DE69332976T2

DE69332976T2 - Digitale analytische nachweisvorrichtung

Info

Publication number: DE69332976T2
Application number: DE69332976T
Authority: DE
Inventors: Fritz Allen; Thomas Niemczyk
Original assignee: Acrogen Inc Oakland; Acrogen Inc
Current assignee: Acrogen Inc Oakland; Acrogen Inc
Priority date: 1992-07-23
Filing date: 1993-07-16
Publication date: 2004-05-19
Anticipated expiration: 2013-07-17
Also published as: DE69332976D1; WO1994002831A1; JPH07509314A; US5488567A; EP0651879B1; EP0651879A4; JP3954089B2; ATE240515T1; US5329461A; EP0651879A1

Description

Technisches Gebiet
Diese Erfindung gehört zum technischen Gebiet der optischen Verfahren für chemische Analysen.
Hintergrund
Chemische Analysen, welche die Detektion und Quantifizierung von Licht umfasst, werden in verschiedensten Situationen eingesetzt. Eine Anwendung besteht in der Detektion von Analyten zur Bestimmung der Gegenwart oder der Menge eines bestimmten Analyten. Viele Tests auf Analyten konzentrieren sich entweder auf die Absorption oder die Abgabe von Licht (z. B. Fluoreszenz oder Chemolumineszenz). In vielen Situationen wird eine Probe zuerst mit Licht bestrahlt, und dann wird versucht, die Wirkung der Probe auf das durchfallende oder abgegebene Licht zu detektieren. Resultiert abgegebenes Licht aus Bestrahlung, so können Nichtanalytmoleküle ebenfalls Licht abgeben, was zu einem relativ starken Hintergrundrauschen führt, was wiederum zum Entstehen eines wesentlichen Fehlers in der Messung der Wirkung der Probe auf das Licht führt. Außerdem gibt es zusätzlich systematische Fehler, die gemeinsam zum Rauschen im Zusammenhang mit der Messung beitragen.
Die Qualität chemischer Messungen, die Licht involvieren, kann durch das Verhältnis zwischen einer geeigneten Messung des optischen Signals von einer Probe aufgrund des Vorhandenseins eines Analyten und der Rauschschwankung, die dem Signal von Natur anhaftet, definiert werden. Anstrengungen, dieses Signal-Rausch- (S/N-) Verhältnis zu erhöhen, haben sich im Allgemeinen auf die Verbesserung der Empfindlichkeit eines Messgeräts konzentriert, um so die "Nachweisgrenze" eines bestimmten Analyten zu reduzieren. Die Nachweisgrenze bezieht sich auf die Analytkonzentration in einer Probe, über der das Signal, das dem Vorhandensein eines Analyten zugeordnet werden kann, so aussieht, dass ein gewünschtes S/N-Verhältnis erzielt werden kann. In der Praxis wird diese Nachweisgrenze durch Durchführung eines Versuchsverfahrens bestimmt, das da zu ausgerichtet ist, ein optisches Signal in Zusammenhang mit der Analytkonzentration hervorzurufen. Genauer gesagt werden Daten in Zusammenhang mit der Signal- und Rauschintensität in einer Eichkurve für eine Reihe von Analytkonzentrationen aufgetragen, wodurch eine einfache Bestimmung der Nachweisgrenze ermöglicht wird.
Die Bestimmung der Konzentration in unbekannten Proben erfolgt, indem das Signal, das durch einen Versuch aus der unbekannten Probe erhalten wurde, mit der Eichkurve verglichen wird. Eine typische Konzentrationseinheit für chemische Messungen ist Mol/ Liter [d. h. Molarität (m)], worin ein Mol als Avogadro'sche Zahl (6,0225 × 10²³) definiert ist. Unglücklicherweise weisen sogar die empfindlichsten herkömmlichen Versuchsverfahren Nachweisgrenzen im Bereich von etwa einem Femtomol (fMol) oder fast einer Milliarde Analyten pro Liter, auf.
Messungen, bei denen die Konzentration unter Bezugnahme auf eine Eichkurve bestimmt wird, können als von Natur aus eher "analog" als "digital" bezeichnet werden. Das heißt, zuerst wird von der Messvorrichtung ein Signal erzeugt, das mit der Analytkonzentration in Wechselbeziehung steht. Dann wird die Eichkurve hinzugezogen, um eine Approximation der Analytkonzentration zu erhalten. Da die Eichkurve fortlaufend als Funktion der Konzentration dargestellt sein kann, ist die aus der Eichkurve abgelesene Konzentration normalerweise keine ganze Zahl. Im Gegensatz dazu sind Messdaten im digitalen Bereich häufig als binäre (d. h. aus zwei Einheiten bestehende) Signale dargestellt, die auf eindeutige Weise bestimmte ganze Zahlen darstellen. Demgemäß besteht ein grundlegender Unterschied zwischen analogen und digitalen Messformen darin, dass der Zusatz eines einzigen zusätzlichen Analyten zu einer Probe, die unter Einsatz analoger Mittel analysiert wird, nicht eindeutig detektiert werden kann. Obwohl beeindruckende Verbesserungen in der Genauigkeit von chemischen Messungen erreicht wurden, basieren solche Fortschritte auf den im Grunde analogen Konzepten der Signalverstärkung und Rauschverringerung.
Bei Molekülproben mit geringen Analytkonzentrationen würde ein digitales Messverfahren zumindest zwei Vorteile mit sich bringen: (i) ein Verweis auf eine Eichkurve wäre notwendig, und (ii) könnte der Zusatz eines einzigen zusätzlichen Moleküls zu einer Probe detektiert werden. Solche ein digitales Verfahren wäre für Proben nützlich, bei denen die Analytkonzentration ausreichend gering ist, so dass statistisches Rauschen, das mit jedem binären Messwert verbunden ist, geringer als die Differenz zwischen aufeinander folgenden ganzen Zahlen bleibt. Demgemäß besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung eines optischen Verfahrens zur Bestimmung geringer Analytkonzentrationen mithilfe eines unbezogenen digitalen Messverfahrens.
Einschlägige Literatur
Whitten et al., Anal., Chem. 63, 1027–1031 (1991), beschreiben die Detektion von Rhodamin-6G-Molekülen unter Einsatz eines Lasers zur Anregung der Fluoreszenz von elektrodynamisch schwebenden Mikrotröpfchen.
Stevenson et al., Applied Spectroscopy 46 (3), 407–419 (1992), erläutern theoretische Überlegungen zu Laserspektroskopieverfahren, die zur Detektion einzelner Atome oder Moleküle im Laserstrahl fähig sind.
Nguyen et al., J. Optical Society of America 4 (2), 138–143 (1987), offenbaren ein Gerät zur Detektion von fluoreszierenden Spezies in hydrodynamisch fokussierten Strömungen.
Tou et al., "Pattern Recognition Principles", Kap. 3 und 7 (1974) (ISBN 0-201-07587-3), erläutern Verfahren zur Bestimmung charakteristischer Prototypen oder Clusterzentren aus einem gegebenen Datensatz. Verfahren zur Muster-Vorverarbeitung und Merkmalselektion werden ebenfalls beschrieben.
Die US-A-4.612.614 beschreibt ein System zur Analyse von Teilchen in einer Probe. Die Probe strömt über eine größere Fläche, so dass immer nur ein kleiner Teil unter einem Mikroskop vorbeifließt, durch das in bestimmten Zeitabständen Bilder gemacht werden. Jedes optische Bild wird in ein elektronisches Bild umgewandelt, wobei die elektronischen Bilder nach visuellen Merkmalen geordnet dargestellt werden.
Die US-A-4 758 727 beschreibt ein Gerät und ein Verfahren zur Messung geringer laserinduzierter Fluoreszenz, wobei ein Lichtstrahl über ein Ziel bewegt und Fluoreszenzlicht, das im Ziel induziert wird, gemessen wird, um die räumliche Verteilung der Licht abgebenden Teilchen zu bestimmen.
Hierin werden ein System und ein Verfahren zum digitalen Detektieren des Vorhandenseins von Analytteilchen in einer Molekülprobe offenbart. Jedes Analytteilchen ist bereit, bei Stimulierung (z. B. Beleuchtung) auf bekannte Weise eine optisch detektierbare Reaktion zu emittieren. Zur Stimulierung von Fluoreszenz, im Gegensatz zu Chemolumineszenz, umfasst das digitale Analytendetektionssystem ein optisches Gerät zur Beleuchtung einer Vielzahl unterschiedlicher Pixelbereiche in der Probe, um jedes der Analytteilchen darin dazu zu bringen, ein optisches Signal, d. h. Photonen, abzugeben. Die Pixelbereiche sind so bemessen, dass die Anzahl der in jedem der Pixelbereiche enthaltenen Analytteilchen ausreichend gering ist, so dass das gesamte optische Signal jeder Region geringer ist als eine maximale Detektionsschwelle, die proportional zur Veränderlichkeit der optischen Reaktionen ist.
Das digitale Detektionssystem umfasst des Weiteren ein Gerät zu Messen des optischen Signals, das von jedem Pixelbereich abgegeben wird. Ein Datenverarbeitungsnetzwerk empfängt die Messungen der optischen Signale und zählt die Anzahl der Analytteilchen in jedem Pixelbereich von diesen Messungen ausgehend, um die Anzahl der Analytteilchen in der Probe zu bestimmen.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein System zum Detektieren des Vorhandenseins einer geringen Anzahl von Analytteilchen in einer Probe bereitgestellt, wobei das System Folgendes umfasst:
ein Mittel zum Teilen der Probe in eine Vielzahl unterschiedlicher Pixelbereiche;
ein Mittel zum Messen abgegebener Signale aus jedem der Pixelbereiche in Bezug auf eine Umgebungsrauschschwelle, wobei das abgegebene Signal von jedem Pixelbereich proportional zu den optischen Reaktionen des darin enthaltenen Analyten ist und das abgegebene Signal von jedem Pixelbereich mit der darin enthaltenen Analytenmenge in Zusammenhang steht;
worin das System weiters Datenverarbeitungsmittel zum Aufnehmen der Messungen und, auf Basis der Messungen und einer Annahme, dass die Pixelbereiche so dimensioniert sind, dass die Anzahl der in jedem der Pixelbereiche enthaltenen Analytteilchen geringer als eine maximale Detektionsschwelle proportional zur Schwankung in der von den Analytteilchen abgegebenen optischen Reaktionen ist, zum Zählen der Anzahl an Analytteilchen in jedem der Pixelbereiche umfasst, um die Anzahl der Analytteilchen in der Probe zu bestimmen.
Gemäß einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein System zum Detektieren des Vorhandenseins einer kleinen Anzahl von Analytteilchen in einer Probe bereitgestellt, wobei das System Folgendes umfasst:
ein Mittel zum Beleuchten der Probe;
ein Mittel zum Auffangen und Messen optischer Signale, die von der Probe abgegeben werden, in Bezug auf eine Umgebungsrauschschwelle, wobei die abgegebenen Signale proportional zum Licht sind, das vom Analyten abgegeben wird, der im beleuchteten Abschnitt der Probe enthalten ist, wobei die Menge des abgegebenen Lichts mit der Menge an Analyt im Abschnitt der Probe in Zusammenhang steht;
worin das System weiters ein Datenverarbeitungsmittel umfasst, um die Messungen aufzunehmen und auf Basis der Messungen und einer Annahme, dass die Anzahl der in der Probe enthaltenen Analytteilchen unter einer maximalen Detektionsschwelle proportional zur Schwankung der von den Analytteilchen abgegebenen optischen Reaktionen ist, die Anzahl der Analytteilchen in der Probe zu zählen.
