DE69432640T2 - Metall-chelat enthaltende zusammensetzungen zur verwendung in chemilumineszierenden assays - Google Patents

Metall-chelat enthaltende zusammensetzungen zur verwendung in chemilumineszierenden assays Download PDF

Info

Publication number
DE69432640T2
DE69432640T2 DE69432640T DE69432640T DE69432640T2 DE 69432640 T2 DE69432640 T2 DE 69432640T2 DE 69432640 T DE69432640 T DE 69432640T DE 69432640 T DE69432640 T DE 69432640T DE 69432640 T2 DE69432640 T2 DE 69432640T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
photosensitizer
analyte
sbp
usually
group
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE69432640T
Other languages
English (en)
Other versions
DE69432640D1 (de
Inventor
F. Edwin ULLMAN
Sharat Singh
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH
Original Assignee
Dade Behring Marburg GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Dade Behring Marburg GmbH filed Critical Dade Behring Marburg GmbH
Application granted granted Critical
Publication of DE69432640D1 publication Critical patent/DE69432640D1/de
Publication of DE69432640T2 publication Critical patent/DE69432640T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D265/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom and one oxygen atom as the only ring hetero atoms
    • C07D265/28—1,4-Oxazines; Hydrogenated 1,4-oxazines
    • C07D265/30—1,4-Oxazines; Hydrogenated 1,4-oxazines not condensed with other rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D279/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one nitrogen atom and one sulfur atom as the only ring hetero atoms
    • C07D279/10—1,4-Thiazines; Hydrogenated 1,4-thiazines
    • C07D279/12—1,4-Thiazines; Hydrogenated 1,4-thiazines not condensed with other rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D327/00—Heterocyclic compounds containing rings having oxygen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D327/02—Heterocyclic compounds containing rings having oxygen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms one oxygen atom and one sulfur atom
    • C07D327/06—Six-membered rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D413/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D413/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings
    • C07D413/04—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms containing two hetero rings directly linked by a ring-member-to-ring-member bond
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/5436—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand physically entrapped within the solid phase
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/585—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with a particulate label, e.g. coloured latex
    • G01N33/586—Liposomes, microcapsules or cells
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/968—High energy substrates, e.g. fluorescent, chemiluminescent, radioactive
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/80—Fluorescent dyes, e.g. rhodamine
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/805—Optical property
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10S436/807—Apparatus included in process claim, e.g. physical support structures
    • Y10S436/808—Automated or kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/13—Tracers or tags

