEB-T4-DNA-Ligasepuffer und
dNTPs bei jeweils 250μM,
in einem Reaktionsvolumen von 10 Mikroliter. Insgesamt enthielt
die Matrix 96 einzelne Reaktionen. Eine volle Reihe von Reaktionen
wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten lang inkubiert, während eine
andere volle Reihe bei 37 °C
30 Minuten lang inkubiert wurde.
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Nach
Inkubation wurde PCR zur Amplifikation des GFP-Gens aus jeder Reaktion
verwendet. Aliquoten aus jeder PCR wurden dann mit HindiII und HpaI
verdaut und auf 3 % Agarose-Gelen mit Ethidiumbromid einer Elektrophorese
unterworfen. Nur Zyklus-3-GFP weist eine HindiII-Stelle auf, und
nur Wildtyp kodiert für
eine HpaI-Stelle.
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Wenn
DNA-Fehlpaarungsauflösung
an einer der fehlgepaarten HindiII- oder HpaI-Stellen auftrat, war zu erwarten, dass
ein Anteil des PCR-Produkts beide Stellen enthielt, was eine neue
Bande ergab. Die Bande wurde in allen Proben beobachtet, einschließlich den
negativen Kontrollproben, die weder CEL I noch T4-DNA-Polymerase
aufwiesen noch Taq-DNA-Polymerase. Die Ergebnisse ließen vermuten,
dass ein Grundmaß an
Hintergrundneukombination an einem bestimmten Punkt im Versuch,
anders als in der GRAMMR-Reaktion, auftreten hätte können; möglicherweise im PCR-Schritt.
Von PCR-vermittelter Neukombination ist bekannt, dass sie in gewisser Häufigkeit
zwischen verwandten Sequenzen während
Amplifikation auftritt; Paabo et al., J. Biol. Chem. 265 (90), 4718-4721.
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In
einem anderen Versuch werden 200 Nanogramm von Zyklus-3/Wildtyp-GFP-Heteroduplex mit
CEL I und T4-DNA-Polymerase in verschiedenen Konzentrationen gemeinsam
mit 2,5 Einheiten von Taq-DNA-Polymerase in Gegenwart oder Abwesenheit
von T4-DNA-Ligase behandelt (0,2 Einheiten, Gibco BRL). Jede Reaktion
enthielt 1 X NEB-T4-DNA-Ligasepuffer mit 0,05 mM jedes dNTP in einem
Endvolumen von 20 Mikrolitern. Reaktionen wurden 30 Minuten lang
bei 37 °C
inkubiert, und 10 Mikroliter wurden auf einem 2 % TBE-Agarose-Gel
in Gegenwart von Ethidiumbromid laufen gelassen. Ergebnisse zeigten,
dass in Gegenwart von DNA-Ligase, aber in Abwesenheit von T4-DNA-Polymerase
zunehmende Mengen von CEL I größeren Abbau
der heteroduplexierten DNA verursachten, aber dass dieser Wirkung
durch die Erhöhung
der Menge von T4-DNA-Polymerase in der Reaktion entgegengewirkt
werden kann. Diese Ergebnisse zeigten, dass die verschiedenen Komponenten
der vollständigen
Reaktion zusammenwirken könnten,
um die Integrität
des Volllängengens
durch DNA-Fehlpaarungsauflösung
zu konservieren.
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Es
wurde ein anderer Matrixversuch durchgeführt, um diese Ergebnisse zu
erweitern und zusätzliche Bedingungen
für DNA-Fehlpaarungsauflösung für dieses
synthetische System zu identifizieren. 60 Nanogramm von Zyklus-3/Wildtyp-GFP-Heteroduplex
wurden mit CEL I und T4-DNA-Polymerase in verschiedenen Konzentrationen
in Gegenwart von 2,5 Einheiten von Taq-DNA-Polymerase und 0,2 Einheiten
von T4-DNA-Ligase
in 1 X NEB-T4-DNA-Ligasepuffer, der 0,5 mM jedes dNTP enthielt,
in einem Rekationsvolumen von 10 Mikrolitern behandelt. Jede Reihe
von Reaktionen wurde 1 Stunde lang bei 20 °C, 30 °C, 37 °C oder 45 °C inkubiert. Alle Reaktionen
wurden dann auf 1,5 % TBE-Agarose-Gelen in Gegenwart von Ethidiumbromid
laufen gelassen. Die Ergebnisse zeigten, dass der GFP-Heteroduplex
durch die CEL-I-Formulierung
alleine in diskrete Fragmente gespalten wurde. Der Erfolg von DNA-Fehlpaarungsauflösung wurde
anfänglich
durch den Grad kalibiert, in welchem die offensichtliche Volllängenintegrität der GFP-Sequenz
durch andere Komponenten des Fehlpaarungsauflösungssystems in Gegenwart von
CEL I aufrechterhalten wur de. Bedingungen von Enzymkonzentration
und Temperatur wurden identifiziert, die einen hohen Anteil der
DNA als Volllängenmoleküle in diesem
Test konservierten. Nämlich
ein Mikroliter der CEL-I-Fraktion-5-Formulierung (in Beispiel 2
beschrieben) mit einem Mikroliter (1 Einheit) von T4-DNA-Polymerase
in Gegenwart der anderen Reaktionskomponenten, die im Versuch konstant
gehalten wurden. Es wurde festgestellt, dass, als die Reaktionstemperatur zunahm,
die Abbauaktivität
von CEL I dementsprechend zunahm. Weiters wurde festgestellt, dass
die anderen Komponenten der Reparaturreaktion wirkten, um die Integrität der Volllängen-DNA
bei 20 °C,
30 °C, und
37 °C zu
konservieren, aber bei der Konservierung der Volllängen-DNA
bei 45 °C
deutlich weniger wirksam waren. Aus diesen Ergebnissen schlussfolgerten
die Erfinder, dass unter diesen Versuchsbedingungen Inkubation bei
45 °C für das GRAMMR-Verfahren
nicht optimal war und dass Inkubation bei 20 °C, 30 °C und 37 °C zulässig war.
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BEISPIEL 7
-
Wiederherstellung von Restriktionsstellen
an GFP-Heteroduplex-DNA nach DNA-Fehlpaarungsauflösung (GRAMMR)
-
Dieser
Versuch zeigt die Funktionsfähigkeit
von genetischer Neuordnung durch DNA-Fehlpaarungsauflösung (GRAMMR),
indem die Wiederherstellung von Restriktionstellen gezeigt wird.
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Die
Volllängen-Produkte
eines zwanzigfachen Scale-Ups der GRAMMR-Reaktion, bei 37 °C eine Stunde
lang durchgeführt,
welche die optimalen Bedingungen vewendet (die 1x Reaktion enthielt
sechzig Nanogramm von Heteroduplex-DNA, einen Mikroliter von CEL-I-Fraktion
fünf (in
BEISPIEL 2 beschrieben), eine Einheit T4-DNA-Polymerase in Gegenwart von 2,5 Einheiten
Taq-DNA-Polymerase und 0,2 Einheiten von T4-DNA-Ligase in 1 X NEB-T4-DNA-Ligasepuffer,
der 0,5 mM jedes dNTP in einem Reaktionsvolumen von 10 Mikrolitern
enthielt) wurden gel-isoliert und Restriktionsanalyse durch Endonucleasen
unterworfen, deren Erkennungsstellen sich mit Fehlpaarungen im GFP-Heteroduplex überlagern,
wodurch diese Stellen in der DNA gegenüber Restriktionsenzymspaltung
resistent gemacht werden. Die verwendeten Enzyme waren BamHI, HindIII,
HpaI und XhoI. Negative Kontrollen bestanden aus unbehandeltem GFP-Heteroduplex.
