DE69034170T2

DE69034170T2 - Verfahren zum In-Vivo-Nachweis von Kollagenabbau

Info

Publication number: DE69034170T2
Application number: DE69034170T
Authority: DE
Inventors: David R. Eyre
Original assignee: Washington Research Foundation
Current assignee: Washington Research Foundation
Priority date: 1989-12-01
Filing date: 1990-11-30
Publication date: 2006-03-02
Anticipated expiration: 2010-12-01
Also published as: GR3030646T3; ATE179521T1; JP2002139492A; DE69025199D1; JP2782017B2; JPH09113510A; US5677198A; EP0682257B1; US5473052A; DE69033082D1; JP2999416B2; JP2999444B2; DE69034170D1; JPH05502223A; EP0682257A1; JP2000055915A; IE904344A1; EP0682256B1; DK0682257T3; DK0682256T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis und zur Überwachung von Kollagen-Abbau in vivo. Genauer gesagt, betrifft sie Verfahren zum Quantifizieren von vernetzten Telopeptiden, welche in vivo beim Abbau von Kollagen-Typ II erzeugt werden. Diese Anmeldung ist aus der WO 91/08478 (EPA 91 900109.9) ausgegliedert, welche, wie veröffentlicht, Verfahren zum Nachweisen und Verfolgen des Kollagen-Abbaus bezüglich Telopeptiden der Kollagen-Typen I, II und III beschrieb und beanspruchte.
Hintergrund der Erfindung
Bis heute sind drei bekannte Klassen von Kollagenen beschrieben worden. Die Klasse-I-Kollagene, unterteilt in die Typen I, II, III, V und XI, bilden bekanntermaßen Fibrillen. Diese Kollagene werden alle als Prokollagen-Moleküle synthetisiert, aufgebaut aus N-terminalen und C-terminalen Propeptiden, welche an das Kern-Kollagenmolekül angeheftet sind. Nach Entfernung der Propeptide, welche natürlicherweise in vivo während der Kollagensynthese stattfindet, besteht der verbleibende Kern des Kollagenmoleküls großteils aus einer tripelhelikalen Domäne mit terminalen Telopeptid-Sequenzen, welche nicht-tripelhelikal sind. Diese Telopeptid-Sequenzen besitzen eine wichtige Funktion als Stellen der extrazellulären intermolekularen Vernetzung von Kollagenfibrillen.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis des Kollagen-Abbaus, basierend auf dem Assay bezüglich besonderer vernetzter Telopeptide, welche in vivo beim Kollagen-Abbau erzeugt werden. In der Vergangenheit sind Assays zum Verfolgen des Abbaus von Kollagen in vivo durch Messen verschiedener biochemischer Marker entwickelt worden, von denen einige Abbauprodukte von Kollagen gewesen sind. Zum Beispiel ist der Knochen-Turnover, welcher mit der Paget-Krankheit assoziiert ist, durch Messen kleiner, hydroxyprolin-haltiger Peptide überwacht worden, welche im Urin im Anschluss an den Abbau von Knochen-Kollagen ausgeschieden werden; Russel et al., Metab, Bone Dis. and Rel. Res. 4 und 5, 255–262 (1981); und Singer, F. R., et al., Metabolic Bone Disease, Band II (Hrsg. Avioli, L. V. und Kane, S. M.), 489–575 (1978), Academic Press, New York.
Andere Forscher haben die vernetzende Verwindung Pyridinolin im Urin als Index des Kollagen-Abbaus bei Gelenkerkrankung gemessen; für Hintergründe und Beispiele siehe Wu und Eyre, Biochemistry, 23: 1850 (1984); Black et al., Annals of the Rheumatic Diseases, 48: 641–644 (1989); Robins et al., Annals of the Rheumatic Diseases, 45: 969–973 (1986); und Seibel et al., The Journal of Rheumatology, 16: 964 (1989). Im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung haben einige Forscher früher Peptide aus Körperflüssigkeiten hydrolysiert und dann nach der Gegenwart individueller Hydroxypyridnium-Reste gesucht. Keiner von diesen Forschern hat über das Messen eines Telopeptids, enthaltend eine Vernetzung, welche in vivo natürlich bei Kollagen-Abbau erzeugt wird, wie in der vorliegenden Erfindung berichtet.
Die GB-Patentanmeldung GB 2 205 643 berichtet, dass der Abbau von Typ-III-Kollagen im Körper quantitativ durch Messen der Konzentration eines N-terminalen Telopeptids aus Typ-III-Kollagen in einer Körperflüssigkeit bestimmt wird. In dieser Bezugsstelle wird berichtet, dass vernetzte Telopeptid-Regionen nicht wünschenswert sind. Tatsächlich berichtet diese Bezugsstelle, dass es notwendig ist, eine nicht-vernetzte Quelle von Kollagen zu verwenden, um das Telopeptid zu erhalten. Die Peptide der vorliegenden Erfindung sind alle vernetzt. Kollagen-Vernetzungen werden in größerer Ausführlichkeit nachstehend unter der Überschrift "Kollagen-Vernetzung" erörtert.
Es gibt eine Reihe von Berichten, welche darauf hinweisen, dass der Kollagen-Abbau durch Quantifizieren bestimmter Prokollagen-Peptide gemessen werden kann. Die vorliegende Erfindung beinhaltet eher Telopeptide denn als Propeptide, wobei die zwei durch ihre Lage im Kollagenmolekül und die Zeitgebung ihrer Spaltung in vivo unterschieden sind; siehe U.S.-Patent 4 504 587; U.S.-Patent 4 312 853; Pierard et al., Analytical Biochemistry 141: 127–136 (1984); Niemela, Clin. Chem., 31/8: 1301–1304 (1985); und Rohde et al., European Journal of Clinical Investigation, 9: 451–459 (1979).
Das U.S.-Patent 4 778 768 betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Veränderungen, welche in künstlichem Knorpel auftreten, beinhaltend das Quantifizieren von Proteoglycan-Monomer oder antigenen Fragmenten davon in einer Gelenkflüssigkeits-Probe. Dieses Patent betrifft nicht das Nachweisen vernetzter Telepeptide, welche aus abgebautem Kollagen stammen.
Dodge, J. Clin. Invest., 83: 647–661 (1981) offenbart Verfahren zum Analysieren des Typ-II-Kollagen-Abbaus unter Verwendung eines polyklonalen Antiserums, welches mit entwundenen Alpha-Ketten und Cyanogenbromid-abgeleiteten Peptiden von Typ-II-Kollagenen von Mensch und Rind spezifisch reagiert. Die betroffenen Peptide sind keine vernetzten Telopeptide, wie in der vorliegenden Erfindung.
Aminosäuresequenzen von humanem Typ-III-Kollagen, humanem Pro-a1-(II)-Kollagen und die gesamte Prä-Pro-a1(III)-Kette von humanem Typ-III-Kollagen und entsprechende cDNA-Klone sind von mehreren Forschergruppen untersucht und bestimmt worden; siehe Loidl et al., Nucleic Acids Research, 12: 9383–9394 (1984); Sangiorgi et al., Nucleic Acids Research, 13: 2207–2225 (1985); Baldwin et al., Biochem. J., 262: 521–528 (1989); und Ala-Kokko et al., Biochem. J., 260: 509–516 (1989). Keine dieser Bezugsstellen beschreibt die Strukturen von besonderen Telopeptid-Abbauprodukten, welche gemessen werden könnten, um die Menge an abgebautem fibrillären Kollagen in vivo zu bestimmen.
Trotz der obenstehend beschriebenen Hintergrundinformation bleibt ein Bedarf nach effektiven und einfachen Assays zur Bestimmung des Kollagenabbaus in vivo bestehen. Derartige Assays könnten angewandt werden, um Krankheitszustände in Menschen, wie Osteoarthritis (Typ-II-Kollagen-Abbau) und verschiedene Entzündungskrankheiten, wie das Vasculitis-Syndrom (Typ-III-Kollagen-Abbau), nachzuweisen und zu überwachen.
Assays für Typ-I-Kollagen-Abbau, beschrieben in der WO-A-85/04491, können angewandt werden, um Knochenresorption in vivo nachzuweisen und zu überprüfen.
Es sind mehrere potentielle organische Indizes getestet worden. Beispielsweise wird Hydroxyprolin, eine großteils auf Kollagen und das Haupt-Strukturprotein in Knochen und allen anderen Bindegeweben beschränkte Aminosäure, in Urin ausgeschieden. Seine Ausscheidungsrate wird bekanntermaßen bei gewissen Befunden erhöht, insbesondere der Paget-Krankheit, einer metabolischen Knochenerkrankung, in welcher der Knochen-Turnover in großen Maße erhöht ist, wie obenstehend hervorgehoben. Aus diesem Grund wurde Hydroxyprolin im Urin als ein Aminosäuremarker für Kollagenabbau weithin herangezogen; Singer, F. R., et al. (1978), hierin obenstehend zitiert.
Das U.S.-Patent Nr. 3 600 132 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung von Hydroxyprolin in Körperflüssigkeiten, wie Serum, Urin, Lumbal-Fluid und anderen interzellulären Fluiden, um Abweichungen im Kollagenstoffwechsel zu überwachen. Insbesondere bemerkt dieser Erfinder, dass bei pathologischen Zuständen, wie der Paget-Erkrankung, dem Marfan-Syndrom, Ostoegenesis imperfecta, neoplastischem Wachstum in Kollagen-Geweben und in verschiedenen Formen von Zwergenwuchs, ein erhöhter Kollagen-Anabolismus oder -Katabolismus, wie gemessen durch den Hydroxyprolin-Gehalt in biologischen Fluiden, festgestellt werden kann. Dieser Erfinder misst Hydroxyprolin durch Oxidieren desselben zu einer Pyrrolverbindung mit Wasserstoffperoxid und N-Chlor-p-toluolsulfonamid, gefolgt von colorimetrischer Bestimmung in p-Dimethylaminobenzaldehyd.
