DE69432586T2

DE69432586T2 - Methode zum generieren von einzelsträngigen dna molekülen

Info

Publication number: DE69432586T2
Application number: DE69432586T
Authority: DE
Inventors: Theo Nikiforov; R. Michael KNAPP
Original assignee: Beckman Coulter Inc
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1993-01-15
Filing date: 1994-01-18
Publication date: 2004-03-25
Anticipated expiration: 2014-01-19
Also published as: US5518900A; EP0679190A1; JP2002209594A; JP3421664B2; JPH08505535A; WO1994016090A1; EP0679190A4; CA2153898A1; EP0679190B1; CA2153898C; JP3330946B2; AU6126294A; AU674211B2; ATE239090T1; DE69432586D1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung einzelsträngiger DNA-Moleküle. Insbesondere betrifft die Erfindung die Verwendung modifizierter Nucleotide und einer 5' → 3'-Exonuclease zur Erzeugung einzelsträngiger Nucleinsäuremoleküle nach der Primervermittelten Verlängerung.
Die Analyse der Struktur, der Organisation und der Sequenz von Nucleinsäuremolekülen ist für die Vorhersage, Diagnose und Behandlung von Erkrankungen des Menschen und von Tieren, in der Gerichtsmedizin, in der Epidemiologie und dem Gesundheitswesen, sowie bei der Ermittlung der Faktoren, welche die Genexpression und -entwicklung steuern, von großer Wichtigkeit.
Drei besonders wichtige Bereiche umfassen die Entwicklung von Nucleinsäuremolekülen, die an eine gewünschte Sequenz hybridisieren können, die Erzeugung von einzelsträngigen Nucleinsäuremolekülen und die Bestimmung der Nucleotidsequenz eines Nucleinsäuremoleküls.
I. Nucleinsäurehybridisierung
Die Fähigkeit eines Nucleinsäure-"Sonden"-Moleküls an ein komplementäres „Ziel"-Nucleinsäuremolekül zu hybridisieren (d. h. eine Basenpaarung einzugehen) bildet den Grundstein für einen weiten Bereich diagnostischer und therapeutischer Verfahren.
Die Hybridisierung wird verwendet, um ursächliche Mittel infektiöser Erkrankungen nachzuweisen und zu identifizieren, um Informationen über Vaterschaft und Abstammung bereitzustellen, um die Wahrscheinlichkeit vorherzusagen, mit der eine Person an einer genetischen Erkrankung leiden wird, oder um Gewebeproben zu identifizieren. Der diagnostische Wert solcher Verfahren hängt von ihrer Empfindlichkeit ab. Die Empfindlichkeit kann durch die Verwendung von Sonden erhöht werden, die nachweisbar markiert sind. Die gebräuchlichsten Marken umfassen die Verwendung von radioaktiven Isotopenmarkern (Falkow et al. (US-PS 4,358,535); Berninger ( US-PS 4,446,237 )). Verfahren zur Markierung und Durchführung solcher Hybridisierungsreaktionen sind z. B. in J. Sambrook et al. (in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)) und B. D. Haymes et al. (in: Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)) beschrieben.
Die Empfindlichkeit von Nucleinsäurehybridisierungs-Nachweistests kann auch durch Ändern der Art erhöht werden, auf die der Nachweis dem Betrachter mitgeteilt oder signalisiert wird. Folglich kann die Testempfindlichkeit z. B. durch die Verwendung nachweisbar markierter Reagenzien erhöht werden. Eine große Zahl verschiedener solcher Marken ist für diesen Zweck verwendet worden. Kourilsky et al. ( US-PS 4,581,333 ) beschreiben die Verwendung von Enzymmarkern zur Erhöhung der Empfindlichkeit in einem Nachweistest. Auch Fluoreszenzmarker (Albarella et al., EP 144914 ), chemische Marken (Sheldon III et al., US-PS 4,582,789 ; Albarella et al., US-PS 4,563,417 ), modifizierte Basen (Miyoshi et al., EP 119448 ), usw., wurden in einem Versuch zur Verbesserung der Effizienz verwendet, mit der die Hybridisierung beobachtet werden kann.
Hybridisierungstests, bei denen synthetisch oder enzymatisch hergestellte einzelsträngige Nucleinsäuresonden verwendet werden, können in Lösung (A. J. Berk et al., Cell 12, 721–732 (1977); L. E. Hood et al., in: Molecular Biology of Eukaryotic Cells: A Problems Approach, Menlow Park, CA, Benjamin-Cummings (1975); J. G. Wetmer, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 5, 337–361 (1976); K. Itakura et al., Ann. Rev. Biochem. 53, 323–356 (1984)) oder in Verbindung mit einer Gelelektrophorese oder Nucleinsäure-bindenden Membran-Blottingverfahren durchgeführt werden. Solche Verfahren ermöglichen auch den Nachweis von Nucleinsäuremolekülen mit Sequenzen, die zu der gesamten Sonde oder einem Teil der Sonde komplementär sind (J. C. Alwine et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A) 74, 5350–5354 (1977); E. M. Southern, J. Molec. Biol. 98, 503–517 (1975); A. J. Berk et al., Cell 12, 721–732 (1977); K. Itakura et al., Ann. Rev. Biochem. 53, 323–356 (1984); F. H. Ruddle, Nature 294, 115–119 (1981); R. White et al., Sci. Amer. 258, 40–48 (1988); W. McGinnis et al., Cell 37, 403–408 (1984)). Einzelsträngige Nucleinsäuresonden können auch in situ zur Lokalisation spezifischer Nucleinsäuresequenzen in einem Verfahren verwendet werden, das als "in-situ-Hybridisierung" bezeichnet wird (J. Abelson et al., Science 209, 1317–1438 (1980); W. Gilbert et al, Sci. Amer. 242, 74–94 (1980)).
Hybridisierungstests können auch unter Verwendung von Affinitätschromatographie-Verfahren durchgeführt werden. Bei diesem Verfahren wird ein einzelsträngiges Nucleinsäuremolekül, gewöhnlich ein Oligonucleotid, an einer Trägermatrix immobilisiert und als Sonde zur Hybridisierung eines zweiten komplementären einzelsträngigen Nucleinsäuremoleküls verwendet. Der effiziente Nachweis oder die effiziente Gewinnung eines einzelnen gewünschten Nucleinsäuremoleküls wird verbessert, wenn die beiden komplementären einzelsträngigen Sequenzen in nicht-beschränkenden Konzentrationen und jeweils in einer im Wesentlichen reinen Form vorliegen. Beispielsweise wurden einzelsträngige Oligonucleotide mit hoher Reinheit aus einer Lösung durch Affinitätschromatographie unter Verwendung im mobilisierter (d. h. an eine Trägermatrix gebundener) Oligonucleotide, die zu den Oligomeren in Lösung komplementär sind, isoliert, wie es z. B. in Gilham et al. (J. Amer. Chem. Soc. 86, 4982 (1964)) und Kremsky et al. (Nucl. Acids Res. 15, 3131–3139 (1987)) beschrieben ist.
Die Fähigkeit von DNA-Molekülen, an komplementäre mRNA-Moleküle zu hybridisieren und dadurch die Translation spezifischer Proteine zu vermindern, bildet eine Basis zur therapeutischen Anwendung der Hybridisierungstechnologie. Eine solche "Antisense"-Technologie weist bei der Anti-Virus-Therapie und der Anti-Krebs-Therapie ein signifikantes Potenzial auf. Die Antisense-Technologie ist in den Europäischen Patentanmeldungen mit den Veröffentlichungsnummern 263 740; 335 451 und 329 882 und in der PCT-Veröffentlichung mit der Nummer WO 90/00624 beschrieben, die alle unter Bezugnahme in diese Beschreibung einbezogen werden.
Die Hybridisierungstechnologie wird auch zur Unterstützung bei der RNA-Gewinnung genutzt. Im Fall eukaryotischer mRNA wurde dies unter Verwendung von Affinitätsmatrixchromatographiesäulen erreicht, die Polydesoxythymidin-Oligonucleotide aufweisen, die an eine Trägermatrix gebunden sind, die aus Cellulose aufgebaut ist (d. h. Oligo (dT)-Cellulosesäulen). Solche Oligonucleotide können an die Polyadenin mRNA"Schwänze" hybridisieren, die normalerweise an dem 3'-Ende aller eukaryotischen mRNA-Moleküle gefunden werden (P. T. Gilham, J. Amer. Chem. Soc. 86, 4982 (1971)). Solche Verfahren zur Isolierung einzelsträngiger Nucleinsäuremoleküle erfordern große Mengen an Ausgangsmaterial.
II. Die Amplifikation von Nucleinsäuremolekülen
Die Fähigkeit zum Nachweis der Gegenwart eines gewünschten Ziel-Nucleinsäuremoleküls in einer Probe ist häufig durch die Konzentration des Moleküls entweder in seiner doppelsträngigen Form oder seiner einzelsträngigen Form begrenzt. In vielen dieser Situationen kann die Konzentration des Ziels durch die Verwendung von Amplifikationssystemen entweder auf in-vivo- oder auf in-vitro-Basis amplifiziert werden.
Amplifikationssysteme auf in-vivo-Basis umfassen die Amplifikation eines Ziel-Nucleotidmoleküls durch dessen Vermehrung (d. h. Replikation und Amplifikation) in Klonierungs- oder Expressionsvektoren. Klonierungs- und Expressionsvektoren sind z. B. in J. Sambrook et al. (in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989)) beschrieben.
Gewöhnlich eingesetzte Amplifikationssysteme auf in-vitro-Basis umfassen enzymatische Verfahren unter Verwendung von DNA-abhängigen oder RNA-abhängigen DNA- oder RNA-Polymerasen. Das am häufigsten verwendete Verfahren der Nucleinsäureamplifikation, die "Polymerase-Kettenreaktion" ("PCR") umfasst die Templat-abhängige Verlängerung unter Verwendung thermisch stabiler DNA-Polymerase (K. Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 263–273 (1986); H. Erlich et al. EP 50 424 ; EP 84 796 ; EP 258 017 ; EP 237 362 ; K. Mullis, EP 201 184 ; K. Mullis et al., US-PS 4,683,202 ; H. Erlich, US-PS 4,582,788 und R. Saiki et al. US-PS 4,683,194 , wobei diese Dokumente in diese Beschreibung unter Bezugnahme einbezogen sind). Die PCR erreicht die Amplifikation einer spezifischen Nucleinsäuresequenz unter Verwendung von zwei Oligonucleotidprimern, die zu Regionen der zu amplifizierenden Sequenz komplementär sind. Verlängerungsprodukte, welche die Primer umfassen, werden dann zu Templaten für anschließende Replikationsschritte. Eine Übersicht über die Polymerase-Kettenreaktion findet sich bei K. B. Mullis (Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51, 263–273 (1986)); R. K. Saiki et al. (Bio/Technology 3, 1008–1012 (1985)); und K. B. Mullis et al. (Meth. Enzymol. 155, 335–350 (1987)).
Andere Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren umfassen Amplifikationssysteme auf Transkriptionsbasis (D. Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86, 1173 (1989); T. R. Gingeras et al., PCT-Anmeldung WO 88/10315 (Priorität: US-Patentanmeldungen mit den Seriennummern 064,141 und 202,978); H. I. Miller et al., PCT-Anmeldung WO 89/06700 (Priorität: US-Patentanmeldung mit der Seriennummer 146,462); C. Davey et al. (Europäische Patentanmeldung mit der Veröffentlichungsnummer 329 822)) und Amplifikationssysteme auf Ligationsbasis (D. Y. Wu et al., Genomics 4, 560 (1989)).
Obwohl Amplifikationstechnologien zum Erreichen einer schnellen und extensiven Amplifikation eines Polynucleotidmoleküls verwendet werden können, führen solche Verfahren im Allgemeinen zur Erzeugung doppelsträngiger DNA. Folglich können die Verfahren im Allgemeinen kein selektives Mittel zur Amplifikation und Isolierung eines Einzelstrangs eines doppelsträngigen Zielmoleküls bereitstellen.
