DE69333425T2

DE69333425T2 - Gegenstände mit bioaktiven Oberflächen

Info

Publication number: DE69333425T2
Application number: DE69333425T
Authority: DE
Inventors: Allan H. Anoka Jevne; Matthew A. Brooklyn Park Bergan; James R. Maplewood KEOGH; Christopher M. Tonka Bay Hobot; John W. Troy Eaton
Original assignee: Medtronic Inc
Current assignee: Medtronic Inc
Priority date: 1992-10-30
Filing date: 1993-10-14
Publication date: 2004-12-02
Anticipated expiration: 2013-10-15
Also published as: JP2691854B2; US5545213A; US5476509A; JPH0716291A; EP0596615B1; DE69333425D1; EP0596615A1; US5344455A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Gegenstände (im Folgenden „Gegenstände mit Blutkontakt" genannt), welche bei Verwendung mit Blut oder Blutprodukten in Berührung kommen, und insbesondere solche Gegenstände mit einer polymeren Angriffsfläche (Angriffsfläche).
Seit über vierzig Jahren sind eine Reihe von medizintechnischen Geräten, die mit dem Blut oder Blutprodukten von lebenden Menschen oder Tieren in Kontakt kommen, entwickelt, hergestellt und klinisch eingesetzt worden. Beispiele solcher Gegenstände sind Schrittmacher, Arterienimplantate, Herzklappen, künstliche Herzen, Herzpumpen, Hüftprothesen, Herz-Lungen-Maschinen, Katheter und Ausrüstung für die Nierendialyse.
Ein Hauptproblem bei solchen Gegenständen ist, dass ihre Angriffsflächen (Oberflächen mit Blutkontakt, das heißt Oberflächen, die mit Blut oder Blutprodukten wie beispielsweise Serum, Plasma und anderen aus Blut gewonnenen Flüssigkeiten und Feststoffen in Kontakt kommen) Blut und Blutprodukten fremd sind und dazu neigen, unter anderem die Zerstörung roter Blutkörperchen und die Blutkoagulation bis zur Bildung von Blutgerinnseln (Thrombogenese) einzuleiten.
Normales intaktes Endothel ist nicht thrombogen, was teilweise auf die Synthese von Heparansulfat zurückzuführen ist. Heparansulfat neigt dazu, an der Oberfläche von Endothelzellen gebunden zu bleiben, wobei die Deaktivierung von Thrombin, dem für die Polymerisation von Fibrinogen zu Fibrin bei der Bildung von Blutgerinnseln verantwortlichen Enzym, durch Antithrombin III (ATIII) beschleunigt wird. Heparansulfat ist ein sehr starkes Antikoagulanz in den natürlichen Blutgefäßen. Folglich ist es für Ärzte und die Pharmaindustrie von großem Interesse gewesen, mit Blut in Kontakt kommende polymere Oberflächen zu entwickeln, die Charakteristika von Heparansulfat besitzen, insbesondere durch das Beschichten von Oberflächen mit Heparin. Beispielsweise werden in US-A-3826678 (Hoffman et al.) biologisch aktive Moleküle chemisch an Polymere und Copolymere, die zuvor auf polymere Trägermaterialien wie Polyurethan und Polyethylen durch Strahlung gepfropft wurden, gebunden. Das Pfropfpolymer ist vorzugsweise ein hydrophiles Hydrogel (zum Beispiel ein Hydroxyethylmethacrylat-(HEMA)Polymer) und kann an das Hydrogel gebundenes Heparin beinhalten.
Ein weiteres Hauptproblem bei solchen Gegenständen ist ihre Anfälligkeit für Post-Implantations-Infektionen. Staph. epidermis, die auf der menschlichen Haut leben, und Staph. aureus, die manchmal in Krankenhausumgebungen zu finden sind, sind die beiden häufigsten pathogenen Erreger, denen man beim Implantieren und in ähnlichen Situationen ausgesetzt ist. Sie haben beide die Fähigkeit, durch die Operationsöffnung in den Körper einzudringen und das Implantat anzugreifen. Dieses Problem ist beispielsweise in US-A-4442133 (Greco et al.) angesprochen worden, in dem ein PTFE- oder Dracon-Implantat mit in Ethanol gelöstem TDMAC (Tridodecylmethylammoniumchlorid) getränkt wird. Das TDMAC wird adsorbiert, so dass es eine Beschichtung bildet, und wird dann mit einer Lösung eines Antibiotikums, zum Beispiel Penicillin oder Cefoxitin, inkubiert. Auch wird beispielsweise in US-A-4612337 (Fox, Jr., et al.) ein polymeres Material wie PTFE in Lösungen von Antibiotika in einem organischen Lösungsmittel getränkt, dann in einem organischen Lösungsmittel mit einem Metallsalz getränkt und anschließend wieder mit der Lösung aus Antibiotikum und organischem Lösungsmittel getränkt.
Es besteht daher ein offensichtlicher Bedarf an neuen und verbesserten thromboresistenten und infektionsresistenten Gegenständen.
Es wurde nunmehr herausgefunden, dass Gegenstände, die bei Verwendung mit Blut oder Blutprodukten in Berührung kommen, in dieser Hinsicht verbesserte Eigenschaften aufweisen, wenn sie eine Angriffsfläche aufweisen, die eine polymere Oberfläche mit einem speziellen, darauf gepfropften Vinyl-Pfropfpolymer, an das ein Biowirkstoff gekoppelt ist, umfasst.
Demnach ist ein Aspekt der Erfindung die Bereitstellung eines Gegenstandes zur Verwendung im Kontakt mit Blut oder Blutprodukten, wobei dieser Gegenstand wenigstens eine exponierte Oberfläche aufweist, die von einem polymeren Substrat ausgebildet ist, woran ein von einem hydrophilen Vinylmonomer abgeleitetes Pfropfpolymer kovalent gepfropft ist, und wobei an das Pfropfpolymer ein Biowirkstoff gekoppelt ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Pfropfpolymer gebundene Gruppen mit ionischer Ladung umfasst und das bioaktive Agens eine ionische Ladung mit einer zu den gebundenen Gruppen des Pfropfpolymers entgegengesetzten Polarität, so dass das bioaktive Agens auf dem Pfropfpolymer durch ionische Wechselwirkung gebunden ist. Vorzugsweise ist das Pfropfpolymer ein Polymer oder Copolymer eines unter Acrylsäure (AA), Acrylamid (AAm), N-(3-Aminopropyl)methacrylamid (APMA), 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure (AMPS) und Salzen davon ausgewählten Vinylmonomers.
In den erfindungsgemäßen Gegenständen ist der Biowirkstoff ionisch an das Pfropfpolymer gekoppelt und kann ein antibiotischer oder antimikrobieller Wirkstoff, beispielsweise Silber oder Gentamycin, oder ein anderer konventioneller Infektionen bekämpfender Wirkstoff, oder ein Antikoagulanz oder ein anderer Thrombogenese bekämpfender Biowirkstoff sein. Die polymere Substrat-Oberfläche des Gegenstandes, auf die das Pfropfpolymer gepfropft ist, ist geeigneterweise ein Polyurethan, wie beispielsweise ein Polyetherurethan. Die Vorteile, die solch ein Gegenstand bietet, schließen Eigenschaften von sowohl hydrophilen Beschichtungen als auch Biowirkstoffen ein. Beispielsweise sind antimikrobielle Wirkstoffe in der Lage, Post-Implantations-Infektionen zu bekämpfen, während hydrophile Beschichtungen wie beispielsweise eine AMPS-haltige Beschichtung Thrombose reduzieren können und glatte Oberflächen bereitstellen.
In dem erfindungsgemäßen Gegenstand mit Blutkontakt umfasst das Pfropfpolymer Seitengruppen mit ionischer Ladung, und der Biowirkstoff ist ionisch dadurch daran gekoppelt, dass er eine ionische Ladung entgegengesetzter Polarität zu der der Seitengruppen des Pfropfpolymers hat. Beispielsweise kann das Pfropfpolymer AMPS oder APMA sein, und der Biowirkstoff kann Gentamycin oder basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) sein. Der Biowirkstoff ist auf diese Weise durch ionische Anziehungskräfte an den Gegenstand gekoppelt und wird auf diesem festgehalten.
In dem erfindungsgemäßen Gegenstand mit Blutkontakt kann ein Albuminbindender Farbstoff wie beispielsweise Blaudextran als Biowirkstoff eingesetzt werden und kann ionisch an das Pfropfpolymer, zum Beispiel an ein APMA/AAm-Copolymer, gebunden werden. Die Oberfläche zieht dann Albumin aus dem mit der Oberfläche des Gegenstandes in Kontakt stehenden Blut an.
In dem erfindungsgemäßen Gegenstand mit Blutkontakt kann das Pfropfpolymer benutzt werden, um eine Einstellung der Hydrophilie und das Koppeln des Biowirkstoffes durch geeignete Auswahl der Monomere für das Pfropfpolymer aus AAm, AA, AMPS, HEMA und APMA in den vorgegebenen Mengenverhältnissen zu gewährleisten. Beispielsweise kann ein Copolymer aus APMA und AAm auf eine Polyurethan-Oberfläche gepfropft werden, und Heparin kann an das Pfropfpolymer gekoppelt werden.
Die Erfindung ermöglicht das gleichzeitige Lösen einer Reihe von Problemen, mit denen man bei implantierbaren Gegenständen konfrontiert wird. Die Erfindung bezieht Eigenschaften von hydrophilen Beschichtungen und Biowirkstoffen, beispielsweise antimikrobiellen Wirkstoffen, die in der Lage sind, sowohl Post-Implantations-Infektionen als auch Thrombose zu bekämpfen, solange sie glatte Oberflächen bereitstellen, ein. Andere Biowirkstoffe werden ebenfalls in Betracht gezogen.
So wird die Erfindung dem Bedürfnis nach neuen und verbesserten thromboresistenten/infektionsresistenten Gegenständen mit Blutkontakt gerecht, zum Beispiel durch Bereitstellen dieser Gegenstände mit antimikrobiellen Wirkstoffen, was eine bakterizide Wirksamkeit dieses Polymers zur Folge haben kann, oder mit antikoagulierenden Wirkstoffen, um ihm Thromboresistenz zu verleihen.
Wie oben jedoch angedeutet, ist es manchmal ebenfalls wünschenswert, Biowirkstoffe, die von antimikrobiellen und antikoagulierenden Wirkstoffen verschieden sind, in diesen Gegenständen mit einzubeziehen.
Das Substrat einer Angriffsfläche eines für den Kontakt mit Blut oder Blutprodukten vorgesehenen Gegenstandes umfasst im Allgemeinen ein biologisch inertes polymeres Material. Ein hydrophiles Pfropfpolymer mit einer durch anionische oder kationische Seitengruppen darauf verursachten Nettoladung ist permanent kovalent durch Pfropfpolymerisation an das polymere Substrat gebunden. Diese Pfropfpolymere können so ausgewählt werden, dass man thromboresistente Gleitbeschichtungen erhält, die sich für ionisches Koppeln (sofern sie so ausgewählt werden, dass eine entsprechende Ladung verschieden von der des Biowirkstoffes zur Verfügung steht) mit verschiedenen ionischen Biowirkstoffen eignen. Ionisches Koppeln des Biowirkstoffes an das Pfropfpolymer kann man durch einfaches Eintauchen des oberflächengepfropften Polymers in eine Lösung des gewünschten Biowirkstoffes erzielen.
Die verschiedenen, von dieser Erfindung umfassten Gegenstände können beispielsweise polymere Substrate mit fester Phase haben, die aus der unten in Tabelle 1 gezeigten Gruppe von Materialien ausgewählt sind.
Tabelle 1

Polyamide
Polycarbonate
Polyether
Polyester
Polyolefine
Polystyrol
Polyurethan
Polyvinylchloride
Silikone
Polyethylene
Polypropylene
Polyisoprene
Polytetrafluorethylene

Derzeit nimmt man an, dass Polyurethan das bevorzugte polymere Substrat für die vorliegende Erfindung ist.
Das geeigneterweise verwendete Pfropfpolymer geht von einem pfropfenden, hydrophilen Monomer aus. Solche Monomere bilden eine hydrophile Polymerbeschichtung auf der Substratoberfläche. Eine hydrophile Beschichtung minimiert Protein-Wechselwirkungen und stattet zudem die Oberfläche mit Gleiteigenschaften aus. Das Monomer muss mindestens eine Vinyl-Gruppe umfassen. Die Vinyl-Gruppe ist für das Eintreten der radikalischen Polymerisation notwendig. Das Monomer kann neutral, anionisch oder kationisch sein. Nach dem Pfropfen (und gegebenenfalls notwendigen chemischen Modifikationen) sollte das erhaltene Pfropfpolymer eine positive Nettoladung oder eine negative Nettoladung aufweisen. Die Ladung erlaubt die ionische Bindung entgegengesetzt geladener bioaktiver Moleküle. Neutrale Monomere können nach dem Pfropfen chemisch modifiziert werden, um anionische oder kationische Oberflächen hervorzubringen. Beispielsweise kann gepfropftes Acrylamid zu Acrylsäure hydrolisiert werden, so dass sich eine anionische Oberfläche bildet.
Insbesondere wurden eine Anzahl von gepfropften Gleitbeschichtungen erfindungsgemäß eingesetzt. Am meisten bevorzugt sind diejenigen, die aus auf die Substratoberflächen mittels Kettenstart durch Cer-Ionen gepfropften Monomeren bestehen. Sowohl Monomere mit kationischen als auch Monomere mit anionischen Gruppen wurden gepfropft. Ein Beispiel für Erstere sind N-(3-Aminopropyl-)methacrylat (APMA) und dessen Copolymere, während ein wichtiges Beispiel für Letztere 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure (AMPS) ist.
Diese geladenen Oberflächen eignen sich für das ionische Koppeln geladener Biowirkstoffe. Das ionische Koppeln der Biowirkstoffe bietet den Vorteil, dass diese Wirkstoffe unter geeigneten Bedingungen nur langsam freigesetzt werden. Beispiele antimikrobieller Biowirkstoffe sind Gentamycinsulfat und Silber-Ionen. Allgemein können unter den in Tabelle 2 gezeigten Typen ausgewählte Biowirkstoffe erfindungsgemäß für ionisches Koppeln eingesetzt werden.
Tabelle 2

