DE69333466T2

DE69333466T2 - Herstellung von transplantatgeweben aus extrazellulärer matrix

Info

Publication number: DE69333466T2
Application number: DE69333466T
Authority: DE
Inventors: Eugene Bell
Original assignee: TEI Biosciences Inc
Current assignee: TEI Biosciences Inc
Priority date: 1992-08-07
Filing date: 1993-08-05
Publication date: 2004-08-19
Anticipated expiration: 2013-08-06
Also published as: JPH07509638A; US5893888A; CA2141851A1; WO1994003584A1; EP0656939A1; EP0656939B1; JP2003047652A; DE69333466D1

Description

Grundlagen der Erfindung
Die Verwendung synthetischer Materialien wie beispielsweise Polyester-Faser (Dacron^TM) oder Polytetrafluorethylen (PTFE) (Teflon^TM) als Implantate, die zum Ersatz erkrankter oder geschädigter Körperteile entwickelt worden sind, ist weit verbreitet gewesen. Diese Materialien sind allerdings nur begrenzt erfolgreich gewesen. Dies ist auf die schlechte Bioverträglichkeit dieser Materialien zurückgeführt worden, die neben anderen Problemen, häufig chronische Entzündungsreaktionen auslösen. Zusätzlich verursacht das Unvermögen des Körpers, diese Materialien zu integrieren, weitere Probleme, da die Materialien sich nicht auflösen und sich nicht für eine Remodellierung durch Gewebezellen eignen, die mit ihnen in Kontakt kommen.
Anstrengungen zur Verwendung tierischer oder humaner Materialien sind ebenfalls unbefriedigend gewesen, wenn diese Materialien zum Beispiel mit Formaldehyd oder Glutaraldehyd vernetzt sind. Der Prozess der allgemeinen Aldehyd-Vernetzung macht Biomaterialien für Gewebezellen nicht hinreichend erkennbar, so dass eine normale Remodellierung sowie Integration nicht gefördert werden. Ähnlich können andere chemischen Behandlungsarten für tierische oder humane Biomaterialien, wie beispielsweise Extraktion mit Detergenzien oder hypertonischen Puffern oder hypotonischen Puffern, diese Materialien in einem Ausmaß verändern, dass sie für eine Förderung der Angiogenese und Stimulierung von Reparatur- und Remodellierungsprozessen unwirksam sind, die für die Umwandlung eines Implantats in ein funktionsfähiges Substitut für das zu ersetzende Gewebe oder Organ erforderlich sind.
Ein dritter Versuchsansatz ist die Rekonstitution von Gewebe und Organäquivalenten aus strukturellen Matrix-Bestandteilen gewesen, wie beispielsweise Kollagen, das zum Beispiel extrahiert und gereinigt und mit spezialisierten Zellen kombiniert worden ist. Der Prozess ist abhängig von Wechselwirkungen zwischen den Zellen und Matrix-Proteinen, dass die Zellen sich verdichten und sich organisieren. Während Gewebe-ähnliche Konstrukte hergestellt worden sind und gezeigt haben, dass sie ihren natürlichen Gegenstücken in gewisser Weise ähneln, entwickeln sie nicht ohne weiteres die Matrix-Komplexität, die für die tatsächlichen Gewebe, die sie nachbilden sollen, charakteristisch sind. Siehe zum Beispiel U.S. Patent Nr. 4.485.096 und 4.485.097, E. Bell, 1984.
U.S. 4.645.669 legt ein Verfahren und eine Kulturlösung offen, die eine in vivo Einbettung von differenzierten Zellen, die von in vitro Kulturen differenzierter Zellen stammen, unter Beibehaltung ihres differenzierten Charakters ermöglichen. In einer alternativen Anwendungsform wird die in vivo Kultivierung von differenzierten Zellen erwogen. Durch die Verwendung extrazellulärer Matrix-Fasern, die speziell von Bindegewebe stammen, als Kultursubstrate legt das Verfahren ebenfalls die Isolierung von Bindegewebefasern und ihre Präparation als ein Kultursubstrat offen. Dieses Verfahren beansprucht signifikant höhere Überlebens- und Anhaftungsraten und oftmals signifikant verbesserte Wachstumseigenschaften für in vivo oder in vitro Kulturen differenzierter Zellen, insbesondere Epithelzellen, gegenüber heutigen Verfahren für Kultivierung zur dieser Zellen. Dieses Verfahren ermöglicht signifikant, bestimmten differenzierten Zellen mehr von ihrer normalen enzymatischen Aktivitäten beizubehalten, und darüber hinaus ermöglicht dieses Verfahren, differenzierten Zellen in einem höheren Ausmaß ihre Fähigkeit beizubehalten, Substanzen wie beispielsweise Hormone zu sezernieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Transplantatgewebe durch Gewinnen eines erwünschten Ausgangsbindegewebes und dessen Verarbeitung, um lebende Zellen zu entfernen ohne Faktoren zu entfernen, die für Zellwachstum erforderlich sind. Das Gewebe wird gefroren oder gefriergetrocknet und dann fragmentiert, und die lebenden Zellen entfernt, um Matrix-Feststoffteilchen des Bindegewebes herzustellen. Alternativ kann das Gewebe vor Gefrieren fragmentiert werden.
Die Erfindung umfasst ebenfalls Verfahren zur Herstellung von Transplantatgewebe, umfassend das obige Verfahren mit zusätzlichen Schritten, allein oder in Kombination, 1) nochmaliges Verarbeiten der Bindegewebe-Feststoffteilchen, um Cytoplasma- und Nucleinsäure-Bestandteile zu entfernen ohne die Faktoren zu entfernen, die für Zellwachstum und -differenzierung erforderlich sind; und 2) Besäen der Bindegewebe-Feststoffteilchen mit kultivierten Zellen unter Bedingungen, die ein Anhaften der Zellen auf oder Besiedeln der Bindegewebe-Feststoffteilchen erlauben.
In einer Anwendungsform der Erfindung sind die Matrix-Feststoffteilchen mit ausgewählten kultivierten humanen oder anderen Zellen besät. Das resultierende, mit Zellen besiedelte Material kann zu Verbundstoffen verschiedener Formen mit oder ohne Zugabe von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren verschmolzen sein.