Gemäß einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Detektieren des Vorhandenseins einer kleinen Anzahl an Analytteilchen innerhalb einer Probe bereitgestellt, folgende Schritte umfassend:
das Teilen der Probe in eine Vielzahl unterschiedlicher Pixelbereiche, wo in jedem der Pixelbereiche abgegebenes Licht mit der Analytenmenge in jedem der Pixelbereiche in Zusammenhang steht, wobei jeder der Pixelbereiche so dimensioniert ist, dass die Anzahl der in jedem der Pixelbereiche enthaltenen Analytteilchen geringer ist als eine maximale Detektionsschwelle proportional zur Schwankung der optischen Reaktionen, die von den Analytteilchen abgegeben werden;
das Messen der abgegebenen Signale von jedem der Pixelbereiche in Bezug auf eine Umgebungsrauschschwelle, worin das abgegebene Signal von jedem Pixelbereich proportional zu den optischen Reaktionen von darin enthaltenen Analytteilchen ist; und
das Zählen der Anzahl an Analytteilchen innerhalb jedes der Pixelbereiche auf Basis der Messungen, um die Anzahl der Analytteilchen in der Probe zu bestimmen.
Gemäß einem vierten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum digitalen Detektieren des Vorhandenseins von molekularen Analytteilchen innerhalb einer Probe bereitgestellt, in der jedes Analytteilchen so angeordnet ist, dass es eine optische Reaktion aussendet, wenn es auf vorbestimmte Weise beleuchtet wird, worin die Konzentration der Analytteilchen eine solche ist, dass die Anzahl derartiger Analytteilchen unter einer maximalen Detektionsschwelle proportional zur Veränderlichkeit der optischen Reaktionen liegt, folgende Schritte umfassend:
das Beleuchten der Probe, um die Analytteilchen dazu zu bringen, die optischen Reaktionen auszusenden;
das Auffangen eines abgegebenen Signals, das aus den optischen Reaktionen besteht; und
das Messen des aufgefangenen abgegebenen Signals und Vergleichen des gemessenen ausgesandten Signals mit einer Detektionsschwelle, um die Anzahl an Analytteilchen in der Probe zu zählen.
Gemäß einem fünften Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Lokalisieren und Zählen diskreter Einheiten innerhalb einer chemischen Probe bereitgestellt, wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst:
das Teilen der Probe in eine Vielzahl unterschiedlicher Pixelbereiche, wo Licht, das in jedem der Pixelbereiche ausgesandt wird, mit der Menge an Analytteilchen in jedem der Pixelbereiche in Zusammenhang steht, wobei jeder der Pixelbereiche so dimensioniert ist, dass die Anzahl an chemischen Einheiten, die in jedem der Pixelbereiche vorhanden sind, geringer als eine maximale Detektionsschwelle proportional zur Schwankung an optischen Reaktionen ist, die von den chemischen Einheiten abgegeben werden;
das Messen abgegebener Signale aus jedem der Pixelbereiche relativ zu einer Umgebungsrauschschwelle, worin das abgegebene Signal von jedem Pixelbereich proportional zu den optischen Reaktionen darin enthaltender chemischer Einheiten ist;
auf Basis der Messungen das Ableiten eines Feldes von Messwerten, die das Vorhandensein und Fehlen der Einheiten in jedem der entsprechenden Pixelbereiche der Probe angeben;
das Sortieren der Messwerte entsprechend des angegebenen Vorhandenseins der Einheiten;
das Auswählen eines Pixelbereichs, der einem ersten der Messwerte entspricht, als Kern eines ersten Pixelclusters; und
das Gruppieren von Pixelbereichen, die den sortierten Messwerten entsprechen, zum ersten Pixelcluster, worin der erste Pixelcluster vordefinierte Größenkriterien erfüllt und das Vorhandensein zumindest einer der Einheiten anzeigt.
KURZBESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 ist ein Blockdiagramm einer bevorzugten Ausführungsform des digitalen molekularen Analytendetektionssystems gemäß vorliegender Erfindung.
2 zeigt eine schematische Seitenansicht einer bevorzugten Implementierung eines empfindlichen Lichtdetektionsgeräts, das im Detektionssystem gemäß vorliegender Erfindung enthalten ist.
3 zeigt, wie eine zu analysierende Probe in eine zweidimensionale Anordnung von aneinander grenzenden Pixelbereichen geteilt wird.
4 ist eine Draufsicht auf eine erste alternative Implementierung des empfindlichen Lichtdetektionsgeräts.
5 ist eine Draufsicht auf eine zweite alternative Implementierung des empfindlichen Lichtdetektionsgeräts.
6 zeigt eine dritte alternative Implementierung des empfindlichen Lichtdetektionsgeräts.
7 ist ein Ablaufdiagramm des Pixelclusterverfahrens, das im digitalen Detektionsverfahren gemäß vorliegender Erfindung zum Einsatz kommt.
BESCHREIBUNG SPEZIFISCHER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Ein Gerät und Verfahren zum digitalen Detektieren des Vorhandenseins geringer Konzentrationen von molekularen Analytteilchen in einer Probe werden bereitgestellt. Wie weiter unten erläutert bezieht sich der Begriff Analytteilchen auf die Kombination aus einem molekularen Analyten von Interesse und einer geeigneten homogenen Markierung, die bei Stimulierung zur Abgabe von Licht bereit ist. Solche Teilchen können jede Einheit sein, die detektiert werden kann, einschließlich solcher, die so klein sind wie ein DNA-Makromolekül oder ein Polysaccharid, oder solcher, die so groß sind wie beispielsweise ein Latexteilchen. Bei großen Teilchen können jedoch auch andere Detek tionsverfahren mit gleicher Effizienz eingesetzt werden. Das Gerät kann geringe Mengen abgegebenen Lichts von einer Vielzahl von Pixelbereichen in der Probe detektieren, wobei das von jedem Pixelbereich abgegebene Licht durch Stimulierung eines darin enthaltenen Analytteilchens hervorgebracht wird. Das abgegebene Licht wird digital analysiert, um die ganzzahlige Anzahl von Analyten in jedem Pixelbereich zu bestimmen.
Die Emission von Photonen kann erreicht werden, indem Fluorophore in ihrem Absorptionsbereich bestrahlt werden, oder durch chemische oder physikalische Stimulierung von chemolumineszenten Markierungen, die bei Bestrahlung oder geeigneter chemischer Umsetzung Licht abgeben. Meistens ist Fluoreszenz geeigneter und wird daher bevorzugt. Folglich wird zum Zweck der Beschreibung der vorliegenden Erfindung das Fluoreszenzverfahren beschrieben. Beim Fluoreszenzverfahren umfasst die Vorrichtung Mittel zum Bestrahlen der Probe, um Fluoreszenz hervorzurufen. Das Bestrahlungsmittel muss nicht unbedingt Chemolumineszenz auslösen, da eine Stimulierung durch Zusatz eines chemischen Reagens erreicht werden kann. Wenn ein chemisches Reagens eingesetzt wird, muss bei der Messung darauf geachtet werden, die Messung auf die seit dem Einmischen vergangene Zeit zu beziehen. Andererseits kann auch die Veränderung der Emissionsgeschwindigkeit über einen bestimmten Zeitraum überwacht werden. Zum Zweck der vorliegenden Erfindung kann dass optische Signal von Chemolumineszenz dem optischen Signal von Fluoreszenz gleichgesetzt werden.
Vor allem bei Fluoreszenzmessungen wird parallel gerichtetes Licht eines engen Wellenlängenbereichs auf jeden Pixelbereich in der Probe gerichtet. Die Intensität des abgegebenen Lichts liegt in diskreten Bereichen in Bezug auf die Anzahl von Analytteilchen in jedem Pixelbereich. Das abgegebene Licht wird dann mithilfe eines Auffangsystems für diskrete Elemente aufgefangen und zur Quantisierung und Analyse zu einem Lichtdetektor geleitet. Ein Auffangsystem für diskrete Elemente ist eine Anordnung von diskreten optischen Elementen, die so angeordnet sind, dass sie Licht von der Probe in einen quasiparallelen Strahl brechen oder reflektieren. Ein Beispiel für solch einen Auf fänger ist eine Fresnel-Linsen/Reflektor-Anordnung mit geringer Blendenzahl des Typs, der von 3M Corporation (Minneapolis, MN) hergestellt wird.
1 zeigt eine bevorzugte Ausführungsform des digitalen Analytendetektionssystems 10 der vorliegenden Erfindung, die ein Universalcomputersystem 100 umfasst, das zur Analyse von Messdaten dient, die mithilfe eines empfindlichen Lichtdetektionsgeräts 101 gesammelt wurden. Das Computersystem 100 umfasst eine Zentraleinheit (CPU) 102, die über einen Systembus mit einem Sekundärspeicher 106 (z. B. einer Magnetplatten-Speichervorrichtung), einem Primärspeicher 112 (d. h. einem Hochgeschwindigkeits-RAM-Speicher) und einer oder mehreren Benutzeroberflächen 120 verbunden ist. Jede Benutzeroberfläche 120 umfasst typischerweise ein Display oder einen Monitor 121, eine Tastatur 122 und eine Mauseingabevorrichtung 123 mit einer Elementauswahltaste 124.
Im Primärspeicher 112 sind ein Datenfeld 126 sowie eine Reihe von Computerprogrammen (Software) gespeichert, die zur Implementierung des digitalen Detektionsverfahrens gemäß vorliegender Erfindung dienen. Die im Primärspeicher 112 gespeicherte Software umfasst unter anderem eine Instrumentenwartungsprogramm 128 zur Steuerung des Lichtdetektionsgeräts 101. Außerdem sind im Primärspeicher 112 eine Reihe von Datenanalyseprogrammen gespeichert, die weiter unten im Detail erläutert werden. Eine Datenclusteringschema-vereinfachende Detektion von Analytteilchen umfasst eine Hintergrund/Rauschschwellenroutine 132, eine Datensortierroutine 136 und eine Clustersyntheseroutine 140.
Das empfindliche Lichtdetektionsgerät 101 umfasst typischerweise ein optisches System, das jenem im US-Patent Nr. 5.315.375, erteilt am 24. Mai 1994, mit dem Titel "Empfindliches Lichtdetektionssystem", das durch Verweis hierin aufgenommen ist, im Wesentlichen ähnelt. Wie oben erwähnt dient das Gerät 101 zum Beleuchten einer Vielzahl von Pixelbereichen in einer Probe von Analytteilchen, um Fluoreszenz der Analytteilchen in jeder Region hervorzurufen. Das Licht (optische Reaktion), das bei Bestrah lung von jedem Analytteilchen für einen vorbestimmten Zeitraum mit bekannter Intensität abgegeben wird, wird zu einem Detektor geleitet, der dazu dient, als Reaktion darauf ein elektrisches Detektionssignal zu erzeugen. Die Stärke des Detektionssignals, das jedem Pixelbereich entspricht, wird dann im Datenfeld 126 gespeichert.
