DE69133452T2

DE69133452T2 - Bestimmungsverfahren und zusammensetzungen zum nachweis und zur auswertung der intrazellulären umwandlung eines extrazellulären signals

Info

Publication number: DE69133452T2
Application number: DE69133452T
Authority: DE
Inventors: Miller Michael HARPOLD; Paul Brust
Original assignee: Merck and Co Inc; Merck Sharp and Dohme LLC
Current assignee: Merck Sharp and Dohme LLC
Priority date: 1990-08-07
Filing date: 1991-08-07
Publication date: 2005-12-15
Anticipated expiration: 2011-08-08
Also published as: US5436128A; ES2240957T5; DE69133452T3; EP0542830B1; EP0542830B2; EP1586658A3; EP0542830A4; CA2087532C; CA2087532A1; US5401629A; DK0542830T3; EP1586658A2; DE69133452D1; JPH06502527A; EP0542830A1; DK0542830T4; WO1992002639A1; ATE292190T1; ES2240957T3

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf Verfahren zur Identifizierung und Bewertung der pharmakologischen Eigenschaften von Substanzen, die die Aktivitäten von Zelloberflächen-Proteinen, und zwar von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, modulieren. Diese Erfindung bezieht sich auch auf Assays, die die intrazelluläre Transduktion eines extrazellulären Signals unter Verwendung rekombinanter Zellen, die durch Einführung eines Reportergens unter der Kontrolle eines regulierbaren Promotors modifiziert sind und die Zelloberflächen-Proteine exprimieren, deren Aktivitäten durch das extrazelluläre Signal moduliert werden und deren Aktivitäten indirekt oder direkt die Expression des Promotors regulieren, bewerten. Insbesondere bezieht sich diese Erfindung auf Verfahren zur Detektion und Bewertung der Fähigkeit von Verbindungen, als Agonisten oder Antagonisten der Aktivität spezifischer Zelloberflächen-lokalisierter Rezeptoren, und zwar G-Protein-gekoppelter Rezeptoren, zu wirken. Eukaryontische Organismen sind zusammengesetzt aus einer Vielzahl von Zellen, Geweben und Organen, die schnell und aufeinander abgestimmt auf Umgebungsstimuli reagieren müssen, einschließlich externer und interner Stimuli und interzellulärer und intrazellulärer Stimuli. Damit sich eukaryontische Organismen so verhalten können, haben sich Mechanismen und biochemische Reaktionen zum Erreichen schneller und aufeinander abgestimmter Antworten entwickelt. Zelloberflächen-Proteine, die die Zellmembran durchspannen, erlauben das Durchführen dieser Antworten. Zelloberflächen-Proteine erlauben die intrazelluläre Transduktion extrazellulärer Signale. Zelloberflächen-Proteine ermöglichen es sowohl eukaryontischen wie prokaryontischen Zellen, extrazelluläre Signale zu detektieren und solche Signale intrazellulär auf eine Art und Weise zu transduzieren, die schließlich zu einer zellulären Antwort oder einer aufeinander abgestimmten Gewebe- oder Organ-Antwort führt. Zelloberflächenproteine induzieren eine passende Antwort auf einen bestimmten Stimulus, indem sie über spezifische intrazelluläre Reaktionen intrazellulär Informationen betreffend die extrazelluläre Umgebung übertragen. Die Antwort kann sofort eintreten und transient oder langsam und aufbauend oder eine Mischung aus beidem sein. Mit Hilfe einer Ansammlung verschiedener Membranoberflächen-Proteine sind eukaryontische Zellen außergewöhnlich sensitiv für ihre Umgebung.
Extrazelluläre Signalmoleküle, wie z. B. Wachstumshormone, Vasodilatoren und Neurotransmitter üben ihre Wirkungen, wenigstens zum Teil, durch Wechselwirkung mit Zelloberflächenproteinen aus. Z. B. bewirken einige extrazelluläre Signalmoleküle Veränderungen in der Transkription von Ziel-Genen durch Veränderungen in den Konzentrationen von sekundären Botenstoffen, wie z. B. cAMP. Andere Signale verändern indirekt die Genexpression durch Aktivierung der Expression von Genen, wie z. B. „immediate-early" Genen, die für regulatorische Proteine kodieren, die selbst wiederum die Expression anderer Gene, die für Transkriptions-Regulations-Proteine kodieren, aktivieren. Z. B. wird die neuronale Genexpression durch zahlreiche extrazelluläre Signale moduliert, einschließlich Neurotransmittern und elektrischer Membranaktivität. Transsynaptische Signale verursachen schnelle Antworten in Neuronen, die in einem Zeitintervall stattfinden, das von Millisekunden, wie z. B. die Öffnung ligandenabhängiger Kanäle, bis zu Sekunden und Minuten reicht, wie z. B. Ereignisse mit sekundären Botenstoffen. Gene in neuronalen Zellen, die responsiv sind gegenüber transsynaptischer Anregung und elektrischer Membranaktivität, umfassen Gene, bezeichnet als „immediate-early"-Gene, deren Transkription schnell, innerhalb von Minuten, und transient aktiviert wird (s. z. B. Sheng et al. (1990) Neuron 4: 477–485), und Gene, deren Expression im Lauf von Stunden induziert oder verändert wird. Zelloberflächenrezeptoren und Ionenkanäle gehören zu den Zelloberflächenproteinen, die auf extrazelluläre Signale antworten und die Ereignisse einleiten, die zu dieser veränderten Genexpression und -antwort führen. Ionenkanäle und Zelloberflächenlokalisierte Rezeptoren sind weit verbreitet und physiologisch wichtige Zelloberflächenmembranproteine. Sie spielen eine zentrale Rolle in der Regulation intrazellulärer Konzentrationen verschiedener Ionen und Chemikalien, von denen viele für die Lebensfähigkeit und das Funktionieren der Zelle wichtig sind.
Ionenkanäle
Ionenkanäle, die in einer großen Vielzahl von Organismen, einschließlich Pilzen, Pflanzen und Tieren vorkommen, sind Membran-durchspannende Proteine, die den kontrollierten Eintritt verschiedener Ionen aus der extrazellulären Flüssigkeit in die Zellen erlauben. Sie funktionieren als öffenbare Poren in der Zellmembran und erlauben den Fluß von Ionen entlang elektrischer oder chemischer Gradienten. Ionenkanäle werden eingeteilt auf der Grundlage des Ions, das die Zelle durch den Kanal betritt.
Spannungsabhängige Ionenkanäle
Die Modulation des transmembranen Ionentransportes ist oft das primäre Ereignis bei der Kopplung extrazellulärer Signale mit intrazellulären Abläufen: Ionenströme spielen essentielle Rollen in der Erregungs-Sekretion, Erregungs-Mitose und Erregungs-Kontraktion (s. Curran et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8521–8524). Z. B. vermittelt das spannungsabhängige Öffnen durch Calzium-Ionen die Kopplung Membran-depolarisierender Stimuli mit der Transkriptions-Aktivierung des c-fos-Gens. Die Erhöhung des intrazellulären Calziums aktiviert ein Calmodulin/Calmodulin-Kinase-System, das die c-fos-Expression induziert.
Natrium-Kanäle
Natriumkanäle sind verantwortlich für die ansteigende Phase des Aktionspotentials in erregbaren Zellen. Natriumkanäle messen das transmembrane elektrische Feld und antworten durch Öffnung eines transmembranen Ionenkanals, der für Na⁺ spezifisch ist. Natriumkanäle wurden untersucht und sind gut charakterisiert. Gene, die für den Natriumkanal, der ein Glykoprotein ist, kodieren, wurden aus einer Vielzahl von Quellen kloniert und wurden verwendet, um nach Injektion in Xenopus-Oozyten spannungsabhängige Natriumströme zu exprimieren (s. Noda et al. (1986) Nature 322: 826–828).
Calzium-Kanäle
Calziumkanäle sind Membran-durchspannende, aus mehreren Untereinheiten bestehende Proteine, die den kontrollierten Einstrom von Ca²⁺-Ionen aus der extrazellulären Flüssigkeit in Zellen erlauben. Alle Zellen im ganzen Tierreich und zumindest einige Bakterien-, Pilz- und Pflanzenzellen, besitzen ein oder mehrere Typen von Calzium-Kanälen.
Der häufigste Typ des Calzium-Kanals ist spannungsabhängig. Bei einem spannungsabhängigen Kanal benötigt das „Öffnen", um einen Einstrom von Ca²⁺-Ionen in die Zellen auszulösen, eine Depolarisierung auf ein bestimmtes Niveau der Potentialdifferenz zwischen der Innenseite der Zelle, die den Kanal trägt, und der extrazellulären Umgebung. Die Rate des Einstroms von Ca²⁺ in die Zelle hängt von dieser Potentialdifferenz ab. Alle „erregbaren" Zellen in Tieren, wie z. B. Neurone des Zentralnervensystems, periphere Nervenzellen und Muskelzellen, einschließlich derer der Skelettmuskeln, Herzmuskeln und venöser und arterieller glatter Muskeln, weisen spannungs-abhängige Calzium-Kanäle auf.
Spannungs-abhängige Calzium-Kanäle bestehen vermutlich aus zwei großen Untereinheiten von zwischen 130 und ungefähr 200 Kilodalton („kD") Molekulargewicht, und einer Anzahl (gewöhnlich vermutet man eine bis drei) verschiedener kleiner Untereinheiten von weniger als 60 kD Molekulargewicht. Mindestens eine der größeren Untereinheiten und möglicherweise einige der kleineren sind glykosyliert. Einige der Untereinheiten können phosphoryliert werden.
Spannungs-abhängige Ca²⁺-Kanäle regulieren zelluläre Funktionen in erregbaren Zellen in vielen Geweben, einschließlich Gehirn- und Muskelzellen. In erregbaren Zellen vermitteln diese Calzium-Kanäle die Calzium-abhängige Depolarisation und übersetzen Änderungen im Membranpotential in ein intrazelluläres Calziumsignal, das spezifische zelluläre Funktionen initiiert.
Calzium-Antagonisten blockieren den Ionenstrom durch Calzium-Kanäle und binden an bestimmte Bereiche, die als der Calzium-Antagonist-Rezeptor bezeichnet werden. Ca²⁺-Antagonist-Medikamente binden spezifisch an Ca²⁺-Kanäle und werden verwendet, um kardiovaskuläre Krankheiten zu behandeln. Von einer Vielzahl organischer Verbindungen, wie z. B. 1,4-Dihydropyridin(DHP)-Derivaten, ist bekannt, daß sie den Ionenstrom durch langsame L-Typ-Calzium-Kanäle modulieren. Der DHP-sensitive L-Typ Calzium-Kanal ist ein hauptsächlicher Eintrittsweg für extrazelluläres Ca²⁺.
Ligandenabhängige Ionenkanäle
Ligandenabhängige Ionenkanäle umfassen nikotinische Acetylcholin-Rezeptoren, gamma-Aminobuttersäure(GABA)-Rezeptoren und exzitatorische Aminosäure-Rezeptoren.
Wegen der gesundheitlichen Folgen von aus Tabak stammendem Nikotin, das ein Neurotransmitteranalog ist, wurde der nikotinische Acetylcholin-Rezeptor, der im Zentralnervensystem exprimiert wird, umfassend untersucht. Der nikotinische Acteylcholin-Rezeptor ist ein liganden-abhängiger Ionenkanal, der den Neurotransmitter Acetylcholin (ACh) bindet und die synaptische Übertragung zwischen Nerv und Muskel bewirkt (s. z. B. Claudio et al. (1987) Science 238: 1688–1694).
Der Rezeptor enthält vier Polypeptidketten α, β, τ und δ, mit einer Stöchiometrie von α₂βτδ. Durch Klonierstudien wurden mehrere Gene identifiziert, die für die verschiedenen Untereinheiten kodieren. Die Gene haben distinkte Expressionsmuster in verschiedenen Geweben und bilden so eine Ansammlung von Rezeptor-Untertypen, die pharmakologisch und funktionell divers sind.
Die Zellinie PC12, die eine Ratten-Phäochromocytom-Zellinie ist, exprimiert sowohl nikotinische als auch muskarinische Acetylcholin-Rezeptoren. Das C-fos-Protoonkogen und Aktin werden innerhalb von Minuten, nachdem nikotinische Agonisten an ihre Rezeptoren auf PC12-Zellen binden, induziert. Das c-fos-Gen wird auch durch Behandlung von PC12-Zellen mit Nervenwachstumsfaktor („Nerve Growth Factor", NGF) induziert. Die Induktion durch Nikotin und NGF, weist jedoch unterschiedliche Abhängigkeiten vom Fluß des extrazellulären Ca²⁺ in die Zelle auf. Die Induktion durch Nikotin hängt vom Fluß durch Ca²⁺-Kanäle ab, wohingegen die Induktion durch NGF vom extrazellulären Ca²⁺ unabhängig ist.
Zelloberflächen-Rezeptoren
Zelloberflächen-lokalisierte Rezeptoren sind Membran-durchspannende Proteine, die extrazelluläre Signalmoleküle binden oder Änderungen in der extrazellulären Umgebung detektieren und das Signal über Signaltransduktionswege übermitteln, um eine zelluläre Antwort zu bewirken. Zelloberflächen-Rezeptoren binden zirkulierende Signal-Polypeptide, wie z. B. Wachstumsfaktoren und Hormone, als erstem Schritt in der Induktion zahlreicher intrazellulärer Reaktionen. Rezeptoren werden auf der Basis des jeweiligen Reaktions-Typs, der induziert wird, eingeteilt. Eingeschlossen in diese Klassen von Rezeptoren sind diejenigen, die Wachstumsfaktoren binden und denen eine Tyrosinkinase-Aktivität innewohnt, wie z. B. die Heparin-Binde-Wachstumsfaktor (HBGF)-Rezeptoren und diejenigen, die an Effektorproteine über Guanin-Nukleotid-bindende regulatorische Proteine, die als G-Protein-gekoppelte Rezeptoren und G-Proteine bezeichnet werden, koppeln.
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren
Der G-Protein-transmembrane-Signalweg besteht aus drei Proteinen: Rezeptoren, G-Proteinen und Effektoren. G-Proteine, die die Zwischenstationen in transmembranen Signalwegen sind, sind Heteromere und bestehen aus α, β und gamma Untereinheiten. Unter den Mitgliedern einer Familie von G-Proteinen unterscheiden sich die α-Untereinheiten. Die Funktionen der G-Proteine werden durch die zyklische Assoziation von GTP mit der α-Untereinheit, gefolgt von der Hydrolyse von GTP zu GDP und der Dissoziation von GDP, reguliert.