Antibakterielle Wirkstoffe oder antimikrobielle Wirkstoffe
Antikoagulantien
Enzyme
Katalysatoren
Hormone
Wachstumsfaktoren
Lecithin-Wikrkstoffe
Vitamine
Antikörper
Antigene
Nukleinsäuren
Farbstoffe, die als biologische Liganden fungieren
DNA- und RNA-Segmente
Proteine
Peptide

So aus einem weiteren Blickwinkel betrachtet, stellt die Erfindung ein Verfahren zur Bereitstellung eines implantierbaren Gegenstandes mit einer bioaktiven Oberfläche zur Verfügung, wobei dieser Prozess die folgenden Schritte umfasst:
Pfropfpolymerisation eines hydrophilen Vinylmonomers mit Seitengruppen, die gegebenenfalls eine ionische Ladung tragen, auf einer exponierten Polymeroberfläche dieses Gegenstandes,
gegebenenfalls chemisches Modifizieren der Oberfläche des resultierenden Pfropfpolymers, um eine ionisch geladene oder ionisierbare Oberfläche zu erhalten, und
ionisches Koppeln eines Biowirkstoffes an die Oberfläche dieses Pfropfpolymers.
Gemäßeiner bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein implantierbarer Gegenstand mit einer bioaktiven Oberfläche bereitgestellt, in dem man:
einen implantierbaren, eine exponierte Polymeroberfläche aufweisenden Gegenstand mit einer wässerigen Lösung von Ce(IV)-Ionen und einem Vinylmonomer in Kontakt bringt, wobei man eine Pfropfpolymer-Oberfläche auf dieser polymeren Oberfläche erzeugt, und einen Biowirkstoff an diese Pfropfpolymer-Oberfläche anbindet. Die wässerige Monomer-Lösung kann ein oder mehrere Vinylmonomere enthalten, und der implantierbare Gegenstand kann nacheinander mit verschiedenen Lösungen in Kontakt gebracht werden, wodurch geschichtete oder copolymere Propfpolymer-Oberflächen gebildet werden, falls dies so gewünscht ist.
Daher umfasst eine Ausführungsform des Verfahrens folgende Schritte:

a) Zubereiten einer wässerigen Lösung aus AMPS und Ce(IV)-Ionen;
b) In Kontakt bringen einer polymeren Oberfläche eines implantierbaren Gegenstandes mit dieser wässerigen Lösung für eine Zeitdauer, die ausreicht, um ein an die Oberfläche gepfropftes Polymer von AMPS zu erhalten; und
c) Binden eines Biowirkstoffes an die gepfropfte Oberfläche.

Bei dieser Ausführungsform findet die Bindung des Biowirkstoffes beispielsweise durch ionische Bindung statt, zum Beispiel einer kationischen antimikrobiellen Verbindung wie Gentamycin, Kanamycin, Neomycin, Silber-Ionen, Chlorhexidin, Vancomycin, Streptomycin oder Erythromycin, oder eines Wirkstoffes wie ein basischer Fibroblastenwachstumsfaktor, oder eines kationischen Farbstoffes wie Toluidin-Blau.
Eine weitere Ausführungsform des Verfahrens umfasst folgende Schritte:

(a) Zubereiten einer wässerigen Lösung aus AAm, APMA und Ce(IV)-Ionen;
(b) In Kontakt bringen einer polymeren Oberfläche eines implantierbaren Gegenstandes mit dieser wässerigen Lösung für eine effektive Zeitdauer, um ein an die Oberfläche gepfropftes Polymer des AAm und APMA zu erhalten; und
(c) Binden eines Biowirkstoffes an die gepfropfte Oberfläche.