Im Falle der Paget-Krankheit stammt der erhöhte Gehalt von Hydroxyprolin im Urin wahrscheinlich großteils aus dem Knochenabbau; Hydroxyprolin kann jedoch im allgemeinen nicht als ein spezifischer Index verwendet werden. Viel von dem Hydroxyprolin im Urin kann aus der neuen Kollagensynthese (beträchtliche Mengen des neu hergestellten Proteins werden abgebaut und ausgeschieden, ohne jemals in Gewebematerial eingebaut zu werden) und aus dem Turnover bestimmter Blutproteine sowie anderer Proteine, welche Hydroxyprolin enthalten, stammen. Darüber hinaus werden etwa 80% des freien Hydroxyprolins, welches aus dem Proteinabbau stammt, in der Leber metabolisiert und erscheinen niemals im Urin. Kiviriko, K. I., Int. Rev. Connect. Tissue Res. 5: 93 (1970), und Weiss, P. H., und Klein, L., J. Clin. Invest. 48: 1 (1969).
Hydroxylysin und seine Glycosid-Derivate, beides eigentümlich für kollagenartige Proteine, sind als Marker für den Kollagenabbau als genauer wie Hydroxyprolin betrachtet worden. Aus denselben Gründen, wie obenstehend für Hydroxyprolin beschrieben, sind jedoch Hydroxylysin und seine Glycoside wahrscheinlich gleichermaßen nicht-spezifische Marker für die Knochen-Resorption; Krane, S. M., und Simon, L. S., Develop. Biochem., 22: 185 (1981).
Kollagen-Vernetzung
Die Polymere der meisten genetischen Typen von Wirbeltier-Kollagen erfordern die Bildung von Aldehyd-vermittelten Vernetzungen für eine normale Funktion. Kollagen-Aldehyde werden aus einigen wenigen spezifischen Lysin- oder Hydroxylysin-Seitenketten durch die Wirkung von Lysyloxidase abgeleitet. Verschiedene di-, tri- und tetrafunktionale vernetzende Aminosäuren werden durch die spontanen intra- und intermolekularen Reaktionen dieser Aldehyde innerhalb der neu gebildeten Kollagenpolymere gebildet; der Typ des vernetzenden Rests variiert spezifisch mit dem Gewebetyp (siehe Eyre, D. R. et al., Ann. Rev. Biochem., 53: 717–748 (1984)).
Zwei grundlegende Wege der Vernetzung können für die streifigen (67 nm-Wiederholung) fibrillären Kollagene unterschieden werden, einer auf Basis von Lysinaldehyden, der andere auf Basis von Hydroxylysin-Aldehyden. Der Lysinaldehyd-Weg dominiert in erwachsener Haut, Hornhaut, Sclera und Rattenschwanzsehnen und tritt häufig auch in anderen weichen Bindegeweben auf. Der Hydroxylysin-Aldehydweg dominiert in Knochen, Knorpel, Ligamenten, den meisten Sehnen und den meisten inneren Bindegeweben des Körpers, Eyre, D. R., et al. (1974) siehe oben. Der eingeschlagene Weg wird davon beherrscht, ob Lysinreste in den Telopeptid-Stellen hydroxyliert sind, wo Aldehydreste später durch Lysyloxidase gebildet werden (Barnes, M. J., et al., Biochem. J., 139: 461 (1974)).
Die chemischen Strukturen) der reifen vernetzenden Aminosäuren auf dem Lysinaldehydweg sind unbekannt, aber Hydroxypyridinium-Reste sind als reife Produkte auf der Hydroxylysin-Aldehyd-Route identifiziert worden. Auf beiden Wegen und in den meisten Geweben verschwinden die intermediären, Borhydrid-reduzierbaren vernetzenden Reste, wenn das neu gebildete Kollagen reift, was nahelegt, dass sie relativ kurzlebige Intermediate sind (Bailey, A. J., et al., FEBS Lett, 16: 86 (1971)). Ausnahmen sind Knochen und Dentin, worin die reduzierbaren Reste in nennenswerter Konzentration während des gesamten Lebens persistieren, anscheinend teilweise weil die rasche Mineralisierung der neu hergestellten Kollagenfibrillen zukünftige spontane Vernetzungs-Wechselwirkungen inhibiert (Eyre, D. R., In: The Chemistry and Biology of Mineralized Connective Tissues, (Hrsg.: Veis, A.), S. 51–55 (1981), Elsevier, New York, und Walters, C., et al., Calc. Tiss. Intl. 35: 401–405 (1983)).
Zwei chemische Formen von 3-Hydroxypyridinium-Vernetzung sind identifiziert worden (Formel I und II). Beide Verbindungen sind natürlicherweise fluoreszent, mit denselben charakteristischen Anregungs- und Emissionsspektren (Fujimoto, D., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 76: 1124 (1977), und Eyre, D. R., Develop. Biochem. 22: 50 (1981)). Diese Aminosäuren können bei guter Empfindlichkeit direkt in Gewebehydrolysaten aufgetrennt und geassayt werden unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC und Fluoreszenznachweis; Eyre, D. R., et al., Analyte. Biochem., 137: 380–388 (1984). Es sollte bemerkt werden, dass die vorliegende Erfindung eher die Quantifizierung von besonderen Peptiden als von Aminosäuren beinhaltet.
In wachsenden Tieren ist es berichtet worden, dass diese reifen Vernetzungen in einer nicht-mineralisierten Fraktion von Knochen-Kollagen stärker konzentriert werden können als in dem mineralisierten Kollagen (Banes, A. J., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 113: 1975 (1983)). Allerdings unterstützen andere Untersuchungen an jungem Rinder- oder erwachsenem Menschen-Knochen dieses Konzept nicht; Eyre, D. R., In: The Chemistry and Biology of Mineralized Tissues (Hrsg.: Butler, W. T.), S. 105 (1985), Ebsco Media Inc., Birmingham, Alabama.
Das Vorhandensein von Kollagen-Hydroxypyridinium-Vernetzungen in menschlichem Urin wurde zuerst von Gunja-Smith und Boucek (Gunja-Smith, Z., und Boucek, R. J., Biochem J., 197: 759–762 (1981)) unter Anwendung langwieriger Isolationsvorgehensweisen für Peptide und herkömmlicher Aminosäureanalyse berichtet. Zu dieser Zeit kannte man bewusst lediglich die HP-Formen der Vernetzung. Robins (Robins, S. P., Biochem J., 207: 617–620 (1982)) hat über einen Enzym-Linked-Immunoassay zur Messung von HP in Urin berichtet, welcher erhöhte polyklonale Antikörper gegen die an Rinderserumalbumin gekoppelte freie Aminosäure aufwies. Mit diesem Assay wird beabsichtigt, einen Index zum Überwachen einer erhöhten Gelenkzerstörung vorzusehen, welche bei arthritischen Krankheiten auftritt, und nach Robins basiert er auf der Feststellung, dass Pyridinolin im Knorpel wesentlich stärker vorherrscht als in Knochen-Kollagen.
In jüngeren Arbeiten, beinhaltend Enzym-Linked-Immunoassay, berichtet Robins, dass Lysyl-Pyridinolin gegenüber Antiserum gegen Pyridinolin, kovalent verknüpft an Rinderserumalbumin, unreaktiv ist (Robins et al., Ann. Rheum. Diseases, 45: 969–973 (1986)). Der Urinindex für die Knorpelzerstörung nach Robins basiert auf der Feststellung, dass hauptsächlich aus Knorpel stammendes Hydroxylysylpyridinolin im Urin bei Konzentrationen, proportional zur Rate der Gelenkknorpel-Resorption (d. h. Abbau), gefunden wird. Im Prinzip könnte dieser Index verwendet werden, um den Gesamtkörper-Knorpelverlust zu messen; allerdings wäre keine Information über die Knochenresorption verfügbar.
Ebenfalls von Interesse ist die internationale Veröffentlichung Nr. WO 89/12824 des "The Rowett Research Institute". Diese letztgenannte Veröffentlichung beschreibt ein Verfahren zur Verfolgung des Kollagenabbaus, umfassend einen Assay einer biologischen Fluidprobe, welche ein Fragment von Kollagen enthält, einschließend Lysyl-Pyrodinolin oder Hydroxylysyl-Pyridinolin oder eine substituierte Form davon, und ein Verfahren zur Bestimmung der Gewebeherkunft von dadurch abgebautem Kollagen.
Es besteht deshalb ein Bedarf nach einem Verfahren, welches die Abbauraten-Messung von Gesamtkörper-Knorpel oder kollagenhaltigem Bindegewebe in Menschen erlaubt. Das nützlichste derartige Verfahren wäre ein solches, weiches auf Körperflüssigkeiten, speziell Urin, angewandt werden könnte. Das Verfahren sollte empfindlich sein, d. h. quantifizierbar hinab bis zu 1 Picomol, und die 24-Stunden-Knochenresorptionsraten rasch messen, so dass der Fortschritt verschiedener Therapien überprüft werden kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Feststellung des Vorhandenseins bestimmter vernetzter Telopeptide in Körperflüssigkeiten von Patienten und normalen menschlichen Subjekten. Diese Telopeptide werden in vivo während Kollagenabbau und -neumodellierung hergestellt. Der Begriff "Telopeptide" wird hierin verwendet, um vernetzte Peptide mit Sequenzen zu bedeuten, welche mit der Telopeptidregion von Typ-II-Kollagen assoziiert sind. Im Allgemeinen werden die hierin offenbarten Telopeptide weniger Aminosäurereste aufweisen als vollständige Telopeptiddomänen von Typ-II-Kollagen. Typischerweise werden die Telopeptide der vorliegenden Erfindung zwei Alpha-Eins(a1)-Peptide, verknüpft durch eine Pyridinium-Quervernetzung und weiterhin verknüpft durch die Pyridinium-Quervernetzung an einen Rest oder ein Peptid der tripelhelikalen Kollagen-Domäne, umfassen. Nach Offenbarung der Strukturen dieser Telopeptide hierin, wird es der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen, dass sie auch anders als in vivo, z. B. synthetisch, hergestellt werden können. Diese Peptide werden im Allgemeinen in gereinigter Form, z. B. im Wesentlichen frei von Verunreinigungen, insbesondere anderen Peptiden, vorgesehen werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zur Bestimmung des in-vivo-Abbaus von Typ-II-Kollagen. Die Verfahren beinhalten das Quantifizieren der Konzentration von bestimmten Telopeptiden, welche eine 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzung aufweisen und welche aus dem Kollagenabbau abgeleitet sind, in einer Flüssigkeitsprobe. Die in der vorliegenden Erfindung offenbarten Verfahren sind analog zu denjenigen, offenbart in der WO-A-89/04491, zur Bestimmung der absoluten Rate der Knochenresorption in vivo. Die Verfahren beinhalteten das Quantifizieren der Konzentration von Telopeptiden mit einer 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzung, abgeleitet aus Typ-I-Kollagenresorption, in einer Körperflüssigkeit.