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren bilden eine diverse Klasse von Rezeptoren, die durch Bindung an G-Proteine Signaltransduktion bewirken. Die Signaltransduktion wird eingeleitet durch das Binden eines Liganden an den Zellmembran-Rezeptor, was das Binden des Rezeptors an das G-Protein stimuliert. Die Rezeptor-G-Protein-Wechselwirkung setzt GDP frei, das spezifisch an das G-Protein gebunden ist, und erlaubt die Bindung von GTP, das das G-Protein aktiviert. Das aktivierte G-Protein dissoziiert von dem Rezeptor und aktiviert das Effektor-Protein, das die intrazellulären Konzentrationen spezifischer sekundärer Botenstoffe reguliert. Beispiele für solche Effektor-Proteine sind Adenylatcyclase, Guanylatcyclase, Phospholipase C und andere. Man weiß, daß G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, die Glykoproteine sind, bestimmte gemeinsame strukturelle Ähnlichkeiten und Homologien miteinander aufweisen (s. z. B. Gilman, A. G., Ann. Rev. Biochem. 56: 615–649 (1987), Strader, C. D. et al. The FASEB Journal 3: 1825–1832 (1989), Kobilka, B. K. et al. Nature 329: 75–79 (1985) und Young et al. Cell 45: 711–719 (1986)). Unter den G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, die identifiziert und kloniert wurden, sind der Substanz K-Rezeptor, der Angiotensin-Rezeptor, die α- und β-adrenergen Rezeptoren und die Serotonin-Rezeptoren. G-Protein-gekoppelten Rezeptoren ist ein konserviertes Strukturmotif gemeinsam. Die allgemeinen und gewöhnlichen strukturellen Merkmale der G-Protein-gekoppelten Rezeptoren sind die Existenz von sieben hydrophoben Abschnitten aus etwa 20–25 Aminosäuren, von denen jeder von acht hydrophilen Regionen variabler Länge umgeben ist. Es wurde postuliert, daß jeder der sieben hydrophoben Abschnitte eine Transmembran-α-Helix bildet und daß die dazwischenliegenden hydrophilen Regionen alternierend intrazellulär und extrazellulär exponierte Schleifen bilden. Die dritte cytosolische Schleife zwischen den Transmembrandomänen fünf und sechs ist die intrazelluläre Domäne, die für die Interaktion mit G-Proteinen verantwortlich ist. Es ist bekannt, daß G-Protein-gekoppelte Rezeptoren induzierbar sind. Diese Induzierbarkeit wurde ursprünglich in niederen Eukaryonten beschrieben. Der cAMP-Rezeptor des zellulären Schleimpilzes Dictyostelium wird während der Differenzierung induziert (Klein et al., Science 241: 1467–1472 (1988). Während der Differenzierungsreaktion von Dictyostelium discoideum induziert cAMP einen hohen Grad der Expression seines G-Protein-gekoppelten Rezeptors. Dieser Rezeptor überträgt das Signal zur Induktion der Expression der anderen an der Chemotaxis beteiligten Gene, was es multizellulären Aggregaten erlaubt, sich anzuordnen, zu organisieren und Stiele zu bilden (s. Firtel, R. A. et al., Cell 58: 235–239 (1989) und Devreotes, P., Science 245: 1054–1058 (1989)).
Wachstumsfaktoren und Wachstumsfaktor-Rezeptoren
Polypeptid-Wachstumsfaktoren sind Modulatoren der Zell-Proliferation und -Differenzierung, deren biologische Funktionen durch die Wechselwirkung des Wachstumsfaktors mit Zelloberflächen-Rezeptoren und darauf folgende Veränderungen der Genexpression bewirkt werden. Wachstumsfaktoren binden an spezifische Rezeptoren und scheinen Tyrosin-Phosphorylierung und C-fos-mRNA-Synthese zu induzieren. Zusätzlich werden wenigstens manche Wachstumsfaktoren, wie z. B. der Blutplättchen-abgeleitete („Platelet-derived")-Wachstumsfaktor (Yeh et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 2317) und der Heparin-Binde-Wachstumsfaktor-2 oder der basale Fibroblasten-Wachstumsfaktor (s. Bouche et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84: 6770) zum Zellkern transportiert.
Die Aktivierung von Wachstumsfaktor-Rezeptoren durch die Wechselwirkung mit spezifischen Wachstumsfaktoren oder mit Stoffen wie z. B. Phorbol-Myristat-Acetat (PMA) aktiviert Proteinkinase C, die eine Familie von Phospholipid- und Calziumaktivierten Proteinkinasen umfasst. Diese Aktivierung führt zur Transkription einer Ansammlung von Proto-Onkogen-Transkriptionsfaktor-kodierenden Genen, umfassend c-fos, c-myc und c-jun, Proteasen, Protease-Inhibitoren, einschließlich Kollagenase Typ I und Plasminogen-Aktivator-Inhibitor und Adhäsionsmolekülen, einschließlich des interzellulären Adhäsionsmoleküls I. Die Aktivierung der Proteinkinase C wirkt der Wachstumsfaktor-Aktivität durch die schnelle Phosphorylierung von Wachstumsfaktor-Rezeptoren, wodurch die Tyrosin-Kinase-Aktivität vermindert wird, entgegen. Die Wechselwirkung von Nervenwachstumsfaktor (NGF) mit seinem Rezeptor ist typisch für die Abfolge von Anworten, die durch ein solches extrazelluläres Signal induziert wird. NGF ist ein Polypeptid-Wachstumshormon, das notwendig ist zur Differenzierung und Wachstum des sensorischen, von der Neuralleiste abgeleiteten Neurons. NGF bindet an seinen spezifischen Zelloberflächen-Rezeptor und wird retrograd zum Zellkörper transportiert (s. Changelian et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 377–381). Dies initiiert eine Kaskade intrazellulärer Ereignisse, die in einem differenzierten Phänotyp kulminieren. PC12-Zellen, die eine Ratten-Phäochromocytom-Zellinie darstellen, werden als Modell zum Studium der NGF-vermittelten Differenzierung verwendet. Wenn sie mit NGF behandelt werden, verändern sich PC 12-Zellen von sich-teilenden adrenal-chromaffin-ähnlichen Zellen zu sich nicht-teilenden, elektrisch erregbaren sympathetisch-neuronal-ähnlichen Zellen.
Zugleich mit den phänotypischen Veränderungen findet eine Induktion und Expression spezifischer Gene statt. Die Bindung von NGF an PC12-Zellen induziert die sofortige und schnelle Expression bestimmter Gene, einschließlich der c-fos-, NGF1-A- und NGF1-B-Gene, die als frühe Gene bezeichnet werden. Man glaubt, daß solche frühen Gene für Transkriptions-Regulatoren kodieren. Das NGF1-A-Genprodukt enthält tandemartig wiederholte „Zinkfinger"-Domänen, die für DNA-Bindeproteine charakteristisch sind, und das NGF1-B-Protein ist homolog zu Mitgliedern der Glucocorticoid-Rezeptor-Familie und kann somit als liganden-abhängiger Transkriptions-Modulator funktionieren. Das c-fos-Genprodukt FOS scheint als Transkriptions-Regulator-Molekül zu funktionieren.
Das c-fos-Gen und verwandte Gene
Wie oben diskutiert, ist die Induktion der Expresion des c-fos-Gens ein Ereignis, das einer Anzahl von Antwort-Reaktionen, die durch die Aktivität einer Vielzahl von Zelloberflächen-Proteinen initiiert werden, gemeinsam ist.
Das c-fos-Genprodukt FOS assoziiert mit dem Transkriptions-Aktivator JUN, dem Produkt des c-jun-Gens, um einen Komplex zu bilden, der den Transkriptions-Aktivierungs-Komplex AP-1 bildet. Die Transkription sowohl von c-fos als auch von c-jun wird nach der Stimulierung schnell und transient induziert. Die induzieten mRNAs akkumulieren 1–2 Stunden lang im Cytoplasma, wo die FOS- und JUN-Proteine, die kurzlebig sind, translatiert und dann zum Zellkern translociert werden, um einen heterodimeren Proteinkomplex zu bilden, der an das regulatorische DNA-Element AP-1-Binderegion bindet.
Die c-fos- und c-jun-Gene sind Mitglieder von Genfamilien, die für Proteine kodieren, die an der Bildung von heterodimeren Komplexen teilnehmen, die mit AP-1-Binderegionen wechselwirken. Der Transkriptionsfaktor AP-1 ist aus mehreren Proteinkomplexen zusammengesetzt, deren Konzentrationen sich nach Stimulation der Zelle verändern. Diese Komplexe wechselwirken spezifisch mit einem aus sieben Basen bestehenden Kern-Nukleotidsequenz-Motiv, von dem bekannt ist, daß es ein relativ verbreiteter Anteil sowohl von positiven als auch von negativen Transkriptions-Regulations-Elementen ist und daß es sowohl für die basalen als auch für die induzierten Anteile der Genexpression benötigt wird.
Die Genprodukte FOS und JUN kooperieren bei der Regulation von Zielgenen, die vielen zellulären und adaptiven Antworten auf die Umgebung zugrundeliegen. Sie sind beteiligt an einer Anzahl neurophysiologischer Prozesse. Z. B. werden in PC12-Zellen FOS und JUN durch pharmakologische, elektrische, operative und physiologische Stimuli, neurotrope Faktoren, Neurotransmitter, depolarisierende Bedingungen und andere Stoffe, die einen Einstrom von Ca²⁺-Ionen durch spannungs-abhängige Ca²⁺-Kanäle bewirken, induziert. Diese Stimuli oder Signale bewirken eine c-fos-Induktion über die Wechselwirkung mit regulatorischen Elementen, die in den 5'-flankierenden Bereichen des Gens lokalisiert sind. Einige extrazelluläre Stimuli führen auch zu Veränderungen im Ausmaß und in der Art von post-translationalen Modifikationen des FOS-Proteins, die Serin- und Threonin-Phosphorylierung umfassen.
Folglich umfasst die c-fos-Induktion bestimmte Wege sekundärer Botenstoffe, die über getrennte regulatorische Elemente wirken und die das resultierende Genprodukt FOS differentiell modifizieren, das wiederum auf verschiedene Weisen mit differentiell modifiziertem JUN-Protein wechselwirkt. Deshalb induziert eine Vielzahl extrazellulärer Ereignisse die Expression einer kleinen Anzahl induzierbarer Proteine, die eine Ansammlung von Proteinkomplexen bilden, die differentiell an regulatorische DNA-Elemente binden können, die AP-1-Binderegionen umfassen.
Deshalb können zahlreiche Zelloberflächen-Proteine durch überlappende Transduktionswege wirken und extrazelluläre Signale übertragen, die schließlich eine Vielzahl von Antworten induzieren.
Zelloberflächenproteine und pharmakologische Folgen
Zelloberflächen-Proteine spielen somit eine physiologische Hauptrolle. Es gibt viele potentielle pharmakologische Anwendungen für Substanzen, die mit Zelloberflächen- Proteinen wechselwirken und ihre Aktivität modulieren. Calzium-Kanäle, z. B., spielen eine zentrale Rolle in der Regulation intrazellulärer Ca²⁺-Konzentrationen, was die Lebensfähigkeit und Funktion der Zelle beeinflusst. Intrazelluläre Ca²⁺-Konzentrationen sind beteiligt an einer Reihe lebenswichtiger Prozesse in Tieren, wie z. B. Neurotransmitter-Freisetzung, Muskel-Kontraktion, Schrittmacher-Aktivität und Sekretion von Hormonen und anderen Substanzen. Andere Zelloberflächen-Moleküle spielen auch lebenswichtige physiologische Rollen. Der liganden-abhängige nikotinische Acetylcholin-Rezeptor, z. B., kann die schädigenden Effekte des aus Tabak stammenden Nikotins bewirken. Man glaubt, daß Wachstumsfaktoren und andere Mitogene, die die Zellproliferation und das Zellwachstum induzieren, eine Rolle beim Wachstum von Tumoren spielen, die oft identifizierbare Zelloberflächen-Rezeptoren tragen, die für Wachstumsfaktoren und andere extrazelluläre Signale spezifisch sind. Man glaubt, daß eine Anzahl von Substanzen, die zur Behandlung verschiedener Krankheiten in Tieren, einschließlich des Menschen, nützlich sind, ihre fördernden Effekte durch ihre Wechselwirkung mit Zelloberflächen-Proteinen ausüben. Vasodilatoren und andere kardiovaskulären Medikamente modulieren die Aktivitäten spannungs-abhängiger Calzium-Kanäle. Viele dieser Substanzen binden an Calzium-Kanäle und blockieren oder vermindern die Rate des Einstroms von Ca²⁺ in Zellen als Reaktion auf die Depolarisierung der Zellmembran. Wachstumsfaktoren wurden eingesetzt, um Toxine auf Tumorzellen zu richten, die Wachstumsfaktor-Rezeptoren exprimieren.
Ein Verständnis der Pharmakologie von Substanzen, die mit Ionenkanälen und/oder Zelloberflächen-lokalisierten Rezeptoren wechselwirken und die Fähigkeit, Substanzen rational zu identifizieren, die spezifisch mit Ionenkanälen und/oder Zelloberflächenlokalisierten Rezeptoren wechselwirken, um erwünschte therapeutische Effekte zu erzielen, wurden behindert durch das Feheln von schnellen, effektiven Möglichkeiten, solche Substanzen zu identifizieren, die mit spezifischen Ionenkanälen und/oder Zelloberflächen-lokalisierten Rezeptoren wechselwirken.
Die Verfügbarkeit von schnellen, effektiven Möglichkeiten, Substanzen zu identifizieren, die Ionenkanäle und/oder Zelloberflächen-lokalisierte Rezeptoren modulieren oder mit ihnen wechselwirken, würde das schnelle Durchmustern einer großen Anzahl von Substanzen ermöglichen, um solche Kandidaten, die für spätere tiefergehende Studien therapeutischer Anwendungen geeignet sind, zu identifizieren.
Stumpo et al (J. Biol Chem., 236, S. 1611–14, 1988) und Chen et al. (Nature, 328, S. 1820–23, 1987) beschreiben die Verwendung von Reportergen-Konstrukten zur Untersuchung von Mechanismen der Tyrosinkinase-Rezeptoraktivität. WO89/09834 beschreibt die Verwendung solcher Konstrukte im Zusammenhang mit spannungsabhängigen Ionenkanälen, speziell Calciumkanälen.
Deshalb ist es ein Ziel dieser Erfindung, einen Assay für die Durchmusterung und Identifizierung potentiell pharmazeutisch wirksamer Verbindungen bereitzustellen, die spezifisch mit Zelloberflächen-Proteinen, insbesondere G-Protein-gekoppelten Rezeptoren wechselwirken und ihre Aktivität modulieren.
Es ist auch ein Ziel dieser Erfindung, rekombinante Zellen bereitzustellen, die spezifische Zelloberflächen-Rezeptoren, G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, exprimieren und die zur Verwendung in Assays modifiziert wurden, mit denen Substanzen, die spezifisch mit Zelloberflächen-Proteinen wechselwirken und ihre Aktivität modulieren, detektiert werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Rekombinante Zellen, die verwendbar sind zum Testen von Substanzen auf ihre agonistische oder antagonistische Aktivität im Hinblick auf G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, werden beschrieben, sind jedoch nicht Teil der Erfindung. Die rekombinanten Zellen wurden gentechnisch verändert, um spezifische Zelloberflächen-lokalisierte Rezeptoren zu exprimieren und enthalten auch DNA-Konstrukte, die ein Reportergen, eine Promotor-Region und andere Transkriptionsregulations-Nukleotidsequenzen umfassen, die die Höhe der Transkription vom Promotor aus modulieren.
