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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis und zur Überwachung
von Kollagen-Abbau in vivo. Genauer gesagt, betrifft sie Verfahren
zum Quantifizieren von vernetzten Telopeptiden, welche in vivo beim
Abbau von Kollagen-Typ II erzeugt werden. Diese Anmeldung ist aus
der WO 91/08478 (EPA 91 900109.9) ausgegliedert, welche, wie veröffentlicht,
Verfahren zum Nachweisen und Verfolgen des Kollagen-Abbaus bezüglich Telopeptiden
der Kollagen-Typen I, II und III beschrieb und beanspruchte.
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Hintergrund
der Erfindung
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Bis
heute sind drei bekannte Klassen von Kollagenen beschrieben worden.
Die Klasse-I-Kollagene, unterteilt
in die Typen I, II, III, V und XI, bilden bekanntermaßen Fibrillen.
Diese Kollagene werden alle als Prokollagen-Moleküle synthetisiert,
aufgebaut aus N-terminalen und C-terminalen Propeptiden, welche
an das Kern-Kollagenmolekül
angeheftet sind. Nach Entfernung der Propeptide, welche natürlicherweise
in vivo während
der Kollagensynthese stattfindet, besteht der verbleibende Kern
des Kollagenmoleküls
großteils
aus einer tripelhelikalen Domäne
mit terminalen Telopeptid-Sequenzen, welche nicht-tripelhelikal
sind. Diese Telopeptid-Sequenzen besitzen eine wichtige Funktion
als Stellen der extrazellulären
intermolekularen Vernetzung von Kollagenfibrillen.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Nachweis des Kollagen-Abbaus,
basierend auf dem Assay bezüglich
besonderer vernetzter Telopeptide, welche in vivo beim Kollagen-Abbau erzeugt werden.
In der Vergangenheit sind Assays zum Verfolgen des Abbaus von Kollagen
in vivo durch Messen verschiedener biochemischer Marker entwickelt
worden, von denen einige Abbauprodukte von Kollagen gewesen sind.
Zum Beispiel ist der Knochen-Turnover,
welcher mit der Paget-Krankheit assoziiert ist, durch Messen kleiner,
hydroxyprolin-haltiger Peptide überwacht
worden, welche im Urin im Anschluss an den Abbau von Knochen-Kollagen
ausgeschieden werden; Russel et al., Metab, Bone Dis. and Rel. Res.
4 und 5, 255–262
(1981); und Singer, F. R., et al., Metabolic Bone Disease, Band
II (Hrsg. Avioli, L. V. und Kane, S. M.), 489–575 (1978), Academic Press,
New York.
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Andere
Forscher haben die vernetzende Verwindung Pyridinolin im Urin als
Index des Kollagen-Abbaus bei Gelenkerkrankung gemessen; für Hintergründe und
Beispiele siehe Wu und Eyre, Biochemistry, 23: 1850 (1984); Black
et al., Annals of the Rheumatic Diseases, 48: 641–644 (1989);
Robins et al., Annals of the Rheumatic Diseases, 45: 969–973 (1986);
und Seibel et al., The Journal of Rheumatology, 16: 964 (1989).
Im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung haben einige Forscher früher Peptide
aus Körperflüssigkeiten
hydrolysiert und dann nach der Gegenwart individueller Hydroxypyridnium-Reste
gesucht. Keiner von diesen Forschern hat über das Messen eines Telopeptids,
enthaltend eine Vernetzung, welche in vivo natürlich bei Kollagen-Abbau erzeugt
wird, wie in der vorliegenden Erfindung berichtet.
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Die
GB-Patentanmeldung
GB 2 205 643 berichtet,
dass der Abbau von Typ-III-Kollagen im Körper quantitativ durch Messen
der Konzentration eines N-terminalen Telopeptids aus Typ-III-Kollagen in einer
Körperflüssigkeit
bestimmt wird. In dieser Bezugsstelle wird berichtet, dass vernetzte
Telopeptid-Regionen nicht wünschenswert
sind. Tatsächlich
berichtet diese Bezugsstelle, dass es notwendig ist, eine nicht-vernetzte Quelle
von Kollagen zu verwenden, um das Telopeptid zu erhalten. Die Peptide
der vorliegenden Erfindung sind alle vernetzt. Kollagen-Vernetzungen
werden in größerer Ausführlichkeit
nachstehend unter der Überschrift "Kollagen-Vernetzung" erörtert.
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Es
gibt eine Reihe von Berichten, welche darauf hinweisen, dass der
Kollagen-Abbau durch Quantifizieren bestimmter Prokollagen-Peptide
gemessen werden kann. Die vorliegende Erfindung beinhaltet eher Telopeptide
denn als Propeptide, wobei die zwei durch ihre Lage im Kollagenmolekül und die
Zeitgebung ihrer Spaltung in vivo unterschieden sind; siehe U.S.-Patent 4 504 587;
U.S.-Patent 4 312 853; Pierard et al., Analytical Biochemistry 141:
127–136
(1984); Niemela, Clin. Chem., 31/8: 1301–1304 (1985); und Rohde et
al., European Journal of Clinical Investigation, 9: 451–459 (1979).
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Das
U.S.-Patent 4 778 768 betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von
Veränderungen,
welche in künstlichem
Knorpel auftreten, beinhaltend das Quantifizieren von Proteoglycan-Monomer
oder antigenen Fragmenten davon in einer Gelenkflüssigkeits-Probe.
Dieses Patent betrifft nicht das Nachweisen vernetzter Telepeptide,
welche aus abgebautem Kollagen stammen.
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Dodge,
J. Clin. Invest., 83: 647–661
(1981) offenbart Verfahren zum Analysieren des Typ-II-Kollagen-Abbaus unter
Verwendung eines polyklonalen Antiserums, welches mit entwundenen
Alpha-Ketten und Cyanogenbromid-abgeleiteten Peptiden von Typ-II-Kollagenen
von Mensch und Rind spezifisch reagiert. Die betroffenen Peptide
sind keine vernetzten Telopeptide, wie in der vorliegenden Erfindung.
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Aminosäuresequenzen
von humanem Typ-III-Kollagen, humanem Pro-a1-(II)-Kollagen und die
gesamte Prä-Pro-a1(III)-Kette
von humanem Typ-III-Kollagen und entsprechende cDNA-Klone sind von mehreren
Forschergruppen untersucht und bestimmt worden; siehe Loidl et al.,
Nucleic Acids Research, 12: 9383–9394 (1984); Sangiorgi et
al., Nucleic Acids Research, 13: 2207–2225 (1985); Baldwin et al.,
Biochem. J., 262: 521–528
(1989); und Ala-Kokko et al., Biochem. J., 260: 509–516 (1989).
Keine dieser Bezugsstellen beschreibt die Strukturen von besonderen
Telopeptid-Abbauprodukten, welche gemessen werden könnten, um
die Menge an abgebautem fibrillären
Kollagen in vivo zu bestimmen.
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Trotz
der obenstehend beschriebenen Hintergrundinformation bleibt ein
Bedarf nach effektiven und einfachen Assays zur Bestimmung des Kollagenabbaus
in vivo bestehen. Derartige Assays könnten angewandt werden, um
Krankheitszustände
in Menschen, wie Osteoarthritis (Typ-II-Kollagen-Abbau) und verschiedene
Entzündungskrankheiten,
wie das Vasculitis-Syndrom
(Typ-III-Kollagen-Abbau), nachzuweisen und zu überwachen.
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Assays
für Typ-I-Kollagen-Abbau,
beschrieben in der WO-A-85/04491, können angewandt werden, um Knochenresorption
in vivo nachzuweisen und zu überprüfen.
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Es
sind mehrere potentielle organische Indizes getestet worden. Beispielsweise
wird Hydroxyprolin, eine großteils
auf Kollagen und das Haupt-Strukturprotein in Knochen und allen
anderen Bindegeweben beschränkte
Aminosäure,
in Urin ausgeschieden. Seine Ausscheidungsrate wird bekanntermaßen bei
gewissen Befunden erhöht,
insbesondere der Paget-Krankheit,
einer metabolischen Knochenerkrankung, in welcher der Knochen-Turnover
in großen
Maße erhöht ist,
wie obenstehend hervorgehoben. Aus diesem Grund wurde Hydroxyprolin
im Urin als ein Aminosäuremarker
für Kollagenabbau
weithin herangezogen; Singer, F. R., et al. (1978), hierin obenstehend
zitiert.
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Das
U.S.-Patent Nr. 3 600 132 offenbart ein Verfahren zur Bestimmung
von Hydroxyprolin in Körperflüssigkeiten,
wie Serum, Urin, Lumbal-Fluid und anderen interzellulären Fluiden,
um Abweichungen im Kollagenstoffwechsel zu überwachen. Insbesondere bemerkt
dieser Erfinder, dass bei pathologischen Zuständen, wie der Paget-Erkrankung,
dem Marfan-Syndrom, Ostoegenesis imperfecta, neoplastischem Wachstum
in Kollagen-Geweben und in verschiedenen Formen von Zwergenwuchs,
ein erhöhter
Kollagen-Anabolismus oder -Katabolismus, wie gemessen durch den
Hydroxyprolin-Gehalt in biologischen Fluiden, festgestellt werden
kann. Dieser Erfinder misst Hydroxyprolin durch Oxidieren desselben
zu einer Pyrrolverbindung mit Wasserstoffperoxid und N-Chlor-p-toluolsulfonamid,
gefolgt von colorimetrischer Bestimmung in p-Dimethylaminobenzaldehyd.
