DE69206876T3

DE69206876T3 - Nukleosidanalogen enthaltende Antiviren-Zubereitungen

Info

Publication number: DE69206876T3
Application number: DE69206876T
Authority: DE
Inventors: Janet Mary Glaxo Group Research Limited Greenford Cameron; Nicholas Glaxo Group Research Limited Greenford Cammack
Original assignee: Glaxo Group Ltd
Current assignee: Glaxo Group Ltd
Priority date: 1991-05-16
Filing date: 1992-05-11
Publication date: 2004-08-12
Anticipated expiration: 2012-05-12
Also published as: CZ242893A3; DK0513917T3; AU661307B2; DE69206876D1; JP2868671B2; LU90234I2; CN1045961C; ES2083668T3; AU1627992A; JPH06234641A; CZ285232B6; IE73261B1; AU1787492A; DE69206876T2; IL101883A; EP0513917B1; IL101883A0; GR3018915T3; SK119993A3; NZ299240A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Kombination des 1,3-Oxathiolan-Nukleosidanalogons 3TC mit AZT.
Das Humanimmundefizienzvirus (HIV) verursacht eine Anzahl klinischer Zustände, einschliesslich des erworbenen Immundefizienzsyndroms (AIDS) und chronischer neurologischer Störungen. Nukleoside wie AZT, ddC und ddI hemmen die HIV-Vermehrung in vitro und scheinen ihre antivirale Aktivität auf das viruskodierte reverse Transkriptaseenzym nach Metabolismus durch die Zelle zu ihren 5'-Triphosphatderivaten auszuüben.
AZT reduziert die Morbidität und Sterblichkeit in Patienten mit AIDS. Jedoch resultiert eine HIV-Infektion von Zellen in der Aufnahme des Virusgenoms in das Wirtschromosom, und daher war es notwendig, die AZT-Behandlung für lange Zeiträume fortzusetzen. Die Konsequenzen einer Langzeit-AZT-Therapie sind mit Knochenmarkstoxizität und dem Auftreten von AZT-resistenten Varianten von HIV-1 verbunden. In ähnlicher Weise entwickeln einige mit ddC behandelte AIDS-Patienten periphere Neuropathie, und es hat sich gezeigt, dass ddI Pankreatitis und periphere Neuropathie induziert.
Die Verwendung von Kombinationen von Verbindungen kann zu einer äquivalenten antiviralen Wirkung mit reduzierter Toxizität oder einer Zunahme in der Arzneistoffwirksamkeit führen, falls ein Synergismus zwischen den Verbindungen auftritt. Geringere Gesamtarzneistoffdosen werden möglicherweise ebenfalls die Häufigkeit des Auftretens von arzneistoffresistenten Varianten von HIV reduzieren. Viele unterschiedliche Methoden wurden verwendet, um die Wirkungen von Kombinationen von Verbindungen zu untersuchen, die zusammenwirken in unterschiedlichen Untersuchungssystemen. Alle diese Methoden weisen Einschränkungen auf, und z. B. wurden einige Methoden auf andere Systeme angewendet, als auf diejenigen, für die sie abgeleitet wurden. AZT zeigt eine synergistische antivirale Aktivität in vitro in Kombination mit Mitteln, die in anderen HIV-1-Vervielfältigungsschritten als der reversen Transkription wirken, einschliesslich von rekombinantem löslichem CD4-Castanospermin und rekombinantem Interferon-α. Jedoch muss angemerkt werden, dass Kombinationen von Verbindungen zu erhöhter Cyto toxizität führen können. AZT und rekombinantes Interferon-α besitzen eine erhöhte cytotoxische Wirkung auf normale menschliche Knochenmarksstammzellen.
Kombinationen von AZT mit anderen Nukleosiden wurden ebenfalls untersucht. ddC räumt die Knochenmarkscytotoxizität von hochdosiertem AZT aus, ohne seine antivirale Aktivität zu beeinflussen. ddI und AZT zeigen etwas erhöhte Selektivität in Kombination durch einen synergistischen antiviralen Effekt, der über einer additiven Toxizität gegen normale menschliche Knochenmarksstammzellen wirkt.
Von der Verbindung der Formel (I)
die ebenfalls als BCH-189 oder NGPB-21 bekannt ist, wurde beschrieben, dass sie eine antivirale Aktivität insbesondere gegen Humanimmundefizienzviren (HIVs) hat, den Erregern von AIDS (5. Anti-Aids Konferenz, Montreal, Kanada, 5.–9. Juni 1989: Zusammenfassungen T.C.O.1 und M.C.P.63: EP-A-0 382 526). Die Verbindung der Formel (I) ist eine racemische Mischung der zwei Enantiomere der Formeln (I-1) und (I-2):
Obwohl die Enantiomere der Verbindung der Formel (I) äquipotent gegen HIV sind, hat eines der Enantiomeren (das (–)-Enantiomer) eine beträchtlich niedrigere Cytotoxizität als das (+)-Enantiomer.
Das (–)-Enantiomer hat den chemischen Namen (–)-cis-4-Amino-1-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-(1H)-pyrimidin-2-on. Es hat die absolute Stereochemie der Verbindung der Formel (I-1), die den Naben (2R,cis)-4-Amino-1-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-(1H)-pyrimidin-2-on hat. Diese Verbindung ist jetzt als 3TC bekannt.
