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TECHNISCHES GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verhinderung oder Behandlung
neoplastischer Erkrankungen, die durch neoplastische Zellen, welche
CD40 exprimieren, gekennzeichnet sind. Insbesondere betrifft die
vorliegende Erfindung die Behandlung oder Verhinderung von B-Zellen-Lymphomen.
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ALLGEMEINER STAND DER
TECHNIK
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Immunoblastische
B-Zellen-Lymphome entstehen häufig
bei Immungeschädigten
wie Allotransplantatempfängern
und anderen Personen, die eine langfristige immunsuppressive Therapie
erhalten, AIDS-Patienten und Patienten mit primären Immundefizienzsyndromen
wie dem X-gebundenen lymphoproliferativen Syndrom oder dem Wiscott-Aldrich-Syndrom
(Thomas et al., Adv. Cancer Res. 57: 329, 1991; Straus et al., Ann.
Intern. Med. 118: 45, 1993). Diese Tumore scheinen als ein Resultat
der beeinträchtigten
T-Zellen-Kontrolle der latenten Epstein-Barr-Virus(EBV)-Infektion
zu entstehen. Ähnliche
Lymphome humanen Ursprungs können
durch Inokulation peripherer Blutlymphozyten (PBL) gesunder, EBV-positiver
Individuen bei Mäusen mit
schwerem kombiniertem Immundefizienzsyndrom (SCID) induziert werden
(Mosier et al., Nature 335: 256, 1988; Rowe et al., J. Exp. Med.
173: 147, 1991).
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CD40,
ein auf der Oberfläche
sowohl normaler als auch neoplastischer humaner B-Zellen vorhandenes
Oberflächenantigen,
ist ein Peptid bestehend aus 277 Aminosäuren mit einem vorausberechneten
Molekulargewicht von 30.600, mit einem 19-Aminosäuren-Sekretionssignalpeptid, welches vorrangig
hydrophobe Aminosäuren
enthält.
Dieses Oberflächenantigen
spielt nachweislich eine wichtige Rolle bei der B-Zellen-Proliferation
und -Differenzierung. Eine CD40 kodierende cDNA wurde aus einer
cDNA-Bibliothek isoliert, die aus der Burkitt-Lymphom-Zelllinie
Raji hergestellt wurde (Stamenkovic et al., EMBO J. 8: 1403, 1989).
CD40 wird auch auf der Oberfläche
von Monozyten- und Epithelzellen sowie auf einigen Epithelkarzinomen
exprimiert (E. A. Clark, Tissue Antigens 36: 33, 1990).
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Aktivierte
CD4+-T-Zellen exprimieren hohe Pegel eines Liganden für CD40 (CD40L).
Humanes CD40L, ein membrangebundenes Glykoprotein, wurde kürzlich aus
peripheren Blut-T-Zellen geklont, wie in Spriggs et al., J. Exp.
Med. 176: 1543 (1992) und in der US-Patentanmeldung Nr. 07/969,703,
eingereicht am 23. Oktober 1992, beschrieben, deren Offenbarung
durch Literaturhinweis hierin eingefügt ist. Das Klonen von murinem
CD40L ist in Armitage et al., Nature 357: 80, 1992 beschrieben.
CD40L induziert die B- Zellen-Proliferation
in Abwesenheit eines Costimulus und kann auch die Produktion von
Immunglobulinen in Gegenwart von Zytokinen induzieren.
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Monoklonale
Antikörper
zu CD40 sind im Stand der Technik bekannt (siehe zum Beispiel die
B-Zellen-Antigene behandelnden Abschnitte in LEUKOCYTE TYPING III:
A. J. McMichael ed. Oxford University Press Oxford und LEUKOCYTE
TYPING IV: Oxford University Press, Oxford). Antikörper zu
CD40 geben nachweislich costimulierende Signale an normale B-Zellen
ab, was zu Proliferations- und Differenzierungsreaktionen führt. Ähnlich sendet
CD40-L Protein-stimulierende oder -costimulierende Signale an normale
B-Zellen.
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Es
wurde beobachtet, dass die Quervernetzung von Oberflächen-IgM
auf einigen B-Zellen-Lymphomlinien
hemmende Signale an die Lymphomzellen sendet (Beckwith et al., J.
Immunol. 147: 2411, 1991). Ähnlich kann
die Wirkung von Stimuli, die zur Aktivierung normaler Lymphozyten
führen,
auf maligne B- oder T-Zellen in einem Wachstumsstillstand der Zellen
resultieren (Ashwell et al., Science 237: 61, 1987; Bridges et al.,
J. Immunol. 139: 4242, 1987; Mercep et al., J. Immunol. 140: 324,
1988; Sussman et al., J. Immunol. 140: 2520, 1988; Warner and Scott,
Cell. Immunol. 115: 195, 1988; Page and DeFranco, J. Immunol. 140:
3717, 1988).
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Garnier
et al. beobachtete, dass Antikörper
zu CD40 oder einem anderen B-Zellen-Marker, CD23, ein bestimmtes Maß an Wirksamkeit
bei der Verhinderung der Lymphombildung bei SCID-Mäusen zeigten,
denen humane PBL injiziert und die dann mit EBV infiziert wurden
(Abstract 167, XIVth Intl. Congress of the Transplantation Society,
1992). Es war jedoch im Stand der Technik unbekannt, ob der beteiligte
Aktionsmechanismus die Verhinderung der Bindung von CD40L an CD40
durch den Anti-CD40-Antikörper
oder durch ein anderes Mittel war. Daher besteht auf dem Gebiet
Bedarf an der Bestimmung der Auswirkungen anderer Anti-CD40-Antikörper und
von CD40-L selbst auf B-Zellen-Lymphome
und andere maligne Zellen, die CD40 exprimieren.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung eines Säugers, der
an einer neoplastischen Erkrankung leidet, die durch neoplastische
Zellen, die CD40 exprimieren, gekennzeichnet ist, unter Verwendung
eines CD40-Bindungsproteins, welches die Bindung von CD40 an CD40L
verhindert, in einem pharmazeutisch akzeptablen Puffer. CD40-Bindungsproteine
sind aus der Gruppe bestehend aus monoklonalen Antikörpern zu
CD40, löslichen
oligomeren CD40-Liganden und Kombinationen daraus ausgewählt. Besonders
bevorzugte monoklonale Antikörper
sind hCD40m2 (hinterlegt als HuCD40-M2 in der American Type Culture
Collection, Rockville, MD, USA, gemäß dem Budapester Vertrag und
versehen mit der ATCC-Zugangsnummer HB11459) und hCD40m3, welche
in WO-A-95/09653
beschrieben sind. Zu oligomeren Formen des CD40-Liganden gehören ein
lösliches
CD40-Liganden-Fc-Fusionsprotein und ein oligomeres CD40-Leucin-Zipper-Fusionsprotein,
welche beide in WO-A-93/08207 beschrieben worden sind. Zu neoplastischen
Zellen, welche CD40 exprimieren, gehören B-Lymphomzellen, einige
Melanomzellen und einige Karzinomzellen.
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KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
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1 veranschaulicht
die Expression von CD40 durch mehrere Lymphomzelllinien mit Hilfe
der monoklonalen Anti-CD40-Antikörper
M2 und M3.