Die vorliegende Erfindung stellt ein neues Verfahren zur Präparation von Tiergeweben als Transplantate dar, die zum Ersatz von Geweben oder Organen, die geschädigt oder erkrankt sind, gestaltet sind. Dies ist auf eine Weise erreicht, dass ihre native Komplexität konserviert ist, was folglich ihre Remodellierung und Integration durch spezialisierte Zellen erlaubt, mit denen sie in Kontakt gebracht werden. Mit anderen Worten, da die Matrix-Feststoffteilchen der vorliegenden Erfindung das Zellwachstum und die Zelldifferenzierung stimulierende Moleküle enthalten, liefern sie die biomolekularen Signale, die für eine Gewebereparatur in vivo erforderlich sind. Im Gegensatz zu zuvor beschriebenen Verfahren umgeht das Verfahren der vorliegenden Erfindung die Verwendung von aggressiven Reagenzien, wie beispielsweise hohe Salzkonzentration oder Lipide entziehende Reagenzien wie beispielsweise Butanol/Ether oder Detergenzien. Die Verwendung derartiger Reagenzien in zuvor beschriebenen Verfahren ist für die Entfernung sehr vieler Faktoren aus dem Bindegewebe verantwortlich, deren Vorhandensein für die Stimulierung von Reparatur- und Remodellierungsprozessen als essentiell betrachtet wird, die für die Umwandlungsprozesse eines Implantats in ein funktionsfähiges Substitut für das zu ersetzende Gewebe oder Organ erforderlich sind.
Weiter entwickelte Verfahren der in vitro Zellkultivierung erlauben die Expansion weniger differenzierter Zellen zu großen Zellbanken. Es besteht ein Bedarf an Gewebematrix-Trägern, welche die Organisation und Differenzierung dieser spezialisierten Zellen steuern können, zum Übertragen auf den menschlichen Empfänger bei klinischen Anwendungen. Die vorliegende Erfindung kann verwendet sein, um eine Krankheit wie beispielsweise Diabetes kontrollieren zu können, mittels Herstellung und Implantierung rekonstituierter Gewebe oder Verbundstoffen, die mit Zellen mit der geeigneten funktionellen Leistung besiedelt sind, um die Probleme zu überwinden, die durch fehlende oder unzureichende Insulin-Biosynthese oder unzureichend regulierte Insulin-Versorgung verursacht sind. Zum Beispiel können Feststoffteilchen der vorliegenden Erfindung mit Zellen von den Langerhans Inseln oder mit nicht dissoziierten Inseln in vitro kombiniert sein, um einen Verbundstoff zu bilden, der dann unter der Nierenkapsel implantiert wird. Außerdem können mit Zellen besiedelte Matrix-Verbundstoffe direkt implantiert werden, zum Beispiel unter Verwendung einer Spritze zur subkutanen Injektion oder eines ähnlichen Gerätes, um den Verbundstoff an die erwünschte Stelle zu bringen. Diese Erfindung kann ähnlicherweise angewandt werden, um die Parkinson Krankheit zu behandeln, indem dem Patienten ein Gewebe bereitgestellt wird, das Dopamin produzierende Zellen enthält. Man kann ebenfalls Nervenzellen auf den Feststoffteilchen aufbringen und somit einen Verbundstoff bilden. Dieser wäre bei der Reparatur von Nervengewebsdefekten zweckdienlich.
Das Verfahren der Erfindung besitzt vielfältige Anwendungsmöglichkeiten bei Wiederherstellung von geschädigten oder anormalen Körperstrukturen wie beispielsweise Haut, verschiedenen tubulären Strukturen und Skelettstrukturen wie beispielsweise Knochen, Sehnen und Bänder. Die Erfindung kann ebenfalls zur Bildung von Bindegewebe-Matrices eingesetzt werden, die als Gewebe-Gerüste Verwendung finden und nach Transplantation an die erwünschte Stelle mit zirkulierenden Zellen besiedelt werden. In einer Anwendungsform sind die Matrix-Feststoffteilchen mit einer Substanz vermischt, die Feststoffteilchen enthaltende poröse Membran-Polymere bilden kann und dann geformt wird. Matrix-Feststoffteilchen enthaltende Fäden sind ein Beispiel der vielen Formen, die unter Verwendung der Feststoffteilchen der vorliegenden Erfindung geformt werden können. Zum Beispiel können die Feststoffteilchen mit Kollagen oder einem anderen bioabsorbierbaren oder nicht bioabsorbierbaren Polymer gemischt werden und dann in ein Dehydratisierungs- oder Koagulationsbad, das absoluten Ethanol oder Aceton oder eine andere dehydratisierende Lösung enthält, extrudiert werden. Der Faden kann auch auf eine andere Weise einer Dehydratisierung, zum Beispiel Vakuumtrocknung, unterzogen werden. Die Feststoffteilchen können ebenfalls gemeinsam mit Kollagen oder einem anderen Polymer, das als eine Hohlfaser dient, extrudiert werden. Gemeinsam bilden die Feststoffteilchen und die Hohlfaser die beladenen Hohlfaser, wobei die Feststoffteilchen das Innere der Polymerhohlfaser füllen. Die auf diese Art und Weise hergestellten Fäden können dann zur Bildung von Fasergeweben oder anderen komplexen Strukturen zur Implantation verflochten oder verwoben sein. Zusätzlich zu dem Vorteil, der aus der großen Stärke, Flexibilität und vergrößerter Oberfläche der verflochtenen oder verwobenen Fäden erwächst, können die Gewebehüllen aus beladenen Hohlfaser-Fäden porös gemacht werden, was siedelnden Zellen ein Festsetzen auf der Fadenoberfläche erlaubt und dadurch einen Kontakt mit den Gewebematrix-Partikeln im Faden ermöglicht.
In einer weiteren Anwendungsform ist das Verfahren der vorliegenden Erfindung angewandt, um Matrix-Feststoffteilchen aus fötalen Skelett-Bestandteilen, die von tierischen Quellen stammen, vor der Mineralisation herzustellen. Diese fötalen Matrix-Feststoffteilchen können mit osteogenen Zellen in zylindrisch geformten Kollagen-Behältern kombiniert sein, um Skelett-Konstrukte zu bilden. Auf den Außenseiten der Kollagen-Behältern können Zellen eines zweiten Zelltyps, der mit periostalem Gewebe assoziiert ist, ausgebracht sein. In ähnlicher Weise kann ein Verbundstoff, der von dermalen Matrix-Feststoffteilchen oder von einer Schicht einer zuvor gefrorenen Matrix, die perforiert worden ist, stammt, mit Keratinocyten überschichtet sein, um ein Haut-ähnliches Konstrukt zu bilden.