2 zeigt eine schematische Seitenansicht einer bevorzugten Implementierung eines empfindlichen Lichtdetektionsgeräts 101. Das Gerät 101 weist einen Laserstrahl 212 auf, der durch eine erste Linse 214 geleitet wird, die den Laserstrahl erweitert und den Strahl zu einer zweiten Linse 216 weiterleitet, wo der Strahl wieder parallel gerichtet wird. Der parallel gerichtete Strahl wird dann durch eine verstellbare Öffnung 218 geleitet, um den Durchmesser des Strahls zu definierten, und schließlich durch die Fokussierlinse 220 geführt. Die Fokussierlinse 220 ist auf einem Gerüst, das nicht dargestellt ist, montiert, auf dem die Fokussierlinse 220 entlang der optischen Achse bewegt werden kann, um den Strahldurchmesser zu verändern, während er auf die Probe fällt. Der Laserstrahl 212 tritt aus der Fokussierlinse 220 aus und wird von einem ersten Oberflächenspiegel 222 reflektiert. Dann tritt das Licht durch eine Öffnung 224 im Auffangsystem für diskrete Elemente 226, das eine erste Auffanglinse für diskrete Elemente 228 zum Auffangen des abgegebenen Lichts und eine zweite Auffanglinse für diskrete Elemente 230 zum Fokussieren des Lichts umfasst. Gewöhnlich ist die Brennweite der ersten Auffanglinse für diskrete Elemente, die eine Struktur wie eine Fresnel-Linse aufweist, wesentlich geringer als die Brennweite der zweiten Linse (die eine Fresnel-Linse sein kann oder auch nicht) und beträgt im Allgemeinen weniger als etwa 60% der Brennweite der zweiten Linse. Der Auffangwinkel für die erste Auffanglinse für diskrete Elemente beträgt normalerweise für direkte Abgabe zumindest etwa 90°. Das abgegebene fokussierte Licht wird dann zu einer zweiten Linse 232 geleitet und durch eine Filterpackung 234 geschickt, die dazu dient, Licht außerhalb des Wellenlängenbrereichs des Lichts, das von der Fluorophormarkierung in jedem Analytteilchen abgegeben wird, herauszufiltern. Die Filterpackung kann so aufgebaut sein, dass eine Wellenlängenisolierung durch beispielsweise herkömmliche optische Filter, Monochromatoren oder Zeitdurchlassverfahren erzielt wird. Das Licht der gewünschten Wellenlänge wird dann mit hilfe einer Photomultiplierröhre und eines Vorverstärkers 236 detektiert, um es zur Analyse in einen elektronischen Schaltkreis zu schicken.
Die Probe 238 befindet sich auf einem Koordinatentisch 240, der es dem einfallenden Licht erlaubt, jeden darin enthaltenen Pixelbereich zu beleuchten. Wie in 3 dargestellt und weiter unten im Detail erläutert, ist die Probe 238 vorzugsweise in eine zweidimensionale Anordnung von aneinander grenzenden Pixelbereichen 246 unterteilt. Die Pixelbereiche 246 werden klein genug gewählt, so dass im Allgemeinen in jedem Pixelbereich weniger als eine gewünschte Anzahl (z. B. zwei) der Analytteilchen vorhanden sind. Beispielsweise kann das Volumen der zu analysierenden Probe so gewählt sein, dass etwa fünf Pixelbereiche pro Analytteilchen vorhanden sind. Bei solch einem Verhältnis ist die Wahrscheinlichkeit sehr hoch, dass die gesamte Fluoreszenzenergie (abgegebenes Signal), die von den Analytteilchen in jedem Pixelbereich erzeugt wird, ausreichend gering ist, dass die statistische Schwankung darin geringer bleibt als die optische Reaktion eines einzelnen Analytteilchens. Wenn jedoch keine hundertprozentige Präzision erforderlich ist, kann ein Probenvolumen gewählt werden, das zu einem geringeren Verhältnis zwischen Pixelbereichen und Analytteilchen führt. Die Anzahl an Analytteilchen innerhalb eines gegebenen Pixelbereichs wird bestimmt, indem die ganze Zahl ausgemacht wird, die dem Verhältnis zwischen dem abgegebenen Signal vom Pixelbereich und einer optischen Reaktion am nähesten kommt. Diese Gruppe von ganzen Zahlen wird im Datenfeld 126 gespeichert und kann summiert werden, um eine digitale Bestimmung der Zahl von Analytteilchen in der Probe 238 zu ermöglichen. Ein Schrittmotor 242 (2) wird bereitgestellt, um die Probe 238 mithilfe des Instrumentenwartungsprogramms 128 in die X- und Y-Richtung exakt bewegen zu können.
Der Koordinatentisch 240 kann beispielsweise aus einem zweiachsigen Verschiebetisch Modell 405 zusammengestellt werden. Eine geeignete Modifikation würde die Unterbringung einer Leitspindel mit 20 Windungen pro Zoll, die aus einer 1/4 Zoll – 20-lagiger Edelstahl-Gewindestange hergestellt wurde, umfassen. Der Einsatz von zwei Schrittmotoren stellt 3,175 Mikrometer linearen Transport pro Schritt für die X- und die Y-Achse bereit. Der Gesamtweg für X und Y ist auf etwa einen halben Zoll beschränkt. Endschalter an beiden Achsenenden stellen ein Mittel zur Zentrierung des Tischs dar. So wird ein bekannter Bezug x,y von 0,0 geschaffen. Die Bildabtastung der Probe kann dann für Pixelbereiche durchgeführt werden, die seitliche Dimensionen im Bereich von 3,175 Mikrometer aufweisen.
In 4 ist schaubildlich eine erste alternative Implementierung 250 des Lichtdetektionsgeräts mit einer Laserquelle 252, die mit einem Strahlverschluss 254 ausgestattet ist, dargestellt. Der Laserstrahl 256 wird durch einen Netzfilter 258 geleitet und dann von einem Drehspiegel 260 in das Linsensystem reflektiert, das eine Erweiterungslinse 262, eine Parallelrichtlinse 264, eine verstellbare Öffnung 265 und eine Fokussierlinse 266 umfasst, die auf einem von einem Schrittmotor betriebenen Apparatetisch montiert ist. Ein von einem Schrittmotor betriebener Probentisch 270 wird bereitgestellt, um die Probe zu halten und durch Instruktionen vom Instrumentenwartungsprogramm 128 zu bewegen, wobei die Probe mithilfe eines Objektträgers 271, der unter einem beweglichen Auffangsystem für diskrete Elemente 272 positioniert ist (versetzt zur Betriebsposition direkt über der Probe dargestellt), gehalten wird.
Meistens handelt es sich bei der Lichtquelle um einen Laser, wobei die Intensität des Strahls von einer Nennleistung von 1 μW bis etwa 100 mW variieren kann. Die Wellenlänge des Lichts kann stark variieren, je nach Absorptionscharakteristika der Fluoreszenzmarkierung, die in jedem Analytteilchen enthalten ist. Meistens weist das Licht eine Wellenlänge von über 350 nm, üblicherweise 400 nm, und von normalerweise unter 700 nm, meist unter etwa 550 nm, auf. Wünschenswerterweise umfasst jedes Analytteilchen einen Fluoreszenten, der eine große Stokes-Verschiebung bereitstellt, üblicherweise zumindest 20 nm, vorzugsweise zumindest 50 nm.
Um die Strahlgröße zu variieren, kann eine bewegliche Linse verwendet werden, die durch Veränderung der Distanz von der Probe die Strahlgröße verändert. Durch die Ver wendung geeigneter Schrittmotoren können bei jedem Schritt kleinere oder größere Veränderungen des Strahls erzielt werden.
Das Licht, das von jedem Pixelbereich 246 abgegeben wird, wird dann effizient aufgefangen, indem ein Auffangsystem für diskrete Elemente verwendet wird, welches das Auffangen des Lichts und seine Weiterleitung zu einem Lichtdetektor ermöglicht. Das Auffangsystem für diskrete Elemente ist üblicherweise ein mehrere Linsen umfassendes System, bei der die Auffanglinse, die der Probe am nächsten gelegen ist, normalerweise eine geringe Blendenzahl aufweist, gewöhnlich kleiner als etwa 2 und größer als etwa 0,05, üblicherweise im Bereich von etwa 0,075 bis 1,0. Die Auffangsysteme für diskrete Elemente mit geringer Blendenzahl produzieren normalerweise einen hochqualitativen parallel gerichteten Strahl. Durch Verwendung einer zweiten Linse mit etwa demselben Durchmesser und einer größeren Blendenzahl, üblicherweise über 0,5, im Allgemeinen von etwa 1 bis 10, kann das Licht auf dem Auffangsystem fokussiert werden. Die Auffanglinse für diskrete Elemente und die zweite Linse sind im Allgemeinen etwa 0 bis 50 cm voneinander entfernt, liegen jedoch üblicherweise nahe beieinander, mit einem Abstand von 0,1 bis 5 cm. Die Auffanglinse für diskrete Elemente ist üblicherweise zumindest etwa 1 cm² groß und kann eine Fläche von bis zu 1 × 10⁴ cm² aufweisen, ist jedoch normalerweise nicht größer als etwa 500 cm².
Durch Aufnahme eines exakt kugelrunden Reflektors hinter dem Strahler, um das Licht zu reflektieren, das vom Detektor weg und durch die Quelle zurück in das Auffangsystem für diskrete Elemente wandert, kann der Anteil an rechtem Winkel, der in den parallel gerichteten Strahl aufgenommen wird, der aus dem Auffangsystem für diskrete Elemente austritt, verdoppelt werden. Der kugelförmige Reflektor muss einen Kugelradius von der Quelle entfernt und auf der dem Strahler gegenüberliegenden Seite des Auffangsystemsfür diskrete Elemente platziert werden. Für Pixelbereiche der Fläche A sollte der Radius des kugelförmigen Reflektors im Bereich von 10 mal A oder mehr liegen, damit die Quelle in Bezug auf den Reflektor punktförmig bleibt. Wenn das nicht der Fall ist, werden größere Teile des Lichts nicht in die Linse zurück reflektiert.
Der Raumwinkel von Licht, das aufgefangen wird, kann auf Basis des verwendeten Auffangsystems berechnet werden.
Durch Verwendung des oben beschriebenen Systems kann der Raumwinkelanteil, der in einem System mit einem idealen Auffänger aufgefangen wird, bis zu 0,90 betragen, während bei realistischeren Blendenzahlen für den Auffänger für diskrete Elemente von 0,5 bis 0,05 der Raumwinkelanteil im Bereich von etwa 0,26 bis 0,81 liegt.
In einer zweiten alternativen Implementierung des empfindlichen Lichtdetektionssystems, das in 5 ganz allgemein durch die Zahl 300 bezeichnet ist, fällt das Licht nicht im rechten Winkel auf die Probe ein, sondern das einfallende Licht steht in einem anderen Winkel zur Probe. In 5 wird ein Laserstrahl 301, der wie in 2 beschrieben bearbeitet wurde, von einem Reflexspiegel (nicht dargestellt) reflektiert, um ihn durch eine Öffnung 304 im Auffangsystem für diskrete Elemente 306 zu schicken. Das Licht trifft auf die Probe 308 auf und wird von der Probe durch eine Öffnung 310 reflektiert und dann mithilfe eines geeigneten Mittels entfernt. Das von der Probe 308 abgegebene Licht wird durch ein Auffangsystem für diskrete Elemente 306 fokussiert und zur Linse 312 geschickt, um wie vorher für 2 beschrieben bearbeitet zu werden.
In einer dritten alternativen Implementierung des empfindlichen Lichtdetektionssystems, das in 6 ganz allgemein durch die Zahl 350 bezeichnet ist, kommt das auf die Probe einfallende Licht nicht von über der Probe und tritt nicht durch Öffnungen im Auffangsystem für diskrete Elemente, sondern die Probe wird auf einem transparenten Substrat montiert und das einfallende Licht trifft von unten auf die Probe. In 6 wird ein Laserstrahl 351 durch eine erste Linse 352 erweitert, die den Laserstrahl erweitert und zu einer zweiten Linse 354 leitet, wo der Strahl wieder parallel ausgerichtet wird. Der parallel ausgerichtete Strahl wird von einem ersten Oberflächenspiegel 356 reflektiert und zu einer Fokussierlinse 358 geleitet, die auf einem verstellbaren Tisch 360 montiert ist, mithilfe dessen der Strahl auf der Probenebene fokussiert werden kann. Die Probe 362 befindet sich auf einem Koordinatentisch 364, mithilfe dessen jeder Pixelbereich der Probe durch das einfallende Licht separat belichtet werden kann. Ein Schrittmotor 366 wird bereitgestellt, um die Probe 362 mithilfe des Instrumentenwartungsprogramms 128 in die X- und Y-Richtung exakt bewegen zu können.
