DE60316040T2

DE60316040T2 - Markierte polyfunktionale Reagenzien, die in der Lage sind, Zielmoleküle pH-abhängig reversibel zu binden

Info

Publication number: DE60316040T2
Application number: DE60316040T
Authority: DE
Inventors: Matthew Maidstone BAKER; Simon Knutsford DOUGLAS; Elliot Maidstone LAWRENCE
Original assignee: Invitrogen Corp
Current assignee: Life Technologies Corp
Priority date: 2002-12-16
Filing date: 2003-12-16
Publication date: 2008-06-05
Anticipated expiration: 2023-12-17
Also published as: DE60316040D1; US20060263780A1; ATE371750T1; WO2004055213A1; US20080261202A1; AU2003292425A1; GB0229287D0; EP1601786A1; EP1601786B1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf polyfunktionale Reagenzien und insbesondere auf Reagenzien, die in der Lage sind, an Zielsubstanzen zu binden und die ein Element eines spezifischen Bindungspaars umfassen, das ermöglicht, dass die gebundene Zielsubstanz weiter manipuliert und optional detektiert wird. Die vorliegende Erfindung bezieht sich ferner auf Verfahren zur Verwendung und auf Kits, die polyfunktionale Reagenzien umfassen.
Hintergrund der Erfindung
Es sind viele Verfahren für das Extrahieren von Nukleinsäure bekannt, einschließlich der Verwendung von Phenol/Chloroform, Aussalzen, chaotropen Salzen und Silica-Harzen, Affinitätsharzen, Ionenaustausch-Chromatographie und magnetischen Kügelchen, siehe zum Beispiel US Patente Nr.: 5,057,426 und 4,923,978 , EP 0 512 767 A und EP 0 515 484 A und WO 95/13368 , WO 97/10331 und WO 96/18731 . Diese Verfahren weisen eine Vielzahl von Nachteilen auf, da die von ihnen eingesetzten Reagenzien und Bedingungen oftmals toxisch sind und die Proben von Nukleinsäure kontaminieren oder die Verfahren implizieren raue Bedingungen, welche die Zielnukleinsäure denaturieren.
EP 0 707 077 A (Johnson & Johnson) beschreibt ein synthetisches, wasserlösliches Polymer, das durch zusätzliche Polymerisation eines ethylenisch ungesättigten Monomers, das eine Aminogruppe aufweist, gebildet wird und seine Verwendung, um Nukleinsäuren bei saurem pH auszufällen und bei basischem pH freizusetzen. Die Verwendung des Polymers in einer wasserlöslichen, freien Form oder gebunden an ein wasserunlösliches Substrat, wie etwa eine Affinitätssäule oder polymere, gläserne oder weitere anorganische Partikel, wird vorgeschlagen. Das in dieser Anmeldung offenbarte Verfahren weist den Nachteil auf, dass das Freisetzen von Nukleinsäuren bei extremen Werten von pH, bei hoher Temperatur und/oder bei hohen Salzkonzentrationen ausgeführt wird, wobei die Nukleinsäuren, im Speziellen RNA, denaturiert, abgebaut werden können oder weitere Reinigung oder Anpassungen vor Lagerung und Analyse erforderlich machen. Zum Beispiel wird Nukleinsäure bei pH 2,3 gebunden und durch Natriumhydroxid und 10minütiges Sieden bei 100 °C freigesetzt.
WO 99/29703 (DNA Research Instruments Limited) offenbart Materialien, die ihre Ladung wechseln können und in der Lage sind, bei einem ersten pH Nukleinsäure reversibel zu binden und dann bei einem zweiten, höheren pH dieselbe freizusetzen, wobei es sich bei den für das Freisetzen der Nukleinsäure verwendeten Bedingungen um milde Bedingungen handelt und dieselben keine Verwendung von extremen Werten von pH, Hitze oder die Verwendung von toxischen Reagenzien erforderlich machen. Weitere Materialien, welche die Eigenschaften besitzen, ihre Ladung wechseln zu können, aufweisen, werden in WO 02/48164 (DNA Research Innovations Limited) offenbart, einschließlich biologischer Puffer und polymerisierter Formen davon, wie etwa Bis-Tris (Bis-(2-hydroxyethyl)iminotris(hydroxymethyl)methan) und Poly-Bis-Tris.
WO 99/29703 (Promega Corporation) offenbart die Verwendung von Festphasen für das Reinigen von Nukleinsäure, die Nukleinsäure in einer Probe bei einem niedrigen pH binden und die Nukleinsäure bei einem höheren pH freisetzen. Die Anmeldung zeigt Beispiele für die Verwendung von Festphasen, die Histidin- oder Polyhistidingruppen inkorporieren. Die Materialien, die Nukleinsäure binden, sind kovalent an Festphasen wie etwa magnetische Partikel gebunden und die Materialien, die weiter derivatisiert werden, werden nicht offenbart.
Zusammenfassung der Erfindung
Allgemein gesprochen bezieht sich die vorliegende Erfindung auf polyfunktionale Reagenzien, die in der Lage sind, reversibel an eine Zielsubstanz zu binden, wobei die Reagenzien ferner ein Element eines spezifischen Bindungspaars zwecks Manipulieren und/oder Detektieren der Zielsubstanz umfassen, wenn diese an das polyfunktionale Reagens gebunden ist. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf das Binden von Zielsubstanzen, wie etwa Nukleinsäure, Proteine, Polypeptide, Zellen, Zellkomponenten, Mikroorganismen oder Viren, unter Verwendung einer Verbindung, die ihre Ladung wechseln kann und die in der Lage ist, die Zielsubstanz bei einem ersten pH zu binden und dieselbe dann bei einem zweiten pH, der üblicherweise höher als der erste ist, freizusetzen. In WO 99/29703 und WO 02/48164 werden Verbindungen, die ihre Ladung wechseln können, beschrieben. Gemäß einigen Aspekten handelt es sich bei den polyfunktionalen Reagenzien um lösliche, z. B. wasserlösliche, polyfunktionale Reagenzien. Wie hierin angegeben, kann bei weiteren Ausführungsformen das Element eines spezifischen Bindungspaars des polyfunktionalen Reagens eingesetzt werden, um dasselbe an eine Festphase zu binden.
Dementsprechend sieht die vorliegende Erfindung gemäß einem Aspekt ein lösliches polyfunktionales Reagens vor, das in der Lage ist, bei einem ersten pH an eine Zielsubstanz zu binden und das bei einem zweiten pH in der Lage ist, die Zielsubstanz freizusetzen, wobei das Reagens ein Element eines spezifischen Bindungspaars umfasst, das in der Lage ist, an einen spezifischen Bindungspartner zwecks Manipulieren der Zielsubstanz, wenn dieselbe an das polyfunktionale Reagens gebunden ist, zu binden.
Somit sieht die vorliegende Erfindung einen Weg vor, Zielsubstanzen, die an Materialien, die ihre Ladung wechseln können, gebunden sind, zu manipulieren und optional ebenfalls zu detektieren. Wie nachfolgend weiter erläutert, handelt es sich bei bevorzugten Ausführungsformen bei den Reagenzien um wasserlösliche Polymere, die aus zwei oder mehr als zwei monomeren Einheiten durch Hinzufügen, Kondensieren oder Vernetzen gebildet werden, wobei diese monomeren Einheiten in der Lage sind, reversibel an Zielsubstanz und im Speziellen an Nukleinsäure zu binden. Dies ermöglicht den Polymeren, an die Zielsubstanz in der flüssigen Phase zu binden, wenn die Bindungskinetiken normalerweise höher sind, und dann kann der Komplex aus dem Reagens und der Zielsubstanz manipuliert und optional durch die Wirkung eines oder mehr als eines Elementes eines spezifischen Bindungspaars, das an das Reagens gebunden ist, detektiert werden. Bei einer bevorzugten Ausführungsform kann das spezifische Bindungspaarelement auf einer Festphase, auf der sein Bindungspartner immobilisiert ist, eingefangen werden oder es handelt sich bei dem spezifischen Bindungspaarelement um einen Marker, der direkt oder indirekt detektiert werden kann. Für das Binden von negativ geladenen Zielmaterialien wie etwa Nukleinsäure und einige Proteine, liegt der erste pH, bei dem die Bindung stattfindet, unter dem zweiten, bei dem die Zielsubstanz von dem polyfunktionalen Reagens freigesetzt werden kann. Für das Binden von positiv geladenen Zielmaterialien liegt der erste pH typischerweise über dem zweiten, wobei die Zielsubstanz bei dem zweiten pH durch Reduzieren der negativen Ladung auf dem polyfunktionalen Reagens freigesetzt wird.
Typischerweise handelt es sich bei dem polyfunktionalen Reagens um ein wasserlösliches Reagens. Um Zweifel aus dem Weg zu räumen, handelt es sich bei der vorliegenden Erfindung im Allgemeinen bei dem polyfunktionalen Reagens um ein lösliches Reagens, wenn es zu Systemen hinzugefügt wird, doch es wird unlöslich, wenn es an die Zielsubstanz bindet. Zum Beispiel fällen einige der hierin offenbarten Materialien bei Binden an Nukleinsäure aus. Wie oben angezeigt, kann das Element eines spezifischen Bindungspaars des polyfunktionalen Reagens ebenfalls als eine Möglichkeit verwendet werden, vor dem Kontaktieren mit einer Probe, die die Zielsubstanz enthält, das Reagens auf einem Träger zu immobilisieren.
Gemäß einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Kit vor, das ein wie hierin definiertes polyfunktionales Reagens umfasst, optional in Kombination mit einer oder mehr als einer weiteren Komponente. Insbesondere kann das Kit eine Festphase umfassen, auf welcher der Bindungspartner des spezifischen Bindungselements immobilisiert ist. Zum Beispiel können magnetische oder paramagnetische Kügelchen mit Streptavidin beschichtet sein, um an mit Biotin markiertes Poly-Tris als polyfunktionales Reagens zu binden.
Gemäß einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung ein Verfahren vor, das ein lösliches polyfunktionales Reagens wie hierin beschrieben einsetzt, wobei das Verfahren folgendes umfasst:
Kontaktieren einer eine Zielsubstanz enthaltenden Probe mit dem polyfunktionalen Reagens unter solchen Bedingungen, dass die Zielsubstanz an das polyfunktionale Reagens bindet; und
Manipulieren oder Detektieren des Reagens und/oder der gebundenen Zielsubstanz durch Einsetzen des spezifischen Bindungselements des polyfunktionalen Reagens.
Bei bevorzugten Ausführungsformen handelt es sich bei der Zielsubstanz um Nukleinsäure. Bei der vorliegenden Anmeldung schließt Nukleinsäure einzel- oder doppelsträngige DNA, RNA oder Oligonukleotide ein. Sie schließt nicht-genomische Nukleinsäure, wie etwa zelluläre Vektor-DNA oder -RNA, selbstreplizierende Satelliten-Nukleinsäuren oder Plasmid-DNA, und genomische Nukleinsäuren, wie etwa Wirtszellenchromosome und ribosomale RNA, ein. Da Nukleinsäure negativ geladen ist, kann sie durch das Reagens bei einem ersten pH, bei dem der Teil des Reagens, die die Ladung wechseln kann, positiv geladen ist, gebunden und bei einem zweiten, höheren pH, bei dem das Reagens weniger positiv, neutral oder negativ geladen ist, freigesetzt werden. In dem nachfolgenden Abschnitt über Materialien, die ihre Ladung wechseln können, wird dies im weiter im Detail erläutert.
Allerdings kann es sich bei weiteren Ausführungsformen bei der Zielsubstanz um ein Protein, ein Polypeptid, eine Zelle oder eine Komponente einer Zelle, ein Lipid, ein Kohlenhydrat, einen Virus oder einen Mikroorganismus handeln. Die vorliegende Erfindung kann verwendet werden, um negativ geladene Zielsubstanzen, wie etwa Nukleinsäure, einige Polypeptide und Zellen, oder positiv geladene Substanzen, zum Beispiel Polypeptide, wie etwa Histone oder Lysozym oder ein Viruspartikel, von denen einige eine positive Nettoladung aufweisen, zu binden. Zum Beispiel können diese Materialien unter Verwendung von Polyacrylsäure-Polymer gebunden werden, um die Substanz bei einem ungefähr neutralen pH zu binden und dann die Substanz durch Reduzieren des pH, z. B. auf unter pH 4, freizusetzen, um die Ladung des polyfunktionalen Reagens zu reduzieren.
Bevorzugt schließt das Reagens eine Vielzahl von spezifischen Bindungspaarelementen ein, um die Affinität der Wechselwirkung zwischen dem Reagens und jedem beliebigen Bindungspartner zu erhöhen oder um ein Signal von den Markierungsgruppen zu verstärken, um Detektion zu erleichtern.
Bei der vorliegenden Erfindung kann die Verwendung des spezifischen Bindungspaarelements dem Detektieren des Reagens dienen und jedes beliebige gebundene Zielmaterial schließt das direkte oder indirekte Detektieren von Markierungen ein. Die Marker schließen folgendes ein:

(1) Fluoreszente Marker, wie etwa ein Fluorescein-Isothiocyanat, oder Kombinationen von Markern, um Akzeptor-Donator-Systeme (FREI) oder polarisierte Fluoreszenzsysteme bereitzustellen.
(2) Enzym-Marker, die direkt oder indirekt auf ein Substrat wirken, um ein detektierbares Ergebnis zu produzieren, z. B. Meerrettichperoxidase oder alkaline Phosphatase.
(3) Chemilumineszierende Marker wie etwa Luminol.
(4) Radioaktive Marker wie etwa Iod-125.
(5) Kolorimetrische Verbindungen wie etwa Farbstoffe, z. B. Cibacron Blau oder gefärbte Latexpartikel.
(6) Agglutinations-Marker, die Veränderungen bei Lichtstreuung verursachen, z. B. Goldsolen.

Somit sieht die vorliegende Erfindung bei einer Ausführungsform ein Verfahren für das allgemeine Markieren von Zielsubstanzen, und im Speziellen von Nukleinsäure, durch Kontaktieren der Zielsubstanz mit einem polyfunktionalen Reagens, das ein Element eines spezifischen Bindungspaars umfasst, bei dem es sich um einen Marker handelt, sodass das polyfunktionale Reagens an die Zielsubstanz bindet und durch Detektieren des Komplexes aus polyfunktionalem Reagens und Zielsubstanz unter Verwendung des Markers, vor.
Bei der vorliegenden Erfindung wird der Begriff „spezifisches Bindungspaar" verwendet, um ein Paar von Molekülen zu beschreiben, das ein spezifisches Bindungselement (specific binding member, sbm) und einen Bindungspartner (bp) umfasst, die bestimmte Spezifitäten füreinander aufweisen und die sich unter normalen Bedingungen eher aneinander als an weitere Moleküle binden. Die Wechselwirkung des spezifischen Bindungspaars ist typischerweise nicht kovalent. Der Begriff „spezifisches Bindungspaar" kann ebenfalls verwendet werden, wenn entweder eines oder beide der spezifischen Bindungselemente und der Bindungspartner genau den Bindungsteil eines größeren Moleküls umfassen.
Beispiele für ein spezifisches Bindungspaar schließen einen Antikörper und ein Antigen, einen Marker und einen Antikörper, der in der Lage ist, den Marker zu binden, Biotin und Avidin oder Streptavidin, einen Liganden und einen Rezeptor, ein Lektin und ein Kohlenhydrat, ein Enzym und einen Kofaktor oder Substrat, einen Bakteriophagen, der an mikrobielle Zellwände oder eine Komponente davon bindet, Zellen, die mittels Rezeptoren oder Antikörpern oder Lektinen binden, entgegengesetzt geladene ionische Gruppen, Redox-/elektrochemische Gruppen, eine chelatierende Gruppe und ihren Bindungspartner, zwei hydrophobe Substanzen, die in der Lage sind, in einem wässrigen System aneinander zu binden, wie etwa ein Farbstoff, ein Phenyl, aliphatische Ketten, zyklische Dextrane, Fettsäuren, eine in Nukleinsäure interkalierende Gruppe und Nukleinsäure oder ein Nukleinsäuremolekül, das in der Lage ist, an eine komplementäre Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, einschließlich mRNa, polydT, RNA, PNA, Primer, Oligonukleotide und weitere Polynukleotid-Interaktionen, ein.
Bevorzugte spezifische Beispiele für spezifische Bindungspaare schließen Biotin und Avidin, Biotin und Streptavidin, Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) und einen Anti-FITC-Antikörper, einen Anti-Digoxygenin-Antikörper und Digoxygenin, Maltose bindendes Protein und Maltose, Glutathion, das an GST bindet, ein Ethidiumbromid oder in Cy3 interkalierende Gruppe und Nukleinsäure, Ni²⁺-Ion und Polyhystidin (z. B. Hexa-His) und an Zuckerreste bindendes Concanavalin A ein. Im Sigma-Katalog 2000-2001 finden sich auf Seite 1922 Beispiele für spezifische Bindungspaare von Reagenzien.
Das Element eines spezifischen Bindungspaars ermöglicht, dass das Reagens und jedes beliebige gebundene Zielmaterial manipuliert werden können, zum Beispiel durch Trennen der Zielsubstanz von einer Mischung, in der dieselbe mit weiteren Materialien vorhanden ist, indem die Zielsubstanz mit einer Festphase, auf welcher der Bindungspartner des spezifischen Bindungselements immobilisiert wurde, kontaktiert wird, sodass das spezifische Bindungspaar das funktionalisierte Reagens und jede beliebige gebundene Zielsubstanz auf der Festphase bindet, wodurch dieselbe von der Mischung getrennt werden kann.
Zum Beispiel weist ein funktionalisiertes Reagens eine oder mehr als eine Biotin- oder Avidin/Streptavidin-Gruppe auf und kann mit einer Mischung aus Nukleinsäure und weiteren Materialien (z. B. resultierend aus lysierenden Zellen) kontaktiert werden und dann kann die gebundene Nukleinsäure unter Verwendung einer Festphase, auf der ihr Bindungspartner immobilisiert ist, getrennt werden. Nach dem Binden kann die Nukleinsäure durch Ändern des pH in Lösung freigesetzt werden (z. B. in PCR oder Lagerpuffer). Alternativ kann die Festphase mit der Zielsubstanz direkt zu einer Reaktionsmischung hinzugefügt werden, z. B. kann DNA auf einem Kügelchen direkt zu einer PCR-Reaktion hinzugefügt werden.
Gemäß einer alternativen bevorzugten Ausführungsform umfasst das polyfunktionale Reagens einen detektierbaren Marker, bei dem es sich ebenfalls um ein spezifisches Bindungselement handelt, das in der Lage ist, an einen auf einer Festphase immobilisierten Bindungspartner zu binden. Ein illustratives Beispiel dafür wird in Beispiel 1 geliefert, wobei es sich bei dem polyfunktionalen Reagens um mit FITC markiertes Poly-Tris handelt, da die Isothiocyanatgruppen von dem FITC gegenüber Hydroxylgruppen des Poly-Tris reaktionsfähig sind. Dieses Reagens ist in der Lage, an auf einer Festphase immobilisierte Anti-Fluorescein-Antikörper zu binden.
Bei weiteren Ausführungsformen können polyfunktionale Reagenzien, die eine oder mehr als eine Tagging-Gruppe aufweisen, bei der/denen es sich um Marker und Elemente eines spezifischen Bindungspaars handelt, als Trennungs-Tags eingesetzt werden, z. B. unter Verwendung einer Festphase wie etwa einem Kügelchen, auf dem der Bindungspartner immobilisiert ist. Zum Beispiel konnte ein System, das eine Tagging-Gruppe, bei der es sich um einen fluoreszenten Marker handelt (z. B. FITC), einsetzt, in Verbindung mit Kügelchen, auf denen Anti-Marker-Antikörper gebunden wurde, verwendet werden, um Nukleinsäure, die an das polyfunktionale Reagens bindet, mittels einer herkömmlichen Durchflusszytometrie (FACS-Maschine, Fluorescent Activated Cell Sorter) zu trennen.
Bei Ausführungsformen der Erfindung, bei denen eine Festphase eingesetzt wird, z. B. um das polyfunktionale Reagens einzufangen, kann es sich bei der Festphase um ein magnetisierbares Material, ein Röhrchen, einen Well, eine Spitze, eine Sonde, eine Pipette, eine Membran, einen Filter, ein Kügelchen, ein Partikel, ein Blech, einen Objektträger, einen Zapfen handeln. Die Festphase kann aus Glas, Silica, Kunststoff, einem Mineral, einem Kohlenhydrat, Papier oder einem Naturprodukt wie etwa Cellulose und Kombinationen davon gebildet sein.
Bevorzugt handelt es sich bei dem Teil des polyfunktionalen Reagens, der in der Lage ist, die Zielsubstanz zu binden, um ein Polymer, obwohl dies die Verwendung von dimeren oder oligomeren Reagenzien einschließen kann. Beispiele für geeignete Polymere werden nachfolgend erläutert und schließen Reagenzien ein, bei denen es sich um ein polyhydroxyliertes Amin, einen polymerisierten biologischen Puffer oder eine polymerisierte Aminosäure handelt. Bevorzugte Beispiele für diese Arten von Reagenzien schließen Poly-Bis-Tris oder Poly-Tris, Polyhistidin oder polyhydroxylierte Amine, die aliphatisch, zyklisch oder verzweigt sind, oder Chitosane oder Thriethanolamine ein.
Weitere bevorzugte Arten von polymeren polyfunktionalen Reagenzien umfassen ein Polymer gemischter Ladung, das heißt, eine Aminogruppe, die von COOH-Gruppen umgeben ist und den passenden pK-Wert liefert, Polyamin-Verbindungen wie etwa ein Polyethylenimin (PEI), ein Poly-DEAE oder eine polyquaternäre Stickstoffgruppe, polyheterozyklische oder polyaromatische Verbindungen wie etwa Polyimidazol oder Polypyridin.
Basierend auf der Lehre dieser Anmeldung, den Anmeldungen, auf die hierin Bezug genommen wird (im Speziellen WO 99/29703 und WO 02/48164 ), und ihrer allgemeinen Kenntnis was den Stand der Technik betrifft, können Fachmänner diese Materialien herstellen.
Zum Beispiel können in einer Polymerisationsreaktion, die einen Schritt umfasst, Monomere vernetzt werden, z. B. vernetztes Bis-Tris, oder durch Additionsreaktionen wie etwa Polymerisation von Vinyl-Monomeren mit geeigneten funktionalen Gruppen, die in der Polymerisation, die einen Schritt umfasst, eingeschlossen sind, oder später hinzugefügt werden, gebildet werden.
Alternativ kann eine Polymerisationsreaktion, die 2 oder mehr als 2 Schritte umfasst, verwendet werden, wobei ein Backbone-Polymer gebildet wird, woraufhin das Hinzufügen einer Seitengruppe (von Seitengruppen), z. B. ein Backbone von Polyacrylsäure, Polyacrylamin, Polyvinylalkohol, Dextran, Polyamid, an die Bis-Tris oder Poly-Bis-Tris-Gruppen als die Seitengruppe gebunden ist, folgt.
Zusätzlich kann die weitere funktionale Gruppe gleichzeitig oder nach Hinzufügen zu der ersten Gruppe hinzugefügt werden, wie dies in dem untenstehenden Beispiel beschrieben wird:
Als Beispiel und nicht einschränkend werden nun die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung unter Bezugnahme auf die begleitenden Figuren weiter im Detail beschrieben werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
1 zeigt ein Gel, dass ein Konjugat aus Poly-Tris und FITC als polyfunktionales Reagens verwendet werden kann, um spezifisch an Nukleinsäure zu binden.
Detaillierte Beschreibung