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2 demonstriert die Verhinderung der Proliferation
mehrerer Lymphomzelllinien durch Antikörper zu CD40 (gefüllte Quadrate);
im Gegensatz dazu verhinderte msIgG die Proliferation nicht (offene
Quadrate).
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3 stellt einen Vergleich der Auswirkungen
von löslichem
Anti-CD40 (Tafel A) oder immobilisiertem Anti-CD40 (Tafel B) auf
das Lymphomwachstum dar.
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4 demonstriert
die Fähigkeit
von löslichem
CD40-Liganden, das Wachstum von B-Zellen-Lymphomen in vitro zu verhindern.
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5 zeigt,
dass Antikörper
zu CD40 das Wachstum von menschlichen Melanomzellen in vitro verhindern.
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6 demonstriert
die Fähigkeit
von löslichem
CD40-Liganden, das Wachstum von B-Zellen-Lymphomen in vivo zu verhindern.
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DETAILLIERTE BESCHREIBUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Behandlung oder Verhinderung
von Erkrankungen, welche durch neoplastische Zellen gekennzeichnet
sind, die ein Zelloberflächenmolekül exprimieren,
welches als CD40 bekannt ist. Das erfinderische Prinzip nutzt ein
Protein (oder Proteine), welche/s besonders CD40 (CD40-Bindungsprotein
genannt) in einer nichtkovalenten Interaktion auf Grundlage der
korrekten Konformation des CD40-Bindungsproteins
und des CD40 selbst bindet binden. Zum Beispiel kann ein CD40- die
Bindung von CD40 an CD40L verhinderndes Bindungsprotein einen Antikörper umfassen,
welcher CD40 über
eine Antigenbindungsregion bindet. Zusätzliche CD40-Bindungsproteine,
welche die Bindung von CD40 an CD40L verhindern, können durch
rekombinierende Verfahren, durch die Herstellung von Fusionsproteinen,
welche eine CD40-Bindungsregion (oder -domäne) von einem CD40-Liganden
aufweisen, oder durch einen Antikörper zu CD40 mit einem zweiten
Protein, zum Beispiel einer humanen Immunglobulin-Fc-Domäne, hergestellt
werden.
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CD40
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Humanes
CD40-Antigen (CD40) ist ein Peptid aus 277 Aminosäuren mit
einem Molekulargewicht von 30.600 und einem 19-Aminosäuren-Sekretionssignalpeptid,
welches vorrangig hydrophobe Aminosäuren umfasst (Stamenkovic et
al., siehe oben). Eine humanes CD40 kodierende cDNA wurde aus einer
cDNA-Bibliothek isoliert, welche aus der Burkitt-Lymphomzelllinie Raji hergestellt wurde.
Das putative, von der CD40-cDNA kodierte Protein enthält eine
putative Führungssequenz,
eine transmembrane Domäne
und eine Reihe weiterer Merkmale, die bei membrangebundenen Rezeptorproteinen üblich sind.
Man hat herausgefunden, dass CD40 auf B-Lymphozyten, Epithelzellen
und einigen Karzinomzelllinien exprimiert wird.
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CD40
ist ein Mitglied der Tumor-Nekrose-Faktor(TNF)/Nervenwachstumsfaktor(NGF)-Rezeptorfamilie,
welche durch die Gegenwart von Cystein-reichen Motiven in der extrazellulären Region
definiert ist (Smith et al., Science 248: 1019, 1990; Mallett and
Barclay, Immunology Today 12: 220; 1991). Zu dieser Familie gehören das
Lymphozytenantigen CD27, CD30 (ein Antigen, das auf Hodgkin-Lymphomen
und Reed-Sternberg-Zellen
gefunden wurde), zwei Rezeptoren für TNF, ein Mäuse-Protein,
welches als 4-1BB bezeichnet wird, das OX40-Rattenantigen, der NGF-Rezeptor
und das Fas-Antigen.
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CD40
kann durch jedes einzelne mehrerer Mittel, die im Stand der Technik
bekannt sind, auf der Oberfläche
einer Zelle entdeckt werden. Zum Beispiel kann ein für CD40 spezifischer
Antikörper
in einem Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierverfahren verwendet
werden, um zu bestimmen, ob Zellen CD40 exprimieren, wie dies in
Beispiel 1 beschrieben ist. Weitere Verfahren der Erkennung von
Zelloberflächenmolekülen sind
auch für
die Erkennung von CD40 von Nutzen.
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Monoklonale CD40-Antikörper
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Gegen
das CD40-Oberflächenantigen
gerichtete monoklonale Antikörper
(CD40 mAb) vermitteln nachweislich unterschiedliche biologische
Aktivitäten
auf humanen B-Zellen.
Zum Beispiel induzieren CD40 mAb homotypische und heterotypische
Adhäsionen
(Barrett et al., J. Immunol. 146: 1722, 1991; Gordon et al., J.
Immunol. 140: 1425, 1988) und erhöhen die Zellgröße (Gordon
et al., J. Immunol. 140: 1425, 1988; Valle et al., Eur. J. Immunol.
19: 1463, 1989). CD40 mAb induzieren außerdem die Proliferation von
mit Anti-IgM, CD20 mAb
oder nur Phorbolester (Clark and Ledbetter, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 83: 4494, 1986; Gordon et al., LEUCOCYTE TYPING III; A. J. McMichael
ed. Oxford University Press, Oxford, S. 426; Paulie et al., J. Immunol.
142: 590, 1989) oder in Übereinstimmung
mit IL-4 (Valle et al., Eur. J. Immunol. 19: 1463, 1989; Gordon et
al., Eur. J. Immunol. 17: 1535, 1987) aktivierten B-Zellen und erzeugen
IgE (Jabara et al., J. Exp. Med. 172: 1861, 1990; Gascan et al.,
J. Immunol. 147: 8, 1991), IgG und IgM (Gascan et al., J. Immunol.
147: 8, 1991) aus IL-4-stimulierten, T-Zellen-verarmten Kulturen.
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Außerdem wurde
von CD40 mAb berichtet, dass sie die IL-4-vermittelte Freisetzung
von löslichem CD23/FcϵRII
aus B-Zellen steigern (Gordon and Guy, Immunol. Today 8: 339, 1987;
Cairns et al., Eur. J. Immunol. 18: 349, 1988) und die B-Zellen-Erzeugung
von IL-6 unterstützen
(Clark and Shu, J. Immunol. 145: 1400, 1990). Vor kurzem wurden
in Gegenwart von CDW32+-verbundenen Zellen
mit IL-4 und CD40 mAb humane B-Zelllinien aus primären B-Zellenpopulationen
erzeugt (Banchereau et al., Science 241: 70, 1991). Ferner kann
verhindert werden, dass Keimzentrums-Zentrozyten die Apoptose durchlaufen,
wenn sie durch CD40 und/oder Rezeptoren für das Antigen aktiviert werden
(Liu et al., Nature 342: 929, 1989). Jede der obengenannten Veröffentlichungen
beschreibt CD40 mAb, welche eine biologische Aktivität von B-Zellen
stimulieren.