Nicht absorbiertes Erregerlicht tritt durch das Auffangsystem für diskrete Elemente 368 und wird vom Langpassfilter 370 absorbiert. Andererseits kann der Langpassfilter auch durch einen dichroitischen Spiegel ersetzt werden, der in einem Winkel von 45° zum nicht absorbierten einfallenden Strahl platziert wird und den Strahl vom Detektor weg reflektiert, wo der Lichtstrahl mithilfe eines geeigneten Mittels entfernt werden kann.
Das von der Probe 362 abgegebene Licht wird durch das Auffangsystem für diskrete Elemente 368 fokussiert und durch eine räumliche Öffnung 372 zur Auffanglinse 374 geleitet, um wie oben für 2 beschrieben bearbeitet zu werden.
Merkmale der Analytteilchen
Das digitale Detektionsverfahren der vorliegenden Erfindung kann verwendet werden, um verschiedenste Analyten unter Einsatz von Emissionsspektroskopie, bei der abgegebenes Licht das detektierte Signal darstellt, zu detektieren. Während abgegebenes Licht das Ergebnis von beispielsweise Fluoreszenz, Chemolumineszenz oder Phosphoreszenz ist, bezieht sich der Begriff "optische Reaktion" hierin auf die Lichtabgabe eines einzelnen Analyten, die jedoch induziert sein kann. Der Begriff "abgegebenes Signal" steht hierin für eine Messung der detektierten optischen Reaktionen eines bestimmten Pixelbereichs. Die Probe ist vorzugsweise eine feste Probe, in der eine detektierbare Markierung, die nicht an einen Analyten gebunden ist, durch ein herkömmliches Waschverfahren entfernt werden kann. Außerdem wird der Probenassay gleichmäßig durchgeführt, um sicherzustellen, dass jedes Analytteilchen eine im Wesentlichen identische optische Reaktion erzeugt, wenn sie gleicher Beleuchtungsenergie ausgesetzt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Analytteilchen in jedem Pixelbereich einzeln gemessen, basierend auf diskreten Signaleinheiten, die im Wesentlichen über einer Hintergrundrauschhöhe liegende optische Reaktionen bereitstellen. Das Ausmaß der einzelnen optischen Reaktionen muss groß genug sein, damit das spezielle Lichtdetektionsgerät zwischen optischen Reaktionen und Umgebungsrauschen unterscheiden kann. Eine oder mehrere optische Reaktionen einer Signaleinheit können einem einzelnen Analytteilchen zugeordnet werden, aber die Anzahl der Einheiten ist gering und im Wesentlichen für jedes Analytteilchen ident. Meistens ist die Anzahl der Signaleinheiten pro Analytteilchen eins. Eine Signaleinheit innerhalb eines gegebenen Analytteilchens könnte ein fluoreszierendes Teilchen oder ein in einen Fluoreszenten eingelagertes DNA-Molekül mit bekannter Fluoreszenz sein, das zu reproduzierbarer Produktion fähig ist. Der im Analytteilchen enthaltene Analyt kann ein einzelnes Molekül oder eine Aggregation, wie beispielsweise ein Virus oder eine Zelle, sein.
Das Assaymedium weist geringe Analytkonzentrationen auf, im Allgemeinen im picomolaren Bereich oder weniger, häufig im femtomolaren Bereich oder weniger. Assayvolumen liegen üblicherweise unter etwa 100 μl, häufig unter 10 μl, und können 1 μl oder weniger betragen. Jeder Pixelbereich 246 (3) ist im Allgemeinen nicht größer als 100 μm², üblicherweise nicht größer als etwa 50 μm², und kann, wie oben erwähnt, sogar 10 μm² klein sein. Die Größe jedes Pixelbereichs 246 hängt von der Analytkonzentration, der Geschwindigkeit, mit der jede Probe 238 bearbeitet werden soll, der Leichtigkeit, mit der einzelne optische Reaktionen unterschieden werden können, und dergleichen ab.
Die Assays umfassen normalerweise spezifische Bindungspaare, wobei durch spezifische Bindungspaare darauf abgezielt wird, dass ein Molekül ein komplementäres Molekül besitzt, wobei die Bindung der Elemente des spezifischen Bindungspaars bei einer im Wesentlichen höheren Affinität auftritt als zufällige Komplexbildung. So können spezifische Bindungspaare Haptene und Antigene (als "Liganden" bezeichnet" und komplementäre Bindungselemente, wie beispielsweise Antikörper, Enzyme, Oberflächenmem branproteinrezeptoren, Lektine usw. (im Allgemeinen als "Rezeptoren" bekannt) und Nukleinsäuresequenzen, sowohl natürlich vorkommende als auch synthetische, entweder RNA oder DNA umfassen, wobei zur Vereinfachung Nukleinsäuren im Konzept von spezifischen Bindungselementen enthalten sind, die Liganden und Rezeptoren umfassen.
Bei der Durchführung des Assays sind normalerweise ein Konjugat eines spezifischen Bindungselelments und eine detektierbare Markierung involviert. Wie schon erwähnt ist eine Fluorszenzmarkierung zu bevorzugen, aber andere diskrete Markierungen, die detektiert werden können, umfassen chemolumineszente Markierungen. Verfahren zur Herstellung dieser Konjugate sind in der Literatur allgemein bekannt. Je nach Analyt können verschiedene Versuchsanleitungen verwendet werden, die mit im Handel erhältlichen Reagentien oder modifizierbaren Reagentien in Zusammenhang stehen.
Datenerfassung unter Verwendung eines empfindlichen Lichtdetektionssystems
Wie oben erwähnt ist eine detaillierte Erklärung der Art, wie optisch Reaktionen von jedem Pixelbereich innerhalb einer bestimmten Probe mithilfe des empfindlichen Lichtdetektionsgeräts aufgefangen und quantisiert werden können, im oben genannten US-Patent Nr. 5.315.375 enthalten. Um jedoch die Erklärung des digitalen Detektionsverfahrens gemäß vorliegender Erfindung zu erleichtern, werden nachstehend bevorzugte Implementierungen des Computers, der Elektronik und der Software, die im Lichtdetektionssystem eingesetzt werden, um Daten über ein abgegebenes Signal zu erfassen, dargelegt:
Elektronik
Nach Trennung der Laserbeleuchtung von der optischen Reaktionsenergie mithilfe herkömmlicher optischer Filterverfahren, werden die optischen Reaktionen üblicherweise unter Verwendung einer Photomultiplierröhre (PMT) detektiert. Verwendet wird eine Hamamatsu^® 1477 mit einer Seitenlänge von einem Zoll. Die Röhre ist mit einer Multialkali-Photokathode mit einem UV-Glasfenster ausgestattet und weist eine Photon : Elektron-Verstärkung im Bereich von 5,3 × 10⁶ bei einer Anoden-Kathoden-Spannungsdifferenz von 1.000 Volt auf.
Der Stromausgang der PMT ist direkt mit dem Impulsgenerator-Schaltkreis verbunden, der auf digitale Weise arbeitet. Bei digitalem Betrieb werden einzelne elektronische Impulse als einzelne Photonenereignisse gezählt. Diese Vorgangsweise, auch als Photonenzählverfahren bekannt, ist nur bei geringen Lichtniveaus möglich, bei denen Photonen im Allgemeinen weit genug voneinander entfernt sind, um eine Gleichstromvormagnetisierung zu verhindern. Es wird angenommen, dass die Dimensionen jedes Pixelbereichs ausreichend klein gewählt sind, so dass solche eine Gleichstromvormagnetisierung, die üblicherweise in Zusammenhang mit optischer Reaktionsenergie höherer Intensität auftritt, nicht stattfindet.
Der Schaltkreis wandelt den Strom von der Röhre in einen Spannungspegel um, vergleicht den Spannungswert mit einem Schwellen-Unterscheidungswert und erzeugt einen Impuls für den Zähler. Jeder Impuls für den Zähler wird dann als einzelnes Photonenereignis gezählt.
Ein Paar Operationsverstärker umfasst den Vorverstärkerabschnitt des Impulsgenerator-Schaltkreises. Der Vorverstärkerabschnitt wandelt Stromimpulse im Mikroamperebereich in einen Voltimpuls von etwa 1,0 Volt um. Ein Vergleicher wird als Diskriminator verwendet, um zu detektieren, wenn diese Impulse einen vorbestimmten Wert überschreiten. Wenn die Impulse über diesem entscheidenden Wert liegen, findet eine logische Umwandlung statt, und eine Impulsformerschaltung wandelt diese in einen definierten 10 ns-Impuls um.
Die Computerschnittstelle besteht aus Schaltungen, um die PC-Computerinstruktionen in logische Befehle und Statusinformationen in Computerlogik umzuwandeln. Diese Schnittstelle ist auf einer ganzen Karte für einen PC-Steckplatz aufgebaut. Die grundlegenden Komponenten auf der Karte sind der Bus-Emfpänger, Adressendecodierer, Funktionslatches, Line-Receiver und Zähler.
Die Computer-Schnittstelle verwendet 8 Ein-Ausgabeportadressen, hex 0310 bis 0317. Ablesungen von den Ports 0310 bis 0312 stellen 20 Bit von den Zählern bereit. Wenn die Zähler vom Zeitgeberschaltkreis gesteuert werden, mit einem Schreibzugriff auf 0317, werden Impulse, die vom Line-Receiver empfangen werden, für die definierte Blendenzeit gezählt. Die Blendenzeit wird durch Schreibzugriffe auf die Stellen 0310 und 0312 programmiert.
Die 20 Bits der Zählungen stellen eine Leistung von über 1 Million bereit. Zusätzliche Bitmuster, die an die Ports 0313 bis 0315 beschrieben werden, ermöglichen die Steuerung eines Laserverschlusses, einer Hochspannungsstromversorgung, der drei Achsen- (d. h. X, Y und Z) Schrittmotoren und der Betriebsart des Zeitgeberschaltkreises und des entfernten Impulsgenerators. Eine Ablesung von 0313 stellt Informationen in Zusammenhang mit den drei Achsenendschaltern bereit.
Die motorbetriebene Karte nimmt logische Signale von der Computerschnittstelle an und wandelt sie in Positionsbefehle um. Bei einfallender Beleuchtung im Bereich von 0,1 bis 1,0 mW sorgt die motorbetriebene Karte dafür, dass jeder Pixelbereich für Verweilzeiten von etwa 1 bis 100 ms beleuchtet wird. Für Beleuchtung von zwischen 10 und 100 mW liegen die Verweilzeiten der Pixelbereiche typischerweise bei 10 bis 100 μs. Logische Linien für jede Achse stellen Motoreinschalt-, Richtungs-, Schrittgrößen- und den Schrittimpuls bereit. Endschalter an den X-, Y- und Z-Achsenenden werden zur Computerschnittstelle geleitet und ebenfalls mit einer Schutzschaltung verbunden. Die Schutzschaltung verhindert das Laufen des Motors, wenn die Enden erreicht wurden, falls Computerinstruktionen das Ende nicht detektieren.
Computer
Ein PC-kompatibler Computer wird verwendet, um das Instrument zu steuern, die Messungen vorzunehmen und die Analyse und Bilderzeugung durchzuführen. Ein Drucker und ein Farbplotter werden für Hardcopyausgaben angeschlossen.
Das Motherboard des Computers ist mit einem Mikroprozessor Intel^® 80286 und einem mathematischen Koprozessor 80287 ausgestattet, die zusammen die CPU 102 (1) ausmachen. Darüber hinaus umfasst das Motherboard einen 1024-kByte-Speicher, Tastatur- und Lautsprecherverbindungen und 8 Steckplätze.