In WO 99/29703 und WO 02/48164 werden Materialien, die ihre Ladung wechseln können, beschrieben und einige dieser Materialien, insbesondere die wasserlöslichen Polymere und biologischen Puffer, können angepasst werden, sodass sie Tagging-Gruppen einschließen und gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können. Materialien, die ihre Ladung wechseln können, können für das Binden von in einer Probe vorhandener Nukleinsäure verwendet werden, indem die Probe mit dem Material, das die Ladung wechseln kann, bei einem ersten pH, bei dem das Material, das die Ladung ändern kann, eine positive Ladung aufweist, kontaktiert und negativ geladene Nukleinsäure gebunden wird und dann die Nukleinsäure bei einem zweiten, höheren pH, bei dem das Material, das die Ladung ändern kann, eine neutrale, negative oder weniger positive Ladung als bei dem ersten pH aufweist, freigesetzt wird. Bei alternativen Ausführungsformen können ebenfalls Materialien, die ihre Ladung wechseln können, verwendet werden, um positiv geladene Zielsubstanzen zu binden, wobei sie in diesem Fall bei einem ersten pH gebunden werden und die Substanzen bei einem zweiten, niedrigeren pH, bei dem das Material, das die Ladung ändern kann, neutral, positiv oder weniger negativ als bei dem ersten pH ist, freigesetzt werden.
Im Allgemeinen weist das Material, das die Ladung ändern kann, eine positive Gesamtladung auf; das bedeutet, die Summe aller positiven und negativen Ladungen auf dem Material, das die Ladung ändern kann, als Ganzes ist positiv. Allerdings ist es möglich (obgleich nicht bevorzugt), dass das Material, das die Ladung wechseln kann, als Ganzes negativ geladen sein kann, jedoch Bereiche mit vorwiegend positiver Ladung aufweist, an welche die Nukleinsäure binden kann. Die Änderung der Ladung des Materials wird hierin als „Ladungswechsel" bezeichnet und durch die Verwendung eines „Materials, das die Ladung wechseln kann" vorgenommen. Das Material, das die Ladung wechseln kann, umfasst eine ionisierbare Gruppe, welche die Ladung in Abhängigkeit der Umgebungsbedingungen ändert. Das Material, das die Ladung wechseln kann, wird so ausgewählt, dass der pK_S der ionisierbaren Gruppe den Bedingungen, bei denen gewünscht wird, dass an die Nukleinsäure gebunden und Nukleinsäure von dem Material, das die Ladung wechseln kann, freigesetzt wird, entspricht. Im Allgemeinen wird Nukleinsäure an das Material, das die Ladung wechseln kann, bei einem pH unterhalb des pK_S oder einem in etwa dem pK_S entsprechendem pH gebunden, wenn das Material, das die Ladung wechseln kann, positiv geladen ist, und sie wird bei einem höheren pH (normalerweise oberhalb des pK_S) freigesetzt, wenn das Material, das die Ladung wechseln kann, weniger positiv, neutral oder negativ geladen ist.
Gleichermaßen bezeichnet die vorliegende Erfindung unter Bezugnahme auf positiv und negativ geladene Zielsubstanzen üblicherweise die gesamte Nettoladung der Zielsubstanz, obwohl unter manchen Voraussetzungen eine Zielsubstanz Bereiche mit zu der Nettoladung entgegengesetzter Ladung aufweisen kann, die durch ein geeignetes polyfunktionales Reagens gebunden werden können.
Die vorliegende Erfindung richtet sich insbesondere auf die Verwendung von Materialien, die ihre Ladung wechseln können, wodurch ermöglicht wird, dass das Binden und/oder das Freisetzen (im Speziellen das Freisetzen) der Nukleinsäure unter milden Bedingungen bezüglich Temperatur und/oder pH und/oder Ionenstärke ablaufen können/kann.
Im Allgemeinen ändert das Material, das die Ladung wechseln kann, aufgrund einer Änderung der Ladung auf einer positiv ionisierbaren Gruppe von positiv zu weniger positiv oder neutral die Ladung, während der pH in einem Bereich, der den pK_S der positiv ionisierbaren Gruppe umspannt oder nahe bei demselben liegt, ansteigt. Dies kann ebenfalls mit einer Ladungsänderung auf einer negativ ionisierbaren Gruppe von neutral oder weniger negativ zu negativer kombiniert werden.
Das Material, das die Ladung wechseln kann, kann eine ionisierbare Gruppe, die einen pK_S von zwischen ungefähr 3 und 9 aufweist, umfassen. Bei positiv ionisierbaren Gruppen beträgt der pK_S bevorzugter zumindest ungefähr 4,5; 5,0; 5,5; 6,0 oder 6,5 und/oder höchstens ungefähr 8,5; 8,0; 7,5 oder 7,0. Ein insbesondere bevorzugter pK_S für eine positiv ionisierbare Gruppe liegt zwischen ungefähr 5 und 8; sogar noch bevorzugter sogar ist ein pK_S zwischen ungefähr 6,0 und 7,0, bevorzugter zwischen ungefähr 6,5 und 7,0. Der pK_S für negativ ionisierbare Gruppen liegt bevorzugt zwischen ungefähr 3 (3,0) und 7 (7,0), noch bevorzugter zwischen ungefähr 4 und 6, weiter bevorzugter ungefähr bei dem pH, bei dem das Binden der Nukleinsäure wünschenswert ist.
Materialien, die mehr als einen pK_S-Wert aufweisen (z. B. jene, die unterschiedliche ionisierbare Gruppen aufweisen), oder Kombinationen von Materialien, die unterschiedliche pK_S-Werte aufweisen, können sich ebenfalls für die Verwendung als Materialien, die die Ladung wechseln können, gemäß der Erfindung eignen, vorausgesetzt, dass das Material/die Materialien bei einem ersten (niedrigeren) pH eine positive Ladung aufweist/aufweisen und dass die Ladung bei einem höheren pH weniger positiv, neutral oder negativ ist.
Im Allgemeinen kann ein Ladungswechsel erreicht werden, indem der pH von einem Wert unterhalb des pK_S der oder einer ionisierbaren Gruppe auf einen Wert oberhalb desselben pK_S verändert wird. Allerdings wird begrüßt, dass, wenn der pH und der pK_S-Wert einer bestimmten ionisierbaren Gruppe identisch sind, 50 % der einzelnen, ionisierbaren Gruppen geladen und 50 % neutral sind. Dadurch kann die Wirkung des Ladungswechsels ebenfalls durch Ändern des pH in einem Bereich, der nahe bei dem pK_S einer ionisierbaren Gruppe liegt, ihn jedoch nicht umspannt, erzielt werden. Zum Beispiel sind bei dem pK_S einer negativ ionisierbaren Gruppe, wie etwa einer Carboxylgruppe (pK_S typischerweise ungefähr 4), 50 % solcher Gruppen in der ionisierten Form (z. B. COO^–) und 50 % in der neutralen Form (z. B. COOH) vorhanden. Steigt der pH an, liegt ein zunehmender Anteil der Gruppen in der negativen Form vor.
Bevorzugt wird der Schritt des Bindens bei einem pH unterhalb des pK_S der ionisierbaren Gruppe oder (obgleich dies nicht bevorzugt wird) bei einem pH, der ungefähr eine pH-Einheit oberhalb des pK_S liegt, durchgeführt. Im Allgemeinen wird der Schritt des Freisetzens bei einem pH oberhalb des pK_S der ionisierbaren Gruppe, bevorzugt bei einem pH, der zwischen 1 und 3 pH-Einheiten oberhalb des pK_S liegt, durchgeführt.
Die Verwendung starker Basen oder schwacher Basen in Kombination mit Erhitzen, wiederum wie in EP 0 707 077 A , kann ebenfalls zum Abbauen von RNA (im Speziellen bei pH-Werten von 10 oder mehr) und zu Denaturieren von doppelsträngiger DNA führen (d. h. irreversible, zumindest teilweise Umwandlung von DNA von der doppelsträngigen Form in die einzelsträngige Form), was zu einem Mangel an spezifischer Bindung bei PCR führen kann.
Im Gegensatz zum Stand der Technik, ermöglicht die geeignete Auswahl von pK_S- Wert(en) gemäß der Erfindung, dass der Schritt des Freisetzens von DNA von der Festphase unter milden Bedingungen durchgeführt werden kann. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff „milde Bedingungen" im Allgemeinen Bedingungen, bei denen Nukleinsäure nicht denaturiert und/oder abgebaut und/oder depuriniert wird, und/oder Bedingungen, die im Wesentlichen physiologisch sind.
Bevorzugt wird der Schritt des Freisetzens bei einem pH von nicht größer als ungefähr pH 10,5, bevorzugter nicht größer als ungefähr pH 10,0; 9,8; 9,6; 9,4; 9,2; 9,0; 8,9; 8,8; 8,7; 8,6 oder 8,5 durchgeführt. Abhängig von dem/den pK_S(s) des Materials, das die Ladung wechseln kann, kann der Schritt des Freisetzens sogar bei niedrigeren pH-Werten wie etwa 8,0; 7,5 oder 7,0 durchgeführt werden. Bevorzugt wird der Schritt des Freisetzens bei substantiellem Fehlen von NaOH durchgeführt, bevorzugt ebenfalls bei substantiellem Fehlen weiterer Alkalimetallhydroxide, bevorzugter bei substantiellem Fehlen starker, mineralischer Basen. Substantielles Fehlen kann bedeuten, dass die Konzentration weniger als 25 mM beträgt, bevorzugt weniger als 20 mM, bevorzugter weniger als 15 mM oder 10 mM.
Die gewünschte Änderung des pH kann erreicht werden, indem die Ionenstärke der Lösung und/oder die Temperatur abgeändert werden/wird, da der pH von diesen beiden Faktoren abhängt. Allerdings sind weder hohe Temperatur noch hohe Ionenstärke im Allgemeinen mit den gewünschten, milden Bedingungen kompatibel und dementsprechend wird die Änderung des pH bevorzugt nicht durch starke Veränderungen der Ionenstärke oder der Temperatur erreicht. Darüber hinaus steigert zunehmende Ionenstärke die Konkurrenz zwischen geladenen Spezies und der Nukleinsäure, wenn es darum geht, an das Material, das die Ladung wechseln kann, zu binden, wodurch das Freisetzen der Nukleinsäure unterstützt werden kann. Daher sind geringfügige Änderungen der Ionenstärke akzeptabel und können in Verbindung mit der Änderung des pH verwendet werden, um die Nukleinsäure freizusetzen, bevorzugt innerhalb der oben angeführten Begrenzungen und Bereiche.
Bevorzugt beträgt die Temperatur, bei der der Schritt des Freisetzens durchgeführt wird, nicht mehr als ungefähr 70 °C, bevorzugter nicht mehr als ungefähr 65 °C, 60 °C, 55 °C, 50 °C, 45 °C oder 40 °C. Bevorzugter werden solche Temperaturen während des gesamten Prozesses angewandt. Der Schritt des Freisetzens oder der gesamte Prozess können sogar bei niedrigeren Temperaturen, wie etwa 35 °C, 30 °C oder 25 °C, durchgeführt werden.