Die Transkriptions-Regulationssequenzen und/oder die Promotor-Region, die ausgewählt werden, werden direkt oder indirekt durch intrazelluläre Signale reguliert, die aus der Wechselwirkung des Zelloberflächen-Proteins mit einem extrazellulären Signal resultieren. Assay-Methoden, die auf Transkription basieren und die rekombinante Zellen verwenden, um extrazelluläre Signale zu detektieren, die als Agonisten oder Antagonisten auf die Aktivität von Zelloberflächen-Proteinen einwirken, werden bereitgestellt.
Außerdem werden Methoden zur Identifizierung extrazellulärer Signale, die die Zelloberflächen-Protein-vermittelte Transkription modulieren, beschrieben, sind aber nicht Teil der Erfindung. Diese Methoden vergleichen die Differenz im Grad der Transkription eines Reportergens in rekombinanten Zellen in Gegenwart des Signals mit dem Grad an Transkription in Abwesenheit des Signals oder mit dem Grad an Transkription in einer Kontrollzelle, die das Zelloberflächenprotein nicht exprimiert. Die rekombinanten Zellen, die in diesen Verfahren verwendet werden, exprimieren das Zelloberflächen-Protein und enthalten ein Reportergen-Konstrukt, in dem die Transkription des Reportergens unter der Kontrolle von Promotor Transkriptionskontrollsequenzen ist, deren Aktivität durch das Zelloberflächen-Protein reguliert wird. Die rekombinanten Zellen können das Zelloberflächen-Protein endogen exprimieren oder können heterologe DNA exprimieren, die für das Zelloberflächen-Protein kodiert.
Die Zelloberflächen-Proteine sind G-Protein-gekoppelte Rezeptoren. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Untersuchung von Testsubstanzen, um die agonistische oder antagonistische Aktivität jeder der Substanzen in Bezug auf einen G-Protein-gekoppelten Zelloberflächenrezeptor zu bestimmen, umfassend die folgenden Schritte:

a) in Kontakt bringen einer eukaryontischen Zelle, die einen heterologen G-Protein-gekoppelten Rezeptor, der von einem heterologen Gen exprimiert wird, und ein heterologes Reportergen-Konstrukt umfasst, mit der Substanz, wobei das Reportergen-Konstrukt ein Reportergen unter der Kontrolle mindestens eines Transkriptionskontrollelementes umfasst, das responsiv ist gegenüber einem intrazellulären Zustand, der eintritt, wenn der Reporter mit der Substanz wechselwirkt; und
b) Messsen des Grads an Transkription oder Translation des Reportergens.

In weiter bevorzugten Ausführungsformen sind die Zelloberflächen-Proteine beliebige muskarinische Rezeptoren, adrenerge Rezeptoren, Dopamin-Rezeptoren und Serotonin-Rezeptoren. Die Promotorregion und die Transkriptions-Regulationssequenzen sind ausgewählt aus dem c-fos-Gen-Promotor und den c-fos-Gen-abgeleiteten Transkriptions-Regulations-Nukleotidsequenzen, dem Promotor des Gens für das Vasoaktive Darmpeptid (Vasoactive Intestinal Peptide, VIP), dem Somatostatin-Gen-Promotor, dem Proenkephalin-Gen-Promotor, dem Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Gen-Promotor und dem Nervenwachstumsfaktor-1A-Gen-Promotor. Die Reportergene sind ausgewählt aus den Genen kodierend für bakterielle Chloramphenicol-Acetyltransferase, Glühwürmchen-Luciferase, bakterielle Luciferase, β-Galactosidase und Alkalische Phosphatase und anderen Transkriptionsregulationselementen, einschließlich zyklisches Adenosinmonophosphat-responsiven Elementen und responsiven Elementen gegenüber intrazellulären Calziumkonzentrationen.
In den meisten bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung sind die Rezeptoren muskarinische Rezeptoren und der Promotor und andere regulatorische Elemente sind abgeleitet vom c-fos-Gen, einschließlich der c-fos-Promotorregion und dem intragenen c-fos-Gen-Regulations-Element (FIRE).
Schnelle, sichere und empfindliche Verfahren, um zu bestimmen, ob Zellen zell-spezifische funktionale Oberflächen-lokalisierte Rezeptoren, einschließlich spezifische Rezeptoren-Subtypen, produzieren, werden auch bereitgestellt.
Die auf Transkription basierenden Assays liefern schnelle, sichere und empfindliche Mittel, um Substanzen zu identifizieren, die wechselwirken mit, und dabei die Funktion von spezifischen Zelloberflächen-lokalisierten Rezeptoren beeinflussen. Insbesondere liefern die Assays Mittel, um potentielle pharmazeutische Substanzen zu screenen oder zu detektieren. In Abhängigkeit von der Affinität der Substanz zu dem Zelloberflächen-Protein oder der Natur der Wechselwirkung, sollten die Assays in der Lage sein, Substanzen in Konzentrationen im nanomolaren Bereich und möglicherweise dem Bereich darunter, zu detektieren. Bei der Entwicklung des Rekombinanten-Zellen-Assays wurde erkannt, daß ein gemeinsames Merkmal unter konzertierten Gewebe-Antworten, wie z. B. Muskelkontraktion, Vasodilatation, Zell-Wachstum und -Proliferation, die durch Membranoberflächen-Proteine bewirkt werden, ist, daß die Transkription spezifischer Gene schnell initiiert wird, innerhalb von Minuten nach dem Kontakt des Zelloberflächen-Membranproteins mit einem extrazellulären Signal, das eine solche Aktivität induziert. Somit spiegelt die Aktivität solcher Promotoren und die Transkription von Genen, die durch die Promotoren kontrolliert werden, die Aktivität des Oberflächen-Proteins entsprechend der Transduktion eines intrazellulären Signals wider.
Das intrazelluläre Signal, das transduziert wird, wird im allgemeinen durch die spezifische Wechselwirkung eines extrazellulären Signals, insbesondere eines Liganden, mit einem G-Protein-gekoppelten Rezeptor, der auf der Zelloberfläche gegenwärtig ist, initiiert. Diese Wechselwirkung führt zur Ingangsetzung einer Kaskade intrazellulärer Ereignisse, deren letztliche Folge eine schnelle und detektierbare Veränderung in der Transkription und Translation eines Gens ist. Durch die Auswahl von Promotoren, die responsiv sind gegenüber den transduzierten intrazellulären Signalen und der operativen Verbindung der ausgewählten Promotoren mit Reportergenen, deren Transkription, Translation oder schließliche Aktivität sofort detektierbar und messbar ist, liefert der auf Transkription basierende Assay ein schnelles Signal dafür, ob ein spezifischer Rezeptor oder Innenkanal mit einer Testsubstanz auf eine beliebige Weise, die die intrazelluläre Transduktion beeinflußt, wechselwirkt. Die Expression des Reportergens liefert so ein wertvolles Durchmusterungs-Werkzeug zur Entwicklung von Substanzen, die als Agonisten oder Antagonisten auf diese Zell-Rezeptoren wirken.
Die Assays dieser Erfindung messen den Endzustand der oben beschrieben Kaskade von Ereignissen, die Expression eines Reportergens. Dies wird erreicht durch die Verwendung eines Reportergen-Expressionskonstrukts, das ein Reportergen und ein Transkriptionskontrollelement enthält, das responsiv ist gegenüber dem intrazellulären Zustand, der eintritt, wenn der Zellrezeptor mit einer Substanz, die agonistische oder antagonistische Eigenschaften in Bezug auf den Rezeptor aufweist, wechselwirkt. Das Reportergen wird in operationaler Assoziation mit dem Transkriptions-Kontrollelement plaziert. Das Erscheinen von Reportergen-Produkt dient als ein sofort erkennbares Signal für Transkription.
Definitionen
Wenn nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke dieselbe Bedeutung, wie sie im allgemeinen von einem Fachmann dieses Fachgebiets, zu dem diese Erfindung gehört, verstanden wird.
So wie hier verwendet, umfassen rekombinante Zellen all die Zellen, die durch die Einführung heterologer DNA modifiziert wurden. Kontrollzellen umfassen Zellen, die grundsätzlich den rekombinanten Zellen identisch sind, aber das eine oder die zusätzlichen Proteine, für das oder die die heterologe DNA kodiert, nicht exprimieren. Die rekombinanten Zellen werden z. B. aus Zellen durch die Einführung von DNA, die ein Reportergen-Konstrukt kodiert und ggf. heterologe DNA, die den Zelloberflächen-Rezeptor kodiert, hergestellt. Kontrollzellen sind, im Hinblick auf solche rekombinanten Zellen, Zellen, die entweder das Reportergenkonstrukt nicht umfassen oder nicht exprimieren, oder die den Rezeptor nicht umfassen oder exprimieren.
So wie hier verwendet, umfasst heterologe DNA solche DNA, die natürlicherweise nicht als Teil des Genoms, in dem sie vorliegt, vorkommt oder die in einem Bereich oder Bereichen des Genoms gefunden wird, der von dem, in dem sie in der Natur vorkommt, abweicht. Heterologe DNA ist nicht endogen in der Zelle, in die sie eingeführt wird, sondern wurde aus einer anderen Zelle erhalten. Im allgemeinen, obwohl nicht notwendigerweise, kodiert solche DNA für RNA und Proteine, die normalerweise nicht durch die Zelle produziert werden, in der sie exprimiert wird. Auf heterologe DNA kann sich der Ausdruck Fremd-DNA auch beziehen. Jedwede DNA, die ein Fachmann auf dem Gebiet als heterolog oder fremd gegenüber der Zelle, in der sie exprimiert wird, erkennen oder betrachten würde, soll hier mit dem Ausdruck heterologe DNA umschrieben werden. Beispiele heterologer DNA umfassen, sind aber nicht darauf beschränkt, DNA, die für Rezeptoren, Reportergene, Transkriptions- und Translations-Regulationssequenzen, selektierbare oder detektierbare Markerproteine, wie z. B. ein Protein, das Resistenz gegen Substanzen vermittelt, kodiert.
So wie hier verwendet, umfassen Zelloberflächen-Proteine Moleküle, die auf der Oberfläche von Zellen vorkommen, die mit der extrazellulären Umgebung wechselwirken und die die Information betreffend die Umgebung intrazelulär transmittieren oder transduzieren, auf eine Art und Weise, die schließlich die Transkription von spezifischen Promotoren moduliert, was zur Transkription spezifischer Gene führt.
So wie hier verwendet, umfassen extrazelluläre Signale ein Molekül oder eine Veränderung in der Umgebung, das oder die intrazellulär durch Zelloberflächen-Proteine transduziert werden, die direkt oder indirekt mit dem Signal wechselwirken. Ein extrazelluläres Signal oder Effektormolekül ist jedwede Substanz oder jedweder Stoff, die oder der auf eine beliebige Weise die Aktivität eines Zelloberflächen-Proteins spezifisch ändert. Beispiele solcher Signale umfassen, aber sind nicht beschränkt auf, Moleküle wie z. B. Acetylcholin, Wachstumsfaktoren, Hormone und andere mitogene Substanzen, wie z. B. Phorbol-Myristat Acetat (PMA), die an Zelloberflächen-Rezeptoren binden und die Aktivität solcher Rezeptoren modulieren. Z. B. sind Antagonisten, die die Aktivität von Zelloberflächen-Proteinen blockieren oder vermindern extrazelluläre Signale und Agonisten, die potenzieren, induzieren oder auf andere Weise die Aktivität von Zelloberflächen-Proteinen steigern, sind Beispiele für extrazelluläre Signale.
So wie hier verwendet, umfassen extrazelluläre Signale auch bislang nicht identifizierte Substanzen, die die Aktivität des Zelloberflächen-Proteins modulieren und dadurch intrazelluläre Funktionen beeinflussen und die potentielle pharmakologische Substanzen sind, die verwendet werden können, um bestimmte Krankheiten durch Modulation der Aktivität G-Protein-gekoppelter Rezeptoren zu behandeln.
So wie hier verwendet, sind Rezeptoren, die durch Acetylcholin stimuliert werden, nikotinische und muskarinische Rezeptoren, die voneinander unterschieden werden können durch Verfahren, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Z. B. können nikotinische und muskarinische Rezeptoren aufgrund ihres Antwortverhaltens gegenüber den Alkaloiden Nikotin und Muskarin unterschieden werden.
So wie hier verwendet, beziehen sich muskarinische Rezeptoren kollektiv auf jedweden der pharmakologisch oder strukturell unterscheidbaren Formen der muskarinischen Rezeptoren. Jedwede besondere Form wird beschrieben durch jedwede Nomenklatur, die von den Fachleuten auf dem Gebiet erkannt wird. Pharmakologisch definierte Subtypen, z. B., werden mit einem Großbuchstaben M bezeichnet, z. B. M₁, M₂ und M₃, und die unterscheidbaren molekularen Formen wurden durch einen Kleinbuchstaben m bezeichnet, wie z. B. m₁, m₂ ... m₅ (s. z. B. Flier et al. (1989) New Engl. J. Med. 321: 1022–1029).
So wie hier verwendet, ist ein Reportergenkonstrukt ein DNA-Molekül, das ein an Transkriptions-Kontrollsequenzen operativ gekoppeltes Reportergen umfasst. Die Transkription des Reportergens wird durch diese Sequenzen kontrolliert. Die Aktivität von mindestens einem oder mehreren dieser Kontrollsequenzen wird direkt oder indirekt reguliert durch das Zelloberflächen-Protein. Die Transkriptions-Kontrollsequenzen umfassen den Promotor und andere regulatorische Bereiche, wie z. B. Enhancer-Sequenzen, die die Aktivität des Promotors modulieren oder Kontrollsequenzen, die die Aktivität oder Effektivität der RNA-Polymerase, die den Promotor erkennt, modulieren, oder Kontrollsequenzen, die durch Effektormoleküle erkannt werden, einschließlich solcher, die spezifisch induziert werden durch Wechselwirkung eines extrazellulären Signals mit einem Zelloberflächen-Protein. Die Modulation der Aktivität des Promotors, z. B., kann bewirkt werden durch eine Veränderung in der Bindung der RNA-Polymerase an den Promotorbereich oder, alternativ, durch die Beeinflussung der Initiation der Transkription oder der Elongation der mRNA. Solche Sequenzen werden hier insgesamt als Transkriptions-Kontrollelemente oder -sequenzen bezeichnet. Zusätzlich kann das Konstrukt Nukleotidsequenzen einschließen, die die Translation der sich ergebenden mRNA beeinflussen, wodurch die Menge an Reportergenprodukt verändert wird.