Genaue Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung umfasst ein Verfahren zur Herstellung eines Transplantatgewebes, das die Gewinnung eines erwünschten Ausgangsbindegewebes und dann Verarbeiten dieses Gewebes umfasst, um lebende Zellen zu entfernen ohne Faktoren zu entfernen, die für Zellwachstum und -differenzierung erforderlich sind. Das zellfreie Ausgangsbindegewebe wird dann gefroren oder gefriergetrocknet und entweder vor oder nach dem Gefrieren oder Gefriertrocknen fragmentiert, um Bindegewebe-Feststoffteilchen herzustellen. Alternativ kann das Gewebe nach Fragmentierung gefroren oder gefriergetrocknet werden. Die zellfreien Bindegewebe-Feststoffteilchen können als ein Implantat, das von Wirtszellen besiedelt werden kann, verwendet sein. Das gefriergetrocknete Bindegewebe kann auch ohne Fragmentierung, sondern vor Gebrauch perforiert, verwendet sein. Gemäß dieser Anwendungsform kann das zellfreie Bindegewebe in Form von perforierten Schichten oder Streifen ohne Fragmentierung verwendet sein.
Die Erfindung umfasst ein anderes Verfahren zur Herstellung eines Transplantatgewebes, das die Gewinnung eines erwünschten Ausgangsbindegewebes und Verarbeiten dieses Gewebes wie oben umfasst, um lebende Zellen zu entfernen ohne Faktoren zu entfernen, die für Zellwachstum und -differenzierung erforderlich sind. Das Ausgangsbindegewebe wird gefroren oder gefriergetrocknet, dann fragmentiert, um Bindegewebe-Feststoffteilchen herzustellen. Die Bindegewebe-Feststoffteilchen werden dann mit kultivierten Zellen unter Bedingungen besät, die den Zellen ein Anhaften auf und Besiedeln der Bindegewebe-Feststoffteilchen erlauben. In einer Anwendungsform der vorliegenden Erfindung sind die Bindegewebe-Feststoffteilchen mit kultivierten Zellen besät und dann in einem vorgeformten porösen Polymerbehälter verpackt. Dieses Verfahren kann ebenfalls den optionalen Schritt der weiteren Verarbeitung der Bindegewebe-Feststoffteilchen umfassen, bevor sie besät sind, um Nucleinsäuren zu entfernen ohne andere Faktoren zu entfernen, die für Zellwachstum und -differenzierung erforderlich sind. Weitere Verarbeitungsschritte können ein Inkontaktbringen der Bindegewebe-Feststoffteilchen mit Nuclease-Präparaten umfassen.
Die Erfindung umfasst ein anderes Verfahren zur Herstellung eines Transplantatgewebes, das die Gewinnung eines erwünschten Ausgangsbindegewebes und Verarbeiten dieses Gewebes wie oben umfasst, um lebende Zellen zu entfernen ohne Faktoren zu entfernen, die für Zellwachstum und -differenzierung erforderlich sind. Das Ausgangsbindegewebe wird dann gefroren oder gefriergetrocknet und fragmentiert, um Bindegewebe-Feststoffteilchen herzustellen. Alternativ können die Zellen vor Fragmentierung entfernt werden. Die Feststoffteilchen werden mit einem porösen Polymer wie beispielsweise Kollagen oder anderen bioabsorbierbaren oder nicht bioabsorbierbaren Polymeren gemischt, dann zur Bildung von Fäden extrudiert, die aus dem Polymer und den Bindegewebe-Feststoffteilchen zusammengesetzt sind. Die Fäden der Erfindung können entweder eine gemischte Faser (in welcher der Faden aus einer Mischung aus dem Polymer und dem Zellmatrix-Feststoffteilchen besteht) oder eine beladene Hohlfaser sein (in welcher der Faden aus einem Kern von Zellmatrix-Feststoffteilchen und einen ihn umgebenden porösen Polymer-Mantel besteht). Diese Fäden werden dann verflochten oder verwoben, um Fasergewebe oder andere komplexe Konstrukte zur Implantation zu bilden. Der Mantel der beladenen Hohlfaser-Fäden ist porös, was folglich den besiedelnden Zellen erlaubt, die Oberfläche des Fadens einzunehmen und dadurch mit den Gewebematrix-Partikeln im Faden in Kontakt zu treten.
Die Erfindung umfasst ein weiteres Verfahren zur Herstellung eines Transplantatgewebes, das die Gewinnung eines erwünschten Ausgangsbindegewebes und Verarbeiten dieses Gewebes umfasst, um lebende Zellen zu entfernen ohne Faktoren zu entfernen, die für Zellwachstum und -differenzierung erforderlich sind.
Gemäß diesem Verfahren wird das Ausgangsbindegewebe gefroren oder gefriergetrocknet aber nicht fragmentiert. Statt dessen wird das Gewebe in Form von Schichten oder Streifen verarbeitet. Diese Schichten oder Streifen werden gefroren oder gefriergetrocknet, dann aufgetaut und perforiert, um Zellen ein Infiltrieren des Gewebes zu ermöglichen. In einer Anwendungsform sind die Bindegewebe-Schichten oder Streifen mit kultivierten Zellen unter Bedingungen besät, die den Zellen ein Anhaften und Besiedeln der Schichten oder Streifen erlauben. Die besäten Schichten oder Streifen können außerdem gestaltet oder geformt sein, um ein zweckdienliches Transplantatgewebe zu bilden. Die Schichten oder Streifen können in einen Wirt implantiert werden, ohne zunächst mit kultivierten Zellen besät zu sein. Die Schichten oder Streifen würden eine Stelle bereitstellen, die Wirtszellen besiedeln könnten.
Eine Fragmentierung des erwünschten Gewebes kann durch Gefrieren oder Gefriertrocknen und dann mechanisches Mischen des gefrorenen oder gefriergetrockneten Gewebes oder mechanisches Zerkleinern des Gewebes zwischen Walzen erreicht werden. Das erwünschte Gewebe kann ebenfalls durch Mischen des Gewebes fragmentiert werden, ohne dieses zuerst einzufrieren. Eine optionale Nuclease-Behandlung dient zum Verdau der Nucleinsäuren, die freigesetzt werden, wenn die Zellen und Zellkerne aufgebrochen werden. Die Bindegewebe-Feststoffteilchen werden dann in aufeinanderfolgenden Schritte von Zentrifugation, Resuspension, erneuter Zentrifugation und Resuspension gewaschen und gesammelt.
