DE69333601T2

DE69333601T2 - Verfahren zur Steuerung der Probeneinführung bei Mikrosäulentrennungstechniken und Probenentnahmevorrichtungen

Info

Publication number: DE69333601T2
Application number: DE69333601T
Authority: DE
Inventors: Dr. Andreas Manz; Prof. Dr. D. Jed Harrison; Dr. Carlo S. Effenhauser
Original assignee: Zeptosens AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1993-04-15
Filing date: 1993-04-15
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2013-04-16
Also published as: US6491804B2; EP1296134A2; EP0620432B1; US20010008213A1; EP1296134B1; US20010025793A1; US6699377B2; US6280589B1; EP1296134A3; US20020027075A1; JPH0712777A; US6960286B2; US20060272945A1; US20010004963A1; US6423198B1; US6730202B2; DE69333601D1; US6699378B2; US7691245B2; JP3656165B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Steuern der Probeneinführung bei Mikrosäulentrenntechniken in Übereinstimmung mit dem Anspruch 1. Die Erfindung betrifft ausserdem eine entsprechende Probenentnahmevorrichtung entsprechend den Merkmalen des Oberbegriffs des Anspruchs 18.
Mikrosäulentrenntechniken, insbesondere die Kapillarelektrophorese hat sich zu einer interessanten Trenntechnik entwickelt, die als Teil eines Sensors oder eines chemischen Analysesystems verwendet wird. Ein hauptsächlicher Grund hierfür ist der grosse Wirkungsgrad des Verfahrens als Trenntechnik. Bei den Probenentnahmeverfahren, die üblicherweise bei der Kapillarelektrophorese zum Einsatz kommen, handelt es sich um folgende: Einspritzen einer Probe mit einer Spritze über ein Septum in einen Einspritzblock, die Verwendung von Einspritzventilen mit/ohne Probenentnahmeschleife, und das Tauchen von einem Ende der Kapillarröhre in den Probevorratsbehälter, wobei die Probe durch Schwerkraftströmung, durch Über- oder Unterdruck oder durch Elektroendosmose und/oder Elektromigration eingeführt wird.
Während im Journal of Chromatography, 452, (1988) 615–622, angeführt ist, dass es sich bei Probenentnahmeventilen um das geeignetste Probenentnahmeverfahren für Kapillarelektrophorese handelt, ist dort ausserdem eine ventillose Vorrichtung zum Einspritzen einer Probe erläutert. Die erläuterte Anordnung umfasst einen gegossenen Kapillarblock, der zwischen einem Elektrodenabteil und einer Probenentnahmevorrichtung in Verbindung gebracht ist. In dem Elektrodenabteil stehen Elektrolytlösungen im Kontakt mit Elektroden. Die Kapillarröhre enthält Messelektroden, die mit einer Evaluierungselektronik in Verbindung stehen. Die Probenentnahmevorrichtung besteht aus einem verbreiterten Teil der Kapillarröhre, der mit zwei Zuführeinrichtungen in Verbindung steht, die senkrecht zur Kapillarröhre verlaufen. Die Anordnung aus den beiden Zuführeinrichtungen, die entlang der Längserstreckung der Kapillarröhre voneinander versetzt sind, ist derart getroffen, dass die Probenentnahmevorrichtung die Form einer Doppel-T-Kapillarstruktur aufweist.
Die Probe wird in die Probenentnahmevorrichtung über eine Spritze eingeführt. Das Einspritzvolumen ist geometrisch durch die Distanz festgelegt, mit der die beiden Zuführeinrichtungen voneinander entlang der Kapillarröhre beabstandet sind. Der Transport der Elektrolytlösung und der Probe in der Kapillarröhre wird durch elektrische Felder bewirkt, die zwischen den jeweiligen Elektroden entlang der Kapillarröhre angelegt sind. Ein Vorteil der T-Form-Probenentnahmevorrichtung, der unter Verwendung von Einspritzventilen ausserdem erzielt wird, betrifft die Konzentrationswirkung verdünnter ionischer Probenspezien. Es ist jedoch möglich, dass, obwohl kein elektrischer Feldgradient über den Zuführeinrichtungen vorliegt, Probekomponenten von den Zuführeinrichtungen in die Kapillarröhre diffundieren können, wenn die Probe die Probenentnahmeposition bereits verlassen hat. Die Mengen der Probekomponenten, die unkontrollierbar in die Kapillarröhre eindringen, hängt von den Diffusionskoeffizienten und den Mobilitäten der jeweiligen Probekomponenten ab. Am Detektor gelangt damit nicht nur ein mehr oder weniger breiter Stopfen aus eingespritztem Probenfluid abhängig von den Diffusionskoeffizienten und den Mobilitäten der jeweiligen Komponenten im Elektrolyten und dem elektrischen Feld an; vielmehr wird auch der Elektrolyt vor und hinter bzw. zwischen einzelnen Probefluidstopfen mit unvorhersagbaren Mengen an Probekomponenten "verschmutzt". Diese unvorhersagbaren Probekomponentenmengen, die den Detektor erreichen, sind hochgradig unerwünscht und führen zu starkem Rauschen im Ermittlungssignal, wodurch die Ermittlungsgrenzen beträchtlich herabgesetzt werden.
