DE69233497T2 - Verfahren zum transfer von nukleinsäuren in zellen - Google Patents

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Description

  • Verfahren zum Transfer von Nukleinsäuren in Zellen
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Methoden zum Erleichtern des Transfers von Nukleinsäuren in Zellen und einen neuen für diesen Zweck nützlichen kationischen Amphiphil.
  • Manche, aber nicht alle kationischen Amphiphile sind bekannt dafür, den Transfer von DNA in Zellen d.h. Transfektion zu erleichtern. Obwohl der Mechanismus dieser Aktivität noch nicht klar ist, betrifft er wahrscheinlich die Bindung des DNA/Lipid-Komplexes mit der Zellenoberfläche durch die überzähligen positiven Ladungen auf dem Komplex. Der Zellenoberflächen-Bindungskomplex wird wahrscheinlich internalisiert und die DNA wird aus einem endozytischen Fach in das Zytoplasma der Zelle freigesetzt. Wie die freigesetzte DNA in den Kern wandert ist nicht bekannt.
  • Ein kationischer Amphiphil beinhaltet die folgenden vier wichtigen strukturellen Elemente:
  • lipophile Gruppe-Linkerbindung-Spacerarm-Aminogruppe
  • Die Aminogruppe ist positiv geladen bei neutralem pH. Es kann eine primäre, sekundäre, tertiäre Amino- oder quaternäre Ammoniumgruppe sein. Der Spacerarm ist gewöhnlich eine hydrophile, 2 bis 15 Atom Einheit, welche die Aminogruppe mit der lipophilen Gruppe über die Linkerbindung verbindet. Die Linkerbindung ist entweder eine Ether-, Ester-, Amid- oder andere hydrolysierbare Bindung.
  • Die lyophile Gruppe ist eine hydrophobe Einheit welche das Einfügen des kationischen Amphiphiles in die Membranen der Zelle oder des Liposoms erlaubt.
  • Biochem.Biophys.Acta. 1982, vol 684; N°1, pp 12–20 betrifft Cholesterin-Analoge zum Einbau in Bläschen. Diese Analogen sind primäre Amine welche, einen -NH-C(=O)-* Linker und einen Ethoxyethan-Spacer haben, und sind nicht unter den Verbindungen von Interesse für die vorliegende Erfindung. US-A-4,544,545 beschreibt Liposome gebildet mit chemisch modifiziertem Cholesterin, welche so mehr spezifisch gemacht sind für schnelle und bevorzugte Ansammelung in vivo in einem spezifischen erwünschten Organ. Beschriebene Cholesterinderivate weisen auf ein primäres Amin mit einem -NH-C(=O)-O-* Linker und einem (CH2)5 Spacer; diese Derivate sind nicht Teil der vorliegenden Erfindung. Obschon US-A-4,544,545 in Sp. 3, Zeilen 47–51, den Einbau von genetischem Material in Liposome erwähnt, führt das nicht offensichtlich den Fachmann zum Gebrauch besagter Liposome in einer Methode zum Erleichtern des Transfers von Nukleinsäure in Säugetierzellen weil US-A-4,544,545 sich bezieht auf Liposome, die für spezifisches Organ-Ziele angepaßt sind. Transfektion wird in US-A-4,544,545 nicht offenbart.
  • WO-A-8800824 betrifft Liposome welche positiv geladene für ophtalmologischen Gebrauch angepasste Lipidbauteile enthalten, wobei die Liposome geliefert werden als Tropfen für die Augen des Patienten. Die Lipidderivate sind mit dem Cholesterin durch ein Sauerstoff- oder Stickstoffatom verbunden. WO-A-8800824 offenbart weder die Linker des -NH-C(=O)-* oder -N-C(=)-* Typs noch wo das Kohlenstoffatom das verbindende Atom ist, wie in -O-(O=)C-. J.Biol.Chem., Vol. 265, N°21, 1990, pp. 12404–12409 untersucht den Effekt von Cholesterinsulfat und damit verwandten Verbindungen auf die Fusion von Sendai Virus zu biologischen und Modellneutronen. Das beschriebene Cholesterinderivat ist ein quaternäres Amin mit einem -NH-C(=O)-*-Linker und einem (CH2)2-Spacer, welches nicht Teil der vorliegenden Erfindung ist. Polym. Commun., 1987, vol.28, N°1, Seiten 16–19 offenbart lipidträger-bildende quaternäre Ammonium-Derivate von Cholesterin. Diese quaternären Amino-Verbindungen haben -(C=O)-O* und einen (CH2)10-Spacer und sind nicht Teil der beanspruchten Verbindungen. J.Chem.Soc., Chem.Commun.,1988, N°15,pp.1037-1038 berichtet von einer piezoelektrischen Studie des Molekularadsorptions-Verhaltens von einfachen hydrophoben Modell-Alkoholen einschließlich Cholesterin oder synthetischen Lipid-Mehrschichtfilmen. J.Med.Chem., 1984, Vol.27, N°5, pp.659–664 berichtet von der Synthese von Estern von (Aminobotyrisäure (GABA)), einschließlich dem Cholesteryl-Ester von GABA. Der Ester, wird berichtet, sei aktiv im Ändern der motorischen Aktivität von Ratten.
  • US Patent 4,958,013 zeigt verschiedene Formeln von cholesterinmodifizierten Oligonukleotiden, welche chemische Zwischenprodukte sind für modifizierte Oligonukleotide, welche an Membranen ankern. Die Verbindungen sind cholesteryl-modifizierte Oligonukleotide welche sekundäre Amine sind mit -NH-C(=O)-O-* Linkern und einem (CH2)n Spacer, wobei n gleich 2 oder 6 ist, welche nicht enthalten sind in der vorliegenden Erfindung.
  • Keine dieser Referenzen lehrt Cholesterinderivate welche im wesentlichen ungiftig und biologisch abbaubar sind, mit einem neutralen Lipid eine stabile wässerige Dispersion bilden und eine Transfektion von Nukleinsäure erleichtern.
  • N-[1-(2,3-Dioleoxyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid (DOTMA) ist der erste kationische Amphiphile, der die Aktivität der Transfektion aufweist. Seine lipophile Gruppe ist eine doppelkettige, C18:1 aliphatische Gruppe. Er enthält eine quaternäre Ammoniumgruppe, die mit der lipophilen Gruppe über einen 3-Kohlenstoff-Spacerarm mit zwei Ether-Linkerbindungen verbunden ist. Obschon dieses Molekül wirksam ist in der Transfektion, ist es nicht biologisch abbaubar und ziemlich giftig für Zellen.
  • Eine andere Reihe von kationischen Amphiphilen, die in der Transfektion gebraucht werden, sind die quaternären Ammonium-Detergentien. Entweder einfache Ketten (wie Cetyltrimethylammoniumbromid) oder doppelte Ketten (wie Dimethyldioktadecylammoniumbromid) Detergentien zeigen die Aktivität, Tierzellen zu transfektieren. Die Aminogruppe in diesen Amphophilen ist quaternär und ist mit der lipophilen Gruppe ohne den Spacerarm oder Linkerbindungen verbunden. Ein anderes einkettiges Detergens, Stearylamin, enthält eine primäre Aminogruppe verbunden mit einer einfachen C18:0 Kette ohne Spacerarm oder Linkerbindung. Diese Gruppe von Amphiphilen ist auch giftig für Zellen.
  • Zwei andere Gruppen von kationischen Amphiphilen für die Transfektion sind beschrieben worden. Die erste Gruppe enthält zwei C18:1 Ketten als die lipophile Gruppe. Beide Gruppen enthalten eine quaternäre Ammoniumgruppe, aber die Spacerarmstruktur ist anders. In einem Fall, ist die Trimethylammoniumgruppe mit den zwei C18:1 Ketten über einen 3-Kohlenstoffspacerarm und Esterbindung direkt verbunden. Der Amphiphile, 1,2-Dioleoxy-3-(trimethylammonio)propan, (DOTAP) ist ein nahes Analogon von DOTMA. In anderen Fällen, so wie 1,2-Dioleoyl-3-(4'-trimethylammonio)butanoyl-sn-glycerin, DOBT, oder Cholesteryl(4'-trimethylammonio)butanoat, ChOTB, ist die Trimethylammonium-Gruppe über einen Butanoylspacerarm entweder an die doppelte Kette (für DOTB) oder Cholesteryl Gruppe (für ChOTB) gebunden. Andere Amphiphile, i.e., 1,2-Dioleoyl-3-succinyl-sn-glycerin-Cholinester (DOSC) und Cholesteryl-hemisuccinat-cholinester, ChOSC, enthalten eine Cholin-Einheit wie die quaternäre Ammoniumgruppe welche mit der doppelten Kette (für DOSC) oder Cholesteryl Gruppe (für ChOSC) über einen Succinyl- Spacerarm verbunden ist. Die Transfektionsaktivität dieses Amphiphils ist im Allgemeinen schwach.
  • Noch eine andere Klasse von Amphiphilen, genannt „Lipopolyamine" wurde beschrieben. Die Ammonium-gruppe ist L-5-Carboxyspermin, welches 2 primäre und 2 sekundäre Ammonium-Gruppen enthält. Zwei Beispiele dieser Lipopolyamine sind Dioktadecylamidologlycylspermin, DOGS, und Dipalmitoylphosphatidylethanolamidospermin, DPPES. Die kationische Gruppe ist verbunden mit zwei verschiedenen doppelkettigen, C16:0 lipophilen Gruppen über einen Amidoglycyl-(für DOGS) oder Phosphorylethanolamin-(für DPPES) Spacerarm. Diese Verbindungen sind speziell wirksam im Transfektieren der primären endokrinen Zellen ohne zellularer Giftigkeit.