Die Erfindung umfasst außerdem ein Verfahren, worin die mit den obigen Verfahren gewonnenen Bindegewebe-Feststoffteilchen auf einer synthetischen porösen Membran in einer Dicke geschichtet sind, die eine Diffusion von Nährstoffen zu allen Bindegewebe-Feststoffteilchen gestattet. Eine Anwendungsform dieses Verfahrens umfasst einen zusätzlichen Schritt des Verschmelzens der Bindegewebe-Feststoffteilchen, um einen Verbundstoff unter Verwendung eines Verschmelzungsmittels zu bilden. Die Art der Verschmelzungsmittel, die ausgewählt werden können, sind dem Fachmann bekannt. In einer bevorzugten Anwendungsform sind die in vitro kultivierten Zellen auf dem Bindegewebe-Verbundstoff in einer Menge ausgebracht, so dass sie gerade den Verbundstoff bedecken und den Nährstofftransport gestatten. Die Zellen werden unter Bedingungen ausgebracht, die den Zellen ein Besiedeln und Anhaften auf den Bindegewebe-Feststoffteilchen erlauben. Es können ein oder mehrere Zelltypen auf dem Verbundstoff ausgebracht sein.
Die Erfindung umfasst außerdem ein Konstrukt, das mit einem der obigen Verfahren herstellbar ist, einschließlich eines vielzelligen Konstrukts.
Das Ausgangsbindegewebe kann von Bindegeweben eines bovinen, ovinen, porcinen oder marinen Tieres wie auch von anderen Vertebraten oder Invertebraten-Species stammen. Die Erfindung umfasst außerdem Bindegewebe, die von verschiedenen Körperteilen oder -geweben stammen. In einer bevorzugten Anwendungsform der Erfindung stammt das Bindegewebe von embryonalen oder fötalen Geweben. Wie hier verwendet, bedeutet der Ausdruck „embryonales Gewebe" ein nicht humanes embryonales Gewebe. Embryonal- und Fötalgewebe sind von Vorteil, da sie verschiedene biomolekulare Faktoren enthalten, die in normalem Gewebe bei den verschiedenen Stadien der Zellentwicklung vorhanden sind. Die in Fötalgeweben vorhandenen Faktoren umfassen zum Beispiel Faktoren, die für Zellteilung, Differenzierung und Gewebemorphogenese erforderlich sind.
Die Bindegewebe-Matrix-Feststoffteilchen, die mit den obigen Verfahren erhalten werden, können mit ausgewählten kultivierten humanen oder anderen Zellen besät sein. Die resultierende, mit Zellen besiedelte Matrix kann zu Verbundstoffen in verschiedene Formen verschmolzen sein, mit oder ohne Zugabe von Wachstums- oder Differenzierungsfaktoren.
In einer bevorzugten Anwendungsform der Erfindung sind die Matrix-Feststoffteilchen so ausgewählt, dass sie dem herzustellenden Gewebe entsprechen. Zum Beispiel, falls ein Hautersatz erwünscht ist, würde eine dermale Matrix bevorzugt partikularisiert und ein Verbundstoff mit dermalen Zellen hergestellt werden. Falls Nervengewebe zu ersetzen wäre, würde vorzugsweise eine Matrix aus embryonalem oder fötalem Bindegewebe des Zentralnervensystems für eine Kombination mit den geeigneten Zellen ausgewählt werden, um einen Verbundstoff zu bilden.
Die Verarbeitungsschritte der obigen Verfahren werden ausgeführt, um Zellen von den ausgewählten Tiergeweben zu entfernen, wobei dadurch Bindegewebe-Matrix-Feststoffteilchen hergestellt werden. Es gibt viele in der Technik bekannte Verfahren zur Entfernung von Zellen von Bindegewebe. Nachfolgend sind Beispiele für einige dieser Verfahren angegeben. Diese Beispiele sind nicht als erschöpfend zu betrachten, sondern dienen lediglich als Beispiele für einige bekannte Verfahren. Die Wahl des Verfahrens und die Reihenfolge der Behandlungsschritte hängt von der An des zu verarbeitenden Gewebes ab.
In einem Verfahren zur Entfernung von Zellen vom Bindegewebe wird das Gewebe mit einer Klinge oder ähnlichem Instrument abgeschabt. Das Gewebe kann ebenfalls nacheinander zwischen zwei parallelen Walzen geführt werden, wo die Walzen in aufeinanderfolgenden Schritte immer enger stehen, wobei dadurch weiche Bestandteile einschließlich Zellen herausgepresst werden. Das Gewebe kann ebenfalls mit Enzymen, insbesondere Nucleasen, behandelt werden. Zusätzlich durchläuft das Gewebe einen Gefrier-Auftau oder Gefriertrocknung-Auftau-Zyklus, um die lebenden Zellen aufzubrechen. Diese Verfahren können ebenfalls angewandt sein, um verbleibende Cytoplasma- und Kernbestandteile in den Bindegewebe-Feststoffteilchen zu entfernen, die durch Fragmentierung des Ausgangsbindegewebes hergestellt sind.
Die Gefrier- und/oder Gefriertrocknungs- und Fragmentierungsschritte werden ausgeführt, um Feststoffteilchen herzustellen und außerdem um das Gewebe von unerwünschten Zellbestandteilen zu befreien. Verfahren zur Sterilisierung von verarbeiteten Geweben sind dem Fachmann bekannt und umfassen Inkontaktbringen des Gewebes mit Peressigsäure-Lösung, vorzugsweise etwa einer 0,5% Lösung, und Waschen des Gewebes in einem sterilen Puffer, vorzugsweise sterile Phosphat gepufferte Saline. Das Gewebe kann dann gefriergetrocknet werden, indem es auf die Temperatur flüssigen Stickstoffs gebracht wird, dann unter sterilen Bedingungen fragmentiert wird. Fragmentierung bei niederer Temperatur kann auf verschiedene, dem Fachmann bekannte Art und Weise durchgeführt werden. Fragmentierungsverfahren könnten eine Schervorrichtung, wie beispielsweise ein mechanischer Mischer, oder mechanisches Zerkleinern des Gewebes zwischen Walzen umfassen, um Feststoffteilchen einer Größe zu gewinnen, die eine Vaskularisation nach Implantation gestattet. In einer bevorzugten Anwendungsform der Erfindung messen die Feststoffteilchen zwischen etwa 50 und etwa 300 Mikrometer im Durchmesser, aber für einige Anwendungen können die Feststoffteilchen 5 bis 10 Micron klein sein. In Abhängigkeit der Ausgangsgewebeart können eine weitere Nuclease-Reinigung und Waschschritte und anschließende Zentrifugation und Resuspension in frischer Phosphat gepufferter Saline durchgeführt sein, um zu versuchen, das Vorhandensein von immunogenen Bestandteilen zu minimieren.
