DE69233045T2

DE69233045T2 - Ribosomen inaktivierende proteine enthaltende materialien, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung

Info

Publication number: DE69233045T2
Application number: DE69233045T
Authority: DE
Inventors: Susan L. Bernhard; Marc D. Better; Stephen F. Carroll; Julie A. Lane; Shau-Ping Lei
Original assignee: Xoma Corp
Current assignee: Research Development Foundation
Priority date: 1991-11-04
Filing date: 1992-11-04
Publication date: 2004-02-12
Anticipated expiration: 2012-11-05
Also published as: JP3759163B2; WO1993009130A1; US5376546A; EP0669982B1; CA2122714A1; JPH07504883A; JP2004141153A; EP0669982A1; ATE239792T1; EP0669982A4; CA2122714C; US5416202A; DE69233045D1; EP1344826A1

Description

Die vorliegende Anmeldung ist eine "Conrinuartion in Parr" (Teilfortserzungsanmeldung) der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/901.707. eingereicht am 19. Juni 1992, die wiederum eine "Continuation in Part" der fallengelassenen US-Patentanmeldund der Seriennummer 07/787,567, eingereicht am 4. November 1991, ist.
H1NTERGRUND
Die vorligende Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf Materialien, die nützlich sind als Bestandteile cytotoxischer therapeutischer Mittel Insbesondere bezieht sich die Erfindung auf polynukleotide, kodierend Ribosomen inaktivierende Proteine, Polynukleotide, kodierend Analoga von Ribosomen inaktivierenden Proteinen, die spezifisch für die Konjugation an zielrichtende Moleküke modifiziert wurden, wie auch auf Genfusionen von Polynukleotiden, kodierend Ribosomen inaktivierende Proteine, mit zielrichtende Moleküle kodierende Polynukleotiden.
Ribosomen inaktivierende Proteine (RIP) umfassen eine Proteinklasse, welche in höheren Pflanzen allgegenwärtig ist. Solche Proteine wurden jedoch auch isoliert aus Bakterien RIPs sind hochwirksame Inhibitoren eukaryotischer Proteinsynthese. Die N-glykosidische Bindung einer spezifischen Adeninbase wird durch RIPs hydrolytisch gespalten in einer hochkonservierten Schleifenregion der 28S rPNS eukaryotischer Pibosomen, wodurch die Translation inaktiviert wird.
Pflanzen-RIFs wurden in zwei Typen aufgetellt. Stirpe et al., FEBS Lett., 195(1,2): 1-8 (1986). Jedes Typ-I-Protein besteht aus einer einzelnen Peptidkette mir Ribosomen inaktivierender Aktivität, wohingegen jedes Typ-II-Protein aus einer A-Kette bestehet die im Wesentlichen äquivalent zu einend Typ-I-Protein ist, welche über Disulfidbrücken mir einer B-Kette verbunden ist die zellbindende Eigenschaften hat. Gelonin. Dodecandrin.
Trichosanthin, Trichokirin, Bryodin, Mirabilis antivirales Protein (MAP), Ribosomen inaktivierendes Protein aus Gerste (BRIP), Phytolacca americana antivirale Proteine (PAP = pokeweed antiviral proteins), Saporine, Luffine und Momordine sind Beispiel von Typ-I-RIPs; wohingegen Ricin und Abrin Beispiele von Typ-II-RIPs sind. Es scheint, dass wenigstens die Tertiärstruktur der aktiven Stelle innerhalb von Typ-I-RIPs, bakteriellen RIPs und A-Ketten der Typ-II-RIPs beibehalten wurde. In vielen Fällen wurde ebenso Homologie in der Primärstruktur gefunden. Ready et al., J. Biol. Chem., 259(24): 15252–15256 (1984) und andere Berichte behaupten, dass die beiden RIP-Typen evolutionär verwandt sind.
Abgetrennt aus ihrer natürlichen Umgebung könnten pflanzliche Typ I Ribosomen inaktivierende Proteine besonders geeignet sein für die Verwendung als Bestandteile cytotoxischer therapeutischer Mittel. Ein RIP kann mit einem Zielagens bzw. zielrichtenden Argens konjugiert sein, welches das RIP zu einem bestimmten Zelltyp in vivo bringen wird, um jene Zellen selektiv abzutöten. Typischerweise ist das Zielagens (z. B. ein Antikörper) mit dem Toxin durch eine Disulfidbrücke verbunden, welche in vivo reduziert wird, wodurch dem Proteintoxin ermöglicht wird, sich von dem überbringenden Antikörper abzutrennen und intrazellulär aktiv zu werden. Eine weitere Strategie zur Herstellung cytotoxischer Mittel ist, ein Gen, das ein cytotoxisches Protein kodiert, das mit einem Gen fusioniert ist, welches eine Zielkomponente kodiert, zu exprimieren. Das resultierende Proteinprodukt ist ein Polypeptid, enthaltend ein RIP, welches gekoppelt ist an z. B. wenigstens eine Kette eines Antikörpers. Eine Reihe solcher Genfusionen, enthaltend Proteintoxinsequenzen, sind diskutiert in einem jüngeren Übersichtsartikel von Pastan et al., Science, 254: 1173–1177 (1991).
Da einige RIPs, wie z. B. das Typ-I-RIP Gelonin, primär erhältlich sind aus seltenen Pflanzenmaterialien, ist es wünschenswert, die Gene zu klonieren, die die RIPs kodieren, um eine rekombinante Produktion der Proteine zu ermöglichen. Es ist ebenso wünschenswert, Analoga der natürlichen Proteine zu entwickeln, welche leicht mit Zielmolekülen konjugiert werden können, während ihre natürliche biologische Aktivität beibehalten wird, da die meisten Typ-I-RIPs keine natürlichen Stellen (das heißt zugängliche Cysteinreste) haben, zur Konjugation mit Zielagenzien. Alternativ ist es wünschenswert, Genfunsi onsprodukte zu entwickeln, die Typ-I-RIPs als eine toxische Komponente und Antikörpersubstanzen als eine Zielkomponente enthalten.
Es besteht somit ein Bedarf an klonierten Genen, kodierend Typ-I-RIPs, und Analogen des Typ-I-RIPs, die sich leicht an Zielmoleküle konjugieren lassen, und an Genfusionsprodukten, umfassend Typ-I-RIPs.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Gemäß einem Aspekt der Erfindung wird bereitgestellt ein Analogen eines Ribosomen inaktivierenden Proteins vom Typ I, ausgewählt aus Gelonin, Momordin-II und BRIP, wobei das Analogon ein Cystein aufweist, verfügbar für intermolekulare Disulfidbindung an einer Aminosäureposition, die einer Position entspricht, die für die intermolekulare Disulfidbindung in dem Ribosomen inaktivierenden Protein vom Typ I nicht natürlich verfügbar ist, und wobei das Cystein in der Aminosäuresequenz des Analogous an einer Position von der Position, die der Position 251 in SEQ ID Nr: l entspricht, bis zu der Carbonylendposition des Analogons vorliegt.
Die Erfindung stellt weiterhin bereit ein Polynukleotid, codierend ein Analogon eines Ribosomen inaktivierenden Proteins vom Typ I, ausgewählt aus Gelonin, Momordin-II und BRIP, wobei das Analogon ein Cystein aufweist, das für die intermolekulare Disulfidbindung an einer Aminosäureposition verfügbar ist, die einer Position entspricht, die für die intermolekulare Disulfidbindung in dem Ribosomen inaktivierenden Protein vom Typ I nicht natürlich verfügbar ist, und wobei das Cystein in der Aminosäuresequenz des Analogons an einer Position von der Position, die der Position 251 in SEQ ID Nr: 1 entspricht, bis zu der Carbonylendposition des Analogous vorliegt.
Die Produkte der Expression der oben definierten Polynukleotide in einer geeigneten Wirtszelle bilden weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung. Analoga eines Typ-I-Pflanzen-RIPs sind hierin definiert als nicht natürlich auftretende Polypeptide, die die Ribosomen inaktivierende Aktivität des natürlichen Proteins teilen, sich jedoch hinsichtlich der Aminosäuresequenz von natürlichem Protein unterscheiden. Wie angegeben sind Analoga gemäß der vorliegenden Erfindung Analoge des Typ-I-Pflanzen-RIPs, die jeweils ein Cystein auf weisen, das für eine Disulfidbindung verfügbar ist, angeordnet an einer Position in seiner Aminosäuresequenz von der Position, entsprechend Position 251 in SEQ ID NR: 1, bis zur carboxyterminalen Position des Analogons. Bevorzugte Analoga gemäß der Erfindung sind solche Typ-I-RIPs, die ein Cystein verfügbar für eine Disulfidbindung an einer Position im Analogon aufweisen, die sich auf der Oberfläche des Proteins in seiner natürlichen Konformation befinden und die die native Faltung oder biologische Aktivität des Ribosomen inaktivierenden Proteins nicht beeinträchtigen.
Die vorliegende Erfindung stellt gemäß einem bevorzugten Aspekt ein Analogon eines Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Proteins bereit, welches Analogon ein Cystein verfügbar für intermolekulare Disulfidbindungen an einer Aminosäureposition aufweist, entsprechend einer Position, die natürlicherweise nicht für intermolekulare Disulfidbindungen in dem Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Protein verfügbar ist, und welches Cystein an einer Position in der Aminosäuresequenz des Analogons angeordnet ist, entsprechend der Position 259 in der SEQ ID NR: 1 oder an einer Position in der Aminosäuresequenz in dem Analogon entsprechend einer Position von der Position, entsprechend Position 251 in der SEQ ID NR: 1 bis zur carboxyterminalen Position des Analogons.
Ein Analogon gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Analogon des Gelonins sein. In einem Analogon des Gelonins gemäß der vorliegenden Erfindung kann sich das Cystein in einer Position im Analogon von Position 244 bis zur carboxyterminalen Position des Analogons, stärker bevorzugt an einer Position im Analogon von Position 247 bis zur carboxyterminalen Position des Analogons befinden, und in diesen Bereichen am meisten bevorzugt an den Positionen 244, an Position 247 oder an Position 248 der Aminosäuresequenz des Analogons. Es ist bevorzugt, dass die Gelonin-Cysteinreste an den Positionen 44 und 50 durch Alaninreste ersetzt sind.
Ein Analogon gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Analogon des Ribosomen inaktivierenden Proteins aus Gerste sein. Vorzugsweise befindet sich ein Cystein in einem solchen Analogon in einer Position im Analogon von Position 256 bis zur carboxyterminalen Position, und stärker bevorzugt befindet sich das Cystein in einer Position in der Aminosäuresequenz des Analogons von Position 260 bis zur carboxyterminalen Position des Analo gons. Am meisten bevorzugt befindet sich das Cystein in diesen Bereichen an Position 256, an Position 270 oder an Position 277 der Aminosäuresequenz des Analogons.
Ein Analogon gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Analogon des Momordins II sein.
Analoga gemäß der vorliegenden Erfindung können ein Cystein in der Aminosäuresequenz des Analogons in einer Position aufweisen, die einer Position innerhalb einer Aminosäure der Position 259 der SEQ ID NR: 1 entspricht. Ein solches Analogon kann ein Analogon des Gelonins, des Ribosomen inaktivierenden Proteins aus Gerste (BRIP) oder des Momordins II sein.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem ein Polynucleotid bereit, codierend ein Analogon eines Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Proteins, welches Analogon ein Cystein verfügbar für intermolekulare Disulfidbindungen an einer Aminosäureposition aufweist, entsprechend einer Position, die natürlicherweise nicht für intermolekulare Disulfidbindungen in dem Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Protein verfügbar ist, und welches Cystein an einer Position in der Aminosäuresequenz des Analogons von der Position, entsprechend Position 251 in der SEQ ID NR: 1, bis zur carboxyterminalen Position des Analogons angeordnet ist. Das Polynucleotid kann ein Analogon des Gelonins codieren, vorzugsweise ein Analogon, worin das Cystein sich an einer Position in der Aminosäuresequenz des Analogons von Position 244 bis zur carboxyterminalen Position des Analogons befindet, stärker bevorzugt worin das Cystein sich an einer Position im Analogon von Position 247 bis zur carboxyterminalen Position des Analogons und am meisten bevorzugt sich das Cystein an einer Position 244, an Position 247 oder an Position 248 der Aminosäuresequenz des Analogons befindet. Es ist bevorzugt, dass ein Polynucleotid gemäß der vorliegenden Erfindung ein Geloninanalogon codiert, worin die Cysteinreste des nativen Gelonins in Positionen 44 und 50 durch Alaninreste ersetzt sind.
Ein Polynucleotid der vorliegenden Erfindung kann ein Analogon des Ribosomen inaktivierenden Proteins aus Gerste codieren, vorzugsweise ein Analogon, worin sich das Cystein an einer Position im Analogon befindet von Position 256 bis zur carboxyterminalen Position des Analogons, stärker bevorzugt, worin sich das Cystein an einer Position im Analogon befindet von Position 260 bis zur carboxyterminalen Position des Analogons, und am meisten bevorzugt, worin das Cystein sich an Position 256, an Position 270 oder an Position 277 der Aminosäuresequenz des Analogons befindet.
Ein Polynucleotid gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Analogon des Momordins II codieren.
Die vorliegende Erfindung stellt einen Vektor bereit, umfassend ein Polynucleotid, codierend ein Analogon eines Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Proteins, welches Analogon ein für intermolekulare Disulfidbindungen verfügbares Cystein an einer Aminosäureposition aufweist, entsprechend einer Position, die natürlicherweise nicht für intermolekulare Disulfidbindungen in dem Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Protein verfügbar ist, und welches Cystein sich an einer Position in der Aminosäuresequenz des Analogons befindet von der Position, entsprechend Position 251 in der SEQ ID NR: 1, bis zur carboxyterminalen Position des Analogons.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin bereit eine Wirtszelle, umfassend einen DNS-Vektor, codierend ein Analogon eines Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Proteins, welches Analogon ein für intermolekulare Disulfidbindungen verfügbares Cystein an einer Aminosäureposition aufweist, entsprechend einer Position, die natürlicherweise nicht für intermolekulare Disulfidbindungen in dem Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Protein verfügbar ist, und welches Cystein sich an einer Position in der Aminosäuresequenz des Analogons befindet von der Position, entsprechend Position 251 in der SEQ ID NR: 1, bis zur carboxyterminalen Position in dem Analogon. In einer solchen Wirtszelle kann der Vektor ein Analogon des Gelonins codieren, insbesondere ein Analogon, in dem sich das Cystein an Position 247 der Aminosäuresequenz des Analogons befindet, wie in der Wirtszelle, die mit der ATCC-Zugangsnummer 69009 hinterlegt worden ist.
Eine Wirtszelle gemäß der vorliegenden Erfindung kann einen Vektor umfassen, codierend ein Ribosomen inaktivierendes Protein aus Gerste, insbesondere eine Wirtszelle, worin sich das Cystein an Position 277 der Aminosäuresequenz des Analogons befindet, wie in der Wirtszelle, die mit der ATCC-Zugangsnummer 68722 hinterlegt worden ist.
Die vorliegende Erfindung stellt außerdem bereit ein für eine Zelle toxisches Mittel, umfassend ein Analogon eines Typ-I-Ribosomen inaktivierendes Proteins, gebunden über eine Disulfidbindung durch ein Cystein an ein Molekül, das spezifisch an die Zelle bindet, welches Cystein sich an einer Aminosäureposition in dem Analogon befindet, entsprechend einer Position, die natürlicherweise nicht für intermolekulare Disulfidbindungen in dem Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Protein verfügbar ist, und welches Cystein sich in der Aminosäuresequenz des Analogons befindet von der Position, entsprechend der Position 251 in der SEQ ID NR: 1, bis zur carboxyterminalen Position des Analogons. Das Mittel kann ein Analogon des Gelonins umfassen, vorzugsweise ein Analogon, worin sich das Cystein an einer Position in dem Analogon von Position 247 bis zur carboxyterminalen Position des Analogons befindet, und stärker bevorzugt, worin das Cystein an Position 247 oder 248 der Aminosäuresequenz des Analogons befindet. Ein Mittel, umfassend ein Analogon, worin die Cysteinreste des nativen Gelonins an den Positionen 44 und 50 durch Alaninreste ersetzt sind, ist bevorzugt.
Ein Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Analogon des Ribosomen inaktivierenden Proteins aus Gerste umfassen, vorzugsweise ein Analogon, in dem sich das Cystein an einer Position in dem Analogon befindet von Position 260 bis zur carboxyterminalen Position des Analogons, stärker bevorzugt, worin sich das Cystein an einer Position im Analogon von Position 270 bis zur carboxyterminalen Position des Analogons befindet, und am meisten bevorzugt, worin das Cystein sich an Position 256, an Position 270 oder an Position 277 der Aminosäuresequenz des Analogons befindet.
Ein Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Analogon des Momordins II umfassen.
Die vorliegenden Erfindung stellt ein Mittel bereit, worin das Typ-I-Ribosomen inaktivierende Protein an einen Antikörper gebunden ist, insbesondere an einen H65-Antikörper oder ein Antikörperfragment, insbesondere an ein Antikörperfragment, ausgewählt aus der Grup pe, bestehend aus chimären und auf den Menschen maßgeschneiderten (humanisierten) Antikörperfragmente, und am meisten bevorzugt an ein Fab-Antikörperfragment, ein Fab'-Antikörperfragment oder ein F(ab')₂-Antikörperfragment. Es ist hoch bevorzugt, dass ein Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung ein chimäres oder auf den Menschen geschneidertes Antikörperfragment umfasst, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Fab-Antikörperfragment, einem Fab'-Antikörperfragment und einem F(ab')₂-Antikörperfragment.
Ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines Analogons eines Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Proteins umfasst den Schritt des Exprimierens eines Polynucleotids in einer geeigneten Wirtszelle, das ein Typ-I-Ribosomen inaktivierendes Protein mit einem für intermolekulare Disulfidbindungen verfügbaren Cystein codiert, das (beispielsweise durch ortsspezifische Mutagenese der natürlichen DNS-Sequenz, die das RIP codiert, oder durch chemische Synthese einer DNS-Sequenz, codierend das RIP-Analogon) an einer Aminosäureposition substituiert ist, entsprechend einer Position, die nicht natürlicherweise für intermolekulare Disulfidbindungen in dem Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Protein verfügbar ist, welches Cystein sich an einer Position in der Aminosäuresequenz des Analogons befindet von der Position, entsprechend der Position 251 in der SEQ ID NR: 1, bis zur carboxyterminalen Position des Analogons.
Ein Produkt gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein Produkt eines Verfahrens sein, umfassend den Schritt des Exprimierens eines Polynucleotids in einer geeigneten Wirtszelle, das ein Typ-I-Ribosomen inaktivierendes Protein mit einem für intermolekulare Disulfidbindungen verfügbaren Cystein codiert, substituiert an einer Aminosäureposition, entsprechend einer Position, die nicht natürlicherweise für intermolekulare Disulfidbindungen in dem Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Protein verfügbar ist, welches Cystein sich an einer Position in der Aminosäuresequenz des Analogons befindet von der Position, entsprechend Position 251 in der SEQ ID NR: 1, bis zur carboxyterminalen Position des Analogons.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren bereit zur Herstellung eines für eine Zelle toxischen Mittels, umfassend den Schritt des Anbindens eines Analogons eines Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Präteins über ein Cystein an ein Molekül, das spezifisch an die Zelle bindet, welches Analogon das Cystein an einer Aminosäureposition aufweist, entsprechend einer Position, die nicht natürlicherweise für intermolekulare Disulfidbindung in dem Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Protein verfügbar ist, und welches Cystein sich an einer Position in der Aminosäuresequenz des Analogons befindet von der Position, entsprechend Position 251 in der SEQ ID NR: 1, bis zur carboxyterminalen Position des Analogons.
Ein Verfahren zur Behandlung einer Erkrankung, worin die Eliminierung einer speziellen Zelle ein Ziel ist, kann den Schritt des Verabreichens einer therapeutisch wirksamen Menge eines für die Zellen toxischen Mittels an einem Patienten mit der Erkrankung umfassen, das ein Analogon eines Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Mittels umfasst, verbunden über ein Cystein mit einem Molekül, das spezifisch an die Zellen bindet, wobei das Analogon das Cystein an einer Aminosäureposition aufweist, entsprechend einer Position, die nicht natürlicherweise für intermolekulare Disulfidbindungen in dem Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Protein verfügbar ist, und wobei das Cystein sich an einer Position in der Aminosäuresequenz des Analogons befindet von der Position, entsprechend Position 251 in der SEQ ID NR: 1, bis zur carboxyterminalen Position des Analogons.
Gemäß einem bevorzugten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Analogon eines Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Proteins bereit, worin das Analogon ein für intermolekulare Disulfidbindungen verfügbares Cystein aufweist, das sich an einer Aminosäureposition befindet, entsprechend einer Position, die nicht natürlicherweise für intermolekulare Disulfidbindungen in dem Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Protein verfügbar ist, und entsprechend einer Position auf der Oberfläche einer Ricin A-Kette in ihrer natürlichen Konformation, und worin das Analogon die Ribosomen inaktivierende Aktivität des Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Proteins beibehält.
Ein solches Analogon kann ein Analogon sein, worin das Typ-I-Ribosomen inaktivierende Protein Gelonin ist; und es ist bevorzugt ein Analogon des Gelonins, worin das Cystein sich an Position 10 der Aminosäuresequenz des Analogons befindet, wie in einem Vektor in einer Wirtszelle codiert, die als ATCC-Zugangsnummer 69008 hinterlegt ist. Andere solche Geloninanaloga schließen diejenigen ein, worin sich das Cystein an Position 60, 103, 146, 184 oder 215 in der Aminosäuresequenz des Geloninanalogons befindet. Es ist bevorzugt, dass die Gelonin-Cysteinreste an den Positionen 44 und 50 durch Alaninreste in diesen Analoga ersetzt sind.
Gemäß einem weiteren bevorzugten Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Analogon eines Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Proteins bereit, worin das Analogon nur ein einzelnes Cystein umfasst. Solch ein Analogon kann ein Analogon des Gelonins sein, und es ist vorzugsweise ein Analogon, worin sich das einzelne Cystein an Position 10, Position 44, Position 50 oder Position 247 in der Aminosäuresequenz des Analogons befindet, das Cystein kann jedoch ebenso an anderen Positionen, wie sie durch die Erfindung definiert sind, angeordnet sein.
die vorliegende Erfindung stellt gemäß einem weiteren bevorzugten Aspekt ein Polynucleotid bereit, codierend ein Analogon eines Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Proteins, worin das Analogon ein für intermolekulare Disulfidbindungen verfügbares Cystein aufweist, das sich an einer Aminosäureposition befindet, entsprechend einer Position, die nicht natürlicherweise für intermolekulare Disulfidbindungen in dem Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Protein verfügbar ist, und entsprechend einer Position auf der Oberfläche der Ricin A-Kette in ihrer natürlichen Konformation, und worin das Analogon die Ribosomen inaktivierende Aktivität des Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Proteins beibehält.
Analoga eines Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Proteins gemäß der Erfindung können über ein Verfahren hergestellt werden, das den Schritt des Exprimierens eines Polynucleotids in einer geeigneten Wirtszelle umfasst, das ein Typ-I-Ribosomen inaktivierendes Protein mit einem für intermolekulare Disulfidbindungen verfügbaren Cystein codiert, ersetzt an einer Aminosäureposition, entsprechend einer Position, die nicht natürlicherweise für Disulfidbindungen in dem Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Protein verfügbar ist, wobei sich das Cystein an einer Position befindet, entsprechend einer Aminosäureposition auf der Oberfläche der Ricin A-Kette in ihrer natürlichen Konformation, und welches Analogon die Ribosomen inaktivierende Aktivität des Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Proteins beibehält.
Analoga gemäß der vorliegenden Erfindung können zur Behandlung einer Erkrankung verwendet werden, in der die Eliminierung spezieller Zellen ein Ziel darstellt. Solche Verwen dungen schließen den Schritt der Verabreichung einer therapeutischen wirksamen Menge eines für die Zellen toxischen Mittels an einen Patienten mit der Erkrankung ein, worin das Mittel ein Analogon eines Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Proteins aufweist, verbunden über eine Disulfidbindung durch ein Cystein mit einem Molekül, das spezifisch an die Zelle bindet, worin das Analogon ein für intermolekulare Disulfidbindungen verfügbares Cystein aufweist, angeordnet an einer Aminosäureposition, entsprechend einer Position, die nicht natürlicherweise für intermolekulare Disulfidbindungen in dem Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Protein verfügbar ist, und entsprechend einer Position auf der Oberfläche der Ricin A-Kette in ihrer natürlichen Konformation, und welches Analogon die Ribosomen inaktivierende Aktivität des Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Proteins beibehält.
Die RIP-Analoga sind insbesondere für Verwendungen als Komponenten von cytotoxischen therapeutischen Mitteln geeignet. Cytotoxische Mittel gemäß der vorliegenden Erfindung können in vivo genutzt werden, um selektiv jeden Zelltyp zu eliminieren, gegen den die RIP-Komponente über die spezifische Bindungskapazität der zweiten Komponente gerichtet ist. Um cytotoxische Mittel zu bilden, können RIP-Analoga an monoklonale Antikörper konjugiert werden, eingeschlossen chimäre und CDR-gepfropfte Antikörper, wie auch Antikörperdomänen/fragmente (beispielsweise Fab, Fab', F(ab')₂, einzelkettige Antikörper wie auch Fv oder einzelne variable Domänen) wie auch die Konjugation an monoklonale Antikörper, die genetisch so konstruiert wurden, dass sie freie Cysteinreste enthalten, befinden sich im Bereich der vorliegenden Erfindung. Beispiele von Fab' und F(ab')₂-Fragmenten, die in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind in der parallel anhängigen, parallel geeigneten US-Patentanmeldung der Serien-Nr. 07/714,175, eingereicht am 14. Juni 1991, wie auch in der Internationalen Veröffentlichung WO 89/00999, veröffentlicht am 9. Februar 1989, beschrieben. RIPs gemäß der vorliegenden Erfindung können auch an andere zielrichtende Mittel bzw. Zielmittel als Antikörper konjugiert werden, beispielsweise Lectine, die an Zellen mit speziellen Oberflächenkohlenhydraten binden, oder Hormone, Lymphokine, Wachstumsfaktoren oder andere Polypeptide, die spezifisch an Zellen mit speziellen Rezeptoren binden. RIP umfassende Immunkonjugate können als Immuntoxine beschrieben werden. Ein Immuntoxin kann auch aus einem Fusionsprotein anstelle eines Immunkonjugats bestehen.
Die Analoga der Erfindung können genutzt werden in einem Verfahren zur Reinigung eines Immuntoxins, umfassend ein Ribosomen inaktivierendes Protein und einen Teil eines Antikörpers, umfassend den Schritt des Durchleitens einer Lösung, enthaltend das Immuntoxin, durch eine Anionenaustauschersäule; Auftragen des Durchflusses auf eine Protein G-Säule; und Eluieren des Immuntoxins von der Protein G-Säule. Das Verfahren kann zusätzlich die Schritte des Einführens des Durchflusses der Anionenaustauschersäule in eine Kationenaustauschersäule; Exponieren der Kationenaustauschersäule an ein Elutionsmittel, effektiv zum Eluieren des Proteins; und anschließend Auftragen des Durchflusses auf eine Protein G-Säule anstelle des direkten Auftrags des Durchflusses der Anionenaustauschersäule auf eine Protein G-Säule, umfassen.
Die Analoga der vorliegenden Erfindung können verwendet werden zur Herstellung von Immunotoxinen, einschließlich cytotoxischer Mittel und Fusionsproteine, die geeignet sind zur Behandlung von Krankheiten, bei denen die Eliminierung eines bestimmten Zelltyps ein Ziel ist, wie z. B. Autoimmunerkrankung, Krebs, Graft-versus-host-Krankheit. Die Immunotoxine sind ebenso geeignet zur Verwendung bei der Erzeugung von Immunsuppression und bei der Behandlung von Infektionen durch Viren, wie z. B. dem HIV.
Besonders erläuternde Polynukleotidsequenzen, die für die Herstellung der Analoga gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind die Inserts in das Plasmid pING3731 in E. coli MC1061 (bezeichnet als Stamm G274) und in das Plasmid pING3803 von E. coli E104 (bezeichnet als Stamm G275), die beide hinterlegt wurden bei der American Type Culture Collection (ATCC), 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, am 2. Oktober 1991, und die den ATCC-Zugangsnummern 68721 bzw. 68722 zugeordnet wurden. Weitere solcher Polynukleotidsequenzen sind die Inserts in das Plasmid pING3746 in E. coli E104 (bezeichnet als Stamm G277) und in das Plasmid pING3737 in E. coli E104 (bezeichnet als Stamm G276), welche beide hinterlegt wurden bei der ATCC am 9. Juli 1992 und welchen die Zugangsnummern 69008 bzw. 69009 zugeordnet wurden. Noch weitere solcher Polynukleotidsequenzen sind die Inserts in das Plasmid pING3747 in E. coli E104 (bezeichnet als Stamm G278), in das Plasmid pING3754 in E. coli E104 (bezeichnet als Stamm G279), in das Plasmid pING3758 in E. coli E104 (bezeichnet als Stamm G280) und in das Plasmid pING3759 in E. coli E104 (bezeichnet als Stamm G281), wobei die Plasmide alle hinterlegt wurden bei der ATCC am 27. Oktober 1992 und ihnen die ATCC-Zugangsnummern 69101, 69102, 69103 bzw. 69104 zugeordnet wurden.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine computererzeugte Anordnung der Aminosäuresequenz der Ricin-A-Kette (RTA) (SEQ ID NO 1) mit der Aminosäuresequenz des Typ I Ribosomen inaktivierenden Proteins Gelonin (SEQ ID NO 2), wobei die mit Stern versehenen Positionen Aminosäuren anzeigen, die in den Ricin-A-Ketten und den Typ-I-RIPs identisch sind.
2 ist eine computererzeugte Anordnung bzw. Alignment der Aminosäuresequenz der Ricin A-Kette (SEQ ID NR: 1) mit der Aminosäuresequenz des Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Proteins BRIP (SEQ ID NR: 3), worin mit Sternchen versehene Positionen Aminosäurereste anzeigen, die in der Ricin A-Kette und dem Typ-I-RIP invariant sind;
3 ist eine computererzeugte Anordnung der Aminosäuresequenz der Ricin A-Kette (SEQ ID NR: 1) mit der Aminosäuresequenz des Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Proteins Momordin II (MOMOII) (SEQ ID NR: 4), worin mit Sternchen versehene Positionen Aminosäurereste anzeigen, die in der Ricin A-Kette und dem Typ-I-RIP invariant sind;
4 ist eine computererzeugte Anordnung der Aminosäuresequenz der Ricin A-Kette (SEQ ID NR: 1) mit der Aminosäuresequenz des Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Proteins Luffin (SEQ ID NR: 5), worin mit Sternchen versehene Positionen Aminosäurereste anzeigen, die in der Ricin A-Kette und dem Typ-I-RIP invariant sind;
5 ist eine computererzeugte Anordnung der Aminosäuresequenz der Ricin A-Kette (SEQ ID NR: 1) mit der Aminosäuresequenz des Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Proteins α-Trichosanthin (TRICHO) (SEQ ID NR: 6), worin mit Sternchen versehene Positionen Aminosäurereste anzeigen, die in der Ricin A-Kette und dem Typ-I-RIP invariant sind;
6 ist eine computererzeugte Anordnung der Aminosäuresequenz der Ricin A-Kette (SEQ ID NR: 1) mit der Aminosäuresequenz des Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Proteins Momordin I (MOMOI) (SEQ ID NR: 7), worin mit Sternchen versehene Positionen Aminosäurereste anzeigen, die in der Ricin A-Kette und dem Typ-I-RIP invariant sind;
7 ist eine computererzeugte Anordnung der Aminosäuresequenz der Ricin A-Kette (SEQ ID NR: 1) mit der Aminosäuresequenz des Mirabilis antiviralen Proteins (MAP) als Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Protein (SEQ ID NR: 8), worin mit Sternchen versehene Positionen Aminosäurereste anzeigen, die in der Ricin A-Kette und dem Typ-I-RIP invariant sind;
8 ist eine computererzeugte Anordnung der Aminosäuresequenz der Ricin A-Kette (SEQ ID NR: 1) mit der Aminosäuresequenz des antiviralen Proteins aus den Samen von Phytolacca Americana (PAPS) als das Typ-I-Ribosomen inaktivierende Protein (SEQ ID NR: 9), worin mit Sternchen versehene Positionen Aminosäurereste anzeigen, die in der Ricin A-Kette und dem Typ-I-RIP invariant sind;
9 ist eine computererzeugte Anordnung der Aminosäuresequenz der Ricin A-Kette (SEQ ID NR: 1) mit der Aminosäuresequenz des Typ-I-Ribosomen inaktivierenden Proteins Saporin 6 (SAP6) (SEQ ID NR: 10), worin mit Sternchen versehene Positionen Aminosäurereste anzeigen, die in der Ricin A-Kette und dem Typ-I-RIP identisch sind;
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
Nukleotidsequenzen von Genen, kodierend drei pflanzliche Typ-I-RIPs, und Expressionsvektoren, die die Gene enthalten, sind durch die vorliegende Erfindung bereitgestellt. Ein erstes Pflanzen-RIP, Gelonin, wird hergestellt durch Samen von Gelonium multiflorum, einer Pflanze der Familie der Euphorbiaceen, die in den tropischen Wäldern Ostasiens heimisch ist, während ein zweites RIP, das BRIP, vom herkömmlichen Getreidekorn Gerste synthetisiert wird. Momordin II, ein drittes pflanzliches RIP wird in Samen von Momordica balsamina erzeugt. Analoga von BRIP werden von der Erfindung ebenfalls bereitgestellt. Die Analoga wurden gentechnisch so hergestellt, dass sie ein freies Cystein enthalten, dass sich an einer intermolekularen Disulfidbindung beteiligen kann; und sie wurden an Antikörpermoleküle konjugiert, ohne unspezifische chemische Derivatisierung des RIP mit chemischen Vernetzungsmitteln.
Typ-I-RIP-Analoga der vorliegenden Erfindung bieten bestimmte Vorteile gegenüber den natürlichen Proteinen zur Verwendung als Bestandteile von Immunotoxinen. Chemische Behandlung, um freie Mercaptogruppen in die natürlichen Proteine einzuführen; denen freie Cysteine fehlen, schließt typischerweise die nicht selektive Modifizierung von Aminosäureseiten ketten ein. Diese Nichtselektivität resultiert oftmals in Antikörpern, die an unterschiedliche Stellen unterschiedlicher RIP-Moleküle konjugiert sind (d. h. eine heterogene Population von Konjugaten), und resultiert auch in einer Abnahme der RIP-Aktivität, falls Antikörper konjugiert sind in oder in der Nähe von wichtigen Bereichen des RIPs (z. B. die aktive Stelle oder Regionen, die in der Translokation durch Zellmembranen verwickelt sind). Im Gegensatz dazu können die RIP-Analoga gemäß der vorliegenden Erfindung an einen einzelnen Antikörper durch eine Disulfidbrücke konjugiert werden mit einem speziellen Rest des Analogons, was in einer reduzierten Charge-zu-Charge-Variation der Immunokonjugate resultiert und in einigen Fällen in Immunokonjugaten mit verbesserten Eigenschaften (z. B. höherer Cytotoxizität oder Löslichkeit) resultiert.
Typ-I-Pflanzen-RIPs, ebenso wie bakterielle RIPs, wie z. B. Shiga und shigaähnliche Toxin-A-Ketten, sind homolog zu der Ricin-A-Kette und sind nützlich in der vorliegenden Erfindung.
Typ-I-RIPs können definiert werden und Stellen für die Substitution eines Cysteins in einem RIP können identifiziert werden durch Vergleich der primären Aminosäuresequenz des RIPs mit der natürlichen Aminosäuresequenz der Ricin-A-Kette, deren Tertiärstruktur beschrieben wurde in Katzin et al., Proteins, 10: 251–259 (1991), hierin durch Bezugnahme eingeschlossen.
Die Aminosäuresequenzaneinanderreihung bzw. das Alignment definiert Typ-I-RIPs, so dass die Ricin-A-Kette und die Typ-I-Pflanzen-RIPs neun identische Aminosäuren gemeinsam haben. Basierend auf der Ricin-Sequenz sind die identischen Aminosäuren Tyrosin₂₁, Aginin₂₉, Tyrosin₈₀, Tyrosin₁₂₃, Leucin₁₄₄, Glutaminsäure₁₇₇, Alanin₁₇₈, Aginin₁₈₀ und Tryptophan₂₁₁. Die Ricin-A-Kette kann verwendet werden als ein Modell für die dreidimensionale Struktur der Typ-I-RIPs. Ein Protein, dem ein Cystein fehlt, welches zugänglich ist für die Konjugation, während es Ribosomen inaktivierende Aktivität hat, und das die neun unveränderlichen Aminosäuren hat, wenn seine Primärsequenz verglichen wird mit der Primärsequenz der Ricin-A-Kette [gemäß dem Aneinanderreihungsalgorithmus von Myers et al., CABIOS COMMUNICATIONS; 4(1): 11–17 (1988), implementiert durch das PC/GENE-Programm PALIGN (Intelligenetics, Inc., Mountain View, Kalifornien) und unter Verwendung der Dayhoff Mutation Data Matrix (MDM-78), wie beschrieben in Schwartz et al., S. 353–358 in Atlas of Protein Sequence and Structure, 5 Supp. 3, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C. (1979)], ist hierin definiert als ein Typ-I-RIP und es wird erwartet, dass es nützlich ist für die vorliegende Erfindung. "Entsprechen" bezieht sich hierin auf Aminosäurepositionen, welche sich übereinstimmend anordnen, wenn zwei Aminosäuresequenzen verglichen werden durch die Strategie von Myers et al., supra.
Die primären Aminosäuresequenzen der Typ-I-RIPs: Gelonin, BRIP, Momordin II, Luffin [siehe Islam et al., Agricultural Biological Chem., 54(5): 1343–1345 (199)], α-Trichosanthin [siehe Chow et al., J. Biol. Chem., 265: 8670–8674 (1990)], Momordin I [siehe Ho et al., BBA, 1088: 311–314 (1991)], Mirabilis antivirales Protein [siehe Habuka et al., J. Biol. Chem., 264(12): 6629–6637 (1989)], antivirales Protein isoliert aus den Samen von Phytolacca americana [siehe Kung et al., Agric. Biol. Chem., 54(12): 3301– 3318 (1990)] und Saporin [siehe Benatti et al., Eur. J. Biochem., 183: 465–470 (1989)] werden individuell angeordnet mit der Primärsequenz der Ricin-A-Kette [siehe Halling et al., Nucleic Acids Res., 13: 8019–8033 (1985)], jeweils in den 1 bis 9, gemäß dem Algorithmus von Myers et al., supra, wie oben spezifiziert.
Die 1 bis 9 können genutzt werden, um die Aminosäurepositionen der Typ-I-RIPs vorherzusagen, an denen die Cystinreste ersetzt werden können. Bevorzugte Aminosäuren für die Cysteinsubstitution befinden sich auf der Oberfläche des Moleküls und schließen alle Lösungsmittel zugänglichen Aminosäuren ein, die nicht mit der richtigen Faltung des Proteins interferieren werden, wenn sie durch ein Cystein ersetzt werden. Ein Bereich der Ricin A-Kette, umfassend solche Aminosäuren, ist der +carboxyterminale Bereich. Aminosäuren, die für die Ersetzung vermieden werden sollten, sind diejenigen, die für die richtige Proteinfaltung kritisch sind, wie Prolin, und auch diejenigen, die nicht für Lösungsmittel zugänglich sind. Auch sollten die neun unter den RIPs Invarianten Aminosäuren vermieden werden, wie auch die Aminosäuren in oder in der Nähe der Bereiche, umfassend die aktive Stelle der Ricin A-Kette, wie in 6 von Katzin et al., supra, gezeigt.