In einem Aspekt sieht die vorliegende Erfindung somit ein Verfahren zum Bestimmen von Typ-II-Kollagen-Abbau vor, umfassend das Quantifizieren der Konzentration von wenigstens einem ersten 3-Hydroxypyridinium-vernetzten Typ-II-Kollagen-Telopeptid in einer Körperflüssigkeitsprobe, gegebenfalls Urin, Blut, Serum oder Gelenkflüssigkeit.
In einem anderen Aspekt wird ein Verfahren zum Bestimmen des Knorpelabbaus in vivo vorgesehen, umfassend die Quantifizierung in einer Körperflüssigkeitsprobe der Konzentrationen von einem ersten Peptid, umfassend ein C-terminales Typ-II-Kollagen-Telopeptid, das eine Hydroxylysyl-Pyridinolin-Quervernetzung, die einen intakten Pyridiniumring aufweist, enthält, und einem zweiten Peptid, umfassend ein C-terminales Typ-II-Kollagen-Telopeptid, das eine Hydroxylysyl-Pyridinolin-Quervernetzung, die einen gespaltenen Pyridiniumring aufweist, enthält.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung sieht ein Verfahren zum Bestimmen von Knorpelabbau in vivo vor, umfassend die Quantifizierung der Konzentration eines Peptids in einer Körperflüssigkeitsprobe, gegebenfalls Urin, Blut, Serum oder Gelenkflüssigkeit, wobei das Peptid ein C-terminales Typ-II-Kollagen-Telopeptid umfasst, das eine Hydroxylysyl-Pyridinolin-Quervernetzung enthält.
Bei noch einem weiteren Aspekt der Erfindung handelt es sich um ein immunometrisches Verfahren zum Bestimmen der Knorpelabbaurate, wobei das Verfahren das in Kontakt Bringen einer Körperflüssigkeitsprobe, gegebenfalls Urin, Blut, Serum oder Gelenkflüssigkeit, mit einem immunologischen Bindungspartner umfasst, der ein Epitop in wenigstens einem C-terminalen Typ-II-Kollagen-Telopeptid erkennt, gewählt aus:
worin
Hydroxylysyl-Pyridinolin ist oder
worin
Hydroxylysyl-Pyridinolin ist.
In einem repräsentativen Assay wird die Körperflüssigkeit des Patienten in Kontakt mit einem immunologischen Bindungspartner gebracht, der spezifisch für ein Telopeptid ist, das eine 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzung aufweist, abgeleitet aus Typ-II-Kollagen. Die Körperflüssigkeit kann, wie vorbereitet, verwendet werden oder vor dem Kontaktierungsschritt gereinigt werden. Dieser Reinigungsschritt kann unter Anwendung einer Reihe von Standardvorgehensweisen bewerkstelligt werden, einschließlich Patronen-Adsorption und Elution, Molekularsieb-Chromatographie, Dialyse, Ionenaustausch, Aluminiumoxid-Chromatographie, Hydroxyapatit-Chromatographie und Kombinationen hiervon.
Andere repräsentative Ausführungsformen der Quantifizierung der Konzentration von Peptidfragmenten mit einer 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzung in einer Körperflüssigkeit schlie ßen elektrochemische Titration, natürliche Fluoreszenz-Spektroskopie und Ultraviolett-Extinktion ein. Elektrochemische Titration kann direkt an einer Körperflüssigkeit ohne weitere Aufreinigung durchgeführt werden. Wenn dies allerdings aufgrund der übermäßigen Mengen an kontaminierenden Substanzen nicht möglich ist, wird die Körperflüssigkeit vor dem elektrochemischen Titrationsschritt zuerst gereinigt. Geeignete Verfahren zur Reinigung vor dem elektrochemischen Nachweis schließen Dialyse, Ionenaustausch-Chromatographie, Aluminiumoxid-Chromatographie, Molekularsieb-Chromatographie, Hydroxyapatit-Chromatographie und Ionenaustausch-Adsorption und Elution ein.
Die fluorometrische Messung einer Körperflüssigkeit, enthaltend eine 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzung, ist ein alternativer Weg zur Quantifizierung des Kollagen-Abbaus.
Der fluorometrische Assay kann direkt an einer Körperflüssigkeit ohne weitere Reinigung durchgeführt werden. Für bestimmte Körperflüssigkeiten, insbesondere Urin, wird es allerdings bevorzugt, dass eine Reinigung der Körperflüssigkeit vor dem fluorometrischen Assay durchgeführt wird. Dieser Reinigungsschritt besteht aus dem Dialysieren eines Aliquots einer Körperflüssigkeit wie Urin, gegen eine wässrige Lösung, wodurch teilweise gereinigte Peptidfragmente hergestellt werden, welche innerhalb des Nicht-Diffusats (Retentat) zurückgehalten werden. Das Nicht-Diffusat wird dann lyophilisiert, in einer Ionenpaar-Lösung aufgelöst und auf einer Affinitätschromatographie-Säule absorbiert. Die Chromatographiesäule wird mit einem Volumen der Ionenpaar-Lösung gewaschen, und danach werden die Peptidfragmente aus der Säule mit einer Elutionslösung eluiert. Diese gereinigten Peptidfragmente können dann hydrolysiert und das Hydrolysat chromatographisch aufgetrennt werden. Die chromatographische Auftrennung kann entweder durch Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie oder Kapillar-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie durchgeführt werden.
Die Erfindung schließt Peptide ein, aufweisend identische Strukturen zu aus Kollagen-Abbau abgeleiteten Peptiden, im wesentlichen frei von anderen humanen Peptiden, welche aus einer Körperflüssigkeit erhalten werden können. Die Peptide enthalten wenigstens eine 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzung, insbesondere eine Lysyl-Pyridinolin-Quervernetzung oder eine Hydroxylysyl-Pyridinolin-Quervernetzung, und sind aus der Telopeptid-Region von Typ-II-Kollagen, verknüpft an einen oder mehrere Reste aus einer tripelhelikalen Domäne, typischerweise durch die Wirkung von endogenen Proteasen und/oder Peptidasen abgeleitet.
Somit sieht die Erfindung ein C-terminales Typ-II-Kollagen-Telopeptid vor, aufweisend die Aminosäuresequenz
worin
Hydroxylysyl-Pyridinolin ist oder
worin
Hydroxylysyl-Pyridinolin ist.
Die Strukturen der Typ-II-Telopeptide sind nachstehend beschrieben.
Ein anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung beinhaltet Assays für die hierin beschriebenen Peptide, in welchen die Pyridiniumringe intakt und gespalten sind. Da es vermutet wird, dass eine gewisse Spaltung von Pyridiniumringen in vivo stattfindet, können Assays, welche sowohl intakte als auch gespaltene Pyridiniumringe nachweisen, zu genaueren Einschätzungen des Kollagen-Abbaus führen. Im Zusammenhang mit diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung können spezifische Bindungspartner für die individuellen Peptide, enthaltend intakte oder gespaltene Pyridiniumringe, in den Assays verwendet werden. Individuelle spezifische Bindungspartner, welche beide Typen von Peptiden erkennen (sowohl intakte als auch gespaltene Pyridiniumringe enthaltende Peptide), können eingesetzt werden. Alternativ dazu könnten auch spezifische Bindungspartner, welche zwischen Peptiden, enthaltend den intakten Pyridiniumring, und denjenigen, in welchen der Pyridiniumring gespalten ist, unterscheiden, verwendet werden.
Die Erfindung betrifft im allgemeinen alle spezifischen Bindungspartner für die hierin beschriebenen Peptide. "Spezifische Bindungspartner" sind Moleküle, welche in der Lage zur Bindung an die Peptide der vorliegenden Erfindung sind. Innerhalb dieses Begriffs eingeschlossen sind immunologische Bindungspartner, wie Antikörper (monoklonal und polyklonal), antigenbindende Fragmente von Antikörpern (z. B. Fab- und F(ab')₂-Fragmente), einzelkettige antigenbindende Moleküle und dergleichen, ob mittels Hybridom- oder rDNA-Technologien hergestellt.
Die Erfindung schließt fusionierte Zellhybride (Hybridome) ein, welche monoklonale Antikörper erzeugen, spezifisch für die obenstehend beschriebenen Kollagenpeptide mit 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzungen (sowohl mit einem intakten Pyridiniumring als auch einem solchen, welcher gespalten worden ist).
Die Erfindung schließt ferner monoklonale Antikörper ein, welche durch die fusionierten Zellhybride hergestellt wurden, und diese Antikörper (sowie bindende Fragmente davon, z. B. Fab), welche an einen detektierbaren Marker gekoppelt sind. Beispiele für detektierbare Marker schließen Enzyme, Chromophore, Fluorophore, Coenzyme, Enzyminhibitoren, chemolumineszente Materialien, paramagnetische Metalle, Spin-Markierungen und radioaktive Isotope ein. Solche spezifischen Bindungspartner können alternativerweise an ein Mitglied eines Ligand-Bindungspartner-Komplexes (z. B. Avidin-Biotin) gekoppelt sein, in welchem Falle der detektierbare Marker an das komplementäre Mitglied des Komplexes gebunden zur Verfügung gestellt werden kann.