Bei dieser Ausführungsform findet die Bindung des Biowirkstoffes auch beispielsweise durch ionische Bindung statt, zum Beispiel einer anionischen antimikrobiellen Verbindung wie Ampicillin, Oxacillin, Cefazolin, Bacitracin, Cephalosporin, Cephalothin, Cefuroxin, Cefoxitin, Norfloxacin, Perfloxacin oder Sulfadiazin, oder eines anionischen Farbstoffes wie Ponceau S.
Während der Initiierung durch Cer-Ionen (Ce(IV)), die derzeit bevorzugteste Technik ist, die zum Pfropfen von Monomeren auf Oberflächen eingesetzt wird, sind andere Pfropftechniken ebenfalls bekannt und können in geeigneten Situationen angewendet werden. Beispielsweise sind Corona-Entladung, UV-Bestrahlung und ionisierende Strahlung (⁶⁰Co, Röntgenstrahlung, Hochenergieelektronenstrahlung, Plasma-Gasentladung) bekannt. Diese Techniken sind Beispiele dafür, wie man freie Radikale auf einer Angriffsfläche eines polymeren Substrats erzeugt. Die darauf erzeugten freien Radikale initiieren die Pfropfung der Vinylmonomere (CH₂=CH-R).
Das ionische Koppeln eines Biowirkstoffes wird einfach durch Eintauchen des oberflächengepfropften Polymers in eine Lösung des gewünschten Biowirkstoffes erreicht. Beispielsweise wurden im Fall der antimikrobiellen Wirkstoffe bakterizide Prüfungen (Hemmhofmethode) auf AMPS/AgNO₃- und AMPS/Gentamycin-Sulfat-Oberflächen durchgeführt. Signifikante antibakterielle Wirksamkeit wurde erreicht. Im Fall der AMPS/Gentamycin-Sulfat-Oberfläche wurde die volle Wirksamkeit selbst nach 24-stündigem Spülen mit entionisiertem Wasser erhalten.
Obwohl die folgende, detaillierte Erörterung Beispiele erwähnt, in denen Filme wie die Polymersubstrat-Oberflächen behandelt werden, ist es nicht beabsichtigt, die Erfindung darauf zu beschränken. Gepfropfte hydrophile, mit Biowirkstoffen ionisch gekoppelte Oberflächen können entsprechend an andere Substratoberflächen gebunden werden, beispielsweise Oberflächen von für den Kontakt mit Blut oder Blutprodukten bestimmten Gegenständen, von Gegenständen jeglicher Form oder Gestaltung einschließlich rohr-, blatt-, oder stabförmiger Gestaltung und Gegenstände in einer für den Einsatz in künstlichen Organen geeigneten Form, in Ausrüstung zur Blutbehandlung oder in Körperimplantaten jeglicher Art und für jegliches einkapselndes Mittel hierfür.
Die Bereitstellung von Gegenständen für den Körperkontakt mit einer ionisch geladenen Pfropfpolymer-Oberfläche wie in den erfindungsgemäßen Gegenständen mit Blutkontakt kann auch genutzt werden, um eine Wechselwirkung zwischen ionischen Biowirkstoffen, die dem Körper durch die Auswahl eines Pfropfpolymers mit einer Oberflächenladung gegensätzlicher Polarität zu der des aktiven Ions des Biowirkstoffes eingegeben werden, zu verhindern.
Wie bereits erläutert, ist gesundes intaktes Endothel nicht thrombogen, teilweise aufgrund der Synthese von Heparansulfat. Das Heparansulfat neigt dazu, auf der Oberfläche der Endothelzellen gebunden zu bleiben und beschleunigt die Inaktivierung von Thrombin, dem für die Polymerisation von Fibrinogen zu Fibrin bei der Gerinsel-Bildung durch ATIII verantwortlichen Enzym. Heparansulfat ist ein sehr wirksames Antikoagulans in den natürlichen Geweben.
Heparin ist ein stark saures Aminoglycan. Es weist einen hohen Gehalt an N- und O-Sulfatgruppen auf. Heparin ist dem Heparan strukturell ähnlich, obwohl es stärker sulfatiert ist. Die antikoagulierende Wirkung von Heparin hängt direkt ab von seinen molekularen Größen und elektrischer Ladung, und somit führt eine Erhöhung des Molekulargewichts und/oder des Sulfonierungsgrades zu einer Erhöhung der antikoagulierenden Wirkung. Daher stimuliert ein hochgradig sulfoniertes Polymer die Inaktivierung von Thrombin durch ATIII, vergleichbar dem Heparin.
Die 2-Acrylamidosulfonsäure(AMPS)-Beschichtung zieht auf die Herstellung einer Oberfläche ab, die aufgrund ihrer Hydrophilie zu einer Verringerung der nichtspezifischen Absorption verschiedener Proteine führt und eine hochgradig sulfonierte Oberfläche bereitstellt, die bevorzugt ATIII adsorbiert.
Im Bezug auf die AMPS-Arbeit dieser Erfindung wurde ein hoher Aufwand in die Entwicklung einer allgemeinen Technik zur Oberflächenmodifizierung von Polyurethan mit AMPS gesteckt, jedoch kann diese Technik mit geringfügigen Modifikationen für Oberflächen anderer Materialien verwendet werden. Die im Folgenden detailliert beschriebene Technik basiert auf der Erzeugung freier Radikale auf einer Polyurethan-Oberfläche mit Ce(IV)-Ionen und der Pfropfpolymerisation von AMPS-Monomeren direkt auf dieser Oberfläche.
Das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäßen Gegenstände werden nun näher an Hand von Illustrationen mit Bezug auf die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele und die dazugehörigen Zeichnungen beschrieben:
1 zeigt ein Diagramm, das die Menge des Farbstoffes Toluidin-Blau zeigt, die von den mit AMPS gepfropften Oberflächen von Pellethan 55D Polyurethan und von Pellethan 55D Polyurethan abgegeben wird;
2 zeigt ein Diagramm, das einen Vergleich von ATIII-Wirksamkeit von unbeschichtetem Pellethan 55D Polyurethan, mit Heparin beschichtetem Pellethan 55D Polyurethan und mit AMPS beschichtetem Pellethan 55D Polyurethan zeigt (die Ergebnisse sind als Menge an durch die Probenobertläche deaktiviertem Thrombin/cm² ausgedrückt);
3 zeigt ein Diagramm, das den Hemmhof von Pellethan 55D Polyurethan, mit AMPS beschichtetem Pellethan 55D Polyurethan und mit AMPS beschichtetem Pellethan 55D Polyurethan, das adsorbiertes Gentamycin enthält, (die eingesetzten Bakterien waren S. epidermis) zeigt;
4 zeigt ein Diagramm, das die Elutionsrate von Gentamycin aus Proben von mit AMPS gepfropften Pellethan 55D Polyurethan-Proben in entionisiertem Wasser, 0,9%iger NaCl-Lösung und 10%iger NaCl-Lösung zeigt, wie durch die Hemmhofmethode gemessen;
5 zeigt ein Diagramm, das die ATIII-Wirksamkeit von mit AMPS beschichtetem Pellethan 55D Polyurethan, das Gentamycin enthält, und von mit AMPS beschichtetem Pellethan 55D Polyurethan nach 24-stündiger Elution von Gentamycin zeigt;
6 zeigt ein Diagramm, das die Menge des Fibroblastenwachstumsfaktors zeigt, der an Polyurethan (PU) und an mit Acrylamid (AAm), N-(3-Aminopropyl)methacrylamidhydrochlorid (APMA) und Acrylamid(AAm)-Copolymeren oder 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure (AMPS) gepfropftes Polyurethan bindet;
7 zeigt ein Diagramm, das die Adsorption des Farbstoffes Toluidin-Blau für die gleichen Substrate wie in 6 zeigt (d. h. PU, AAm, APMA/AAm und AMPS);
8 zeigt ein Diagramm, das die Adsorption des Farbstoffes Ponceau S. für die gleichen Substrate wie in 6 und 7 zeigt (d. h. PU, AAm, APMA/AAm und AMPS);
9a zeigt einen postulierten Reaktionsmechanismus für den Kettenstart mit Ce(IV)-Ionen als Radikalbildner auf einer Polyurethan-Oberfläche;
9b zeigt eine Pfropfpolymerisation von AAm und APMA auf einer durch Ce(IV)-Ionen aktivierten Polyurethan-Oberfläche;
10 zeigt die Oxidation von Dextran mit Periodat;
11 zeigt die reduktive Aminierung (Schiff'sche Base-Reaktion) von oxidiertem Dextran und gepfropften APMA;
12 zeigt die Stabilisation von Imin-Verbindungen mit Natriumcyanborhydrid;
13 zeigt kovalent an oberflächengebundenes Dextran gekoppelten Farbstoff Cibracon-Blau;
14 zeigt ein Diagramm, das die Adsorption von ¹²⁵I-Albumin an Pellethan 55D Polyurethan, mit Blaudextran vollständig derivatisiertem Pellethan 55D Polyurethan (55D/BD) und mit Blaudextran oberflächenderivatisiertem Pellethan 55D Polyurethan (Blaudextran) zeigt;
15 zeigt ein Diagramm, das die Adsorption von ¹²⁵I-Albumin an unbeschichtetes Pellethan 55D Polyurethan, an mit APMA/AAm oberflächenbeschichtetes Pellethan 55D Polyurethan, an mit Dextran oberflächenbeschichtetes Pellethan 55D Polyurethan und an mit Blaudextran oberflächenbeschichtetes Pellethan 55D Polyurethan zeigt;
16 zeigt ein Diagramm, das den Immunogold-Assay von Albumin zeigt, das an Proben von mit APMA/AAm oberflächenbeschichtetem Pellethan 55D Polyurethan, mit Dextran oberflächenbeschichtetem Pellethan 55D Polyurethan und mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem Pellethan 55D Polyurethan aus frischem menschlichen Blutplasma adsorbiert wird (die Ergebnisse sind ausgedrückt als Goldpartikel/cm²);
17 zeigt ein Diagramm, das die Adsorption von ¹²⁵I-Albumin an mit Blaudextran oberflächenbeschichtetes Pellethan 55D Polyurethan zeigt, wobei die Proben getrocknet und 1 Stunde in PBS rehydratisiert wurden (die Ergebnisse sind ausgedrückt als % der ursprünglichen Albumin-Adsorption);
18 zeigt ein Diagramm, das die selektive Adsorption von Albumin in Gegenwart von Fibrinogen an Proben von Pellethan 55D Polyurethan und von mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem Pellethan 55D Polyurethan zeigt (die Ergebnisse sind ausgedrückt in % des an der Oberfläche adsorbierten Gesamtproteins (wobei es sich um Albumin handelt);
19 zeigt ein Diagramm, das den Anteil in % des adsorbierten Albumins zeigt, das von Proben von Pellethan 55D Polyurethan und von mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem Pellethan 55D Polyurethan während eines Waschens mit einprozentiger SDS-Lösung entfernt wurde;
20 zeigt ein Diagramm, das die konkurrierende Verdrängung von ¹²⁵I-Albumin auf Proben von mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem Pellethan 55D Polyurethan und von unbeschichtetem Pellethan 55D Polyurethan zeigt, die in entweder PBS oder PBS-haltigem Blaudextran gewaschen wurden (die Ergebnisse sind ausgedrückt in % des während des Waschens mit Blaudextrans aus den Proben entfernten Albumins);
21 zeigt ein Diagramm, das einen Vergleich der ATIII-Wirksamkeit von Proben von unbeschichtetem Pellethan 55D Polyurethan, von mit CBAS (Heparin) beschichtetem Pellethan 55D Polyurethan und von mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem Pellethan 55D Polyurethan zeigt (die Ergebnisse sind ausgedrückt als die Menge an durch die Probenoberflächen deaktivierten Thrombins/cm²);
22 zeigt ein Diagramm, das die prozentuale Abnahme der bakteriellen Adhäsion an Proben von mit Blaudextran oberflächenderivatisiertem Pellethan 55D im Vergleich zu nicht derivatisiertem Pellethan 55D ohne Albumin und mit Pre-Albumin-Adsorption zeigt;
23 zeigt eine schematische Formel, die verschiedene, ein Polymer bildende Monomere zeigt; und
24 zeigt ein Diagramm, das die Menge an auf der Oberfläche von mit CBAS beschichtetem Pellethan 55D Polyurethan und von mit Heparin beschichtetem Pellethan 55D Polyurethan deaktiviertem Thrombin in IU/cm² zeigt.
Beispiel 1
Extrudiertes Pellethan 55D Polyurethan wurde als ein Polyurethan-Material verwendet. Es ist erhältlich bei der DOW Chemical Company of Midland, Michigan 48640, USA. Filme des Pellethan 55D Polyurethans wurden über 72 Stunden in Azeton und in Ethanol für weitere 72 Stunden vor dem Pfropfen mit Ce(IV)-Ionen extrahiert. Das Verfahren der Lösungsmittel-Extraktion entfernt jegliche Prozesshilfsmittel, die den Pfropfprozess beeinträchtigen könnten. Es wurde eine 50%ige AMPS-Monomer-Lösung in entionisiertem Wasser zubereitet, und 20 ml der Ce(IV)-Ionen-Lösung wurde auf 100 ml der Monomer-Lösung gegeben. Die Ce(IV)-Ionen-Lösung bestand aus 2,74 g Cerammoniumnitrat und 3,15 g Salpetersäure in 50 ml entionisiertem Wasser. Die Ce(IV)-Monomer-Lösung wurde dann vor dem Pfropfen entgast und von Stickstoff befreit. Proben von Pellethan 55D Polyurethan wurden dann in die entgaste Monomer-Lösung gegeben und diese wurden gerührt. Das Pfropfen fand über einen Zeitraum von 2 Stunden statt. Gepfropfte Proben wurden dann entfernt und gründlich in entionisiertem Wasser gewaschen.
Die Anwesenheit von Sulfonsäuregruppen auf mit AMPS gepfropftem Material wurde unter Verwendung des Farbstoffes Toluidin-Blau bestimmt. Durch seine positive Ladung lagert sich der Farbstoff Toluidin-Blau an negativ geladenen Oberflächen an. Daher weist die Anlagerung von Toluidin-Blau an die AMPS-Oberflächen auf die Anwesenheit von negativen Ladungen auf Grund der Sulfonsäuregruppen in AMPS hin. Mit AMPS gepfropfte Proben wurden 1 Minute in eine 1%ige Lösung des Farbstoffes Toluidin-Blau in entionisiertem Wasser gegeben und anschließend in entionisiertem Wasser gespült. Der gebundene Farbstoff wurde dann von der Oberfläche mit einer 1%igen Lösung aus Natriumdodecylsulfat (SDS) in entionisiertem Wasser entfernt. Die Menge an eluiertem Farbstoff wurde durch Spektralfotometrie bei 640 nm bestimmt. Die Menge an Farbstoff, die aus Proben von Pellethan 55D Polyurethan und von mit AMPS gepfropftem Pellethan 55D Polyurethan abgegeben wurden, sind in 1 dargestellt.
Wie die Ergebnisse zeigen, adsorbierte Pellethan 55D Polyurethan, das kein AMPS enthält, keinen Toluidin-Blau-Farbstoff. Das ist darauf zurückzuführen, dass Pellethan 55D Polyurethan keine negativ geladenen Gruppen enthält. Die AMPS-Beschichtung adsorbierte jedoch eine große Menge des Farbstoffes Toluidin-Blau, was auf die Anwesenheit von Sulfonsäuregruppen auf der Oberfläche hinweist. Weil die AMPS-Oberfläche eine große Anzahl an Sulfonsäuregruppen enthielt, wurde seine Fähigkeit, ATIII zu binden, als nächstes näher untersucht.
Beispiel 2
Da das Koagulieren auf Materialien, deren Oberflächen mit AMPS beschichtet sind, auf Grund der Aktivierung von ATIII durch die Sulfonsäuregruppen, die auf der modifizierten Oberfläche des Polymersubstrats anwesend sind, verzögert werden kann, wurde die oberflächenvermittelte Aktivierung von ATIII durch mit AMPS beschichteten Proben bewertet. Proben wurden erst in phosphatgepufferter salzhaltiger Lösung (PBS) 15 Minuten gespült, bevor sie ATIII ausgesetzt wurden. Im Anschluss an das Spülen wurden die Proben 15 Minuten einem Überschuss an gereinigtem ATIII (50 IU/ml) ausgesetzt. Nicht adsorbiertes ATIII wurde durch rasches Spülen in Tris-gepufferter Salzlösung mit einem pH-Wert von 7,4 bei 25°C (100 mM NaCl und 50 mM Tris) entfernt. Die Menge des an der Oberfläche gebundenen und aktivierten ATIII wurde dann ermittelt, indem die Proben mit einem Überschuss an Thrombin inkubiert wurden. Nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten unter konstantem Mischen bei 25°C wurde das überschüssige Thrombin über die Reaktion mit einem chromogenen Substrat (H-D-Phenylanalyl-L-pipecolyl-arginin-p-nitroaniliddichlorid) in einem Spektralfotometer gemessen. Die Veränderung in der Absorption bei 405 nm wurde gemessen.
Die Ergebnisse werden in 2 dargestellt. Wie die Ergebnisse zeigen, scheint die Oberflächenderivatisierung mit AMPS eine Heparin-artige Wirksamkeit aufzuweisen. Tatsächlich stellt sich heraus, dass die mit AMPS beschichteten Proben eine höhere ATIII-Wirksamkeit als die mit CBAS^® (Carmeda^® Bioactive Surface) beschichteten Polyurethan-Proben besitzen. CBAS^® ist eine Heparin-Beschichtung, erhältlich bei Carmeda AB, einer schwedischen Firma. Dieser Heparin-artige Effekt ist zurückzuführen auf die in der AMPS-Beschichtung vorhandenen Sulfonsäuregruppen. Daher erwartet man, dass die AMPS-Beschichtung nicht-thrombogene Eigenschaften, die üblicherweise mit Heparin beschichteten Materialien zugesprochen werden, besitzt.
INFEKTIONSRESISTENTE BESCHICHTUNG MIT AMPS/GENTAMYCIN
Ein großes Problem bei implantierbaren polymeren Gegenständen ist ihre Anfälligkeit für Post-Implantations-Infektion. Stagh. epidermis, die auf der menschlichen Haut leben, und Staph. aureus, die man manchmal in Krankenhausumgebungen findet, sind die beiden häufigsten pathogenen Erreger. Beide besitzen die Fähigkeit, durch die Operationsöffnung in den Körper einzudringen und das Implantat anzugreifen. Obwohl ein solches Risiko durch gute Operationstechniken und eine saubere Umgebung des Operationsraumes minimiert werden kann, kann man es nicht vollständig ausräumen. Darüber hinaus sind die Folgen einer Post-Implantations-Infektion fast immer schwerwiegend. Bis zu 5% der Implantate (abhängig von dem implantierten Gerät) werden infiziert; Krankheit/Tod ist in den meisten Fällen die Folge.
Die meisten Arbeiten mit Prototypen zum Erfassen von Daten bei antimikrobiellen Additionen an AMPS wurden mit Gentamycin durchgeführt. Es wurde festgestellt, dass es die Fähigkeit hat, ionisch an die AMPS-Beschichtung zu binden. Kommerziell ist Gentamycin meist als ein Sulfat-Salz erhältlich. Da AMPS eine Sulfonsäure als funktionale Gruppe enthält, hat man festgestellt, dass die Immersion eines mit AMPS beschichteten Polymers in eine Gentamycin-Sulfat-Lösung eine Adsorption von Gentamycin an die Oberfläche zur Folge hat. Darüber hinaus, eluierte das adsorbierte Gentamycin in vitro von der Oberfläche, was der AMPS-Oberfläche eine bakterizide Wirksamkeit verleiht. Als Folge führte die geeignete Zugabe von antibakteriellen Wirkstoffen zu den AMPS-Beschichtungen zu einer sowohl infektionsresistenten als auch nicht-thrombogenen Beschichtung.
Beispiel 3
Das Verfahren, zur Beladung der AMPS-Oberflächen mit Gentamycin wurde wie folgt durchgeführt. Eine AMPS-Oberfläche wurde auf einem Polymersubstrat wie oben beschrieben hergestellt. Die mit AMPS beschichteten Polymere wurden dann in eine wässerige (üblicherweise 5% w/w) Lösung aus Gentamycin-Sulfat getaucht; diese Immersion benötigt nur 3 Minuten. Bei Beendigung der Immersion wurden die Proben entnommen, 10 bis 15 Sekunden in entionisiertem Wasser gespült, luftgetrocknet und dann gelagert.
Proben wurden in Hinblick auf antibakterielle Wirksamkeit mit Hilfe der „Hemmhofmethode" (ring of inhibition) analysiert. Die Hemmhofmethode wird in der Literatur als In-vitro-Test für die antibakterielle Wirksamkeit eines Medikamentes oder eines medikamentenbeladenen Systems beschrieben. Sie wird wie folgt durchgeführt. Auf einer Agar-Platte mit Blut wird mit dem zu testenden bakteriellen Organismus eine Kultur angelegt und über Nacht inkubiert. Eine oder zwei Kolonien von dieser Platte werden dann abgetupft und in eine Trisgepufferte salzhaltige (TBS) Lösung bis zu einer Standard-Trübung (1,5*10⁹/ml nach Macfarland Standards) eingerührt. Diese bakterielle Lösung wird dann auf einer Mueller-Hinton Agar-Platte als Strichkultur angelegt. Die zu testenden Proben werden dann gemeinsam mit einer positiven und einer negativen Kontrolle auf das Agar gepresst oder darin eingebettet. Die positive Kontrolle sollte eine medikamentenbeladene Probe mit genau definierten antibakteriellen Eigenschaften sein; die negative Kontrolle sollte eine Probe ohne Medikament sein. Ein oder zwei Proben (abhängig von ihrer Größe) können dann auf der gleichen Platte ausgetestet werden. Wenn das Agar einmal mit Proben beladen ist, wird es auf den Kopf gestellt und über Nacht bei 37°C inkubiert. Am nächsten Tag kann die Platte aus der Inkubation entnommen werden und der von Bakterien unbewachsene Hemmhof kann um jede Probe herum gemessen werden. Die Bereiche bakteriellen Wachstums und Hemmung sind deutlich sichtbar. Das normale trübe Erscheinungsbild von Bakterien auf Agar fehlt in den Bereichen gehemmten Wachstums völlig. Der Hemmhof wird einfach mit einem Lineal gemessen (ist der „Hof" länglich, wird ein ungefährer durchschnittlicher Radius bestimmt). Die Hemmhofmethode ist ein gutes Maß für die relative Wirksamkeit verschiedener mit Medikamenten beladener Materialien.
S. epidermis war der Test-Organismus für alle Tests nach der Hemmhofmethode, die im Zusammenhang mit mit AMPS beschichteten Polymeren, wie hierin beschrieben, durchgeführt wurden.
Das Diagramm in 3 veranschaulicht die bakteriziden Eigenschaften von adsorbiertes Gentamycin enthaltenden AMPS-Beschichtungen. 3 zeigt im Vergleich die Wirksamkeit gegen S. epidermis von Pellethan 55D Polyurethan, von Pellethan 55D Polyurethan mit mit AMPS gepfropfter Beschichtung und von mit AMPS beschichtetem Pellethan 55D Polyurethan mit adsorbiertem Gentamycin.
Wie die Ergebnisse in 3 erkennen lassen, gab es keine bakteriziden Eigenschaften im Zusammenhang mit einfachem Pellethan 55D Polyurethan oder mit dem mit AMPS gepfropften Pellethan 55D Polyurethan. Allerdings wies das mit AMPS gepfropfte, adsorbiertes Gentamycin enthaltende Pellethan 55D Polyurethan eine signifikante bakterizide Wirksamkeit auf. Die Fähigkeit des Gentamycins, von den mit AMPS gepfropften Oberflächen unter verschiedenen ionischen Gegebenheiten zu eluieren, wurde als nächstes untersucht.
4 zeigt die Ergebnisse eines Elutionstests, der durchgeführt wurde, um zu bestimmen, wie die Ionenstärke die Elutionsrate des Gentamycins von der AMPS-Beschichtung beeinflusst. Man erkennt, dass je größer die Ionenstärke der Vorratslösung ist, desto schneller der Hemmhof abnimmt, und desto größer deshalb die Elutionsrate des Gentamycins von der Oberfläche ist. Dies zeigt nicht nur, dass ionische Bindung von Wirkstoffen an Beschichtungen stattgefunden hat, sondern auch, dass bei einer physiologischen Ionenstärke (Konzentration von 0,9%) die Desorptionsrate förderlich für eine langzeitliche, langsame Abgabe von Wirkstoffen ist. Diese Kinetik ist auffallend ähnlich der der Diffusion von Wirkstoffen aus einer durchgängig beladenen Matrix, woran man erkennt, dass therapeutische Mengen an Wirkstoffen über eine relativ lange Zeitspanne freigesetzt werden.
Beispiel 4
Das folgende Beispiel wurde ausgearbeitet, um zu bestimmen, ob die Adsorption von Gentamycin die Wirksamkeit von ATIII auf einer mit AMPS beschichteten Oberfläche herabsetzt. Es besteht aus der Beladung von mit AMPS gepfropften Oberflächen mit Gentamycin durch Immersion in einer wässerigen (üblicherweise 5% w/w) Lösung aus Gentamycin-Sulfat über 5 Minuten. Nach Fertigstellung der Immersion in Gentamycin wurden die Proben entfernt, 10 bis 15 Sekunden in entionisiertem Wasser gespült und entweder getrocknet oder 24 Stunden in eine 10%ige NaCl-Lösung gegeben. Die Proben wurden dann auf ATIII-Wirksamkeit untersucht.
Die Proben wurden zuerst 15 Minuten in phosphatgepufferter salzhaltiger Lösung (PBS) gespült, bevor sie ATIII ausgesetzt wurden. Im Anschluss an das Spülen wurden die Proben 15 Minuten einem Überschuss an gereinigtem ATIII (50 IU/ml) ausgesetzt. Nicht adsorbiertes ATIII wurde durch schnelles Spülen in Trisgepufferter salzhaltiger Lösung, pH-Wert von 7,4 bei 25°C (100 mM NaCl und 50 mM Tris), entfernt. Die Menge der an der Oberfläche gebundene und aktivierten ATIII wurde dann ermittelt, indem die Proben mit einem Überschuss an Thrombin inkubiert wurden. Nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten unter konstantem Mischen bei 25°C wurde das überschüssige Thrombin über die Reaktion mit einem chromogenen Substrat (N-D-Phenylanalyl-L-pipecolyl-L-arginin-p-nitroaniliddichlorid) in einem Spektralfotometer gemessen. Die Veränderung in der Absorption bei 405 nm wurde gemessen. Die Ergebnisse sind in 5 dargestellt. Wie die Ergebnisse veranschaulichen, behält die AMPS-Oberfläche, die adsorbiertes Gentamycin enthält, einen großen Prozentsatz (74%) ihrer ursprünglichen ATIII-Wirksamkeit. Die ATIII-Wirksamkeit, die die AMPS-Oberfläche auf Grund des adsorbierten Gentamycins verliert, kehrt mit der Elution des Gentamycins wieder. Daraus lässt sich schließen, dass die AMPS-Beschichtung einen Großteil ihrer antithrombogenen Eigenschaften besitzt, während sie mit Gentamycin beladen ist, und alle ihre antithrombogenen Eigenschaften mit der Elution von Gentamycin wiedererlangt. Daher ist eine solche Beschichtung nicht-thrombogen und bakterienresistent.
Die Idee, die sich hinter der Beschichtung mit AMPS verbirgt, ist die Bereitstellung einer Heparin-artigen Oberfläche, um Thrombogenität zu vermeiden, mit dem Nebeneffekt, implantierbare Geräte mit Gleiteigenschaften zu versehen. Die oben erörterten Daten veranschaulichen, dass die Beschichtung tatsächlich eine Heparin-artige Oberfläche auf Grund seiner selektiven Adsorption von ATIII schafft. Zusätzlich zu diesen antithrombogenen Eigenschaften wurde festgestellt, dass die anionische AMPS-Beschichtung die Fähigkeit besitzt, kationische antimikrobielle Wirkstoffe ionisch zu binden und langsam freizusetzen, so dass sie der Oberfläche zusätzlich langfristige bioaktive Eigenschaften verleiht. Es stellte sich heraus, dass sich diese Zugabe von Biowirkstoffen nicht nachteilig auf die Fähigkeit der AMPS-Oberfläche, ATIII selektiv zu adsorbieren, auswirkte. Diese Ergebnisse lassen erkennen, dass die AMPS-Beschichtung eine wirkungsvolle sowohl nicht-thrombogene als auch infektionsresistente Oberflächenmodifikation ist, die die Biokompatibilität von implantierbaren, polymeren Medizingeräten signifikant erhöht.
Andere Beispiele kationischer antimikrobieller Wirkstoffe (gebunden durch negativ geladene Oberflächen) werden in untenstehender Tabelle 3 aufgezeigt.
Tabelle 3