In Analytical Chemistry, 1992, 64, Seiten 1926–1932, ist eine elektrophoretische Kapillarvorrichtung erläutert, in der die Probe elektrokinetisch eingespritzt wird, indem ein Ende der Kapillare in den Probebehälter eingetaucht wird, wobei eine Spannung über die Enden der Kapillare angelegt wird. In dem elektrischen Feld wird die Probe elektrokinetisch transportiert und an der T-Verzweigung in das Kanalsystem der elektrophoretischen Kapillarvorrichtung eingespritzt. Dieses Verfahren führt jedoch zu einer an sich bekannten Vorbelastung der tatsächlichen Probenzusammensetzung auf Grund der Differenzen bezüglich der elektrophoretischen Mobilitäten der Probekomponenten. Die eingeführte Probe weist deshalb häufig nicht dieselbe Zusammensetzung auf wie die ursprüngliche Probe. Das Volumen der eingeführten Probe ist ausserdem häufig unbekannt, so dass für quantitative Analysen interne Standards verwendet werden müssen.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht deshalb darin, ein Verfahren zum Steuern der Probeneinführung bei Mikrosäulentrenntechniken zu schaffen, und insbesondere bei der Kapillarelektrophorese (CE), sowie eine Probenentnahmevorrichtung, die die vorstehend genannten Nachteile des Standes der Technik überwindet. Das Probenvolumen sollte geometrisch definiert sein. Die Zusammensetzung der Probe, die eingespritzt wird, sollte sich von der ursprünglichen Zusammensetzung der Probe in dem Vorratsbehälter nicht unterscheiden. Die unkontrollierte Einführung eines Probenfluids in die Kapillarröhre sollte beträchtlich verringert sein. Wenn die unerwünschte Leckage von Probefluid in die Kapillarröhre nicht vollständig vermieden werden kann, sollten Massnahmen ergriffen werden, dass dies zumindest in vorhersehbarer und kontrollierbarer bzw. steuerbarer Weise erfolgt.
Das Verfahren und die Probenentnahmevorrichtung in Übereinstimmung mit der Erfindung soll ausserdem eine problemlose Verwirklichung miniaturisierter Analysekonzepte ermöglichen, wie etwa diejenigen, die beispielsweise in Sensors and Actuators B, 10 (1993) 107–116, erläutert sind. Das Konzept eines Mehrfachverteiler-Strömungssystems, integriert auf einem Siliziumsubstrat, mit ventillosem Umschalten eines Lösungsmittelstroms zwischen Kanälen und elektrokinetischem Pumpen eines wässrigen Lösungsmittels ist dort erläutert. Ein ähnliches Konzept ist beispielsweise in Analytical Chemistry, Band 64, Nr. 17, 1. September 1992, 1926–1932, erläutert. Das erläuterte miniaturisierte chemische Analysesystem auf Grundlage von Kapillarelektrophorese umfasst einen komplexen Verteiler aus Kapillarkanälen, die in einem planaren Glassubstrat mikromaschinell gebildet sind. Der Transport des Lösungsmittels und der Probe finden auf Grund elektrokinetischer Effekte (Elektroosmose und/oder Elektrophorese) statt.
Gelöst werden die der Erfindung zugrunde liegenden Aufgaben durch ein Verfahren zum Steuern der Probeneinführung in Mikrosäulentrenntechniken, insbesondere der Kapillarelektrophorese (CE), das die Prozessschritte entsprechend Anspruch 1 umfasst.
In einem weiteren bevorzugten Prozessschritt, unmittelbar nach der Einspritzung des Probestopfens, wird der Elektrolytpufter in den Zuführkanal vorrücken gelassen sowie in den Ablaufkanal in jeweiligen Zufuhr- und Ablaufanschlüssen für eine Zeitperiode, die zumindest der Migrationszeit der langsamsten Komponente innerhalb des Probestopfens vom Zufuhranschluss zum Detektor entspricht, die Probe wird dadurch in die jeweiligen Zufuhr- und Ablaufkanäle zurückgeschoben und im wesentlichen daran gehindert, unkontrollierbar in den Elektrolytpuffer zu diffundieren, der an den Zufuhr- und Ablaufanschlüssen vorbei transportiert wird. Ausserdem erlaubt das Verfahren die Steuerung der Probenzusammensetzung in dem Elektrolytpufter.
Bevorzugte Varianten des erfindungsgemässen Verfahrens sowie bevorzugte Ausführungsformen der erfindungsgemässen Probenentnahmevorrichtung bilden Gegenstand der jeweiligen abhängigen Ansprüche. Die Erfindung erschliesst sich aus der nachfolgenden Beschreibung in Bezug auf die schematischen Zeichnungen; in diesen zeigen:
1 eine schematische Ansicht einer Mikrosäulentrennvorrichtung, die eine Probenentnahmevorrichtung für das Verfahren in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung umfasst,
2 eine Schnittansicht der Mikrosäulentrennvorrichtung von 1,
3 eine vergrösserte Ansicht des mit einem Kreis umschlossenen Teils der Mikrosäulentrennvorrichtung von 1 unter Darstellung einer Probenentnahmevorrichtung für das Verfahren entsprechend der Erfindung, und
4 eine Probenentnahmevorrichtung entsprechend Anspruch 18.