So wie hier verwendet, bezieht sich Promotor auf diejenige DNA-Region, die im Hinblick auf die Richtung der Transkription stromaufwärts des Transkriptions-Initiationspunktes liegt. Er umfasst den Bereich der Bindung der RNA-Polymerase und der Transkriptions-Initiationspunkte und alle anderen Regionen, eingeschlossen, aber nicht beschränkt auf, Repressor- oder Aktivator-Protein-Bindebereiche, Calzium- oder cAMP-responsive Bereiche und jedwede Nukleotidsequenzen, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind als solche, die den Grad an Transkription vom Promotor aus verändern, entweder direkt oder indirekt.
So wie hier verwendet, ist ein Promotor, der reguliert oder beeinflusst wird durch die Aktivität eines Zelloberflächen-Proteins, ein Promotor, dessen Aktivität sich ändert, wenn eine Zelle einem bestimmten extrazellulären Signal ausgesetzt wird, durch die Anwesenheit von Zelloberflächen-Proteinen, deren Aktivitäten durch das extrazelluläre Protein beeinflusst wird. Der c-fos-Promotor, z. B., der spezifisch aktiviert wird durch die spezifische Wechselwirkung bestimmter extrazellulärer Signale, wie z. B. Wachstumshormone, mit einem Zelloberflächen-Protein, wie z. B. dem Wachstumshormon-Rezeptor. Insbesondere tritt die Regulation solcher Promotoren durch das Zelloberflächen-Protein, obwohl indirekt, innerhalb von Minuten nach der Wechselwirkung des Zelloberflächen-Proteins mit dem extrazellulären Signal auf. So wie hier verwendet, bezieht sich operative Verbindung auf ein DNA-Fragment, wie z. B. die Verbindung eines Promotors mit einem DNA-Molekül, das durch RNA-Polymerase, die an den Promotor bindet, transkribiert wird, so daß die regulatorische Region für ihre Aktivität passend angeordnet ist. So liegt ein DNA-Fragment in operativer Verbindung mit einem Promotor stromabwärts im Hinblick auf die Richtung der Transkription vom Promotor aus gesehen, und liegt im richtigen Leserahmen in Bezug auf den Transkriptionsstartpunkt und ist so eingefügt, daß die Transkriptionselongation durch das DNA-Fragment führt.
Der auf Transkription basierende Assay
Die Durchführung des Assays besteht in der Einführung eines Reportergen-Konstrukts in eine eukaryontische Zelle, um eine rekombinante Zelle herzustellen, auf deren Oberfläche ein Zelloberflächen-Protein des bestimmten oben beschriebenen Typs vorkommt. Der Zelloberflächen-Rezeptor kann endogen exprimiert werden, oder er kann von einem heterologen Gen exprimiert werden, das in die Zelle eingeführt wurde. Verfahren zum Einführen heterologer DNA in eukaryontische Zellen sind nach dem Stand der Technik gut bekannt und jedwede dieser Methoden kann verwendet werden. Außerdem ist DNA, die für verschiedene Zelloberflächen-Proteine kodiert, den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt oder sie kann kloniert werden durch jedwede Methode, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt ist.
Die rekombinante Zelle wird mit einer Testsubstanz in Kontakt gebracht und der Grad an Reportergenexpression wird gemessen. Das In-Kontakt-Bringen kann durch ein beliebiges Vehikel bewirkt werden und das Testen kann unter Verwendung eines beliebigen Protokolls, wie z. B. Serienverdünnung, durchgeführt werden, um spezifische molekulare Wechselwirkungen zu ermitteln, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind.
Nach dem In-Kontakt-Bringen der rekombinanten Zelle für eine ausreichende Zeit, um eine beliebige Wechselwirkung auszulösen, wird der Grad an Genexpresion gemessen.
Die Menge an Zeit, die benötigt wird, eine solche Wechselwirkung auszulösen kann empirisch bestimmt werden, wie z. B. durch Bestimmen einer Zeitverlaufsfunktion und durch Messen des Grades an Transkription als Funktion der Zeit.
Der Grad an Transkription kann durch ein beliebiges Verfahren gemessen werden, das den Fachleuten auf dem Gebiet als passend bekannt ist. Die spezifische mRNA-Expression, z. B., kann unter Verwendung von Northern-Blots gemessen werden, oder ein bestimmtes Proteinprodukt kann durch eine charakteristische Färbung identifiziert werden.
Der Grad an Transkription wird dann verglichen mit dem Grad an Transkription in entweder derselben Zelle in Abwesenheit der Testsubstanz oder er kann verglichen werden mit dem Grad an Transkription in einer im wesentlichen identischen Zelle, der die spezifischen Rezeptoren fehlen. Eine im wesentlichen identische Zelle kann aus denselben Zellen abgeleitet sein, aus denen die rekombinante Zelle hergestellt wurde, die aber nicht durch Einführung heterologer DNA verändert wurde. Alternativ kann es eine Zelle sein, bei der die spezifischen Rezeptoren entfernt wurden. Jedweder statistische oder anderweitig signifikante Unterschied im Grad an Transkription zeigt an, daß die Testsubstanz irgendwie die Aktivität des spezifischen Rezeptors verändert hat.
Wenn die Testsubstanz die Aktivität des Zelloberflächen-Rezeptors nicht zu erhöhen, zu aktivieren oder zu induzieren scheint, kann der Assay wiederholt und durch die Einführung eines Schritts verändert werden, in dem die rekombinante Zelle zuerst auf die Fähigkeit eines bekannten Agonisten oder Aktivators des spezifischen Rezeptors, die Transkription zu aktivieren, getestet wird. Wenn die Transkription induziert wird, wird die Testsubstanz dann auf ihre Fähigkeit getestet, die Aktivität des Agonisten zu hemmen, zu blockieren oder anderweitig zu beeinflussen.
Der auf Transkription basierende Assay ist nützlich für die Identifizierung von Substanzen, die mit einem beliebigen Zelloberflächen-Protein wechselwirken, dessen Aktivität letztendlich die Genexpression verändert. Insbesondere können die Assays verwendet werden, um funktionale Ligand-Rezeptor Wechselwirkungen für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren zu untersuchen. Beispiele dafür umfassen:
G-Protein-gekoppelte Rezeptoren
adrenerge Rezeptoren, muskarinische Rezeptoren und dergleichen.
Herstellung rekombinanter Zellen
Jede transfizierte Zelle, die das gewünschte Zelloberflächen-Protein auf eine Weise exprimieren kann, so dass das Protein funktioniert, um intrazellulär ein extrazelluläres Signal zu übertragen, kann verwendet werden. Diese Zellen können so ausgewählt werden, dass sie das Zelloberflächen-Protein endogen exprimieren oder sie können gentechnisch dahingehend erzeugt werden. Viele solcher Zellen sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Solche Zellen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Ltk^–-Zellen, PC12-Zellen und COS-7-Zellen.
Die Herstellung von Zellen, die den Rezeptor und ein Reportergenexpressions-Konstrukt exprimieren, und die verwendbar sind zum Testen von Substanzen, zur Ermittlung von deren Aktivitäten, wird beispielhaft in den Beispielen dargestellt, die hiermit vorgelegt werden, unter Bezugnahme auf die Säuger-Zellinien Ltk^– und COS-7, die den Typ 1 menschlich-muskarinischen (HM1)-Rezeptor exprimieren und die entweder mit einem c-fos-Promotor-CAT-Reportergen-Expressionskonstrukt oder mit einem c-fos-Promotor-Luciferase-Reportergen-Expressionskonstrukt transformiert sind.
Zelloberflächen-Proteine
Das Zelloberflächen-Protein kann endogen auf der ausgewählten Zelle exprimiert werden oder es kann von klonierter DNA aus exprimiert werden. Beispielhafte Zelloberflächen-Proteine umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: muskarinische Rezeptoren (z. B. menschlicher M2 (GenBank Nr. M16404), Ratte M3 (GenBank Nr. M16407), menschlicher M4 (GenBank Nr. M16405), menschlicher M5 (Bonner et al. (1988) Neuron 1: 403–410, und dergleichen), adrenerge Rezeptoren (z. B. menschlicher β₁ (Frielle et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 7920–7924), menschlicher α₂ (Kobilka et al. (1987) Science 238: 650–656), Hamster β₂ (Dixon et al. (1986) Nature 321: 75–79), und dergleichen), Dopamin-Rezeptoren (z. B. menschlicher D2 (Stormann et al. (1990) Molec. Pharm. 37: 1–6), Ratte (Bunzow et al. (1988) Nature 336: 783–787), und dergleichen), Serotonin-Rezeptoren (z. B. menschlich 5HT1a (Kobilka et al. (1987) Nature 329: 75–79), Ratte 5HT2 (Julius et al. (1988) Science 241: 558–564), und dergleichen).
Reportergenkonstrukte
Reportergenkonstrukte werden durch operative Verbindung eines Reportergens mit mindestens einem Transkriptions-Regulationselement hergestellt. Wenn nur ein Transkriptions-Regulationselement eingeführt wird, muß es ein regulierbarer Promotor sein. Mindestens eines der ausgewählten Transkriptions-Regulationselemente muß indirekt oder direkt durch die Aktivität des ausgewählten Zelloberflächen-Rezeptors reguliert werden, wodurch die Aktivität des Rezeptors über die Transkription des Reportergens gemessen werden kann.
Das Konstrukt kann zusätzliche Transkriptions-Regulationselemente, wie z. B. die FIRE-Sequenz, oder eine andere Sequenz, die nicht notwendigerweise durch das Zelloberflächen-Protein reguliert wird, enthalten, wird aber ausgewählt im Hinblick auf ihre Fähigkeit, den Hintergrundgrad an Transkription zu vermindern oder das übertragene Signal zu amplifizieren und dadurch die Empfindlichkeit und Glaubwürdigkeit des Assays zu erhöhen.
Viele Reportergene und Transkriptions-Regulationselemente sind den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt und andere können identifiziert oder synthetisiert werden durch Verfahren, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind.
Reportergene
Ein Reportergen umfasst ein beliebiges Gen, das ein detektierbares Genprodukt exprimiert, das RNA oder Protein sein kann. Bevorzugte Reportergene sind solche, die sofort detektierbar sind. Das Reportergen kann in das Konstrukt auch in Form eines Fusionsgens mit einem Gen, das gewünschte Transkriptions-Regulationssequenzen umfasst oder andere gewünschte Eigenschaften aufweist, eingeschlossen sein. Beispiele von Reportergenen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, CAT (Chloramphenicol-Acetyltransferase) (Alton und Vapnek (1979) Nature 282: 864–869), Luciferase und andere Enzym-Detektionssysteme, wie z. B. beta-Galactosidase, Glühwürmchen-Luciferase (de Wet et al. (1987) Mol. Cell. Biol. 7: 725–737), Bakterielle Luciferase (Engebrecht und Silverman (1984) PNAS 1: 4154–4158; Baldwin et al. (1984) Biochemistry 23: 3663–3667), Alkalische Phosphatase (Toh et al. (1989) Eur. J. Biochem. 182: 231–238; Hall et al. (1983) J. Mol. Appl. Gen. 2: 101).
Transkriptions-Kontrollelemente
Transkriptions-Kontrollelemente umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Promotoren, Enhancer und Repressor- und Aktivator-Binderegionen. Passende Transkriptions-Regulationselemente können von den Transkriptions-Regulationsbereichen von Genen, deren Expression schnell induziert wird, abgeleitet sein, im allgemeinen innerhalb von Minuten nach Kontakt zwischen dem Zelloberflächen-Protein und dem Effektor-Protein, das die Aktivität des Zelloberflächen-Proteins moduliert. Beispiele solcher Gene umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, die Immediate-early Gene (s. Sheng et al. (1990) Neuron 4: 477–485), wie z. B. c-fos. Immediate-early Gene sind Gene, die nach der Bindung eines Liganden an ein Zelloberflächen-Protein schnell induziert werden. Die Transkriptions-Kontrollelemente, die zur Verwendung in den Genkonstrukten bevorzugt sind, umfassen Transkriptions-Kontrollelemente von Immediate-early Genen, Elemente, die aus anderen Genen stammen, die einige oder alle Charakteristika der Immediate-early Gene aufweisen oder synthetische Elemente, die so konstruiert sind, daß Gene in operativer Verbindung mit diesen solche Charakteristika aufweisen.
Die Charakteristika bevorzugter Gene, von denen die Transkriptions-Kontrollelemente abgeleitet sind, umfassen, sind aber nicht beschränkt auf: Geringe oder nicht detektierbare Expression in ruhenden Zellen; schnelle Induktion auf Transkriptionshöhe innerhalb von Minuten nach extrazellulärer Stimulation; Induktion, die transient und unabhängig von neuer Proteinsynthese ist; darauffolgendes Abschalten der Transkription benötigt neue Proteinsynthese; und mRNAs, die von diesen Genen transkribiert werden, haben eine kurze Halbwertszeit. Es ist nicht notwendig, daß alle diese Eigenschaften vorliegen.
In den am meisten bevorzugten Konstrukten sind die Transkriptions-Regulationselemente vom c-fos-Gen abgeleitet.
Das c-fos-Proto-Onkogen ist das zelluläre Homolog des transformierenden Gens des FBJ Osteosarkom Virus. Es kodiert für ein nukleäres Protein, das sehr wahrscheinlich am normalen Zellwachstum und der Differenzierung beteiligt ist. Die Transkription von c-fos ist transient und wird schnell aktiviert durch Wachstumsfaktoren und durch andere Induktoren anderer Zelloberflächen-Proteine, einschließlich Hormone, Differenzierungs-spezifische Stoffe, Stress, Mitogene und andere bekannte Induktoren von Zelloberflächen-Proteinen. Die Aktivierung ist unabhängig von der Proteinsynthese. Die c-fos-Regulationselemente umfassen (s. Verma et al. (1987) Cell 51): eine TATA-Box, die benötigt wird zur Transkriptions-Initiation, zwei Stromaufwärts-Elemente für die basale Transkription und einen Enhancer, der ein Element mit Spiegelsymmetrie einschließt, das benötigt wird zur Induktion durch TPA, Serum, EGF und PMA.
Das 20 Basenpaare (bp) umfassende Transkriptions-Enhancer-Element, das sich zwischen -317 und -298 bp stromaufwärts von der c-fos mRNA-Cap-Stelle befindet, ist essentiell für die Serum-Induktion von NIH 3T3-Zellen, die sich unter Serum-Entzug befinden. Eines der beiden Stromaufwärts-Elemente befindet sich zwischen -63 bis -57 bp und es zeigt Ähnlichkeiten zu der Konsensussequenz für die cAMP-Regulation. Andere Promotoren und Transkriptions-Kontrollelemente, zusätzlich zu den oben beschriebenen, umfassen den Promotor des Gens für das Vasoaktive Darmpeptid (VIP) (cAMP-responsiv; Fink et al. (1988), Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 6662–6666), den Somatostatin-Gen-Promotor (cAMP-responsiv; Montminy et al. (1986), Proc. Natl. Acad. Sci USA 83: 6682–6686), den Proenkephalin-Gen-Promotor (responsiv gegenüber cAMP, Nikotinischen Agonisten und Phorbolestern; Comb et al. (1986) Nature 323: 353–356), den Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Gen-Promotor (cAMP-responsiv; Short et al. (1986) J. Biol. Chem. 261: 9721–9726), den NGF1-A-Gen-Promotor (resposiv gegenüber NGF, cAMP und Serum; Changelian et al. (1989), Proc. Natl. Acad. Sci USA 86: 377–381), und andere, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind oder von ihnen hergestellt werden.