Positive Kontrollen bestanden einzeln aus Zyklus-3- oder Wildtyp-GFP-Sequenzen.
Alle Kontrollen wurden mit denselben Enzymen verdaut wie das Produkt
der DNA-Fehlpaarungsauflösungsreaktion.
Alle Proben wurden auf einem 2 % TBE-Agarose-Gel in Gegenwart von
Ethidiumbromid laufen gelassen.
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Nach
Behandlung mit dem Fehlpaarungsauflösungscocktail erhielt ein DNA-Abschnitt
Empfindlichkeit auf BamHI- und XhoI-Restriktionsendonucleasen, was
zeigte, dass DNA-Fehlpaarungsauflösung aufgetreten war. Die HapI-geschnittenen
Proben konnten nicht interpretiert werden, da ein geringes Ausmaß an Spaltung in
der negativen Kontrolle auftrat. Die HindII-, BamHI- und XhoI-Stellen
zeigten verschiedene Grade an Spaltung in den GRAMMR-behandelten
Proben. Die Wiederherstellung der XhoI-Stelle war umfassender als
jene der BamHI-Stelle, die hingegen umfassender war als die Wiederherstellung
an der HindIII-Stelle.
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Das
Ausmaß,
in welchem Spaltung auftritt, zeigt das Ausmaß an, in welchem Fehlpaarungen
in der DNA an jener Stelle aufgelöst worden waren. Unterschiede
in der Fehlpaarungsauflösungswirksamkeit
können mit
dem Wesen oder der Dichte von Fehlpaarungen in Zusammenhang stehen,
die an diesen Stellen gegenwärtig
sind. Zum Beispiel erstreckt sich die XhoI-Stelle über einen
Drei-Fehlpaarungscluster, während
die BamHI-Stelle sich über
zwei Fehlpaarungen erstreckt und die HindIII-Stelle sich über eine einzige Fehlpaarung erstreckt.
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BEISPIEL 8
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GRAMMR-behandelte GFP-Gene
-
Dieses
Beispel zeigt, dass GRAMMR Sequenzvariation zwischen zwei Gensequenzen
in einem Heteroduplex neu anordnet und dass es keine signifikanten
Unterschiede in GRAMMR-Produkten gibt, die direkt kloniert wurden
oder vor Klonierung PCR-amplifiziert wurden.
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Die
GRAMMR-behandelten DNA-Moleküle
aus BEISPIEL 7 wurden in der Folge entweder direkt durch Ligation
in pCR-Blunt-II-TOPO (Invitrogen) kloniert oder durch PCR amplifiziert
und in pCR-Blunt-II-TOPO gemäß den Anweisungen
des Herstellers ligiert, gefolgt von Transformation in E. coli.
Nach dem Ernten individueller Kolonien und Züchtung in flüssiger Kultur
wurde DNA hergestellt, und die Sequenzen des GFP-Inserts wurden
bestimmt. Als negative Kontrollen wurde das unbehandelte GFP-Heteroduplexsubstrat
entweder direkt kloniert oder vor Klonierung in das Plasmid PCR-amplifiziert.
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In
GRAMMR resultiert Neuordnung von Sequenzinformation aus einem Verfahren
des Informationstransfers von einem Strang auf den anderen. Diese
Stellen des Informationstransfers sind analog zu Crossover-Ereignissen,
die in rekombinationsbasierten DNA-Neukombinationsverfahren auftreten.
Um die Ergebnisse dieser Neuordnungsversuche zueinander in Beziehung
zu setzen, sind die entstehenden GRAMMR-Sequenzen hinsichtlich Crossover
beschrieben. Sequenzen von zwanzig Volllängen-GFP-Klonen, die von GRAMMR-behandelten
GFP-Genen stammten, wurden analysiert. Vier dieser Klone stammten
von DNA, die direkt in pZeroBlunt (Invitrogen) nach GRAMMR-Reaktion
kloniert wurden (keine PCR-Amplifikation). Die anderen sechzehn
Sequenzen wurden nach PCR-Amplifikation kloniert. Analyse dieser
Volllängen-GFP-Sequenzen
zeigte, dass alle zwanzig Sequenzen Sequenzneuordnung mit zwischen
ein und zehn Crossover pro Gen durchmacht haben. Eine Gesamtheit
von 99 Crossover wurde in dieser Reihe von Genen festgestellt, was einen
Durchschnitt von etwa 5 Crossover pro Gen ergab. Mit dem Abstand
zwischen der ersten und den letzten Fehlpaarungen von etwa 590 Nucleotiden
wurde eine gesamte Häufigkeit
von etwa einem Crossover pro 120 Basenpaare berechnet. Innerhalb
dieser Reihe von zwanzig Klonen war eine Gesamtheit von sieben Punktmutationen
innerhalb der Sequenzen aufgetreten, die sich zwischen den PCR-Primersequenzen
befanden, was eine Mutationshäufigkeit
von etwa 0,05 % ergab.
-
Fünfunddreißig Klone,
die nicht GRAMMR-Reaktion unterzogen wurden, wurden sequenziert.
Von diesen Kontrollen stammten vierzehn von direkter Klonierung,
und einundzwanzig wurden nach PCR-Amplifikation unter Verwendung
von GFP-Hetero duplex als Matrize erhalten. Von diesen fünfunddreißig nicht-GRAMMR-behandelten
Kontrollkolonien waren acht Rekombinanten, die von einem bis drei
Crossover reichten, wobei die meisten einzelne Crossoverereignisse
waren. Eine Gesamtheit von fünfundzwanzig
Punktmutationen waren innerhalb der Sequenzen, die sich zwischen
den PCR-Primern befanden, aufgetreten, was eine Mutationshäufigkeit
von etwa 0,1 % ergab.
-
Zwischen
den GRAMMR-behandelten Produkten, die entweder direkt kloniert oder
PCR-amplifiziert wurden, wurden keine signifikanten Unterschiede
beobachtet. Bemerkenswerterweise war jedoch, in den nicht-GRAMMR-behandelten
Kontrollen, die Häufigkeit
von Rekombinanten in den PCR-amplifizierten DNAs höher als
in den direkt klonierten DNAs. Diese höhere Häufigkeit stimmt mit Ergebnissen überein,
die von anderen erhalten wurden, bei welchen festgestellt wurde,
dass ein bestimmtes Ausmaß an
Rekombination durch „Jumping-PCR" verursacht wurde
(Paabo et al., DNA damage promotes jumping between templates during
enzymatic amplification; J. Biol. Chem. 265 (90), 4718-4721).