Daher ist ein bevorzugter Bereich der Substitution für die Typ-I-RIPs ihr carboxyterminaler Bereich, der Lösungsmittel zugänglich ist und dem carboxyterminalen Bereich entspricht, indem die A-Ketten und B-Ketten der Typ-II-RIPs natürlicherweise über eine Disulfidbindung verbunden sind. Wie in den Beispielen gezeigt, kann ein Cystein in den Positionen der Aminosäuresequenz eines Typ-I-RIPs ersetzt werden von der Position, entsprechend der Position 251 in der SEQ ID NR: 1, bis zur carboxyterminalen Position des Typ-I-RIPs, was zu RIP-Analoga führt, die die enzymatische Aktivität beibehalten und die Befähigung zur Quervernetzung über Disulfide gewinnen. Eine für die Cysteinsubstitution bevorzugte Position befindet sich in der Nähe der Position, die dem Cystein in Position 259 in der Ricin A-Kette entspricht.
Die vorliegende Erfindung spezifisch veranschaulichende Immuntoxine, eingeschlossen cytotoxische Mittel und Genfusionsprodukte, sind insbesondere für die Verwendung in der Behandlung von Autoimmunerkrankungen des Menschen geeignet, in denen die T-Zell-Funktion involviert ist. Die Behandlung von Autoimmunerkrankungen mit Immuntoxinen ist in der parallel geeigneten US-Patentanmeldung der Serien-Nr. 07/306,433, eingereicht am 13. September 1991, und in der Internationalen Patentveröffentlichung WO 89/06968, veröffentlicht am 10. August 1989, beschrieben, die durch Bezugnahme hierin aufgenommen sind. Beispiele für Autoimmunerkrankungen sind der systemische Lupus Erythematosus, die Sclerodermien (eingeschlossen Lichen Sclerosus, Morphea und Lichen Planus), die rheumatoide Arthritis, die chronische Thyreoiditis, Pemphigus Vulgaris, Diabetes Mellitus vom Typ 1, die progressive systemische Sklerose, die aplastische Anämie, die Myasthenia Gravis, die Myositis, das Sjogrens-Syndrom, Morbus Crohn, die ulcerative Colitis und die primäre Leberzirrhose. Die Autoimmunität ist auch bei der multiplen Sklerose, der Uveitis, der Psoriasis und der Menier-Krankheit involviert. Eine allgemeine Beschreibung verschiedener Autoimmunerkrankungen findet sich in Rose und Mackey, Herausgeber, "The Autoimmune Diseases", Academic Press (1985).
Die Immunotoxine können einem Patienten entweder einzeln oder in einem Cocktail, der zwei oder mehr Immunotoxine, andere therapeutische Mittel, Zusammensetzungen oder Ähnliches enthält, verabreicht werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf immunsuppressive Mittel; Toleranz induzierende Mittel, Verstärker und Nebenwirkungen er leichternde Mittel. Besonders bevorzugt sind immunsupprimierende Mittel, die nützlich sind bei der Unterdrückung allergischer Reaktionen eines Wirts. Bevorzugte immunsupprimierende Mittel schließen ein Prednison, Prednisolon, DECADRN (Merck, Sharp & Dohme, West Point, Pennsylvania), Cyclophosphamid, Cyclosporin, 6-Mercaptopurin, Methotrexat, Azathioprin und i.v. Gamma-globulin oder deren Kombination. Bevorzugte Verstärker schließen ein Monensin, Ammoniumchlorid, Perhexilin, Verapamil, Amantadin und Chloroquin. Alle diese Mittel werden verabreicht in allgemein akzeptierten wirk-samen Dosisbereichen, wie z. B. jene, offenbart in Physician's Desk Reference, 41. Auflage, Verlag Edward R. Barnhart, New Jersey (1987). Die Patentzusammenarbeitsvertrags-(PCT)-Patentanmeldung WO 89/069767, veröffentlicht am 10. August 1989, offenbart die Verabreichung eines Immunotoxins als ein immunsupprimierendes Mittel und wird hierin durch Bezugnahme einbezogen.
Gegen T-Zellen gerichtete Immunotoxine können formuliert werden in entweder einer injizierbaren oder einer topischen Zubereitung. Parenterale Formulierungen sind bekannt und geeignet zur Verwendung in der Erfindung, vorzugsweise für die intramuskuläre oder intravenöse Applikation. Die Formulierungen, die therapeutisch wirksame Mengen an Immunotoxinen enthalten, sind entweder sterile, flüssige Lösungen, flüssige Suspension oder lyophylisierte Ausführungen und enthalten wahlweise Stabilisatoren oder Trägerstoffe. Lyophylisierte Zusammensetzungen werden rückgebildet mit geeigneten Verdünnungsmitteln, z. B. Wasser zur Injektion, physiologischer Salzlösung, 0,3 % Glycin und Ähnlichem, für einen Spiegel von ungefähr von 0,01 mg/kg des Körpergewicht des Wirts bis 10 mg/kg, wo die biologische Aktivität weniger ist als oder gleich ist mit 20 ng/ml, wenn sie in einem Retikulozyten-Lysat-Test gemessen wird. Typischerweise werden die Anti-T-Zellen-Immunotoxine enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen in einer therapeutisch wirksamen Dosis in einem Bereich von ungefähr 0,01 mg/kg bis ungefähr 5 mg/kg des Patienten verabreicht. Eine bevorzugte, therapeutisch wirksame Dosis der Anti-T-Zellen-Immunotoxine der vorliegenden Erfindung enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzung liegt in einem Bereich von ungefähr 0,01 mg/kg bis ungefähr 0,5 mg/kg Körpergewicht des Patienten, verabreicht über etliche Tage bis zwei Wochen durch tägliche intravenöse Infusion, wobei jede über einen Zeitraum von einer Stunde gegeben wird, in einer sequenziellen Patientendosis-Anstiegs-Abfolge.
Anti-T-Zell-Immunotoxine, können in topischen Zubereitungen formuliert werden für die lokale Therapie, indem eine therapeutisch wirksame Konzentration des Anti-T-Zell-Immunotoxins in ein dermatologisches Vehikel eingeschlossen wird. Die Menge des zu applizierenden Anti-T-Zell-Immunotoxins und die Anti-T-Zell-Immunotoxinkonzentration in den topischen Formulierungen hängen ab von dem gewählten Vehikel, dem klinischen Zustand des Patienten, der systemischen Toxizität und der Stabilität des Anti-T-Zell-Immunotoxins in der Formulierung. Folglich versteht ein Arzt, die angemessene Zubereitung, die die angemessene Konzentration des Anti-T-Zell-Immunotoxins in der Formulierung enthält, anzuwenden, ebenso wie die angemessene Menge der Formulierung zu applizieren, in Abhängigkeit der klinischen Erfahrung mit dem fraglichen Patienten oder mit ähnlichen Patienten. Die Konzentration des Anti-T-Zell-Immunotoxins für topische Formulierungen liegt in dem Bereich von größer als von ungefähr 0,1 mg/ml bis ungefähr 25 mg/ml. Typischerweise liegt die Konzentration des Anti-T-Zell-Immunotoxins für topische Formulierungen in dem Bereich von größer als von ungefähr 1 mg/ml bis ungefähr 20 mg/ml. Feste Dispersionen von Anti-T-Zell-Immunotoxin ebenso wie solubilisierte Zubereitungen können verwendet werden. Folglich ist die genaue, in dem Vehikel zu verwendende Konzentration der mäßigen experimentellen Manipulation ausgesetzt, um die therapeutische Antwort zu optimieren. Zum Beispiel können mehr als ungefähr 10 mg Anti-T-Zell-Immunotoxin/100 g Vehikel nützlich sein mit 1% w/w Hydrogelvehikel bei der Behandlung von Hautentzündung. Geeignete Vehikel, zusätzlich zu Gelen, sind Öl-in-Wasser- oder Wasser-in-Öl-Emulsionen unter Verwendung von Mineralölen, Petroleum und Ähnlichem.
Anti-T-Zell-Immunotoxine können wahlweise topisch durch die Verwendung eines transdermalen, therapeutischen Systems verabreicht werden [Barry, Dermatological Formulations, S. 181 (1983) und die darin zitierte Literatur]. Während solche topischen Applikationssysteme gestaltet sind für die transdermale Verabreichung von Wirkstoffen niedrigen Molekulargewichts, sind sie der perkutanen Applikation befähigt. Weiterhin können solche Systeme leicht angepasst werden an die Verabreichung von ANTI-T-ZELLEN Immunotoxinen oder deren Derivate und assoziierten therapeutischen Proteinen durch die angemessene Auswahl der die Geschwindigkeit kontrollierenden mikroporösen Membran.
Topische Zubereitung von Anti-T-Zellen Immunotoxinen, welche Fusionsproteine der Erfindung sind, können sowohl für die systemische oder lokale Applikation verwendet werden, und können Trägerstoffe, wie oben beschrieben für die parenterale Verabreichung, enthalten, und andere Trägerstoffe, die in einer topischen Zubereitung verwendet werden, wie z. B. Verschnittmittel, Tenside, Öle, Benetzungsmittel, Weichmacher, Konservierungsmittel, Stabilisatoren und Antioxidantien. Pharmakologisch annehmbare Puffer können verwendet werden, z. B. Tris oder Phosphatpuffer. Die topischen Formulierungen können ebenso wahlweise eines oder mehrere Agenzien einschließen, die verschieden bezeichnet werden als Verstärker, Tenside, Beschleuniger, Adsorptionsbeschleuniger oder Penetrationsverstärker, wie z. B. ein Mittel zum Verstärken der perkutanen Penetration des Anti-T-Zellen Immunotoxins oder anderer Agenzien. Solche Agenzien sollten wünschenswerterweise einige oder alle der folgenden Eigenschaften besitzen, was dem Durchschnittsfachmann bekannt sein würde: pharmakologische Passivität, Nichtfördern den Verlust von Körperflüssigkeit oder Elektrolyt, kompatibel mit Anti-T-Zellen Immunotoxin (nicht inaktivierend) und geeignet für die Formulierung in Cremes, Gelen oder anderen topischen Applikationssystemen, wie gewünscht.
Anti-T-Zellen Immunotoxine können ebenso verabreicht werden durch Aerosol, um eine lokalisierte Applikation an die Lungen zu erreichen. Dies wird erzielt, indem ein wässriges Aerosol, eine liposomale Zubereitung oder feste Partikel, die Anti-T-Zellen Immunotoxin enthalten, zubereitet werden. Gewöhnlich wird ein wässriges Aerosol hergestellt durch Formulieren einer wässrigen Lösung oder Suspension des Anti-T-Zellen Immunotoxins gemeinsam mit üblichen, pharmazeutisch annehmbaren Trägern und Stabilisatoren. Die Träger und Stabilisatoren variieren in Abhängigkeit von den Erfordernissen für das bestimmte Anti-T-Zellen Immunotoxin, aber schließen typischerweise ein: nichtionische Tenside (Tweens, Pluronics oder Polyethylenglykol); unschädliche Proteine, wie Serumalbumin, Sorbitanester, Ölsäure, Lecithin; Aminosäuren, wie z. B. Glycin; und Puffer, Salze, Zucker oder Zuckeralkohole. Die Formulierungen können auch mukolyti-sche Agenzien, ebenso wie bronchodilatierende Agenzien einschließen. Die Formiulie rungen sind steril. Aerosole sind im Allgemeinen zubereitet aus isotonischen Lösungen. Die Partikel schließen wahlweise normale Lungenantiatelektasefaktoren ein.
Die Aerosole können aus den Teilchen in wässriger oder nicht-wässriger (z. B. Fluorkohlenwasserstoffe als Treibmittel) Suspension hergestellt werden. Solche Teilchen schließen bspw. ein intra-molekulare Aggregate von Anti-T-Zellen-Immuntoxin oder Derivate davon. Die Aerosole sollten frei von die Lunge irritierenden Substanzen, d. h. Substanzen sein, die akute Bronchokonstriktion, Husten, Lungenödeme, oder Gewebezerstörung verursachen. Nicht irritierende, die Absorption fördernde Mittel sind jedoch für die Verwendung hierin geeignet. Ultraschallzerstäuber werden vorzugsweise bei der Herstellung von Aerosolen verwendet. Ultraschallzerstäuber minimieren die Exposition des Anti-T-Zellen Immuntoxins oder von dessen Derivaten an Scherkräfte, die zur Zersetzung des Anti-T-Zellen-Immuntoxins führen können.
Anti-T-Zellen Immunotoxine können systemisch verabreicht werden, eher als topisch, durch intramuskuläre, subkutane, intrathecale oder intraperitoneale Injektion oder durch Injektion in Gefäßräume, insbesondere in die Gelenke, z. B. interartikuläre Injektion in einer Dosierung von größer als ungefähr 1 μg/cc Gelerikflüssigkeit/Tag. Die Dosis wird abhängig sein von den Eigenschaften des verwendeten Anti-T-Zellen Immunotoxins, z. B. seiner Aktivität und biologischen Halbwertszeit, der Konzentration des Anti-T-Zellen Immunotoxins in der Formulierung, der Stelle und Geschwindigkeit der Dosierung, der klinischen Toleranz des involvierten Patienten, der Autoimmunkrankheit, die den Patienten heimsucht, und Ähnlichem, was gut innerhalb des Könnens des Arztes liegt.
Die Anti-T-Zellen Immunotoxine der vorliegenden Erfindung können in Lösung verabreicht werden. Der pH der Lösung sollte im Bereich von pH 5 bis 9,5 liegen, vorzugsweise pH 6,5 bis 7,5. Die Anti-T-Zellen Immunotoxine oder deren Derivate sollten in einer Lösung sein mit einem geeigneten pharmazeutisch annehmbaren Puffer, wie z. B. Phosphat, Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCl oder Citrat und Ähnlichem. Pufferkonzentrationen sollten in dem Bereich von 1 bis 100 mM liegen. Die Anti-T-Zellen Immunotoxinlösung kann auch ein Salz enthalten, wie z. B. Natriumchlorid oder Kaliumchlorid in einer Konzentration von 50 bis 150 mm. Eine wirksame Menge eines sta bilisierenden Mittels, wie z. B. ein Albumin, ein Globulin, eine Gelatine, ein Protamin oder ein Salz von Protamin kann ebenso eingeschlossen werden und kann zu einer Lösung, die Anti-T-Zellen Immunotoxin enthält, oder zu der Zusammensetzung, aus der die Lösung zubereitet wird, hinzugefügt werden.
Die systemische Verabreichung des Immunotoxins kann täglich und im Allgemeinen durch intramuskuläre Injektion, obwohl intravaskuläre Infusion annehmbar ist, durchgeführt werden. Die Verabreichung kann auch intranasal oder durch andere nicht parenterale Wege erfolgen. Anti-T-Zellen Immunotoxine können auch verabreicht werden über Mikrokugeln, Liposomen oder andere mikropartikuläre Applikationssysteme, die in gewissen Geweben einschließlich Blut platziert werden. Topische Zubereitungen werden täglich direkt auf die Haut oder Schleimhaut aufgetragen und sind dann vorzugsweise okkludiert, das heißt geschützt durch Überlagerung einer Bandage, eines Polyolefinfilms oder einer anderen Barriere, die undurchlässig ist für die topische Zubereitung.
Die folgenden Beispiele sind erläuternd für die Praxis der Erfindung, aber sind nicht als die Erfindung begrenzend aufzufassen. Die vorliegende Anmeldung wird in großen Zügen wie folgt aufgebaut. Beispiel 1 ist die Beschreibung der Klovierung der cDNS, codierend das Typ-I-RIP Gelonin. Der Bau des Expressionsvektors, umfassend das Geloningen, wird in Beispiel 2 gelehrt. Die Konstruktion von Geloninanalogen mit Cysteinresten, die zugänglich sind für die Konjugation, wird im Beispiel 3 gelehrt, und Beispiel 4 stellt Ergebnisse eines Retikulozyten-Lysat-Testes, durchgeführt mit rekombinantem Gelonin und Geloninanalogen, auf die Fähigkeit der Inhibition der Proteinsynthese bereit. Beispiel 5 zeigt die Beschreibungen der Herstellung verschiedener Gelonin-Immunkonjugate. Beispiel 6 beschreibt das Testen der Immunkonjugate auf ihre Fähigkeit, als cytotoxische Mittel in einem Gesamtzellen-Abtötungs-Test zu fungieren. Beispiel 7 stellt die Löslichkeits- und Stabilitäts-Eigenschaften der Immunkonjugate dar. Beispiel 8 stellt die Ergebnisse von in vivo-Pharmakokinetiken und Immunogenitätsuntersuchungen der Gelonin-Immunkonjugate dar; und Beispiel 9 präsentiert die Ergebnisse von Tests der Immunkonjugate auf die Fähigkeit, humane T-Zellen abzureichern in einem Maus-Modell eines menschlichen peripheren Blutlymphocyten (PBL) rekonstituierten, schweren kombinierten Immundefektes. Beschrieben in Beispiel 10 sind verschiedene Genfusionen von Gelonin-DNS-Sequenzen und Sequenzen, welche Antikörperfragmente codieren. Die Expression von Produkten dieser Genfusionsprodukte und das Testen der Produkte in dem Retikulozyten- und Gesamtzelt-Abtötungs-Test sind in Beispiel 11 beschrieben. Beispiel 12 ist eine Beschreibung der Konstruktion von Gelonin-Genfusionen an Einzelkettenantikörper. Beispiel 13 beschreibt die Klonierung einer cDNS, codierend das Typ-I-RIP BRIP, die Konstruktion von Expressionsvektoren, enthaltend das BRIP-Gen, die Produktion von BRIP-Analoga mit einem einzelnen Cystein, das für Disulfidbindungen verfügbar ist, das Testen der Analoga in dem Retikulozyten-Lysat-Test, und die Konstruktion der BRIP-Immunkonjugate und das Testen ihrer Aktivität in dem Gesamtzell-Abtötungs-Test. Beispiel 14 beschreibt das Klonieren einer cDNS, codierend Momordin II, und die Konstruktion von Expressionsvektoren, enthaltend das Momordin-II-Gen.
Beispiel 1
Zubereitung von Gelonin
Die Klonierung des Geloningens gemäß der vorliegenden Erfindung beseitigt das Erfordernis, das RIP-Genprodukt aus seiner vergleichsweise seltenen, natürlichen Quelle, G. multif1orum-Samen, aufzureinigen, und erlaubt ebenfalls die Entwicklung von Geloninanaloga, welche konjugiert werden können mit Antikörpern ohne vorausgehende chemische Derivatisierung und erlaubt ebenfalls die Entwicklung von Geloningenfusionsprodukten. Eine beachtliche Hürde bei der Klonierung des Gens bestand darin, dass die verfügbaren Gelonium-Samen alt und nicht mehr lebensfähig waren, was die Präparation intakter Messenger-RNS aus den Samen unmöglich machte. Die Klonierung des Gens aus aus Messenger-RNS hergestellter DNS war somit undurchführbar, und die Gesamt-RNS wurde zur Erzeugung der cDNS verwendet. Die Verwendung von RNS zur Herstellung von cDNS unter normalen Umständen, d. h. dann, wenn mRNS genutzt werden kann, ist nicht erwünscht, da die Gesamt-RNS typischerweise etwa 95% ribosomale RNS enthält.
A. Zubereitung von RNS aus G. multiflorum-Samen
Gesamt-RNS wurde zubereitet aus Geloniumsamen (Dr. Michael Rosenblum, M.D. Anderson Cancer Center, Houston, Texas) durch eine Anpassung des Vorgehens für die Zubereitung von Pflanzen-RNS, beschrieben in Ausubel et al., Hrsg., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, 1989. In Kürze, 4,0 g Samen wurden zu einem feinen Pulver vermahlen in einem vorgekühlten (–70°C) Mörser und Pistill mit flüssigem N₂. Das Pulver wurde hinzugefügt zu 25 ml Mahlpuffer (0,18 M Tris, 0,09 M LiCI, 4,5 mM EDTA, 1% SDS, pH 8,2) zusammen mit 8,5 ml Phenol, welches mit TLE (0,2 M Tris, 0,1 M LiCI, 5 mM EDTA, pH 8,2) äquilibriert ist. Die Mischung wurde homogenisiert unter Verwendung eines Polytron PT-1035 (Einstellung #5). Es wurden 8,5 ml Chloroform hinzugefügt, gemischt und inkubiert bei 50°C für 20 Minuten. Die Mischung wurde zentrifugiert bei 3000 g für 20 Minuten in einem auf 4°C vorgekühlten Rotor und die wässrige Phase wurde in ein neues Röhrchen verbracht. Es wurden 8,5 ml Phenol hinzugefügt, gefolgt von 8,5 ml Chloroform, und die Mischung wurde erneut zentrifugiert. Diese Extraktion wurde dreimal wiederholt. Die RNS in der wässrigen Phase wurde dann gefällt durch Hinzufügen von 1/3 Volumen 8 M LiCI und inkubiert bei 4°C für 16 Stunden. Als Nächstes wurde die RNS pelletiert durch Zentrifugation für 20 Minuten bei 4°C. Das Pellet wurde gewaschen mit 5 ml 2 M LiCI, erneut zentrifugiert und resuspendiert in 2 ml Wasser. Die RNS wurde gefällt durch Zugabe von NaOAc auf 0,3 M und 2 Volumen Ethanol. Die RNS wurde gelagert in 70% Ethanol bei 70°C.
B. cDNS-Zubereitung
cDNS wurde zubereitet aus Gesamtgelonium-RNS durch zwei ähnliche Verfahren.
Das erste Verfahren war verbunden mit der Herstellung einer cDNS-Library in dem bakteriellen Expressionsplasmid pcDNAII unter Verwendung des LibrarianII cDNA Library Construction System Kit (Invitrogen). Annähernd 5 μg der Gesamt-RNS wurde umgewandelt in Erststrang-cDNS mit einer 1 : 1-Mischung von zufälligen Primernund Oli- go-dT. Die Synthese des zweiten Strangs mit DNS-Polymerase I wurde durchgeführt, wie beschrieben durch den Systemhersteller. Zweisträngige cDNS wurde ligiert an BstXl-Linker und größenfraktioniert. Stücke größer als ungefähr 500 bp wurden in den Expressionsvektor, der durch den Kit bereitgestellt wurde, ligiert. Einzelne Vektoren wurden eingeführt in E. coli, entweder durch Transformation in hocheffiziente kompetente Zellen oder durch Elektroporation in elektrokompetente Zellen. Elektroporation wurde durchgeführt mit einer BTX100-Einheit (BTX, San Diego, CA) in 0,56 μ Flatpack-Zellen, wie empfohlen durch BTX, basierend auf dem Verfahren von Dower et al., Nucleic Acids Res., 16: 6127–6145 (1988), in einer Spannungsamplitude von 850 V und einer Pulslänge von 5 ms. Die resultierende Bibliothek bestand aus ungefähr 150.000 Kolonien.
Das zweite Verfahren war verbunden mit der Erzeugung von cDNS unter Verwendung des RNA-PCR-Kits, verkauft durch Perkin-Elmer-Cetus. Ungefähr 100 ng Gesamtgelonium-RNS wurde verwendet als Template für cDNS-Synthese.
C. Bestimmung der Geloninproteinsequenz
Die Teilsequenz des natürlichen Geloninproteins wurde bestimmt durch direkte Aminosäuresequenzanalyse unter Verwendung des automatisierten Edman-Abbaus, wie empfohlen durch den Hersteller, unter Verwendung eines Applied Biosystems Modell 470A Proteinsequenziergerätes. Proteolytische Peptidfragmente von Gelonin (isoliert aus derselben Charge an Samen wie die Gesamt-RNS) wurden sequenziert.
D. Klonierung des Geloningens
Drei überlappende Gelonin-cDNS-Fragmente wurden kloniert und ein zusammengesetztes Geloningen wurde aus den drei Fragmenten zusammengebaut.
1. Klonierung des die mittleren Aminosäuren von Gelonin kodierenden Fragmentes im Vektor pING3823
Degenerierte DNS-Primer, basierend auf den Gelonin-Teilaminosäuresequenzen, wurden verwendet, um mittels PCR Segmente der mit dem Perkin-Elmer-Cetus-Kit erzeugten cDNS zu amplifizieren. Sechs Primer wurden entwickelt, basierend auf Regionen der Gelonin-Aminosäuresequenz, in denen die Degeneriertheit der Primer minimiert werden könnte. Geeignete Primerpaare wurden getestet für die Amplifikation eines Geloningenfragments. Wenn Produkte der erwarteten DNS-Größe als ethidiumbromidgefärbte DNS-Banden auf Agarosegelen identifiziert wurden, würde diese DNS mit T4-DNS-Polymerase behandelt und dann aufgereinigt aus einem Agarosegel. Nur das Primerpaar, das aus als Gelo-7 und Gelo-5 bezeichneten Primern bestand, ergab ein vergleichsweise reines Produkt der erwarteten Größe. Die Sequenzen der degenerierten Primer Gelo-7 und Gelo-5 sind unten aufgezeigt unter Verwendung von IUPAC-Nukleotidsymbolen.
Der Primer Gelo-7 entspricht den Aminosäuren 87–97 von Gelonin, während der Primer Gelo-5 den Aminosäuren 226–236 entspricht. Das stumpf endende DNS-Fragment (entsprechend mit den Aminosäuren 87–236 von Gelonin), erzeugt mit den Primern Gelo-7 und Gelo-8, wurde kloniert in pUCl8 (BRL, Gaithersburg, Maryland). Die DNS-Sequenz des Inserts wurde bestimmt und die, basierend auf der resultierenden DNS, abgeleitete Aminosäuresequenz entsprach der experimentell bestimmten Gelonin-Aminosäuresequenz. Der Klon, der dieses Geloninsegment enthielt, wurde als pING3726 bezeichnet.
Das Insert von Klon pING3726 wurde mit ³²P markiert und verwendet als eine Sonde, um die 150.000-gliedrige Gelorium-cDNS-Bibliothek zu screenen. Nur ein Klon hybridisierte mit der doppelt ausplattierten Bibliothek. Dieser Klon wurde von der Bibliothek gereinigt und seine DNS-Sequenz wurde bestimmt. Der Klon enthält ein Fragment, das 185 der 270 Aminosäuren von Gelonin (Reste 25–209) kodiert und wird pING3823 bezeichnet.
2. Klonieren des die N-terminalen Aminosäuren von Gelonin kodierenden Fragmentes
Basierend auf der für das Geloningensegment in pING3726 bestimmten Sequenz wurden genaue Oligonukleotidprimer als PCR-Amplifikationsprimer gestaltet, um in Verbindung mit einem degenerierten Primer verwendet zu werden, um ein 5'-Geloningenfragment zu amplifizieren, und mit einem nicht spezifischen Primer, um ein 3'-Geloningenfragment zu amplifizieren. Die unter Verwendung des Perkin-Elmer-Cetus RNS-PCR-Kits erzeugte cDNS wurde amplifiziert.
Um das 5'-Ende des Geloningens zu amplifizieren, wurde PCR-Amplifikation mit einem degenerierten Primer Gelo-1 und einem genauen Primer Gelo-10 durchgeführt. Die Sequenzen der Primer sind unten angeführt.
Der Primer Gelo-1 entspricht den Aminosäuren 1–1 des Geloningens, wohingegen der Primer Gelo-10 den Aminosäuren 126–133 entspricht. Das Produkt der Reaktion wurde erneut amplifiziert mit Gelo-1 (SEQ ID NO 16) und Gelo-11 (ein genauer Primer, umfassend Sequenzen, die die Aminosäuren 119–125 von Gelonin kodieren), um dem Reaktionsprodukt Spezifität zu verleihen. Die Sequenz des Primers Gelo-11 ist unten aufgelistet.
Hybridisierung mit einer internen Sonde bestätigte, dass das gewünschte spezifische Gelonin-DNS-Fragment amplifiziert wurde. Jenes Fragment wurde in pUC 18 kloniert und der erzeugte Vektor wurde als pING3727 bezeichnet. Das Fragment wurde sequenziert, wodurch offenbart wurde, dass die Region des Fragmentes (die ersten 27 Nukleotide), die einem Teil des degenerierten Primers Gelo-1 entsprachen, nicht translatiert werden konnte, um. die Aminosäuresequenz zu ergeben, auf der der Primer Gelo-1 ursprünglich basierte. Dies war nicht unerwartet in Anbetracht der Degeneriertheit des Primers. Das Fragment wurde erneut amplifiziert aus der Gelonium-cDNS mit den genauen Primern Gelo-11 (SEQ ID NO 18) und Gelo-5' (welcher sieh stromaufwärts des 5'-Endes des Geloningens erstreckt, zusätzlich zur Kodierung der ersten 16 Aminosäuren von Gelonin). Die Sequenz des Primers Gelo-5' ist unten angeführt.
Das resultierende DNS-Fragment kodiert die ersten 125 Aminosäuren von Gelonin. Während die Mehrheit der Sequenz identisch ist mit dem natürlichen Geloningen, können die ersten 32 Nukleotide des DNS-Fragmentes unterschiedlich sein. Für die Zwecke dieser Anmeldung wird auf dieses N-terminale Fragment Bezug genommen als Fragment GELl-125.
3. Klonieren des die C-terminalen Aminosäuren von Gelonin kodierenden Fragmentes
Um das 3'-Ende des Geloningens zu amplifizieren, ebenso wie die 3' nicht translatierten Sequenzen, wurde PCR-Amplifikation mit genauen Primern Gelo-9 und XE-dT durchgeführt. Die Sequenz von jedem der Primer ist unten angeführt.
Der Primer Gelo-9 entspricht den Aminosäuren 107–113 von Gelonin. Der Primer XE-dT besteht aus einem 3'-Oligo-dT-Teil und einem 5'-Teil, der die Restriktionsstellen HindIII und XhoI enthält, und wird jegliche Poly-A enthaltende cDNS primen. Das Reaktionsprodukt wurde erneut amplifiziert mit genauen Primern Gelo-8 und XE. Die Sequenzen der Primer Gelo-8 und XE sind unten aufgeführt.
Der Primer Gelo-8 ist zusammengesetzt aus Sequenzen, die die Aminosäuren 115–120 von Gelonin kodieren, wohingegen der Primer XE dem 5'-Teil des XE-dT-Primers entspricht, welcher HindIII- und XhoI-Restriktionsstellen enthält. Die Hybridisierung mit internen Sonden bestätigte, dass das gewünschte Geloningenfragment amplifiziert wurde. Dieses Fragment wurde dann in pUCl8 kloniert durch zwei unterschiedliche Verfahren. Erstens wurde es kloniert als ein stumpf endendes Fragment in die SmaI-Stelle von pUC 18 (der resultierende Vektor wurde pING3728 genannt), und zweitens wurde es als ein EcoRI- bis HindIII-Fragment in pUC18 kloniert (dieser Vektor wurde pING3729 genannt). Beide Vektorinserts wurden sequenziert. Das Insert von pING3728 kodiert die Aminosäuren 114–270 von Gelonin, wohingegen das Insert von pING3729 die Aminosäuren 184–270 von Gelonin plus weitere 3'-Sequenzen kodiert.
4. Zusammenbau der überlappenden Gelonin-DNS-Fragmente zu einem zusammengesetzten Geloningen
Um die C-terminalen Zweidrittel des Geloningens wieder zusammenzubauen, wurde der Vektor pING3729 mit SspI (eine SspI-Stelle liegt im Vektor und die zweite liegt ungefähr 80 bp stromabwärts des Stoppcodons des Inserts im Vektor) geschnitten und ein XhoI-Linker (8 bp, New England Biolabs) wurde mit den resultierenden freien Enden ligiert. Die DNS wurde dann geschnitten mit XhoI und EcoRI und das erzeugte 350 bp Fragment, welches die Aminosäuren 185–270 von Gelonin kodiert, wurde isoliert. Dieses 35 bp Fragment wurde benachbart zu einem NcoI- bis EcoRI-Fragment von pING3823, das die Aminosäuren 37–185 von Gelonin kodiert, in einen intermediären Vektor, bezeichnet als pING3730, ligiert, wodurch folglich die terminalen 87% des Geloningens (Aminosäuren 37–270) wieder zusammengebaut wurden.
Als Nächstes wurde das Fragment GEL1-125 mit SmaI und NcoI geschnitten, wodurch ein Fragment, das die Aminosäuren 1–36 von Gelonin kodiert, resultierte, welches zusammen mit dem NcoI- bis XhoI-Fragment von pING3730 in den Vektor pIC100 ligiert wurde. [pIC100 ist identisch mit pING1500, beschrieben in Better et al., Science, 240: 1041–1043 (1988), mit der Ausnahme, dass ihm 37 bp stromaufwärts der pe1B-Signalsequenz fehlen. Die 37 bp wurden eliminiert durch Verdauung von pING1500 mit SphI und EcoRI, Behandlung mit T4-Polymerase und erneutem Ligieren des Vektors. Diese Beeinflussung regenerierte eine EcoRI-Stelle in dem Vektor, während andere unerwünschte Restriktionsstellen eliminiert wurden.] Vor der Ligierung war der Vektor pIC100 zuvor mit SstI verdaut worden, behandelt mit T4-Polymerase und geschnitten mit XhoI. Die Ligierung erzeugte einen neuen Vektor, der ein vollständiges Geloningen enthielt, welches als Plasmid pING3731 bezeichnet wurde (ATCC-Zugangsnummer 68721). Die vollständige DNS-Sequenz des Geloningens ist angeführt in SEQ ID NO 11.
Beispiel 2
Konstruktion der das Geloningen enthaltenden Expressionsvektoren
Ein erster E. coli-Expressionsvektor wurde konstruiert, enthaltend das Geloningen, welches an die Erwinia carotovora pelB-Leadersequenz und an den Salmonella typhinrurium araB-Promotor gekoppelt ist. Ein grundlegender Vektor, der den araB-Promotor enthält, ist beschrieben in dem mit zu eigenen US-Patent Nr. 5,028,530, erteilt am 2. Juli 1991, welches durch Bezugnahme eingeschlossen ist. Der den araB-Promotor enthaltende Vektor wurde geschnitten mit EcoRI und XhoI. Zwei DNS-Fragmente wurden dann in das Tandem unmittelbar stromabwärts des Promotors ligiert. Das benachbart zu dem Promotor ligierte Fragment war ein 131 bp Fragment, welches erhalten wurde durch SstI-Verdauung, T4-Polymerasebehandlung und Verdauung mit EcoRI von dem pIC100-Vektor, welcher die Leadersequenz des E. carotovora pelB-Gens einschließt. Die translatierte Leadersequenz ist ein Signal für die Sekretion des jeweiligen Proteins durch die cytoplasmatische Membran. Das stromabwärts der Leadersequenz ligierte Fragment war ein SmaI- bis XhoI-Fragment von pING3731, welches das vollständige Geloningen enthält.
Folglich enthält der Expressionsvektor das Geloningen gekoppelt an die pe1B-Leadersequenz und den araB-Promotor. Dieses Plasmid wird pING3733 genannt.
Ein zweiter Expressionsvektor kann konstruiert werden, der identisch ist mit dem ersten, mit der Ausnahme, dass die Geloningensequenzen, die die 19 C-terminalen Aminosäuren von Gelonin kodieren, nicht enthalten sind. Die cDNS-Sequenz des Geloningens sah ein 19 Reste aufweisendes C-terminales Segment voraus, das in keinem der Peptidfragmente, die für die Bestimmung der Gelonin-Aminosäuresequenz erzeugt wurden, nachgewiesen worden war. Diese 19 Aminosäuren könnten ein Peptidsegment repräsentieren, welches posttranslational von dem reifen Toxin abgespalten wurde, das heißt es ist nicht vorhanden in dem natürlichen Protein. Ein ähnliches C-terminales Aminosäuresegment wurde identifiziert in dem Pflanzentoxin α-Trichosanthin [Chow et al., J. Biol. Chem., 265: 8670– 8674 (1990)]. Demzufolge könnte das Expressionsprodukt ohne das C-terminale Fragment von Bedeutung sein.
Zur Konstruktion eines Gelonin-Expressionsvektors ohne die 19 C-terminalen Aminosäuren von Gelonin wurde PCR verwendet, um das 3'-Ende des Gens zu amplifizieren und zu ändern. pING3728 wurde amplifiziert mit den Primern Gelo-14 und Gelo-9 (SEQ ID NO 20). Die Sequenz des Primers Gelo-14 ist unten angeführt.
Der Primer Gelo-14, welcher mit den Gelonin-Aminosäuren 245 bis 256 entspricht, führt ein Stoppcodon (in der Primersequenz unterstrichen) in die Geloningensequenz ein, welches die Transkription des Gens unterbricht, vor den Sequenzen, die die terminalen 19 Aminosäuren des Gelonins kodieren, und führt auch eine XhoI-Stelle unmittelbar stromabwärts des Stoppcodons ein. Das PCR-Produkt wurde geschnitten mit XhoI und EcoRI und das resultierende 208 bp-Fragment, das die Aminosäuren 185–251 von Gelonin kodiert, wurde von einem Agarosegel aufgereinigt. Dieses Fragment wurde benachbart zu dem NcoI- bis EcoRI-Fragment aus pING3823, welches die Aminosäuren 37–185 von Gelonin kodiert, ligiert, um das Plasmid pING3732 zu erzeugen. Ein letzter Expressions vektor, pING3734, der ein Geloningen mit einem veränderten 3'-Ende enthält, wurde erzeugt durch Substituieren eines NcoI- bis XhoI-Fragmentes von pING3732 in pING3733, das die Aminosäuren 37–251 von Gelonin kodiert.
Identifizierung des natürlichen Gelonin-5'-Endes Umkehr-PCR wurde verwendet, um einen cDNS-Klon zu identifizieren, der das 5'-Ende des reifen Geloningens kodiert. Es wurden 5 μg von G. multiflorum-Gesamt-RNS umgewandelt in cDNS unter Verwendung des Superscript Plasmid Systems (BRL, Gaithersburg, Maryland) mit Gelo-11 (SEQ ID NO 18) als ein Primer. Gelonin-cDNS wurde selbstligiert, um kovalente, zirkuläre DNS zu erzeugen, und die ligierte DNS wurde amplifiziert durch PCR mit den Oligonukleotiden Gelo-9 (SEQ ID NO 20) und Gelo-16. Die Sequenz des Primers Gelo-16 ist unten angeführt.
Das PCR-Produkt wurde größenfraktioniert auf einem Agarosegel und DNS größer als 300 by wurde in mit SmaI geschnittenen pUC18 kloniert. Zahlreiche Klone wurden sequenziert mit dem Primer Gelo-18, dessen Sequenz unten angeführt ist.
Ein Klon, der identifiziert wurde, als einer, der das größte geloninspezifische Insert aufweist, wurde als pING3826 bezeichnet. Die DNS-Sequenz von pING3826 schloss die ersten 32 Nukleotide des natürlichen, reifen Geloningens ein, das nicht notwendigerweise vorhanden ist in den Gelonin-Expressionsplasmiden pING3733 und pING3734. Die voll-ständige DNS-Sequenz des natürlichen Geloningens ist angeführt in SEQ ID NO 57.
Konstruktion von Expressionsvektoren, die ein Geloningen mit einem natürlichen 5'-Ende enthalten Derivate der Expressionsvektoren pING3733 und pING3734 (oben beschrieben), die ein Geloningen mit der natürlichen 5'-Sequenz enthalten, wurden wie folgt erzeugt. Das 5'-Ende von Gelonin wurde amplifiziert aus pING3826 mit den PCR-Primern Gelo-16 (SEQ ID NO 24) und Gelo-17, dessen Sequenz unten angeführt ist.
Das 285 bp PCR-Produkt wurde behandelt mit T4-Polymerase und geschnitten mit NcoI. Das resultierende 100 bp 5'-Ende DNS-Fragment wurde isoliert aus einem Agarosegel und benachbart zu dem 120 by pelB-Leaderfragment aus pIC100 (geschnitten mit SstI, behandelt mit T4-Polymerase und geschnitten mit PstI) ligiert in entweder pING3733 oder pING3734, verdaut mit PstI und NcoI. Die resultierenden Plasmide pING3824 und pING3825 enthalten das gesamte natürliche Geloningen bzw. das natürliche Geloningen abzüglich der 19 Aminosäurecarboxylausdehnung, gekoppelt an die pe1B-Leadersequenz und unter der Transkriptionskontrolle des araB-Promotors. Das Genkonstrukt ohne die 19 Aminosäurecarboxylausdehnung in sowohl pING3734 als auch pING3825 kodiert ein Proteinprodukt, auf das in dieser Anmeldung als "rekombinantes Gelonin" Bezug genommen wird.
Aufreinigung von rekombinantem Gelonin
Rekombinantes Gelonin wurde aufgereinigt durch das folgende Vorgehen. E. coli-Wachstumsmedium wurde konzentriert und pufferausgetauscht auf 10 mM Natriumphosphat bei einem pH 7,0 unter Verwendung einer S10Y10-Kartusche über eine DC10-Einheit (Amicon), wobei das konzentrierte und pufferausgetauschte Material aufgetragen wurde auf eine CM52-Säule (100g, 5 × 10 cm). Die Säule wurde gewaschen mit 1 L Startpuffer und eluiert mit einem 0 bis 300 mM NaCl-Gradienten in Startpuffer (750 ml Gesamtvolumen). Die reines Gelonin enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt (die Elution war von 100 bis 250 mM NaCl), über eine Amicon YM10-Membran konzentriert, mit 10 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, äquilibriert und tiefgefroren gelagert bei –20°C. Ein weiterer Reinigungsschritt wurde versucht unter Verwendung von Blue Toyopearl Chromatographie. Dieses Vorgehen resultierte jedoch nicht in einer erhöhten Reinheit des Materials und resultierte in ungefähr 50% Verlust des Ausgangsmaterials.
Beispiel 3
Zusammenbau des Geloningens mit Cysteinresten, die der Konjugation zugänglich sind
Das Wildtyp-Geloninprotein hat zwei Cysteinreste an den Positionen 44 und 50, welche durch eine endogene Disulfidbindung gekoppelt sind. Das Protein enthält keinen freien Cysteinrest, der direkt zugänglich wäre für die Konjugation an Antikörper oder andere Proteine. Analoga von Gelonin, welche einen freien Cysteinrest, der zugänglich ist für die Konjugation, enthalten, wurden erzeugt durch drei unterschiedliche Ansätze. In einem Test wurden zahlreiche Reste entlang der Primärsequenz des Gelonins ersetzt mit einem Cysteinrest, wodurch eine Reihe von Analoga geschaffen wurde, welche eine ungerade Anzahl an Cysteinresten enthalten. In einem weiteren Test wurde eines der beiden endogenen Cysteine durch Alanin ersetzt, wodurch ein Molekül geschaffen wurde, dem eine zwischen den Ketten bestehende Disulfidbindung fehlt, das aber ein einzelnes, ungepaartes Cystein enthält. In noch einem weiteren Test wurden beide endogenen Cysteine durch Alanine ersetzt und ein dritter Nicht-Cysteinrest wurde ersetzt durch ein Cystein, wodurch ein Analogon mit einem einzelnen, ungepaarten Cystein geschaffen wurde.
Fünfzehn Analoga von Gelonin wurden konstruiert. Zehn Nicht-Cysteinreste von Gelonin waren das Ziel für die Substitution mit einem Cysteinrest. Ein Vergleich der Aminosäuresequenz von Gelonin mit der natürlichen Aminosäuresequenz und Tertiärstruktur der Ricin-A-Kette (siehe 1) legte nahe, dass diese Positionen an der Oberfläche des Moleküls und für die Konjugation zugänglich sein würden. Jedes dieser zehn Geloninanaloga schließt ein Cystein ein, das substituiert wurde anstelle von einem der folgenden Reste: Lysin₁₀, Asparagin₆₀ Isoleucin₁₀₃, Asparaginsäure₁₄₆, Aginin₁₈₄, Serin₂₁₅, Asparagin₂₃₉, Ly sin₂₄₄, Asparaginsäure₂₄₇, und Lysin₂₄₈, und die Analoga wurden dementsprechend bezeichnet als Gel_C10, Gel_C60, Gel_C103, Gel_C146, Gel_C184, Gel_C215, Gel_C239, Gel_C244, Gel_C247, und Gel_C248.
Zwei Geloninanaloga wurden konstruiert, bei denen eines der natürlichen Gelonincysteine, die in einer endogenen Disulfidbindung teilhaben, ersetzt wurde durch einen Nicht-Cysteinrest. Insbesondere wurde das Cystein an Position 50 ersetzt mit einem Alaninrest, wodurch ein Geloninanalogon (bezeichnet als Gelc₄₄) geschaffen wurde, welches ein Cystein hat, das zugänglich ist für Disulfidbindung an Position 44. Umgekehrt wurde das Cystein an Position 44 ersetzt mit einem Alaninrest, was in einem Analogon (bezeichnet als Gelc₅₀) resultierte, welches ein Cystein, das zugänglich für Disulfidbindung an Position 50 ist, hat. Die kombinierten Serien der vorangegangen zwölf Analoga umspannen folglich die gesamte Länge des reifen Geloninproteins.
Ein weiteres Geloninanalogon (Gel_C44AC50A) wurde konstruiert, in welchem beide natürlichen Gelonincysteine ersetzt wurden durch Alanine. Zwei zusätzliche Analoga wurden konstruiert, welche Alaninreste haben, die substituiert waren anstelle beider natürlicher Cysteine, und die entweder einen Cysteinrest hatten, der substituiert war anstelle des natürlichen Lysins an Position 10 (Gel_C10C44AC50A) oder einen Cysteinrest, der substituiert wurde anstelle des natürlichen Aspartats an Position 247 (Gel_C247C44AC50A)
Die Varianten des rekombinanten Gelonins wurden konstruiert durch Restriktionsfragment-Manipulation oder durch overlap-extension-PCR mit synthetischen Oligonukleotiden. Die Sequenzen der Primer, die für die PCR verwendet wurden, sind unten angeführt. In jeder mutagenen Primersequenz sind die Nukleotide, die der geänderten Aminosäure, entweder einem Cystein- oder einem Alaninrest, entsprechen, unterstrichen.