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WO-A-95/09653
offenbart zwei monoklonale Antikörper
zu CD40, welche als hCD40m2 und hCD40m3 bezeichnet werden. Im Gegensatz
zu anderen CD40 mAb binden hCD40m2 (ATCC HB 11459) und hCD40m3 CD40
und verhindern die Bindung von CD40 an Zellen, die CD40L konstitutiv
exprimieren. Eine höher
als 95%ige Verhinderung der Bindung wurde mit hCD40m2 oder mit CD40
mAb M3 bei so geringen Konzentrationen wie 12,5 μg/ml im Vergleich zum irrelevanten
IgG oder einem Kontroll-CD40-mAb, G28.5, beobachtet. hCD40m2 war
außerdem
in der Lage, die CD40L-induzierte TNF-α-Produktion zu verhindern.
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Weitere
monoklonale CD40 Antikörper
können
unter Verwendung konventioneller Verfahren erzeugt werden (siehe
US-Patentschrift Nr. RE 32,011, 4,902,614, 4,543,439 und 4,411,993;
siehe auch Monoclonal Antibodies, Hybridomas: A New Dimension in
Biological Analyses, Plenum Press, Kennett, McKearn und Bechtol
(Hsg.), 1980 und Antibodies: A Laboratory Manual, Harlow and Lane
(Hsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988).
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Kurz,
einem Tier wird eine Form von CD40 injiziert, die für die Erzeugung
einer Immunreaktion gegen CD40 geeignet ist. Das Tier kann wie benötigt re-immunisiert
werden, bis die Pegel des Serumantikörpers gegen CD40 ein Plateau
erreicht haben; dann erhält
es einen letzten Schub von löslichem
CD40 und drei bis vier Tage später
wird es getötet.
Organe, die große
Mengen B-Zellen enthalten, wie die Milz und die Lymphknoten, werden entnommen
und in eine Einzelzellensuspension gespalten, indem die Organe durch
ein Maschensieb passiert werden oder indem die Milz- oder die Lymphknotenmembranen,
welche die Zellen einkapseln, zerrissen werden.
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Alternativ
erhält
man geeignete Zellen für
die Herstellung monoklonaler Antikörper durch den Einsatz von
in vitro Immunisierungsverfahren. Kurz, ein Tier wird getötet und
die Milz- und Lymphknotenzellen werden entnommen. Es wird eine Einzelzellensuspension
hergestellt und die Zellen werden in eine Kultur gegeben, welche
eine Form von CD40 enthält,
die für
die Erzeugung eine Immunreaktion wie oben beschrieben geeignet ist.
Nachfolgend werden die Lymphozyten entnommen und wie unten beschrieben
verschmolzen.
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Zellen,
die wie oben beschrieben durch den Einsatz von in vitro Immunisierung
oder aus einem immunisierten Tier gewonnen werden können durch
Transfektion mit einem Virus wie dem Epstein-Bar-Virus (EBV) immortalisiert
werden (siehe Glasky and Reading, Hybridoma 8(4): 377–389, 1989).
Alternativ werden die entnommenen Milz- und/oder Lymphknotenzellensuspensionen
mit einer geeigneten Myelomzelle verschmolzen, um ein „Hybridom" zu erzeugen, welches
monoklonale Antikörper
abscheidet. Geeignete Myelomlinien sind vorzugsweise defekt im Aufbau
oder in der Expression von Antikörpern
und sind außerdem
gen-identisch mit den Zellen aus dem immunisierten Tier. Viele solcher
Myelomzelllinien sind im Stand der Technik gut bekannt und können aus
Quellen wie der American Type Culture Collection (ATCC), Rockville,
Maryland (siehe Catalogue of Cell Lines & Hybridomas, 6th ed., ATCC, 1988)
bezogen werden.
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CD40-Ligand
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Aktivierte
CD4+ T-Zellen exprimieren hohe Levels eines Liganden für CD40 (CD40L).
Humanes CD40L, ein membrangebundenes Glykoprotein, wurde vor kurzem
aus T-Zellen peripheren Blutes geklont, wie in Spriggs et al., J.
Exp. Med. 176: 1543 (1992) und in WO-A-93/08207 beschrieben. Das
Klonen von murinem CD40L ist in Armitage et al., Nature 357: 80,
1992 beschrieben. CD40L induziert die B-Zellen-Proliferation in Abwesenheit
eines Costimulus und kann auch die Herstellung von Immunglobulinen
in Gegenwart von Zytokinen induzieren.
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CD40-L
ist ein Typ-II-Membran-Polypeptid mit einer extrazellulären Region
an seinem C-Ende, einer transmembranen Region und einer intrazellulären Region
an seinem N-Ende.
Lösliches
CD40-L umfasst eine extrazelluläre
Region von CD40-L (Aminosäure
47 bis Aminosäure
261 der SEQ ID Nr. 1) oder ein Fragment davon. Die biologische Aktivität von CD40-L
wird durch die Bindung der extrazellulären Region von CD40-L mit CD40
vermittelt und beinhaltet die B-Zellen-Proliferation sowie die Induzierung
der Antikörper-Sekretion (einschließlich IgE-Sekretion).
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WO-A-93/08207
beschreibt die Herstellung eines löslichen CD40-L/Fc-Fusionsproteins,
das als CD40-L/FC2 bezeichnet wird. CD40-L/FC2 enthält eine
hydrophile Acht-Aminosäurensequenz,
beschrieben von Hopp et al. (Hopp et al., Bio/Technology 6: 1204,
1988; bezeichnet als Flag®), eine IgG1-Fc-Domäne, eine [Gly4Ser]3-Verbindungssequenz
(beschrieben in US-Patentschrift 5,073,627) und der extrazellulären Region von
humanem CD40-L. Außerdem
ist in WO-A-93/08207 ein lösliches
CD40-L-Fusionsprotein beschrieben, das als trimeres CD40-L bezeichnet
wird, welches eine 33-Aminosäurensequenz,
die als ein „Leucin-Zipper" bezeichnet wird,
die von Hopp et al. (siehe oben) beschriebene hydrophile Acht-Aminosäurensequenz,
gefolgt von der extrazellulären
Region des humanen CD40-L enthält.
Beide oligomere Formen des CD40-L induzieren die humane B-Zellen-Proliferation
in Abwesenheit von Costimuli und führen (in Verbindung mit dem
geeigneten Zytokin) zur Herstellung von IgG, IgE, IgA und IgM.
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Das
in WO-A-93/08207 beschriebene trimere CD40-L wird in der vorliegenden
Erfindung von Nutzen sein.
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Weitere CD40-Bindungsproteine
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Bindungsproteine
können
auch mit Hilfe rekombinierter DNA-Verfahren zur Integration der
variablen Regionen eines Genes, welches einen Antikörper zu
CD40 kodiert, welcher die Bindung von CD40 an CD40L verhindert,
hergestellt werden (siehe James W. Larrick et al., „Polymerase
Chain Reaction Using Mixed Primers: Cloning of Human Monoclonal
Antibody Variable Region Genes From Single Hybridoma Cells", Biotechnology 7:
934–938,
September 1989; Reichmann et al., „Reshaping Human Antibodies
for Therapy", Nature 332:
323–327,
1988; Roberts et al., „Generation
of an Antibody with Enhanced Affinity and Specificity for its Antigen
by Protein Engineering",
Nature 328: 731–734,
1987; Verhoeyen et al., „Reshaping
Human Antibodies: Grafting an Antilysozyme Activity", Science 239: 1534–1536, 1988;
Chaudhary et al., „A
Recombinant Immunotoxin Consisting of Two Antibody Variable Domains
Fused to Pseudomonas Exotoxin",
Nature 339: 394–397,
1989).