-
BEISPIEL 9
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Heteroduplex-Substratherstellung für genetische
Plasmid-auf-Plasmid-Neuordnung
durch DNA-Fehlpaarungsauflösung
(POP-GRAMMR) von GFP-Plasmiden
-
Dieses
Beispiel zeigt, dass Heteroduplex-Substrat für genetische Neuordnung durch
DNA-Fehlpaarungsauflösung
in Form von intakten zirkulären
Plasmiden erfolgen kann. Zyklus-3-GFP und Wildtyp-GFP-Heteroduplexmoleküle wurden
im Plasmid-auf-Plasmid-(POP-)Format
hergestellt. In diesem Format wurden die GFP-Sequenzen innerhalb
des Kontextes eines zirkulären
doppelsträngigen
Plasmidvektorrückgrats
neu geordnet. Dies ermöglichte
die Gewinnung von neu geordnetem Produkt durch direkte Transformation
von E. coli unter Verwendung einer Aliquoten der GRAMMR-Reaktion.
In der Folge war weder PCR-Amplifikation noch andere zusätzliche
Manipulation der GRAMMR-behandelten DNA notwendig, um neugeordnete
Klone zu erhalten.
-
Es
wurde fehlgepaartes DNA-Substrat für POP-GRAMMR-Reaktionen erzeugt,
das Wildtyp-GFP (Seq-ID Nr. 29) und Zyklus-3-GFP (Seq.-ID Nr. 30)
enthielt, was zu zwei pBluescript-basierten Plasmiden führte, pBSWTGFP
(Seq.-ID Nr. 31) bzw. pBSC3GFP (Seq.-ID Nr. 17). Die GFPs wurden
zwischen den Kpnl- und EcoRI-Stellen
des pBluescript-Polylinkers insertiert, sodass die einzigen Sequenzunterschiede
zwischen den zwei Plasmiden an Stellen auftraten, wo die Wildtyp-
und Zyklus-3-GFPs sich voneinander unterschieden. Beide Plasmide
wurden durch Verdau des Plasmidrückgrats
mit SapI linearisiert, unter Verwendung einer DNA-Zentrifugationssäule gereinigt,
gemischt und zu einem 1 X PCR-Puffer geändert (Barnes, PNAS 91, 2216-2220
(1994)), in siedendem Wasserbad drei Minuten lang erhitzt und langsam
auf Raumtemperatur abgekühlt,
um die denaturierten DNA-Stränge
zu anellieren. Denaturierung und Annealing dieser DNAs führte zu einem
Gemisch aus Duplexen, der Neubildung von Elternduplexen und der
Bildung von Heteroduplexen aus dem Annealing von Strängen von
jedem der zwei Input-Plasmide. Eltern-Duplexe wurden für GRAMMR als unerwünscht angesehen
und wurden durch Verdau mit Restriktionsenzymen entfernt, die in
dem einen oder anderen Elternduplex entfernt wurden, aber nicht
in den heteroduplexierten Molekülen.
PmII und XhoI wurden für diese
Operation ausgewählt,
da PmII nur in der Wildtyp-GFP-Sequenz schneidet und XhoI nur Zyklus-3-GFP schneidet.
Nach Behandlung mit diesen Enzymen wurden die Produkte auf einem
Agarose-Gel aufgelöst.
Die ungeschnittenen Volllängen-Heteroduplex-Moleküle wurden
aus den PmII- und XhoI-geschnittenen Elternhomoduplexen in einem
Agarose-Gel aufgelöst
und durch Exzision der Bande und Reinigung mit einer DNA-Zentrifugationssäule gereinigt.
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Die
resultierende Population von heteroduplexierten Molekülen wurde
mit DNA-Ligase behandelt,
um die linerare DNA in zirkuläre,
doppelsträngige
DNA-Heteroduplexe zu überführen. Nach
Nachweis durch Agarose-Gel-Shift-Analyse wurde das zirkuläre doppelsträngige heteroduplexierte
GFP-Plasmid als Substrat für GRAMMR-Reaktionen verwendet.
Beispiele für
die resultierenden Klone sind als Seq.-ID Nr. 5, Seq.-ID Nr. 6, Seq.-ID
Nr. 7 und Seq.-ID Nr. 8 enthalten.
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BEISPIEL 10
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Exemplarische Reaktionsparameter für genetische
Neuordnung durch DNA-Fehlpaarungsauflösung
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Vergleich der CEL-I- und T4-DNA-Polymerasekonzentrationen
-
Die
GRAMMR-Reaktion umfasst die Wechselwirkung von zahlreichen enzymatischen
Aktivitäten. Mehrere
Parameter, die mit GRAMMR-Reaktion assoziiert waren, wurden untersucht,
wie z. B. CEL-I-Konzentration, T4-DNA-Polymerasekonzentration, Reaktionstemperatur,
Substitution von T4-DNA-Polymerase mit T7-DNA-Polymerase, die Gegenwart
von Taq-DNA-Polymerase und die Quelle von CEL-I-Enzym. Eine Matrix aus
drei verschiedenen CEL-I-Konzentrationen gegen zwei Konzentrationen
von T4-DNA-Polymerase
wurde geschaffen, um die Grenzen der In-vitro-DNA-Fehlpaarungsauflösungsreaktion
zu untersuchen.
-
Einundzwanzig
Nanogramm (21 ng) des zirkulären
doppelsträngigen
heteroduplexierten Plasmids, das wie in BEISPIEL 9 beschrieben hergestellt
wurde, wurde als Substrat in einer Reihe von 10-Mikroliter-Reaktionen
verwendet, die 1 X NEB-Ligasepuffer,
0,5 mM jedes dNTP, 1,0 Einheiten Taq-DNA-Polymerase, 0,2 Einheiten
T4-DNA-Ligase (Gibco/BRL), entweder 1,0 oder 0,2 Einheiten T4-DNA-Polymerase
und entweder 0,3, 0,1 oder 0,03 Mikroliter einer CEL-I-Formulierung
(Fraktion 5, in BEISPIEL 2 beschrieben) enthielten. Sechs Reaktionen,
die alle sechs Kombinationen der zwei T4-DNA-Polymerasekonzentrationen
mit den drei CEL-I-Konzentrationen darstellten, wurden hergestellt,
in äquivalente
Gruppen von fünf
Mikrolitern geteilt und bei entweder 20 Grad Celsius oder 37 Grad
Celsius inkubiert. Eine Kontrollreaktion, die kein CEL I und 0,2 Einheiten
von T4-DNA-Polymerase enthielt, wurde mit den anderen Reaktionskomponenten
hergestellt und bei 37 Grad Celsius inkubiert. Nach 30 Minuten wurden
1-Mikroliter-Aliquoten jeder Reaktion in kompetente DH5-alpha-E.-coli
transformiert, die dann auf LB-amp-Platten ausplattiert wurden.