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Im
Falle der Paget-Krankheit stammt der erhöhte Gehalt von Hydroxyprolin
im Urin wahrscheinlich großteils
aus dem Knochenabbau; Hydroxyprolin kann jedoch im allgemeinen nicht
als ein spezifischer Index verwendet werden. Viel von dem Hydroxyprolin
im Urin kann aus der neuen Kollagensynthese (beträchtliche Mengen
des neu hergestellten Proteins werden abgebaut und ausgeschieden,
ohne jemals in Gewebematerial eingebaut zu werden) und aus dem Turnover
bestimmter Blutproteine sowie anderer Proteine, welche Hydroxyprolin
enthalten, stammen. Darüber
hinaus werden etwa 80% des freien Hydroxyprolins, welches aus dem Proteinabbau
stammt, in der Leber metabolisiert und erscheinen niemals im Urin.
Kiviriko, K. I., Int. Rev. Connect. Tissue Res. 5: 93 (1970), und
Weiss, P. H., und Klein, L., J. Clin. Invest. 48: 1 (1969).
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Hydroxylysin
und seine Glycosid-Derivate, beides eigentümlich für kollagenartige Proteine,
sind als Marker für
den Kollagenabbau als genauer wie Hydroxyprolin betrachtet worden.
Aus denselben Gründen,
wie obenstehend für
Hydroxyprolin beschrieben, sind jedoch Hydroxylysin und seine Glycoside
wahrscheinlich gleichermaßen
nicht-spezifische Marker für
die Knochen-Resorption; Krane, S. M., und Simon, L. S., Develop. Biochem.,
22: 185 (1981).
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Kollagen-Vernetzung
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Die
Polymere der meisten genetischen Typen von Wirbeltier-Kollagen erfordern
die Bildung von Aldehyd-vermittelten Vernetzungen für eine normale
Funktion. Kollagen-Aldehyde werden aus einigen wenigen spezifischen
Lysin- oder Hydroxylysin-Seitenketten durch die Wirkung von Lysyloxidase
abgeleitet. Verschiedene di-, tri- und tetrafunktionale vernetzende
Aminosäuren
werden durch die spontanen intra- und intermolekularen Reaktionen
dieser Aldehyde innerhalb der neu gebildeten Kollagenpolymere gebildet;
der Typ des vernetzenden Rests variiert spezifisch mit dem Gewebetyp
(siehe Eyre, D. R. et al., Ann. Rev. Biochem., 53: 717–748 (1984)).
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Zwei
grundlegende Wege der Vernetzung können für die streifigen (67 nm-Wiederholung)
fibrillären Kollagene
unterschieden werden, einer auf Basis von Lysinaldehyden, der andere
auf Basis von Hydroxylysin-Aldehyden. Der Lysinaldehyd-Weg dominiert
in erwachsener Haut, Hornhaut, Sclera und Rattenschwanzsehnen und
tritt häufig
auch in anderen weichen Bindegeweben auf. Der Hydroxylysin-Aldehydweg
dominiert in Knochen, Knorpel, Ligamenten, den meisten Sehnen und
den meisten inneren Bindegeweben des Körpers, Eyre, D. R., et al.
(1974) siehe oben. Der eingeschlagene Weg wird davon beherrscht,
ob Lysinreste in den Telopeptid-Stellen hydroxyliert sind, wo Aldehydreste
später
durch Lysyloxidase gebildet werden (Barnes, M. J., et al., Biochem.
J., 139: 461 (1974)).
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Die
chemischen Strukturen) der reifen vernetzenden Aminosäuren auf
dem Lysinaldehydweg sind unbekannt, aber Hydroxypyridinium-Reste
sind als reife Produkte auf der Hydroxylysin-Aldehyd-Route identifiziert worden.
Auf beiden Wegen und in den meisten Geweben verschwinden die intermediären, Borhydrid-reduzierbaren
vernetzenden Reste, wenn das neu gebildete Kollagen reift, was nahelegt,
dass sie relativ kurzlebige Intermediate sind (Bailey, A. J., et
al., FEBS Lett, 16: 86 (1971)). Ausnahmen sind Knochen und Dentin, worin
die reduzierbaren Reste in nennenswerter Konzentration während des
gesamten Lebens persistieren, anscheinend teilweise weil die rasche
Mineralisierung der neu hergestellten Kollagenfibrillen zukünftige spontane
Vernetzungs-Wechselwirkungen inhibiert (Eyre, D. R., In: The Chemistry
and Biology of Mineralized Connective Tissues, (Hrsg.: Veis, A.),
S. 51–55
(1981), Elsevier, New York, und Walters, C., et al., Calc. Tiss.
Intl. 35: 401–405
(1983)).
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Zwei
chemische Formen von 3-Hydroxypyridinium-Vernetzung sind identifiziert
worden (Formel I und II). Beide Verbindungen sind natürlicherweise
fluoreszent, mit denselben charakteristischen Anregungs- und Emissionsspektren
(Fujimoto, D., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 76: 1124
(1977), und Eyre, D. R., Develop. Biochem. 22: 50 (1981)). Diese
Aminosäuren
können
bei guter Empfindlichkeit direkt in Gewebehydrolysaten aufgetrennt
und geassayt werden unter Verwendung von Umkehrphasen-HPLC und Fluoreszenznachweis;
Eyre, D. R., et al., Analyte. Biochem., 137: 380–388 (1984). Es sollte bemerkt
werden, dass die vorliegende Erfindung eher die Quantifizierung
von besonderen Peptiden als von Aminosäuren beinhaltet.
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In
wachsenden Tieren ist es berichtet worden, dass diese reifen Vernetzungen
in einer nicht-mineralisierten
Fraktion von Knochen-Kollagen stärker
konzentriert werden können
als in dem mineralisierten Kollagen (Banes, A. J., et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun., 113: 1975 (1983)). Allerdings unterstützen andere
Untersuchungen an jungem Rinder- oder erwachsenem Menschen-Knochen
dieses Konzept nicht; Eyre, D. R., In: The Chemistry and Biology
of Mineralized Tissues (Hrsg.: Butler, W. T.), S. 105 (1985), Ebsco
Media Inc., Birmingham, Alabama.
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Das
Vorhandensein von Kollagen-Hydroxypyridinium-Vernetzungen in menschlichem
Urin wurde zuerst von Gunja-Smith und Boucek (Gunja-Smith, Z., und
Boucek, R. J., Biochem J., 197: 759–762 (1981)) unter Anwendung
langwieriger Isolationsvorgehensweisen für Peptide und herkömmlicher
Aminosäureanalyse
berichtet. Zu dieser Zeit kannte man bewusst lediglich die HP-Formen
der Vernetzung. Robins (Robins, S. P., Biochem J., 207: 617–620 (1982))
hat über
einen Enzym-Linked-Immunoassay zur Messung von HP in Urin berichtet,
welcher erhöhte
polyklonale Antikörper
gegen die an Rinderserumalbumin gekoppelte freie Aminosäure aufwies.
Mit diesem Assay wird beabsichtigt, einen Index zum Überwachen
einer erhöhten
Gelenkzerstörung
vorzusehen, welche bei arthritischen Krankheiten auftritt, und nach
Robins basiert er auf der Feststellung, dass Pyridinolin im Knorpel
wesentlich stärker
vorherrscht als in Knochen-Kollagen.
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In
jüngeren
Arbeiten, beinhaltend Enzym-Linked-Immunoassay, berichtet Robins,
dass Lysyl-Pyridinolin
gegenüber
Antiserum gegen Pyridinolin, kovalent verknüpft an Rinderserumalbumin,
unreaktiv ist (Robins et al., Ann. Rheum. Diseases, 45: 969–973 (1986)).
Der Urinindex für
die Knorpelzerstörung
nach Robins basiert auf der Feststellung, dass hauptsächlich aus
Knorpel stammendes Hydroxylysylpyridinolin im Urin bei Konzentrationen,
proportional zur Rate der Gelenkknorpel-Resorption (d. h. Abbau),
gefunden wird. Im Prinzip könnte
dieser Index verwendet werden, um den Gesamtkörper-Knorpelverlust zu messen;
allerdings wäre
keine Information über
die Knochenresorption verfügbar.
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Ebenfalls
von Interesse ist die internationale Veröffentlichung Nr. WO 89/12824
des "The Rowett
Research Institute".
Diese letztgenannte Veröffentlichung
beschreibt ein Verfahren zur Verfolgung des Kollagenabbaus, umfassend
einen Assay einer biologischen Fluidprobe, welche ein Fragment von
Kollagen enthält, einschließend Lysyl-Pyrodinolin
oder Hydroxylysyl-Pyridinolin
oder eine substituierte Form davon, und ein Verfahren zur Bestimmung
der Gewebeherkunft von dadurch abgebautem Kollagen.
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Es
besteht deshalb ein Bedarf nach einem Verfahren, welches die Abbauraten-Messung
von Gesamtkörper-Knorpel
oder kollagenhaltigem Bindegewebe in Menschen erlaubt. Das nützlichste
derartige Verfahren wäre
ein solches, weiches auf Körperflüssigkeiten,
speziell Urin, angewandt werden könnte. Das Verfahren sollte
empfindlich sein, d. h. quantifizierbar hinab bis zu 1 Picomol,
und die 24-Stunden-Knochenresorptionsraten rasch messen, so dass
der Fortschritt verschiedener Therapien überprüft werden kann.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung beruht auf der Feststellung des Vorhandenseins
bestimmter vernetzter Telopeptide in Körperflüssigkeiten von Patienten und
normalen menschlichen Subjekten. Diese Telopeptide werden in vivo
während
Kollagenabbau und -neumodellierung hergestellt. Der Begriff "Telopeptide" wird hierin verwendet,
um vernetzte Peptide mit Sequenzen zu bedeuten, welche mit der Telopeptidregion
von Typ-II-Kollagen assoziiert sind. Im Allgemeinen werden die hierin
offenbarten Telopeptide weniger Aminosäurereste aufweisen als vollständige Telopeptiddomänen von
Typ-II-Kollagen. Typischerweise werden die Telopeptide der vorliegenden
Erfindung zwei Alpha-Eins(a1)-Peptide, verknüpft durch eine Pyridinium-Quervernetzung
und weiterhin verknüpft
durch die Pyridinium-Quervernetzung an einen Rest oder ein Peptid
der tripelhelikalen Kollagen-Domäne,
umfassen. Nach Offenbarung der Strukturen dieser Telopeptide hierin,
wird es der Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet richtig einschätzen, dass
sie auch anders als in vivo, z. B. synthetisch, hergestellt werden
können.