Description

  • HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft eine chemolumineszierende Verbindung sowie ein Verfahren, Zusammensetzungen und Sets zur Bestimmung eines Analyten in einer Probe. Insbesondere betrifft die Erfindung eine Zusammensetzung, die Chemolumineszenz mit hoher Quantenausbeute aufweist, wenn sie durch Singulett-Sauerstoff aktiviert wird, die rasch abklingt und die bei langen Wellenlängen emittiert.
  • Das Gebiet der klinischen Diagnostik ist in den letzten Jahren in großem Umfang ausgeweitet worden – sowohl hinsichtlich der Vielfalt an Materialien (Analyten), die ohne Schwierigkeiten und präzise bestimmt werden können, als auch hinsichtlich der Bestimmungsverfahren. Es sind praktikable, zuverlässige und ungefährliche Verfahren zum Nachweis der Gegenwart niedriger Konzentrationen von Materialien in Flüssigkeiten wünschenswert. In der klinischen Chemie können diese Materialien in Körperflüssigkeiten in Konzentrationen von unter 1012 Mol vorhanden sein. Die Schwierigkeit, niedrige Konzentrationen dieser Materialien zu detektieren, wird durch die relativ geringen Probengrößen, die dafür einsetzbar sind, noch verstärkt.
  • Bei der Entwicklung von Tests müssen unterschiedliche Faktoren berücksichtigt werden. Eine Überlegung ist die Signalreaktion auf Änderungen der Analytenkonzentration. Eine zweite Überlegung ist die Leichtigkeit, mit der die Arbeitsvorschrift für den Test durchgeführt werden kann. Eine dritte Überlegung sind die schwankenden Störungen von Probe zu Probe. Einfache Herstellung und Reinigung der Reagenzien, Verfügbarkeit von Geräten, einfache Automatisierung und Wechselwirkungen mit Materialien von Interesse sind weitere Faktoren, die es bei der Entwicklung nützlicher Tests zu berücksichtigen gilt.
  • Eine Vielzahl von Techniken einer bestimmten Kategorie sieht die Verwendung eines Rezeptors vor, der sich spezifisch an eine bestimmte räumliche und polare Struktur eines markierten Liganden als Funktion der Gegenwart eines Analyten binden kann.
  • Die beobachtete Wirkung der Bindung durch den Rezeptor hängt vom Marker ab. In einigen Fällen sorgt die Bindung des Rezeptors lediglich für eine Differenzierung des Molekulargewichts zwischen gebundenem und ungebundenem markiertem Liganden. In anderen Fällen erleichtert die Bindung des Rezeptors die Trennung von gebundenem markiertem Liganden von freiem markiertem Liganden, oder sie kann die Beschaffenheit des aus dem Marker erhaltenen Signals beeinflussen, sodass das Signal je nach Menge des an den markierten Liganden gebundenen Rezeptors variiert. Eine weitere Variation besteht darin, dass der Rezeptor markiert ist und der Ligand unmarkiert. Alternativ dazu sind sowohl der Rezeptor als auch der Ligand markiert, oder es sind unterschiedliche Rezeptoren mit zwei unterschiedlichen Markern markiert, woraufhin die Marker miteinander in Wechselwirkung treten, wenn sie sich in unmittelbarer Nähe befinden, und die Menge an vorhandenem Liganden das Ausmaß beeinflusst, in dem die Marker des Rezeptors miteinander wechselwirken.
  • Es besteht nach wie vor die Notwendigkeit, neue und präzise Techniken zu entwickeln, die auf ein breites Spektrum unterschiedlicher Liganden abgestimmt oder in konkreten Fällen verwendet werden können, wo andere Verfahren nicht ohne Weiteres in Frage kommen.
  • Es wurden bereits homogene Immunassays für kleine Moleküle beschrieben. Diese Tests sind z. B. der FRAT®-Test von SYVA, der EMIT®-Test, der Enzymkanalisierungs-Immuntest und der Fluoreszenz-Energietransfer-Immuntest (FETI); ferner gibt es Enzyminhibior-Immuntests (Hoftman LaRoche und Abbott Laboratories), wie z. B. den Fluoreszenz-Polarisations-Immuntests (Dandlicker) u. a. Alle diese Verfahren besitzen beschränkte Sensitivität, und nur einige, wie z. B. FETI und Enzymkanalisierung, sind für große Multiepitop-Analyten geeignet. Lumineszierende Verbindungen, wie z. B. fluoreszierende Verbindungen und chemolumineszierende Verbindungen, werden für Tests sehr häufig eingesetzt, da sie die Fähigkeit des Lichtaussendens besitzen. Aus diesem Grund wurden Lumineszenzmittel als Marker in Tests, wie z. B. Nucleinsäureassays und Immunassays, verwendet. Beispielsweise wird ein Element eines spezifischen Bindungspaars an ein Lumineszenzmittel gebunden, und es werden verschiedene Arbeitsvorschriften befolgt. Das Lumineszenzmittel-Konjugat kann im Verhältnis zur Analytenmenge in einer Probe, von der man vermutet, dass sie den Analyten enthält, zwischen einer festen Phase und einer flüssigen Phase verteilt werden. Durch Messen der Lumineszenz einer der beiden Phasen kann der beobachtete Lumineszenzwert mit der Konzentration des Analyten in der Probe in Beziehung gesetzt werden.
  • Teilchen, wie z. B. Liposomen und Erythrozyten-Geisterpeaks, wurden als Träger eingekapselter wasserlöslicher Materialien verwendet. Beispielsweise dienten Liposomen dazu, biologisch aktives Material aus unterschiedlichen Gründen einzukapseln, z. B. für ein Arzneimittel-Zufuhrsystem, in dem ein Medikament während der Liposomen-Herstellung eingeschlossen und dann dem zu behandelnden Patienten verabreicht wird.
  • Teilchen, wie z. B. Latexperlen und Liposomen, wurden auch in Tests eingesetzt. Beispielweise kann in homogenen Assays ein Enzym in der wässrigen Phase eines mit Antikörper oder Antigen markierten Liposoms eingeschlossen werden. Die Liposomen setzen dann das Enzym in Gegenwart einer Probe und eines Komplements frei. Antikörper- oder Antigen-markierte Liposomen mit wasserlöslichen fluoreszierenden oder nichtfluoreszierenden Farbstoffen (in wässriger Phase eingeschlossen) oder löslichen Lipidfarbstoffen (in der Lipid-Doppelschicht des Lipidvesikels oder in Latexperlen gelöst) wurden auch für Tests auf Analyten herangezogen, die eine immunochemische Reaktion mit dem oberflächengebundenen Antikörper oder Antigen eingehen können. Es wurden Detergenzien dazu verwendet, die Farbstoffe aus der wässrigen Phase der Liposomen freizusetzen.
  • Kurzbeschreibung des verwandten Standes der Technik
  • White et al. (White) besprechen „Chemically Produced Excited States. Energy Transfer, Photochemical Reactions, and Light Emission" in J. Am. Chem. Soc. 93, 6286 (1971).
  • McCapra et al. (McCapra) offenbaren „Metal Catalysed Light Emission from a Dioxetan" in Tetrahedron Letters 23 (49), 5225–5228 (1982).
  • Wildes et al. (Wildes) besprechen „The Dioxetane-Sensitized Chemiluminescence of Lanthanide Chelates. A Chemical Source of ,Monochromatic' Light" in J. Am. Chem. Sco. 93(23), 6286–6288 (1971).
  • Handley et al. (Handley) offenbaren „Effects of Heteroatom Substituents on the Properties of 1,2-Dioxetanes" in Tetrahedron Letters 26, 3183 (1985).
  • Zaklika et al. (Zaklika) besprechen „Substituent Effects on the Decomposition of 1,2-Dioxetanes" in J. Am. Chem. Soc. 100, 4916 (1978).
  • EP-A-0.345.776 (McCapra) offenbart spezifische Bindungstests, die einen Sensibilisator als Marker verwenden. Die Sensibilisatoren enthalten jede Gruppe, die – bei Stimulierung durch Anregung mit Strahlung einer oder mehrerer Wellenlängen oder andere chemische oder physikalische Stimulierung (z. B. Elektronentransfer, Elektrolyse, Elektrolumineszenz oder Energietransfer) – einen angeregten Zustand erreichen, der (a) nach Wechselwirkung mit molekularem Sauerstoff molekularen Singulett-Sauerstoff produziert oder (b) nach Wechselwirkung mit einem Leuko-Farbstoff eine reduzierte Form annimmt, die durch Wechselwirkung mit molekularem Sauerstoff wieder in ihren ursprünglichen nicht angeregten Zustand rückgeführt werden kann, was zur Bildung von Wasserstoffperoxid führt. Beide Wechselwirkung mit dem angeregten Sensibilisator werden unter Zugabe von Reagenzien ein detektierbares Signal liefern.
  • EP-A-0.070.685 (Heller et al. 1) beschreibt eine homogene Nucleinsäure-Hybridisierungsdiagnostik durch strahlungsfreien Energietransfer.
  • Ein lichtaussendendes Polynucleotid-Hybridisierungs-Diagnostikverfahren ist in EP-A-0.070.687 (Heller et al. II) beschrieben.
  • EP-A-515.194 beschreibt Verfahren zur Bestimmung eines Analyten, die jenen der vorliegenden Beschreibung ähneln, und offenbart insbesondere die chemolumineszierende Dioxenverbindung, die weiter unten als Verbindung 9 angeführt ist.
  • In einem Aspekt betrifft die Erfindung eine Verbindung der Formel:
    Figure 00050001
    worin X S ist und D und D' Methyl sind. Diese Verbindung ist hierin als Verbindung 11 bezeichnet.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, die einen Latex mit der darin inkorporierten Verbindung 11 umfasst.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten wie in Anspruch 5 definiert. In diesem Verfahren wird das Ausmaß an Lumineszenz mit der Analytenmenge im Medium in Beziehung gesetzt.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Set, das eine abgepackte Kombination von Folgendem umfasst: (1) einer Zusammensetzung, die ein suspendierbares Latexteilchen umfasst, das Verbindung 11 enthält, und (2) eines Photosensibilisators. Das Teilchen besitzt ein daran gebundenes spezifisches Bindungspaar(sbp-) Element. Der Photosensibilisator kann in seinem angeregten Zustand Sauerstoff in dessen Singulett-Zustand anregen.
  • BESCHREIBUNG SPEZIFISCHER AUSFÜHRUNGSFORMEN
  • Die vorliegende Endung betrifft chemolumineszierende Verbindungen, die unter Aktivierung durch Singulett-Sauerstoff rasch abklingend chemolumineszierendes Licht aussenden; im Allgemeinen besitzen sie eine Halbwertszeit von 0,5 Sekunden bis zu 30 Minuten, vorzugsweise 0,5 bis 30 Sekunden, üblicherweise weniger als 20 Sekunden. Außerdem können die vorliegenden chemolumineszierenden Verbindungen hohe chemolumineszierende Quantenausbeute aufweisen, nachdem sie mit Singulett-Sauerstoff angeregt wurden, d. h. im Allgemeinen von 0,1 bis 0,9, üblicherweise von 0,1 bis 0,6, vorzugsweise von 0,2 bis 0,4. Das vom Metallchelat in den vorlie genden Zusammensetzungen nach Aktivierung ausgesandte chemolumineszierende Licht besitzt im Allgemeinen eine Wellenlänge von etwa 550 bis 700 nm, üblicherweise von mehr als 600 nm. Die chemolumineszierenden Verbindungen der Erfindung eignen sich besonders für Lumineszenzassays. Beispielsweise verhindert das Aussenden bei langer Wellenlänge Störungen aufgrund der Serumabsorption in Tests hinsichtlich Blut- oder Serumproben. Die hohe Quantenausbeute verbessert die Detektierbarkeit, und die kurze Lebensdauer sorgt für eine weitere Verbesserung der Detektierbarkeit, indem bewirkt wird, dass das gesamte ausgesandte Licht in einem kurzen Puls und nicht über einen langen Zeitraum abgegeben wird. Dies kann höhere Lichtintensität bei niedrigeren Quantenausbeuten ermöglichen.
  • Die Quantenausbeute von Chemolumineszenz der vorliegenden chemolumineszierenden Verbindungen bei Aktivierung durch Singulett-Sauerstoff ist im Allgemeinen etwa 10- bis 100fach höher, vorzugsweise 10- bis 50fach höher, als jene, die bei getrennter Bestrahlung der Komponenten der Zusammensetzung zu beobachten wäre. Außerdem wird die Abklingrate der Chemolumineszenz aufgrund einiger der vorliegenden Zusammensetzungen deutlich erhöht. Diese Eigenschaften machen die Zusammensetzungen für Assays zur Bestimmung von Analyten äußerst interessant.
  • Bevor mit einer ausführlichen Beschreibung spezifischer Ausführungsformen der Erfindung fortgefahren wird, werden einige Begriffe definiert und im Detail beschrieben.
  • Metallligand: Eine Verbindung, in der zwei oder mehr Atome des gleichen Moleküls mit einem Metall koordinieren können, um ein Metallchelat zu bilden. Die Metallchelate, die einen Teil der Zusammensetzungen der Erfindung bilden können, umfassen ein Metall, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Europium, Terbium, Dysprosium, Samarium, Osmium und Ruthenium. Eines der obigen Metalle ist mit einem oder mehreren Metallliganden koordiniert; es kann sich z. B. um 3-(2-Thienoyl)-1,1,1-trifluoraceton (TTA), 3-Benzoyl-1,1,1-trifluoraceton (BFTA), 3-Naphthoyl-1,1,1-trifluoraceton (NPPTA), 2,2-Dimethyl-4-perfluorbutyroyl-3-butanon (fod), 2,2'-Dipyridyl (bpy), Phenanthrolin (phen), Salicylsäure, Phenanthrolincarbonsäure, Bipyridylcarbonsäure, Aza-Kronenether, Trioctylphosphinoxid, Azakryptanden usw. handeln. Üblicherweise ist das Metall im Metallchelat zumindest sechsfach koordiniert, doch es kann auch – je nach den Metallliganden – achtfach oder noch höher koordiniert sein. Das Metallchelat ist ungeladen, d. h. die Anzahl saurer Gruppen, die seine Liganden bereitstellen, entspricht der Oxidationsstufe des Metalls. Üblicherweise sind die Metallliganden relativ hydrophob, um dem Metallchelt in nichtpolaren Lösungsmitteln Löslichkeit zu verleihen. Seltenerdmetalle besitzen üblicherweise eine Oxidationsstufe von drei, Ruthenium besitzt eine Oxidationsstufe von zwei, und Osmium besitzt ebenfalls eine Oxidationsstufe von zwei. Veranschaulichende und keinesfalls einschränkende Beispiele für solche Metallchelate sind die folgenden:
    Figure 00080001
  • Ein TTA in 3(a) oder 3(b) kann durch Folgendes ersetzt sein:
    Figure 00090001
    Figure 00100001
    Figure 00110001
  • Zwei TTAs in 3(a) und 3(b) können unabhängig voneinander durch Verbindungen ersetzt sein, die aus Folgenden ausgewählt sind:
    Figure 00110002
    Figure 00120001
    Figure 00130001
    Figure 00140001
  • Drei TTAs können unabhängig voneinander durch Verbindungen ersetzt sein, die aus Folgenden ausgewählt sind:
    Figure 00150001
  • Viele dieser Metallliganden und Metallchelate sind auf dem Gebiet bekannt und im Handel erhältlich. Im Allgemeinen können Metallchelate aus Metallliganden herge- stellt werden, indem das Metallchlorid mit dem gewünschten Anteil an Metallligand-Molekülen in einem organischen Lösungsmittel, z. B. Acetonitril, und ausreichend Base, z. B. Pyridin, kombiniert wird, um die freigesetzte Salzsäure aufzunehmen. Beispielsweise können Metallchelate nach einem Verfahren hergestellt werden, das von Shinha, A. P., in „Fluorescences and laser action in rare earth chelates", Spectroscopy Inorganic Chemistry 2, 255–288 (1971), beschrieben wurde.
  • Arylgruppe: Ein organischer Rest, abgeleitet von einem aromatischen Kohlenwasserstoff durch Entfernung eines Atoms, umfassend einen oder mehrere aromatische Ringe, üblicherweise ein bis vier aromatische Ringe, die im Allgemeinen fünf- oder sechsgliedrige Ringe sind, z. B. Phenyl (von Benzol), Naphthyl (von Naphthalin), Biphenylenyl, Azulenyl, Anthryl, Phenanthrenyl, Pyridyl, Indolyl, Benzofuranyl, Benzothiophenyl, Chinolinyl, Isochinolinyl, Carbazolyl, Acridinyl, Imidazolyl, Thiazolyl, Pyrazinyl, Pyrimidinyl, Purinyl, Pteridinyl usw.
  • Aralkyl: Ein organischer Rest mit einer Alkylgruppe, an die eine Arylgruppe gebunden ist, z. B. Benzyl, Phenethyl, 3-Phenylpropyl, 1-Naphthylethyl usw.
  • Elektronen-Donorgruppe: Ein Substituent, der, wenn er an ein Molekül gebunden ist, dieses so polarisieren kann, dass die Elektronen-Donorgruppe im Vergleich zu einem anderen Abschnitt des Moleküls elektronenarm und positiv geladen wird, d. h. eine verringerte Elektronendichte aufweist. Solche Gruppen sind u. a. Amine, Ether, Thioether, Phosphine, Hydroxy, Oxyanionen, Mercaptane und deren Anionen, Sulfide usw.
  • Alkyl: Ein einwertiger, verzweigter oder unverzweigter Rest, der von einem aliphatischen Kohlenwasserstoff durch Entfernung eines H-Atoms abgeleitet wird; dazu zählen sowohl niedere als auch höhere Alkyle.
  • Alkylrest: Ein Substituent aus zwei oder mehr Alkylgruppen, die unabhängig voneinander niedere oder höhere Alkylgruppen sein können, die über eine Funktionalität, wie z. B. einen Ether, einschließlich Thioether, ein Amid, einen Ester u. dgl. miteinander verbunden sein können.
  • Niederes Alkyl: Alkyl mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, Butyl, Isopropyl, Isobutyl, Pentyl, Isopentyl usw.
  • Höheres Alkyl: Alkyl mit mehr als 6 Kohlenstoffatomen, üblicherweise mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, z. B. Hexyl, Heptyl, Octyl usw.
  • Alkyliden: Ein zweiwertiger organischer Rest, der von einem aliphatischen Kohlenwasserstoff abgeleitet ist, z. B. Ethyliden, worin zwei Wasserstoffatome vom gleichen Kohlenstoffatom entfernt sind.
  • Substituiert: Ein Wasserstoffatom oder ein Molekül wurde durch ein anderes Atom ersetzt, das ein einzelnes Atom, wie z. B. Halogen usw., oder ein Teil einer Atomgruppe sein kann, die eine Funktionalität bildet, z. B. ein Substituent aus 1 bis 50 Atomen (mit Ausnahme der erforderlichen Wasserstoffatome, die zur Erfüllung der Wertigkeiten solcher Atome benötigt werden), welche Atome unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor ausgewählt sind und die an ein oder mehrere Metallatome gebunden sein können oder auch nicht.
  • Analyt: Die zu detektierende Verbindung oder Zusammensetzung. Der Analyt kann aus einem Element eines spezifischen Bindungspaars (sbp) bestehen und kann ein Ligand sein, der einwertig (monoepitopisch) oder mehrwertig (polyepitopisch), üblicherweise ein Antigen oder Hapten ist und eine einzelne Verbindung oder eine Mehrzahl von Verbindungen, die zumindest eine gemeinsame Epitop- oder Determinantenstelle aufweisen, ist. Der Analyt kann ein Teil einer Zelle, wie z. B. Bakterien, oder eine Zelle sein, die ein Blutgruppen-Antigen trägt, z. B. A, B, D usw., oder er kann ein HLA-Antigen oder ein Mikroorganismus sein, z. B. Bakterien, Pilze, Protozoen oder Viren.
  • Die mehrwertigen Ligandenanalyten sind normalerweise Poly(aminosäuren), d. h. Polypeptide und Proteine, Polysaccharide, Nucleinsäuren und Kombinationen davon. Solche Kombinationen sind z. B. Komponenten von Bakterien, Viren, Chromosomen, Genen, Mitochondrien, Kernen, Zellmembranen u. dgi.
  • In den meisten Fällen weisen die Polyepitop-Ligandenanalyten der Erfindung ein Molekulargewicht von zumindest etwa 5.000, noch häufiger von zumindest etwa 10.000, auf. In der Kategorie der Poly(aminosäuren) weisen die Poly(aminosäuren) von Interesse im Allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 5.000 bis 5.000.000, noch häufiger von üblicherweise etwa 20.000 bis 1.000.000, auf; unter den Hormonen von In- teresse reichen die Molekulargewichte üblicherweise von etwa 5.000 bis 60.000.
  • Eine Vielzahl von Proteinen kann als zugehörig zu einer Familie angesehen werden – einer Familie von Proteinen mit ähnlichen strukturellen Merkmalen, Proteinen mit bestimmten biologischen Funktionen, Proteinen, die mit spezifischen Mikroorganismen, besonders krankheitsverursachenden Mikroorganismen, in Verbindung stehen, usw. Solche Proteine sind z. B. Immunglobuline, Cytokine, Enzyme, Hormone, Krebsantigene, Nährstoffmarker, gewebespezifische Antigene usw.
  • Nachstehend werden Klassen strukturverwandter Proteine angeführt: Protamine, Histone, Albumine, Globuline, Skleroproteine, Phosphoproteine, Mucoproteine, Chromoproteine, Lipoproteine, Nucleoproteine, Glykoproteine, T-Zellen-Rezeptoren, Proteoglykane, HLA, unklassifizierte Proteine, z. B. Somatotropin, Prolactin, Insulin, Pepsin, Proteine im menschlichem Plasma, wie z. B. Blutgerinnungsfaktoren, andere polymere Materialien, wie z. B. Mucopolysaccharide und Polysaccharide, Mikroorganismen, wie z. B. Bakterien, Viren und Pilze.
  • Die Monoepitop-Ligandenanalyten besitzen im Allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 100 bis 2.000, noch häufiger von 125 bis 1.000. Zu den Analyten zählen Medikamente, Metaboliten, Pestizide, Schmutzstoffe u. dgl. Unter den Medikamenten von Interesse sind Akaloide, Steroide, Steroid-mimetische Substanzen, Lactame, Aminoalkylbenzole, Benzoheterozyklen, Purine, von Marihuana Abgeleitete, Hormone, Vitamine, Prostaglandine, trizyklische Antidepressiva, Anti-Neoplastika, Antibiotika, Nucleoside und Nucleotide, verschiedene individuelle Medikamente, z. B. Methadon, Meprobamat, Serotonin, Meperidin, Lidocain, Procainamid, Acetylprocainamid, Propranolol, Griseofulvin, Valproinsäure, Butyrophenone, Antihistamine, Chloramphenicol, anticholinergische Medikamente, z. B. Atropine, mit Krankheitszuständen assoziierte Metaboliten, z. B. Spermin, Galactose, Phenylbranztraubensäure und Typ-1-Porphyrin, Aminoglykoside, polyhalogenierte Biphenyle, Phosphatester, Thiophosphate, Carbamate, polyhalogenierte Sulfenamide.
  • Für Rezeptoranalyten reichen die Molekulargewichte im Allgemeinen von 10.000 bis 2 × 108, noch häufiger von 10.000 bis 106. Für Immunglobuline, IgA, IgG, IgE und IgM, reichen die Molekulargewichte im Allgemeinen von etwa 160.000 bis etwa 106. Enzyme besitzen normalerveise ein Molekulargewicht von etwa 10.000 bis 1.000.000. Natürliche Rezeptoren können in Bezug auf das Molekulargewicht stark variieren – im Allgemeinen von zumindest etwa 25.000 bis zu 106 oder mehr; dazu zählen Materialien wie Avidin, DNA, RNA, Thyroxin-Bindungsglobulin, Thyroxin-bin- dendes Präalbumin, Transcortin usw.
  • Der Ausdruck „Analyt" umfasst überdies Polynucleotid-Analyten wie die unten definierten Polynucleotide. Dazu zählen m-RNA, r-RNa, t-RNA, DNA, DNA-RNA-Duplexe usw. Der Ausdruck Analyt umfasst auch Rezeptoren, die Polynucleotid-Bindungsmittel sind, z. B. Restriktionsenzyme, Aktivatoren, Repressoren, Nuclease, Polymerasen, Histone, Reparaturenzyme, Chemotherapeutika u. dgl.
  • Der Analyt kann ein direkt in einer Probe gefundenes Molekül sein, z. B. eine Körperflüssigkeit aus einem Wirt. Die Probe kann direkt untersucht oder vorbehandelt werden, um den Analyten leichter detektierbar zu machen. Außerdem kann der Analyt von Interesse bestimmt werden, indem ein Mittel detektiert wird, das den Anayten von Interesse nachweist, z. B. ein sbp-Element, das komplementär zum Analyten von Interesse ist, dessen Gegenwart nur dann detektiert wird, wenn der Analyt von Interesse in einer Probe vorhanden ist. Somit wird das den Analyten nachweisende Mittel zum in einem Assay detektierten Analyten. Die Körperflüssigkeit kann z. B. Harn, Blut, Plasma, Serum, Speichel, Sperma, Kot, Sputum, Rückenmarksflüssigkeit, Tränenflüssigkeit, Schleim und dergleichen sein.
  • Element eines spezifischen Bindungspaars („sbp-Element"): Eines von zwei unterschiedlichen Molekülen mit einem Bereich auf der Oberfläche oder in einem Hohlraum, der sich spezifisch an eine bestimmte räumliche und polare Struktur des anderen Moleküls bindet und dadurch als komplementär dazu definiert ist. Die sbp-Elemente werden als Ligand und Rezeptor (Anti-Ligand) bezeichnet. Sie sind üblicherweise Elemente eines immunologischen Paars, wie z. B. Antigen-Antikörper, obwohl andere spezifische Bindungspaare, wie z. B. Biotin-Avidin, Hormon-Hormon-Rezeptoren, Nucleinsäure-Duplexe, IgG-Protein A, Polynucletid-Paare, wie z. B. DNA-DNA, DNA-RNA u. dgl., nicht immunologische Paare sind, aber gemäß vorliegender Erfindung und in der Definition von sbp-Element enthalten sind.
  • Polynucleotid: Eine Verbindung oder Zusammensetzung, die ein polymeres Nucleotid mit (im natürlichen Zustand) etwa 50 bis 500.000 oder mehr Nucleotiden und (im isolierten Zustand) etwa 15 bis 50.000 oder mehr Nucleotiden, üblicherweise mit etwa 15 bis 20.000 Nucleotiden, noch häufiger mit 15 bis 10.000 Nucleotiden. Das Polynucleotid enthält Nucleinsäuren aus jeder beliebigen Quelle in gereinigter oder ungereinigter Form, in der Natur vorkommend oder synthetisch produziert, z. B. DNA (dsDNA und ssDNA) und RNA, üblicherweise DNA; Beispiele sind t-RNA, m-RNA, r-RNA, Mitochondrien-DNA und -RNA, Chloroplasten-DNA und -RNA, DNA-RNA-Hy bride oder Gemische davon, Gene, Chromosomen, Plasmide, Genome von biologischem Material, wie z. B. Mikroorganismen, beispielsweise aus Bakterien, Hefen, Viren, Viroiden, Schimmelpilzen, Pilzen, Pflanzen, Tieren, Menschen, und Fragmente davon und dergleichen.
  • Ligand: Jede organische Verbindung, für die ein Rezeptor natürlich vorkommt oder hergestellt werden kann.
  • Ligandenanalog: Ein modifizierter Lignd, ein organischer Rest oder Analytenanalog, üblicherweise mit einem Molekulargewicht von über 100, der mit dem analogen Liganden um einen Rezeptor konkurrieren kann, wobei die Modifikation ein Mittel bereitstellt, um ein Ligandenanalog mit einem anderen Molekül zu verbinden. Das Ligandenanalog unterscheidet sich vom Liganden üblicherweise um mehr als eine Substitution eines Wasserstoffs durch eine Bindung, die das Ligandenanalog mit einem Hub oder Marker verbindet, was aber nicht der Fall sein muss. Das Ligandenanalog kann sich in ähnlicher Weise wie der Ligand an den Rezeptor binden. Das Analog könnte beispielsweise ein Antikörper sein, der gegen den Idiotyp eines Antikörpers gegen den Liganden gebildet ist.
  • Rezeptor („Antiligand"): Jede Verbindung oder Zusammensetzung, die eine bestimmte räumliche und polare Struktur eines Moleküls erkennen kann, wie z. B. eine Epitop- oder Determinantenstelle. Beispiele für Rezeptoren sind natürlich vorkommende Rezeptoren, z. B. Thyroxin-Bindungsglobulin, Antikörper, Enzyme, Fab-Fragmente, Lectine, Nucleinsäuren, Protein A, Komplementkomponente C1q und dergleichen.