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Kurz,
die DNA, welche die Antigenbindungsstelle (oder CD40-Bindungsdomäne; variable
Region) eines CD40 mAb kodiert, wird isoliert, vergrößert und
mit DNA verbunden, die ein anderes Protein kodiert, zum Beispiel
ein humanes IgG (siehe Verhoeyen et al., oben siehe auch Reichmann
et al., oben). Alternativ kann die Antigenbindungsstelle (variable Region)
entweder mit einem komplett unterschiedlichen Protein verbunden oder
darin integriert werden (siehe Chaudhary et al., oben), was zu einem
neuen Protein mit sowohl Antigenbindungsstellen des Antikörpers als
auch der funktionalen Aktivität
des komplett unterschiedlichen Proteins führt.
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Außerdem sind
die DNA-Sequenzen, die Proteine oder Peptide kodieren, welche Oligomere
bilden, besonders nützlich
bei der Herstellung von CD40-Bindungsproteinen, welche die Bindung
von CD40 an CD40L verhindern, und welche eine Antigenbindungsdomäne des CD40-Antikörpers oder
eine extrazelluläre Domäne eines
CD40-Liganden aufweisen. Bestimmte dieser Oligomer-bildenden Proteine
sind in WO-A-93/08207
offenbart; außerdem
sind nützliche
Oligomer-bildende Proteine auch in WO-A-94/10308 offenbart.
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Nach
der Gewinnung geeigneter Antikörper
oder Bindungsproteine können
diese mit Hilfe vieler, dem Durchschnittsfachmann bekannter Verfahren
isoliert oder gereinigt werden (siehe Antibodies: A Laboratory Manual,
Harlow and Lane (Hsg.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988).
Zu geeigneten Verfahren gehören
die Peptid- oder Proteinaffinitätssäulen, HPLC
oder RP-HPLC, Reinigung auf Protein-A- oder Protein-G-Säulen oder eine beliebige Kombination
dieser Verfahren. Rekombinierte CD40-Bindungsproteine können gemäß der Standardverfahren hergestellt
und mit Hilfe von im Stand der Technik bekannten Versuchen, einschließlich, zum
Beispiel, ELISA, ABC oder Dot-Blot-Versuchen sowie durch Bioaktivitätsversuche
wie die für
CD40 mAb beschriebenen, auf die Bindungsspezifität zum CD40 und auf die Verhinderung
der CD40/CD40L-Bindung getestet werden.
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SCID-Maus-Modelle
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Der
Begriff SCID(schwere kombinierte Immundefizienz)-Maus bezieht sich
auf einen mutierten C. B-17-Mausstamm mit einer Chromosom-16-Defizienz,
welche die korrekte Neuanordnung des T-Zellen-Rezeptors und des
Immunglobulingens verhindert, und welchem so praktisch funktionelle
B- und T-Zellen fehlen (Bosma et al., Nature 301: 257, 1983). SCID-Mäuse können erfolgreich mit humanen
fötalen
Lymphgeweben und mit humanen Lymphozyten Erwachsener wiederhergestellt
werden und waren so nützlich
als ein Model zum Studieren der humanen Immunfunktion in vivo (Mosier
et al., Nature 335: 256, 1988; McKune et al., Science 241: 1632,
1988; Kamel-Reid and Dick, Science 242–1707, 1988). SCID-Mäuse, die
mit humanen peripheren Blut-Lymphozyten (PBL) aus Individuen mit
serologischem Nachweis der Infektion mit dem Epstein-Bar-Virus (EBV)
wiederhergestellt wurden, entwickeln oft Lymphome mit B-Zellen-Ursprung
(Mosier et al. oben; Cannon et al., J. Clin. Invest. 85: 1333, 1990;
Rowe et al., J. Exp. Med. 173: 147, 1991; Purrilo et al., Int. J.
Cancer 47: 510, 1991). Veronese et al. berichtete, dass die Gegenwart
funktionaler T-Zellen in den injizierten PBL für die Progression latent-EBV-infizierter
B-Zellen in Tumormassen absolut notwendig war (J. Exp. Med. 176:
1763, 1992). Die sich bei diesem SCID-Maus-Modell entwickelnden Lymphome sind hoch-aggressiv
und analog zu den EBV-Lymphomen, die bei immungeschädigten Individuen
entstehen.
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Verabreichung von CD40-Bindungsprotein-Zusammensetzungen
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Die
vorliegende Erfindung sieht eine therapeutische Verwendung vor,
welche die Verabreichung einer effektiven Menge eines CD40-Bindungsproteins,
welches die Bindung von CD40 an CD40L verhindert, in einem geeigneten
Verdünnungsmittel
oder Träger
aufweist. Zur therapeutischen Verwendung muss einem Patienten, vorzugsweise
einem Menschen, gereinigtes CD40-Bindungsprotein, welches die Bindung
von CD40 an CD40L verhindert, oder ein biologisch aktives Gegenstück dazu
verabreicht werden, um die Behandlung in einer der Indikation angemessenen
Art und Weise durchzuführen.
So können
zum Beispiel die pharmazeutischen Zusammensetzungen des CD40-Bindungsproteins,
welches die Bindung von CD40 an CD40L verhindert (zum Beispiel in
Form einer löslichen
extrazellulären
Domäne
des CD40-Liganden oder eines Fragmentes davon oder eines monoklonalen
Antikörpers
zu CD40), welche zu verabreichen sind, um eine gewünschte therapeutische
Wirkung zu erreichen, mittels Bolus-Injektion, kontinuierlicher
Infusion, verzögerter
Freisetzung aus Implantaten oder eines anderen geeigneten Verfahrens
verabreicht werden.
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Normalerweise
ist ein therapeutisches Mittel eines CD40-Bindungsproteins, welches
die Bindung von CD40 an CD40L verhindert, in der Form einer pharmazeutischen
Zusammensetzung zu verabreichen, welche das Mittel in Verbindung
mit physiologisch akzeptablen Trägern,
Arzneimittelträgern
oder Verdünnungsmitteln enthält. Diese
Träger
sind in den angewendeten Dosierungen und Konzentrationen nichttoxisch
für Patienten. Normalerweise
erfordert die Herstellung solcher Zusammensetzungen die Kombination
eines CD40-Bindungsproteins, welches die Bindung von CD40 an CD40L
verhindert, mit Puffern, Antioxidationsmitteln wie Ascorbinsäure, Polypeptiden
mit geringem Molekulargewicht (weniger als etwa 10 Reste), Proteinen,
Aminosäuren,
Kohlenhydraten, einschließlich
Glukose, Saccharose oder Dextran, Chelatbildnern wie EDTA, Glutathion und
andere Stabilisatoren und Arzneimittelträger. Neutrale gepufferte Salzlösung oder
Salzlösung
gemischt mit artspezifischem Serumalbumin sind beispielhafte geeignete
Verdünnungsmittel.