In einer anderen Anwendungsform der Erfindung kann das Gewebe mit Aceton, absolutem Alkohol oder hydrophilen Polymeren wie beispielsweise Carbowax chemisch dehydratisiert und dann fragmentiert sein. In einer bevorzugten Anwendungsform der Erfindung sind die Feststoffteilchen durch Besäen der Matrix mit Zellen weiter behandelt. Vorzugsweise würde man humane Zellen zum Besiedeln der Matrix verwenden, aber die Erfindung ist nicht auf humane Zellen beschränkt. In einer Anwendungsform ist das Besäen durch Rehydratisieren der Matrix-Feststoffteilchen unter Verwendung von Gewebe-Kulturmedium, mit oder ohne zugefügten Wachstums- und Differenzierungssupplementen, durchgeführt und die Feststoffteilchen dürfen bis zum Gleichgewicht mit ihrer flüssigen Umgebung anschwellen.
In einer anderen Anwendungsform der Erfindung sind die Matrix-Feststoffteilchen mit Zellen mit einem oder mehreren Phänotypen in einem Bioreaktor, Spinner-Flasche oder anderen ähnlichen Vorrichtung besiedelt. Die Anzahl eingesetzter Zellen und die Verweildauer in der Vorrichtung ist abhängig von der Zellanhaftungszeit und dem erwünschten Ausmaß der Bedeckung der Feststoffteilchen von Zellen. Diese Parameter variieren in Abhängigkeit des eingesetzten Zelltyps und der für das Endprodukt erforderlichen Zelldichte. Die besonderen Parameter für jeden Zelltyp sind dem Fachmann klar. In einer bevorzugten Anwendungsform der Erfindung liegt die anfängliche Zelldichte in der Größenordnung von etwa 10⁴ bis etwa 10⁶ Zellen pro ml.
In einer weiteren Anwendungsform der vorliegenden Erfindung sind die Feststoffteilchen zu Verbundstoffen unterschiedlicher Formen mit oder ohne Zusatz von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren verschmolzen. Dieser Schritt kann mit Feststoffteilchen, die mit Zellen besät sind, oder mit Feststoffteilchen, die keine Zellen enthalten, durchgeführt sein. Im letzteren Fall kann der verschmolzene Matrix-Verbundstoff mit Zellen nach Verschmelzen der Feststoffteilchen zu Verbundstoffen besät sein. Der Matrix-Verbundstoff, mit oder ohne Zellen, wird dann auf eine synthetische poröse Membran geschichtet. Beispiele für eine synthetische poröse Membran, die hier nur zum Zwecke der Verdeutlichung und nicht zu irgendeiner Beschränkung der Erfindung angegeben sind, umfassen aus Polycarbonat hergestellte Membranen, zum Beispiel in einer Transwell-Anordnung, oder ein bioabsorbierbares Polymer wie beispielsweise eine poröse Kollagen-Schicht, die eine Form mit einer porösen Membran als Boden auskleidet, um die Kollagen-Schicht zu fixieren und einen Durchtritt von Medium von unten erlaubt. Die Membran kann ebenfalls aus anderen bioabsorbierbaren Polymeren wie beispielsweise Poly-L-lactat hergestellt sein. In einer Anwendungsform der Erfindung sind die Feststoffteilchen in einer einzigen Schicht geschichtet. In einer bevorzugten Anwendungsform beträgt die Schichtdicke weniger als etwa 0,5 Millimeter.
Falls die Matrix mit Zellen besät worden ist, muss die Schichtdicke auf eine Weise kontrolliert sein, um sicherzustellen, dass die erforderlichen Nährstoffe zu den Zellen gelangen können. Das Besäen der Matrix erfolgt durch direktes Auftragen von Zellen in Suspension auf den Feststoffteilchen-Verbundstoff in einer Menge, die den Verbundstoff gerade bedeckt, aber nicht davon abfließt, unter Bedingungen, die den Zellen ein Besiedeln der Matrix erlauben.
Nicht beschränkende Beispiele für einige Methoden, wo die Porosität der Verbundstoffe kontrolliert sein kann, umfassen: Limitierung des Zellwachstums, Limitierung der Vernetzung und mechanisch durch Auflegen einer bürstenartigen Vorrichtung mit weit auseinander stehenden Teflon^TM „Haaren" auf das Substrat, bevor die Feststoffteilchen darauf gelangen. Wenn das letztere Hilfsmittel verwendet ist, wird sich die Schicht um die Mikrostifte oder „Haare" bilden, wobei dadurch Löcher geschaffen werden, wenn die „Haare" entfernt werden.
Falls die Matrix mit Zellen besät und dann über einen Zeitraum in Gewebekulturmedium inkubiert ist, wird das Konstrukt in Form einer zusammenhängenden Schicht sein, die allein oder zum Beispiel mit einer porösen Kollagen-Membran, auf der sie gebildet ist, verwendet sein kann. In einer bevorzugten Anwendungsform der Erfindung beträgt die Inkubationsdauer etwa 7 bis 14 Tage. Die Kollagen-Membran kann auch verwendet sein, um den Verbundstoff einzuwickeln. Die Kollagen-Membran kann an dem Verbundstoff fixiert sein, zum Beispiel durch Vernähen; so dass ein flaches Paket gebildet wird. Die Schicht kann ebenfalls um eine Spindel gewickelt sein, um ein Röhrchen in jedem Entwicklungsstadium zu bilden, nachdem es kohärent wird.