Des Weiteren läuft der Schritt des Freisetzens bevorzugt unter Bedingungen mit geringer Ionenstärke ab, entsprechend weniger als 1 M oder 500 mM, bevorzugt weniger als 400 mM, 300 mM, 200 mM, 100 mM, 75 mM, 50 mM, 40 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM oder 15 mM. Sie kann sogar unter 10 mM liegen. Die Ionenstärke kann bei zumindest ungefähr 5 mM liegen, bevorzugter bei zumindest ungefähr 10 mM. Bevorzugter werden diese Ionenstärken ebenfalls bei dem Schritt des Bindens angewandt.
PCR ist auf pH und das Vorhandensein von geladenen Kontaminanten sensitiv. Bei insbesondere bevorzugten Ausführungsformen wird der Schritt des Freisetzens unter Verwendung von Reagenzien, die für das Lagern von Nukleinsäure geeignet sind (wie etwa ein im Handel erhältlicher Lagerpuffer, z. B. 10 mM Tris HCl, pH 8,0–8,5, optional bei Vorhandensein von 1 mM EDTA) oder unter Verwendung von Reagenzien, die für die Verwendung in einem Vorgang, dem die Nukleinsäure ausgesetzt werden soll, geeignet sind (wie etwa ein PCR-Puffer, z. B. 10 mM Tris HCl, 50 mM KCl, pH 8,5), durchgeführt.
Herkömmliche, bisher bekannte Vorgänge für das Extrahieren von Nukleinsäure erfordern einen Schritt des Verdünnens des Nukleinsäure enthaltenden Elutionsprodukts, um die Lösung z. B. für PCR geeignet zu machen. Bevorzugt verhindert die vorliegende Erfindung im Wesentlichen das Verdünnen der freigesetzten Nukleinsäure.
Bevorzugt läuft der Schritt des Bindens von DNA unter milden Bedingungen ab, entsprechend bei einem pH von nicht weniger als 3,0, bevorzugt von nicht weniger als 3,5; 4,0; 4,5 oder 5,0. Bei bisherigen Verfahren wurden hohe Konzentrationen an chaotropen Mitteln, wie etwa 8 M Guanidin, verwendet. Solche Bedingungen können bei der praktischen Umsetzung der vorliegenden Erfindung nicht notwendig sein, wobei der Schritt des Bindens bevorzugt in Lösung, die eine Gesamtkonzentration von 1 M oder weniger aufweist, abläuft. Bevorzugtere Temperaturen und Ionenstärken entsprechen jenen, die für den Schritt des Freisetzens oben detailliert angeführt wurden.
Die Verwendung solcher milder Bedingungen für das Freisetzen von Nukleinsäure ist im Speziellen für das Extrahieren kleiner Mengen an Nukleinsäure zweckmäßig, da die extrahierte DNA oder RNA ohne weitere Schritte des Reinigens (z. B. Schritte, die durch die Verwendung hoher Ionenkonzentrationen bei Verfahren im Stand der Technik erforderlich werden) und ohne die Notwendigkeit, hohe Ionenstärken zu verdünnen (wie dies bei Verfahren im Stand der Technik der Fall ist, bei denen hohe Ionenstärke verwendet wird, um die Nukleinsäure zu eluieren) direkt zu einem Reaktions- oder Lagerröhrchen hinzugefügt werden kann. Daher können Verlust von Nukleinsäure beim Wechseln des Behälters, mangelhafte Ausbeute bei den Schritten des Reinigens, Abbauen oder Denaturieren und Verdünnen kleiner Mengen von Nukleinsäure vermieden werden. Dies ist insbesondere dann von Vorteil, wenn eine Nukleinsäure von Interesse in einer Probe bei einer geringen Anzahl von Kopien vorhanden ist (oder wenn ihr Vorhandensein vermutet wird), wie etwa in gewissen Verfahren für das Detektieren und/oder Amplifizieren.
Allgemein gesprochen umfassen für die Verwendung als Materialien, die ihre Ladung wechseln können, gemäß der Erfindung bevorzugte chemische Spezies ein positiv ionisierbares Stickstoffatom und zumindest eine, bevorzugt jedoch mehr als eine, elektronegative Gruppe (wie etwa eine Hydroxyl-, Carboxyl-, Carbonyl-, Phosphat- oder Sulfonsäuregruppe) oder eine Doppelbindung (z. B. Doppelbindung C=C), die dem Stickstoffatom ausreichend nahe liegt, um seinen pK_S zu reduzieren. Es wurde gefunden, dass solche Moleküle dazu tendieren, für das Extrahieren von Nukleinsäure unter milden Bedingungen gemäß der vorliegenden Erfindung geeignete pK_S-Werte aufzuweisen. Bevorzugt zumindest eine (bevorzugter jedoch mehr als eine) elektronegative Gruppe wird von dem ionisierbaren Stickstoff durch nicht mehr als zwei Atome (üblicherweise Kohlenstoffatome) getrennt. Hydroxylgruppen sind insbesondere bevorzugte elektronegative Gruppen (insbesondere, wenn mehrere Hydroxylgruppen vorhanden sind, z. B. in Polyhydroxylaminen, wie etwa Tris (C(CH₂OH)₃-NH₂) oder Bis-Tris (siehe unten)), da sie (1) den pK_S des Stickstoffatoms (z. B. Aminogruppe, z. B. von ungefähr 10 oder 11) auf einen geeigneten Wert von ungefähr neutral (d. h. pK_S von ungefähr 7) reduzieren, (2) den Spezies ermöglichen, oberhalb des pK_S löslich/hydrophob zu bleiben, wenn das Stickstoffatom der Aminogruppe seine positive Ladung verliert, (3) eine Stelle für kovalentes Binden an eine Tagging-Gruppe und/oder feste Substrate, z. B. ein polycarboxyliertes Polymer (wie etwa Polyacrylsäure), bereitstellen, und (4) bei pH-Werten, die für den Schritt des Freisetzens geeignet sind und bei denen Vorgänge wie etwa PCR durchgeführt werden (typischerweise pH 8,5) keine Ladung aufweisen; das Vorhandensein von geladenen Spezies kann im Speziellen mit PCR zu Wechselwirkungen führen. Im Speziellen bevorzugt sind chemische Spezies, die ein ionisierbares Stickstoffatom und zumindest 2, 3, 4, 5 oder 6 Hydroxylgruppen aufweisen. Bei weiteren Beispielen für polyhydroxylierte Amine handelt es sich um Dialkoholamin-Reagenzien, wie etwa Diethanolamin. Bei einer Ausführungsform können Silan-Reagenzien, die auf diesen Verbindungen basieren, verwendet werden, um [HO-(CH₂)_n]₂-N-(CH₂)_m-Gruppen an Tagging-Gruppen zu binden, wobei n und m ausgewählt werden aus 1 bis 10.
Bei einigen standardmäßigen, schwach basischen Puffern handelt es sich um ideale chemische Spezies, um die ionisierbaren Gruppen von Materialien, die ihre Ladung wechseln können, bereitzustellen, da sie pK_S-Werte aufweisen, die nahe bei neutral liegen (d. h. 7).
Die polyfunktionalen Reagenzien der vorliegenden Erfindung können wie hierin offenbart unter Verwendung der Wechselwirkung eines spezifischen Bindungspaars auf einer Festphase eingefangen werden. Ein Element des spezifischen Bindungspaars wird als die Tagging-Gruppe des polyfunktionalen Reagens bereitgestellt und sein Bindungspartner kann auf einer Festphase immobilisiert werden, sodass die Festphase dann in der Lage ist, an das polyfunktionale Reagens zu binden. Festphasen, die auf diese Art und Weise abgeleitet werden können, schließen Kügelchen, Partikel, Röhrchen, Wells, Sonden, Pegelstäbe, Pipettenspitzen, Objektträger, Membranen, Papiere, Cellulosen, Agarosen, Glas oder Kunststoffe in einer monomeren oder polymeren Form durch Adsorption, ionische oder kovalente Wechselwirkungen oder durch kovalentes Binden des Bindungspartners an einen Polymer-Backbone, der wiederum auf dem festen Träger immobilisiert ist, ein.
Festphasenmaterialien, im Speziellen Kügelchen und Partikel, können magnetisierbar, magnetisch oder paramagnetisch sein. Dies kann das Entfernen der Festphase aus einer Lösung, welche die freigesetzte Nukleinsäure enthält, unterstützen, ehe die Nukleinsäure weiter verarbeitet oder gelagert wird.
Bevorzugt handelt es sich bei den schwach basischen Puffern um biologische Puffer, d. h. Puffer aus der Kategorie der üblicherweise in Lösungen von biologischen Puffern verwendeten Puffer. Beispiele für biologische Puffer finden sich in Katalogen für im Handel erhältliche Chemikalien, wie etwa dem Sigma-Katalog.
Laugung (d. h. Übergang von der Festphase in Lösung in der flüssigen Phase) chemischer Spezies, die verwendet werden, um ionisierbare Gruppen in Ionenaustauschharzen bereitzustellen, ist gewissermaßen tatsächlich ein in gewissem Ausmaß unvermeidbares Phänomen, im Speziellen, wenn die Spezies durch die Wechselwirkung des spezifischen Bindungspaars auf der Festphase immobilisiert werden. Solche Laugung führt in dem resultierenden Produkt typischerweise zu Verunreinigung, was zu signifikanten Problemen führen kann, insbesondere wenn das resultierende Produkt bei PCR verwendet werden soll (und im Speziellen, wenn es sich bei den Spezies um geladene Spezies handelt). Die Verwendung von biologischen Puffern für das Bereitstellen von ionisierbaren Gruppen in Materialien, die ihre Ladung wechseln können, kann dieses Problem vermeiden, da Laugung solcher Puffer in die flüssige Phase im Allgemeinen weder auf die Nukleinsäure noch auf beliebige stromabwärts ablaufenden Prozesse, wie etwa PCR, denen sie ausgesetzt werden kann, signifikanten Einfluss nimmt. Nichtsdestotrotz werden einige biologische Puffer routinemäßig als PCR-Puffer, Lagerpuffer und weitere Pufferlösungen verwendet.
In einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform läuft der Schritt des Freisetzens in einer Pufferlösung ab, die denselben biologischen Puffer wie jener Puffer, der in, als oder auf dem Bereich des polyfunktionalen Reagens, der die Ladung wechseln kann, verwendet wird, enthält.
Beispiele für gemäß der Erfindung geeignete biologische Puffer für die Verwendung in Materialien, die ihre Ladung wechseln können, und ihre pK_S-Werte lauten wie folgt:
N-(2-Acetamido)-2-aminoethansulfonsäure ‡‡ (ACES), pK_S 6,8;
N-(2-Acetamido)-2-iminodiessigsäure ‡‡ (ADA), pK_S 6,6;
Aminomethylpropandiol ‡ (AMP), pK_S 8,8;
3-(1‚1-Dimethyl-2-hydroxyethyl)-amino-2-hydroxypropansulfonsäure ‡ (AMPSO), pK_S 9,0;
N,N-Bis-(2-hydroxyethyl)-2-amino-ethansulfonsäure ‡‡ (RES), pK_S 7,1;
N,N-Bis-(2-hydroxyethyl)-glycin ‡ (BICIN), pK_S 8,3;
Bis-(2-hydroxyethyl)imino-tris(hydroxymethyl)methan ‡‡ (Bis-Tris), pK_S 6,5;
1,3-Bis(tris(hydroxymethyl)-methylaminopropan) ‡‡ (BIS-IRIS-Propan), pK_S 6,8 ;
4-(Cyclohexylamino)-1-butansulfonsäure (CARS), pK_S 10,7;
3-(Cyclohexylamino)-1-propansulfonsäure (CAPS), pK_S 10,4;
3-Cyclohexylamino-2-hydroxy-1-propansulfonsäure (CAPSO), pK_S 9,6;
2-N-(Cyclohexylamino)-ethansulfonsäure (CHES) pK_S 9,6;
3-(N,N-Bis-2-hydroxyethylamino)-2-hydroxypropansulfonsäure †† (DIPSO), pK_S 7.6;
N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N'-3-propansulfonsäure †† (EPPS oder HEPPS), pK_S 8,0;