Einzelsträngige DNA-Moleküle können unter Verwendung des Bakteriophagen M13, der einzelsträngige DNA aufweist, erzeugt werden (J. Messing et al., Meth. Enzymol. 101, 20 (1983); vgl. auch J. Sambrook et al. (in: Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1989). Die Verwendung von M13 zur Erzeugung einzelsträngiger DNA erfordert jedoch ein Klonen und andere zeitaufwändige Vorgänge und folglich wird M13 in erster Linie zur DNA-Sequenzierung eingesetzt. Im Allgemeinen umfasst das Verfahren das Klonen eines Ziel-DNA-Moleküls in die einzelsträngige DNA-Kette von M13. Sobald der rekombinante M13-Vektor in ein Wirtsbakterium eingeschleust worden ist, bestimmt der rekombinante M13-Vektor die Bildung und Extrusion von Bakteriophagenteilchen, die einzelsträngige DNA enthalten.
Bei der Verwendung von M13 zur Erzeugung einzelsträngiger DNA-Moleküle gibt es mehrere wichtige Nachteile. Erstens erfordert das Verfahren das Klonen der Ziel-DNA und letztendlich die Isolierung und Reinigung der reifen Bakteriophagenteilchen. Somit ist das Verfahren ziemlich zeitaufwändig. Insbesondere wird die isolierte Ziel-DNA zwangsläufig mit den viralen DNA-Sequenzen von M13 verbunden. Ein weiterer Nachteil des M13-Systems liegt in der Instabilität von DNA-Zielmolekülen, die größer als 1000 Nucleotide sind, was häufig zu einem Verlust des gewünschten rekombinanten M13-Phagen führt. Aus den vorstehend genannten Gründen wird M13 für die meisten Anwendungen, die von DNA-Sequenzieren verschieden sind, nicht zur Erzeugung einzelsträngiger DNA verwendet.
Gegenwärtig werden verschiedene Verfahren zur Erzeugung einzelsträngiger DNA-Moleküle verwendet. U. Gyllensten et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85, 7652–7656 (1988) und M. Mihovilovic et al. (BioTechniques 7, 14 (1989)) beschreiben ein Verfahren, das die Modifizierung des Standard-"PCR"-Verfahrens umfasst, das normalerweise zur Amplifikation doppelsträngiger DNA-Moleküle verwendet wird. Bei diesem modifizierten PCR-Verfahren, das als asymmetrische PCR bezeichnet wird, werden Amplifikationsprimer verwendet, die in unterschiedlichen molaren Konzentrationen vorliegen. Wenn in der "asymmetrischen PCR"-Technik asymmetrische Primerkonzentrationen verwendet werden, dann ist der Primer in der limitierenden Konzentration nach den ersten 10 bis 15 Amplifikationszyklen verbraucht. Eine fortgesetzte Durchführung der Zyklen erzeugt einzelsträngige DNA, die von dem nichtlimitierenden Primer stammt.
Es gibt leider einige Nachteile bei der Verwendung der "asymmetrischen PCR" zur Erzeugung einzelsträngiger DNA. Die Amplifikation einzelsträngiger DNA findet im Gegensatz zur exponentiellen DNA-Amplifikation unter Verwendung des Standard-PCR-Verfahrens lediglich linear mit der Zykluszahl statt. Darüber hinaus ist es zur Optimierung der Ausbeute an einzelsträngigem Produkt häufig erforderlich, mehrere getrennte Amplifikationsreaktionen durchzuführen, die variierende Konzentrationen und Verhältnisse der Start-Oligonucleotide enthalten. Die Vorteile der Erzeugung einzelsträngiger DNA in Kombination mit einer exponentiell produzierenden Amplifikationsreaktion, wie z. B. die nicht-asymmetrische Standard-PCR sind damit offensichtlich.
R. G. Higuchi et al. (Nucl. Acids Res. 17, 5865 (1985)) gibt ein Beispiel für ein weiteres Verfahren, das gegenwärtig zur Erzeugung einzelsträngigen Amplifikationsprodukte verwendet wird. Das Verfahren umfasst die Phosphorylierung des 5'-Endes eines Strangs eines doppelsträngigen Amplifikationsprodukts und anschließend das bevorzugte Abbauenlassen des phosphorylierten Strangs durch eine 5' → 3'-Exonuclease (wie z. B. eine λ-Exonuclease). Das Verfahren weist somit mehrere Nachteile auf. Die Effizienz des Verfahrens hängt sowohl vom Ausmaß als auch der Spezifität der Phosphorylierungsreaktion sowie dem Grad der Bevorzugung der Exonuclease ab.
5' → 3'-Exonucleasen wurden zur Herstellung einzelsträngigen DNA-Fragmente aus doppelsträngigen DNA-Molekülen mit voller Länge verwendet. Wenn ein solches Molekül mit voller Länge in Gegenwart einer 5' → 3'-Exonuclease inkubiert wird, findet der Abbau vom 5'-Ende jedes Strangs statt. Der Abbau des ersten Strangs setzt sich fort, bis die Exonuclease, die auf diesen Strang einwirkt, die Region erreicht, in welcher der zweite Strang durch die Exonuclease, die auf diesen Strang einwirkt, abgebaut worden ist. Folglich erzeugt das Verfahren zwei nicht-komplementäre Moleküle mit "halber Länge" aus einem doppelsträngigen DNA-Molekül mit voller Länge.
Zusätzlich haben andere Verfahren die Nuclease-beständigen Eigenschaften der Phosphorothioatderivate zur Erzeugung einzelsträngigen DNA-Moleküle genutzt. Benkovic et al. (US-PS 4,521,509; 4. Juni 1985) haben die Restriktionsendonuclease- und 3' → 5'-Exonuclease-Beständigkeitseigenschaften Phosphorothioat-enthaltender Nucleinsäuresequenzen zur Erzeugung einzelsträngigen DNA-Moleküle verwendet. Bei diesem Verfahren wird eine Restriktionsendonuclease zur Bildung eines doppelsträngigen Moleküls mit einem einzelnen zurückgesetzten 3'-Hydroxylende verwendet. Zur Modifizierung dieses Endes werden Phosphorothioatnucleotide verwendet, wodurch ein Strang erzeugt wird, der gegenüber einem Exonuclease-Angriff beständig ist, was die Erzeugung eines einzelsträngigen Produkts erlaubt. Dieses Verfahren ist beschränkt, da die Ziel-DNA-Sequenz zwei gewünschte Restriktionsendonuclease-Stellen enthalten muss: Die erste Stelle muss ein zurückgesetztes 3'-OH-Ende erzeugen und an einem Ende des Zielmoleküls liegen, und die zweite Stelle muss ein zurückgesetztes 5'-Ende erzeugen und am zweiten Ende liegen. Eine weitere Beschränkung dieses Verfahrens liegt darin, dass die Erzeugung eines gewünschten einzelsträngigen DNA-Produkts eine hohe Konzentration doppelsträngigen Ziel-DNA-Moleküle erfordert.
J. R. Sayers et al. (Nucl. Acids Res. 16, 791–802 (1988)) geben ein Beispiel für ein Verfahren, bei dem die Restriktionsendonuclease-Beständigkeitseigenschaften von Phosphorothioatenthaltender DNA zur Erzeugung einzelsträngigen DNA verwendet werden. In dem Verfahren wird ein Primer an ein ringförmiges Zielmolekül hybridisieren gelassen. Die Primerverlängerung findet dann in Gegenwart von Phosphorothioatnucleotiden statt, und zwar derart, dass die Nucleotidderivate in das Verlängerungsprodukt eingebaut werden. Die Enden des Verlängerungsprodukts werden dann zur Bildung eines doppelsträngigen ringförmigen Moleküls ligiert. Die Gegenwart der Phosphorothioatreste in dem ringförmig gemachten Verlängerungsprodukt macht diesen Strang gegenüber Restriktionsendonucleasen beständig. Folglich wird der Zielstrang bei der Inkubation mit solchen Endonucleasen gespalten. Eine solche Spaltung erzeugt Enden, die dann durch Exonucleasen angegriffen werden können. Es ist signifikant, dass die Exonucleasebeständigkeit des Phosphorothioat-enthaltenden Strangs nicht bewertet werden kann, da dieser Strang, der ringförmig ist, kein Substrat für eine Exonuclease ist.
Es wurde gefunden, dass Phosphorothioat-enthaltende Oligonucleotide Oligonucleotidprimer vor einem Abbau durch die 5' → 3'-"Fehlpaarungs"-Exonucleaseaktivität von Polymerase 1 bewahren können (J. Ott et al., Biochem. 26, 8237–8241 (1987)). Das Verfahren von Ott et al. kann keine einzelsträngige DNA erzeugen, da in dem Verfahren eine Polymerase eingesetzt wird.
Obwohl dieses Verfahren für eine ortsspezifische Mutagenese geeignet ist, ist es aufgrund der Abhängigkeit von einer Verwendung des mühsamen und begrenzten M13-Bakteriophagensystems, das vorstehend beschrieben worden ist, begrenzt. Darüber hinaus erfordert das Verfahren von Sayers et al. die Gegenwart einer Restriktionsendonuclease-Spaltstelle in dem Zielmolekül.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Fähigkeit zur Manipulation und Nutzung von Nucleinsäuremolekülen häufig die Isolierung einer einzelsträngigen Molekülspezies erfordert. Gegenwärtige Verfahren der Nucleinsäureamplifikation führen typischerweise zur Bildung doppelsträngiger Spezies und erfordern folglich zusätzliche Verarbeitungsschritte, um gereinigte Zubereitungen einzelsträngiger Moleküle zu erhalten.
III. Die Sequenzierung von Nucleinsäuremolekülen
Anfängliche Versuche, die Sequenz eines DNA-Moleküls zu bestimmen, umfassten die Erweiterung von Techniken, die entwickelt wurden, um die Sequenzierung von RNA-Molekülen zu ermöglichen (F. Sauger, J. Molec. Biol. 13, 373 (1965), G. G. Brownlee et al., J. Molec. Biol. 34, 379 (1968)). Solche frühen Verfahren umfassten die spezifische Spaltung von DNA in kleinere Fragmente durch (1) enzymatischen Abbau (H. D. Robertson et al., Nature New Biol. 241, 38 (1973); E. B. Ziff et al., Nature New Biol. 241, 34 (1973)); (2) die Analyse der nächsten Nachbarn (R. Wu et al., J. Molec. Biol. 57, 491 (1971)) und (3) das Verfahren des "wandering spot" (F. Sangen, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 70, 1209 (1973)).
Neuere Fortschritte haben zur Entwicklung von zwei intensiv verwendeten Verfahren zur Ermittlung der Sequenz eines DNA-Moleküls geführt: Das "Didesoxy-Kettenabbruchverfahren", das auch als "Sanger-Verfahren" bekannt ist (F. Sangen et al., J. Molec. Biol. 94, 441 (1975)) und das "Chemische Abbauverfahren nach Maxam-Gilbert" (A. M. Maxam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 74, 560 (1977), wobei beide Dokumente unter Bezugnahme in diese Beschreibung einbezogen werden). Verfahren zur Sequenzierung von DNA unter Verwendung entweder des Didesoxy-vermittelten Verfahrens oder des Verfahrens nach Maxam-Gilbert sind dem Fachmann bekannt. Solche Verfahren sind z. B. in T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) und in J. W. Zyskind et al., Recombinant DNA Laboratory Manual, Academic Press, Inc., New York (1988) beschrieben.
Bei dem Didesoxy-vermittelten Verfahren wird die Sequenz eines Zielmoleküls unter Verwendung vier getrennter Primer-Verlängerungsreaktionen bestimmt, wobei jede der Verlängerungsreaktionen unter Verwendung einer Polymerase, eines Oligonucleotid-Primers und der vier Nucleotidtriphosphate durchgeführt wird, die zur Polymerisation von DNA benötigt werden. Jede der Reaktionen wird in der Gegenwart eines 2',3'-Didesoxyderivats eines A-, T-, C- oder G-Nucleosidtriphosphats durchgeführt. Solche Derivate unterscheiden sich von herkömmlichen Nucleotidtriphosphaten darin, dass ihnen ein Hydroxylrest an der 3'-Position von Desoxyribose fehlt. Obwohl sie in die neu synthetisierte Primer-Verlängerung eingebaut werden können, führt ein solcher Einbau folglich zum Abbruch der Verlängerungsreaktion. Das Gesamtergebnis jeder der vier Reaktionen ist die Erzeugung eines Satzes von ineinandergeschachtelten Oligonucleotiden, von denen jedes durch das spezielle, in der Reaktion verwendete Didesoxyderivat endet. Solche Reaktionsprodukte können einfach analysiert werden, wobei die Sequenz des Zielmoleküls erhalten wird.
