DE69133310T2

DE69133310T2 - Säuger-Zentromere mit menschlicher DNS, die mit einem dominanten Marker assoziiert sind

Info

Publication number: DE69133310T2
Application number: DE69133310T
Authority: DE
Inventors: Gyula Hadlaczky
Original assignee: BIOLOG RES CT OF HUNGARIAN; Hungarian Academy of Sciences Biologic Research Center
Current assignee: BIOLOG RES CT OF HUNGARIAN; Hungarian Academy of Sciences Biologic Research Center
Priority date: 1990-05-09
Filing date: 1991-05-09
Publication date: 2004-07-08
Anticipated expiration: 2011-05-10
Also published as: DE69133310D1; EP0473253A1; EP0473253B1; US5891691A; JPH06121685A; CA2042093C; ATE250134T1; CA2042093A1; US5712134A; JP3382256B2

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Das Centromer ist eine spezialisierte Region des eukaryontischen Chromosoms. Es ist der Ort der Kinetochorenbildung, einer Struktur, welche während der Zellteilung die präzise Segregation von Chromosomen ermöglicht. Zusätzlich dazu wurde auch eine mögliche strukturelle Rolle bei der Organisation höherer Ordnung von eukaryontischen Chromosomen vorgeschlagen (Hadlaczky (1985), Internatl. Rev., 94: 57–76).
Die Isolierung und Klonierung von Centromeren ist nicht nur für das Verständnis ihrer molekularen Struktur und Funktion sondern auch für die Konstruktion stabiler künstlicher Chromosomen entscheidend. Durch Ausnutzung der Existenz von Genen, die mit Centromeren verbunden sind, wurden funktionelle Centromere von niederen Eukaryonten (Hefe) erfolgreich isoliert (Blackburn et al. (1984), Ann. Rev. Biochem., 53: 163–194; Clarke et al. (1985), Ann. Rev. Genet. 19: 29–56). Die Kombination eines funktionellen Centromers mit Telomeren, welche die Chromosomenenden stabilisieren, ermöglichte die Konstruktion von künstlichen Hefechromosomen (Murray et al. (1983), Nature 305: 189–193; Burke et al. (1987), Science 236: 806–812). Dies initiierte eine neue Ära in der Untersuchung von Chromosomenfunktion und genetischer Manipulation.
Höhere Eukaryonten (z. B. Säuger) enthalten im Gegensatz zu Hefe repetitive DNA-Sequenzen, die an beiden Seiten des Centromers eine Grenze bilden. Diese hoch repetitive, mit bestimmten Proteinen wechselwirkende DNA, insbesondere in Tierchromosomen, erzeugt eine genetisch inaktive Zone (Heterochromatin) um das Centromer herum. Dieses perizentrische Heterochromatin hält jedes selektierbare Markergen auf einem beträchtlichen Abstand, und somit verhindert repetitive DNA die Isolation von centromeren Sequenzen durch "Wandern entlang des Chromosoms".
Es besteht somit in der Technik ein Bedarf für Verfahren zur Isolierung von Centromer-DNA aus höheren Eukaryonten. Die Isolation derartiger DNA ist für eine Konstruktion von künstlichen Säugerchromosomen notwendig. Eine Verwendung derartiger Chromosomen könnte Probleme überwinden, die den derzeitigen Techniken zum Einbringen von Genen in Säugerzellen inhärent sind, umfassend die gleichzeitige Erzeugung von Insertionsmutationen, Größenbeschränkungen bezüglich der eingebrachten DNA, und unperfekte Segregation von Plasmidvektoren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es ist ein Gegenstand der Erfindung, ein DNA-Element bereitzustellen, das eine zuverlässige Segregation von insertierter DNA in Meiose und Mitose sicherstellt.
Es ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung, ein DNA-Element für die Bildung von Vektoren, um große DNA-Mengen in Säugerzellen zu insertieren, bereitzustellen.
Diese und andere Gegenstände werden durch eine oder mehrere der nachstehend beschriebenen Ausführungsformen bereitgestellt.
In einer Ausführungsform wird eine nicht-humane Säugerzelllinie bereitgestellt, umfassend Zellen, die einen Überschuss an Centromeren umfassen, worin ein Chromosom, enthaltend ein überschüssiges Centromer, human-DNA umfasst und die human-DNA die in 1 angegebene Nukleotidsequenz umfasst.
In einer anderen Ausführungsform wird eine Nukleinsäuresonde bereitgestellt, welche an ein DNA-Molekül mit der in 1 gezeigten Sequenz hybridisiert.
In einer anderen Ausführungsform wird ein Verfahren bereitgestellt zur Herstellung einer nicht-humanen Säugerzelle, die einen Überschuss an Säugercentromeren umfasst, umfassend:

(a) Cotransfizieren von Zellen mit einem DNA-Fragment, umfassend human-DNA, und einem für einen dominanten selektierbaren Marker kodierenden Fragment, wobei das human-DNA umfassende DNA-Fragment die in 1 angegebene Nukleotidsequenz umfasst;
(b) Anzüchten der Zellen und Selektieren von Zellen, welche den dominanten selektierbaren Marker exprimieren; und
(c) Bestimmen der Zellen mit einem Überschuss an Säugercentromeren unter den Zellen, welche den dominanten selektierbaren Marker exprimieren.