Eine Multifunktionskarte AST Advantage^® stellt 576 kByte an Primärspeicher 112 (1), eine serielle Schnittstelle für den Plotter und eine parallele Schnittstelle für den Drucker bereit. Eine IBM^®-Festplatten/Diskettenlaufwerks-Controllerkarte und eine externe Diskettenlaufwerks-Treiberkarte stellen Kommunikationsverbindungen zum Diskettenspeichermedium 106 bereit. Eine Video-Seven-VEGA-VGA^®-Karte stellt hochauflösende grafische Leistung von bis zu 800 × 600 Pixel bereit.
Von den drei verbleibenden Kartensteckplätzen wird einer für eine maßgeschneiderte Leiterplatte zur Steuerung und Überwachung des Instruments verwendet, und zwei Steckplätze stehen für Erweiterungen zur Verfügung. Die maßgeschneiderte Karte ist die Computerschnittstellenkarte, die im Abschnitt Elektronik erwähnt wurde. Sie stellt das Mittel zur Steuerung der Instrumentendatenerfassung bereit.
Software
Datenerfassungssoftware, die im Instrumentenwartungsprogramm 128 (1) enthalten sind, wurden unter Verwendung der C-Programmiersprache entwickelt. Sie wurde mit dem C-Compiler Version 5.1 von Microsoft^® kompiliert und mit Bibliotheken von Microsoft^® und Vermont Creative Software^® verbunden. Es handelt sich hierbei um ein fens terorientiertes Paket mit verschiedenen Ebenen für Datenerfassung und Wartungsabläufe. Dateien, die im 3,5-Zoll-Laufwerk gespeichert werden, umfassen eine binäre .FCD-Datei, die Header-Informationen, Betriebsparameter und die Daten enthält. Außerdem werden .GRD-Dateien zum 3D-Bildplotten von Photonenzähldaten als Funktion eines Pixelbereichs, .DAT-Dateien, die X- und Y-Koordinaten und Photonenzähldaten enthalten und .COR-Dateien mit korrekten Koordinaten gespeichert.
Die .DAT-Datei kann verwendet werden, um eine .GRD-Datei bereitzustellen, die Glättungsfaktoren zur Interpolation von fehlenden Datenpunkten verwendet. Die .COR-Datei kann verwendet werden, um dieselben Stellen wie in einem vorhergehenden Durchgang erneut abzubilden.
Die Grafik-Software ist in C geschrieben und mit den GSS-Grafikbibliotheken verbunden. So wird eine visuelle Anzeige der gesammelten Daten und das Senden dieser Anzeige zum Farbplotter ermöglicht.
Das Sofware-Paket Golden Surfer^® ist ein im Handel erhältliches Produkt, das die 3D-Oberflächenabbildung und 2D-Topographieansichten erstellt. Sechs Programme sind vorhanden: GRID, SURF, TOPO, VIEW, PLOTCALL und PLOT. GRID liest Dateien, welche die Photonenzählungen (abgegebene Signaldaten) von jedem Pixelbereich enthalten, und stellt Mittel zur Erstellung eines Gitterbildes der Daten bereit. Die Ausgabe dieses Programms kann von SURF für 3D-Bilder oder von TOPO für 2D-Profile gelesen werden. PLOTCALL und PLOT stellen die Mittel bereit, um diese Darstellungen an den Farbplotter weiterzuleiten. VIEW ist eine Utility, welche die vom Plotter erstellten Dateien auf dem Bildschirm darstellt und stellt Zoom- und Pan-Funktionen bereit.
Das Tabellenkalkulationssoftwarepaket Lotus^® 123 wird ebenfalls zur Analyse der Daten eingesetzt. Daten, die normalerweise nicht automatisch vom Instrument gesammelt werden, können verarbeitet und mithilfe der Grafikfunktionen dargestellt werden. Die vom Instrument gesammelten Daten können auch anderer wissenschaftlicher Verarbeitung unterzogen werden, wie beispielsweise der Anwendung von Photonenimpuls-Anhäufungs-Korrelationsgleichungen auf die tatsächlichen Daten.
Kompilierung und Analyse von Pixeldaten
Das digitale Detektionssystem 100 gemäß vorliegender Erfindung ist so aufgebaut, dass es auf eine oder zwei Arten funktionieren kann, um die Anzahl von Analytteilchen in der Probe zu bestimmen, die durch die Pixeldaten in der Anordnung 126 dargestellt ist. Wie schon. erwähnt entspricht der Wert, der innerhalb eines beliebigen Elements der Anordnung 126 gespeichert ist, dem Ausmaß des abgegebenen Signals, das aus einem bestimmten Pixelbereich innerhalb der Probe aufgefangen wurde. Genauer gesagt ist das System 100 so aufgebaut, dass es bei Anweisung eines Benutzers, dass die Größe der Markierung in jedem Analytteilchen geringer ist als die Fläche der Pixelbereiche 246, auf eine erste Art, durch "direktes Zählen", funktioniert. Wenn die Markierung größer ist als die Fläche der Pixelbereiche funktioniert das System 100 auf eine zweite Art, durch "Pixelclustering".
I. Direktes Zählen
Beim direkten Zählen wird das Ausmaß des abgegebenen Signals von jedem Pixelbereich 246 mit einem Hintergrundintensitätsmerkmal der Probe verglichen. In Pixelbereichen, in denen das abgegebene Signal davon die Hintergrundintensität durch die Reaktion einer einzelnen Markierung übertrifft, kann die Anzahl von Analytteilchen gezählt werden, indem das abgegebene Signal (weniger Hintergrund) durch die Größe der Markierung dividiert wird. Das wird durchgeführt, indem jeder in der Anordnung 126 gespeicherte Wert mit einer Detektionsschwelle verglichen wird, die proportional zur Summe der Probenhintergrundintensität und zur Größe der Markierung in jedem Analytteilchen ist. Jene Datenwerte, die unter der Detektionsschwelle liegen, werden im Allgemeinen ignoriert, während die Werte der restlichen Elemente innerhalb der Anordnung 126 normalisiert werden, indem die Hintergrundintensität der Probe subtrahiert wird. Jeder normalisierte Eintrag in der Anordnung 126 wird dann durch die Größe der Markie rungsreaktion dividiert und auf die nächste ganze Zahl gerundet, wobei die Anzahl von Analytteilchen in der Probe durch Summieren der Ergebnisse jeder Division bestimmt wird. Ein geeignetes Verfahren zum Berechnen der Umgebungsrauschintensität der Probe in weiter unten bei der Beschreibung des Pixelclustering angeführt.
Da die erwartete Analytteilchenkonzentration beim direkten Zählverfahren oft ausreichend gering ist, so dass jeder Pixelbereich so gewählt wird, dass er merklich größer ist als einzelne Teilchen, ist die Wahrscheinlichkeit gering, dass sich ein Analytteilchen an der Grenze zwischen zwei nebeneinander liegenden Pixelbereichen befindet. Trotzdem besteht in solchen Fällen die Möglichkeit, dass das Teilchen nicht detektiert wird, da die Energie, die dadurch zum mit dem benachbarten Pixelbereich in Zusammenhang stehenden abgegebenen Signal beigetragen wird, ausreichen kann, um jedes beliebige Signal über die Detektionsschwelle zu verstärken. Bei Anwendungen, die äußerste Präzision erfordern, kann es wünschenswert sein, diese relativ unwahrscheinliche Möglichkeit in Betracht zu ziehen. Ein Verfahren, das dazu ausgerichtet ist, die Detektion von Analytteilchen zu erleichtern, die sich auf Pixelgrenzen befinden, umfasst die Verschiebung der Orientierung der Pixelanordnung 238 in Bezug auf die Probe und das Erfassen einer zweiten Datenreihe. Genauer gesagt würde die Anordnung vorzugsweise in Bezug auf die Probe um etwa eine Viertel Pixeldimension in die X- und Y-Richtung verschoben. Daten, die auf dem abgegebenen Signal von jedem Pixelbereich basieren, würden wieder aufgefangen werden, und eine zweite Zählung der Anzahl von Analytteilchen würde wie oben durchgeführt werden. Wenn sich in der ersten Zählung ein Analytteilchen auf einer Pixelgrenze befände und nicht detektiert würde, würde der Wert der zweiten Zählung über dem der ersten liegen. Ebenso ist es, wenn die zweite Zählung einen geringeren Wert ergibt als die erste, wahrscheinlich, dass die Pixelgrenzen so verschoben wurden, dass sie ein Analytteilchen überlappen, das bei der ersten Zählung detektiert wurde. Auf jeden Fall weist der höhere Wert auf die Anzahl von Analytteilchen in der Probe hin.
II. Pixelclustering
Wie oben erwähnt, ist das Detektionssystem 100 dazu ausgerichtet, bei Anweisung eines Benutzers, dass die Fläche der Pixelbereiche 246 kleiner ist als die einzelnen Analytteilchen, zu funktionieren. Als Folge müssen die Pixelbereiche, unter denen ein einzelnes Teilchen aufgeteilt ist, in ein einzige Einheit aufgenommen oder "geclustert" werden, um eine genau Bestimmung der Anzahl von Analytteilchen in der Probe zu ermöglichen. Wie weiter unten im Detail beschrieben wird, wird das Clustering-Verfahren begonnen, indem abgegebene Signaldaten, die von jedem Pixel aufgefangen wurden, in eine Gruppe von Hintergrunddaten und eine Gruppe von Pixeldaten, die für Bildelemente von Interesse repräsentativ sind, geteilt werden. Die Signalwerte innerhalb der Datengruppe von Interesse werden dann in absteigender Reihenfolge angeordnet (Helligkeit). Der größte Datenwert wird als Kern eines ersten Pixelclusters bezeichnet, und Pixel von Interesse, die nahe genug am ersten Kern sind, werden in den ersten Pixelcluster aufgenommen. Das Kriterium der "Nähe" kann modifiziert werden, beispielsweise auf Basis der Form der Analytteilchen oder der spezifischen Ziele des Detektionsverfahrens. Die Pixelwerte, die zum ersten Cluster gruppiert werden, werden aus der Liste interessanter Pixelwerte gelöscht, und der größte der verbleibenden Werte wird als Kern eines zweiten Pixelclusters bezeichnet. Dieses Verfahren wird wiederholt, bis ein vordefinierter Prozentsatz der Pixel von Interesse zu Clustern gruppiert ist. Ein Fortran^®-Computerprogramm das geschrieben wurde, um das Pixelclusteringschema der vorliegenden Erfindung umzusetzen, wird unter Bezugnahme auf das Ablaufdiagramm von 7 beschrieben.