(1) Insbesondere wurde ein Cystein anstelle der Aminosäure 247 von Gelonin (einer Asparaginsäure, welche entspricht dem Cystein an Position 259 in der Ricin-A-Kette) durch PCR mit den mutagenen Primern GeloC-3-2 und GeloC-4 gemeinsam mit den Pri mern HindIII-2 (einem Primer, der in dem Vektorteil von pING3734 oder pING3825 lokalisiert ist), Gelo-9 und Gelo-8 eingeführt. Matrizen-DNS (pING3734) wurde amplifiziert mit GeloC-3-2 und HindIII-2 in einer gleichzeitigen Reaktion mit GeloC-4 und Gelo-9. Die Produkte dieser Reaktionen wurden gemischt und amplifiziert mit den Außenprimern Gelo-8 und HindIII-2. Das Reaktionsprodukt wurde geschnitten mit EcoRI und XhoI, gereinigt und in das Plasmid pING3825 in einer dreiteiligen Ligation eingefügt. Die DNS-Sequenz der Gel_C247-Variante (SEQ ID NO 102) wurde dann nachgeprüft. Das Plasmid, das die Gel_C247, kodierende Sequenz enthält, wurde als pING3737 bezeichnet (ATCC-Zugangsnummer 69009).
(2–3) Auf dieselbe Art und Weise wurde ein Cysteinrest eingeführt anstelle der Aminosäure an Position 248 (ein Lysin) von Gelonin mit den mutagenen Oligonukleotiden GeloC-1 und GeloC-2, um ein analoges Gel_C248 zu erzeugen im Plasmid pING3741, und ein Cysteinrest wurde eingeführt bei der Aminosäure an Position 239 (ein Lysin) mit den Primern GeloC-9 und GeloC-10, um analoges Gel₂₃₉ im Plasmid pING3744 zu erzeugen.
(4) Auch auf dieselbe Art und Weise wurde ein Cysteinrest eingeführt bei der Aminosäure 244 (ein Lysin) von Gelonin mit den mutagenen Primern GeloC-5 und GeloC-6, um ein analoges Gel_C244 in einem Plasmid, bezeichnet als pING3736, zu erzeugen. Diese Variante wurde hergestellt mittels PCR unter Verwendung des Plasmids pING3734 als Matrizen-DNS anstelle von pING3825. Es kodiert demzufolge die gesamte N-terminale Gelonin-Aminosäuresequenz als Plasmide pING3737, pING3741 und pING3744, schließt aber die 32 von dem PCR-Primer stammenden Nukleotide des 5'-Endes anstelle der natürlichen Geloninnukleotide des 5'-Endes ein.
(5) Ein Cysteinrest wurde eingeführt anstelle der Aminosäure (ein Lysin) an Position 10 von Gelonin durch ein ähnliches Verfahren. Ein Cystein wurde eingeführt mit den mutagenen Primern GeloC-13 und GeloC-14 durch Amplifikation von pING3824 mit araB2 (ein Vektorprimer) und GeloC-14, und in einer getrennten Reaktion mit GeloC-13 und Gelo-11. Diese Reaktionsprodukte wurden gemischt und amplifiziert mit den Außenprimern araB2 und Gelo-11. Das PCR-Produkt wurde geschnitten mit PstI und NcoI, ge reinigt und zurück kloniert in pING3825, um analoges Gel_C10 zu erzeugen in dem Plasmid, das bezeichnet wurde mit pING3746 (ATCC-Zugangsnummer 69008).
(6) Das Asparagin an Position 60 von Gelonin wurde ersetzt durch einen Cysteinrest unter Verwendung zweier mutagener Oligos, GeloC-15 und GeloC-16, zusammen mit den Oligos araB2 und Gelo-11 auf dieselbe Art und Weise wie für die Gel_C10-Variante. Das Plasmid, das das Gel_C60-Analogon kodiert, wurde bezeichnet als pING3749.
(7) Ein Cystein wurde eingeführt bei der Aminosäure 103 (ein Isoleucin) durch PCR mit mutagenen Primern GeloC-20 und GeloC-21 gemeinsam mit den Primern araB2 und HindIII-2. Matrizen-DNS (pING3733) wurde amplifiziert mit GeloC-21 und araB2 und getrennt mit GeloC-20 und HindIII-2. Die Produkte dieser Reaktionen wurden gemischt und amplifiziert mit den Außenprimern araB2 und HindIII-2. Das Reaktionsprodukt wurde geschnitten mit NcoI und Bc1I, gereinigt und eingefügt in pING3825, welches verdaut war mit NcoI und BcII. Die Oligonukleotide, die verwendet wurden anstelle eines Cysteins am Rest 103, führten ebenfalls eine AfIIII-Restriktionsstelle ein, welche in dem klonierten Gen verifiziert wurde. Das Plasmid, das das Gel_C103-Analogon enthält, wurde bezeichnet als pING3760.
(8) Ein Cystein wurde eingeführt an Position 146 (eine Asparaginsäure) durch eine ähnliche Strategie. Matrizen-DNS (pING3733) wurde mit dem mutagenen Primer GeloC-22 und Gelo-14 und separat mit dem mutagenen Primer GeloC-23 und Gelo-19 amplifiziert. Die Produkte dieser Reaktionen wurden gemischt und mit Gelo-19 und Gelo-14 amplifiziert. Das Reaktionsprodukt wurde geschnitten mit Bg1II und EcoRI und kann in pING3825 mit einer dreiteiligen Ligation eingefügt werden. Die Oligonukleotide, die verwendet wurden, um ein Cystein am Rest 146 zu platzieren, führten auch eine NdeI-Restriktionsstelle ein, welche in dem klonierten Gen verifiziert werden kann.
(9) Um ein Cystein an Position 184 (einem Arginin) von Gelonin einzufügen, wurde Matrizen-DNS (pING3733) amplifiziert mit dem mutagenen Primer GeloC-25 und araB-2 und separat mit dem mutagenen Primer GeloC-24 und HindIII-2. Die Produkte dieser Reaktionen wurden gemischt und mit araB2 und Gelo-14 amplifiziert. Das Reaktionsprodukt wurde geschnitten mit NcoI und BcII und in pING3825, welches zuvor mit NcoI und Bc1I verdaut worden war, eingefügt. Die Oligonukleotide, die verwendet wurden, um ein Cystein an dem Rest 184 zu platzieren, fügten auch eine NsiI-Restriktionsstelle ein, welche in dem klonierten Gen verifiziert wurde. Das Plasmid, das die Sequenz enthält, welche die Gel_C184-Variante kodiert, wurde bezeichnet als pING3761.
(10) Ein Cystein kann an Position 215 (ein Serin) durch eine ähnliche Strategie eingeführt werden. Matrizen-DNS (pING3733) wurde mit dem mutagenen Primer GeloC-27 und araB2, und separat mit dem mutagenen Primer GeloC-26 und HindIII-2 amplifiziert. Die Produkte dieser Reaktionen wurden gemischt und mit araB2 und HindIII-2 amplifiziert. Das Reaktionsprodukt wurde geschnitten mit EcoRI und BcII und kann durch eine dreiteilige Ligation eingefügt werden in pING3825.
(11) Eine andere Geloninvariante mit einem freien Cysteinrest wurde erzeugt durch Ersetzen einer der beiden natürlich vorkommenden Gelonincysteinreste, das Cystein an Position 50, durch ein Alanin. Das Plasmid pING3824 wurde mit den Primern GeloC-17 und Gelo-11 und zugleich in einer getrennten Reaktion mit dem Primer GeloC-19 und araB2 amplifiziert. Die Reaktionsprodukte wurden gemischt und mit araB2 und Gelo-11 amplifiziert. Dieses Produkt wurde geschnitten mit NcoI und BglII und zurück in den Vektorteil von pING3825 kloniert, um pING3747 (ATCC 69101) zu erzeugen. Dieses Analogon wurde als Gel_C44 bezeichnet, da es ein Cystein enthält, das zugänglich ist für die Disulfidbindung an der Aminosäureposition 44.
(12) Eine Geloninvariante, in welcher das natürliche Cystein an Position 44 geändert wurde zu Alanin, wurde gebildet durch Amplifizieren von pING3733 unter Verwendung der mutagenen Oligonukleotide GeloC-28 und GeloC-29 zusammen mit den Primern araB2 und HindIII-2. Die amplifizierte DNS wurde geschnitten mit NcoI und BglII und in einen Geloninvektor kloniert, wodurch pING3756 erzeugt wurde. Diese erzeugte Variante wurde als Gel_C50 bezeichnet.
(13) Eine Geloninvariante, bei der beide, das Cystein an Position 44 und das Cystein an Position 50 von Gelonin, zu Alaninresten geändert wurden, wurde gebildet durch overlap- PCR von pING3824 unter Verwendung der mutagenen Oligonukleotide GeloC-17 und GeloC-18 zusammen mit den Primern araB2 und Gelo-11. Dieses Analogon, ähnlich wie das natürliche Geloninprotein, hat keine Cysteinreste, die für die Konjugation zugänglich sind. Das das Analogon kodierende Plasmid wurde bezeichnet als pING3750. Das erzeugte Analogon wurde bezeichnet als Gel_C44AC50A.
(14) Die dreifache mutante Gelonin_C247C44AC50A wurde konstruiert aus den Plasmiden pING3824, pING3750 und pING3737. Diese Variante enthält ein eingefügtes Cystein an Position 247, während beide der natürlich vorkommenden Cysteinreste an den Positionen 44 und 50 durch Alanin ersetzt wurden. Das Analogon ist wünschenswert, da bei diesem Analogon die Disulfidverbindung zu einem Antikörper nur sichergestellt ist an einem einzelnen Cysteinrest. Das Plasmid pING3824 wurde geschnitten mit NcoI und XhoI und das Vektorfragment wurde gereinigt in einem Agarosegel. pING3750 wurde geschnitten mit NcoI und EcoRI und pING3737 wurde geschnitten mit EcoRI und XhoI. Das NcoI-EcoRI-Fragment kodiert die Alanine an den Positionen 44 und 50, während das EcoRI-XhoI-Fragment das Cystein an Position 247 kodiert. Jedes dieser Fragmente wurde gereinigt und in das NcoI-XhoI-Vektorfragment ligiert. Das resultierende Plasmid wurde pING3752 genannt.
(15) Die dreifache Mutante Gelonin_C10C44AC50Awurde ebenfalls konstruiert durch Zusammenbau von zuvor zusammengesetzten Plasmiden. In diesem Fall wurde pING3746 geschnitten mit PstI und NcoI, während pING3750 geschnitten wurde mit NcoI und XhoI. Jedes dieser Insertfragmente wurde gereinigt durch Elektrophorese in einem Agarosegel und die Fragmente wurden ligiert in ein mit PstI und XhoI verdautes Vektorfragment. Der resultierende Vektor wurde bezeichnet als pING3753.