Es wird ein Verfahren zur Isolierung von Centromer-DNA aus einem Säuger bereitgestellt, umfassend:
das Isolieren von Metaphase-Chromosomen einer Säugerzelllinie,
das Fragmentieren der Chromosomen, wobei eine Chromosomenfragmenteenthaltende Suspension gebildet wird,
das Inkubieren der Suspension mit anti-Centromer-Antikörpern enthaltendem Humanserum, wobei Chromosomenfragmente an die Antikörper binden,
das Abtrennen von Antikörper-gebundenen Chromosomenfragmenten aus der Suspension, und
das Entproteinieren der gebundenen Fragmente, wobei eine Präparation von centromerer DNA bereitgestellt wird.
Diese und andere Ausführungsformen werden nachstehend ausführlicher beschrieben. Die vorliegende Erfindung stellt somit der Technik Methoden bereit, um die wichtige Centromer-DNA von Säugerzellen zugänglich zu machen und zu isolieren. Insbesondere wird das humane DNA-Fragment CM8 bereitgestellt, welches für die Erzeugung von künstlichen Chromosomen für die Gentherapie verwendet werden kann.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt die Sequenz eines 13.863 bp DNA-Fragments bereit, identifiziert in einer λ Charon 4A Bibliothek des Humangenoms.
2 zeigt die Ergebnisse einer Agarosegelelektrophorese von durch Immunpräzipitation erhaltenen DNA-Fragmenten.
Bahnen A und B: DNA, isoliert aus Chromosomenfragmenten, welche an anti-Centromer-Sepharose ungebunden bleiben.
Bahnen C und D: DNA aus Chromosomenfragmenten, welche an anti-Centromer-Sepharose binden. Die Gegenwart einer Population von DNA-Fragmenten mit hohem Molekulargewicht ist zu bemerken. Die Proben der Bahnen B und D wurden vor der Elektrophorese mit 100 μg/ml RNase A behandelt.
Bahn M: λ HindIII Marker.
3 zeigt die Restriktionskarte des Humangenom-DNA-Inserts des λ Charon 4A Klons CM8. Der Pfeil zeigt die Position eines 300 bp Alu-Repeats, dem die flankierenden Direktrepeatsequenzen fehlen.
4 zeigt die Ergebnisse einer in situ Hybridisierung von ³H-Thymidin-markierter CM8-DNA an humane Metaphasechromosomen.
A: Präferentielle Lokalisierung von Silberkörnchen an den Centromeren von Humanchromosomen (Pfeilspitzen).
B: Diagramm, das die Verteilung von Silberkörnchen (•) auf 131 metazentrischen Chromosomen zeigt. Zahlen zeigen die Häufigkeit der Lokalisierung von Silberkörnchen an bestimmten Regionen der Chromosomen an.
5 zeigt die Bestimmung von dizentrischen Chromosomen und Minichromosomen der EC3/7 Zellen durch indirekte Immunfluoreszenz ( A und B) mit anti-Centromer-Antikörpern, und durch in situ Hybridisierung mit Biotinmarkierten CM8-Sonden (C) und mit einem 1 kb SmaI/BglII-Fragment eines APH-II Gens (D).
E und F: DNA-Anfärbung mit Hoechst 33258,
G und H: DNA-Anfärbung mit Propidiumjodid. Die E–H entsprechen jeweils den A–D. Pfeilspitzen zeigen auf dizentrische Chromosomen und Minichromosomen.
6 zeigt die Duplikation des zusätzlichen Chromosoms in der Zelllinie EC3/7.
A–C: In situ Hybridisierung mit Biotin-markierter CM8-Sonde.
D–F: Entsprechende DNA-Anfärbung von A–C.
7 zeigt die Colokalisierung der integrierten DNA-Sequenzen in der Centromer-Region, bestimmt durch Immunanfärbung mit anti-Centromer-Serum (A und D) und anschließende in situ Hybridisierung mit Biotin-markierter CM8-Sonde (B) und APHII-Sonde (E) auf den gleichen Metaphasen der EC3/7 Zellen.
C und F: DNA-Anfärbung
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG
Es ist die Entdeckung der vorliegenden Erfindung, dass ein Segment humaner DNA isoliert und in Mauszellen eingebracht werden kann, und zu einem funktionellen Centromer führt. Die DNA-enthaltenden funktionellen Centromere der vorliegenden Erfindung sind bevorzugt mit einem dominanten selektierbaren Marker verbunden. Dies kann ein Resistenzmarker sein, wie etwa die Aminoglykosid-3'-phosphotransferase-II, die eine Resistenz gegen G418 (Sigma) bereitstellt. Andere solche, in der Technik bekannte Marker können verwendet werden.