Wie in 7 dargestellt wird das Clusteringprogramm gestartet, indem die Dimensionen der Pixeldatenanordnung 126 und darin gespeicherte Werte in eine Datei eingelesen werden. Die Dimensionen der Anordnung 126 in die X- und Y-Richtung werden als Nx bzw. Ny bezeichnet. Die Pixelwerte und das Quadrat der Pixelwerte, die aus der Anordnung eingelesen werden, werden dann getrennt summiert und jeweils als ganze Zahlen SUM1 und SUMSQ1 gespeichert. SUM1 wird durch das Produkt von Nx und Ny (d. h. durch die Anzahl von Einträgen in der Anordnung 126) dividiert, um die mittlere (AVE₁) Pixelintensität aller Elemente in der Anordnung 126 zu bestimmen. Außerdem wird die Standardabweichung (σ₁) der Gruppen von Pixeldaten wie folgt bestimmt: σ1 = {(SUMSQ1 – (SUM1)2/(NxNy))/(NxNy – 1)}1/2 [1]
Die Parameter σ₁ und AVE₂ werden verwendet, um die Hintergrundschwelle zu bestimmen, auf die in 7 Bezug genommen wird. Die Hintergrundschwelle wird durch den Wert TEST bezeichnet und wird wie folgt berechnet: TEST = AVE1 + 2,5σ1 [2]
Jeder Pixeldatenwert wird mit TEST verglichen, wobei die Summe jener Werte, die geringer sind als TEST, durch SUM2 und die Summe der Quadrate von Werten, die geringer sind als TEST, SUMSQ2 entspricht. Dann wird eine revidierte Pixelintensität AVE₂ berechnet: AVE2 = SUM2/N [3]worin N der Anzahl von Pixelwerten entspricht, die geringer sind als TEST. Auf diese Weise ist AVE₂ charakteristischer für die Hintergrundhelligkeit als AVE₂, da die relativ hellen Merkmale im Ausdruck SUM2 der Gleichung [3] nicht enthalten sind. Dann wird wie folgt eine revidierte Standardabweichung σ₂ berechnet: σ2 = {(SUMSQ2 – (SUM2)2/(N2))/(N2 – 1)}1/2 [4]
Basierend auf der revidierten Annäherung der Hintergrundhelligkeit AVE₂ und auf der revidierten Standardabweichung σ₂ wird ein Bildfenster relativ zur Hintergrundhelligkeit definiert, das Pixelwerte umfasst, die abgegebenen Signalen von Interesse entsprechen. Ein WINLO des Bildfensters an der unteren Grenze übertrifft vorzugsweise die Hintergrundhelligkeit um fünf Standardabweichungen, und ist somit wie folgt definiert: WINLO = AVE2 + 5σ2 [5]
Ein WINHI des Bildfensters an der oberen Grenze wird im Allgemeinen bei der Höhe des größten Pixelwerts fixiert. Die Gruppe von Pixelwerten von Interesse wird dann gesucht, und die großen innerhalb des Bildfensters werden in absteigender Reihenfolge sortiert (Helligkeit). Die Anzahl von Pixelwerten in dieser sortierten Liste wird durch NOUT bezeichnet, wobei die X- und Y-Koordinaten der gespeicherten Pixelwerte in Zeigeanordnungen INDX bzw. INDY gespeichert werden. Genauer gesagt werden die X- und Y-Koordinaten des i-hellsten Pixelwerts an Zeigeanordnungsstellen INDX(i) und INDY(i) gespeichert, wobei der Index "i" von 1 bis NOUT reicht.
Die Synthese des ersten Pixelclusters schreitet voran, indem INDX(1) und INDY(1) als X- und Y-Koordinaten eines Kerns eines ersten Pixelclusters bestimmt werden. Bei Anwendungen, bei denen die Querschnittsdimensionen der Analytteilchen in der Probe beispielsweise relativ kreisförmig sind, ist es im Allgemeinen wünschenswert, diese Geometrie wiederzuspiegeln, indem kreisförmige Pixelcluster geschaffen werden. In solchen Fällen befindet sich der erste Kern im Zentrum eines Kreises, der zur Definition des ersten Pixelclusters verwendet wird. Der Radius des ersten Pixelclusters wird bestimmt, indem in acht Richtungen (d. h. 45, 90, 135, 180, 225 und 360 Grad) in Bezug auf den ersten Kern nach sortierten Pixeln gesucht wird, die im Bildfenster enthalten sind. Das Ziel dieser Suche besteht darin, einen geeigneten Clusterradius in jede der acht Richtungen zu bestimmen, wobei diese Radien dann verwendet werden, um den Radius des ersten Pixelclusters zu definieren.
Genauer gesagt werden, um den Radius bei 45 Grad zu bestimmen, die Pixel mit einer X-Koordinate INDX(1) + 1 und Y-Koordinate INDY(1) + 1 untersucht, um festzustellen, ob ihre Koordinaten in Zeigeanordnungen INDX und INDY enthalten sind. Wenn das der Fall ist, muss das zu untersuchende Pixel ausreichend hell sein, um im Bildfenster enthalten zu sein. Folglich werden die 45°-Radien des ersten Pixelclusters so gewählt, dass sie zumindest das untersuchte Pixel, das im Bildfenster lokalisiert wurde, enthalten. An genommen das Pixel an der X,Y-Koordinatenstelle INDX(1) + 1, INDY(1) + 1 ist im Bildfenster enthalten, so wird dann bestimmt, ob die Koordinaten des nächsten Pixels in die 45°-Richtung (d. h. das Pixel mit den X,Y-Koordinaten XINDX(1) + 2, INDY(1) + 2) in den Zeigeanordnungen INDX und INDY enthalten sind. Wenn die Koordinaten dieses zweiten untersuchten Pixels nicht in INDX und INDY enthalten sind, werden die 45°-Radien auf einen Wert von zwei eingestellt. Auf ähnliche Weise wird, wenn die Koordinaten des ersten untersuchten Pixels nicht in INDX und INDY gefunden wurden, den 45°-Radien ein Einheitswert zugewiesen. Als Nächstes werde die Radien in Zusammenhang mit den verbleibenden sieben Richtungsvektoren auf im Wesentlichen dieselbe Weise bestimmt. Danach wäre es möglich, ein gemeinsames Radiusmerkmal des ersten Pixelclusters zu berechnen, indem einfach ein Mittel dieser acht einzelnen Radien bestimmt wird.
Andererseits könnten die größten zwei oder drei Radien auch vor Bestimmung des Mittels gelöscht werden, um zu verhindern, dass das Vorhandensein eines zweiten Pixelclusters mit Elementen, die an den Rand des ersten Clusters angrenzen, den Radius des ersten Clusters unangemessen vergrößern. Dieser Fall könnte beispielsweise eintreten, wenn die Trennung zwischen einem Paar von Analytteilchen in der Probe ausreichend klein ist, so dass die Pixelcluster, die jedes charakterisieren, zumindest entlang einem Richtungsvektor aneinander grenzen.
Wenn die Analytteilchen in der Probe einen nicht kreisförmigen Querschnitt aufweisen, können die einzelnen Richtungsradien verwendet werden, um einen Clusterrand mit beliebiger Form zu definieren. Auf ähnliche Weise können nicht kreisförmige (z. B. elliptische) Konturen bevorzugt werden, indem die Clustergrenze, die durch die Richtungsradien definiert wird, so modifiziert wird, dass sie näher an eine bevorzugte Form heranreichen.
Wie in 7 aufgezeigt, sind jene Pixelelemente, die ausreichend hell sind, um im Bildfenster enthalten zu sein und im Kreis vorhanden zu sein, der durch den ersten Clusterkern und -radius definiert ist, zum ersten Pixelcluster gruppiert. Dieser Schritt wird umgesetzt, indem INDX und INDY abgetastet werden, um die Koordinatenstellen zu bestimmen, die darin von der durch den ersten Pixelcluster definierten Fläche eingeschlossen werden. Die Einträge in die so eingeschlossenen INDX und INDY sind so gewählt, dass sie sich im ersten Pixelcluster befinden, und werden dann von INDX und INDY gelöscht. Außerdem subtrahiert das Clustering-Programm die Anzahl von Pixelstellen, die ursprünglich im Bildfenster enthalten waren. Wenn diese Zahl kleiner ist als ein vorbestimmter Prozentsatz (z. B. 99%) der Anzahl von Pixeln, die im Bildfenster enthalten sind, wird der Clustering-Vorgang beendet. Ansonsten wird die Bildung eines zweiten Pixelclusters begonnen.
Der Kern des zweiten Pixelclusters wird bestimmt, indem der größte Wert gesucht wird, der in der sortierten Liste von Pixelwerten, die im Bildfenster enthalten sind, bestimmt wird; d. h. durch Suchen nach dem hellsten Pixel, das nicht im ersten Pixelcluster enthalten ist. Der zweite Pixelcluster wird dann auf dieselbe Weise gebildet wie der erste Pixelcluster. Wiederum werden zusätzliche Cluster gebildet, bis die Anzahl von nicht geclusterten Pixelwerten, die auf der sortierten Liste von Pixelwerten verbleiben, geringer ist als ein vorbestimmter Prozentsatz der ursprünglich vorhandenen Anzahl.
Das Clustering-Verfahren gemäß vorliegender Erfindung kann in einer Reihe von Anwendungen verwendet werden, um diskrete chemische Einheiten räumlich aufzulösen und zu zählen. Wie oben erwähnt umfasst eine solche Anwendung die digitale Detektion von Analytteilchen, in denen jedes Teilchen aus einem Molekül und einer Fluoreszenzmarkierung besteht. Auf ähnliche Weise kann die Anzahl von Chromosomen oder Partialchromosomen innerhalb eines Kerns bestimmt werden, indem die Pixelgröße in Bezug auf die Größe der Fluoreszenzmarkierung klein gewählt wird. Die mit einzelnen Chromosomen in Zusammenhang stehende Markierung wird so über eine Vielzahl von Pixelbereichen verteilt, und Clustering ist notwendig, um das Zählen der Chromosomenanzahl, die in jedem Kern vorhanden ist, zu vereinfachen.
Das Clustering-Verfahren gemäß vorliegender Erfindung kann auch in einem Abtastverfahren eingesetzt werden, um Flächen von Interesse innerhalb eines Bildes einer Probe rasch zu lokalisieren. Beim Abtastverfahren werden Bilddaten anfangs durch Abfragen der Probe unter Verwendung einer großen Pixelgröße gesammelt. Der Clustering-Algorithmus wird dann zu Hilfe genommen, um Bereiche von Interesse durch Bestimmung der Größe und des Zentrums einer Anzahl von Pixelclustern zu identifizieren. Falls dann eine Synthese höherauflösender Bilder der identifizierten Bereiche von Interesse erwünscht ist, können Daten von jedem solchen Bereich unter Verwendung von Pixeln reduzierter Bereiche identifiziert werden.
Laborergebnisse
Das Clustering-Verfahren gemäß vorliegender Erfindung wurde unter Verwendung des in 2 dargestellten Geräts umgesetzt, um die Anzahl von Fluoreszenzmarkierungskügelchen in der Probe des folgenden Assays zu bestimmen. Der Assay umfasst magnetische Fängerkügelchen, die mit kovalent gebundenen (dT)₂₁-DNA-Oligomeren beschichtet sind, Fluoreszenzmarkierungskügelchen, die mit einer kovalent gebundenen Sequenz beschichtet sind, die für das Human-Papillomavirus Typ 6 (HPV-6) spezifisch ist, DNA-Fängeroligomere und Analyt-DNA-Moleküle, die HPV-6-Sequenzen enthalten.
In diesem Beispiel werden die magnetischen Fängerkügelchen mit einem Überschuss an Fängersondenoligomeren umgesetzt. Die Fängeroligomere sind 51 Nukleotide lang. Das 5'-Ende der Fängersonde besteht aus einer 30 Basen umfassenden DNA-Sequenz (Nukleotide 810 bis 840) von HPV-6-DNA. Das 3'-Ende der Fängersonde besteht aus (dA)₂₁. Das (dA)₂₁ hybridisiert an die (dT)₂₁-Oligomere auf der Oberfläche der magnetischen Kügelchen. Nichthybridisierte Fängersonden wurden durch magnetische Konzentration der magnetischen Kügelchen und Entfernung und Ersetzung der Überstandslösung aus der Lösung entfernt.
