DE69034220T2 - Nukleotid-Sequenzen von HIV-1, HIV-2 and SIV Retrovirusgenommen, ihre Verwendung zur Amplifizierung von diesen Retrovieren und zur in vitro Diagnostik von diesen Viren verursachten Infektion - Google Patents
Nukleotid-Sequenzen von HIV-1, HIV-2 and SIV Retrovirusgenommen, ihre Verwendung zur Amplifizierung von diesen Retrovieren und zur in vitro Diagnostik von diesen Viren verursachten Infektion Download PDFInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft Oligonukleotidsequenzen, die für die Durchführung von Amplifikationstechniken spezifischer Nukleotidsequenzen menschlicher Immundefizienz-Retroviren vom Typ HIV oder Immundefizienz-Retroviren bei Affen vom Typ SIV geeignet sind.
- Die Isolierung und Charakterisierung der unter den Bezeichnungen HIV-1 und HIV-2 zusammengefassten Retroviren wurde in den europäischen Patentanmeldungen Nr. 85/905.513.9 (HIV-1) und Nr. 87/400.151.4 und
EP 0269520 (HIV-2) beschrieben. Diese Retroviren wurden bei mehreren Kranken isoliert, welche die Symptome einer Lymphadenopathie oder einer erworbenen Immunschwäche (AIDS) aufwiesen. - Die Retroviren vom Typ HIV-2 sowie die Retroviren vom Typ HIV-1 sind durch einen Tropismus für menschliche Lymphozyten T4 und einen zytopathogenen Efffekt gegenüber diesen Lymphozyten, wenn sie sich dort vermehren, gekennzeichnet, um dann unter anderem eine ausgebreitete und andauernde Polyadenopathie oder AIDS zu verursachen.
- Ein anderer Retrovirus, SIV-1 genannt, wobei diese Bezeichnung die vorher bekannte Bezeichnung STLV-III ersetzt, wurde bei den Rhesusaffen (Makak) isoliert (M.D. DANIEL et al., Science, 228, 1201 (1985); N.L. LETWIN et al., Science, 230, 71 (1985) unter der Bezeichnung "STLV-IIImac".
- Ein anderer Retrovirus, "STLV-IIIAGM" (oder SIVAGM) wurde bei den wilden Grünaffen isoliert. Im Gegensatz zu den bei den Rhesusaffen (Makaken) vorhandenen Viren scheint das Vorhandensein des STLV-IIIAGM bei den afrikanischen Grünaffen eine Krankheit vom Typ AIDS nicht hervorzurufen.
- Zur sprachlichen Annehmlichkeit werden diese Viren in der Folge nur mit dem Begriff SIV (SIV ist die englische Abkürzung für "Simian Immunodeficieny Virus" (Immundefizienz-Virus beim Affen)) bezeichnet, gegebenenfalls gefolgt von einer Abkürzung, welche die Art des Affen kennzeichnet, von dem sie stammen, zum Beispiel "MAC" für den Makak oder "AGM" für den afrikanischen Grünaffen (Abkürzung für "African Green Monkey").
- Ein Stamm des Retrovirus SIV-1Mac wurde beim C.N.C.M. am 7. Februar 1986 unter der Nummer I-521 hinterlegt.
- Nachfolgend hat das Studium der Retroviren HIV-1 und HIV-2 gleichermaßen dazu geführt, cDNA-Sequenzen von RNA ihres Genoms zu erhalten. Die vollständige Nukleotidsequenz einer cDNA eines für die Klasse HIV-2 (HIV-2 ROD) repräsentativen Retrovirus wurde beim C.N.C.M. am 21.02.1986 unter der Nummer I-522 und der Bezugsbezeichnung LAV-2 ROD hinterlegt.
- Gleichermaßen wurde die vollständige Nukleotidsequenz einer cDNA eines für die Klasse HIV-1 repräsentativen Retrovirus von WAIN HOBSON, SONIGO, COLE, DANOS und ALIZON in Cell (Januar 1985) beschrieben.
- Ebenfalls aus Gründen der sprachlichen Annehmlichkeit werden die Viren vom Typ HIV-1 und HIV-2 in der Folge gelegentlich mit dem Ausdruck HIV bezeichnet.
- Die gegenwärtig bestehenden Diagnoseverfahren in vitro von Infektionen durch Viren vom Typ HIV-1 und HIV-2 sind auf das Feststellen von Antikörpern ANTI-HIV-1 oder anti-NIV-2 gerichtet, die gegebenenfalls in einer biologischen Probe (Biopsie) oder in einer biologischen Flüssigkeit, zum Beispiel in einem erhaltenen Serum, des untersuchten Patienten vorhanden sind, indem diese biologische Flüssigkeit mit Extrakten oder Antigenen von HIV-1 oder HIV-2 unter Bedingungen in Kontakt gebracht werden, die das Erzeugen einer etwaigen Immunreaktion dieser Extrakte oder Antigene mit den Antikörpern ermöglichen.
- Derartige Diagnoseverfahren weisen die Gefahr auf, fälschlicherweise negativ zu sein, insbesondere im Fall einer neuen Infektion einer Einzelperson mit Viren vom Typ HIV.
- Die Genamplifikationstechniken sind eine beachtliche Ergänzung für die Entwicklung von Diagnoseverfahren in vitro, die besonders für Viruskrankheiten empfindlich sind. Von diesen Genamplifikationstechniken kann insbesondere die PCR- (Polymerase Chain Reaction) Technik, wie in den europäischen Patentanmeldungen Nr. 86/302.298.4 vom 27.03.1986 und Nr. 87/300.203.4 vom 09.01.1987 beschrieben, genannt werden, oder auch die Technik, die "QβReplikase" genannt wird und in Biotechnology, Bd. 6, Seite 1197 (Oktober 1988) beschrieben ist, sowie jene, die mittels RNA-Polymerase (T7RNA-Polymerase) durchgeführt wird und in der Internationalen Patentanmeldung Nr. WO89/01050 beschrieben ist. Diese Techniken ermöglichen es, die Detektionsempfindlichkeit von Nukleinsäuren von Viren zu verbessern, und erfordern die Verwendung spezifischer Synthesestarter.
- Für die Untersuchung von Viren vom Typ HIV ist die Wahl der Starter problematisch. Tatsächlich kann aufgrund der großen Veränderlichkeit der Nukleotidsequenzen des viralen Genoms ein Starter, der der bekannten Nukleotidsequenz eines gegebenen Isolats eines Virus vom Typ HIV entspricht, bei der Amplifikation bestimmter Virusvarianten vom Typ HIV versagen. Andererseits kann, selbst wenn ein Starter in einer erhaltenen Region des Genoms eines HIV-Virus zu einem andern gewählt wird, dessen "korrekte Funktion" trotzdem nicht sichergestellt werden und kann zu einer schlechten Amplifizierungsausbeute führen.