Diese Peptide werden im Allgemeinen in gereinigter Form, z. B. im
Wesentlichen frei von Verunreinigungen, insbesondere anderen Peptiden,
vorgesehen werden.
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls Verfahren zur Bestimmung
des in-vivo-Abbaus von Typ-II-Kollagen. Die Verfahren beinhalten
das Quantifizieren der Konzentration von bestimmten Telopeptiden, welche
eine 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzung aufweisen und welche aus
dem Kollagenabbau abgeleitet sind, in einer Flüssigkeitsprobe. Die in der
vorliegenden Erfindung offenbarten Verfahren sind analog zu denjenigen,
offenbart in der WO-A-89/04491,
zur Bestimmung der absoluten Rate der Knochenresorption in vivo. Die
Verfahren beinhalteten das Quantifizieren der Konzentration von
Telopeptiden mit einer 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzung, abgeleitet
aus Typ-I-Kollagenresorption, in einer Körperflüssigkeit.
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In
einem Aspekt sieht die vorliegende Erfindung somit ein Verfahren
zum Bestimmen von Typ-II-Kollagen-Abbau vor, umfassend das Quantifizieren
der Konzentration von wenigstens einem ersten 3-Hydroxypyridinium-vernetzten
Typ-II-Kollagen-Telopeptid in einer Körperflüssigkeitsprobe, gegebenfalls
Urin, Blut, Serum oder Gelenkflüssigkeit.
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In
einem anderen Aspekt wird ein Verfahren zum Bestimmen des Knorpelabbaus
in vivo vorgesehen, umfassend die Quantifizierung in einer Körperflüssigkeitsprobe
der Konzentrationen von einem ersten Peptid, umfassend ein C-terminales
Typ-II-Kollagen-Telopeptid,
das eine Hydroxylysyl-Pyridinolin-Quervernetzung, die einen intakten
Pyridiniumring aufweist, enthält,
und einem zweiten Peptid, umfassend ein C-terminales Typ-II-Kollagen-Telopeptid,
das eine Hydroxylysyl-Pyridinolin-Quervernetzung, die einen gespaltenen
Pyridiniumring aufweist, enthält.
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Ein
weiterer Aspekt der Erfindung sieht ein Verfahren zum Bestimmen
von Knorpelabbau in vivo vor, umfassend die Quantifizierung der
Konzentration eines Peptids in einer Körperflüssigkeitsprobe, gegebenfalls Urin,
Blut, Serum oder Gelenkflüssigkeit,
wobei das Peptid ein C-terminales
Typ-II-Kollagen-Telopeptid umfasst, das eine Hydroxylysyl-Pyridinolin-Quervernetzung
enthält.
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Bei
noch einem weiteren Aspekt der Erfindung handelt es sich um ein
immunometrisches Verfahren zum Bestimmen der Knorpelabbaurate, wobei
das Verfahren das in Kontakt Bringen einer Körperflüssigkeitsprobe, gegebenfalls
Urin, Blut, Serum oder Gelenkflüssigkeit,
mit einem immunologischen Bindungspartner umfasst, der ein Epitop
in wenigstens einem C-terminalen
Typ-II-Kollagen-Telopeptid erkennt, gewählt aus:
worin
Hydroxylysyl-Pyridinolin
ist oder
worin
Hydroxylysyl-Pyridinolin
ist.
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In
einem repräsentativen
Assay wird die Körperflüssigkeit
des Patienten in Kontakt mit einem immunologischen Bindungspartner
gebracht, der spezifisch für
ein Telopeptid ist, das eine 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzung
aufweist, abgeleitet aus Typ-II-Kollagen. Die Körperflüssigkeit kann, wie vorbereitet,
verwendet werden oder vor dem Kontaktierungsschritt gereinigt werden.
Dieser Reinigungsschritt kann unter Anwendung einer Reihe von Standardvorgehensweisen
bewerkstelligt werden, einschließlich Patronen-Adsorption und
Elution, Molekularsieb-Chromatographie, Dialyse, Ionenaustausch,
Aluminiumoxid-Chromatographie, Hydroxyapatit-Chromatographie und
Kombinationen hiervon.
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Andere
repräsentative
Ausführungsformen
der Quantifizierung der Konzentration von Peptidfragmenten mit einer
3-Hydroxypyridinium-Quervernetzung in einer Körperflüssigkeit schlie ßen elektrochemische
Titration, natürliche
Fluoreszenz-Spektroskopie und Ultraviolett-Extinktion ein. Elektrochemische Titration
kann direkt an einer Körperflüssigkeit
ohne weitere Aufreinigung durchgeführt werden. Wenn dies allerdings
aufgrund der übermäßigen Mengen
an kontaminierenden Substanzen nicht möglich ist, wird die Körperflüssigkeit vor
dem elektrochemischen Titrationsschritt zuerst gereinigt. Geeignete
Verfahren zur Reinigung vor dem elektrochemischen Nachweis schließen Dialyse,
Ionenaustausch-Chromatographie, Aluminiumoxid-Chromatographie, Molekularsieb-Chromatographie,
Hydroxyapatit-Chromatographie und Ionenaustausch-Adsorption und Elution
ein.
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Die
fluorometrische Messung einer Körperflüssigkeit,
enthaltend eine 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzung, ist ein alternativer
Weg zur Quantifizierung des Kollagen-Abbaus.
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Der
fluorometrische Assay kann direkt an einer Körperflüssigkeit ohne weitere Reinigung
durchgeführt werden.
Für bestimmte
Körperflüssigkeiten,
insbesondere Urin, wird es allerdings bevorzugt, dass eine Reinigung
der Körperflüssigkeit
vor dem fluorometrischen Assay durchgeführt wird. Dieser Reinigungsschritt
besteht aus dem Dialysieren eines Aliquots einer Körperflüssigkeit
wie Urin, gegen eine wässrige
Lösung,
wodurch teilweise gereinigte Peptidfragmente hergestellt werden,
welche innerhalb des Nicht-Diffusats (Retentat) zurückgehalten
werden. Das Nicht-Diffusat wird dann lyophilisiert, in einer Ionenpaar-Lösung aufgelöst und auf einer
Affinitätschromatographie-Säule absorbiert.
Die Chromatographiesäule
wird mit einem Volumen der Ionenpaar-Lösung gewaschen, und danach
werden die Peptidfragmente aus der Säule mit einer Elutionslösung eluiert.
Diese gereinigten Peptidfragmente können dann hydrolysiert und
das Hydrolysat chromatographisch aufgetrennt werden. Die chromatographische
Auftrennung kann entweder durch Hochleistungsflüssigkeits-Chromatographie oder
Kapillar-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
durchgeführt
werden.
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Die
Erfindung schließt
Peptide ein, aufweisend identische Strukturen zu aus Kollagen-Abbau
abgeleiteten Peptiden, im wesentlichen frei von anderen humanen
Peptiden, welche aus einer Körperflüssigkeit
erhalten werden können.
Die Peptide enthalten wenigstens eine 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzung,
insbesondere eine Lysyl-Pyridinolin-Quervernetzung oder eine Hydroxylysyl-Pyridinolin-Quervernetzung,
und sind aus der Telopeptid-Region von Typ-II-Kollagen, verknüpft an einen oder mehrere Reste
aus einer tripelhelikalen Domäne,
typischerweise durch die Wirkung von endogenen Proteasen und/oder
Peptidasen abgeleitet.
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Somit
sieht die Erfindung ein C-terminales Typ-II-Kollagen-Telopeptid
vor, aufweisend die Aminosäuresequenz
worin
Hydroxylysyl-Pyridinolin
ist oder
worin
Hydroxylysyl-Pyridinolin
ist.
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Die
Strukturen der Typ-II-Telopeptide sind nachstehend beschrieben.
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Ein
anderer Aspekt der vorliegenden Erfindung beinhaltet Assays für die hierin
beschriebenen Peptide, in welchen die Pyridiniumringe intakt und
gespalten sind. Da es vermutet wird, dass eine gewisse Spaltung von
Pyridiniumringen in vivo stattfindet, können Assays, welche sowohl
intakte als auch gespaltene Pyridiniumringe nachweisen, zu genaueren
Einschätzungen
des Kollagen-Abbaus führen.
Im Zusammenhang mit diesem Aspekt der vorliegenden Erfindung können spezifische
Bindungspartner für
die individuellen Peptide, enthaltend intakte oder gespaltene Pyridiniumringe,
in den Assays verwendet werden. Individuelle spezifische Bindungspartner,
welche beide Typen von Peptiden erkennen (sowohl intakte als auch
gespaltene Pyridiniumringe enthaltende Peptide), können eingesetzt
werden. Alternativ dazu könnten
auch spezifische Bindungspartner, welche zwischen Peptiden, enthaltend
den intakten Pyridiniumring, und denjenigen, in welchen der Pyridiniumring
gespalten ist, unterscheiden, verwendet werden.
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Die
Erfindung betrifft im allgemeinen alle spezifischen Bindungspartner
für die
hierin beschriebenen Peptide. "Spezifische
Bindungspartner" sind
Moleküle,
welche in der Lage zur Bindung an die Peptide der vorliegenden Erfindung
sind. Innerhalb dieses Begriffs eingeschlossen sind immunologische
Bindungspartner, wie Antikörper
(monoklonal und polyklonal), antigenbindende Fragmente von Antikörpern (z.