  • Auch ein Lipolysin-Reagens für Transfektion ist beschrieben worden. Dieses Reagens enthält eine Polylysin-Einheit als die Ammoniumgruppe welche verbunden ist mit einem Phospholipid(N-glutarylphosphatidylethanolamin). Deshalb ist der Spacerarm die Seitenkette von Lysin und die Kopfgruppe des Phospholipids. Die lipophile Gruppe ist eine doppelkette, C18:1 Gruppe, die mit dem Spacerarm durch zwei Esterbindungen verbunden ist. Obschon die Reagenzien wirksam sind zur Transfektion und nicht giftig für Zellen, erfordert diese Aktivität das Kratzen der behandelten Zellen. Dies ist natürlich kein günstiger Schritt und kann nicht ausgeführt werden bei In Vivo Experimenten.
  • Ein ideales Transfektionsreagens sollte ein hohes Niveau von Transfektionsaktivität ohne Kratzen oder gleich welchen anderen mechanischen oder physischen Manipulationen der Zellen oder der Gewebe aufweisen. Das Reagenz sollte nicht giftig oder minimal giftig sein bei den effektiven Dosen. Es sollte auch biologisch abbaubar sein, um nachteilige Langzeit-Nebeneffekte in den behandelten Zellen zu vermeiden.
  • Viele Reagenzien welche diese Kriterien erfüllen, enthalten eine Linkerbindung, die in der Zelle hydrolysierbar ist. Zum Beispiel, DOBT und DOSC: beide enthalten Ester-Linkerbindungen und können in den behandelten Zellen in andere Lipidarten metabolisiert und katabolisiert werden. Jedoch sind kationische Amphiphile mit Ester- Linkerbindungen nicht stabil, wenn sie in wässriger Lösung aufbewahrt werden. Dies ist wahrscheinlich der Fall wegen einer basen-katalysierten Hydrolysereaktion vermittelt durch die Aminogruppe des Amphiphils.
  • Ein anderer Schlüsselfaktor der zellulären Giftigkeit der kationischen Amphiphile ist deren hemmender Effekt auf die Aktivität von Proteinkinase C (PKC). PKC ist ein Schlüsselenzym, welches eine entscheidende Rolle spielt in der zellulären Signaltransduktion. Kationische Amphiphile hemmen die PKC-Aktivität durch Nachahmen des endogenen Inhibitors, Sphingosin. PKC-Aktivität ist auch wichtig für den zellulären Endocytoseweg, welcher wahrscheinlich verwickelt ist in der Aktion der kationischen Amphiphile, um den Eintritt von DNA in Zellen zu erleichtern. Vor kurzem wurde berichtet, daß ein PKC-Aktivator, Phorbolmyristatacetat, die Transfektionswirksamkeit von DNA stimulieren kann vermittelt durch die Kalzium-Phosphat-Niederschläge.
  • Die gegenwärtigen Erfinder haben daher eine Serie von neuen kationischen Amphiphilen synthetisiert und deren Aktivitäten der PKC-Hemmung überprüft. Verschiedene Amphiphile, welche schwache Hemmungsaktivitäten gegenüber PKC zeigen, sind besonders geeignet für Transfektionen. Zusätzlich sind kationische Reagenzien geschaffen worden mit einer Carbamoyl-Linkerbindung, um das Problem der Instabilität in Lösung zu überwinden. Die Stabilität der Bindung in wässeriger Lösung ist viel größer als jene der Esterbindung, sie ist jedoch in der Zelle hydrolysierbar.
  • Kurz gesagt, die vorliegende Erfindung liefert eine Methode zum Erleichtern des Transfers von Nukleinsäuren in Zellen. Die Methode beinhaltet das Vorbereiten einer gemischten Lipiddispersion eines kationischen Lipids mit einem Co-Lipid in einem passenden Trägerlösungsmittel, wie zum Beispiel destilliertes Wasser oder normale Kochsalzlösung. Das kationische Lipid hat eine Struktur welche beinhaltet eine lipophile Gruppe abgeleitet von Cholesterin, eine Linkerbindung, einen Spacerarm mit ungefähr 1 bis ungefähr 20 Kohlenstoffatomen in einer verzweigten oder unverzweigten linearen Alkylkette, und eine kationische Aminogruppe. Die Aminogruppe ist ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus primären, sekundären, tertiären und quaternären Aminogruppen. Die Methode beinhaltet weiterhin das Hinzufügen der Nukleinsäuren zu der Dispersion um einen Komplex zu bilden. Die Zellen werden dann mit dem Komplex behandelt.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, hat die Dispersion Partikel mit einem durchschnittlichen Durchmesser von ungefähr 150nm. Das kationische Lipid ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cholesteryl-3β-carboxylamidoethylentrimethylammonium-Jodid, 1-Dimethylamino-3-trimethylamino-DL-2-propyl-cholesterylcarboxylat-Jodid, Cholesteryl-3β-carboxyamidoethylenamin, Cholesteryl-3β-oxysuccinamidoethylentrimethylammonium-Jodid, 1-Dimethylamino-3-trimethylamino-DL-2-propylcholesteryl-3β-oxysuccinat-Jodid, 2-[(2-Trimethylammonio)-ethylmethylamino]ethyl-cholesteryl-3β-Oxysuccinat-Jodid, 3β[N-(N', N'-dimethylaminoethan)-carbamoyl]cholesterin, und 3β-[N-(polyethylenimin)-carbamoyl]cholesterin. In einer bevorzugten Ausführungsform, ist das Co-Lipid ein neutrales oder saures Phospholipid welches vorzugsweise ausgewählt sein kann aus der Gruppe bestehend aus Phosphatidyl-Cholin und Phosphatidyl-Ethanolamin.
  • Zusätzlich liefert die vorliegende Erfindung auch ein im wesentlichen nicht-hydrolysierbares kationisches Lipid, um den Transfer von Nukleinsäuren in Zellen zu erleichtern. Das Lipid beinhaltet eine lipophile Gruppe abgeleitet von Cholesterin, eine Linkerbindung, einen Spacerarm mit ungefähr 1 bis ungefähr 20 Kohlenstoffatomen in einer verzweigten oder nicht verzweigten linearen Alkylkette, und eine kationische Aminogruppe. Die Aminogruppe ist ausgewählt aus der Gruppe primäre, sekundäre, tertiäre oder quaternäre Aminogruppen.
  • Das kationische Lipid ist vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Cholesteryl-3β-carboxylamidoethylentrimethylammonium-Jodid, 1-Dimethylamino-3-trimethylamino-DL-2-propyl-cholesteryl-carboxylat-Jodid, Cholesteryl-3β-carboxyamidoethylenamin, Cholesteryl-3β-oxysuccinamidoethylentrimethylammonium-Jodid, 1-Dimethylamino-3-trimethylamino-DL-2-propylcholesteryl-3-oxysuccinat-Jodid, 2-[(2-Trimethylammonio)-ethylmethylamino]ethyl-cholesteryl-3β-oxysuccinat-Jodid, 3β[N-(N', N'-dimethylaminoethan)-carbamoyl]cholesterin, und 3β-[N-(polyethylenimin)-carbamoyl]cholesterin.
  • Die vorliegende Erfindung kann besser verstanden werden mit Bezug auf die folgenden Beispiele in Verbindung mit den Abbildungen worin:
  • 1 ist ein Syntheseschema für Cholesteryl-Carboxylat-Analoge;
  • 2 ist ein Syntheseschema für Cholesteryl-Hemisuccinat-Analoge;
  • 3 ist ein Syntheseschema für Cholesteryl Format-Analoge;
  • 4 ist ein Graph des Effekts von verschiedenen Co-Lipiden auf die Transfektionsaktivität einer kationischen Lipid-Dispersion in L929 Zellen;
  • 5 ist ein Graph des Effekts des Verhältnisses von Co-Lipiden zu einem kationischen Lipid der vorliegenden Erfindung auf die Transfektionsaktivität in L929 Zellen;
  • 6 ist ein Graph des Effekts der Lipiddosis auf die Transfektionsaktivität in L929 Zellen;
  • 7 ist ein Graph des Effekts der DNA Dosis auf die Transfektionsaktivität der Lipid-Dispersion in L929 Zellen;
  • 8 ist eine Ausführungsform eines Gels, die Komplexbildung von DNA mit der kationischen Lipid-Dispersion zeigt; und
  • 9 ist ein Graph der Transfektionswirksamkeit und Giftigkeit eines kationischen Lipids der vorliegenden Erfindung.
  • Um weiteres Verstehen der vorliegenden Erfindung zu erleichtern, werden die folgenden Beispiele vor allem gegeben zum Zweck bestimmte mehr spezifische Details davon zu illustrieren.
  • Materialien:
  • Cholesterin (99+% Qualität), Cholesterin-Hemisuccinat, 1,1'-Carbonyldimidazol, wurden gekauft von Sigma Chemical Co., St.Louis, MO. Magnesium-Pulver 50 Maschen (99+%), Thionyl-bromid (97%), 1,3-Propansulfon (99%), Iodomethan (98%), Trans-1,2-dichlorethylen (98%), M,M-dimethylanilin (99%), N,N-dimethylethylendiamin (96%), 1,3-bis-dimethylamino-2-propanol (97%), 2-{[2-(Dimethylamino)ethyl]methylamino}ethanol (98%), wurden erhalten von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI. Cholesterylchloroformat (95%) und Polyethylenimin wurden erhalten von Fluka. Methanol, Dichlormethan, und Acetonitril waren HPLC Qualität Lösungsmittel. Alle anderen Chemikalien und Lösungsmittel, wenn nicht spezifiziert, waren Reagens Qualität.
  • Ein Syntheseschema für Cholesteryl-Carboxylat Analoge wird gezeigt in 1.