N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N'-4-butansulfonsäure † (HEPBS), pK_S 8,3;
N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N'-2-ethansulfonsäure †† (HEPES), pK_S 7,5;
N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N'-2-propansulfonsäure †† (HEPPSO), pK_S 7,8;
2-(N-Morpholino)-ethansulfonsäure ‡ (MES), pK_S 6,1;
4-(N-Morpholino)-butansulfonsäure †† (MOBS), pK_S 7,6;
3-(N-Morpholino)-propansulfonsäure †† (MOPS), pK_S 7,2;
3-(N-Morpholino)-2-hydroxypropansulfonsäure ‡‡ (MOPSO), pK_S 6,9;
Piperazin-N,N'-bis-(2-ethansulfonsäure) ‡‡ (PIPES), pK_S 6,8;
Piperazin-N,N'-bis-(2-Hydroxypropansulfonsäure) †† (POPSO), pK_S 7,8;
N-[Tris-(hydroxymethyl)-methyl]-4-aminobutansulfonsäure † (TABS), pK_S 8,9;
N-[Tris-(hydroxymethyl)-methyl]-3-aminopropansulfonsäure †† (TAPS), pK_S 8,4;
3-[N-Tris-(hydroxymethyl)-methylamino]-2-hydroxypropansulfonsäure †† (TAPSO), pK_S 7,4;
N-[Tris-(hydroxymethyl)-methyl]-2-aminoethansulfonsäure †† (TES), pK_S 7,4;
N-[Tris-(hydroxymethyl)]-methylglycin † (TRICINE), pK_S 8,1 und
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan †(IRIS), pK_S 8,1;
Histidin*, pK_S 6,0, und Polyhistidin ‡‡;
Imidazol*, pK_S 6,9, und Derivate* davon (d. h. Imidazole), im Speziellen Derivate, die
Hydroxylgruppen** enthalten;
Triethanolamindimere**, Oligomere** und Polymere**; und
Di/Tri/Oligoaminosäuren**, zum Beispiel Gly-Gly, pK_S 8,2; und Ser-Ser, Gly-Gly-Gly und Ser-Gly, wobei die drei letztgenannten pK_S-Werte in dem Bereich von 7–9 aufweisen.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die obenstehend mit einem Asterisk (*) gekennzeichneten Puffer nicht als biologische Puffer für den Zweck der Erfindung angesehen (unabhängig davon, ob sie in einem beliebigen Katalog für Chemikalien als solche bezeichnet werden oder nicht). Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden die mit zwei Asterisken (**) gekennzeichneten Puffer ebenfalls nicht als biologische Puffer angesehen. Bevorzugte biologische Puffer werden mit einem Kreuz (†), bevorzugtere Puffer mit zwei Kreuzen (††), noch bevorzugtere Puffer mit einem Doppelkreuz (‡) und am meisten bevorzugte Puffer mit zwei Doppelkreuzen (‡‡) gekennzeichnet.
Diese und weitere chemische Spezies, die ionisierbare Gruppen umfassen, werden typischerweise als Polymere, bevorzugt nach Polymerisation durch Kondensation, eingesetzt.
Biologische Puffer und weitere chemische Spezies, die positiv ionisierbare Gruppen umfassen, können in Verbindung mit einer chemischen Spezies, die eine negativ ionisierbare Gruppe, die einen geeigneten pK_S aufweist, bevorzugt in den oben beschriebenen Bereichen, enthält, verwendet werden. Zum Beispiel ein biologischer Puffer (der ein oder mehr als ein positiv ionisierbares Stickstoffatom aufweist) kann an ein Polymer oder weiteres Festphasenmaterial, das sogar nach der Bindung des biologischen Puffers Carboxylgruppen aufwies, gebunden werden. Ein solches Material kann bei einem niedrigen pH Nukleinsäuren binden, wenn einige der Carboxylgruppen negativ (d. h. einige liegen in der COO-Form vor, wobei die meisten in der COOH-Form vorliegen) und die meisten der ionisierbaren Stickstoffatome positiv geladen sind. Bei höherem pH ist die negative Ladung stärker (d. h. ein größerer Anteil der Carboxylgruppen liegt in der COO-Form vor) und/oder die positive Ladung ist schwächer und die Nukleinsäure wird von der Festphase abgestoßen.
Chemische Spezies, die ionisierbare Gruppen enthalten (wie etwa die oben aufgelisteten biologischen Puffer), können unter Verwendung bekannter chemischer Verfahren an ein Polymer-Backbone gebunden werden. Zum Beispiel kann eine chemische Spezies, die eine Hydroxylgruppe enthält, unter Verwendung von Carbodiimid-Verfahren an carboxylierte Polymer-Backbones gebunden werden. Unter Verwendung weiterer Polymer-Backbones (z. B. basierend auf Polyethylenglycol (PEG) oder Kohlenhydrat) kann der Fachmann in der Technik weitere chemische Verfahren einsetzen, wobei eine Palette standardmäßiger chemischer Kopplungsverfahren verwendet wird (siehe z. B. Immobilised Affinity Ligand Techniques, Greg T. Hermanson, A. Krishna Mallia und Paul K. Smith, Academic Press, Inc., San Diego, CA, 1992, ISBN 0123423309, das durch Bezugnahme hierin in seiner Vollständigkeit inkorporiert ist).
Alternativ können die chemischen Spezies, die ionisierbare Gruppen enthalten, ohne einen Polymer-Backbone polymerisiert werden, indem Vernetzungsmittel, zum Beispiel Reagenzien, die mittels einer Hydroxylgruppe koppeln (z. B. Carbonyldiimidazol, Butandioldiglycidylether, Dialdehyde, Diisothiocyanate) verwendet werden. Polymere können ebenfalls durch einfache chemische Kondensationsverfahren für das Erzeugen polymerer Aminosäuren mit geeignetem pK_S gebildet werden, z. B. Gly-Gly.
Bevorzugt nehmen solches Immobilisieren, Binden und/oder Polymerisieren der chemischen Spezies, welche die ionisierbare Gruppe enthalten, keinen Einfluss auf den pK_S der ionisierbaren Gruppe oder derselbe verbleibt in den oben angeführten gewünschten Bereichen. Im Allgemeinen wird zum Beispiel bevorzugt, dass die chemischen Spezies mittels eines positiv ionisierbaren Stickstoffatoms nicht gekoppelt oder polymerisiert werden (zum Beispiel im Gegensatz zu WO 97/2982 ). Bei der praktischen Umsetzung der Erfindung wird im Speziellen bevorzugt, dass die chemischen Spezies mittels einer Hydroxylgruppe immobilisiert, gebunden und/oder polymerisiert werden.
Bei einem bevorzugten polymeren Material handelt es sich um ein Dimer oder ein Oligomer von Bis-Tris oder Tris oder ein Material, das durch Binden einer Vielzahl von Bis-Tris oder Tris-Molekülen an einen Polyacrylsäure-Backbone gebildet wird, z. B. durch Reagieren von Bis-Tris- oder Tris-Monomer mit Polyacrylsäure unter Verwendung von 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC). Das Polymer kann dann unter Verwendung von Dialyse gegen ein geeignetes Reagens oder Wasser mühelos von den Reaktionspartnern getrennt werden. Bevorzugt weist die Polyacrylsäure ein Molekulargewicht von zwischen ungefähr 500 und 5 Millionen oder mehr auf. Bevorzugter weist sie ein Molekulargewicht von zwischen 100 000 und 500 000 auf.
Die Natur der resultierenden Bis-Tris- oder Tris/Polyacrylsäuremoleküle hängt von dem Verhältnis der gekoppelten Komponenten ab, da das Polymer abhängig von dem Anteil der mit Bis-Tris oder Tris modifizierten Acrylsäuregruppen unterschiedliche Eigenschaften aufweist, zum Beispiel ist es bei manchen Carboxylgruppen wünschenswert, dass sie unmodifiziert bleiben, da durch das Vorhandensein derselben nicht verhindert werden kann, dass Bis-Tris oder Tris Nukleinsäure bei niedrigem pH bindet (im Speziellen, wenn Bis-Tris oder Tris in einem Überschuss vorkommt), allerdings unterstützen die negativen Ladungen derselben bei höheren pHs das Freisetzen der Nukleinsäure. Für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung liegt das molare Verhältnis von Bis-Tris oder Tris:Carboxylgruppen (vor der Bindung) bevorzugt zwischen 5:1 und 1:5, bevorzugter zwischen 3:1 und 1:3, noch bevorzugter zwischen 2:1 und 1:2, noch weiter bevorzugt zwischen 1,5:1 und 1:1,5 und am bevorzugtesten bei ungefähr 1:1.
Das Vorhandensein von hoher Restladung (d. h. geladene Spezies, die gemeinsam mit der extrahierten Nukleinsäure in Lösung enthalten sind) kann die Analyse von Nukleinsäuren durch PCR nachteilig beeinflussen oder das Binden von Primern, dNTPs oder Polymerase an die Nukleinsäure oder an die Sequestrierung von Mg² ⁺-Ionen, die bei PCR von essentieller Bedeutung sind, stören. Es ist insbesondere bevorzugt, positive Restladung zu vermeiden.
Bevorzugte Materialien für die erfindungsgemäße Verwendung, wie etwa die oben beschriebenen biologischen Puffer, besitzen bei dem pH, bei dem die Nukleinsäure freigesetzt wird, und/oder bei pHs von 8–8,5 minimale positive Restladung (bevorzugt minimale Restladung), was das Stören oder Hemmen von stromabwärts ablaufenden Prozessen unwahrscheinlich macht.
Weitere Beispiele für Moleküle, die ihre Ladung wechseln können, für das Reinigen von Nukleinsäure basieren auf Detergentien oder oberflächenwirksamen Substanzen, die einen hydrophoben Bereich und einen hydrophilen Bereich aufweisen, die eine positiv ionisierbare Gruppe mit einem geeigneten pK_S umfassen, z. B. Decylmethylimidazol oder Dodecyl-Bis-Tris. Diese Detergentien/oberflächenwirksamen Substanzen können durch ihre hydrophoben Bereiche auf die Oberflächen, z. B. Kunststoff, adsorbiert und die hydrophilen (ionisierbaren) Bereiche können für das Einfangen von Nukleinsäure verwendet werden.
Eine weitere Familie geeigneter Materialien für Einfangen und leichtes Freisetzen von Nukleinsäuren stellen Kohlenhydrate dar, z. B. Glucosamin, Polyglucosamin (einschließlich Chitosane), Kanamycine und deren Derivate, d. h. auf Zuckerringen basierende Strukturen, die ein oder mehr als ein Stickstoffatom, das von Hydroxylgruppen umlagert wird, enthalten, die ebenfalls weitere Gruppen wie etwa Acetat- oder Sulfatgruppen enthalten können, um einen für das Binden und Freisetzen von Nukleinsäuren geeigneten pK_S bereitzustellen.
Bei einer weiteren Gruppe von Materialien mit geeigneten pK_S-Werten handelt es sich um Nukleinsäurebasen, z. B. Cytidin (pK_S 4,2). Diese können mittels Hydroxylgruppen auf einem Polymer oder unter Verwendung von Carbodiimiden auf einer Festphasen-Carboxylgruppe immobilisiert werden.