Kolonien wurden geerntet und kultiviert. Plasmid-DNA wurde extrahiert
und durch Restriktionsfragmentlängenpolymorphismusanalyse (RFLP),
gefolgt von Sequenzanalyse der GFP-Gensequenzen untersucht. RFLP-Analyse
basierte auf Unterschieden in mehreren Restriktionsenzymerkennungsstellen
zwischen den Wildtyp- und Zyklus-3-GFP-Genen. Die RFLP-Ergebnisse
zeigten, dass durch die CEL-1/T4-DNA-Polymerase/Temperaturmatrix Neuordnung
von Restriktionsstellen, d.h. GRAMMR, aufgetreten war und dass keine
solche Neuordnung in den Null-CEL-I-Kontrollklonen aufgetreten war.
DNA-Sequenzanalyse bestätigte,
dass Neuordnung in allen CEL-I-enthaltenden Proben
aufgetreten war. Sequenzierung bestätigte auch, dass die Null-CEL-I-Kontrollen
nicht neu geordnet waren, mit Ausnahme eines einzigen Klons der
16 Kontrollklone, der eine Einzelbasenänderung von einer Gensequenz
zur anderen aufwies, die vermutlich entweder aus der Reparatur in
E. coli oder aus willkürlicher Mutation
resultierte. Die Sequenzen mehrerer exemplarischer entstehender
GRAMMR-GFP-Klone sind dargestellt, wobei alle aus der Reaktion entstanden
sind, die 0,3 Mikroliter der CEL-I-Formulierung und 1,0 Einheiten
von T4-DNA-Polymerase enthielten, die bei 37 Grad Celsius inkubiert
wurde. Die Eltern-Wildtyp- und Zyklus-3-GFP-Gene sind hauptsächlich für Referenzzwecke dargestellt.
-
BEISPIEL 11
-
Taq-DNA-Poymerase ist für genetische
Neuordnung durch DNA-Fehlpaarungsauflösung nicht
erforderlich
-
Dieser
Versuch zeigt, dass Taq-DNA-Polymerase nicht dramatisch, wenn überhaupt,
zur Funktionsweise von GRAMMR beiträgt oder diese beeinflusst.
Von Taq-DNA-Polymerase
wird berichtet, dass sie eine 5'-Klappen-ase-Aktivität aufweist,
und ist in die Lehren der vorherigen Beispiele als Schutz gegen
die mögliche Bildung
und das Bestehen von unerwünschten
5'-Klappen in der
heteroduplexierten DNA, die der GRMAMR-Reaktion unterzogen wurden,
aufgenommen worden.
-
GRAMMR-Reaktionen
wurden geschaffen, wie in Beispiel 10, mit einundzwanzig Nanogramm
des zirkulären
doppelsträngigen
heteroduplexierten GFP-Plasmidsubstrats in 10-Mikroliter-Reaktionen,
die 1 X NEB-Ligasepuffer, jeweils 0,5 mM dNTP, 0,2 Einheiten T4-DNA-Ligase,
1,0 Einheiten T4-DNA-Polymerase, 1,0 Mikroliter einer CEL-I-Formulierung
(Fraktion 5, in Beispiel 2 beschrieben) und entweder 2,5 Einheiten,
0,5 Einheiten von Taq-DNA-Polymerase oder keine Taq-DNA-Polymerase
enthielten. Nach 30 Minuten wurden 1-Mikroliter-Aliquoten jeder
Reaktion in kompetente DH5-alpha-E.-coli transformiert, die dann
auf LB-amp-Platten ausplattiert wurden. Kolonien wurden geerntet
und kultiviert. Plasmid-DNA wurde extrahiert und durch RFLP-Analyse,
gefolgt von Sequenzanalyse der GFP-Gensequenzen, analysiert. Die
RFLP-Ergebnisse zeigten, dass Neuordnung von Restriktionsstellen,
d.h. GRAMMR, sowohl in Gegenwart als auch in Abwesenheit von Taq-DNA-Polymerase
in der GRAMMR-Reaktion aufgetreten war. DNA-Sequenzanalyse bestätigte diese
Ergebnisse. Deshalb zeigen die Daten, dass Taq-DNA-Polymerase für GRAMMR
nicht notwendig war.
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BEISPIEL 12
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Alternierende Proof-Reading-DNA-Polymerasen
zur genetischen Neuordnung durch DNA-Fehlpaarungsauflösung
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Dieser
Versuch zeigt, dass genetische Neuordnung durch DNA-Fehlpaarungsauflösung nicht
auf die Verwendung von T4-DNA-Polymerase beschränkt ist und dass alternierende
DNA-Polymerasen dadurch ersetzt werden können.
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Es
wurden Reaktionen geschaffen, wie in Beispiel 10, mit einundzwanzig
Nanogramm des zirkulären, doppelsträngigen heteroduplexierten
GFP-Plasmidsubstrats in 10-Mikroliter-Reaktionen, die 1 X NEB-Ligasepuffer,
0,5 mM jedes dNTP, 0,2 Einheiten T4-DNA-Ligase (Gibco/BRL), 10 Einheiten
oder 2 Einheiten T7-DNA-Polymerase, 1,0 Mikroliter einer CEL-I-Formulierung
(Fraktion 5, in Beispiel 2 beschrieben) und 2,5 Einheiten von Taq-DNA-Polymerase
enthielt. Nach 30 Minuten wurden 1-Mikroliter-Aliquoten jeder Reaktion
in kompetente DH5-alpha-E.-coli transformiert, die dann auf LB-amp-Platten
ausplattiert wurden. Kolonien wurden geerntet und kultiviert. Plasmid-DNA
wurde extrahiert und durch RFLP-Analyse, gefolgt von Sequenzanalyse
der GFP-Gensequenzen, untersucht. Die RFLP-Ergebnisse zeigten, dass
Neuordnung von Restriktionsstellen, d.h. GRAMMR, in beiden T7-DNA-Polymeraseenthaltenden
Reaktionen aufgetreten war. DNA-Sequenzanalyse bestätigte diese
Ergebnisse. Deshalb zeigen die Daten, dass T7-DNA-Polymerase T4-DNA-Polymerase
für GRAMMR
ersetzen kann. Zusätzlich
dazu zeigt es, dass indiviudelle Kom ponenten und Funktionalitäten in GRAMMR
weitgehend ersetzt werden können,
während ähnliche
Ergebnisse erhalten werden.
-
BEISPIEL 13
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Molekulares Züchten von Tobamovirus-30K-Genen
in einem Virusvektor
-
In
den vorangegangenen Beispielen ist gelehrt worden, dass genetische
Neuordnung durch DNA-Fehlpaarungsauflösung zur Neuordung von Sequenzen
nützlich
ist, die höchst
homolog sind, zum Beispiel wtGFP und Zyklus-3-GFP sind 96 % identisch.
Das vorliegende Beispiel lehrt, dass GRAMMR zur Neuordnung von abweichenderen
Nucleinsäuresequenzen
verwendet werden kann, wie z.B. Gene, die für Tobamovirusbewegungsproteingen
kodieren.
-
Heteroduplexe
von zwei Tobamovirus-Bewegungsprotein (MP-)Genen, die etwa 75 %
identisch sind, wurden erzeugt. Das Heteroduplex-Substrat wurde
durch Annealing von teilweise komplementären einzelsträngigen DNAs
von entgegengesetzter Strangbeschaffenheit durch asymmetrische PCR
synthetisiert, wobei ein Strang für das Bewegungsproteingen aus
dem Tabakmosaikvirus-U1-Typ-Stamm (TMV-U1) (Seq.-ID Nr. 9) und der
andere Strang für
das Bewegungsproteingen aus Tomatenmosaikvirus (ToMV) (Seq.-ID Nr.