  • BEISPIEL I
  • Cholesteryl-Bromid (I):
  • Cholesterin, (25g, 64,6mmol) wurde aufgelöst in 10ml Dimethylanilin (78,9mmol) und 5ml Chloroform. Während Rühren auf Eis wurden geringe Mengen von Thionyl-Bromid (6ml, 77,6mmol) aufgelöst in 20ml kaltem Chloroform langsam während 15 Minuten zugesetzt. Nachdem das Zufügen von Thionyl-Bromid beendet war, wurde die Mischung weitere 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die resultierende Lösung wurde in 200ml eiskaltes 95% Ethanol geschüttet und während 2 Stunden auf Eis gehalten bis die Kristallisierung vollendet war. Das Produkt wurde gefiltert und gewaschen mit 25ml eiskaltem 95% Ethanol. Eine geringe Menge des Produktes wurde von dem Filtrat gewonnen durch Zugabe von 75ml destilliertem Wasser gefolgt von Kühlen. Zuletzt wurde das Produkt wieder kristallisiert aus 120ml Azeton und ergab 21,8g Cholesteryl-Bromid (Ausbeute 75%) mit einem Schmelzpunkt von 93–95°C (lit. 97–98°C). Die Identität des Produktes wurde bestätigt durch Massenspektrometrie (EI) welche einen großen Peak mit m/z von 448 zeigte, entsprechend dem molekularen Ion (M+°) von Cholesteryl-Bromid. Auch wurde die molekulare Gewichtmuster-Charakteristik der zwei verschiedenen Isotope vom Brom (79Br:81Br, 1:1) beobachtet.
  • BEISPIEL II
  • Cholest-5-en-3β-carboxylsäure (II)
  • Die Synthese von Cholesteryl-3β-carboxylat wurde durchgeführt mittels einer Grignard Reaktion. Alle Glaswaren wurden über Nacht ofengetrocknet bei 110°C. In einem 500ml Dreihals-Rückflußkolben, wurde eine Lösung von Methyl magnesium-jodid frisch hergestellt durch Behandeln von 9g ofengetrocknetem (110°C) Magnesium-Pulver in 100ml wasserfreiem Diethylether mit 10ml Methyl-jodid. Nachdem die heftige Reaktion nachließ, wurde Cholesteryl-bromid (25g, 56mmol) gelöst in 100ml wasserfreiem Diethylether während drei Stunden langsam beigefügt zur Methylmagnesium-jodid Lösung. Die Lösung wurde während 36 Stunden am Rückfluß genügend erwärmt um den Diethylether am Sieden zu halten. Nach dem Abkühlen, wurde das Grignard-Reagens beigefügt zu fein gemahlenem festem Kohlendioxid, und nach einer Stunde, wurde der Komplex hydrolysiert durch Behandlung mit eiskalter 1 M Schwefelsäure. Danach wurde das Steroid mit Diethylether (3×250ml) extrahiert, die etherische Schicht wurde gewaschen mit 10mM Natrium-thiosulfat (3×50ml), um eine hartnäckige orange Farbe zu entfernen. Nach dem Abtrennen der Wasserschicht wurde die Etherschicht gewaschen mit destilliertem Wasser und gefiltert, um einen unlöslichen Rückstand zu entfernen. Die Etherschicht wurde danach getrocknet über wasserfreiem Natriumsulfat und rotierend verdampft, um eine weiß-gelbe ölige Suspension zu erhalten. Triturieren mit Pentan ergab 8,6g Cholesteryl-3β-carboxylat (Ausbeute 37%) ein feines Pulver mit einem Schmelzpunkt von 212–215°C (lit. 218–220°C). Massenspektrometrie (EI) ergab ein m/z von 414 des molekularen Ions (M+°). Das Produkt wurde charakterisiert durch 2 Protonen NMR. Das Produkt wurde über Nacht lyophilisiert um ein wasserfreies Startmaterial für Acylierungsreaktionen zu erhalten.
  • BEISPIEL III
  • Cholesteryl-3β-carboxyamidoethylendimethylamin (III)
  • Die Acylierung von Cholesterylcarboxylat wurde ausgeführt unter einer trockenen Argon- oder Stickstoffatmosphäre in ofengetrockneten Glasgefäßen. Cholesterincarboxylat (2g 4,8mmol) wurde suspendiert in 5ml Dichlormethan (HPLC Güte unter 4Å Molekülsiebe). Ein 1,5 molarer Überschuss von 1,1'-Carbonyldimidazol (CDI, 1,2g) aufgelöst in 15ml Dichlormethan wurde beigefügt zu der Cholesterylcarboxylat-Suspension in geringen Volumen mit intermittierendem Schütteln. Als die Reaktion nachließ wurde die Lösung über Nacht gerührt. N,N-Dimethylethylendiamin (5ml, 43,2mmol) wurde danach beigefügt und die erhaltene Lösung wurde während 36 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Dichlormethan wurde entfernt durch rotierende Verdampfung, wonach die Reaktion mit einem kleinen Volumen von destilliertem Wasser gelöscht wurde. Das acylierte Steroid wurde extrahiert mit Diethylether (4×50ml). Danach wurden die vereinigten Etherfraktionen zurückextrahiert mit destilliertem Wasser (3×50ml), getrocknet über wasserfreiem Natriumsulfat, und rotierend verdampft unter reduziertem Druck. Der Rückstand wurde dann zerrieben mit Pentan und das Produkt aufgefangen in einem Sinterglastrichter. Ein voluminöses Pulver (1,7g, 73%Ertrag) wurde erhalten und als rein gefunden durch TLC (Rf=0,72) unter Verwendung von Chloroform:Methanol:Wasser (65:25:4, v/v/v) als Entwicklungs-Lösungsmittel. Das Produkt ergab einen Schmelzpunkt von 167–169°C. Massenspektrometrie (FAB+) zeigte einen großen Peak mit einem m/z von 485 welcher dem protonierten molekularen Ion (M+H)+° entspricht. Das Produkt wurde charakterisiert durch Protonen NMR.
  • BEISPIEL IV
  • Cholesteryl-3β-carboxyamidoethylentrimethylammoniumjodid (IV):
  • Die Quaternisierung von Verbindung III wurde ausgeführt mit Hilfe von Methyljodid und Kaliumbicarbonat. Kurz gesagt, 1g (2,1mmol) von Verbindung III wurde aufgelöst in 40ml Methanol zusammen mit 2g (20mmol) Kaliumbicarbonat und 2ml (32,1mmol) Methyljodid. Die Reaktion wurde während 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde danach unter Vakuum entfernt und das verbleibende Bicarbonat wurde neutralisiert mit 1 M HCl bis die Lösung einen pH-Wert von 7 ergab. Wasser wurde entfernt durch Lyophilisierung und das Produkt wurde aus anorganischen Salzverunreinigungen unter Verwendung eines kleinen Volumens von eiskaltem Methanol extrahiert. Nach Verdampfung des Lösungsmittels wurde das Produkt umkristallisiert aus absolutem Ethanol und wurde weiter gereinigt in einer Umkehrphasensäule mit einem Acetonitril/0,1% Trifluoressigsäuregradienten (100% zu 85% Acetonitril in 60 Minuten). Das Pulver wurde als rein gefunden mit TLC (Rf=0,10) mit Chloroform:Methanol:Wasser (85:25:4 v/v/v) als Entwicklungs-Lösungsmittel. Es wurde gezeigt, daß es mit Zersetzung schmilzt bei ungefähr 190°C, und ein molekulares Ion mit einem m/z von 500 (M+°) hat entsprechend der Massenspektrometrie (FAB+). Das Produkt wurde charakterisiert durch Protonen NMR.
  • BEISPIEL V
  • 1,3-Bis-dimethylamino-2-propyl-cholesteryl-3β-carboxylat (V):
  • Die Acylierung wurde durchgeführt unter Verwendung von mit CDI aktiviertem Cholesteryl-3β-Carboxylat analog zu der Methode beschrieben für Verbindung III, abgesehen davon daß 2,3-Bis-dimethylamino-2-propanol (8ml, 47,8mmol) der Nukleophil war. Nach der Zugabe des Nukleophils, wurde die Reaktion bei Raumtemperatur während 72 Stunden gerührt. Das Dichlormethan wurde entfernt und der verbleibende ölige Rückstand wurde aufgelöst in Chloroform. Unreinheiten wurden gefällt mit einem großen Volumen von Petrolether (Sp, 35-60°C). Das Filtrat wurde rotierend verdampft bis zur Trockne, wieder aufgelöst in Pentan, und erneut gefiltert. Nach dem Trocknen wurde das in Pentan lösliche Material getrocknet und wieder aufgelöst in einem geringen Volumen von Diethylether und zu einem großen Volumen von heißem Diethylether:Acetonitril (30:70, v/v) gegeben. Das Produkt kristallisierte bei –20°C nachdem man etwas von dem Ether hatte verdunsten lassen. Massenspektrometrie (FAB+) ergab einen m/z von 543 für das protonierte molekulare Ion (M+H)+°. Das Produkt wurde charakterisiert durch Protonen NMR.
  • BEISPIEL VI
  • 1-Dimethylamino-3-trimethylammonio-DL-2-propyl-cholesterylcarboxylat-jodid-Salz (VI)
  • Das Methyljodid der Verbindung V wurde bereitet durch sanftes Erhitzen der Verbindung V (0,5g, 0,9mmol) und Methyljodid (2ml, 32,1mmol) in 20ml Ethanol am Rückfluß während einer Stunde. Nach Abkühlen wurde der Niederschlag (0,5g, Ausbeute 79%) zweimal umkristallisiert aus absolutem Methanol. Das Produkt schmolz mit Zersetzung bei ungefähr 232°C und wurde als single Spot auf einer TLC Platte (Rf=0,22) gefahren mit Chloroform:Methanol:Wasser (65:25:4, v/v/v) als Entwicklungs-Lösungsmittel. Das Produkt hatte ein molekulares Ion mit einem m/z von 557 (M+°) mit FAB+ Massenspektrometrie, übereinstimmend mit der Alkylierung einer der zwei möglichen tertiären Aminstellen. Das Produkt wurde charakterisiert durch Protonen NMR.