Die Erfindung beinhaltet ebenfalls Testkits, nützlich zur Quantifizierung der Menge von Peptiden mit 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzungen, welche aus Kollagen-Abbau abgeleitet sind, in einer Körperflüssigkeit. Die Kits können einen spezifischen Bindungspartner für ein aus abgebautem Kollagen abgeleitetes Peptid, wie hierin offenbart, einschließen. Die spezifischen Bindungspartner der Testkits können an einen detektierbaren Marker oder ein Mitglied eines Ligand-Bindungspartner-Komplexes, wie oben stehend beschrieben, gekoppelt sein.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
Die 1 ist eine Abbildung von Typ-II-Kollagen und ein Vorschlag für die Quelle von Telopeptiden. Es ist nicht bestätigt, ob die zwei gezeigten Telopeptide aus einem Kollagenmolekül, wie gezeigt in 1, oder aus zwei Kollagenmolekülen kommen.
Die 2 zeigt die relative Fluoreszenz (297 nm Anregung; 390 nm Emission) gegen die Fraktions-Nummer (4 ml), erhalten während einer chromatographischen Molekularsieb-Reinigung von vernetzten Telopeptiden. Vernetzte Typ-II-Kollagen-Telopeptide sind in den mit II bezeichneten Fraktionen enthalten.
Die 3A zeigt die relative Fluoreszenz (330 nm Anregung, 390 nm Emission) gegen die Elutionszeit von Fraktionen während einer Ionenaustausch-HPLC (DEAE-SPW). Vernetzte Typ-II-Kollagen-Telopeptide sind in der mit IV bezeichneten Fraktion enthalten.
Die 3B zeigt die Extinktion (220 nm) gegen die Elutionszeit in Minuten für dasselbe Chromatogramm.
Die 4A zeigt die relative Fluoreszenz (297 nm Anregung, 390 nm Emission) gegen die Elutionszeit von Fraktionen während einer Umkehrphasen-HPLC. Vernetzte Typ-II-Kollagen-Telopeptide werden eluiert, wie angegeben. Die durch den Balken (–) angegebenen Fraktionen zeigen Beweise durch Sequenz- und eine Zusammensetzungsanalyse der angegebenen Peptide, dass sie die Reste Gly (G) und Pro (P) beibehalten oder verloren haben.
Die 4B zeigt die Extinktion (220 nm) als Funktion der Elutionszeit während der Umkehrphasen-HPLC.
Ausführliche Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
Typ-II-Kollagen-Telopeptide
Ein spezifisches Telopeptid mit einer Hydroxylysyl-Pyridinolin-Quervernetzung, abgeleitet aus der C-terminalen Telopeptid-Domäne von Typ-II-Kollagen, besitzt die folgende Aminosäuresequenz (hierin nachstehend bezeichnet als die Kernpeptidstruktur): Formel III
worin der vernetzende Rest, dargestellt als Hyl-Hyl-Hyl, Hydroxylysyl-Pyridinolin (HP) ist, ein natürlicher 3-Hydroxypyridinium-Rest, welcher in reifen Kollagenfibrillen verschiedener Gewebe vorhanden ist.
Die Kernpeptidstruktur der Typ-II-Kollagenpeptide kann in Körperflüssigkeiten als Komponente größerer Peptide gefunden werden, welche zusätzliche Aminosäuren oder Aminosäuresequenzen an einem oder mehreren Enden der drei Peptidsequenzen tragen, welche durch den HP-Rest verknüpft sind. Die 1 zeigt, wie Typ-II-Kollagen-Telopeptide, welche an eine tripelhelikale Sequenz verknüpft sind, in vivo aus einer menschlichen Quelle unter Verwendung der proteolytischen Enzyme Pepsin und Trypsin hergestellt werden können. Kleinere Fragmente, welche Aminosäuren aus der Kernpeptidstruktur verloren haben, insbesondere aus der helikalen Sequenz, können ebenfalls in Körperflüssigkeiten auftreten. Im Allgemeinen werden Additionen oder Deletionen von Aminosäuren aus der Kernpeptidstruktur 1 bis etwa 3 Aminosäuren beteiligen. Zusätzliche Aminosäuren werden im allgemeinen durch die Typ-II-Kollagen-Telopeptid-Sequenz bestimmt werden, welche natürlich in vivo vorkommt. Als Beispiele können Peptide mit der folgenden Struktur: Formel III
und Formel IV
chromatographisch aus Urin isoliert werden, und ein Anderes mit der Struktur: Formel V
kann isoliert werden. Darüber hinaus können glycosylierte Varianten der Kernstruktur und ihre größeren und kleineren Varianten auftreten, in welchen ein Galactoserest oder ein Glucosylgalactoserest an die Seitenketten-Hydroxylgruppe des HP-Quervernetzungs-Rests angeheftet sind. Jeder Gipfel in der Grafik, welche in den 4A und 4B gezeigt ist, kann einem vernetzten Fragment mit einer besonderen Struktur entsprechen, welches für die Zwecke der vorliegenden Erfindung quantifiziert werden kann.
Diese Strukturen sind konsistent mit ihrer Herkunftsstelle in humanen Typ-II-Kollagenfibrillen an einer molekularen Quervernetzungsstelle, gebildet zwischen zwei al(II)-C-Telopeptiden und dem Rest 87 einer tripelhelikalen Domäne, deren bekannte Sequenzen die folgenden sind:
Formel VI
Die isolierten Peptidfragmente repräsentieren die Produkte des proteolytischen Abbaus von Typ-II-Kollagenfibrillen innerhalb des Körpers. Die Kernstruktur, welche den HP-Rest enthält, ist relativ resistent gegenüber weiterer Proteolyse und sieht ein quantitatives Maß der Menge an abgebautem Typ-II-Kollagen vor.
Kollagen-Typ-II ist im hyalinen Knorpel von Gelenken im Erwachsenenskelett vorhanden. Die Quantifizierung der Kollagen-Typ-II-Telopeptide in einer Körperflüssigkeit, zum Beispiel mittels eines monoklonalen Antikörpers, welcher ein Epitop in der Peptidstruktur erkennt, würde ein quantitatives Maß der Gesamtkörper-Knorpelzerstörung oder -Neumodellierung vorsehen. In einer bevorzugten Ausführungsform beinhaltet die vorliegende Erfindung einen Assay für Knorpelgewebe-Abbau in Menschen, basierend auf der Quantifizierung der Urin-Ausscheidungsrate von mindestens einem Mitglied dieser Familie von Telopeptiden. Ein derartiger Assay könnte beispielsweise angewandt werden, um:

(1) adulte humane Subjekte nach denjenigen Individuen zu screenen, welche abnorm hohe Knorpelabbau-Raten aufweisen, als frühem diagnostischen Indikator von Osteoarthritis;
(2) die Effekte von potenziellen antiarthritischen Arzneimitteln auf den Knorpelmetabolismus in Osteoarthritis- und rheumatoiden Arthritis-Patienten zu überwachen; oder
(3) den Fortschritt von degenerativer Gelenkerkrankung in Patienten mit Osteoarthritis und rheumatoider Arthritis und ihre Antworten auf verschiedene therapeutische Eingriffe zu überwachen.

Osteoarthritis ist eine Degenerationserkrankung der artikulierenden Knorpel von Gelenken. In ihren frühen Stadien ist sie großteils nicht-entzündlich (d. h. unterschieden von rheumatoider Arthritis). Sie ist keine einzelne Krankheit, sondern repräsentiert die späteren Stadien von Gelenkversagen, welche aus verschiedenen Faktoren resultieren können (z. B. genetische Veranlagung, mechanische Überbeanspruchung, Gelenkmissbildung oder eine frühere Verletzung etc.). Die Zerstörung von Gelenk-Artikulärknorpel ist das zentrale progressive Kennzeichen von Osteoarthritis. Das Auftreten von Osteoarthritis, basierend auf radiographischen Untersuchungen, liegt im Bereich von 4% in der Altersgruppe von 18–24 Jahren bis 85% in der Altersgruppe von 75–79 Jahren. Derzeit kann die Krankheit lediglich durch Schmerz- und radiographische oder andere Bilderzeugungs-Anzeichen einer fortgeschrittenen Knorpelerosion diagnostiziert werden.
Die obenstehend offenbarten Assays können angewandt werden, um frühe Beweise eines beschleunigten Knorpelabbaus in mild symptomatischen Patienten zu detektieren, den Krankheitsverlauf in fortgeschritteneren Patienten zu verfolgen, und als Mittel zur Verfolgung der Effekte von Arzneimitteln oder anderen Therapien.
In normalen jungen Erwachsenen (mit ausgereiften Skeletten) besteht wahrscheinlich ein sehr geringer Abbau des Knorpelkollagens. Ein Test, welcher Fragmente von Knorpelkollagen im Urin (und im Blut und der Gelenkflüssigkeit) messen könnte, wäre sehr nützlich zur Beurteilung der "Gesundheit" des Knorpels im gesamten Körper und in einzelnen Gelenken. Die obenstehend beschriebenen Typ-II-Kollagen-spezifischen Peptid-Assays werden dies bewerkstelligen. Langfristig könnte ein derartiger Assay ein routinemäßiger diagnostischer Screen zum Aufspüren derjenigen Individuen sein, deren Gelenke sich abnutzen. Diese könnten früh für eine vorbeugende Therapie ausgewählt werden, beispielsweise durch die nächste Generation sogenannter chondroprotektiver Arzneimittel, die jetzt von den größeren pharmazeutischen Firmen ausgewertet werden, welche alle aktiv nach besseren Mitteln zur Behandlung von Osteoarthritis suchen.
Andere Erkrankungen, in denen Gelenkknorpel zerstört wird, schließen ein: rheumatoide Arthritis, juvenile rheumatoide Arthritis, ankylosierende Spondylitits, psoriatrische Arthritis, Reiter-Syndrom, rezidivierende Polychondritis, das untere Rückenschmerzen-Syndrom und andere infektiöse Formen von Arthritis. Die hierin beschriebenen Typ-II-Kollagen-spezifischen Assays könnten angewandt werden, um diese Krankheiten zu diagnostizieren und zu überwachen und deren Antwort auf eine Therapie auszuwerten, wie obenstehend im Zusammenhang mit Osteoarthritis offenbart wurde.