10) kodiert. Die Sequenzen der zwei teilweise komplementären Bewegungsproteingene
wurden durch 33 Nucleotide von absoluter Komplementarität flankiert,
um Annealing der DNAs an deren Termini zu fördern und PCR-Amplifikation
und Klonierung zu erleichtern. Die Annealing-Reaktion fand durch
Mischung von 2,5 Mikrogramm jeder einzelsträngigen DNA in einer 150-Mikroliter-Reaktion, die 333
mM NaCl, 33 mM MgCl2, 3,3 mM Dithiothreit,
166 mM Tris-HCl, pH 7, enthielt, und Inkubation bei 95 °C eine Minute
lang, gefolgt von langsamem Abkühlen
auf Raumtemperatur statt. GRAMMR wurde durch Inkubation von 5 Mikroliter
des Heteroduplex-Substrats in einer 20-Mikroliter-Reaktion, die
1 X NEB-Ligasepuffer,
0,5 mM jdes dNTP, 0,4 Einheiten T4-DNA-Ligase (Gibco/BRL), 2,0 Einheiten
von T4-DNA-Polymerase und CEL I enthielt, durchgeführt. Das CEL
I stammte aus einer klonierten Formulierung, und die Menge, die
verwendet wurde, variierte von 2 Mikroliter von Prep, gefolgt von
fünf seriellen
3fach-Verdünnungen.
Es wurde eine siebente Formulierung ohne CEL I hergestellt, die
als Kontrolle diente.
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Nach
einer Stunde bei Raumtemperatur wurde DNA aus den Reaktionen unter
Verwendung von Strataprep-Zentrifugations-DNA-Reinigungssäulen (Stratagene,
LaJolla, CA) gereinigt und als Matrizen für PCR-Reaktionen unter Verwendung
von Primern verwendet, die zum Annealing an die flankierenden Primer-Bindungsstellen
der zwei Sequenzen entworfen wurden. PCR-Produkte aus jeder Reaktion
wurden unter Verwendung von Strataprep-Säulen gereinigt, mit AvrII und
PacI verdaut und in den Bewegungsprotein-Slot von ähnlich geschnittenem
pGENEWARE®-MP-Avr-Pac
ligiert. Dieses Plasmid enthielt einen infektiösen Tobamovirus-GFP-Klon voller
Länge,
der mit AvrII- und Pac-I-Stellen modifiziert worden war, die das
Bewegungsproteingen flankieren, um sein Ersetzen durch andere Bewegungsproteingene
zu ermöglichen.
Nach Transformation von DH5-alpha-E.-coli und Ausplattierung wurden
Kolonien geerntet, Kulturen gezüchtet
und DNA extrahiert. Die Bewegungsproteininserts wurden DNA-Sequenzanalyse
aus beiden Richtungen unterworfen, und die Sequenzdaten bestätigten,
dass in der Mehrheit der Inserts, die von GRAMMR-behandeltem Material abstammen,
neugeordnete Sequenzen befanden, die sowohl aus TMV-U1- als auch
ToMV-Bewegungsproteingensequenzen stammten. Die DNA-Sequenzen aus mehreren
exemplarischen entstehenden GRAMMR-MP-Klonen sind als Seq.-ID Nr.
11, Seq.-ID Nr. 12, Seq.-ID Nr. 13, Seq.-ID Nr. 14 und Seq.-ID Nr. 15
dargestellt.
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BEISPIEL 14
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Molekulare Züchtung von höchst divergierenden
Tobamovirus-30K-Genen in Virusvektoren unter Verwendung von genetischer
Plasmid-auf-Plasmid-Neuordnung
durch DNA-Fehlpaarungsauflösung
(POP-GRAMMR)
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Beispiel
4 lehrte die Neuordnung von Bewegungsprotein-(MP-)Genen aus mehreren
divergierenden Stämmen
von Tobamovirus (etwa 75 % identisch; in den pGE-NEWARE-MP-Avr-Pac-Vektor kloniert) unter Verwendung
von GRAMMR. Dieses Beispiel zeigt die Verwendung von Plasmid-auf-Plasmid-GRAMMR (POP-GRAMMR)
zur Neuordnung von noch höher
divergierenden Spezies.
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Es
wurden Ausgangs-Eltern-MP-Gene aus den Tobamoviren TMV-Cg (6,
Seq-ID Nr. 18), TMV-Ob (7, Seq.-ID Nr. 19), TVM-U2
(8, Seq.-ID Nr. 20), TMV-U1 (Seq.-ID Nr. 9) und
Tomatenmosaikvirus (ToMV) (Seq.-ID Nr. 10) verwendet. Das Plasmid
von pGENEWARE-ToMV-MP wurde durch Verdau mit Sma-I linearisiert.
Die Plasmide von pGENEWARE, die MP-Gene entweder aus TMV-Cg, TMV-Ob,
TMV-U2 oder TMV-U1
enthielten, wurden mit Stu I verdaut. Die verdauten pGENEWARE-MP-Konstrukte wurden
unter Verwendung von DNA-Zentrifugationssäulen gereinigt. Die folgenden
Heteroduplexpaare wurden erzeugt: pGENEWARE-Cg-MP und pGE-NEWARE-ToMV-MP, pGENEWARE-TMV-Ob-MP
und pGENEWARE-ToMV-MP, pGENEWARE-TMV-U2-MP und pGENEWARE-ToMV-MP,
pGENEWARE-ToMV-MP-U1-MP
und pGENEWARE-ToMV-MP. Die Heteroduplexe dieser MP-Gensequenzen
sind etwa 47 %, 58 %, 62 %, bzw. 75 % identisch. Heteroduplex-DNA
wurde durch Mischung von 200 Nanogramm jedes der zwei linearisierten
Plasmide in 1 X SSPE (180 mM NaCl, 10 mM NaH2PO4, 1 mM EDTA, bei pH 7,4) in einem Volumen
von 20 Mikroliter erzeugt. Das Gemisch wurde bei 95 Grad Celsius
4 Minuten lang inkubiert, in Eiswasser getaucht, wo es 10 Minuten
vor Inkubation bei 37 Grad Grad Celsius blieb. Nach 30 Minuten wurde
die anellierte DNA-Probe dann zurück auf Eis transferiert, wo
sie bis zur Verwendung in GRAMMR-Reaktionen beibehalten wurde.
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Jede
10-Mikroliter-GRAMMR-Reaktion enthielt 1 Einheit von T4-DNA-Polymerase,
2 Einheiten E.-coli-DNA-Ligase und 0,5 mM von jedem dNTP in 1 X
NEB-E.-coli-DNA-Ligasepuffer,
ergänzt
mit KCl auf 50 mM. Eine 1-Mikroliter-Aliquote von CEL I (verdünnt 1/3,
1/9, 1/27, 1/81, 1/243 oder 1/729) wurde als Nächstes hinzugefügt. Eine
endonucleasefreie Kontrollreaktion wurde ebenfalls hergestellt.