- Die vorliegende Erfindung bietet genaue Oligonukleotidstarter, welche unter anderem die Amplifikation des Genoms aller Viren vom Typ HIV und SIV mit momentan gemäß dem aktuellen Stand der Technik als maximal zu betrachtenden Ausbeuten ermöglichen, wobei das Vorhandensein zahlreicher unpezifischer Banden vermieden wird.
- Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Starter sind zugleich spezifisch für Viren der Gruppe HIV-1 und/oder Viren der Gruppen HIV-2 und SIV und sind gegenüber Veränderungen des Genoms dieser Viren unempfindlich.
- Die vorliegende Erfindung hat die Verwendung von Starteroligonukleotiden mit ungefähr 15 bis 30 Nukleotiden zum Gegenstand, die für die Genomamplifikation von Viren vom Typ HIV-1 und/oder vom Typ HIV-2 und SIV verwendbar sind.
- Für die Erfindung wird jede Nukleotidsequenz verwendet, die dadurch gekennzeichnet ist, dass ihre Sequenz:
- – entweder aus jenen gewählt ist, die in einer der Nukleotidsequenzen enthalten sind, die in dem Gen gag der Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 ROD und SIV MAC eingeschlossen sind, und genauer aus jenen, die in den nachstehend definierten Nukleotidketten enthalten sind,
- – oder (insbesondere für die längsten Sequenzen) eine der oben genannten Nukleotidsequenzen enthalten, die von HIV-1 Bru oder HIV-1 Mal oder HIV-1 Eli oder HIV-2 ROD oder SIVMac stammen, oder eine Nukleotidsequenz enthält, die zu einer der letztgenannten Sequenzen komplementär ist, wobei darauf hingewiesen wird, dass die etwaigen zusätzlichen Nukleotide, die über die Nukleotidsequenz der betreffenden Art auf Seite des 3'-oder 5'-Endes "hinausstehen", sich vorzugsweise mit jenen decken, die sich diesseits der entsprechenden 3'- oder 5'- Enden selbst im Innern der vollständigen Sequenz von Viren vom Typ HIV-1, HIV-2 oder SIV MAC wie oben genannt befinden,
- – oder, falls diese Nukleotidsequenz nicht mit einer der oben genannten Nukleotidsequenzen identisch ist oder nicht zu einer dieser Sequenzen komplementär ist, jedoch geeignet ist, mit einer dieser Nukleotidsequenzen, die von den Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli stammen, oder mit einer der oben genannten Nukleotidsequenzen, die von dem Virus HIV-2 ROD oder SIV MAC stammen, zu hybridisieren. Die Hybridisierung kann bei einer Temperatur von 60°C ± 1°C (vorzugsweise 60°C ± 0,5°C) erfolgen, was für eine optimale Ausbeute empfohlen wird.
- Die Nummerierung der untenstehenden Nukleotide entspricht jener, die in dem Referenzhandbuch "Human Retrovirus and AIDS-1989", herausgegeben von "Los Alamos National Library – New Mexico – USA" verwendet wird.
- (Die Sequenzen der Viren HIV-1 Mal, HIV-1 Eli wurden von MONTAGNIER, SONIGO, WAINHOBSON und ALIZON in der europäischen Patentanmeldung EP0253701 beschrieben).
- Die Sequenzen gemäß der Erfindung wurden mit einem von Applied Biosystems (Phosphoramidit-Verfahren) vermarkteten Synthesizer synthetisiert oder mit jedem anderen Gerät, welches ein ähnliches Verfahren verwendet.
- Die Erfindung betrifft genauer die Verwendung von Oligonukleotidsequenzen, die durch die folgenden Nukleotidsequenzen gekennzeichnet sind (dargestellt in der Richtung 5' ☐ 3'; die Anfangsbuchtstaben "S" und "AS" geben an, ob das Oligonukleotid Sense oder Antisense ist, das heißt, ob das Oligonukleotid jeweils in der Richtung 5'O☐3' oder der Richtung 3'O☐ 5' ausgerichtet ist):
1°) die den Genomen der Viren HIV-1, HIV-2 und SIV gemeinen Sequenzen (die Reihen von mit einem Bindestrich beabstandeten Zahlen geben die Position der Nukleotide auf den Genomen an, die jeweils den Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 ROD und SIV entsprechen): - • für das Gen gag des Genoms der oben genannten Viren spezifische Sequenzen (Gen, welches für eine für Nukleotide dieser Viren spezifische Antigene kodiert).
- Gewisse Varianten können auf gewisse Positionen von untenstehenden Nukleotidsequenzen angewendet werden, ohne dass die Hybridisierungseigenschaften dieser Nukleotidsequenzen mit den Genen von Viren vom Typ HIV und/oder SIV betroffen sind. Die Nukleotidsequenzen, die diese Varianten aufweisen, sind unter den anfänglichen Nukleotidsequenzen dargestellt, von denen sie durch Ersetzen einer oder mehrerer Basen abstammen. Die modifizierten Basen sind bezogen auf die Basen, von denen sie abstammen, mit jedem Buchstaben senkrecht unter den entsprechenden Positionen von Basen, die bei den anfänglichen Sequenzen ersetzt wurden, angegeben; wohingegen die Basen von anfänglichen Se quenzen, die bei den Sequenzen, die diese Varianten aufweisen, nicht ersetzt wurden, mit Hilfe von Punkten angegeben sind.
- Die Synthese von Startern wird bewirkt, indem alte Varianten gleichzeitig verwendet werden.
- Die Mischung aller für eine Sequenz gegebenen Varianten wurde bei den Tests verwendet.
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- Die Erfindung hat gleichermaßen die Verwendung von Sequenzen (oder Startern), welche eine zu den oben genannten Startern komplementäre Nukleotidstruktur aufweisen, in dem Syntheseverfahren zum Gegenstand.
- Sie betrifft gleichermaßen die Verwendung von Nukleotidsequenzen in dem Syntheseverfahren, welche gewisse Mutationen bezogen auf die oben genannten aufweisen, ohne dass dadurch die Hybridisierungseigenschaften dieser Sequenzen wie oben beschrieben modifiziert werden. Der Prozentsatz an Nukleotiden, die zu denen verschieden sind, welche die oben beschriebenen Sequenzen bilden, ohne dadurch die Hybridisierungseigenschaften der Sequenzen gemäß der Erfindung zu beeinflussen, kann 40% erreichen.