Isolierung von Typ-II-Kollagen-Telopeptiden
Allgemeine Vorgehensweise:
Urin wird von einem normalen Heranwachsenden während einer raschen Phase des Skelettwachstums gesammelt. Unter Anwendung einer Abfolge von chromatographischen Schritten, welche ohne Einschränkung darauf die Adsorption auf selektiven Patronen eines hydrophoben Wechselwirkungs-Trägers und eines Ionenaustausch-Trägers und Molekularsieb-, Ionenaustausch- und Umkehrphasen-HPLC-Säulen-Chromatographieschritte einschließen, werden individuelle Peptide isoliert. Die vernetzten Peptide, enthaltend HP- (und LP-)Reste, werden während der Säulenchromatographie durch ihre natürliche Fluoreszenz nachgewiesen (Ex. max 297 nm < pH 4, Ex. max 330 nm, > pH 6; Em. max 390 nm). Ein beispielhaftes Isolationsvorgehen wird im nachstehenden Beispiel angegeben.
Spezifisches Beispiel:
Frischer Urin (bei 4°C), fünffach verdünnt mit Wasser und eingestellt auf 2% (v/v) Trifluoressigsäure, wurde durch eine hydrophobe C-18-Bindungs-Patrone hindurchgeleitet (Waters C-18 Sep-Pak, vorbenetzt mit 80% (v/v) Acetonitril, dann gewaschen mit Wasser). Zurückgehaltene Peptide wurden mit Wasser gewaschen, dann mit 3 ml 20%igem (v/v) Acetonitiril eluiert, und dieses Eluat wurde auf 0,05 M NH₄HCO₃, 10% (v/v) Acetonitril eingestellt durch Zugabe eines gleichen Volumens an 0,1 M NH₄HCO₃. Diese Lösung wurde durch eine QMA-Sep-Pak (Waters) hindurchgeleitet, welche mit 10 ml 0,1 M NaCl, 20% (v/v) Acetonitril, gefolgt von 10 ml Wasser gewaschen wurde, und die Peptide wurden dann mit 3 ml 1% (v/v) Trifluoressigsäure eluiert und mittels Speed-Vac (Savant) getrocknet.
Peptide wurden in drei chromatographischen Schritten fraktioniert. Der erste Schritt war eine Molekularsieb-Chromatographie auf einer Säule von Bio-Gel P-10 (Bio Rad Labs, 2,5 cm × 90 cm), eluiert mittels 10% (v/v) Essigsäure, wobei der Ausfluss hinsichtlich HP-Fluoreszenz überwacht wurde, wie gezeigt in der 2. In der 2 ist die Y-Achse die relative Fluoreszenz-Emission bei 390 nm (297 nm Anregung), und die X-Achse ist die Fraktionsnummer. Die Fraktionsgröße belief sich auf 4 ml. Die als II angegebenen Fraktionen sind hinsichtlich der vernetzten Kollagen-Typ-II-Telopeptide angereichert. Die vernetzten Kollagen-Typ-I-Telopeptide sind in den Fraktionen enthalten, welche als III und IV gekennzeichnet sind. Fraktionen, welche den Pool II überspannten (angereichert hinsichtlich vernetzten Typ-II-Kollagen-Peptiden), wurden vereinigt, gefriergetrocknet und durch Ionenaustausch-Säulenchromatographie auf einer DEAE-HPLC-Säule (TSK-DEAE-SPW, 7,5 mm × 7,5 mm, Bio-Rad Labs), äquilibriert mit 0,02 M Tris/HCl, 10% (v/v) Acetonitril, pH 7,5, fraktioniert und mit einem Gradienten von 0,05 M NaCl im gleichen Puffer eluiert, wie gezeigt in der 2.
Die 3A trägt die relative Fluoreszenzemission bei 390 nm (330 nm Anregung) gegen die Elutionszeit auf. Die vernetzten Kollagen-Typ-II-Telopeptide werden vorwiegend in dem als IV angegebenen Segment gefunden. Die 3B trägt die Extinktion bei 220 nm als Funktion der Elutionszeit in Minuten auf. Der Pool IV enthält die vernetzten Typ-II-Kollagen-Peptide. Individuelle Peptide wurden dann aus dem Pool IV durch Umkehrphasen-HPLC auf einer C-18-Säule (Aquapore RP-300, 25 cm × 4,6 mm, Brownlee Labs) aufgetrennt, wobei mit einem Gradienten von 0–30% (v/v) Acetonitril in 0,1% (v/v) Trifluoressigsäure eluiert wurde. Die 4A zeigt eine Grafik der relativen Fluoreszenzintensität bei 390 nm (297 nm Anregung) als Funktion der Elutionszeit. Die mit jeweiligen Peptiden assoziierten Peaks sind in der 4A angegeben. Die 4B zeigt die relative Extinktion bei 220 nm als eine Funktion der Zeit.
Wie in dieser Beschreibung und in den beigefügten Patentansprüchen in Bezug auf Typ-II-Telopeptide verwendet, wird mit "Quantifizieren" das mittels jedweder geeigneten Methode, einschließlich, ohne darauf eingeschränkt zu sein, spektrophotometrischen, gravimetrischen, volumetrischen, coulometrischen, immunometrischen, potentiometrischen oder amperometrischen Methoden, erfolgende Messen der Konzentration von Peptidfragmenten, welche 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzungen enthalten, in einem Aliquot einer Körperflüssigkeit gemeint. Geeignete Körperflüssigkeiten schließen Urin, Serum und Gelenkflüssigkeit ein. Die bevorzugte Körperflüssigkeit ist Urin.
Da die Konzentration von Urin-Peptiden abnehmen wird, wenn das Volumen des Urins zunimmt, wird es ferner bevorzugt, dass wenn Urin die gewählte Körperflüssigkeit ist, das getestete Aliquot aus einem vereinigten Pool von Urin stammt, welche über eine festgelegte Zeitdauer, beispielsweise 24 Stunden hinweg gesammelt wird. Auf diese Weise wird die Absolutrate des Kollagen-Abbaus für eine 24-Stunden-Dauer berechnet. Alternativ dazu können Urin-Peptide als ein Verhältnis relativ zu einer Markersubstanz gemessen werden, welche im Urin gefunden wird, wie Kreatinin. Auf diesem Weg würde der Urin-Index des Kollagen-Abbaus unabhängig vom Urinvolumen bleiben.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden monoklonale oder polyklonale Antikörper hergestellt, welche spezifisch für die Peptidfragmente mit Pyridinolin-Quervernetzungen sind, welche in einer Körperflüssigkeit wie Urin gefunden werden.
Typ-II-Telopeptide können aus einer Körperflüssigkeit von einem beliebigen Patienten isoliert werden, können aber einfacher aus Patienten, welche unter Krankheiten leiden, die Typ-II-Kollagen-Abbau beteiligen, oder aus rasch wachsenden Heranwachsenden erhalten werden.
Beispiele von Vorgehensweisen zur Quantifizierung von Peptiden
A. Immunologische Vorgehensweise zur Quantifizierung von Peptiden
Immunologische Bindungspartner, fähig zur spezifischen Bindung an Peptidfragmente, abgeleitet aus Knochenkollagenen, welche aus einem physiologischen Fluid erhalten wurden, können durch im Fachgebiet gut bekannte Verfahren hergestellt werden. Das bevorzugte Verfahren zum Isolieren dieser Peptidfragmente ist obenstehend beschrieben. Mit immunologische Bindungspartner, wie hierin verwendet, werden Antikörper und Antikörperfragmente gemeint, welche zur Bindung an ein Telopeptid in der Lage sind.
Sowohl monoklonale als auch polyklonale Antikörper, welche die hierin offenbarten Peptide spezifisch binden, als auch deren Äquivalente, werden durch im Fachgebiet bekannte Verfahren hergestellt; beispielsweise Campbell, A. M. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Band 13 (1986), Elsevier, hierin durch den Bezug darauf einbezogen. Es ist möglich, Antikörper gegen die obenstehenden Peptide oder ihre Äquivalente, wie isoliert, herzustellen. Weil die Molekulargewichte dieser Peptidfragmente jedoch im Allgemeinen geringer als 5 000 sind, wird es bevorzugt, dass das Hapten an ein Trägermolekül konjugiert wird. Geeignete Trägermoleküle schließen, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Rinderserumalbumin, Ovalbumin, Thyroglobulin, und "Keyhole-Limpet"-Hämocyanin (KLH) ein. Bevorzugte Träger sind Thryoglobulin und KLH.
Es ist auf dem Fachgebiet gut bekannt, dass die Orientierung des Haptens, wenn es an das Trägerprotein gebunden wird, von kritischer Bedeutung für die Spezifität des Antiserums ist. Darüber hinaus sind nicht alle Hapten-Protein-Konjugate gleich erfolgreiche Immunogene. Die Auswahl eines Protokolls für die Bindung des jeweiligen Haptens an das Trägerprotein hängt deshalb von der Aminosäuresequenz der gewählten gewöhnlichen Peptidfragmente ab. Beispielsweise könnte ein Protokoll die Kopplung dieses Haptens an Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH) oder einen anderen geeigneten Träger mit Glutaraldehyd beinhalten. Ein alternatives Protokoll besteht darin, die Peptide mit einem Carbodiimid an KLH zu koppeln.
Andere Peptide können, abhängig von der Quelle, unterschiedliche Bindungsprotokolle erfordern. Folglich kann eine Reihe von Bindungsmitteln in geeigneter Weise angewandt werden. Diese schließen, ohne Einschränkung darauf, Carbodiimide, Glutaraldehyd, gemischte Anhydride und sowohl homobifunktionelle als heterobifunktionelle Reagenzien ein (siehe zum Beispiel den Katalog von Pierce 1986–87, Pierce Chemical Co., Rockford, IL). Bevorzugte Bindungsmittel schließen Carbodiimide und heterobifunktionelle Reagenzien, wie m-Maleimidobenzyl-N-hydroxysuccinimidester (MBS) ein.