Die folgenden Beispiele werden allein zum Zwecke der Veranschaulichung gegeben und sollen den Schutzbereich der Erfindung nicht einschränken.
Beispiel 1
Herstellung von stabilen und von transient co-transfizierten Säuger-Zellinien, die HM1-Rezeptoren exprimieren und die DNA enthalten, die für ein Reportergen unter Kontrolle eines Promotors, dessen Aktivität, entweder direkt oder indirekt, durch HM1-Effektoren moduliert wird, kodiert
Stabile Zellinien und transient transfizierte Zellinien zum Gebrauch in dem auf Transkription basierenden Assay wurden hergestellt. Ltk^–-Zellen, die eine Thymidinkinase-defekte Mäusefibroblasten-Zellinie darstellen, wurden stabil co-transfiziert mit einem Plasmid, das entweder das Wildtyp- oder ein verkrüppeltes Thymidinkinasegen und ein Reportergen-Expressionskonstrukt umfasst. COS-7-Zellen (African Green Monkey Nierenzellen) wurden transient co-transfiziert mit einem Reportergenkonstrukt und einem β-Galaktosidase-Expressionsplasmid, pCH110 (Hall et al. (1983) J. Mol. Appl. Gen. 2: 101), das DNA, die für den HM1-Rezeptor kodiert, umfasst.
A. Herstellung von Säuger-Zellinien, die zum Gebrauch in dem auf Transkription basierenden Assay modifiziert wurden
Die folgenden Zellinien wurden als Wirtszellen verwendet: HEK 293, die erhältlich sind von der ATCC (Nr. CRL1573), Ltk^–-Zellen, die erhältlich sind von der ATCC (Nr. CCL1.3), COS-7-Zellen, die erhältlich sind von der ATCC (Nr. 1651) und DG44-Zellen (s. z. B. L. Chasin (1986) Cell. Molec. Genet. 12: 555).
B. DNA, die für den M1-Rezeptor kodiert, wurde kloniert und inseriert in ein M1-Expressionsplasmid
Die Sequenz des für HM1-kodierenden DNA-Fragments wird in Allard et al. (1987) Nucl. Acids Res. 15: 10604 beschrieben. Sie kann hergestellt werden durch Synthese der DNA, durch Präparation wie beschrieben in Allard et al., oder sie kann durch Screenen einer partiellen menschlich genomischen DNA-Bank isoliert werden. Sie wurde isoliert durch Screenen einer partiellen menschlich genomischen Bank, die 2,5 bis 4,5 Kilobasen(kb)-große EcoRI-Fragmente im λgt11-Vektor trägt, mit einem Oligonukleotid, das zu den Nukleotiden 250–279 der HM1-Gensequenz homolog ist. Die angewandten Screen-Bedingungen waren wie folgt:
Hybidisierung: 20% deionisiertes Formamid, 5 × Denhardt-Lösung, 6 × SSPE, 0,2% SDS, 200 μg/ml ultraschall-behandelte Heringssperma-DNA, 42°C.
Waschvorgang: 0,2 × SSPE, 0,2% SDS, 50°C.
Ein positiver Klon wurde identifiziert und es wurde durch DNA-Sequenzierung überprüft, ob er für den HM1-Rezeptor kodiert. Das EcoRI-Insert dieses Klons wurde isoliert und inseriert in die EcoRI-Schnittstelle von pIBI24 (International Biotechnologies, Inc., New Haven, CT), woraus der Klon pIBI24/HM1 erhalten wurde. Das für HM1 kodierende Fragment von pIBI24/HM1 wurde modifiziert zur Insertion in das SV40-Promotor-basierte Plasmid pSV2dhfr (s. Subramani et al. (1981) Mol. Cell. Biol. 1: 854–864). Fünfzig Nanogramm des 1,97 kb BamHI-Fragments aus pIBI24/HM1 wurden ligiert mit 50 ng des BamHI-gespaltenen M13mp18. Die Ligation wurde in den E. coli-Stamm JM103 transformiert und Ampicillin-resistente Kolonien wurden selektiert. Korrektes Plasmid wurde identifiziert durch die Anwesenheit eines 1,45 kb großen KpnI-Spaltungsfragments. Matrize wurde von diesem Plasmid erzeugt, um eine EcoRI-Stelle unmittelbar vor dem Initiationscodon der kodierenden Region des menschlichen HM1 einzuführen. Dies wurde erreicht durch Standard-Mutagenese unter Verwendung eines Oligonukleotids mit der Sequenz ATG CCCCAGCCCC ACCTTGAATT CATGAACACT TCAGCC (SEQ ID No. 1).
Die Mutagenese-Produkte wurden in JM103 transformiert und mit einem 18 Basen langen Oligonukleotid (SEQ ID No. 4) auf Plaque-Lift-Assays durchmustert. Vier der positiven Klone wurden einer Didesoxy-Sequenzierung unterworfen und bei allen vier wurde die korrekte Sequenz gefunden, also eine hinzugefügte EcoRI-Schnittstelle direkt 5' vom 5'ATG. Einer der positiven Sequenz-Klone, mHM1AChR103, wurde ausgewählt und eine zweite EcoRI-Schnittstelle wurde auf das menschliche HM1-Terminationscodon folgend eingeführt unter Verwendung Oligonukleotid-spezifischer Mutagenese mit einem 37 Nukleotide langen Oligonukleotid (SEQ ID No. 2).
Die Mutagenese-Produkte wurden in JM103 transformiert und mit einem 17 Basen langen Oligonukleotid (SEQ ID No. 3) auf Plaque-Lift-Assays durchmustert. Positive Klone wurden identifiziert und vier wurden sequenziert, um zu bestätigen, daß die EcoRI-Schnittstelle eingeführt worden war und daß der Rest der Sequenz unverändert war. Die vier sequenzierten Klone hatten die korrekte Sequenz.
Einer der sequenzierten Klone, M3HM1AR04, wurde mit EcoRI gespalten und das 1,4 kb-Fragment, das die kodierende Region des menschlichen HM1 darstellt, wurde Gelgereinigt und eluiert unter Verwendung von DE-81-Papier. Sechzig Nanogramm des 1,4 kb-Fragmentes wurden mit 20 ng des EcoRI-gespaltenen pUC19 ligiert. Korrekte Klone wurden durch die Anwesenheit eines 1,2 kb-KpnI-Fragmentes identifiziert. Einer dieser Klone wurde ausgewählt und als pHM1RO2 bezeichnet. Das 1,4 kb-EcoRI-Fragment wurde aus pHM1RO2 ausgeschnitten und inseriert (38,5 ng) in 50 ng EcoRI-gespaltenen pSV2dhfr. Das erhaltene Produkt wurde in DH5α-Zellen transformiert (Sambrook et al., Molecular Cloning, 2nd ed., Cold Spring Harbor Lab, 1989, S. 10) und Ampicillin-resistente Kolonien wurden selektiert. Von den ausgewählten Kolonien hatten diejenigen die erwarteten und erwünschten Plasmide, die nach der Isolation und der Spaltung von Plasmid-DNA mit EcoRI Fragmente mit 1,4 und 5,0 kb ergaben und nach Spaltung mit PvuII Fragmente mit 250, 1150 und 5000 Basenpaaren ergaben. Der endgültige HM1-Expressionsvektor wurde pHM1pSV2dHFR genannt.
C. Herstellung von TK⁺ (Thymidinkinase)-Selektionsplasmiden
Entweder pThx59 (Zipser et al. (1981) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 6276–6280), das für das Wildtyp TK-Gen kodiert oder pThx24 (ibid.), das für ein verkrüppeltes TK-Gen kodiert, wurde co-transfiziert in Ltk^–-Zellen zusammen mit den den muskarinischen Rezeptor exprimierenden Plasmiden, um stabil modifizierte Ltk-Zellen herzustellen, die den klonierten HM1-Rezeptor auf ihrer Zelloberfläche exprimieren.
D. Herstellung von Reportergenkonstrukten und Expressionsplasmiden, die die Konstrukte enthalten
1. Das Plasmid pFC4 wurde verwendet, um Reportergenkonstrukte herzustellen, die die c-fos-Gen-Promotor-Region umfassen
Das Reportergen-Expressionsplasmid pFC4 (Deschamps et al. (1985) Science 230: 1174–1177), das das CAT-Gen unter der Kontrolle des c-fos-Gen-Promotors enthält, wurde als Quelle für den c-fos-Promotor und das CAT-Reportergen verwendet und wurde auch in Ltk^–-Zellen durch Co-Transfektion mit DNA, die für Rezeptoren kodiert, eingeführt. Kurz gesagt beschreiben Deschamps et al. die Herstellung einer Serie von Plasmiden, die den menschlichen c-fos-Promotor und verschiedene Mengen an Stromaufwärts-Sequenzen enthalten. Ein 2,25 kb EcoRI-NaeI-Fragment (FC1) aus dem menschlichen c-fos-Gen (van Straaten et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci USA 80: 3183), das den c-fos-Promotor und Stromaufwärts-Sequenzen enthält, wurde in den Vektor pSV2CAT (Gorman et al. (1982) Mol. Cell. Biol. 2: 1044) anstelle des AceI-HindIII-Fragments in pSV2CAT mit Hilfe von HindIII-Linkern eingeführt. Das erhaltene Plasmid war pFC1. Ein zweites Plasmid pFC2 wurde hergestellt durch Isolierung des 1,4 kb-NaeI (FC2)-Fragments aus der Stromaufwärts-Region des menschlichen c-fos-Gens und Insertion unter Verwendung von HindIII-Linkern in pSV2CAT, wie für FC1 beschrieben. Eine Serie von zusätzlichen Plasmiden wurde durch Deletion von Teilen der Stromaufwärts-Sequenz aus FC2 erzeugt. Deletionen von SmaI bis XhoI und SstII bis SstII in FC2 ergaben jeweils FC3 und FC4. Nachdem die deletierten Fragmente, die den restlichen flankierenden Sequenzen und dem c-fos-Promotor entsprechen, mit HindIII gespalten und gelelektrophoretisch aufgetrennt worden waren, wurden sie in die SmaI-HindIII-gespaltene DNA, anstelle des ursprünglichen 1,3 kb-Fragmentes, kloniert. Deschamps et al. beschreiben auch die Herstellung der Konstrukte FC5-11, -10, -20, -30 und -40 und der entsprechenden Plasmide.
In den unten beschriebenen Konstrukten wird, wenn nicht anders vermerkt, die c-fos-Promotorregion erhalten als das 400 bp-Fragment aus pFC4, der ein 500 bp Insert aus dem c-fos-Promotor umfasst. Der 5'-100 Basenpaar-Bereich wird abgeleitet von einer nicht-kontinuierlichen distalen Stromaufwärts-Region.
2. Die c-fos-Promotor-Luciferase-Reportergen-Konstrukte und Plasmide
Die Plasmide pFC4XP1 und pFC4XP2 wurden durch Insertion des FC4-Fragments von pFC4 (Deschamps et al. (1985) Science 230: 1174–1177) in pXP1 und pXP2, die Glühwürmchen-Luciferase-Reportergen-Konstrukte enthalten, hergestellt (s. Nordeen S. K. (1988) Biotechniques 6(5): 454–457). Die Plasmide pFC4XP1 und pFC4XP2 umfassen zwei tandemartig angeordnete Transkription/Translation-Terminations-Sequenzen am 5'-Ende des c-fos-Promotor-Fragments. Die zwei Konstrukte unterscheiden sich in der Position des c-fos-Promotors relativ zum Luciferase-Gen. In Plasmid pFC4XP1 ist der c-fos-Promotor nahe dem 3'-Ende des Polylinkers inseriert, mit nur einer 66 bp langen Sequenz, die ihn vom Luciferasegen trennt. In Plasmid pFC4XP2, ist der c-fos-Promotor nahe dem 5'-Ende des Polylinkers angeordnet und dort liegt eine 36 bp Sequenz, die ihn vom Luciferase-Gen trennt. Die sich ergebenden Luciferase-Reportergen-enthaltenden Expressionsplasmide pFC4XP1 und pFC4XP2 sind austauschbar und wurden verwendet, um PC12- und COS-7-Zellen zu transfizieren.
3. Andere c-fos Promotor-Reportergen-Konstrukte und Plasmide, die verschiedene Anteile der c-fos-Promotorregion und andere Transkriptions-Regulationselemente enthalten, wurden hergestellt
Die Größe des c-fos-Promotorsegments im Reportergen wurde verändert, um den Grad an Induktion der Reportergen-Expression in Rezeptor-exprimierenden Zellen, die mit dem c-fos-Promotor-Reportergen-Konstrukt transfiziert sind, zu maximieren. Das c-fos-Promotorsegment, das in den oben beschriebenen c-fos-Promotor-Luciferase-Reportergenkonstrukten pFC4XP1 und pFC4XP2 verwendet wurde, die in den PC12- und COS-7-Zelltransfektionen verwendet wurden, ist das FC4-Fragment des c-fos-Promotors aus Plasmid pFC4. Obwohl in einer Vielzahl von Anwendungen gezeigt wurde, daß dieser Teil des c-fos-Promotors in der Lage ist, die Transkription des c-fos-Gens in Antwort auf erhöhte Konzentrationen von cAMP und/oder Calzium zu aktivieren, war nicht bekannt, ob größere oder kleinere Anteile des c-fos-Promotors in der Stimulation der Reportergen-Expression in bestimmten, Rezeptor-exprimierenden Zellinien in höherem Maße, weniger oder gleich wirksam sind. Um diese Möglichkeit zu untersuchen, wurden c-fos-Promotor-Luciferase-Reportergenkonstrukte, die größere (2200 bp) oder kleinere (350 bp) Fragmente des c-fos-Promotors (erhalten jeweils aus den Plasmiden pFC1 und pFC7) enthalten, zusammengesetzt und zur Transfektion von PC12-Zellen, die endogen Ratten-Acetylcholin-Rezeptoren (nAChRs) exprimieren, verwendet. Die transfizierten Zellen wurden dann im Hinblick auf Carbachol-induzierte Luciferase-Aktivitäten getestet.