Wir haben jetzt gefunden, dass die Verbindung der Formel (I) und insbesondere ihr (–)-Enantiomer unerwartete Vorteile ausübt, wenn sie in Kombination mit bekannten Inhibitoren für die HIV-Vervielfältigung verwendet wird. Insbesondere die Verbindung der Formel (I) zeigt eine synergistische antivirale Wirkung und/oder eine Reduktion in der Cytotoxizität, wenn sie in Kombination mit AZT verwendet wird.
Daher wird in einem ersten Aspekt der Erfindung eine Kombination bereitgestellt, die die Verbindung der Formel (I) in Form ihres (–)-Enantiomers (3TC) oder ein pharmazeutisch akzeptables Derivat davon und 3'-Azido-3'-desoxythymidin (AZT, Zidovudin) oder ein pharmazeutisch akzeptables Derivat davon umfasst.
Die Verbindung der Formel (I) wird in Form des (–)-Enantiomers bereitgestellt, das im wesentlichen frei vom entsprechenden (+)-Enantiomer ist, d. h. nicht mehr als 5% G/G des (+)-Enantiomers, bevorzugt nicht mehr als ca. 2%, insbesondere weniger als ca. 1% G/G, werden vorliegen.
Mit "ein pharmazeutisch akzeptables Derivat" ist jedes pharmazeutisch akzeptable Salz, Ester oder Salz eines solchen Esters einer Stammverbindung oder jede andere Verbindung gemeint, die bei Verabreichung an den Empfänger fähig ist, (direkt oder indirekt) die Stammverbindung oder einen antiviral aktiven Metaboliten oder Rest davon bereitzustellen.
Es wird für die Fachleute ersichtlich sein, dass die Verbindung der Formel (I-1) modifiziert werden kann, um pharmazeutisch akzeptable Derivate davon bereitzustellen, an funktionellen Gruppen sowohl in der Basiseinheit als auch in der Hydroxymethylgruppe des Oxathiolanrings. Eine Modifikation aller solcher funktioneller Gruppen ist im Erfindungsumfang eingeschlossen. Jedoch sind pharmazeutisch akzeptable Derivate von besonderem Interesse, die durch Modifikation der 2-Hydroxymethylgruppe des Oxathiolanrings erhalten werden.
Bevorzugte Ester der Verbindung der Formel (I-1) schliessen die Verbindungen ein, in denen der Wasserstoff der 2-Hydroxymethylgruppe durch eine Acylfunktion
ersetzt ist, worin die Nicht-Carbonyleinheit R des Esters ausgewählt ist aus Wasserstoff, linearem oder verzweigtkettigem Alkyl (z. B. Methyl, Ethyl, n-Propyl, t-Butyl, n-Butyl), Alkoxyalkyl (z. B. Methoxymethyl), Aralkyl (z. B. Benzyl), Aryloxyalkyl (z. B. Phenoxymethyl), Aryl (z. B. Phenyl, gegebenenfalls substituiert mit Halogen, C_1-4-Alkyl oder C_1-4-Alkoxy); Sulfonatestern wie Alkyl- oder Aralkylsulfonyl (z. B. Methansulfonyl); Aminosäureestern (z. B. L-Valyl oder L-Isoleucyl) und Mono-, Di- oder Triphosphatestern.
Bezüglich der oben beschriebenen Ester enthält jede vorhandene Alkyleinheit in vorteilhafter Weise, wenn nicht anders angegeben, 1 bis 16 Kohlenstoffatome, insbesondere 1 bis 4 Kohlenstoffatome. Jede vorhandene Aryleinheit in solchen Estern umfasst vorteilhafterweise eine Phenylgruppe.
Insbesondere können die Ester ein C_1-16-Alkylester, ein unsubstituierter Benzylester oder ein Benzylester sein, der mit wenigstens einem Halogen (Brom, Chlor, Fluor oder Iod), C_1-6-Alkyl, C_1-6-Alkoxy, Nitro oder Trifluormethylgruppen substituiert ist.
Pharmazeutisch akzeptable Salze der Verbindung der Formel (I-1) schliessen jene ein, die aus pharmazeutisch akzeptablen anorganischen und organischen Säuren und Basen stammen. Beispiele für geeignete Säuren schliessen ein: Salzsäure, Bromwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Perchlorsäure, Fumarsäure, Maleinsäure, Phosphorsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Salicylsäure, Bernsteinsäure, Toluol-p-sulfonsäure, Weinsäure, Essigsäure, Zitronensäure, Methansulfonsäure, Ameisensäure, Benzoesäure, Malonsäure, Naphthalin-2-sulfonsäure und Benzolsulfonsäure. Andere Säuren wie Oxalsäure können, obwohl sie selbst nicht pharmazeutisch akzeptabel sind, nützlich als Zwischenstufen beim Erhalt der Verbindungen der Erfindung und ihrer pharmazeutisch akzeptablen Säureadditionssalze sein.
Aus geeigneten Basen stammende Salze schliessen Alkalimetall- (z. B. Natrium-), Erdalkalimetall- (z. B. Magnesium-), Ammonium- und NR₄ ⁺-Salze ein (worin R C_1-4-Alkyl ist).
Die Verbindung der Formel (I-1) ist entweder synergistisch mit der zweiten Komponente der Kombination und/oder entfernt die cytotoxischen Effekte der zweiten Komponente.
Die vorteilhaften Effekte der Verbindung der Formel (I-1) und der zweiten Antivirusmittel werden über ein weites Verhältnis erreicht, z. B. 1 : 250 bis 250 : 1, bevorzugt 1 : 50 bis 50 : 1, insbesondere ca. 1 : 10 bis 10 : 1. Zweckmässig wird jede Verbindung in der Kombination in einer Menge eingesetzt werden, in der sie eine antivirale Aktivität ausübt, wenn sie allein verwendet wird.