Verfahren zur Bindung des Haptens an das Trägermolekül sind im Fachgebiet bekannt; siehe zum Beispiel Chard, T., Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Band 6 (1987), Partz Elsevier, N. Y., was hierin durch Bezug darauf einbezogen ist.
Es können entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper gegen das Hapten-Trägermolekül-Immunogen hergestellt werden. Es wird jedoch bevorzugt, dass monoklonale Antikörper (Mab) hergestellt werden. Aus diesem Grund wird es bevorzugt, dass die Immunisierung in der Maus ausgeführt wird. Immunisierungsprotokolle für die Maus schließen gewöhnlicher Weise ein Adjuvans ein. Beispiele von geeigneten Protokollen sind von Chard, T. (1987) siehe oben, beschrieben. Milzzellen aus der geimpften Maus werden geerntet und homogenisiert und danach mit Krebszellen in Gegenwart von Polyethylenglycol fusioniert, um ein fusioniertes Zellhybrid herzustellen, welches monoklonale Antikörper herstellt, die spezifisch für aus Kollagen abgeleitete Peptidfragmente sind. Beispiele derartiger Peptide werden durch die obenstehend angegebenen Formeln repräsentiert. Geeignete Krebszellen schließen Myelom-, Hepatom-, Karzinom- und Sarkomzellen ein. Ausführliche Beschreibungen dieses Vorgehens, einschließlich Screening-Protokollen, Protokollen zum Züchten selektierter Hybridzellen und zum Ernten von monoklonalen Antikörpern, welche durch die selektierten Hybridzellen hergestellt wurden, sind angegeben in Galfre, G. und Milstein, C., Meth. Enzymol., 73: 1 (1981).
Ein bevorzugtes, einleitendes Screening-Protokoll beinhaltet die Verwendung von Peptidfragmenten, abgeleitet aus Typ-II- oder Typ-III-Kollagen-Resorption und enthaltend 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzungen, in einem Festphasen-Radioimmunassay. Ein spezifisches Beispiel, welches einen bevorzugten monoklonalen Antikörper beschreibt, wird nachstehend vorgesehen.
Verfahren, welche rekombinante DNA-Techniken einsetzen, können auch angepasst werden, um monoklonale Antikörper zu konstruieren. Diese Verfahren können durch die Konstruktion von Expressionsbibliotheken und Primern vom Durchschnittsfachmann (siehe William D. Huse et al., "Generation of a Large Combinational Library of the Immunoglobulin Repertoire in Phage Lambda", Science 246: 1275–1281, Dezember 1989, siehe auch L. Sastry et al., "Cloning of the Immunological Repertoire in Escherichia coli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies: Construction of a Heavy Chain Variable Region-Specific cDNA Library", Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5728–5732, August 1989; siehe auch Michelle Altine-Mees et al., "Monoclonal Antibody Expression Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology 3: 1–9, Januar 1990) oder durch den Erwerb von handelsüblichen Kits, welche für diesen Zweck verfügbar sind (d. h. von Stratacyte, La Jolla, Californien), bewerkstelligt werden. Kurz gesagt, wird innerhalb dieser Ausführungsform mRNA aus einer B-Zellpolulation isoliert und verwendet, um schwere und leichte Ketten-Immunglobulin-cDNA-Expressionsbibliotheken in den Vektoren λImmunoZap (H) und λImmunoZap (L) zu erzeugen. Diese Vektoren können individuell gescreent oder coexprimiert werden, um Fab-Fragmente oder Antikörper zu bilden (siehe Huse et al., siehe oben: siehe auch Sastry et al., siehe oben). Anschließend können positive Plaques zu einem nicht-lytischen Plasmid umgewandelt werden, welches die Expression von monoklonalen Antikörperfragmenten aus E. coli bei hohen Spiegeln gestattet.
Die monoklonalen Antikörper oder anderen immunologischen Bindungspartner, welche im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind vorzugsweise spezifisch für einen besonderen Typ von Kollagen-Telopeptid. Assays für die Typ-II-Kollagenabbau-Telopeptide sollten vorzugsweise in der Lage sein, zwischen den Peptiden von Typ I, Typ II und Typ III zu unterscheiden. Allerdings wird in manchen Fällen eine solche Selektivität nicht notwendig sein, beispielsweise wenn bekannt ist, dass ein Patient nicht unter dem Abbau eines Typs von Kollagen leidet, sondern im Verdacht steht, unter dem Abbau von dem getesteten Typ von Kollagen zu leiden. Wegen der Unterschiede in den Aminosäuresequenzen zwischen Telopeptiden der Typ-I-, Typ-II- und Typ-III-Familien sollte Kreuzreaktivität nicht in einem nennenswerten Ausmaß auftreten. Tatsächlich kann man hinsichtlich Hybridomen selektieren während des Screenings von Milzzellen-Fusionsklonen, welche monoklonale Antikörper herstellen, die spezifisch für das vernetzte Telopeptid von Interesse sind (und denen Affinität für diejenigen der anderen zwei Kollagentypen fehlt). Basierend auf den Unterschieden in der Sequenz der isolierten Peptidstrukturen, ist eine derartige Spezifität völlig durchführbar. Peptidfragmente der Kollagene der Eltern-Typen I, II und III, welche für ein solches Hybridom-Screening geeignet sind, können aus menschlichem Knochen, Knorpel und anderen Geweben hergestellt und verwendet werden, um Klone aus Mäusen zu screenen, die in geeigneter Weise mit den individuellen, aus Körperflüssigkeit isolierten, vernetzten Peptid-Antigenen immunisiert wurden.
Immunologische Bindungspartner, speziell monoklonale Antikörper, hergestellt durch die oben stehenden Vorgehensweisen oder äquivalente Vorgehensweisen, werden in verschiedenen immunometrischen Assays verwendet, um die Konzentration der obenstehend beschriebenen Peptide mit 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzungen zu quantifizieren. Diese immunometrischen Assays umfassen vorzugsweise einen monoklonalen Antikörper oder ein Antikörperfragment, gekoppelt an einen detektierbaren Marker. Beispiele von geeigneten detektierbaren Markern schließen ohne Einschränkung darauf: Enzyme, Coenzyme, Enzyminhibitoren, Chromophore, Fluorophore, chemolumineszente Materialien, paramagnetische Materialien, Spin-Markierungen und Radionuklide ein. Beispiele von standardmäßigen immunometrischen Verfahren, geeignet zur Quantifizierung der Telopeptide, schließen ohne Einschränkung darauf Enzym-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) (Ingvall, E., Meth. Enzymol., 70 (1981)), Radio-Immunoassay (RIA) und immunoradiometrischen "Sandwich"-Assay (IRMA) ein.
In ihrer einfachsten Form können diese immunometrischen Verfahren angewandt werden, um die absolute Rate der Knochenresorption oder des Kollagen-Abbaus zu bestimmen, einfach mittels in Kontakt Bringen einer Körperflüssigkeit mit dem immunologischen Bindungspartner, der spezifisch für ein Kollagen-Telopeptid mit einer 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzung ist.
Es wird bevorzugt, dass die obenstehend beschriebenen immunometrischen Assays direkt an unbehandelten Körperflüssigkeiten durchgeführt werden (z. B. Urin, Blut, Serum oder Gelenkflüssigkeit). Gelegentlich können jedoch kontaminierende Substanzen den Assay stören, was eine partielle Aufreinigung der Körperflüssigkeit notwendig macht. Partielle Reinigungsvorgehensweisen schließen ohne Einschränkung darauf Patronen-Adsorption und -Elution, Molekularsieb-Chromatographie, Dialyse, Ionenaustausch, Aluminiumoxid-Chromatographie, Hydroxyapatit-Chromatographie und Kombinationen hiervon ein.
Testkits, welche zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind, enthalten spezifische Bindungspartner, wie monoklonale Antikörper, hergestellt wie obenstehend beschrieben, welche spezifisch an aus Kollagen-Abbau abgeleitet Peptidfragmente, welche in einer Körperflüssigkeit gefunden werden, binden. Es wird bevorzugt, dass die spezifischen Bindungspartner dieses Testkits an einen detektierbaren Marker des obenstehend beschriebenen Typs gekoppelt sind. Testkits, enthaltend eine Auswahl von zwei oder mehreren spezifischen Bindungspartnern, insbesondere immunologischen Bindungspartnern, werden ebenfalls in Betracht gezogen. Jeder immunologische Bindungspartner in einem solchen Testkit wird vorzugsweise nicht wesentlich mit einem Telopeptid kreuzreagieren, welches aus einem ande ren Typ von Kollagen abgeleitet ist. Beispielsweise sollte ein immunologischer Bindungspartner, der spezifisch mit einem Typ-II-Kollagen-Telopeptid bindet, vorzugsweise weder mit einem Typ-I- noch einem Typ-III-Kollagen-Telopeptid kreuzreagieren. Ein kleines Ausmaß (z. B. 5–10%) an Kreuzreaktivität kann tolerierbar sein. Andere Testkits können einen ersten spezifischen Bindungspartner gegen ein Kollagen-abgeleitetes Telopeptid mit einer Quervernetzung, enthaltend einen Pyridiniumring (der OH-substituiert sein kann), und einen zweiten spezifischen Bindungspartner gegen ein Telopeptid mit der gleichen Struktur wie das erste Telopeptid, außer dass der Pyridiniumring, z. B. photolytisch, gespalten worden ist, enthalten.
Herstellung von monoklonalem Antikörper
Es folgt ein Beispiel der Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen ein Telopeptid-Immunogen.