  • BEISPIEL VII
  • Cholesteryl-3β-carboxyamidoethylenamin (VII):
  • Zu einer Lösung von Ethylendiamin (5,11g, 85mmol) in 20ml Dichlormethan, wurde eine Lösung von mit CDI aktiviertem Cholesterylcarboxylat (0,7g, 1,7mmol) in 5ml Dichlormethan tropfenweise während 1,5 Stunden zugesetzt. Nach vollständiger Zugabe des aktivierten Sterols wurde die Reaktion während 48 Stunden unter Stickstoff gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels unter reduziertem Druck wurde der Rückstand aufgelöst in Chloroform:Methanol (2:1, v/v) und gegen Wasser (3×50ml) extrahiert. Die Chloroformphase wurde anschließend mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, das Lösungsmittel entfernt und der Rückstand gereinigt durch präparative TLC mit Chloroform:Methanol:Wasser (65:25:4, v/v/v) als Entwicklungs-Lösungsmittel. Das Band bei ungefähr Rf=0,3 wurde aufgenommen, extrahiert mit Chloroform:Methanol (1:1, v/v) und getrocknet unter reduziertem Druck. Das Produkt (0,65g, Ausbeute 81%) wurde als single Spot (Rf=0,33) gefahren und schmolz mit Zersetzung bei ungefähr 194°C. Massenspektrometrie (FAB+) ergab einen m/z von 457 für das protonierte molekulare Ion (M+H)+. Das Produkt wurde charakterisiert durch Protonen NMR.
  • Ein Schema beschreibend die verschiedenen Schritte zum Herstellen von Cholesterinhemisuccinat-Analogen ist dargestellt in 2.
  • BEISPIEL VIII
  • Cholesteryl-3β-Oxysuccinamidoethylendimethylamin (VIII):
  • Die Synthese der Verbindung VIII erforderte zuerst das Acylimidazolid von Cholesterylhemisuccinat welches bereitet wurde durch Umsetzen von Cholesterinhemisuccinat mit N,N-carbonyldimidazol (CDI) wie beschrieben für die Synthese von Verbindung III. Kurz gesagt, zu Cholesterinhemisuccinat (2g, 4,1mmol) suspendiert in 5ml Dichlormethan wurden beigefügt 1,5 Äquivalente von CDI (1g) gelöst in 15ml Dichlormethan. Die Lösung wurde über Nacht gerührt und danach N,N-Dimethylethylendiamin (5ml, 43,2mmol) beigefügt. Dichlormethan wurde danach entfernt durch rotierendes Verdunsten, destilliertes Wasser wurde beigefügt und das acylierte Sterol wurde extrahiert mit Diethylether (4×50ml). Danach wurden die Etherfraktionen gewaschen mit destilliertem Wasser (3×50ml) und getrocknet über wasserfreiem Natriumsulfat. Der Ether wurde entfernt durch rotierende Verdampfung. Das Produkt wurde gewaschen mit 200ml Pentan, und geringe Verunreinigungen wurden entfernt durch präparative Silicagel-TLC. Nach Entwicklung mit Chloroform:Methanol:Wasser (65:25:4, v/v/v) wurde das Band bei ungefähr Rf=0,80 aufgenommen und extrahiert mit Chloroform/Methanol (2:1 v/v). Der Rückstand wurde weiter gereinigt mit Chloroform:Ethylacetat (1:1, v/v) als zweites Entwicklungs-Lösungsmittel. Das Band bei ungefähr Rf=0,2 wurde extrahiert mit Chloroform/Methanol (2:1, v/v). Das lyophilisierte Produkt liess man als single Spot auf TLC mit Rf von 0,75 laufen mit Chloroform:Methanol: Wasser (65:25:4, v/v/v) als Entwicklungs-Lösungsmittel und es hatte einen Schmelzpunkt von 119–111°C. Massenspektrometrie (FAB+) zeigte ein m/z von 557 welches dem protonierten molekularen Ion (M+H)+° entsprechen würde. Das Produkt wurde charakterisiert durch Protonen NMR.
  • BEISPIEL IX
  • Cholesteryl-3β-oxysuccinamidoethylentrimethylammoniumjodid (IX):
  • Die Quaternisierung von Verbindung VIII wurde durchgeführt mit Methyljodid in absolutem Ethanol wie oben beschrieben für die Synthese von Verbindung VI. Abkühlen der Lösung auf Raumtemperatur erbringt 0,5g (80% Ausbeute) quaternäres Ammoniumsalz. Danach wurde das Produkt umkristallisiert aus absolutem Ethanol und lieferte ein feines weißes Pulver welches mit Zersetzung bei ungefähr 196°C schmolz. Das Produkt wurde als single Spot auf einer TLC Platte (Rf=0,43) gefahren mit Chloroform-Methanol:Wasser (65:25:4, v/v/v) als Entwicklungs-Lösungsmittel. Massenspektrometrie (FA+) zeigte ein molekulares Ion mit einem m/z von 572 (M+°). Das Produkt wurde charakterisiert durch Protonen NMR.
  • BEISPIEL X
  • 1,3-Bi-dimethylamino-2-propyl-cholesteryl-3β-oxysuccinat (X):
  • Die Acylierung wurde ausgeführt mit durch CDI aktiviertem Cholesterylhemisuccinat entsprechend der vorher für Verbindung V beschriebenen Methode. Nach der Beigabe von 1,3-Bi-dimethylamino-2-propanol (7ml, 41,6mmol), wurde das Gemisch während 72 Stunden gerührt, wonach das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt wurde. Das aus dem Rückstand mit Diethylether (3×75ml) extrahierte Produkt ergab nach dem Entfernen des Ethers ein Öl. Die Beigabe von Pentan fällte weitere Verunreinigungen; nach rotierender Verdampfung konnte das resultierende Öl nicht erfolgreich kristallisiert werden mit einer Vielzahl von Lösungsmitteln oder durch Lyophilisierung. Massenspektrometrie (FA+) zeigte ein protoniertes molekulares Ion mit einem m/z von 616 (M+H)+°. Das Produkt wurde charakterisiert durch Protonen NMR.
  • BEISPIEL XI
  • 1-Dimethylamino-3-trimethylamino-DL-2-propyl-cholesteryl-3β-oxysuccinatjodidsalz (XI):
  • Die Methylierung der Verbindung X wurde durchgeführt nach der vorher beschriebenen Methode (Beispiel VI). Nach einer Stunde wurde die Lösung gekühlt und das Methjodid zweimal umkristallisiert aus absolutem Methanol um nadelförmige Kristalle zu bilden, welche mit Zersetzung bei ungefähr 222°C schmolzen. Das Produkt wurde als single Spot auf einer TLC Platte (Rf=0,17) gefahren mit Chloroform:Methanol:Wasser (65:25:4, v/v/v) als Entwicklungs-Lösungsmittel. Massenspektrometrie (FA+) zeigte ein molekulares Ion mit einem m/z von 629 (M+°) was übereinstimmt mit der Methylierung von 1 von möglichen 2 tertiären Aminstellen. Das Produkt wurde charakterisiert durch Protonen NMR.
  • BEISPIEL XII
  • 2-{[2-(Dimethylamino)ethyl]methylamino}ethyl-cholesteryl-3β-oxysuccinat (XII):
  • Die Synthese von Verbindung XII war analog zu der für die Acylierung von Verbindung VIII beschriebenen Methode ausgenommen, daß 2-{[2-(Dimethylamino)ethyl]-methylamino}ethanol (7ml, 42,0mmol) der als Nukleophil gebrauchte Aminoalkohol war. Nach Extraktion mit Diethylether wurde das Produkt zur Trockne lyophilisiert und weiter gereinigt durch präparative TLC mit Chloroform:Methanol:Wasser (65:25:4, v/v/v). Danach wurde das Band bei R=0,80 vorhandene gewonnen und extrahiert mit Chloroform:Methanol, (2:1, v/v), der Rückstand wurde weiter gereinigt mit Chloroform:Ethylacetat (1:1; v/v) als zweites TLC Entwicklungs-Lösungsmittel. Das Band bei R=0,2 wurde gewonnen und das Siliziumdioxid wurde extrahiert mit Chloroform:Methanol (2:1, v/v). Das Produkt, welches als single Spot auf einer TLC Platte (Rf=0,72) mit Chloroform:Methanol:Wasser (65:25:4, v/v/v) als Entwicklungs-Lösungsmittel lief, ergab einen Schmelzpunkt von 50–52°C. Massenspektrometrie (FA+) zeigte ein protoniertes molekulares Ion mit einem m/z von 615 (M+H)+°. Das Produkt wurde charakterisiert durch Protonen NMR.
  • BEISPIEL XIII
  • 2-{[2-Trimethylammonio]ethylmethylamino}ethyl-cholesteryl-3β-oxysuccinatjodsalz (XIII):
  • Die Acylierung von Verbindung XII (0,5g, 0,8mmol) wurde durchgeführt unter Rückflussbedingungen mit Methyljodid in absolutem Ethanol wie beschrieben in Beispiel VI. Der Rückstand wurde zweimal umkristallisiert aus absolutem Methanol und färbte als ein single Spot auf einer TLC Platte (R=0,22) mit Chloroform:Methanol:Wasser (65:25:4, v/v/v) als Entwicklungs-Lösungsmittel. Die Kristalle schmolzen mit Zersetzung bei ungefähr 172°C. Massenspektrometrie (FA+) ergab ein m/z von 629 für das molekulare Ion (M+°) passend zur Methylierung von nur einer der möglichen zwei tertiären Aminstellen. Das Produkt wurde charakterisiert durch Protonen NMR.