Das Verfahren zur Isolierung von Centromer-DNA kann auf jeden höheren Eukaryonten, insbesondere Säuger angewandt werden. Bevorzugt wird eine Humanzelllinie verwendet. Metaphase-Chromosomen werden gemäß in der Technik bekannten Techniken isoliert. Die Chromosomen werden danach fragmentiert. Verdau mit Endonukleasen und mechanisches Scheren können zur Fragmentierung der Chromosomen verwendet werden. Wünschenswert liegt die Mehrzahl der Fragmente in einem Größenbereich von kleiner 1 μm, und bleiben manche Chromosomen unzerbrochen. Unzerbrochene Chromosomen können aus der Präparation leicht entfernt werden durch etwa 10-minütige Zentrifugation bei etwa 1.500 G.
Ein anti-Centromer-Autoantikörper enthaltendes Humanserum kann in diesem Verfahren verwendet werden. Dies ist aus Patienten mit dem CREST-Syndrom erhältlich. Alternative Antikörperquellen können verwendet werden, wie etwa monoklonale Antikörper oder aus Tieren stammende polyklonale Seren, die anti-Centromer-Antikörper enthalten. Die Antikörper werden mit der Präparation von Chromosomenfragmenten unter Bedingungen inkubiert, bei denen sich Antikörper-Antigen-Komplexe bilden und stabil sind. Es ist günstig, wenn die Antikörper an einen festen Träger gebunden sind. Bevorzugt wird ein Träger wie etwa Protein A-Sepharose CL4B (Pharmacia) verwendet um die Abtrennung gebundener von nichtgebundenen Chromosomenfragmenten zu erleichtern. Es können jedoch andere Methoden verwendet werden um dieses Ziel zu erreichen, wie in der Technik bekannt, ohne die Verwendung eines an einen festen Träger gebundenen Antikörpers.
Die DNA-Fragmente, welche Centromer-DNA umfassen, werden durch eine Entproteinierungsbehandlung von den Antikörpern und Centromer-Proteinen befreit. Schließlich wird die DNA von allen Proteinen gereinigt, indem die Proteine abgebaut und aus der Chromosomenfragmentpräparation extrahiert werden. Jede solche in der Technik bekannte Behandlung kann verwendet werden, umfassend aber nicht beschränkt auf Proteasen und organische Lösungsmittel, wie etwa Proteinase K und Phenol.
Die Centromer-DNA-Fragmente können für jeden Zweck oder jede Anwendung, der bzw. die in der Technik bekannt ist, verwendet werden. Beispielsweise können sie markiert und als Sonden verwendet werden; sie können in Vektoren ligiert werden um die Sequenzen teilweise oder vollständig zu klonieren; und sie können durch Befestigung an einem festen Träger zur Reinigung von Centromer-Proteinen verwendet werden.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung werden die Centromer-DNA-Fragmente als Sonden verwendet, um eine Bibliothek genomischer DNA aus Menschen oder anderen Säugern auf Klone zu screenen, mit denen sie hybridisieren. Hybridisierende Klone können auf ihre Fähigkeit analysiert werden, Funktionen auszuführen, welche Centromer-DNA besitzt. Eine derartige Funktion ist, an Centromer-Proteine zu binden. Eine weitere derartige Funktion ist, in Zellen eine Struktur zu bilden, die unter Verwendung einer geeigneten Immunanfärbung mit anti- Centromer-Antikörpern, welche Centromere besonders färben, zytologisch nachgewiesen werden kann.
Gemäß einem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine nicht-humane Säugerzelle, die einen Überschuss an Säugercentromeren umfasst, gebildet. Das Centromer kann DNA umfassen, die aus der gleichen Säugerspezies wie die Zelle oder einer davon verschiedenen isoliert worden ist. Das Verfahren umfasst eine Cotransfektion einer Zelle mit zwei DNA-Molekülen: eines ist eine DNA, welche die DNA-Sequenz von 1 umfasst; das andere ist eine DNA, die einen dominanten selektierbaren Marker umfasst. Bevorzugt enthalten diese zwei DNA-Moleküle Sequenzen, welche eine Concatamerbildung ermöglichen, beispielsweise Phagen-DNA, wie etwa Phage λ. Das erste DNA-Molekül kann aus einer Bibliothek genomischer DNA isoliert werden, unter Verwendung von beispielsweise den oben gelehrten Centromerfragmenten als eine Sonde. Alternativ kann das erste DNA-Molekül aus der Klonierung der oben gelehrten Centromerfragmente in einen Phagen, beispielsweise λ, resultieren, nach Manipulationen um Fragmente mit den geeigneten Größen und Termini zu erzeugen. Das zweite DNA-Molekül ist für den Fachmann leicht verfügbar, beispielsweise ein λ Phage, der einen Arzneimittelresistenzmarker umfasst.
Es wird angenommen, dass es erwünscht ist, Phage λ-DNA zu verwenden, da sie concatamerisiert, die absolute Notwendigkeit davon wurde jedoch nicht bestimmt. Weiter könnten, sogar wenn diese Eigenschaft notwendig ist, andere virale DNA oder DNA-Konstrukte geeignet sein, diese Funktion bereitzustellen. Derartige andere Mittel um eine Concatamerisierung zu erreichen, werden als von diesem Verfahren umfasst erachtet.