Zusätzlich zu den obigen zwei Plasmiden und Konstrukten wurde ein drittes Plasmid, das ein c-fos-Promotor-Luciferase-Reportergenkonstrukt enthält, hergestellt, das das aus pFC4 erhaltene 500 bp FC4 c-fos-Promotor-Fragment, die für das Luciferasegen kodierende Sequenz und das intragene regulatorische Element des c-fos-Gens (FIRE), das ein 14-mer-Palindrom TCCCCGG gefolgt von CCGGGGA ist (s. Lamb et al. (1990) Cell 61: 485–496, s. auch Bonnieu et al. (1989) Oncogene 4: 881–888 und Blanchard et al. (1988) Biochimie 70: 877–884), umfasst. Die Plasmide, die diese Konstrukte enthalten, pFC4XP1FIRE und pFC4XP2FIRE, unterscheiden sich von pFC4XP1 und pFC4XP2 nur darin, daß die FIRE-Sequenz stromabwärts vom c-fos-Gen-Promotor-Luciferase-Reportergenkonstrukt inseriert wurde.
Da die FIRE-Sequenz die Expression von c-fos in nicht-induzierten Zellen vermindert, sollte das Einfügen dieser Sequenz in die im auf Transkription basierenden Assay verwendeten Konstrukte zu einer Verminderung der Höhe des Hintergrundrauschens führen und dadurch die Sensitivität und Verläßlichkeit des Assays erhöhen.
Andere Plasmide werden konstruiert, in denen die FIRE-Sequenz anderswo in die Reportergenkonstrukte eingeführt ist, um die erhaltene Verminderung der Höhe des Hintergrundrauschens durch Einfügung dieser Sequenz zu optimieren. Da die FIRE-Sequenz am Ende des ersten Exons im c-fos-Gen lokalisiert ist und über die Förderung der vorzeitigen Termination von c-fos-Transkripten in nicht-induzierten Zellen zu wirken scheint, wurden Konstrukte hergestellt, die Fusionen des Reportergens und verschiedener Anteile des c-fos-Gens umfassen. Diese Fusionskonstrukte umfassen das erste Exon und die FIRE-Sequenz des c-fos-Gens und zunehmende Anteile der intragenen Region. Der Anteil an intragener Region wird durch Herstellen der Konstrukte und deren Testen auf c-fos-Expression in Abwesenheit eines Induktors optimiert. Diejenigen, die den geringsten Grad an Expression in Abwesenheit des Induktors und den höchsten Grad induzierter Expression, also das höchste Signal/Hintergrundrauschen-Verhältnis aufweisen, werden zur Verwendung in dem auf Transkription basierenden Assay ausgewählt. Die Konstrukte können in PC12-, COS-7- und anderen passenden Rezeptor-exprimierenden und Kontroll-Zellen eingeführt werden.
4. Herstellung von Reportergenkonstrukten und Plasmiden, die die Somatostatin-Promotorregion umfassen
a. Somatostatin-Promotor-CAT-Reportergenkonstrukte
Das Reportergenexpressionsplasmid pΔ(-71), das das CAT-Gen reguliert vom Somatostatingen-Promotor enthält (s. Montminy, M. R. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci USA 83: 6682–6686) wurde hergestellt und in COS-7-Zellen eingeführt.
b. Somatostatin-Promotor-Luciferase-Reportergenplasmide
Das Plasmid pΔ(-71)XP1, das ein Glühwürmchen-Luciferase-Reportergenkonstrukt unter der Kontrolle des pΔ(-71)Somatostatin-Promotorelements (s. Montminy, M. R. et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci USA 83: 6682–6686) enthält, wurde verwendet, um COS-7-Zellen zu transfizieren.
E. Herstellung stabiler und transienter Zellinien durch Co-Transfektion von Säuger-Wirtszellen mit Plasmiden, die DNA, die für HM1 kodiert und das Reportergenkonstrukt und DNA, die für einen selektiven Marker kodiert, enthalten
1. Herstellung stabil transfizierter Ltk^–-Zellen
Stabile, HM1-exprimierende Zellinien wurden unter Verwendung der Calziumphosphat-Transfektion zur Einführung der Plasmid-DNA (s. Wigler et al. (1979) Proc. Natl. Acad. Sci USA 76: 1373–1376) hergestellt. In Kürze wurden Ltk^–-Zellen in nicht-selektivem Medium D + 10, das Dulbecco's modifiziertes Eagle's-Medium + 10% Kälberserum, 100 U/ml Penicillin und 100 μg/ml Streptomycin enthält, in einer 10 cm großen Anzuchtschale auf 20% Konfluenz angezogen. Die drei zirkulären Plasmide, das TK⁺-Plasmid, das HM1-tragende Plasmid und das pFC4-Plasmid wurden mit CaPO₄ co-präzipitiert und zum Zellen-Monolayer zugegeben.
Die Vektor-Konzentrationen waren wie folgt:

Thx24 : HM1 : pFC4 2 μg : 2 μg : 2 μg/ml

Thx59 : HM1 : pFC4 0,25 μg : 2 μg : 2 μg/ml
Die Endkonzentration der DNA wurde eingestellt auf 20 bis 40 μg/ml durch Zugabe von Ltk^–- oder PVC-DNA. Die transfizierten Zellen wurden für zwei Tage in nicht-selektivem Medium angezogen. Nach zwei Tagen wurden die Zellen passiert, nicht-selektives Medium wurde durch HAT-Medium (D + 10 + 15 μg/ml Hypoxanthin + 1 μg/ml Aminopterin + 5 μg/ml Thymidin) ersetzt und die Zellen wurden für 10–15 Tage kultiviert, während dieser Zeit wurde den Zellen alle 3–4 Tage frisches HAT-Medium „gefüttert". Nach 10–15 Tagen erschienen Kolonien oder Klone, die die Akzeptanz und die Expression zumindest des Plasmids, das das TK-Gen trägt, anzeigte. Die Kolonien wurden in einzelne Vertiefungen (Wells) einer 24-Well Anzuchtschale überführt und für sieben Tage in Selektiv-Medium angezogen. Einzelne Klone wurden dann in 6-Well Anzuchtschalen überführt und weitere sieben Tage in Selektivmedium angezogen. Um Zellen zum Einfrieren und anschließende molekulare und funktionelle Rezeptoranalysen bereitzustellen, wurden die Einzelklone in den 6-Well Anzuchtschalen in 100 ml- Anzuchtschalen überführt. Zwei der erhaltenen Zellinien wurden als LM1FC4-8 und LM1FC4-15 bezeichnet.
2. Transiente Co-Transfektion von COS-7-Zellen
Die CaPO₄-Transfektionsmethode wurde zur transienten Transfektion von COS-7-Zellen verwendet. Das verwendete Protokoll war das, das in „Current Protocols in Molecular Biology", 1, Supplement 14, Section I, Unit 9.1.1–3.1.3; Wiley Interscience Publish (1990) beschrieben ist.
COS-7-Zellen (ungefähr 1–2 × 10⁶ Zellen) wurden auf 20% Konfluenz in Dulbecco's Modifiziertem Eagle-Medium (Gibco Nr. 320-1965AJ) mit 10% fötalem Rinderserum (Gibco Nr. 200-6140 AJ) 1 × Pen/Strep (Gibco Nr. 600-5140 AJ) und 1 × MEM nicht-essentiellen Aminosäuren (Gibco Nr. 320-1140 AG) angezogen. Die drei zirkulären Plasmide, die den HM1-Rezeptor, das TK-Gen und ein Reportergen umfassen, wurden mit CaPO₄ co-präzipitiert und zum Zell-Monolayer hinzugegeben. Die Plasmid-Konzentrationen waren wie folgt:

pCH110 : HM1pSV2dHFR : pFC4XP1 5 μg : 5 μg: 0,5 μg/ml

pCH110 : HM1pSV2dHFR : pΔ(-71) 5 μg : 5 μg : 1 μg/ml

pCH110 : HM1pSV2dHFR : pΔ(-71)XP2 5 μg : 5 μg : 0,5 μg/ml
Nach der Transfektion wurden die Zellen für 24–48 Stunden im oben beschriebenen Dulbecco's Modifiziertem Medium inkubiert und unter Verwendung des auf Transkription basierenden Assays dann im Hinblick auf Reportergenexpression und auf β-Galaktosidaseexpression getestet, wie unten in Beispiel 3.D. beschrieben.
Beispiel 2
Herstellung von Zellinien zur Verwendung als Kontrollen im auf Transkription basierenden Assay
Kontrollzellinien, die zum Vergleich des Grads an Transkription in Zellen, die das Zelloberflächen-Protein exprimieren und die ein Reportergen umfassen, herangezogen werden, wurden hergestellt.
Zwei Serien von Kontrollzellinien wurden unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Transfektions- und Anzuchtprotokolle hergestellt.
Die erste Serie von Kontrollzellen wurde durch Co-Transfektion von Ltk^–-Zellen mit Plasmiden, die für HM1 und TK⁺ kodierende DNA enthalten, unter Verwendung der in Beispiel 1 beschriebenen Methoden und von HM1- und TK⁺-DNA, hergestellt. Die erste Serie umfasst Zellinien, einschließlich der Zellinien LM159-10 und LM124-3, die endogene c-fos-Gene enthalten und hergestellt und selektiert wurden, um klonierte HM1-Rezeptoren zu exprimieren. Diese erste Serie wurde hergestellt zur Verwendung sowohl als positive als auch als negative Kontrollen in den auf Transkription basierenden Assays. Sie wurden verwendet als positive Kontrollen, weil sie anzeigen, daß der HM1-Rezeptor exprimiert wurde und daß die Aktivierung des exprimierten HM1-Rezeptors zu einer Zunahme an endogener c-fos-RNA führte. Diese Zellinien dienten auch als negative Kontrollen, weil sie das pFC4-Reportergenkonstrukt nicht einschließen und so benutzt wurden, um zu zeigen, daß CAT-mRNA oder -Enzymaktivität in Abwesenheit der pFC4-Reporterkonstrukte nicht detektiert wurde. Die zweite Serie von Kontrollzellinien wurde durch transiente Transfektion von COS-7-Zellen mit pFC4XP1 und durch Co-Transfektion von Ltk^–-Zellen mit pFC4 und TK⁺-DNAs und Selektion auf TK⁺-Klone, hergestellt. Die Ltk^–-Zellen LFC4-3, LFC4-5, LFC4-7, LFC4-8 und LFC4-10 waren unter den selektierten positiven Klonen.
Diese Serien von auf Ltk-Zellen basierenden Zellinien, einschließlich LCF4-3, LCF4-5, LCF4-8 und LCF4-11 und die co-transfizierten COS-7-Zellen exprimieren keine HM1-Rezeptoren, sondern enthalten das Reportergenkonstrukt. Sie wurden deshalb als positive Kontrollen verwendet, um CAT mRNA und Enzymaktivität als Reaktion auf Substanzen, die den c-fos-Promotor vom pFC4-Konstrukt aus aktivieren, nachzuweisen. Die zweite Serien umfasste Zellinien, die auch als negative Kontrollen in den auf Transkription basierenden Assays dienten, weil die CAT mRNA oder Luciferase-Aktivitäten nicht verändert waren, wenn diese Zellen mit HM1-Agonisten oder -Antagonisten in Kontakt gebracht worden waren.
Nicht-transfizierte Ltk^–-Zellen und Ltk^–-Zellen, die mit pThx59 (59-0-Zellen) transfiziert waren, wurden als zusätzliche negative Kontrollen verwendet, um zu zeigen, daß HM1- Antagonisten und Agonisten die c-fos-Expression bei Abwesenheit von HM1-Rezeptoren nicht verändern. PC12-Zellen (ATCC CRL1721 und Michel et al. (1989) Br. J. Pharmacol. 97: 914–920) und SH-SY5Y-Zellen (s. Lambert et al. (1989) Eur. J. Pharmacol. 165: 71–77 und Serra et al. (1988) Neurochem. 50: 1513–1521), die endogene Zelloberflächen-Rezeptoren exprimieren, wurden auch als positive Kontroll-Zellinien in den auf Transkription basierenden Assays verwendet.
Beispiel 3
Die wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellten Zellinien, die für den HM1-Rezeptor kodierende DNA und ein Reportergenkonstrukt umfassen, wurden analysiert, um die Fähigkeit des auf Transkription basierenden Assays zu ermitteln, HM1-Agonisten und -Antagonisten zu detektieren.
Stabil co-transfizierte Ltk^–-Zellen wurden durch Northern-Blot-Hybridisierung, Bindestudien und Phosphatidylinositolphosphat Hydrolyse-Assays und durch den auf Transkription basierenden Assay analysiert.
A. Detektion und Analyse von mRNA-Transkripten von für HM1, c-fos und CAT kodierende DNA
Die Zellinien wurden zuerst auf die Expression von für HM1 kodierende mRNA hin getestet. Gesamt-RNA wurde aus 1 × 10⁷ Zellen isoliert und 10–15 μg jeder RNA wurde auf einem 1%igen Agarose-Formaldehydgel aufgetrennt, gefolgt vom Transfer auf Nitrocellulose. Der Northern-Blot wurde getrennt mit einer oder mehreren der folgenden Proben analysiert: random-primed 1,2 oder 1,4 kb EcoRI-Fragment aus Plasmid pSV2HM1, um HM1-Genexpression zu detektieren; random-primed 788 bp TaqI-Fragment aus Plasmid pCaMVCN (Alton et al. (1979) Nature 282: 864), um CAT-Genexpression zu detektieren; und random-primed 1,1 kb PstI-Fragment aus Plasmid p-fos1 (Curran et al. (1982) J. Virol. 44: 674–682), um c-fos-Expression zu detektieren. Die Filter wurden gegen die Sonden in 50% deionisiertem Formamid, 5 × Denhardt's-Lösung, 5 × SSPE und 100 μg/ml ultraschallbehandelter Heringssperma-DNA bei 42°C hybridisiert und gewaschen in 0,2 × SSPE/0,2% SDS bei 65°C.
Die erwarteten Größen der hybridisierenden Banden auf den Blots sollten ungefähr 3 kb für HM1, ungefähr 2 kb für CAT und ungefähr 2,2 kb für c-fos sein.
B. Kompetitive Bindestudien mit M1-Rezeptor detektierten in den experimentellen Zellinien und in den positiven Kontroll-Zellinien PC12 und SH-SY5Y (s. Beispiel 1) Bindung von HM1-Agonisten und -Antagonisten an HM1-Zelloberflächen-Rezeptoren
Ungefähr 1 × 10⁶ Zellen wurden mit 1,4 nM des Antagonisten [³H]-N-Methyl-Scopolamin (NMS) für 1 Stunde bei 37°C in Abwesenheit oder Anwesenheit verschiedener Konzentrationen von Agonisten, einschließlich Atropin, Pirenzepin, Carbamylcholin und Scopolamin inkubiert. Nicht-gebundener markierter Ligand wurde vom zellgebundenen Marker durch Filtration des Assay-Gemisches durch Whatman GF/C-Filter, die mit Polyethylenimin vorbehandelt worden waren, getrennt. Die Filter wurden mit 4 ml eiskaltem Assay-Puffer (144 mM NaCl; 4,7 mM KCl; 1,7 mM KH₂PO₄; 2,5 mM CaCl₂·2H₂O; 1,1 mM MgCl₂; 10 mM Glucose; 10 mM Tris-HCl) gewaschen, getrocknet und in einem Scintillationszähler analysiert, um den Gehalt an gebundenem ³H-NMS zu ermitteln. Um das Ausmaß an spezifischer Bindung zu bestimmen, wurde der Meßwert (Counts) für die gebundene Form in der Gegenwart von Atropin subtrahiert vom Meßwert (Counts) für die gebundene Form in Abwesenheit von Atropin.