Gentamycin
Kanamycin
Neomycin
Silber-Ionen
Chlorhexidin
Vancomycin
Streptomycin
Erythromycin

Spezielle Beispiele anionischer antimikrobieller Wirkstoffe (gebunden durch positiv geladene Oberflächen) werden in untenstehender Tabelle 4 aufgezeigt.
Tabelle 4

Ampicillin
Oxacillin
Cefazolin
Bacitracin
Cephalosporin
Cefuroxin
Cefoxitin
Norfloxacin
Perfloxacin
Sulfadiazin

AN IONISCH GELADENE OBERFLÄCHEN BINDENDER BASISCHER FIBROBLASTENWACHSTUMSFAKTOR (PFROPFPOLYMER)
Basischer Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) wurde aus vielen Ausgangsgeweben isoliert und ist ein Einzelketten-Protein mit einem ungefähren Molekulargewicht von 18.000. Es ist ein kationisches Protein mit einem isoelektrischen Punkt von 9. Das Binden von bFGF an ionisch geladene Oberflächen wird im Folgenden veranschaulicht.
Dabei verwendete Polyurethan-Proben wiesen entweder negativ geladene, positiv geladene oder neutrale hydrophile Pfropfpolymer-Oberflächen auf. Die modifizierten Polyurethan-Oberflächen wurden über ein Pfropfen mit Cer-Ionen hergestellt. Nicht beschichtete Polyurethan-Proben (PU) wurden ebenfalls verwendet.
Beispiel 5
Ungeladene Proben (AAm)
Ungeladene Polyurethan-Proben (1 cm²) wurden hergestellt, indem die Proben 45 Minuten bei Umgebungstemperatur in die folgenden entgasten Pfropflösungen gegeben wurden.
50 g Acrylamid (AAm)
1,1 g Cerammoniumnitrat
1,3 g Salpetersäure
70 ml entionisiertes Wasser
Im Anschluss an das Pfropfen wurden die Proben gründlich in entionisiertem Wasser gespült.
Beispiel 6
Positiv geladene Proben (APMA/AAm)
Positiv geladene Polyurethan-Proben (1 cm²) wurden hergestellt, indem die Proben 45 Minuten bei Umgebungstemperatur in die folgenden entgasten Pfropflösungen gegeben wurden.
40 g Acrylamid (AAm)
10 g N-(3-Aminopropyl)methacrylamidhydrochlorid (APMA)
1,1 g Cerammoniumnitrat
1,3 g Salpetersäure
70 ml entionisiertes Wasser
Im Anschluss an das Pfropfen wurden die Proben gründlich in entionisiertem Wasser gespült.
Beispiel 7
Negativ geladene Proben (AMPS)
Negativ geladene Polyurethan-Proben (1 cm²) wurden hergestellt, indem die Proben 2 Stunden bei Umgebungstemperatur in die folgenden entgasten Pfropflösungen gegeben wurden.
50 g 2-Acrylamid-2-methylpropansulfonsäure (AMPS)
1,1 g Cerammoniumnitrat
1,3 g Salpetersäure
70 ml entionisiertes Wasser
Im Anschluss an das Pfropfen wurden die Proben gründlich in entionisiertem Wasser gespült.
Ergebnisse – Beispiele 5 bis 7
Die gepfropften Proben (1 cm²) wurden dann in 24 Well-Gewebeplatten aus Polystyren-Gewebe gegeben und mit Silikon-Gummiringen fixiert. Die Proben wurden bis zur Untersuchung zur Befeuchtung in Wasser bei Umgebungstemperatur gelagert.
Verdünnte bFGF wurde in phosphatgepufferte salzhaltige Lösung (PBS) mit 1 mg/ml Albumin aus Rinderserum (BSA) gegeben. Die Proben wurden über Nacht bei 25°C inkubiert. Drei Konzentrationen von bFGF wurden untersucht: 0,5 ng/ml, 5 ng/ml und 50 ng/ml. Man gab 0,1 mg ¹²⁵I-markierte bFGF zu jedem Well bis zu einem Gesamtvolumen von 0,5 ml pro Well. Die Proben wurden mit PBS gewaschen. Anschließend wurden die Proben wurden in einem Beckmann-Gamma-Zähler ausgezählt.
Tabelle 5
Wie man aus den Daten der Tabelle 5 und der 6 ersieht, ist die Menge an Fibroblastenwachstumsfaktor, der an die unterschiedlichen Oberflächen bindet, dargestellt. Wie die Ergebnisse zeigen, adsorbierten die negativ geladenen Proben (AMPS) erheblich mehr bFGF als die anderen Proben.
Wollte man andererseits den gegenteiligen Effekt erzielen, d. h. Abstoßung anstelle von Anziehung, würde man ein Pfropfpolymer bzw. einen Biowirkstoff mit gleichartigen Ladungen (+,+) oder (–,–) wählen. Das kann in solchen Fällen gemacht werden, wenn man jegliche Wechselwirkung zwischen diesen zu minimieren wünscht. So kann es beispielsweise wünschenswert sein, Peptid-Wechselwirkungen in Bezug auf eine implantierte Oberfläche zu minimieren. Um dies zu erreichen, kann man hydrophile Polymere auf die zu implantierende Oberfläche pfropfen, die gleichartige Ladungen aufweist wie das Peptid von Interesse, so dass das Fehlen von Wechselwirkungen durch die Ladungsabstoßung unterstützt wird. Als Beispiel ist 6 zu sehen, woraus man eine APMA/AAm-Beschichtung wählen könnte, um bFGF abzustoßen. Man betrachte 7, woraus man eine APMA/AAm-Beschichtung wählen könnte, um Toluidin-Blau abzustoßen. Zuletzt betrachte man 8, woraus man eine AMPS-Beschichtung wählen könnte, um Ponceau S. abzustoßen.
IONISCHE BINDUNG VON FARBSTOFFEN AN GELADENE OBERFLÄCHEN (PFROPFPOLYMER)
Die Fähigkeit eines kationischen und eines anionischen Farbstoffes, an geladene Oberflächen zu binden, wurde ebenfalls untersucht. Das ist auf Grund des Konzeptes, verschiedene Farbstoffe als biologische Liganden zu verwenden, von Interesse. Der in dieser Studie verwendete kationische Farbstoff war Toluidin-Blau, und der verwendete anionische Farbstoff war Ponceau S.
Hierbei verwendete Polyurethan-Substratproben wiesen entweder negativ geladene, positiv geladene oder ungeladene hydrophile Oberflächen auf. Die Polyurethan-Oberflächen wurden mittels Pfropfen mit Cer-Ionen hergestellt. Unbeschichtete Polyurethan-Proben (PU) wurden ebenfalls verwendet.
Beispiel 8
Ungeladene Proben (AAm)
Ungeladene Polyurethan-Proben (1 cm²) wurden hergestellt, indem die Proben 45 Minuten bei Umgebungstemperatur in die folgenden entgasten Pfropflösungen gegeben wurden.
50 g Acrylamid (AAm)
1,1 g Cerammoniumnitrat
1,3 g Salpetersäure
70 ml entionisiertes Wasser
Im Anschluss an das Pfropfen wurden die Proben gründlich in entionisiertem Wasser gespült.
Beispiel 9
Positiv geladene Proben (APMA/AAm)
Positiv geladene Polyurethan-Proben (1 cm²) wurden hergestellt, indem die Proben 45 Minuten bei Umgebungstemperatur in die folgenden entgasten Pfropflösungen gegeben wurden.
40 g Acrylamid (AAm)
10 g N-(3-Aminopropyl)methacrylamidhydrochlorid (APMA)
1,1 g Cerammoniumnitrat
1,3 g Salpetersäure
70 ml entionisiertes Wasser
Im Anschluss an das Pfropfen wurden die Proben gründlich in entionisiertem Wasser gespült.
Beispiel 10
Negativ geladene Proben (AMPS)
Negativ geladene Polyurethan-Proben (1 cm²) wurden hergestellt, indem die Proben 2 Stunden bei Umgebungstemperatur in die folgenden entgasten Pfropflösungen gegeben wurden.
50 g 2-Acrylamid-2-methylpropansulfonsäure (AMPS)
1,1 g Cerammoniumnitrat
1,3 g Salpetersäure
70 ml entionisiertes Wasser
Im Anschluss an das Pfropfen wurden die Proben gründlich in entionisiertem Wasser gespült.
Ergebnisse – Beispiele 8 bis 10
Die gepfropften Proben aus den Beispielen 8 bis 10 (1 cm²) wurden 1 Minute entweder in eine Lösung aus 1% des Farbstoffes Toluidin-Blau in entionisiertem Wasser (12a–14a) oder in eine Lösung aus 1% des Farbstoffes Ponceau S. in entionisiertem Wasser (12b–14b) gegeben. Im Anschluss an das Färben wurden die Proben gründlich mit 500 ml entionisiertem Wasser gespült. Gefärbte Proben wurden in einer Lösung aus 1% Natriumdodecylsulfat (SDS) in entionisiertem Wasser 24 Stunden bewegt.
Die Extinktion jeder eluierten Farbstoff enthaltenden SDS-Probe-Lösung wurde dann in einem Beckmann DU 64 Spektralfotometer bei einer Wellenlänge von 640 nm für den Farbstoff Toluidin-Blau und bei 520 nm für den Farbstoff Ponceau S. gemessen.
Die Menge des an jeder Probe adsorbierten Farbstoffs wird dann errechnet, indem die Extinktion der Probe mit einer standardisierten Extinktionskurve verglichen wird, bei der bekannte Mengen des Farbstoffes verwendet wurden. Die Ergebnisse für die Extinktion des Farbstoffes Toluidin-Blau werden sowohl in Tabelle 6 als auch in 7 dargestellt.
Tabelle 6
Ähnliche Ergebnisse werden in Tabelle 7 und 8 für die Extinktion des Farbstoffes Ponceau S. dargestellt.
Tabelle 7
Wie die Ergebnisse erkennen lassen, adsorbierten die negativ geladenen Proben (AMPS) erheblich mehr kationischen Farbstoff (Toluidin-Blau) als die anderen Proben. Dahingegen adsorbierten die positiv geladenen Proben (APMA/AAm) erheblich mehr des anionischen Farbstoffes (Ponceau S.) als die anderen Proben.
KOVALENTES BINDEN VON BIOWIRKSTOFFEN
Das Konzept, Biowirkstoffe wie beispielsweise Farbstoffe kovalent auf implantierbare Materialien, beispielsweise aus Polyurethan, zu binden, die gepfropfte Gleitbeschichtungen aufweisen, ist ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Materialien mit Oberflächen, die bevorzugt Albumin binden, werden weniger thrombogen, weniger entzündungsfördernd und weniger anfällig dafür sein, pathogene Bakterien zu beherbergen.
Die vorliegende Erfindung beschreibt hierin Verfahren, um Blaudextran, Dextran oder den Farbstoff Cibacron-Blau kovalent an eine gepfropfte Polymeroberfläche zu binden. Das Binden dieser Wirkstoffe basiert auf der Erzeugung freier Radikale auf der Oberfläche eines basischen Materials und der Copolymerisation von Vinylmonomeren direkt an diese Oberfläche, gefolgt von dem kovalenten Binden von Biowirkstoffen, d. h. Blaudextran, Dextran oder des Farbstoffes Cibacron-Blau. Im Bereich der Pfropf-Copolymerisation auf Materialien wurde von einer Anzahl von Verfahren berichtet. Pfropf-Copolymerisation stellt ein Verfahren zur Verfügung, um die Zusammensetzung des gepfropften Polymers durch das Variieren der Monomere und das Variieren ihrer Konzentrationen zu steuern. Es ist möglich, gepfropfte Oberflächen mit folgenden Eigenschaften zu schaffen:

1. Hydrophilie.
2. Keine nicht-spezifischen Wechselwirkungen mit Proteinen im allgemeinen.
3. Eine ausreichende Anzahl aktiver Gruppen, die für die chemische Funktionalisierung und Modifikation zugänglich sind, die für das kovalente Binden von Biowirkstoffen, wie beispielsweise Blaudextran, Dextran oder des Farbstoffes Cibacron-Blau, erforderlich ist.
4. Mechanische, chemische und enzymatische Stabilität.