Jede dieser konstruierten Geloninvarianten wurde in den E. coli-Stamm E104 transformiert. Nach Induktion der Bakterienkulturen mit Arabinose konnte das Gelonin-Polypeptid in den Kulturüberständen mit geloninspezifischen Antikörpern detektiert werden. Es wurde keine signifikanten Unterschiede in den Expressionsraten von Gelonin zwischen den Plasmiden pING3734 und pING3825 oder in den Raten von irgendeiner der Geloninvari anten nachgewiesen. Jedes Protein wurde in E. coli mit Spiegeln von ungefähr 1 g/l erzeugt.
Beispiel 4
Retikulozyten-Lysat-Test

Die Fähigkeit von Gelonin und rekombinanten Geloninanaloga, die Proteinsynthese in vitro zu inhibieren, wurde getestet unter Verwendung eines Retikulozyten-Lysat-Testes (RLA), beschrieben in Press et al., Immunol. Letters, 14: 37–41 (1986). Der Test misst die Hemmung der Proteinsynthese in einem zelltfreien System unter Verwendung endogener Globin-mRNS aus einem Lysat von roten Blutkörperchen aus Kaninchen. Der herabgesetzte Einbau von mit Tritium markiertem Leucin (³H-Leu) wurde gemessen als eine Funktion der Toxinkonzentration. Serielle logarithmische Verdünnungen von Standardtoxin (die 30 kD-Form der Ricin-A-Kette, abgekürzt als RTA 30), natürlichem Gelonin, rekombinantem Gelonin (rGelonin oder rGel) und Geloninanaloga wurden getestet über einen Bereich von 1 μg/ml bis 1 pg/ml. Die Proben wurden dreifach getestet, zubereitet auf Eis, für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und dann in einem Inotec Trace 96 Kaskadenionisierungszählgerät gezählt. Durch Vergleich mit einer nicht inhibierten Probe wurde die pikomolare Konzentration des Toxins (pM), welche der 50% igen Inhibiton der Proteinsynthese (IC₅₀) entsprach, berechnet. Wie in Tabelle 1 unten gezeigt, üben rekombinantes Gelonin und die meisten seiner Analoga in dem RLA eine Aktivität aus, die vergleichbar ist zu der des natürlichen Gelonins. Für einige dieser Analoga (wie z. B. Gel_C239) wurde die RLA-Aktivität vermindert. Tabelle 1

Toxin	IC₅₀ (pM)
RTA 30	2.5
Gelonin	15
rGelonin	11
Gel_C10	60
Gel_A50(C44)	20
Gel_A44(C50)	47
Gel_C60	26
Gel_C239	955
Gel_C244	32
Gel_C247	12
Gel_C248	47
Gel_C44AC50A	16
^GelC10C44AC50A	7
^GelC247C44AC50A	20