  • Spezifische Bindung: Eines von zwei unterschiedlichen Molekülen erkennt spezifisch das andere (im Vergleich zu deutlich verringerter Erkennung anderer Moleküle). Im Allgemeinen besitzen die Moleküle Bereiche auf ihren Oberflächen oder in Hohlräumen, die zu spezifischer Erkennung zwischen den zwei Molekülen führen. Beispiele für spezifische Bindung sind Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen, Enzym-Substrat-Wechselwirkungen, Polynucleotid-Wechselwirkungen usw.
  • Nichtspezifische Bindung: Nichtkovalente Bindung zwischen Molekülen, die relativ unabhängig von spezifischen Oberflächenstrukturen ist. Nichtspezifische Bindung kann das Ergebnis mehrerer Faktoren sein, wie z. B. der hydrophoben Wechselwirkungen zwischen Molekülen.
  • Antikörper: Ein Immunglobulin, das sich spezifisch an eine bestimmte räumliche und polare Struktur eines weiteren Moleküls bindet und dadurch als komplementär dazu definiert ist. Der Antikörper kann monoklonal oder polyklonal sein und durch auf dem Gebiet der Erfindung bekannte Verfahren hergestellt werden, z. B. durch Immunisierung eines Wirts und Sammeln von Seren (polyklonal), durch Produktion kontinuierlicher Hybrid-Zelllinien und Sammeln des sekretierten Proteins (monoklonal) oder durch Klonieren und Exprimieren von Nucleotidsequenzen oder von deren mutagenisierten Versionen, die zumindest für die Aminosäuresequenzen kodieren, die für die spezifische Bindung natürlicher Antikörper erforderlich sind. Antikörper können ein komplettes Immunglobulin oder ein Fragment davon umfassen, welche Immunglobuline die verschiedenen Klassen und Isotypen umfassen, IgA, IgD, IgE, IgG1, IgG2a und IgG3, IgM usw. Fragmente davon sind z. B. Fab, Fv und F(ab'), Fb' u. dgl. Außerdem kommen gegebenenfalls Aggregate, Polymere und Konjugate von Immunglobulinen oder ihren Fragmenten in Frage, sofern die Bindungsaffinität für ein bestimmtes Molekül aufrechterhalten wird.
  • Ein Substituent mit 1 bis 50 Atomen (mit Ausnahme der erforderlichen Wasserstoffatome, die zur Erfüllung der Wertigkeiten solcher Atome notwendig sind), welche Atome unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus Kohlenstoff, Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel und Phosphor ausgewählt sind: Ein organischer Rest. Der organische Rest besitzt 1 bis 50 Atome, abgesehen von der erforderlichen Anzahl an Wasserstoftatomen, die zur Erfüllung der Wertigkeiten der Atome im Rest notwendig sind. Im Allgemeinen ist das vorherrschende Atom Kohlenstoff (C), es kann aber auch Sauerstoff (0), Stickstoff (N), Schwefel (S), Phosphor (P) sein, worin 0, N, S oder P – falls sie vorhanden sind – an Kohlenstoff oder an eines oder mehrere voneinander, an Wasserstoff oder an ein Metallatom gebunden sind, um verschiedene funktionelle Gruppen zu bilden, z. B. Carbonsäuren, Alkohole, Thiole, Carboxamide, Carbamate, Carbonsäureester, Sulfonsäureester, Phosphorsäuren, Phosphosäureester, Harnstoffe, Carbamate, Phosphoramide, Sulfonamide, Ether, Sulfide, Thioether, Olefine, Acetylene, Amine, Ketone, Aldehyde, Nitrile und dergleichen. Veranschaulichende Beispiele für solche organischen Reste oder Gruppen sind u. a. Alkyl, Alkylidin, Aryl, Aralkyl und Alkyl, Aryl und Aralkyl, substituiert mit einer oder mehreren der oben erwähnten Funktionalitäten.
  • Linkergruppe: Die kovalente Bindung zwischen Molekülen. Die Linkergruppe hängt von der Beschaffenheit der gebundenen Moleküle ab, d. h. vom Photosensibilisator, der chemolumineszierenden Verbindung, dem sbp-Element oder einem Molekül, das mit einem Teilchen assoziiert ist oder einen Teil davon bildet. Funktionelle Gruppen, die auf einem Photosensibilisator oder einer chemolumineszierenden Verbindung normalerweise vorhanden sind oder eingeführt werden, dienen dazu, diese Materialien an ein sbp-Element oder ein Teilchen, wie z. B. ein Latexteilchen, zu binden.
  • In den meisten Fällen werden Carbonylfunktionalitäten verwendet, sowohl Oxocarbonyl, z. B. Aldehyd, als auch Nicht-Oxocarbonyl (einschließlich Stickstoff- und Schwefelanalogen), z. B. Carboxy, Amidin, Amidat, Thiocarboxy und Thionocarboxy.
  • Alternative Funktionalitäten zu Oxo sind aktives Halogen, Diazo, Mercapto, Olefin, insbesondere aktiviertes Olefin, Amino, Phosphoro und dergleichen. Eine Beschreibung von Linkergruppen findet sich in US-Patent 3.817.837, das hierin durch Verweis aufgenommen ist.
  • Gemeinsame Funktionalitäten bei der Bildung einer kovalenten Bindung zwischen der Linkergruppe und dem zu konjugierenden Molekül sind Alkylamin, Amidin, Thioamid, Ether, Harnstoff, Thioharnstoff, Guanidin, Azo, Thioether, Carboxylat, Sulfonat sowie Phosphatester, Amide und Thioester.
  • In den meisten Fällen besitzen der Photosensibilisator und die chemolumineszierende Verbindung eine Nicht-Oxocarbonylgruppe, umfassend Stickstoff- und Schwefelanaloge, eine Phosphatgruppe, eine Aminogruppe, Alkylierungsmittel, wie z. B. Halo- oder Tosylalkyl, Oxy (Hydroxyl oder das Schwefelanalog Mercapto), Oxocarbonyl (z. B. Aldehyd oder Keton) oder aktives Olefin wie etwa ein Vinylsulfon oder α,β-ungesättigter Ester. Diese Funktionalitäten sind an Aminogruppen, Carboxylgruppen, aktive Olefine, Alkylierungsmittel, z. B. Bromacetyl, gebunden. Wenn ein Amin und Carbonsäure oder das Stickstoffderivat davon oder Phosphorsäure verbunden werden, entstehen Amide, Amidine und Phophoramide. Wenn Mercaptan und aktiviertes Olefin verbunden werden, entstehen Thioether. Wenn Aldehyd und ein Amid unter reduzierenden Bedingungen verbunden werden, entsteht ein Alkylamin. Wenn eine Carbonsäure oder Phosphatsäure und ein Alkohol verbunden werden, entstehen Ester.
  • Photosensibilisator: Ein Sensibilisator für die Erzeugung von Singulett-Sauerstoff, üblicherweise durch Anregung mit Licht. Der Photosensibilisator kann photoaktivierbar sein (z. B. Farbstoffe und aromatische Verbindungen) oder chemisch aktiviert werden (z. B. Enzyme und Metallsalze). Wenn die Anregung durch Licht erfolgt, ist der Photosensibilisator üblicherweise eine Verbindung, die aus kovalent gebundenen Atomen besteht, wobei üblicherweise auch mehrere konjugierte Doppel- oder Dreifachbindungen vorhanden sind. Die Verbindung sollte Licht im Wellenlängenbereich von 200 – 1100 nm, üblicherweise 300 – 1000 nm, vorzugsweise 450 – 950 nm, absorbieren, wobei der Extinktionskoeffizient an ihrem Extinktionsmaximum bei der Anregungswellenlänge mehr als 500 M–1cm–1, vorzugsweise zumindest 5000 M–1cm–1, noch bevorzugter zumindest 50.000 M–1cm–1, beträgt. Die Lebensdauer eines nach Lichtabsorption in Abwesenheit von Sauerstoff erzeugten angeregten Zustands beträgt üblicherweise zumindest 100 ns, vorzugsweise zumindest 1 ms. Im Allgemeinen muss die Lebensdauer ausreichend lang sein, um Energietransfer zu Sauerstoff zu ermöglichen, der normalerweise – je nach Medium – in Konzentrationen im Bereich von 10–5 bis 10–3 M vorhanden ist. Der angeregte Zustand des Sensibilisators weist üblicherweise eine andere Spin-Quantenzahl (S) als der Grundzustand auf und ist üblicherweise ein Triplett (S = 1), wenn – wie dies üblicherweise der Fall ist – der Grundzustand ein Singulett (S = 0) ist. Vorzugsweise besitzt der Sensibilisator eine hohe Zwischensystemübergangsausbeute. Die Lichtanregung eines Sensibilisators führt zum langlebigeren Zustand (üblicherweise Triplett, wobei der Wirkungsgrad zumindest 10%, günstigerweise zumindest 40%, vorzugsweise mehr als 80% beträgt. Der Photosensibilisator ist üblicherweise unter den Testbedingungen zumindest schwach fluoreszierend (Quantenausbeute üblicherweise weniger als 0,5, vorzugsweise weniger als 0,1).
  • Photosensibilisatoren, die durch Licht anzuregen sind, sind relativ photostabil und reagieren nicht wirkungsvoll mit Singulett-Sauerstoff. Mehrere strukturelle Merkmale sind in den meisten nützlichen Sensibilisatoren vorhanden. Die meisten Sensibilisatoren besitzen zumindest eine und häufig drei oder mehr konjugierte Doppel- oder Dreifachbindungen, die in einer starren und oft aromatischen Struktur gebunden sind. Sie enthalten häufig zumindest eine Gruppe, die Zwischensystemübergang beschleunigt, z. B. eine Carbonyl- oder Iminogruppe, oder ein schweres Atom, das aus den Reihen 3–6 des Periodensystems ausgewählt ist, insbesondere Iod oder Brom, oder sie sie können erweiterte aromatische Strukturen sein. Typische Sensibilisatoren sind z. B. Aceton, Benzophenon, 9-Thioxanthon, Eosin, 9,10-Dibromanthracen, Methylenblau, Metalloporphyrine, z. B. Hämatoporphyrin, Phthalocyanine, Chlorophyile, Diodeosin, Buckminsterfulleren usw. sowie Derivate dieser Verbindungen mit Substituenten aus 1 bis 50 Atomen, um solche Verbindungen lipophiler oder hydrophiler zu machen, und/oder als Bindungsgruppen, beispielsweise zur Bindung an ein sbp-Element. Beispiele für andere hierin geeignete Photosensibilisatoren sind jene, die die obigen Eigenschaften aufweisen und in N. J. Turro, „Molecular Photochemistry", S. 132, W. A. Benjamin Inc., N. Y., USA, 1965 aufgelistet sind.
  • Die Photosensibilisatoren sind vorzugsweise relativ unpolar, um das Lösen in lipophilem Medium zu gewährleisten, wenn der Photosensibilisator in ein Öltröpfchen, Liposom, Latexteilchen usw. inkorporiert wird.
  • Die hierin geeigneten Photosensibilisatoren umfassen auch andere Substanzen und Zusammensetzungen, die Singulett-Sauerstoff mit oder – was weniger bevorzugt ist – ohne Aktivierung durch eine externe Lichtquelle erzeugen können. So wurde gezeigt, dass z. B. Molybdat- (MoO4 - ) Salze und Chlorperoxidase sowie Myeloperoxidase plus Bromid- oder Chloridionen (Kanofsky, J. Biol. Chem. 259, 5596 (1983)) die Umwandlung von Wasserstoffperoxid in Singulett-Sauerstoff und Wasser katalysiert. Beide dieser Zusammensetzungen können beispielsweise in Teilchen enthalten sein, an die ein sbp-Element gebunden ist, und im Assayverfahren verwendet werden, in dem Wasserstoffperoxid als Zusatzreagens vorgesehen ist, Chlorperoxidase an eine Oberfläche gebunden wird und Molybdat in die wässrige Phase eines Liposoms inkorporiert wird. Im Schutzbereich der Erfindung sind als Photosensibilisatoren auch Verbindungen enthalten, die keine echten Sensibilisatoren sind, jedoch bei Aktivierung durch Wärme, Licht oder chemische Aktivierung ein Molekül Singulett-Sauerstoff freisetzen. Die bekanntesten Elemente dieser Klasse von Verbindungen sind Endoperoxide, wie z. B. 1,4-Biscarboxyethyl-1,4-naphthalin-endoperoxid, 9,10-Diphenylanthracen-9,10-endoperoxid und 5,6,11,12-Tetraphenylnaphthalin-5,12-endoperoxid. Erwärmung oder direkte Lichtabsorption durch diese Verbindungen setzt Singulett-Sauerstoff frei.
  • Träger oder Oberfläche: Eine Oberfläche, die aus einem porösen oder nichtporösen wasserunlöslichen Material besteht. Die Oberfläche kann jede beliebige Form aufweisen (Streifen, Stab, Teilchen, z. B. Perle, und dergleichen). Die Oberfläche kann hydrophil sein oder hydrophil gemacht werden; Beispiele sind anorganische Pulver, wie z. B. Kieselsäure, Magnesiumsulfat und Aluminiumoxid; natürliche polymere Materialien, insbesondere Cellulosematerialien und von Cellulose abgeleitete Materialien, etwa faserhältige Papiere, wie z. B. Filterpapier, Chromatographiepapier usw.; synthetische oder modifizierte natürlich vorkommende Polymere, wie z. B. Nitrocellulose, Celluloseacetat, Pol(vinylchlorid), Polyacrylamid, vernetztes Dextran, Agarose, Polyacrylat, Polyethylen, Polypropylen, Poly(4-methylbuten), Polystyrol, Polymethacrylat, Poly(ethylenterephthalat), Nylon, Poly(vinylbutyrat) usw.; entweder alleine oder zusammen mit anderen Materialien verwendet; als Bioglas erhältliches Glas, Keramikmaterialien, Metalle und dergleichen. Natürliche oder synthetische Strukturen wie z. B. Liposomen, Phospholipidvesikel und Zellen, kommen ebenfalls in Frage.
  • Die Bindung von sbp-Elementen an den Träger oder die Oberfläche kann durch allgemein bekannte Techniken erfolgen; diese sind in der Literatur ausgiebig beschrieben. Siehe z. B. „Immobilized Enzymes", Ichiro Chibata, Halsted Press, New York (1978) und Cuatrecasas, J. Biol. Chem. 245, 3059 (1970).
  • Teilchen: Teilchen mit einem Durchmesser von zumindest etwa 20 nm und höchstens etwa 20 μm, üblicherweise zumindest etwa 40 nm und weniger als etwa 10 μm, vorzugsweise von etwa 0,10 bis 2 μm, normalenweise mit einem Volumen von weniger als 1 Picoliter. Das Teilchen kann organisch oder anorganisch, quellfähig oder nicht quellfähig, porös oder nicht porös sein, eine Dichte (vorzugsweise eine an Wasser heranreichende Dichte) von im Allgemeinen etwa 0,7 bis etwa 1,5 g/l aufweisen, vorzugsweise in Wasser suspendierbar sein und aus einem Material bestehen, das lichtdurchlässig, teilweise lichtdurchlässig oder lichtundurchlässig sein kann. Die Teilchen können eine Ladung aufweisen oder nicht, und wenn sie geladen sind, sind sie vorzugsweise negativ. Die Teilchen können in folgenden Formen vorliegen: fest (z. B. Polymer, Metall, Glas, organisch und anorganisch, wie z. B. Mineralien, Salze und Diatomeen), Öltröpfchen (z. B. Kohlenwasserstoff, Fluorkohlenstoff, flüssiges Silikon) oder Vesikel (z. B. synthetisch wie etwa Phospholipid oder natürlich wie etwa Zellen und Organellen). Die Teilchen können Folgendes sein: Latexteilchen oder an dere Teichen, die aus organischen oder anorganischen Polymeren bestehen; Lipid-Doppelschichten, z. B. Liposomen, Phospholipidvesikel; Öltröpfchen; Silikonteilchen; Metallsole; Zellen; und Farbstoffkristallite.
  • Die organischen Teilchen sind normalerweise Polymere (entweder Additions- oder Kondensationspolymere), die im Testmedium leicht dispergierbar sind. Die organischen Teilchen sind auch adsorptionsfähig oder funktionalisierbar, um an ihre Oberfläche (entweder direkt oder indirekt) ein sbp-Element zu binden und einen Photosensibilisator oder eine chemolumineszierende Verbindung an ihre Oberfläche zu binden oder in ihr Volumen zu inkorporieren.
  • Die Teilchen können aus natürlich vorkommenden Materialien, natürlich vorkommenden Materialien, die synthetisch modifiziert sind, und synthetischen Materialien abgeleitet sein. Natürliche oder synthetische Strukturen wie etwa Lipiddoppelschichten, z. B. Liposomen und Nicht-Phospholipidvesikel, sind vorzuziehen. Unter organischen Polymeren von besonderem Interesse sind Polysaccharide, insbesondere vernetzte Polysaccharide wie etwa Agarose, die als Sepharose erhältlich ist, Dextran, das als Sephadex und Sephacryl erhältlich ist, Cellulose, Stärke und dergleichen; Additionspolymere, z. B. Polystyrol, Polyacrylamid, Homopolymere und Copolymere von Derivaten von Acrylat und Methacrylat, insbesondere Estern und Amiden mit freien Hydroxyl-Funktionalitäten, wie z. B. Hydrogele und dergleichen. Anorganische Polymere sind z. B. Silikone, Glase (als Bioglas erhältlich) und dergleichen. Sole umfassen z. B. Gold, Selen und andere Metalle. Teilchen können auch dispergierte wasserunlösliche Farbstoffe, wie z. B. Porphyrine, Phthalocyanine usw., sein, die auch als Photosensibilisatoren dienen können. Zu Teilchen zählen auch Diatomeen, Zellen, virale Teilchen, Magnetosomen, Zellkerne und dergleichen.
  • Wenn die Teilchen im Handel erhältlich sind, kann die Teilchengröße variiert erden, indem größere Teilchen mechanisch wie z. B. durch Mahlen, Ultraschallbehandlung, Schütteln usw. in kleinere Teilchen aufgebrochen werden.
  • Die Teilchen sind üblicherweise polyfunktionell, oder sie können polyfunktionalisiert oder an ein sbp-Element, einen Photosensibilisator oder eine chemolumineszierende Verbindung durch spezifische oder nichtspezifische kovalente oder nichtkovalente Wechselwirkungen gebunden werden. Eine Vielzahl funktioneller Gruppen steht zur Verfügung und kann inkorporiert werden. Beispiele für funktionelle Gruppen sind Carbonsäuren, Aldehyde, Aminogruppen, Cyanogrouppen, Ethylengruppen, Hydroxylgruppen, Mercaptogruppen und dergleichen. Wenn kovalente Bindung eines sbp-Elements, einer chemolumineszierenden Verbindung oder eines Photosensibilisators an das Teilchen vorliegt, ist die Art der Bindung allgemein bekannt und in der Literatur ausführlich beschrieben. Siehe z. B. Cautrecasas, J. Biol. Chem. 245, 3059 (1970). Die Länge einer Linkergruppe kann je nach Beschaffenheit der gebundenen Verbindung, je nach der Beschaffenheit des Teilchens, je nach der Auswirkung der Entfernung zwischen der gebundenen Verbindung und dem Teilchen auf die Bindung von sbp-Elementen und den Analyten und dergleichen stark variieren.
  • Der Photosensibilisator kann so ausgewählt werden, dass er sich in der Oberfläche der Teilchen löst oder sich nichtkovalent an die Oberfläche bindet. In diesem Fall sind diese Verbindungen vorzugsweise hydrophob, um ihre Fähigkeit zu verringern, vom Teilchen zu dissoziieren und dadurch zu bewirken, dass beide Verbindungen an dasselbe Teilchen assoziieren.
  • Die Anzahl an Photosensibilisator- und Chemolumineszenz-Molekülen, die mit jedem Teilchen assoziiert sind, ist im Durchschnitt üblicherweise zumindest eins und kann ausreichend hoch sein, damit das Teilchen zur Gänze aus Photosensibilisator- und Chemolumineszenz-Molekülen besteht. Die bevorzugte Anzahl an Molekülen wird empirisch so bestimmt, dass im Test das stärkste Signal gegenüber dem Hintergrund erhalten wird. In einigen Fällen wird dies am besten erreicht, indem eine Vielzahl unterschiedlicher Photosensibilisator-Moleküle mit Teilchen assoziiert wird. Üblicherweise sollte das Verhältnis zwischen Photosensibilisator oder chemolumineszieren der Verbindung und sbp-Element in den Teilchen zumindest 1, vorzugsweise zumindest 100 : 1, noch bevorzugter über 1000 : 1, betragen.
  • Latexteilchen: „Latex" bezieht sich hierin auf ein teilchenförmiges, in Wasser suspendierbares, in Wasser unlösliches Polymermaterial, das üblicherweise einen Teilchendurchmesser von 20 nm bis 20 mm, noch bevorzugter 100 bis 1000 nm, aufweist. Der Latex ist häufig ein substituiertes Polyethylen wie etwa Polystyrol-Butadien-, Polyacrylamid-Polystyrol-, Polystyrol-Aminosäure-, Polyacrylsäure-, Polymethacrylsäure-, Acrylnitril-Butadien-, Styrol-Copolymere, Polyvinylacetat-Acrylat-, Polyvinylpyridin, Vinylchlorid-Acrylat-Copolymere und dergleichen. Nichtvernetzte Polymere von Styrol und carboxyliertem Styrol oder mit anderen aktiven Gruppen, wie z. B. Amino, Hydroxyl, Halogen und dergleichen, funktionalisiertem Styrol sind vorzuziehen. Häufig werden Copolymere substituierter Styrole mit Dienen, wie z. B. Butadien, verwendet.
  • Die Assoziation des Photosensibilisators oder der chemolumineszierenden Verbindung mit Latexteilchen, wie dies hierin geoffenbart ist, kann die Inkorporation während der Bildung der Teilchen durch Polymerisation umfassen; üblicherweise sieht sie aber die Inkorporation in vorgeformten Teilchen vor, üblicherweise durch nichtkovalentes Lösen in den Teilchen. Üblicherweise wird eine Lösung der chemolumineszierenden Verbindung oder des Sensibilisators verwendet. Geeignete Lösungsmittel sind Alkohole, z. B. Ethanol, Ethylenglykol und Benzylalkohol; Amide, wie z. B. Dimethylformamid, Formamid, Acetamid und Tetraethylharnstoff und dergleichen; Sulfoxide, wie z. B. Dimethylsulfoxid und Sulfolan; und Ether, wie z. B. Carbitol, Ethylcarbitol, Dimethoxyethan und dergleichen; sowie Wasser. Die Verwendung von Lösungsmitteln mit hohen Siedepunkten, in denen die Teilchen unlöslich sind, ermöglicht den Einsatz hoher Temperaturen, um so das Lösen der Verbindungen in den Teilchen zu vereinfachen, und ist besonders geeignet. Die Lösungsmittel können einzeln oder in Kombination verwendet werden. Besonders bevorzugte Lösungsmittel zur Inkorporation von Photosensibilisator sind jene, die den angeregten Triplett- Zustand des Photosensibilisators nicht quenchen – entweder infolge ihrer eigenen inhärenten Eigenschaften, oder da sie anschließend aus den Teilchen entfernt werden können (aufgrund ihrer Fähigkeit, in einem Lösungsmittel wie etwa Wasser gelöst zu werden, das in den Teilchen unlöslich ist). Aromatische Lösungsmittel sind vorzuziehen; ebenso wie Lösungsmittel, die im Teilchen löslich sind. Für die Inkorporation von chemolumineszierenden Verbindungen in Teilchen sollte ein Lösungsmittel gewählt werden, das die Lumineszenz nicht stört (aufgrund ihrer inhärenten Eigenschaften oder ihrer Fähigkeit, aus den Teilchen entfernt zu werden). Häufig sind auch, aromatische Lösungsmittel vorzuziehen. Typische aromatische Lösungsmittel sind Dibutylphthalat, Benzonitril, Naphthonitril, Dioctylterephthalat, Dichlorbenzol, Diphenylether, Dimethoxybenzol usw.
  • Außer, wenn die chemolumineszierende Verbindung oder der Photosensibilisator kovalent an die Teilchen gebunden werden soll, ist es üblicherweise vorzuziehen, elektronisch neutrale Photosensibilisatoren oder chemolumineszierende Verbindungen zu verwenden. Es ist vorzuziehen, dass das ausgewählte flüssige Medium die Polymerperlen nicht bis zur Klebrigkeit erweicht. Eine bevorzugte Technik umfasst das Suspendieren der ausgewählten Latexteilchen in einem flüssigen Medium, in dem der Photosensibilisator oder die chemolumineszierende Verbindung zumindest eingeschränkte Löslichkeit aufweist. Vorzugsweise werden die Konzentrationen des Photosensibilisators und der chemolumineszierenden Verbindung in den flüssigen Medien, ausgewählt, um Teilchen bereitzustellen, die den höchsten Wirkungsgrad der Bildung von Singulett-Sauerstoff und die höchste Quantenausbeute der Emission aus der chemolumineszierenden Verbindung in den Medien aufweisen; weniger konzentrierte Lösungen sind aber manchmal vorzuziehen. Verformung oder Auflösung der Teilchen im Lösungsmittel kann durch Zugabe eines mischbaren Co-Lösungsmittels, in dem die Teilchen unlöslich sind, verhindert werden.
  • Im Allgemeinen wird die Temperatur während des Verfahrens so gewählt, dass die die Fähigkeit der mit Photosensibilisator markierten Teilchen zur Bildung von Singu lett-Sauerstoff und die Quantenausbeute der Teilchen der chemolumineszierenden Verbindung maximiert wird, mit der Maßgabe, dass die Teilchen bei der ausgewählten Temperatur nicht schmelzen oder aggregieren sollten. Es herrschen normalerweise höhere Temperaturen. Die Temperatur für das Verfahren reicht im Allgemeinen von 20°C bis 200°C, noch üblicher von 50°C bis 170°C. Es wurde beobachtet, dass einige Verbindungen, die bei Raumtemperatur fast unlöslich sind, z. B. bei erhöhten Temperaturen in niedermolekularen Alkoholen, wie z. B. Ethanol und Ethylenglykol und dergleichen, löslich sind. Es wurde aufgezeigt, dass carboxylierte modifizierte Latexteilchen niedermolekulare Alkohole bei derartigen Temperaturen tolerieren.
  • Ein sbp-Element kann physikalisch auf die Oberfläche des Latexteilchens adsorbiert oder kovalent an das Teilchen gebunden werden. In Fällen, in denen ein sbp-Element nur schwach an die Oberfläche des Latexteilchens gebunden ist, kann die Bindung manchmal den Scherkräften zwischen Teilchen, die während der Inkubation und den Waschgängen auftreten, nicht standhalten. Daher kann es vorzuziehen sein, sbp-Elemente unter Bedingungen an die Latexteilchen zu binden, die Adsorption minimieren. Dies kann erfolgen, indem die Oberfläche des Latex chemisch aktiviert wird. Beispielsweise kann der N-Hydroxysuccinimidester von Oberflächen-Carboxylgruppen gebildet werden, und es werden dann die aktivierten Teilchen zur Reduktion nichtspezifischer Bindung der Assaykomponenten an der Teilchenoberfläche mit einem Linker mit Aminogruppen in Kontakt gebracht, die mit den Estergruppen oder direkt mit einem sbp-Element reagieren, das eine Aminogruppe besitzt. Der Linker wird üblicherweise so gewählt, dass die nichtspezifische Bindung von Testkomponenten an der Teilchenoberfläche reduziert wird, und bietet vorzugsweise geeignete Funktionalität sowohl für die Bindung an das Latexteilchen als auch für die Bindung des sbp-Elements. Zweckmäßige Materialien sind maleimidiertes Aminodextran (MAD), Polylysin, Aminosaccharide und dergleichen. MAD kann nach dem Verfahren von Hubert et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 75(7), 3143 (1978) hergestellt werden.
  • In einem Verfahren wird MAD zunächst an Carboxyl-enthaltende Latexteilchen unter Einsatz eines wasserlöslichen Carbodiimids, wie z. B. 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid, gebunden. Die beschichteten Teilchen werden dann in Reagenzien äquilibriert, um nichtspezifische Bindung zu verhindern. Zu solchen Reagenzien zählen Proteine, wie z. B. Rinder-γ-Globulin (BGG), und Detergenzien, wie z. B. Tween 20, TRITON X-100 und dergleichen. Ein sbp-Element mit einer Sulfhydrylgruppe oder ein in geeigneter Weise modifiziertes, um eine Sulfhydrylgruppe einzuführen, wird dann der Suspension der Teilchen zugesetzt, woraufhin eine kovalente Bindung zwischen dem sbp-Element und dem MAD auf den Teilchen entsteht. Jegliches überschüssiges nichtumgesetztes sbp-Element kann dann durch Waschen entfernt werden.
  • Das bekannte Dioxen (Verbindung 9) und die Verbindung der Erfindung (Verbindung 11) sind in der folgenden Abbildung unter Bezugnahme auf die folgende Struktur dargestellt:
    Figure 00330001
    Figure 00340001