Magnetische Kügelchen mit hybridisierten Fängersonden wurden dann mit variierenden Mengen HPV-6-DNA-(Analyt-DNA-) Sequenz vermischt. Die verwendete Analytsequenz war ein Oligomer mit einer Länge von 42 Nukleotiden. Einundzwanzig Nukleotide am 5'-Ende der Analytsequenz waren komplementär zu 21 der 30 Nukleotide in der Sequenz von HPV-6-DNA auf der Fängersonde. Die 21 Nukleotide am 3'-Ende der Analyt-DNA war komplementär zu den DNA-Oligomeren auf den Fluoreszenzmarkierungskügelchen. Die Analyt-DNA wurde an die Fängersonde auf den Magnetkügelchen hybridisiert.
Der spezifische Typ und die Konzentration von Magnetkügelchen wird so gewählt, dass die Konzentration von Analyten in jedem Pixelbereich begrenzt wird, so dass das gesamte abgegebene Signal von jedem Bereich unter der oberen Detektionsschwelle bleibt. Ein Verfahren zur Umsetzung dieser Begrenzung besteht in der Wahl von Kügelchen mit nur einem einzigen Bindungspaar. Andererseits kann auch eine im Vergleich zur Anzahl von Analyten große Anzahl von Kügelchen eingesetzt werden.
Fluoreszenzmarkierungskügelchen wurden dann an die Analyt-DNA auf den magnetischen Fängerkügelchen hybridisiert. Ungebundene Markierungskügelchen wurden durch wiederholte Waschschritte entfernt, wie sie im Folgenden für die überschüssige Fängersonde und ungebundene Markierungs-DNA beschrieben sind.
Die spezifische Methode, die verwendet wird, um die Proben herzustellen, umfasst das Zusetzen von 12 μl 1,5 × 10⁵ magnetischen Kügelchen pro μl magnetischer, 2,8 μm großer Kügelchen (Dynal^® Inc., Great Neck, NY, USA) zu 100 μl Waschpuffer (0,5 M GuSCN, 0,04 M Tris-CHl, 0,008 M EDTA, 0,5% N-Laurylsarcosin, 0,5% BSA, pH 7,4). Die Kügelchensuspension wurde gemischt, und die Kügelchen wurden magnetisch konzentriert, wobei der Überstand entfernt wurde. 50 μl Waschpuffer wurden zugesetzt, und die Kügelchen wurden resuspendiert. Dann wurden 6 μg 51 Nukleotide umfassende Fängersonde zugesetzt, und die Suspension wurde bei 37°C eine Stunde lang inkubiert. Die Kügelchen wurden dann magnetisch konzentriert, und der Überstand wurde wieder entfernt. 100 μl frischer Waschpuffer wurden zugesetzt, und die Kügelchen wurden resuspendiert. Dieser Waschvorgang wurde zwei weitere Male wiederholt. Das gewaschene Kügelchen-Pellet wurde in 65 μl Waschpuffer resuspendiert, und 10 μl Kügelchensuspension wurden in je ein Röhrchen übertragen. Jedem Röhrchen wurde 1 μl von 1 μg pro μl Hefe-tRNA zugesetzt.
Röhrchen 1 wurden ein μl von 100 pg/μl Analyt-DNA und 9 μl Waschpuffer zugesetzt. Röhrchen 2 wurden 10 μl von 1 pg/μl Analyt-DNA zugesetzt. Röhrchen 3 wurden 7 μl Waschpuffer und 3 μl von 1 pg/μl Analyt-DNA zugesetzt. Röhrchen 4 wurden 1 μl von 1 pg/μl Analyt-DNA und 9 μl Waschpuffer zugesetzt. Röhrchen 5 wurden 1 μl von 0,1 pg/μl Analyt-DNA und 9 μl Waschpuffer zugesetzt. Und Röhrchen 6 wurden 10 μl Waschpuffer zugesetzt.
Die sechs Proben wurden eine Stunde lang bei 37°C inkubiert. Dann wurden 3 μl Waschpuffer und 2 μl (10⁶ Kügelchen/μl von 0,74 μm großen fluoreszierenden Kügelchen (YG Beads^®, Polysciences^®, Inc., Warrington, PA, USA) zu jeder der Proben zugesetzt. Die Inkubation wurde eine weitere Stunde bei 37°C fortgesetzt. Nach der Inkubation wurden die Fängerkügelchen magnetisch konzentriert, und der Überstand, der ungebundene Markierungskügelchen enthielt, wurde entfernt. Die Fängerkügelchen wurden in 50 μl Waschpuffer resuspendiert und vermischt. Der Waschvorgang wurde 5 weitere Male wiederholt. Nach dem letzten Waschdurchgang wurden die Kügelchen in 50 μl Waschpuffer resuspendiert. Die Platzierung einer geeigneten Menge (z. B. 5 μl) jeder Probe auf einem Objektträger würde eine Beobachtung laut dem digitalen Detektionsverfahren gemäß vorliegender Erfindung, das hierin beschrieben ist, ermöglichen.
Aus den oben angeführten Ergebnissen und der Beschreibung des Clustering-Verfahrens gemäß vorliegender Erfindung ist ersichtlich, dass eine exakte digitale Detektion von Analyten unter Verwendung einer fluoreszierenden oder einer anderen Markierung, die abgegebenes Licht bereitstellt, möglich ist. Auf diese Weise können verschiedenste Ana lyten detektiert werden, die in Proben vielleicht nur in extrem geringen Konzentrationen vorliegen.
Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung zitiert wurden, sind durch Verweis hierin aufgenommen, als ob jede einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung spezifisch und einzeln durch Verweis aufgenommen wäre.
Obwohl die vorliegende Erfindung zum besseren Verständnis durch Veranschaulichungen und Beispiele in einem gewissen Maße detailliert beschrieben wurde, werden Fachleuten auf dem Gebiet der Erfindung erkennen, dass im Lichte der Lehren dieser Erfindung bestimmte Veränderungen und Modifikationen vorgenommen werden können, ohne vom Schutzumfang der beiliegenden Ansprüche abzuweichen.

Claims

System (10) zum Detektieren des Vorhandenseins einer kleinen Anzahl von Analytteilchen in einer Probe (238), wobei das System umfasst: Mittel zum Teilen der Probe (238) in eine Vielzahl unterschiedlicher Pixelbereiche (246); Mittel (226) zum Messen abgegebener Signale aus jedem der Pixelbereiche in Bezug auf eine Umgebungsrauschschwelle, wobei das abgegebene Signal von jedem Pixelbereich proportional zu den optischen Reaktionen des darin enthaltenen Analyten ist und das abgegebene Signal von jedem Pixelbereich mit der darin enthaltenen Analytmenge in Zusammenhang steht; dadurch gekennzeichnet, dass das System weiters Datenverarbeitungsmittel (100) zum Empfangen der Messungen und, auf Basis der Messungen und einer Annahme, dass die Pixelbereiche so dimensioniert sind, dass die Anzahl der in jedem der Pixelbereiche enthaltenen Analytteilchen geringer als eine maximale Detektionsschwelle proportional zur Schwankung in der von den Analytteilchen abgegebenen optischen Reaktionen ist, zum Zählen der Anzahl an Analytteilchen in jedem der Pixelbereiche (246) umfasst, um die Anzahl der Analytteilchen in der Probe (238) zu bestimmen.
System nach Anspruch 1, worin das Datenverarbeitungsmittel (100) Mittel (102) zum Dividieren jeder der Messungen durch einen Wert umfasst, der einer Größe einer der optischen Reaktionen entspricht; wodurch die ganze Zahl, die dem Ergebnis einer jeden Division am nächsten liegt, der Anzahl der Analytteilchen innerhalb eines der Pixelbereiche (246) entspricht.
System nach Anspruch 1, welches weiters Mittel (212; 252) zum Beleuchten eines jeden Pixelbereichs umfasst, worin das Messmittel Wellenlängenisolationsmittel umfasst, um die optischen Reaktionen von Licht zu trennen, das vom Beleuchtungsmittel stammt.
System nach Anspruch 3, worin das Mittel zum Beleuchten Laserstrahlmittel (212; 252) umfasst, um einen fokussierten Beleuchtungsstrahl mit optischen Wellenlängen bereitzustellen, die primär auf einen ersten Spektralbereich beschränkt sind.
System nach Anspruch 4, worin das Mittel zur Wellenlängenisolation ein optisches Filter (234; 370) umfasst, das so eingestellt ist, dass es im ersten Spektralbereich liegendes Licht nicht durchlässt.
System nach Anspruch 5, worin alle Pixelbereiche (246) im Wesentlichen äquivalente Flächen aufweisen und aneinander angrenzend in der Probe angeordnet sind, und worin das Beleuchtungsmittel weiters Rasterabtastmittel (240; 360, 366) umfasst, um nacheinander jeden der Pixelbereiche (246) für einen vordefinierten Zeitintervall mit dem fokussierten Beleuchtungsstrahl zu beleuchten.
System nach Anspruch 6, worin das Messmittel einen Lichtdetektor (236) umfasst, um als Reaktion auf Beleuchtung durch Photonen innerhalb jeder der optischen Reaktionen ein Detektionssignal zu erzeugen.
System nach Anspruch 7, worin das Messmittel eine Detektorschaltung umfasst, die vom Detektionssignal angesteuert wird, um die Anzahl an Photonen zu zählen, die von jedem der Pixelbereiche ausgesandt werden, um Pixelzählungen zu erhalten, wobei das Messmittel weiters einen elektronischen Speicher (126) zum Speichern der Pixelzählungen umfasst.
System zum digitalen Detektieren des Vorhandenseins einer kleinen Anzahl an Analytteilchen innerhalb einer Probe (238), wobei das System umfasst: Mittel (212, 252) zum Beleuchten des Probenmittels (226; 368, 370) zum Auffangen und Messen optischer Signale, die von der Probe abgegeben werden, in Bezug auf eine Umgebungsrauschschwelle, wobei die abgegebenen Signale proportional zum Licht sind, das vom Analyten abgegeben wird, der im beleuchteten Abschnitt der Probe enthalten ist, wobei die Menge des abgegebenen Lichts mit der Menge an Analyt im Abschnitt der Probe in Zusammenhang steht; dadurch gekennzeichnet, dass das System weiters umfasst: Datenverarbeitungsmittel (100), um die Messungen aufzunehmen und auf Basis der Messungen und einer Annahme, dass die Anzahl der in der Probe enthaltenen Analytteilchen unter einer maximalen Detektionsschwelle proportional zur Schwankung der von den Analytteilchen abgegebenen optischen Reaktionen ist, die Anzahl der Analytteilchen in der Probe zu zählen.
System nach Anspruch 9, worin das Mittel zum Messen des abgegebenen Signals Mittel umfasst, um das gemessene abgegebene Signal durch einen Wert zu dividieren, der einer Größe der optischen Reaktionen entspricht; wobei die ganze Zahl, die der dividierten Messung am nächsten liegt, der Anzahl an Analytteilchen in der Probe entspricht.
System nach Anspruch 10, worin das Mittel (212; 252) zum Beleuchten Beleuchtungslicht mit Frequenzen erzeugt, die sich von den optischen Frequenzen unterscheiden, die den optischen Reaktionen zugeordnet sind, und worin das Mittel zum Auffangen Mittel zur Wellenlängenisolation vom Beleuchtungslicht der aufgenommenen optischen Reaktionen umfasst.
System nach Anspruch 11, worin das Mittel zum Beleuchten (212; 252) Laserstrahlmittel umfasst, um einen fokussierten Beleuchtungsstrahl mit Wellenlängen bereitzustellen, die auf einen ersten Spektralbereich begrenzt sind.
System nach Anspruch 12, worin das Wellenlängenisolationsmittel ein optisches Filter (234; 370) umfasst, das eingestellt ist, um im ersten Spektralbereich enthaltenes Licht zu sperren.