- Auf allgemeine Weise wird in dem Fall von Sense- (S) Startern (Primern) auf der 5'-Seite eine größere Anzahl an Mutationen toleriert als auf der 3'-Seite des Starters, da die 3'-Seite genau mit einem bestimmten Strang einer Nukleinsequenz hybridisieren muss, um die Amplifikation dieser Sequenz zu ermöglichen. Im Fall eines Antisense- (AS) Starters ist die Toleranz auf der 3'-Seite möglich.
- Die Starter wie oben beschrieben können eine Konservierung von wenigstens 5 Basen auf jeder Seite aufweisen, wobei der mittlere Teil Modifikationen aufweist, ohne dass dadurch die oben genannten Hybridisierungseigenschaften modifiziert werden.
- Eines der charakteristischen Merkmale der Oligonukleotidstarter, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden, ist es, eine saubere Amplifikationsbande zu ergeben, der im Allgemeinen ohne unspezifische Banden ist, wenn die in der vorliegenden Erfindung beschriebenen technischen Angaben zur Verwendung angewendet werden. Dies beruht auf der Länge der Starter, welche bis zu 27 Basen betragen kann, was die Hybridisierungsspezifizität steigert, sowie auf den drastischen Verwendungsbedingungen, welche es ermöglichen, Nebenassoziationen zu entfernen. Die Spezifizität für jeden Typ Virus hängt außer von dem Prozentsatz der Homologie mit der Referenzmatrize von der Länge der Starter ab, welche für einen annehmbaren Ausbeute bis zu 40 Basen betragen kann.
- Die Erfindung erstreckt sich gleichermaßen auf die Verwendung der Starter wie oben beschrieben, die auf Höhe ihres 5'-Endes mit einem Promotor für die Durchführung eines Genomamplifikationsverfahrens durch Synthese zahlreicher Kopien von DNA oder RNA, wie in der europäischen Patentanmeldung Nr. 88/307.102.9 vom 01.08.1988 beschrieben, gebunden sind.
- Die Erfindung hat gleichermaßen die Verwendung der oben beschriebenen Starter für die Durchführung eines Genamplifikationsverfahrens von Nukleotidsequenzen von Viren vom Typ HIV-1 und/oder HIV-2 und/oder SIV zum Gegenstand.
- Das Genamplifikationsverfahren weist hauptsächlich die folgenden Schritte auf:
- – einen Schritt der Extraktion von zu detektierender Nukleinsäure, welche zum Genom des Virus des Typs HIV-1, HIV-2 oder SIV gehört, welcher gegebenenfalls in der oben genannten biologischen Probe vorhanden ist, und gegebenenfalls einen Schritt der Behandlung mittels einer inversen Transcriptase der Nukleinsäure, wenn diese letztgenannte in Form von RNA vorliegt, um eine Doppelstrang-Nukleinsäure zu erhalten (wobei dieser letzte Schritt unten als Schritt der Retro-Transkription viraler RNA bezeichnet ist)
- – einen Cyclus, der die folgenden Schritte aufweist:
- – Denaturierung der zu detektierenden Doppelstrang-Nukleinsäure, was zur Bildung einer Einzelstrang-Nukleinsäure führt,
- – Hybridisierung von jedem der Nukleinsäurestränge, die bei dem vorausgegangenen Schritt der Denaturierung erhalten wurden, mit wenigstens einem Starter gemäß der Erfindung durch in Kontakt bringen der oben genannten Stränge mit wenigstens einem Starterpaar gemäß der Erfindung unter den unten stehend beschriebenen Bedingungen,
- – ausgehend von den Startern Bilden von DNA, die zu den Strängen komplementär ist, auf welche diese in Gegenwart eines Polymerisationsmittels (DNA-Polymerase) und vier unterschiedlichen Nukleosidtriphosphaten (dNTP) hybridi siert sind, was zu der Bildung einer größeren Anzahl zu detektierender Doppelstrang-Nukleinsäuren als bei dem vorausgegangenen Schritt der Denaturierung führt,
- Der oben genannte Hybridisierungsschritt wird vorteilhafterweise bei 60°C für 1 Minute 30 Sekunden in einem Puffer "10 X buffer" durchgeführt, dessen Zusammensetzung (in der endgültigen Verwendungskonzentration) unten angegeben ist.
- Tatsächlich liegen die Genome der Viren HIV und SIV in Form von RNA oder DNA entsprechend der Lokalisation des Virus in dem Organismus vor.
- Wenn der Virus im Inneren der Zellen des Organismus, insbesondere im Inneren von Blutzellen, vorliegt, wird dessen RNA durch inverse Transcriptase in DNA übertragen. Hingegen bleibt das Genom der Viren vom Typ HIV in extrazellulärer Umgebung, insbesondere im Blut, in Form von RNA.
- Der von den Erfindern vorgesehene Schritt der Extration von in den Zellen der biologischen Probe enthaltener viraler DNA weist – außer dem herkömmlichen Phenol-Chloroform-Verfahren, die folgenden Schritte auf:
- – Aufschlämmen des Zellansatzes in 0,5 ml Pyrolysewasser in einem großen Potter-Kolben,
- – Zerkleinern der Zellen durch "hin und zurück",
- – Hinzufügen von Triton X100 für 1 Endkonzentration von 0,1%
- – Denaturieren bei Wärme für 15 bis 25 Minuten bei 100°C,
- – kurzes Zentrifugieren, um nur die Zelltrümmer zu entfernen,
- – Ausfällen der DNA über Nacht bei –20°C durch Hinzufügen von 2,5 Volumina absolutem Ethanol und 10% der Endmenge an 3-molarem Natriumacetat. Die DNA wird dann zurückerhalten und anschließend in Pyrolysewasser nach zweimaligem Waschen mit Ethanol bei 70°C resuspendiert. Es wird darauf hingewiesen, dass dieses Verfahren das gemeinsame Ausfällen von DNA und RNA ermöglicht, was die Detektion der Genombotschaft von Viren vom Typ HIV oder SIV durch das "DNA direkt PCR" genannte Verfahren oder das "PCR-RNA" genannte Verfahren ermöglicht.
- Der Schritt der Extraktion viraler RNA wird im Allgemeinen auf dem Durchschnittsfachmann bekannte herkömmliche Weise durchgeführt.
- Nach dem Schritt der Extraktion von RNA ist es notwendig, einen zusätzlichen Schritt der Transformation des RNA-Einzelstrangs in Doppelstrang-DNA durchzuführen, wenn die Diagnostik in vitro gemäß der Erfindung anhand von biologischen Proben durchgeführt wird, welche die Viren vom Typ HIV-1 und/oder HIV-2 und/oder SIV enthalten, deren Genome in Form von RNA vorliegen.