B. Fab- und F(ab')2-Fragmente), einzelkettige antigenbindende
Moleküle
und dergleichen, ob mittels Hybridom- oder rDNA-Technologien hergestellt.
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Die
Erfindung schließt
fusionierte Zellhybride (Hybridome) ein, welche monoklonale Antikörper erzeugen,
spezifisch für
die obenstehend beschriebenen Kollagenpeptide mit 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzungen
(sowohl mit einem intakten Pyridiniumring als auch einem solchen,
welcher gespalten worden ist).
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Die
Erfindung schließt
ferner monoklonale Antikörper
ein, welche durch die fusionierten Zellhybride hergestellt wurden,
und diese Antikörper
(sowie bindende Fragmente davon, z. B. Fab), welche an einen detektierbaren
Marker gekoppelt sind. Beispiele für detektierbare Marker schließen Enzyme,
Chromophore, Fluorophore, Coenzyme, Enzyminhibitoren, chemolumineszente
Materialien, paramagnetische Metalle, Spin-Markierungen und radioaktive
Isotope ein. Solche spezifischen Bindungspartner können alternativerweise
an ein Mitglied eines Ligand-Bindungspartner-Komplexes (z. B. Avidin-Biotin)
gekoppelt sein, in welchem Falle der detektierbare Marker an das
komplementäre
Mitglied des Komplexes gebunden zur Verfügung gestellt werden kann.
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Die
Erfindung beinhaltet ebenfalls Testkits, nützlich zur Quantifizierung
der Menge von Peptiden mit 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzungen,
welche aus Kollagen-Abbau abgeleitet sind, in einer Körperflüssigkeit.
Die Kits können
einen spezifischen Bindungspartner für ein aus abgebautem Kollagen
abgeleitetes Peptid, wie hierin offenbart, einschließen. Die
spezifischen Bindungspartner der Testkits können an einen detektierbaren
Marker oder ein Mitglied eines Ligand-Bindungspartner-Komplexes,
wie oben stehend beschrieben, gekoppelt sein.
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Kurze Beschreibung
der Zeichnungen
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Die 1 ist
eine Abbildung von Typ-II-Kollagen und ein Vorschlag für die Quelle
von Telopeptiden. Es ist nicht bestätigt, ob die zwei gezeigten
Telopeptide aus einem Kollagenmolekül, wie gezeigt in 1,
oder aus zwei Kollagenmolekülen
kommen.
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Die 2 zeigt
die relative Fluoreszenz (297 nm Anregung; 390 nm Emission) gegen
die Fraktions-Nummer (4 ml), erhalten während einer chromatographischen
Molekularsieb-Reinigung
von vernetzten Telopeptiden. Vernetzte Typ-II-Kollagen-Telopeptide
sind in den mit II bezeichneten Fraktionen enthalten.
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Die 3A zeigt
die relative Fluoreszenz (330 nm Anregung, 390 nm Emission) gegen
die Elutionszeit von Fraktionen während einer Ionenaustausch-HPLC
(DEAE-SPW). Vernetzte Typ-II-Kollagen-Telopeptide sind in der mit
IV bezeichneten Fraktion enthalten.
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Die 3B zeigt
die Extinktion (220 nm) gegen die Elutionszeit in Minuten für dasselbe
Chromatogramm.
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Die 4A zeigt
die relative Fluoreszenz (297 nm Anregung, 390 nm Emission) gegen
die Elutionszeit von Fraktionen während einer Umkehrphasen-HPLC.
Vernetzte Typ-II-Kollagen-Telopeptide
werden eluiert, wie angegeben. Die durch den Balken (–) angegebenen
Fraktionen zeigen Beweise durch Sequenz- und eine Zusammensetzungsanalyse
der angegebenen Peptide, dass sie die Reste Gly (G) und Pro (P)
beibehalten oder verloren haben.
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Die 4B zeigt
die Extinktion (220 nm) als Funktion der Elutionszeit während der
Umkehrphasen-HPLC.
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Ausführliche
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform
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Typ-II-Kollagen-Telopeptide
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Ein
spezifisches Telopeptid mit einer Hydroxylysyl-Pyridinolin-Quervernetzung,
abgeleitet aus der C-terminalen Telopeptid-Domäne von Typ-II-Kollagen, besitzt
die folgende Aminosäuresequenz
(hierin nachstehend bezeichnet als die Kernpeptidstruktur): Formel
III
worin der vernetzende Rest, dargestellt als Hyl-Hyl-Hyl,
Hydroxylysyl-Pyridinolin (HP) ist, ein natürlicher 3-Hydroxypyridinium-Rest,
welcher in reifen Kollagenfibrillen verschiedener Gewebe vorhanden
ist.
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Die
Kernpeptidstruktur der Typ-II-Kollagenpeptide kann in Körperflüssigkeiten
als Komponente größerer Peptide
gefunden werden, welche zusätzliche
Aminosäuren
oder Aminosäuresequenzen
an einem oder mehreren Enden der drei Peptidsequenzen tragen, welche
durch den HP-Rest verknüpft
sind. Die
1 zeigt, wie Typ-II-Kollagen-Telopeptide,
welche an eine tripelhelikale Sequenz verknüpft sind, in vivo aus einer menschlichen
Quelle unter Verwendung der proteolytischen Enzyme Pepsin und Trypsin
hergestellt werden können.
Kleinere Fragmente, welche Aminosäuren aus der Kernpeptidstruktur
verloren haben, insbesondere aus der helikalen Sequenz, können ebenfalls
in Körperflüssigkeiten
auftreten. Im Allgemeinen werden Additionen oder Deletionen von
Aminosäuren
aus der Kernpeptidstruktur 1 bis etwa 3 Aminosäuren beteiligen. Zusätzliche
Aminosäuren
werden im allgemeinen durch die Typ-II-Kollagen-Telopeptid-Sequenz bestimmt
werden, welche natürlich
in vivo vorkommt. Als Beispiele können Peptide mit der folgenden
Struktur: Formel
III
und Formel
IV
chromatographisch aus Urin isoliert werden, und
ein Anderes mit der Struktur: Formel
V
kann isoliert werden. Darüber hinaus können glycosylierte
Varianten der Kernstruktur und ihre größeren und kleineren Varianten
auftreten, in welchen ein Galactoserest oder ein Glucosylgalactoserest
an die Seitenketten-Hydroxylgruppe des HP-Quervernetzungs-Rests
angeheftet sind. Jeder Gipfel in der Grafik, welche in den
4A und
4B gezeigt
ist, kann einem vernetzten Fragment mit einer besonderen Struktur
entsprechen, welches für
die Zwecke der vorliegenden Erfindung quantifiziert werden kann.
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Diese
Strukturen sind konsistent mit ihrer Herkunftsstelle in humanen
Typ-II-Kollagenfibrillen an einer molekularen Quervernetzungsstelle,
gebildet zwischen zwei al(II)-C-Telopeptiden
und dem Rest 87 einer tripelhelikalen Domäne, deren bekannte Sequenzen
die folgenden sind:
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Die
isolierten Peptidfragmente repräsentieren
die Produkte des proteolytischen Abbaus von Typ-II-Kollagenfibrillen
innerhalb des Körpers.
Die Kernstruktur, welche den HP-Rest enthält, ist relativ resistent gegenüber weiterer
Proteolyse und sieht ein quantitatives Maß der Menge an abgebautem Typ-II-Kollagen vor.
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Kollagen-Typ-II
ist im hyalinen Knorpel von Gelenken im Erwachsenenskelett vorhanden.
Die Quantifizierung der Kollagen-Typ-II-Telopeptide in einer Körperflüssigkeit,
zum Beispiel mittels eines monoklonalen Antikörpers, welcher ein Epitop in
der Peptidstruktur erkennt, würde
ein quantitatives Maß der
Gesamtkörper-Knorpelzerstörung oder
-Neumodellierung vorsehen. In einer bevorzugten Ausführungsform
beinhaltet die vorliegende Erfindung einen Assay für Knorpelgewebe-Abbau
in Menschen, basierend auf der Quantifizierung der Urin-Ausscheidungsrate
von mindestens einem Mitglied dieser Familie von Telopeptiden. Ein
derartiger Assay könnte
beispielsweise angewandt werden, um:
- (1) adulte
humane Subjekte nach denjenigen Individuen zu screenen, welche abnorm
hohe Knorpelabbau-Raten aufweisen, als frühem diagnostischen Indikator
von Osteoarthritis;
- (2) die Effekte von potenziellen antiarthritischen Arzneimitteln
auf den Knorpelmetabolismus in Osteoarthritis- und rheumatoiden
Arthritis-Patienten zu überwachen;
oder
- (3) den Fortschritt von degenerativer Gelenkerkrankung in Patienten
mit Osteoarthritis und rheumatoider Arthritis und ihre Antworten
auf verschiedene therapeutische Eingriffe zu überwachen.
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Osteoarthritis
ist eine Degenerationserkrankung der artikulierenden Knorpel von
Gelenken. In ihren frühen
Stadien ist sie großteils
nicht-entzündlich
(d. h. unterschieden von rheumatoider Arthritis). Sie ist keine einzelne
Krankheit, sondern repräsentiert
die späteren
Stadien von Gelenkversagen, welche aus verschiedenen Faktoren resultieren
können
(z. B. genetische Veranlagung, mechanische Überbeanspruchung, Gelenkmissbildung
oder eine frühere
Verletzung etc.). Die Zerstörung
von Gelenk-Artikulärknorpel
ist das zentrale progressive Kennzeichen von Osteoarthritis. Das
Auftreten von Osteoarthritis, basierend auf radiographischen Untersuchungen,
liegt im Bereich von 4% in der Altersgruppe von 18–24 Jahren
bis 85% in der Altersgruppe von 75–79 Jahren. Derzeit kann die
Krankheit lediglich durch Schmerz- und radiographische oder andere
Bilderzeugungs-Anzeichen einer fortgeschrittenen Knorpelerosion
diagnostiziert werden.