  • Das Schema für die Synthese von Cholesteryl-format-Analogen wird gezeigt in 3.
  • BEISPIEL XIV
  • 3β[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)-carbamoyl]cholesterin (XIV)
  • Die Verbindung XIV wurde synthetisiert durch Mischen einer Lösung von Cholesterylchloroformat (0,5mmol) in Chloroform mit einer Lösung von N,N-Dimethylethylendiamin (9,1mmol) in Chloroform in einem Trockeneis-Ethanol-Bad. Das Lösungsmittel und das nicht umgesetzte Amin wurden entfernt in Vakuo. Verbindung XIV wurde gereinigt durch zwei aufeinander folgende Umkristallisierungen in Ethanol. (Ausbeute, 65%) TLC (Chloroform:Methanol-65:35) zeigte einen einzigen Spot (R=0,37) nach Entwickelung mit Jod. Das Produkt wurde charakterisiert durch Protonen NMR.
  • BEISPIEL XV
  • 3β[N-(Polyethylenimin)-carbamoyl]cholesterin (XV):
  • Die Synthese von Verbindung XV war ähnlich wie jene von Verbindung XIV. Cholesterinchloroformat (0,1mmol) und Polyethylenimin 600 (6g) wurden gemischt in Chloroform in einem Trockeneneis-Ethanol-Bad. Nachdem das flüchtige Material des Reaktionsgemisches im Vakuum entfernt war, wurde das feste Rohprodukt dialysiert gegen 41 destilliertes Wasser während drei Tagen (währenddessen wurde das Wasser mehrere Male gewechselt). Endlich wurde das Produkt lyophilisiert zur Trockne, und ergab eine geschätzte Ausbeute von 81%. Die Verbindung XV lief als ein single Spot auf TLC (Chloroform:Methanol-65:35).
  • BEISPIEL XVI
  • Herstellung von kationischen Lipid-Dispersionen:
  • Kationische Cholesterin-Derivate wurden gemischt mit einem Phospholipid in Chloroform-Lösung bei verschiedenen molaren Verhältnissen. Das Lösungsmittel wurde entfernt durch Verdampfen unter einem Strom von N2-Gas und dann wurde in Vakuo während wenigstens 30 Minuten getrocknet. Der trockene Lipidfilm wurde über Nacht hydratisiert in 20mM Hopes Puffer (pH 7,8). Die Suspension wurde "sonicated" in einem Bad-Typ Sonicator (Laboratory Supplies, Hicksville, NY) um Dispersionen kleiner Partikel (durchschnittlicher Durchmesser = 150nm) zu erhalten.
  • BEISPIEL XVII
  • Transfektion von Zellen:
  • Das Plasmid pUCSV2CAT (ungefähr 5kb Größe) enthaltend das strukturelle Gen von E.coli Chloramphenicol-Acetyl-Transferase (CAT) getrieben durch den SV40 Virus Früh-Promoter wurde gebraucht als ein Modell für die Polyanionen, die durch die kationischen Lipid-Dispersionen geliefert werden sollen. DNA wurde gemischt mit kationischen Lipid-Dispersionen in 1ml serum-freiem M199 Medium oder McCoy's Medium, um einen DNA/Lipid-Komplex zu bilden. Kultivierte Säugetierzellen von ungefähr 80–100% Konfluenz in einer G-well Platte wurden einmal gewaschen mit serumfreiem Medium. Der DNA/Lipid-Komplex wurde beigefügt zu den gewaschenen Zellen, welche bei 37°C während 5 Stunden inkubiert wurden. Die Zellen wurden erneut gewaschen und das Serum enthaltende Medium wurde beigefügt. Die Zellen wurden 30–72 Stunden später geerntet und zelluläre Proteine wurden extrahiert. Die CAT Aktivität in dem extrahierten Protein wurde gemessen mit entweder [14C] Chloramphenicol oder [3H] Acetyl-CoA als ein radiomarkiertes Substrat. Eine Aktivitätseinheit von CAT ist definiert als nmol von radiomarkiertem Substrat umgewandelt in das radiomarkiertee Produkt in einer Minute. Der Proteingehalt in den Zellextrakten wurde gemessen durch den Bradford (BIORAD) Assay.
  • BEISPIEL XVIII
  • Isolierung von Proteinkinase C:
  • So schnell wie möglich wurden Gehirne von 25 Sprague-Dawley Ratten (150–200g) entnommen, gewaschen mit 100ml 20mM TRIS, 1mM EDTA, 1mM EGTA, pH7,5, und homogenisiert in 150ml eiskaltem 20mM TRIS, 10mM EGTA, 2mM EDTA, 10mM DTT, 0,25 M Sucrose, 2 mM PMSF und 100μg/ml Leupeptin, pH7,5. Das Homogenat wurde sofort zentrifugiert bei 100.000g während 40 Minuten bei 4°C in einem Beckman Ti50.2 Rotor. Der Überstand wurde aufgebracht auf eine 2,5×20cm Säule von DEAE Sepharose (schneller Durchfluss) enthaltend 60ml Harz ins Gleichgewicht gesetzt mit 20mM TRIS, 1mM EDTA, 1mM DTT, pH7,5 (Puffer A). Die Säule wurde gewaschen mit 300ml Puffer A und zusätzlichen 200ml Puffer A enthaltend 0,03M KCl. Protein Kinase C wurde eluiert mit einem 500ml kontinuierlichen KCl Gradienten (0,03–0,3M KCl). Fraktionen von 5ml Volumen wurden gesammelt. Fraktionen, die Kalzium- und Phospholipid-Abhängigkeit zeigten wurden vereinigt: die Salzkonzentration wurde mit der entsprechenden Menge von festem KCl eingestellt auf 1,5 M/KCl. Die rohe Probe enthaltend 1,5M KCl wurde während 15 Minuten gerührt und danach auf eine 1×10cm Säule geladen, die 9ml Phenyl-Sepharose im Gleichgewicht mit 1,5M KCl in 20mM TRIS, 0,5mM EGTA, 1mM DTT, pH7,5 (Puffer B) enthielt. Die Säule wurde gewaschen mit 90ml Puffer B enthaltend 1,5M KCl. PKC wurde eluiert mit einem 100ml kontinuierlichen KCl Gradienten (1,5-0M KCl). Fraktionen von 3ml Volumen wurden gesammelt. Die Säule wurde gewaschen mit zusätzlichen 50ml Puffer B. Die meiste Enzymaktivität eluierte während dieser Etappe. Fraktionen, die Kalzium- und Phospholipid-Abhängigkeit aufwiesen, wurden vereinigt und konzentriert auf 4ml mit einer Amicon-Ultrafiltrierzelle ausgestattet mit einem YM-10 Filter. Die konzentrierte Probe wurde geladen auf eine 2,5×100cm Säule enthaltend 400ml Sephacryl S-200 HR Perlen im Gleichgewicht mit Puffer B, der 10% Glycerin enthielt (Puffer C). Fraktionen von 3ml Volumen wurden gesammelt. Ungefähr 150ml Puffer wurden durchgelassen; PKC eluierte sehr nah zu dem Säulen-Leervolumen. Die Fraktionen, die Kalzium- und Phospholipid-Abhängigkeit aufwiesen, wurden vereinigt und auf eine 0,5×5cm Säule enthaltend 2,5ml Polylysin-Agarose im Gleichgewicht mit Puffer C geladen. PKC wurde eluiert mit einem 40ml kontinuierlichen KCl Gradienten (0–0,8M KCl). Fraktionen von 1ml Volumen wurden gesammelt. Wenige der ersten aktiven Fraktionen waren kontaminiert. Die unkontaminierten Fraktionen wurden vereinigt, konzentriert, und verdünnt mit Puffer C, um den hohen Salzgehalt zu entfernen. Nach erneutem Konzentrieren wurde die Probe in Arbeitsportionen aufgeteilt, in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei –80°C aufbewahrt. Volle Aktivität wurde wieder erhalten nach schnellem Auftauen. Spurenunreinheiten (116k, 66k, und 50k Mr) konnten immer noch gefunden werden, wenn das Gel stark mit Silber gefärbt wurde. Das Enzym ergab eine spezifische Aktivität von 200nmol Phosphat eingebaut pro Minute pro Milligramm Protein beim Assay für Histon-Phosphorylierung unter Verwendung des Triton-gemischte-Micelle-Assays in Gegenwart von 6,5Mol % Phosphatidylserin, 2,5 Mol % DAG und 100 μM Kalzium. Spezifische Aktivitäten von 30 nMol/min/mg bis 600 nMol/min/mg wurden beobachtet für PKC bei Verwendung des Triton-gemischte-Micelle-Assays unter den gleichen Bedingungen.
  • BEISPIEL XIX
  • Gemischte-Micelle-Assay von Protein Kinase C:
  • Phosphatidylserin und 1,2-Diolein mit und ohne Additiv wurden gelöst in einer Lösung von Chloroform/Methanol (2:1, v/v). Das Lösungsmittel wurde verdampft mit einem Strom von Stickstoff, und die letzten Spuren entfernt in einem Vakuum-Dessikator bei 40°C. Die Lipidfilme wurden dann aufgelöst durch Zugabe von 3% Triton X-100, stark gevortext während 30 Sekunden und dann inkubiert bei 30°C während 10 Minuten um das Gleichgewicht zu erreichen. Mit 25μl wurde ein Aliquot dieser Lösung gebraucht in einem endgültigen Assayvolumen von 250ml, enthaltend 20mM TRIS-HCl, pH7,5, 10mM MgCl2, 200μg/ml Histon III-S, 100μM CaCl2, 10μM[J32p] Adenosin5'-triphosphat, 2,75mM Triton X-100, mit 300μM (6,5Mol Prozent) Phosphatidylserin und 107μM (2,5Mol Prozent) 1,2-Diolein. Für Kontrollen ersetzten 25μl von 20mM EGTA das CaCl2. Um die Reaktion einzuleiten wurden 150ng Protein beigefügt. Nach kurzem Mischen wurden die Reagenzgläser bei 30°C während 10 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde beendet durch Beifügen von 1ml kaltem 0,5mg/ml BSA und 1ml kalter 25% Trichloressigsäure. Die Mischung wurde durch einen GF/C Whatman Filter gegeben und fünfmal gewaschen mit 2ml von 25% Trichloroessigsäure. Nach dem Trocknen wurden die Filter gezählt mit 6ml ACS Scintillations-Fluid.