Nach der Cotransfektion werden Zellen selektiert, welche den dominanten selektierbaren Marker exprimieren, beispielsweise mittels Wachstum in G418-Mengen, die für Zellen ohne den Marker zytotoxisch sind. Diese selektierte Zellpopulation wird weiter gescreent, um Zellen mit einem Überschuss an Säugercentromeren zu bestimmen. Dieses Screening kann durch zytogenetische Standardtechniken sowie durch Immunanfärbung mit anti-Centromer-Antikörpern erfolgen. Wünschenswert sind die Lambda-DNA, Marker-DNA und Centromer-DNA (aus dem λ-Klon) alle am Ort des zusätzlichen Chromosoms lokalisiert. Dies kann durch in situ Hybridisierungsuntersuchungen, die in der Technik gut bekannt sind, bestimmt werden.
Eine durch die vorstehend beschriebenen Verfahren hergestellte Zelllinie ist EC3/7, die bei der European Collection of Animal Cell Cultures, Porton Down, U. K., unter der Zugangsnummer 90051001 unter den Bedingungen des Budapester Vertrags hinterlegt ist.
Die Sequenz des DNA-Inserts in dem Lambda-Phagen, der zur Herstellung der Zelllinie EC3/7 verwendet wurde (bezeichnet als CM8) wurde mittels Standardtechniken bestimmt und ist in 1 gezeigt. Die Sequenz entspricht keiner Sequenz in DNA-Datenbanken.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet auch Nukleinsäuresonden, bevorzugt von mindestens 10 Nukleotiden, welche an ein DNA-Molekül mit der in 1 gezeigten Sequenz hybridisieren. Ein derartiges Molekül ist CM8, der Lambda-Phage-Klon von dem die Sequenz abgeleitet ist. Sonden können beispielsweise radioaktiv markiert, Biotin-markiert oder auch unmarkiert sein, in Abhängigkeit von der für sie gewünschten Verwendung.
Die nachfolgenden Beispiele beschränken die Erfindung nicht auf die besonderen beschriebenen Ausführungsformen, sondern werden präsentiert um bestimmte Weisen, auf welche die Erfindung praktiziert werden kann, besonders zu beschreiben.
Beispiel 1
Dieses Beispiel zeigt die Isolierung von humaner Centromer-DNA. Eine humane Kolonkarzinomzelllinie (Colo320) wurde in RPMI-Medium, ergänzt mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) als eine Suspension angezüchtet. Metaphase-Chromosomen von Colo320 Zellen wurden mittels unserer Standardmethode (Hadlaczky et al. (1982), Chromosomes 86: 643–659) isoliert. Isolierte Metaphase-Chromosomen wurden in 1 ml Puffer (105 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 5 mM 2-Mercaptoethanol) in einer Konzentration von 1 mg/ml DNA resuspendiert und 1 h mit 500 U Restriktionsendonuklease EcoRI verdaut. Die Suspension wurde mit 4 ml IPP-Puffer (500 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 0,5% NP-40, pH 8.0) verdünnt und 5 × 50 s mit einer MSE 5–70 Beschallungsvorrichtung beschallt. Diese Behandlung führte zu einer Suspension, die Chromosomenfragmente und ein paar (≤ 1%) unzerbrochene kleine Chromosomen enthielt. Die Suspension wurde 10 min bei 1500 G zentrifugiert, um unzerbrochene Chromosomenfragmente zu entfernen. Der Überstand enthielt nur kleine Chromosomenfragmente (≤ 1 μm), wie mittels Lichtmikroskopie bewertet.
Zweihundertfünfzig mg Protein A-Sepharose CL4B (Pharmacia) wurden in IPP-Puffer gequollen und mit 500 μl humanem anti-Centromer-Serum LU851 (Hadlaczky et al. (1989), Chromosoma 97: 282–288), 20-fach mit IPP-Puffer verdünnt, inkubiert. Die Suspension aus beschallten Chromosomenfragmenten (5 ml) wurde mit anti-Centromer-Sepharose (1 ml) gemischt und 2 h unter sanftem Rollen bei Raumtemperatur inkubiert. Nach drei nachfolgenden Waschschritten mit 25 ml IPP-Puffer wurde die Sepharose 10 min bei 200 G zentrifugiert.
Die Isolierung von DNA aus dem Immunpräzipitat wurde mittels Proteinase K-Behandlung (Merck, 100 μg/ml) in 10 mM Tris-HCl, 2,5 mM EDTA, pH 8,0, enthaltend 1% SDS, über Nacht bei 50°C, gefolgt von wiederholten Phenol-Extraktionen und Präzipitation mit Isopropanol, durchgeführt. Alle allgemeinen DNA-Manipulationen waren gemäß Maniatis (Maniatis et al. (1982), Molecular Cloning – A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)).