Beispiel 5
Zubereitung von Gelonin-Immunokonjugaten
Geloninanaloga der Erfindung wurden verschieden konjugiert mit dem Nager-Antikörper (ATCC HB9286) und chimären H65-Antikörper (cH65) und cH65-Antikörperdomänen (einschließlich cFab-, cFab'- und cF(ab')₂-Fragmenten), von denen alle spezifisch reaktiv sind mit der menschlichen T-Zell-Determinante CDS. H65-Antikörper wurde zubereitet und gereinigt durch Verfahren, die in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/306,433, oben, und der internationalen Veröffentlichung mit der Nr. WO 89/06968, oben, beschrieben sind. Chimärer H65-Antikörper wurde zubereitet gemäß den Verfahren, die ähnlich sind zu jenen, die in Robinson et al., Human Antibodies and Hybridomas, 2: 84–93 (1991), beschrieben sind.
(1) Konjugation an H65-Antikörper
Um ein reaktives Sulfhydryl zu exponieren, wurden die ungepaarten Cysteinreste der Geloninanaloga zuerst reduziert durch Inkubation mit 0,1 bis 2 mM DTT (30 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur) und wurden dann entsalzt durch Größenausschlusschromatographie.
Insbesondere wurde das Gel_C248-Analogon (3,8 mg/ml) behandelt mit 2 mM DTT für 60 Minuten in 0,1 M Na Phosphat, 0,25 M NaCI, pH 7,5 Puffer. Die Gel_C244-Variante (7,6 mg/ml) wurde behandelt mit 2 mM DTT für 30 Minuten in 0,1 M Na Phosphat, 0,25 M NaCI, pH 7,5 Puffer. Das Gel_C247-Analogon (4 mg/ml) wurde behandelt mit 2 mM DTT für 30 Minuten in 0,1 M Na Phosphat, 0,5 M NaCI, pH 7,5 Puffer mit 0,5 mM EDTA. Die Gel_C239-Variante (3,2 mg/ml) wurde behandelt mit 2 mM DTT für 30 Minuten in 0,1 M Na Phosphat, 0,5 M NaCl, pH 7,5 Puffer mit 0,5 mM EDTA. Das Gel_C44-Analogon (4,2 mg/ml) wurde behandelt mit 0,1 mM DTT für 30 Minuten in 0,1 M Na Phosphat, 0,1 M NaCI, pH 7,5 Puffer mit 0,5 mM EDTA. Schließlich wurde die Gel_C10-Variante (3,1 mg/ml) behandelt mit 1 mM DTT für 20 Minuten in 0,1 M Na Phosphat, 0,1 M NaCI, pH 7,5 Puffer mit 1 mM EDTA.
Die Anwesenheit von freiem Sulfliydryl wurde nachgeprüft durch Reaktion mit DTNB und der erhalten Durchschnittswert war 1,4 ± 0,65 SH/Molekül. In Abwesenheit der Reduktion wurden keine freien Thiole detektiert.
H65-Antikörper und chimäre H65-Antikörper wurden chemisch modifiziert mit dem gestörten Linker 5-Methyl-2-iminothiolan (M2IT) an Lysinresten, um eine reaktionsfähige Sulfhydrylgruppe einzuführen, wie beschrieben in Goff et al, Bioconjugate Chem., 1: 381–386 (1990).
Insbesondere wurde für die Konjugation mit Gel_C248 und Gel_C244 Nager-H65-Antikörper in einer Konzentration von 4 mg/ml derivatisiert mit 18x M2IT und 2,5 mM DTNB in 25 mM TEOA, 150 mM NaCI, pH 8 Puffer für eine Stunde bei 23°C. Die Reaktion ergab 1,9 Linker pro Antikörper, wie bestimmt durch DTNB-Assay.
Für die Konjugation mit Gel_C247 und Gel_C239 wurde H65-Antikörper in einer Konzentration von 4,7 mg/ml derivatisiert mit 20x M2IT und 2,5 mM DTNB in 25 mM TEOA-, 150 mM NaCI, pH 8 Puffer für 50 Minuten bei 23°C. Die Reaktion ergab 1,6 Linker pro Antikörper, wie bestimmt durch DTNB-Assay.
Vor der Reaktion mit Gel_C44 wurde H65-Antikörper in einer Konzentration von 5,8 mg/ml derivatisiert mit 20x M2IT und 2,5 mM DTNB in 25 mM TEOA, 150 mM NaCI, pH 8 Puffer für 30 Minuten bei 23°C. Die Reaktion ergab 1,5 Linker pro Antikörper, wie bestimmt durch DTNB-Assay.
Für die Konjugation mit Gel_C10 wurde H65-Antikörper in einer Konzentration von 2,2 mg/ml derivatisiert mit 10x M2IT und 2,5 mM DTNB in 25 mM TEOA, 150 mM NaCI, pH 8 Puffer für eine Stunde bei 23°C. Die Reaktion ergab 1,4 Linker pro Antikörper, wie bestimmt durch DTNB-Assay.
Chimärer H65-Antikörper wurde zubereitet für die Konjugation auf eine ähnliche Art und Weise wie der Nager-H65-Antikörper.
Zwei Verfahren wurden anfänglich verglichen auf ihre Wirksamkeit bei der Zubereitung von Immunokonjugaten mit rekombinantem Gelonin. Erstens wurde die natürliche Disulfidbindung im rekombinanten Gelonin reduziert durch die Zugabe von 2 mM DTT bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Das reduzierte Gelonin wurde wiedergewonnen durch Größenausschlusschromatographie auf einer Säule aus Sephadex GF-OSLS und analysiert auf das Vorhandensein freier Sulfhydrylgruppen durch den DTNB-Assay. Es wurden 1,4 freie SH-Gruppen detektiert. Dieses reduzierte Gelonin wurde dann umgesetzt mit H65-(M2IT)-S-S-TNB (1,8 TNB-Gruppen/H65). Unter diesen experimentellen Bedingungen wurde nur wenig oder gar keine Konjugat hergestellt zwischen reduziertem Gelonin und thiolaktiviertem H65-Antikörper.
Im Gegensatz dazu wurde, wenn beide, das rekombinante Gelonin und der H65-Antikörper, zuerst mit dem Vernetzer M2IT (wodurch Gelonin-(M2IT)-SH und H65-(M2IT)-S-S-TNB geschaffen wurde) derivatisiert und dann miteinander vermischt wurden, H65-(M2IT)-S-S-(M2IT)-Gelonin-Konjugat in einer guten Ausbeute gebildet (Toxin/Antikörper-Verhältnis von 1,6). Die Ausgangsmaterialien für diese Konjugation (Ge lonin-(M2IT)-SH und H65-(M2IT)-S-S-TNB) enthielten Linker/Protein-Verhältnisse von 1,2 bzw. 1,4. Natürliches Gelonin wurde auf eine ähnliche Art und Weise vor der Konjugation an Nager- oder chimärem H65-Antikörper derivatisiert.
Die reduzierten Geloninanaloga wurden vermischt mit H65-(M2IT)-S-S-TNB, um die Konjugation zu ermöglichen. Die folgenden Konjugationsreaktionen wurden für jedes Analogon durchgeführt: 23 mg (in 7,2 ml) H65-M2IT-TNB wurden vermischt mit einem 5-fachen molaren Überschuss an Gel_C248 (23 mg in 6 ml) für 2 Stunden bei Raumtemperatur, dann für 18 Stunden über Nacht bei 4°C; 23 mg (in 7,3 ml) H65-M2IT-TNB wurden vermischt mit einem 5-fachen molaren Überschuss an Gel_C244 (23 mg in 3 ml) für drei Stunden bei Raumtemperatur, dann für 18 Stunden über Nacht bei 4°C; 9 mg (in 2,8 ml) H65-M2IT-TNB wurden vermischt mit einem 5-fachen molaren Überschuss an Gel_C247, (9 mg in 2,25 ml) für zwei Stunden bei Raumtemperatur, dann für fünf Nächte bei 4°C; 9 mg (in 2,8 ml) H65-M2IT-TNB wurden vermischt mit einem 5-fachen molaren Überschuss an Gel_C239 (9 mg in 2,6 ml) für zwei Stunden bei Raumtemperatur, dann bei 4°C für drei Tage; 12 mg (in 1,9 ml) H65-M2IT-TNB wurden vermischt mit einem 5,6-fachen molaren Überschuss an Gel_C44 (13,44 mg in 3,2 ml) für 4,5 Stunden bei Raumtemperatur, dann bei 4°C über Nacht; und 11 mg H65-M2IT-TNB wurden vermischt mit einem 5-fachen molaren Überschuss an Gel_C10 (11 mg in 3,5 ml) für vier Stunden bei Raumtemperatur, dann bei 4°C über Nacht.
Nach der Konjugation wurden nicht verbrauchter M2IT-Linker auf dem Antikörper mit 1 : 1 Mol Cysteamin zu Linker für 15 Minuten bei Raumtemperatur abgelöscht. Die abgelöschte Reaktionslösung wurde dann auf eine Gelfiltrationssäule geladen [Sephadex G-150 (Pharmacia) in dem Fall von Gel_C248, Gel_C247, Gel_C244 und Gel_C239 und eine AcA-44-Säule (IBF Biotecnics, Frankreich) in dem Fall von Gel_C44 und Gel_C10]. Die Reaktionen wurden über die Gelfiltrationssäulen laufen gelassen und eluiert mit 10 mM Tris, 0,15 M NaCI, pH 7. Der erste Peak jeder Säule wurde geladen auf Blue Toyopearl^® Harz (TosoHaas, Philadelphia, Pennsylvania) in 10 mM Tris, 30 mM NaCI, pH 7, und das Produkt wurde eluiert mit 10 mM Tris, 0,5 M NaCI, pH 7,5.
Proben der Konjugationsendprodukte wurden laufen gelassen auf 5% nicht reduzierter SDS PAGE; Coomassie gefärbt und abgetastet mit einem Laserdensometer von Shimadzu, um die Zahl der Toxine pro Antikörper (T/A-Verhältnis) zu quantifizieren. Die Ausbeute des Endproduktes für jedes Analogon-Konjugat war wie folgt: Gel_C248, 17 mg mit einem T/A-Verhältnis von 1,6; Gel_C247, 1,1 mg mit einem T/A-Verhältnis von 1; Gel_C244, 4,5 mg mit einem T/A-Verhältnis von 1,46; Gel_C239, 2,9 mg mit einem T/A-Verhältnis von 2,4; Gel_C44, 7,3 mg mit einem T/A-Verhältnis von 1,22; und Gel_C10, 6,2 mg mit einem T/A-Verhältnis von 1,37. Die Konjugationseffizienz (das heißt Umwandlung von freiem Antikörper zu Immunokonjugat) war signifikant höher (ungefähr 80%) für einige Analoga (Gel_C10, Gel_C44, Gel_C239, Gel_C247, und Gel_C248) als für andere (ungefähr 10%, Gel_C244).
(2) Konjugation an Antikörperfragmente
Die Analoga Gel_C247, und Gel_C44 wurden auch konjugiert mit zahlreichen chimären [cH65Fab, cH65Fab' und cH65F(ab')₂] und "auf Mensch entwickelten" [hel Fab, he2-Fab, he3-Fab, he1-Fab' und hel-F(ab')₂] Antikörperfragmenten. Chimäre H65-Antikörperfragmente können zubereitet werden gemäß den in der US-Patentanmeldung der Seriennummer 07/714,175, oben, und in der internationalen Veröffentlichung der Nummer WO 89/00999, oben, beschriebenen Verfahren. Die DNS-Sequenzen, die die variablen Bereiche der H65-Antikörperfragmente kodieren, die auf Mensch entwickelt wurden (was sich bezieht auf das Ersetzen ausgewählter nagerkodierter Aminosäuren, um die H65-Antikörpersequenzen weniger immunogen für Menschen zu machen) gemäß den Verfahren die in der parallel anhängigen und eigenen US-Patentanmeldung der Seriennummer 07/808,454, eingereicht am 13. Dezember 1991, beschrieben sind, die durch Bezugnahme hierin aufgenommen wird, sind aufgezeigt in SEQ ID NO 71 (die kappa-Kette von hel und he2), SEQ ID NO 72 (die Gamma-Kette von hel), SEQ ID NO 73 (die Gamma-Kette von heg und he3) und SEQ ID NO 74 (die kappa-Kette von he3).
Die chimären H65-Antikörperfragmente wurde konjugiert mit dem Gel_C247-Analogon auf dieselbe Art und Weise, wie unten beschrieben für die Konjugation von auf Mensch entwickelten Fab- und Fab'-Fragmenten mit Gel_C247, und Gel_C44.
(a) Hel-Fab-Gel_C247,
Das hel Fab wurde dialysiert in 25 mM TEOA-Puffer, 250 mM NaCI, pH 8, und dann konzentriert auf 6,8 mg/ml vor der Derivatisierung mit dem M2IT-Vernetzer. Für die Linker-Reaktion wurde M2IT verwendet in einem 20-fachen molaren Überschuss in Anwesenheit von 2,5 mM DTNB. Der Reaktion wurde ermöglicht, für 30 Minuten bei Raumtemperatur fortzuschreiten, dann entsalzt auf GF05 (Gelfiltrationsharz) und äquilibriert in 0,5 M Na Phosphat, 0,2 M NaCI, pH 7,5. Eine Linker-Zahl von 1,8 Linkern pro Fab wurde berechnet, basierend auf dem DTNB-Assay. Das hel Fab-M2IT-TNB wurde konzentriert auf 3,7 mg/ml vor der Konjugation mit Gel_C247.
Gel_C247, in einer Konzentration von 12,8 mg/ml in 10 mM Na Phosphat, 0,3 M NaCI, wurde behandelt mit 1 mM DTT, 0,5 mM EDTA, für 20 Minuten bei Raumtemperatur, um eine reaktive Sulfhydrylgruppe für die Konjugation zu exponieren, und wurde dann entsalzt auf GF05 und äquilibriert in 0,1 M Na Phosphat, 0,2 M NaCI, pH 7,5. Der freie Thiolgehalt wurde bestimmt auf 0,74 Mol freies SH pro Mol Gel_C247, unter Verwendung des DTNB-Assays. Das Gelonin wurde konzentriert auf 8,3 mg/ml vor der Konjugation mit aktiviertem Antikörper.
Bei der Konjugationsreaktion zwischen dem freien Thiol auf Gel_C247, und dem derivatisierten hel Fab-M2IT-TNB waren die Bedingungen wie folgt. Ein 5-facher Überschuss des Geloninanalogons wurde hinzugefügt zu aktiviertem hel-Fab-M2IT-TNB (beide Proteine waren in 0,1 M Na Phosphat, 0,2 M NaCI, pH 7,5) und die Reaktionsmischung wurde inkubiert für 3,5 Stunden bei Raumtemperatur und dann über Nacht bei 4°C. Nach der Konjugation wurden unbehandelte M2IT-Linker abgelöscht mit 1 : 1 Mol Cysteamin zu Linker für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Die abgelöschte Reaktionslösung wurde auf eine Gelfiltrationssäule (G-75), äquilibriert mit 10 mM Tris, 150 mM NaCI, pH 7, geladen. Der erste Peak dieser Säule wurde auf 30 mM NaCI verdünnt mit 10 mM Tris, pH 7, und auf Blue Toyopearl^® geladen. Das Produkt wurde eluiert mit 10 mM Tris, 0,5 M NaCI, pH 7,5.
(ii) hel Fab' -Gel_C247,
Ähnlich wurde das H65 hel Fab'-Fragment dialysiert in 25 mM TEOA-Puffer, 400 mM NaCI, pH 8, in einer Konzentration von 2,9 mg/ml vor der Derivatisierung mit dem M2IT-Vernetzer. Für die Linker-Reaktion wurde M2IT verwendet in 20-fachem molaren Überschuss in Anwesenheit von 2,5 mM DTNB. Der Reaktion wurde ermöglicht, für eine Stunde bei Raumtemperatur fortzuschreiten, und wurde dann entsalzt auf GF05 (Gelfiltrationsharz) und äquilibriert in 0,1 M Na Phosphat, 0,2 M NaCI, pH 7,5. Eine Linker-Zahl von 1,6 Linkern pro Fab' wurde berechnet, basierend auf dem DTNB-Assay. Das hel Fab'-M2IT-TNB wurde konzentriert auf 3,7 mg/ml vor der Konjugation mit Gel_C247.
Das Gel_C247, in einer Konzentration von 77 mg/ml wurde verdünnt mit 10 mM Na Phosphat, 0,1 M NaCI, auf eine Konzentration von 5 mg/ml, behandelt mit 1 mM DTT, 0,5 mM EDTA, für 30 Minuten bei Raumtemperatur, um ein freies Thiol für die Konjugation zu exponieren, und wurde dann entsalzt auf GF05 und äquilibriert in 0,1 M Na Phosphat, 0,2 M NaCI, pH 7,5. Der freie Thiolgehalt wurde bestimmt auf 1,48 Mol freies SH pro Mol Gel_C247, unter Verwendung des DTNB-Assays. Das Gel_C247, wurde konzentriert auf 10 mg/ml vor der Konjugation mit aktiviertem hel Fab'-M2IT-TNB.
Für die Reaktion zwischen dem freien Thiol auf Gel_C247, und dem derivatisierten hel-Fab'-M2IT-TNB waren die Bedingungen wie folgt. Ein 5,7-fach molarer Überschuss Gelonin wurde hinzugefügt zu aktiviertem hel Fab'-M2IT-TNB und die Salz-Endkonzentration wurde angepasst auf 0,25 M. Die Reaktionsmischung wurde inkubiert für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur und dann über das Wochenende bei 4°C. Nach der Konjugation wurden nicht verbrauchte M2IT-Linker abgelöscht mit 1 : 1 Mol Cysteamin zu Linker für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Die abgelöschte Reaktionslösung wurde auf eine Gelfriltrationssäule (AcA54), äquilibriert mit 10 mM Tris, 250 mM NaCI, pH 7,5, geladen. Der erste Peak dieser Säule wurde auf 20 mM NaCI verdünnt mit 10 mM Tris, pH 7, und auf Blue Toyopearl^® geladen, welches äquilibriert wurde in 10 mM Tris, 20 mM NaCI, pH 7. Die Säule wurde dann gewaschen mit 10 mM Tris, 30 mM NaCI, pH 7,5. Das Produkt wurde eluiert mit 10 mM Tris, 1 M NaCI, pH 7,5.
(c) he2-Fab-Gel_C44
Das he2-Fab wurde über Nacht dialysiert in 25 mM TEOA, 0,25 M NaCI, pH 8 Puffer, und dann konzentriert auf 13,3 mg/ml vor der Derivatisierung mit dem M2IT-Vernetzer. Für die Linker-Reaktion wurde M2IT verwendet in einem 20-fachen molaren Überschuss in Anwesenheit von 2,5 mM DTNB. Der Reaktion wurde ermöglicht, für 20 Minuten bei Raumtemperatur fortzuschreiten, und wurde dann entsalzt auf GF05-LS (Gelfiltrations)-Säule, äquilibriert in 0,1 M Na Phosphat, 0,2 M NaCI mit 0,02% Na Azid. Eine Linker-Zahl von 1,7 Linkern pro Fab-M2IT-TNB wurde berechnet basierend auf dem DTNB-Assay. Nach der Derivatisierung und Gelfiltration betrug die he2-Fab-Konzentration 5,2 mg/ml.
Gel_C44 in einer Konzentration von 8,33 mg/ml in 10 mM Na Phosphat, pH 7,2, wurde behandelt mit 5 mM DTT und 0,5 mM EDTA für 30 Minuten bei Raumtemperatur, um ein reaktives Thiol für die Konjugation zu exponieren, und wurde dann entsalzt auf GF05-LS-Harz, welches äquilibriert wurde in 0,1 M Na Phosphat, 0,1 M NaCI mit 0,5 M ED-TA plus 0,02% Na Azid, pH 7,5. Der freie Thiolgehalt wurde bestimmt auf 0,83 Mol freies SH pro Mol Gel_C44 unter Verwendung des DTNB-Assays. Das Gelonin wurde konzentriert auf 11,4 mg/ml vor der Konjugation mit aktiviertem he2-Fab.
Die Konjugationsreaktionsbedingungen zwischen dem freien Thiol auf Gel_C44 und dem derivatisierten he2-Fab-M2IT-TNB waren wie folgt. Ein dreifacher Überschuss des Geloninanalogons wurde hinzugefügt zu aktiviertem he2-Fab-M2IT-TNB (beide Proteine waren in 0,1 M Na Phosphat, 0,1 M NaCI, pH 7,5, aber die Geloninlösung enthielt auch 0,5 mM EDTA). Die Reaktionsmischung wurde auf die Hälfte ihres Ursprungsvolumens konzentriert, dann wurde die Mischung für 4 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von 72 Stunden bei 4°C. Nach der Inkubationsperiode wurde die Effizienz der Konjugation geschätzt auf 70 bis 75% durch Untersuchung der SDS PAGE.
Nach der Konjugation wurden die überschüssigen M2IT-Linker abgelöscht durch Inkubation mit 1 : 1 Mol Cysteamin zu Linker für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Die abgelöschte Reaktion wurde geladen auf eine Gelfiltrationssäule (G-75), welche in 10 mM Tris, 0,15 M NaCI, pH 7, äquilibriert wurde. Der erste Peak dieser Säule wurde verdünnt auf 30 mM NaCI mit 10 mM Tris, pH 7, und geladen auf eine Blue Toyopearl^® (Toso-Haas) Säule. Das Produkt wurde eluiert mit 10 mM Tris, 1 M NaCI, pH 7,5.
(d) he3-Fab-Gel_C44
Ähnlich wurde he3-Fab über Nacht dialysiert in 25 mM TEOA, 0,25 M NaCI, pH 8 Puffer, und dann konzentriert auf 5 mg/ml vor der Derivatisierung mit dem M2IT-Vernetzer. Für die Linker-Reaktion wurde M2IT verwendet in einem 10-fachen molaren Überschuss in Anwesenheit von 2,5 mM DTNB. Der Reaktion wurde ermöglicht, für 45 Minuten bei Raumtemperatur fortzuschreiten, und wurde dann entsalzt auf einer GF05-LS (Gelfiltrations)-Säule, äquilibriert in 0,1 M Na Phosphat, 0,2 M NaCI mit 0,02% Na Azid. Eine Linker-Zahl von 1 M2IT pro Fab-M2IT-TNB wurde berechnet, basierend auf dem DTNB-Assay. Nach der Derivatisierung und Gelfiltration betrug die he3-Fab-Konzentration 5,3 mg/ml.
Gel_C44 in einer Konzentration von 7,8 mg/ml in 0,1 mM Na Phosphat, 0,1 M NaCI, pH 7,5, wurde behandelt mit 1,5 mM DTT und 1 mM EDTA für 30 Minuten bei Raumtemperatur, um ein reaktives Thiol für die Konjugation zu exponieren, und wurde dann entsalzt auf GF05-LS-Harz, welches äquilibriert wurde in 0,1 M Na Phosphat, 0,1 M NaCI plus 0,02% Na Azid, pH 7,5. Der freie Thiolgehalt wurde bestimmt auf 0,66 Mol freies SH pro Mol Gel_C44 unter Verwendung des DTNB-Assays. Gelonin wurde konzentriert auf 5,2 mg/ml vor der Konjugation mit aktiviertem he3-Fab.
Die Konjugationsreaktionsbedingungen zwischen dem freien Thiol auf Gel_A50(C44) und dem derivatisierten he3-Fab-M2IT-TNB waren wie folgt. Ein 5-facher Überschuss des Geloninanalogons wurde hinzugefügt zu aktiviertem he3-Fab-M2IT-TNB (beide Proteine waren in 0,1 M Na Phosphat, 0,1 M NaCI, pH 7,5). Die Reaktionsmischung wurde inkubiert für zwei Stunden bei Raumtemperatur, gefolgt von 72 Stunden bei 4°C. Nach der Inkubationsperiode wurde die Effizienz der Konjugation geschätzt auf 70 bis 75% durch Untersuchung der SDS PAGE.
Nach der Konjugation wurden die überschüssigen M2IT-Linker abgelöscht durch Inkubation mit 1 : 1 Mol Cysteamin zu Linker für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Die abgelöschte Reaktion wurde geladen auf ein GammaBind G (immobilisiertes Protein-G-Affinitätsharz, erhalten von Genex, Gaithersburg, Maryland), welches äquilibriert wurde in 10 mM Na Phosphat, 0,15 M NaCI, pH 7. Es wurde eluiert mit 0,5 M NaOAc, pH 3, und neutralisiert mit Tris. Es wurde dialysiert in 10 mM Tris, 0,15 M NaCI, pH 7, über Nacht, dann verdünnt auf 30 mM NaCI mit 10 mM Tris, pH 7, und auf eine Blue Toyopearl^® (TosoHaas) Säule geladen. Das Produkt wurde eluiert mit 10 mM Tris, 1 M NaCI, pH 7,5.
Beispiel 6
Gesamtzelt-Abtötungs-Assays
Mit Gelonin und Geloninanaloga zubereitete Immunokonjugate wurden untersucht auf Cytotoxizität gegen eine akute Lymphoblastoid-Leukämie-T-Zellinie (HSB2-Zellen) und gegen menschliche periphere Blut-mononukleäre Zellen (PBMCs). Immunokonjugate von Ricin-A-Kette mit H65-Antikörper (H65-RTA) und Antikörperfragmente wurden auch untersucht. Die Ricin-A-Kette (RTA) ebenso wie die H65-RTA-Immunokonjugate wurden zubereitet und gereinigt gemäß den Verfahren, beschrieben in der US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 07/306,433, oben, und der internationalen Veröffentlichung Nr. WO 89/06968, oben.
In Kürze, die HSB2-Zellen wurden inkubiert mit Immunotoxin und die Inhibition der Proteinsynthese in Anwesenheit des Immunotoxins wurde gemessen im Vergleich zu unbehandelten Kontrollzellen. Die Standard-Immunokonjugate H65-RTA (H65 derivatisiert mit SPDP, gekoppelt an RTA), H65-Gelonin und H65-rGelonin, H65-Fragment-Immunokonjugat und Gelonin-Immunokonjugat als Proben wurden verdünnt mit RPMI ohne Leucin in halblogarithmischen Konzentrationen im Bereich von 2000 bis 0,632 ng/ml. Alle Verdünnungen wurden dreifach hinzugefügt zu Vertiefungen von Mikrotiterplatten, die 1 × 10⁵ HSB2-Zellen enthielten. HSB2-Platten wurden inkubiert für 20 Stunden bei 37°C und dann mit ³H-Leu für vier Stunden vor der Ernte gepulst. Die Proben wurden gezählt auf dem Inotec Trace 96 Kaskadenionisierungszählgerät. Durch Vergleich mit einer unbehandelten Probe wurde die pikomolare Konzentration (pM) des Immunotoxins, welche in einer 50%igen Inhibition der Proteinsynthese (IC₅₀) resultierte, berechnet. Um auf Konjugate zu normalisieren, welche unterschiedliche Mengen des Toxins oder Toxinanalogons enthalten, wurden die Cytotoxizitätsdaten umgewandelt auf pikomolar Toxin (pM T) durch Multiplizieren des Konjugats-IC₅₀ (in pM) mit dem Toxin/Antikörper-Verhältnis, welches einzigartig / speziell ist für jede Konjugatzubereitung.
Die PMBC-Assays wurden durchgeführt, wie beschrieben durch Fishwild et al., Clin. and Exp. Immunol., 86: 506–513 (1991), und schlossen die Inkubation von Immunokonjugaten mit PBMCs für eine Gesamtdauer von 90 Stunden ein. Während der letzten 16 Stunden der Inkubation wurde ³H-Thymidin hinzugefügt; nach Abschluss wurde die Immunokonjugat induzierte Inhibition der DNS-Synthese quantifiziert. Die Aktivitäten der H65- und Chimären H65-Antikörper-Konjugate gegen HSB2-Zellen und PBMC-Zellen sind in Tabelle 2 unten aufgelistet.
Tabelle 2 IC₅₀ (PM T)
Gegen die HSB2-Zellen waren viele der Geloninanaloga-Immunokonjugate signifikant wirksamer als die Konjugate, die zubereitet wurden mit natürlichem Gelonin oder rekombinantem, nicht modifiziertem Gelonin, beides in Begriffen eines niedrigen IC₅₀-Wertes, aber auch in Begriffen eines größeren Ausmaßes von Zellabtötung. Gegen menschliche PBMCs ivaren die Geloninanalogon-Konjugate wenigstens so wirksam, wie natürliche und rekombinante Gelonin-Konjugate. Wichtig ist jedoch, dass einige der Konjugate (z. B. Gel_C10, Gel_C44 und Gel_C247) eine gesteigerte Wirksamkeit gegen PBMCs ausübten im Vergleich zu natürlichen und rekombinanten Gelonin-Konjugaten und auch eine gesteigerte Zellabtötungsrate ausübten (Daten nicht gezeigt).
Die Aktivitäten der H65-Antikörperfragment-Konjugate gegen HSB2-Zellen und PBMC-Zellen sind in den Tabellen 3 und 4 unten aufgelistet, worin das Ausmaß des Abtötens in Tabelle 3 sich bezieht auf den Prozentsatz der Proteinsynthese, der in HSB2-Zellen in der höchsten untersuchten Immunotoxin-Konzentration (I μg/ml) inhibiert wurde.
Tabelle 3 IC₅₀ (PM T)
Tabelle 4 IC₅₀ (PM T)
Das cFab'-Gel₂₄₇-Immunkonjugat ist klar cytotoxischer als cFab'-Konjugate mit rekombinantem Gelonin oder RTA30.
Beispiel 7A
A. Löslichkeit
Rekombinantes Gelonin und die Geloninanaloga wiesen eine erhöhte Löslichkeit im Vergleich zu sowohl natürlichem Gelonin als auch RTA30 auf. Ferner wiesen rekombinante Gelonin- und Geloninanalogon-Immunokonjugate eine erhöhte Löslichkeit auf im Vergleich zu Immunokonjugaten, die mit natürlichem Gelonin und RTA30 zubereitet wurden. Diese erhöhte Löslichkeit war besonders bemerkenswert für rekombinante Geloninund Analogonkonjugate, zubereitet mit chimären Fab-Fragmenten.
B. Disulfidbindungsstabilitäts-Assay
Von der Stabilität der Disulfidbindung, die ein RIP mit einem zielrichtendes Molekül (wie z. B. einem Antikörper) verbindet, ist bekannt, dass sie die Lebensspanne von Immunokonjugaten in vivo beeinflusst [siehe Thorpe et al., Cancer Res., 47: 5924–5931 (1987)]. Zum Beispiel sind Konjugate, in denen die Disulfidbindung leicht gebrochen wird durch Reduktion in vitro, weniger stabil und weniger wirksam in Tiermodellen [siehe Thorpe et al, Cancer Res., 48: 6396–6403 (1988)].
Immunokonjugate, die zubereitet wurden mit natürlichem Gelonin, rekombinantem Gelonin und Geloninanaloga wurden deswegen in einem in vitro Disulfidbindungsstabilitäts-Assay untersucht, ähnlich zu jenem, der beschrieben ist in Wawrzynczak et al., Cancer Res., 50: 7519–7526 (1990). Die Konjugate wurden inkubiert mit steigenden Konzentrationen von Glutathion für 1 Stunde bei 37°C und, nachdem die Reaktion mit Iodacetamid beendet wurde, wurde die Menge an freigesetztem RIP quantifiziert durch Größenausschluss-HPLC auf einer TosoHaas TSK-G2000SW Säule.
Durch Vergleich mit der Menge des mit hohen Konzentrationen an 2-Mercaptoethanol (um die 100% Freisetzung zu bestimmen) freigesetzten RIPs, wurde die Konzentration des Glutathions berechnet, die benötigt wird, um 50% des RIP (der RC₅₀) freizusetzen.

Die Ergebnisse der Assays für H65-Antikörper-Konjugate sind in Tabelle 5 unten dargestellt. Tabelle 5

Konjugat	RC₅₀"(mM)
H65-RTA 30	3.2
H65-(M2IT)-S-S-(M2IT)-Gelonin	11.1
H65-(M2IT)-S-S-(M2IT)-rGelonin	3.0
H65-(M2IT)-S-S-Gel_C10	2.5
H65-(M2IT)-S-S-Gel_C44	0.6
H65-(M2IT)-S-S-Gel_C239	774.0
H65-(M2IT)-S-S-Gel_C244	1.2
H65-(M2IT)-S-S-Gel_C247	0.1
H65-(M2IT)-S-S-Gel_C248	0.4
cH65-RTA 30	2.50
cH65-(M2IT)-S-S-(M2IT)-rGelonin	2.39
cH65-(M2IT)-S-S-Gel_C247	0.11
cH65-(M2IT)-S-S-Gel_C248	0.32

Die vorangegangenen Resultate zeigen, dass die Stabilität der Bindungen zwischen den unterschiedlichen Geloninproteinen und dem H65-Antikörper stark variierte. Mit Ausnahme von Gel_C10 und Gel_C239 resultierten die meisten der Geloninanaloga in Konjugaten mit Bindungen, die etwas weniger stabil in dem in vitro Assay waren als die chemischen Doppel-Linker-Konjugate. Die Stabilität des Gel_C239-Analogons war jedoch besonders erhöht.
Die Ergebnisse des Assays für H65-Antikörperfragment-Konjugate sind in Tabelle 6 unten angeführt.

Tabelle 6

Konjugat	RC₅₀ (mM)
hel Fab'-Gel_C247	0.07
cFab'-Gelonin	1.27
cFab'-Gel_C247	0.08
cF(ab')₂-RTA 30	1.74
cF(ab')₂-rGelonin	2.30
cF(ab')₂-Gel_C247	0.09
cF(ab')₂-Gel_C248	0.32
he2-Fab-Gel_C44	0.46
he3-Fab-Gel_C44	0 .58