  • BEISPIEL XX
  • Bildung einer homogenen Dispersion mit kationischen Cholesterin-Derivaten
  • Keines der kationischen Cholesterin-Derivate bildet selbst stabile homogene Dispersionen durch Sonication in einem Puffer mit niedriger ionischer Stärke. Es war nötig ein saures oder neutrales Phospholipid beizufügen, um eine gemischte Lipid-Dispersion zu bilden. Zum Beispiel, Verbindung VIII benötigt ein Minimum von 1 Teil von PC oder PC und 9 Teile von Verbindung VIII um eine gleichförmige Dispersion zu bilden. Im Fall von Verbindung XIV ist ein minimales Verhältnis von Phosphatidyl-Cholin (PC) oder Phosphatidyl-Ethanolamin (PE) zu XIV = 4:6 nötig. Ein solches in der Dispersion verwendetes nicht-kationisches Lipid wird Co-Lipid genannt.
  • BEISPIEL XXI
  • Lieferung von DNA in Säugetierzellen durch kationische Lipid-Dispersionen
  • Plasmid DNA, pUCSV2CAT, wurde als Modellverbindung für Polyanionen verwendet weil es ein strukturelles Gen für CAT beinhaltet. Die Wirksamkeit von intrazellulärer Lieferung kann sogleich assayed werden durch die Expression von CAT Aktivität in den extrahierten Proteinen der behandelten Zellen. Tabelle 1 verzeichnet die CAT Aktivität von Maus L929 Zellen welche transfektiert wurden mit dieser Plasmid-DNA wie durch verschiedene kationische Lipid-Dispersionen vermittelt. Zusätzlich haben wir auch die hemmende Aktivität der reinen kationischen Cholesterin-Derivaten auf Diolein, Phosphatidyl-Serin (PS), und Ca2+ stimulierte Protein-Kinase C gemessen. Diese Aktivität wurde ausgedrückt als ein IC50, welches die Konzentration ist, bei welcher 50% der PKC Aktivität gehemmt wurde. Wie aus Tabelle 1 ersichtlich, sind Derivate mit niedrigen IC50 Werten, i.e., jene starken PKC Hemmer, nicht ein gutes Liefermittel für DNA. Zum Beispiel, Verbindungen IV, XI, VI und XIII, die alle einen IC50 Wert von weniger als 20μM haben, produzierten minimale CAT Aktivitäten in den behandelten Zellen. Unter denen welche hohe CAT Aktivitäten ergaben, waren Derivate mit einer einzigen tertiären Aminogruppe (Verbindungen VIII, VI und III) wirksamer im Liefern der DNA als ähnliche Analoge mit einer einzigen quaternären Aminogruppe (Verbindungen IX und IV). Überdies lieferten von den Derivaten mit der gleichen Amino-Kopfgruppe jene, welche einen längeren Spacerarm enthielten (Verbindungen VIII und IX), eine größere Quantität von DNA als jene, die einen kürzeren Spacerarm enthielten (Verbindungen X, XI, V, VI und XV). Letztere waren im Allgemeinen weniger wirksame Liefermittel.
  • Verbindung VII verdient besondere Beachtung. Sie enthält eine einzige Aminogruppe mit einem kurzen Spacerarm, dennoch war die Transfektionsaktivität relativ hoch.
  • TABELLE 1
    Figure 00250001
  • BEISPIEL XXII
  • Die Wichtigkeit des Co-Lipids
  • Die im Beispiel XXI beschriebenen Experimente wurden ausgeführt mit einer Lipid-Dispersion enthaltend ein kationisches Cholesterin-Derivat und ein Co-Lipid Dioleoyl-Phosphatidylethanolamin (DOPE). Wir haben die Rolle des Co-Lipids in der Lieferungswirksamkeit untersucht. 4 zeigt die Daten eines Experiments worin Verbindung VIII gemischt wurde mit einer Vielzahl von verschiedenen Co-Lipiden, neutral oder sauer, mit einem molaren Verhältnis von 1:1. Die DNA Lieferaktivitäten dieser gemischten Dispersionen wurden dann untersucht. Wie man sieht, unterstützte nur DOPE die Lieferaktivität der Verbindung VIII. Andere neutrale Lipide wie Dioleoyl-Phosphatidylcholin (DOPC), N-methyl-DOPE, N,N-dimethyl-DOPE hatten nur wenig oder keine Aktivität. Keines der sauren Lipide, wie PS und Phosphatidylglycerin (PG) zeigte eine Aktivität.
  • Das Molarverhältnis von DOPE und Verbindung VIII in der Dispersion spielte auch eine wichtige Rolle. 5 zeigt, daß die maximale DNA Lieferungsaktivität der Dispersion eintrat, wenn die Dispersion 20–50% der Verbindung VIII enthielt. Zu viel oder zu wenig von Verbindung VIII in der gemischten Dispersion ergab keine gute Lieferaktivität.
  • BEISPIEL XXIII
  • Optimierung des Dispersion-zu-DNA Verhältnisses für die Lieferung
  • Ein 1:1 Gemisch von Verbindung VIII und DOPE wurde verwendet um das optimale Verhältnis von Dispersion-zu-DNA zu untersuchen. 6 zeigt die Daten eines Experiments worin verschiedene Mengen von Dispersion beigefügt wurden zu einer gleichen Menge von DNA (5μg) zur Transfektion. Maximale Aktivitäten zeigten sich bei 69-80nMol Dispersion. Wir setzten dann 70nMol Dispersion ein und variierten die Menge von DNA zur Transfektion (7). Die glockenförmige Kurve der Abbildung zeigt daß 5μg DNA die maximale Aktivität ergab. Demzufolge war das optimale Verhältnis von Dispersion-zu-DNA 70nMol Lipid für 5μg DNA.
  • BEISPIEL XXIV
  • Komplexbildung von DNA mit kationischen Lipid-Dispersionen
  • Es wurde erwartet, daß Polyanionen mit der kationischen Lipid-Dispersion über elektrostatische Interaktionen Komplexe bilden. Es wurde wieder ein 1:1 Gemisch von Verbindung VIII und DOPE für die Untersuchung eingesetzt. Wir haben die Dispersion/DNA Komplexe charakterisiert durch Agarose-Gel-Elektrophorese. Wie in 8 gezeigt, wanderte bei der Elektrophorese 1μg Plasmid DNA als zwei nah beieinander liegende Bänder in dem Gel (Spur 1), welche komplett verdaut werden konnten, wenn DNAse im Inkubationspuffer (Spur 7) enthalten war. Inkubationsmischungen mit zunehmenden Mengen von Dispersion zeigten abnehmende Intensitäten der DNA Bänder (Spuren 2,3,4,5 und 6). Weiterhin, konnte die gesamte unkomplexierte, freie DNA verdaut werden durch die DNAse, aber nur ein Teil der komplexierten wurde verdaut (Spuren 8,9,10,11 und 12). Diese Resultate zeigen klar, daß die Lipid-Dispersion Komplexe bildet mit DNA, welche entweder größer und/oder weniger negativ geladen sind, so daß der Komplex während der Elektrophorese nicht in das Gel eintritt. Weiterhin ist der Komplex teilweise widerstandsfähig gegenüber DNAse, während die freie nicht komplexierte DNA nicht widerstandsfähig ist. Es sollte bemerkt werden, daß bei optimalem Dispersion/DNA-Verhältnis fast die gesamte DNA mit Liposomen komplexiert wurde (nicht gezeigt in 8).
  • BEISPIEL XXV
  • Beziehung zwischen Lieferaktivität und Zellgiftigkeit des kationischen Lipid-Komplexes
  • Dies wurde untersucht unter Verwendung einer Dispersion bestehend aus Verbindung XIV und DOPE (3:2, molares Verhältnis). A431 menschliche Epidermoid Carcinoma Zellen wurden für die Transfektions Experimente verwendet. Eine feste Menge von DNA (4μg) wurde gemischt mit einer zunehmenden Menge von kationischer Lipid-Dispersion oder einem kommerziell verfügbaren Transfektions-Reagens, Lipofectin, und zu den A431 Zellen zur Transfektion beigefügt (9). Die Giftigkeit der Behandlung gegenüber den Zellen wurde gemessen als die totale Menge von extrahierbarem Protein während der CAT-Aktivitäts-Analyse.
  • Wie aus der Abbildung zu ersehen ist, zeigten Lipofectinbehandelte Zellen einen stark reduzierten Proteingehalt mit 50% Hemmung bei ungefähr 7μg Lipid/ml. Zellen, die mit der Dispersion behandelt wurden, die Verbindung XIV und DOPE enthielt, zeigten eine geringere Giftigkeit; der IC50 lag bei ungefähr 25μg Lipid/ml. Die neue kationische Cholesterin-Dispersion hatte auch höhere CAT Aktivitäten produziert als Lipofectin. Es ist wichtig zu notieren, daß maximale CAT Aktivität von Zellen behandelt mit Lipofectin vorkam bei einer Lipofectin-Konzentration von 15μg/ml. Bei dieser Konzentration konnten nur ungefähr 12% der gesamten zellulären Proteine aus der Kultur zurückgewonnen werden. Auf der anderen Seite zeigte sich maximale CAT Aktivität von mit der kationischen Cholesterin-Dispersion behandelten Zellen bei 20μg/ml; ungefähr 80% der gesamten zellulären Proteine verblieben bei dieser Konzentration noch in der Kultur. Also ist die neue kationische Cholesterin-Dispersion wirksamer in der Lieferaktivität und ist auch weniger giftig für die behandelten Zellen.