Ergebnisse einer Elektrophorese von immunpräzipitierter DNA und DNA im Überstand sind in 2 gezeigt. Der Großteil an DNA von Chromosomenfragmenten, die nicht an die anti-Centromer-Sepharose banden (Überstand), lag in einem Bereich von mehreren hundert Basenpaaren bis 5 kb ( 2, Bahnen A und B), während DNA von Chromosomenfragmenten, die an die anti-Centromer-Sepharose banden, eine zusätzliche Fraktion von Fragmenten mit hohem Molekulargewicht (9–20 kb) enthielt (2, Bahnen C und D). Diese Verteilung von Fragmentgrößen ist konsistent mit der Feststellung, dass die centromere DNA die strukturell stabilste Region von Säugerchromosomen ist (Hadlaczky et al. (1981), Chromosoma 81: 557–567), was diese DNA somit gegen enzymatischen Verdau und mechanisches Scheren relativ beständig macht.
Beispiel 2
Dieses Beispiel zeigt die Verwendung der immunpräzipitierten DNA mit hohem Molekulargewicht als eine Hybridisierungssonde, um eine genomische DNA-Bibliothek zu screenen.
Die DNA mit hohem Molekulargewicht wurde mittels Elektroelution aus dem in Beispiel 1 beschriebenen Agarosegel isoliert, mit ³²P-dATP markiert, durch Zufalls-Oligonukleotidprimer (Feinberg et al. (1983), Anal. Biochem. 132: 6–13), und als eine Sonde zum Screening einer λ Charon 4A Bibliothek des Humangenoms (Maniatis et al. (1978), Cell 15: 687–701) verwendet. Es wurde ein hybridisierender Klon (CM8) erhalten, der ein 14 kb Insert humaner DNA enthält. Die Restriktionskarte dieses Inserts für manche Restriktionsendonukleasen ist in 3 gezeigt. Southern-Hybridisierug von Teilen des 14 kb Inserts an humane genomische DNA von Lymphozyten deutet darauf hin, dass das 14 kb Insert einen kontinuierlichen DNA-Abschnitt im Genom darstellt und nicht das Ligationsprodukt aus mehreren Fragmenten ist.
Beispiel 3
Dieses Beispiel zeigt, dass die Anzahl von Kopien des 14 kb Inserts von Klon CM8 damit konsistent ist, dass es in jedem Chromosom des menschlichen Genoms vorhanden ist.
Es wurden Southern Blot-Experimente durchgeführt, bei denen eine Einzelkopie-DNA-Sonde (XV2C) (Estivill et al. (1987), Nature 326: 840–845) und das zentrale XhoI-EcoRI-Fragment des CM8-Inserts (2) gleichzeitig mit Reihenverdünnungen von DNA aus peripheren humanen Lymphozyten hybridisiert wurden. Die Sonden wurden durch Zufalls-Oligonukleotidprimer (Feinberg et al. (1983), Anal. Biochem. 132: 6–13) markiert. Durch einen Vergleich des Signals der CM8-Sonde mit dem der bekannten Einzelkopiesonde wurde die Kopienzahl von CM8 auf 16–32 pro haploides Genom geschätzt.
Beispiel 4
Dieses Beispiel zeigt die Verwendung der CM8-DNA als eine Sonde für humane Metaphase-Chromosomen.
Radioaktive in situ Hybridisierung mit ³H-Thymidin-markierter CM8-DNA an humane (Colo320) Metaphase-Chromosomen wurde gemäß dem Verfahren von Pinkel et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2934–2938, durchgeführt. Es wurde eine präferentielle centromere Lokalisierung von Silberkörnchen beobachtet (4).
Bei einer nicht-radioaktiven in situ Hybridisierung gemäß dem Verfahren von Graham et al. ((1973), Virology 52: 456–467), unter Verwendung von Biotin-markierten Subfragmenten oder dem vollständigen CM8-Insert war es nicht möglich, mit unserem Standardverfahren ein positives Hybridisierungssignal nachzuweisen. Weiterhin wurde unter Verwendung eines Hybridisierungsverfahrens, das für den Nachweis eines Einzelkopie-Gens mit einer Biotin-markierten Sonde geeignet ist (Lawrence et al. (1988), Cell 52: 51–61), neben dem typischen, R-Banden-ähnlichen Alu-Hybridisierungsmuster (Korenberg et al. (1988), Cell 53: 391–400) kein spezifisches Hybridisierungssignal auf irgendeinem der Chromosomen mit dem vollständigen 14 kb CM8-Insert nachgewiesen. Mögliche Erklärungen für dieses negative Ergebnis sind, dass diese Sequenzen aufgrund ihrer kompakten Verpackung inmitten der Centromerstruktur für die Hybridisierungssonde praktisch unzugänglich sind, und dass das Biotinsystem weniger empfindlich ist als das radioaktive System.
Beispiel 5
Dieses Beispiel offenbart die Sequenz des humanen CM8-Klons.
Die Sequenz des humanen genomischen Inserts von λ CM8 wurde unter Verwendung des Didesoxyverfahrens (Sanger et al. (1980), J. Mol. Biol. 143: 161– 178; Biggin et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 3963–3965) bestimmt. Siehe 1.