  • Die vorliegenden chemolumineszierenden Verbindungen erfahren chemische Reaktion mit Singulett-Sauerstoff, um ein metastabiles Zwischenprodukt zu bilden, das sich unter gleichzeitiger oder nachfolgender Aussendung von Licht im Wellenlängenbereich von 250 bis 1200 nm zersetzen kann. Vorzugsweise zersetzt sich das Zwischenprodukt spontan ohne Erwärmung oder Zugabe zusätzlicher Reagenzien nach seiner Bildung. Die Zugabe eines Reagens nach der Bildung des Zwischenprodukts oder das Vorherrschen erhöhter Temperaturen zur Beschleunigung der Zersetzung ist allerdings für einige chemolumineszierende Verbindungen erforderlich. Die chemolumineszierenden Verbindungen sind Elektronen-reiche Verbindungen, die mit Singulett-Sauerstoff reagieren, häufig unter Bildung von Dioxetanen oder Dioxetanonen, wie sie beispielsweise durch die nachstehende Struktur dargestellt sind, worin die Substituenten auf den Kohlenstoff- (C-) Atomen jene sind, die auf dem entsprechenden Olefin vorhanden sind:
    Figure 00340002
    von denen sich einige spontan zersetzen, andere wiederum durch Erwärmen und/ oder durch Katalyse, üblicherweise durch einen Elektronen-reichen Energieakzeptor, unter Aussendung von Licht. In einigen Fällen wird das Dioxetan spontan in ein Hydroperoxid umgewandelt, woraufhin basischer pH-Wert das Dioxetan neu bilden und die Zersetzung und Lichtaussendung ermöglichen muss.
  • Die chemolumineszierenden Verbindungen von Interesse emittieren im Allgemeinen bei Wellenlängen von über 300 nm und üblicherweise über 400 nm. Verbindungen, die alleine oder gemeinsam mit einem fluoreszierenden Molekül Licht mit Wellenlängen außerhalb des Bereichs emittieren, in denen Serumkomponenten Licht absorbieren, sind hierin von besonderem Interesse. Die Fluoreszenz von Serum fällt oberhalb von 500 nm rasch ab und wird oberhalb von 550 nm relativ insignifikant. Wenn sich daher der Analyt in Serum befindet, sind chemolumineszierende Verbindungen, die Licht über 550 nm, vorzugsweise über 600 nm, aussenden, von besonderem Interesse. Um Autosensibilisierung der chemolumineszierenden Verbindung zu vermeiden, ist es vorzuziehen, dass die chemolumineszierenden Verbindungen kein Licht absorbieren, das zur Anregung des Photosensibilisators dient. Da es im Allgemeinen vorzuziehen ist, den Sensibilisator mit Wellenlängen von mehr als 500 nm anzuregen, ist es daher wünschenswert, dass die Lichtabsorption durch die chemolumineszierende Verbindung über 500 nm sehr niedrig ist.
  • Die chemolumineszierenden Verbindungen der Erfindung können in unterschiedlicher Weise hergestellt werden. In eine Verfahren wird ein 2-Thioethanolderivat mit einem geeigneten Diaryl-substituierten α-Hydroxyketon (substituiertes Benzoin) kondensiert, worin ein Aryl auf dem Ketonkohlenstoff und das andere auf dem die α-Hydroxygruppe enthaltenden Kohlenstoff substituiert ist. Die Kondensationsreaktion liefert den geeigneten Enolether direkt. Die Kondensation kann in einem inerten Lösungsmittel, wie z. B. Toluol, stattfinden. Üblicherweise beträgt die Reaktionstemperatur etwa 90°C bis 130°C, und die Reaktion dauert 5–50 Stunden. Im Allgemeinen erfolgt die Reaktion bei der Rückflusstemperatur der kombinierten Reagenzien.
  • Die Kondensation findet in Gegenwart einer Lewis-Säure, wie z. B. Acylchlorid, Silylchlorid, Zinn(II)-chlorid usw., statt. Das folgende Reaktionsschema ist eine Veranschaulichung des oben beschriebenen Verfahrens für die Herstellung der endungsgemäßen chemolumineszierenden Verbindung:
  • Figure 00360001
  • Zusatzmaterialien: Es werden im Test gemäß der Erfindung häufig verschiedene Zusatzmaterialien verwendet. Beispielsweise sind im Testmedium normalerweise Puffer sowie Stabilisatoren für das Testmedium und die Testkomponenten vorhanden. Häufig können zusätzlich zu diesen Additiven Proteine wie etwa Albumine, organische Lösungsmittel wie etwa Formamid, quaternäre Ammoniumsalze, Polykatione wie etwa Dextransulfat Tenside, insbesondere nichtionogene Tenside, Bindungsverstärker, z. B. Polyalkylenglykole, oder dergleichen enthalten sein. Wenn die chemolumines zierende Verbindung chemisch und nicht durch Bestrahlung aktiviert wird, ist oft Wasserstoffperoxid als Zusatzreagens enthalten. Wenn gewünscht wird, die Emissionswellenlänge der chemolumineszierenden Verbindung zu längeren Wellenlängen hin zu verschieben oder die Zersetzung ihrer Sauerstoff-aktivierten Form zu katalysieren, kann ein Fluoreszenzmolekül eingesetzt werden.
  • Gänzlich oder teilweise nacheinander: Wenn die Probe und verschiedene hierin verwendete Mittel nicht gleichzeitig kombiniert werden, können eine oder mehrere davon mit einem oder mehreren der verbleibenden Mittel kombiniert werden, um eine Subkombination zu bilden. Jede Subkombination lässt sich dann einem oder mehreren Schritten des vorliegenden Verfahrens unterziehen. Somit kann jede der Subkombinationen unter Bedingungen inkubiert werden, unter denen eines oder mehrere der gewünschten Ergebnisse erzielbar sind.
  • Ein Aspekt der Erfindung betrifft Zusammensetzungen, die (a) ein Metallchelat, umfassend ein Metall, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Europium, Terbium, Dysprosium, Samarium, Osmium und Ruthenium, in zumindest einem sechsfach koordinierten Zustand, und (b) die Verbindung 11 umfassen. Die Zusammensetzung der Endung, die ein Metallchelat und Verbindung 11 umfasst, liegt im Allgemeinen in einem Medium vor, das flüssig oder fest sein kann, üblicherweise festes Teilchenmaterial. Das flüssige Medium ist üblicherweise eine hochsiedende, mit Wasser nichtmischbare Flüssigkeit, z. B. aus der Gruppe, bestehend aus Toluol, Lipiden, Fluorkohlenstoffen, Diphenylether, Chlorbenzol, Dioctylphthalat, Dimethoxybenzol, Mineralöl und Triacylglyceriden; das aus festem Teilchenmaterial gebildete Medium kann ein organisches Polymer, wie z. B. Polystyrol, Polymethylacrylat, Polyacrylat, Polyacrylamid, Polyvinylchlorid und Copolymere davon, Nylon und andere Polyamide usw. sein. Vorzugsweise ist die Zusammensetzung in einem teilchenförmigen Latexmaterial inkorporiert.
  • Das Metallchelat ist in einer Menge vorhanden, um die Chemolumineszenz-Quantenausbeute zu maximieren und die Abklingzeit der Chemolumineszenz zu minimieren. Üblicherweise ist das Metallchelat in einer Menge von 0,2–500 mM, vorzugsweise 2–100 mM, vorhanden. In einigen Fällen, üblicherweise wenn das Metallchelat sechsfach koordiniert ist, erfolgt die Reduktion der Abklingzeit durch Reduktion der Quantenausbeute, wobei man zwischen diesen zwei Wirkungen ein Gleichgewicht erzielen muss. Demzufolge sollte die Konzentration des Metallchelats in der Zusammensetzung darauf abgestimmt sein, ein solches Gleichgewicht zu erzielen. Die Konzentration der chemolumineszierenden Verbindung in der Zusammensetzung beträgt üblicherweise 0,1–500 mM, vorzugsweise 2 bis 100 mM.
  • Ein Aspekt der Erfindung betrifft eine Zusammensetzung, die einen Latex umfasst, in den Verbindung 11 inkorporiert ist. Die Latexteilchen sind üblicherweise suspendierbar und besitzen einen durchschnittlichen Durchmesser von 0,04 bis 4000 nm. Für Assays besitzt das Teilchen ein daran gebundenes sbp-Element und weist einen durchschnittlichen Durchmesser von 100 bis 1000 μm auf.
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung eines Analyten. Das Verfahren umfasst (a) das Bereitstellen in Kombination (1) eines Mediums, von dem vermutet wird, dass es einen Analyten enthält, (2) eines Photosensibilisators, der in seinem angeregten Zustand Sauerstoff in seinen Singulett-Zustand anregen kann, wobei der Photosensibilisator mit einem spezifischen sbp-Element assoziiert ist, und (3) eines suspendierbaren teilchenförmigen Latexmaterials, das Verbindung 11 umfasst. Das teilchenförmige Material weist ein daran gebundenes sbp-Element auf. Die Kombination wird mit Licht – üblicherweise mittels Bestrahlung – behandelt, um den Photosensibilisator anzuregen, und dann hinsichtlich der Menge ausgesendeter Lumineszenz untersucht. Das Ausmaß dieser Lumineszenz wird mit der Analytenmenge im Medium in Beziehung gesetzt. Der Photosensibilisator kann in ein zweites suspendierbares Teilchenmaterial inkorporiert werden.
  • In der Testvorschrift werden die Komponenten in Kombination bereitgestellt, und das als Funktion der Aktivierung von Sauerstoff durch den Sensibilisator erzeugte Licht ist eine Funktion der Analytenkonzentration. Günstigerweise können die Verfahren der Erfindung ohne Erwärmen des Mediums durchgeführt werden, um Licht zu erzeugen. Daher kann der Test der Endung bei konstanter Temperatur erfolgen.
  • Die chemolumineszierende Verbindung kann an ein sbp-Element gebunden sein, das zur direkten oder indirekten Bindung an den Analyten oder an eine Testkomponente fähig ist, deren Konzentration durch die Gegenwart des Analyten beeinflusst wird. Der Ausdruck „zur direkten oder indirekten Bindung fähig" bedeutet hierin, dass sich die bezeichnete Struktur spezifisch (direkt) an die Struktur binden kann oder sich spezifisch an ein spezifisches sbp oder an einen Komplex von zwei oder mehr sbp-Elementen binden kann, die zur Bindung mit der anderen Struktur fähig sind (indirekt). Vorzugsweise verwenden erfindungsgemäß durchgeführte Assays eine der obigen Zusammensetzungen in einem Latexteilchen. Dieses Latexteilchen besitzt ein sbp-Element, das im Allgemeinen zur direkten oder indirekten Bindung an den Analyten oder einen Rezeptor für den Analyten fähig ist. Wenn die mit dem Photosensibilisator oder der chemolumineszierenden Verbindung assoziierten sbp-Elemente beide zur Bindung an den Analyten fähig sind, ist eine Sandwich-Assayvorschrift die Folge. Wenn eines der mit dem Photosensibilisator oder der chemolumineszierenden Verbindung assoziierten sbp-Elemente zur Bindung an den Analyten und einen Analytenanalog fähig ist, kann sich daraus eine kompetitive Assayvorschrift ergeben.
  • Es wird üblicherweise bewirkt, dass der Photosensibilisator die chemolumineszierende Verbindung durch Bestrahlen des die obigen Reaktanden enthaltenden Mediums aktiviert. Das Medium muss mit Licht einer Wellenlänge bestrahlt werden, deren Energie ausreicht, um den Photosensibilisator in einen angeregten Zustand umzuwandeln und ihn dadurch in die Lage zu versetzen, molekularen Sauerstoff zu Singulett-Sauerstoff zu aktivieren. Der angeregte Zustand für den Photosensibilisator, der zur Anregung von molekularem Sauerstoff fähig ist, ist im Allgemeinen ein Triplett-Zustand, der mehr als etwa 20, üblicherweise zumindest 23, kcal/Mol energiereicher ist als der Grundzustand des Photosensibilisators. Vorzugsweise wird das Medium mit Licht einer Wellenlänge von etwa 450 bis 950 nm bestrahlt, obwohl auch kürzere Wellenlängen in Frage kommen, z. B. 230 bis 950 nm. Die erzeugte Lumineszenz kann in jeder geeigneten Weise, wie z. B. fotografisch, visuell oder photometrisch, gemessen werden, um ihr Ausmaß zu ermitteln, das mit der Analytenmenge im Medium in Beziehung gesetzt wird.
  • Obwohl es üblicherweise vorzuziehen ist, den Photosensibilisator durch Bestrahlen mit Licht einer Wellenlänge anzuregen, die durch den Photosensibilisator wirkungsvoll absorbiert wird, eignen sich auch andere Möglichkeiten der Anregung, z. B. durch Energietransfer von einem angeregten Zustand eines Energiedonors, wie z. B. eines zweiten Photosensibilisators. Wenn ein zweiter Photosensibilisator verwendet wird, können Licht-Wellenlängen gewählt werden, die vom Photosensibilisator ineffizient, aber vom zweiten Photosensibilisator effizient absorbiert werden. Der zweite Photosensibilisator kann an eine Testkomponente gebunden sein, die mit dem ersten Photosensibilisator assoziiert ist oder mit ihm assoziiert werden kann (z. B. gebunden an eine Oberfläche oder in das Teilchen mit dem ersten Photosensibilisator inkorporiert). Bei Verwendung eines zweiten Photosensibilisators weist er üblicherweise einen energieärmsten Singulett-Zustand bei höherer Energie auf als der energieärmste Singulett-Zustand des ersten Photosensibilisators.
  • Die 632,6-nm-Emissionslinie eines Helium-Neon-Lasers ist eine billige Lichtquelle für die Anregung. Photosensibilisatoren mit Absorptionsmaxima im Bereich von etwa 620 bis etwa 650 nm sind mit der Emissionslinie eines Helium-Neon-Lasers kompatibel und eignen sich daher besonders gut.
  • Das Verfahren und die Zusammensetzungen der Endung können auf die meisten Assays abgestimmt werden, in denen es um sbp-Elemente wie z. B. Ligand-Rezeptor geht; Beispiele dafür sind Antigen-Antikörper-Reaktionen; Polynucleotid-Bindungstests usw. Die Tests können homogen oder heterogen, kompetitiv oder nichtkompetitiv sein. Die Testkomponenten – chemolumineszierende Verbindung und Photosensibilisator – können in unterschiedlicher Weise mit (1) einer Oberfläche (falls vorhanden), (2) Nucleinsäure oder Rezeptor und (3) Nucleinsäure oder Ligand verwendet werden. Die Assoziation kann kovalente oder nichtkovalente Bindungen vorsehen. Fachleute auf dem Gebiet der Erfindung können unter Berücksichtigung der obigen Ausführungen und der nachstehenden veranschaulichenden Besprechung je nach dem konkreten Test die richtigen Assoziationen wählen.
  • In einem homogenen Testverfahren kann die Probe gegebenenfalls vorbehandelt werden, um unerwünschte Materialien zu entfernen. Die Reaktion für einen nichtkompetitiven Sandwich-Assay kann ein sbp-Element (z. B. einen Antikörper, eine Nucleinsäure-Sonde, einen Rezeptor oder einen Liganden), das zum Analyten komplementär und mit einer chemolumineszierenden Verbindung assoziiert ist; einen mit einem sbp-Element assoziierten Photosensibilisator (z. B. Antikörper, Nucleinsäure-Sonde, Rezeptor oder Ligand), der ebenfalls mit dem Analyten komplementär ist; die Probe von Interesse; und allenfalls erforderliche Zusatzreagenzien enthalten. Vorzugsweise ist zumindest die chemolumineszierende Verbindung in Teilchen inkorporiert, an denen ein sbp-Element gebunden ist. Der Photosensibilisator kann direkt an ein sbp-Element gebunden oder auch in Teilchen inkorporiert sein. In einer kompetitiven Arbeitsvorschrift kann ein sbp-Element ein Derivat des Analyten und das andere sbp-Element komplementär zum Analyten sein, z. B. Antikörper. In beiden Arbeitsvorschriften können die Komponenten entweder gleichzeitig oder gänzlich oder teilweise nacheinander kombiniert werden. Die Fähigkeit von durch einen aktivierten Photosensibilisator erzeugtem Singulett-Sauerstoff, mit der chemolumineszierenden Verbindung zu reagieren, wird durch die Bindung eines sbp-Elements an den Analyten bestimmt. Daher kann die Gegenwarf oder Menge eines Analyten bestimmt werden, indem man die Lichtmenge misst, die nach Aktivierung des Photosensibilisators durch Bestrahlung, Erwärmung oder Zugabe eines chemischen Reagens, vorzugs weise durch Bestrahlung, ausgesendet wird. Sowohl die Bindungsreaktion als auch die Detektion ihres Ausmaßes können in einer homogenen Lösung ohne Trennung durchgeführt werden. Dies ist ein Vorteil der vorliegenden Erfindung gegenüber Verfahren des Stands der Technik unter Einsatz von Chemolumineszenz.
  • In einem heterogenen Testverfahren umfassen die Assaykomponenten eine Probe, die vermutlich einen Analyten enthält, der ein sbp-Element ist; ein an einen Träger gebundenes sbp-Element, welcher Träger entweder eine nichtdispergierbare Oberfläche oder ein Teilchen sein kann, mit dem ein Element einer Gruppe assoziiert ist, die aus der chemolumineszierenden Verbindung und dem Photosensibilisator besteht; und ein sbp-Element, mit dem das andere Element der Gruppe assoziiert ist, worin die sbp-Elemente unabhängig voneinander entweder direkt oder indirekt den Analyten oder einen Rezeptor für den Analyten binden können. Diese Komponenten werden im Allgemeinen entweder gleichzeitig oder gänzlich oder teilweise nacheinander kombiniert. Die Oberfläche oder die Teilchen werden dann von der flüssigen Phase getrennt, und es wird entweder die abgeschiedene Phase oder die flüssige Phase Bedingungen zur Aktivierung des Photosensibilisators unterworfen (üblicherweise durch Bestrahlen der jeweiligen Phase und Messen der ausgesendeten Lichtmenge).
  • Die Bindungsreaktionen in einem Test für den Analyten erfolgen normalerweise in einem wässrigen Medium bei moderatem pH-Wert – im Allgemeinen bei jenem, der für optimale Testsensitivität sorgt. Vorzugsweise erfolgt die Aktivierung des Photosensibilisators in einem wässrigen Medium. Wenn jedoch ein Abtrennungsschritt vorgesehen ist, können nichtwässrige Medien, wie z. B. Acetonitril, Aceton, Toluol, Benzonitril usw., und wässrige Medien mit sehr hohen pH-Werten, d. h. von mehr als 10,0, oder sehr niedrigen pH-Werten, d. h. weniger als 4,0, üblicherweise aber mit sehr hohen pH-Werten, verwendet werden. Wie oben erwähnt, kann der Test entweder ohne Abtrennung (homogen) oder mit Abtrennung (heterogen) jeglicher der Testkomponenten oder -produkte durchgeführt werden.
  • Das wässrige Medium kann lediglich Wasser sein oder 0,01 bis 80 Vol.-% eines Co-Lösungsmittels enthalten; üblicherweise enthält es aber weniger als 40% eines Co-Lösungsmittels, wenn ein sbp-Element verwendet wird, das ein Protein ist. Der pH-Wert für das Medium der Bindungsreaktion liegt üblicherweise im Bereich von etwa 4 bis 11, noch häufiger im Bereich von etwa 5 bis 10, vorzugsweise im Bereich von etwa 6,5 bis 9,5. Wenn sich der pH-Wert während der Erzeugung von Singulett-Sauerstoff nicht ändert, ist er üblicherweise ein Kompromiss zwischen optimaler Bindung der Bindungselemente, dem pH-Optimum für die Signalproduktion und der Stabilität anderer Reagenzien des Assays. Wenn erhöhte pH-Werte für die Signalerzeugung notwendig sind, kann ein Schritt, der die Zugabe eines alkalischen Reagens vorsieht, zwischen der Bindungsreaktion und der Erzeugung von Singulett-Sauerstoff und/ oder Signalproduktion erfolgen. Üblicherweise liegen die erhöhten pH-Werte über 10, noch häufiger liegen sie zwischen 10 und 14. Für heterogene Assays eignen sich auch nichtwässrige Lösungsmittel (siehe oben), wobei die Hauptüberlegung die ist, dass das Lösungsmittel nicht wirkungsvoll mit Singulett-Sauerstoff reagiert.
  • Verschiedene Puffer können dazu dienen, den gewünschten pH-Wert zu erzielen und diesen während des Tests aufrechtzuerhalten. Beispiele für Puffer sind Borat, Phosphat, Carbonat, Tris, Barbital und dergleichen. Der jeweils verwendete Puffer ist für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend, doch in einem individuellen Assay können ein oder mehrere Puffer vorzuziehen sein.
  • Für die Durchführung der Bindungsreaktionen proteinhältiger Liganden und Rezeptoren im Test herrschen während der Messphase normalerweise moderate Temperaturen, üblicherweise konstante Temperaturen, vorzugsweise zwischen 25°C und 40 °C. Die Inkubationsteperaturen für die Bindungsreaktion reichen normalerweise von etwa 5°C bis 45°C, üblicherweise von etwa 15°C bis 40°C, noch häufiger von 25 °C bis 40°C. Wenn die Bindung von Nucleinsäuren im Test auftritt, herrschen häufiger höhere Temperaturen (üblicherweise 20°C bis 90°C, noch häufiger 35°C bis 75 °C). Die Temperaturen während der Messungen, d. h. der Erzeugung von Singulett- Sauerstoff und der Lichtdetektion, reichen im Allgemeinen von etwa 20°C bis 100 °C, noch häufiger von etwa 25°C bis 50°C, noch häufiger von 25°C bis 40°C.
  • Die Konzentration des untersuchten Analyten variiert im Allgemeinen und reicht von etwa 10–4 bis unter 10–6 M, noch häufiger von etwa 106 bis 10–4 M. Überlegungen wie z. B. die Frage, ob der Test qualitativ, semiquantitativ oder quantitativ ist, das jeweilige Detektionsverfahren, die Konzentration des Analyten von Interesse und die maximalen gewünschten Inkubationszeiten bestimmen normalerweise die Konzentrationen der verschiedenen Reagenzien.
  • Während in kompetitiven Tests die Konzentrationen der verschiedenen Reagenzien im Testmedium im Allgemeinen durch den Konzentrationsbereich von Interesse des Analyten bestimmt wird, wird die Endkonzentration jedes Reagens normalerweise empirisch festgelegt, um die Sensitivität des Assays über den jeweiligen Bereich zu optimieren. Die Variation der Konzentration des Analyten von Interesse sollte daher eine präzise messbare Signaldifferenz liefern.
  • Die Konzentration der sbp-Elemente hängt von der Analytenkonzentration, der gewünschten Bindungsrate und dem Grad der nichtspezifischen Bindung der sbp-Elemente ab. Üblicherweise sind die sbp-Elemente zumindest in der niedrigsten erwarteten Analytenkonzentration vorhanden, vorzugsweise zumindest in der höchsten erwarteten Analytenkonzentration; in nichtkompetitiven Assays kann die Konzentration das 10- bis 106fache der höchsten Analytenkonzentraiton ausmachen – üblicherweise ist sie aber weniger als 10–4 M, vorzugsweise weniger als 10–6 M, und häufig liegt sie zwischen 10–11 und 10–7 M. Die Menge an Photosensibilisator oder chemolumineszierender Verbindung (mit einem sbp-Element assoziiert) ist üblicherweise zumindest ein Molekül pro sbp-Element und kann bis zu 105, üblicherweise 10–104, betragen, wenn der Photosensibilisator oder die chemolumineszierende Verbindung in einem Teilchen inkorporiert ist.
  • Die Reihenfolge der Zugabe kann zwar stark variieren, doch es gibt je nach Natur des Tests bestimmte Präferenzen. Die einfachste Reihenfolge der Zugabe ist die gleichzeitige Zugabe aller Materialien. Alternativ dazu können die Reagenzien gänzlich oder teilweise nacheinander kombiniert werden. Wenn der Test kompetitiv ist, ist es oft wünschenswert, den Analytenanalog nach dem Kombinieren der Probe mit einem sbp-Element zuzusetzen, das zur Bindung des Analyten fähig ist. Gegebenenfalls kann ein Inkubationsschritt nach dem Kombinieren der Reagenzien vorgesehen sein; seine Dauer reicht im Allgemeinen von etwa 30 Sekunden bis zu 6 Stunden, noch häufiger von etwa 2 Minuten bis zu 1 Stunde, bevor der Sensibilisator dazu veranlasst wird, Singulett-Sauerstoff zu erzeugen, und die Lichtaussendung gemessen wird.
  • In einer besonders bevorzugten Zugabereihenfolge wird eine erste Gruppe spezifischer Bindungspaarelemente, die zum Analyten komplementär und/oder mit diesem homolog sind, mit dem Analyten kombiniert, gefolgt von der Zugabe spezifischer Bindungspaarelemente, die zu den ersten sbp-Elementen komplementär sind, die jeweils mit einem unterschiedlichen Element der Gruppe bestehend aus einem Photosensibilisator und einer Zusammensetzung der Erfindung assoziiert sind. Das Assaygemisch oder eine getrennte Komponente davon wird dann bestrahlt und die Lichtemission gemessen.
  • In einem homogenen Assay können nach dem Kombinieren aller Reagenzien diese gegebenenfalls inkubiert werden. Dann wird die Kombination bestrahlt und das resultierende ausgesendete Licht gemessen. Das ausgesendete Licht wird mit der Menge des Analyten in der untersuchten Probe in Beziehung gesetzt. Die Mengen der in einem homogenen Assay verwendeten Reagenzien der Erfindung hängen von der Beschaffenheit des Analyten ab. Im Allgemeinen weist der homogene Test der Erfindung erhöhte Sensitivität gegenüber bekannten Assays wie z. B. dem EMIT®-Test auf. Dieser Vorteil ergibt sich vor allem aus dem verbesserten Signal-Rauschverhältnis, das hierin erzielt wird.
  • Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Sets, die sich zur wirkungsvollen Durchführung eines Testverfahrens der Erfindung eignen, damit die Gegenwarf oder Menge eines Analyten in einer Probe bestimmt wird, von der vermutet wird, dass sie den Analyten enthält. Die Sets umfassen in abgepackter Kombination Folgendes: (1) eine Zusammensetzung, die ein suspendierbares Latexteilchen umfasst, das Verbindung 11 enthält, und (2) einen Photosensibilisator, der in seinem angeregten Zustand Sauerstoff in seinen Singulett-Zustand aktivieren kann. Der Photosensibilisator kann ein Teil einer Zusammensetzung sein, die ein zweites suspendierbares Teilchen enthält, das den Photosensibilisator umfasst, worin das zweite Teilchen ein daran gebundenes sbp-Element besitzt oder direkt an ein sbp-Element gebunden sein kann. Das Set kann überdies eine schriftliche Beschreibung eines erfindungsgemäßen Verfahrens und Anleitungen zur Verwendung der Reagenzien des Sets in einem derartigen Verfahren enthalten.
  • Um die Vielseitigkeit der Erfindung zu erhöhen, können die Reagenzien in abgepackter Kombination in den gleichen oder getrennten Behältern bereitgestellt sein, sodass das Verhältnis der Reagenzien für Optimierung des Verfahrens und des Tests sorgt. Die Reagenzien können jeweils in getrennten Behältern vorliegen, oder es können verschiedene Reagenzien in einem oder mehreren Behältern kombiniert sein; dies hängt von der Kreuzreaktivität und der Stabilität der Reagenzien ab. Das Set kann außerdem andere getrennt abgepackte Reagenzien zur Durchführung eines Assays mit Zusatzreagenzien usw. enthalten.
  • BEISPIELE
  • Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden veranschaulichenden Beispiele näher erläutert. Die hierin angeführten Teile und Prozentsätze beziehen sich – sofern nicht anders angegeben – auf das Gewicht. Die Temperaturen sind in °C angegeben. Abkürzungen:
    AbF (Anti-Fluorescein) – monoklonaler Mäuse-Antikörper gegen Fluorescein