Aus den in Tabellen 5 und 6 präsentierten RC₅₀-Ergebnissen scheint es, dass die besondere RIP-Analogon-Komponente jedes Immunotoxins die Stabilität der Immunotoxin-Disulfidbindung in vitro diktiert.
Beispiel 8
Pharmakokinetiken von H65-Antikörper-Konjugaten
Die Pharmakokinetiken der Geloninanaloga Gel_C247, Gel_C44 und Gel_C10, gekoppelt an den gesamten H65-Antikörper, wurden in Ratten untersucht. Ein IV-Bolus von 0,1 mg/kg ¹²⁵Imarkiertem Immunokonjugat H65-(M2IT)-S-S-Gel_C247, H65-(M2IT)-S-S-Gel_C44 oder H65-(M2IT)-S-S-Gel_C10 wurde appliziert an männliche Sprague-Dawley-Ratten, die 134 bis 148 g wogen. Serumproben wurden von den Ratten gesammelt nach 3, 15, 30 und 45 Minuten und nach 1,5, 2, 4, 6, 8, 18, 24, 48, 72 und 96 Stunden. Die Radioaktivität (cpm/ml) jeder Probe wurde gemessen und SDS-PAGE wurde durchgeführt, um die Fraktion der Radioaktivität zu bestimmen, die mit dem gesamten Immunokonjugat assoziiert ist. Immunokonjugatassoziierte Serumradioaktivität wurde analysiert unter Verwendung des Computerprogramms PCNONLIN (SCI Software, Lexington, Kentucky). Die Tabelle 7 unten listet die pharmakokinetischen Parameter der Immunokonjugate auf. In jenen Tabelle ist die Standardabweichung für jeden Wert angezeigt und eine Einweganalyse der Varianz wird präsentiert, IC ist das Immunokonjugat (spezifiziert durch die Abkürzung für die Geloninvariante, die Teil des Immunokonjugats ist), n ist die Anzahl der Tiere in der Studie, Vc ist das mittlere Volumen der Verteilung, Cl ist die Clearance, MRT ist die mittlere Gesamtkörperverweilzeit, Alpha ist die α-Halbwertszeit und Beta ist die β-Halbwertszeit des Immunokonjugates.
Von dem Gel_C447-Immunokonjugat wurde herausgefunden, dass es α- und β-Halbwertszeiten von 2,3 und 20 Stunden hat mit einer mittleren Gesamtverweilzeit von 17 Stunden. Die 72 und 96 Stunden Zeitpunkte wurden aus der Analyse ausgeschlossen wegen der schlechten Auflösung der immunokonjugatassoziierten Radioaktivität auf dem SDS-PAGE-Gel für diese Serumproben.
Da in vitro-Studien nahe legten, dass das Gel_C10-Immunokonjugat eine höhere Disulfidbindungsstabilität hatte, wurde erwartet, dass seine Halbwertszeiten in vivo länger sein würden im Vergleich zu der cys₂₄₇-Form des Immunokonjugates. Die β-Halbwertszeit des Immunokonjugates betrug ungefähr 33 Stunden im Vergleich zu 20 Stunden für das Gel_C247-Konjugat. Die mittlere Gesamtverweildauer war auch viel höher für das Gel_C10-Immunokonjugat (42 Stunden gegen 42 Stunden für das Gel_C247-Konjugat). Zusätzlich betrug die Clearance des Gel_C10-Immunokonjugates 2,5 ml/h/kg, was ungefähr viermal weniger war als jene des Gel_C447-Immunokonjugates (11 ml/h/kg). Wie auch vorhergesagt aus den in vitro Disulfidstabilitätsdaten, lag die Clearance des Gel_C44-Immunokonjugates zwischen jenen der Gel_C10- und Gel_C44-Immunokonjugate.
Basierend auf diesen Studien hat das Gel_C10-Analogon, konjugiert an H65-Antikörper, eine höhere in vivo-Stabilität als die Gel_C44- und Gel_C247-Analoga, konjugiert an H65-Antikörper (wie bestimmt durch die längere mittlere Verweilzeit und Clearanceraten), obwohl die Eigenschaften des Gel_C44-Immunokonjugates mehr jenen des Gel_C10-Immunokonjugates ähnelten als denen des Gel_C447-Immunokonjugates.
Pharmakokinetiken von Konjugaten mit H65-Antikörperfragmenten
Die Pharmakokinetiken von Gel_C447- und Gel_C44-Analoga, gekoppelt an für Menschen entwickelte H65-Fab-Fragmente, wurden ebenfalls in Ratten untersucht. Ein IV-Bolus von 0,1 mg/kg ¹²⁵I-markiertem hel H65-Fab-Gel_C247, heg H65-Fab-Gel_C44 oder he3 H65-Fab-Gel_C44 wurde männlichen Sprague-Dawley-Ratten, die 150 bis 180 g wogen, verabreicht. Serumproben wurden gesammelt nach 3, 5, 15, 20, 30 und 40 Minuten und 1, 1,5, 3, 6, 8, 18, 24, 32, 48 und 72 Stunden und wurden mit ELISA analysiert unter Verwendung von Anti-Gelonin-Antikörpern aus Kaninchen als Erstantikörper und biotinmarkiertem anti-menschlichen kappa leichte Kette-Antikörpern aus Ziege als den sekundären Antikörper. Ergebnisse der Analyse sind in Tabelle 8 unten präsentiert. In der Tabelle ist die Standardabweichung für jeden Wert gezeigt und IC ist das Immunokonjugat, n ist die Anzahl der Tiere in der Studie, Vc ist das Kernverteilungsvolumen, Vss ist das Gleichgewichtsverteilungsvolumen, Cl ist die Clearance, MRT ist die mittlere Gesamtkörperverweilzeit, Alpha ist die α-Halbwertszeit und Beta ist die β-Halbwertszeit des angegebenen Konjugats.
Im Vergleich der drei Immunokonjugate waren die Pharmakokinetiken von hel H65-Fab-Gel_C247, heg-H65-Fab-Gel_C44 und he3-Fab-Gel_C44 sehr ähnlich; wobei sie ähnliche α- und β-Halbwertszeiten, mittlere Verweildauern und Clearance hatten, insbesondere, wenn die Parameter, die aus den mittels ELISA bestimmten Kurven gewonnen wurden, verglichen werden. Dies steht im Widerspruch zu ihren Gesamt-Antikörper-Immunokonjugat-Gegenstücken, wo die Clearance des Gel_C247-Immunokonjugates (11 ml/kg/h) dreifach höher war als die des Gel_C44-Immunokonjugates (4 ml/kg/h). Dies legt nahe, dass die Spaltung der Disulfidbindung, die das Fab-Fragment und Gelonin verbindet, nicht so wichtig ist für die Serum-Clearance des Fab-Immunokonjugates, wie für die Gesamt-Antikörper-Immunokonjugate.
Immunogenität der Immunokonjugate
Ausgewachsene Swiss/Wehster-Mäuse wurden wiederholt (0,2 mg/kg bei jeder Injektion) mit H65-Nager-Antikörper-Konjugaten, hergestellt mit RTA, RTA30 und rekombinantem Gelonin, injiziert. Der Zyklus war dergestalt, dass jedes Tier an den Tagen 1 und 2 injiziert wurde und dass dann die Injektionen 28 und 29 Tage später wiederholt wurden. Die Tiere erhielten fünf solcher Injektionszyklen. Eine Woche und drei Wochen nach jeder Injektionsserie wurde Blut entnommen und die Menge der vorhanden Anti-RIP-Antikörper wurde bestimmt mittels ELISA; die Peaktiter für jeden Zyklus sind in Tabelle 9 gezeigt. RTA und RTA30 erzeugten starke Antworten, die unmittelbar nach dem ersten Injektionszyklus begannen und während des Experimentes hoch blieben. Im Gegensatz dazu wurde keine Immunantwort für das Gelonin-Konjugat nachgewiesen, sogar nach fünf Injektionszyklen. Wenn die Konjugate mit komplettem Freund'schem Adjuvans gemischt und i.p. in Mäuse injiziert wurden, so wurden Anti-RTA und RTA30-Antikörper leicht nachgewiesen nach etlichen Wochen. Diese Daten zeigen, dass Anti-Gelonin-Antikörper, falls sie erzeugt worden wären, detektiert worden wären durch den ELISA-Assay und legen nahe, dass rekombinantes Gelonin viel weniger immunogen in Tieren sein mag als es RTA ist.
Tabelle 9
Beispiel 9
Ein Maus-Modell eines menschlichen peripheren Blutlymphozyten (PBL) rekonstituierten, schweren kombinierten Immundefektes wurde verwendet, um die in vivo-Wirksamkeit verschiedener Immunokonjugate, die die Geloninanaloga Gel_C247, und Gel_C44 enthalten, zu evaluieren. Die Immunokonjugate wurden untersucht auf die Fähigkeit, menschliche Blutzellen, die das CDS-Antigen exprimieren, abzureichern.
Menschliche PBL-Donoren und Zellisolierung
Menschliche periphere Blutzellen wurden erhalten von Lymphozytaphereseproben (HemaCare Corporation, Sherman Oaks, CA) oder venösen Blutproben (Stanford University Blood Bank, Palo Alto, CA), welche gesammelt wurden von gesunden Spendern. Die Blutzellen wurden angereichert für PBL unter Verwendung von Ficoll-Hypaque-Dichtegradienten-Zentrifugation (Ficoll-Paque^® ; Pharmacia, Piscataway, New Jersey) und anschließend viermal gewaschen mit PBS. Die restlichen Erythrozyten wurden lysiert mit RBC-Lysepuffer (16 μM Ammoniumchlorid, 1 mM Kaliumbicarbonat, 12,5 μM EDTA) während dem zweiten Waschvorgang. Die Lebensfähigkeit der Zellen in der Endsuspension betrug > 95%, wie abgeschätzt wurde anhand des Ausschlusses des Farbstoffs Trypanblau.
Tiere und Transfer menschlicher PBL
CB.17 scid/scid (SCID) Mäuse wurde bezogen von Taconic (Germantown, New York) oder wurden gezüchtet unter sterilen Bedingungen in einer besonderen, pathogenfreien Tieranlage (die ursprünglichen Zuchtpaare wurden erhalten von Hana Biologics, Alameda, Kalifornien). Die Tiere wurden in Käfigen mit oben angebrachten Filtern gehalten und sie erhielten keine prophylaktische Antibiotika-Behandlung. Die Käfige, Einstreu, Futter und Wasser wurden vor der Verwendung autoklaviert. Alle Manipulationen der Tiere wurden durchgeführt in einem Laminarströmungsabzug.
Von unbehandelten SCID-Mäusen wurde Blut abgenommen für die Bestimmung der Maus-IgG-Spiegel. Von mit menschlichen PBL injizierten Mäusen wurde Blut abgenommen in verschiedenen Intervallen für die Quantifizierung von menschlichem IgG und sIL-2R. Die Blutabnahme erfolgte aus dem retro-orbitalen Sinus in heparinisierte Röhrchen. Die Blutproben wurden zentrifugiert bei 300 × g für 10 Minuten und Plasma wurde gesammelt und gelagert bei –70°C. Maus- und menschliches IgG wurde quantifiziert unter Verwendung von Standard-Sandwich-ELISAs. Kurz, Mikrotiterplatten mit flachem Boden (MaxiSorp Immuno-Plates, Nunc, Roskilde, Dänemark) wurden über Nacht bei 4°C mit Anti-Maus-IgG+IgA+IgM aus Ziege (Zymed Laboratories, Inc., South San Francisco, Kalifornien) oder Anti-Mensch-IgGs aus Ziege (Tago, Inc., Burlingame, Kalifornien) in Bicarbonatpuffer, pH 9,6, überzogen. Die Platten wurden für zwei Stunden bei Raumtemperatur geblockt mit 1% BSA in trisgepufferter Salzlösung, pH 7,5 (TBS), und dann bei 37°C für 1 Stunde inkubiert mit Standards oder Proben, die seriell verdünnt wurden in TBS/1% BSA/0,05% Tween 20. Die verwendeten Standards waren ein monoklonales Maus-IgG2a (IND1 Anti-Melanom; XOMA Corporation, Berkeley, Kalifornien) und polyklonales menschliches IgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri). Anschließend wurden die Platten gewaschen mit TBS/Tween 20 und inkubiert bei 37°C für eine Stunde mit an alkalische Phosphatase konjugierten Anti-Maus-IgG+IgA+IgM aus Ziegen oder anti-menschlichen IgGs aus Ziegen (Caltag Laboratories, South San Francisco, Kalifornien). Der Nachweis erfolgte durch Messung der Absorption bei 405 nm nach der Inkubation mit 1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat (Sigma) in 10% Diethanolaminpuffer (pH 9,8). Plasma einer normalen BALB/c-Maus wurde verwendet als eine positive Kontrolle in dem Maus-Ig-ELISA. Plasmaproben einer nicht stimulierten SCID-Maus oder normalen BALB/c-Maus hatten keine nachweisbaren Spiegel menschlicher Igs. Menschliches sIL-2R wurde quantifiziert unter Verwendung eines ELISA-Kits (Immunotech S.A., Marseille, Frankreich) gemäß den Anweisungen des Herstellers.
Fünf bis sieben Wochen alte Mäuse mit geringen Plasmaspiegeln an Maus-IgG (< 10 μg/ml) wurden mit einer i.p. Injektion Cyclophosphamid (Sigma) in einer Konzentration von 200 mg/kg präkonditioniert. Zwei Tage später wurden ihnen i.p. 25–40 × 10⁶ frisch isolierte, menschliche PBL, suspendiert in 0,8 ml PBS, injiziert.
Immunokonjugatbehandlung
SCID-Mäusen wurde Blut abgenommen, ungefähr zwei Wochen nach der Transplantation menschlicher PBL. Mäuse mit nicht nachweisbaren (<10 pM) oder geringen Plasmaspiegeln an menschlichem sIL-2R wurden aus der Studie ausgeschlossen. Die Ausschlussgrenze von Mäusen mit detektierbaren, aber niedrigen Spiegeln an menschlichem sIL-2R wurde empirisch bestimmt für jede Studie und betrug im Allgemeinen 20 pM. Die verbleibenden Mäuse wurden in Gruppen aufgeteilt und es wurde ihnen Vehikel oder Immunokonjugat als ein i.v.-Bolus (0,2 mg/kg) täglich für 5 aufeinander folgende Tage verabreicht. Die Tiere wurden einen Tag nach Ende der Behandlung zur Quantifizierung menschlicher T-Zellen in Geweben und von menschlichem sIL-2R im Plasma geschlachtet.
Gewebeentnahme und Analyse der PBL-Abreicherung
Blut wurde aus dem retro-orbitalen Sinus in heparinisierte Röhrchen entnommen. Die Mäuse wurden dann getötet durch Dislokation der Halswirbelsäule und die Milzen wurden aseptisch entfernt. Einzelne Zellsuspensionen von Splenozyten wurden zubereitet in HBSS, indem die Milzen zwischen den überfrorenen Enden steriler Glasobjektträger gepresst wurden. Die gesammelten Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen. Erythrozyten wurden eliminiert aus Blut und Splenozytensuspensionen unter Verwendung von RBC-Lysepuffer. Anschließend wurden die Zellen in PBS resuspendiert zum Auszählen. Die wiedergewonnenen Zellen wurden dann untersucht für die Ag-Expression unter Verwendung der Durchflusszytometrie.
Zwei- bis fünfhunderttausend Zellen in 100 μl PBS/1% BSA/0,1% Natriumazid wurden auf Eis 30 Minuten mit gesättigten Mengen verschiedener FITC- oder Phykoerythrin (PE)-konjugierten Abs (Becton-Dickinson, Mountain View, CA), wobei das für die Färbung verwendete Abs einschloss: HLe-1-FITC (Igel Anti-CD45), Leu 2-FITC (Igel Anti-CD8), Leu 3 PE (Igel Anti-CD4) und Leu M3-PE (IgG2a Anti-CD14). Die Zellen wurden dann in kaltem Puffer gewaschen und in 0,37% Formaldehyd in PBS fixiert. Die Proben wurden analysiert auf einem FACscan (Becton-Dickinson) unter Verwendung logarithmischer Verstärker. Bereiche zur Quantifizierung positiver Zellen wurden gesetzt, basierend auf der Färbung von Zellen, die aus nicht stimulierten SCID-Mäusen gewonnen wurden. Die absolute Anzahl menschlicher Ag-positiver Zellen, die aus SCID-Geweben gewonnen wurden, wurde bestimmt durch Multiplizieren des Prozentsatzes positiver Zellen mit der Gesamtzahl der aus jeder Gewebeprobe gewonnenen Zellen. Die Gesamtzahl der Leukozyten im Blut wurde berechnet unter Verwendung eines theoretischen Blutvolumens von 1,4 ml/Maus. Die Nachweisgrenze für die exakte Quantifizierung menschlicher Zellen in SCID-Mausgeweben war 0,05%. Jeder statistische Vergleich zwischen den Behandlungsgruppen wurde durchgeführt unter Verwendung des Mann-Whitney-U-Tests. Es wurde festgesetzt, dass die Behandlungsgruppen signifikant unterschiedlich von Pufferkontrollgruppen waren, wenn der p-Wert < 0,05 war. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 unten vorgestellt, worin + einen signifikanten Unterschied von Kontrollen anzeigt, – einen nicht signifikanten Unterschied anzeigt und NT bedeutet, dass das Konjugat nicht untersucht worden war. CDS Plus (XOMA Corporation, Berkeley, Kalifornien) ist ein Maus-H65-Antikörper, der chemisch an RTA gekoppelt ist, und ist eine positive Kontrolle. 0X19-Fab-Gel_C247 ist ein negatives Kontroll-Immunokonjugat. Der 0X19-Antikörper (European Collection of Animal Cell Cultures #84112012) ist ein Maus-Anti-Ratten-CDS-Antikörper, der nicht mit menschlichen CDS kreuzreagiert.
Tabelle 10
Alle Gelonin-Immunokonjugate waren fähig, menschliche Zellen in dem SCID-Mausmodell abzureichern.
Beispiel 10
Neun genetische Konstrukte wurden zusammengebaut, die ein Geloningen mit natürlicher Sequenz enthielten, das mit gekürztem H65 schwere Kettengen (Fd) oder einem H65 leichte Kettengen (kappa) fusioniert war.

Die H65 leichte Kettensequenz besteht aus den Nukleotiden, die die Nager H65 leichte Ketten variable (V), Verbindungs- (J) und menschliche kappa-(C_k)-Regionen kodieren. Die DNS-Sequenzen der V- und J-Regionen der H65 Fd und kappa-Fragmentgene, die an die pe1B-Leadersequenz gekoppelt sind, können erhalten werden von GenBank (Los Alamos National Laboratories, Los Alamos, New Mexico) unter den Zugangsnummern M90468 bzw. M90467. Vier der Genfusionen schlossen ein Geloningen ein, das an das 5'-Ende eines H65-Fab-Fragmentgens gekoppelt war, wohingegen die anderen vier ein Geloningen einschlossen, das an das 3'-Ende eines H65-Fab-Fragmentgens gekoppelt war. Ein DNS-Linker, der ein Peptidsegment des E. coli shigaähnlichen Toxins (SLT) (SEQ ID NO 58) kodiert, welches zwei Cysteinreste enthält, die an einer Disulfidbindung teilhaben und eine Schleife bilden, die eine proteasesensitive Aminosäuresequenz einschließt, oder der ein Peptidsegment der Muskelaldolase aus Kaninchen kodiert [(RMA), wie in SEQ ID NO 59, welches zahlreiche mögliche Cathepsin-Spaltstellen enthält], wurde zwischen das Geloningen und das Antikörpergen in den Konstrukten eingefügt. Alternativ wurde eine direkte Fusion erzeugt zwischen einem Geloningen und einem H65-Fab-Fragmentgen ohne ein Peptid-Linker-Segment. Tabelle 11 unten gibt einen beschreibenden Namen für jede Genfusion an und zeigt das Expressionsplasmid, das die Genfusion enthält. Jedes Plasmid schließt auch das Fab-Fragmentgen ein (gezeigt in Klammern in Tabelle 11), mit dem jede bestimmte Genfusion co-exprimiert worden war. Tabelle 11

Plasmid	Beschreibung
pING3754	Gelonin::SLT::Fd (kappa)
pING3757	Gelonin::SLT::kappa (Fd)
pING3759	Gelonin::RMA::Fd (kappa)
pING3758	Gelonin::RMA::kappa (Fd)
pING4406	Fd::SLT::Gelonin (kappa)
pING4407	kappa::SLT::Gelonin (Fd)
pING4408	Fd::RMA::Gelonin (kappa)
pING4410	kappa::RMA::Gelonin (Fd)
pING3334	Gelonin::Fd (kappa)

Fusionen von Gelonin an den Carboxyterminus von Antikörpergenen
(i) Fd::SLT::Gelonin (kappa)
Eine Geloningenfusion an das 3'-Ende der H65-Fd-Kette mit der 23 Aminosäuren SLT Linker-Sequenz wurde zusammengefügt in einer dreier Ligation aus den Plasmiden pVKl, pING3731 (ATCC 68721) und pING4000. Das Plasmid pVKl enthält das Fd-Gen, das mit der SLT-Linker-Sequenz im Leseraster gekoppelt ist. Das Plasmid pING3731 enthält das Geloningen, und pING4000 enthält die H65-kappa- und Fd-Gene, die jeweils an die pe1B- Leadersequenz gekoppelt sind, unter der Kontrolle des araB-Promotors als eine dicistronische Nachricht.
Das Plasmid pVKl wurde gebildet, um das 3'-Ende einer menschlichen, konstanten IgG-Fd-Region im Leseraster an ein proteasesensitives Segment des SLT-Gens, begrenzt durch zwei Cysteinreste, welche eine Disulfidbindung zwischen den Ketten bilden, zu koppeln. Das SLT-Gensegment (20 Aminosäuren von SLT, begrenzt durch Cysteinreste, plus drei Aminosäuren, die eingefügt sind, um das Klonieren zu erleichtern) wurde zusammengesetzt aus zwei Oligonukleotiden, SLT-Linker 1 und SLT-Linker 2.
Die beiden Oligonukleotide wurden annealed und in einen Vektor (pING3185) ligiert, der PstI und XhoI kohäsive Enden enthält, wodurch die PstI-Stelle zerstört wurde und die XhoI-Stelle erhalten wurde. Der Vektor pING3185 enthielt eine konstruierte PstI-Stelle am 3'-Ende des Fd-Gens und enthielt eine XhoI-Stelle stromabwärts des Fd-Gens. Das Produkt dieser Ligation, pVKI, enthielt das H65-Fd-Gen (fusioniert mit der pe1B-Leadersequenz) im Leseraster mit dem SLT-Linker-Segment und enthielt zwei Restriktionsstellen, FspI und ScaI, am 3'-Ende des SLT-Linkers.
Das Plasmid pVKl wurde verdaut mit SauI und ScaI und das 217 by Fragment, das einen Teil der Fd konstanten Domäne und das gesamte SLT-Gensegment enthält, wurde gereinigt durch Elektrophorese auf einem Agarosegel. pING3731 wurde verdaut mit SmaI und XhoI und das 760 bp Geloningen wurde ähnlich gereinigt. Das Plasmid pING4000 wurde verdaut mit SauI und XhoI und das Vektorsegment, das das gesamte kappa-Gen und einen Teil des Fd-Gens enthält, wurde auch gereinigt. Die Ligation dieser drei DNS-Fragmente resultierte in pING4406, welches den Fd::SLT::Gelonin(kappa)-Genfusionsvektor enthält.
(2) kappa:: SLT:: Gelonin (Fd)
Eine Geloningenfusion am 3'-Endes der H65-kappa-Kette mit der 25 Aminosäuren SLT-Linker-Sequenz (20 Aminosäuren von SLT, begrenzt durch Cysteinreste, plus 5 Aminosäuren, die eingefügt sind, um das Klonieren zu erleichtern) wurden zusammengesetzt aus den DNS-Segmenten in pING3731 (ATCC 68721) und pING3713.
Das Plasmid pING3713 ist ein Fab-Expressionsvektor, worin die H65-Fd- und kappa-Gene in einer dicistronischen Transkriptionseinheit gekoppelt sind, welche das SLT-Linker-Segment enthält, das im Leseraster an das 3'-Ende des kappa-Gens kloniert ist. Das Plasmid wurde wie folgt gebildet. In ein Quellenplasmid, das die H65-Fd- und kappa-Gene enthält, wurde eine EagI-Stelle am 3'-Ende des kappa-Gens positioniert durch ortsgerichtete Mutagenese, ohne die kodierte Aminosäuresequenz zu verändern. Das SLT-Gensegment aus pVKl wurde amplifiziert mit den Primern SLT-EagI-5' und SaII für eine Kopplung im Leseraster an die EagI-Stelle des 3'-Endes des kappa-Gens.
Das 140 by PCR-Produkt wurde verdaut mit EagI und XhoI und das 75 by Fragment, das das SLT-Gensegment enthält, wurde benachbart zu den Fd- und kappa-Genen in das Quellenplasmid kloniert, um pING3713 zu erzeugen.
Für die Konstruktion der Genfusion an Gelonin wurde pING3713 geschnitten mit ScaI und XhoI und das Vektorfragment, das das Fd-Gen und die kappa::SLT-Fusion enthält, wurde gereinigt. pING3731 wurde verdaut mit SmaI und XhoI und das DNS-Fragment, das das Geloningen enthält, wurde auch gereinigt. Das Produkt der Ligation dieser zwei Fragmente, pING4407, enthält die Fd- und kappa::SLT::Geloningene.
(3) Fd::RMA::Gelonin (kappa)
Eine Geloningenfusion am 3' Ende der H65-Fd-Kette mit der 21 Aminosäuren-RMA-Linker-Sequenz (20 Aminosäuren von RMA plus 1 Aminosäure, die eingeführt ist, um das Klonieren zu erleichtern) wurde zusammengesetzt in einer dreier Ligation aus den Plasmiden pSH4, pING3731 (ATCC 68721) und pING4000.
Das Plasmid pSH4 enthält ein Fd-Gen, das im Leseraster an die RMA-Linker-Sequenz gekoppelt ist. Das RMA-Gensegment wurde verbunden mit dem 3'-Ende von Fd durch overlap-extension-PCR wie folgt. Das 3'-Ende (konstante Region) des Fd-Gens wurde amplifiziert durch PCR aus einem Quellenplasmid mit den Primern KBA-γ2 und RMAG-1. Jede Fd konstante Region kann verwendet werden, da die konstanten Regionen aller menschlichen IgG₁-Antikörper identisch sind.
Das Produkt dieser Reaktion wurde vermischt mit dem Primer RMA-76, der mit dem amplifizierten Produkt der ersten Reaktion einen Doppelstrang bildete, und die Mischung wurde amplifiziert mit den Primern KBA-γ2 und RMAK-2.
Das PCR-Produkt enthielt einen Teil der Fd konstanten Region, die im Leseraster mit dem RMA-Gensegment gekoppelt ist. Das Produkt enthielt auch eine ScaI-Restriktionsstelle, die nützlich ist für die Fusion im Leseraster an ein Protein, wie z. B. Gelonin, und es enthält auch eine XhoI-Stelle für das nachfolgende Klonieren. Dieses PCR-Produkt wurde geschnitten mit SauI und XhoI und benachbart in die Reste des Fd-Gens ligiert, um pSH4 zu erzeugen.
Zum Zusammensetzen des Genfusionsvektors, der die Fd::RMA::Gelonin, kappa-Gene enthält, wurde pSH4 geschnitten mit SauI und ScaI und das Fd::RMA-Segrrient wurde gereinigt. Das Plasmid pING3731 wurde geschnitten mit SmaI und XhoI und das 760 by DNS-Fragment, das das Geloningen enthält, wurde gereinigt, und pING4000 wurde geschnitten mit SauI und XhoI und der Vektor wurde gereinigt. Das Produkt der Ligation dieser Fragmente, pING4408, enthielt die Fd::RMA::Gelonin- und kappa-Gene.
(4) kappa:: RMA:: Gelonin (Fd)
Eine Geloningenfusion am 3'-Ende der H65-kappa-Kette mit der 21 Aminosäuren RMA-Linker-Sequenz wurde zusammengesetzt in einer dreier Ligation aus den Plasmiden pSH6, pING4408 (siehe vorangegangener Abschnitt) und pING3713.
Das Plasmid pSH6 enthält ein kappa-Gen, das im Leseraster an die RMA-Linker-Sequenz gekoppelt ist. Das RMA-Gensegment wurde an das 3'-Ende von kappa durch overlapextension-PCR wie folgt gekoppelt. Das 3'-Ende (konstante Region) des kappa-Gens wurde amplifiziert durch PCR aus einem Quellenplasmid mit den Primern KBA-K2 und RMAK-1.
Das Produkt dieser Reaktion wurde vermischt mit dem Primer RMA-76 (SEQ ID NO 81), der mit dem amplifizierten Produkt der ersten Reaktion einen Doppelstrang bildet, und die Mischung wurde amplifiziert mit den Primern KBA-K2 und RMAK-2 (SEQ IDNO82). Das PCR-Produkt enthielt einen Teil der kappa konstanten Region, gekoppelt im Leseraster an das RMA-Gensegment. Das Produkt enthielt auch eine ScaI-Restriktionsstelle, die nützlich ist für die Fusion im Leseraster an ein Protein, wie z. B. Gelonin, und es enthielt auch eine XhoI-Stelle für das nachfolgende Klonieren. Dieses PCR-Produkt wurde ge schnitten mit SstI und XhoI und benachbart zu den Resten des kappa-Gens ligiert, um pSH6 zu erzeugen.
Zum Zusammenbau des Genfusionsvektors, der die kappa::RMA::Gelonin- und Fd-Gene enthält, wurde pSH6 geschnitten mit HindIII und PstI und das DNS-Fragment, das die kappa konstante Region und einen Teil des RMA-Linker-Segments (das PstI-RMA-Linker-Segment enthält eine PstI-Stelle) enthält, wurde gereinigt. Das Plasmid pING4408 wurde geschnitten mit PstI und SaII und das DNS-Fragment, das ein Segment des RMA-Linkers, das Geloningen und einen Teil des Tetracyclinresistenzgens im Vektorsegment enthält, wurde gereinigt. pING3713 wurde geschnitten mit SaII und HindIII und der Vektor wurde gereinigt. Das Produkt der Ligation dieser drei Fragmente, pING4410, enthielt die kappa::RMA::Gelonin- und Fd-Gene.
Fusionen von Gelonin an das Aminoende von Antikörpergenen
(1) Gelonin::SLT::Fd' (kappa)
Eine Geloningenfusion an das 5'-Ende der H65-Fd'-Kette mit einer 25 Aminosäuren SLT-Linker-Sequenz (20 Aminosäuren von SLT, gebunden durch Cysteinreste, plus 5 Aminosäuren, die eingefügt wurden, um das Klonieren zu erleichtern), wurde zusammengebaut in einer dreier Ligation aus den Plasmiden pING3748, pING3217 und einem PCR-Fragment, das das H65 schwere Ketten variable Region (V_H) Gensegment kodiert, das die variable Region des Fd'-Gens in pING3217 ist. Das Plasmid pING3748 enthält das Geloningen, das an die SLT-Linker-Sequenz im Leseraster gekoppelt ist, und pING3217 enthält die H65-Fd'- und kappa-Gene in einer dicistronischen Transkriptionseinheit.
Das Plasmid pING3825 (siehe Beispiel 2) wurde amplifiziert mit den PCR-Primern ge-lo3'-Eag und Gelo-9, um eine EagI-Restriktionsstelle in das 3'-Ende des Geloningens durch PCR-Mutagenese einzufügen.
Das PCR-Produkt wurde geschnitten mit Bc1I und EagI und das 56 by DNS-Fragment wurde gereinigt. Das Plasmid pING3713 wurde geschnitten mit EagI und XhoI und das 77 by DNS-Fragment, das den SLT-Linker enthält, wurde gereinigt. Das 56 by BcII- bis EagI-Fragment und das 77 by EagI- bis XhoI-Fragment wurden ligiert in pING3825, welches verdaut worden war mit BcII und XhoI, um pING3748 zu erzeugen, das das Geloningen, gekoppelt im Leseraster an die SLT-Linker-Sequenz, enthält.
Zum Zusammensetzen des Genfusionsvektors, der die Gelonin::SLT::Fd'- und kappa-Gene enthält, wurde H65 V_H amplifiziert durch PCR aus pING3217 mit den Primern H65-G1 und H65-G2, und das Produkt wurde behandelt mit T4-Polymerase, gefolgt von der Verdauung mit NdeI.
Das 176 by Fragment, welches das 5'-Ende der H65 schwere Ketten V-Region enthält, wurde gereinigt. Gleichzeitig wurde pING3217 verdaut mit NdeI und XhoI, und das 1307 by DNS-Fragment, das einen Teil des Fd'-Gens und alle kappa-Gene enthält, wurde gereinigt. Die beiden Fragmente wurden in pING3748 ligiert, welches verdaut worden war mit ScaI und XhoI in einer dreier Ligation, wodurch pING3754 (ATCC 69102) erhalten wurde, welches die Gelonin::SLT::Fd'- und kappa-Gene enthält.
(2) Gelonin::SLT::kappa (Fd)
Eine Geloningenfusion an das 5'-Ende der H65-kappa-Kette mit dem 25 Aminosäuren SLT-Linker-Segment wurde zusammengefügt in einer dreier Ligation aus den Plasmiden pING3748 (siehe vorangegangener Abschnitt), pING4000 und einem PCR-Fragment, das das H65 leichte Ketten variable Region (V_L) Gensegment kodiert.
Zum Zusammensetzen des Genfusionsvektors, der die Gelonin::SLT::kappa- und Fd'-Gene enthält, wurde ein H65 V_L-Fragment amplifiziert mittels PCR aus pING3217 mit den Primern H65-K1 und JK1-HindIII, und das Produkt wurde behandelt mit T4-Polymerase, gefolgt von der Verdauung mit HindIII.
Das 306 by Fragment, das die leichte Ketten V-Region enthält, wurde gereinigt. Anschließend wurde pING4000 verdaut mit HindIII und XhoI und das 1179 by DNS-Fragment, das die kappa konstante Region und alle Fd'-Gene enthält, wurde gereinigt. Die beiden Fragmente wurden ligiert an pING3748, der mit ScaI und XhoI verdaut worden war, in einer dreier Ligation, wobei man pING3754 erhielt, welches die Gelonin::SLT::kappa- und Fd-Gene enthält.
(3) Gelonin::RMA::Fd (kappa)
Eine Geloningenfusion an das 5'-Ende der H65-Fd-Kette mit der 24 Aminosäuren RMA-Linker-Sequenz (20 Aminosäuren von RMA plus 4 Aminosäuren, die eingefügt wurden, um das Klonieren zu erleichtern) wurde zusammengesetzt in einer dreier Ligation aus den Plasmiden pING3755, pING3217 und einem PCR-Fragment, das das H65 V_H-Gensegment kodiert. Das Plasmid pING3755 enthält das Geloningen, das im Leseraster an die RMA-Linker-Sequenz gekoppelt ist, und pING3217 enthält die H65-Fd- und kappa-Gene in einer dicistronischen Transkriptionseinheit.
Das Plasmid pING3755 wurde zusammengebaut, um das Geloningen zu enthalten, das gekoppelt ist an das RMA-Linker-Gensegment. Das RMA-Linker-Gensegment wurde amplifiziert mittels PCR aus pSH4 mit den Primern RMA-EagI und HindIII-2.
Das 198 by PCR-Produkt wurde geschnitten mit EagI und HindIII und das resultierende 153 by DNS-Fragment wurde gereinigt. Dieses RMA-Gensegment wurde benachbart zu Gelonin kloniert, unter Verwendung eines PstI- und EagI-Fragmentes aus pING3748 und unter Verwendung des PstI- bis HindIII-Vektorfragmentes aus pING3825. Das Produkt dieser dreier Ligation war pING3755.
Zum Zusammensetzen des Genfusionsvektors der die Gelonin::RMA::Fd, kappa-Gene, enthält, wurde H65 V_H amplifiziert mittels PCR aus pING3217 mit den Primern H65-G1 (SEQ ID NO 86) und H65-G2 (SEQ ID NO 87), und das Produkt wurde behandelt mit T4-Polymerase, gefolgt von der Verdauung mit NdeI. Das 186 by Fragment, das das 5'-Ende der V-Region der schweren Kette enthält, wurde gereinigt. Gleichzeitig wurde pING3217 verdaut mit NdeI und XhoI, und das einen Teil des Fd'-Gens und alle kappa-Gene enthaltende 1307 by DNS-Fragment wurde gereinigt. Diese beiden Fragmente wurden an pING3755 ligiert, welches verdaut worden war mit ScaI und XhoI, in einer dreier Ligation, wodurch pING3759 (ATCC 69104) geerntet wurde, welches die Gelonin::RMA::Fd'- und kappa-Gene enthält.
(4) Gelonin::RMA::kappa (Fd)
Eine Geloningenfusion an das 5'-Ende der H65-kappa-Kette mit der 24 Aminosäuren RMA-Linker-Sequenz wurde zusammengefügt in einer dreier Ligation aus den Plasmiden pING3755, pING4000 und einem das H65 V_L. Gensegment kodierenden PCR-Fragment.
Zum Zusammenfügen des Genfusionsvektors, der die Gelonin::RMA::kappa- und Fd-Gene enthält, wurde ein H65 V_L Segment amplifiziert mittels PCR aus pING3217 mit den Primern H65K-1 (SEQ ID NO 88) und JK1-HindIII (SEQ ID NO 89), und das Produkt wurde behandelt mit T4-Polymerase, gefolgt von der Verdauung mit HindIII. Das 306 by Fragment, das das 5'-Ende der V-Region der leichten Kette enthält, wurde gereinigt.
Gleichzeitig wurde pING4000 verdaut mit HindIII und XhoI, und das 1179 by DNS-Fragment, das die kappa konstante Region und das gesamte Fd-Gene enthält, wurde gereinigt. Diese beiden Fragmente wurden ligiert an pING3755, welches verdaut worden war mit ScaI und XhoI, in einer dreier Ligation, wodurch pING3758 (ATCC 69103) erhalten wurde, welches die Gelonin::RMA::kappa- und Fd-Gene enthält.
(5) Gelonin::Fd (kappa)
Eine direkte Geloningenfusion wurde konstruiert aus pING3754. pING3754 wurde verdaut mit BglII und XhoI und das Vektorsegment wurde gereinigt. Gleichzeitig wurde pING3754 verdaut mit EagI, behandelt mit T4-Polymerase, geschnitten mit BglII und das Geloningensegment wurde gereinigt. pING3754 wurde auch geschnitten mit FspI und XhoI, und das Fd- und kappa-Gensegment wurden gereinigt. Diese Fragmente wurden zusammengefügt in einer dreier Ligation, um pING3334 zu erzeugen, welches eine direkte Genfusion von Gelonin mit Fd in Assoziation mit einem kappa-Gen enthält.
Beispiel 11
Jede dieser Geloningenfusionen, deren Konstruktion beschrieben ist in Beispiel 10, wurde co-exprimiert mit ihrem Gegenstück H65-Fab-Gen in Arabinose induziertem E. coli-Stamm E104.
Die Expressionsprodukte der Genfusionen wurden nachgewiesen in dem Überstand induzierter Kulturen durch ELISA. Typischerweise wurde eine Platte überzogen mit Antikörper, der Gelonin erkennt. Der Kulturüberstand wurde aufgetragen und gebundenes Fab wurde nachgewiesen mit Antikörper erkennendem menschlichen kappa, gekoppelt an Meerrettichperoxidase. An Gelonin chemisch konjugiertes H65-Fab-Fragment wurde als ein Standard verwendet. Alternative ELISA-Protokolle, welche das Überziehen einer Platte mit Antikörper einschlossen, der entweder kappa oder Fd erkennt, oder die einen Detektionsschritt mit anti-menschlichem Fd anstelle von anti-menschlichem kappa einschlossen, ergaben ähnliche Ergebnisse. Nur richtig zusammengebautes Fusionsprotein, das Gelonin, kappa und Fd enthält, wurde durch diesen Test detektiert. Nicht assoziierte Ketten wurden nicht detektiert.
Das Fusionsprotein, das erzeugt wurde aus induzierten Kulturen, die die Expressionsvektoren pING4406. 4407, 4408 und 4410 in E. coli E104 enthielten, akkumulierte in einer Konzentration von ungefähr 20 bis 50 ng/ml. Die Fusionsproteine, die exprimiert wurden auf die Induktion von pING3754, 3334, 3758 und 3759 (aber nicht pING3757), wurden in viel höheren Spiegeln exprimiert, und zwar bei ungefähr 100 bis 500 ng/ml. Ein Fusionsprotein von ungefähr 70.000 Kd wurde nachgewiesen in dem konzentrierten E. coli-Kulturüberstand durch Immunfärbung von Western Blots mit entweder anti-menschlichen kappa- oder Anti-Gelonin-Antikörpern.
Das Gelonin::SLT::Fd (kappa)-Fusionsprotein von pING3754 (ATCC 69102) wurde gereinigt aus induzierter 10 L Fermentationslösung. Die 10 L Fermentationslösung wurde konzentriert und Puffer ausgetauscht in 10 mM Phosphatpuffer bei pH 7,0 unter Verwendung einer S10Y10-Kartusche (Amicon) und einem DC10-Konzentrationsapparat. Der Überstand wurde gereinigt, indem der konzentrierte Überstand durch eine DE52-Säule (20 × 5 cm) hindurchgeführt wurde, welche äquilibriert war mit 10 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7,0. Das Durchgeflossene wurde dann weiter gereinigt und konzentriert durch Säulenchromatographie auf CM52 (5 × 10 cm) in 10 mM Phosphatpuffer. Ein 0 bis 0,2 M linearer Gradienten von NaCI wurde verwendet, um das Fusionsprotein zu eluieren, und Fraktionen, die das Fusionsprotein enthalten, wurden gesammelt und auf eine Protein-G-Säule (1 ml) geladen. Das Fusionsprotein wurde eluiert von Protein-G mit 0,2 M Glycin. Die Gelonin::RMA::Fd (kappa)- und Gelonin::RMA::kappa (Fd)-Fusionsproteine wurden gereinigt aus Fermentationslösungen durch ähnliche Verfahren, mit Ausnahme, dass der CM52-Säulenschritt weggelassen wurde, und die DE52-Säule äquilibriert wurde mit 100 mM Natriumphosphatpuffer bei pH 7,0. Die Fusionsproteine wurden nicht bis zur Homogenität gereinigt.
Jedes der drei gereinigten Fusionsproteine wurde dann untersucht auf seine Aktivität in dem RLA-Assay und auf Cytotoxizität gegen die T-Zeltlinie HSB2. (T-Zellen exprimieren das CDS-Antigen, welches erkannt wird durch den H65-Antikörper.) Der RLA-Assay wurde durchgeführt, wie beschrieben in Beispiel 4, und die Ergebnisse des Assays sind unten in Tabelle 12 gezeigt. Tabelle 12