Die Sequenz des 13.863 bp humanen CM8-Klons wurde mit einer kompletten Nukleinsäure-Datenbank (MicroGenie, Beckman) verglichen und zeigte keine Homologie zu irgendeiner bekannten Sequenz. In dem 2,5 kb EcoRI-XhoI-Fragment wurde jedoch ein 300 bp Alu-Repeat, dem die flankierenden Direktrepeatsequenzen fehlen, gefunden (3) was das in situ Hybridisierungsmuster vom Alu-Typ erklärt.
Beispiel 6
Dieses Beispiel zeigt die Verwendung der CM8-DNA, um in Säugerzellen Centromere zu bilden.
Um eine in vivo Centromer-Funktion der CM8-DNA zu bestimmen, wurde sie mit dem selektierbaren APH-II Gen in Maus LMTK^– Fibroblastenzellen eingebracht. Die Mausfibroblastenzellen wurden als eine Monoschicht in F12-Medium, ergänzt mit 10% FCS, gehalten. Das Calciumphosphat-Verfahren (Harper et al. (1981), Chromosoma 83: 431–439) wurde verwendet, um die Zellen mit 20 μg λ CM8 und 20 μg λ gtWESneo DNA pro Petrischale (80 mm) zu transfizieren. Ein 2-minütiger Glyzerinschock wurde verwendet. λ gtWESneo wurde hergestellt durch Klonierung des Plasmids pAG60 (Colbere-Garapin et al. (1981, J. Mol. Biol. 150: 1–14) in einen Bakteriophagenvektor λ gtWES (Leder et al. (1977), Science 196: 175–177).
Die ganzen λ CM8 und λ gtWESneo Konstruktionen wurden aus zwei Gründen für Transfektionen verwendet. Erstens, um das Markergen von den CM8-Sequenzen zu trennen, um eine Inaktivierung des APH-II Gens zu verhindern, ein Vorgang, der während der Centromerenbildung auftreten kann. Zweitens kann λ DNA durch Concatamerisierung lange Anordnungen von DNA-Molekülen hintereinander bilden. Es war postuliert, dass eine Concatamerisierung zur Bildung von Centromeren notwendig ist, da in S. pombe 4 bis 15 Kopien konservierter Sequenzmotive Centromere bilden (Chikashige et al. (1989), Cell 57: 739–751). Unter Berücksichtigung dieser zwei Tatsachen könnte eine Multiplikation der mutmaßlichen Centromer-DNA durch Concatamerisierung die Chance für eine Centromerenbildung erhöhen.
Transformierte Zellen wurden auf Wachstumsmedium, enthaltend 400 μg/ml G418 (Genticin, Sigma) selektiert. Individuelle G418-resistente Klone wurden analysiert. Die Gegenwart von humanen Sequenzen in den transformierten Klonen wurde unter Verwendung von Southern Blots, die mit Subfragmenten des CM8-Inserts getestet wurden, überwacht. Ein Screening auf überschüssige Centromere wurde durch indirekte Immunfluoreszenz unter Verwendung des humanen anti-Centromer-Serums LU851 (Hadlaczky et al. (1989), Chromosoma 97: 282–288) erreicht. Die chromosomale Lokalisierung von "fremden" DNA-Sequenzen wurde mittels in situ Hybridisierung mit Biotin-markierten Sonden bestimmt.
Acht transformierte Klone wurden analysiert. Alle der Klone enthielten humane, in Mauschromosomen integrierte DNA-Sequenzen. Nur zwei Klone (EC5/6 und EC3/7) zeigten jedoch die reguläre Gegenwart von dizentrischen Chromosomen. Individuelle Zellen des Klons EC5/6, die di-, tri- und multizentromere Chromosomen enthielten, zeigten eine extreme Instabilität. In mehr als 60% der Zellen dieser Zelllinie variierte die chromosomale Lokalisierung der integrierten DNA-Sequenzen von Zelle zu Zelle. Aufgrund dieser Instabilität wurde der Klon EC5/6 als ungeeignet erachtet. Zellen des Klons EC3/7 waren jedoch stabil und enthielten entweder ein dizentrisches Chromosom (85%) oder ein Minichromosom (10%). Durch Immunanfärbung mit anti-Centromer-Antikörpern waren die Centromere von dizentrischen Chromosomen und Minichromosomen von den normalen Mauscentromeren nicht unterscheidbar ( 5A und B).
Beispiel 7
Dieses Beispiel zeigt, dass die neu in die Zelllinie EC3/7 eingebrachte DNA zu Centromerbildung beiträgt.
In situ Hybridisierung mit Biotin-markiertem CM8, APH-II Gen und Phage λ DNA wurde durchgeführt. Chromosomen wurden für in situ Hybridisierungsexperimente mit Propidiumjodid gegengefärbt (Pinkel et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 2934–2938), während bei indirekter Immunfluoreszenz mit DNA-bindendem Farbstoff der Farbstoff Hoechst 33258 verwendet wurde. Alle Beobachtungen und Mikrophotographie wurden unter Verwendung eines Olympus AHBS Vanox Mikroskops ausgeführt. Für Photographien wurden Forte 400 Schwarzweißfilm und Fujicolor 400 Super HG Farbfilm verwendet.