    AbT3 (Anti-T3) – monoklonaler Mäuse-Antikörper gegen T3
    t-Bu t-Butyl
    TF Trifluoressigsäure
    T3
    Φ Chemolumineszenz-Quantenausbeute
    PMT
    EtoAc Ethylacetat
    BSA Rinderserumalbumin
    Chl-a Chlorophyll-a
    D-H2O entionisiertes Wasser
    DPPA 4,7-Diphenylphenanthrolin
    DPPC Dipalmitoylphosphatidylcholin
    DPPG Dipalmitoylphosphatidylglycerin
    DPPE Dipalmitoylphosphatidylethanolamin
    EDAC 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid
    nC10 Tetra-(n-decyl)phthalocyanin-Aluminuimchlorid-Komplex
    PB Polystyrolperlen
    PB/nC10 PB mit nC10
    PBS Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, 0,02 M NaPi, 0,14 M NaCl/pH 7,2
    Pi Phosphat
    Sulfo-NHS Sulfo-N-hydroxysuccinimid
    SATA S-Acetylthioglykolsäure-N-hydroxysuccinimidester
    RLU Relative Lichteinheiten
    NHS N-Hydroxysuccinimid
    DMSO Dimethylsulfoxid
    DMF Dimethylformamid
    DCC Dicyclohexylcarbodiimid
    TEA Triethylamin
    DC Dünnschicht-Chromatographie
    TNBSA 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure
    BGG Rinder-γ-Globulin
    TMSCI Trimethylsilylchlorid
    MeOH Methanol
    Biotin-LC7 -NHS Sulfosuccinimidyl-6-(biotinamido)hexanoat
    λmax ABS λ-Absorptionsmaximum
    λmax EMI λ-Maximum der Fluoreszenzemission
    λ CH.EM λ-Maximum der Chemolumineszenzemission
  • Alle monoklonalen Antikorper wurden durch herkömmliche Hybridzellen-Technologie erzeugt. Kurz zusammengefasst wurde das geeignete Immunogen in einen Wirt, üblicherweise eine Maus oder ein anderes zweckmäßiges Säugetier, injiziert; nach einer ausreichend langen Zeit wurden die Milzzellen aus dem Wirt erhalten. Alternativ dazu wurden unsensibilisierte Zellen aus dem Wirt isoliert und direkt mit dem Immunogen in vitro sensibilisiert. Hybridzellen wurden durch Fusionieren der obigen Zellen mit einer geeigneten Myelom-Zelllinie und Kultivieren der fusionierten Zellen gebildet. Die durch die kultivierten Hybridzellen produzierten Antikörper wurden auf ihre Bindungsaffinität für das konkrete Antigen, z. B. THS oder HCG, gescreent. Es wurden einige Screening-Techniken eingesetzt, z. B. ELISA-Screens. Die ausgewählten Fusionen wurden rekloniert.
  • BEISPIEL 1 (Vergleichsbeispiel)
  • Gesamt-Triiodthyronin-Test
  • 1. Perlenpräparate
  • Materialien
  • 175 nm Carboxylat-modifizierter Latex (CML-Perlen) von Bangs Laboratories Ethylenglykol, ethoxyethanol, Benzylalkohol, Chlorophyll-a von Aldrich Europium(III)-thienoyltrifluoracetonat (EuTTA) von Kodak Trioctylphosphinoxid (TOPO) von Aldrich Dioxen[1-(4-dimethylaminophenyl)-6-phenyl-1,4-dioxen): hergestellt nach einem modifizierten Verfahren gemäß Giagnon, S. D. (1982), University Microfilms International (Ann Arbor, Michigan, USA)
  • Verfahren
  • 1. Chlorphyll-1-Sensibilisatorperlen
  • Eine Lösung Chlorophyll-a in Benzylalkohol (1,0 ml, 0,6 mM) wurde 8,0 ml Benzylalkohol bei 105°C zugesetzt. Eine Suspension von Carboxlat-modifiziertem Latex mit einer Größe von 175 nm in Wasser (10%, 1,0 ml) wurde der Benzylalkohol-Lösung zugesetzt. Das Gemisch wurde 5 min lang bei 105°C gerührt und auf Raumtemperatur abgekühlt. Ethanol (10,0 ml) wurde zugesetzt und das Gemisch zentrifugiert. Das Pellet wurde in einem 1 : 1-Ethanol-Wasser-Gemisch (10,0 ml) resuspendiert und die Suspension zentrifugiert. Die gleiche Resuspensions- und Zentrifugationstechnik wurde in Wasser (10,0 ml) angewendet und das Pellet in Wasser resuspendiert (1,8 ml).
  • Charakterisierung
    • A. Farbstoffkonzentration: Eine Lösung, gebildet durch die Zugabe von 10 μl der obigen Perlensuspension in Dioxan (990 μl), besaß eine Extinktion von 0,11 bis 660 nm, was 2,6 μMol Chlorophyll-a in 1 g Perlen entsprach.
    • B. Singulett-Sauerstoff-Erzeugung: Ein Gemisch aus Chlorophyll-a-Perlen (200 μg), 2 × 10–4 Mol Anthracen-9,10-dipripionsäure (ADPA) in 2 ml Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,5, umfassend 100 mM NaCl) wurde mit einer Wolframhalogen-Lampe, ausgestattet mit einem 645 nm-Cutoff-Filter, 20 min lang bestrahlt. Die Perlen wurden durch Filtration entfernt und die Konzentration des Oxidationsprodukts spektralphotometrisch bei 400 nm bestimmt. Die Rate betrug 3,0 nMol Oxidationsprodukt pro min. Unter den gleichen Bedingungen er zeugten 38 pMol eines löslichen Sensibilisators, Aluminiumphthalocyanintetrasulfonat, die gleiche Menge an Oxidationsprodukt (die Menge an Sensibilisator in den Perlen betrug 200·106 2,6·10–6 = 520 pMol).
  • 2. Chlorophyll-a/Tetrabutylsquarat-Sensibilisatorperlen
  • Eine Suspension von carboxylierten Latexperlen (Größe 175 nm, 10% Feststoffanteil in Wasser, 30,0 ml) wurde zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet in Ethylenglykol (60,0 ml) resuspendiert. Die Suspension wurde auf 100°C erhitzt. 9,0 ml einer Benzylalkohol-Lösung – 1,67 mM an Chlorophyll-a und 3,33 mM an Tetrabutylsquarat [1,3-bis(4-Dibutylaminophenyl)squarat] – wurde langsam im Lauf von 3 min der Suspension zugesetzt. Die Erhitzung wurde 7 min lang fortgesetzt und dann die Suspension in einem Wasserbad auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Benzylalkohol-Suspension wurde kaltem Ethanol (120 ml) zugesetzt. Das Gemisch wurde zentrifugiert und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 50% Ethanol und Wasser resuspendiert und die Suspension zentrifugiert. Die gleiche Resuspensions- und Suspensions-Vorgangsweise wurde in 5% Ethanol in Wasser (30 ml) wiederholt.
  • Charakterisierung
    • A. Farbstoffkonzentration: Die Konzentration des Tetrabutylsquarats in den Perlen wurde – wie oben in Zusammenhang mit den Chlorophyll-a-Perlen beschrieben – spektralphotometrisch bestimmt. Der gemessene Wert betrug 44 μM Farbstoff in den Perlen.
    • B. Singulett-Sauerstoff-Erzeugung: 25 μl einer 5 mM Lösung von ADPA in Ethanol wurden der Perlensuspenion (100 μg) in Phosphatpuffer, pH 7,0 (2 mM, umfassend 50 mM NaCl) zugesetzt. Das Gemisch wurde wie oben mit einem 610 nm-Langpassfilter bestrahlt. Die Erzeugungsrate von Singulett-Sauerstoff wurde anhand der Abnahmerate der Extinktion (bei 400 nm) von ADPA er rechnet. Es stellte sich heraus, dass die Perlen 7·10–2 μMol Singulett-Sauerstoff/min erzeugen.
  • 3. Dioxen/EuTTA/OPO-Akzeptorperlen
  • 20 ml 175 nm carboxylierter Latexperlen (10% Suspension in Wasser) wurde Ethoxyethanol (20,0 ml) zugesetzt. Das Gemisch wurde auf 90°C erhitzt. 20 ml einer Lösung – 10 mM 2-(p-Dimethylaminophenyl)-3-phenyldioxen, 20 mM Eu-TTA und 60 mM TOPO in Ethoxyethanol – wurden dem Gemisch zugesetzt. Das Erhitzen wurde weitere 7 min lang bei Raumtemperatur bis 97°C fortgesetzt. Das Gemisch wurde auf Raumtemperatur abgekühlt. Ethanol (40,0 ml) wurde zugegeben und das Gemisch zentrifugiert. Das Pellet wurde in 80% Ethanol resuspendiert und die Suspension zentrifugiert. Die Resuspensions- und Zentrifugations-Vorgänge wurden in 10% Ethanol (36 ml) wiederholt.
  • Charakterisierung
    • A. Farbstoffkonzentration: Die Konzentration von EuTTA in den Perlen wurde spektralphotometrisch bestimmt und betrug 0,07 M. Da die Konzentration von Dioxen in der Gegenwart von EuTTA nicht bestimmbar ist, wurde sie unter den gleichen Bedingungen in Perlen gemessen, die nur mit dem Dioxen, 2-(p-Dimethylaminophenyl)-3-phenyldioxen, gefärbt waren. Die Konzentration stellte sich als 0,016 M heraus.
    • B. Signalerzeugung: Eine Suspension von Perlen (25 μg) in Phosphatpuffer (0,5 ml, 20 mM Phosphat, 50 mM NaCl, 0,1% Tween 20, pH 7,0) wurde mit einer Lösung von 2 μM Aluminiumphthalocyanintetrasulfonat (0,5 ml) im gleichen Puffer vermischt. Das Gemisch wurde 1 min lang mit einer 125 W-Wolframhalogen-Lampe, ausgestattet mit einem 610 nm-Langpassfilter, bestrahlt. Nach der Bestrahlung wurde das Gemisch in ein LTurner TD-20e-Luminometer gefüllt und die Lumineszenz 20 s lang gemessen. Die Intensität betrug 327 RLU/s. Die Wellenlänge des ausgesendeten Lichts wurde mittels eines Perkin-Elmer 650-40-Scanning-Spektralfluorimeter gemessen. Die Mitte des Haupt-Emissionspeaks lag in der Nähe von 615 nm.
  • II. Testverfahren
  • EDAC/NHS-Bindung von Antikörper an 40 nM-Perlen
  • 73,6 mg Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimid, Pierce Chemical Co. # 24510 G) wurden in 6 ml einer Suspension von 4 mg/ml Caboxylat-modifizierten 40 nm-Polystyrolperlen (gefärbt mit Chlorophyll-a und Tetrabutylsquarat) in Wasser gelöst. 136 μl 0,5 M NaHP2O4 wurden zugesetzt. Der pH-Wert wurde auf 5,2 eingestellt. 136 μl zusätzliches Wasser wurden zugesetzt. 130,4 mg EDAC (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimidhydrochlorid, Sigma Chemical Co. #E-6384) in 454 μl Wasser wurden langsam einer Perlen-Rührlösung zugesetzt. Die Suspension wurde 20 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Perlen wurden 20 min lang bei 15.000 U/min im Sorvall SA-600-Rotor bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Die Perlen wurden anschließend in 1,2 ml 5 mM Natriumphosphat, pH 5,8, resuspendiert und die Suspension ultraschallbehandelt, um die Perlen erneut zu dispersieren. Die Perlen wurden langsam 4,8 ml einer Rührlösung zugesetzt, umfassend 1,7 mg/ml IgG (monoklonales Mäuse-Anti-Fluorescein) und 6,7 mg/ml BSA sowie 17 mM Borx, pH 9,2, und vorsichtig über Nacht bei 4°C gemischt. 800 μl 2 M Glycin und danach 2,8 ml 50 mg/ml BSA in 0,1 M Borax wurden der Perlensuspension zugesetzt. Die Suspension wurde ultraschallbehandelt und 3 h lang vorsichtig bei 4°C vermischt. Die Perlen wurden 30 min lang bei 15.000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Die Perlen wurden in 3 ml 50 mM Natriumphosphat und 150 mM NaCl, pH 7,6, resuspendiert und die Suspension ultraschallbehandelt. Die Schritte der Zentrifugation, Resuspension und Ultraschallbehandlung wurden für insgesamt drei Spins wiederholt. Nach dem dritten Spin wurden die Perlen in 2,4 ml 50 mM Natriumphosphat und 150 mM NaCl, pH 7,6, resuspendiert. Die resultierende Suspension wurde ultraschallbehandelt und bei 4°C gelagert.
  • III. EDAC/NHS-Bindung von Avidin-D an 175 nm-Perlen
  • 4,4 mg Sulfo-NHS wurden in 0,4 ml einer Suspension von 25 mg/ml Carboxylatmodifizierten 175 nm Polystyrolperlen (gefärbt mit 2-(p-Dimethylaminophenyl)-3-phenyldioxen/Eu(TTA)TTOPO) in Wasser gelöst. 0,0160 ml 0,25 M NaHP2O4 wurden zugesetzt. 8 mg EDAC, gelöst in 0,030 ml Wasser, wurde langsam der wirbelnden Perlensuspension zugegeben. Die Suspension wurde 20 min lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Perlen wurden 20 min lang bei 15.000 U/min im Sorvall SA-600 Rotor bei 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Die Perlen wurden in 0,6 ml 0,005 M Natriumphosphat, pH 5,8, resuspendiert. Die Suspension wurde ultraschallbehandelt, um die Perlen zu resuspendieren. Die Perlen wurden wiederum langsam 3 ml einer Rührlösung zugesetzt, die 1,33 mg/ ml Avidin-D (Vector) und 17 mM Borax, pH 9,2, enthielt, und vorsichtig über Nacht bei 4°C vermischt. 0,004 ml 1 M Bernsteinsäureanhydrid in DMF wurde zugegeben. Die Suspension wurde 1 h lang bei 4°C unter leichtem Mischen inkubiert. 0,4 ml 50 mg/ml BSA in 10 mM Natriumphosphat und 150 mM NaCl, pH 7,0, wurden zugesetzt. Die Suspension wurde 3 h lang bei 4°C vorsichtig gemischt, Die Perlen wurden 30 min lang bei 15.000 U/min zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Die Perlen wurden in 3 ml 50 mM Natriumphosphat und 150 mM NaCl, pH 7,6, resuspendiert. Die Suspension wurde ultraschallehandelt. Die Schritte der Zentrifugation, Resuspension und Ultraschallbehandlung wurden für insgesamt drei Spins wiederholt. Nach dem dritten Spin wurden die Perlen in 2,25 ml 50 mM Natriumphosphat und 150 mM NaCl, pH 7,6, resuspendiert. Die Suspension wurde ultraschallbehandelt und bei 4°C gelagert.
  • IV. Gesamter T3-Assay
  • Assaypuffer
  • 0,075 M Barbital, 0,2 M NaCl, 0,4% BSA, 1,25% Mäuse-IgG, 10 mg/ml Dextransulfat (Molekulargewicht 500.000), 1,0 mg/ml Dextran T-500, 10 μg/ml aggregiertes IgG
  • Perlen
  • Akzeptorperlen: Avidin.EDAC, 175 nm, gefärbt mit 2-p-Dimethylaminophenyl)-3-phenyldioxen/Eu(TTA)3/TOPO Sensibilisatorperlen: Anti-Fluorescein-EDAC, 40 nm, gefärbt mit Chlorophyll-a/Squarat
  • Assay-Arbeitsvorschrift
  • 50 μl einer Lösung von 8-Anilino-1-naphthalinsulfonsäure und Ammoniumsalz (Sigma, A-3125) in Assaypuffer (0,75 mg/ml) wurde 50 μl T3-Standard oder Probe zugesetzt. 100 μl Assaypuffe wurden zugesetzt. Biotinyliertes Anti-T3 wurde auf herkömmliche Weise durch Reaktion von Biotin-LC7NHS (Pierce Chemical Company) mit monoklonalem Anti-T3, gefolgt von Reinigung durch Chromatographie auf einer Sephadex-Säule, hergestellt. 50 μl biotinyliertes Anti-T3 (70 ng/ml) in Assaypuffer wurden zugesetzt. Der Tracer, T3LC21-FI (1,8 ng/ml)
    Figure 00540001
    in Assaypuffer (50 μl) wurde zugesetzt. Das Gemisch wurde 15 min lang bei 37 °C inkubiert. 500 μl einer Suspension von Sensibilisatorperlen 50 μg) und Akzeptorperlen (6,25 μg) in Assaypuffer wurden zugesetzt und das Gemisch 15 min lang bei 37°C inkubiert. Es wurde „Stop Solution" (50 μl; 10 μM Fluorescein, 0,5 mM Biotin) zugesetzt.
  • Signal wurde durch eine Halogenlampe mit einem 610 nm-Cutoff-Filter mittels einminütiger Bestrahlung sowie 20-s-Messung abgelesen.
  • Ergebnisse
  • Das Lumineszenzsignal wurde als Funktion der T3-Konzentration aufgetragen. Die Signalmodulation betrug 94% mit 8,5 ng/ml T3. Bei 0,5 ng/ml betrug die Signalmodulation 38%.
  • BEISPIEL 2
  • Chemolumineszenz-Quantenausbeute und Bestimmung der Abklingrate
  • Herstellung von Verbindung 11
  • Einer gerührten Lösung von 2,55 g 4-Dimethylaminobenzoin (10 mMol) in 50 ml trockenem Toluol wurden 1,2 ml 2-Mercaptoethanol (15 mMol) und anschließend 2,5 ml TMSCI zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 18 Stunden lang unter Argon am Rückfluss gehalten, auf Raumtemperatur abgekühlt und in 150 ml einer gesättigten Bicarbonatlösung gegossen. Das Zweiphasen-Gemisch wurde getrennt. Die organische Phase wurde mit 100 ml gesättigter Bicarbonatlösung gewaschen. Die kombinierten wässrigen Phasen wurden mit 75 ml CH2Cl2 extrahiert. Die kombinierten organischen Phasen wurden über Natriumsulfat (20 g) getrocknet und eingedampft. Der verbleibende Rückstand wurde Flashchromatographie unterzogen (CH2Cl2), um 2,6 g der Verbindungen 11 und 20 (4 : 1-Gemisch der 2-Regioisomere) zu ergeben.
  • Der aschfarbene Feststoff wurde aus einem CH2Cl2-MeOH-Gemisch (10 : 90) umkristallisiert, um 1,8 g nadelförmige Kristalle eines einzigen Regioisomers der Verbindung 11 zu ergeben.
  • Fp.: 108°C–110°C 1H-NMR (CDCl3, 250 MHz): δ 2,85 (s, 6H), 3,22 (t, 2H), 4,5 (t, 2H), 6,55 (d, 2H), 7,1 – 7,3 (m, zH) Massenspektrum: (Cl: m/e, relative Intensität) Hauptpeaks: 297 (M+, 40), 165 (100) Absorptionsspektren (Toluol): 330 nm (ε 13.000)
  • Photooxidations-Verfahren
  • 25 mg Verbindung 11 (Haupt-Regioisomer, siehe oben) wurden in 10 ml CH2Cl2 in einen Photooxidations-Röhrchen gelöst. Etwa 50 mg Polystyrol-gebundenes Diodeosin wurde zugesetzt und ein Sauerstoff-Einleitrohr angeschlossen. Sauerstoff wurde langsam durch die Lösung geleitet, während die Probe mit einer Dolan-Jenner-Lampe (ausgestattet mit einem 500 nm-Cutoff-Filter) bestrahlt wurde. Der Reaktionsverlauf wurde durch DC überwacht. Ein Fleck für das Thioesterprodukt konnte detektiert werden und besaß einen niedrigeren Rf(CH2Cl2) als Verbindung 11. Die Reaktion wurde als abgeschlossen betrachtet, als Verbindung 13 vollständig aufgebraucht war. Der Sensibilisator wurde abfiltriert und die Lösung auf einem Rotationsverdampfer eingedampft, um 26 mg Thioester 32 als einziges Produkt zu ergeben.
  • Figure 00560001
  • 1H-NMR: (CD2Cl2): δ 3,05 (s, 6H), 3,4 (5, 2H), 4,45 (5, 2H), 6,72 (d, 2H), 7,5 (m, 3H), 7,85 (d, 2H), 8,05 (d, 2H).
  • Massenspektren (Cl, relative Intensität) Hauptpeaks 329 (M+, 25) 148 (100) Absorptionsspektrum (CH2Cl2): 342 nm (~ 30.000) Fluoreszenzspektrum (Toluol): 370 nm
  • Fluoreszenzmessungen
  • Eine Lösung von Thioester 32 wurde in vier unterschiedlichen Lösungsmitteln gebildet (trockenes Toluol; CH2Cl2; Hexan; und Acetonitril) und in eine 1-cm2-Quarzkuvette im Probenfach eines Perkin-Elmer 650-40-Fluorimeters gefüllt. Die Probe wurde an den Absorptionsmaxima jedes Lösungsmittels angeregt (Schlitzbreite: 2 nm) und die Emissionsspektren (Schlitzbreite: 3 nm) durch Abtasten von 350 nm bis 470 nm aufgezeichnet. Der Fluroeszenz-Wirkungsgrad wurde bestimmt und ist in Tabelle 1 angegeben.
  • Tabelle 1 Wirkungsgrad von Thioester in unterschiedlichen Lösungsmitteln
    Figure 00570001
  • Bestimmung der Quantenausbeute der Chemolumineszenz
  • Herstellung von Eu(TTA)Phen
  • 8,69 g Eu(TTA)3·3H2O (10 mMol, Kodak) und 1,8 g 1,10-Phenanthrolin (10 mMol, Aldrich) in 50 ml trockenem Toluol wurden In einem Ölbad 1 h lang auf 95°C erhitzt. Toluol wurde unter reduziertem Druck entfernt. Der aschfarbene Feststoff wurde aus 10 ml Toluol kristallisiert, um 10 g Eu(TTA)3Phen zu ergeben.
  • Absorptionsspektrum. 270 nm (20.000), 340 nm (60.000) (Toluol) IR(KBr): Cm–1: 3440(s), 1600(s), 1540(s), 1400(s), 1300(s)
  • Energietransfer von Eu(TTA)3Phen
  • Eine Lösung von Verbindung 11 (Regioisomere, siehe oben; 0,1 mM; 8 : 2-Gemisch), Aluminiumphthalocyanin (0,1 μM) und Eu(TTA)3Phen (siehe oben; 0 – 4,0 mM) in trockenem Toluol wurden in eine 1 cm2-Quazküvette (zweiseitig versilbert) im Probenfach eines Spex Fluorolog-Spektralphotometers gefüllt. Die Temperatur der Probenhalterung wurde durch ein externes zirkulierendes Wasserbad bei 25°C gehalten. Ein 640-nm-Cutoff-Filter wurde vor dem Anregungsstrahl angeordnet. Die Probenlösungen wurden zumindest 3 min lang im Probenfach gehalten, bis thermisches Gleichgewicht erzielt wurde. Die Emission wurde im zeitabhängigen Modus aufgezeichnet. Die Proben wurden bei 680 nm (Schlitzbreite 24 nm) bestrahlt, bis ein stationärer Emissionszustand bei 613 nm (Schlitzbreite 8 nm) erreicht wurde. Die Lichtintensität im stationären Zustand bei verschiedenen Konzentrationen von Eu(TTA)3-Phen wurde aufgezeichnet und ist in Tabelle 2 zusammengefasst. Anhand der Lichtintensität im stationären Zustand wurden die Quantenausbeuten bestimmt. Reziproke Doppelkurven der Chemolumineszenzintensität über der Eu(TTA)3Phen-Konzentration waren linear.
  • Tabelle 2 Chemolumineszenz-Wirkungsgrad als Funktion von Eu(TTA)3Phen-Konzentration
    Figure 00590001
  • Chemolumineszenz von Dioxen 9
  • Versuch 1: Eine Lösung von Dioxen 9 (0,1 mM) und Aluminiumphthalocyanin (0,1 μM) in trockenem Toluol wurde mit 680 nm wie oben bestrahlt. Es wurde die Emission bei einer Lichtintensität von 400 nm (Schlitzbreite 8 nm) als Funktion der Bestrahlungszeit aufgezeichnet. Die Lichtintensität betrug für 180 s Bestrahlung 8793 RLUs (Mittelwert von drei Versuchen).
  • Versuch 2: Die Rate der Dioxen 9-Dioxetan-Zersetzung wurde durch Abklingen der Chemolumineszenz einer belüfteten Lösung in trockenem Toluol bei 25°C überwacht. Die Zersetzungsrate wurde in Gegenwart von 1,0 μM Aluminiumphthalocya nin und Dioxen (weniger als 0,1 mM Dioxen) überwacht. Das Abklingen der Chemolumineszenz wurde auf einem Spex-Fluorolog-Spektralphotometer unter den oben genannten Bedingungen überwacht. Die Geschwindigkeitskonstante des Abklingens bei 25°C betrug 2,88 × 10–4 s–1.
  • Herstellung von Akzeptorperlen
  • 4 ml einer 20% Suspension (400 mg) von 175 nm gewaschenem Carboxylat-modifiziertem Latex wurde mit 3 ml Ethoxyethanol in einem 25 ml Rundkolben mit einem Rührer verdünnt. Der Rundkolben wurde dann bei 105°C in ein Ölbad eingebracht und 10 min lang gerührt. Danach wurden 3,3 mM Thioxen 11 und 15,5 mM Eu(TTA)3DPP zugesetzt. Die Perlen wurden 5 weitere min lang gerührt. Zu diesem Zeitpunkt wurde 1,0 ml 0,1 n NaOH langsam im Lauf von 5 min zugesetzt. Während aller Zugaben wurde die Ölbadtemperatur auf 105°C gehalten. Die Ölbadtemperatur wurde im Lauf von 2 h langsam auf Raumtemperatur gesenkt.
  • Nach dem Abkühlen wurde das Gemisch mit 20 ml Ethanol verdünnt und zentrifugiert (12.500 U/min, 30 min}. Überstände wurden verworfen und die Pellets in Ethanol durch Ultraschallbehandlung resuspendiert. Die Zentrifugation wurde wiederholt und das Pellet in Wasser resuspendiert; dann wurde die Zentrifugation nochmals wiederholt. Das Pellet wurde in 5 ml wässrigem Ethanol in einem Endvolumen von 40 ml resuspendiert. Die Endkonzentration der Perlen betrug 10 mg/ml.
  • Die Konzentration von Eu(TTA)3DPP wurde spektralpotometrisch bestimmt. Eine Aliquote der Perlensuspension wurde unter einem Strom von trockenem Argon bis zur Trockene eingeengt und der Rückstand in Dioxan gelöst. Unter Annahme einer Dichte von 1,06 g/cm3 für Polystyrol, (ε 340 nm = 6,7 × 104) für Eu(TTA) und (ε 270 nm = 4,0 × 104) für DPP wurde die Konzentration von Eu(TTA)3DPP mit 100 mM bestimmt. Die Konzentration von Verbindung 11 in den Perlen konnte nicht bestimmt werden, da ihre Extinktion durch Eu(TTA)3DPP maskiert war.
  • Die Chemolumineszenz der Perlen wurde in einem ORIEL-Luminometer unter Einsatz von wasserlöslichem Aluminiumphthalocyanin als Sensibilisator gemessen. Eine Aliquote von Perlen wurde in Phosphatpuffer, pH 8,0, mit 0,1% Tween-20 auf 100 μg/ml verdünnt. 1,0 μM Aluminiumphthalocyanintetrasulfonsäure wurde zugesetzt und das chemolumineszierende Signal als Funktion der Bestrahlungszeit gemessen. Eine identische Probe wurde auch in ein Spex-Fluorolog-Fluorimeter eingebracht und bei 680 nm (Schlitzbreite: 20 nm; 640-nm-Cutoff-Filter) bestrahlt. Die Chemolumineszenz-Emissionsspektren wurden durch Abtasten von 570 nm bis 620 nm aufgezeichnet und sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
  • Bestimmung von Quantenausbeuten in Perlen
  • Dioxen 9-Perlen
  • Eine Lösung von Dioxen 9-Perlen (0,2 mg) in Aluminiumphthalocyanintetrasulfonsäure (2,5 μM) in Phosphatpuffer (pH 8,2; 50 mM 0,1% Tween-20) wurde in eine 1-cm2-Quarzküvette (zweiseitig versilbert) im Probenfach eines Spex-Fluorolog-Spektralphotometers gefüllt. Die Temperatur der Probenhalterung wurde auf 25°C gehalten. Ein 640-nm-Cutoff-Filter wurde vor dem Anregungsstrahl positioniert. Die Probenlösungen wurden zumindest 3 min lang im Probenfach gehalten, damit thermisches Gleichgewicht erzielt werden konnte. Die Lichtemission bei 360 nm wurde im zeitabhängigen Modus aufgezeichnet. Die Proben wurden bei 680 nm (Schlitzbreite: 24 nm) 60 s lang bestrahlt. Die Emission bei 360 nm (Schlitzbreite: 16 nm) wurde im Zeitverlauf 5000 s lang aufgezeichnet. Das gesamte ausgestrahlte Licht wurde mittels das „Cut-and-weigh"-Verfahrens bestimmt. Auch die Peakform-Korrektur erfolgte durch das Cut-and-weigh-Verfahren. Das gesamte bei 360 nm ausgestrahlte Licht betrug 8,87 ± 0,2 × 104 RLUs (45000 s (nach der Peakform-Korrektur; Mittelwert von 2 Versuchen}.
  • Dioxen 9: Eu(TTA)3TOPO-Perlen
  • Eine Lösung von Dioxen 9 Eu(TTA)3TOPO-Perlen (0,2 mg) und Aluminiumphthalocyanintetrasulfonsäure (2,5 μM) in Phosphatpuffer (pH 8,2, 50 mM 0,1% Tween-20) wurde in eine 1-cm2-Quarzküvette (zweiseitig versilbert) im Probenfach eines Spex-Fluorolog-Spektralphotometers gefüllt. Der Rest des Versuchs erfolgte wie für die Dioxen 9-Perlen. Die Lichtemission der Perlen wurde bei 613 nm (Schlitzbreite: 16 nm) aufgezeichnet.
  • Das gesamte ausgesendete Licht wurde durch das Cut-and-weigh-Verfahren bestimmt. Die PMT-Korrektur erfolgte wie zuvor in Lösungsstudien beschrieben. Das gesamte ausgesendete Licht bei 613 nm betrug 25,0 ± 0,3 × 105 RLUs/4500 s (nach PMT-Korrektur; Mittelwert von 2 Versuchen).
  • Verfahren betreffend den stationären Zustand
  • Dioxen 9: Eu(TTA)3TOPO-Perlen
  • Eine Lösung von Dioxen 9 (Eu(TTA)3TOPO-Perlen; 0,5 mg) und Aluminiumphthalocyanintetrasulfonsäure (0,05 μM) in Phosphatpuffer (pH 8,2; 50 mM 0,1% Tween-20) wurde in ein 12–75 mM Reagenzglas im Probenfach eines ORIEL-Chemoluminometers gefüllt. Die Temperatur der Probenhalterung betrug 37°C. Ein 610-nm-Cutoft-Filter wurde vor dem Anregungsstrahl positioniert. Die Probenlösungen wurden zumindest 5 min lang im Probenfach gehalten, damit thermisches Gleichgewicht erzielt werden konnte. Die Probe wurde in 30 s-Intervallen bestrahlt, gefolgt von einer 5 s dauernden Ablesezeit, bis ein stationärer Emissionszustand erreicht wurde. Die durchschnittliche Intensität bei Emission in stationärem Zustand betrug 21.000 ± 1000 RLUs (3 Versuche).
  • Verbindung 11: Eu(TTA)3DPP-Perlen
  • Eine Lösung von Thioxen 11 (Eu(TTA)3DPP-Perlen (0,5 mg) und Aluminiumphthalocyanintetrasulfonsäure (0,05 μM) in Phosphatpuffer (pH 8,2, 50 mM, 0,1% Tween-20) wurde in ein 12-75 mM Reagenzglas im Probenfach eines ORIEL-Chemoluminometers gefüllt. Die Temperatur der Probenhalterung betrug 37°C. Ein 610-nm-Cutoff-Filter wurde vor dem Anregungsstrahl positioniert. Die Probenlösungen wurden zumindest 5 min lang im Probenfach gehalten, damit thermisches Gleichgewicht erzielt werden konnte. Die Probe wurde in 6 s-Intervallen bestrahlt, gefolgt von einer 3 s dauernden Ablesezeit, bis ein stationärer Emissionszustand erreicht wurde. Die durchschnittliche Intensität bei Emission in stationärem Zustand betrug 32.000 ± 1000 (3 Versuche).
  • Tabelle 3 Chemolumineszenz-Eigenschaften von Thioxen 11 und Dioxen 9
    Figure 00640001