Um Oberflächen mit dem gewünschten Maß an Hydrophilie und der gewünschten Menge funktionaler Gruppen, die für das Koppeln der Biowirkstoffe gebraucht werden, zu erzeugen, kann das Pfropfen stöchiometrisch in die Wege geleitet werden. Hydrophile Spacer-Monomere (neutral, anionisch und kationisch) können ausgewählt werden, um entsprechend geladene hydrophile Spacer zu erzeugen. Kopplungsmonomere können auf der Grundlage ihrer funktionalen Seitengruppen, beispielsweise -OH, -NH₂, -CHO, -NCO, die für das Immobilisieren eines Biowirkstoffes, beispielsweise Blaudextran, Dextran oder des Farbstoffes Cibacron-Blau benötigt werden, ausgewählt werden.
Pfropf-Copolymerisation auf Poly(etherurethan) mit Ce(IV)-Ionen war die angewendete Methode. Die verwendeten Monomere sind Acrylamid (AAm) und N-(3-Aminopropyl)methacrylamidhydrochlorid (APMA). Diese Monomere wurden teilweise auf Grund ihrer Reaktivitäts- und Wasserlöslichkeits-Charakteristika ausgewählt. Das AAm-Monomer wird als hydrophiles Spacer-Monomer eingesetzt.
Das APMA-Monomer wird als Kopplungsmonomereingesetzt. AAm wurde extensiv als Matrix für die Affinitäts-Chromatografie eingesetzt. AAm ist ein neutrales hydrophiles Monomer; daher zeigten Polymere von AAm wenig Protein-Assoziation. APMA ist ein Aminogruppen enthaltendes Monomer, das die Bindung von Blaudextran, Dextran oder des Farbstoffes Cibacron-Blau erlaubt.
Der Farbstoff Cibacron-Blau kann direkt mit der funktionalen Aminogruppe des APMA-Monomers durch sein reaktives Chlor im Triazin-Ring reagieren. Dextran und Blaudextran können an die Aminogruppe des APMA über eine stabilisierte Schiff'sche Base-Reaktion kovalent gebunden werden. Das Dextran oder Blaudextran wird erst mit Hilfe von Natriumperiodat oxidiert. Die Oxidation bildet reaktive Aldehydgruppen, die mit den primären Aminen auf dem APMA reagieren, wobei sie Imine bilden. Die Imine werden mit Hilfe von Natriumcyanborhydrid stabilisiert.
Der Farbstoff Cibacron-Blau kann mit dem kovalent gebundenen Dextran zu Blaudextran auf der Oberfläche des Materials reagieren. Dies ermöglicht, so viel Farbstoff wie gewünscht auf der Oberfläche zu binden. Darüber hinaus kann das gebundene Dextran in gewünschter Weise im Molekulargewicht verändert werden.
VERFAHREN ZUR OBERFLÄCHENBESCHICHTUNG MIT BLAUDEXTRAN
Das Verfahren zur Oberflächenderivatisierung mit Blaudextran beginnt mit der Pfropf-Copolymerisation von AAm- und APMA-Monomeren auf eine saubere Polyurethan-Oberfläche mit Ce(IV)-Ionen. Das Ce(IV)-Ion bildet ein freies Radikal auf der Polyurethan-Oberfläche, das die Pfropf-Copolymerisation der Acrylamide (9a und b) startet. Das APMA-Monomer enthält eine primäre Aminogruppe, die dann für das Koppeln von Dextran, das später mit dem Farbstoff Cibacron-Blau gefärbt wird, verwendet wird. Das Anbinden von Dextran umfasst zunächst das Oxidieren des Kohlenwasserstoffes mit Natriumperiodat, wobei Aldehydgruppen (10) gebildet werden. Diese Aldehydgruppen werden dann kovalent an die primären Aminogruppen auf dem gepfropften APMA-Monomer durch reduktive Aminierung (Schiff'sche Base-Reaktion) gebunden (11). Natriumcyanborhydrid (NaCNBH₃) wird verwendet, um die Imin-Verbindung zu stabilisieren (12). Schließlich wird der Farbstoff Cibacron-Blau kovalent an das oberflächengebundene Dextran gekoppelt (13).
Der Umfang der Oberflächenaminierung (der Pfropf-Copolymerisation von APMA und AAm), die auf der Polyurethan-Oberfläche stattfindet, kann durch Monomerkonzentrationen, Katalysatorkonzentrationen und die Pfropfzeit beeinflusst werden. Daher wurde eine Untersuchung zur Bestimmung der optimalen Pfropfbedingungen für eine hoch aminierte Polyurethan-Oberfläche durchgeführt. Den Umfang der erhaltenen Oberflächenaminierung bestimmt man über das Einfärben der Oberfläche mit dem Farbstoff Ponceau S., einem negativ geladenen Farbstoff-Molekül. Der Farbstoff geht eine ionische Bindung mit primären Aminen auf der aminierten Oberfläche ein. Nach dem Einfärben wird der Farbstoff von der Oberfläche mit Hilfe von SDS gelöst und durch Spektralfotometrie bei 520 nm quantifiziert.
Beispiel 11
Verfahren zum APMA/AAm-Pfropfen
Extrudierte Pellethan 55D Filme wurden vor dem Pfropfen mit Ce(IV)-Ionen in Azeton und Ethanol extrahiert. Das Verfahren der Lösungsmittel-Extraktion entfernt jegliche Prozesshilfsmittel, die den Pfropfprozess beeinträchtigen könnten. Es wurden Monomer-Lösungen in entionisiertem Wasser zubereitet, und verschiedene Konzentrationen der Ce(IV)-Ionen-Lösung wurden zugegeben. Die Ce(IV)-Ionen-Lösung bestand aus 2,74 g Cerammoniumnitrat und 3,15 g Salpetersäure in 50 ml entionisiertem Wasser. Die Ce(IV)-Monomer-Lösung wurde vor dem Pfropfen entgast und von Stickstoff befreit. Proben von Pellethan 55D wurden in die entgaste Monomer-Lösung gegeben und gerührt. Das Pfropfen konnte über verschiedene Zeiträume stattfinden. Die Proben wurden dann entfernt und gründlich in entionisiertem Wasser gewaschen.
Der Umfang der Oberflächenaminierung, die auf Grund der Pfropf-Copolymerisation der Proben stattfand, wurde mit Hilfe des Farbstoffes Ponceau S. bestimmt. Gepfropfte Proben wurden 1 Minute in eine 1%ige Lösung des Farbstoffes Ponceau S. in entionisiertem Wasser gegeben und dann in entionisiertem Wasser gespült. Der gebundene Farbstoff wurde dann von der Oberfläche unter Verwendung von 1%iger SDS-Lösung gelöst. Die Menge an eluiertem Farbstoff wurde anschließend durch Spektralfotometrie bei 520 nm bestimmt.
Tabelle 8 beschreibt die verschiedenen, verwendeten Pfropf-Bedingungen und den Umfang der erreichten Oberflächenaminierung, die durch die Einfärbe-Methode mit Ponceau S. bestimmt wurde. Basierend auf diesen Ergebnissen wurden Proben unter Verwendung einer absoluten Monomerkonzentration von 50%, einer Reaktionszeit von 30 Minuten, einer Katalysatorkonzentration von 20 und einem AMPA/AAm-Monomer-Verhältnis von 0,10 (10%/90%) gepfropft.
Beispiel 12
Bindung von Dextran an aminierte Polyurethan-Oberflächen
Dextran wurde zuerst oxidiert, indem 1,0 g davon in 18 g entionisiertes Wasser, das 1,0 g NaIO₄ enthielt, gegeben wurde. Die Mischung wurde 2 Stunden im Dunkeln inkubiert. Die oxidierte Mischung wurde dann 24 Stunden gegen entionisiertes Wasser dialysiert, um jegliches überschüssiges Periodat zu entfernen. Mit APMA/AAm gepfropfte Proben von Pellethan 55D wurden dann 1 Stunde bei Umgebungstemperatur in die oxidierte Dextran-Lösung gegeben, gefolgt von der Zugabe von NaCNBH₃ (3 mg/ml). Die erhaltene Mischung ließ man 2 Stunden bei Umgebungstemperatur reagieren. Die Proben wurden dann entfernt und gründlich in entionisiertem Wasser gespült.
Beispiel 13
Kovalent gekoppeltes Dextran enthaltende Proben wurden anschließend mit dem Farbstoff Cibacron-Blau gefärbt.
Die Proben wurden über Nacht in eine Färbelösung aus 1,0 g Farbstoff Cibacron-Blau, 4,0 g NaCl und 12,0 g NaHCO₃ in 200 ml entionisiertem Wasser gegeben. Dann wurden die Blaudextran-Proben gründlich in entionisiertem Wasser gespült.
REM-Analyse von mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem Material (Beispiel 13)
Es wurde eine Raster-Elektronenmikroskopie (REM) an Oberflächen von mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem Pellethan 55D durchgeführt. Die Oberflächen wurden bei einer 6000-fachen Vergrößerung untersucht. REM-Bilder der Oberfläche zeigen, dass sich die Blaudextran/APMA/AAm-Beschichtung ungefähr 2 μm dick und einheitlich über die Oberfläche verteilt zeigt.
Tabelle 8 Oberflächenaminierung von Pellethan 55D-Filmen
ESCA-Analyse von mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem Material
ESCA wurde durchgeführt auf unbeschichteten Pellethan 55D Proben (Kontrolle), mit APMA/AAm oberflächenbeschichteten Pellethan 55D Proben, mit Dextran oberflächenbeschichteten Pellethan 55D Proben und mit Blaudextran oberflächenbeschichteten Pellethan 55D Proben (Tabelle 9). Wie die Ergebnisse zeigen, ist Blaudextran auf der Oberfläche des mit Blaudextran oberflächenbeschichteten Materials vorhanden. Das wird durch eine Abnahme des Kohlenstoffanteiles, eine Zunahme des Sauerstoffanteiles und eine Zunahme des Schwefelanteiles deutlich.
Tabelle 9
Dehnungseigenschaften von mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem Material
Dehnungseigenschaften von mit Blaudextran oberflächenbeschichteten Pellethan 55D Filmen, von mit Dextran oberflächenderivatisierten Pellethan 55D Filmen, von mit APMA/AAm oberflächenderivatisierten Pellethan 55D Filmen und Pellethan 55D Filmen wurden unter Verwendung einer mechanischen Instron-Prüfvorrichtung gemessen. Wie in Tabelle 10 gezeigt wird, verändern der Schritt der Pfropf-Copolymerisation und weitere Derivatisierungsschritte der Methode zur Oberflächenderivatisierung mit Blaudextran die physikalischen Eigenschaften von Polyurethan nicht wesentlich.
Tabelle 10
BEISPIEL 14
Die Adsorption von Albumin auf oberflächenbeschichtetem Material
Das Ausmaß der Bindung von mit radioaktiven Isotopen markiertem Albumin an mit Blaudextran oberflächenbeschichteten Proben, mit Blaudextran vollständig beladenen Proben (55D/BD) und Proben von Pellethan 55D (Kontrolle) wurden untersucht. Die Proben wurden jeweils 15 Minuten in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gespült und danach 15 Minuten in ¹²⁵I-Albumin (0,08 mg/ml) inkubiert. Die Proben wurden entnommen und erneut in PBS gewaschen und in einem Szintillationszähler ausgezählt. Die Ergebnisse (14) zeigen, dass die mit Blaudextran oberflächenbeschichteten Proben mehr Albumin adsorbierten als die 55D-Kontroll-Proben und mehr als die vollständig beladenen 55D/BD-Proben.
BEISPIEL 15
Die Adsorption von Albumin auf oberflächenbeschichtetem Blaudextran
Das Ausmaß der Bindung von mit radioaktiven Isotopen markiertem Albumin an mit Blaudextran oberflächenbeschichteten Proben, mit Dextran oberflächenbeschichteten Proben, mit APMA/AAm oberflächenbeschichteten Proben und unbeschichteten 55D-Proben wurde untersucht. Diese Untersuchung wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Bindung von Albumin auf die Anwesenheit des Farbstoffes Cibacron-Blau in der Blaudextran-Beschichtung oder statt dessen auf die darunter liegenden Dextran- oder APMA/AAm-Beschichtungen zurückzuführen ist. Die Proben wurden jeweils 15 Minuten in PBS gespült und anschließend 15 Minuten in ¹²⁵I-Albumin (0,08 mg/ml) inkubiert. Die Proben wurden dann entnommen und erneut in PBS gewaschen und in einem Szintillationszähler ausgezählt. Die Ergebnisse (15) zeigen, dass die mit Blaudextran oberflächenbeschichteten Proben wesentlich mehr Albumin adsorbierten als die anderen Proben. Die Zunahme in der Adsorption von Albumin ist daher auf die Anwesenheit des Farbstoffes Cibacron-Blau in der Blaudextran-Beschichtung zurückzuführen.
BEISPIEL 16
Immunogold-Assay von an oberflächenbeschichtetem Material adsorbiertem Albumin
Eine andere Untersuchung wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob die Bindung von Albumin wieder auf die Anwesenheit von Cibacron-Blau Farbstoff in der Blaudextran-Beschichtung oder auf die darunter liegenden Dextran- oder APMA/AAm-Beschichtungen zurückzuführen ist. In dieser Untersuchung wurden die Proben jeweils 15 Minuten in PBS gespült und danach 45 Minuten bei 37°C in frischem menschlichen Plasma inkubiert. Die Proben wurden dann 5 Minuten in PBS gespült. Im Anschluss an das Spülen wurden die Proben 7 Minuten in eine 1,0%ige Glutaraldehyd-Lösung gegeben und dann 10 Minuten in PBS gespült. Die Proben wurden dann 7 Minuten in 1 ml einer 50 mM Glyzin-Lösung gegeben. Die Proben wurden dann wieder 10 Minuten in PBS gespült. Im Anschluss an das Spülen wurden die Proben eine Stunde bei 37°C in 1 ml einer 15%igen Milch-Lösung, die 10 μg einer Protein A-Lösung enthielt, inkubiert. Die Proben wurden dann 10 Minuten in PBS gespült. Im Anschluss an das Spülen wurden die Proben in 0,5 ml Hasen-Antihuman-Albumin gegeben und 1 Stunde bei 37°C inkubiert. Die Proben wurden dann 10 Minuten in PBS gespült. Im Anschluss an das Spülen wurden die Proben über Nacht bei 4°C in 1 ml einer 2,5%igen Glutaraldehyd-Lösung inkubiert. Nach dem Inkubieren in der Glutaraldehyd-Lösung wurden die Proben 10 Minuten in PBS gespült. Die Proben wurden dann 25 Minuten in 1 ml einer 50 mM Glyzin-Lösung gegeben, gefolgt von einer einstündigen Inkubation in 0,5 ml einer Gold-markierten Protein A-Lösung bei 37°C. Die Proben wurden dann 10 Minuten in PBS und 10 Minuten in entionisiertem Wasser gespült. Eine Lösung zur Silber-Anreicherung (0,5 ml) wurde dann 15 Minuten zu den Proben gegeben. Die Proben wurden entnommen, und ihre Oberflächen wurden mit einem Rasterelektronenmikroskop (REM) aufgenommen. Die Anzahl der Partikeln auf den REM-Aufnahmen der Oberflächen von mit APMA/AAm oberflächenderivatisiertem 55D, mit Dextran oberflächenderivatisiertem 55D und mit Blaudextran oberflächenderivatisiertem 55D wurden ausgezählt und in 16 dargestellt.