- Diese Transformation von RNA in DNA wird durch Behandlung der nach Extraktion der biologischen Probe erhaltenen RNA, insbesondere des Serums, in einem geeigneten Medium mit Hilfe von inverser Transkriptase durchgeführt.
- Der Schritt der Retro-Transkription viraler RNA wird folgendermaßen durchgeführt:
- – 10 μg RNA-Extrakt, resuspendiert in Wasser, wird in Gegenwart eines Starterpaars zu jeweils einer Konzentration von 40 μM in einer Endmenge von 40 μl gebracht. Das Gesamte wird bei 100°C für 10 Minuten denaturiert, anschließend in Eiswasser getaucht,
- – dann werden 10 μl der folgenden Mischung hinzugefügt: 5 μl des unten beschriebenen Puffers "10 X buffer" + 1 Einheit revers-Transkriptase (AMV (Avian Myeloblastosis Virus) oder MuMLV (Moloney Leukemia Virus)) + 1 Einheit Taq-Polymerase + 1 μl der Mischung aus 4 dNTP zu 25 mM jeweils + Wasser ad 10 μl. Die Endmenge beträgt folglich 50 μl.
- Diese Reaktion wird in zwei Schritten durchgeführt:
- – a) erster Schritt: Herstellung der cDNA durch Tätigkeit der reversen Transkriptase bei 42°C für 13 Minuten,
- – b) zweiter Schritt: herkömmliche Genamplifikation: es wird auf 95°C für 3 Minuten erhitzt, um die revers-Transkriptase zu zerstören und den Schritt der Dehybridisierung/Hybridisierung zu ermöglichen, dann wird der zuvor für die Genamplifikation beschriebene Cyclus wiederholt.
- Der Schritt der Denaturierung wird in Gegenwart des (oder der) Paars (Paare) von Startern (oder Primern) gemäß der Erfindung durchgeführt. Tatsächlich ist, wie bereits oben angegeben, eines der charakteristischen Merkmale der Oligonukleotide (oder Primer) gemäß der Erfindung, eine saubere Amplifikationsbande zu ergeben, welcher im Allgemeinen ohne unspezifische Banden ist, wenn diese unter den folgenden Bedingungen verwendet werden:
- – Hybridisierung: die Primer (1 μl einer Lösung zu 40 μmol (40 μM) jedes Primers) werden für den ersten Schritt der Denaturierung/Reassoziation in Gegenwart der DNA-Matrize (100 zu 300 ng) gebracht; es wird für 10 Minuten auf 100°C erhitzt, dann werden die Röhrchen mit der Mischung aus DNA-Matrize und Primern in Wasser getaucht, welches Eis enthält, um den Reassoziationsgehalt DNA-Matrize/Primer zu erhöhen. Die Primer müssen in dem Schritt der Amplifikation zu einer Endkonzentration verwendet werden, die jeweils 0,8 μM beträgt.
- – Amplifikation: dem vorherigen Medium werden 4 A dNTP, die jeweils zu 0,5 μmol in der Endlösung (50 μl) verwendet werden, und eine Einheit Taq-Polymerase zu einem Reaktionsmedium von 50 μl hinzugefügt; dieser Schritt wird in einem Amplifikationspuffer gemäß der vorliegenden Erfindung, im Allgemeinen mit dem Namen "10 X buffer" bezeichnet, durchgeführt, dessen Zusammensetzung (wenn dieser zu 1/10° verdünnt ist) wie folgt ist: Tris-HCl, pH 8,9: 50mM; (NH4)2SO4: 15 mM; MgCl2: 5 mM; β-Mercaptoethanol: 10 mM; Gelatine: 0,25 mg/ml. Es werden 5 μl dieses Puffers und Wasser ad 50 μl zu dem vorherigen Medium hinzugefügt.
- Die Amplifikationscyclen werden auf folgende Weise durchgeführt: 30 bis 40 Cyclen, welche bestehen aus:
- – 94°C für 10 Sekunden (Denaturierung),
- – 60°C für 1 Minute 30 (Hybridisierung),
- – 78°C für 1 Minute 30 (Verlängerung).
- Daran schließt sich ein einzelner Cyclus von 78°C für 15 Minuten an.
- Die Genauigkeit der angegebenen Temperatur beträgt ± 0,3°C, ebenso wie ihre Stabilität während der verschiedenen Cyclen, welche die grundlegenden Bedingungen für das Erhalten einer maximalen Ausbeute sowie die Abwesenheit aspezifischer Banden darstellen.
- Die optimale Konzentration an DNA beträgt 100 bis 300 ng für das genomische DNA-Extrakt von Zellen (von Patienten oder aus Kultur, von Säugetieren oder anderen).
- Es wird darauf hingewiesen, dass die vorgenannten Bedingungen für ein Endreaktionsmedium von 50 μl optimale Bedingungen darstellen und entsprechend der Endmenge des Reaktionsmediums geändert werden können.
- Das bei dem Verlängerungsschritt des Cyclus verwendete Polymerisationsmittel ist eine thermostabile DNA-Polymerase, insbesondere Taq-Polymerase, die Amplifiose der Firma Appligène oder jede thermostabile DNA-Polymerase, die vermarktet werden kann.
- Auf allgemeine Weise wird der Cyclus des Verfahrens gemäß der Erfindung zwischen 30 und 40 Mal wiederholt.
- Als Beispiele sind die für das Genamplifikationsverfahren verwendbaren Starterpaare wie folgt:
- – MMy1-MMy4, MMy2-MMy4, MMy1-MMy3, MMy4bis-MMy28bis für das Gen gag,
- – MMy18-MMy19 für das Gen vpr,
- – MMy5-MMy8, MMy6-MMy8, MMy7-MMy8, MMy5-MMy7bis, MMy6-MMy7bis, MMy26-MMy5bis, MMy8bis-MMy9bis, MMy8bis-MMy89, MMy89bis-MMy9bis für das Gen env,
- – MMy9-MMy11, MMy9-MMy10bis, MMy10-MMy11 für das Gen nef1,
- – MMy15-MMy17, MMy15-MMy16bis, MMy16-MMy17 für das Gen vif1,
- – MMy20-MMy22, MMy20-MMy2lbis, MMy21-MMy22 für vif2,
- – MMy23-MMy24 für vpx,
- – MMy12-MMy14, MMy12-MMy13bis, MMy13-MMy14 für nef2,
- – MMy25-MMy27, MMy26-MMy27 für das Gen vpu,
- – MMy28-MMy29bis, MMy29-MMy30bis, MMy30-MMy31bis, 1-MMy32bis für das Gen pol.