Das Maxam-Gilbert-Verfahren zur DNA-Sequenzierung ist ein Abbauverfahren. Bei diesem Verfahren wird ein DNA-Fragment an einem Ende markiert und in vier getrennten chemischen Reaktionen teilweise gespalten, wobei jede chemische Reaktion für die Spaltung des DNA-Moleküls an einer bestimmten Base (G oder C) an einem bestimmten Basentyp (A/G, C/T oder A > C) spezifisch ist. Wie bei dem vorstehend beschriebenen Didesoxyverfahren besteht die Wirkung solcher Reaktionen darin, einen Satz von ineinandergeschachtelten Molekülen zu erzeugen, deren Länge durch die Stellen einer bestimmten Base entlang der Län ge des sequenzierten DNA-Moleküls bestimmt wird. Die ineinandergeschachtelten Reaktionsprodukte können analysiert werden, wobei die Sequenz des Zielmoleküls erhalten wird.
Im Allgemeinen müssen mehrere Sätze ineinandergeschachtelten Oligonucleotide bewertet werden, um die Sequenz des Zielmoleküls zu bestimmen. Verschiedene Modifizierungen, wie z. B. die Verwendung von mehreren, unterscheidbaren Markern hat zur Entwicklung von "Multiplex"-Verfahren geführt, die mehr Sequenzdaten liefern können (G. M. Church et al., Science 240, 185–188 (1988); G. M. Church et al., US-PS 4,942,124 ; Tabor et al., US-PS 4,962,020 ; J. M. Proben et al., Science 238, 336–340 (1987)).
Andere "Multiplex"-Sequenzierverfahren, wie z. B. das von S. C. Macevicz ( US-PS 5,002,867 ) beschriebene Verfahren, betreffen Verfahren zur Bestimmung der Nucleotidsequenz eines DNA- oder RNA-Moleküls unter Verwendung mehrerer gemischter Oligonucleotidsonden. Die Sequenzinformation wird durch Ausführen einer Reihe von Hybridisierungen erhalten, deren Ergebnisse für jede Sonde einen Wert liefert, wieviel Mal das Komplement der Sondensequenz in der RNA oder DNA vorliegt, deren Sequenz bestimmt werden soll. Die Nucleotidsequenz der RNA oder DNA wird aus dieser Information und aus den bekannten Sequenzen der Sonden rekonstruiert. Die Nucleinsäure, deren Sequenzbestimmt werden soll, wird hier als Zielsequenz bezeichnet.
Die doppelsträngige Struktur von DNA kompliziert das Verfahren der Sequenzanalyse. Da die beiden Stränge der DNA symmetrisch und chemisch identisch sind, wird eine Sequenzanalyse, die unter Verwendung beider Stränge eines DNA-Moleküls durchgeführt wird, zwei nicht unterscheidbare Sätze von Sequenzdaten liefern. Deshalb ist es ganz besonders erwünscht, die Sequenzanalyse unter Verwendung von DNA-Zubereitungen durchzuführen, die nur einen der beiden Stränge enthalten. Leider ist es aufgrund der mangelnden chemischen Unterscheidbarkeit der DNA-Stränge im Allgemeinen ziemlich schwierig, DNA-Zubereitungen zu erhalten, die nur einen Strang enthalten. Das Didesoxy-Sequenzierverfahren versucht dieses Problem zu vermeiden, und zwar durch die Verwendung entweder einer DNA-Quelle, die einzelsträngig ist (wie z. B. den Bakteriophagen M13 oder eines Phagemidvektors (J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989) oder eines Primers, der nur an einen Strang eines Zielmoleküls binden kann. Es sollte beachtet werden, dass es keine a-priori-Sicherheit gibt, dass ein bestimmter Primer nicht an beide DNA-Stränge hybridisieren wird, da die Sequenz des Zielmoleküls unbekannt ist. Im Fall des Maxam-Gilbert-Verfahrens ist es im Allgemeinen erforderlich, beide Stränge des Zielmoleküls zu markieren und anschließend den Macker von einem der Stränge selektiv zu entfernen. Diese Vorgänge komplizieren die Bestimmungen der Nucleinsäuresequenz.
Im Hinblick auf die Mängel der vorstehend beschriebenen Verfahren zur Herstellung einzelsträngiger DNA und im Hinblick auf die Wichtigkeit solcher Verfahren für eine Vielzahl molekularbiologischer und medizinischer Verfahren besteht ein starker Bedarf für ein Verfahren, das vorwiegend einen Einzelstrang eines gewünschten Zielmoleküls erzeugen kann und das in Verbindung mit Nucleinsäure-Amplifikationsverfahren verwendet werden kann. Die vorliegende Erfindung stellt ein solches Verfahren bereit.
Darüber hinaus beschreibt ein Übersichtsartikel von Goodchild in Bioconjugate Chemistry, Mai/Juni 1990, Band 1, Nr. 3, Anmerkungen auf Seite 176, dass Blöcke angrenzender Phosphorothioate eine Beständigkeit gegenüber Exonucleasen verleihen, während die gewünschten Eigenschaften des unmodifizierten Grundgerüsts erhalten bleiben. Goodchild verweist diesbezüglich auf Stein et al. (Nucleic Acids Research 16, 3209–3221).
Auch die WO 89/11548 stellt ein Nucleinsäure-Hybridisierungstestreagenz bereit, das an eine Nucleinsäure binden kann, die eine ausgewählte Zielsequenz aufweist, und das eine Trägermatrix umfasst, die Oligonucleotidsonden aufweist, die an die Trägermatrix kovalent über einen Spacerarm gebunden sind. Thio-substituierte Nucleotide, wie z. B. Phosphorothioate, können zur Herstellung von Oligonucleotiden verwendet werden, die gegenüber DNAse beständig sind. Diesbezüglich werden Sitzen und Eckstein, 1998, Nucleic Acids Research 16, 11, 691 zitiert.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Erzeugung einzelsträngiger DNA-Moleküle nach einer Primer-vermittelten Verlängerungs- oder Amplifikationsreaktion bereit. Solche Moleküle sind als Hybridisierungssonden und beim Nucleinsäure-Sequenzieren geeignet.
Insbesondere stellt die Erfindung bereit:
Ein Verfahren zum Erzeugen eines gewünschten einzelsträngigen Nucleinsäuremoleküls, das im Wesentlichen frei von einem Nucleinsäuremolekül mit komplementärer Sequenz ist, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Inkubieren eines vorausgewählten Ziel-Nucleinsäuremoleküls in Gegenwart eines Primermoleküls, das an das Zielmolekül hybridisieren kann und das eine Region mit mindestens vier benachbarten Phosphorothioatnucleotidresten an einer Position enthält, die das 5'-Ende des gewünschten einzelsträngigen Nucleinsäuremoleküls definiert;
(b) Zulassen einer Templat-abhängigen Verlängerung des Primers zur Bildung des gewünschten Nucleinsäuremoleküls; und
(c) Inkubieren des Zielmoleküls und des gewünschten Nucleinsäuremoleküls mit einer 5' → 3'-Exonuclease zur Erzeugung des gewünschten einzelsträngigen Moleküls, das im Wesentlichen frei von einem Nucleinsäuremolekül mit komplementärer Sequenz ist.

Vorzugsweise befinden sich die Phosphorothioatreste am 5'-Ende des Primers.
Vorzugsweise wird die 5' → 3'-Exonuclease dem Inkubationsgemisch von Schritt (b) zugesetzt.
Die Erfindung umfasst darüber hinaus eine Ausführungsform des vorstehenden Verfahrens, bei dem in Schritt (b), jedoch nach der Bildung des gewünschten Nucleinsäuremoleküls, das Molekül in Gegenwart eines zweiten Primermoleküls inkubiert wird, das daran hybridisieren und in einer Templat-abhängigen Weise verlängert werden kann, zur Bildung eines Nucleinsäuremoleküls, das eine Sequenz aufweist, die im Wesentlichen komplementär zur Sequenz des gewünschten Moleküls ist.
Die Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung bereit, die ein Ziel-Nucleinsäuremolekül umfasst, das an ein Primermolekül hybridisiert ist, das eine Länge von 10 bis 30 Nucleotiden aufweist und das eine Region von mindestens vier benachbarten Phosphorothioat-Nucleotidresten am 5'-Ende aufweist, wobei das Primermolekül an einen Träger gebunden ist.
Die Erfindung umfasst auch:
Ein Verfahren zum Nachweisen eines gewünschten Exonuclease-beständigen Amplifikationsprodukts einer Polymerase-Kettenreaktion, wobei das Verfahren umfasst:

(a) Durchführen einer Polymerase-Kettenreaktion mit zwei Primermolekülen, von denen eines eine Region mit mindestens vier benachbarten Phosphorothioatnucleotidresten am 5'-Ende des Primers enthält, wobei die Reaktion zur Bildung doppelsträngiger Amplifikationsprodukte ausreichend ist;
(b) anschließend Behandeln der Amplifikationsprodukte mit einer 5'→ 3'-Exonuclease unter Bedingungen, die zum Abbau von Oligonucleotiden führen, denen eine ausreichende Anzahl von Phosphorothioatbindungen fehlt, um die Oligonucleotide gegenüber der Exonuclease beständig zu machen; und
(c) Nachweisen des gewünschten Amplifikationsprodukts der Polymerase-Kettenreaktion durch Hybridisierenlassen des Produkts an ein komplementäres Oligonucleotid, das an einen Träger gebunden ist.

Die Erfindung umfasst auch:
Ein Verfahren zur Minimierung der gegenseitigen Verunreinigung zwischen Polymerase-Kettenreaktionen, wobei das Verfahren umfasst:
Durchführen einer Polymerase-Kettenreaktion, bei der mindestens eines der Primermoleküle der Reaktion mindestens vier benachbarte Phosphorothioatnucleotidderivate am 3'-Ende des Primers enthält, um das Ende gegen eine 5' → 3'-Exonuclease beständig zu machen;
und, anschließend an die Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion, Inkubieren der Amplifikationsprodukte der Reaktion in Gegenwart einer 5' → 3'-Exonuclease unter Bedingungen, die ausreichend sind, um den Abbau von Oligonucleotidregionen nicht verwendeter Primer und von Amplifikationsprodukten zu ermöglichen, denen eine ausreichende Anzahl von Phosphorothioatbindungen fehlt, wobei ein solcher Abbau im Wesentlichen verhindert, dass die nicht verwendeten Primer und die Amplifikationsprodukte als Substrate in einer zusätzlichen Polymerase-Kettenreaktion dienen können, wodurch eine gegenseitige Verunreinigung zwischen Polymerase-Kettenreaktionen minimiert wird.
Die Erfindung stellt auch einen Kit bereit, der speziell angepasst ist, so dass er eng angrenzend abgeteilt einen ersten Behälter, der einen ersten Primer enthält, wobei der erste Primer eine Region mit mindestens vier benachbarten Phosphorothioatnucleotidresten am 5'-Ende enthält; und einen zweiten Behälter enthält, der einen zweiten Primer enthält, dem jegliche Phosphorothioatnucleotidderivate fehlen, so dass die beiden Primer zur Amplifikation einer vorbestimmten Gensequenz verwendet werden können.
Vorzugsweise umfasst der Kit zusätzlich eine 5' → 3'-Exonuclease.
I. Einführung
Die Erfindung stellt ein Verfahren zur Erzeugung einzelsträngiger DNA-Moleküle bereit, insbesondere nach der Herstellung doppelsträngiger Nucleinsäuremoleküle durch ein in-vitro-Amplifikationsverfahren, wie z. B. PCR. Bei dem Verfahren werden Nuclease-beständige Nucleotidderivate verwendet und es bringt diese Derivate durch chemische Synthese oder enzymatische Mittel anstelle von natürlich vorkommenden Nucleotiden in Primermoleküle ein.
Die Moleküle können dann durch die Verwendung des vorliegenden Verfahrens eine Länge aufweisen, die von wenigen Nucleotiden bis zu mehreren Kilobasen reicht. Die "gewünschten" Moleküle der Erfindung weisen eine Sequenz auf, die zu der Sequenz eines "Ziel"-Strangs eines Nucleinsäuremoleküls "komplementär" oder im Wesentlichen komplementär ist.