In 1 und 2 ist eine beispielhafte Ausführungsform einer Mikrosäulentrennvorrichtung, insbesondere einer elektrophoretischen Trennvorrichtung gezeigt. Sie umfasst einen Basisteil 1 und einen Deckelteil 2. Der Basisteil 1 kann aus Glas, einkristallinem Silizium oder anderen Materialien hergestellt sein, die aus der Halbleiterherstellung bekannt sind, oder aus einem geeigneten Polymermaterial. Der Deckelteil 2 ist bevorzugt aus Glas hergestellt. Der Basisteil 1 umfasst ein Kanalsystem 4, das in seine Oberfläche geätzt, mikromaschinell eingebracht oder andennreitig erzeugt ist. Bevorzugte Techniken, die aus der Halbleitertechnik bekannt sind, werden angewandt, um das Kanalsystem in der Oberfläche des Basisteils 1 zu erzeugen. Der Deckelteil ist mit Durchgangslöchern R, S, D, W versehen, die mit dem Kanalsystem 4 in Verbindung stehen und dazu ausgelegt sind, die Enden der Kapillarröhren aufzunehmen und zu halten. Der Deckelteil 2 ist ausserdem mit verschiedenen Anschlüssen für Lichtwellenleiter versehen, die Teil eines optischen Ermittlungssystems, wie beispielsweise eines Fluoreszenzermittlungssystems oder eines Absorptionsermittlungssystems oder eines Systems zum Ermitteln von Änderungen des Brechungsindex einer Probe bilden, die durch das Kanalsystem fliesst bzw. strömt. Die Anschlüsse sind entlang dem Kanalsystem 4 hinter einer Probenentnahmevorrichtung 3 verteilt, in der eine Probe in einen Elektrolytpuffer eingeführt wird, wodurch Messungen an unterschiedlichen Stellen entlang dem Kanalsystem durchgeführt werden können.
Der Transport des Elektrolytpuffers und der mehr oder weniger konzentrierten Probe erfolgt bevorzugt durch elektrische Felder, die durch Umschalten elektrischer Potentiale zwischen Elektroden eines jeweiligen Vorratsbehälters R und von Abflüssigkeitsbehältern W für den Elektrolytpuffer und zwischen Elektroden erzeugt werden, die mit einem jeweiligen Quellenbehälter S sowie Ablaufbehältern D für die Probe verbunden sind.
In 3 und 4 ist die in 1 mit einem Kreis umschlossene Probenentnahmevorrichtung 3 in vergrössertem Massstab gezeigt. Sie bildet Teil des Strömungseinspritzanalysesystems von 1, das auf elektrokinetischen Prinzipien basiert und eine elektrophoretische Analyse einer Probe erlaubt. Die Probenentnahmevorrichtung 3 kann einen integrierten Teil des Kapillarkanalsystems 4 bilden und ist deshalb mit dem Vorratsbehälter R und dem Abflüssigkeitsbehälter W hinter den Detektoren 5–8 für den Elektrolytpuffer sowie mit dem Quellenvor ratsbehälter S und dem Ablaufvorratsbehälter D für die zu analysierende Probe verbunden. In 3 und 4 sind der Klarheit wegen der Behälter R und die Behälter W, S, D nicht gezeigt, sondern lediglich durch Pfeile symbolisch dargestellt, die gleichzeitig die Richtung des Fluidstroms in dem Kanalsystem 4 bezeichnen.
In 3 ist eine Probenentnahmevorrichtung zur Ausführung des Verfahrens gezeigt. Diese umfasst ein Kapillarkanalelement 22, das an einem Ende mit einem Kapillarkanal verbunden ist, der mit dem Vorratsbehälter R für den Elektrolytpufter verbunden ist, und in Längsrichtung am anderen Ende mit einem Kapillarkanal, in dem die elektrophoretische Trennung der Probe stattfindet, und der zu dem Detektor bzw. den Detektoren und daraufhin zu dem Abflüssigkeitsbehälter bzw. den Abflüssigkeitsbehältern W führt. Die Probenentnahmevorrichtung umfasst ausserdem einen Zufuhrkanal 23, der mit einem Quellenbehälter S für die Probe verbunden ist, und einen Ablaufkanal 24, der zu einem Ablaufbehälter D führt. Der Quellenkanal 23 und der Ablaufkanal 24 verlaufen in Bezug auf die Längserstreckung des Kanalelements 2 geneigt und sind bevorzugt in etwa senkrecht derart angeordnet, dass sie zusammen mit dem Kanalelement 22 eine Doppel-T-Struktur bilden, wie in der Zeichnung gezeigt. Der Quellenkanal S und der Ablaufkanal D tragen jeweils in das Kanalelement 22 an jeweiligen Zufuhr- und Ablaufanschlüssen 25, 26 aus. In Übereinstimmung mit der Zeichnung in 3 sind der Zufuhranschluss 25 und der Ablaufanschluss 26 in Längsrichtung des Kanalelements 22 derart voneinander beabstandet, dass ein Probevolumen 27 geometrisch definiert ist, wie nachfolgend näher erläutert. Es wird bemerkt, dass der Ablaufkanal 24 in Richtung der Längserstreckung des Quellenkanals 23 derart angeordnet sein kann, dass die Zufuhr- und Ablaufanschlüsse 25, 26 in Gegenüberlage zueinander sich befinden. In diesem Fall besitzen die Kanäle der Probenentnahmevorrichtung keine Doppel-T-Struktur; vielmehr sind sie in Form einer üblichen Kreuzung angeordnet.