- Jedoch sind die oben beschriebenen Kombinationen aus Primern "S" und "AS" nicht einschränkend und können entsprechend dem Wunsch des Benutzers geändert werden.
- Die Größen der mit Hilfe der oben als Beispiel genannten Starterpaare synthetisierten Nukleotidfragmente sind in der folgenden Tabelle I angegeben:
(die in der untenstehenden Tabelle angegebenen Zahlen stellen die Anzahl an Nukleotiden synthetisierter Fragmente dar, und die Gedankenstriche zeigen an, dass die getesteten Starterpaare es nicht ermöglichen, den entsprechenden viralen Stamm zu charakterisieren). - Tabelle I
- Die Erfindung hat gleichermaßen die Verwendung von Oligonukleotiden wie oben beschrieben und solche, welche Zucker in α-Konformation aufweisen, zum Gegen-stand. Derartige Oligonukleotide weisen das charakteristische Merkmal auf, die Richtung der mit der Matrize (Strang des Genoms des Virus) gebildeten Doppelhelix umzukehren, wodurch diese Doppelhelix von dem Zustand "S" somit in den Zustand "AS" übergeht.
- Die Erfindung betrifft ebenfalls Oligonukleotide wie oben beschrieben, bei denen gewisse Nukleotide methyliert sind und/oder ein oder mehrere Schwefelatome aufweisen, insbesondere auf den Adeninen. Derartige Oligonukleotide weisen das charakteristische Merkmal auf, die Stabilität der Doppelhelix zu erhöhen und als Folge besser mit dem zu amplifizierenden DNA-Strang zu hybridisieren.
- Die Erfindung betrifft ebenfalls Oligonukleotide wie oben beschrieben, die in " modifizierte Basen" genannter Form vorliegen und Nukleotide aufweisen, auf welche auf kovalente Weise Chromophore gepfropft sind (flache aromatische Moleküle wie beispielsweise oranges Acridin), insbesondere gemäß dem Verfahren, das in dem Artikel von C. Helene, erschienen in "Ia Vie des Sciences", zusammengefasst, allgemeine Reihe, Band 4, Nr. 1, S. 17-37, beschrieben ist. Derartige Oligonukleotide weisen das charakteristsiche Merkmal auf, leicht detektierbar zu sein, insbesondere durch Fluoreszenz.
- Die Erfindung betrifft die Verwendung von Startern gemäß der Erfindung wie oben angegeben für die Durchführung eines Syntheseverfahrens von Proteinen, die durch die mittels dieser Starter amplifizierten Nukleotidsequenzen kodiert sind.
- Das Syntheseverfahren eines Proteins oder eines Polypeptids, welches durch eine Nukleotidsequenz des Virus HIV-1, HIV-2 oder SIV gemäß der Erfindung kodiert ist, ist dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte aufweist:
- a. Synthese der Nukleotidsequenz durch ein Verfahren der Genamplifikation von Nukleotidsequenzen des Virus des Typs HIV-1, HIV-2 oder SIV mit Hilfe wenigstens zweier Starteroligonukleotide, deren Sequenzen bestehen aus: i. einer spezifischen Sequenz des Gens gag, welche aus einer zwischen den Genomen des Virus HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod und SIV Mac erhaltenen Region ist und in der Lage ist, bei einer Temperatur von 60°C +1°C mit den Genomen der Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod und SIV Mac zu hybridisieren; oder ii. einer Komplementärsequenz einer wie unter i. definierten Sequenz; und
- b. Rückgewinnung der so amplifizierten Nukleotidsequenz und Übersetzung in Protein.
- Ein bestimmtes Syntheseverfahren ist jenes, bei welchem die Sequenz der Starter wenigstens 60% identisch ist zu der Sequenz des Gens gag eines Virus HIV-1 Bru oder HIV-1 Mal oder HIV-1 ELI oder HIV-2 ROD oder SIV-Mac.
- Ein anderes bestimmtes Syntheseverfahren gemäß der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotidstarter einen Erhalt von wenigstens 5 Basen auf jeder Seite des Starters bezogen auf die Sequenz des Gens gag eines Virus HIV-1Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli oder HIV-2-ROD oder SIV-Mac aufweisen und in ihrem mittleren Teil Modifikationen aufweisen und die Hybridisierungseigenschaften mit den Genomen des Virus HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod und SIV Mac überwachen.
- Ein anderes Verfahren gemäß der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren der Genamplifikation die folgenden Schritte aufweist:
- a. einen Schritt der Extraktion von Nukleinsäure, welche zum Genom des Virus des Typs HIV-1, HIV-2 oder SIV gehört, und gegebenenfalls einen Schritt der Behandlung mittels einer reversen Transkriptase der Nukleinsäure, wenn diese letztgenannte in Form von RNA vorliegt,
- b. einen Cyclus, der die folgenden Schritte aufweist: i. Denaturierung der zu detektierenden Doppelstrang-Nukleinsäure, was zur Bildung einer Einzelstrang-Nukleinsäure führt, ii. Hybridisierung von jedem der Nukleinsäurestränge, die bei dem vorausgegangenen Schritt der Denaturierung erhalten wurden, an wenigstens einen Nukleotidstarter durch in Kontakt bringen der oben genannten Stränge mit wenigstens einem Starterpaar gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, iii. ausgehend von den Startern Bilden von DNA, die zu den Strängen komplementär ist, auf welche die Starter in Gegenwart einer DNA-Polymerase und von vier unterschiedlichen Nukleosidtriphosphaten (dNTP) hybridisiert sind, was zu der Bildung einer größeren Anzahl Doppelstrang-Nukleinsäuren als bei dem vorausgegangenen Schritt der Denaturierung führt,
- Ein weiteres Verfahren gemäß der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens zwei Oligonukleotidstarter Sequenzen aufweisen, welche jeweils bestehen aus
- i wenigstens einer Sequenz, die aus der folgenden Gruppe von Sense-Sequenzen gewählt ist: 5'-TGG CGC CCG AAC AGG GAC-3' 5'-TGG CGC CTG AAC AGG GAC-3' 5'-GGC CAG GGG GAA AGA AAA A-3' 5'-GGC CCG GCG GAA AGA AAA A-3' 5'-GGC CAG GAG GAA AGA AAA A-3' 5'-CAT CAA GCA GCC ATG CAA AG-3' 5'-CAC CAG GCA GCT ATG CAG AG-3' 5'-AGG GCT GTT GGA AAT GTG G-3' 5'-AGG GCT GTT GGA AGT GTG G-3' und wenigstens einer Sequenz, die aus der folgenden Gruppe von Antisense-Sequenzen gewählt ist: 3'-TGC CCA TAC AAA ATG TTT TA-5'' 3'-TGC CCA CAC TAT ATG TTT TA-5' 3'-TGC ATG GCT GCT TGA TG-5' 3'-TGC ATA GCT GCC TGG TG-5' 3'-CTT TGC ATG GCT GCT TGA TG-5' 3'-CTC TGC ATA GCT GCC TGA TG-5' 3'-CCA CAT TTC CAG CAT CCC T-5' 3'-CCA CAT TTC CAG CAG CCC T-5' 3'-CCA CAT TTC CAG CAC CCC T-5'
- ii. einer Komplementärsequenz einer wie unter i. definierten Sequenz; oder
- iii. einer Sequenz, welche wenigstens 60% identisch ist zu einer der unter i. oder ii. definierten Sequenzen und welche in der Lage ist, bei einer Temperatur von 60°C +1°C mit den Genomen der Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 ROD und SIV Mac zu hybridisieren.