Claims (18)

  1. Chemolumineszierende Verbindung der Formel:
    Figure 00650001
  2. Zusammensetzung, umfassend (a) ein Metallchelat, das ein Metall, das aus der aus Europium, Terbium, Dysprosium, Samarium, Osmium und Ruthenium bestehenden Gruppe ausgewählt ist, in zumindest sechfach koordiniertem Zustand umfasst; und (b) eine chemolumineszierende Verbindung nach Anspruch 1.
  3. Zusammensetzung, die einen Latex umfasst, in dem eine Verbindung nach Anspruch 1 enthalten ist.
  4. Zusammensetzung nach Anspruch 3, die weiters ein Metallchelat umfasst, worin das Metall aus der aus Europium, Terbium, Dysprosium, Samarium, Osmium und Ruthenium bestehenden Gruppe in zumindest sechsfach koordiniertem Zustand ausgewählt ist.
  5. Verfahren zum Bestimmen eines Analyten, das Folgendes umfasst: (a) das Bereitstellen einer Kombination aus (1) einem Medium, von dem vermutet wird, dass es einen Analyten enthält, (2) einem Photosensibilisator, der in seinem angeregten Zustand in der Lage ist, Sauerstoff in den Singlett-Zustand zu aktivieren, wobei der Photosensibilisator mit einem Element eines spezifischen Bindungspaares (sbp) assoziiert ist, und (3) suspendierbarem Latex-Teilchenmaterial, das eine chemolumineszierende Verbindung umfasst, wobei an das Teilchenmaterial ein sbp-Element gebunden ist, wobei die chemolumineszierende Verbindung eine Verbindung nach Anspruch 1 ist; (b) das Behandeln der Kombination mit Licht, um den Photosensibilisator anzuregen, und (c) das Untersuchen der Kombination bezüglich der Menge an davon ausgesandter Lumineszenz, wobei die Menge der Lumineszenz mit der Menge an Analyt im Medium in Beziehung steht.
  6. Verfahren nach Anspruch 5, worin der Photosensibilisator in einem zweiten suspendierbaren Teilchenmaterial enthalten ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, worin der Photosensibilisator ein Farbstoff ist, der im angeregten Zusand molekularen Sauerstoff zu Singlett-Sauerstoff aktivieren kann.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, worin der Farbstoff aus der aus Methylenblau, Diodeosin, Porphyrinen und Phthalocyaninen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  9. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, worin die sbp-Elemente unabhängig voneinander aus der aus Rezeptoren, Liganden und Polynucleotiden bestehenden Gruppe ausgewählt sind.
  10. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 9, worin der Analyt aus der aus Arzneimitteln, Proteinen, Nucleinsäuren und Mikroorganismen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  11. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 10, worin das Verfahren ein homogener Immuntest ist.
  12. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 11, worin die Kombination mittels Bestrahlung behandelt wird, um den Photosensibilisator anzuregen.
  13. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 12, worin die Kombination mit Licht mit einer Wellenlänge von 450 bis 950 nm bestrahlt wird.
  14. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 13, worin das mit dem Photosensibilisator assoziierte sbp-Element Avidin oder ein Antikörper ist und das sbp-Element der chemolumineszierenden Verbindung Avidin oder ein Antikörper ist.
  15. Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 14, worin das Teilchenmaterial ein Metallchelat umfasst, das ein Metall umfasst, das aus der aus Europium, Terbium, Dysprosium, Samarium, Osmium und Ruthenium bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
  16. Set, das eine abgepackte Kombination aus Folgendem umfasst: (1) einer Zusammensetzung, die ein suspendierbares Latexteilchen umfasst, das eine chemolumineszierende Verbindung nach Anspruch 1 umfasst, wobei an das Teilchen ein Element eines spezifischen Bindungspaares (sbp) gebunden ist, und (2) einem Photosensibilisator, der in seinem angeregten Zustand dazu fähig ist, Sauerstoff in seinen Singlett-Zustand zu aktivieren.
  17. Set nach Anspruch 16, das eine Zusammensetzung umfasst, die ein zweites suspendierbares Teilchen umfasst, das den Photosensibilisator umfasst, wobei an das zweite Teilchen ein sbp-Element gebunden ist.
  18. Set nach Anspruch 16 oder 17, worin das Teilchenmaterial ein Metallchelat umfasst, das ein Metall umfasst, das aus der aus Europium, Terbium, Dysprosium, Samarium, Osmium und Ruthenium bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
DE69432640T 1993-11-22 1994-11-21 Metall-chelat enthaltende zusammensetzungen zur verwendung in chemilumineszierenden assays Expired - Lifetime DE69432640T2 (de)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US08/156,181 US5578498A (en) 1991-05-22 1993-11-22 Metal chelate containing compositions for use in chemiluminescent assays
US156181 1993-11-22
PCT/US1994/013193 WO1995014928A1 (en) 1993-11-22 1994-11-21 Metal chelate containing compositions for use in chemiluminescent assays