Es wird erwartet, dass die vorliegenden Kombinationen allgemein nützlich gegen Virusinfektionen oder virusverbundene Tumore im Menschen sind.
Es ist ersichtlich, dass 3TC und AZT entweder simultan, sequentiell oder in Kombination verabreicht werden können. Falls die Verabreichung sequentiell ist, sollte die Verzögerung in der Verabreichung des zweiten der Wirkstoffe nicht derart sein, dass der Nutzen der synergistischen Wirkung der Kombination verlorengeht. Bevorzugt wird die Verabreichung gleichzeitig sein.
Es ist ersichtlich für die Fachleute, dass Verweise hierin auf die Behandlung sich auf die Prophylaxe sowie auf die Behandlung vorhandener Infektionen oder Symptome erstreckt.
Es wird weiter ersichtlich sein, dass die zur Verwendung in der Behandlung erforderliche Menge einer Kombination der Erfindung nicht nur mit der besonderen ausgewählten Verbindung, sondern ebenfalls mit dem Verabreichungsweg, der Natur des behandelten Zustands und dem Alter und dem Zustand des Patienten variieren wird und letztlich in der Verantwortung des behandelnden Arztes oder Tierarztes liegen wird. Allgemein wird jedoch eine geeignete Dosis im Bereich von ca. 1 bis ca. 750 mg/kg liegen, z. B. von ca. 10 bis ca. 75 mg/kg Körpergewicht pro Tag, wie 3 bis ca. 120 mg pro kg Körpergewicht des Empfängers pro Tag, bevorzugt im Bereich von 6 bis 90 mg/kg/Tag, am meisten bevorzugt im Bereich von 15 bis 60 mg/kg/Tag jedes der Wirkstoffe der Kombination.
Die gewünschte Dosis kann zweckmässig in einer Einzeldosis oder als verteilte Dosen angeboten werden, die in geeigneten Intervallen verabreicht werden, z. B. als zwei, drei, vier oder mehr Unterdosen pro Tag.
Die Kombination wird zweckmässig in Einheitsarzneiform verabreicht, die z. B. 10 bis 1.500 mg, zweckmässig 20 bis 1.000 mg, am zweckmässigsten 50 bis 700 mg eines jeden Wirkstoffs pro Einheitsarzneiform enthält.
Idealerweise sollten die Kombinationen verabreicht werden, um Spitzenplasmakonzentrationen eines jeden der Wirkstoffe von ca. 1 bis ca. 75 mM zu erreichen, bevorzugt ca. 2 bis 50 mM, am meisten bevorzugt ca. 3 bis ca. 30 mM. Dies kann z. B. durch intravenöse Injektion einer 0,1 bis 5%-igen Lösung der Wirkstoffe, gegebenenfalls in Kochsalzlösung, oder oral verabreicht als Bolus, der ca. 1 bis ca. 100 mg eines jeden Wirkstoffs enthält, erreicht werden. Wünschenswerte Blutspiegel können aufrecht erhalten werden durch eine kontinuierliche Infusion, um ca. 0,01 bis ca. 5,0 mg/kg/h bereitzustellen, oder durch unterbrochene Infusionen, die ca. 0,4 bis ca. 15 mg/kg eines jeden Wirkstoffs enthalten.
Obwohl es möglich ist, dass zur Verwendung in der Therapie die Wirkstoffe der Kombination als Rohchemikalie verabreicht werden, ist es bevorzugt, Kombinationen als pharmazeutische Formulierung anzubieten.
Die Erfindung stellt somit ausserdem eine pharmazeutische Formulierung bereit, die 3TC oder ein pharmazeutisch akzeptables Derivat davon und AZT zusammen mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Trägern dafür und gegebenenfalls anderen therapeutischen und/oder prophylaktischen Bestandteilen umfasst, worin das 3TC im wesentlichen frei vom entsprechenden (+)-Enantiomer der Verbindung der Formel (I) ist. Der (die) Träger muss (müssen) "akzeptabel" in dem Sinne sein, dass er (sie) mit den anderen Bestandteilen der Formulierung verträglich und nicht nachteilig für den Empfänger ist (sind).
Pharmazeutische Formulierungen schliessen jene ein, die zur oralen, rektalen, nasalen, topischen (einschliesslich bukkalen und sublingualen), vaginalen oder parenteralen (einschliesslich intramuskulären, subkutanen und intravenösen) Verabreichung geeignet, oder in einer Form sind, die zur Verabreichung durch Inhalation oder Insufflation geeignet ist. Die Formulierungen können, wenn angemessen, zweckmässig in diskreten Dosierungseinheiten angeboten werden und können durch jedes der auf dem Gebiet der Pharmazie wohlbekannten Verfahren hergestellt werden. Alle Verfahren schliessen den Schritt des Inverbindungbringens des Wirkstoffs mit flüssigen Trägern oder feinverteilten festen Trägern oder beiden und, falls erforderlich, anschliessendes Formen des Produkts zur gewünschten Formulierung ein.