Gemäß dieser Beschreibung sind zwei Moleküle komplementär, wenn sie mit ausreichender Stabilität miteinander hybridisieren können, so dass sie zumindest unter gewöhnlichen "niedrig-stringenten" Bedingungen miteinander hybridisiert bleiben können (vgl. J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Auflage, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York (1989), wobei dieses Dokument unter Bezugnahme in diese Beschreibung einbezogen wird.)
Das Zielmolekül kann entweder DNA, cDNA oder RNA sein. Es kann entweder einzelsträngig oder doppelsträngig sein. Wenn das "Ziel"-Molekül doppelsträngig ist, dann unterscheidet die Erfindung diese Stränge entweder als "Ziel"-Strang oder "Komplement"-Strang (dessen Sequenz zu der Zielsequenz komplementär ist). Wenn das Zielmolekül doppelsträngig ist, dann kann das erfindungsgemäße Verfahren zur Erzeugung jedes dieser Stränge verwendet werden.
Es ist signifikant, dass das erfindungsgemäße Verfahren die Erzeugung einzelsträngiger Moleküle ermöglicht, welche die gleiche Länge wie das Zielmolekül aufweisen. Die Fähigkeit zur Bildung von Molekülen mit voller Länge (anstelle von Molekülen, die nur Fragmente der Moleküle mit voller Länge umfassen) vereinfacht die Sequenzieranalyse stark und erleichtert die Herstellung von Hybridisierungssonden.
Die vorliegende Erfindung kann einzelsträngige Moleküle ungeachtet ihrer Natur, ihres Ursprungs oder der Sequenz des Zielmoleküls erzeugen. Folglich kann die vorliegende Erfindung zur Erzeugung einzelsträngiger Moleküle verwendet werden, die natürlich vorkommende Sequenzen aufweisen, wie z. B. eine Sequenz, die in einem Virus (z. B. einem Rhinovirus, einem Hepatitisvirus, einem Herpesvirus, HIV, usw.), einem Bakterium (z. B. Escherichia, Clostridium, Mycobakterium, Neisseria, Mycoplasma, Vibrio, Chlamydia, Rickettsia, usw.), einer Hefe, einem Pilz oder einem anderen niederen Eukaryoten vorliegt. Insbesondere kann die vorliegende Erfindung zur Erzeugung einzelsträngiger Moleküle verwendet werden, die eine Sequenz aufweisen, die in einer Pflanzenzelle oder einer tierischen Zelle vorliegt (insbesondere in einer Säugerzelle, wie z. B. von einem Pferd, einer Kuh, einem Hund, einer Katze oder einem Menschen). Die vorliegende Erfindung kann auch zur Erzeugung einzelsträngiger Moleküle verwendet werden, die voll- oder teilsynthetisch sind (d. h. die nicht natürlich vorkommen).
Es ist signifikant, dass das erfindungsgemäße Verfahren es ermöglicht, dass die erzeugten einzelsträngigen Moleküle "im Wesentlichen frei" von anderen Sequenzen erhalten werden können, mit denen sie natürlicherweise verbunden sind. Wie er hier verwendet wird, bezeichnet der Begriff "im Wesentlichen frei" die Verminderung oder den Ausschluss mindestens einer anderen Sequenz, die mit der erhaltenen Sequenz natürlicherweise verbunden ist, oder deren Komplement.
Die vorliegende Erfindung erreicht die Erzeugung solcher einzelsträngiger Moleküle durch die Verwendung und Verlängerung von "Primer"-Molekülen, die Exonuclease-beständige Nucleotidderivate enthalten. Beispiele für solche modifizierten Nucleotidderivate sind z. B. von G. Zon et al. (Anti-Cancer Drug Design 6, 539–568 (1991)) und J. Goodchild et al. (Bioconjugate Chem. 1, 613–629 (1990)) beschrieben, wobei beide Dokumente unter Bezugnahme in diese Beschreibung einbezogen sind. Im Allgemeinen umfassen geeignete Nucleotiderivate solche Derivate, bei denen eines oder zwei der nicht-verbrückenden Sauerstoffatome des Phosphatrests eines Nucleotids durch eine Schwefel-enthaltende Gruppe (insbesondere ein Phosphothioat), eine Alkylgruppe (insbesondere eine Methyl- oder Ethylalkylgruppe), eine Stickstoff-enthaltende Gruppe (insbesondere eine Aminogruppe) und/oder eine Selenenthaltende Gruppe, usw., ersetzt worden ist. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind Phosphorothioat-Nucleotidderivate die am meisten bevorzugten Derivate. Ein Phosphorothioat-Nucleotidderivat (z. B. ein Nucleosid-5'-O-1-thiotriphosphat) enthält ein nichtverbrückendes (d. h. einfach koordiniertes) Schwefelatom anstelle des Sauerstoffatoms des Orthophosphatrests. Es sollte beachtet werden, dass die Einführung des Schwefelatoms die Bildung zweier Stereoisomere ermöglicht. Ein solches racemisches Gemisch ist für die Zwecke der vorliegenden Erfindung geeignet.
Es ist wichtig, dass das ausgewählte Nucleotidderivat zur Primer-vermittelten in-vitro-Verlängerung geeignet sein muss und der Region des Nucleinsäuremoleküls, in die es eingebaut wird, eine Nucleasebeständigkeit verleiht. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform muss es eine Beständigkeit gegenüber Exonucleasen verleihen, die doppelsträngige DNA vom 5'-Ende her angreifen ("5' → 3'-Exonucleasen"). Beispiele für solche Exonucleasen umfassen Bakteriophage-T7-Gen 6-Exonuclease ("T7-Exonuclease") und die Bakte riophage-Lambda-Exonuclease ("λ-Exonuclease"). Sowohl die T7-Exonuclease als auch die λ-Exonuclease werden durch die Gegenwart von Phosphorothioatbindungen zu einem signifikanten Grad gehemmt, so dass der selektive Abbau eines der Stränge ermöglicht wird. Für dieses Verfahren kann jedoch jede doppelstrangspezifische 5' → 3'-Exonuclease verwendet werden, mit der Maßgabe, dass deren Aktivität durch die Gegenwart der Bindungen der Nuclease-beständigen Nucleotidderivate beeinflusst wird. Das bevorzugte Enzym bei der Verwendung von Phosphorothioatderivaten ist die T7-Gen 6-Exonuclease, die eine maximale enzymatische Aktivität in dem gleichen Puffer zeigt, der für viele DNA-abhängige Polymerasepuffer verwendet wird, einschließlich Taq-Polymerase. Die 5' → 3'-Exonuclease-Beständigkeitseigenschaften von Phosphorothioatderivat-enthaltenden DNA-Molekülen sind z. B. in T. A. Kunkel diskutiert (in: Nucleic Acids and Molecular Biology, Band 2, 124–135 (F. Eckstein et al., Hrsg.), Springer-Verlag, Berlin (1988)). Die 3' → 5'-Exonuclease-Beständigkeitseigenschaften von Phosphorothioatnucleotid-enthaltenden Nucleinsäuremolekülen sind in S. D. Putney et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 78, 7350–7354 (1981)) und A. P. Gupta et al. (Nucl. Acids Res. 12, 5897–5911 (1984)) beschrieben.
Zusätzlich zu der Beständigkeit gegenüber solchen Exonucleasen sind Nucleinsäuremoleküle, die Phosphorothioatderivate an Restriktionsendonuclease-Spalterkennungsstellen enthalten, gegenüber einer solchen Spaltung beständig. J. W. Taylor et al. (Nucl. Acids Res. 13, 8749–8764 (1985)) beschreiben die Endonuclease-Beständigkeitseigenschaften von Phosphorothioatnucleotid-enthaltenden Nucleinsäuremolekülen.
Die Nucleasebeständigkeit von Phosphorothioatbindungen wurde in einem DNA-Amplifikationsprotokoll verwendet (T. G. Walker et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 89, 392– 396 (1992)). In dem Verfahren nach Walker et al. werden Phosphorothioatnucleotidderivate innerhalb einer Restriktionsendonuclease-Erkennungsstelle in einem Strang eines doppelsträngigen DNA-Moleküls eingebaut. Die Gegenwart der Phosphorothioatnucleotidderivate schützt den Strang vor einer Spaltung und führt folglich zu einem Bruch des ungeschützten Strangs durch die Restriktionsendonuclease. Die Amplifikation wird durch Wiederholen des Brechens und Polymerisierens der Stränge erreicht.
Entsprechend wurde diese Beständigkeit gegenüber einem Nucleaseangriff als Basis für ein modifiziertes „Sanger"-Sequenzierverfahren verwendet (S. Labeit et al. (DNA 5, 173–177 (1986)). In dem Verfahren von Labeit et al. wurden anstelle der Didesoxynucleotide des „Sanger"-Verfahrens ³⁵S-markierte Phosphorothioatnucleotid-Derivate verwendet.
Wie es vorstehend erwähnt worden ist, wurden in Versuchen zur Erzeugung einzelsträngiger Moleküle andere Verfahren (wie z. B. asymmetrische PCR, usw.) verwendet. Die erfindungsgemäßen Verfahren bieten den Vorteil, dass das doppelsträngige PCR-Produkt quantitativ in ein einzelsträngiges Produkt mit exakt der gleichen Länge umgewandelt wird. Zweitens zeigt die verwendete Exonuclease eine optimale enzymatische Aktivität in PCR-Salzen. Folglich ist vor der Exonucleasebehandlung keine Reinigung oder kein Pufferaustausch erforderlich. Schließlich ist das resultierende einzelsträngige Molekül gegenüber einem weiteren Abbau durch die T7-Gen 6-Exonuclease vollständig beständig.
Wie er hier verwendet wird, bezieht sich der Begriff „Primer" auf ein einzelsträngiges Oligonucleotid oder ein einzelsträngiges Polynucleotid, dass durch das kovalente Hinzufügen eines Nucleotids in einer „Templat-abhängigen" Verlängerungsreaktion verlängert werden kann. Um eine solche Fähigkeit aufzuweisen, muss der Primer ein 3'-Hydroxylende aufweisen und an ein zweites Nucleinsäuremolekül (d. h. das „Templat") hybridisiert werden. Ein Primer weist typischerweise eine Länge von 11 Basen oder mehr auf. Insbesondere weist ein Primer eine Länge von 25 Basen auf. Primer mit einer geringeren oder größeren Länge können jedoch ausreichend sein. Der Begriff „Templat-abhängige" Verlängerung bezieht sich auf die Fähigkeit einer Polymerase, die Verlängerung eines Primers derart zu vermitteln, dass die verlängerte Sequenz zu der Sequenz eines Nucleinsäuretemplats komplementär ist. Eine „Polymerase" ist ein Enzym, das Nucleosidtriphosphate einbauen kann, um eine 3'-Hydroxylgruppe eines Nucleinsäuremoleküls zu verlängern, wenn dieses Molekül an ein geeignetes Templatnucleinsäuremolekül hybridisiert hat. Polymeraseenzyme sind bei J. D. Watson in: Molecular Biology of the Gene, 3. Auflage, W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park, CA (1977) und entsprechenden Texten diskutiert, wobei dieses Dokument in diese Beschreibung unter Bezugnahme einbezogen wird. Für Amplifikationszwecke ist eine bevorzugte DNA-Polymerase Taq-Polymerase (Cetus). Andere Polymerasen, wie z. B. das große proteolytische Fragment der DNA-Polymerase I des Bakterium E. Coli, das als „Klenow"-Polymerase bekannt ist, E. coli DNA-Polymerase I und Bakteriophage T7-DNA-Polymerase können auch zur Durchführung des hier beschriebenen Verfahrens verwendet werden.
Bedingungen oder Mittel, welche die Geschwindigkeit oder das Ausmaß des Startens, der Primerverlängerung oder des Strangersatzes erhöhen, können das Ausmaß der mit den erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Amplifikation erhöhen. Beispielsweise kann die Zugabe von Helicasen oder einzelsträngige Nucleinsäure-bindenden Proteinen die Strangersatzrate einer DNA-Polymerase erhöhen oder kann die Verwendung einer DNA-Polymerase ermöglichen, die gewöhnlich keine wesentliche Amplifikation ergibt.