Wie die Ergebnisse zeigen, gibt es keine signifikante Differenz zwischen Dextran- und APMA/AAm-Oberflächen; allerdings gibt es signifikant mehr Albumin auf Blaudextran-Oberflächen.
BEISPIEL 17
Trocknungs- und Rehydratisations-Effekte auf Albumin-Bindungen
Es gab einige Bedenken, dass die Blaudextran-Oberfläche, wenn sie austrocknet, einen Teil ihrer Albumin-bindenden Wirksamkeit verlieren könnte, da die Oberfläche extrem hydrophil ist. Daher wurden Untersuchungen zur Dehydratation/Rehydratation durchgeführt. Mit Blaudextran oberflächenbeschichtete Proben von Pellethan 55D wurden im Ofen bei 50°C getrocknet und dann auf Albumin-Adsorption getestet. Einige der getrockneten Proben wurden eine Stunde in PBS rehydratisiert und dann auf Albumin-Adsorption getestet. Um die Albumin-Adsorption zu testen, wurden die Proben 15 Minuten in ¹²⁵I-Albumin (0,08 mg/ml) inkubiert, anschließend in PBS gespült und in einem Szintillationszähler ausgezählt. Wie die Ergebnisse in 17 erkennen lassen, verringert das Austrocknen der Oberfläche seine Albumin-Wirksamkeit, allerdings scheint die Rehydratation der getrockneten Proben diese wiederherzustellen.
Beispiel 18
Die selektive Bindung von Albumin an oberflächenbeschichtetes Material
Die selektive Bindung von Albumin an mit Blaudextran gepfropfte Oberflächen in Anwesenheit von Fibrinogen wurde als nächstes bestimmt, indem eine 50/50-Mischung aus Albumin/¹²⁵I-Fibrinogen und ¹²⁵I-Albumin/Fibrinogen eingesetzt wurde. Fibrinogen war anwesend, um die nicht spezifische Bindung von Proteinen an die Oberfläche zu bestimmen und weil Oberflächen, die bereitwillig Fibrinogen adsorbieren, hochgradig thrombogen sein können. Daher wurden die Proben 15 Minuten einer Mischung entweder aus Albumin/¹²⁵I-Fibrinogen oder aus ¹²⁵I-Albumin/Fibrinogen ausgesetzt und anschließend mit PBS gespült. Im Anschluss an das Spülen mit PBS wurden die Proben in einem Szintillationszähler ausgezählt. Wie in 18 gezeigt, wiesen die mit Blaudextran oberflächenbeschichteten Proben trotz der Anwesenheit von Fibrinogen eine höhere Fähigkeit auf, Albumin selektiv zu adsorbieren. Die Reversibilität der Albumin-Adsorption an mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem Material wurde als nächstes untersucht.
Beispiel 19
Die reversible Bindung von Albumin an oberflächenbeschichtetem Material
Die reversible Bindung von Albumin wurde bestimmt, indem seine Elutionsfähigkeit durch das Waschen mit 1%iger SDS untersucht wurde. Protein, das im Anschluss an ein Waschen mit SDS an einer Oberfläche haften bleibt, wird als denaturiert und irreversibel gebunden betrachtet (vergleiche Rapoza et al. J. Biomedical Materials Research 24: 1263–1287 (1990)).
Die Proben wurden deshalb fünf Stunden in ¹²⁵I-Albumin inkubiert, dann entnommen und eine Stunde in einer 1%igen SDS-Lösung gewaschen. Wie 19 zeigt, wurden ungefähr 95% des ursprünglich an die mit Blaudextran gepfropfte Oberfläche adsorbierten Albumins während des Waschens mit SDS entfernt. Diese Ergebnisse zeigen, dass adsorbiertes Albumin nicht denaturiert und reversibel an die mit Blaudextran oberflächenbeschichteten Proben gebunden ist. Die Bindungsstelle von Albumin an mit Blaudextran oberflächenbeschichteten Proben wurde als nächstes untersucht.
Beispiel 20
Die Bindungsstelle von Albumin an oberflächenbeschichtetem Material
Die Bindungsstelle von Albumin an mit Blaudextran oberflächenbeschichteten Pellethan 55D wurde untersucht, indem Blaudextran in der festen Phase eingesetzt wird, um konkurrierend die Bindung des Albumins an das auf die Oberfläche des Polyurethans gepfropfte Blaudextran zu unterbinden. Proben von mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem und unbeschichtetem Pellethan 55D wurden je 15 Minuten in PBS gespült, bevor sie 15 Minuten in ¹²⁵I-Albumin (0,08 mg/ml) inkubiert wurden. Die Proben wurden dann entweder in PBS oder in gelöstes Blaudextran enthaltender PBS gewaschen und in einem Szintillationszähler ausgezählt. Die Ergebnisse sind in 20 dargestellt. Wie aus 20 zu ersehen ist, entfernte die Aufnahme von Blaudextran in die Pufferwaschlösung selektiv ungefähr 95% des am oberflächenbeschichteten Materials anhaftenden Albumins. Daher wird an oberflächenbeschichtetes Material gebundenes Albumin mit dem Blaudextran auf der Oberfläche in Zusammenhang gebracht.
Beispiel 21
Blut-Schlaufen-Versuch von mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem Material
Pellethan 55D (mit einem Durchmesser von 2 mm und einer Länge von 30 cm) wurde mit Blaudextran oberflächenbeschichtet. Eine Venenpunktion wurde ohne Antikoagulans in eine Kunststoffspritze an einem menschlichen Wesen vorgenommen. Aliquoten von einem Milliliter des Vollblutes wurden dann sofort in ein 12*75 mm Reagenzglas und einen Probeschlauch aus unbeschichtetem Pellethan 55D gegeben. Ein Ende jedes Polyurethan-Schlauches wurde um das andere Ende geschlungen und über ein Verbindungsteil aus Silikon damit verbunden. Eine Stoppuhr wurde gestartet, sobald das Blut in die Proben eintrat. Die Polyurethan-Schläuche wurden dann mit 9 U/min rotiert bis das Blut koagulierte. Das Reagenzglas wurde vorsichtig alle 30 Sekunden gekippt, bis ein Klumpen zu sehen war; die Stoppuhr wurde an diesem Punkt gestoppt und die Zeit wurde protokolliert. Die Zeitdauer, in der 1 ml des frischen Vollblutes in den Polyurethan-Schläuchen koagulierte, wurde mit der Zeitdauer des Koagulierens im Reagenzglas verglichen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 dargestellt.
Tabelle 11
Die Ergebnisse in Tabelle 11 zeigen, dass sowohl mit Blaudextran oberflächenbeschichtete als auch unbeschichtete Oberflächen der Schlauchsysteme einen hemmenden Effekt auf die Koagulation von Vollblut hatten. Das Blaudextran enthaltende Schlauchsystem hatte einen genügend großen Effekt, um eine vollständige Koagulation über 16 Stunden, in denen es rotiert wurde, zu verhindern. Daher vermindert eine Oberflächenbeschichtung mit Blaudextran offensichtlich die Thrombogenität von Pellethan 55D.
Beispiel 22
Im Anschluss an die Koagulations-Untersuchungen wurde eine Gel-Elektrophorese mit Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid (SDS-PAGE) an den Polyurethan-Schläuchen durchgeführt, um zu bestimmen, ob eine Albumin-Beschichtung auf der Oberfläche des mit Blaudextran oberflächenbeschichteten Materials vorlag. Beide Polyurethan-Oberflächen wurden intensiv mit PBS gespült. Die Schläuche wurden dann in zwei Stücke geschnitten. Ein Stück jeden Schlauches wurde in SDS-PAGE-Pufferlösung gelegt und über Nacht inkubiert, um das anhaftende Protein zu entfernen. Die Pufferlösung bestand aus 62,5 mM Tris-HCl, 5% β-Mercaptoethanol, 10% Glycerol und 2,3% SDS in entionisiertem Wasser. Dann wurde mit 100 μl der die eluierten Proteine enthaltenden Pufferlösung SDS-PAGE durchgeführt. Im Anschluss an die Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie Brilliant Blau eingefärbt, und die Identität des eluierten Proteins wurde durch Referenz zu den auf dem Gel enthaltenen Molekuargewicht-Standards bestimmt. Die Ergebnisse dieses Experiments weisen darauf hin, dass das hauptsächlich an mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem Material adsorbierende Protein Albumin ist. Dagegen hatte unbeschichtetes Material viel weniger adsorbiertes Albumin und proportional mehr von Albumin verschiedene Proteine.
Beispiel 23
Das jeweils andere Stück der Polyurethan-Schlauchsysteme wurde über Nacht in 2,5%ige Glutaraldehyd-Lösung gegeben. Mittels Raster-Elektronenmikroskopie wurde dann die Oberfläche jedes Schlauchsystems untersucht. Die REM-Aufnahmen zeigten eine Anhäufung von Thromben auf der Oberfläche des unbeschichteten Materials. Dagegen gab es keine Thrombenbildung auf der mit Blaudextran beschichteten Oberfläche. Tatsächlich gab es keinerlei offensichtliche Zelladhäsion. Die Methode der Oberflächenbeschichtung mit Blaudextran vermindert also die Thrombogenität der Polyurethan-Oberfläche. Als nächstes wurde die Oberflächenbeschichtung mit Blaudextran untersucht, um zu sehen, ob irgendeine Heparin-artige Wirksamkeit vorlag.
Beispiel 24
ATIII-Wirksamkeit von mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem Material
Koagulation kann auf mit Blaudextran oberflächenbeschichteten Materialien aufgrund der Aktivierung von ATIII durch die drei Sulfonsäuregruppen pro Farbstoffmolekül verzögert werden. Diese Wechselwirkung kann eine Heparinartige Aktivierung von ATIII bewirken.
Daher wurde die oberflächenvermittelte Aktivierung von ATIII durch beschichtete Proben bewertet. Die Proben wurden erst 15 Minuten in PBS gespült, bevor sie ATIII ausgesetzt wurden. Im Anschluss an das Spülen wurden die Proben 15 Minuten einem Überschuss an gereinigtem ATIII (50 IU/ml) ausgesetzt. Nicht adsorbiertes ATIII wurde durch schnelles Spülen in Trisgepufferter salzhaltiger Lösung, pH-Wert von 7,4 bei 25°C (100 mM NaCl und 50 mM Tris) entfernt. Die Menge von an der Oberfläche gebundenen und aktivierten ATIII wurde dann ermittelt, indem die Proben mit einem Überschuss an Thrombin inkubiert wurden. Nach einer Inkubationszeit von 10 Minuten unter konstantem Mischen bei 25°C wurde das restliche Thrombin über die Reaktion mit einem chromogenen Substrat (H-D-Phenylanalyl-L-pipecolyl-L-arginin-p-nitroaniliddichlorid) in einem Spektralfotometer bestimmt. Die Veränderung in der Absorption bei 405 nm wurde dann bestimmt. Die Ergebnisse sind in 21 dargestellt. Wie die Ergebnisse veranschaulichen, scheint die Oberflächenbeschichtung mit Blaudextran einen gewissen Heparin-artigen Effekt aufzuweisen. Dieser Heparin-artige Effekt ist vermutlich auf den Farbstoff Cibacron-Blau in der Blaudextran-Beschichtung zurückzuführen.
Beispiel 25
Bakterielle Adhäsion an mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem Material
Die Adhäsion pathogener Bakterien an mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem und an unbeschichtetem Pellethan 55D wurde untersucht, um die Effektivität der Methode der Oberflächenbeschichtung mit Blaudextran in Hinblick auf das Vermeiden bakterieller Adhäsion zu bestimmen. Staphylococcus epidermidis wurden für die Untersuchung zur bakteriellen Adhäsion ausgewählt, da sie die häufigste Ursache für die durch medizintechnische Geräte verursachten Infektionen sind.
Staph. epidermidis wurden über Nacht in Gehirn-Herz-Infusionslösung vermehrt. Die Bakterien wurden durch Zentrifugieren konzentriert und drei Mal in isotonischer salzhaltiger Lösung gewaschen. Die Bakterien wurden bis zu einer Konzentration von 7 × 10⁶ cfu/ml resuspendiert, und Proben von mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem und unbeschichtetem Pellethan 55D wurden entweder in die Lösung unter vorsichtigem Mischen bei 25°C über 2 Stunden eingetaucht oder 15 Minuten in einer Albumin-Lösung vorinkubiert und anschließend zwei Stunden in der Bakterienlösung inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Proben in steriler isotonischer Kochsalzlösung gespült und dann in 5 ml einer sterilen Kochsalzlösung gegeben. Die Proben wurden dann eine Minute mit Ultraschall bei 20 Watt behandelt. Nach der Ultraschall-Behandlung wurden 50 μl der Lösung, die jetzt abgelöste Bakterien enthielt, auf Platten gegeben, inkubiert und ausgezählt. Die Ergebnisse sind in 22 dargestellt.