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Geeignete
Dosierungen können
mit Mitteln bestimmt werden, die im Stand der Technik bekannt sind. Normalerweise
liegen therapeutisch wirksame Dosierungen des CD40-Bindungsproteins,
welches die Bindung von CD40 an CD40L verhindert, im Bereich zwischen
etwa 0,01 bis etwa 1 mg/kg Körpergewicht.
Ferner können
CD40-Bindungsproteine,
welche die Bindung von CD40 an CD40L verhindern, auch in konjugierten Verbindungen
von oder in Kombination mit Arzneimitteln, Toxinen oder radioaktiven
Verbindungen verwendet werden. Die Herstellung solcher konjugierter
Verbindungen für
die Behandlung unterschiedlicher Erkrankungen ist im Stand der Technik
bekannt (siehe zum Beispiel Waldmann, Science 252: 1657, 1991).
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Verhinderung oder Behandlung
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Die
hier dargelegten Ergebnisse zeigen, dass CD40-Bindungsproteine,
welche die Bindung von CD40 an CD40L verhindern, nicht nur bei der
Behandlung von B-Zellen-Lymphomen
von signifikantem klinischen Nutzen sein können, sondern auch bei der
Verhinderung von EBV-induzierten B-Zellen-Lymphomen, welche nach
einer Transplantation oder in anderen Fällen der Immunsuppression,
wie AIDS, auftreten können
und welche ein signifikantes Risiko bei solchen Patientenpopulationen
darstellen. Da CD40-Bindungsproteine,
welche die Bindung von CD40 an CD40L verhindern, verschieden B-Zellen-Lymphome direkt
behindern können, ist
es möglicherweise
nicht notwendig, sie in konjugierten Verbindungen von Toxinen oder
radioaktiven Verbindungen zu verwenden, und so die Toxizität und potentielle
negative Auswirkungen auf normale B-Zellen zu vermeiden.
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Die
Erfindung kann bei der Prävention
von immunoblastischen B-Zellen-Lymphomen von Nutzen sein, die häufig bei
immungeschädigten
Individuen auftreten. Bei solchen präventiven Verfahren kann einem
Säuger,
bei dem die Gefahr besteht, dass er ein immunoblastistisches B-Zellen-Lymphom
entwickelt, ein CD40-Bindungsprotein verabreicht werden. Die CD40-Bindungsproteine
können
so lange verabreicht werden, wie der Zustand der Immunschädigung andauert,
der das Individuum der Gefahr aussetzt.
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Ähnlich zeigen
die Ergebnisse, dass die Erfindung eingesetzt werden kann, um das
Auftreten (oder das erneute Auftreten) einer neoplastischen Erkrankung,
welche durch andere Arten maligner Zellen gekennzeichnet ist, die
CD40 bei Individuen, die der Gefahr einer solchen Erkrankung ausgesetzt
sind, exprimieren zu verhindern. Zu den Individuen, die als für diese
Fälle gefährdet erachtet
werden, gehören
diejenigen mit einer Familienvorgeschichte oder anderen genetischen
Eigenschaften, welche die Veranlagung für Krebsarten zeigen, bei denen
die neoplastischen Zellen CD40 exprimieren, sowie Individuen, die
aufgrund einer Chemotherapie, bei der die Arzneimittel-resistenten
neoplastischen Zellen CD40 exprimieren, eine Arzneimittel-resistente
neoplastische Erkrankung entwickeln.
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Individuen,
die von einer Erkrankung betroffen sind, die durch neoplastische
Zellen, welche CD40 exprimieren, gekennzeichnet ist, können auch
entsprechend der Erfindung behandelt werden. Der Begriff Behandlung,
wie er im Stand der Technik allgemein verstanden wird, bezieht sich
auf die Einleitung einer Therapie, nachdem klinische Symptome oder
Erkrankungsanzeichen beobachtet wurden. Die Erfindung kann in Verbindung
mit anderen Therapien eingesetzt werden, die für betroffene Individuen geeignet
sind, einschließlich Chemotherapie,
Bestrahlungstherapie und Immuntherapie.
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Die
folgenden Beispiele dienen der Veranschaulichung besonderer Ausführungsformen
und schränken
den Umfang der Erfindung nicht ein.
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Beispiel 1
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Dieses
Beispiel beschreibt die Charakterisierung humaner B-Zellen-Lymphom-Zellen
und -Zelllinien. Zu den verwendeten Zellen gehörten RL und DB, Zelllinien,
die aus Patienten mit diffusen, großen Zelllymphomen mit B-Zellen-Ursprung
gewonnen wurden (Beckwith et al., oben), und TU2C und CHIM62, sowie
EBV-induzierte Lymphome, die aus SCID-Mäusen gewonnen wurden, denen
PBL aus EBV-seropositiven Individuen injiziert wurde. Diese Zellen
wurden für
weniger als sechs Monate vor Beginn der Studie unter Standardkulturbedingungen
in Kultur erhalten. Weitere Zellen waren Raji, eine Zelllinie kultiviert
aus einem Patienten mit dem Burkitt-Lymphom und LCL-2311, eine Lymphoblastoidzelllinie,
erzeugt durch die Infektion humaner PBL mit EBV in vitro.
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In
der Durchflusszytometrie mit den monoklonalen Anti-CD40-Antikörpern M2
und M3 waren all diese Zelllinien positiv für die CD40-Exprimierung; die
Ergebnisse werden in 1 gezeigt. RL-, DB- und Raji-Zellen waren
bei ihrer Exprimierung von CD40 homogen, wogegen die EBV-induzierten
Lymphome aus SCID-Mäusen
bei der Färbungsintensität mit Anti-CD40
heterogen waren. Für
Lymphome aus diesen Mäusen
wurde kürzlich
nachgewiesen, dass sie heterogen und oligoklonal sind (Nakamine
et al., Am J. Pathol, 142: 139, 1993), was für die differenzielle Exprimierung
von CD40 verantwortlich sein könnte.
CD20, ein weiterer B-Zellen-Marker, war auch auf den Tumorzellen
vorhanden.