Eine hinsichtlich des Peptids angereicherte Fraktion wird aus humanem Urin von Heranwachsenden unter Anwendung von Umkehrphasen- und Molekularsieb-Chromatographie hergestellt. Das Peptid wird an Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH) mit Glutaraldehyd unter Anwendung von Standardverfahrensweisen konjugiert. Mäuse (Balb/c) werden subkutan mit diesem Konjugat (50–70 g) geimpft, zuerst in vollständigem Freund'schem Adjuvans, und dann in 3-wöchigen Intervallen intraperitoneal in unvollständigem Freund'schem Adjuvans geboostert (25 g). Nachdem Test-Blutentnahmen einen hohen Titer gegen das an Rinderserumalbumin (BSA) konjugierte Peptid unter Anwendung eines ELISA-Formats zeigten, werden ausgewählte Mäuse mit einer niedrigen Dosis (5 g) des Immunogens in sterilem PBS intravenös geboostert. Drei Tage später werden Zellen aus den Milzen von einzelnen Mäusen mit Maus-Myelom-Zellen unter Verwendung der standardmäßigen Hybridom-Technologie fusioniert. Die Überstände von Hybridom-Klonen, welche in einzelnen Vertiefungen von 96-Vertiefungs-Platten wuchsen, werden hinsichtlich reaktiver monoklonaler Antikörper gescreent, anfänglich unter Verwendung einer rohen Telopeptid-Präparation, konjugiert an BSA. Nach formaler Klonierung mittels limitierender Verdünnung werden die Antikörper, welche von individuellen Hybridomen hergestellt werden, gegen eine Auswahl von, an BSA konjugierten, Screening-Antigenen unter Anwendung der ELISA-Analyse charakterisiert. Ein Inhibitions-Assay wird angewandt, in welchem an BSA konjugiertes Telopeptid in den Kunststoffvertiefungen ausplattiert wird, und Antikörper mit einer Lösung des potentiellen Antigens präinkubiert wird. Ein zweiter Antikörper (Ziege-Anti-Maus-IgG, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase, HRP) wird zur Farbentwicklung unter Verwendung eines passenden Substrats eingesetzt.
Wenn eine Öffnung des Pyridiniumrings in den Telopeptiden entweder in vivo oder sogar in vitro unter routinemäßigen Handhabungsbedingungen stattfindet, dann wird ein quantitativer Assay der vorliegenden Peptid(e) mit intakten Pyridiniumringen die Menge des Kollagen-Abbaus unterschätzen. Folglich wird von einem auf zwei möglichen Vorgehensweisen beruhendem Assay erwartet, vergleichsweise genauer zu sein. Die zwei ins Auge gefassten Ausführungsformen sind: ein einziger spezifischer Bindungspartner wird verwendet, welcher sowohl geschlossen- als auch offenringige Ausführungsformen der angezielten Peptid(e) erkennt; oder zwei spezifische Bindungspartner werden verwendet, welche zwischen den geschlossen- bzw. offenringigen Epitopen unterscheiden.
Spezifische Bindungspartner, welche zwischen offenen und geschlossenen Ring-Formen der angezielten Peptide unterscheiden, können erhalten werden durch Einbinden eines passenden Screening-Schritts in die Standardvorgehensweisen zum Erhalten solcher spezifischen Bindungspartner. Um beispielsweise einen monoklonalen Antikörper zu erhalten, der spezifisch an eine offene Ringform eines Telopeptids bindet, kann eine Bibliothek von monoklonalen Kandidaten-Antikörpern hinsichtlich ihrer Fähigkeit, an das Peptid mit einem geöffneten Pyridinolin-Ring (z. B. durch Bestrahlung mit Ultraviolettlicht) zu binden, und ihrer Fähigkeit, an das Peptid mit einem intakten Pyridinolin-Ring zu binden, gescreent werden. Die in einem derartigen Screening-Schritt nützlichen Offen-Ring- und Intakt-Ring-Peptide können durch bekannte Reinigungstechniken, wie RP- bzw. Umkehrphasen-HPLC, wie obenstehend beschrieben, erhalten werden.
B. Elektrochemisches Vorgehen für den Assay hinsichtlich Peptiden
Eine alternative Vorgehensweise für den Assay hinsichtlich der obenstehend beschriebenen Peptide besteht im Messen einer physikalischen Eigenschaft der Peptide mit 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzungen. Eine solche physikalische Eigenschaft beruht auf dem elektrochemischen Nachweis. Dieses Verfahren besteht aus dem Injizieren eines Aliquots einer Körperflüssigkeit, wie Urin, in einen elektrochemischen Detektor, eingestellt auf ein Redoxpotential, geeignet zum Nachweis von Peptiden, welche den 3-Hydroxypyridinium-Ring enthalten. Der 3-Hydroxypyridinium-Ring, welcher aphenolisch ist, wird einer reversiblen Oxidation unterzogen, und deswegen ist der elektrochemische Detektor (z. B. Modell 5100A Coulochem, vertrieben von Esa 45 Wiggins Ave., Bedford, MA) ein in hohem Maße wünschenswertes Instrument, das zur Quantifizierung der Konzentration der vorliegenden Peptide geeignet ist. Zwei grundlegende Formen des elektrochemischen Detektors sind derzeitig kommerziell erhältlich: amperometrisch (z. B. BioAnalytical Systems) und coulometrisch (ESA, Inc., Bedford, MA 01730). Beide sind zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet, allerdings ist das letztgenannte System inhärent empfindlicher und deswegen bevorzugt, weil eine vollständige Oxidation oder Reduktion des analysierten Moleküls im Säulenausfluss erzielt wird. Weiterhin können Screening- oder Schutzelektroden "stromaufwärts" der analytischen Elektrode eingebaut sein, um störende Substanzen selektiv zu oxidieren oder zu reduzieren, wodurch die Selektivität in großem Maße verbessert wird. Im wesentlichen wird die Spannung der analytischen Elektrode auf das Redoxpotential des Probenmoleküls eingestellt, und eine oder mehrere Vorbehandlungszellen werden eingesetzt, um störende Substanzen in der Probe zu zerstören.
In einem bevorzugten Assay-Verfahren wird eine Strom/Spannung-Standardkurve für Standardpeptide, enthaltend Lysyl-Pyridinolin oder Hydroxylysyl-Pyridinolin, aufgestellt, um die richtige Spannung zu bestimmen, welche für eine optimale Empfindlichkeit einzustellen ist. Diese Spannung wird dann in Abhängigkeit von der Körperflüssigkeit modifiziert, um den Störeinfluss von Kontaminanten zu minimieren und die Empfindlichkeit zu optimieren. Elektrochemische Detektoren und die Optimalbedingungen für ihre Anwendung sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Komplexe Mischungen von Körperflüssigkeiten können oft direkt mit dem elektrochemischen Detektor ohne Störung analysiert werden. Folglich ist für die meisten Patienten keine Vorbehandlung der Körperflüssigkeit notwendig. In manchen Fällen können jedoch störende Verbindungen die Zuverlässigkeit der Messungen verringern. In solchen Fällen kann eine Vorbehandlung der Körperflüssigkeit (z. B. Urin) notwendig sein.
Folglich wird in einer alternativen Ausführungsform der Erfindung eine Körperflüssigkeit, vor dem elektrochemischen Titrieren der gereinigten Peptidfragmente, zuerst gereinigt. Der Reinigungsschritt kann auf vielfältige Weise durchgeführt werden, einschließlich, ohne darauf eingeschränkt zu sein, Dialyse, Ionenaustausch-Chromatographie, Aluminiumoxid-Chromatographie, Hydroxyapatit-Chromatographie, Molekularsieb-Chromatographie oder Kombinationen hiervon. In einem bevorzugten Reinigungsprotokoll wird ein abgemessenes Aliquot (25 ml) einer 24-Stunden-Urinprobe in einem Dialyseschlauch mit verringerter Porosität dialysiert, um die Hauptmasse an kontaminierenden fluoreszenten gelösten Substanzen zu entfernen. Das Nicht-Diffusat wird dann lyophilisiert, erneut in 1% Heptafluorbuttersäure (HFBA), einer Ionenpaar-Lösung, gelöst, und die Peptide werden auf einer Water-Sep-Pak-C-18-Patrone adsorbiert. Diese Patrone wird dann mit 5 ml 1% HFBA gewaschen und danach mit 3 ml 50%igem Methanol in 1% HFBA eluiert.
Ein anderes bevorzugtes Verfahren zur Reinigung besteht im Adsorbieren eines abgemessenen Aliquots von Urin auf einen Ionenaustausch-Adsorptionsfilter und Eluieren des Adsorptionsfilters mit einer gepufferten Elutionslösung. Die Eluatfraktionen, enthaltend Peptidfragmente mit 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzungen, werden dann aufgefangen, um getestet zu werden.
Noch ein anderes bevorzugtes Verfahren zur Reinigung verwendet Molekularsieb-Chromatographie. Beispielsweise wird ein Aliquot von Urin auf eine Bio-Gel-P2- oder Sephadex-G-20-Säule aufgetragen, und die Fraktion, welche im Bereich von 1000–5000 Dalton eluiert, wird aufgefangen. Dem Fachmann auf dem Gebiet wird offensichtlich sein, dass eine Kombination der obenstehenden Verfahren angewandt werden kann, um Urin oder andere Körperflüssigkeiten zu reinigen oder teilweise zu reinigen, um die Peptidfragmente mit 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzungen zu isolieren. Die gereinigten oder teilweise gereinigten Peptidfragmente, welche durch die obenstehenden Vorgehensweisen erhalten werden, können zusätzlichen Reinigungsvorgehensweisen unterzogen werden, weiterverarbeitet oder direkt im teilweise gereinigten Zustand untersucht werden. Zusätzliche Reinigungsvorgehensweisen schließen das Auftrennen der teilweise gereinigten Peptidfragmente unter Anwendung von Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) oder Kapillar-HPLC ein, wenn eine erhöhte Empfindlichkeit gewünscht wird. Diese Peptide können dann durch elektrochemische Titration quantifiziert werden.
Ein bevorzugtes elektrochemisches Titrationsprotokoll besteht aus der Abstimmung des Redoxpotentials der nachweisenden Zelle des elektrochemischen Detektors (Coulochem Model 5100A) für ein Maximalsignal mit reinem HP. Der Detektor wird dann verwendet, um den Ausfluss aus einer C-18-HPLC-Säule zu überwachen, welche zur Auftrennung der teilweise gereinigten Peptide verwendet wurde.