Die Ergebnisse dieser kompetitiven Bindeexperimente führten zu folgenden IC₅₀-Werten für die Verdrängung von spezifisch gebundenem ³H-NMS:
Tabelle I
Diese Ergebnisse sind in enger Übereinstimmung mit den von Michel et al. ((1989) Br. J. Pharmacol. 97: 914–920) im Hinblick auf die muskarinische Pharmakologie von PC12-Zellen veröffentlichten Ergebnissen. Außerdem exprimierten Zellinien, die durch Transfektion mit für HM1 kodierender DNA, LM159-10 und LM124-3, oder mit für HM1-kodierender DNA und den c-fos-CAT-DNA-Konstrukten hergestellt wurden, HM1-Rezeptoren, die die erwarteten pharmakologischen Eigenschaften aufwiesen.
C. Phosphatidylinositol (PI)-Hydrolyse-Assay
Das Protokoll, dem hier gefolgt wurde, war eine Modifikation von dem in Sevva et al. (1986) Biochem. Biophys. Res. Comm. 140: 160–166 und Peralta et al. (1988) Nature 334: 434–437 beschriebenen. In Kürze umfasst der funktionale Assay die Markierung der Zellen mit ³H-myo-Inositol für 48 oder mehr Stunden, weil die Aktivierung des M1-muskarinischen Rezeptors durch einen Agonisten zur Aktivierung der Phospahtidylinositol(PI)-Hydrolysekaskade führt. Die markierten Zellen werden mit dem muskarinischen Agonisten Carbamylcholin (CCh), in Anwesenheit und Abwesenheit des muskarinischen Antagonisten, für 1 Stunde behandelt. Die behandelten Zellen werden lysiert und in Chloroform-Methanol-Wasser extrahiert, wonach die Inositolphosphate durch Ionenaustauschchromatographie aufgetrennt und durch Scintillationszählung quantifiziert wurden.
Positive Kontrollzellen SH-SY5Y- und PC12-Zellen, negative Kontrollzellen, die 59-0-Zellinie, und die rekombinanten experimentellen Zellen LM159-10, LM124-3, LM1FC4-8 und LM1FC4-15 wurden in 12-Well Platten(Costar) in einer Dichte von 5 × 10⁵ Zellen/Well und für 65–70 Stunden markiert mit ³H-myo-Inositol (3 μCi/Well). Das Medium wurde dekantiert und die Wells mit 1 ml 2 × PI-Assay-Puffer (10 mM Hepes; 0,5 mM CaCl₂; 1 mM MgCl₂; 10 mM LiCl in 500 ml DMEM) gewaschen. Die Zellen wurden in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Agonisten inkubiert, oder wurden inkubiert mit Agonist in Gegenwart verschiedener Konzentrationen von Antagonisten, bei 37°C für 60 Minuten. Nach der Inkubation wurden die Zellen lysiert und die Suspension mit 3 ml CHCl₃/MeOH (1 : 1) extrahiert. Nach Zentrifugation (3200 Upm für 5 min) wurde die obere wäßrige Phase entfernt und mit 2 ml H₂O verdünnt und wiederum zentrifugiert. Die Überstände wurden auf Säulen geladen, die 1 ml Dowex^® 1X8 AG-Harz, das vorher mit 5 mM myo-Inositol äquilibiriert wurde, enthielten und mit 9 ml 5 mM myo-Inositol, und danach mit 8 ml 60 mM Natriumformiat, 5 mM Natriumborat gewaschen wurde. Alle Inositolphosphate (IP1, IP2, IP3) wurden mit 6 ml 0,1 M Ameisensäure, 1 M Ammoniumformiat zusammen eluiert. 3 ml der Eluate wurden abgenommen und mit 20 ml Scintillationsflüssigkeit zur Analyse gezählt.
Der Stimulationsfaktor wurde durch Berechnung des Verhältnisses der Cpm (Signale (Counts) pro Minute) in Gegenwart des Agonisten zu den Cpm in Gegenwart der Puffer-Kontrolle bestimmt.
EC₅₀-Werte für die Agonist-Stimulierung der PI-Hydrolyse wurden bestimmt durch Messung der PI-Hydrolyse bei verschiedenen Konzentrationen des Agonisten. Die nur in Gegenwart des Puffers gemessenen Cpm wurden subtrahiert von den Cpm, die in Anwesenheit des Agonisten gemessen wurden, um den Grad an PI-Hydrolyse zu erhalten, der sich aus der Bindung des Agonisten ergibt. Der maximale Gehalt an hydrolysiertem PI, die maximale Antwort wurde für jeden Agonisten festgestellt und der Prozentwert an maximaler Antwort gegen die Konzentration des Agonisten wurde aufgetragen und der EC₅₀-Wert aus dem Graphen bestimmt.
IC₅₀-Werte für die Inhibition der Agonist-Stimulierung der PI-Hydrolyse durch Antagonisten wurden durch Messung des spezifischen Wertes der PI-Hydrolyse in Gegenwart einer konstanten Konzentration von Agonist und verschiedener Konzentrationen von Antagonist bestimmt. Für jede Konzentration von Antagonist wurde der Prozentwert der maximalen Antwort in Abwesenheit von Antagonist als eine Funktion der Antagonist-Konzentration aufgetragen, woraus die IC₅₀-Werte bestimmt wurden.
Wie in den Rezeptor-Bindeassays wurden SH-SY5Y-(Serra et al. (1988) Neurochem 50: 1513–1521) und PC12-Zellen (Horowitz, J., J. Neurochem. 53: 197–204 (1989) als positive Kontrollsysteme zur Aktivierung des PI-Hydrolyse-Weges durch muskarinische Agonisten und Hemmung der Stimulierung durch muskarinische Antagonisten verwendet. In der positiven Kontroll-Zellinie SH-SY5Y ergab die Behandlung mit 1 mM Carbamylcholin eine ungefähr 50-fache Stimulierung der Inositolphosphat- Akkumulation, die durch 100 nM Atropin blockiert wurde. In den PC12-Zellen führte die Behandlung mit 1 mM Carbamylcholin zu einer 27-fachen Aktivierung. Die negative Kontroll-Zellinie, 59-0-Zellen, antwortete nicht auf die Carbamylcholin-Behandlung, während die Zellen, die mit der M1-cDNA transfiziert worden waren, verschiedene Grade an Stimulierung durch Carbamylcholin zeigten. Die mit 1 mM Carbamylcholin beobachtete Stimulierung wird unten für die positive Kontrolle und transfizierte Zellinien zusammengefasst.
Tabelle II
Die pharmakologischen Eigenschaften der transfizierten Zellinien LM124-3, LM159-10, LM1FC4-8 und LM1FC4-15-Zellen und die SH-SY5Y und PC12-Zellen wurden durch Untersuchung der Dosis-abhängigen Hemmung der Carbamylcholin-stimulierten Inositolphosphat-Akkumulation durch die muskarinischen Antagonisten Atropin, Pirenzepin und Scopolamin charakterisiert. Die für die Antagonisten erhaltenen IC₅₀-Werte sind unten tabellarisch dargestellt: Tabelle III

n. b.: nicht bestimmt

D. Der auf Transkription basierende Assay
1. Die Ltk-Zellen, die mit für den HM1-Rezeptor kodierender DNA und dem c-fos-Promotor-CAT-Reportergen-Konstrukt stabil co-tansfiziert waren, exprimierten HM1-Rezeptoren und detektierbare CAT-Gen-mRNA und CAT-Aktivität, wenn sie mit dem M1-Antagonisten Carbachol bei 100 μM behandelt wurden
Die stabil co-transfizierten Ltk^–-Zellen und Kontrollzellen wurden auf 70–80% Konfluenz in einem 0,5% Serum enthaltenden Medium für zwei Tage vor dem Assay angezogen. Dieser Serum-Entzugsschritt vermindert die Hintergrundwerte der c-fos-Promotor-Transkription. Für jeden zu testenden Zelltyp wurden Gruppen von drei Platten von Zellen gleich behandelt. Die verschiedenen Behandlungweisen umschlossen: Behandlung mit 100–500 μM Carbachol für 15–45 min, Behandlung mit 20% Serum für 15–45 min, keine Behandlung, aber Verwirbeln wie bei den anderen und Behandlung mit 10 μM Atropin für 5 min vor der Behandlung mit Carbachol. Eine Platte in jeder Gruppe wurde für 30–60 min bei 37°C inkubiert und dann verwendet, um Gesamt-RNA für Northern-Blots zu isolieren (s. Beispiel 3.A.). Die anderen beiden Platten wurden für 5 Stunden bei 37°C inkubiert und dann auf CAT-Aktivität hin getestet.
a. CAT-Assay zur Bestimmung der Reportergen-Induktion
Proteinlysate wurden durch Waschen der Platten mit Phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und anschließender Lyse der Zellen auf der Platte in 500 μl 0,25 M Tris-HCl pH 7,8; 1% Triton X-100, hergestellt. Das Lysat wurde in ein Eppendorf-Gefäß übertragen und dann bei 65°C für 10 min inkubiert. Nach Zentrifugieren des Gefäßes für 5 min in einer Mikrofuge bei 4°C wurde der Überstand in neue Gefäße übertragen und bei –20°C bis zur Verwendung im CAT-Assay eingefroren.
Nach dem Auftauen wurden die Lysate doppelt auf Protein getestet, 150 μl Zellysat wurde im CAT-Assay eingesetzt. 90 μl dH₂O; 0,5 μl 500 mM Chloramphenicol und 10 μl ¹⁴C-Acetyl CoA oder ³H-Acetyl CoA wurden zum Lysat zugegeben, um die Reaktion zu starten, die für 1–4 Stunden bei 37°C inkubiert wurde. Die Reaktion wurde auf Eis gestoppt und 300 μl kaltes Ethylacetat wurde zugegeben. Die Gefäße wurden geschüttelt, in einer Mirkofuge für 1 min abzentrifugiert und 200 μl der organischen Phase wurden in ein Glas-Scintillations-Gefäß übertragen. Die 300 μl Ethylacetat-Extraktion wurde wiederholt und die organischen Extrakte wurden mit 5 ml Econofluor-Scintillationsmessungslösung vereinigt. Die Radioaktivität wurde in einem Scintillationszähler bestimmt.
b. Northern-Analyse
Die RNA wurde auf die Gegenwart von c-fos- und CAT-RNA hin untersucht wie in Beispiel 3.A. beschrieben. CAT-spezifische RNA der erwarteten Größe wurde detektiert.
c. Expression von CAT-mRNA wurde in Zellen, die HM1-Rezeptoren exprimieren, induziert und blockiert durch den M1-Antagonisten Atropin
Die Ltk^–-Zellinien, einschließlich LM159-10 und LM124-3, die mit Plasmiden, die das HM1-Gen tragen; transfiziert worden waren, wurden nach Behandlung mit dem cholinergen Agonisten Carbachol oder Carbachol und Atropin, einem muskarinischen Antagonisten, auf Expression endogener c-fos-RNA hin analysiert. Wenn funktionale HM1-Rezeptoren auf der Oberfläche der Zellen anwesend sind, sollte das Carbachol mit dem Rezeptor wechselwirken, was zu erhöhten Konzentrationen von Ca²⁺ und cAMP führt, wodurch das endogene c-fos-Gen-Transkriptions-Kontrollelement aktiviert wird, so daß das c-fos-Gen in stärkerem Maße transkribiert werden sollte, was auf RNA-Ebene durch eine Induktion endogener c-fos-RNA detektierbar sein sollte. Außerdem sollte die M1-Agonisten-vermittelte Induktion von c-fos durch M1-Antagonisten blockiert werden.
Wie in der Tabelle unten gezeigt, werden diese Ergebnisse in den Zellinien LM159-10 und LM124-3 erhalten, was anzeigt, daß sie HM1-Rezeptoren, die mit einem funktionalen c-fos-Induktionsweg gekoppelt sind, exprimieren.
Tabelle IV c-fos mRNA Induktion
In mit dem HM1-Vektor plus dem c-fos-CAT-Markerplasmid transfizierten Zellen, z. B. LM1FC4-8 und LM1FC4-15, zeigen Zellen, die funktionalen HM1-Rezeptor exprimieren, gleichfalls eine Zunahme in c-fos-mRNA nach Wechselwirkung mit einem HM1-Agonisten. Diese Zellen jedoch sollten auch eine Zunahme der CAT-spezifischen RNA und Enzymaktivität zeigen, aufgrund der Aktivierung des c-fos-CAT-Expressionskonstruktes. Nach Behandlung der Zellinie LM1FC4-15 mit dem HM1-Antagonisten Carbachol und mit dem allgemeinen c-fos-Expressionsinduktor 20% Serum wurden Zunahmen der c-fos-mRNA und CAT-mRNA detektiert.
Tabelle V
2. COS-7-Zellen, die transient mit HM1-Rezeptor DNA und Reportergen-Konstrukten co-transfiziert waren, exprimierten funktionale HM1-Rezeptoren und zeigten erhöhte Reportergenexpression
a. COS-7-Zellen, transient co-tranfiziert mit HM1-Rezeptor-DNA und pFC4XP1
Vierundzwanzig bis 48 Stunden nach der transienten Co-Transfektion von COS-7-Zellen mit der HM1-Rezeptor-DNA, dem c-fos-Promotor-Luciferase-Reportergenkonstrukt (pFC4XP1) und dem β-Galaktosidasegen (pCH110), wurden die Transfektanden mit 500 μM Carbamylcholin in Kontakt gebracht oder blieben für 5 Stunden ohne Behandlung. Drei bis fünf Stunden nach der Behandlung wurden die Zellen lysiert und auf Luciferase (s. Brasier et al. (1989) Biotechniques 7: 1116–11223), β-Galaktosidase (Miller (1972) „Experiments in Molecular Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY) und die Proteinkonzentration (Biorad; Bradford (1976) Analytical Biochemistry 72: 248) hin analysiert. Die Konzentrationen an β-Galaktosidase und Protein wurden verwendet, um die Luciferasekonzentrationen nach Tranfektionseffizienz und Proteingehalt pro Platte zu normalisieren. Normalisierte Luciferase = Luciferase-Aktivität/ΔA420 (β-Galaktosidase-Aktivität)/μg Protein/μl, wobei die für Luciferase und β-Galaktosidase verwendeten Volumina für alle Lysate gleich sind. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI gezeigt.
Diese Ergebnisse zeigen, daß die Luciferase-Aktivitäten von COS-7-Zellen, die mit der HM1-Rezeptor DNA und dem c-fos-Promotor-Luciferase-Gen co-transfiziert und mit 500 μM Carbamylcholin in Kontakt gebracht worden waren, 10fach höher waren, als die der unbehandelten Transfektanden. Die Luciferase-Aktivitäten von COS-7-Zellen, die mit pFC4XP1 transfiziert worden waren, worden durch Carbamylcholin nicht beeinflusst. Diese Daten bestätigen, daß die Luciferase-Induktionen in diesen Zellen spezifisch für die Expression des HM1-Rezeptors waren.