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Die
obenstehend offenbarten Assays können
angewandt werden, um frühe
Beweise eines beschleunigten Knorpelabbaus in mild symptomatischen
Patienten zu detektieren, den Krankheitsverlauf in fortgeschritteneren
Patienten zu verfolgen, und als Mittel zur Verfolgung der Effekte
von Arzneimitteln oder anderen Therapien.
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In
normalen jungen Erwachsenen (mit ausgereiften Skeletten) besteht
wahrscheinlich ein sehr geringer Abbau des Knorpelkollagens. Ein
Test, welcher Fragmente von Knorpelkollagen im Urin (und im Blut
und der Gelenkflüssigkeit)
messen könnte,
wäre sehr
nützlich
zur Beurteilung der "Gesundheit" des Knorpels im gesamten
Körper
und in einzelnen Gelenken. Die obenstehend beschriebenen Typ-II-Kollagen-spezifischen Peptid-Assays
werden dies bewerkstelligen. Langfristig könnte ein derartiger Assay ein
routinemäßiger diagnostischer
Screen zum Aufspüren
derjenigen Individuen sein, deren Gelenke sich abnutzen. Diese könnten früh für eine vorbeugende
Therapie ausgewählt
werden, beispielsweise durch die nächste Generation sogenannter
chondroprotektiver Arzneimittel, die jetzt von den größeren pharmazeutischen
Firmen ausgewertet werden, welche alle aktiv nach besseren Mitteln
zur Behandlung von Osteoarthritis suchen.
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Andere
Erkrankungen, in denen Gelenkknorpel zerstört wird, schließen ein:
rheumatoide Arthritis, juvenile rheumatoide Arthritis, ankylosierende
Spondylitits, psoriatrische Arthritis, Reiter-Syndrom, rezidivierende
Polychondritis, das untere Rückenschmerzen-Syndrom
und andere infektiöse
Formen von Arthritis. Die hierin beschriebenen Typ-II-Kollagen-spezifischen Assays
könnten
angewandt werden, um diese Krankheiten zu diagnostizieren und zu überwachen
und deren Antwort auf eine Therapie auszuwerten, wie obenstehend im
Zusammenhang mit Osteoarthritis offenbart wurde.
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Isolierung
von Typ-II-Kollagen-Telopeptiden
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Allgemeine Vorgehensweise:
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Urin
wird von einem normalen Heranwachsenden während einer raschen Phase des
Skelettwachstums gesammelt. Unter Anwendung einer Abfolge von chromatographischen
Schritten, welche ohne Einschränkung
darauf die Adsorption auf selektiven Patronen eines hydrophoben
Wechselwirkungs-Trägers
und eines Ionenaustausch-Trägers
und Molekularsieb-, Ionenaustausch- und Umkehrphasen-HPLC-Säulen-Chromatographieschritte
einschließen,
werden individuelle Peptide isoliert. Die vernetzten Peptide, enthaltend
HP- (und LP-)Reste, werden während
der Säulenchromatographie
durch ihre natürliche
Fluoreszenz nachgewiesen (Ex. max 297 nm < pH 4, Ex. max 330 nm, > pH 6; Em. max 390
nm). Ein beispielhaftes Isolationsvorgehen wird im nachstehenden
Beispiel angegeben.
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Spezifisches Beispiel:
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Frischer
Urin (bei 4°C),
fünffach
verdünnt
mit Wasser und eingestellt auf 2% (v/v) Trifluoressigsäure, wurde
durch eine hydrophobe C-18-Bindungs-Patrone hindurchgeleitet (Waters
C-18 Sep-Pak, vorbenetzt
mit 80% (v/v) Acetonitril, dann gewaschen mit Wasser). Zurückgehaltene
Peptide wurden mit Wasser gewaschen, dann mit 3 ml 20%igem (v/v)
Acetonitiril eluiert, und dieses Eluat wurde auf 0,05 M NH4HCO3, 10% (v/v)
Acetonitril eingestellt durch Zugabe eines gleichen Volumens an
0,1 M NH4HCO3. Diese
Lösung
wurde durch eine QMA-Sep-Pak
(Waters) hindurchgeleitet, welche mit 10 ml 0,1 M NaCl, 20% (v/v)
Acetonitril, gefolgt von 10 ml Wasser gewaschen wurde, und die Peptide
wurden dann mit 3 ml 1% (v/v) Trifluoressigsäure eluiert und mittels Speed-Vac
(Savant) getrocknet.
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Peptide
wurden in drei chromatographischen Schritten fraktioniert. Der erste
Schritt war eine Molekularsieb-Chromatographie auf einer Säule von
Bio-Gel P-10 (Bio Rad Labs, 2,5 cm × 90 cm), eluiert mittels 10% (v/v)
Essigsäure,
wobei der Ausfluss hinsichtlich HP-Fluoreszenz überwacht wurde, wie gezeigt
in der 2. In der 2 ist die
Y-Achse die relative Fluoreszenz-Emission bei 390 nm (297 nm Anregung),
und die X-Achse ist die Fraktionsnummer. Die Fraktionsgröße belief
sich auf 4 ml. Die als II angegebenen Fraktionen sind hinsichtlich
der vernetzten Kollagen-Typ-II-Telopeptide angereichert. Die vernetzten
Kollagen-Typ-I-Telopeptide
sind in den Fraktionen enthalten, welche als III und IV gekennzeichnet
sind. Fraktionen, welche den Pool II überspannten (angereichert hinsichtlich
vernetzten Typ-II-Kollagen-Peptiden),
wurden vereinigt, gefriergetrocknet und durch Ionenaustausch-Säulenchromatographie auf einer
DEAE-HPLC-Säule
(TSK-DEAE-SPW, 7,5 mm × 7,5
mm, Bio-Rad Labs), äquilibriert
mit 0,02 M Tris/HCl, 10% (v/v) Acetonitril, pH 7,5, fraktioniert
und mit einem Gradienten von 0,05 M NaCl im gleichen Puffer eluiert,
wie gezeigt in der 2.
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Die 3A trägt die relative
Fluoreszenzemission bei 390 nm (330 nm Anregung) gegen die Elutionszeit
auf. Die vernetzten Kollagen-Typ-II-Telopeptide werden vorwiegend
in dem als IV angegebenen Segment gefunden. Die 3B trägt die Extinktion
bei 220 nm als Funktion der Elutionszeit in Minuten auf. Der Pool
IV enthält
die vernetzten Typ-II-Kollagen-Peptide.
Individuelle Peptide wurden dann aus dem Pool IV durch Umkehrphasen-HPLC
auf einer C-18-Säule
(Aquapore RP-300, 25 cm × 4,6
mm, Brownlee Labs) aufgetrennt, wobei mit einem Gradienten von 0–30% (v/v)
Acetonitril in 0,1% (v/v) Trifluoressigsäure eluiert wurde. Die 4A zeigt
eine Grafik der relativen Fluoreszenzintensität bei 390 nm (297 nm Anregung)
als Funktion der Elutionszeit. Die mit jeweiligen Peptiden assoziierten
Peaks sind in der 4A angegeben. Die 4B zeigt
die relative Extinktion bei 220 nm als eine Funktion der Zeit.
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Wie
in dieser Beschreibung und in den beigefügten Patentansprüchen in
Bezug auf Typ-II-Telopeptide verwendet,
wird mit "Quantifizieren" das mittels jedweder
geeigneten Methode, einschließlich,
ohne darauf eingeschränkt
zu sein, spektrophotometrischen, gravimetrischen, volumetrischen,
coulometrischen, immunometrischen, potentiometrischen oder amperometrischen
Methoden, erfolgende Messen der Konzentration von Peptidfragmenten,
welche 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzungen
enthalten, in einem Aliquot einer Körperflüssigkeit gemeint. Geeignete
Körperflüssigkeiten
schließen
Urin, Serum und Gelenkflüssigkeit
ein. Die bevorzugte Körperflüssigkeit
ist Urin.
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Da
die Konzentration von Urin-Peptiden abnehmen wird, wenn das Volumen
des Urins zunimmt, wird es ferner bevorzugt, dass wenn Urin die
gewählte
Körperflüssigkeit
ist, das getestete Aliquot aus einem vereinigten Pool von Urin stammt,
welche über
eine festgelegte Zeitdauer, beispielsweise 24 Stunden hinweg gesammelt
wird. Auf diese Weise wird die Absolutrate des Kollagen-Abbaus für eine 24-Stunden-Dauer
berechnet. Alternativ dazu können
Urin-Peptide als ein Verhältnis
relativ zu einer Markersubstanz gemessen werden, welche im Urin
gefunden wird, wie Kreatinin. Auf diesem Weg würde der Urin-Index des Kollagen-Abbaus unabhängig vom
Urinvolumen bleiben.
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In
einer Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung werden monoklonale oder polyklonale Antikörper hergestellt,
welche spezifisch für
die Peptidfragmente mit Pyridinolin-Quervernetzungen sind, welche
in einer Körperflüssigkeit
wie Urin gefunden werden.
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Typ-II-Telopeptide
können
aus einer Körperflüssigkeit
von einem beliebigen Patienten isoliert werden, können aber
einfacher aus Patienten, welche unter Krankheiten leiden, die Typ-II-Kollagen-Abbau beteiligen, oder
aus rasch wachsenden Heranwachsenden erhalten werden.