Eine weitere Anwendungsform der Erfindung umfasst die Verwendung mehrerer Zelltypen, die mit dem Verbundstoff mittels Ausbringen von Zellen auf jeder Verbundstoffseite oder mittels Ausbringen von Zellen auf der porösen Kollagen-Membran, die zum Einwickeln des Verbundstoffes verwendet ist, kombiniert sind. Außerdem kann eine Schicht eines Zelltyps über einer Schicht ausgebracht sein, die einen anderen Zelltyp enthält, oder Zellen verschiedener Typen können zusammen ausgebracht sein.
Des weiteren umfasst die Erfindung den Fall, wo die zellbeladenen Feststoffteilchen in einem vorgeformten porösen Kollagen-Behälter oder einem anderen polymeren Behälter beliebig erwünschter Form verpackt sind. Der Behälter kann eine rechteckige Box sein, wo in einer bevorzugten Anwendungsform die Box nicht dicker als etwa 1,0 mm ist. Zusätzlich legt die Erfindung die Verwendung konzentrischer Röhrchen mit verschiedenen Radien offen, wo in einer bevorzugten Anwendungsform die Radien nur um etwa 1,0 mm oder weniger differieren. Es ist ebenfalls daran gedacht, dass weitere Formen ebenso eingesetzt werden können.
Die Behälter können mit Streben oder anderen Mitteln verstärkt sein, um eine gleichmäßige Dicke aufrechtzuerhalten. Die Dichte der Streben beträgt vorzugsweise 1–10 pro mm². Der Behälter kann aus einer Kollagen-Schicht mit Poren hergestellt sein, die zu klein sind, dass Feststoffteilchen entweichen können. In einer bevorzugten Anwendungsform messen die Poren etwa 30 bis etwa 60 Mikron. Nach Einführen der Feststoffteilchen durch eine Endöffnung kann der Behälter durch Vernähen oder auf andere Weise verschlossen werden.
In einer anderen Anwendungsform der vorliegenden Erfindung sind die Bindegewebe-Feststoffteilchen zu Fäden geformt, die sich zum Weben oder Flechten eignen. Die Fäden können zu Fasergeweben oder anderen komplexen Konstrukten für eine Implantation verwoben sein. Die verflochtenen oder verwobenen Fasergewebe können ein Gerüst aus Matrix-Material für Wirtszellen bereitstellen, die darauf haften können. Zusätzlich kann der Faden oder das aus Fäden hergestellte Fasergewebe mit Zellen in vitro, wie oben, besät sein und dann an einer geeigneten Stelle im Wirt transplantiert werden.
Die Fäden dieser Erfindung können entweder ein gemischter Faser-Typ oder ein beladener Hohlfaser-Typ sein. Gemischte Faser-Fäden sind hergestellt durch Mischen von Bindegewebe-Feststoffteilchen mit einem bioabsorbierbaren oder nicht bioabsorbierbaren Polymer, dann Extrudieren der Mischung unter Verwendung zum Beispiel einer Spinndüse, um einen gemischten Faden zu formen. Der Hohlfaser-Faden umfasst einen Kern aus Bindegewebe-Feststoffteilchen dieser Erfindung, umgeben von einem porösen polymeren Mantel. Das zur Herstellung der Fäden verwendete Polymer kann entweder bioabsorbierbar oder nicht bioabsorbierbar sein. In einer bevorzugten Anwendungsform ist das Polymer Kollagen. Nach Extrudieren werden die Fäden dieser Erfindung dehydratisiert und koaguliert, zum Beispiel mittels Extrudieren in ein Bad, das absoluten Alkohol, Carbowax oder Aceton enthält. Die Fäden können vergütet werden zum Beispiel mittels Ziehen der Fäden über Walzen vom Koagulationsbad in ein Vergütungsbad, das eine Saline-Lösung enthält. Die Fäden können dann getrocknet und aufgespult werden, zum Beispiel mittels Ziehen der Fäden über mehrere Walzen, um sie zu trocknen und dann auf Spulen zu wickeln.
Beispiele
Tierische Quellen für Bindegewebe-Matrixmaterialien wie beispielsweise Organe sind porcine, bovine, ovine, marine oder andere Tiere. Zum Beispiel können zur Rekonstitution eines endokrinen Pankreas-Äquivalents wenigstens drei Organe verwendet sein. Erstens der Pankreas selbst, der die Gewebe-Spezifität der Matrix liefern würde. Zweitens das Duodenum oder Jejunum des Darms und drittens die Haut.
Die Organe werden auf Eis in sterilen Behältern unmittelbar nach Töten des Tieres verpackt und ins Labor gebracht. Der Pankreas wird entsprechend des Protokolls für Entfernung der Inseln behandelt, das heißt, in den Pankreas-Gang wird eine Kanüle eingeführt und 2 mg/ml Kollagenase (Typ X, Sigma) und 2% fötales Kälberserum haltige Hanks Lösung injiziert. Zusätzlich sind die beiden Arterien, die den Pankreas versorgen, die Arteria colica und die Arteria mesenterica superior ähnlicherweise mit Heparin haltiger Kollagenase-Lösung perfundiert, um Endothel aus dem Gefäßsystem der Drüse zu entfernen. Die adäquate Reinigung des Pankreas kann ein Heparinisieren des Tieres vor dem Töten erfordern. Eine Druckvorrichtung wird eingesetzt, um auf das Organ vorsichtig Druck auszuüben, wenn es in einer Sterilkammer im Kalten perfundiert und reperfundiert wird.
Im Verlauf der Rezirkulation wird die Kollagenase-Lösung allmählich verdünnt. Ein faserartiges Netz aus Gängen und Gefäßen verbleibt nach dem Kollagenase-Verdau. Nach Waschen in Phosphat gepufferter Saline wird das faserartige Material gefriergetrocknet und mechanisch in einem Omnimixer^TM Scherröhrchen gebrochen. Nach Auftauen werden die Feststoffteilchen erneut gewaschen und in 5% Peressigsäure sterilisiert.