Zur oralen Verabreichung geeignete pharmazeutische Formulierungen können zweckmässig als diskrete Einheiten wie Kapseln, Kachets oder Tabletten angeboten werden, die jeweils eine vorher festgelegte Menge des Wirkstoffs enthalten; als Pulver oder Granalien; als Lösung, Suspension oder Emulsion. Der Wirkstoff kann ebenfalls als Bolus, Elektuarium oder Paste angeboten werden. Tabletten und Kapseln zur oralen Verabreichung können herkömmliche Arzneimittelzusatzstoffe wie Bindemittel, Füllstoffe, Gleitmittel, Tablettensprengmittel oder Benetzungsmittel enthalten. Die Tabletten können gemäss auf dem Gebiet wohlbekannten Verfahren umhüllt werden. Orale flüssige Zubereitungen können in Form von z. B. wässrigen oder öligen Suspensionen, Lösungen, Emulsionen, Sirupen oder Elixieren sein oder können als ein trockenes Produkt zur Wiederherrichtung mit Wasser oder einem anderen geeigneten Träger vor der Verwendung angeboten werden. Solche flüssigen Zubereitungen können herkömmliche Additive wie Suspendiermittel, Emulgatoren, nicht-wässrige Träger (die essbare Öle einschliessen können) oder Konservierungsmittel enthalten.
Die erfindungsgemässen Verbindungen können ebenfalls zur parenteralen Verabreichung (z. B. durch Injektion, z. B. Bolusinjektion oder kontinuierliche Infusion) formuliert werden und können in Einheitsdosisform in Ampullen, vorgefüllten Spritzen, als Infusion mit geringem Volumen oder in Mehrfachdosisbehältern mit zugegebenem Konservierungsmittel angeboten werden. Die Zusammensetzungen können solche Formen wie Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Trägern annehmen und können Formulierungsmittel wie Suspendier-, Stabilisierungs- und/oder Dispergiermittel enthalten. Alternativ kann der Wirkstoff in Pulverform sein, erhalten durch aseptische Isolierung des sterilen Feststoffs oder durch Gefriertrocknung aus der Lösung, zur Wiederherrichtung mit einem geeigneten Träger, z. B. sterilem pyrogenfreiem Wasser, vor der Verwendung.
Zur topischen Verabreichung auf die Epidermis können die erfindungsgemässen Verbindungen als Salben, Cremes oder Lotionen oder als transdermales Pflaster formuliert werden. Salben und Cremes können z. B. mit einer wässrigen oder öligen Base unter Zugabe geeigneter Verdickungs- und/oder Gelierungsmittel formuliert werden. Lotionen können mit einer wässrigen oder öligen Base formuliert werden und werden allgemein ebenfalls ein oder mehrere Emulgatoren, Stabilisierungsmittel, Dispergiermittel, Suspendiermittel, Verdickungsmittel oder Färbemittel enthalten.
Zur topischen Verabreichung in den Mund geeignete Formulierungen schliessen Lutschtabletten ein, die den Wirkstoff in einer aromatisierten Basis umfassen, gewöhnlich Saccharose und Gummi arabicum oder Tragacanthharz; Pastillen, die den Wirkstoff in einer inerten Basis wie Gelatine und Glycerin oder Saccharose und Gummi arabicum umfassen; und Mundspülungen, die den Wirkstoff in einem geeigneten flüssigen Träger umfassen.
Zur rektalen Verabreichung geeignete pharmazeutische Formulierungen, worin der Träger ein Feststoff ist, werden am meisten bevorzugt als Einheitsdosis-Suppositorien angeboten. Geeignete Träger schliessen Kakaobutter und andere, üblicherweise auf diesem Gebiet verwendete Stoffe ein, und die Suppositorien können zweckmässig durch Vermischen des Wirkstoffs mit dem (den) erweichten oder geschmolzenen Träger(n), gefolgt von Abkühlen und Formen in Formen gebildet werden.
Zur vaginalen Verabreichung geeignete Formulierungen können als Pessare, Tampons, Cremes, Gele, Pasten, Schäume oder Sprays angeboten werden, die zusätzlich zum Wirkstoff solche Träger enthalten, wie sie als geeignet auf dem Gebiet bekannt sind.
Zur intranasalen Verabreichung können die Verbindungen der Erfindung als flüssiges Spray oder dispergierbares Pulver oder in Form von Tropfen verwendet werden.
Tropfen können mit einer wässrigen oder nicht-wässrigen Basis formuliert werden, die ebenfalls ein oder mehrere Dispergiermittel, Solubilisierungsmittel oder Suspendiermittel umfasst. Flüssige Sprays werden zweckmässig aus Druckbehältern abgegeben.
Zur Verabreichung durch Inhalation werden die erfindungsgemässen Verbindungen zweckmässig aus einem Insufflator, Vernebler oder einem Druckbehälter oder anderen zweckmässigen Mitteln zur Abgabe eines Aerosolsprays abgegeben. Druckbehälter können ein geeignetes Treibmittel wie Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder ein anderes geeignetes Gas umfassen. Im Fall eines Druckaerosols kann die Einheitsdosis festgelegt werden, indem ein Ventil zur Abgabe einer abgemessenen Menge bereitgestellt wird.
Alternativ können die erfindungsgemässen Verbindungen zur Verabreichung durch Inhalation oder Insufflation die Form einer trockenen Pulverzusammensetzung annehmen, z. B. einer Pulvermischung aus der Verbindung und einer geeigneten Pulverbasis wie Lactose oder Stärke. Die Pulverzusammensetzung kann in Einheitsarzneiform in z. B. Kapseln oder Kartuschen oder z. B. Gelatine- oder Durchdrückpackungen angeboten werden, aus denen das Pulver mit Hilfe eines Inhalators oder Insufflators verabreicht werden kann.