Zu jeder der Reaktionen wurde eine 1-Mikroliter-Aliquote hinzugefügt, die
20 Nanogramm des anellierten DNA-Heteroduplex-Substrats enthielt,
und die Reaktionen wurden eine Stunde lang bei Raumtemperatur und
30 Minuten lang auf Eis vor Transformation in kompetentes E. coli
inkubiert.
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DNA-Sequenzanalyse
wurde aus beiden Richtungen durchgeführt, und die Sequenzdaten zeigten, dass
eine signfikante Zahl an Klonen, die von GRAMMR-behandeltem Material
abstammten, neugeordnete Sequenzen waren, die Information aus beiden
Elternbewegungsproteingensequenzen enthielten. Die DNA-Sequenzen
aus mehreren exemplarischen entstehenden pGENEWARE-MP-Klonen aus
der GRAMMR-Reaktion sind wie folgt, TMV-CG/ToMV-Klone, 9,
Seq.-ID Nr. 21 und 10, Seq.-ID Nr. 22, TMV-Ob/ToMV-Klone, 11, Seq.-ID Nr. 23 und 12,
Seq.-ID Nr. 24; TMV-U2/ToMV-Klone, 13, Seq.-ID
Nr. 25 und 14, Seq.-ID Nr. 26, und TMV-U1/ToMV-Klone, 15, Seq.-ID Nr. 27 und 16, Seq.-ID
Nr. 28.
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BEISPIEL 15
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GRAMMR auf linearisiertem DNA-Substrat
unter Verwendung von Endonucleasen, die innerhalb eines selektierbaren
Markers spalten
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Dieses
Beispiel zeigt eine GRAMMR-Reaktion, wo DNA-Substratmoleküle mit Restriktionsendonucleasen
linearisiert werden, die innerhalb eines selektierbaren Markergens
spalten.
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GRAMMR
wird zwischen dem Wildtyp-Aequorea-victoria-GFP-Gen [Prasher et
al., Gene 111 (92) 229] in einem PBS-Derivat (Stratagene, La Jolla,
CA), für
welches pBSWTGFP (Seq.-ID Nr. 31) kodiert, und einer Variante mit
Mutationen durchgeführt,
um Fluoreszenzintensität
in E. coli zu verstärken
und um die Emissionswellenlänge
auf Blaulichtemission zu ändern
[Crameri et al., Nat. Biotechnol. 14 (96) 315; Heim et al., PNAS 91
(94) 12501; Yang et al., J. Biol. Chem. 273 (98) 8212]. Dieses Variantengen,
für welches
das Plasmid pBSC3BFP (Seq.-ID Nr. 32) kodiert, kodiert für ein fluoreszierendes
Protein, das starkes blaues Licht emittiert, wenn es durch langwelliges
UV-Licht angeregt wird.
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Die
GRAMMR-Reaktionen werden auf GFP/c3BFP-Heteroduplexen in einem zirkulären doppelsträngigen Plasmid-DNA-Kontext
durchgeführt.
Die zirkulären
Gesamtplasmid-Heteroduplex-DNA-Substrate werden durch erstes Linearisieren
von pBSWTGFP (Seq.-ID Nr. 31) und pBSC3BFP (Seq.-ID Nr. 32) durch
Verdau mit Ahd I bzw. Bcg I, dann durch Reinigung der verdauten
DNA unter Verwendung von DNA-Zentrifugationssäulen hergestellt.
Als Nächstes
wurden 200 Nanogramm jedes der zwei linearisierten Plasmide gemischt
und auf 1 X SSPE (180 nM NaCl, 10 mM NaH2PO4, 1 mM EDTA bei pH 7,4)
in ein Volumen von 20 Mikrolitern gebracht. Das Gemisch wird dann
bei 95 Grad Celsius 4 Minuten lang inkubiert, in Eiswasser getaucht,
wo es 10 Minuten lang vor Inkubation bei 37 Grad Celsius blieb.
Nach 30 Minuten wird die anellierte DNA-Probe zurück auf Eis
transferiert, wo sie bis zur Verwendung in GRAMMR-Reaktionen gehalten
wurde.
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Zwei
unabhängige
Reihen von Neuordnungsreaktionen wurden durchgeführt, um CEL I mit RES I in deren
Fähigkeiten
zu vergleichen, um Sequenzneuordnung durch GRAMMR zu erleichtern.
Jede Reaktion wird zuerst 10 Minuten lang bei Raumtemperatur mit
1 Einheit von T4-DNA-Polymerase in Gegenwart von 5 Nanomol jedes
dNTP in 1 X NEB-E.-coli-Ligasepuffer, ergänzt mit KCl auf 50 mM, behandelt.
In der Folge wurden 2 Einheiten von E.-coli-DNA-Ligase hinzugefügt. Zwei
separate Enzymverdünnungsreihen
werden dann durchgeführt.
Zu jeder von zwei Reihen von Röhrchen,
die Aliquoten des obigen Cocktails enthielten, wurden 1-Mikroliter-Aliquoten
von GENEWARE®-exprimierten
CEL-I- oder RES-I-Extrakten in Verdünnungen von 1/3, 1/9, 1/27,
1/81 oder 1/243 hinzugefügt.
Eine endonucleasefreie Kontrollreaktion wird ebenfalls vorbereitet.
Zu jeder der Reaktionen werden 1-Mikroliter-Aliquoten hinzugefügt, die
20 Nanogramm des anellierten DNA-Heteroduplex-Substrats enthalten,
und die Reaktionen werden bei Raumtemperatur eine Stunde lang und
auf Eis 30 Minuten lang vor Transformation in kompetente E. coli
inkubiert.
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Grünfluoreszierendes
Protein (GFP) und blaufluoreszierendes Protein (BFP) wird in den
resultierenden Kolonien durch Bestrahlung mit langwelligem UV sichtbar
gemacht. Das Eltern-Wildtyp-GFP ergibt schwache Grünfluoreszenz,
und das Eltern-c3BFP
ergibt starke Blaufluoreszenz. In den Genen, die für diese
Fluoreszenzproteine kodieren, befinden sich die Sequenzen, welche
die Emissionsfarbe bestimmen, und jene, die Fluoreszenzintensität regeln,
an voneinander unterschiedlichen Positionen.
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Es
wird angenommen, dass DNA-Neuordnung zur „Aufheben der Verbindung" der Sequenzen, welche die
Emissionsfarbe bestimmen, von jenen, die Fluoreszenzintensität regeln,
führt.
Als Folge wird von den resultierenden Nachkommen erwartet, dass
sie Neuordnung der funktionellen Eigenschaften von Emissionsfarbe
und Intensität
zeigen. Deshalb kann ein Maß für das Ausmaß der DNA-Neuordnung,
das in jeder Reaktion stattgefunden hatte, durch Untersuchung der
Farbe und Intensität
von Fluoreszenz aus den Baterienkolonien auf den entsprechenden
Platten beurteilt werden.