Fusionsprotein IC₅₀(pM)

rGelonin 11

Gelonin::SLT::Fd (kappa) 19

Gelonin::RMA::Fd (kappa) 28

Gelonin::RMA::kappa (Fd) 10
Das Fusionsprotein war in Gesamtzelt-Cytotoxizitäts-Ansätzen, durchgeführt. wie beschrieben in Beispiel 6 (Tabelle 13), aktiv und tötete zwei T-Zelllinien, HSB2 und CEM, mit IC₅₀-Werten 2-fach (HSB2) oder 10-fach (CEM) niedriger als jene Werte von Gelonin, das chemisch gekoppelt ist an H65. Siehe Tabelle 13 unten für die Ergebnisse, in welcher die IC₅₀-Werte angepasst wurden relativ zu der Menge an Fusionsprotein in jeder Probe.
Tabelle 13 IC₅₀ (pMT) .
Das Fusionsprotein zeigte eine ähnliche Aktivität auf periphere Blut-mononukleäre Zellen (Daten nicht gezeigt).
Beispiel 12
Das Geloningen mit natürlicher Sequenz wurde auch fusioniert an eine Einzetkettenforrn der für Menschen entwickelten he H65 variablen Region. Das Geloningen wurde positioniert entweder am N-Terminus oder am C-Terminus des Fusionsgens und das SLT- oder RMA-Linker-Petptid wurde positioniert zwischen dem Gelonin und Antikörperdomänen. um intrzelluläre Reifung des Fusionsproteins mit nachfolgendem cytosolischen Freisetzen von Gelonin zu ermöglichen.
A. Konstruktion von Gel::RMA::SCA(V_L-V_H). Gel::SLT::SCA(V_L-V_H). Gel::RMA::SCA(V_H-V_L) und Gel::SLT::SCA(V_H-V_L)
Eine Einzelketten-Antikörper-(SCA)-Form der he3 H65 variablen Domäne wurde zusammengebaut aus zuvor konstruierten Genen. Diese SCA-Segment bestand aus der gesamten V- und J-Region der einen Kette (schwer oder leicht), gekoppelt an das gesammte V- und 7-Segment der anderen Kette (schwer oder leicht), über ein 15 Aminosäuren enthaltendes flexibles Peptid [(Gly)₄Ser]₃. Diese Peptid ist identisch mit jenem das beschrieben ist in Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879–5883 (1988); Glockshuber et al., Biochemistry, 29: 1362–1367 (1990); und Cheadle et al., Molecular Immunol., 29: 21–30 (1992). Das SCA wurde in zwei Orientierungen zusammengebaut: V–J_kappa::[(Gly)₄ Ser]₃::V-J_Gmma und V-J_Gamma::[(Gly)₄Ser]₃::V-J_kappa. Jedes SCA-Segment wurde zusammengefügt und anschließend an Gelonin fusioniert.
Zum Zusammenbau des SCA-Segments V-J_kappa::[(Gly)₄Ser]₃::V-J_Gamma wurden die Primer HUK-7 und SCFV-1 verwendet, um ein 352 by DNS-Fragment, das die he3-V/J kappa-Sequenzen von pING4627 enthält, durch PCR in einer Reaktion zu amplifizieren, die 10 mM KCl, 20mM TRIS, pH 8,8, 10mM (NH₄)₂SO₂, 2 mM MgSO₄, 0,1% Triton X-100 100 ng/ml BSA, 200uM jeden dNTPs, und 2 Einheiten Vent-Polymerase (New England Biolabs, Beverley, Massachusetts) in einem Gesamtvolumen von 100 μl enthält.
Gleichzeitig wurden die Primer SCFV-2 und SCFV-3 verwendet, um ein he3 schwere Ketten V/j-gamma-Segment aus pING4623 zu amplifizieren, wodurch ein 400 by Fragment erzeugt wurde.
Die Produkte dieser Reaktion wurden vermischt und amplifiziert mit den Außenprimern HUK-7 und SCFV-3. Das Produkt dieser Reaktion wurde behandelt mit T4-Polymerase und dann mit XhoI geschnitten. Das resultierende 728 by Fragment wurde dann gereinigt durch Elektrophorese auf einem Agarosegel. Dieses Fragment wurde in die Vektoren pING3755 und pING3748 ligiert (siehe Beispiel 10), wobei jedes mit ScaI und XhoI verdaut wurde. Die resultierenden Vektoren pING4637 und pING4412 enthalten die Gelonin::RMA::SCA-V-J_kappa::[(Gly)₄Ser]₃::V-J_Gamma- und Gelonin::SLT::SCA-V-J_kappa::[(Gly)₄ Ser]₃::V-J_Gamma-Fusionsgene.
Ähnlich wurde SCA V-J_Gamma::[(Gly)₄Ser]₃::V-J_kappa zusammengefügt durch Amplifikation von pING4627 mit den Primern SCFV-5 und SCFV-6, wodurch ein 367 bp Fragment erzeugt wurde, das he3V/7-kappa-Sequenzen enthält,
und pING4623 wurde mir den Primern H65-G3 und SCFV-4 amplifiziert, wodurch ein 385 by Fragment erzeugt wurde, das die he3-gamma-V/J-Sequenzen enthält, durch PCR mit Vent-Polymesse.
Die Produkte dieser Reaktionen wurden vermischt und amplifiziert mit H65-G3 und SCFV-6. Das 737 by Produkt wurde behandelt mit T4-Polymerase und geschnitten mit XhoI. Die Ligation in pING3755 und pING3748 (verdaut mit ScaI und XhoI) resultierte im Zusammenbau des Gelonin::RMA::SCA V-J_Gamma::[(Gly)₄Ser]₃::V-J_kappa Fusiensgen bzw. Gelonin::SLT::SCA V-J_Gamma::[(Gly)₄Ser]₃::V-J_kappa Fusionsgens.
Gelonin::scA-Fusionen ohne einen spaltbaren Linker können durch Deletion des SLT-Linkers in pING4412 unter Verwendung der Restriktionsenzyme EagI und FspI konstruiert werden. Das Andauern an diesen Stellen und die Religierung der Plasmide führt zu einer Deletion der SLT-Sequenz im Leseraster.
Beispiel 13
Das BRIP besitzt Eigenschaften, die es zu einem attraktiven Kandidaten für eine Komponente eines Immuntoxins machen. Bei BRIP handelt es sich im ein natürlicherweise unglycosyliertes Protein, das verringeite Aufnahme in die Leber und eine höhere Verweilzeit im Bkutkreislauf in vivo zeigen kann. Zusätzlich ist BRIP weniger toxisch und weniger immunogen in Tieren als die A-Kette von Ricin. Das Klonieren des BRIP-Gens und die Expression von rekombinantem BRIP in E. coli-Expressionssystemen beseitigt das Erfordernlis, natives BRIP direkt aus Gerste zu reinigen, und ermöglicht die Entwicklung von BRIP-Analoga, die mit einem verfügbaren Cysteinrest für die Konjugation an Antikörper konjugiert werden können.
Reinigung von BRIP und Erzeugung polyklonaler Antikörper gegen BRIP
Natives BRIP wurde aus Vollgraupenmehl gereinigt. Vier Kilogramm Mehl wurden mir 16 Litern Extraktionspuffer (10 mM NaPO₄, 25 mM NaCl, pH 7.2) für 20 Stunden bei 4°C extrahiert. Das Sediment wurde mittels Zentrifugation entfernt und 200 ml gepackte S-Sepharose (Pharmacia. Piscataway, New Jersey) zum Absorbieren des BRIP zugesetzt. Nach Mischen für 20 Stunden bei 4°C ließ man das Harz absetzen spülte mehrmals mit Extraktionspuffer und packte es in eine 26 × 40 cm Säule. Nach dem Packen wude die Säule mit Extraktionspuffer (150 ml/h) gewaschen, bis sich die Absorption des Eluats null näherte. Das BRIP wurde anschließend mit einem linearen Gradienten von 0,025 bis 0.3 M NaCI im Extraktionspuffer eluiert und ml Fraktionen wurden gesammelt. Die BRIPenthaltenden Peaks (identifiziert über Western-Analyse der Säulenfraktionen) wurden vereinigt, auf etwa 20 ml konzentriert und anschließend auf einer 2,6 × 100 cm Sephacryl S-200HR-Säule (Pharmacia) chromatographiert, die mit 10 mM NaPO₄, 125 mM NaCI, pH 7,4 (10 ml/h) equilibriert war. BRIP-enthaltende Peaks wurden wiederum gepoolt, konzentriert und bei –70°C gelagert.
Das resultierende gereinigte BRIP-Protein wies ein Molekulargewicht von etwa 30.000 Dalton auf, basierend auf der Mobilität Coomassie-gefärbter Proteinbanden nach SDS-PAGE. Die Aminosäurezusammensetzung stimmte mit der von Asano et al., Carlsberg Res. Comm., 49, 619–626 (1984) veröffentlichten überein.
Kaninchen wurden mit gereinigtem BRIP immunisiert, um polyklonale Antiseren zu erzeugen.
Klonieren des BRIP-Gens
Eine eDNS-Expressionslibrary, hergestellt aus keimenden Gerstensamen im Phagen λ-Expressionsvektor λZAPII, wurde von Stratagene, La Jolla, CA bezogen. Etwa 700.000 Phagenplaques wurden mit gegen BRIP gerichteten polyklonalen Antiseren gesichtet und 6 immunreaktive Plaques identifiziert. Ein Plaque wurde ausgewählt, und die darin enthaltene cDNS aus λZAPII mit EcoRI ausgeschnitten und in pUC18 subkloniert, woraus der Vektor pBS1 hervorging. Das cDNS-Insert wurde mit Sequenase (United States Biochemical, Cleveland, Ohio) sequenziert. Die DNS-Sequenz des nativen BRIP-Gens ist in SEQ ID NR: 12 dargestellt. Um zu bestätigen, dass die cDNS das native BRIP-Gen codierte. wurde die cDNS in dem E: coli-Plasmid pKK233-2 (Pharmacia) exprimiert. Das BRIP-Protein wurde in IPTG-induzierten Zellen detektiert, die mit dem Plasmid transformiert worden waren. und zwar mittels Western-Analyse mit den oben beschriebenen Anti-BRIP-Antiseren aus Kaninchen.
Konstruktion eines E. coli-Expressionsvektors. enthaltend das BRIP-Gen
Gersten-cDNS, enthaltend das BRIP-Gen, wurde an eine pelB-Leadersequenz gebunden und unter der Kontrolle eines araB-Promoters in einem bakteriellen Sekretionsvektor angeordnet.
Ein Zwischenvektor, enthaltend das an die pelB-Leadersequenz gebundene BRIP-Gen, wurde erzeugt. Das Plasmid pBSl wurde mit NcoI geschnitten, mit Mungobohnen-Nuclease behandelt, mit BamHI geschnitten und das den Aminosäuren 1–256 von BRIP entsprechende 760 by Fragment aus einem Agarosegel gereinigt. Gleichzeitig wurde eine einzelne XhoI-Stelle stromab des 3'-Endes des BRIP-Gens in pBSl mittels PCR-Amplifikation mit einem pUC18-Vektorprimer eingeführt (der dem Reverse^®-Primen identisch war, vertrieben von NEB oder BRL, jedoch auf einem Zyklon Modell 8400 DNS-Synthesegerät synthetisiert worden war), wie auch dem spezifischen Primen BRIP 3'Xho. Die Sequenz jedes Primers ist unten gezeigt.
Der Primen BRIP 3'Xho umfasst einen Anteil, entsprechend den letzten 8 by des BRIP-Gens, das Stoppcodon und zahlreiche Basenpaare stromab des BRIP-Gens, wie auch einen zusätzlichen Anteil, der eine XhoI-Stelle in das resultierende PCR-Fragment einführt. Das PCR-Reaktionsprodukt wurde mit BamHI und XhoI verdaut, und ein 87 by Fragment. enthaltend das 3'-Ende des BRIP-Gens, wurde einem aus einem 5%igen Acrylamidgel gereinigt. Die gereinigten BRIP-Fragmente von 760 by und 87 by wurden im Vektor pING1500 benachbart zur pelB-Leadersequenz ligiert. Das pING1500 war zuvor mir SstI geschnitten, mit T4-Polymerase behandelt, mit XhoI geschnitten und gereinigt worden. Die DNS-Sequenz an der Verbindung der pe1B-Leadersequenz und dem 5'-Ende des BRIP-Gens wu de über DNS-Sequenzanalyse verifiziert. Dieser Vektor wurde als pING3321-1 bezeichnet.
Der fertige Expressionsvektor wurde zusammengesetzt, indem man das BRIP-Gen unter die Kontrolle des induzierbaren araB-Promoters stellte. Das Plasmid pING3321-1 wurde mit PstI und XhoI geschnitten, und das BRIP-Gen, das an die pe1B-Leadersequenz gebunden war, wurde aus einem Agarosegel gereinibt. Der Expressionsvektor pING3217, enthaltend den araB-Promoter, wurde mit PstI und XhoI geschnitten und an das BRIP-Gen ligiert. Der Expressionsvektor wurde als pING3322 bezeichnet.
Die Arabinoseinduktion von E. coli-Zellen, enthaltend das Plasmid pING3322, in einem Fermerlter führte zur Produktion von etwa 100 mg pro Liter an rekombinatem BRIP. Das von E. coli erzeugte BRIP zeigt Eigenschaften, den denjenigen des direkt aus Gerstensamen gereinigten BRIPs identisch sind.
Konstruktion von BRIP-Analoga mit einem freien Cysteinrest
Das BRIP-Protein enthält keine Cysteinreste und enthält daher keine direkt verfügbaren Reste, die eine Disulfidbindung an Antikörper oder andere Proteine bilden könnten. Analoga des rekombinanten BRIP wurden erzeugt, die einen freien Cysteinrest in der Nähe des C-Terminus des Proteins enthalten. Drei Reste des BRIP-Proteins stellten Ziele für die Aminosäuresubstitutionen dar. Ein Vergleich der Aminosäuresequenz des BRIP mit der bekannten Tertiärstruktur der Ricin A-Kette (siehe 2) lebte nahe, dass diese drei Positionen in der Nähe der Oberfläche des Moleküls verfügbar sein würden. Die drei BRIP-Analoga umfassen Cysteine, substituiert anstelle von Serin₂₇₇, Alanin₂₇₀ und Leucin₂₅₆, des nativen Proteins, und wurden bezeichnet als BRIP_C277, BRIP_C270 bzw. BRIP_C256.
(1) Ein Plasmidvektor, der das BRIP_C277-Analogon exprimieren kann, wurde durch Ersetzen des 3'-Endes des BRIP-Gens durch ein DNS-Segment, das den Aminosäureaustausch verleiht, konstruiert. Das EcoRI-Fragment, enthaltend das BRIP-Gen aus pBSl, wurde in M13mp18 subkloniert, und einzelsträngige DNS (Antisensestrang) wurde mittels PCR mit den Primern OBM2 (entsprechend den Nucleotiden –11 bis +8 des BRIP-Gens) und OMB4 (entsprechend den Aminosäuren 264–280 von BRIP sowie dem Stoppcodon von BRIP, und enthaltend die Substitution eines Cysteincodons für das native Codon für Serin₂₇₇, des nativen BRIP) amplifiziert. Die Sequenzen der Primer OBM2 und OMB4, sind unten dargestellt worin die unterstrichenen Nucleotide das substituierte Cystein codieren:
Ein Fragment, enthaltend BRIP-Gen, in dem das Codon für die Aminosäure in Position 277 zu einem Cysteincodon geändert war, wurde amplifiziert. Das Fragment wurde in die SmaI-Stelle von pUC19 (BRL) kloniert, und das erzeugte Plasmid wurde als pMB22 bezeichnet. pMB22 wurde mit EcoRI verdaut, und ein EcoRI-XhoI-Linker (Clonetech, Palo Alto, CA) wurde in den Vektor ligiert. Die folgende Verdauung mit XhoI und die Religierung erzeugte den Vektor pINGMB2X. Ein BamHI bis XhoI-Fragment, codierend das 3'-Ende von BRIP mit der geänderten Aminosäure, wurde aus pMB2X ausgeschnitten, und das Fragment wurde auf einen 5% igen Acrylamidgel gereinigt. Dieses Fragment wurde zusammen mit einem EcoRI bis BamHI-Fragment, enthaltend die pelB-Leadersequenz, und Sequenzen, codierend die ersten 256 Aminosäuren von BRIP, wurden in einer dreiteiligen Ligation in pING3322 substituiert, geschnitten mit EcoRI und XhoI. Der resultierende Vektor, enthaltend das BRIP_C277-Analogon wurde als pING3603 bezeichnet (ATCC-Zugangsnummer 66722).
s(2) Ein BRIP-Analogon mit einem freien Cystein in Position 26 wurde unter Anwendung der PCR konstruiert, um die Aminosäuresubstitution einzuführen. Ein Teil des Expressionsplasmids pING3322 wurde amplifiziert mit den Primern BRIP-256 und HINDIII-2. Die Sequenz jedes Primers ist unten dargestellt.
Die Nucleotide 4–21 des Primers BRIP-256 codieren die Aminosäuren 256–262 von BRIP, während die unterstrichenen Nucleotide das Cystein angeben, das für das Leucin in der entsprechenden Position des nativen BRIP-Proteins substituiert werden soll. Der Primer HINDIII-2 entspricht einem Teil des Plasmids. Das PCR-Produkt das den carboxyterminalen Anteil des BRIP-Analogons codiert wurde mit T4-Polymerase behandelt. mit XhoI geschnitten, und das resultierende Fragment wurde auf einem 5%igen Acrylamidgel gereinigt. Gleichzeitig wurde das Plasmid pING3322 mit BamHI geschnitten, mit T4 Polymerase behandelt, mit EcoRI geschnitten, und das die pelB-Leadersequenz wie auch die ersten 256 Aminosäuren von BRIP codierenden Sequenzen enthaltende Fragment wurde gereinigt. Die zwei Fragmente wurden anschließend zurück in pING3322 zusammengesetzt. um das Gen zu erzeugen, das für das Analogon BRIP₂₅₆, codiert. Das Plasmid wird bezeichnet als pING3801.