- Ein anderes Verfahren gemäß der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens zwei der folgenden Startermischungen für die Amplifikation verwendet werden:
- MMy1: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 5-TGG CGC CCG AAC AGG GAC-3' 5-TGG CGC CTG AAC AGG GAC-3'
- MMy2: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 5'-GGC CAG GGG GAA AGA AAA A-3' 5'-GGC CCG GCG CAA AGA AAA A-3' 5'-GGC CAG GAG GAA AGA AAA A-3'
- MMy3: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 3'-TGC CCA TAC AAA ATG TTT TA-5'' 3'-TGC CCA CAC TAT ATG TTT TA-5'
- MMy4: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 3'-TGC ATG GCT GCT TGA TG-5' 3'-TGC ATA GCT GCC TGG TG-5'
- MMy4B: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 3'CTT TGC ATG GCT GCT TGA TG-5' 3'CTC TGC ATA GCT GCC TGA TG-5'
- MMy4Bbis: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 5'-C4T CAA GCA GCC ATG CAA AG-3' 5'-CAC CAG GCA GCT ATG CAG AG-3'
- MMy28: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 5'-AGG GCT GTT GGA AAT GTG G-3' 5'-AGG GCT GTT GGA AGT GTG G-3'
- MMy28bis: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 3'-CCA CAT TTC CAG CAT CCC T-5' 3'-CCA CAT TTC CAG CAG CCC T-5' 3'-CCA CAT TTC CAG CAC CCC T-5'
- Ein anderes Verfahren gemäß der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass es unter den folgenden Bedingungen durchgeführt wird:
- – für den Schritt der Hybridisierung: 1 μl einer Lösung zu 40 μmol jedes Starters wird für den ersten Schritt der Denaturierung – Reassoziation mit 100 bis 300 ng DNA-Matrize in Gegenwart gebracht; es wird für 10 Minuten bei 100°C erhitzt, dann werden die Röhrchen, welche die Mischung aus DNA-Matrize und Startern enthalten, in Wasser getaucht, das Eis enthält, wobei die Starter mit einer End-Konzentration in dem Folgeschritt der Amplifikation von 0,8 μM jeweils verwendet werden;
- – für den Schritt der Amplifikation werden dem vorausgegangenen Medium die 4 dNTPs hinzugefügt, wobei jedes zu 0,5 μmol in 50 μl der Endlösung verwendet wird, und eine Einheit Taq-Polymerase zu einem Reaktionsmedium von 50 μl, wobei dieser Schritt in dem Amplifikationspuffer durchgeführt wird, der mit dem Namen "10 X buffer" bezeichnet wird, sofern dieser zu 1/10 in der Endlösung verdünnt ist: Tris-HCl, pH = 8,9 50 mM; (NH4)2SO4: 15 mM; MgCl2: 5 mM; β-Mercaptoethanol: 10 mM; Gelatine: 0,25 mg/ml.
- Ein anderes Verfahren gemäß der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt der Übersetzung durchgeführt wird durch Transformation von geeigneten Wirtszellen mittels Vektoren, welche die amplifizierten Sequenzen enthalten, und Rückgewinnung der in diesen Wirtszellen produzierten Proteine.
- Ein anderes Verfahren gemäß der Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotidstarter aus den folgenden Paaren von Startermischungen gewählt sind:
- a. MMy1-MMy4 MMy1: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 5'-TGG CGC CCG AAC AGG GAC-3' 5'-TGG CGC CTG AAC AGG GAC-3' MMy4: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 3'-TGC ATG GCT GCT TGA TG-5' 3'-TGC ATA GCT GCC TGG TG-5'
- b. MMy2-MMy4 MMy2: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 5'-GGC CAG GGG GAA AGA AAA A-3' 5'-GGC CCG GCG GAA AGA AAA A-3' 5'-GGC CAG GAG GAA AGA AAA A-3' MMy4: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 3'-TGC ATG GCT GCT TGA TG-5' 3'-TGC ATA GCT GCC TGG TG-5'
- c. MMy1-MMy3 MMy1: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 5'-TGG CGC CCG AAC AGG GAG-3' 5'-TGG CGC CTG AAC AGG GAC-3' MMy3: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 3'-TGC CCA TAC AAA ATG TTT TA-5'' 3'-TGC CCA CAC TAT ATG TTT TA-5'
- d. MMy4Bbis-MMy28bis MMy4Bbis: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 5'-CAT CAA GCA GCC ATG CAA AG-3' 5'-CAC CAG GCA GCT ATG CAG AG-3' MMy28bis: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 3'-CCA CAT TTC CAG CAT CCC T-5' 3'-CCA CAT TTC CAG CAG CCC T-5' 3'-CCA CAT TTC CAG CAC CCC T-5'
- Zu Beispielzwecken weist dieses Syntheseverfahren von Proteinen die Amplifikation von Nukleotidsequenzen des Genoms der Viren vom Typ HIV oder SIV (welche für ein bestimmtes Protein kodieren und an denen gegebenenfalls gewisse Modifikationen ihrer Nukleotide vorhanden sind) durch in Kontakt bringen dieser Sequenzen mit wenigstens einem Starterpaar gemäß der Erfindung unter den oben beschriebenen Bedingungen auf, gefolgt von der Übertragung dieser derart amplifizierten Sequenzen in Proteine; der letztgenannte Schritt der Übertragung wird insbesondere durch Transformation von geeigneten Wirtszellen mit Hilfe von Vektoren durchgeführt, die diese amplifizierten Sequenzen enthalten, und Wiedergewinnung der in den Wirtszellen hergestellten Proteine.