Wenn gewünscht, können die oben beschriebenen Formulierungen zum Erhalt einer andauernden Freisetzung des Wirkstoffs angepasst werden.
Die erfindungsgemässen pharmazeutischen Zusammensetzungen können ebenfalls andere Wirkstoffe wie Antimikrobiotika oder Konservierungsmittel enthalten.
Die Verbindung der Formel (I) kann wie in EP-A-0 382 526 beschrieben erhalten werden.
Ihre individuellen Enantiomere können aus ihrem Racemat durch Auftrennung durch jedes Verfahren erhalten werden, das auf dem Gebiet zur Trennung von Racematen in ihre Enantiomerbestandteile bekannt ist. Insbesondere können sie aus dem bekannten Racemat durch chirale HPLC, durch enzymvermittelten enantioselektiven Katabolismus mit einem geeigneten Enzym wie Cytidindeaminase oder durch selektiven enzymatischen Abbau eines geeigneten Derivats unter Verwendung eines 5'-Nukleotids erhalten werden. Verfahren zur Herstellung von 3TC werden in der internationalen Patentanmeldung WO 91/17159 beschrieben.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, sind aber nicht als deren Beschränkung beabsichtigt.
ZWISCHENSTUFE 1
5-Methoxy-1,3-oxathiolan-2-methanol-benzoat:
Eine Lösung aus Zinkchlorid (1,6 g) in heissem Methanol (15 ml) wurde zu einer gerührten Lösung aus Mercaptoacetaldehyd, Dimethylacetal (34,2 g) und Benzoyloxyacetaldehyd (48,3 g) in Toluol (1.300 ml) gegeben, die dann unter Stickstoff für 50 Minuten zum Rückfluss erhitzt wurde. Die abgekühlte Mischung wurde auf konzentriert, mit etwas Toluol verdünnt und dann durch Kieselgur filtriert. Die kombinierten Filtrate und Toluol wurden mit gesättigter wässriger Natriumbicarbonatlösung (× 2) und Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet (MgSO₄) und dann zu einem Öl eingedampft, das einer Säulenchromatografie an Silica (2 kg, Merck 9385) unterworfen wurde, das mit Chloroform unter Erhalt des Titelprodukts als Öl (45,1 g) aus einer Mischung der Anomere (ca. 1 : 1) eluiert wurde; ¹H-NMR (DMSO-d₆): 3,1–3,3 (4H), 3,42 (6H), 4,4–4,6 (4H), 5,41 (1H), 5,46 (1H), 5,54 (1H), 5,63 (1H), 7,46 (4H), 7,58 (2H), 8,07 (4H); ν_max (CHBr₃)- 1717,6 cm^–1.
ZWISCHENSTUFE 2
(±)-cis-1-(2-Benzoyloxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-(1H)-pyrimidin-2,4-dion:
Eine Mischung aus feingemahlenem Uracil (9,62 g), Hexamethyldisilazan (50 ml) und Ammoniumsulfat (30 mg) wurde unter Stickstoff zum Rückfluss erhitzt, bis eine klare Lösung erhalten wurde. Diese wurde abgekühlt und dann zu einem farblosen Öl eingedampft, das unter einer Stickstoffatmosphäre in Acetonitril (100 ml) aufgelöst wurde. Die Lösung wurde zu einer gerührten, eisgekühlten Lösung aus 5-Methoxy-1,3-oxathiolan-2-methanol-benzoat (Zwischenstufe 1) (19,43 g) in Acetonitril (600 ml) gegeben und mit Trimethylsilyltrifluormethansulfonat (14,7 ml) versetzt. Das Eisbad wurde entfernt, und die Lösung wurde unter Stickstoff für 45 Minuten zum Rückfluss erhitzt. Nach Abkühlen und Verdampfen wurde der Rückstand durch Säulenchromatografie über 1 kg Silicagel (Merck 9385) gereinigt, wobei mit Chloroform/Methanol 9 : 1 eluiert wurde. Entsprechende Fraktionen wurden abgekühlt und eingedampft, um einen Rohrückstand zu liefern. Dieser wurde fraktioniert aus dem Minimum von heissem Methanol (ca. 1.200 ml) auskristallisiert, um die Titelverbindung (6,32 g) als weisse Kristalle zu liefern. ¹H-NMR (DMSO-d6) δ: 11,36 (1H, bs), 7,50–8,00 (6H, m), 6,20 (1H, t), 5,46 (2H, m), 4,62 (2H, m), 3,48 (1H, m), 3,25 (1H, m).