  • BEISPIEL XXVI
  • Stabilität der kationischen Cholesterin-Derivate Lipid-Dispersionen wurden präpariert mit verschiedenen kationischen Cholesterin-Derivaten und DOPE (ungefähr 1:1 molares Verhältnis). Die Transfektions-Aktivitäten der Dispersionen wurden getestet zu verschiedenen Zeiten nachdem die Dispersionen aufbewahrt wurden bei 4°C in PBS, pH7,5. Aus den in Tabelle 1 aufgezeigten Derivaten waren nur die Dispersionen mit Verbindungen XIV und XV stabil nach der Lagerung; deren Transfektions-Aktivitäten änderten sich nicht während wenigstens 2 Monaten. Auf der anderen Seite, verloren die Dispersionen bestehend aus anderen Derivaten ihre Aktivität nach 2–3 Tagen Lagerung. Verbindungen XIV und XV beinhalten eine Carbamoyl-Linkerbindung während andere Verbindungen entweder eine Esterbindung oder eine Amidbindung enthalten. Es ist bekannt, daß Ester- und Amidbindungen gegenüber Hydrolyse empfindlicher sind als Carbamoylbindungen, besonders in der Gegenwart von Basen. Die kationischen Derivate können womöglich gegenseitig die Hydrolyse ihrer jeweiligen Esterbindungen katalysieren, was zu einer Inaktivierung der Lieferaktivität führt. Verbindungen die Carbamoyl-Linkerbindungen enthalten sind weniger sensibel gegenüber der Basen-katalysierten Hydrolyse, obschon sie immer noch hydrolysiert werden können durch Zellenzyme, i.e., sie sind biologisch abbaubar. Dies steht im Kontrast zu der nicht-abbaubaren Etherbindung in DOTMA welches der aktive Bestandteil von Lipofectin ist. Folglich scheint eine Carbamoylbindung die beste Wahl zu sein für die Linkerbindung der kationischen Lipide als ein Liefermittel für Polyanionen.
  • Verschiedene der Merkmale der Erfindung welche als neu erscheinen, werden dargelegt in den beiliegenden Ansprüchen.

Claims (83)

  1. Ein im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin mit einer Cholesterylgruppe, einem Linker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Carbamoyl -NH-(CO)-O-*, Carboxyamid -NH-(CO)-*, Revers-Ester -O-(CO)-*, welcher Linker mit der mit einem Stern markierten Seite verbunden ist zur Position 3 der Cholesterylgruppe und mit der anderen Seite durch den Stickstoff oder den Kohlenstoff zu einem Spacer mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen in einer verzweigten oder unverzweigten Alkylkette welche wenigstens eines der folgenden Heteroatome: Sauerstoff oder Stickstoff enthält oder nicht enthält, und der auf seiner anderen Seite mit einer kationischen Aminogruppe verbunden ist, die ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus primären, sekundären, tertiären und quaternären Aminogruppen, ausgenommen die Verbindungen worin: (1) die Aminogruppe primär ist, der Linker -NH-C(=O)-O-* ist und der Spacer (i) eine -CH2-O-CH2)2- Gruppe enthält oder (ii) der Spacer -(CH2)2- oder -(CH2)5- ist, (2) die Aminogruppe sekundär ist, der Linker-NH-C(C=O)-O-* ist und der Spacer -(CH2)n- ist, worin n 2 oder 6 ist, und (3) die Aminogruppe quaternär ist, der Linker Carbonat -O-C(=O)-O-* oder Ester -(CO)-O-* ist, und der Spacer -(CH2)2- oder -(CH2)10- ist.
  2. Im wesentlichen ungiftiges, biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin nach Anspruch 1 worin der -N-C(=O)-O- Linker -NH-C(=O)-O-* ist.
  3. Im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin nach Anspruch 1 worin der Linker -NH-C(=O)-* ist.
  4. Im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin nach Anspruch 1 worin der Spacer mindestens ein Stickstoffatom enthält.
  5. Im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin nach Anspruch 1 worin der Spacer ein Sauerstoffatom enthält.
  6. Im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin nach Anspruch 5 worin die Verbindung Cholesteryl-3β-oxysuccinamidoethylendimethylamin ist.
  7. Im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin nach Anspruch 2 worin der Spacer -(CH2)2- ist.
  8. Im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin nach Anspruch 2 worin die Aminogruppe tertiär ist.
  9. Im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin nach Anspruch 1 bis 8 welches ein kationisches Lipid ist.
  10. Im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin nach Anspruch 9 welches ein quaternäres Ammoniumsäuresalz ist.
  11. Im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin nach Anspruch 10 worin das Salz ein Jodidsalz ist.
  12. Im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin nach Anspruch 9 worin das Salz ein Salz einer anorganischen Säure ist.
  13. Im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin nach Anspruch 9 welches 3β- [N-(N',N'dimethylaminoethan)-carbamoyl]-cholesterin ist.
  14. Im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin nach Anspruch 9 welches 3β [N-(polyethylenimin)-carbamoyl)-cholesterin ist.
  15. Im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin nach Anspruch 13 oder 14 welches das Hydrochloridsalz ist.
  16. Im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin nach Anspruch 13 oder 14 welches frei von organischem Lösungsmittel ist.
  17. Im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin nach Anspruch 13 oder 14 welches ein trockener Feststoff ist.
  18. Im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin nach Anspruch 13 welches kristallisiert ist.
  19. Im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin nach Anspruch 14 welches lyophilisiert ist.
  20. Im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin nach Anspruch 13 oder 14 welches ein trockener Film ist.
  21. Im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin nach Anspruch 13 oder 14 welches hydratisiert ist.
  22. Im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin nach Anspruch 21 in einem wässrigen Puffer.
  23. Im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin nach Anspruch 4 worin der Linker -NH-C(=O)-O-* ist.
  24. Im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin nach Anspruch 23 worin der Spacer eine primäre Aminogruppe enthält.
  25. Im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin nach Anspruch 23 worin der Spacer verbunden ist mit einer Aminogruppe ausgewählt aus primären und sekundären Aminogruppen.
  26. Im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin nach Anspruch 24 welches Cholesteryl-3b-carboxyamidoethylenamin ist.
  27. Im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin nach Anspruch 1 welches ein Pulver, kristallisiert oder lyophilisiert ist.
  28. Eine wässerige Dispersion welche enthält ein neutrales Lipid und ein im wesentlichen ungiftiges biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin mit einer Cholesterylgruppe, einem Linker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Carbamoyl -NH-(CO)-O-*, Carboxyamid -NH-(CO)-*, Revers- Ester -O-(CO)-*, welcher Linker mit der mit einem Stern markierten Seite verbunden ist zur Position 3 der Cholesterylgruppe und mit der anderen Seite durch den Stickstoff oder den Kohlenstoff zu einem Spacer mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen in einer verzweigten oder unverzweigten Alkylkette, welche wenigstens eines der folgenden Heteroatome: Sauerstoff oder Stickstoff enthält oder nicht enthält, und der auf seiner anderen Seite verbunden ist mit einer kationischen Aminogruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus primären, sekundären, tertiären und quaternären Aminogruppen, ausgenommen die Verbindungen worin die Aminogruppe primär ist, der Linker -NH-C(=O)-O-* ist und der Spacer (i) -(C2H5)- ist oder (ii) eine -(CH2-O-CH2)2- Gruppe enthält.
  29. Dispersion nach Anspruch 28 worin das im wesentlichen ungiftige biologisch abbaubare Aminderivat von Cholesterin ein kationisches Lipid ist.
  30. Dispersion nach Anspruch 28 worin in dem im wesentlichen ungiftigen biologisch abbaubaren Aminderivat von Cholesterin der -N-C(=O)-O-* Linker -NH-C(=O)-O-* ist.
  31. Dispersion nach Anspruch 28 worin in dem im wesentlichen ungiftigen biologisch abbaubaren Aminderivat von Cholesterin, der Linker -NH-C(=O)-* ist.
  32. Dispersion nach Anspruch 29 welche einen alkalischen pH hat.
  33. Dispersion nach Anspruch 29 worin in dem im wesentlichen ungiftigen biologisch abbaubaren Aminderivat von Cholesterin der Spacerarm -(CH2)2- ist.
  34. Dispersion nach Anspruch 29 worin in dem im wesentlichen ungiftigen biologisch abbaubaren Aminderivat von Cholesterin die Aminogruppe tertiär ist.
  35. Dispersion nach Anspruch 29 worin das neutrale Lipid Phosphatidylethanolamin ist.
  36. Dispersion nach Anspruch 35 worin das Phosphatidylethanolamin Dioleoylphosphatidylethanolamin ist.
  37. Dispersion nach Anspruch 29 worin das im wesentlichen ungiftige biologisch abbaubare Aminderivat von Cholesterin 3β[N-(N',N'-dimethylaminoethan)carbamoyl]-cholesterin ist.
  38. Dispersion nach Anspruch 37 worin das im wesentlichen ungiftige biologisch abbaubare Aminderivat von Cholesterin 3β[N-(N',N'-dimethylaminoethan)carbamoyl]-cholesterin ist und das neutrale Lipid Dioleoylphosphatidylethanolamin ist.
  39. Dispersion nach Anspruch 38 worin der molare Prozentsatz des im wesentlichen ungiftigen biologisch abbaubaren Aminderivats von Cholesterin in der Dispersion 20 bis 50% ist.