Das Ziel der Gefrier- und Zerkleinerungsprozedur ist, Matrix-Feststoffteilchen mit einem Durchmesser zwischen 100 und 200 μm zu liefern. Die Langerhans Inseln des Pankreas, die für die Sekretion von Insulin und anderen Hormonen verantwortlich sind, messen selbst zwischen 100 und 200 μm. Die Größe der Feststoffteilchen ist ebenfalls durch die maximal mögliche Dicke des für einen Wirt hergestellten Gewebetransplantates festgelegt. Die Dicke muss mit dem Weiterleben nach Implantation in vivo in Einklang stehen. Eine Diffusionsstrecke größer als 0,5 mm ist nicht erwünscht, da das Transplantat von diffundierenden Gewebsflüssigkeiten zwecks Gasaustausch und Nährstoffen abhängig ist, bis es von Gefäßen durchzogen ist. Das Ziel ist, Feststoffteilchen relativ gleicher Größe aus dem gefrorenen Gewebe mittels eines mechanischen Prozesses herzustellen, der das Material nicht mit seiner Reibungswärme schmilzt. Mischen, Reiben, Zerkleinern und/oder Zerstoßen in der Kälte bei –30°C oder darunter sind Verfahren, die angewandt sein können.
Die Feststoffteilchen werden dann zu Aggregaten mit kleinen Clustern kultivierter Zellen vereint oder werden als Mikrokügelchen in einem Zellbioreaktor eingesetzt, in dem Zellen von Inselzellkulturen ausgesät sind. Die Zellen haften auf den Oberflächen der Matrix-Mikrokügelchen im Bioreaktor. Die zuletzt erwähnte Strategie ist als ein Mittel zur Expansion von Inselzellkulturen zweckdienlich; sie kann ebenfalls als ein Mittel zur Bildung von Pseudo-Inseln dienen.
Das zweite Beispiel eines Organs, dessen Matrix präpariert wurde, ist das Jejunum oder Duodenum, das nach dem Öffnen mechanisch abgeschabt wurde. Wie von Badylak et al., U.S. Patent Nr. 4.902.508 (1990) beschrieben, wird das Stratum compactum, das etwa 100 μm dick ist und zwischen den luminalen Schichten auf der einen Seite und muskulären Schichten auf der anderen Seite liegt, von ihnen befreit und es verbleibt ein zellfreies kollagenes Bindegewebe. Das gewaschene Stratum compactum wird nach Gefriertrocknen, wie oben beschrieben, partikularisiert.
Ähnlich wird das dritte Organ, die Haut, von Epidermis und darunter liegendem Fettmaterial befreit und die Dermis wird in 100–200 μm dicke Schichten parallel zur Dermis-Oberfläche mit einem Dermatom geschnitten. Sie wird dann gefriergetrocknet, partikularisiert und als Vorbereitung auf eine Kombination mit Zellen oder Transplantation gewaschen. Alternativ können die Schichten, die von Jejunum oder Duodenum stammen, mit einem Meshdermatom oder ähnlichen Vorrichtung porös gemacht oder perforiert sein, so dass sie mit Zellen oder Pseudo-Inseln oder beidem besät werden können.
Aggregate können ebenfalls gebildet werden, wenn Suspensionen kultivierter Zellen mit den Matrix-Feststoffteilchen in einer Transwell-Kammer, wie beispielsweise in der Costar^TM Kammer, kombiniert werden. Die Flüssigkeit, in der die Zellen und das Feststoffteilchen suspendiert sind, fließt durch die poröse Membran, die als Kammerboden dient, und die Zellen geraten in unmittelbare Nähe zu den Feststoffteilchen, an deren Oberflächen sie haften. Sezernierte Zellprodukte versorgen die zusätzliche Matrix, die dem Großteil der Feststoffteilchen Zusammenhalt verleiht.
Die beiden weiteren Versuchsansätze, die den Kombinationen aus Feststoffteilchen-Zelle oder Feststoffteilchen-Pseudo-Insel Zusammenhalt verleihen, um eine Transplantation in Schichten zu erleichtern, sind die folgenden: Ein flacher Behälter aus porösem Kollagen oder aus einem Poly-L-lactat oder einem anderen Biopolymer wird hergestellt und mit den Matrix-Feststoffteilchen und anhaftenden Zellen gefüllt, die in einem Bioreaktor oder anderen Gerät gebildet worden sind. Der Biopolymer-Behälter und dessen Inhalt können dann in einer Kammer gehalten werden, deren Boden eine Transwell-Membran ist und mit dem Nährmedium in Kontakt steht.
Das andere Verfahren besteht aus nicht toxischem Vernetzen der Feststoffteilchen mit Transglutaminase in Gegenwart von Dermatansulfat und Fibronectin, wobei dadurch dreidimensionale rekonstituierte Gewebe gebildet werden. Weil dieses Verfahren Zellen nicht schädigt, kann die Vernetzung in Gegenwart der Zellen erfolgen. Die zusammengefügten Konstrukte, das heißt dreidimensionale rekonstituierte Gewebe, werden bei 37°C in einem 5% CO₂ Inkubator inkubiert und lässt sie als Vorbereitung auf die Transplantation in vitro differenzieren.
Entsprechungen
Der Fachmann erkennt oder ist in der Lage, viele Entsprechungen zu den spezifischen Anwendungsformen der hier beschriebenen Erfindung unter ausschließlicher Anwendung von Routineexperimenten zu erkennen. Diese und weitere Entsprechungen sind beabsichtigterweise von den folgenden Ansprüchen umfasst.

Claims

Eine Bindegewebe-Matrix, einschließlich mindestens eines Fragmentes: dem lebende Zellen fehlen, die normalerweise in dem Ausgangsgewebe gefunden werden, von dem es stammt; das die native Komplexität des Ausgangsgewebes konserviert, von dem es stammt; und das Faktoren umfasst, die für Zellwachstum, -morphogenese und -differenzierung erforderlich sind.
Die Bindegewebe-Matrix nach Anspruch 1, worin das Ausgangsgewebe ein Gewebe ist, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Haut, Geweben von Organen, Duodenum, Pankreas oder Arterien, Bindegewebe, Fötalgewebe, porcinem Fötalgewebe und nicht-humanem Embryonalgewebe.
Ein Konstrukt, umfassend ein Biopolymer mit den Bindegewebe-Matrices nach Anspruch 1 oder 2.
Das Konstrukt nach Anspruch 3, worin die Fragmente vernetzt sind.
Das Konstrukt nach Anspruch 3, worin das Biopolymer Kollagen ist.