Verfahren zum Detektieren des Vorhandenseins einer kleinen Anzahl an Analytteilchen innerhalb einer Probe (238), folgende Schritte umfassend: das Teilen der Probe (238) in eine Vielzahl unterschiedlicher Pixelbereiche, wo in jedem der Pixelbereiche abgegebenes Licht mit der Analytmenge in jedem der Pixelbereiche in Zusammenhang steht, wobei jeder der Pixelbereiche (246) so dimensioniert ist, dass die Anzahl der in jedem der Pixelbereiche enthaltenen Analytteilchen geringer ist als eine maximale Detektionsschwelle proportional zur Schwankung der optischen Reaktionen, die von den Analytteilchen abgegeben werden; das Messen der abgegebenen Signale von jedem der Pixelbereiche (246) in Bezug auf eine Umgebungsrauschschwelle, worin das abgegebene Signal von jedem Pixelbereich proportional zu den optischen Reaktionen von darin enthaltenen Analytteilchen ist; und das Zählen der Anzahl an Analytteilchen innerhalb jedes der Pixelbereiche auf Basis der Messungen, um die Anzahl der Analytteilchen in der Probe (238) zu bestimmen.
Verfahren nach Anspruch 14, das weiters den Schritt des Dividierens einer jeden der Messungen durch einen Wert umfasst, der einer Größe der optischen Reaktionen entspricht; wobei die ganze Zahl, die jeder der geteilten Messung am nächsten liegt, der Anzahl an Analytteilchen in den Pixelbereichen entspricht.
Verfahren nach Anspruch 14, das weiters den Schritt des Beleuchtens eines jeden der Pixelbereiche (246) mit Beleuchtungslicht umfasst; worin: der Schritt des Beleuchtens den Schritt des Erzeugens von Beleuchtungslicht mit Frequenzen umfasst, die sie von den optischen Frequenzen unterscheiden, die den optischen Reaktionen zugeordnet sind, und der Schritt des Messens den Schritt des Filterns der optischen Reaktionen aus dem Beleuchtungslicht umfasst.
Verfahren nach Anspruch 16, worin der Schritt des Beleuchtens weiters den Schritt des Bereitstellens eines fokussierten Beleuchtungsstrahls mit Wellenlängen umfasst, die primär auf einen ersten Spektralbereich beschränkt sind.
Verfahren zum digitalen Detektieren des Vorhandenseins von molekularen Analytteilchen innerhalb einer Probe (238), in der jedes Analytteilchen so angeordnet ist, dass es eine optische Reaktion aussendet, wenn es auf vorbestimmte Weise beleuchtet wird, worin die Konzentration der Analytteilchen eine solche ist, dass die Anzahl derartiger Analytteilchen unter einer maximalen Detektionsschwelle proportional zur Veränderlichkeit der optischen Reaktionen liegt, folgende Schritte umfassend: das Beleuchten der Probe (238), um die Analytteilchen dazu zu bringen, die optischen Reaktionen auszusenden; das Auffangen eines abgegebenen Signals, das aus. den optischen Reaktionen besteht; und das Messen des aufgefangenen abgegebenen Signals und Vergleichen des gemessenen ausgesandten Signals mit einer Detektionsschwelle, um die Anzahl an Analytteilchen in der Probe (238) zu zählen.
Verfahren nach Anspruch 18, worin der Schritt des Messens des aufgefangenen abgegebenen Signals den Schritt des Dividierens der Messung durch einen Wert umfasst, der einer der optischen Reaktionen entspricht; wodurch die ganze Zahl, die der dividierten Messung am nächsten liegt, der Anzahl an Analytteilchen in der Probe (238) entspricht.
Verfahren nach Anspruch 14, das weiters den Schritt des Herstellens der Probe (238) aus Analytteilchen umfasst, worin der Herstellungsschritt folgende Schritte umfasst: das Binden von Analyten an eine Oberfläche durch ein spezifisches Bindungspaarelement; das Bilden von Analytteilchen durch Kontaktieren der Analyten mit einer Vielzahl von Fluorophormarkierungen, die so angeordnet sind, dass sie auf vorbestimmte Weise mit den Analytteilchen kombiniert werden; und das Entfernen der Fluorophormarkierungen, die nicht spezifisch an einen Analyten gebunden sind, aus der Nähe der Oberfläche.
Verfahren nach Anspruch 20, worin der Schritt des Bindens den Schritt des Bindens eines zum Analyten komplementären Bindungselements an die Oberfläche umfasst.
Verfahren nach Anspruch 21, worin das Bindungselement einen für den Analyten spezifischen Antikörper umfasst.
Verfahren nach Anspruch 20, worin jeder der Analyten an eine magnetische Kugel gebunden wird und worin der Schritt des Bindens den Schritt des Anlegens eines Magnetfeldes in der Nähe der Oberfläche umfasst, um Kontakt zwischen den Analyten und der Oberfläche herbeizuführen.
System nach Anspruch 1, worin das Datenverarbeitungsmittel Mittel zum Erzeugen eines Feldes (126) von Datenwerten umfasst, worin jeder der Datenwerte dem gemessenen abgegebenen Signal von einem der Pixelbereiche entspricht.
System nach Anspruch 24, worin das Datenverarbeitungsmittel (100) weiters umfasst: Mittel zum Berechnen einer Hintergrundrauschhöhe auf Basis der Datenwerte, und Mittel, um jeden der Datenwerte mit der Hintergrundrauschhöhe zu vergleichen, um zu bestimmen, ob zumindest einer der Analyten im zugeordneten Pixelbereich enthalten ist.
System nach Anspruch 25, worin das Datenverarbeitungsmittel (100) weiters umfasst: Mittel zum Berechnen einer Hintergrundrauschhöhe auf Basis der Datenwerte; Mittel zum Anordnen in abfallender Reihenfolge eines Satzes der Datenwerte, die die Rauschhöhe um eine Nutz-Schwelle übersteigen, und das Auswählen des größten aus dem angeordneten Satz von Datenwerten, wodurch der dem ausgewählten Datenwert zugeordnete Pixelbereich ein Kern eines ersten der Pixelcluster wird.
System nach Anspruch 26, worin das Datenverarbeitungsmittel (100) weiters umfasst: Mittel zum Identifizieren von Datenwerten innerhalb des angeordneten Satzes von Datenwerten, die Pixelbereichen nahe des Kerns zugeordnet sind, und Mittel zum Gruppieren der identifizierten Datenwerte in den ersten Pixelcluster.
System nach Anspruch 27, worin das Datenverarbeitungsmittel (100) weiters Mittel umfasst, um den größten der angeordneten Datenwerte, der einem Pixelbereich zugeordnet ist, der nicht im ersten Cluster enthalten ist, als Kern eines zweiten der Pixelcluster zu benennen.
Verfahren nach Anspruch 14, worin der Schritt des Zählens weiters den Schritt des Erzeugens eines Feldes (126) von Datenwerten umfasst, worin jeder der Datenwerte dem gemessenen abgegebenen Signal aus einem der Pixelbereiche entspricht.
Verfahren nach Anspruch 29, worin der Schritt des Zählens weiters folgende Schritte umfasst: das Berechnen einer Hintergrundrauschhöhe auf Basis der Datenwerte; und das Vergleichen eines jeden der Datenwerte mit der Hintergrundrauschhöhe, um zu bestimmen, ob zumindest eines der Analytteilchen im zugeordneten Pixelbereich enthalten ist.
Verfahren nach Anspruch 30, worin der Schritt des Zählens weiters folgende Schritte umfasst: das Berechnen einer Hintergrundrauschhöhe auf Basis der Datenwerte; das Anordnen in abfallender Reihenfolge eines Satzes der Datenwerte, die die Rauschhöhe um eine Nutz-Schwelle übersteigen, und das Auswählen des größten aus dem angeordneten Satz von Datenwerten, wodurch der dem ausgewählten Datenwert zugeordnete Pixelbereich ein Kern eines ersten der Pixelcluster wird.
Verfahren nach Anspruch 31, worin der Schritt des Zählens weiters folgende Schritte umfasst: das Identifizieren von Datenwerten innerhalb des angeordneten Satzes von Datenwerten, die Pixelbereichen (246) nahe des Kerns zugeordnet sind, und das Gruppieren der identifizierten Datenwerte in das erste Pixelcluster.
Verfahren nach Anspruch 32, worin der Schritt des Zählens weiters den Schritt des Benennens des größten der Datenwerte, der einem Pixelbereich (246) zugeordnet ist, der nicht im ersten Cluster enthalten ist, als Kern eines zweiten der Pixelcluster.
Verfahren zum Lokalisieren und Zählen diskreter Einheiten innerhalb einer chemischen Probe (238), wobei das Verfahren folgende Schritte umfasst: das Teilen der Probe in eine Vielzahl unterschiedlicher Pixelbereiche (246), wo Licht, das in jedem der Pixelbereiche ausgesandt wird, mit der Menge an Analytteilchen in jedem der Pixelbereiche in Zusammenhang steht, wobei jeder der Pixelbereiche so dimensioniert ist, dass die Anzahl an chemischen Einheiten, die in jedem der Pixelbereiche vorhanden sind, geringer als eine maximale Detektionsschwelle proportional zur Schwankung an optischen Reaktionen ist, die von den chemischen Einheiten abgegeben werden; das Messen abgegebener Signale aus jedem der Pixelbereiche relativ zu einer Umgebungsrauschschwelle, worin das abgegebene Signal von jedem Pixelbereich proportional zu den optischen Reaktionen darin enthaltender chemischer Einheiten ist; auf Basis der Messungen das Ableiten eines Feldes von Messwerten, die das Vorhandensein und Fehlen der Einheiten in jedem der entsprechenden Pixelbereiche (246) der Probe (238) angeben; das Sortieren der Messwerte entsprechend des angegebenen Vorhandenseins der Einheiten; das Auswählen eines Pixelbereichs (246), der einem ersten der Messwerte entspricht, als Kern eines ersten Pixelclusters; und das Gruppieren von Pixelbereichen, die den sortierten Messwerten entsprechen, zum ersten Pixelcluster, worin der erste Pixelcluster vordefinierte Größenkriterien erfüllt und das Vorhandensein zumindest einer der Einheiten anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 34, worin der Schritt des Sortierens weiters folgende Schritte umfasst: das Berechnen einer Hintergrundrauschhöhe auf Basis der Datenwerte; und das Anordnen in abfallender Reihenfolge eines Satzes der Datenwerte, die die Rauschhöhe um eine Nutz-Schwelle übersteigen.
Verfahren nach Anspruch 35, worin der ausgewählte erste Schwellenwert dem größten aus dem angeordneten Satz von Datenwerten entspricht.
Verfahren nach Anspruch 36, worin der Schritt des Gruppierens weiters folgende Schritte umfasst: das Identifizieren von Datenwerten innerhalb des angeordneten Satzes von Datenwerten, die Pixelbereichen (246) nahe dem Kern des ersten Pixelclusters zugeordnet sind, und das Gruppieren der identifizierten Datenwerte in das erste Pixelcluster.
Verfahren nach Anspruch 37, worin der Schritt des Identifizierens weiters folgende Schritte umfasst: das Speichern eines Satzes von Radii, die angeben, ob Pixelbereiche, die den angeordneten Datenwerten zugeordnet sind, an vordefinierten Positionen nahe dem ersten Kern vorliegen; das Berechnen einer optimalen Clusterfläche, die den ersten Kern umschreibt, auf Basis der gespeicherten Radii, worin die identifizierten Datenwerte den angeordneten Datenwerten entsprechen, die Pixelbereichen (246) innerhalb der optimalen Clusterfläche zugeordnet sind.
Verfahren nach Anspruch 38, worin der Schritt des Gruppierens weiters den Schritt des Benennens des größten der angeordneten Datenwerte, der einem Pixelbereich (246) zugeordnet ist, der nicht im ersten Cluster enthalten ist, als Kern eines zweiten Pixelclusters umfasst.