Diese drei Sonden hybridisierten ohne Ausnahme an die gleichen Punkte: entweder an das distale Centromer des dizentrischen Chromosoms (5C) oder an das Centromer des Minichromosoms (5D). In weniger als 5% der EC3/7 Zellen wurde eine alternative Lokalisierung des Hybridisierungssignals festgestellt. Diese umfassten Zellen mit mehr als einer Integrationsstelle, Zellen ohne ein nachweisbares Signal, oder Zellen, an denen die Hybridisierung auf anderen Chromosomen als denen, die als das dizentrische Chromosom identifiziert worden waren, aufgefunden wurde.
In weniger als 0,5% der Zellen wurde eine hintereinander liegende Mehrfachanordnung des Hybridisierungssignals auf den dizentrischen Chromosomen beobachtet (6A–C), was nahelegte, dass das zusätzliche Centromer zu autonomer "Duplizierung" fähig war. Mindestens manche dieser duplizierten Centromere schienen funktionell zu sein. Dies wurde durch die Existenz eines Minichromosoms mit doppelten Centromeren angezeigt. Beide Centromere dieses Minichromosoms zeigten eine positive Immunanfärbung mit anti-Centromer-Antikörpern (7A). Minichromosomen, die doppelte Centromere enthalten, könnten Bruchstückprodukte von multicentromeren Chromosomen sein.
Indirekte Immunfluoreszenz von Maus-Metaphasezellen wurde durchgeführt, wie von Hadlaczky et al. (1989), Chromosoma 97: 282–288, beschrieben. Wenn indirekte Immunfluoreszenz und in situ Hybridisierung an den gleichen Metaphasen durchgeführt wurden, wurden mitotische Zellen in einem Glycin-Hexylenglykol-Puffer (Hadlaczky et al. (1989), Chromosoma 97: 282–288) resuspendiert, 10 min bei 37°C gequollen, gefolgt von Zytozentrifugation und Fixierung mit kaltem (–20°C) Methanol. Nach der Standardimmunanfärbung (Hadlaczky et al. (1989), Chromosoma 97: 282– 288) wurden Metaphasen photographiert, danach wurden Deckgläser mit Phosphatgepufferter Salzlösung abgewaschen und Objektträger wurden in eiskaltem Methanol-Essigsäure fixiert, luftgetrocknet und für die in situ Hybridisierung verwendet.
Um die Integration des humanen CM8-Klons und des APH-II Gens in der Centromerregion zu zeigen, wurde eine Immunanfärbung von Centromeren mit anti-Centromer-Antikörpern, gefolgt von in situ Hybridisierung mit den Sonden CM8 und APH-II auf den selben Metaphase-Platten von EC3/7 Zellen ausgeführt. Die in situ Hybridisierungssignale mit den beiden Biotin-markierten Sonden CM8 und APH-II zeigte eine Colokalisierung innerhalb der immunangefärbten Centromerregion der zusätzliche Centromere enthaltenden Chromosomen (7).
Beispiel 8
Dieses Beispiel beschreibt die Stabilität der Zelllinie EC3/7.
Sechsundvierzig unabhängige, von einer einzigen Zelle abstammende Subklone wurden isoliert und analysiert. Jeder der Subklone enthielt das dizentrische Chromosom. Der Prozentanteil von Minichromosom-enthaltenden Zellen variierte in unterschiedlichen Subklonen zwischen 2% und 30%. Es gelang uns nicht, einen Subklon zu isolieren, der das zusätzliche Centromer ausschließlich in einem Minichromosom enthielt. Dieses Ergebnis legte nahe, dass die Minichromosomen instabil waren, und sie können als die Produkte eines regulären Auseinanderbrechens der dizentrischen Chromosomen angesehen werden.
Eine vorläufige Analyse von EC3/7 Zellen (103 Metaphasen), die 46 Tage in einem nicht-selektiven Medium kultiviert worden waren, zeigte, dass 80,6% der Zellen entweder ein dizentrisches Chromosom (60,2%) oder ein Minichromosom (20,4%) enthielten. Nachfolgende in situ Hybridisierung mit Biotin-markierten Sonden bewies die Gegenwart der "fremden" DNA im zusätzlichen Centromer. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass während dieses Kultivierungszeitraums unter nicht-selektiven Bedingungen kein schwerwiegender Verlust oder eine Inaktivierung der zusätzlichen Centromere stattgefunden hatte.
Beispiel 9
Dieses Beispiel zeigt, dass das CM8-Insert concatamerisierte um das funktionierende Centromer der Zelllinie EC3/7 zu bilden.
DNA der Zelllinie EC3/7 und DNA von humanen Lymphozyten wurden mit Restriltionsendonukleasen verdaut und in einem Hybridisierungsexperiment nach Southern mit Subfragmenten des CM8-Inserts getestet. Durch Vergleich der Intensität des Hybridisierungssignals von EC3/7 zu der von Human-DNA wurde die minimale Anzahl integrierter Humansequenzen in dem zusätzlichen Centromer auf ≥ 30 geschätzt. Die Kopienzahl von CM8 in DNA von Humanlymphozyten wurde bestimmt, wie vorstehend in Beispiel 3 beschrieben.