Alle in einer Amplifikationsreaktion verwendeten Enzyme können unter den gleichen Reaktionsbedingungen aktiv sein. Tatsächlich existieren Puffer, in denen sich alle Enzyme nahe an ihren optimalen Reaktionsbedingungen befinden. Es ist bevorzugt, dem Reaktionsgemisch eine Menge an erforderlichen Co-Faktoren wie z. B. Mg²⁺ und dATP, dCTP, dGTP, dTTP, ATP, CTP, GTP, UTP oder andere Nucleosidtriphosphate in einer Menge zuzusetzen, die ausreichend ist, um den gewünschten Amplifikationsgrad zu unterstützen. Äquivalente Nucleosidtriphosphat-Analoga, usw. (J. A. Piccirilli et al., Nature 343, 33–37 (1990) können den vorstehend genannten Nucleosidtriphosphaten zugesetzt werden oder diese ersetzen, mit der Maßgabe, dass die Basenpaarungs-, Polymerase- und Strangersatzfunktionen nicht dahingehend negativ beeinflusst werden, dass die Amplifikation nicht in dem gewünschten Ausmaß fortschreitet.
Bei der Definition der Bedingungen, die in einer beliebigen erfindungsgemäßen Ausführungsform verwendet werden sollen, können Primer-vermittelte, zielunabhängige Reaktionen stattfinden, welche die Amplifikationseffizienz vermindern können und die während der Optimierung des Tests untersucht werden sollten. Aus diesem Grund sollten Primer ausgewählt werden, die sich nicht selbst starten können. Primer können in ungewöhnlichen Promotorunabhängigen Transkriptionsreaktionen auch als DNA-Template wirken (G. Krupp, Nucl. Acids Res. 17, 3023–3036 (1989)). Um die Wahrscheinlichkeit potenziell störender Reaktionen zu minimieren, sollten potenzielle Primer vor ihrer Verwendung in dem Amplifikationsverfahren vorzugsweise in Reaktionen getestet werden, die zum diesbezüglichen Testen geeignet sind.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform werden die einzelsträngigen Moleküle der vorliegenden Erfindung oder deren Amplifikationsprodukte nachweisbar markiert. Es kann ein beliebiges geeignetes nachweisbares Markierungsmittel verwendet werden. Folglich kann der Marken ein Enzymmarker, ein Fluoreszenzmarker, ein radioaktiver Isotopenmarker, ein Chemilumineszenzmarker, usw., sein. Beispiele für geeignete Enzymmarker umfassen alkalische Phosphatase, Acetylcholinesterase, Alpha-glycerinphosphatdehydrogenase, Asparaginase, β-Galactosidase, Katalase, Delta-5-steroidisomerase, Glucoseoxidase, Glucose-6-phosphatdehydrogenase, Glucoamylase, Glycoamylase, Luciferase, Malatdehydrogenase, Peroxidase, Ribonuclease, staphylococcale Nuclease, Triosephosphatisomerase, Urease und Hefe-Alkohol-Dehydrogenase. Beispiele für geeignete Fluoreszenzmarker umfassen einen Fluoresceinmarker, einen Isothiocyanatmarker, einen Rhodaminmarker, einen Phycoerythrinmarker, einen Phycocyaninmarker, einen Allophycocyaninmarker, einen o-Phthalaldehydmarker, einen Fluorescaminmarker, usw. Beispiele für geeignete Chemilumineszenzmarker umfassen einen Luminalmarker, einen Isoluminalmarker, einen aromatischen Acridiniumestermarker, einen Imidazolmarker, einen Acridiniumsalzmarker, einen Oxalatestermarker, einen Luciferinmarker, einen Aequorinmarker, usw.
II. Das bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren
Wie bereits erwähnt erreicht die Erfindung die Erzeugung einzelsträngiger Moleküle durch die Verwendung von Primermolekülen, die einen Bereich von mindestens vier Phosphorothioatnucleotidresten an einer Position enthalten, die das 5'-Ende des gewünschten einzelsträngigen Nucleinsäuremoleküls definiert, das erzeugt werden soll. Zur Erzeugung solcher Phosphorothioatderivate können verschiedene chemische Verfahren verwendet werden (vgl. z. B. G. Zon et al., Anti-Canc. Drug Des. 6, 539–568 (1991); S. G. Kim et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 179, 1614–1619 (1991); H. Vu et al., Tetrahedron Lett. 32, 3005– 3008 (1991); J. W. Taylor et al., Nucl. Acids Res. 13, 8749–8764 (1985); F. Eckstein et al., Biochemistry 15, 1685–1691 (1976); J. Ludwig et al., J. Org. Chem. 54, 631–635 (1989)). Phosphorothioatnucleotidderivate können auch von Amersham oder Pharmacia erworben werden.
Die Primermoleküle weisen vorzugsweise eine Länge von etwa 25 Nucleotiden auf und enthalten etwa 4% bis etwa 100%, mehr bevorzugt etwa 4% bis etwa 40% und insbesondere etwa 16% Phosphorothioatreste (bezogen auf die gesamten Reste).
Der Primer enthält mindestens vier benachbarte Phosphorothioatreste. Vorzugsweise befinden sich diese am 5'-Ende des Primers.
In einer Ausführungsform kann die vorliegende Erfindung zusammen mit einem Amplifikationsprotokoll verwendet werden, z. B. mit PCR. In dieser Ausführungsform ist es bevorzugt, die Anzahl der Phosphorothioatbindungen der Primer auf etwa 10 (oder auf etwa die Hälfte der Länge des Primers) zu begrenzen, so dass die Primer in einer PCR-Reaktion ohne Änderung des PCR-Protokolls verwendet werden können, das für nicht-modifizierte Primer festgelegt worden ist. Wenn die Primer mehr Phosphorothioatbindungen enthalten, müssen die PCR-Bedingungen gegebenenfalls eingestellt werden, insbesondere die Hybridisierungstemperatur, um die Reaktion zu optimieren. Der Einbau von weniger als 4 Phosphorothioaten führt zu einem unvollständigen Exonucleaseschutz. Die Verwendung von Primern, die 4 Phosphorothioatbindungen enthalten, ist deshalb bevorzugt.
Der Einbau solcher Nucleotidderivate in DNA oder RNA kann enzymatisch unter Verwendung einer DNA-Polymerase erreicht werden (H. P. Vosberg et al., Biochemistry 16, 3633– 3640 (1977); P. M. J. Burgers et al., J. Biol. Chem. 254, 6889–6893 (1979); T. A. Kunkel in: Nucleic Acids and Molecular Biology, Band 2, 124–135 (F. Eckstein et al., Hrsg.), Springer-Verlag, Berlin (1988); D. B. Olsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87, 1451–1455 (1990); M. A. Griep et al., Biochemistry 29, 9006–9014 (1990); J. R. Sayers et al., Nucl. Acids Res. 16, 791–802 (1988)). Alternativ können Phosphorothioatnucleotidderivate synthetisch in ein Oligonucleotid eingebracht werden (G. Zon et al., Anti-Canc. Drug Des. 6, 539–568 (1991)).
Die Primermoleküle werden an ein komplementäres Ziel-Nucleinsäuremolekül hybridisieren gelassen und dann verlängert, vorzugsweise mittels einer Polymerase, zur Bildung eines Verlängerungsprodukts. Die Gegenwart der Phosphorothioatnucleotide in den Primern macht das Verlängerungsprodukt gegenüber einem Nucleaseangriff beständig. Wie es bereits erwähnt worden ist, sind die Amplifikationsprodukte, die Phosphorothioat oder andere geeignete Nucleotidderivate enthalten, gegen eine „Eliminierung" (d. h. Abbau) durch „5' → 3'"-Exonucleasen wie z. B. T7-Exonuclease oder λ-Exonuclease im Wesentlichen beständig und folglich wird eine 5' → 3'-Exonuclease ein Nucleinsäuremolekül im Wesentlichen nicht weiter abbauen können, sobald in das Nucleinsäuremolekül eine Mehrzahl von Phosphorothioatresten eingebaut worden ist (insbesondere etwa 4 (d. h. 3 bis 5)). Die Verwendung einer zusätzlichen Anzahl von Phosphorothioatresten ist der Verwendung von 4 dieser Reste äquivalent.
Da dem Zielmolekül Nuclease-beständige Reste fehlen, führt die Inkubation des Verlängerungsprodukts und dessen Templat – das Ziel – in Gegenwart einer 5' → 3'-Exonuclease zur Zerstörung des Templatstrangs und dadurch wird die bevorzugte Erzeugung des gewünschten Einzelstrangs erreicht.
III. Anwendungen einzelsträngiger Moleküle, die durch die vorliegende Erfindung erzeugt worden sind
A. Hybridisierungssubstrate
Wie bereits erwähnt kann das Zielmolekül entweder einzelsträngig oder doppelsträngig sein und es kann sich entweder um DNA oder um RNA handeln. Obwohl das erfindungsgemäße Verfahren bei der Amplifikation eines doppelsträngigen Moleküls eine einzelne molekulare Spezies erzeugen kann, besteht keine Beschränkung dahingehend, welcher der Stränge amplifiziert werden soll. Da Verfahren wie PCR zur Amplifikation doppelsträngiger Moleküle führen, und zwar unabhängig davon, ob das Zielmolekül der Quelle ursprünglich einzelsträngig oder doppelsträngig war, ermöglicht es die vorliegende Erfindung, dass jeder Strang ei nes ursprünglich doppelsträngigen Moleküls erzeugt werden kann. Entsprechend kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren entweder der ursprüngliche Strang eines einzelsträngigen Moleküls oder das Komplement dieses Strangs erzeugt werden.
Folglich kann die vorliegende Erfindung beispielsweise entweder zur Bildung von cDNA, deren Sequenz einem mRNA-Molekül entspricht, oder zur Erzeugung eines „Antisense"-Moleküls verwendet werden, das an dieses mRNA-Molekül hybridisieren kann. „Antisense"-Moleküle können zum Nachweis und zur Identifizierung von Pathogenen (entweder viral oder bakteriell) in Gewebe (einschließlich Blut, Rückenmarksfluid, Tumorgewebe, usw.), Nahrungsmitteln, Wasser, Milch, usw., verwendet werden. Sie können auch zur Bewertung der Persistenz oder der Signifikanz einer latenten viralen oder bakteriellen Infektion verwendet werden. In einer Ausführungsform einer solchen Verwendung werden die durch die Erfindung erzeugten einzelsträngigen Moleküle vorzugsweise nachweisbar markiert und als Hybridisierungssonden des Zielmoleküls verwendet. In einer anderen Ausführungsform können die einzelsträngigen Moleküle der vorliegenden Erfindung (entweder markiert oder unmarkiert) unter Verwendung von PCR oder einem anderen Mittel zur Erzeugung von Amplifikationsprodukten amplifiziert werden, die nachweisbar markiert worden sind. Da eine solche Markierung gegebenenfalls in das gesamte Amplifikationsprodukt eingebaut werden kann, erlaubt diese Ausführungsform eine höhere spezifische Aktivität der Markierung, als sie durch eine End-Markierung erhältlich ist.
Die therapeutische Verwendung von Antisense-Molekülen leitet sich von der Fähigkeit solcher Moleküle, wenn sie in eine Zelle eingebracht werden, zur Hybridisierung an ein mRNA-Molekül mit komplementärer Sequenz und dadurch zur Störung (d. h. Abschwächung oder Verhinderung) der Translation dieses mRNA-Moleküls in ein Genprodukt ab. Um als Antisense-Oligonucleotid wirken zu können, muss das Nucleinsäuremolekül zur Bindung an diesen oder zur Hybridisierung mit diesem Abschnitt eines Ziel-mRNA-Moleküls (oder Gens) fähig sein, das die Translation der Ziel-mRNA vermittelt.