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BEISPIEL 16
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Detektion von DNA-Mutationen unter Verwendung
von RES-I- und Multiplex-Analyse
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Die
Empfindlichkeit von RES I für
Fehlpaarungsdetektion wird durch seine Fähigkeit veranschaulicht, Mutationen
in gepoolten DNA-Proben zu detektieren. DNA wird aus peripheren
Blutlymphozyten von Individuen erhalten, die genetischem Sreening
unterzogen werden. Proben werden entweder nur aus Brustkrebs, nur Ovarialkrebs,
Brust/Ovarialkrebssyndromfamilien oder aus Nicht-Brust/Ovarialkrebskontrollproben
erhalten. Unmarkierte Primer, die für Exon-2 von BRCA1 spezifisch
sind, werden verwendet, um diese Region des Gens zu PCR-amplifizieren.
Die Wildtyp-PCR-Produkte
von Exon-2 werden mit γ-32P-ATP markiert. Kurz gesagt, 10 Picomol
von PCR-Produkt werden durch das Wizard-Verfahren (Promega) gereinigt.
Exon-2-Wildtypprodukte werden
dann unter Verwendung von T4-Kinase und 15 Picomol von γ-32P-ATP bei 6.000 Ci/mmol in 30 μl 1 X Kinasepuffer
(70 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 5
mM Dithiothreit) bei 37 °C
1 Stunde lang phosphoryliert. Die Reaktionen werden dann mit 1 μl 0,5 M EDTA
gestoppt. Das Reaktionsvolumen wird mit 1 X STE-Puffer (100 mM NaCl,
20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA) auf 50 μl gebracht und durch eine Pharmacia-Sonden-Quant-Säule verarbeitet.
Markierte DNA (1 pmol/μl
in 100 μl)
wird dann für
Hybridisierung mit individuellen markierten PCR-amplifizierten Versuchsproben verwendet.
Für jede
individuelle Probe werden 100 fmol des unmarkierten PCR-amplifizierten
Produkts mit 200 fmol des 32P-markierten Wildtyp-PCR-Produkts
in RES-I-Reaktionspuffer (25 mM KCl, 10 mM MgCl2,
20 mM Tris-HCl, pH 7,5) inkubiert. Nach Denaturierung und Renaturierung
werden heteroduplexierte, radiomarkierte PCR-Produkte gegenüber RES
130 Minuten lang bei 37 °C
in 1 X RES-Reaktionspuffer ausgesetzt und über die Hinzufügung von
10 μl eines
Stopp-Gemisches gestoppt (75 % Formamid, 47 mM EDTA, 1,5 % SDS,
Xylol-Cyanol und
Bromphenolblau). Die Heteroduplexe werden dann mit dem Enzym individuell
behandelt oder in einem Probenröhrchen
gepoolt und behandelt. Die Produkte der Reaktion werden auf ein
15 % Polyacrylamidgel geladen, das 7 M Harnstoff enthält.
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Um
die Fähigkeit
von RES I, Mutationen in gepoolten DNA-Proben zu detektieren, weiter
zu veranschaulichen, werden 1, 2, 3, 5, 10 oder 30 heteroduplexierte,
radiomarkierte PCR-Produkte (wieder aus Exon 2 des BRCA1-Gens amplifiziert)
gegenüber
RES I in einem einzigen Reaktionsröhrchen ausgesetzt und die Produkte
auf einem 6 % Poylacrylamidgel, das 7 M Harnstoff enthielt, laufen
gelassen. Proben werden amplifiziert und wie oben beschrieben radiomarkiert.
Jeder Pool enthält
nur eine Probe, die eine Mutation aufweist (AG-Deletion). Die anderen
Proben in jedem Pool sind vom Wildtyp. Kontrollproben werden nicht
RES I ausgesetzt. In den gepoolten Proben, wo eine Mutation gegenwärtig ist,
spaltet RES I die PCR-Produkte einheitlich, was die Empfindlichkeit
des Enzyms in Gegenwart von überschüssiger nichtmutierter
Wildtyp-DNA veranschaulicht. Als Kontrolle werden die heteroduplexierten
PCR-Produkte, die keine Mutationen enthielten, analysiert, und es
erscheint keine geschnittene Bande, die einer Mutation entspricht.
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BEISPIEL 17
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Detektion von Mutationen und Polymorphismen
durch RES I in Proben, die aus Familien erhalten wurden, die hohes
Risiko aufwiesen
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PCR-Primer-Sets,
die für
die Exons in dem BRCA1-Gen spezifisch sind, werden synthetisiert.
Die Gensequenz von BRCA1 ist bekannt. Die Exongrenzen und entsprechenden
Basennummern sind in Tabelle II angeführt. Primer zur Amplifikation
gewünschter
Sequenzen können
einfach von Fachleuten nach dem in Current Proto cols in Molecular
Biology, Ausubel et al., Hrsg. John Wiley and Sons, Inc. (1995),
beschriebenen Verfahren entworfen werden. Diese Primer werden so
geplant, dass in jeder PCR-Reaktion ein Primer am 5'-Terminus mit einer
Fluoreszenzmarkierung, 6-FAM,
markiert wird, während
der andere Primer ähnlich
mit einer Markierung einer anderen Farbe, TET, markiert wird. Ein
PCR-Produkt ist daher mit zwei Farben markiert, sodass DNA-Nicking-Ereignisse
in jedem Strang unabhängig
beobachtet werden können
und die Messungen bekräftigt
werden. TABELLE II
EXONGRENZEN
UND ENTSPRECHENDE BASENNUMMERN IN BRCA1 |
EXON | BASENNUMMERN |
1 | 1-100 |
2 | 101-199 |
3 | 200-253 |
5 | 254-331 |
6 | 332-420 |
7 | 421-560 |
8 | 561-665 |
9 | 666-712 |
10 | 713-788 |
11 | 789-4215 |
11B | 789-1591 |
11C | 1454-2459 |
11A | 2248-3290 |
11D | 3177-4215 |
12 | 4216-4302 |
13 | 4303-4476 |
14 | 4477-4603 |
15 | 4604-4794 |
16 | 4795-5105 |
17 | 5106-5193 |
18 | 5194-5273 |
19 | 5274-5310 |
20 | 5311-5396 |
21 | 5397-5451 |
22 | 5452-5526 |
23 | 5527-5586 |
24 | 5587-5711 |
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Periphere
Blutproben von Personen aus Familien mit hohem Risiko werden entnommen
und die DNA isoliert. Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung von
E-Iongase (BRL)
amplifiziert und unter Verwendung von Wizard PCR Preps (Promega)
gereinigt. Die DNA wird auf 94 °C
erhitzt und langsam in 1 X RES-I-Puffer (20 mM Tris-HCl, pH 7,4,
25 mM KCl, 10 mM MgCl2) abgekühlt, um
Heteroduplexe zu bilden. Die Heteroduplexe werden in 20 μl 1 X RES-I-Puffer
mit 0,2 μl
von RES-I und 0,5 Einheiten von AmpliTaq bei 45 °C 30 Minuten lang inkubiert.