Bei noch einer weiteren Gruppe von Materialien, die Elemente mit geeigneten pK_S-Werten aufweisen, handelt es sich um heterozyklische, Stickstoff enthaltende Verbindungen. Bei solchen Verbindungen kann es sich um aromatische oder aliphatische Verbindungen oder Monomere, Oligomere oder Polymere handeln, wie etwa Verbindungen, die Morpholin, Pyrrol, Pyrrolidin, Pyridin, Pyridinol, Pyridon, Pyrrolin, Pyrazol, Pyridazin, Pyrazin, Piperidon, Piperidin oder Piperazin enthalten, z. B. Polyvinylpyridin. Solche Verbindungen können mit elektronegativen Gruppen substituiert sein, um den/die pK_S-Wert(e) des/der ionisierbaren Stickstoffatoms/Stickstoffatome in einen akzeptablen Bereich zu bringen, z. B. wie oben definiert. Bei manchen Verbindungen allerdings kann dies nicht von Nöten sein, da der pK_S-Wert bereits in einem solchen Bereich ist.
Noch eine weitere Gruppe von Materialien für das Binden von Nukleinsäure, die ihre Ladung wechseln können, weisen Oberflächenamingruppen auf und insbesondere Amingruppen, bei denen es sich nicht um Polyamine handelt. Diese Monoamingruppen können durch die Formel -NR₁R₂ dargestellt werden, wobei es sich bei R₁ und R₂ um Wasserstoff oder substituiertes oder nicht substituiertes Alkyl handelt. Obgleich diese Materialien typischerweise pK_S-Werte aufweisen, die höher liegen als jene von Materialien, die in bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung verwendet werden, können sie für das Extrahieren von Nukleinsäure eingesetzt werden, wobei sie optional mit negativ geladenen Spezies wie hierin beschrieben eingesetzt werden, um den Gesamt-pK_S des Materials, das die Ladung wechseln kann, zu modifizieren.
Eine weitere Gruppe stellen Materialien dar, die ionisierbare Gruppen bereitstellen, die in der Lage sind, als Materialien, die ihre Ladung wechseln können, zu wirken und Nukleinsäure zu binden, wobei es sich hier um Farbstoffe handelt und insbesondere um biologische Farbstoffe, die pK_S zwischen 5 und 8 aufweisen.
Bei für die Verwendung gemäß der Erfindung bevorzugten Materialien handelt es sich um hydrophile Materialien, wobei zum Beispiel Materialien umfasst werden, die ihre Ladung wechseln können und wasserlöslich sind (oder es werden chemische Spezies umfasst, die vor dem Immobilisieren oder Polymerisieren wasserlöslich sind).
Nach der Herstellung eines geeigneten Materials, das die Ladung wechseln kann, können wiederholtes Einfangen und Freisetzen von Nukleinsäuren durchgeführt werden, indem der pH nach oben oder unten eingestellt wird. Unter Verwendung desselben Materials, das die Ladung wechseln kann, können diese sequentiellen Reaktionen oder Analysen auf den Nukleinsäuren durchgeführt werden. Zum Beispiel kann unter Verwendung eines PCR-Röhrchens, das ein Material umfasst, das die Ladung wechseln kann, DNA aus einer biologischen Probe isoliert werden. Nach der PCR kann das amplifizierte DNA-Produkt dann aus den Bestandteilen des Puffers oder den Primern isoliert werden, indem der pH in demselben Röhrchen eingestellt wird.
Die Zusammensetzungen und Verfahren der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um einzelsträngige RNA oder DNA von doppelsträngiger DNA zu trennen, da die Ladungsdichte auf einzel- und doppelsträngigen Molekülen durch geeignetes Manipulieren des pH oder der Salzkonzentration unterschiedlich ist. Einzelsträngige Moleküle werden typischerweise bei einem geringeren pH als doppelsträngige Moleküle von der Bindung an das Material, das die Ladung wechseln kann, freigesetzt.
Unter manchen Umständen, zum Beispiel für das Konstruieren von Gen-Chips und für das Herstellen von Sonden, kann es wünschenswert sein, eine einzelsträngige DNA zu produzieren. Manipulieren von pH und/oder Ionenstärke kann das Reinigen und Freisetzen von einzelsträngiger Nukleinsäure unterstützen. Das Verfahren der Erfindung kann einen vorab ablaufenden Schritt des Umwandelns von doppelsträngiger Nukleinsäure in der Probe in einzelsträngige Nukleinsäure umfassen (bevorzugt unter Verwendung einer starken Base, z. B. 100 mM NaOH, oder einer schwachen Base bei hoher Temperatur, z. B. 60–100 °C). Der Ladungswechsel wird dann bevorzugt gleichzeitig mit einem Puffer, der den pH der Probe in den pH für das Binden von einzelsträngiger Nukleinsäure (typischerweise ein pH von 4–7) ändert, hinzugefügt. Bei einer alternativen Ausführungsform kann ssDNA durch Binden von dsDNA an das polyfunktionale Reagens gewonnen werden, wobei das Reagens durch die Wechselwirkung eines spezifischen Bindungspaars auf einer Festphase immobilisiert und dann Hitze verwendet wird, um die dsDNA zwecks Bildung von ssDNA zu denaturieren. Dieser Ansatz ist insbesondere zweckmäßig, um ssDNA für die Verwendung in einem Assay für infektiöse Krankheiten bereitzustellen.
Die Verfahren der Erfindung schließen bevorzugt zwischen dem Schritt des Bindens und dem Schritt des Freisetzens einen oder mehr als einen Schritt des Waschens ein. Ein solcher Waschschritt/solche Waschschritte können bei diesem ersten pH oder bei einem pH oberhalb dieses ersten pH, aber unterhalb dieses zweiten pH, ausgeführt werden, sodass die Nukleinsäure im Wesentlichen nicht während dem Waschschritt/den Waschschritten freigesetzt wird.
Wie dies obenstehend angezeigt wurde, sind die Verfahren der Erfindung insbesondere für das Extrahieren von Nukleinsäure geeignet, die dann gelagert oder weiter verarbeitet wird (z. B. durch PCR), insbesondere wenn das Material, das die Ladung wechseln kann, in der Form z. B. eines Röhrchens oder eines Wells vorliegt, in der solches Lagern und/oder Verarbeiten stattfinden kann. Um Zweifel aus dem Weg zu räumen sei allerdings zu betonen, dass der Schritt des Freisetzens und jedwedes nachfolgende Lagern oder Verarbeiten nicht als einzelne Schritte ausgeführt werden müssen, aber zusammenfallen können, wenn dieses Lagern oder Verarbeiten bei einem pH, bei dem eine Freisetzung der Nukleinsäure erfolgt, abläuft. Zum Beispiel schließt das Verfahren der Erfindung das Binden von Nukleinsäure an ein Material, das die Ladung wechseln kann und auf ein PCR-Röhrchen aufgetragen oder anderweitig von diesem bereitgestellt wird, das Waschen der gebundenen Nukleinsäure und dann, ohne einen separaten Schritt des Freisetzens, das Beginnen der PCR-Reaktion unter Verwendung eines PCR-Puffers, der das Freisetzen der Nukleinsäure verursacht, ein.
Gemäß einem weiteren Aspekt sieht die vorliegende Erfindung für die Verwendung in den Verfahren der vorhergehenden Aspekte neuartige Materialien, die ihre Ladung wechseln können, vor. Ferner umfasst wird die Verwendung von solchen Materialien, die ihre Ladung wechseln können, bei solchen Verfahren. Alle bevorzugten Merkmale der oben im Zusammenhang mit den Verfahren beschriebenen Materialien, die ihre Ladung wechseln können, werden gleichermaßen und unabhängig von dem vorliegenden Aspekt der Erfindung angewandt (d. h. bevorzugte Kombinationen der Merkmale bezüglich dieses Aspekts können sich von bevorzugten Kombinationen bezüglich der Verfahrensaspekte unterscheiden).
Beispiel 1
Ein monoklonaler Maus-Antikörper gegen Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) wurde unter Verwendung von 0,1 M NaHCO₃ bei einer Antikörper-Konzentration von 4,6 μg/ml als Beschichtung auf 300 μl-Wells einer Polystyrol Mikrotiterplatte aufgetragen. Nach dem Waschen in 0,15 M NaCl konnten die Platten verwendet werden.
Zu jeder Reihe von Wells wurde DNA in einem 50 mM Kaliumacetatpuffer bei pH 4 hinzugefügt. Die Wells A–D enthielten DNA bei 20 μg/ml, die Wells E–H enthielten DNA bei 100 μg/ml. Unbeschichtete Wells wurden als eine Kontrolle für das Detektieren von nicht spezifischer Bindung verwendet. Zu jedem Well wurden doppelte Verdünnungen von an FITC gekoppeltem Poly-Tris hinzugefügt und 1 Stunde lang bei Umgebungstemperatur inkubiert. Das Poly-Tris-Polymer wurde gemäß den DRI-Patentanmeldungen US 09/586,009 oder WO 02/48164 hergestellt, dann in einem 0,1 M NaHCO₃–Puffer durch Mischen von FITC mit dem Poly-Tris in einem Verhältnis von jeweils ungefähr 1,25 mg zu 5 mg an FITC gekoppelt. Nach der Dialyse konnte das konjugierte Polymer (PT-FITC) verwendet werden.
Bei gewissen Reihen wurde das Konjugat aus Poly-Tris und FITC weggelassen, um nicht spezifische Bindung von der DNA zu bewerten.
Nach dem Einfangen der DNA bei pH 4 und Waschen der Wells mit Wasser konnte die DNA durch Einstellen des pH auf 8,5 mit 100 μl 10 mM Tris HCl gewonnen werden. Die Gelbilder (1) und Ergebnisse der Quantifizierung von PicoGreen (Tabelle 1) zeigen spezifische Bindung von DNA an die Flüssigkeit an.
Beispiel 2
Bei diesem Beispiel wurden mit Bis-Tris markiertes Biotin und mit Streptavidin beschichtete Platten verwendet. Mit Biotin markiertes Poly-Bis-Tris wurde durch Mischen von Biotin mit EDC und einem Überschuss an Poly-Bis-Tris hergestellt. Zum Beispiel wurde 1 Gramm Poly-Bis-Tris mit 200 mg Biotin, 160 mg EDC in 45 ml 0,1 M Imidazolpuffer, pH 6,5, vermischt, um ungefähre Gew.%-Verhältnisse von Biotin zu PBT von 20 % zu ergeben. Nach einer Inkubation über Nacht und vollständiger Dialyse konnte das Polymer verwendet werden. Die mit Streptavidin beschichteten Platten wurden durch Hinzufügen von 300 μl Streptavidin bei ungefähr 75 μg/ml in 0,1 M NaHCO₃ mit 0,1 % Glutaldehyd zu jedem Well einer schwarzen Polystyrol-Mikrotiterplatte hergestellt. Nach einer Inkubation über Nacht wurden die Platten gründlich mit einer salinen Lösung gewaschen und luftgetrocknet.
Zu einer Reihe von Wells wurden Verdünnungen von dem Biotin-PBT in 10 mM Tris HCl, pH 8,5, hinzugefügt und 3 Stunden lang inkubiert. Die Platten wurden in demselben Puffer gewaschen und danach mit einer DNA-Lösung behandelt. Eine Lösung von DNA aus Kalbsthymus wurde bei 17 μg/ml in 16 mM Kaliumacetat, pH 4, hergestellt und 200 μl wurden zu jedem Well hinzugefügt. Nach 3-stündigem Inkubieren bei RT wurden die Wells mit Wasser gewaschen und zu jedem Well wurde eine Lösung von Picogreen direkt hinzugefügt. Ergebnisse für 20 %iges Biotin-Poly-Bis-Tris