Die mit dem hier beschriebenen Verfahren erzeugten einzelsträngigen Nucleinsäuremoleküle können auch zur Erzeugung von Oligonucleotiden verwendet werden, wie sie z. B. in diagnostischen Tests der Nucleinsäuresequenzvariation auf Oligonucleotidbasis verwendet werden, und insbesondere in dem von P. Goelet et al. (WO 92/15712) beschriebenen "Genetischen Bitanalyse"-Verfahren ("GBA^TM"-Verfahren). GBA^TM ist ein Verfahren zum Nachweisen von genetischen Einzelnucleotid-Polymorphismen in Nucleinsäureproben, das auf einem schnellen, nicht-radioaktiven Festphasen- bzw. Träger-Testverfahren beruht. Im Wesentlichen werden ortsspezifische DNA-Primer an einen Träger gekoppelt und an genomische Template hybridisiert, und anschließend vorzugsweise durch Klenow- oder T7-DNA-Polymerasen in einer Sequenz-bestimmten Art und Weise verlängert. Die Substrate für diese Kettenverlängerungsreaktion sind vorzugsweise neue kettenabbrechende Didesoxynucleotide mit einem kovalent gebundenen Biotinrest. Die jeweilige(n) Base(n), die in einer gegebenen Reaktion eingebaut worden ist/sind, können dann mit einer kolorimetrischen Reaktion unter Verwendung käuflicher Enzymkonjugate ausgelesen werden. Die Reaktionen wurden an ein ELISA-artiges 96-Well-Format angepasst und unter Verwendung von Standard-Roboter-Flüssigkeitshandhabungssystemen automatisiert.
Moderne Genkartierungsstrategien beruhen auf der Ansammlung informativer genetischer Macker an eng beabstandeten Intervallen entlang eines Genoms. Einer der Vorteile von GBATM liegt darin, dass die dabei verwendeten Standardreaktionsbedingungen eine einfache Entwicklung von Tests hinsichtlich neu definierter Nucleotidpolymorphismen ermöglichen. GBATM ermöglicht auch eine rasche vorläufige Bestimmung von Allelhäufigkeiten in einer Population, so dass die Informationen, die von einem neuen Marken geliefert werden, bequem bewertet werden können.
Folglich werden bei der GBA^TM gereinigte Oligonucleotide, die eine definierte Sequenz aufweisen (die zu einem Zielmolekül komplementär ist) an einen Träger gebunden. Eine Probe, von der vermutet wird, dass sie das Zielmolekül enthält, wird mit dem Träger in Kontakt gebracht und beliebige vorliegende Zielmoleküle werden an das gebundene Oligonucleotid hybridisieren gelassen. In einer Ausführungsform wird das 5'-Ende des Oligonucleotids an den Träger gebunden, wie es z. B. von Nickerson et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 87, 8923–8927 (1990)) beschrieben wird, so dass das 3'-Ende als Substrat für die Primerverlängerung dienen kann. Das Vorliegen des gewünschten Moleküls wird durch den Einbau eines markierten Nucleotids in das 3'-Ende des gebundenen Oligonucleotids mittels einer Primerabhängigen Polymerase bestimmt.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können zur Herstellung modifizierter einzelsträngiger Oligonucleotide verwendet werden, einschließlich Oligonucleotiden, die zur Bindung nachweisbarer Reportergruppen modifiziert worden sind, oder Oligonucleotiden, die zur Bindung an eine Trägermatrix modifiziert worden sind (J. L. Ruth, US-PS 4,948,882 )).
Das erfindungsgemäße Verfahren bietet mehrere herausragende Vorteile. Die vorliegende Erfindung stellt ein sehr bequemes und zuverlässiges Verfahren zur Herstellung einzelsträngiger DNA-Moleküle mit voller Länge oder mit Teil-Längen nach der Synthese doppelsträngiger DNA-Moleküle mittels einer Primer-bestimmten Nucleinsäureamplifikationsreaktion, wie z. B. PCR, bereit. Es ist signifikant, dass der Abbau des Nuclease-empfindlichen Strangs ohne vorherige Isolierung oder Reinigung des doppelsträngigen PCR-Amplifikationsprodukts durchgeführt werden kann.
Im Gegensatz zu dem weiter oben diskutierten Verfahren von R. G. Higuchi et al., das typischerweise nur zu einer Umwandlung von 50 bis 70% führt, selbst wenn ein Überschuss an λ-Exonuclease verwendet wird, ergibt das erfindungsgemäße Verfahren einen vollständigen quantitativen Abbau des Nuclease-empfindlichen Strangs.
B. Amplifikation
Wie vorstehend angemerkt wird das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhaft mit einem invitro-Amplifikationsverfahren gekoppelt, um einen einzelnen Strang eines doppelsträngigen Moleküls spezifisch zu amplifizieren. Dieser Aspekt der Erfindung ist nachstehend unter Bezugnahme auf die PCR veranschaulicht. Alternativ kann jedoch ein beliebiges der weiter oben beschriebenen Amplifikationsverfahren verwendet werden.
Zu diesem Zweck wird die PCR unter Verwendung von zwei Primern durchgeführt, von denen nur einer so modifiziert worden ist, dass er Nuclease-beständige Nucleotidderivate enthält, wie z. B. Phosphorothioatnucleotide. Die resultierenden Nuclease-beständigen Bindungen werden ein integraler Teil des "Zielstrangs" des doppelsträngigen PCR-Amplifikationsprodukts. Im Gegensatz dazu ist der "Komplementstrang" des PCR-Amplifikationsprodukts, das aus dem Primer gebildet worden ist, der die Nucleasebeständigen Nucleotidderivate nicht enthielt, gegenüber einem Abbau durch Nuclease empfindlich. Nach der PCR-Amplifikation enthält das erhaltene doppelsträngige DNA-Produkt Phosphorothioatbindungen am 5'-Ende von nur einem Strang. Die Verwendung einer geeigneten, Doppelstrarig-spezifischen 5' → 3'-Exonuclease wandelt dieses Produkt daher durch den selektiven Abbau des nicht-geschützten Komplementstrangs in ein einzelsträngiges Molekül um. Die in dem gewünschten Strang vorliegenden Phosphorothioatbindungen schützen den Strang vor einer enzymatischen Hydrolyse. Vorzugsweise kann die Exonuclease (vorzugsweise T7-Gen 6-Exonuclease) dann nach der PCR-Reaktion einfach direkt dem Reaktionsgemisch zugesetzt werden und anschließend kann die Hydrolyse des nicht-geschützten Strangs durchgeführt werden, und zwar entweder bei Raumtemperatur oder mehr bevorzugt bei 37°C für 15 bis 30 min. Wenn die λ-Exonuclease verwendet wird, dann wird das Reaktionsgemisch insbesondere auf pH 9,4 (dem optimalen pH-Wert dieses Enzyms) eingestellt. Signifikant mehr an Enzym sollte dann verwendet werden, wenn der vollständige Abbau des Nuclease-empfindlichen Strangs erwünscht ist. Da die λ-Exonuclease eine signifikante Be vorzugung für 5'-phosphorylierte Substrate gegenüber nicht-phosphorylierten Substraten zeigt, wird der Nuclease-empfindliche PCR-Primer ganz besonders bevorzugt 5'phosphoryliert, um mit diesem Enzym optimale Ergebnisse zu erhalten.
Da die 5' → 3'-Exonuclease dazu führt, dass der "Komplementstrang" abgebaut wird, wird folglich die Herstellung eines "Zielstrangs" erreicht, der im Wesentlichen frei von natürlichen Verunreinigungen ist. Die einzelsträngigen Zielmoleküle können als Hybridisierungssonden, als Sequenziertemplate oder in anderen Anwendungen eingesetzt werden, die eine einzelsträngige DNA erfordern.
C. Sequenzanalyse
Wie bereits erwähnt können die mit der vorliegenden Erfindung erzeugten einzelsträngigen Moleküle zur Sequenzierung eines Zielmoleküls verwendet werden. In einer endungsgemäßen Ausführungsform wird der Primer, der die Phosphorothioatnucleotidderivate enthält, vorzugsweise markiert, so dass das Verlängerungsprodukt, das aus dem Primer gebildet worden ist, einfach nachgewiesen oder visualisiert werden kann. Für diesen Zweck kann ein beliebiger Macker verwendet werden, wie z. B. ein radioaktives Isotop, ein Enzym, ein fluoreszierender Rest, ein chemilumineszierender Rest, usw. In einer alternativen Ausführungsform wird der Marker in das Phosphorothioatnucleotidderivat eingebaut, wie z. B. durch die Verwendung eines radioaktiven Schwefelisotops (d. h. ³⁵S). In einer weiteren Ausführungsform können die einzelsträngigen Moleküle der vorliegenden Erfindung (entweder markiert oder unmarkiert) unter Verwendung von PCR oder einem anderen Mittel zur Erzeugung von Amplifikationsprodukten amplifiziert werden, die nachweisbar markiert worden sind. Wie es vorstehend erwähnt worden ist, kann eine derartige Markierung gegebenenfalls in ein Amplifikationsprodukt eingebaut werden, das durch PCR oder ein anderes Mittel erhalten worden ist, um eine höhere spezifische Markierungsaktivität zu erhalten, als diejenige, die durch eine End-Markierung erhältlich ist.
Folglich ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren die Herstellung einzelsträngiger Moleküle, die entweder an ihrem 5'-Ende oder gegebenenfalls über das ganze Molekül markiert ist. So können die Moleküle schnell und effizient unter Verwendung des weiter oben beschriebenen Maxam-Gilbert-Sequenzierverfahrens sequenziert werden.
Die vorliegende Erfindung umfasst Gegenstände wie z. B. "Kits". Solche Kits sind typischerweise speziell angepasst, so dass sie angrenzend abgeteilt einen ersten Behälter, der einen ersten Primer enthält, der ein Phosphorothioatnucleotidderivat am 5'-Ende enthält; und einen zweiten Behälter enthalten, der einen zweiten Primer enthält, dem jegliche Phosphorothioat-Nucleotidderivate fehlen, so dass die beiden Primer zur Amplifikation einer vorbestimmten Gensequenz verwendet werden können. Der Kit kann zusätzlich Puffer, Enzyme, Gebrauchsanweisungen und dergleichen enthalten.
Nachdem die Erfindung nun allgemein beschrieben worden ist, kann die Erfindung durch Bezugnahme auf die nachstehenden Beispiele besser verstanden werden, wobei die Beispiele lediglich der Veranschaulichung dienen und nicht beschränkend aufzufassen sind.
Beispiel 1
Herstellung einzelsträngiger DNA
Eine einzelsträngige Molekülspezies, die einem 257 bp-Bereich einer genomischen Pferde-DNA entsprach, wurde mittels PCR und zwei 25 Reste langen Primern mit vier Phosphorothioatbindungen an ihren 5'-Enden erzeugt ("ps" bezeichnet eine Phosphorothioatbindung):
Die Phosphorothioatbindungen wurden während der automatisierten Synthese der Oligonucleotide unter Verwendung des käuflichen Reagenzes Tetraethylthiuramdisulfid (TETD) eingeführt. Die Phosphorothioat-modifizierten PCR-Primer wurden unter Verwendung käuflicher Oligonucleotid-Reinigungskartuschen (OPC) gereinigt.
Die gleichen Primer (SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2) wurden auch in ihrer nichtmodifizierten Form hergestellt. In allen PCR-Reaktionen wurde dann, wenn die Erzeugung eines einzelsträngigen Produkts erforderlich war, einer der PCR-Primer Phosphorothioatmodifiziert und der andere wurde nicht modifiziert. Die PCR-Amplifikationen wurden über 30 oder 35 Zyklen durchgeführt, wobei jeder Amplifikationszyklus eine Minute Denaturierung, zwei Minuten Hybridisieren bei 60°C und drei Minuten Verlängerung bei 72°C umfasste. Nach der PCR-Amplifikation wurde eine Verdünnung von T7-Gen 6-Exonuclease (etwa 16 Einheiten des Enzyms für 100 μl der PCR-Reaktion) zugesetzt und das Gemisch wurde 15 min bei 37°C inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA bis 10 mM gestoppt und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert.
Die PCR-Amplifikation resultierte in der exponentiellen Amplifikation der 257 Basenpaar-Sequenz, welche die jeweiligen Primer-Bindungsstellen trennte. Die Behandlung mit Exonuclease führte zum vollständigen Abbau des Nuclease-empfindlichen Strangs. Die elektrophoretische Analyse des amplifizierten Materials nach der Exonucleasebehandlung zeigte, dass das Material in eine 257 Basen lange einzelsträngige Form umgewandelt worden ist.