Zwischenstufe 3
(±)-(cis)-4-Amino-1-(2-benzoyloxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-(1H)-pyrimidia-2-on:
Verfahren (a):
Eine Suspension aus Cytosin (20,705 g) und Ammoniumsulfat (wenige mg) und Hexamethyldisilazan (110 ml) wurde für 2,5 Stunden unter Stickstoff gerührt und zum Rückfluss erhitzt. Das Lösungsmittel wurde durch Verdampfung entfernt, und der zurückbleibende Feststoff wurde in trockenem Acetonitril (350 ml) aufgelöst. Diese Lösung wurde unter Verwendung einer Technik mit flexibler Nadel in eine gerührte eisgekühlte Lösung aus 5-Methoxy-1,3-oxathiolan-2-methanol-benzoat (Zwischenstufe 1) (43,57 g) in Acetonitril (650 ml) unter Stickstoff überführt. Trimethylsilyltrifluormethansulfonat (33 ml) wurde hinzugegeben, die Lösung wurde auf Umgebungstemperatur erwärmen gelassen (1,5 Stunden) und dann über Nacht zum Rückfluss erhitzt. Die zurückbleibende Mischung wurde aufkonzentriert, mit gesättigter wässriger Natriumbicarbonatlösung (500 ml) verdünnt und dann mit Ethylacetat (3 × 500 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit Wasser (2 × 250 ml) und Kochsalzlösung (250 ml) gewaschen, getrocknet (MgSO₄), dann zu einem Schaum eingedampft, der einer Säulenchromatografie an Silica (600 g, Merck 7734) unterworfen wurde, und mit Ethylacetat-Methanol-Mischungen unter Erhalt einer Mischung der Anomere (ca. 1 : 1, 31,59 g) eluiert. Die Mischung wurde aus Wasser (45 ml) und Ethanol (9,0 ml) unter Erhalt eines Feststoffs (10,23 g) auskristallisiert, der aus Ethanol (120 ml) und Wasser (30 ml) unter Erhalt des Titelprodukts als weisser Feststoff (9,26 g) umkristallisiert wurde; λmax (MeOH) 229,4 mm (E^1% 610); 272,4 mm (E^1% 1 cm 1 cm 293); ¹H-NMR (DMSO-d₆) δ: 3,14 (1H), 3,50 (1H), 4,07 (2H), 5,52 (1H), 5,66 (1H), 7,22 (2H), 7,56 (2H), 7,72 (2H), 8,10 (2H).
Verfahren (b):
Phosphoroxychlorid (7,0 ml) wurde zu einer gerührten, eisgekühlten Suspension aus 1,2,4-Triazol (11,65 g) in Acetonitril (120 ml) getropft und dann unter Halten der internen Temperatur auf unter 15°C tropfenweise mit Triethylamin (22,7 ml) versetzt. Nach 10 Minuten wurde langsam eine Lösung aus (±)-cis-1-(2-Benzoyloxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-(1H)-pyrimidin-2,4-dion (Zwischenstufe 2) (6,27 g) in Acetonitril (330 ml) hinzugegeben. Das Rühren wurde dann bei Raumtemperatur über Nacht fortgesetzt. Die Mischung wurde mittels eines Eisbades abgekühlt, und Triethylamin (30 ml) wurde langsam hinzugegeben, gefolgt von Wasser (21 ml). Die resultierende Lösung wurde eingedampft, und der Rückstand wurde zwischen gesättigter Natriumbicarbonatlösung (400 ml) und Chloroform (3 × 200 ml) aufgetrennt. Die vereinigten Chloroformextrakte wurden getrocknet (Magnesiumsulfat), filtriert und unter Erhalt eines Rohrückstands (9,7 g) eingedampft. Der Rückstand wurde in 1,4-Dioxan (240 ml) aufgelöst und mit konzentrierter wässriger Ammoniaklösung (spezifisches Gewicht 0,880, 50 ml) versetzt. Nach 1,5 Stunden wurde die Lösung eingedampft und der Rückstand in Methanol aufgelöst. Dies verursachte die Ausfällung eines Feststoffs, der abfiltriert wurde. Die Mutterlaugen wurden durch Säulenchromatografie über Silicagel (Merck 9385, 600 g) gereinigt. Entsprechende Fraktionen wurden gesammelt und unter Erhalt der Titelverbindung als rehbrauner Feststoff (2,18 g) eingedampft, der identisch mit dem durch Verfahren (a) erhaltenen war.
ZWISCHENSTUFE 4
(±)-(cis)-4-Amino-1-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-(1H)-pyrimidin-2-on:
Eine Suspension aus (cis)-4-Amino-1-(2-benzoyloxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-(1H)-pyrimidin-2-on (Zwischenstufe 3) (8,19 g) und Amberlite IRA-400 (OH)-Harz (8,24 g) in Methanol (250 ml) wurde für 1 1/4 Stunden gerührt und zum Rückfluss erhitzt. Die Feststoffe wurden durch Filtration entfernt und dann mit Methanol gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden eingedampft. Der Rückstand wurde mit Ethylacetat (80 ml) verrieben. Der resultierende weisse Feststoff wurde durch Filtration unter Erhalt des Titelprodukts (5,09 g) aufgefangen; ¹H-NMR (DMSO-d₆): 3,04 (1H), 3,40 (1H), 3,73 (2H), 5,18 (1H), 5,29 (1H), 5,73 (1H), 6,21 (1H), 7,19 (2H), 7,81 (1H).
BEISPIEL 1
(–)-cis-4-Amino-1-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-(1H)-pyrimidin-2-on:
(i) Drei 50 ml-Kolben mit Nährmittelbrühe (Oxoid Ltd.) wurden mit jeweils einer Schlaufe von Escherichia coli (ATCC 23848) geimpft, das von einer Nährmittel-Agarplatte abgeschabt worden war. Die Kolben wurden über Nacht bei 37°C unter Schütteln mit 250 U/min inkubiert, und dann wurde jeder Kolben verwendet, um 4 l CDD-Medium (Glutaminsäure, 3 g/l; MgSO₄, 0,2 g/l; K₂SO₄, 2,5 g/l; NaCl, 2,3 g/l; Na₂HPO₄·2H₂O, 1,1 g/l; NaH₂PO₄·2H₂O, 0,6 g/Q; Cytidin, 1,2 g/Q) in einem 7 l-Fermenter zu impfen. Die Kulturen wurden bei 750 U/min, 37°C, unter Belüftung mit 4 l/min fermentiert. Nach Wachstum für 24 Stunden wurden die Zellen durch Zentrifugation (5.000 g, 30 Minuten) unter Erhalt von 72 g Nassgewicht aufgefangen. Das Zellpellet wurde erneut in 300 ml 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) suspendiert und durch Ultraschallbehandlung (4 × 45 Sekunden) aufgerissen. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation (30.000 g, 30 Minuten) entfernt, und das Protein im Überstand wurde durch Zugabe von Ammoniumsulfat auf 75% Sättigung ausgefällt. Die Ausfällung wurde durch Zentrifugation (30.000 g, 30 Minuten) aufgefangen, und das Pellet wurde erneut in 25 ml HEPES-Puffer (100 mM, pH 7,0), der Ammoniumsulfat enthielt (75% Sättigung) suspendiert. Eine Enzymlösung wurde hergestellt durch Zentrifugation bei 12.000 U/min für 30 Minuten. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in Tris-HCl-Puffer (pH 7,0; 100 mM) auf das Ursprungsvolumen gelöst.