Verdünnung von Biotin-PBT DNA-Ausbeute (ng)

1/30 15

1/50 15

1/90 15

1/170 12

1/330 13

Kein Biotin-PBT 6

Kein Biotin-PBT 6

Kein Biotin PBT 6
Die Ergebnisse zeigen, dass durch das Vorhandensein von Biotin-PBT die Bindungskapazität für DNA bei den nicht verarbeiteten Wells anstieg und dass das Streptavidin der Beschichtung der Platten in der Lage ist, an den biotinylierten Teil des Reagens, das die Nukleinsäure bindet, zu binden. Das Verfahren ist ebenfalls effizient, wenn die DNA aus der Probe vor dem Kontaktieren mit der Festphase an das polyfunktionale Reagens gebunden wird.
Beispiel 3
Bei diesem Beispiel wurden mit Biotin markiertes Bis-Tris und mit Streptavidin beschichtete Spitzenstopfen verwendet. Ein gesinterter Kunststoffstopfen mit 30 μm-Poren wurde durch 2-tägiges Einweichen der stopfen wie oben beschrieben mit Streptavidin beschichtet und dann mit jedem beliebigen ungebundenem Material ausgewaschen. Der Stopfen wurde dann in einer Lösung von 20 %igem Biotin-PBT in 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, durch Einführen des Stopfens in eine 1 ml Pipettenspitze und wiederholtes Pumpen gewaschen. Das ungebundene Polymer wurde dann unter Verwendung desselben Puffers ausgewaschen und der Spitzenstopfen konnte verwendet werden.
Zwecks Testens des beschichteten Stopfens wurden 10 μg Lambda-DNA zu 100 μl Serum mit 1 ml DRI Lysispuffer (DRI Teil Nr. C033) und 10 μl Proteinase K bei 20 mg/ml hinzugefügt. Nach einem Inkubationszeitraum von 15 Minuten mit Vermischen wurden 100 μl von 1,6 M Kaliumacetat und Kaliumchloridpuffer, pH 4, hinzugefügt und vermischt. Diese Lösung wurde dann mehrmals über den Spitzenstopfen gepumpt, um die DNA zu binden. Dann wurde der Stopfen mit Wasser gewaschen und die DNA mit 200 μl 10 mM Tris-HCl, pH 8,5, durch mehrmaliges Pumpen eluiert.
Die eluierte DNA wurde durch UV- und Gel-Elektrophorese analysiert. Ergebnisse 260/280 nm

260 nm 280 nm Verhältnis Ausbeute Biotin-PBT-Stopfen

0,11 0,061 1,8 1,1 μg Biotin-PBT-Stopfen

0,05 0,04 1,25 0 Nur Serum – keine

DNA

Diese Ergebnisse zeigen, dass das Biotin-Poly-Bis-Tris selektiv die DNA aus biologischen Proben bindet. Das geringe Verhältnis von 260/280 des eluierten Materials der Kontrolle zeigt an, dass wenig oder gar keine DNA vorhanden ist und dies wurde durch Gel-Elektrophorese bestätigt. Das Verfahren ist ebenfalls effizient, wenn die DNA aus der Probe vor dem Kontaktieren mit der Festphase an das polyfunktionale Reagens gebunden wird. Tabelle 1. Unter Verwendung von 100 μl Elutionspuffer bei pH 8,5 aus jedem Well erhaltene DNA DNA-Ausbeute (μg/ml)