(3) Ein BRIP-Analogon mit einem Cystein in Position 270 wurde ebenfalls unter Anwendung der PCR erzeugt. Ein Teil des Expressionsplasmids pING3322 wurde amplifiziert mit den Primern BRIP-270 und dein HINDIII-2-Primer (SEQ ID NR: 50). Die Sequenz des Primers BRIP-270 ist unten gezeigt:

Der Primer BRIP-270 entspricht den Aminosäuren 268–276 von BRIP mit der Ausnahme des Restes 270. Das Codon des Primers, entsprechend der Position 270, spezifiziert ein Cystein anstelle des in der entsprechenden Position im nativen BRIP vorhandenen Alanins. Das PCR-Produkt wurde mit T4-Polymerase behandelt, mit XhoI geschnitten, und das 51 bp Fragment, das den carboxyterminalen Anteil des Analogons codiert, wurde auf einem 5%igen Acrylamidgel gereinigt. Das Fragment (entsprechend den Aminosäuren 268–276 von BRIP_C270) wurde in einer dreiteiligen Ligation zusammen mit dem internen 151 by BRIP Restriktionsfragment von SstII bis MscI (entsprechend den BRIP-Aminosäuren 217–267) aus Plasmid pING3322 und dein Restriktionsfragment von SstII bis ChoI aus pING3322. enthaltend den Rest des BRIP-Gens, kloniert. Das erzeugte Plasmid enthält das Gen, codierend das BRIP_C270-Analogon, und wird bezeichnet als pING3802.
Reinigung von rekombinantem BRIP und der BRIP-Analoga
Rekombinantes BRIP (rBRIP) und die BRIP-Analoga mit freien Cysteinresten wurden im Vesentlichen wie für das native BRIP beschrieben gereinigt, ausgenommen dass sie aus konzentrierten Fermentationsbrühen hergestellt wurden. Für rBRIP wurde konzentrierte Brühe aus einem 10 Liter-Fermentationsbatch ausgetauscht zu 10 mM Tris., 20 mM NaCl, pH 7,5, auf eine Sephacryl S-200-Säule geladen und mit 20 bis 500 mM NaCl als linearen Gradienten eluiert. Vereinigtes rBRIP wurde weiter auf einer Blue Toyopearl^®-Säule (Toso-Haas) gereinigt, aufgeladen in 20 mM NaCl und eluiert in einem 20 bis 500 mM NaCl-Gradienten in 10 mM Tris, pH 7,5. Für die BRIP-Analoga wurden konzentrierte Fermentationsbrühen auf eine CM52-Säule (Whatman) in einem 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,5, geladen und mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,3 M NaCl eluiert. Die weitere Reinigung war über Chromatographie auf einer Blu Toyopearl^®-Säule.
Retikulozyten-Lysat-Test (RLA)
Die Fähigkeit des rBRIP und der BRIP-Analoga, die Proteinsynthese in vitro zu inhibieren, wurde über den Retikulozyten-Lysat-Test wie in Beispiel 1 beschrieben getestet. Serielle logarithmische Verdünnungen von Standardtoxin (RTA 30), nativem BRIP, rBRIP und den BRIP-Analoga wurden über einen Bereich von 1 μg/ml bis 1 pg/ml getestet. Über den Vergleich mit einer nichtinhibierten Probe wurde die picomolare Konzentration an Toxin (pM) berechnet, die der 50%igen Inhibition der Proteinsynthese (IGn) entspricht. Die Ergebnisse der Tests sind unten in Tabelle 14 angegeben. Tabelle 14

Toxin IC₅₀

RTA 30 3,1

Natives BRIP 15

rBRIP 18

BRIP_C256 23

BRIP_C270 20

BRIP_C277 24
Die RLA-Ergebnisse zeigen an, dass die BRIP-Analoga eine Ribosomen inaktivierende Akti vität aufweisen, die vergleichbar derjenigen des rekombinanten und des nativen BRIP-Toxins ist. Alle Analoga behielten die natürliche Fähigkeit des nativen BRIPs bei, die Proteinsynthese zu inhibieren, was nahelegt, dass die Aminosäuresubstitution an diesen Positionen die Proteinfaltung und -aktivität nicht beeinträchtigt.
Konstruktion von BRIP-Immunkonjugaten
Immunkonjugate von nativem BRIP mit 4A2 (beschrieben in Morishima et al., J. Immunol., 129, 1091 (1982)) und H65-Antikörper (erhalten aus dem Hybridom ATCC HB9286), die die T-Zell-Determinanten CD7 bzw. CD5 erkennen, wurden konstruiert. Immunkonjugate von Ricin A-Ketten (RTAs) mit 4A2 und H65 als Antikörper wurden als Kontrollen konstruiert. Der H65 Antikörper und Ricin A-Ketten wie auch die RTA-Immunkonjugate wurden gemäß den Verfahren hergestellt und gereinigt, die in der US-Patentanmeldung der Serien-Nr. 07/306,433, supra, und in der Internationalen Veröffentlichung Nr. WO 89/06968 beschrieben sind.
Um Immunkonjugate des nativen BRIP herzustellen, wurden sowohl der Antikörper (4A2 oder H65) als auch das native BRIP chemisch mit dem sterisch gehinderten Linker 5-Methyl-2-iminothiolan (M2IT) an den Lysinresten modifiziert, um eine reaktive Sulfhydrylgruppe einzuführen, wie beschrieben in Goff et al., Bioconjugate Chem., 1, 381– 386 (1990). BRIP (3 mg/ml) wurde zunächst mit 0,5 mM M2IT und 1 mM DTNB in 25 mM Triethanolamin, 150 mM NaCl, pH 8,0, für 3 Stunden bei 25°C inkubiert. Das derivatisierte BRIP-(M2IT)-S-S-TNB wurde anschließend auf einer Sephadex GF-05LS-Säule entsalzt, und die Anzahl der eingeführten Thiolgruppen durch Zusatz von 0,1 mM DTT quantifiziert. Im Mittel enthielt jedes BRIP-Molekül 0,7 SH/mol.
4A2 oder H65 als Antikörper (4 mg/ml) in Triethanolaminpuffer wurden gleichermaßen mit M2IT (0,3 mM) und DTNB (1 mM) für 3 Stunden bei 25°C inkubiert. Das Antikörper(M2IT)-S-S-TNB wurde anschließend entsalzt, und das TNB:Antikörper-Verhältnis bestimmt. Um das Konjugat herzustellen, wurde das BRIP-(M2IT)-S-S-TNB zunächst zu BRIP-(M2IT)-SH durch Behandlung mit 0.5 mM DTT für 1 Stunde bei 25°C reduziert. mittels Gelfiltration auf Sephadex^® GF-05LS entsalzt, um das Reduktionsmittel zu entfer nen, und danach mit Antikörper-(M2IT)-S-S-TNB gemischt.
Nach 3 Stunden Inkubation bei 25°C und weiteren 18 Stunden bei 4°C wurde das Konjugat aufgereinigt durch sequentielle Chromatographie auf AcA44 (IBF) und Blu Toyopearl^® . Proben des fertigen Produkts ließ man auf einer 5%igen, nicht reduzierenden SDS-PAGE laufen. sie wurden Coomassie gefärbt und mit einem Shimadzu-Laser Densometer abgetastet. um die Anzahl an Toxinen pro Antikörper zu quantifizieren.
Die ein freies Cystein enthaltenden BRIP-Analoga wurden ebenfalls an 4A2 und H65 als Antikörper konjugiert. Die Analoga wurden mit 50 mM DTT entweder für 2 Stunden bei 25°C oder für 18 Stunden bei 4°C behandelt, um die reaktive Sulfhydrylgruppe des Cysteins zu exponieren, und entsalzt. Die Anwesenheit eines freien Sulfhydryls wurde durch Umsetzung mit DTNB verifiziert [Ellman et al., Arch. Biochem. Biophys., 82, 70– 77 (1959)]. Die wie oben beschrieben mit M2IT derivatisierten 4A2 oder H65-Antikörper wurden mit den reduzierten BRIP-Analoga in einem Verhältnis von 1 : 5 bei Raumtemperatur für 3 Stunden inkubiert und anschließend über Nacht bei 4°C. Immunkonjugate H65-BRIP_C256, 4A2-BRIP_C256, H65-BRIP_C277 wurden in 25 mM Triethanolamin, 150 mM NaCl, pH 8, hergestellt, während die Immunkonjugate H65-BRIP_C270, 4A2-BRIP_C270 und 4A2-BRIP_C277 in 0,1 M Natriumphosphat, 150mM NaCl, pH 7,5, hergestellt wurden. Nach der Konjugation setzte man 10 μM Mercaptoethylamin für 15 Minuten bei 25°C zu, um nichtumgesetzte m2IT-Linker auf dem Antikörper abzulöschen. Die abgelöschte Reaktionslösung wurde prompt auf eine Gelfiltrationssäule geladen (AcA44), um nichtkonjugiertes Ribosomen inaktivierendes Protein zu entfernen. Die Reinigung wurde unter Anwendung einer weichen Gelaffinitätschromatographie auf einem Blue Toyopearl^®-Harz unter Anwendung eines Verfahrens abgeschlossen, ähnlich dem von Knowles et al., Analyt. Biochem., 160, 440 (1987). Proben des Endproduktes ließ man auf einer 5%igen, nichtreduzierten SDS-PAGE laufen, sie wurden mit Coomassie gefärbt und mit einem Shimadzu-Laser-Densometer abgetastet, um die Anzahl an Toxinen pro Antikörper zu quantifizieren. Die Konjugationseffizienz war wesentlich größer für BRIP_C277 (78 %), als für eines der anderen Analoga BRIP_C270 und BRIP_C256 (jedes von diesen betrug etwa 10%). Zusätzlich handelte es sich bei dem BRIP_C277-Produkt um ein Polykonjugat, d.h. zahlreiche BRIP-Moleküle konjugierten mit einem einzelnen Antikörper. im Gegensatz zu den BRIP_C270- und BRIP_C256- Produkten, bei denen es sich um Monokonjugate handelte.
Gesamtzell-Abtötungs-Test
Immunkonjugate von nativen BRIP und der BRIP-Analoga wurden auf ihre Fähigkeit getestet, die Proteinsynthese in HSB2-Zellen zu inhibieren. und zwar über den in Beispiel 1 beschriebenen Gesamtzelt-Abtötungs-Test. Standard-Immunkonjugate H65-RTA (H65. derivatisiert mit SPDP, verbunden mit RTA) und 4MRTA (4A2-Antikörper, derivatisiert mit M2IT, verbunden mit RTA) wie auch BRIP-Immunkonjugat als Proben wurden mit RPMI ohne Leucin verdünnt in halblogarithmischen Konzentrationen im Bereich von 2000 bis 0,632 ng/ml. Alle Verdünnungen wurden dreifach zu Mikrotiterplatten zugefügt, enthaltend 1 × 105 HSB2-Zellen. Die HSB2-Platten wurden für 20 Stunden bei 37°C inkubiert und dann mit ³H-Leu für 4 Stunden gepulst vor der Ernte. Die Proben wurden auf dem Inotec Trace 96 Cascade-Ionisierungszählgerät gezählt. Durch Vergleich mit einer nicht behandelten Probe wurde die picomolare Toxinkonzentration (pM T) des Immunkonjugats berechnet, die zu einer 50%igen Inhibition der Proteinsynthese führte (IC₅₀). Die Testergebnisse sind in Tabelle 15 unten dargestellt. Tabelle 15

Konjugat IC₅₀(pM T)

4A2-BRIP 122,45

4A2-BRIP_C270 46, 3

4A2-BRIP_C277 57,5

4A2-BRIP_C256 1116

H65-BRIP > 5000

H65-BRIP_C277 1176
Die Konjugate der BRIP-Analoga waren weniger potent als das Ricin-Konjugat der Kontrolle (Daten nicht gezeigt). Die Immuntoxine, die den Antikörper 4A2 und entweder das BRIP_C270 oder das BRIP_C277, als Analogon enthielten, wiesen vergleichbare bis erhöhte spezifische Cytotoxizität gegenüber Zielzellen auf, verglichen mit dem das native BRIP enthaltende Immuntoxin. Wdährend 4A2- BRIP_C256 weniger aktiv als 4A2-BRIP ist, sind die 4A2- BRIP_C270 und 4A2- BRIP_C277 um zwischen dem Drei- und Vierfachen aktiver. Gleichermaßen zeigt das Immunkonjugat von H65 an BRIP_C277 größere Toxizität gegenüber Zellen. als die Immunkonjugate von H65 an natives BRIP. Somit führt die Bindung von Antikörper an BRIP-Derivate, die einen verfügbaren Cysteinrest in einer geeigneten Anordnung aufweisen zu Immuntoxinen mit erhöhter spezifischer Toxizität gegenüber Zielzellen im Vergleich zu Konjugaten mit nativem BRIP.
Stabilitätstest der Disulfidbindung
Mit nativen BRIP und den BRIP-Analoga hergestellte Immunkonjugate wurden über den in Beispiel 1 beschriebenen Stabilitätstest für Disulfidbindungen untersucht. Kurz gesagt, wurden Konjugate mit steigenden Konzentrationen an Glutathion für 1 Stunde bei 37°C inkubiert und, nach Beenden der Reaktion mit Iodacetamid, wurde die Menge an freigesetztem RIP durch Größenausschluss-HPLC auf einer TosoHaas TSK-G2000SW-Säule quantifiziert.
Über Vergleiche mit der Menge an RIP, freigesetzt durch hohe Konzentrationen an 2-Mercaptoethanol (um 100% Freisetzung zu bestimmen), wurde die Konzentration an Glutathion berechnet, die zur Freisetzung von 50% des RIP erforderlich war (die RC₅₀). Wie in Tabelle 16 unten gezeigt, waren die mit BRIP_C270 oder BRIP_C277 hergestellten Konjugate signifikant stabiler als sowohl die RTA-Konjugate oder diejenigen, die mit nativem BRIP hergestellt wurden. Tabelle 16

Konjugat RC₅₀ (mM)

H65-RTA 7,0

H65-BRIP 2,8

H65-BRIP_C277 196,0

4A2-RTA 4,4

4A2-BRIP 3,3

4A2-BRIP_C277 53,0

4A2-BRIP_C277 187,0
Diese unerwarteten Ergebnisse legen nahe, dass mit Typ-I-RIP-Analoga hergestellte Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung eine höhere Stabilität und Wirksamkeit in vivo aufweisen könnten.
BEISPIEL 14
Pflanzen der Genus Momordica erzeugen eine Anzahl verwandter Proteine, die als Momordine oder Momorcharine bekannt sind und bei denen es sich um Typ-I-RIPs handelt. Das Momordin II codierende Gen wurde aus Samen von Momordica balsamina kloniert.
Herstellung von M. balsamina RNS
Gesamt-RNS wurde aus 4 g Samen von M. balsamina wie im Ausubel et al., supra, beschrieben hergestellt. PolyA enthaltende RNS wurde aus 1 mg Gesamt-RNS mittels Chromatogräphie auf Oligo-(dT)-Cellulose hergestellt. 40 mg Oligo-(dT)-Cellulose vom Typ 7 (Pharmacia) wurde zu 0,1 N NaOH zugesetzt und in eine Wegwerfsäule (Biorad) gegossen. Die Säule wurde mit Wasser, bis das Eluat den pH-Wert von 5,5 aufwies, und anschließend mit 1X Beladungspuffer (50 mM NaCltrat, 0,5 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS, pH 7,0) gewaschen, bis das Eluat einen pH-Wert 7,0 aufwies. Ein mg Gesamt-RNS wurde in 300 μl Wasser suspendiert, für 5 Minuten auf 65°C erwärmt, und 300 μl 2X Beladungspuffer zugesetzt (100 mM NaCltrat, 1 M NaCl, 2 mM EDTA und 0,2% SDS). Die RNS wurde auf die Säule geladen und der Durchfluss auf 65°C erwärmt, auf Raumtemperatur abgekühlt und wieder auf die Säule geladen. Säulengebundene mRNS wurde 5 mal mit 0,5 ml 1X Beladungspuffer und zweimal mit 0,5 ml 0,05 M NaCltrat, 0,1 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS gewaschen. PolyA-enthaltende RNS wurde zweimal aus der Säule mit 0.5 ml an 25 nM NaCltrat, 1 mM EDTA und 0,05% SDS eluiert.
Library-Herstellung
Eine cDNS-Library aus der PolyA-enthaltenden RNS von M. balsamina wurde in einem bakteriellen Expressionsplasmid mit dem Superscript Plasmid System (BRL, Gaithersburg. Maryland) hergestellt. Die cDNS wurde aus 2 μg PolyA-enthaltende RNS synthetisiert, grö ßenfraltioniert, mit NotI angedaut und in den Expressionsvektor pSPORT legiert. wie vom Hersteller des Vektors. BRL, empfohlen.
Klonierung des Momordin II-Gens
Ein DNS-Fragment, codierend die ersten 27 Aminosäuren von Momordin II. wurde aus der M. balsamina-cDNS mittels PCR amplifiziert. cDNS des ersten Stranges wurde aus 100 ng PolyA-enthaltende RNS mit einem RNS-PCR-Kit (Perkin Elmer Cetus) hergestellt. Zwei partiell degenerierte Primer wurden auf Basis der Aminosäuresequenz der ersten 27 Aminosäuren des Momordins II, beschrieben in Li et al., Experientia, 36, 524–527 (1980), synthetosiert. Da die Aminosäuresequenz der Aminosäuren 1 – 27 von Momordin II zu 52% homolog den Aminosäuren 1–17 des Momordins I ist [Ho et al., BBA, 1088, 311–314 (1991)], basierten einige der Codonzuordnungen in den degenerierten Primern auf der Homologie zu der entsprechenden Aminosäure wie auch der Codonpräferenz im Momordin I-Gen. Die Sequenzen der Primer Momo-3 und Momo-4 sind unten unter Anwendung der IUPAC-Nucleotidsymbole dargestellt.
Das resultierende 81 bp PCR-Produkt wurde auf einem 5%igen Acrylamidgel gereinigt und in die Sma1-Stelle aus pUC18 Moniert. Drei mögliche Klone wurden sequenziert und ein Klon, pMO110, als einer identifiziert, der die N-terminalen 27 Aminosäuren von Momordin II codiert.
Eine Hybridisierungssonde wurde zum Screenen der Momordin II-cDNS-Library auf Basis der Sequenz des pMO110-Momordin II-DNS-Fragments designed. Die Sequenz des Primers Momo-5 ist unten gezeigt:
Der Primer Momo-5 entspricht den Aminosäuren 9–18 des reifen Momordins II. Von den unterstrichenen Nucleotiden des Primers wurde angenommen, dass sie mit der DNS- Sequenz des Momordin II-Gens exakt übereinstimmen. Da diese Sequenz hoch A/T-reich ist, kann sie schwach mit dem Momordin II-Gen hybridisieren, so dass die zusätzlichen benachbarten Nucleotide in den Primer eingeschlossen wurden. Die Basen 3 und 30 (überstrichen) befanden sich in der "Wobble"-Position (d.h. das dritte Nucleotid in einem Codon) der Aminosäuren 9 (Alanin) bzw. 18 (Isoleucin) des Momordins II und brauchen der Nucleotidbase im nativen Gen nicht identisch sein.
Eine cDNS-Library in pSPORT mit 90.000 Elementen wurde mittels Phosphorkinase-markiertem ³²P-Momo-5 gesichtet, und acht mögliche Kandidatenklone wurden identifiziert. Ein Klon, pING3619, wurde sequenziert und enthält einen offenen Leserahmen, entsprechend teilweise den erwarteten 27 N-terminalen Resten von Momordin II. Das vollständige Momordingen enthält 286 Aminosäuren, von denen die ersten 23 vermutlich ein Leader-Signal darstellen (das reife Momordin II hat 263 Reste). Die DNS-Sequenz des Momordin II-Gens ist in SEQ ID NR: 13 dargestellt.
Konstruktion eines Expressionsvektors enthaltend das Momordin II-Gen
Ein bakterieller Expressionsvektor für das Momordin II-Gen wurde konstruiert. Zwei PCR-Primer wurden synthetisiert, von denen einer (Momo-9) vom + 1-Rest der Aminosäuresequenz des reifen Momordins II primed und der andere am C-Terminus (Momo-10) des Momordins II, wobei dieser eine XhoI-Restriktionsstelle einführt:

pING3619 wurde mit Momo-9 und Momo-10 amplifiziert, und das Produkt wurde mit T4-Polymerase behandelt, mit XhoI geschnitten und auf einem Agarosegel gereinigt. Dieses Genfragment wurde zusammen mit dem 131 by pe1B-Leaderfragment aus pIC100; das mittels SstI-Andauen, T4-Polymerase-Behandlung und EcoRI-Andauen erzeugt worden war. in einen mit EcoRI und XhoI gespaltenen araB-Expressionsvektor ligiert. Das Produkt dieser Dreierliation wurde sequenziert, um zu verifizieren, dass die pelB-Verbindung und die Momordin II-codierende Sequenz richtig waren. Die Arabinoseinduktion der Zellen. ent haltend das Momordin II-Expressionsplasmid pING3621, führt zur Produktion von Momordin II in E. coli.
Analoga des Momordins II
Momordin II weist keine natürlichen Cysteine auf, die für die Konjugation an Antikörper verfügbar wären. Analoga des Momordins, die ein freies Cystein für die Konjugation an Antikörper aufweisen, können konstruiert werden. Positionen, die wahrscheinlich für die Substitution eines Cysteinrestes geeignet sind, können aus 3 als Positionen in der Nähe des Cysteins₂₅₆ aus der Ricin A-Kette und als Positionen, die die letzten 26 Aminosäuren des Momordins II einschließen, die für Lösungsmittel zugänglich sind, identifiziert werden. Beispielsweise ordnet sich das Arginin in Position 242 von Momordin II mit dem Cystein in Position 259 der Ricin A-Kette an und stellt ein bevorzugtes Ziel für die Substitution dar. Zusätzliche bevorzugte Substitutionspositionen für Momordin II schließen das Serin in Position 241 und das Alanin in Position 243 ein.
Während die vorliegende Erfindung hinsichtlich bevorzugter Ausführungsformen beschrieben worden ist, ist zu verstehen, dass Variationen und Verbesserungen dem Fachmann ersichtlich sein werden. Daher sollen die angefügten Ansprüche alle solchen äquivalenten Variationen abdecken, die in den Bereich der Erfindung, wie beansprucht, fallen.
SEQUENZ-PROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER: Bernhard, Susan L. Better. Marc D. Carroll Stephan F. Lane. Julie A. Lei, Shau-Ping
(ii) BEZEICHNUNG DER ERFINDUNG: Materialien. umfassend RIPs, und Verfahren zur Herstellung derselben, wie auch Verwendung derselben
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 101
(iv) FORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADDRESSAT: Marshall, O'Toole, Gerstein, Murray & Brown
(B) STRASSE: Two First National, Plaza, 20 South Clark
(C) STADT: Chicago
(D) STAAT: Illionois
(E) LAND: USA
(F) PLZ: 60603
(v) MASCHINENLESBARE FORM:
(A) DATENTRÄGER: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC Compatible
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Ausgabe #1.0, Version #1.25
(vi) DATEN DER VORLIGENDEN PATENTANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER:
(B) ANMELDETAG:
(vii) DATEN DER FRÜHEREN PATENTANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: US 07/901,707
(B) ANMELDETAG: 19. Juni 1992
(viii) DATEN DER FRÜHEREN PATENTANMELDUNG:
(A) ANMELDENUMMER: US 07/767,567
(B) ANMELDETAG: 4. November 1991
(ix) ANWALT/VERTRETER-INFOPMATION:
(A) NAME: Noland, Greta E.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 35.302
(C) REFERENZ/AKTENNUMMER: 31133
(x) TELKOMMUNIKATIONSINFORMATIONEN:
(A) TELEFON: 312/346-760
(B) TELEFAX: 312/346-9740
(C) TELEX: 25-3656
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 1:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 267 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Protein
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(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
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(ii) MOLEKÜLART: Protein
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(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
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(B) ART: Aminosäure
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(ii) MOLEKÜLART: Protein
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 3:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 4:
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(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
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(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
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(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 7:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 263 Aminosäuren
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(D) TOPOLOGIE: linear
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(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 8:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
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(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
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(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
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(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
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(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
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(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
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(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 15:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 32 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: Protein
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(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 32 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
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(D) TOPOLOGIE: linear
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(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
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(B) ART: Aminosäure
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(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 17:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 18:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 23 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
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(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 23 Aminosäuren
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(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 24:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 35 Aminosäuren
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(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 22 Aminosäuren
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(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 26:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
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(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 28:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 29:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 28 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 29:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 30:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 32 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 30:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 31:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 27 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
s(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 31:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 32:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 25 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 32:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 33:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 27 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 33:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 34:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 32 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 34:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 35:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 32 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 35:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 36:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 29 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 36:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 37:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 23 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 37:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 38:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 25 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 38:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 39:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 32 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 39:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 40:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 36 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 40:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 41:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 41 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 41:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 42:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 23 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 42:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 43:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 18 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 43:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 44:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 21 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 44:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 45:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 29 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 45:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 46:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 29 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 43:) 46:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 47:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 39 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 47:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 48:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 64 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 48:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 49:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 21 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 49:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 50:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 21 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 50:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 51:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 21 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 51:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 52:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 29 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 52:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 53:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 29 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 53:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 54:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 32 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 54:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 55:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 22 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 55:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 56:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 33 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 56:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 57:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 83 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 57:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 58:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 58:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 59:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 59:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 60:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 22 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 60:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 61:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 28 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 61:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 62:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 36 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 62:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 63:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 30 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 63:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 64:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 33 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 64:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 65:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 33 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 65:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 66:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 33 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 66:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 67:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 26 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 67:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 68:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 34 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 68:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 69:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 69:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 70:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 35 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 70:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 71:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 321 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 71:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 72:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 354 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 72:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 73:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 354 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 73:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 74:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 321 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 74:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 75:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 70 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 75:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 76:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 78 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 76:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 77:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 30 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 77:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 78:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 15 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 78:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 79:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 38 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 79:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 80:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 37 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 80:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 81:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 76 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 81:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 82:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 82:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 83:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 36 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 83:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 84:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 18 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 84:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 85:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 32 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 85:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 86:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 22 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 86:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 87:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 20 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 87:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 88:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 19 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 88:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 89:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 23 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 89:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 90:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 31 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 90:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 91:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 21 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 91:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 92:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 723 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 92:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 93:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 723 Aminosäuren
(B)ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 93:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 94:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 52 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 94:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 95:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 19 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 95:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 96:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 49Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 96:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 97:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 35 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 97:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 98:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 30 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 98:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 99:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 37 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 99:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 100:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 22 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 100:
(2) ANGABEN ZU SEQ ID NO 101:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGA: 49 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRÄNGINGKEIT: einzel
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLART: DNS
(xi) BESCHREIBUNG DRR SEQUENZ: SEQ ID NO 101:

Fortsetzung zu Punkt C. durch Herausgabe einer solchen Probe an einen vom Antragstellar bekannten Sacherständiger zugänglich gemacht werden (Regel 23(4) EPÜ)."

ATCC Zugangsnummer	Hinrerlegungsdatum
68721	2. Oktober 1991
68722	2. Oktober 1991
69008	9. Juni 1992
69009	9. Juni 1992
69101	27. Oktober 1992
6910?	27. Oktober 1992
6910	27. Oktober 1992
69104	27. Oktober 1992

Claims

Ein Analogon eines Ribosomen inaktivierenden Proteins vom Typ I, ausgewählt aus Gelonin, Momordin-II und BRIP, wobei das Analogon ein Cystein aufweist, verfügbar für intermolekulare Disulfidbindung an einer Aminosäureposition, die einer Position entspricht, die für die intermolekulare Disulfidbindung in dem Ribosomen inaktivierenden Protein vom Typ I nicht natürlich verfügbar ist, und wobei das Cystein in der Aminosäuresequenz des Analogons an einer Position von der Position die der Position 251 in SEQ ID Nr: 1 entspricht, bis zu der Carboxylendposition des Analogons vorliegt.
Analogon gemäß Anspruch 1, wobei das Ribosomen inaktivierende Protein vom Typ I Gelonin ist.
Analogon gemäß Anspruch 2, wobei das Cystein an einer Position in dem Analogon von Position 244 bis zu der Carboxylendposition des Analogons vorliegt.
Analogon gemäß Anspruch 3, wobei das Cystein an einer Position in dem Analogon von Position 247 bis zu der Carboxylendposition des Analogons vorliegt.
Analogon gemäß Anspruch 3, wobei das Cystein an Position 244 der Aminosäuresequenz des Analogons vorliegt.
Analogon gemäß Anspruch 4, wobei das Cystein an Position 247 der Aminosäuresequenz des Analogons vorliegt.
Analogon gemäß Anspruch 2, wobei die nativen Gelonincysteinreste an den Positionen 44 und 50 durch Alaninreste ersetzt sind.
Analogon gemäß Anspruch 4, wobei das Cystein an der Position 248 der Aminosäuresequenz des Analogons vorliegt.
Analogon gemäß Anspruch 1, wobei das Ribosomen inaktivierende Protein vom Typ I ein Ribosomen inaktivierendes Protein aus Gerste ist.
Analogon gemäß Anspruch 9, wobei das Cystein in dem Analogon an einer Position von Position 256 bis zu der Carboxylendposition des Analogons vorliegt.
Analogon gemäß Anspruch 10, wobei das Cystein in dem Analogon an einer Position von Position 260 bis zu der Carboxylendposition des Analogons vorliegt.
Analogon gemäß Anspruch 10, wobei das Cystein an einer Position 256 der Aminosäuresequenz des Analogons vorliegt.
Analogon gemäß Anspruch 11, wobei das Cystein an Position 270 der Aminosäuresequenz des Analogons vorliegt.
Analogon gemäß Anspruch 11, wobei das Cystein an Position 277 der Aminosäuresequenz des Analogons vorliegt.
Analogon gemäß Anspruch 1, wobei das Ribosomen inaktivierende Protein vom Typ I Momordin-II ist.
Analogon gemäß Anspruch 1, wobei die Position des Cysteins in der Aminosäuresequenz des Analogons einer Position innerhalb einer Aminosäure der Position 259 von SEQ ID Nr: 1 entspricht.
Analogon gemäß Anspruch 16, wobei das Ribosomen inaktivierende Protein vom Typ I Gelonin ist.
Analogon gemäß Anspruch 16, wobei das Ribosomen inaktivierende Protein vom Typ I Ribosomen inaktivierendes Protein aus Gerste ist.
Analogon gemäß Anspruch 16, wobei das Ribosomen inaktivierende Protein vom Typ I Momordin-II ist.
Analogon gemäß Anspruch 1, wobei die Position des Cysteins in der Aminosäuresequenz des Analogons Position 259 von SEQ ID Nr: 1 entspricht.
Analogon gemäß Anspruch 20, wobei das Ribosomen inaktivierende Protein vom Typ I Ribosomen inaktivierendes Protein aus Gerste ist.
Analogon gemäß Anspruch 20, wobei das Ribosomen inaktivierende Protein vom Typ I Momordin-II ist.
Ein Polynukleotid, codierend ein Analogon eines Ribosomen inaktivierenden Proteins vom Typ I, ausgewählt aus Gelonin, Momordin-II und BRIP, wobei das Analogon ein Cystein aufweist, das für die intermolekulare Disulfidbindung an einer Aminosäureposition verfügbar ist, die einer Position entspricht, die für die intermolekulare Disulfidbindung in dem Ribosomen inaktivierenden Protein von Typ I nicht natürlich verfügbar ist, und wobei das Cystein in der Aminosäuresequenz des Analogons an einer Position von der Position, die der Position 251 in SEQ ID Nr: 1 entspricht, bis zu der Carboxylendposition des Analogons vorliegt.
Produkt eines Verfahrens zur Herstellung eines Analogons eines Ribosomen inaktivierenden Proteins vom Typ I, ausgewählt aus Gelonin, Momordin-II und BRIP, umfassend den Schritt der Expression eines Polynukleotids in einer geeigneten Wirtzelle das Polynukleotid codierend ein Ribosomen inaktivierendes Protein vom Typ I mit einem Cystein das verfügbar ist für die intermolekulare Disulfidbindung substituiert an einer Aminosäureposition die einer Position entspricht die für die intermolekulare Disulfidbindung in dem Ribosomen inaktivierenden Typ-I-Protein nicht natürlich verfügbar ist, wobei das Cystein in der Aminosäuresequenz des Analogons an einer Position von der Position, die Position 251 in SEQ ID Nr: 1 entspricht, bis zur der Carboxylendposition des Analogons vorliegt.