(ii) Zwischenstufe 4 (115 mg) wurde in Wasser (100 ml) aufgelöst und gerührt. Die Enzymlösung (0,5 ml) wurde hinzugegeben, und die Mischung wurde auf einem konstanten pH durch kontinuierliche Zugabe von HCl (25 mM) gehalten. Die Konvertierung wurde durch chirale HPLC überwacht, die zeigte, dass das (+)-Enantiomer des Substrats bevorzugt deaminiert wurde. Nach 22 Stunden war das (+)-Enantiomer des Substrats (RT 12,5 Minuten) vollständig entfernt worden, und die Lösung wurde durch Zugabe von konzentriertem Natriumhydroxid auf pH 10,5 eingestellt.
Die oben hergestellte Lösung wurde durch eine Säule aus QAE-Sephadex (A25; Pharmacia; 30 × 1,6 cm), die auf pH 11 voräquilibriert war, eluiert. Die Säule wurde mit Wasser (200 ml) und dann mit HCl (0,1 M) gewaschen. Fraktionen (40 ml) wurden entnommen und durch Umkehrphasen-HPLC analysiert. Die Fraktionen 5 bis 13, die das unumgesetzte (–)-Enantiomer des Substrats enthielten, wurden vereinigt und mit HCl auf pH 7,5 eingestellt. Fraktion 47, die das deaminierte Produkt enthielt, wurde mit verdünnter NaOH auf pH 7,5 eingestellt. Analyse durch chirale HPLC zeigte, dass dieses Material eine Mischung war, die aus einem Enantiomer (RT 10,2 Minuten) als Hauptkomponente mit dem anderen Enantiomer (RT 8,5 Minuten) als Nebenkomponente (e. e. ca. 90%) bestand.
(iii) Der obige Schritt (ii) wurde im grossen Massstab wiederholt. Die Verbindung aus Beispiel 1 (363 mg) in 250 ml Wasser wurde mit der in Schritt (i) hergestellten Enzymlösung (0,5 ml) inkubiert. Weitere Aliquote (0,5 ml) des Enzyms wurden nach 18 und 47 Stunden hinzugegeben. Die Reaktionsmischung wurde für 70 Stunden gerührt und dann für weitere 64 Stunden stehengelassen. Eine Analyse durch chirale HPLC ergab, dass das (+)-Enantiomer des Substrats vollständig deaminiert worden war, und die resultierende Lösung wurde mit NaOH auf pH 10,5 eingestellt.
Die obige Lösung wurde auf die gleiche QAE-Säule aufgetragen und wie in Schritt (i) eluiert. Fraktionen 2 bis 6, die eine Mischung aus dem verbleibenden Substrat und dem deaminierten Produkt enthielten, wurden vereinigt. Fraktionen 7 bis 13, die das verbleibende Substrat ((–)-Enantiomer) enthielten, wurden vereinigt und auf pH 7,5 eingestellt.
Fraktionen 25 bis 26, die das deaminierte Produkt enthielten, wurden vereinigt und neutralisiert.
Die obigen Fraktionen 2 bis 6 wurden erneut durch die gleiche QAE-Säule eluiert. Fraktionen 3 bis 11 aus dieser zweiten Säule enthielten unumgesetztes Substrat ((–)-Enantiomer). Fraktion 70 enthielt das deaminierte Produkt.
(iv) Die aufgetrennten Substratfraktionen aus Schritt (ii) und (iii) wurden vereinigt und auf pH 7,5 eingestellt. Diese Lösung wurde durch eine Säule aus XAD-16 (40 × 2,4 cm), gepackt in Wasser, eluiert. Die Säule wurde mit Wasser gewaschen und dann mit Aceton : Wasser (1 : 4 V/V) eluiert. Die das gewünschte (–)-Enantiomer enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt und unter Erhalt eines weissen Pulvers (190 mg) gefriergetrocknet.

Die oben verwendeten HPLC-Verfahren waren wie folgt: 1. Analytische Umkehrphasen-HPLC:

Säule	: Capital Cartridge Spherisorb ODS-2 (5 μM) 150 × 4,6 mm
Elutionsmittel	: Ammoniumdihydrogenphosphat (50 mM) + 5% MeCN
Fluss	: 1,5 ml/min
Detektion	: W, 270 nm
Retentionszeiten	: BCH 189 5,5 min : deaminiertes BCH-189 8,1 min

2. Analytische chirale HPLC:

Säule	: Cyclobond 1 Acetyl 250 × 4,6 mm
Elutionsmittel	: 0,2% Triethylammoniumacetat (pH 7,2)
Fluss	: 1,0 ml/min
Detektion	: UV, 270 nm
Retentionszeiten	: BCH 189 11,0 und 12,5 min : deaminiertes BCH-189 8,5 und 10,2 min

(Die Biokonvertierung wurde durch Überwachung des Verlusts des Peaks bei 12,5 Minuten verfolgt und sammelte das Produkt bei 10,2 Minuten).