Beispiel 2
Stabilität von Phosphorothioatbindungen gegenüber einer Hydrolyse durch T7-Gen 6-Exonuclease
Die Bakteriophage T7-Gen 6-Exonuclease hydrolysiert doppelsträngige DNA in der 5' → 3'-Richtung. Zum Studieren des Effekts der Substitution gewöhnlicher Phosphodiesterbindungen durch Phosphorothioate auf die Enzymaktivität wurden die nachstehenden 3'biotinylierten, selbst-komplementären Oligonucleotide synthetisiert (45-mere; "X" steht für die Gegenwart einer Phosphorothioatbindung zwischen angrenzenden Nucleotiden; B steht für einen Biotinrest):
Die Oligonucleotide #1–3 wurden trityliert synthetisiert, durch Umkehrphasen-HPLC gereinigt, durch Behandeln mit 80%iger Essigsäure detrityliert und entsalzt. Das Oligonucleotid #1 enthält an seinem 5'-Ende keine Phosphorothioatbindungen. Das Oligonucleotid #2 enthält am 5'-Ende eine Phosphorothioatbindung. Es ist daher ein Gemisch aus zwei Diastereoisomeren Rp und Sp, und zwar abhängig von der Orientierung des Phosphorothioatrests. Diese beiden Diastereoisomere wurden durch Umkehrphasen-HPLC im tritylierten Zustand sorgfältig getrennt und nach der Detritylierung in reiner Form erhalten. Die beiden so erhaltenen einzelnen Diastereoisomere des Oligonucleotids #2 werden nachstehend als Peak A (eluiert früher) und als Peak B (eluiert später) bezeichnet.
Die Oligonucleotide #1–3 wurden so gestaltet, dass sie stabile selbst-komplementäre Sekundärstrukturen des Haarnadeltyps bilden, und zwar mit einer einzelsträngigen Schleife aus fünf Thymidinresten. Bei der Behandlung mit T7-Gen 6-Exonuclease sollten diese Oligonuc leotide vom 5'-Ende her bis zur Thymidinschleife hydrolysiert werden und sie würden dadurch in einzelsträngige Moleküle umgewandelt werden. Um diese resultierenden 3'biotinylierten einzelsträngigen Oligonucleotide durch Hybridisierung auf einem Träger einzufangen, wurde das Oligonucleotid #4 in 96-Well-Platten immobilisiert. Dieses Oligonucleotid hat die Sequenz:
Die sechzehn 3'-endständigen Basen dieses Oligonucleotids sind zu den 3'-Enden der biotinylierten Oligonucleotide #1–3 komplementär.
Etwa 60 pmol der gereinigten Oligonucleotide #1–3 wurden mit entweder 0 oder 4 Einheiten/μl T7-Gen 6-Exonuclease bei 37°C in einem Gesamtvolumen von 100 μl behandelt. Nach dieser Behandlung wurden die Aliquots in bestimmten Zeitabständen entfernt und mit einem äquivalenten Volumen von 3 M NaCl, 2 mM EDTA gemischt. Nach einem zusätzlichen Verdünnungsschritt in 1,5 M NaCl, 10 mM EDTA wurden Aliquots, die etwa 1 pmol Oligonucleotid enthielten, den Wells einer 96-Well-Platte zugesetzt, die das immobilisierte Oligonucleotid #4 enthielten.
Die Gegenwart oder Abwesenheit von Biotin wurde dann in einem kolorimetrischen Test nachgewiesen. Dieser Test wurde auf die folgende Weise durchgeführt: Nach der Hybridisierung wurde die Platte mit einer 1 : 1200-Verdünnung eines Anti-Biotin-Meerrettichperoxidasekonjugats (Vector Laboratories, Burlingame, CA) in 1% BSA in TNTw 30 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platte wurde dann sechsmal mit TNTw gewaschen und eine Lösung von 1 mg/ml o-Phenylendiamin (OPD) in 0,1 M Citratpuffer, pH 4,5, der 0,012% H₂O₂ enthielt, wurde zugesetzt. Die Platte wurde dann sofort in ein Plattenlesegerät (V_max, Molecular Devices) eingesetzt und die Farbentwicklung bei 450 nm wurde 2 min verfolgt. Die Ergebnisse wurden als mOD₄₅₀/min dargestellt.
Die Ergebnisse dieses Tests sind in Tabelle 1 zusammengefasst. Die in dieser Tabelle angegebenen Signale wurden 15 min nach der Behandlung mit Exonuclease erhalten. Bei einer längeren Inkubation ergab sich keine Zunahme des Signals. Tabelle 1 zeigt demnach den Effekt der Phosphorothioatreste auf die Aktivität der T7-Gen 6-Exonuclease.
Tabelle 1
Aus diesen Experimenten ergaben sich mehrere wichtige Ergebnisse. Wie erwartet war keines der selbst-komplementären doppelsträngigen Oligonucleotide zur Hybridisierung an das Träger-immobilisierte Oligonucleotid fähig. Die Hybridisierung fand lediglich dann statt, wenn ein einzelsträngiges biotinyliertes Oligonucleotid durch Behandeln mit T7-Gen 6-Exonuclease erhalten wurde. In diesem Test wurde gefunden, dass das Oligonucleotid #1 sowie beide Diastereoisomere des Oligonucleotids #2 gleich gute Substrate für die Exonuclease waren. Folglich stellt die Gegenwart von nur einem Phosphorothioatrest keinen ausreichenden Schutz bereit. Im Gegensatz dazu stellten vier Phosphorothioatreste am 5'-Ende des Oligonucleotids #3 einen vollständigen Schutz vor der hydrolytischen Aktivität der T7-Gen 6-Exonuclease bereit. Am wahrscheinlichsten ist das Enzym zur Umgehung der 5'endständigen Phosphorothioatbindung fähig und kann die Hydrolyse ausgehend von dem nächsten Phosphodiester starten.
Beispiel 3
Kolorimetrischer Nachweis von PCR-Produkten in 96-Well-Platten
Nachdem ermittelt worden ist, dass Phosphorothioatbindungen einen Schutz vor der hydrolytischen Aktivität der T7-Gen 6-Exonuclease bereitstellen kann, wurden PCR-Primer hergestellt, die vier internucleotidische Phosphorothioatbindungen an ihren 5'-Enden aufwiesen. Eine fünfte Phosphorothioatbindung verbindet das 5'-endständige Nucleotid dieser Primer mit einem Biotinrest, der einen nicht-radioaktiven Nachweis der PCR-Produkte ermöglicht. Diese markierten Primer wurden zusammen mit unmodifizierten Primern mit entgegengesetztem Strang zur Amplifikation von Fragmenten genomischer Pferde-DNA verwendet. Die Sequenzen der PCR-Primer und Einfangsonden sind nachstehend angegeben:
Primerpaar A
Das Ampliflkationsprodukt des Primerpaars A war 93 Basenpaare lang und wurde unter Verwendung einer Einfangsonde mit der nachstehenden Sequenz eingefangen:
Primerpaar B
Das Amplifikationsprodukt des Primerpaars B war 201 Basenpaare lang und wurde unter Verwendung einer Einfangsonde mit der nachstehenden Sequenz eingefangen:
Primerpaar C
Das Amplifikationsprodukt des Primerpaars C war 547 Basenpaare lang und wurde unter Verwendung einer Einfangsonde mit der nachstehenden Sequenz eingefangen:
Für alle PCR-Reaktionen wurden Negativkontrollen durchgeführt, die alle Reaktionskomponenten mit Ausnahme der genomischen Pferde-DNA enthielten. Ein positives Ergebnis einer solchen Kontrollreaktion würde eine Kontamination einer der Reaktionskomponenten durch ein vorher erhaltenes PCR-Produkt anzeigen.
Nach der PCR-Amplifikation wurden Aliquots der Reaktionsgemische entnommen und als doppelsträngige PCR-Kontrollen aufbewahrt, während der Rest der Gemische mit T7-Gen 6-Exonuclease behandelt wurde. Die Analyse wurde dann mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese und auch durch Hybridisieren der einzelsträngigen Produkte der Exonucleasereaktion an Oligonucleotidsonden, die in 96-Well-Platten immobilisiert waren, durchge führt. Die Einfang-Oligonucleotide wurden dann so gestaltet, dass sie an interne Bereiche der PCR-Produkte hybridisierten, wodurch der mögliche Einfang von Primer-Dimeren ausgeschlossen wurde. Nach dem Hybridisierungsschritt wurde die Gegenwart oder Abwesenheit von Biotin mit einer kolorimetrischen Reaktion unter Verwendung eines Anti-Biotin-Meerrettichperoxidasekonjugats bestimmt.
Die Ergebnisse der Polyacrylamid-Gelelektrophorese-Analyse der PCR-Produkte zeigte, dass die verwendete Exonuclease den unmodifizierten DNA-Strang hydrolysierte und den Phosphorothioat-modifizierten Strang intakt ließ.
Zur Demonstration der Hybridisierungsspezifität wurde jedes der gleichen drei PCR-Produkte nach der Exonucleasebehandlung an Wells hybridisiert, die jedes der drei Einfang-Oligonucleotide enthielt. Folglich wurden die Produkte der PCR-Reaktionen A, B und C durch Behandlung mit 2 Einheiten/μl T7-Gen 6-Exonuclease einzelsträngig gemacht und Aliquots, die 5 μl der ursprünglichen PCR-Reaktion entsprachen, wurden den Wells einer Mikrotiterplatte zugesetzt, welche die geeigneten Einfang-Oligonucleotide zur Hybridisierung enthielten. Die Ergebnisse des kolorimetrischen Tests sind in mOD₄₅₀/min angegeben. Alle Experimente wurden zweifach durchgeführt. Die gezeigten Ergebnisse sind Durchschnitte (NT = nicht getestet, "-Kontrolle" = Negativkontrolle). Die Ergebnisse des Mikrotiterplatten-Hybridisierungsassays sind in Tabelle 2 zusammengefasst. Es sollte beachtet werden, dass bei der direkten Verwendung der doppelsträngigen PCR-Produkte ohne den Exonuclease-Schritt keine Hybridisierungssignale erhalten wurden. Dies veranschaulicht erneut, dass die verwendete Exonuclease den unmodifizierten DNA-Strang hydrolysiert und den Phosphorothioat-modifizierten Strang intakt läßt. Die Ergebnisse dieses Kreuzhybridisierungsexperiments sind auch in Tabelle 2 angegeben. Jedes der drei PCR-Produkte hybridisierte lediglich an sein spezifisches Einfang-Oligonucleotid.
Tabelle 2
Beispiel 4
Verwendung von Phosphorothioat-PCR-Primern zur Sterilisierung von PCR-Produkten
Eine erfindungsgemäße Ausführungsform betrifft das Binden der Phosphorothioatbindungen an das 3'-Ende anstelle des 5'-Endes der PCR-Primer. Bei der Behandlung mit T7-Gen 6-Exonuclease werden die 5'-unmodifizierten Teile der doppelsträngigen PCR-Produkte bis zu den Phosphorothioatbindungen abgebaut. Das resultierende Produkt kann entweder einzelsträngig oder doppelsträngig sein, und zwar abhängig davon, ob nur einer der PCR-Primer oder beide PCR-Primer Phosphorothioate enthielt bzw. enthielten. In beiden Fällen sollten die resultierenden Produkte unter der Annahme einer sehr hohen Effizienz der Exonucleasereaktion in einer anschließenden Polymerase-Kettenreaktion, bei der die gleichen Primer verwendet werden, nicht reamplifizierbar sein, da die Teile des Moleküls, an denen der Primer hybridisieren sollte, zerstört sein werden. Dies sollte ein alternatives Verfahren zur Verhinderung der gegenseitigen PCR-Verunreinigung sein.
Beispiel 5
Typisierung von DNA-Einzelbasen-Polymorphismen durch GBA^TM
Wie vorstehend erwähnt ist die genetische Bit^TM-Analyse (GBA^TM) ein Festphasen- bzw. Trägerverfahren zur Typisierung von Einzelnucleotid-Polymorphismen. Bei diesem Verfahren werden Oligonucleotidprimer (GBA^TM-Primer genannt) auf Trägern wie z. B. Polystyrol oder Glas immobilisiert, an einzelsträngige PCR-Template, die mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten worden sind, hybridisiert, und einer enzymatischen Verlängerung an ihren 3'-Enden durch ein einzelnes markiertes ddNTP unterworfen. Die Natur des eingebauten ddNTP's wird durch das Nucleotid bestimmt, das sich in dem entgegengesetzten Strang befindet (das polymorphe Nucleotid). Dieser Test kann bequem in Polystyrol-ELISA-Platten, auf Polystyrolstiften oder auf Glasobjektträgern durchgeführt werden. Ein typisches Beispiel einer GBA^TM, die in einer Polystyrolplatte durchgeführt wird, ist nachstehend angegeben. In diesem Beispiel wird GBA^TM verwendet, um einen Diallelpolymorphismus in genomischer Pferde-DNA zu typisieren.