- Es sind gleichermaßen die Polypeptide betroffen, die aus der Übertragung von Nukleotidsequenzen (oder Startern) gemäß der Erfindung hervorgegangen sind.
- Die vorliegende Anmeldung beschreibt gleichermaßen immunogene Zusammensetzungen, welche ein oder mehrere Übertragungsprodukte von Nukleotidsequenzen gemäß der Erfindung aufweisen, und/oder ein oder mehrere Übertragungsprodukte von gemäß den oben beschriebenen Verfahren amplifizierten Nukleotidsequenzen aus gemäß der Erfindung definierten Startern, wobei diese Übertragungsprodukte mit einem pharmazeutisch geeigneten Träger verbunden sind.
- Die vorliegende Anmeldung beschreibt Antikörper, die gegen ein oder mehrere oben beschriebene Übertragungsprodukte gerichtet sind (oder anders formuliert, die geeignet sind, eine immunologische Reaktion mit einem oder mehreren Übertragungsprodukten von Nukleotidsequenzen gemäß der Erfindung zu bilden, oder auch mit einem oder mehreren Übertragungsprodukten von aus Startern gemäß der Erfindung amplifizierten Nukleotidsequenzen).
- Ein Verfahren zur Herstellung von Nukleotidsequenzen (oder Startern) wie oben beschrieben weist die folgenden Schritte auf:
- – Inkubieren genomischer DNA, welche aus einem der Viren vom oben genannten Typ HIV oder SIV isoliert ist, mit DNAase I, dann Hinzufügen von EDTA und Reinigen durch Extraktion mit der Mischung Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol (25/24/1), dann mit Ether,
- – Behandlung der so extrahierten DNA mit Eco R1 Methylase in Gegenwart von DTT, und Reinigen durch Extraktion wie oben beschrieben,
- – Inkubieren der so gereinigten DNA mit den 4 Desoxynukleotidtriphosphaten dATP, dCTP, dGTP und dTTP in Gegenwart von T4 DNA-Polymerase und DNA-Ligase von E.coli, dann Reinigen gemäß dem oben beschriebenen Verfahren,
- – Klonieren der so erhaltenen Nukleinsäuren in einem geeigneten Vektor und Wiedergewinnung der untersuchten Nukleinsäure mit Hilfe einer geeigneten Sonde.
- Ein besonders vorteilhaftes Herstellungsverfahren von Nukleotidsequenzen gemäß der Erfindung weist die folgenden Schritte auf:
- – Synthese von DNA unter Verwendung des in Bioorganic Chemistry 4; 274-325 (1986) beschriebenen automatisierten Verfahrens von β-Cyanethylphosphoramidit,
- – Klonieren der so erhaltenen Nukleinsäuren in einem geeigneten Vektor und Wiedergewinnung der Nukleinsäure durch Hybridisierung mit einer geeigneten Sonde.
- Ein anderes Herstellungsverfahren von Nukleotidsequenzen gemäß der Erfindung weist die folgenden Schritte auf:
- – Zusammenfügen von chemisch synthetisierten Oligonukleotiden, die an ihren Enden mit verschiedenen Spaltstellen versehen sind, deren Sequenzen kompatibel sind mit der Aminosäurekette des natürlichen Polypeptids gemäß dem in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80; 7461-7465, (1983) beschriebenen Prinzip,
- – Klonieren der so erhaltenen Nukleinsäuren in einem geeigneten Vektor und Wiedergewinnung der untersuchten Nukleinsäure durch Hybridisierung mit einer geeigneten Sonde.
Claims (9)
- Syntheseverfahren eines Proteins oder eines Polypeptids, welches durch eine Nukleotidsequenz des Virus HIV-1, HIV-2 oder SIV kodiert ist, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte aufweist: a. Synthese der Nukleotidsequenz durch ein Verfahren der Genamplifikation von Nukleotidsequenzen des Virus des Typs HIV-1, HIV-2 oder SIV mit Hilfe wenigstens zweier Starteroligonukleotide, deren Sequenzen bestehen aus: i. einer spezifischen Sequenz des Gens gag, welche aus einer zwischen den Genomen des Virus HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod und SIV Mac erhaltenen Region ist und in der Lage ist, bei einer Temperatur von 60 °C ± 1 °C an die Genomen der Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod und SIV Mac zu hybridisieren; oder ii. einer Komplementärsequenz einer wie unter i. definierten Sequenz; oder b. Rückgewinnung der so amplifizierten Nukleotidsequenz und Übersetzung in Protein
- Syntheseverfahren gemäß Anspruch 1, in welchem die Sequenz der Starter wenigstens 60% identisch ist zu der Sequenz des Gens gag eines Virus HIV-1 Bru oder HIV-1 Mal oder HIV-1 ELI oder HIV-2 ROD oder SIV-Mac.
- Syntheseverfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotidstarter einen Erhalt von wenigstens 5 Basen auf jeder Seite des Starters bezogen auf die Sequenz des Gens gag eines Virus HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli oder HIV-2-ROD oder SIV-Mac aufweisen und in ihrem mittleren Teil Modifikationen aufweisen und die Hybridisierungseigenschaften an die Genome des Virus HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 Rod und SIV Mac bewahren.
- Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren der Genamplifikation die folgenden Schritte aufweist: a. einen Schritt der Extraktion von Nukleinsäure, welche zum Genom des Virus des Typs HIV-1, HIV-2 oder SIV gehört, und gegebenenfalls einen Schritt der Behandlung mittels einer reversen Transcriptase der Nukleinsäure, wenn diese letztgenannte in Form von RNA vorliegt, b. einen Kreislauf, der die folgenden Schritte aufweist: i. Denaturierung der zu detektierenden Doppelstrang-Nukleinsäure, was zur Bildung einer Einzelstrang-Nukleinsäure führt, ii. Hybridisierung von jedem der Nukleinsäurestränge, die bei dem vorausgegangenen Schritt der Denaturierung erhalten wurden, an wenigstens einen Nukleotidstarter durch in Kontakt bringen der oben genannten Stränge mit wenigstens einem Starterpaar gemäß einem der Ansprüche 1 oder 2, iii. ausgehend von den Startern Bilden von DNA, die zu den Strängen komplementär ist, auf welche die Starter in Gegenwart einer DNA-Polymerase und vier unterschiedlichen Nukleosidtriphosphaten (dNTP) hybridisiert sind, was zu der Bildung einer größeren Anzahl Doppelstrang-Nukleinsäuren als bei dem vorausgegangenen Schritt der Denaturierung führt, wobei dieser Kreislauf eine bestimmte Anzahl von Malen wiederholt wird, um die Nukleotidsequenz in einer Menge zu erhalten, die ausreichend ist, um ihre Detektion zu ermöglichen.
- Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die wenigstens zwei Oligonukleotidstarter Sequenzen aufweisen, welche jeweils bestehen aus: i. wenigstens einer Sequenz, die aus der folgenden Gruppe von Sense-Sequenzen gewählt ist: 5'-TGG CGC CCG AAC AGG GAC-3' 5'-TGG CGC CTG AAC AGG GAC-3' 5'-GGC CAG GGG GAA AGA AAA A-3' 5'-GGC CCG GCG GAA AGA AAA A-3' 5'-GGC CAG GAG GAA AGA AAA A-3' 5'-CAT CAA GCA GCC ATG CAA AG-3' 5'-CAC CAG GCA GCT ATG CAG AG-3' 5'-AGG GCT GTT GGA AAT GTG G-3' 5'-AGG GCT GTT GGA AGT GTG G-3' und wenigstens einer Sequenz, die aus der folgenden Gruppe von Antisense-Sequenzen gewählt ist: 3'-TGC CCA TAC AAA ATG TTT TA-5'' 3'-TGC CCA CAC TAT ATG TTT TA-5' 3'-TGC ATG GCT GCT TGA TG-5' 3'-TGC ATA GCT GCC TGG TG-5' 3'-CTT TGC ATG GCT GCT TGA TG-5' 3'-CTC TGC ATA GCT GCC TGA TG-5' 3'-CCA CAT TTC CAG CAT CCC T-5' 3'-CCA CAT TTC CAG CAG CCC T-5' 3'-CCA CAT TTC CAG CAC CCC T-5' ii. einer Komplementärsequenz einer wie unter i. definierten Sequenz; oder iii. einer Sequenz, welche wenigstens 60% identisch ist zu einer der unter i. oder ii. definierten Sequenzen und welche in der Lage ist, bei einer Temperatur von 60 °C ± 1 °C an die Genomen der Viren HIV-1 Bru, HIV-1 Mal, HIV-1 Eli, HIV-2 ROD und SIV Mac zu hybridisieren.
- Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens zwei der folgenden Startermischungen für die Amplifikation verwendet werden: MMy1: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 5'-TGG CGC CCG AAC AGG GAC-3' 5'-TGG CGC CTG AAC AGG GAC-3' MMy2: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 5'-GGC CAG GGG GAA AGA AAA A-3' 5'-GGC CCG GCG GAA AGA AAA A-3' 5'-GGC CAG GAG GAA AGA AAA A-3' MMy3: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 3'-TGC CCA TAC AAA ATG TTT TA-5'' 3'-TGC CCA CAC TAT ATG TTT TA-5' MMy4: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 3'-TGC ATG GCT GCT TGA TG-5' 3'-TGC ATA GCT GCC TGG TG-5' MMy4B: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 3'-CTT TGC ATG GCT GCT TGA TG-5' 3'-CTC TGC ATA GCT GCC TGA TG-5' MMy4Bbis: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 5'-CAT CAA GCA GCC ATG CAA AG-3' 5'-CAC CAG GCA GCT ATG CAG AG-3' MMy28: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 5'-AGG GCT GTT GGA AAT GTG G-3' 5'-AGG GCT GTT GGA AGT GTG G-3' MMy28bis: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 3'-CCA CAT TTC CAG CAT CCC T-5' 3'-CCA CAT TTC CAG CAG CCC T-5' 3'-CCA CAT TTC CAG CAC CCC T-5'
- Verfahren gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass es unter den folgenden Bedingungen durchgeführt wird: – für den Schritt der Hybridisierung: 1 μl einer Lösung zu 40 μmol jedes Starters wird für den ersten Schritt der Denaturierung – Reassoziation mit 100 bis 300 ng DNA-Matrix in Gegenwart gebracht; es wird für 10 Minuten bei 100°C erhitzt, dann werden die Röhrchen, welche die Mischung aus DNA-Matrix und Startern enthalten, in Wasser getaucht, das Eis enthält, wobei die Starter mit einer End-Konzentration in dem Folgeschritt der Amplifikation von 0,8 μM jeweils verwendet werden; – für den Schritt der Amplifikation werden dem vorausgegangenen Medium die 4 dNTPs hinzugefügt, wobei jedes zu 0,5 μmol in 50 μl der Endlösung verwendet wird, und eine Gruppierung von Taq-Polymerase für ein Reaktionsmedium von 50 μl, wobei dieser Schritt in dem Amplifikationspuffer durchgeführt wird, der mit dem Namen "10 X buffer" bezeichnet wird, so fern dieser zu 1/10 in der Endlösung verdünnt ist: Tris-HCl, pH = 8,9 50 mM; (NH4)2SO4: 15 mM; MgCl2: 5 mM; β-Mercaptoethanol: 10 mM; Gelatine: 0,25 mg/ml.
- Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Schritt der Übersetzung durchgeführt wird durch Transformation von geeigneten Wirtszellen mittels Vektoren, welche die amplifizierten Sequenzen enthalten, und Rückgewinnung der in diesen Wirtszellen produzierten Proteine.
- Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Oligonukleotidstarter aus den folgenden Paaren von Startermischungen gewählt sind: a. MMy1-MMy4 MMy1: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 5'-TGG CGC CCG AAC AGG GAC-3' 5'-TGG CGC CTG AAC AGG GAC-3' MMy4: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 3'-TGC ATG GCT GCT TGA TG-5' 3'-TGC ATA GCT GCC TGG TG-5' b. MMy2-MMy4 MMy2: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 5'-GGC CAG GGG GAA AGA AAA A-3' 5'-GGC CCG GCG GAA AGA AAA A-3' 5'-GGC CAG GAG GAA AGA AAA A-3' MMy4: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 3'-TGC ATG GCT GCT TGA TG-5' 3'-TGC ATA GCT GCC TGG TG-5' c. MMy1-MMy3 MMy1: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 5'-TGG CGC CCG AAC AGG GAC-3' 5'-TGG CGC CTG AAC AGG GAC-3' MMy3: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 3'-TGC CCA TAC AAA ATG TTT TA-5'' 3'-TGC CCA CAC TAT ATG TTT TA-5' d. MMy4Bbis-MMy28bis MMy4Bbis: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 5'-CAT CAA GCA GCC ATG CAA AG-3' 5'-CAC CAG GCA GCT ATG CAG AG-3' MMy28bis: Mischung, die gebildet ist aus den Startern 3'-CCA CAT TTC CAG CAT CCC T-5' 3'-CCA CAT TTC CAG CAG CCC T-5' 3'-CCA CAT TTC CAG CAC CCC T-5'
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