Wie bereits vorstehend angeführt, wird der Transport bzw. die Förderung der Fluide, d. h. des Elektrolytpufters und der Probe, mit elektrischen Feldern bewirkt, die ein Ergebnis unterschiedlicher elektrischer Potentiale am Vorratsbehälter R und dem Abflüssigkeitsbehälter W für den Elektrolytpuffer und dem jeweiligen Quellenbehälter S und dem Ablaufbehälter D für die Probe sind. Beispielsweise durch Anlegen eines positiven elektrischen Potentials an den Vorratsbehälter R und eines negativen elektrischen Potentials an den Abflüssigkeitsbehälter wird der Elektrolytpufter elektrokinetisch vom Vorratsbehälter R durch das Kapillarkanalsystem zum Abflüssigkeitsbehälter W gefordert. Um die Probe beispielsweise in das Kanalelement 22 einzuführen, wird der Quellenbehälter S für die Probe auf einem positiven Potential gehalten und der Ablaufbehälter D wird auf einem negativen Potential gehalten. In dem re sultierenden elektrischen Feld wird die Probe elektrokinetisch vom Quellenbehälter S zum Ablaufbehälter D transportiert. Die Strömungsrichtung ist in 3 durch Pfeile S, V und D gezeigt. Durch diese Massnahme wird ein Teil 27 des Kanalelements 22, der durch den Zufuhranschluss 25 an einem Ende und den Ablaufanschluss 26 am anderen Ende begrenzt ist, mit Probe befüllt. Der mit der Probe befüllte Teil 27 des Kanalelements der Probenentnahmevorrichtung 3 definiert das Volumen des elektrokinetisch eingespritzten Probestopfens, wie in 3 schraffiert gezeigt. Mit anderen Worten ist das Volumen 27 des Probestopfens geometrisch durch die voneinander beabstandeten Zufuhr- und Ablaufanschlüsse 25, 26 begrenzt. In dem vorstehend angesprochenen Fall, demnach die Zufuhr- und Ablaufanschlüsse einander gegenüberliegend angeordnet sind, so dass das Kanalelement 22 und die Zufuhr- und Ablaufkanäle 23, 24 eine übliche Kreuzung bilden, legen die Grösse und das Volumen der Schnittstelle das Probevolumen fest. In diesem Fall ist deshalb das Probevolumen ausschliesslich durch die Querschnitte der jeweiligen Kanäle 22, 23, 24 definiert.
Um sicherzustellen, dass die Zusammensetzung der Probe in dem Probevolumen 27 die tatsächliche Probenzusammensetzung in dem Vorratsbehälter R widerspiegelt, muss das elektrische Feld über den Zufuhr- und Ablaufkanälen 23, 24 für zumindest eine Zeitperiode bzw. Zeitdauer aufrecht erhalten werden, die ausreicht, dass das geometrisch definierte Probenvolumen befüllt wird und die Komponente der Probe enthält, die die geringste elektrophoretische Mobilität aufweist. Diese minimale Zeitdauer t_min ist durch die Gleichung t_min = d/μ_i·E gegeben. In dieser Gleichung steht d für die Distanz, mit der der Quellen- und Ablaufanschluss voneinander beabstandet sind; μ_i steht für die Gesamtmobilität der langsamsten Komponente i der Probe, auf die nachfolgend näher eingegangen ist, und E steht für die Feldstärke über den Quellen- und Ablaufkanälen, die aus der Potentialdifferenz herrührt.
Wenn eine elektrophoretische Analyse einer Probe ausgeführt wird, wird zunächst ein elektrisches Feld zwischen dem Vorratsbehälter R und dem Abflüssigkeitsbehälter W derart festgelegt, dass der Elektrolytpufter von dem Vorratsbehälter R zu dem Abflüssigkeitsbehälter W transportiert wird. Nachdem das Kanalsystem des chemischen Analysesystems mit dem Elektrolytpufter gefüllt worden ist, wird das Einspritzen der Probe in das Kanalelement 22 initiiert. Für diesen Zweck wird ein elektrisches Feld zwischen dem Quellenbehälter S und dem Ablaufbehälter D derart aufgebaut, dass die Probe von dem Quellenbehälter S durch den Zufuhrkanal 23 über das Kanalelement 22 in den Ablaufkanal 24 und weiter zu dem Ablaufbehälter D elektrokinetisch transportiert wird. Es wird bemerkt, dass während der Zeitperiode, in der die Probe eingespritzt wird, das elektrische Feld zwischen dem Vorratsbehälter R und dem Abflüssigkeitsbehälter W ausgeschaltet wird, oder dass die Potentiale derart ge wählt werden, dass ausschliesslich die Probe entlang dem vorstehend erläuterten Pfad transportiert wird. Nach der Einspritzzeitdauer, die derart gewählt ist, dass sichergestellt ist, dass das Probevolumen 27 zwischen dem Zufuhranschluss 26 und dem Ablaufanschluss 26 mit der Probe gefüllt ist, wird das elektrische Feld zwischen dem Quellenbehälter S und dem Ablaufbehälter D ausgeschaltet. Gleichzeitig wird das elektrische Feld zwischen dem Vorratsbehälter R und dem Abflüssigkeitsbehälter W derart erneut aktiviert, dass die in dem Probenvolumen 27 enthaltene Probe in Richtung des Detektors bzw. der Detektoren und des Abflüssigkeitsbehälters transportiert wird. Während sie durch das Kanalsystem transportiert wird, wird die Probe in dem elektrischen Feld elektrophoretisch getrennt.
Das Leckage- oder Diffusionsproblem der Probekomponenten in den Elektrolytpuffer, während dieser über die Zufuhr- und Ablauföffnungen 23 und 24 hinaus transportiert wird, obwohl noch kein elektrisches Feld zwischen dem Quellenbehälter S und dem Ablaufbehälter D angelegt ist, wird dadurch gelöst, dass der Elektrolytpuffer in den Zufuhrkanal 23 und in den Ablaufkanal 24 hinein an den jeweiligen Zufuhr- und Ablaufanschlüsse 25 und 26 für eine Zeitdauer vorgerückt wird, die zumindest der Migrationszeit t_i der langsamsten Komponente i in dem Probestopfen von dem Zufuhranschluss 25 zum jeweiligen Detektor beträgt. Die Probe wird dadurch in die Zufuhr- und Ablaufkanäie 23 und 24 zurückgeschoben und im wesentlichen daran gehindert, unkontrollierbar in den Elektrolytpuffer zu diffundieren, der über die Zufuhr- und Ablaufanschlüsse 25, 26 hinaus transportiert wird.