Probe	H	G	F	E	D	C	B	A
Reihe 1 mit Antikörper beschichtet, PT-FITC	4,53	4,53	19,5	16,42	1,19	0,85	1,0	0,95
Reihe 2 mit Antikörper beschichtet, kein PT-FITC	1,4	1,7	1,25	1,82	1,23	0,84	0,86	1,08
Reihe 3 Kein Antikörper, PT-FITC	0,87	0,6	0,93	1,17	0,77	0,34	0,81	0,43
Reihe 4 Kein Antikörper, kein PT-FITC	0,5	0,39	0,29	0,27	0,61	0,46	0,26	0,82

Claims

Ein lösliches polyfunktionales Reagens, das bei einem ersten pH in der Lage ist, an eine Zielsubstanz zu binden und das bei einem zweiten pH in der Lage ist, die Zielsubstanz freizusetzen, wobei das Reagens ein Element eines spezifischen Bindungspaars umfasst, das in der Lage ist, an einen spezifischen Bindungspartner zwecks Manipulieren oder Detektieren der Zielsubstanz zu binden, wenn diese an das polyfunktionale Reagens gebunden ist.
Das polyfunktionale Reagens aus Anspruch 1, wobei das Reagens in der Lage ist, bei einem ersten pH, bei dem das Reagens positiv geladen ist, reversibel an die Zielsubstanz zu binden, und die Nukleinsäure bei einem zweiten, höheren pH, bei dem das Reagens weniger positiv, neutral oder negativ geladen ist, freizusetzen.
Das polyfunktionale Reagens aus Anspruch 2, wobei das Reagens positiv ionisierbare Gruppen mit einem pK_S zwischen 4,5 und 8,5 aufweist.
Das polyfunktionale Reagens aus Anspruch 2 oder Anspruch 3, wobei der erste pH, bei dem die Zielsubstanz bindet, nicht unter pH 3,0 liegt und der zweite pH, bei dem die Zielsubstanz freigesetzt wird, zwischen pH 7,0 und 9,0 liegt.
Das polyfunktionale Reagens aus einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der Zielsubstanz um Nukleinsäure handelt.
Das polyfunktionale Reagens aus Anspruch 5, wobei es sich bei der Nukleinsäure um einzel- oder doppelsträngige DNA, RNA oder Oligonukleotide handelt.
Das polyfunktionale Reagens aus Anspruch 5 oder Anspruch 6, wobei es sich bei der Nukleinsäure um nicht-genomische Nukleinsäure, zelluläre Vektor-DNA oder -RNA, selbstreplizierende Satelliten-Nukleinsäuren oder Plasmid-DNA, genomische Nukleinsäure, Wirtszellenchromosome oder ribosomale RNA handelt.
Das polyfunktionale Reagens aus Anspruch 1, wobei das Reagens in der Lage ist, bei einem ersten pH, bei dem das Reagens negativ geladen ist, reversibel an die Zielsubstanz zu binden und die Nukleinsäure bei einem zweiten, niedrigeren pH, bei dem das Reagens weniger negativ, neutral oder positiv geladen ist, freizusetzen.
Das polyfunktionale Reagens aus Anspruch 8, wobei das Reagens negativ ionisierbare Gruppen mit einem pK_S zwischen 3,0 und 7,0 aufweist.
Das polyfunktionale Reagens aus einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei der Zielsubstanz um ein Protein, ein Polypeptid, eine Zelle oder eine Komponente einer Zelle, ein Lipid, ein Kohlenhydrat, einen Virus oder einen Mikroorganismus handelt.
Das polyfunktionale Reagens aus einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Reagens die Zielsubstanz unter folgenden Voraussetzungen freisetzt: (a) im Wesentlichen in Abwesenheit starker, mineralischer Base; und/oder (b) bei einer Temperatur von weniger als 70° C; und/oder (c) bei einer Ionenstärke von weniger als 100 mM.
Das polyfunktionale Reagens aus einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem Reagens um ein polyhydroxyliertes Amin, einen polymerisierten biologischen Puffer oder eine polymerisierte Aminosäure handelt.
Das polyfunktionale Reagens aus Anspruch 12, wobei es sich bei dem Reagens um Poly-Bis-Tris, Poly-Tris, Polyhistidin, ein polyhydroxyliertes Amin, ein Chitosan oder ein Triethanolamin handelt.
Das polyfunktionale Reagens aus einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Reagens eine Vielzahl an Elementen des spezifischen Bindungspaares umfasst.
Das polyfunktionale Reagens aus einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Element des spezifischen Bindungspaars des Weiteren einen Marker umfasst.
Das polyfunktionale Reagens aus einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei es sich bei dem spezifischen Bindungspaar um einen Antikörper und ein Antigen, einen Marker und einen Antikörper, der in der Lage ist, den Marker zu binden, Biotin und Avidin oder Streptavidin, einen Liganden und einen Rezeptoren, ein Lektin und ein Kohlenhydrat, ein Enzym und einen Kofaktor oder Substrat, einen Bakteriophagen, der an mikrobielle Zellwände oder eine Komponente davon bindet, Zellen, die mittels Rezeptoren oder Antikörpern oder Lektinen binden, entgegengesetzt geladene ionische Gruppen, Redox/elektrochemische Gruppen, eine chelatierende Gruppe und ihren Bindungspartner, zwei hydrophobe Substanzen, die in der Lage sind, in einem wässrigen System aneinander zu binden, eine in Nukleinsäure interkalierende Gruppe und Nukleinsäure, oder ein Nukleinsäuremolekül, das in der Lage ist, an eine komplementäre Nukleinsäuresequenz zu hybridisieren, handelt.
Das polyfunktionale Reagens aus Anspruch 15 oder Anspruch 16, wobei es sich bei dem Marker um einen fluoreszenten Marker handelt.
Das polyfunktionale Reagens aus einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei es sich bei dem spezifischen Bindungspaar um Biotin und Avidin, Biotin und Streptavidin, Fluoresceinisothiocyanat (FITC) und einen Anti-FITC-Antikörper, einen Anti-Digoxigenin-Antikörper und Digoxigenin, Maltose bindendes Protein und Maltose, Glutathion, das an GST bindet, ein Ethidiumbromid oder in Cy3 interkalierende Gruppe und Nukleinsäure, Ni²⁺-Ion und Polyhistidin, oder an Zuckerreste bindendes Concanavalin A handelt.
Ein Kit, das ein polyfunktionales Reagens aus einem der vorhergehenden Ansprüche umfasst, optional in Kombination mit einer festen Phase, an die das polyfunktionale Reagens gebunden ist oder binden kann.
Das Kit aus Anspruch 19, wobei es sich bei der festen Phase um ein magnetisierbares Material, ein Röhrchen, einen Well, eine Spitze, eine Sonde, eine Pipette, eine Membran, einen Filter, ein Kügelchen, einen Partikel, ein Blech, einen Objektträger, einen Zapfen handelt.
Das Kit aus Anspruch 20, wobei es sich bei der festen Phase um magnetische oder paramagnetische Kügelchen handelt.
Das Kit aus einem der Ansprüche 19 bis 21, wobei die feste Phase aus Glas, Silica, Kunststoff, einem Mineral, einem Kohlenhydrat, Papier, einer Zellulose oder einer Kombination aus diesen gebildet wird.
Ein Verfahren, in dem ein lösliches, polyfunktionales Reagens aus einem der Ansprüche 1 bis 18 verwendet wird, wobei das Verfahren folgendes umfasst: Kontaktieren einer eine Zielsubstanz enthaltenden Probe mit dem polyfunktionalen Reagens unter solchen Bedingungen, dass die Zielsubstanz an das polyfunktionale Reagens bindet; und Manipulieren oder Detektieren des Reagens und/oder der gebundenen Zielsubstanz durch Einsetzen des spezifischen Bindungselements des polyfunktionalen Reagens.
Das Verfahren aus Anspruch 23, wobei Manipulieren des Reagens das Kontaktieren des an die Zielsubstanz bindenden polyfunktionalen Reagens mit einer festen Phase, auf welcher der Bindungspartner des spezifischen Bindungselements immobilisiert wurde, sodass das spezifische Bindungspaar bindet, und das Trennen des polyfunktionalisierten Reagens und jeder beliebigen gebundenen Zielsubstanz, umfasst.
Das Verfahren aus Anspruch 24, wobei das polyfunktionale Reagens einen detektierbaren Marker umfasst, bei dem es sich um ein spezifisches Bindungselement handelt, das in der Lage ist, an einen auf einer festen Phase immobilisierten Bindungspartner zu binden.
Das Verfahren aus Anspruch 25, wobei das polyfunktionale Reagens einen fluoreszenten Marker umfasst und der Bindungspartner Antikörper umfasst, die in der Lage sind, an den auf der festen Phase immobilisierten fluoreszenten Marker zu binden.
Das Verfahren aus Anspruch 26, wobei Manipulieren des Reagens das Trennen der an das polyfunktionale Reagens bindenden Zielsubstanz durch einen Fluoreszenz-Zellseparator umfasst.
Ein Verfahren, in dem ein lösliches polyfunktionales Reagens aus einem der Ansprüche 1 bis 18 verwendet wird, wobei das Verfahren folgendes umfasst: Kontaktieren des polyfunktionalen Reagens mit einer festen Phase, auf der ein Bindungspartner des Elements des spezifischen Bindungspaars des polyfunktionalen Reagens immobilisiert wurde, sodass das polyfunktionale Reagens durch Wechselwirkung mit den Elementen des spezifischen Bindungspaars an die feste Phase bindet; Kontaktieren einer eine Zielsubstanz enthaltenden Probe mit dem polyfunktionalen Reagens unter solchen Bedingungen, dass die Zielsubstanz an das polyfunktionale Reagens bindet.
Das Verfahren aus einem der Ansprüche 23 bis 28, wobei es sich bei der Zielsubstanz um Nukleinsäure handelt.
Das Verfahren aus einem der Ansprüche von 23 bis 29, wobei es sich bei der festen Phase um ein magnetisierbares Material, ein Röhrchen, einen Well, eine Spitze, eine Sonde, eine Pipette, eine Membran, einen Filter, ein Kügelchen, einen Partikel, ein Blech, einen Objektträger, einen Zapfen handelt.
Das Verfahren aus Anspruch 30, wobei es sich bei der festen Phase um magnetische oder paramagnetische Kügelchen handelt.
Das Verfahren aus einem der Ansprüche 23 bis 31, wobei die feste Phase aus Glas, Silica, Kunststoff, einem Mineral, einem Kohlenhydrat, Papier, einer Zellulose oder einer Kombination aus diesen gebildet wird.