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE69432640D1 DE69432640D1 (de) 2003-06-12
DE69432640T2 true DE69432640T2 (de) 2004-03-25

Family

ID=22558459

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE69432640T Expired - Lifetime DE69432640T2 (de) 1993-11-22 1994-11-21 Metall-chelat enthaltende zusammensetzungen zur verwendung in chemilumineszierenden assays

Country Status (7)

Country Link
US (9) US5578498A (de)
EP (2) EP0730738B1 (de)
JP (1) JP3426241B2 (de)
AT (1) ATE239917T1 (de)
CA (1) CA2177143C (de)
DE (1) DE69432640T2 (de)
WO (1) WO1995014928A1 (de)

Families Citing this family (116)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6395506B1 (en) * 1991-04-18 2002-05-28 Becton, Dickinson And Company Device for monitoring cells
US5578498A (en) * 1991-05-22 1996-11-26 Behringwerke Ag Metal chelate containing compositions for use in chemiluminescent assays
US6251581B1 (en) * 1991-05-22 2001-06-26 Dade Behring Marburg Gmbh Assay method utilizing induced luminescence
WO1994002486A1 (en) * 1992-07-20 1994-02-03 Syntex (U.S.A.) Inc. Novel chemiluminescent compounds and methods of use
US6002000A (en) * 1992-07-20 1999-12-14 Dade Behring Marburg Gmbh Chemiluminescent compounds and methods of use
US5827653A (en) * 1993-09-23 1998-10-27 Zeneca Limited Nucleic acid detection with energy transfer
EP0881879B1 (de) * 1996-02-19 2003-06-18 Schaffer, Moshe Photoempfindliche zusammensetzung
DE69736382T2 (de) * 1996-05-01 2007-08-09 Dade Behring Marburg Gmbh Chemilumineszente zusammensetungen und ihre verwendung zum nachweis von wasserstoffperoxid
US6028025A (en) * 1996-10-21 2000-02-22 Massachusetts Institute Of Technology Metalloporphyrin oxidation catalyst covalently coupled to an inorganic surface and method making same
US5854078A (en) 1996-11-06 1998-12-29 University Of Pittsburgh Polymerized crystalline colloidal array sensor methods
US5898004A (en) * 1996-11-06 1999-04-27 University Of Pittsburgh Of The Commonwealth System Of Higher Education Polymerized crystalline colloidal array sensors
US6753191B2 (en) 1996-11-06 2004-06-22 University Of Pittsburgh Polymerized crystalline colloidal array chemical sensing materials for use in high ionic strength solutions
US5772926A (en) * 1997-05-13 1998-06-30 Lumigen, Inc. Chemiluminescent reactions using dihydroxyaromatic compounds and heterocyclic enol phosphates
WO1999006821A1 (de) * 1997-08-01 1999-02-11 Presens Precision Sensing Gmbh Verfahren und vorrichtung zur referenzierung von fluoreszenzintensitätssignalen
US6322980B1 (en) 1999-04-30 2001-11-27 Aclara Biosciences, Inc. Single nucleotide detection using degradation of a fluorescent sequence
US6514700B1 (en) * 1999-04-30 2003-02-04 Aclara Biosciences, Inc. Nucleic acid detection using degradation of a tagged sequence
US20040248150A1 (en) * 1999-04-02 2004-12-09 Sharat Singh Methods employing oligonucleotide-binding e-tag probes
US6627400B1 (en) 1999-04-30 2003-09-30 Aclara Biosciences, Inc. Multiplexed measurement of membrane protein populations
US20030235832A1 (en) * 2000-06-21 2003-12-25 Ahmed Chenna Multiplexed analysis by chromatographic separation of molecular tags
US7001725B2 (en) 1999-04-30 2006-02-21 Aclara Biosciences, Inc. Kits employing generalized target-binding e-tag probes
US6673550B2 (en) 1999-04-30 2004-01-06 Aclara Biosciences, Inc. Electrophoretic tag reagents comprising fluorescent compounds
US7037654B2 (en) 1999-04-30 2006-05-02 Aclara Biosciences, Inc. Methods and compositions for enhancing detection in determinations employing cleavable electrophoretic tag reagents
DE19933104A1 (de) * 1999-07-15 2001-01-18 Ingo Klimant Phosphoreszierende Mikro- und Nanopartikel als Referenzstandard und Phosphoreszenzmarker
US6329205B1 (en) 1999-08-31 2001-12-11 Molecular Probes, Inc. Detection method using luminescent europium-based protein stains
WO2001032665A2 (en) * 1999-11-01 2001-05-10 Fluorrx, Inc. New ruthenium metal ligand complexes
US6703248B1 (en) * 1999-12-15 2004-03-09 Dade Behring Marburg Gmbh Particles for diagnostic and therapeutic use
EP1264181B1 (de) 2000-03-06 2007-06-06 Dade Behring Marburg GmbH Mit polysacchariden beschichtete träger, deren herstellung und verwendung
US20030207300A1 (en) * 2000-04-28 2003-11-06 Matray Tracy J. Multiplex analytical platform using molecular tags
US7771929B2 (en) * 2000-04-28 2010-08-10 Monogram Biosciences, Inc. Tag library compounds, compositions, kits and methods of use
US7537938B2 (en) * 2000-04-28 2009-05-26 Monogram Biosciences, Inc. Biomarker detection in circulating cells
US7160735B2 (en) * 2000-04-28 2007-01-09 Monogram Biosciences, Inc. Tagged microparticle compositions and methods
US7635571B2 (en) * 2000-12-07 2009-12-22 Siemens Healthcare Diagnostics Products Gmbh Amplified signal in binding assays
SG92833A1 (en) * 2001-03-27 2002-11-19 Sumitomo Chemical Co Polymeric light emitting substance and polymer light emitting device using the same
EP1565747B1 (de) * 2001-03-29 2013-11-27 Cellect Technologies Corp. Verfahren and System zum Sortieren und Trennen von Teilchen
WO2002095356A2 (en) * 2001-05-21 2002-11-28 Aclara Biosciences, Inc. Methods and compositions for analyzing proteins
WO2002094998A2 (en) 2001-05-21 2002-11-28 Aclara Biosciences, Inc. Analyzing phosphorylated proteins
US7358052B2 (en) * 2001-05-26 2008-04-15 Monogram Biosciences, Inc. Catalytic amplification of multiplexed assay signals
US20030089273A1 (en) * 2001-08-23 2003-05-15 Thomas Potrawa Europium-ammonium tetra chelates
US7045311B2 (en) * 2001-10-25 2006-05-16 Monogram Biosciences, Inc. Whole cell assay systems for cell surface proteases
CN1166422C (zh) * 2001-11-05 2004-09-15 北京源德生物医学工程股份有限公司 用于体外高能聚焦超声波治疗机的坐位架
US20050053939A1 (en) * 2001-11-09 2005-03-10 Ahmed Chenna Methods and compositions for enhancing detection in determinations employing cleavable electrophoretic tag reagents
AU2003222253A1 (en) * 2002-03-05 2003-09-22 Monogram Biosciences, Inc. Multiplex analysis using membrane-bound sensitizers
US20040229299A1 (en) * 2002-05-21 2004-11-18 Badal M. Youssouf Intracellular complexes as biomarkers
US20040229380A1 (en) * 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui ErbB heterodimers as biomarkers
US20040229294A1 (en) 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui ErbB surface receptor complexes as biomarkers
US20040229293A1 (en) * 2002-05-21 2004-11-18 Po-Ying Chan-Hui Surface receptor complexes as biomarkers
US7402397B2 (en) * 2002-05-21 2008-07-22 Monogram Biosciences, Inc. Detecting and profiling molecular complexes
US20040175765A1 (en) * 2002-07-05 2004-09-09 Sharat Singh Cell-screening assay and composition
CA2490654C (en) * 2002-07-25 2012-02-07 Aclara Biosciences, Inc. Detecting receptor oligomerization
US6783699B2 (en) 2002-10-17 2004-08-31 Medgene, Inc. Europium-containing fluorescent nanoparticles and methods of manufacture thereof
AU2003280667A1 (en) * 2002-10-31 2004-05-25 Reverse Proteomics Research Institute Co., Ltd. Method of immobilizing compound on solid phase support
US20040091850A1 (en) * 2002-11-08 2004-05-13 Travis Boone Single cell analysis of membrane molecules
US7179542B2 (en) 2003-05-20 2007-02-20 Canon Kabushiki Kaisha Thiazole- and imidazole-fused phenanthroline molecules in organic light-emitting devices
CN1795252A (zh) * 2003-05-22 2006-06-28 三菱化学株式会社 发光器件和荧光材料
US7402398B2 (en) * 2003-07-17 2008-07-22 Monogram Biosciences, Inc. Measuring receptor homodimerization
JP2007502417A (ja) * 2003-08-11 2007-02-08 モノグラム バイオサイエンシズ，インコーポレーテッド 分子複合体の検出および特徴づけ
EP1680666A4 (de) * 2003-10-27 2008-03-26 Monogram Biosciences Inc Nachweisen von menschlichen antitherapeutischen antikörpern
WO2005062048A1 (de) 2003-12-01 2005-07-07 Dade Behring Marburg Gmbh Homogenes nachweisverfahren
US7722842B2 (en) * 2003-12-31 2010-05-25 The Ohio State University Carbon dioxide sequestration using alkaline earth metal-bearing minerals
US8859291B2 (en) * 2004-06-09 2014-10-14 Perkinelmer Las, Inc. Methods for target molecule detection using siderophores and related compositions
US7964407B2 (en) * 2004-07-21 2011-06-21 Bates Lynn S Methods of marking products using natural materials having genetically controlled micromorphological structures as markers
US7807468B2 (en) * 2004-07-21 2010-10-05 Bates Lynn S Methods of marking and testing pharmaceutical products
US20060040258A1 (en) * 2004-08-23 2006-02-23 Huiyan Guo Water-soluble conjugates and methods of preparation
RU2007114042A (ru) * 2004-09-17 2008-10-27 Чирон Корпорейшн (Us) Гомогенный люминесцентный способ анализа при сближении, опосредованного трехвалентным металлом
US7939267B2 (en) * 2004-11-04 2011-05-10 Laboratory Corporation Of America Holdings Detection of activation of endothelial cells as surrogate marker for angiogenesis
US20060166376A1 (en) * 2005-01-21 2006-07-27 Craig Alan R Compositions for use as a signal generation component and methods of using same
CN100429197C (zh) * 2005-02-04 2008-10-29 博阳生物科技（上海）有限公司 双丁二酮化合物、铕配合物、含该配合物的组合物及其用途
US20060205090A1 (en) * 2005-03-14 2006-09-14 Newton Michael W Water-soluble conjugates for electrochemical detection
CN100445744C (zh) * 2005-04-25 2008-12-24 博阳生物科技（上海）有限公司 用于免疫分析的微球组合物或组件及免疫分析方法
US20080312092A1 (en) * 2005-07-08 2008-12-18 The University Of Denver Photoinduced Signal Amplification Through Externally Sensitized Photofragmentation in Masked Photosensitizers
US20090247420A1 (en) * 2005-12-12 2009-10-01 Kutateladze Andrei G Method for encoding and screening combinatorial libraries
US20080220434A1 (en) * 2007-02-07 2008-09-11 Perscitus Biosciences, Llc Detection Of Molecule Proximity
US8735167B2 (en) * 2007-08-20 2014-05-27 Colorado Seminary, Which Owns And Operates The University Of Denver Photoinduced signal amplification through externally sensitized photofragmentation in masked photosensitizers and photoamplified fluorescence turn-off system
CA2706763C (en) * 2007-11-27 2013-07-30 Laboratory Corporation Of America Holdings Enhanced method for detecting and/or quantifying an analyte in a sample
US10416162B2 (en) * 2007-12-20 2019-09-17 Monogram Biosciences, Inc. Her2 diagnostic methods
CN101251540B (zh) * 2008-03-26 2012-12-05 博阳生物科技（上海）有限公司 乙型肝炎病毒e抗原检测微粒、其制备及应用
EP2406545B1 (de) 2008-09-26 2019-05-29 The Ohio State University Umwandlung von kohlenstoffhaltigen brennstoffen in kohlenstofffreie energieträger
CA2764386C (en) 2008-12-01 2018-05-01 Laboratory Corporation Of America Holdings P95-her2 antibodies and uses thereof
SG10201408392PA (en) 2009-01-15 2015-01-29 Lab Corp America Holdings Methods of determining patient response by measurement of her-3
US8486719B2 (en) 2009-02-20 2013-07-16 Perkinelmer Biosignal, Inc. Multiplex assay methods and compositions
US9347947B2 (en) * 2009-03-12 2016-05-24 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Immunoassays employing non-particulate chemiluminescent reagent
JP5311662B2 (ja) * 2009-08-24 2013-10-09 キッコーマン株式会社 ペルオキシダーゼ化学発光反応の発光増強方法及びペルオキシダーゼ化学発光反応用発光増強剤
EP2483371B1 (de) 2009-09-08 2017-11-08 The Ohio State University Research Foundation Herstellung von synthetischen kraftstoffen und chemischen stoffen mit in-situ co2-abscheidung
ES2630217T3 (es) 2009-09-08 2017-08-18 The Ohio State University Research Foundation Integración de reformación/división de agua y sistemas electromagnéticos para generación de energía con captura de carbono integrada
US8153442B2 (en) * 2009-10-21 2012-04-10 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Stabilization of signal generation in particles used in assays
US20110306148A1 (en) 2010-06-14 2011-12-15 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Composition for use as an assay reagent
US10088490B2 (en) 2010-08-20 2018-10-02 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Assay for analytes using multiple receptors
WO2012064712A1 (en) 2010-11-08 2012-05-18 The Ohio State University Circulating fluidized bed with moving bed downcomers and gas sealing between reactors
DE102011007546A1 (de) 2011-04-15 2012-10-18 Humboldt-Universität Zu Berlin Messvorrichtung für eine Messung einer Singulettsauerstoff-Lumineszenz
US9903584B2 (en) 2011-05-11 2018-02-27 Ohio State Innovation Foundation Systems for converting fuel
US9777920B2 (en) 2011-05-11 2017-10-03 Ohio State Innovation Foundation Oxygen carrying materials
SG194609A1 (en) 2011-05-19 2013-12-30 Lab Corp America Holdings Methods for determining the likelihood of survival and for predicting likelihood of metastasis in cancer patients
WO2013025532A2 (en) 2011-08-12 2013-02-21 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Detection of sex steroids
US9244083B2 (en) 2012-11-30 2016-01-26 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Compositions and methods for detecting vitamin D
AU2014214982B2 (en) 2013-02-05 2017-11-16 Ohio State Innovation Foundation Methods for fuel conversion
US9616403B2 (en) 2013-03-14 2017-04-11 Ohio State Innovation Foundation Systems and methods for converting carbonaceous fuels
EP2981828A1 (de) 2013-04-05 2016-02-10 Laboratory Corporation of America Holdings Systeme und verfahren zur erleichterung der diagnose, prognose und behandlung von krebs auf basis der erkennung einer her3-aktivierung
US20140308751A1 (en) 2013-04-12 2014-10-16 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Assays for Analyte Homologs
US10124072B2 (en) 2013-09-18 2018-11-13 Caliper Life Sciences, Inc. In-vivo reactive species imaging
US20150238915A1 (en) 2014-02-27 2015-08-27 Ohio State Innovation Foundation Systems and methods for partial or complete oxidation of fuels
KR102309377B1 (ko) 2014-06-27 2021-10-05 지멘스 헬쓰케어 다이아그노스틱스 인크. 비타민 d 에피머에 특이적인 결합 파트너
US9746484B2 (en) 2014-06-27 2017-08-29 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Binding partners specific for vitamin D epimers in vitamin D assays
JP2019515252A (ja) 2016-03-15 2019-06-06 ラボラトリー コーポレイション オブ アメリカ ホールディングス 細胞間のタンパク質相互作用を評価する方法
US11111143B2 (en) 2016-04-12 2021-09-07 Ohio State Innovation Foundation Chemical looping syngas production from carbonaceous fuels
AU2017292172A1 (en) 2016-07-06 2019-01-03 Prothena Biosciences Limited Assay for detecting total and S129 phosphorylated alpha-synuclein
CA3071395A1 (en) 2017-07-31 2019-02-07 Ohio State Innovation Foundation Reactor system with unequal reactor assembly operating pressures
WO2019118592A1 (en) * 2017-12-12 2019-06-20 Massachusetts Institute Of Technology Cell-permeable imaging sensors and uses thereof
US10549236B2 (en) 2018-01-29 2020-02-04 Ohio State Innovation Foundation Systems, methods and materials for NOx decomposition with metal oxide materials
CN110514651A (zh) 2018-05-21 2019-11-29 博阳生物科技（上海）有限公司 一种化学发光免疫分析测定方法及使用该方法的系统、试剂盒
KR102281252B1 (ko) * 2018-05-21 2021-07-23 (주)인벤티지랩 두타스테라이드를 포함하는 마이크로 입자 및 이의 제조 방법
WO2019223691A1 (zh) 2018-05-21 2019-11-28 博阳生物科技（上海）有限公司 一种化学发光分析测定方法及使用该方法的系统、试剂盒
CN112424589A (zh) 2018-07-30 2021-02-26 美国西门子医学诊断股份有限公司 用于进行生物素测定的试剂盒、微流体装置和方法
WO2020033500A1 (en) 2018-08-09 2020-02-13 Ohio State Innovation Foundation Systems, methods and materials for hydrogen sulfide conversion
WO2020210396A1 (en) 2019-04-09 2020-10-15 Ohio State Innovation Foundation Alkene generation using metal sulfide particles
CN112500434B (zh) * 2020-11-20 2021-10-22 复旦大学 基于铱配合物的光扳机分子及应用
CN115947714A (zh) * 2022-11-01 2023-04-11 上海泰辉生物科技有限公司 光化学缓存剂的合成方法