Das Konstrukt nach Anspruch 5, worin das Kollagen in einer Gestalt oder Form vorliegt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Kollagen-Faden, einem Kollagen-Fasergewebe und einer Kollagen-Membran.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Bindegewebe-Matrix, umfassend: Verarbeiten eines Ausgangsgewebes mit einer Matrix und lebenden Zellen, wodurch die lebenden Zellen zerstört werden, um Zellreste zu bilden; Verarbeiten des Ausgangsgewebes, um die Zellreste von der Matrix zu entfernen ohne Faktoren zu entfernen, die für Zellwachstum, -morphogenese und -differenzierung erforderlich sind, um ein verarbeitetes Ausgangsgewebe zu bilden; und Fragmentieren des verarbeiteten Ausgangsgewebes, um Matrix-Feststoffteilchen herzustellen.
Das Verfahren nach Anspruch 7, außerdem nach dem Fragmentierungsschritt umfassend den Schritt des Auftragens der Matrix-Feststoffteilchen auf ein Polymer.
Das Verfahren nach Anspruch 8, worin die Matrix-Feststoffteilchen vernetzt werden.
Das Verfahren nach Anspruch 9, worin das Polymer Kollagen ist.
Das Verfahren nach Anspruch 10, worin das Kollagen in einer Gestalt oder Form vorliegt, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus einem Kollagen-Faden, einem Kollagen-Fasergewebe und einer Kollagen-Membran.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, außerdem umfassend Besäen der Matrix-Feststoffteilchen mit Zellen unter Bedingungen, die den Zellen ein Anhaften auf den Matrix-Feststoffteilchen erlauben.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11, worin das Ausgangsgewebe Fötalgewebe umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 13, worin das Fötalgewebe porcines Fötalgewebe ist.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11 und 13 bis 14, worin der Fragmentierungsschritt entweder mechanisches Scheren eines gefrorenen oder nichtgefrorenen Ausgangsgewebes oder mechanisches Zerkleinern zwischen Walzen umfasst.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11 und 13 bis 15, außerdem umfassend den Schritt der enzymatischen Behandlung der Matrix-Feststoffteilchen, um Nucleinsäuren zu entfernen.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11 und 13 bis 16, außerdem umfassend den Schritt der Behandlung der Matrix-Feststoffteilchen mit einem Verschmelzungsmittel, um einen Verbundstoff zu bilden, in dem die Matrix-Feststoffteilchen miteinander verschmolzen sind.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11 und 13 bis 17, worin die Zellen zwei oder mehrere Zelltypen umfassen.
Das Verfahren nach einem der Ansprüche 7 bis 11 und 13 bis 18, worin die Matrix-Feststoffteilchen Transplantatgewebe bilden.
Das Verfahren nach Anspruch 19, außerdem umfassend den Schritt der weiteren Verarbeitung der Ausgangsmatrix, um restliche Zellkomponenten zu entfernen ohne Faktoren zu entfernen, die für Zellwachstum, -morphogenese und -differenzierung erforderlich sind, um Matrix-Feststoffteilchen nach dem Fragmentierungsschritt zu bilden.
Das Verfahren nach Ansprüchen 19 bis 20, worin der Schritt der Verarbeitung des Ausgangsgewebes mit einer Matrix und lebenden Zellen, um Zellreste zu bilden, ein Verarbeiten von Gewebe umfasst, das aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus bovinem Gewebe, ovinem Gewebe, porcinem Gewebe und Gewebe von einem marinen Säuger.
Das Verfahren nach Ansprüchen 19 bis 21, das außerdem Supplementieren der Matrix-Feststoffteilchen mit Wachstums- und Differenzierungsfaktoren umfasst.
Das Verfahren nach Anspruch 17 bis 19 und 21 bis 22, außerdem umfassend den Schritt des Besäens der Matrix-Feststoffteilchen mit Zellen unter Bedingungen, die den Zellen ein Anhaften auf den Matrix-Feststoffteilchen erlauben.
Ein Matrix-Feststoffpartikulat, das mit einem der Verfahren nach Ansprüchen 7 bis 11 und 13 bis 22 herstellbar ist.
Ein Konstrukt, das mit dem Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 11 und 13 bis 22 herstellbar ist.
Ein Verfahren zur Herstellung eines nicht-fragmentierten, verarbeiteten Matrix-Gewebes, umfassend: Verarbeiten eines Ausgangsgewebes mit einer Matrix und lebenden Zellen, wodurch die lebenden Zellen zerstört werden, um Zellreste zu bilden, ohne das Ausgangsgewebe zu fragmentieren; und Verarbeiten des Ausgangsgewebes, ohne das Ausgangsgewebe zu fragmentieren, um die Zellreste von der Matrix des Ausgangsgewebes zu entfernen ohne Faktoren zu entfernen, die für Zellwachstum, -morphogenese und -differenzierung erforderlich sind, um ein nicht-fragmentiertes, verarbeitetes Matrix-Gewebe zu bilden.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Biopolymer-Fadens, Fasergewebes oder Membran, umfassend die Schritte: (a) Verarbeiten eines Ausgangsgewebes mit einer Matrix und lebenden Zellen, wodurch die lebende Zellen zerstört werden, um Zellreste zu bilden; (b) Verarbeiten des Ausgangsgewebes, um die Zellreste von der Matrix zu entfernen ohne Faktoren zu entfernen, die für Zellwachstum, -morphogenese und -differenzierung erforderlich sind, um ein verarbeitetes Ausgangsgewebe zu bilden; (c) Fragmentieren des verarbeiteten Ausgangsgewebes, um Matrix-Feststoffteilchen zu bilden; (d) Verarbeiten eines Biopolymers, um einen Biopolymer-Faden, ein Biopolymer-Fasergewebe oder eine Biopolymer-Membran zu bilden; und (e) Herstellen eines Polymer-Fadens, Fasergewebes oder Membran aus dem Biopolymer-Faden, Fasergewebe oder Membran von Schritt (d) mit den Matrix-Feststoffteilchen von Schritt (c).
Ein Fasergewebe, das aus gewobenen oder geflochtenen Biopolymer-Fäden und Matrix-Feststoffteilchen gebildet ist, die mit einem der Verfahren nach Ansprüchen 7 bis 23 und 27 gebildet sind.
Das Fasergewebe nach Anspruch 28, worin das Biopolymer Kollagen ist.
Ein Fasergewebe, das aus gewobenen oder geflochtenen Biopolymer-Fäden und Matrix-Gewebe gebildet ist, das mit den Verfahren nach Ansprüchen 26 und 27 gebildet ist.