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Beispiel 2
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Dieses
Beispiel beschreibt die Wirkung von Anti-CD40-Antikörpern (M2
und M3) auf das proliferative Potential von Lymphomzellen und -zelllinien
in vitro. Die Proliferation wurde mit Hilfe einer Untersuchung bestimmt,
die im Wesentliche der von Rowe et al. beschriebenen entspricht
(J. Exp. Med. 173: 147, 1991). Kurz, Zelllinien wurden 24 Stunden
bevor Untersuchungen durchgeführt
wurden aufgespaltet. Die Zellen wurden in Kulturmedium mit einer
Konzentration von 1 × 105/ml re-suspendiert und 100 μl der Zellsuspension
wurde in 96-Vertiefungen-, Rundboden-Mikrotiterplatten pipettiert
(Corning Glass Works, Corning, NY, USA), die bereits 100 μl angemessen
verdünnter
Reagenzien enthielten (monoklonale Anti-CD40-Antikörper M2
und M3, erhalten von der Immunex Corporation, Seattle, WA, USA oder
IgG-Mausmyelomprotein (msIgG), erworben von Cappel, Westchester,
PA, USA). Zweiundsiebzig Stunden später wurde für die letzten 8 bis 18 Stunden
der Kultur 1 μCi
[3H]-Thymidin/Vertiefung (spezifische Aktivität 6,7 Ci/mmol;
New England Nuclear Research Products, Bosten, MA, USA) hinzugefügt. Die
Kulturen wurden auf Glasfaserfilter mit einem PhDZell-Ernte-System
(Cambridge Technology Inc., Cambridge, MA, USA) entnommen und die
Aufnahme von [3H]-Thymidin durch Flüssigkeitsszintillation
mittels eines LKB-β-Zählers (LKB
Instruments Inc., Turku, Finnland) untersucht. Jedes Experiment
wurde vier bis sechs Mal durchgeführt; die Ergebnisse eines repräsentativen
Experiments sind in 2 dargestellt.
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Die
Inkubation mit monoklonalen Anti-CD40-Antikörpern M2 und M3 ergab eine
signifikante Verhinderung der Proliferation der getesteten RL-,
DB-, LCL-2311- und EBV-Lymphomzelllinien,
wobei eine optimale Verhinderung von 40–60% abhängig von der Lymphomzelle bei
1–10 μg/ml löslicher
Antikörper
auftrat. Die Raji-Zelllinie schien durch lösliches Anti-CD40 nicht wesentliche
beeinflusst zu werden.
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Die
Auswirkungen von löslichem
Anti-CD40 auf das Lymphomwachstum wurden dann mit denen von immobilisiertem
Anti-CD40 verglichen. Kurz, die Vertiefungen wurden über Nacht
bei 37°C
mit Ziegen-Anti-Maus-Antikörper
inkubiert. Monoklonale Anti-CD40-Antikörper M2,
M3, ein monoklonaler Anti-CD20-Antikörper, bereitgestellt durch
Dr. Kevin Conlon (Laboratory of Experimental Immunology, BRMP, NCI-FCRDC,
Frederick, MD, USA) oder msIgG mit einer Konzentration von 10 μg/ml wurden
dann zu den Vertiefungen hinzugefügt, und die Vertiefungen für weitere
4 Stunden bei 37°C
inkubiert. Die Proliferationsuntersuchungen wurden dann wie oben
beschrieben durchgeführt;
die Ergebnisse sind in 3 dargestellt.
Die Immobilisierung führte
zu einer erheblich größeren Verhinderung
der Proliferation (p < 0,05)
durch die immobilisierten Anti-CD40-Antikörper als im Vergleich zu löslichem
Anti-CD40 oder löslichem
oder immobilisiertem CD20. Also übt
die Stimulation von CD40 im Gegensatz zu seinen Auswirkungen auf
normale B-Zellen eine verhindernde Wirkung auf EBV-induzierte B-Lymphome
aus.
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Beispiel 3
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Wirkung des CD40-Liganden auf das Wachstum
von B-Zellen-Lymphomen in vitro. Löslicher CD40-Ligand (CD40-L;
beschrieben in WO-A-93/08207)
wurde aus transfizierten COS-7-Zellen als Überstandsfluid gewonnen und
in einer Proliferationsuntersuchung, die wie oben in Beispiel 2
beschrieben durchgeführt
wird, mittels RL- oder TU2C-Zellen getestet. Sowohl Maus- als auch
Menschen-CD40-L-enthaltende Überstandsfluide
wurden getestet, da Maus- CD40-L an humane Zellen bindet, die CD40
exprimieren und als ein Costimulus in der gleichen Art und Weise
wie humanes CD40-L fungiert. Jede Charge des Überstandsfluids wurde titriert,
um die Konzentration zu bestimmen, mit der die optimale Verhinderung
der Proliferation erreicht wurde; eine 1 : 5-Verdünnung
erreichte die maximale Verhinderung.
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Beispielhafte
Ergebnisse sind in 4 dargestellt; die Werte sind
als Prozent der Verhinderung verglichen mit Kontroll-Überstandsfluiden
dargestellt. Der lösliche
humane Ligand war hemmend für
die unterschiedlichen getesteten Lymphome, mit einer maximalen Verhinderung
(50–80%)
auf RL- und TU2C-Zelllinien bei einer 1 : 5-Verdünnung des Überstandsfluids. Der lösliche murine
CD40-L erzeugte ähnliche,
wenn nicht gar bessere, hemmende Wirkungen. Das Kontroll-Überstandsfluid
aus COS-7-Zellen transfiziert mit dem Vektor allein förderte sogar
das Lymphomzellenwachstum. Entsprechend sind die hemmenden Wirkungen
von CD40-L auf B-Lymphome parallel zu denen von Antikörpern zu
CD40.
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Beispiel 4
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Wirkung von Anti-CD40 auf das Wachstum
von humanen B-Zellen-Lymphomen bei SCID-Mäusen. C. B-17-scid/scid(SCID)-Mäuse wurden
von der Animal Production Facility (NCI-FCRDC, Frederick, MD, USA)
erworben, und wurden nicht vor der 6. bis 8. Lebenswoche verwendet.
Die Mäuse
wurden jederzeit unter spezifischen pathogenfreien Bedingungen gehalten;
sie waren in Mikroisolator-Käfigen
untergebracht und das gesamte Futter, Wasser und Streu wurde vor
der Verwendung autoklaviert. Trimethoprim/Sulfamethoxazol (40 mg
Trimethoprim und 200 mg Sulfamethoxazol pro 320 ml) wurden dem den
Mäusen
verabreichten Trinkwasser in Suspensionsform beigefügt. Alle
Mäuse erhielten
Antiseren gegen Asialo-GM1 (Wako Chemical, Dallas, TX, USA), einen
auf Mäuse-NK-Zellen
vorhandenen Marker (Murphy et al., Eur. J. Immunol. 22: 1421, 1992),
intravenös
einen Tag vor dem Zelltransfer, um die Wirtsresistenz gegen den
Tumor zu entfernen.
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Am
Tag 0 wurden SCID-Mäusen
entweder intravenös
oder intraperitoneal 5 × 106 RL- oder
TU2C-Zellen injiziert. Die Tumorzellenempfänger erhielten dann für einen
Zeitraum von 10 Tagen, beginnend mit Tag 0, 3 oder 14, jeden zweiten
Tag intravenös
entweder 2 μg
Anti-CD40 oder msIgG
(insgesamt 5 Injektionen) in 0,2 ml HBSS (Hanks Balanced Salt Solution).
Die Mäuse
wurden auf die Tumorentwicklung und -progression hin überwacht;
moribunde Mäuse
wurden getötet.
Bei allen Mäusen
wurde bei Hinweisen auf einen Tumor eine Nekropsie durchgeführt. Leber,
Niere und Lymphorgane wurden histologisch auf die Gegenwart von
Tumorzellen analysiert. Sowohl parametrische (Student's t Test) als auch
nicht-parametrische (Wilcoxan-Test) Analysen wurden durchgeführt, um
zu bestimmen, ob sich die Gruppen signifikant unterschieden (p < 0,05). Alle Experimente
umfassten 3–10
Mäuse pro
Gruppe und wurden 2–3
mal durchgeführt.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 unten dargestellt.