Die Reaktionen werden mit 1 mM Phenanthrolin gestoppt und weitere
10 Minuten bei 45 °C
inkubiert. Die Probe wurde durch eine Centricep-Säule (Princeton
Separations) verarbeitet und getrocknet. Ein Mikroliter von ABI-Ladungspuffer
(25 mM EDTA, pH 8,0, 50 mg/ml Blaudextran), 4 μl entionisiertes Formamid und
0,5 μl interner
Spurstandard TAMRA werden zu dem getrockneten DNA-Pellet hinzugefügt. Die
Probe wird 2 Minuten lang auf 90 °C
erhitzt und dann vor Ladung auf Eis abgeschreckt. Die Probe wird
dann auf ein 4,25 % denaturierendes, 34 cm großes, gut abzulesendes Acrylamidgel
geladen und auf einem ABI-373-Sequenzierer unter Verwendung von
GENESCAN-672-Software
analysiert. Der 6-FAM-markierte Primer in dieser Versuchsprobe befindet
sich an Nucleotid 3177 der BRCA1-cDNA (Region 11 D), der TET-markierte
Primer ist 73 Nucleotide in dem Intron zwischen Exon 11 und Exon
12. Jeder Spike repräsentiert
die Gegenwart einer DNA-Bande, die durch Spaltung des Heteroduplexes
durch RES I produziert wurde, wo eine Muitation oder ein Polymorphismzus
vorhanden ist. Ein Spike repräsentiert
die Größe des RES-I-produzierten
Fragments von der 3'-Seite der Fehlpaarungsstelle
zur 5'-6-FAM-Markierung
des oberen Strangs. Der andere Spike repräsentiert das entsprechende
Fragment im unteren Strang von der 3'-Seite
der Fehlpaarung zur 5'-TET-Markierung. Die
Summe der zwei Fragmente ist eine Base länger als die Länge des
PCR-Produkts. Das 6-FAM-Panel zeigt einen Spike an Base Nr. 645
aus der 6-FAM-Markierung, und das TET-Panel zeigt einen Spike an
Base Nr. 483 aus der TET-Markierung, die beide der Stelle der 5-Basen-Deletion an Nucleotid
3819 der BRCA1-DNA entsprechen.
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Analyse
von Exon 11 in einem anderen Individuum wird unter Verwendung eines
6-FAM-markierten Primers
an Nucleotid 1454 von BRCA1-cDNA durchgeführt. Der TET-markierte Primer
befindet sich an Nucleotid 2459 (Region 11C). Die PCR-amplifizierten Produkte
werden amplifiziert und wie oben beschrieben hergestellt. In diesem
Individuum zeigt das 6-Fam-Panel einen Spike an Base Nr. 700 und
das TET-Panel einen Spike an Nr. 305, wobei jeder Spike der Stelle
der RES-I-Inzision im jeweiligen DNA-Strang einer Nichtsinnmuation
von A > T an Nucleotid
2154 von BRCA1-cDNA entspricht. Das 6-FAM-Panel zeigt auch einen
Spike an Base Nr. 747, und das TET-Panel zeigt einen Spike an Nr.
258, welcher der Stelle eines Polymorphismus C > T an Nucleotid 2201 von BRCA1-cDNA entspricht.
Die Nichtsinnmutation und der Polymorphismus können durch Sequenzierung der
Probe unter Verwendung des ABI-377-Sequenzierers nachgewiesen werden.
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Bestimmte
Individuen weisen Mutationen in einer anderen Region von Exon 11,
Region 11A, auf der schematischen Darstellung in n auf.
Ein 6-FAM-markierter Primer an Nucleotid 2248 von BRCA1-cDNA und
ein TET-markierter Primer an Nucleotid 3290 werden verwendet, um
diese Region von Exon 11 zu amplifizieren. Nach Amplifikation werden
die Proben wie oben beschrieben verarbeitet.
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Hinterlegungen bei der American Type Culture
Collection (ATCC)
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Es
sind drei Hinterlegugen bei der American Type Culture Collection
(ATCC), 10801 University Blvd., Manassas, VA, durchgeführt worden.
Es ist eine Hinterlegung eines Plasmid-DNA-Konstrukts durchgeführt worden,
das ein Derivat von Tabakmosaikvirus und cDNA des CEL-I-Fehlpaarungsendonucleasegens
aus Sellerie, markiert mit 6HIS, enthält. Das Konstrukt wird intern
P1177MP4-CEL-I-6HIS genannt und hat die ATCC-Nummer PTA-3927 zugewiesen
bekommen. Eine Hinterlegung eines Plasmid-DNA-Konstrukts, das ein Derivat von
Tabakmosaikvirus und cDNA des CEL-I-Fehlpaarungsendonucleasegens aus Sellerie
enthielt, ist durchgeführt
worden. Das Konstrukt wird intern P1177MP4-CEL-I-Avr genannt und
hat die ATCC-Nummer PTA-3926 zugewiesen bekommen. Eine Hinterlegung
eines Plasmid-DNA-Konstrukts, das ein Derivat von Tabakmosaikvirus
und ein cDNA-Insert enthält,
das für
ein 34kDa-Protein aus Selaginella lepidophylla kodiert, ist durchgeführt worden.
Das cDNA-Insert wird als RES-I-6HIS bezeichnet. RES I ist ein Fehlpaarungsendonuc leasegen.
Das Konstrukt wird intern pLSB-2225 genannt und hat die ATCC-Nummer
PTA-4562 zugewiesen bekommen.
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Diese
Hinterlegungen wurden gemäß den Vorschriften
des Budapester Vertrages über
die Hinterlegung von Mikroorganismen und den darunter gültigen Bestimmungen
und für
einen Zeitraum von zumindest dreißig (30) Jahren und zumindest
fünf (05)
Jahren, nachdem die Hinterlegungsstelle die letzte Anfrage für das Ausstatten
einer Probe der Hinterlegung erhalten hat, oder für den wirksamen
Zeitraum eines Patents, das aus dieser Anmeldung oder einer nachfolgenden
Anmeldung, die beliebige dieser Hinterlegungen zitiert, hervorgehend
erteilt worden ist, abhängig
davon, welcher Zeitraum länger
ist, durchgeführt.
Jede Hinterlegung wird ersetzt, sollte sie in diesem Zeitraum nicht-lebensfähig werden.
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Es
gilt anzumerken, dass die Bezeichnungen des Anmelders für jeden
dieser Klone in der Hinterlegung auf die zuvor genannte Hinterlegung
bei der American Type Culture Collection gekürzt wurden, d.h. p1177MP4-CEL-I-Avr-B3
wird p1177MP4-CEL-I-Avr
genannt, und p1177MP4-CEL-I-6His-A9 wird p1177MP4-CEL-I-6His genannt.
Der Klon p1177MP4-CEL-I-Avr (Seq.-ID Nr. 1) enthielt das offene
CEL-I-Lesegerüst,
das sich von Nucleotid 5765 bis 6655 erstreckte (Seq.-ID Nr. 3),
und der Klon p1177MP4-CEL-I-6His-A9 (Seq.-ID Nr. 2) enthielt das
offene CEL-I-6His-Lesegerüst,
das sich von Nucleotid 5765-6679 (Seq.-ID Nr. 4) erstreckte.
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