Die Migrationszeit t_i der langsamsten Komponente i der Probe ist als Quotient zwischen der Trennungslänge L und dem Produkt aus Gesamtmobilität μ_i der langsamsten Komponente i der Probe mit der elektrischen Feldstärke E' definiert, die entlang ihrem Pfad L wirkt und sie ist gegeben durch die Gleichung t_i = L/μ_i·E'). In dieser Gleichung entspricht die Trennungslänge L (1) der Distanz der Probekomponente i, die zwischen dem Zufuhranschluss 25 und dem jeweiligen aktivierten Detektor 5–8 zurückgelegt wurde, und die Gesamtmobilität μ_i der Komponente entspricht der Summe aus der elektrophoretischen Mobilität μ_i,ep und der Komponente der elektroosmotischen Gesamtmobilität μ_eo der Probe. Die Zeitdauer, während derer die Ermittlung ausgeführt wird, ist sehr kurz im Vergleich zur Migrationszeit der langsamsten Komponente der Probe und damit vernachlässigbar.
Um den Elektrolytpuffer in die Zufuhr- und Ablaufkanäle 23 und 24 gelangen zu lassen, werden in der beispielhaften Ausführungsform der in 3 gezeigten Probenentnahmevorrichtung der Quellenbehälter S und der Ablaufbehälter D auf ein elektrisches Potential umgeschaltet, das sich von dem elektrischen Potential am Vorratsbehälter R für den Elektrolytpuf fer unterscheidet, wodurch eine Potentialdifferenz geeigneter Höhe erzeugt wird. In einer Ausführungsform, in der der Elektrolytpufter von einem positiven Potential zu einem negativen Potential transportiert wird, werden die Potentiale an den Quellen- und Ablaufbehältern S, D relativ zum positiven Potential am Vorratsbehälter R negativ gewählt. Im Fall eines Transports des Elektrolytpuffers von einem negativen Potential zu einem positiven Potential werden die Potentiale der Quellen- und Ablaufbehälter S, D relativ zum Vorratsbehälter R positiv gewählt.
Bevorzugt wird die Potentialdifferenz zwischen dem Vorratsbehälter R und den Quellen- und Ablaufbehältern S, D derart gewählt, dass das resultierende elektrische Feld eine Feldstärke aufweist, die sich auf zumindest etwa 0,1 V/cm beläuft.
Ein weiterer Ansatz, um ein Vorrücken des Elektrolytpuffers in die Zufuhr- und Ablaufkanäle 3, 4 zu ermöglichen, ist in 4 gezeigt. Der Aufbau der dargestellten Probenentnahmevorrichtung 3 entspricht grundsätzlich demjenigen, der in 3 gezeigt ist. Sie umfasst ein Kanalelement 12 mit zwei Seitenkanälen 13, 14. Die Seitenkanäle sind zur Längserstreckung des Kanalelements 12 unter einem Winkel geneigt, der etwa 5 Grad bis etwa 175 Grad beträgt; bevorzugt sind sie jedoch in etwa senkrecht in Bezug auf das Kanalelement 12 angeordnet. Bei den Seitenkanälen handelt es sich um einen Zufuhrkanal 13 und einen Ablaufkanal 14, die in das Kanalelement 12 an jeweiligen Zufuhr- und Ablaufanschlüssen 15, 16 austragen. Bevorzugt sind der Zufuhranschluss 15 und der Ablaufanschluss 16 am Kanalelement 12 voneinander beabstandet und begrenzen ein Probevolumen 17. Die Distanz d, mit der sie voneinander beabstandet sind, beträgt typischerweise von etwa 0 μm bis etwa 3 cm, bzw. etwa 3 mm, wobei der Wert 0 anzeigt, dass die Zufuhr- und Ablaufanschlüsse einander gegenüberliegend angeordnet sind. Das Kanalelement 12 steht mit einem Vorratsbehälter R und einem Abflüssigkeitsbehälter W für den Elektrolytpuffer in Verbindung. Der Zufuhrkanal 13 ist mit einem Quellenbehälter S für die Probe verbunden, während der Ablaufkanal 14 mit dem Ablaufbehälter D in Verbindung steht.
Die Probenentnahmevorrichtung 3 bildet einen Teil eines elektrophoretischen chemischen Analysesystems und arbeitet grundsätzlich in derselben Weise wie die in 3 gezeigte Probenentnahmevorrichtung. Damit der Elektrolytpuffer in die Zufuhr- und Ablaufkanäle 13, 14 vorrücken kann, ist der Strömungswiderstand in den beiden Kanälen jedoch herabgesetzt. Insbesondere besitzen der Quellenkanal und der Ablaufkanal jeweils einen Strömungswiderstand relativ zu dem Elektrolytpuffer, der etwa 5% niedriger ist als der jeweilige Strömungswiderstand des Elektrolytkanals. Überraschenderweise führt die Verringerung des Strömungswiderstands der Zufuhr- und Ablaufkanäle 13, 14 nicht zu einer Erhöhung der Leckage bzw. Diffusion von Probekomponenten in den Elektrolytpuffer, wenn dieser über die jeweiligen Zufuhr- und Ablaufanschlüsse 15, 16 hinaus transportiert bzw. gefördert wird. Die Verringerung des Strömungswiderstands des Seitenkanals 13, 14 führt vielmehr zu einer Konvektionsströmung des Elektrolytpuffers in die Kanäle 13, 14 selbst dann, wenn die angelegten elektrischen Felder in einen derartigen Strom nicht resultieren sollten. Die Leckage bzw. Diffusion von Probekomponenten ist deshalb beträchtlich verringert und das Rauschen des Ermittlungssignals ist herabgesetzt. Folglich ist die Empfindlichkeit des Analysesystems, bei der es sich um die Ermittlungsgrenze handelt, erhöht. Der Strömungswiderstand des Zufuhr- und Ablaufkanals kann verringert werden durch entweder Verringern der Länge der jeweiligen Kanäle oder durch Vergrössern ihrer jeweiligen Breite w. Die Verringerung des Strömungswiderstands der Zufuhr- und Ablaufkanäle 13, 14 wird erzielt, indem diese jeweils mit einer Breite w bereit gestellt werden, die zumindest etwa zweimal grösser ist als die Breite p der Zufuhr- und Ablaufanschlüsse 15, 16. Die Zufuhr- und Ablaufkanäle 13, 14 weisen deshalb die Form einer Flasche auf, wobei der Flaschenhals der jeweilige Zufuhr- bzw. Ablaufanschlüsse 15, 16 ist.