Die Verwendung von Phosphorothioat-enthaltenden Oligonucleotiden in der GBA^TM wird durch die Verwendung von PCR-Primern zur Amplifikation einer 112 bp-Region genomischer Pferde-DNA veranschaulicht, die einen Einzelbasen-Polymorphismus enthält. Die PCR-Primer hatten die nachstehenden Sequenzen.
Der PCR-Primer von SEQ ID NO: 17 enthält an seinem 5'-Ende vier Phosphorothioatbindungen. Diese schützen dieses Ende des doppelsträngigen PCR-Produkts vor der exonucleolytischen Wirkung der T7-Gen 6-Exonuclease und ermöglichen die Herstellung eines einzelsträngigen PCR-Produkts.
Es wurde genomische DNA verwendet, die aus vier verschiedenen Pferden isoliert worden ist. Die Amplifikation durch PCR wurde mit Standardtechniken durchgeführt, und zwar unter Verwendung der Oligonucleotide SEQ ID NO: 16 und SEQ ID NO: 17 als Primer. Das doppelsträngige PCR-Produkt wurde wie beschrieben in das einzelsträngige PCR-Produkt umgewandelt und es wurde an einen GBA^TM-Primer mit der folgenden Sequenz hybridisiert:
Dieser GBATM-Primer wurde auf einer 96-Well-Polystyrolplatte immobilisiert. Nach der Hybridisierung des PCR-abgeleiteten einzelsträngigen DNA-Fragments an den immobilisierten GBATM-Primer wurde das 3'-Ende desselben enzymatisch um ein markiertes ddNTP verlängert, und zwar in Gegenwart des großen Fragments von DNA-Polymerase 1 von E. coli (Kle now-Polymerase). Das verwendete Verlängerungsgemisch enthielt die folgenden Komponenten: 20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM MgCl₂; 25 mM NaCl; 10 mM MnCl₂; 15 mM Natriumisocitrat; jeweils 1,5 μM jedes der drei unmarkierten 2',3'-Didesoxynucleosid-5'triphosphate und entweder 1,5 μM Biotin-markiertes 2',3'-Didesoxyadenosin-5'-triphosphat oder 1,5 μM Biotin-markiertes 2',3'-Didesoxyguanosin-5'-triphosphat sowie 0,15 Einheiten der Klenow-Polymerase pro Well. Die Verlängerung wurde in getrennten Wells durchgeführt, wobei jeder Well ein unterschiedlich markiertes ddNTP enthielt. Die Gegenwart von Biotin wurde dann durch einen kolorimetrischen Nachweis gezeigt, wie es vorstehend beschrieben worden ist. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
Diese Ergebnisse zeigen, dass für diesen Polymorphismus die Pferde 1 und 3 heterozygot sind, das Pferd 2 ein G-Homozygot und das Pferd 4 ein A-Homozygot ist.
Das GBA^TM-Verfahren (genetisches Bitanalyseverfahren) ist folglich ein einfaches, bequemes und automatisierbares Genotypisierungsvertahren. In diesem Verfahren wird ein sequenzspezifisches Hybridisieren an einen trägergebundenen Primer eingesetzt, um eine einzelne polymorphestelle in einer Nucleinsäureprobe auszuwählen, und die Abfrage dieser Stelle findet mittels einer sehr genauen DNA-Polymerasereaktion unter Verwendung eines Satzes neuer nicht-radioaktiver Didesoxynucleotid-Analoga statt. Eines der attraktivsten Merkmale des GBA^TM-Ansatzes besteht darin, dass ein Satz von Reaktionsbedingungen zur Abfrage vieler verschiedener polymorpher Stellen verwendet werden kann, da die tatsächliche Allelunterscheidung durch die DNA-Polymerase durchgeführt wird. Dieses Merkmal ermöglicht die Reduzierung der Kosten in komplexen DNA-Tests durch die Nutzung paralleler Formate und ermöglicht eine rasche Entwicklung neuer Tests.
Die intrinsische Fehlerrate des GBA^TM-Verfahrens in dem vorliegenden Format wird als niedrig angenommen. Das Signal-Rausch-Verhältnis bezüglich eines korrekten Nucleotideinbaus gegenüber einem nicht korrekten Nucleotideinbau für Homozygoten scheint bei etwa 20 : 1 zu liegen. GBA^TM ist folglich ausreichend quantitativ, um den zuverlässigen Nachweis von Heterzygoten bei Genotypisierungsstudien zu ermöglichen. Das Vorliegen aller vier Didesoxynucleosidtriphosphate als einzige Nucleotidsubstrate in der DNA-Polymerase-vermittelten Verlängerungsreaktion erhöht die Präzision von Genotyp-Bestimmungen durch die Unterdrückung eines falschen Einbaus. GBA^TM kann in einer beliebigen Anwendung eingesetzt werden, bei der Punktmutationsanalysen gegenwärtig verwendet werden – einschließlich Genkartierungsstudien und Genkopplungsstudien, Gendiagnosen und Identitäts/Vaterschaftstests – unter der Voraussetzung, dass die umgebende DNA-Sequenz bekannt ist.
Während die Erfindung bezüglich ihrer spezifischen Ausführungsformen beschrieben worden ist, ist es klar, dass die Erfindung weiter modifiziert werden kann und dass diese Anmeldung jegliche Variationen, Anwendungen oder Anpassungen der Erfindung umfasst, die im Allgemeinen den Prinzipien der Erfindung folgen, einschließlich solcher Abweichungen von der vorliegenden Offenbarung, die auf dem Fachgebiet üblich sind und die im Schutzbereich der beigefügten Patentansprüche liegen.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein Verfahren zum Erzeugen eines gewünschten einzelsträngigen Nucleinsäuremoleküls, das im Wesentlichen frei von einem Nucleinsäuremolekül mit komplementärer Sequenz ist, wobei das Verfahren umfasst: (a) Inkubieren eines vorausgewählten Ziel-Nucleinsäuremoleküls in Gegenwart eines Primermoleküls, das an das Zielmolekül hybridisieren kann und das eine Region mit mindestens vier benachbarten Phosphorothioatnucleotidresten an einer Position enthält, die das 5'-Ende des gewünschten einzelsträngigen Nucleinsäuremoleküls definiert; (b) Zulassen einer Templat-abhängigen Verlängerung des Primers zur Bildung des gewünschten Nucleinsäuremoleküls; und (c) Inkubieren des Zielmoleküls und des gewünschten Nucleinsäuremoleküls mit einer 5' → 3'-Exonuclease zur Erzeugung des gewünschten einzelsträngigen Moleküls, das im Wesentlichen frei von einem Nucleinsäuremolekül mit komplementärer Sequenz ist.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem sich die Phosphorothioatreste am 5'-Ende des Primers befinden.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die 5' → 3'-Exonuclease dem Inkubationsgemisch von Schritt (b) zugesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, bei dem in (b), jedoch nach der Bildung des gewünschten Nucleinsäuremoleküls, das Molekül in Gegenwart eines zweiten Primermoleküls inkubiert wird, das daran hybridisieren und in einer Templat-abhängigen Weise verlängert werden kann, zur Bildung eines Nucleinsäuremoleküls, das eine Sequenz aufweist, die im Wesentlichen komplementär zur Sequenz des gewünschten Moleküls ist.
Verfahren nach Anspruch 4, bei dem die Inkubation in Gegenwart mindestens eines Didesoxynucleotidderivats, jedoch in Abwesenheit nicht-terminierender Desoxynucleotidderivate und unter Bedingungen stattfindet, die ausreichend sind, um die Verlängerung des Primers in einer Templat-abhängigen Weise zuzulassen.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem der Primer eine Länge von 10 bis 30 Nucleotiden, wie z. B. 20 bis 25 Nucleotide, aufweist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem der Primer nachweisbar markiert ist und/oder das Phosphorothioatnucleotid nachweisbar markiert ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das gewünschte einzelsträngige Nucleinsäuremolekül durch Einbringen von markierten Nucleotiden während der Templat-abhängigen Verlängerung des Primers nachweisbar markiert wird.
Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, bei dem der nachweisbare Marken ein Enzymmarker, ein Fluoreszenzmarker, ein radioaktiver Isotopenmarker oder ein Chemolumineszenzmarker ist.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die 5' → 3'-Exonuclease T7-Gen 6-Exonuclease oder λ-Exonuclease ist.
Eine Zusammensetzung, die ein Ziel-Nucleinsäuremolekül umfasst, das an ein Primermolekül hybridisiert ist, welches eine Länge von 10 bis 30 Nucleotiden aufweist und das eine Region mit mindestens vier benachbarten Phosphorothioatnucleotidresten am 5'-Ende enthält, wobei das Primermolekül an einen Träger gebunden ist.
Ein Verfahren zum Nachweisen eines gewünschten Exonuclease-beständigen Amplifikationsprodukts einer Polymerase-Kettenreaktion, wobei das Verfahren umfasst: (a) Durchführen einer Polymerase-Kettenreaktion mit zwei Primermolekülen, von denen eines eine Region mit mindestens vier benachbarten Phosphorothioatnucleotidresten am 5'-Ende des Primers enthält, wobei die Reaktion zur Bildung doppelsträngiger Amplifikationsprodukte ausreichend ist; (b) anschließend Behandeln der Amplifikationsprodukte mit einer 5' → 3'-Exonuclease unter Bedingungen, die zum Abbau von Oligonucleotiden führen; denen eine ausreichende Anzahl von Phosphorothioatbindungen fehlt, um die Oligonucleotide gegenüber der Exonuclease beständig zu machen; und (c) Nachweisen des gewünschten Amplifikationsprodukts der Polymerase-Kettenreaktion durch Hybridisierenlassen des Produkts an ein komplementäres Oligonucleotid, das an einen Träger gebunden ist.
Ein Verfahren zur Minimierung der gegenseitigen Verunreinigung zwischen Polymerase-Kettenreaktionen, wobei das Verfahren umfasst: Durchführen einer Polymerase-Kettenreaktion, bei der mindestens eines der Primermoleküle der Reaktion mindestens vier benachbarte Phosphorothioatnucleotidderivate am 3'-Ende des Primers enthält, um das Ende gegen eine 5' → 3'-Exonuclease beständig zu machen; und, anschließend an die Durchführung der Polymerase-Kettenreaktion, Inkubieren der Amplifikationsprodukte der Reaktion in Gegenwart einer 5' → 3'-Exonuclease unter Bedingungen, die ausreichend sind, um den Abbau von Oligonucleotidregionen nicht verwendeter Primer und von Amplifikationsprodukten zu ermöglichen, denen eine ausreichende Anzahl von Phosphorothioatbindungen fehlt, wobei ein solcher Abbau im Wesentlichen verhindert, dass die nicht verwendeten Primer und die Amplifikationsprodukte als Substrate in einer zusätzlichen Polymerase-Kettenreaktion dienen können, wodurch eine gegenseitige Verunreinigung zwischen Polymerase-Kettenreaktionen minimiert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, 12 oder 13, bei dem die Anzahl der Phosphorothioatbindungen im Primer zehn oder weniger beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, 12, 13 oder 14, bei dem der Anteil der Phosphorothioatnucleotidreste in dem Primer die Hälfte oder weniger beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, 12, 13, 14 oder 15, bei dem die Anzahl der Phosphorothioatnucleotidreste in dem Primer vier beträgt
Ein Kit, der speziell angepasst ist, so dass er eng angrenzend abgeteilt einen ersten Behälter, der einen ersten Primer enthält, wobei der erste Primer eine Region mit mindestens vier benachbarten Phosphorothioatnucleotidresten am 5'-Ende enthält; und einen zweiten Behälter enthält, der einen zweiten Primer enthält, dem jegliche Phosphorothioatnucleotidderivate fehlen, so dass die beiden Primer zur Amplifikation einer vorbestimmten Gensequenz verwendet werden können.
Kit nach Anspruch 17, der zusätzlich eine 5' → 3'-Exonuclease enthält.