Claims

Nicht-humane Säugerzelllinie, umfassend Zellen, die einen Überschuss an Centromeren umfassen, worin: ein Chromosom, enthaltend ein überschüssiges Centromer, human-DNA umfasst und die human-DNA die in 1 angegebene Nukleotidsequenz umfasst.
Zelllinie nach Anspruch 1, worin ein Chromosom, das ein extra Centromer enthält, von einer Zelllinie mit allen den charakteristischen Eigenschaften der unter der ECACC Zugangsnummer 90051001 hinterlegten Zelllinie abgeleitet ist.
Zelllinie nach Anspruch 1 mit allen den charakteristischen Eigenschaften der Zelllinie, die bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) unter der Zugangsnummer 90051001 hinterlegt ist.
Zelllinie nach einem der Ansprüche 1 bis 3, die eine Mauszelllinie ist.
Zelllinie nach einem der Ansprüche 1 bis 4, die ein dizentrisches Chromosom umfasst.
DNA-Molekül, umfassend die in 1 angegebene Nukleotidsequenz.
Nukleinsäuresonde, umfassend mindestens 10 aufeinanderfolgende Nukleotide der in 1 angegebenen Sequenz.
Sonde nach Anspruch 7, die radioaktiv markiert ist.
Sonde nach Anspruch 8, die Biotin-markiert ist.
Zelle, abgeleitet von einer Zelllinie nach Anspruch 1, die einen Überschuss an Centromeren umfasst.
Zelle nach Anspruch 10 mit allen den charakteristischen Eigenschaften der Zellen, die bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) unter der Zugangsnummer 90051001 hinterlegt sind.
Minichromosom, abgeleitet von der Zelllinie nach Anspruch 3, wobei das Minichromosom human-DNA umfasst.
Dizentrisches Chromosom, abgeleitet von der Zelllinie nach Anspruch 3.
Verfahren zur Herstellung der Säugerzellen nach einem der Ansprüche 1 bis 5, umfassend: (a) Cotransfizieren von Zellen mit einem DNA-Fragment, umfassend human-DNA, und einem für einen dominanten selektierbaren Marker kodierenden DNA-Fragment, wobei das human-DNA umfassende DNA-Fragment die in 1 angegebene Nukleotidsequenz umfasst; (b) Anzüchten der Zellen und Selektieren von Zellen, welche den dominanten selektierbaren Marker exprimieren; (c) Bestimmen der Zellen mit einem Überschuss an Säugercentromeren unter den Zellen, welche den dominanten selektierbaren Marker exprimieren.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei das cotransfizierte human-DNA-Fragment λCM8 umfasst, wobei λCM8 die in 1 angegebene Sequenz und Phage λ-DNA umfasst.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Zellen, welche den dominanten selektierbaren Marker exprimieren und einen Überschuss an Säugercentromeren aufweisen, Zellen sind, die alle die charakteristischen Eigenschaften der Zellen haben, die bei der European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC) unter der Zugangsnummer 90051001 hinterlegt sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16 zur Herstellung von Säugerzellen, die ein dizentrisches Chromosom mit einem überschüssigen Centromer enthalten, wobei Schritt (c) das Bestimmen der Zellen mit einem Überschuss an Centromeren, welche ein Chromosom mit zwei Centromeren umfassen, unter den Zellen, welche den dominanten selektierbaren Marker exprimieren, umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 16 zur Herstellung von Säugerzellen, enthaltend ein heterologe DNA enthaltendes Minichromosom, wobei: Schritt (c) das Bestimmen der Zellen mit einem Überschuss an Centromeren, welche ein Minichromosom umfassen, unter den Zellen, welche den dominanten selektierbaren Marker exprimieren, umfasst; und das Minichromosom das kleinste Chromosom in der Zelle ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, wobei der selektierbare Marker G418-Resistenz ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 18, wobei der selektierbare Marker für Aminoglykosid-3'-phosphotransferase-II kodiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 20, wobei das für den selektierbaren Marker kodierende DNA-Fragment weiter Nukleotidsequenzen umfasst, welche concatamerisieren können.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 21, wobei der dominante selektierbare Marker auf einem Phage Lambda-Vektor vorhanden ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 22, wobei die überschüssigen Centromere nachgewiesen werden durch Reagieren der Zellen in situ mit anti-Centromer-Antikörpern.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei die Antikörper aus Serum eines Patienten mit CREST-Syndrom stammen.
Zelle oder Zelllinie, erhältlich durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 14 bis 24.
Nicht-humane Säugerzelle, welche erhältlich ist durch Transfizieren der nicht-humanen Säugerzelle mit einem λCM8 umfassenden DNA-Molekül, wobei λCM8 die in 1 angegebene Sequenz und Phage λ-DNA umfasst.