Der auf Transkription basierende Assay wurde auch verwendet, um Dosis-Antwort-Graphen für den muskarinischen Acetylcholinrezeptor-Agonisten und -Antagonisten zu erzeugen. Vierzehn 10-cm Platten mit COS-7-Zellen wurden nach dem Calziumphosphatprotokoll (s. Beispiel I. F.) mit HM1pSV2dHFR, pFC4XP1 und pCH110 transient co-transfiziert. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden Duplikat-Platten für 5 Stunden vor der Lyse der Zellen mit 0; 0,01; 0,10; 1,0; 10; 100 oder 1000 μM Carbamylcholin behandelt und auf Carbamylcholin-induzierte Luciferase-Aktivität getestet. Dosis-Antwort-Verhalten der Luciferase-Induktion wurde in einem Bereich von 1 bis 1000 μM Carbamylcholin beobachtet.
Aus diesen Daten wurde ein ungefährer EC₅₀ Wert (6 μM) berechnet. Dieser EC₅₀-Wert korreliert mit veröffentlichten EC₅₀-Werten für die Carbamylcholin-Induktion der PI-Hydrolyse in HEK 293-Zellen, die mit dem HM1-Rezeptorgen transfiziert worden waren (s. Peralta et al., (1988), Nature 334: 434–437).
Graphen für die Dosis-Antwort der Atropin-Hemmung der Carbamylcholin-induzierten Luciferase-Aktivitäten in co-transfizierten COS-7-Zellen wurden auch mit Hilfe des auf Transkription basierenden Assays erzeugt. Für diese Experimente wurden 16 10-cm Platten mit COS-7-Zellen nach dem Calziumphosphat-Protokoll mit pCH110, HM1pSV2dHFR und pFC4XP1 co-transfiziert. Achtundvierzig Stunden nach Transfektion wurden Duplikat-Platten mit Zellen für 5 Minuten in 0; 0,01; 0,1; 1,0; 10; 100; 1.000 oder 10.000 nM Atropin in STBS (Tris-gepufferte Salzlösung) inkubiert, bevor 500 μM Carbamylcholin zu den Platten gegeben wurden. Nach 5 Minuten Inkubation der Zellen in Anwesenheit von Carbamylcholin und Atropin wurden die Stoffe von den Zellen entfernt und durch konditionierte Medien ersetzt. Fünf Stunden nach der Zugabe von Carbamylcholin wurden Zellysate hergestellt und auf β-Galaktosidase- und Luciferase-Aktivitäten und Gesamt-Protein-Konzentration hin analysiert.
Atropin hemmte die Carbamylcholin-induzierten Aktivitäten von Luciferase in einer Dosis-abhängigen Weise in einem Konzentrationsbereich von 10–10.000 nM. Weil die Hemmung der Carbamylcholin-induzierten Luciferase-Aktivität in Gegenwart von 10.000 nM Atropin in diesem Experiment vollständig war (d. h. die Luciferase-Aktivität in mit 500 μM Carbamylcholin und 10.000 nM Atropin behandelten Zellen war gleich zu dem von Zellen, die nicht mit Carbamylcholin behandelt worden waren), konnte aus diesen Daten ein IC₅₀-Wert von 80 mM für die Atropin-Hemmung berechnet werden. Dieser IC₅₀-Wert liegt im in Assays der Atropin-Hemmung der Carbamylcholininduzierten PI-Hydrolyse in mit dem HM1-Rezeptorgen transfizierten Ltk^–-Zellen, bestimmten Bereich.
b. COS-7-Zellen, die mit einem Plasmid, das die für HM1-Rezeptor-DNA kodierende DNA und mit einem Plasmid, das das Somatostatin-Promotor-CAT-Genkonstrukt enthält, transient co-transfiziert worden waren
COS-7-Zellen wurden mit dem Somatostatin-Promotor-CAT-Gen(pΔ-71) und der HM1-Rezeptor-DNA unter Verwendung der Calziumphosphat-Methode transient co-transfiziert. Achtundvierzg Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen entweder mit 0,500–1 μM Carbamylcholin für 5 Stunden behandelt oder sie blieben unbehandelt. Nach der Inkubation wurden die Zellen wie in Beispiel 3.D. beschrieben, auf CAT-Aktivität hin getestet. Nicht-transfizierte, unbehandelte COS-7-Kontrollzellen zeigten einen hohen Hintergrund an CAT-Aktivität. Die CAT-Aktivitäten der transfizierten COS-7-Zellen, die dem Carbamylcholin nicht ausgesetzt worden waren, waren denen der Kontrollzellen gleich. Die CAT-Aktivitäten der Carbamylcholin-behandelten, transfizierten COS-7-Zellen waren ungefähr 1,7-fach höher als die der unbehandelten, transfizierten Zellen.
c. PC12-Zellen, die mit der HM1-Rezeptor-DNA und dem c-fos-Promotor-Luciferasegen transient co-transfiziert sind
PC12-Zellen wurden mit 0,5 μg pFC4XP1 unter Verwendung der Calziumphosphatfällungs-Methode transient transfiziert. Achtundvierzg Stunden nach der Transfektion wurden die Zellen entweder mit 500 μM Carbamylcholin für 5 Stunden behandelt oder sie blieben unbehandelt. Zellysate wurden wie in Beispiel 3.D. (s. Brasier et al. (1989) Biotechniques 7: 1116–1122), beschrieben hergestellt und auf Luciferase-Aktivität hin getestet. Die Ergebnisse dieser Assays zeigten, daß die Luciferase-Aktivität der Carbamylcholin-behandelten Zellen 30-fach höher war, als die Luciferase-Aktivität der unbehandelten Zellen.
d. PC12-Zellen, die mit für HM1-Rezeptoren kodierende DNA und mit Plasmiden, die c-fos-Luciferase-Reportergenkonstrukte, die verschiedene Anteile der c-fos-Promotorregion co-transfiziert sind
Lamb et al. ((1990) Cell 61: 485–496) zeigten, daß die FIRE-Sequenz, wenn sie in den kodierenden Bereich eines c-fos-Promotor-β-Galaktosidase-Fusionsgens inseriert wurde, konstitutive oder nicht-induzierte Anteile der c-fos-Promotor-regulierten β-gal- Transkription vermindert. Deshalb sollten Zellen, die mit einem c-fos-Promotor (pFC4-Fragment)-Luciferase-Genkonstrukt, das die FIRE-Sequenz umfasst, transfiziert wurden, geringere Grade an konstitutiv exprimierten, nicht-induzierten Luciferase-Aktivitäten (Hintergrundrauschen) aufweisen als Zellen, die mit einem c-fos-Promotor-Luciferase-Genkonstrukt, dem die FIRE-Sequenz fehlt, transfiziert wurden. Geringere Hintergrund-Luciferase-Aktivitäten sollten deshalb höhere, in Luciferase-Induktions-Assays der Reportergen-transfizierten Zellen erzeugte, Signal-zu-Rauschen-Verhältnisse ergeben (z. B. das Verhältnis der Luciferase-Aktivitäten von Carbamylcholinbehandelten und nicht-behandelten Zellen).
PC12-Zellen wurden verwendet, um die Carbachol-Induktion der drei c-fos-Promotor-Luciferase-Genkonstrukte pFC4X2FIRE, pFC1XP2, das ein 2200 bp-c-fos-Fragment von c-fos umfasst und pFC7XP2, das ein 350 bp-Fragment des c-fos-Promotors umfasst, zu analysieren. Zu Vergleichszwecken wurden PC12-Zellen auch mit pFC4XP2 transfiziert, einem Plasmid, das ein Reportergen-Fusionsgen, bestehend aus dem 500 bp-Fragment des c-fos-Promotors aus pFC4 und der kodierenden Sequenz des Luciferasegens, enthielt.
Die Signal-zu-Rauschen-Verhältnisse der Luciferase-Aktivitäten von Carbachol-behandelten gegen nicht-behandelte PC12-Zellen, die mit den drei alternativen c-fos-Promotor-Luciferasegen-Plasmide und dem nicht-modifizierten c-fos-Promotor-Luciferasekonstrukt pFC4XP2 transfiziert worden waren, wurden gemessen. Carbachol-induzierte Luciferae-Aktivitäten von PC12-Zellen, die mit dem nicht-modifizierten Reportergenkonstrukt pFC4XP2 und dem die FIRE-Sequenz enthaltenden Reporter-Fusionsgenkonstrukt (pFC4XP2FIRE) transfiziert worden waren, waren jeweils ungefähr 12- und 17-fach höher als die Hintergrund-Luciferase-Aktivitäten nicht-behandelter Zellen. Die Luciferase-Aktivitäten von Carbachol-behandelten PC12-Zellen, die mit Reportergenkonstrukten, die größere (pFC1XP2) und kleinere (pFC7XP2)c-fos-Promotor-Fragmente enthielten, transfiziert worden waren, waren jeweils 14- und 11-fach höher als die Hintergrund-Luciferase-Aktivitäten.
Da eine Verbesserung in der Carbachol-Induktion der Luciferase-Aktivität in PC12-Zellen, die mit dem die FIRE-Sequenz-enthaltenden c-fos-Promotor-Luciferase- Genkonstrukt pFC4XP2FIRE transfiziert waren, erreicht worden war, sollte es möglich sein, eine verbesserte Induktion und höhere Signal-zu-Rauschen-Verhältnisse durch Veränderung des Konstruktes und Optimierung der Lokalisation der FIRE-Sequenz im Konstrukt im Hinblick auf diese Parameter zu erreichen. Das Signal-zu-Rauschen-Verhältnis, also die Sensitivität und Sicherheit des Assays sollte sich verbessern, wenn PC12, COS-7 oder andere Zellen mit diesen Plasmiden transfiziert und in dem auf Transkription basierenden Assay verwendet werden.
Insbesondere wird erwartet, daß Konstrukte, in denen die Position der FIRE-Sequenz ihrer Position im c-fos-Gen besser entspricht, verbesserte Grade an Induktion und Signal-zu-Rauschen-Verhältnisse ergeben. Z. B. sollten Konstrukte, die eine Reportergenfusion enthalten, die mindestens das erste Exon des c-fos-Gens, einschließlich der FIRE-Sequenz, umfasst, ein relativ hohes Signal-zu-Rauschen-Verhältnis nach Induktion der c-fos-Promotor-Region aufweisen. Eine Serie von Konstrukten, die verschiedene Anteile des c-fos-Gens enthält, kann konstruiert und an ein Reportergen fusioniert werden und in operativer Weise mit dem c-fos-Promotor verbunden werden. COS-7-, PC12-Zellen und andere passenden Zellen können in entsprechender Weise transfiziert und der Grad an Induktion des Reportergens gemessen werden. Jedes andere Reportergen, das als Reportergen arbeitet, wie z. B. das Gen für β-Galaktosidase, kann benutzt werden, wenn es an einen Teil des c-fos-Promotors fusioniert ist.
Da Veränderungen den Fachleuten auf dem Gebiet offenkundig sind, ist es beabsichtigt, daß diese Erfindung nur auf den Schutzumfang der angehängten Ansprüche beschränkt ist. Verschiedene Merkmale der Erfindung werden auch in den folgenden Ansprüchen beschrieben.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Untersuchung von Testsubstanzen, um die agonistische oder antagonistische Aktivität dieser Substanzen im Hinblick auf einen Zelloberflächen G-Protein-gekoppelten Rezeptor zu ermitteln, welches die folgenden Schritte umfasst: a) in Kontakt bringen einer eukaryontischen Zelle, die einen heterologen G-Protein-gekoppelten Rezeptor, der von einem heterologen Gen exprimiert wird und ein heterologes Reportergen-Konstrukt umfasst, mit der Substanz, worin das Reportergenkonstrukt ein Reportergen unter der Kontrolle mindestens eines Transkriptionskontrollelementes umfasst, das responsiv ist gegenüber einem intrazellulären Zustand, der eintritt, wenn der Rezeptor mit der Substanz wechselwirkt; und b) Messung des Grads an Transkription oder Translation des Reportergens.
Verfahren nach Anspruch 1, weiter umfassend: Vergleichen des Unterschieds des Grads an Transkription oder Translation eines Reportergens in einer eukaryontischen Zelle in Gegenwart der Testsubstanz mit dem Grad an Transkription oder Translation in Abwesenheit der Substanz oder mit dem Grad an Transkription in Abwesenheit des G-Protein-gekoppelten Rezeptors, wobei Testsubstanzen identifiziert werden, welche die rezeptorvermittelte Aktivität modulieren.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin das Reportergenkonstrukt eine Transkriptionsregulationssequenz umfasst, die das intragene regulatorische Element des c-fos Gens ist, wobei die Höhe der Transkription des Reportergens in Abwesenheit des Zelloberflächenrezeptors oder der Testsubstanz niedriger ist als bei Abwesenheit des intragenen Regulationselements.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der G-Protein-gekoppelte Rezeptor ausgewählt ist aus muskarinischen Rezeptoren, adrenergen Rezeptoren, Dopamin-Rezeptoren und Serotonin-Rezeptoren.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Transkriptionskontrollelement einen Promotor umfasst, ausgewählt aus: dem c-fos-Gen-Promotor, dem Promotor des Gens für das Vasoaktive Darmpeptid, dem Somatostatin-Gen-Promotor, dem Proenkephalin-Gen-Promotor, dem Phosphoenolpyruvat-Carboxykinase-Gen-Promotor oder dem Nervenwachstumsfaktor-1A-Gen-Promotor.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Reportergen ausgewählt ist aus dem Gen kodierend für bakterielle Chloramphenicol-Acetyltransferase, dem Gen kodierend für Glühwürmchen-Luciferase, dem Gen kodierend für β-Galaktosidase oder dem Gen kodierend für Alkalische Phosphatase.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin das Reportergenkonstrukt mindestens eine Transkriptionsregulations-Nukleotidsequenz enthält, ausgewählt aus serumresponsiven Elementen, cyclischen Adenosinmonophosphat-responsiven Elementen und responsiven Elementen gegenüber intrazellulären Calziumionenwerten.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, worin der Grad an Transkription ermittelt wird durch die Messung der Menge an mRNA, die von dem Reportergen transkribiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin der Grad an Transkription oder Translation durch die Messung der Menge an produziertem Reportergenprotein gemessen wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die Testsubstanz ein Antagonist ist.
Verfahren nach Anspruch 10, weiter umfassend, dass die eukaryontische Zelle mit einem Agonisten, der den G-Protein-gekoppelten Rezeptor aktiviert, in Kontakt gebracht wird, wodurch Transkription des Rezeptorgens induziert wird, bevor der Unterschied im Grad an Transkription oder Translation des Reportergens verglichen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Untersuchung ein Screeing einer großen Anzahl möglicherweise pharmazeutisch wirksamer Substanzen ist.