Während die Zufuhr- und Ablaufkanäle 13, 14 direkt in das Kanalelement 12 austragen bzw. entleeren können, so dass ihre Enden, die in unmittelbarer Nähe des Kanalelements 12 zu liegen kommen, die jeweiligen Quellen- und Ablaufanschlüsse 15, 16 bilden, von denen aus die Breite der Kanäle allmählich über ein jeweiliges Zwischenelement 13', 14' ausgehend von der Breite p der Anschlüsse zu einer endgültigen Breite w der Kanäle allmählich zunimmt, besitzen die Zufuhr- und Ablaufanschlüsse ausserdem Längserstreckungen 1. Diese Längserstreckungen entsprechen zumindest der Breite p der jeweiligen Zufuhr- und Ablaufanschlüsse 15, 16. Die Breiten p des Zufuhr- und Ablaufanschlusses 15, 16 werden vorteilhafterweise entlang ihrer gesamten Längserstreckung 1 konstant gehalten. Die Breiten p der Zufuhr- und Ablaufanschlüsse 15, 16 sind derart gewählt, dass sie in etwa der Breite b des Kanalelements 12 entsprechen.
Die Tiefe des Kanalelements 12 (die der Tiefe des Kanalsystems entsprechen sollte, von dem das Element einen Teil bildet) und der Zufuhr- und Ablaufkanäle 13, 14 beträgt typischerweise etwa 0,1 μm bis etwa 100 μm. Die Tiefen der flaschenhalsartigen Zufuhr- und Ablaufanschlüsse 15, 16 entsprechen etwa der Tiefe der Kanäle.
Die Probenentnahmevorrichtung 3 in Übereinstimmung mit der Erfindung ist unter Bezug auf beispielhafte Ausführungsformen erläutert worden, die Teil von Mikroanalysechips bilden. Es kann sich bei ihr auch um eine Anordnung aus Kapillarröhren handeln, die Teil eines elektrophoretischen chemischen Analysesystems bildet, das aus Kapillarröhren besteht. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die Probenentnahmevorrichtung jedoch in ein System aus Kapillarröhren integriert, die in einer kleinen planaren Glassscheibe, einem Halbleitermaterial oder einem geeigneten Polymer festgelegt sind. Vorteilhafterweise ist das Kanalsystem mit den Zufuhr- und Ablaufkanälen und den jeweiligen Zufuhr- und Ablaufanschlüssen geätzt, mikromaschinell erstellt oder gegossen (im Fall eines Polymerbasisteils) oder anderweitig im planaren Substrat erstellt. Am besten geeignet für seine Herstellung sind Techniken, die bei der Halbleiterherstellung oder der Herstellung von mikromechanischen Elementen an sich bekannt sind.
Die Kombination einer Struktur, die das eingespritzte Probevolumen geometrisch definiert, bei elektrokinetischer Einspritzung der Probe über eine definierte minimale Zeitperiode erlaubt es, das Probevolumen zuverlässig zu steuern und sicherzustellen, dass die Zusammensetzung der Probe, die im Probevolumen enthalten ist, die ursprüngliche Zusammensetzung der Probe im Vorratsbehälter widerspiegelt. Eine weitere Verbesserung des Verfahrens und der Probenentnahmevorrichtung in Übereinstimmung mit der Erfindung erlaubt eine beträchtliche Herabsetzung unkontrollierter Leckage oder Diffusion von Probekomponenten in den Elektrolytpuffer. Dadurch ist es möglich, die Leckage oder Diffusion derart herabzusetzen, dass die noch verbleibende Leckage zu einer Konzentration der Probe in dem Elektrolytpuffer führt, die geringer ist als 3% der ursprünglichen Konzentration der Probe. Durch diese Massnahme wird das Rauschen des ermittelten elektrophoretischen Signals verringert und die Ermittlungsgrenzen werden heraufgesetzt.