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Beispiele
von Vorgehensweisen zur Quantifizierung von Peptiden
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A. Immunologische Vorgehensweise
zur Quantifizierung von Peptiden
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Immunologische
Bindungspartner, fähig
zur spezifischen Bindung an Peptidfragmente, abgeleitet aus Knochenkollagenen,
welche aus einem physiologischen Fluid erhalten wurden, können durch
im Fachgebiet gut bekannte Verfahren hergestellt werden. Das bevorzugte
Verfahren zum Isolieren dieser Peptidfragmente ist obenstehend beschrieben.
Mit immunologische Bindungspartner, wie hierin verwendet, werden
Antikörper und
Antikörperfragmente
gemeint, welche zur Bindung an ein Telopeptid in der Lage sind.
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Sowohl
monoklonale als auch polyklonale Antikörper, welche die hierin offenbarten
Peptide spezifisch binden, als auch deren Äquivalente, werden durch im
Fachgebiet bekannte Verfahren hergestellt; beispielsweise Campbell,
A. M. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,
Band 13 (1986), Elsevier, hierin durch den Bezug darauf einbezogen.
Es ist möglich,
Antikörper
gegen die obenstehenden Peptide oder ihre Äquivalente, wie isoliert, herzustellen.
Weil die Molekulargewichte dieser Peptidfragmente jedoch im Allgemeinen
geringer als 5 000 sind, wird es bevorzugt, dass das Hapten an ein
Trägermolekül konjugiert
wird. Geeignete Trägermoleküle schließen, ohne
darauf eingeschränkt
zu sein, Rinderserumalbumin, Ovalbumin, Thyroglobulin, und "Keyhole-Limpet"-Hämocyanin
(KLH) ein. Bevorzugte Träger
sind Thryoglobulin und KLH.
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Es
ist auf dem Fachgebiet gut bekannt, dass die Orientierung des Haptens,
wenn es an das Trägerprotein
gebunden wird, von kritischer Bedeutung für die Spezifität des Antiserums
ist. Darüber
hinaus sind nicht alle Hapten-Protein-Konjugate gleich erfolgreiche
Immunogene. Die Auswahl eines Protokolls für die Bindung des jeweiligen
Haptens an das Trägerprotein
hängt deshalb
von der Aminosäuresequenz
der gewählten
gewöhnlichen
Peptidfragmente ab. Beispielsweise könnte ein Protokoll die Kopplung
dieses Haptens an Keyhole-Limpet-Hämocyanin
(KLH) oder einen anderen geeigneten Träger mit Glutaraldehyd beinhalten.
Ein alternatives Protokoll besteht darin, die Peptide mit einem
Carbodiimid an KLH zu koppeln.
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Andere
Peptide können,
abhängig
von der Quelle, unterschiedliche Bindungsprotokolle erfordern. Folglich
kann eine Reihe von Bindungsmitteln in geeigneter Weise angewandt
werden. Diese schließen,
ohne Einschränkung
darauf, Carbodiimide, Glutaraldehyd, gemischte Anhydride und sowohl
homobifunktionelle als heterobifunktionelle Reagenzien ein (siehe
zum Beispiel den Katalog von Pierce 1986–87, Pierce Chemical Co., Rockford,
IL). Bevorzugte Bindungsmittel schließen Carbodiimide und heterobifunktionelle
Reagenzien, wie m-Maleimidobenzyl-N-hydroxysuccinimidester
(MBS) ein.
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Verfahren
zur Bindung des Haptens an das Trägermolekül sind im Fachgebiet bekannt;
siehe zum Beispiel Chard, T., Laboratory Techniques in Biochemistry
and Molecular Biology, Band 6 (1987), Partz Elsevier, N. Y., was
hierin durch Bezug darauf einbezogen ist.
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Es
können
entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper gegen das Hapten-Trägermolekül-Immunogen
hergestellt werden. Es wird jedoch bevorzugt, dass monoklonale Antikörper (Mab)
hergestellt werden. Aus diesem Grund wird es bevorzugt, dass die
Immunisierung in der Maus ausgeführt
wird. Immunisierungsprotokolle für
die Maus schließen
gewöhnlicher
Weise ein Adjuvans ein. Beispiele von geeigneten Protokollen sind
von Chard, T. (1987) siehe oben, beschrieben. Milzzellen aus der
geimpften Maus werden geerntet und homogenisiert und danach mit
Krebszellen in Gegenwart von Polyethylenglycol fusioniert, um ein
fusioniertes Zellhybrid herzustellen, welches monoklonale Antikörper herstellt,
die spezifisch für
aus Kollagen abgeleitete Peptidfragmente sind. Beispiele derartiger
Peptide werden durch die obenstehend angegebenen Formeln repräsentiert.
Geeignete Krebszellen schließen
Myelom-, Hepatom-, Karzinom- und Sarkomzellen ein. Ausführliche
Beschreibungen dieses Vorgehens, einschließlich Screening-Protokollen,
Protokollen zum Züchten
selektierter Hybridzellen und zum Ernten von monoklonalen Antikörpern, welche
durch die selektierten Hybridzellen hergestellt wurden, sind angegeben
in Galfre, G. und Milstein, C., Meth. Enzymol., 73: 1 (1981).
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Ein
bevorzugtes, einleitendes Screening-Protokoll beinhaltet die Verwendung
von Peptidfragmenten, abgeleitet aus Typ-II- oder Typ-III-Kollagen-Resorption
und enthaltend 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzungen,
in einem Festphasen-Radioimmunassay. Ein spezifisches Beispiel,
welches einen bevorzugten monoklonalen Antikörper beschreibt, wird nachstehend
vorgesehen.
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Verfahren,
welche rekombinante DNA-Techniken einsetzen, können auch angepasst werden,
um monoklonale Antikörper
zu konstruieren. Diese Verfahren können durch die Konstruktion
von Expressionsbibliotheken und Primern vom Durchschnittsfachmann
(siehe William D. Huse et al., "Generation
of a Large Combinational Library of the Immunoglobulin Repertoire
in Phage Lambda",
Science 246: 1275–1281,
Dezember 1989, siehe auch L. Sastry et al., "Cloning of the Immunological Repertoire
in Escherichia coli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies:
Construction of a Heavy Chain Variable Region-Specific cDNA Library", Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 86: 5728–5732,
August 1989; siehe auch Michelle Altine-Mees et al., "Monoclonal Antibody Expression Libraries:
A Rapid Alternative to Hybridomas", Strategies in Molecular Biology 3:
1–9, Januar
1990) oder durch den Erwerb von handelsüblichen Kits, welche für diesen
Zweck verfügbar
sind (d. h. von Stratacyte, La Jolla, Californien), bewerkstelligt
werden. Kurz gesagt, wird innerhalb dieser Ausführungsform mRNA aus einer B-Zellpolulation
isoliert und verwendet, um schwere und leichte Ketten-Immunglobulin-cDNA-Expressionsbibliotheken
in den Vektoren λImmunoZap
(H) und λImmunoZap
(L) zu erzeugen. Diese Vektoren können individuell gescreent
oder coexprimiert werden, um Fab-Fragmente oder Antikörper zu
bilden (siehe Huse et al., siehe oben: siehe auch Sastry et al.,
siehe oben). Anschließend
können
positive Plaques zu einem nicht-lytischen
Plasmid umgewandelt werden, welches die Expression von monoklonalen
Antikörperfragmenten
aus E. coli bei hohen Spiegeln gestattet.
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Die
monoklonalen Antikörper
oder anderen immunologischen Bindungspartner, welche im Zusammenhang
mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind vorzugsweise
spezifisch für
einen besonderen Typ von Kollagen-Telopeptid. Assays für die Typ-II-Kollagenabbau-Telopeptide
sollten vorzugsweise in der Lage sein, zwischen den Peptiden von
Typ I, Typ II und Typ III zu unterscheiden. Allerdings wird in manchen Fällen eine
solche Selektivität
nicht notwendig sein, beispielsweise wenn bekannt ist, dass ein
Patient nicht unter dem Abbau eines Typs von Kollagen leidet, sondern
im Verdacht steht, unter dem Abbau von dem getesteten Typ von Kollagen
zu leiden. Wegen der Unterschiede in den Aminosäuresequenzen zwischen Telopeptiden
der Typ-I-, Typ-II- und Typ-III-Familien sollte Kreuzreaktivität nicht
in einem nennenswerten Ausmaß auftreten.
Tatsächlich
kann man hinsichtlich Hybridomen selektieren während des Screenings von Milzzellen-Fusionsklonen,
welche monoklonale Antikörper
herstellen, die spezifisch für
das vernetzte Telopeptid von Interesse sind (und denen Affinität für diejenigen
der anderen zwei Kollagentypen fehlt). Basierend auf den Unterschieden
in der Sequenz der isolierten Peptidstrukturen, ist eine derartige
Spezifität
völlig
durchführbar. Peptidfragmente
der Kollagene der Eltern-Typen I, II und III, welche für ein solches
Hybridom-Screening geeignet sind, können aus menschlichem Knochen,
Knorpel und anderen Geweben hergestellt und verwendet werden, um
Klone aus Mäusen
zu screenen, die in geeigneter Weise mit den individuellen, aus
Körperflüssigkeit
isolierten, vernetzten Peptid-Antigenen immunisiert wurden.
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Immunologische
Bindungspartner, speziell monoklonale Antikörper, hergestellt durch die
oben stehenden Vorgehensweisen oder äquivalente Vorgehensweisen,
werden in verschiedenen immunometrischen Assays verwendet, um die
Konzentration der obenstehend beschriebenen Peptide mit 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzungen
zu quantifizieren. Diese immunometrischen Assays umfassen vorzugsweise
einen monoklonalen Antikörper
oder ein Antikörperfragment,
gekoppelt an einen detektierbaren Marker. Beispiele von geeigneten
detektierbaren Markern schließen
ohne Einschränkung
darauf: Enzyme, Coenzyme, Enzyminhibitoren, Chromophore, Fluorophore,
chemolumineszente Materialien, paramagnetische Materialien, Spin-Markierungen
und Radionuklide ein. Beispiele von standardmäßigen immunometrischen Verfahren,
geeignet zur Quantifizierung der Telopeptide, schließen ohne
Einschränkung
darauf Enzym-Linked-Immunosorbent-Assay (ELISA) (Ingvall, E., Meth.