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Tabelle
1: Wirkung der Anti-CD40-Verabreichung auf das Überleben Tumor-tragender Mäuse
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Anti-CD40
verbesserte die Überlebensrate
der Mäuse,
die entweder RL- oder TU2C-Tumore
erhielten, signifikant (p < 0,05),
wenn die Behandlung an Tag 0, 3 oder 14 initiiert wurde. Wurden
SCID-Mäuse
an Tag 0 mit Anti-CD40 behandelt, lag nach mehreren Monaten kein
Nachweis eines Tumors bei den Mäusen
vor, die die RL-B-Zellen-Lymphomlinie erhielten. Jedoch entwickelten
einige Mäuse,
die das EBV-Lymphom TU2C und Anti-CD40 erhielten, mehrere Wochen
nach Beendigung der Anti-CD40-Behandlung Tumore.
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Für die verschiedenen
Wege der Tumorzellenverabreichung wurden unterschiedliche Muster
metastatischen Wachstums beobachtet. Mäuse, die die EBV-induzierten
Lymphome i. p. erhielten, entwickelten peritoneale Tumore mit extensiven
Metastasen in den Lymphknoten und der Leber, wogegen Mäuse, die
die Lymphome i. v. erhielten, primär renale Metastasen entwickelten.
Anti-CD40 war ungeachtet des Weges der Tumorverabreichung in der
Lage, das Tumorwachstum signifikant zu verhindern und das Überleben
der Empfängermäuse zu fördern.
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Die
Behandlung Tumor-tragender Mäuse
mit Anti-CD40 führte
außerdem
zu einer signifikant verbesserten Überlebensrate, wenn die Behandlung
3 oder 4 Tage nach dem Tumorzellentransfer oder auch noch 14 Tage
danach initiiert wurde. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Anti-CD40-Behandlung
auch wirksam war, wenn die Behandlung bei relativ großen und
extensiven Tumorbelastungen (> 1
cm3) bei den Empfängermäusen initiiert wurde.
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Beispiel 5
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Wirkung von Anti-CD40 auf das Wachstum
von Tumoren bei SCID-Mäusen,
denen PBL aus EBV-seropositiven Individuen injiziert wurde. SCID-Mäuse (beschrieben
in Beispiel 4 oben) erhielten Injektionen mit rekombiniertem humanem
Wachstumshormon (rhGH; Genentech, South San Francisco, CA, USA),
welches nachweislich die EBV-Lymphogenese bei huPBL-SCID-Mäusen fördert (Murphy
et al., Brain Behav. Immun. 6: 355, 1992), vermutlich aufgrund der
Förderung
der humanen T-Zellen-Verpflanzung
bei behandelten Mäusen
(Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 89: 4481, 1992). Die T-Zellen-Verpflanzung
scheint für
die Bildung des humanen B-Zellen-Lymphoms
im huPBL-SCID-Modell (18) essentiell zu sein. An Tag 0 wurde rhGH
(10 μg in
0,2 ml HBSS) i. p. verabreicht, und dann jeden zweiten Tag bis zur
Durchführung
des Versuchs 4–8
Wochen später.
Humane PBLs wurden gesunden Spendern in Leukopacks entnommen. Anti-asialo
GM-1 wurde wie in Beispiel 4 beschrieben verabreicht.
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Humane
PBLs wurden gesunden, EBV-seropositiven Spendern in Leukopacks entnommen.
Alle Spender wurden auf Antikörper
gegen das humane Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1) und auf das
Hepatitis-B-Oberflächenantigen
(HbsAG) untersucht und gaben nach Information ihre Zustimmung vor
der Spende. Die PBLs wurden durch Gegenstromschlämmung gereinigt und die Lymphozytenfraktion,
die, wie mit der Durchflusszytometrie bewertet, > 90% Lymphozyten enthielt, wurde entnommen.
Die PBLs (1 × 108) wurden an Tag 0 i. p. in Empfänger-SCID-Mäuse injiziert.
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Die
Mäuse wurden
für 20
Tage jeden zweiten Tag mit insgesamt 10 Injektionen i. p. mit Anti-CD40, Anti-CD20
oder mit msIgG (2 μg/0,2
ml PBS) behandelt. Tabelle 2 stellt die repräsentativen Ergebnisse aus drei
Experimenten mit 5–8
Mäusen
pro Gruppe dar.
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Tabelle
2: Wirkung der Anti-CD40-Verabreichung auf die EBV-induzierte B-Zellen-Lymphom-Entwicklung
bei huPBL-SCID-Mäuse-Chimären
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Die
Ergebnisse zeigten, dass die Behandlung von chimären huPBL-SCID-Mäusen mit
Anti-CD40 zum Zeitpunkt der huPBL-Übertragung die Entwicklung
humaner B-Zellen-Lymphome
bei den Mäusen
komplett verhinderte. Obwohl Anti-CD20 in vitro keine Auswirkung
auf die Lymphome hatte, verhinderte auch die Behandlung der huPBL-SCID-Chimären mit
Anti-CD20 das Auftreten von Lymphomen.
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Beispiel 6
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Wirkung von Anti-CD40 auf die Verpflanzung
humaner T-(HLA+, CD3+)
und B-(HLA+, CD3–)Zellen
bei SCID-Mäusen.
huPBL-SCID-Mäuse-Chimären wurden
wie in Beispiel 5 oben hergestellt. Die in der Peritonealhöhle gefundenen
Prozentsätze
humaner T- und B-Zellen wurden bestimmt und das humane Immunglobulin
im Serum durch das Enzyme-linked Immunoabsorbent Assay (ELISA) quantitativ
bestimmt. Die Tiere wurden auch auf die Gegenwart von Lymphomen
untersucht; die Tiere, bei denen Lymphome nachgewiesen wurden, waren
moribund, mit dem Nachweis extensiver Tumorknötchen in der Peritonealhöhle. Die
Mäuse wurden
4–8 Wochen
nach der huPBL-Übertragung
untersucht, wobei alle zur Kontrolle (msIg) behandelten Mäuse an Tag
33,2 ± 1,2
dem EBV-induzierten B-Zellen-Lymphom erlagen.
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Es
wurden Einzelzellensuspensionen von Peritonealhöhlenzellen entnommen und mittels
der Durchflusszytometrie (FACS) bewertet. Die Anfärbung erfolgte
in Gegenwart von 2% humanem AB-Serum (Gibco BRL, Grand Island, NY,
USA) zur Sättigung
der humanen und Maus-Fc-Rezeptoren. Bei der FACS-Analyse verwendete
Reagenzien waren monoklonale Anti-Human-HLA-ABC konjugiert an Fluorescein-Isothiocyanat (FITC;
Olympus, Lake Success, NY, USA) und Leu4-Biotinyl-Anti-CD3 (Becton-Dickinson,
Mountain View, CA, USA). Nach der primären Antikörper-Inkubation wurden die
Zellen mit Hilfe eines EPICS-Durchflusszytometers analysiert.