Claims

Verfahren zum Steuern der Probeneinführung in Mikrosäulentrenntechniken mit einem System aus Kapillarkanälen, aufweisend eine Probenentnahmevorrichtung, die einen Zufuhrkanal enthält, der eine Probe enthält, einen Ablaufkanal und einen Elektrolytkanal, der einen Elektrolytpufter enthält, wobei die Zufuhr- und Ablaufkanäle relativ zu dem Elektrolytkanal jeweils geneigt verlaufen, und wobei die Zufuhr- und Ablaufkanäle den Elektrolytkanal am Zufuhr- und Ablaufanschluss jeweils schneiden, so dass ein geometrisch definiertes Probenvolumen durch einen Abschnitt des Elektrolytkanals, der zwischen dem Zufuhranschluss und dem Ablaufanschluss zu liegen kommt, definiert ist, wobei die Probe eine Zusammensetzung ist, die aus Komponenten mit unterschiedlichen elektrophoretischen Mobilitäten besteht, und wobei der Elektrolytpuffer und die Probe durch das System aus Kapillarkanälen transportiert werden, wobei das Verfahren den Schritt aufweist, die Probe als Probestopfen in den Elektrolytkanal durch Anlegen eines elektrischen Felds über den Zufuhr- und Ablaufkanälen elektrokinetisch einzuspritzen, wobei das elektrische Feld für eine Zeitdauer angelegt wird, die zumindest lang genug ist, dass eine Komponente der Probe mit der niedrigsten elektrophoretischen Mobilität in das geometrisch definierte Probenvolumen migriert, und wobei die Zeitdauer zumindest der Zeit entspricht, die durch die Gleichung t_min = d/μ_i·E) definiert ist, wobei d für den Querschnitt des Elektrolytkanals zwischen den Zufuhr- und Ablaufanschlüssen steht, wobei μ_i die elektrokinetische Mobilität der Komponente mit der niedrigsten elektrophoretischen Mobilität ist und wobei E für die elektrische Feldstärke über den Zufuhr- und Ablaufkanälen steht.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Elektrolytpuffer und die Probe elektrokinetisch transportiert werden, und wobei ausserdem unmittelbar nach dem Einspritzen des Probestopfens der Elektrolytpuffer in den Zufuhrkanal hinein und in den Ablaufkanal hinein an den jeweiligen Zufuhr- und Ablaufanschlüssen für eine Zeitdauer vorrücken gelassen wird, die zumindest der Migrationszeit der langsamsten Komponente in dem Probestopfen von dem Zufuhranschluss zu einem Detektor entspricht, wodurch die Probe in die jeweiligen Zufuhr- und Ablaufkanäle hinein zurückgeschoben wird und im wesentlichen verhindert, dass die Probe unkontrolliert in den Elektrolytpufter diffundiert, der über die Zufuhr- und Ablaufanschlüsse hinaus transportiert wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei innerhalb der besagten Zeitdauer die Probe in den Zufuhr- und Ablaufkanälen einem elektrischen Potential unterworfen wird, das sich von einem elektrischen Potential an einem Vorratsbehälter für den Elektrolytpuffer unterscheidet, wodurch eine Potentialdifferenz derart erzeugt wird, dass der Elektrolytpufter in den Zufuhrkanal und in den Ablaufkanal hinein vorrücken gelassen wird.
Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Potentialdifferenz derart gewählt ist, dass eine resultierende elektrische Feldstärke zumindest 0,1 V/cm beträgt.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei der Elektrolytpuffer in die Zufuhr- und Ablaufkanäle vorrücken gelassen wird durch Verringern eines Strömungswiderstands in den Zufuhr- und Ablaufkanälen entweder durch Verringern der Längen der Zufuhr- und Ablaufkanäle oder durch Vergrössern ihrer jeweiligen Breiten.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Strömungswiderstand der Zufuhr- und Ablaufkanäle durch Bereitstellen der Zufuhr- und Ablaufkanäle jeweils mit einer Breite verringert wird, die zumindest zweimal so gross ist wie die Breite der Zufuhr- und Ablaufanschlüsse.
Verfahren nach Anspruch 6, wobei die Zufuhr- und Ablaufanschlüsse der jeweiligen Zufuhr- und Ablaufkanäle eine Längserstreckung aufweisen, die zumindest in etwa den Breiten der Zufuhr- und Ablaufanschlüsse entspricht, und wobei die Breiten entlang der Erstreckung der Zufuhr- und Ablaufanschlüsse konstant gehalten sind.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Breiten der Zufuhr- und Ablaufanschlüsse derart gewählt sind, dass sie einer Breite des Kanalelements entsprechen.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, wobei das System aus Kapillarkanälen, die die Zufuhr- und Ablaufkanäle mit ihren jeweiligen Anschlüssen umfassen, geätzt oder mikromaschinell eingebracht oder anderweitig in einem planaren Substrat ausgebildet sind, das aus Glas, Halbleitermaterialien oder einem geeigneten Polymer hergestellt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Ablaufkanal eine Längsverlängerung des Zufuhrkanals bildet und wobei die Zufuhr- und Ablaufanschlüsse einander gegenüberliegend angeordnet sind.
Verfahren nach Anspruch 1 wobei die Zufuhr- und Ablaufanschlüsse entlang dem Elektrolytkanal in Längsrichtung verlaufend voneinander beabstandet sind, und wobei der Probevolumenbereich als Bereich entlang den Elektrolytkanälen zwischen dem Zufuhr- und Ablaufanschluss definiert ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das System aus den Kapillarkanälen einen Kapillarkanal umfasst, der an einem Ende mit einem Vorratsbehälter für den Elektrolytpufter verbunden ist und der sich nach dem geometrisch definierten Probenvolumen in Längsrichtung in einem Kapillarkanal erstreckt, in dem eine elektrophoretische Trennung der Probe stattfindet.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Zufuhrkanal, der Ablaufkanal und der den Elektrolytpuffer enthaltende Kanal mit Vorratsbehältern verbunden sind.
Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Elektroden an die Vorratsbehälter angelegt sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, aufweisend die Schritte (1) Anlegen eines elektrischen Felds über dem Elektrolytkanal, (2) Ausschalten des elektrischen Felds über dem Elektrolytkanal, (3) Anlegen eines elektrischen Felds über den Zufuhr- und Ablaufkanälen, um die Probe als Probestopfen in das Probevolumen in dem Elektrolytkanal elektrokinetisch einzuspritzen, und (4) Anlegen eines elektrischen Felds über dem Elektrolytkanal, um die in dem Probevolumen enthaltende Probe durch den Elektrolytkanal zu bewegen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, aufweisend die Schritte (1) Anlegen eines elektrischen Felds über dem Elektrolytkanal, (2) Anlegen eines elektrischen Felds über den Zufuhr- und Ablaufkanälen, um die Probe als Probestopfen in das Probevolumen in dem Elektrolytkanal elektrokinetisch einzuspritzen, und (3) Aufrechterhalten eines elektrischen Felds nach dem Schritt (1) über dem Elektrolytkanal mit einem Potential derart, dass die in dem Probevolumen enthaltende Probe durch den Elektrolytkanal bewegt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, aufweisend die Schritte (1) Anlegen eines elektrischen Felds über dem Elektrolytkanal, um den Elektrolytpuffer durch den Elektrolytkanal zu bewegen, und (2) gleichzeitiges Anlegen eines elektrischen Felds über den Zufuhr- und Ablaufkanälen, um die Probe von dem Zufuhr- zu dem Ablaufkanal elektrokinetisch zu bewegen, wobei die Potentiale der elektrischen Felder im Schritt (1) und im Schritt (2) unterschiedlich sind.