C. Fluorometrisches Vorgehen zur Quantifizierung von Peptiden
Ein alternatives bevorzugtes Verfahren zur Quantifizierung der Konzentration von Peptiden mit 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzungen, wie hierin beschrieben, besteht darin, die charakteristische natürliche Fluoreszenz dieser Peptide zu messen. Für diejenigen Körperflüssigkeiten, welche wenig natürlich vorkommende fluoreszierende Materialien, verschieden von den 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzungen enthalten, kann der fluorometrische Assay direkt ohne weitere Aufreinigung der Körperflüssigkeit durchgeführt werden. In diesem Fall werden die Peptide mittels HPLC getrennt, und die natürliche Fluoreszenz der HP- und LP-Aminosäurereste wird bei 395 nm nach Anregung bei 297 nm gemessen, im wesentlichen wie beschrieben von Eyre, D. R., et al., Analyte. Biochem. 137: 380 (1984), was hierin durch den Bezug darauf einbezogen wird.
Gemäß der vorliegenden Erfindung wird es bevorzugt, dass der fluorometrische Assay an Urin durchgeführt wird. Urin enthält jedoch üblicherweise wesentliche Mengen von natürlich vorkommenden fluoreszierenden Kontaminanten, welche vor der Durchführung des fluorometri schen Assays entfernt werden müssen. Folglich werden Urinproben zuerst teilweise aufgereinigt, wie obenstehend für den elektrochemischen Nachweis beschrieben wurde. Diese teilweise gereinigte Urinprobe kann dann fluorometrisch geassayt werden, wie obenstehend beschrieben. Alternativ dazu können die HP- und LP-vernetzten Peptide in teilweise gereinigten Urinproben oder anderen Körperflüssigkeiten in 6 M HCl bei etwa 108°C während ungefähr 24 Stunden hydrolysiert werden, wie beschrieben von Eyre, et al. (1984) siehe oben. Dieses Verfahren hydrolysiert die an die Lysinvorläufer von "Tripeptid"-HP- und -LP-Quervernetzungen verknüpften Aminosäuren, wobei die freien HP- und LP-Aminosäuren erzeugt werden, welche von den Formeln I und II wiedergegeben werden. Diese kleinen "Tripeptide" werden dann durch die obenstehend beschriebenen Techniken, vorzugsweise mittels HPLC, aufgetrennt, und die natürliche Fluoreszenz wird gemessen (Ex. 297 nm, Ex. 390 nm).
Gegebenenfalls wird die Körperflüssigkeit (vorzugsweise Urin) direkt durch eine C-18-Umkehrphasen-Affinitäts-Patrone geleitet, nachdem Acetonitril/Methanol 5–10% v/v zugesetzt wurde. Das Nicht-Retentat wird mit einem kationischen Ionenpaar-Mittel wie Tetrabutylamoniumhydroxid auf 0,05–0,10 M eingestellt und durch eine zweite C-18-Umkehrphasen-Patrone hindurchgeleitet. Das gewaschene Retentat, enthaltend fluoreszierende Peptide, aus dieser zweiten Patrone wird mit Acetonitril:Wasser (oder Methanol:Wasser) eluiert, getrocknet und fluoreszierende Peptide werden mittels Umkehrphasen-HPLC oder Kapillar-HPLC unter Verwendung eines anionischen Ionenpaar-Mittels, wie 0,01 M Trifluoressigsäure, in dem Elutionsmittel analysiert.
Das Verhältnis von HP:LP, gefunden in normalem menschlichem Urin und Urin aus Patienten mit der Paget-Krankheit, beträgt in beiden Fällen ungefähr 4,5:1. Dies ist etwas höher als das 4:1-Verhältnis, welches in Knochen selbst gefunden wird (Eyre, et al., 1984). Das in Urin gefundene, höhere Verhältnis zeigt, dass ein Teil der HP-Fraktion in Urin aus anderen Quellen als Knochen, wie der Nahrung oder anderen Quellen des Kollagen-Abbaus, d. h. Knorpel-Katabolismus, stammen kann.
Während die Erfindung in Zusammenhang mit bevorzugten Ausführungsformen beschrieben worden ist, wird der Durchschnittsfachmann nach dem Lesen der vorstehenden Beschreibung in der Lage sein, verschiedene Änderungen, Substitutionen oder Äquivalente, und Veränderungen am hierin dargelegten Gegenstand, vorzunehmen. Somit kann die Erfindung auf anderen Wegen ausgeführt werden, als denjenigen, die hierin spezifisch beschrieben wurden. Es wird deswegen beabsichtigt, dass der durch die Patenturkunde hierzu gewährte Schutz nur durch die beigefügten Patentansprüche beschränkt sein soll.

Claims

Verfahren zur Bestimmung von Typ-II-Kollagen-Abbau, umfassend die Quantifizierung der Konzentration von wenigstens einem ersten 3-Hydroxypyridinium-vernetzten Typ-II-Kollagen-Telopeptid in einer Körperflüssigkeitsprobe, gegebenenfalls Urin, Blut, Serum oder Gelenkflüssigkeit.
Verfahren gemäß Anspruch 1, das zusätzlich den Schritt der Quantifizierung in einer Körperflüssigkeit der Konzentration eines zweiten 3-Hydroxypyridinium-vernetzten Typ-II-Kollagen-Telopeptids umfasst, wobei die 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzung eines der Kollagen-Telopeptide einen gespaltenen Pyridiniumring aufweist.
Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei das Verfahren das in Kontakt Bringen der Körperflüssigkeit mit wenigstens einem spezifischen Bindungspartner des ersten und/oder des zweiten Polypeptids umfasst.
Verfahren zur Bestimmung von Knorpelabbau in vivo, umfassend die Quantifizierung in einer Körperflüssigkeitsprobe der Konzentrationen von einem ersten Peptid, umfassend ein C-terminales Typ-II-Kollagen-Telopeptid, das eine Hydroxylysyl-Pyridinolin-Quervernetzung, die einen intakten Pyridiniumring aufweist, enthält, und einem zweiten Peptid, umfassend ein C-terminales Typ-II-Kollagen-Telopeptid, das eine Hydroxylysyl-Pyridinolin-Quervernetzung, die einen gespaltenen Pyridiniumring aufweist, enthält.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 4, worin das erste und zweite Peptid die folgenden Strukturen aufweisen:
worin
Hydroxylysyl-Pyridinolin ist, wobei das erste und das zweite Peptid jeweils einen intakten oder einen gespaltenen Pyridiniumring enthalten; oder
worin
Hydroxylysyl-Pyridinolin ist, wobei das erste und das zweite Peptid jeweils einen intakten oder einen gespaltenen Pyridiniumring enthalten.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2 bis 5, worin die Körperflüssigkeit Urin, Blut, Serum oder Gelenkflüssigkeit ist.
Kit zum Durchführen eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, umfassend wenigstens einen spezifischen Bindungspartner des Typ-II-Kollagen-Telopeptids.
Verfahren zur Bestimmung von Knorpelabbau in vivo, umfassend die Quantifizierung der Konzentration eines Peptids in einer Körperflüssigkeitsprobe, gegebenenfalls Urin, Blut, Serum oder Gelenkflüssigkeit, wobei das Peptid ein C-terminales Typ-II-Kollagen-Telopeptid umfasst, das eine Hydroxylysyl-Pyridinolin-Quervernetzung enthält.
Verfahren gemäß Anspruch 8, worin der Detektionsschritt das in Kontakt Bringen der Körperflüssigkeit mit einem spezifischen Bindungspartner des C-terminalen Typ-II-Kollagen-Telopeptids umfasst.
Verfahren gemäß Anspruch 8 oder 9, worin das C-terminale Typ-II-Kollagen-Telopeptid wie folgt ist:
worin
Hydroxylysyl-Pyridinolin ist,
worin
Hydroxylysyl-Pyridinolin ist.
Ein C-terminales Typ-II-Kollagen-Telopeptid mit der Aminosäuresequenz
worin
Hydroxylysyl-Pyridinolin ist
worin
Hydroxylysyl-Pyridinolin ist.
Testkit zum Durchführen eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6 oder 8 bis 10, umfassend einen spezifischen Bindungspartner eines C-terminalen Typ-II-Kollagen-Telopeptids, das eine Hydroxylysyl-Pyridinolin-Quervernetzung enthält.
Testkit umfassend einen oder mehrere immunologische Bindungspartner, die spezifisch an ein C-terminales Typ-II-Kollagen-Telopeptid, das eine Hydroxylysyl-Pyridinolin-Quervernetzung enthält, binden.
Testkit umfassend einen oder mehrere immunologische Bindungspartner, die spezifisch an ein C-terminales Typ-II-Kollagen-Telopeptid, das eine Hydroxylysyl-Pyridinolin-Quervernetzung enthält, binden.
Zelllinie, die einen monoklonalen Antikörper produziert, der an ein Peptid gemäß Anspruch 11 bindet.
Antikörper, erhältlich aus einer Zelllinie gemäß Anspruch 14.
Antikörper, der an ein Peptid gemäß Anspruch 11 bindet.
Antikörper gemäß Anspruch 16, der ein monoklonaler Antikörper ist, der ein Epitop eines Peptids gemäß Anspruch 11 erkennt.
Immunometrisches Verfahren zum Bestimmen der Knorpelabbaurate, wobei das Verfahren das in Kontakt Bringen einer Körperflüssigkeitsprobe, gegebenenfalls Urin, Blut, Serum oder Gelenkflüssigkeit, mit einem immunologischen Bindungspartner umfasst, der ein Epitop in wenigstens einem C-terminalen Typ-II-Kollagen-Telopeptid erkennt, gewählt aus:
worin
Hydroxylysyl-Pyridinolin ist oder
worin
Hydroxylysyl-Pyridinolin ist.
Verfahren gemäß Anspruch 18, worin der immunologische Bindungspartner sowohl das erste als auch das zweite Telopeptid erkennt, wobei das erste Telopeptid aus Peptiden der in Anspruch 18 dargestellten Formeln gewählt ist, und in denen der Pyridiniumring in dem Quervernetzungsrest intakt ist, und das zweite Telopeptid das gleiche wie das erste Telopeptid ist, außer dass der Pyridiniumring gespalten ist.