Die Proben wurden eingefärbt und unter einem Lichtmikroskop nach Ultraschall-Behandlung betrachtet. Man konnte in der Untersuchung im Lichtmikroskop keine anhaftenden Bakterien auf den Proben mehr erkennen, was darauf hinweist, dass die Ultraschall-Behandlung die anhaftenden Bakterien abgelöst hat.
Wie die Ergebnisse in 22 zeigen, haften an mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem Material ungefähr 50% weniger Bakterien als an unbeschichtetem Material, wenn kein Albumin anwesend ist. Diese Verringerung ist vermutlich auf die hydrophile Oberfläche des beschichteten Materials zurückzuführen. In Anwesenheit von Albumin war das mit Blaudextran oberflächenbeschichtete Material sogar in der Lage, die bakterielle Adhäsion um fast 100% zu senken.
Zusammenfassung der Methode zur Oberflächenbeschichtung mit Blaudextran
Die Methode zur Oberflächenbeschichtung mit Blaudextran umfasst die Pfropf-Copolymerisation von APMA/AAm an Polyurethan-Oberflächen, wobei Ce(IV)-Ionen verwendet werden. Dextran wird dann an diese hydrophile Beschichtung mittels einer Schiff'schen-Base-Reaktion kovalent gebunden. Der Farbstoff Cibacron-Blau wird dann an das gebundene Dextran kovalent gebunden, so dass man das mit Blaudextran oberflächenbeschichtete Polyurethan erhält.
Es wurde gezeigt, dass das Binden von Albumin an oberflächenbeschichtetes Material zu 95% spezifisch ist und sogar in Anwesenheit von Fibrinogen stattfindet. Zweitens erscheint Albumin, das von unbeschichtetem Material adsorbiert wird, denaturiert zu sein und kann nicht konkurrierend verdrängt werden. Im Gegensatz dazu werden 95% des an oberflächenbeschichtetes Material gebundenes Albumin leicht durch eine 1%ige SDS-Lösung verdrängt. Drittens wird die Bindung von Albumin an 95% der Oberfläche des oberflächenbeschichteten Materials offensichtlich primär durch das ortspezifische Binden des Proteins an das Blaudextran vermittelt. Dies wird gestützt durch die Beobachtung, dass zugefügtes (freies) Blaudextran konkurrierend ungefähr 95% des bereits am oberflächenbeschichteten Material vor-adsorbierten Albumins freisetzt.
Es wurde gezeigt, dass das Binden von Albumin an mit Blaudextran oberflächenbeschichtetem Material die Oberflächenaktivierung der Koagulation hemmt, was sich aus der gemessenen Koagulationszeit von Vollblut ergibt, die Adhäsion von Blutplättchen vermindert und die Bildung von Fibrin auf der Oberfläche verhindert. Ebenfalls wurde gezeigt, dass mit der Methode zur Oberflächenbeschichtung mit Blaudextran signifikant weniger Bakterien anhaften.
Thrombose und Infektionen sind wahrscheinlich die beiden größten Hindernisse bei der Verwendung künstlicher, implantierbarer medizintechnischer Vorrichtungen. Die Materialien dieser Vorrichtungen neigen dazu, die Bildung von Thromben zu verursachen und sind Infektionsherd im Körper für eine Reihe von Bakterienarten. Durch Gerätschaften verursachte Infektionen werden durch die Neigung dieser Organismen, an der Oberfläche der Vorrichtung anzuhaften und zu siedeln, gefördert. Thrombenbildung kann durch die Adsorption großer Mengen zelladhäsiver Proteine, beispielsweise Fibrinogen, an der Oberfläche der Vorrichtung gefördert werden. Dieses adsorbierte adhäsive Protein tritt dann in Wechselwirkung mit den Plättchen-Membran-Rezeptoren GPIIB-IIIa und möglicherweise GPIb, was zu einer Ablagerung und Aktivierung von Blutplättchen führt. Die Ablagerung und Aktivierung von Blutplättchen verursacht eine Anhäufung der Blutplättchen und letztlich Thrombenbildung. Um Thrombenbildung und Infektionen zu vermeiden, wurde festgelegt, dass ein implantierbares Material eine „aktive" Oberfläche besitzen soll, die selektiv und reversibel Albumin mit einer hohen Affinität bindet, ohne es zu denaturieren. Daher wurde ein Verfahren zur Modifizierung bereitgestellt, das dem Zweck dient, die Fähigkeit eines implantierbaren Polyurethans, Albumin zu binden, zu erhöhen.
Dieses Verfahren schafft eine Oberfläche eines Biomaterials mit einem Albumin-bindenden Farbstoff von hoher Affinität, der Albumin selektiv und reversibel bindet, indem eine erneuerbare, endogene Albumin-Beschichtung auf der Oberfläche geschaffen wird, sobald das Material mit einer physiologischen, Albumin enthaltenden Flüssigkeit in Kontakt kommt. Es wurde gezeigt, dass die Bildung dieser Albumin-Beschichtung die Tendenz des Materials, Thrombose auf der Materialoberfläche zu unterstützen, dadurch verringert, dass die zelladhäsiven Proteine und die koagulationsfördernden Proteine davon abgehalten werden, an der Materialoberfläche zu adsorbieren. Es wurde ebenfalls gezeigt, dass die Beschichtung die Tendenz des Materials, bakterielle Infektionen zu unterstützen, verringert, indem die Adhäsion pathogener Bakterien an der Materialoberfläche und Besiedlung mit diesen darauf gemindert wird.
Die Modifikationsmethode bietet ein Verfahren, nach dem ungefähr 95% der Oberfläche des Materials selektiv und reversibel Albumin binden.
HEPARIN-BESCHICHTUNG
Pfropfen kann in stöchiometrischer Weise in die Wege geleitet werden, um Oberflächen mit dem gewünschten Maß an Hydrophilie und der gewünschten Menge an biowirksamen Kopplern zu erzeugen. Hydrophile Spacer-Monomere (neutral, anionisch oder kationisch) können so ausgewählt werden, dass man entsprechend geladene hydrophile Spacer erhält. Kopplungsmonomere für Bioagenzien können auf der Grundlage ihrer funktionellen Seitengruppen, beispielsweise -OH, -NH₂, -CHO, -COOH, -NCO, ausgewählt werden, die von den Acryl-artigen Monomeren benötigt oder hierfür gewünscht werden, was durch 23 veranschaulicht wird.
Pfropf-Copolymerisation auf Poly(etherurethan) mit Ce(IV)-Ionen ist das bevorzugte Mittel. Die für diesen Einsatz ausgesuchten Monomere sind Acrylamid (AAm), Acrylsäure (AA), 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure (AMPS), 2-Hydroxyethylmethacrylat (HEMA) und N-(3-Aminopropyl)methacrylamidhydrochlorid (APMA). Diese Monomere wurden teilweise auf Grund ihrer Reaktivitäts- und Wasserlöslichkeits-Charakteristika ausgewählt. AAm-, AA- und AMPS-Monomere wurden als biokompatible, hydrophile Spacer-Monomere verwendet. HEMA und APMA wurden als biowirksame Kopplungsmonomere für Bioagenzien verwendet. AAm wurde extensiv als eine Matrix für die Affinitätschromatographie verwendet. AAm ist ein neutrales hydrophiles Monomer; daher haben Polymere von AAm wenig Proteinassoziation gezeigt. AMPS und AA sind anionische hydrophile Monomere. Polymere von AMPS und Copolymere von AMPS und AA haben, wie gezeigt wurde, Heparin-artige Wirksamkeit. HEMA ist ein Hydroxylgruppen enthaltendes Monomer, und APMA ist ein Aminogruppen enthaltendes Monomer.
Pfropfen kann stöchiometrisch in die Wege geleitet werden, um Oberflächen bereitzustellen, die das gewünschte Maß an Hydrophilie und die gewünschten Menge an Kopplern aufweisen. Hydrophile Spacer-Monomere (neutral, anionisch oder kationisch) können so ausgewählt werden, dass man entsprechend geladene hydrophile Spacer erhält. Kopplungsmonomere können auf der Grundlage ihrer funktionellen Seitengruppen, beispielsweise -OH, -NH₂, -CHO, -NCO, ausgewählt werden, die für das Immobilisieren von Heparin benötigt oder gewünscht werden.
Entweder wird das AAm- oder das AMPS-Monomer als hydrophiles Spacer-Monomer verwendet. Das APMA-Monomer wird als Kopplungsmonomer verwendet. AAm wurde extensiv als eine Matrix für die Affinitätschromatographie verwendet. AAm ist ein neutrales hydrophiles Monomer; daher haben Polymere von AAm wenig Proteinassoziation gezeigt. APMA ist ein Aminogruppen enthaltendes Monomer, das daher das Anbinden von Heparin ermöglicht.
Heparin wird kovalent durch eine stabilisierte Schiff'sche Base-Reaktion (reduktive Aminierung) an die Aminogruppen des APMA gebunden. Das Heparin wird unter Verwendung von entweder Natriumperiodat oder Salpetersäure oxidiert. Beide Oxidationsmethoden erzeugen reaktive Aldehydgruppen. Diese Aldehydgruppen reagieren mit den primären Aminen auf APMA zu Iminen. Die Imine werden unter Verwendung von Natriumcyanborhydrid stabilisiert.
Das folgende Beispiel 26 veranschaulicht eine Methode zur Heparinisierung einer Polyurethan-Oberfläche. Gegenwärtig liefert diese Methode Polyurethan-Oberflächen mit ungefähr fünffacher Heparin-Wirksamkeit im Vergleich zu Carmeda^®-beschichteter Polyurethan-Oberflächen. Mit der beschriebenen heparinisierten Oberfläche ausgerüstete Chandler-Schleifen haben gezeigt, dass diese Beschichtung Blutkoagulation während einer zweistündigen Untersuchung unterband.
Beispiel 26
Die Methode zur Oberflächenbeschichtung mit Heparin beginnt mit der Pfropf-Copolymerisation von Monomeren von Acrylamid (AAm) und N-(3-Aminopropyl)methacrylamid (APMA) auf sauberen Polyurethan-Oberflächen mittels Ce(IV)-Ionen. Das Ce(IV)-Ion bildet ein freies Radikal auf der Polyurethan-Oberfläche, das die Pfropf-Copolymerisation der Acrylamide (9a und 9b) startet. Das Ausmaß der Oberflächenaminierung (die Pfropf-Copolymerisation von APMA und AAm), die auf der Polyurethan-Oberfläche stattfindet, kann durch Einfärben der Oberfläche mit dem Farbstoff Ponceau S., einem negativ geladenen Farbstoffmolekül, bestimmt werden. Dieser Farbstoff bindet ionisch an primäre Amine auf der aminierten Oberfläche. Nach dem Einfärben wird der Farbstoff mit SDS von der Oberfläche entfernt und durch Spektralphotometrie bei 520 nm quantifiziert.
Diese aminierte Oberfläche wird dann verwendet, um Heparin zu koppeln. Das Binden von Heparin umfasst zunächst die Oxidation mit Natrium-m-Periodat (NaIO₄), so dass Aldehydgruppen (10) entstehen. Diese Aldehydgruppen werden dann kovalent an primäre Aminogruppen in dem gepfropften APMA/AAm durch reduktive Aminierung (Schiff'sche-Base-Reaktion) gebunden (11). Natriumcyanborhydrid (NaCNBH₃) wird verwendet, um die Imin-Verbindungen zu stabilisieren (12).
Die Menge an gebundenem Heparin kann über das Einfärben der Oberfläche mit dem Farbstoff Toluidin-Blau, einem positiv geladenen Farbstoff, der ionisch an das negativ geladene Heparin bindet, bestimmt werden. Toluidin-Blau wird ebenfalls durch SDS von der Oberfläche entfernt und durch Spektralphotometrie bei 640 nm quantifiziert. Die Heparin-Wirksamkeit der Oberfläche wird durch eine Thrombin-ATIII-Wirksamkeitsprüfung bestimmt. Die Prüfung beginnt damit, die mit Heparin derivatisierten Proben einem Überschuss an ATIII auszusetzen. Nicht adsorbiertes ATIII wird dann durch rasches Spülen in Tris-gepufferter salzhaltiger Lösung entfernt. Die Menge an oberflächengebundenem und aktiviertem ATIII wird dann durch Inkubieren der Proben mit einem Überschuss an Thrombin bestimmt. Nach der Inkubation wird das überschüssige Thrombin durch die Reaktion mit einem chromogenen Substrat in einem Spektralfotometer gemessen. Die Veränderung in der Extinktion bei 405 nm wird gemessen. Die Ergebnisse sind in 24 zu sehen.
Beispiel 27
Die Methode zur Oberflächenderivatisierung mit dem Farbstoff Cibacron-Blau beginnt mit der Pfropfpolymerisation von AMPS- und HEMA-Monomeren auf die Polyurethan-Oberfläche mit Ce(IV)-Ionen. Das Ce(IV)-Ion bildet ein freies Radikal auf der Polyurethan-Oberfläche, das die Pfropf-Copolymerisation der Monomere startet. Das HEMA-Monomer enthält eine Hydroxylgruppe, die dann für das Koppeln des Farbstoffes Cibacron-Blau gebraucht wird.
Kovalent gebundenen Farbstoff Cibacron-Blau enthaltende Polyurethan-Oberflächen wurden hergestellt, indem die Polyurethan-Proben zunächst 2 Stunden bei Umgebungstemperatur in die folgende entgaste Pfropflösung gegeben wurden:
40 g 2-Acrylamid-2-methylpropansulfonsäure (AMPS)
10 g 2-Hydroxyethylmethacrylat (HEMA)
1,1 g Cerammoniumnitrat
1,3 g Salpetersäure
70 ml entionisiertes Wasser
Im Anschluss an das Pfropfen wurden die Proben gründlich in entionisiertem Wasser gespült. Die mit AMPS/HEMA gepfropften Proben wurden dann über Nacht in eine Lösung des Farbstoffes Cibacron-Blau gegeben, die aus 1,0 g des Farbstoffes Cibacron-Blau, 4,0 g NaCl und 12,0 g NaHCO₃ in 200 ml entionisiertem Wasser bestand. Die eingefärbten Proben wurden dann gründlich in entionisiertem Wasser gespült.