BEISPIEL 2
3.1. Antivirale Aktivitäten allein oder in Kombination:
Die Verbindungen wurden zuerst seriell in zweifachen Dekrementen in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen verdünnt. Schachbrett-Titrationen wurden hergestellt durch Vermischung von 25 ml-Aliquoten aus jeder Verbindungsverdünnung sowohl allein oder in Kombination (auf ein Endvolumen von 50 ml in neuen Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen). Aliquoten aus MT-4-Zellen (10⁶ Zellen/ml) in RPMI 1640-Wachstumsmedium wurden mit dem HIV-1-Stamm RF bei einem moi von 2 × 10^–3 infektiösen Dosen/Zelle infiziert. Das Virus wurde bei Raumtemperatur für 90 Minuten adsorbiert, worauf die Zellen in RPMI 1640-Wachstumsmedium zur Entfernung von nicht-adsorbiertem Virus gewaschen und erneut auf 10⁶ Zellen/ml in RPMI 1640-Wachstumsmedium suspendiert wurden. 50 ml der infizierten Zellsuspension wurden in Vertiefungen übergeimpft, die nur Verbindung oder Wachstumsmedium enthielten. 50 ml jeder scheininfizierten Zellsuspension wurden in Vertiefungen übergeimpft, die keine Verbindung enthielten. Die Platten wurden dann für 7 Tage bei 37°C in 5% CO₂/Luft inkubiert.
Nach der Inkubation wurden 10 ml 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) mit 7,5 mg/ml in alle Vertiefungen gegeben und die Platten für weitere 90 Minuten bei 37°C inkubiert. 150 ml 10%-iges (V/V) Triton X-100 in Isopropanol wurden dann hinzugegeben und die Zellen erneut suspendiert. Nach 15 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Platten in einem Multiskan MC (Flow Laboratories, Irvine, GB) Lesegerät bei 405 nm analysiert. Die Konvertierung von gelbem MTT zu seinem Formazanderivat ist maximal in den nicht-infizierten unbehandelten Zellen und fehlt in unbehandelten infizierten Zellen.
Dosis-Reaktionskurven wurden für jede Verbindung allein (IC_50%-Werte) und für reziproke Titrationen jeder Verbindung bei einer festen Konzentration der zweiten Verbindung aufgetragen. Isobologramme aller Verbindungskombinationen, die IC_50%-Werte ergeben, wurden aufgetragen.
1 bis 5 sind Isobologramme von 3TC in Kombination mit AZT, ddC, ddI, RO 31-8959 bzw. R-82150-(TIBO). Falls die IC_50%-Werte der Verbindungskombination auf einer Linie liegen, die die IC_50%-Werte jeder Verbindung für sich selbst verbindet, dann wirken die zwei Verbindungen additiv. Falls die Kombination IC_50% links der Linie liegt, wirken die Verbindungen synergistisch.
Dosis-Antwort-Kurven für 3TC in Kombination mit AZT, ddC, ddI, RO 31-8959 bzw. R-82150 (TIBO) sind in 1 bis 5 gezeigt.
Keine toxischen Wirkungen wurden beobachtet, als die antiviralen Aktivitäten der Kombinationen bestimmt wurden.
Die Kombinationen von 3TC mit anderen Verbindungen als AZT wurden als Vergleichsbeispiele beibehalten.
BEISPIEL 3
Cytotoxizitäten der Verbindungen allein und in Kombination:
In diesen Experimenten wurden die Cytotoxizitäten von 3TC, AZT und ddC allein und in Kombination (bei Verhältnissen in mg/ml von 1 : 1, 1 : 5 und 5 : 1) in nicht-infizierten peripheren Blutlymphozyten und einer etablierten T-Lymphozyten-Zellinie verglichen.
Die Cytotoxizität wurde unter Verwendung eines [³H]-Thymidin-Aufnahmetests gemessen. Typische Dosis-Reaktionskurven, die für jede Verbindung oder eine 1 : 1-Kombination in PBL-Zellen erhalten wurden, sind in 6 und 7 gezeigt. 7 wird als Vergleichsbeispiel beibehalten.

Claims

Kombination, umfassend (2R,cis)-4-Amino-1-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-1H-pyrimidin-2-on (3TC) oder ein pharmazeutisch akzeptables Derivat davon und 3'-Azido-3'-desoxythymidin oder ein pharmazeutisch akzeptables Derivat davon, worin das 3TC im wesentlichen frei vom entsprechenden (+)-Enantiomer ist.
Kombination gemäss Anspruch 1, worin das Gewichtsverhältnis von (2R,cis)-4-Amino-1-(2-hydroxymethyl-1,3-oxathiolan-5-yl)-1H-pyrimidin-2-on (3TC) oder einem pharmazeutisch akzeptablen Derivat davon zu 3'-Azido-3'-desoxythymidin oder einem pharmazeutisch akzeptablen Derivat davon 250 : 1 bis 1 : 250 beträgt.
Pharmazeutische Formulierung, umfassend eine Kombination gemäss Anspruch 1 zusammen mit einem pharmazeutisch akzeptablen Träger dafür.