Probenentnahmevorrichtung, aufweisend einen Elektrolytkanal (12; 22) für einen Elektrolytpuffer, einen Zufuhrkanal (13; 23) und einen Ablaufkanal (14; 24) für eine Probe, wobei die Zufuhr- und Ablaufkanäle gegenüber dem Elektrolytkanal jeweils geneigt verlaufen, und wobei die Zufuhr- und Ablaufkanäle den Elektrolytkanal an einem Zufuhranschluss (15; 25) und einem Ablaufanschluss (16; 26) jeweils schneiden, so dass ein geometrisch definiertes Probevolumen (17; 27) durch einen Abschnitt des Elektrolytkanals definiert ist, der zwischen dem Zufuhr- und dem Ablaufanschluss zu liegen kommt, wobei die Probenentnahmevorrichtung außerdem eine Einrichtung zum elektrokinetischen Einspritzen einer Probe in das geometrisch definierte Probevolumen aufweist, und worin der Zufuhrkanal (13; 23) und der Ablaufkanal (14; 24) jeweils einen Strömungswiderstand relativ zu dem Elektrolytpuffer aufweisen, der in etwa 5% geringer ist als der entsprechende Strömungswiderstand des Elektrolytkanals (12; 22), dadurch gekennzeichnet, dass der Zufuhrkanal (13; 23) und der Ablaufkanal (14; 24) jeweils eine Breite (w) aufweisen, die zumindest doppelt so gross ist wie eine Breite (p) des Zufuhranschlusses (15; 25) und des Ablaufanschlusses (16; 26), und die Breite (p) des Zufuhranschlusses (15; 25) und des Ablaufanschlusses (16; 26) einer Breite (b) des Kanalelements (12; 22) entspricht.
Probenentnahmevorrichtung nach Anspruch 18, wobei der Zufuhranschluss (15; 25) und der Ablaufanschluss (16; 26) des jeweiligen Zufuhrkanals (13, 23) und des jeweiligen Ablaufkanals (14; 24) eine Längserstreckung (1) aufweisen, die zumindest der Breite (p) der Zufuhr- und Ablaufanschlüsse entspricht, und wobei die Breite (p) entlang der Erstreckung (1) der Zufuhr- und Ablaufanschlüsse konstant ist.
Probenentnahmevorrichtung nach Anspruch 19, wobei die Kanäle eine Tiefe von 0,1 μm bis 100 μm aufweisen.
Probenentnahmevorrichtung nach Anspruch 18, wobei der Ablaufkanal (14; 24) eine Längsverlängerung des Zufuhrkanals (13; 23) ist und wobei der Zufuhranschluss (15; 25) und der Ablaufanschluss (16; 26) einander gegenüberliegen.
Probenentnahmevorrichtung nach Anspruch 18, wobei der Zufuhranschluss (15; 25) und der Ablaufanschluss (16; 26) voneinander entlang dem Elektrolytkanal in Längsrichtung beabstandet sind, und wobei der Probevolumenbereich als Bereich entlang den Elektrolytkanälen zwischen dem Zufuhranschluss (15; 25) und dem Ablaufanschluss (16; 26) definiert ist.
Probenentnahmevorrichtung nach Anspruch 22, wobei der Zufuhranschluss (15; 25) und der Ablaufanschluss (16; 26) voneinander um eine Distanz (d) beabstandet sind, die von 0 μm bis 3 cm, bevorzugt 3 mm beträgt.
Probenentnahmevorrichtung nach einem der Ansprüche 18 bis 23, wobei der Zufuhrkanal (13; 23) und der Ablaufkanal (14; 24) jeweils relativ zur Längserstreckung des Kanalstücks um einen Winkel geneigt verlaufen, der von 5 bis 175, bevorzugt 90 Grad beträgt, und wobei der Zufuhrkanal (13; 23) und der Ablaufkanal (14; 24) parallel zueinander verlaufen.
Probenentnahmevorrichtung nach Anspruch 18, aufweisend ein System aus Kapillarkanälen mit einem Elektrolytkanal (12; 22) für einen Elektrolytpuffer, einem Zufuhrkanal (13; 23) und einem Ablaufkanal (14; 24), und wobei der Elektrolytkanal an einem Ende mit einem Vorratsbehälter für den Elektrolytpuffer verbunden ist und sich hinter dem geometrisch definierten Probenvolumen in Längsrichtung des Kapillarkanals erstreckt.
Probenentnahmevorrichtung nach Anspruch 25, wobei der Zufuhrkanal (13; 23) und der Ablaufkanal (14; 24) mit Vorratsbehältern verbunden sind.
Probenentnahmevorrichtung nach Anspruch 26, wobei Elektroden an den Vorratsbehältern angelegt sind.
Verwendung der Probenentnahmevorrichtung nach Anspruch 18 zur elektrokinetischen Probeneinführung und kapillarelektrophoretischen Trennung.