Family Cites Families (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3340716A (en) * 1964-11-10 1967-09-12 Reynolds Metals Co Method of producing wrought structure
US3720622A (en) * 1970-01-02 1973-03-13 American Cyanamid Co Generation of light from the decomposition of dioxetaneones in the presence of a fluorescer
US3850578A (en) 1973-03-12 1974-11-26 H Mcconnell Process for assaying for biologically active molecules
US3947264A (en) * 1974-04-09 1976-03-30 Uniroyal, Inc. Substituted 2,3-dihydro-,4-oxathiin plant growth stunting agents
US4043792A (en) * 1974-04-09 1977-08-23 Uniroyal, Inc. Plant growth regulation using certain substituted 2,3-dihydro-1,4-oxathiins
US4199559A (en) 1974-08-12 1980-04-22 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US3996345A (en) 1974-08-12 1976-12-07 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4383031A (en) 1975-04-28 1983-05-10 Miles Laboratories, Inc. Homogeneous chemiluminescent specific binding assay
US4174384A (en) 1975-06-30 1979-11-13 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
CA1121647A (en) 1977-11-09 1982-04-13 Norman L. Betz Feed intake limiting acidulated fat for animals
US4529561A (en) 1978-03-24 1985-07-16 The Regents Of The University Of California Method for producing liposomes in selected size range
US4277437A (en) 1978-04-05 1981-07-07 Syva Company Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay
US4233402A (en) 1978-04-05 1980-11-11 Syva Company Reagents and method employing channeling
US4220450A (en) 1978-04-05 1980-09-02 Syva Company Chemically induced fluorescence immunoassay
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4380580A (en) 1978-04-10 1983-04-19 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous chemiluminescent specific binding assay
US4193983A (en) 1978-05-16 1980-03-18 Syva Company Labeled liposome particle compositions and immunoassays therewith
AU517292B2 (en) 1978-06-20 1981-07-23 Syva Co. Fluorescence quenching system
US4226993A (en) 1978-07-24 1980-10-07 Miles Laboratories, Inc. Amino-functionalized phthalhydrazides
US4318707A (en) 1978-11-24 1982-03-09 Syva Company Macromolecular fluorescent quencher particle in specific receptor assays
US4576912A (en) 1978-11-30 1986-03-18 Technicon Instruments Corporation Fluoroimmunoassaying
US4261968A (en) 1979-05-10 1981-04-14 Syva Company Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays
US4299916A (en) 1979-12-26 1981-11-10 Syva Company Preferential signal production on a surface in immunoassays
CA1130297A (en) * 1980-05-02 1982-08-24 Michael A. Puttock Method of making 2,3-dihydro-5,6-diphenyl- 1,4-oxathiin
US4483921A (en) 1981-01-12 1984-11-20 Collaborative Research, Inc. Immunoassay with antigen or antibody labeled liposomes sequestering enzyme
US4650770A (en) 1981-04-27 1987-03-17 Syntex (U.S.A.) Inc. Energy absorbing particle quenching in light emitting competitive protein binding assays
CA1190838A (en) * 1981-07-17 1985-07-23 Cavit Akin Homogeneous nucleic acid hybridization diagnostics by non-radiative energy transfer
CA1180647A (en) * 1981-07-17 1985-01-08 Cavit Akin Light-emitting polynucleotide hybridization diagnostic method
US4522803A (en) 1983-02-04 1985-06-11 The Liposome Company, Inc. Stable plurilamellar vesicles, their preparation and use
US4654300A (en) 1982-04-02 1987-03-31 Syntex (U.S.A.) Inc. Fluorescent microbead quenching assay
US4483929A (en) 1982-05-03 1984-11-20 Liposome Technology Incorporated Liposomes with glycolipid-linked antibodies
US4485054A (en) 1982-10-04 1984-11-27 Lipoderm Pharmaceuticals Limited Method of encapsulating biologically active materials in multilamellar lipid vesicles (MLV)
US4568649A (en) 1983-02-22 1986-02-04 Immunex Corporation Immediate ligand detection assay
US4588578A (en) 1983-08-08 1986-05-13 The Liposome Company, Inc. Lipid vesicles prepared in a monophase
US4652533A (en) 1983-04-28 1987-03-24 Pandex Laboratories, Inc. Method of solid phase immunoassay incorporating a luminescent label
JPS6036962A (ja) 1983-08-09 1985-02-26 Toray Ind Inc 生物学的検査用微粒子
EP0144914A3 (de) 1983-12-12 1986-08-13 Miles Inc. Hybridisierungstest mittels markierter Paare von hybridbindenden Reagenzien
CA1273552A (en) 1985-12-23 1990-09-04 Michael J. Heller Fluorescent stokes shift probes for polynucleotide hybridization assays
ATE88761T1 (de) 1986-01-10 1993-05-15 Amoco Corp Kompetitiver homogener test.
WO1987005334A1 (en) 1986-03-04 1987-09-11 Angenics, Inc. Nucleic acid detection using particle agglutination
US5254477A (en) 1986-06-25 1993-10-19 Trustees Of Tufts College Flourescence intramolecular energy transfer conjugate compositions and detection methods
US5143853A (en) 1986-06-25 1992-09-01 Trustees Of Tufts College Absorbance modulated fluorescence detection methods and sensors
US4857652A (en) * 1986-07-17 1989-08-15 Board Of Governors Of Wayne State University Chemiluminescent 1,2-dioxetane compounds
US5004565A (en) 1986-07-17 1991-04-02 The Board Of Governors Of Wayne State University Method and compositions providing enhanced chemiluminescence from 1,2-dioxetanes
US4959182A (en) 1986-07-17 1990-09-25 Board Of Governors Of Wayne State University Method and compositions providing enhanced chemiluminescence from 1,2-dioxetanes
US5616729A (en) 1986-07-17 1997-04-01 Board Of Governors Of Wayne State University Enhanced chemiluminescence from 1,2-dioxetanes through energy transfer to tethered fluorescers
BR8707399A (pt) 1986-07-24 1988-09-13 Quest Systems Inc Metodo de detectar uma substancia usando decomposicao enzimaticamente induzida de dioxetanos
US4978614A (en) 1988-10-26 1990-12-18 Tropix, Inc. Method of detecting a substance using enzymatically-induced decomposition of dioxetanes
US4891324A (en) 1987-01-07 1990-01-02 Syntex (U.S.A.) Inc. Particle with luminescer for assays
US4806485A (en) * 1987-02-27 1989-02-21 Cooperative Institute For Research In Environmental Sciences Univers. Of Colorado Method of improving the detection limits of UV-VIS absorbing compounds in HPLC by the use of a singlet oxygen trap
US5070158A (en) 1987-03-12 1991-12-03 Hewlett-Packard Company Covalently labeled siloxane polymers
US5017473A (en) 1987-05-26 1991-05-21 Becton, Dickinson And Company Homogeneous chemiluminescence immunoassay using a light absorbing material
US4822878A (en) 1987-06-30 1989-04-18 Viomedics, Inc. Cyclic anhydride derivatives of chromophors
SE8703682L (sv) * 1987-09-24 1989-03-25 Wallac Oy Homogen bestaemningsmetod som utnyttjar affinitetsreaktioner
US4943525A (en) 1987-11-02 1990-07-24 Bioventures, Inc. Simultaneous immunoassay for the determination of antigens and antibodies
US4910303A (en) * 1988-05-26 1990-03-20 Texaco Chemical Company Process for preparing oxazine derivatives
AU636110B2 (en) 1988-06-08 1993-04-22 Nichols Institute Diagnostics Assays utilizing sensitizer-induced production of detectable signal
WO1990002205A1 (en) 1988-08-25 1990-03-08 Angenics, Inc. Detection of nucleic acid sequences using particle agglutination
US5061445A (en) 1988-11-03 1991-10-29 Igen, Inc. Apparatus for conducting measurements of electrochemiluminescent phenomena
US5019496A (en) 1989-02-17 1991-05-28 Gerald Oster Photopolymerization diagnostic test composition and method for immunoassay and nucleic acid assay
CA2035029C (en) 1989-09-06 2001-12-18 Brooks Edwards Synthesis of stable water-soluble chemiluminescent 1,2-dioxetanes and intermediates therefor
AU6602890A (en) 1989-10-05 1991-04-28 Exoxemis, Inc. Haloperoxidase acid optimum chemiluminescence assay system
DE69125992T2 (de) 1990-09-14 1997-08-21 Tosoh Corp Verfahren und Kit für Immunoassay
FI88654C (fi) * 1991-03-15 1993-06-10 Datacity Center Oy Fluorescenshoejningsmetod
ATE350665T1 (de) * 1991-05-22 2007-01-15 Dade Behring Marburg Gmbh Homogenes testsystem zur bestimmung eines analytes
US6251581B1 (en) * 1991-05-22 2001-06-26 Dade Behring Marburg Gmbh Assay method utilizing induced luminescence
US5340716A (en) 1991-06-20 1994-08-23 Snytex (U.S.A.) Inc. Assay method utilizing photoactivated chemiluminescent label
US5578498A (en) * 1991-05-22 1996-11-26 Behringwerke Ag Metal chelate containing compositions for use in chemiluminescent assays
US5257970A (en) 1992-04-09 1993-11-02 Health Research, Inc. In situ photodynamic therapy
ES2113547T3 (es) 1992-07-31 1998-05-01 Behringwerke Ag Matrices quimioluminiscentes fotoactivables.
FR2707658B1 (fr) 1993-07-12 1995-11-24 Prolabo Sa Latex fluorescent comportant au moins deux fluorochromes, procédé d'obtention et application dudit latex comme marqueur, notamment en biologie.
CA2170873A1 (en) 1993-09-03 1995-03-09 Dariush Davalian Fluorescent oxygen channeling immunoassays

Also Published As

Publication number Publication date
US20020058280A1 (en) 2002-05-16
EP0730738A1 (de) 1996-09-11
US20040121490A1 (en) 2004-06-24
WO1995014928A1 (en) 1995-06-01
CA2177143C (en) 2007-09-18
CA2177143A1 (en) 1995-06-01
US20050214875A1 (en) 2005-09-29
EP0730738B1 (de) 2003-05-07
US5536834A (en) 1996-07-16
US6180354B1 (en) 2001-01-30
US5811311A (en) 1998-09-22
US7229842B2 (en) 2007-06-12
US6340599B1 (en) 2002-01-22
US5780646A (en) 1998-07-14
JP3426241B2 (ja) 2003-07-14
US5578498A (en) 1996-11-26
DE69432640D1 (de) 2003-06-12
US6916667B2 (en) 2005-07-12
US6692975B2 (en) 2004-02-17
ATE239917T1 (de) 2003-05-15
EP1091211A1 (de) 2001-04-11
JPH09505888A (ja) 1997-06-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69432640T2 (de) Metall-chelat enthaltende zusammensetzungen zur verwendung in chemilumineszierenden assays
DE69233146T2 (de) Partikel, die eine Zusammensetzung beinhalten, die eine chemilumineszierende Verbindung umfassen
US5616719A (en) Photoactive indicator compounds
US6251581B1 (en) Assay method utilizing induced luminescence
US5340716A (en) Assay method utilizing photoactivated chemiluminescent label
EP1219964B1 (de) Nachweisverfahren, in welchem der High-Dose-Hook-Effekt vermieden, verringert oder nachgewiesen wird
DE69720809T2 (de) Durch gruppen erweiterte fluorophore polymere, die eine hydrophobe und konformativ eingeschrankte mikroumgebung schaffen
JPH09502253A (ja) 光活性化化学発光基質
DE69736382T2 (de) Chemilumineszente zusammensetungen und ihre verwendung zum nachweis von wasserstoffperoxid
JP2003532119A (ja) 複数のアナライトの検出において使用するための組成物
CA2425483C (en) Assay method utilizing induced luminescence

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition
8327 Change in the person/name/address of the patent owner

Owner name: SIEMENS HEALTHCARE DIAGNOSTICS PRODUCTS GMBH, , DE