Enzymol., 70 (1981)), Radio-Immunoassay (RIA) und immunoradiometrischen "Sandwich"-Assay (IRMA) ein.
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In
ihrer einfachsten Form können
diese immunometrischen Verfahren angewandt werden, um die absolute
Rate der Knochenresorption oder des Kollagen-Abbaus zu bestimmen,
einfach mittels in Kontakt Bringen einer Körperflüssigkeit mit dem immunologischen
Bindungspartner, der spezifisch für ein Kollagen-Telopeptid mit
einer 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzung ist.
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Es
wird bevorzugt, dass die obenstehend beschriebenen immunometrischen
Assays direkt an unbehandelten Körperflüssigkeiten
durchgeführt
werden (z. B. Urin, Blut, Serum oder Gelenkflüssigkeit). Gelegentlich können jedoch
kontaminierende Substanzen den Assay stören, was eine partielle Aufreinigung
der Körperflüssigkeit
notwendig macht. Partielle Reinigungsvorgehensweisen schließen ohne
Einschränkung
darauf Patronen-Adsorption und -Elution, Molekularsieb-Chromatographie,
Dialyse, Ionenaustausch, Aluminiumoxid-Chromatographie, Hydroxyapatit-Chromatographie
und Kombinationen hiervon ein.
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Testkits,
welche zur Verwendung gemäß der vorliegenden
Erfindung geeignet sind, enthalten spezifische Bindungspartner,
wie monoklonale Antikörper,
hergestellt wie obenstehend beschrieben, welche spezifisch an aus
Kollagen-Abbau abgeleitet Peptidfragmente, welche in einer Körperflüssigkeit
gefunden werden, binden. Es wird bevorzugt, dass die spezifischen
Bindungspartner dieses Testkits an einen detektierbaren Marker des
obenstehend beschriebenen Typs gekoppelt sind. Testkits, enthaltend
eine Auswahl von zwei oder mehreren spezifischen Bindungspartnern,
insbesondere immunologischen Bindungspartnern, werden ebenfalls
in Betracht gezogen. Jeder immunologische Bindungspartner in einem
solchen Testkit wird vorzugsweise nicht wesentlich mit einem Telopeptid
kreuzreagieren, welches aus einem ande ren Typ von Kollagen abgeleitet ist.
Beispielsweise sollte ein immunologischer Bindungspartner, der spezifisch
mit einem Typ-II-Kollagen-Telopeptid bindet, vorzugsweise weder
mit einem Typ-I- noch einem Typ-III-Kollagen-Telopeptid kreuzreagieren. Ein
kleines Ausmaß (z.
B. 5–10%)
an Kreuzreaktivität
kann tolerierbar sein. Andere Testkits können einen ersten spezifischen
Bindungspartner gegen ein Kollagen-abgeleitetes Telopeptid mit einer
Quervernetzung, enthaltend einen Pyridiniumring (der OH-substituiert
sein kann), und einen zweiten spezifischen Bindungspartner gegen
ein Telopeptid mit der gleichen Struktur wie das erste Telopeptid,
außer
dass der Pyridiniumring, z. B. photolytisch, gespalten worden ist,
enthalten.
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Herstellung von monoklonalem
Antikörper
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Es
folgt ein Beispiel der Herstellung eines monoklonalen Antikörpers gegen
ein Telopeptid-Immunogen.
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Eine
hinsichtlich des Peptids angereicherte Fraktion wird aus humanem
Urin von Heranwachsenden unter Anwendung von Umkehrphasen- und Molekularsieb-Chromatographie
hergestellt. Das Peptid wird an Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH) mit Glutaraldehyd
unter Anwendung von Standardverfahrensweisen konjugiert. Mäuse (Balb/c)
werden subkutan mit diesem Konjugat (50–70 g) geimpft, zuerst in vollständigem Freund'schem Adjuvans, und
dann in 3-wöchigen
Intervallen intraperitoneal in unvollständigem Freund'schem Adjuvans geboostert
(25 g). Nachdem Test-Blutentnahmen einen hohen Titer gegen das an
Rinderserumalbumin (BSA) konjugierte Peptid unter Anwendung eines
ELISA-Formats zeigten, werden ausgewählte Mäuse mit einer niedrigen Dosis
(5 g) des Immunogens in sterilem PBS intravenös geboostert. Drei Tage später werden Zellen
aus den Milzen von einzelnen Mäusen
mit Maus-Myelom-Zellen unter Verwendung der standardmäßigen Hybridom-Technologie
fusioniert. Die Überstände von
Hybridom-Klonen, welche in einzelnen Vertiefungen von 96-Vertiefungs-Platten
wuchsen, werden hinsichtlich reaktiver monoklonaler Antikörper gescreent,
anfänglich
unter Verwendung einer rohen Telopeptid-Präparation, konjugiert an BSA.
Nach formaler Klonierung mittels limitierender Verdünnung werden
die Antikörper,
welche von individuellen Hybridomen hergestellt werden, gegen eine
Auswahl von, an BSA konjugierten, Screening-Antigenen unter Anwendung
der ELISA-Analyse charakterisiert. Ein Inhibitions-Assay wird angewandt,
in welchem an BSA konjugiertes Telopeptid in den Kunststoffvertiefungen
ausplattiert wird, und Antikörper
mit einer Lösung
des potentiellen Antigens präinkubiert wird.
Ein zweiter Antikörper
(Ziege-Anti-Maus-IgG, konjugiert an Meerrettich-Peroxidase, HRP) wird zur Farbentwicklung
unter Verwendung eines passenden Substrats eingesetzt.
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Wenn
eine Öffnung
des Pyridiniumrings in den Telopeptiden entweder in vivo oder sogar
in vitro unter routinemäßigen Handhabungsbedingungen
stattfindet, dann wird ein quantitativer Assay der vorliegenden Peptid(e)
mit intakten Pyridiniumringen die Menge des Kollagen-Abbaus unterschätzen. Folglich
wird von einem auf zwei möglichen
Vorgehensweisen beruhendem Assay erwartet, vergleichsweise genauer
zu sein. Die zwei ins Auge gefassten Ausführungsformen sind: ein einziger
spezifischer Bindungspartner wird verwendet, welcher sowohl geschlossen-
als auch offenringige Ausführungsformen
der angezielten Peptid(e) erkennt; oder zwei spezifische Bindungspartner
werden verwendet, welche zwischen den geschlossen- bzw. offenringigen
Epitopen unterscheiden.
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Spezifische
Bindungspartner, welche zwischen offenen und geschlossenen Ring-Formen
der angezielten Peptide unterscheiden, können erhalten werden durch
Einbinden eines passenden Screening-Schritts in die Standardvorgehensweisen
zum Erhalten solcher spezifischen Bindungspartner. Um beispielsweise
einen monoklonalen Antikörper
zu erhalten, der spezifisch an eine offene Ringform eines Telopeptids
bindet, kann eine Bibliothek von monoklonalen Kandidaten-Antikörpern hinsichtlich
ihrer Fähigkeit,
an das Peptid mit einem geöffneten
Pyridinolin-Ring (z. B. durch Bestrahlung mit Ultraviolettlicht)
zu binden, und ihrer Fähigkeit, an
das Peptid mit einem intakten Pyridinolin-Ring zu binden, gescreent
werden. Die in einem derartigen Screening-Schritt nützlichen
Offen-Ring- und Intakt-Ring-Peptide können durch bekannte Reinigungstechniken,
wie RP- bzw. Umkehrphasen-HPLC, wie obenstehend beschrieben, erhalten
werden.
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B. Elektrochemisches Vorgehen
für den
Assay hinsichtlich Peptiden
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Eine
alternative Vorgehensweise für
den Assay hinsichtlich der obenstehend beschriebenen Peptide besteht
im Messen einer physikalischen Eigenschaft der Peptide mit 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzungen. Eine
solche physikalische Eigenschaft beruht auf dem elektrochemischen
Nachweis. Dieses Verfahren besteht aus dem Injizieren eines Aliquots
einer Körperflüssigkeit,
wie Urin, in einen elektrochemischen Detektor, eingestellt auf ein
Redoxpotential, geeignet zum Nachweis von Peptiden, welche den 3-Hydroxypyridinium-Ring enthalten.
Der 3-Hydroxypyridinium-Ring, welcher aphenolisch ist, wird einer
reversiblen Oxidation unterzogen, und deswegen ist der elektrochemische
Detektor (z. B. Modell 5100A Coulochem, vertrieben von Esa 45 Wiggins
Ave., Bedford, MA) ein in hohem Maße wünschenswertes Instrument, das
zur Quantifizierung der Konzentration der vorliegenden Peptide geeignet
ist. Zwei grundlegende Formen des elektrochemischen Detektors sind
derzeitig kommerziell erhältlich:
amperometrisch (z. B. BioAnalytical Systems) und coulometrisch (ESA,
Inc., Bedford, MA 01730). Beide sind zur Verwendung gemäß der vorliegenden
Erfindung geeignet, allerdings ist das letztgenannte System inhärent empfindlicher
und deswegen bevorzugt, weil eine vollständige Oxidation oder Reduktion
des analysierten Moleküls
im Säulenausfluss
erzielt wird. Weiterhin können
Screening- oder Schutzelektroden "stromaufwärts" der analytischen Elektrode eingebaut
sein, um störende
Substanzen selektiv zu oxidieren oder zu reduzieren, wodurch die
Selektivität
in großem
Maße verbessert
wird. Im wesentlichen wird die Spannung der analytischen Elektrode
auf das Redoxpotential des Probenmoleküls eingestellt, und eine oder
mehrere Vorbehandlungszellen werden eingesetzt, um störende Substanzen
in der Probe zu zerstören.