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Die
humanen Immunglobulinpegel wurden mit ELISA bewertet. Flachboden-96-Vertiefungen-Mikrotiterplatten
(Corning Glass Works, Corning, NY, USA) wurden mit Ziegen-Anti-Human-Ig
(Kirkegaard and Perry Laboratory, Gaithersburg, MD, USA) mit 1 μg/ml in PBS
beschichtet, zweimal gewaschen und mit 5% Ziegenserum blockiert.
Die Vertiefungen wurden dann mit Seren, die aus huPBL-SCID-Mäuse-Chimären entnommen wurden
oder einer Titration von humanem IgM + IgG-Standard (DAKO Corp.,
Santa Barbara, CA, USA) inkubiert. Nach viermaligem Waschen wurde
mit Alkalischer Phosphatase konjugiertes Ziegen-Anti-Human-Ig (Kirkegaard
and Perry Laboratory, Gaithersburg, MD, USA) hinzugefügt. Die
Platten wurden inkubiert und nochmals gewaschen. Nach der abschließenden Waschung
wurde Substrat hinzugefügt
und die Entwicklung der Enzymreaktion zugelassen. OD wurde bei 402
nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt.
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Tabelle
3: Wirkung des Anti-CD40 auf die humane B-Zellen-Verpflanzung und
die EBV-induzierte Entwicklung bei huPBL-SCID-Chimärenmäusen
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Die
Behandlung mit Anti-CD40 verhinderte die Verpflanzung humaner T-
und B-Zellen nicht,
wie dies durch die FACS-Analyse peritonealer Zellen und die Bestimmung
der Serumpegel von humanem Immunglobulin bestimmt wurde. In Experiment
A schien aufgrund der Pegel von humanem Ig im Serum das Ausmaß der humanen
Zellverpflanzung bei Anti-CD40-behandelten Tieren quantitativ geringer
zu sein als bei Tieren, die msIgG erhielten. Da jedoch die huPBL-SCID-Chimären-Mäuse, die
kein Anti-CD40 erhielten, B-Zellen-Lymphome
entwickelten, entstanden die verzeichneten hohen Pegel an humanem
Immunglobulin wahrscheinlich aufgrund der B-Zellen-Lymphome. Im
Gegensatz zu Anti-CD40
schien die Behandlung mit Anti-CD20 die Verpflanzung von B-Zellen,
die sich sowohl bei geringeren Prozentsätzen von B-Zellen als auch
bei verringerten Levels von humanem Ig im Serum zeigte zu verhindern.
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Beispiel 7
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Wirkung von Anti-CD40 und msIgG auf
die Verpflanzung von B-Zellen bei SCID-Mäusen. huPBL-SCID-Mäuse-Chimären wurden
wie in Beispiel 5 oben beschrieben hergestellt, ausgenommen dass
die PBLs aus EBV-negativen Spendern gewonnen wurden. So ging man
davon aus, dass die Chimären
keine Lymphome entwickeln, wodurch eine exaktere Indikation der
Verpflanzung normaler B-Zellen bereitgestellt wurde. Die Chimären wurden
entweder mit Anti-CD40 oder Anti-CD20 behandelt, und die Prozentsätze der
in der Peritonealhöhle
gefundenen humanen T- und B-Zellen
wurden bestimmt und die Menge des humanen Immunglobulins im Serum
wie in Beispiel 6 beschrieben quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 5 gezeigt.
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Tabelle
5: Wirkung der Anti-CD40-Behandlung auf die humane Immunglobulin-Produktion
bei huPBL-SCID-Chimären
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Die
Behandlung mit Anti-CD40 förderte
die Verpflanzung humaner B-Zellen, wobei sich zeigte, dass Anti-CD40
aufgrund seiner Fähigkeit,
Lymphomzellen zu entfernen, während
normale B-Zellen verschont bleiben, einen zusätzlichen Wert für die Behandlung
oder Verhinderung von Lymphomen besitzt.
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Beispiel 8
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Auswirkung von Antikörpern gegen
CD40 auf das Wachstum humaner Melanomzellen in vitro. Der Antikörper gegen
den CD40-Ligand (M2) wurde bei einem Proliferationsversuch, der
im wesentlichen wie oben in Beispiel 2 beschrieben ablief, mit Hilfe
von humanen M16 Melanomzellen, die CD40 exprimieren, getestet.
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Die
daraus resultierenden Ergebnisse sind in 5 dargestellt;
die Werte sind als Prozent der Verhinderung im Vergleich zu Kontroll-Überstandsfluiden
dargestellt. Die Inkubation mit dem monoklonalen Anti-CD40-Antikörper M2
resultierte in einer signifikanten Verhinderung der Proliferation
der getesteten humanen M16 Melanomzelllinien, mit gerade einmal
0,1 ng/ml, die eine Verhinderung von fast 50% verursachten. Mit steigender
Konzentration von Anti-CD40 wurde eine erhöhte Verhinderung beobachtet.
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Beispiel 9
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Dieses
Beispiel veranschaulicht die Auswirkung von rekombiniertem humanem
CD40-Liganden auf das Wachstum humaner B-Zellen-Lymphome bei SCID-Mäusen. SCID-Mäuse wurden erzeugt und im wesentlichen
wie in Beispiel 4 oben beschrieben behandelt. An Tag 0 wurden SCID-Mäusen intraperitoneal
entweder 5 × 106 RL- oder TU2C-Zellen injiziert. Die Tumorzellenempfänger erhielten
dann 100 μl
konzentriertes Überstandsfluid
aus Zellen, die entweder mit einem Vektor, der humanen CD40-Liganden
kodiert, oder nur mit einem Vektor (Kontrolle) transfiziert. Zwei
Konzentrationen des CD40-Liganden-enthaltenden Überstandsfluids wurden getestet:
ein zehnfaches Konzentrat und ein zweifaches Konzentrat (10 × bzw. 2 ×). Die
konzentrierten Überstände wurden
beginnend am 3. Tag für
einen Zeitraum von 15 Tagen jeden dritten Tag intraperitoneal verabreicht
(insgesamt 5 Injektionen). Die Mäuse
wurden auf die Tumorentwicklung und -weiterentwicklung hin überwacht;
moribunde Mäuse
wurden getötet.
An allen Mäusen
wurde für
Nachweise von Tumoren eine Nekroskopie durchgeführt. Leber, Nieren und Lymphoidorgane
wurden histologisch auf die Gegenwart von Tumorzellen analysiert.
Sowohl die parametrische (Student's t Test) als auch die nicht-parametrische
(Wilcoxan-Test) Analyse wurde durchgeführt, um zu bestimmen, ob sich
die Gruppen signifikant unterschieden (p < 0,05). Alle Experimente umfassten
7–10 Mäuse pro
Gruppe und wurden 3 Mal durchgeführt.
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Die
Ergebnisse eines beispielhaften Experiments unter Verwendung von
RL-Zellen sind in 6 dargestellt. Ähnlich der
in vitro in Beispiel 3 erhaltenen Ergebnisse verhinderte der rekombinierte
CD40-Ligand das Wachstum von Tumorzellen in vivo bei SCID-Mäusen.
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