Claims

Gegenstand zur Verwendung im Kontakt mit Blut oder Blutprodukten, wobei der Gegenstand wenigstens eine exponierte Oberfläche aufweist, die von einem polymeren Substrat ausgebildet ist, woran ein von einem hydrophiler Vinylmonomer abgeleitetes Pfropfpolymer kovalent gepfropft ist und wobei an das Pfropfpolymer ein Biowirkstoff gekoppelt ist, dadurch gekennzeichnet, dass das Pfropfpolymer Seitengruppen mit ionischer Ladung aufweist und der Biowirkstoff eine ionische Ladung entgegengesetzter Polarität zu der der Seitengruppen des Pfropfpolymers aufweist, so dass der Biowirkstoff durch ionische Anziehung am Pfropfpolymer gehalten wird.
Gegenstand nach Anspruch 1, wobei das Pfropfpolymer ein hydrophiles Polymer mit ionischen oder ionisierbaren Seitengruppen ist.
Gegenstand nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Pfropfpolymer ein Polymer oder Copolymer eines unter Acrylsäure (AA), Acrylamid (AAm), N-(3-Aminopropyl)methacrylamid (APMA), 2-Acrylamido-2-methylpropansulfonsäure (AMPS) und Salzen davon ausgewählten Vinylmonomers ist.
Gegenstand nach Anspruch 3, wobei das Pfropfpolymer unter AMPS-Polymeren, APMA-Polymeren, APMS/Hydroxyethylmethacrylat (HEMA)-Copolymeren und APMA/AAm-Copolymeren ausgewählt ist.
Gegenstand nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Biowirkstoff eine antibiotische oder antimikrobielle Verbindung ist.
Gegenstand nach Anspruch 5, wobei es sich bei dem Biowirkstoff um Gentamycin oder Silberionen handelt.
Gegenstand nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es sich bei dem Biowirkstoff um basischen Fibroblastenwachstumsfaktor handelt.
Gegenstand nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es sich bei dem Biowirkstoff um einen Albumin-bindenden Farbstoff handelt.
Gegenstand nach Anspruch 8, wobei der Farbstoff unter Cibacron Blau und Blaudextran ausgewählt ist.
Gegenstand nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei es sich bei dem Biowirkstoff um Heparin handelt.
Gegenstand nach Anspruch 1, wobei es sich bei dem Pfropfpolymer um ein AMPS-Polymer und bei dem Biowirkstoff um Gentamycin handelt.
Gegenstand nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das polymere Substrat ein Polyurethan ist.
Gegenstand nach Anspruch 12, wobei es sich bei dem polymeren Substrat um ein Polyetherurethan handelt.
Verfahren zur Herstellung eines implantierbaren Gegenstandes mit einer bioaktiven Oberfläche, bei dem man: – an eine exponierte polymere Oberfläche des Gegenstands ein hydrophiles Vinylmonomer mit Seitengruppen, die gegebenenfalls eine ionische Ladung tragen, pfropfpolymerisiert, – die erhaltene Pfropfpolymeroberfläche gegebenenfalls chemisch modifiziert, um eine ionisch geladene oder ionisierbare Oberfläche auszubilden, und – an die Pfropfpolymeroberfäche einen Biowirkstoff ionisch koppelt.