  40. Dispersion nach Anspruch 39 worin der molare Prozentsatz des im wesentlichen ungiftigen biologisch abbaubaren Aminderivats von Cholesterin in der Dispersion 50% ist.
  41. Dispersion nach Anspruch 38 welche in destilliertem Wasser, normaler Kochsalzlösung oder gepufferter Kochsalzlösung ist.
  42. Dispersion nach Anspruch 38 worin die Partikel in der wässerigen Dispersion einen mittleren Durchmesser von ungefähr 150 nm haben.
  43. Dispersion nach Anspruch 29 welche Nukleinsäure beinhaltet.
  44. Dispersion nach Anspruch 43 worin die Nukleinsäure DNA ist.
  45. Dispersion nach Anspruch 44 worin die Dispersion Säugetier-DNA enthält.
  46. Die Dispersion nach Anspruch 44 worin das im wesentlichen ungiftige biologisch abbaubare Aminderivat von Cholesterin 3β[N-(N',N'-dimethylaminoethan)carbamoyl]-cholesterin ist.
  47. Dispersion nach Anspruch 29 worin in dem im wesentlichen ungiftigen biologisch abbaubaren Aminderivat von Cholesterin der Spacer wenigstens ein Stickstoffatom enthält.
  48. Dispersion nach Anspruch 47 worin in dem im wesentlichen ungiftigen biologisch abbaubaren Aminderivat von Cholesterin der Spacer ein Sauerstoffatom enthält.
  49. Dispersion nach Anspruch 47 worin in dem im wesentlichen ungiftigen biologisch abbaubaren Aminderivats von Cholesterin der Spacer -(CH2)2- ist.
  50. Dispersion nach Anspruch 29 worin das im wesentlichen ungiftige biologisch abbaubare Aminderivat von Cholesterin ein quaternäres Ammoniumsäuresalz ist.
  51. Dispersion nach Anspruch 29 worin im das wesentlichen ungiftige biologisch abbaubare Aminderivat von Cholesterin mehr als eine kationische Aminogruppe hat.
  52. Dispersion nach Anspruch 29 worin das im wesentlichen ungiftige biologisch abbaubare Aminderivat von Cholesterin eine einzige tertiäre Aminogruppe hat.
  53. Dispersion nach Anspruch 52 worin das im wesentlichen ungiftige biologisch abbaubare Aminderivat von Cholesterin 3β[N-(N',N'-dimethylaminoethan)carbamoyl]-cholesterin ist.
  54. Dispersion nach Anspruch 29 worin das im wesentlichen ungiftige biologisch abbaubare Aminderivat von Cholesterin 3β[N-(polyethylenimin)carbamoyl]-cholesteryl ist.
  55. Dispersion nach Anspruch 29 worin das im wesentlichen ungiftige biologisch abbaubare Aminderivat von Cholesterin 3β[N-(N',N'-dimethylaminoethan)carbamoyl]-cholesterin ist.
  56. Dispersion nach Anspruch 29 worin in dem im wesentlichen ungiftigen biologisch abbaubaren Aminderivat von Cholesterin die Aminogruppe tertiär ist.
  57. Dispersion nach Anspruch 29 worin in dem im wesentlichen ungiftigen biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin der Spacer eine primäre Aminogruppe enthält.
  58. Dispersion nach Anspruch 29 worin in dem im wesentlichen ungiftigen biologisch abbaubaren Aminderivat von Cholesterin der Spacer verbunden ist mit einer Aminogruppe ausgewählt aus primären und sekundären Aminogruppen.
  59. Dispersion nach Anspruch 43 worin das im wesentlichen ungiftige und biologisch abbaubare Aminderivat von Cholesterin Cholesteryl-3β-carboxyamidoethylenamin, Cholesteryl-3β-oxysuccinamidoethylendimethylamin, Cholesteryl-3β-oxysuccinamidoethylentrimethylammonium-Jodid, 1-Dimethylamino-3-trimethylammonio-DL-2-propyl-cholesteryl-3β-oxysuccinat-Jodidsalz, 2-([2-(Dimethylamino)ethyl)methylamino)ethyl-cholesteryl-3β-oxysuccinat, 3β[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)carbamoyl]cholesterin, oder 3β[N-(Polyethylenimin)carbamoyl]cholesterin ist.
  60. Eine Methode zum Erleichtern des Transfers von Nukleinsäure in Säugetierzellen mit einer wässerigen Dispersion, welche ein neutrales Lipid enthält welches, wenn es eine Acylgruppe enthält, ein nichtgesättigtes Lipid ist, und ein im wesentlichen ungiftiges und biologisch abbaubares Aminderivat von Cholesterin enthält mit einer Cholesterylgruppe, einem Linker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus
    Figure 00380001
    NH-C(=O)-*, und -O-(=O)C-*, welcher Linker mit der mit einem Stern markierten Seite verbunden ist zur Position 3 der Cholesterylgruppe und mit der anderen Seite durch den Stickstoff oder den Kohlenstoff zu einem Spacer mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen in einer verzweigten oder unverzweigten Alkylkette, welche wenigstens eines der folgenden Heteroatome: Sauerstoff oder Stickstoff enthält oder nicht enthält, und auf seiner anderen Seite verbunden ist mit einer kationischen Aminogruppe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus primären, sekundären, tertiären und quaternären Aminogruppen welche Methode beinhaltet Mischen besagter wässerigen Dispersion mit der Nukleinsäure, wobei ein Dispersion/Nukleinsäurekomplex gebildet wird, und Inkubieren der zu transfektierenden Säugetierzellen mit dem Komplex wodurch der Transfer der Nukleinsäure in die Zellen erleichtert wird.
  61. Methode nach Anspruch 60 worin, das im wesentlichen ungiftige biologisch abbaubare Aminderivat von Cholesterin ein kationisches Lipid ist.
  62. Methode nach Anspruch 61 worin in dem im wesentlichen ungiftigen biologisch abbaubaren Aminderivat von Cholesterin, der
    Figure 00390001
  63. Methode nach Anspruch 61 worin in dem im wesentlichen ungiftigen biologisch abbaubaren Aminderivat von Cholesterin der Linker -NH-C(=O)-* ist.
  64. Methode nach Anspruch 61 worin in dem im wesentlichen ungiftigen biologisch abbaubaren Aminderivat von Cholesterin der Linker -O-(=O)C-* ist.
  65. Methode nach Anspruch 61 worin die Dispersion einen alkalischen pH hat.
  66. Methode nach Anspruch 61 worin in dem im wesentlichen ungiftigen biologisch abbaubaren Aminderivat von Cholesterin der Spacer -(CH2)2-* ist.
  67. Methode nach Anspruch 61 worin in dem im wesentlichen ungiftigen biologisch abbaubaren Aminderivat von Cholesterin die Aminogruppe tertiär ist.
  68. Methode nach Anspruch 61 worin das neutrale Lipid Phosphatidylethanolamin ist.
  69. Methode nach Anspruch 68 worin das Phosphatidylethanolamin Dioleoylphosphatidylethanolamin ist.
  70. Methode nach Anspruch 68 worin das im wesentlichen ungiftige und biologisch abbaubare Aminderivat von Cholesterin 3β[N-(N',N'-dimethylaminoethan)-carbamoyl]-cholesterin ist.
  71. Methode nach Anspruch 70 worin im wesentlichen ungiftiges und biologisch abbaubaress Aminderivat von Cholesterin 3β[N-(N',N'-dimethylaminoethan)-carbamoyl]-cholesterin und das neutrale Lipid Dioleoylphosphatidylethanolamin ist.
  72. Methode nach Anspruch 71 worin der molare Prozentsatz des im wesentlichen ungiftigen biologisch abbaubaren Aminderivats von Cholesterin in der Dispersion 20 bis 50% ist.
  73. Methode nach Anspruch 72 worin der molare Prozentsatz des im wesentlichen ungiftigen biologisch abbaubaren Aminderivats von Cholesterin in der Dispersion 50% ist.
  74. Methode nach Anspruch 71 worin die Dispersion in destilliertem Wasser, normaler Kochsalzlösung oder gepufferter Kochsalzlösung ist.
  75. Dispersion nach Anspruch 71 worin die Partikel in der wässerigen Dispersion einen mittleren Durchmesser von ungefähr 150 nm haben.
  76. Methode nach Anspruch 61 worin die wässerige Dispersion Nukleinsäure beinhaltet.
  77. Methode nach Anspruch 76 worin die Nukleinsäure DNA ist.
  78. Methode nach Anspruch 77 worin die DNA Säugetier-DNA ist.
  79. Methode nach Anspruch 61 worin das im wesentlichen ungiftige biologisch abbaubare Aminderivat von Cholesterin 3β[N-(N',N'-dimethylaminoethan)carbamoyl]-cholesterin ist.
  80. Methode nach Anspruch 79 worin die wässerige Dispersion Nukleinsäure beinhaltet.
  81. Methode nach Anspruch 80 worin die Nukleinsäure DNA ist.
  82. Methode nach Anspruch 81 worin die Dispersion Säugetier-DNA beinhaltet.
  83. Methode nach Anspruch 61 worin das im wesentlichen ungiftige und biologisch abbaubare Aminderivat von Cholesterin Cholesteryl-3β-carboxyamidoethylenamin, Cholesteryl-3β-oxysuccinamidoethylendimethylamin, Cholesteryl-3β-oxysuccinamidoethylentrimethylammonium-Jodid, 1-Dimethylamino-3-trimethylammonio-DL-2-propyl-cholesteryl-3β-oxysuccinatjodsalz, 2-([2-(Dimethylamino) ethyl]methylamino)ethyl-cholesteryl-3β-oxysuccinat, 3β[N-(N',N'-Dimethylaminoethan)-carbamoyl]cholesterin oder 3β[N-(Polyethylenimin)-carbamoyl]cholesterin ist.
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