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In
einem bevorzugten Assay-Verfahren wird eine Strom/Spannung-Standardkurve
für Standardpeptide,
enthaltend Lysyl-Pyridinolin oder Hydroxylysyl-Pyridinolin, aufgestellt,
um die richtige Spannung zu bestimmen, welche für eine optimale Empfindlichkeit
einzustellen ist. Diese Spannung wird dann in Abhängigkeit
von der Körperflüssigkeit
modifiziert, um den Störeinfluss
von Kontaminanten zu minimieren und die Empfindlichkeit zu optimieren.
Elektrochemische Detektoren und die Optimalbedingungen für ihre Anwendung
sind dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt. Komplexe Mischungen von
Körperflüssigkeiten
können
oft direkt mit dem elektrochemischen Detektor ohne Störung analysiert
werden. Folglich ist für
die meisten Patienten keine Vorbehandlung der Körperflüssigkeit notwendig. In manchen
Fällen
können
jedoch störende
Verbindungen die Zuverlässigkeit
der Messungen verringern. In solchen Fällen kann eine Vorbehandlung
der Körperflüssigkeit
(z. B. Urin) notwendig sein.
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Folglich
wird in einer alternativen Ausführungsform
der Erfindung eine Körperflüssigkeit,
vor dem elektrochemischen Titrieren der gereinigten Peptidfragmente,
zuerst gereinigt. Der Reinigungsschritt kann auf vielfältige Weise
durchgeführt
werden, einschließlich,
ohne darauf eingeschränkt
zu sein, Dialyse, Ionenaustausch-Chromatographie, Aluminiumoxid-Chromatographie,
Hydroxyapatit-Chromatographie, Molekularsieb-Chromatographie oder
Kombinationen hiervon. In einem bevorzugten Reinigungsprotokoll
wird ein abgemessenes Aliquot (25 ml) einer 24-Stunden-Urinprobe
in einem Dialyseschlauch mit verringerter Porosität dialysiert,
um die Hauptmasse an kontaminierenden fluoreszenten gelösten Substanzen
zu entfernen. Das Nicht-Diffusat wird dann lyophilisiert, erneut
in 1% Heptafluorbuttersäure
(HFBA), einer Ionenpaar-Lösung,
gelöst,
und die Peptide werden auf einer Water-Sep-Pak-C-18-Patrone adsorbiert.
Diese Patrone wird dann mit 5 ml 1% HFBA gewaschen und danach mit
3 ml 50%igem Methanol in 1% HFBA eluiert.
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Ein
anderes bevorzugtes Verfahren zur Reinigung besteht im Adsorbieren
eines abgemessenen Aliquots von Urin auf einen Ionenaustausch-Adsorptionsfilter
und Eluieren des Adsorptionsfilters mit einer gepufferten Elutionslösung. Die
Eluatfraktionen, enthaltend Peptidfragmente mit 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzungen,
werden dann aufgefangen, um getestet zu werden.
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Noch
ein anderes bevorzugtes Verfahren zur Reinigung verwendet Molekularsieb-Chromatographie. Beispielsweise
wird ein Aliquot von Urin auf eine Bio-Gel-P2- oder Sephadex-G-20-Säule aufgetragen, und die Fraktion,
welche im Bereich von 1000–5000
Dalton eluiert, wird aufgefangen. Dem Fachmann auf dem Gebiet wird
offensichtlich sein, dass eine Kombination der obenstehenden Verfahren
angewandt werden kann, um Urin oder andere Körperflüssigkeiten zu reinigen oder
teilweise zu reinigen, um die Peptidfragmente mit 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzungen
zu isolieren. Die gereinigten oder teilweise gereinigten Peptidfragmente, welche
durch die obenstehenden Vorgehensweisen erhalten werden, können zusätzlichen
Reinigungsvorgehensweisen unterzogen werden, weiterverarbeitet oder
direkt im teilweise gereinigten Zustand untersucht werden. Zusätzliche
Reinigungsvorgehensweisen schließen das Auftrennen der teilweise
gereinigten Peptidfragmente unter Anwendung von Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie
(HPLC) oder Kapillar-HPLC ein, wenn eine erhöhte Empfindlichkeit gewünscht wird.
Diese Peptide können
dann durch elektrochemische Titration quantifiziert werden.
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Ein
bevorzugtes elektrochemisches Titrationsprotokoll besteht aus der
Abstimmung des Redoxpotentials der nachweisenden Zelle des elektrochemischen
Detektors (Coulochem Model 5100A) für ein Maximalsignal mit reinem
HP. Der Detektor wird dann verwendet, um den Ausfluss aus einer
C-18-HPLC-Säule
zu überwachen,
welche zur Auftrennung der teilweise gereinigten Peptide verwendet
wurde.
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C. Fluorometrisches Vorgehen
zur Quantifizierung von Peptiden
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Ein
alternatives bevorzugtes Verfahren zur Quantifizierung der Konzentration
von Peptiden mit 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzungen, wie hierin
beschrieben, besteht darin, die charakteristische natürliche Fluoreszenz
dieser Peptide zu messen. Für
diejenigen Körperflüssigkeiten,
welche wenig natürlich
vorkommende fluoreszierende Materialien, verschieden von den 3-Hydroxypyridinium-Quervernetzungen
enthalten, kann der fluorometrische Assay direkt ohne weitere Aufreinigung
der Körperflüssigkeit
durchgeführt
werden. In diesem Fall werden die Peptide mittels HPLC getrennt,
und die natürliche
Fluoreszenz der HP- und LP-Aminosäurereste
wird bei 395 nm nach Anregung bei 297 nm gemessen, im wesentlichen
wie beschrieben von Eyre, D. R., et al., Analyte. Biochem. 137:
380 (1984), was hierin durch den Bezug darauf einbezogen wird.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird es bevorzugt, dass der fluorometrische Assay an Urin
durchgeführt
wird. Urin enthält
jedoch üblicherweise
wesentliche Mengen von natürlich
vorkommenden fluoreszierenden Kontaminanten, welche vor der Durchführung des
fluorometri schen Assays entfernt werden müssen. Folglich werden Urinproben
zuerst teilweise aufgereinigt, wie obenstehend für den elektrochemischen Nachweis
beschrieben wurde. Diese teilweise gereinigte Urinprobe kann dann
fluorometrisch geassayt werden, wie obenstehend beschrieben. Alternativ
dazu können
die HP- und LP-vernetzten Peptide in teilweise gereinigten Urinproben
oder anderen Körperflüssigkeiten
in 6 M HCl bei etwa 108°C
während
ungefähr
24 Stunden hydrolysiert werden, wie beschrieben von Eyre, et al.
(1984) siehe oben. Dieses Verfahren hydrolysiert die an die Lysinvorläufer von "Tripeptid"-HP- und -LP-Quervernetzungen
verknüpften
Aminosäuren,
wobei die freien HP- und LP-Aminosäuren erzeugt werden, welche
von den Formeln I und II wiedergegeben werden. Diese kleinen "Tripeptide" werden dann durch
die obenstehend beschriebenen Techniken, vorzugsweise mittels HPLC,
aufgetrennt, und die natürliche
Fluoreszenz wird gemessen (Ex. 297 nm, Ex. 390 nm).
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Gegebenenfalls
wird die Körperflüssigkeit
(vorzugsweise Urin) direkt durch eine C-18-Umkehrphasen-Affinitäts-Patrone geleitet, nachdem
Acetonitril/Methanol 5–10%
v/v zugesetzt wurde. Das Nicht-Retentat wird mit einem kationischen
Ionenpaar-Mittel wie Tetrabutylamoniumhydroxid auf 0,05–0,10 M
eingestellt und durch eine zweite C-18-Umkehrphasen-Patrone hindurchgeleitet.
Das gewaschene Retentat, enthaltend fluoreszierende Peptide, aus
dieser zweiten Patrone wird mit Acetonitril:Wasser (oder Methanol:Wasser)
eluiert, getrocknet und fluoreszierende Peptide werden mittels Umkehrphasen-HPLC
oder Kapillar-HPLC unter Verwendung eines anionischen Ionenpaar-Mittels,
wie 0,01 M Trifluoressigsäure,
in dem Elutionsmittel analysiert.
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Das
Verhältnis
von HP:LP, gefunden in normalem menschlichem Urin und Urin aus Patienten
mit der Paget-Krankheit, beträgt
in beiden Fällen
ungefähr
4,5:1. Dies ist etwas höher
als das 4:1-Verhältnis,
welches in Knochen selbst gefunden wird (Eyre, et al., 1984). Das
in Urin gefundene, höhere
Verhältnis
zeigt, dass ein Teil der HP-Fraktion in Urin aus anderen Quellen
als Knochen, wie der Nahrung oder anderen Quellen des Kollagen-Abbaus,
d. h. Knorpel-Katabolismus,
stammen kann.
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Während die
Erfindung in Zusammenhang mit bevorzugten Ausführungsformen beschrieben worden ist,
wird der Durchschnittsfachmann nach dem Lesen der vorstehenden Beschreibung
in der Lage sein, verschiedene Änderungen,
Substitutionen oder Äquivalente,
und Veränderungen
am hierin dargelegten Gegenstand, vorzunehmen. Somit kann die Erfindung
auf anderen Wegen ausgeführt
werden, als denjenigen, die hierin spezifisch beschrieben wurden.
Es wird deswegen beabsichtigt, dass der durch die Patenturkunde
hierzu gewährte
Schutz nur durch die beigefügten
Patentansprüche
beschränkt
sein soll.